CN111214646B - Pd-l1/ctla-4在制备免疫抑制剂中的应用 - Google Patents

Pd-l1/ctla-4在制备免疫抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PD‑L1和/或CTLA‑4在免疫抑制中的用途。本发明制备了一种表达PD‑L1和CTLA‑4的PD‑L1/CTLA‑4胞膜纳米囊泡，在细胞水平和动物实验水平上，研究了PD‑L1/CTLA‑4胞膜纳米囊泡的作用，发现PD‑L1/CTLA‑4胞膜纳米囊泡可以与T细胞表面抑制性受体PD‑1结合，并与活化性受体CD28竞争抗原提呈细胞表面B7受体，抑制T细胞的活化，进而调控机体免疫反应，抑制机体对移植器官的免疫排斥。表明所述PD‑L1/CTLA‑4纳米囊泡抑制剂可用来制备抑制T细胞活性的制剂，具有应用前景。

Description

PD-L1/CTLA-4在制备免疫抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域。更具体地，涉及PD-L1/CTLA-4在制备免疫抑制剂中的应用。
背景技术
免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，具有识别和排除抗原性异物，维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。然而，在人体器官移植手术中，移植器官往往会引发机体的同种异体免疫排斥，使移植器官无法在机体内正常生存，甚至由于免疫排异导致机体严重的不良反应。
同种异体免疫排斥是指同种属、不同个体之间进行器官移植后，器官接受体对移植物发生特异性免疫应答的过程。同种异体免疫识别引起的T细胞活化，是引发器官排异的重要原因。在器官移植手术中，同种异体免疫排斥是导致器官移植并发症缘由之一。为了提高器官移植的成功率，临床上常于手术前后使用免疫抑制剂，降低免疫系统活性，提高器官接受体的存活率。
免疫抑制剂是对机体免疫反应具有抑制作用的药物，抑制与免疫反应有关的细胞增殖等，降低机体的免疫反应。临床上常用的免疫抑制剂包括糖皮质激素、环磷酰胺和环孢素A等，这些抑制剂通过抑制炎症因子、杀伤免疫细胞和抑制IL-2以阻滞免疫细胞生长，起到免疫抑制的作用；但这些抑制剂存在有激素作用广致使副作用多、肝肾毒性强及过敏等不良反应。因此，研发通过新路线抑制免疫反应的高效、安全免疫抑制剂，存有其现实意义。
PD-L1和/或CTLA-4是肿瘤免疫治疗的重要靶点，现有技术中主要公开的的均为PD-L1和/或CTLA-4靶点的抑制剂或抗体等用于肿瘤免疫治疗的相关报道。例如专利CN109890405A公开了PD-1/PD-L1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂与含有多种细胞因子组分的生物制剂用于治疗癌症的用途；专利CN109069631A公开了包含抗PD-L1和抗CTLA-4抗体的共配制品的组合物；专利CN105796597A公开了携带PD-L1和CTLA-4抗体基因的CAR-T细胞在肿瘤免疫上的应用；CN104470949A公开了用于癌症患者的免疫治疗的方法，包括对患者施用抑制PD-1/PD-L1信号传输途径的抗体，或施用这种抗体与抗CTLA-4抗体的组合。但是关于PD-L1与CTLA-4在免疫抑制，尤其是在器官移植免疫排斥中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供PD-L1/CTLA-4在制备免疫抑制剂中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明为了研究PD-L1和/或CTLA-4在免疫抑制，尤其是在器官移植免疫排斥中的用途，首先制备了一种表达PD-L1和/或CTLA-4的PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡。在细胞水平和动物实验水平上PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在免疫抑制中的作用。结果表明，PD-L1胞膜纳米囊泡、CTLA-4胞膜纳米囊泡及PD-L1和CTLA-4双纳米囊泡均具有抑制T细胞的活化，进而调控机体免疫反应，抑制机体对移植器官的免疫排斥的功能；其中PD-L1和CTLA-4双纳米囊泡可以与T细胞表面抑制性受体PD-1结合，并与活化性受体CD28竞争抗原提呈细胞表面B7受体，通过PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80的双重相互作用，对机体的免疫系统进行抑制，具有更好的免疫抑制效果。
因此本发明首先提供PD-L1/CTLA-4的如下用途：
PD-L1和/或CTLA-4在制备免疫抑制剂中的应用。
PD-L1和/或CTLA-4在制备器官移植免疫排斥抑制剂中的应用。具体地，是在器官同种异体移植免疫排斥中的应用。
PD-L1和/或CTLA-4在制备抑制T细胞活化的制剂中的应用。
PD-L1和/或CTLA-4在制备抑制T细胞增殖的制剂中的应用。
PD-L1和/或CTLA-4在制备促进PD-1受体、B7受体活性的制剂中的应用。
PD-L1和/或CTLA-4在制备抑制CD28受体活性的制剂中的应用。
一种免疫抑制剂，含有PD-L1和/或CTLA-4；理论上含有PD-L1和/或CTLA-4蛋白或可表达PD-L1和/或CTLA-4的制剂均可实现发明目的。例如：装载有PD-L1和/或CTLA-4蛋白的载药纳米粒，含有可表达PD-L1和/或CTLA-4蛋白的生物制剂等。
本发明还具体提供一种PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡，由生物细胞膜构成，粒径10～300nm，细胞膜表面表达PD-L1和/或CTLA-4。本发明运用基因工程策略构建多功能的细胞膜衍生化纳米囊泡，人为赋予细胞膜纳米囊泡癌免疫抑制功能。PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡表面富含PD-L1和/或CTLA-4，PD-L1可以与T细胞表面抑制性受体PD-1结合，CTLA-4可与T细胞表面活化性受体CD28竞争抗原提呈细胞表面B7受体，通过PD-1/PD-L1和/或CTLA-4/CD80的相互作用。通过上述功能的有机整合，实现对机体的免疫系统进行抑制。
优选地，所述PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡是一种以HEK 293T细胞为基础，胞膜表面表达PD-L1和CTLA-4的囊泡颗粒，通过PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80的双重相互作用，对机体的免疫系统进行抑制。
所述PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的制备方法，先将PD-L1和/或CTLA-4的质粒转染细胞，获得稳定表达PD-L1和/或CTLA-4靶细胞系；再用缓冲液溶解靶细胞系的细胞膜并连续挤压，然后梯度离心，沉淀经重悬后依次经过0.8和0.22μm孔径的膜过滤，即得PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡。可获得单独表达PD-L1的PD-L1胞膜纳米囊泡，单独表达CTLA-4的CTLA-4胞膜纳米囊泡，同时表达PD-L1和CTLA-4的胞膜纳米囊泡或表达PD-L1和CTLA-4的双胞膜纳米囊泡。
本发明试验结果表明，PD-L1胞膜纳米囊泡、CTLA-4胞膜纳米囊泡及PD-L1和CTLA-4双纳米囊泡均具有抑制T细胞的活化，进而调控机体免疫反应，抑制机体对移植器官的免疫排斥的功能；其中PD-L1和CTLA-4双纳米囊泡可以与T细胞表面抑制性受体PD-1结合，并与活化性受体CD28竞争抗原提呈细胞表面B7受体，通过PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80的双重相互作用，对机体的免疫系统进行抑制，具有更好的免疫抑制效果。
因此，本发明还提供PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的如下用途：
PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在制备免疫抑制剂中的应用。
PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在制备器官移植免疫排斥抑制剂中的应用。
PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在制备抑制T细胞活化、增殖的制剂中的应用。
PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在制备促进PD-1受体、B7受体活性的制剂中的应用。
PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在制备抑制CD28受体活性的制剂中的应用。
一种免疫抑制剂，含有PD-L1胞膜纳米囊泡或CTLA-4胞膜纳米囊泡或含有同时表达PD-L1和CTLA-4的纳米囊泡或含有分别表达PD-L1与CTLA-4的双纳米囊泡。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了PD-L1和/或CTLA-4在免疫抑制中的用途。本发明通过制备一种表达PD-L1和/或CTLA-4的PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡，在细胞水平和动物实验水平上，研究了PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的作用，发现PD-L1胞膜纳米囊泡、CTLA-4胞膜纳米囊泡及PD-L1和CTLA-4双纳米囊泡均具有抑制T细胞的活化，进而调控机体免疫反应，抑制机体对移植器官的免疫排斥的功能；其中PD-L1和CTLA-4双纳米囊泡可以与T细胞表面抑制性受体PD-1结合，并与活化性受体CD28竞争抗原提呈细胞表面B7受体，通过PD-1/PD-L1和CTLA-4/CD80的双重相互作用，对机体的免疫系统进行抑制，具有更好的免疫抑制效果，表明PD-L1和/或CTLA-4在免疫抑制，尤其在抑制机体对移植器官的免疫排斥中具有较大的应用前景。
附图说明
图1为PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的构建情况。图1a为激光共聚焦显微镜检测PD-L1/CTLA-4在293T细胞膜上表达的定位结果，绿光代表CTLA-4；红色代表PD-L1；蓝色代表细胞；Merge为将前两张图片叠加的结果，证明293T细胞系能够稳定表达PD-L1/CTLA-4质粒；图1b为透射电子显微镜检测纳米囊泡的形状和大小，比例尺为200nm；图1c为动态光散射试验检测纳米囊泡的大小分布情况。图1d为Zeta Potential试验检测纳米囊泡直径和Zeta电位；图1e为Western blot检测PD-L1/CTLA-4、PD-1/CD80在纳米囊泡上的表达情况；图1f为共聚焦显微镜下PD-L1/CTLA-4双囊泡的荧光共定位
图2是PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的体外生物行为。图2a为激光共聚焦显微镜检测PD-L1纳米囊泡能够与Jurkat细胞相互作用及CTLA-4囊泡与DC相互作用；图2b为激光共聚焦显微镜检测PD-L1纳米囊泡和293T细胞上表达的PD-1相互作用及CTLA-4纳米囊泡和293T细胞上表达的CD80相互作用的定位结果；图2c为CFSE标记法(FITC通道)检测PD-L1/CTLA-4囊泡对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的增殖情况，结果表明PD-L1/CTLA-4纳米囊泡可抑制PBMC的增殖。
图3是PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在皮肤移植的动物实验中的作用。图3a为皮肤移植的动物实验证明PD-L1/CTLA-4的双囊泡能够缓解免疫排斥现象，延长移植皮肤的生存曲线；图3b为流式实验证明共表达PD-L1/CTLA-4的双囊泡减少皮肤移植动物脾脏的CD8分子；图3c为HE染色证明PD-L1/CTLA-4的双囊泡能够缓解免疫排斥现象。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
试剂：普罗霉素购自Sigma-Aldrich；GFP抗体和OFP抗体均购自Abmart；aPD-L1抗体购自Invitrogen；小麦胚芽凝集素(WGA)Alexa Fluor 488和350染料购自ThermoScientific；用于FACS分析的染色抗体包括CD3、CD4、CD8和CD25均购自Biolegend公司；Na+K+ATPase抗体购自Santa Cruz公司；Ficoll Paque Plus购自GE Healthcare公司。
质粒：人质粒(PLV-puro-PDCD1-GFPSpark、PLV-puro-CD274-ofspark、PLV-puro-CTLA4-t1-GFPSpark、PLV-puro-CD80-ofspark)和小鼠质粒(PLV-puro-mCTLA4-t1-GFPSpark和PLV-puro-mCD274-ofspark)均购自北京义翘神州科技有限公司。
细胞培养：HEK 293T细胞、ASC细胞和原始264.7细胞在DMEM(Thermo Scientific)中保存，DMEM中添加100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素(Genstar)和10％胎牛血清(FBS)，温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。用10％胎牛血清培养人外周血Jurkat细胞和PBMC细胞。
实施例1 PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的构建
构建细胞系：采用Lipofectamine 2000(Life Technologies)将包装质粒VSV-G，pHIV-gag-pol以及靶向质粒Lenti-PD-L1-OFP或者Lenti-CTLA-4-GFP质粒转染HEK 293T细胞。转染后12、24小时(p.t.)，收集含有慢病毒的上清液，过滤(0.45μm)。然后将收集的病毒感染HEK293T细胞，或ASC细胞和原始264.7细胞感染慢病毒，并用嘌呤霉素(2μg/ml)进行筛选，以获得稳定表达的靶细胞。首先构建稳定表达PD-L1-OFP的细胞系然后用CTLA-4-GFP的慢病毒再感染细胞，经过嘌呤霉素筛选获得共感染细胞系。
用激光共聚焦显微镜检测PD-L1/CTLA-4在293T细胞膜上表达的定位结果情况。结果如图1a所示，激光共聚焦照片表明293T细胞系能够稳定表达PD-L1/CTLA-4质粒。
(2)细胞膜囊泡(NVs)分离：用HM缓冲液溶解上述定表达PD-L1/CTLA-4质粒的靶细胞，并在冰上连续挤压，然后进行梯度离心，首先在4℃离心机进行5000转离心10分钟取上清，然后再进行12000g离心10分钟弃上清。得到的白色沉淀通过HM缓冲液重悬后依次经过0.8和0.22μm孔隙大小聚碳酸酯膜过滤，最后保存在在-80℃冰箱。
纳米囊泡的大小和表面电位分析：利用仪器(NanoBrook 90Plus PALS,Brookhaven instruments)评价细胞膜的大小分布和zeta电位。用PBS将细胞膜稀释，然后放入试管中。在0～5000nm范围内定量测定了样品的粒度分布。透射电子显微镜检测纳米囊泡的形状和大小。纳米囊泡的透射电子显微镜结果如图1b所示，表明纳米囊泡构建成功，比例尺为200nm。动态光散射试验检测纳米囊泡的大小分布情况如图1c所示，表明粒径大小大约在180nm，属于纳米级别。Zeta Potential试验检测纳米囊泡Zeta电位情况如图1d所示，表明囊泡电位大约是-38mv，能够稳定存在。
Western blot检测PD-L1/CTLA-4、PD-1/CD80在纳米囊泡上的表达情况：用RIPA裂解液(Thermo Scientific)裂解细胞。细胞溶解产物经过离心后加入5xloading buffer煮样，然后样品加到10％SDS蛋白胶中，利用GFP和OFP抗体进行过夜孵育，β-actin和Na+K+ATP酶抗体作为内参对照。再利用HRP标记的抗小鼠二抗进行室温孵育1h，利用ECL化学发光试剂盒(Protein Tech,China)进行检测蛋白条带。蛋白免疫印迹结果如图1e所示，表明纳米囊泡的PD-L1/CTLA-4表达，成功构建了表达PD-L1/CTLA-4的细胞膜纳米囊泡。共焦显微镜结果如图1f所示，证明构架的双靶点囊泡上同时表达PD-L1-OFP和CTLA-4-GFP。
实施例2 PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的体外生物行为
(1)纳米囊泡细胞结合试验：将Jurkat细胞与PD-L1-OFP NVs(50微克/毫升，蛋白质重量)孵育30分钟，并用Ceoporep-4离心机(中国英泰)离心制成玻片。然后，加入麦胚凝集素(WGA)、Alexa-Fluor 488结合物染色细胞膜10min，将bmdc接种于共聚焦培养皿中，用10U-TNF-α刺激DC细胞。如前所述，加入CTLA-4-OFP NVs(50微克/毫升，蛋白质重量)，孵育30分钟。然后，加入麦胚凝集素(WGA)、Alexa-Fluor 350结合物，在37℃下孵育10min，对膜进行染色。将293T-CD80-OFP细胞或293T-PD-1-GFP细胞分别接种于共聚焦培养皿中。将CTLA-4-OFP NVs(50微克/毫升，蛋白质重量)或PD-L1-OFP NVs(50微克/毫升，蛋白质重量)加入培养基中培养30分钟。使用共焦显微镜(蔡司，LSM880)拍摄图像。结果如图2a所示，表明PD-L1-OFP纳米囊泡与jurkat T细胞相互作用，CTLA-4-GFP囊泡可以和树突细胞相互作用。
如图2b所示，共聚焦实验证明表达PD-L1的囊泡能够和表达PD-1的293T细胞共定位，表达CTLA-4的囊泡能够和表达CD80的293T细胞共定位。
(2)人外周血PBMC：将健康献血者外周血单个核细胞(PBMC)收集到EDTA钾溶液中。PBMC分离采用Ficoll-Paque-Plus(GE Healthcare，USA)密度梯度离心法，用RPMI 1640清洗PBMCs 3次，计算计数。
CFSE染色：分离到的PBMCs细胞被种在包被CD3(10μg ml-1，clone OKT3；Biolegend)和CD28(2μg ml-1，clone OKT3；Biolegend)抗体的24孔板。2天后，将不同的NVs组(50μg/mL)加入上述孔中。第7天收集细胞，在第7天收集细胞，并用CFSE染料(5μM)染色，放在37℃20min然后用无血清的1640培养基进行洗涤，然后通过流式进行分析。
CFSE标记法(FITC通道)检测PD-L1/CTLA-4纳米囊泡对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的增殖情况，结果如图2c所示，表明PD-L1/CTLA-4纳米囊泡可抑制PBMC的增殖。
实施例3 PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在皮肤移植模型中的用途
分别建立皮肤移植模型。实验动物的使用和所有实验均由中山大学中山医学院动物伦理委员会审核通过，核准号为2018000577。
为进行皮肤移植，对小鼠进行麻醉、剃须和75％乙醇消毒。将雄性C57BL/6小鼠的皮肤(0.8cm2)移植到8周龄BALB/c小鼠背侧。将15例受者随机分为5组：PC组(生理盐水，n＝3)、第2组(PD-L1 NVs，25mg/kg，n＝3)、第3组(CTLA-4NVs，25mg/kg，n＝3)、第4组(PD-L1/CTLA-4NVs，25mg/kg，n＝3)、NC组(自体移植，n＝3)。移植小鼠在前3天通过尾静脉注射每日给药。3d后，每隔1天注射一次NVs，观察老鼠的生存曲线直到14天。结果如图3a所示，PD-L1/CTLA-4的双囊泡能够缓解免疫排斥现象，延长移植皮肤的生存曲线。
苏木精/伊红染色：从移植部位采集组织样本(皮肤)，用4％多聚甲醛固定24小时，转移到70％乙醇中。然后，用石蜡包埋样品并切片(4μm厚)。切片用苏木精和伊红(H&E)进行标准程序染色。100倍荧光显微镜下观察炎性细胞浸润情况。结染色果如图3c所示，表明PD-L1/CTLA-4的双囊泡能够缓解免疫排斥现象。
细胞分离和流式细胞术：取小鼠脾脏，用PBS转移至1.5ml的EP管中，冰冻保存后进行细胞分离。分离脾脏细胞时，反复研磨脾脏，在PBS中洗涤，通过70μm过滤器，在细胞染色缓冲液(Biolegend，USA)中用以下抗体在黑暗中染色15分钟：anti-CD3 FITC(clone17A2)，anti-CD4 APC(GK1.5)，anti-CD8 Brilliant Violet 510(clone 53-6.7)，anti-CD25 PE(clone PC61)。细胞在350xg离心5分钟后洗涤2次，固定细胞在固定缓冲液(Biolegend，USA)中于室温下黑暗中洗涤20分钟，然后再次离心洗涤。数据在MoFlo-XDP流式细胞仪(Beckman-Coulter，UAS)上获得。流式细胞试验结果如图3b所示，表明共表达PD-L1/CTLA-4的双囊泡减少动物脾脏的CD8分子。

Claims (3)

1.一种PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡，其特征在于，由生物细胞膜构成，粒径10～300nm，细胞膜表面表达PD-L1和CTLA-4；所述PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡的制备方法为先将PD-L1和CTLA-4的质粒转染细胞，获得稳定表达PD-L1和CTLA-4靶细胞系；再用缓冲液溶解靶细胞系的细胞膜并连续挤压，然后梯度离心，沉淀经重悬后依次经过0.8和0.22μm孔径的膜过滤，即得PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡。
2.权利要求1所述的PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡在制备器官移植免疫排斥抑制剂中的应用。
3.一种免疫抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述PD-L1/CTLA-4胞膜纳米囊泡。
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