CN110215514B - 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用 - Google Patents

一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110215514B
CN110215514B CN201910325394.0A CN201910325394A CN110215514B CN 110215514 B CN110215514 B CN 110215514B CN 201910325394 A CN201910325394 A CN 201910325394A CN 110215514 B CN110215514 B CN 110215514B
Authority
CN
China
Prior art keywords
trail
cell
puro
pcdh
cmv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910325394.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110215514A (zh
Inventor
刘小龙
吴名
郑东烨
蔡志雄
苏小平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Geyuan Zhishan Shanghai Bio Tech Co ltd
Shanghai Ruikesheng Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Geyuan Zhishan Shanghai Bio Tech Co ltd
Shanghai Ruikesheng Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Geyuan Zhishan Shanghai Bio Tech Co ltd, Shanghai Ruikesheng Biological Technology Co ltd filed Critical Geyuan Zhishan Shanghai Bio Tech Co ltd
Priority to CN201910325394.0A priority Critical patent/CN110215514B/zh
Publication of CN110215514A publication Critical patent/CN110215514A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110215514B publication Critical patent/CN110215514B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01006—Catalase (1.11.1.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种基因工程化细胞膜纳米囊泡PD‑1/TRAIL@CAT NVs及制备方法和应用。纳米囊泡由生物细胞膜构成，表面转配有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、程序性死亡受体1(PD‑1)，内部包埋过氧化氢酶(CAT)。TRAIL可特异性诱导肿瘤细胞死亡，释放肿瘤抗原和“危险信号分子”，触发免疫应答；PD‑1可与癌细胞上的PD‑L1蛋白结合，阻断相关免疫抑制通路；CAT则可催化肿瘤部位H2O2产生氧气，改善肿瘤乏氧环境，增强免疫细胞浸润性。通过上述功能的有机整合，实现肿瘤细胞的有效清除和自身免疫体系的快速激活，发挥多点协同增效的抗肿瘤效果。

Description

一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备方法，以及其在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
(二)背景技术
肿瘤免疫治疗是近年来的研究热点，其利用免疫学原理和方法，旨在激发机体内在免疫反应，增强对肿瘤细胞的免疫排斥、抑制和杀伤效果，从而实现肿瘤杀伤、降低肿瘤复发和转移的目的。2013年《Science》杂志将肿瘤免疫治疗评为年度十大科学突破之一，并且目前已有部分免疫治疗药物获FDA批准临床用于黑色素瘤、肺癌、食道癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗。肿瘤免疫治疗主要包括过继性免疫细胞治疗、细胞因子、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂等治疗策略，具有副作用小、特异性强、有效时间持久、复发率低等优点。其中，基于PD-1/PD-L1生物轴的免疫检查点抑制剂疗法在临床上显示出巨大应用潜力。PD-1和PD-L1分别存在于T细胞和肿瘤细胞表面，当两者结合便提供了抑制性信号，诱导T细胞凋亡、抑制T细胞的活化和增殖，肿瘤细胞借此逃避T细胞识别。目前已有多种分别以PD-1(O药，K药)和PD-L1(T药，B药，I药)为靶点的单抗类抑制剂，通过抗体与PD-1或者PD-L1竞争性结合阻断PD-1/PD-L1间相互作用，恢复T细胞免疫监视功能。除单抗外，外源性PD-1重组蛋白也可通过与PD-L1相结合，阻断其与T细胞表面PD-1间的识别，发挥类似的免疫检查点抑制作用。即便如此，目前肿瘤免疫治疗只能使小部分患者获益，总体抗肿瘤效果还需进一步提升。在免疫选择压力下，肿瘤细胞可依靠自身高突变性，逐步建立起多种免疫抑制网络(如：下调癌细胞抗原表达，高表达T细胞抑制性配体，分泌免疫抑制分子，诱导免疫抑制细胞在肿瘤中分化、增殖、聚集，乏氧微环境抑制效应性淋巴细胞浸润等)，因此靶向一种免疫抑制分子或者细胞通常难以有效激活机体抗肿瘤免疫反应。如何在攻击肿瘤细胞的同时，对肿瘤免疫抑制通路中的多个关键节点进行调控，充分激活机体内在的抗肿瘤免疫反应，对提高疗效和发展新的治疗方案具有积极意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种多功能细胞膜衍生化纳米囊泡，选择性引起肿瘤细胞免疫原性死亡并调控免疫抑制微环境，充分调动机体内在的抗肿瘤免疫反应，实现肿瘤多点协同增效治疗。
本发明采用的技术方案是：
一种基因工程化细胞膜纳米囊泡PD-1/TRAIL@CAT NVs，由生物细胞膜构成，粒径10～200nm，表面转配有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、程序性死亡受体1(PD-1)，内部包埋过氧化氢酶(CAT)。
所述的生物细胞膜来源于工程化293FT细胞株，细胞膜表面表达有PD-1蛋白。所述的纳米囊泡为细胞膜与过氧化氢酶共混后，通过膜挤压器获得。
所述PD-1、TRAIL蛋白和过氧化氢酶质量比为1～3：1～3：0.2～1。
本发明首先在pCDH-CMV-Puro空载中，分别插入C端含有mCherry(红色荧光)、EGFP(绿色荧光)的PD-1、TRAIL融合基因序列，分别得到两种质粒(pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro、pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro)。上述质粒通过慢病毒包装，感染并筛选出稳转293FT细胞株，最后通过western blot和激光共聚焦显微镜验证两种蛋白分别在相应稳转细胞株中的表达情况。分别从上述细胞中提取含有PD-1和TRAIL的细胞膜，按照一定比例与过氧化氢酶(CAT)共混后，使用脂质体挤出器处理获得纳米囊泡。上述构建的纳米囊泡(PD-1/TRAIL@CAT NVs)可选择性引起肿瘤细胞免疫原性死亡，同时阻断免疫抑制通路，并改善肿瘤乏氧环境。
具体的，所述纳米囊泡由如下方法构建获得：
(1)将PD-1、TRAIL蛋白的基因序列分别与mCherry红色荧光蛋白基因序列、EGFP绿色荧光蛋白(其他用于标记的荧光蛋白序列也可)基因序列通过柔性肽序列ggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggt连接构建成新的融合蛋白基因序列，再分别插入到pCDH-CMV-Puro空载质粒(其他用于表达PD-1和TRAIL蛋白的空载质粒也可)中，获得pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro、pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro两种质粒；
(2)pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro和pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro使用293FT细胞进行慢病毒包装，收集病毒液进行纯化和浓缩，用浓缩后的病毒液感染293FT细胞，感染过程中加入polybrene增强感染效率，感染两天后用抗性药物Puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；可通过激光共聚焦显微镜观察以及western blot等实验进行验证来确定稳转细胞株的成功构建，证明PD-1、TRAIL可表达在细胞膜表面；
(3)将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，按细胞膜抽提试剂盒提供的方法获取细胞膜，用PBS溶解细胞膜，与过氧化氢酶混溶后，先后用800nm、400nm和200nm孔径的挤膜器处理，离心洗涤数次，最终获取粒径均一的纳米囊泡。全程置于冰上或在低温环境中操作，防止蛋白变性。
本发明运用基因工程策略构建多功能的细胞膜衍生化纳米囊泡(GECVs)，人为赋予GECVs癌细胞杀伤功能和免疫抑制微环境多点调控功能。GECVs表面富含肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、程序性死亡受体1(PD-1)，内部包埋过氧化氢酶(CAT)。TRAIL可特异性诱导肿瘤细胞死亡，释放肿瘤抗原和“危险信号分子”，触发免疫应答；PD-1可与癌细胞上的PD-L1蛋白结合，阻断相关免疫抑制通路；CAT则可催化肿瘤部位H2O2产生氧气，改善肿瘤乏氧环境，增强免疫细胞浸润性。通过上述功能的有机整合，实现肿瘤细胞的有效清除和自身免疫体系的快速激活，发挥多点协同增效的抗肿瘤效果。
本发明还涉及构建所述的纳米囊泡的方法，所述方法包括：
(1)将PD-1、TRAIL蛋白的基因序列分别与mCherry红色荧光蛋白基因序列、EGFP绿色荧光蛋白基因序列通过柔性肽序列ggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggt连接构建成新的融合蛋白基因序列，再分别插入到pCDH-CMV-Puro空载质粒中，获得pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro、pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro两种质粒；
(2)pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro和pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro使用293FT细胞进行慢病毒包装，收集病毒液进行纯化和浓缩，用浓缩后的病毒液感染293FT细胞，感染过程中加入polybrene增强感染效率，感染两天后用抗性药物Puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；
(3)将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，按细胞膜抽提试剂盒提供的方法获取细胞膜，用PBS溶解细胞膜，与过氧化氢酶混溶后，先后用800nm、400nm和200nm孔径的挤膜器处理，离心洗涤数次，最终获取粒径均一的纳米囊泡。
所用PD-1、TRAIL蛋白和过氧化氢酶质量比为1～3：1～3：0.2～1，优选为1:1:0.5。
本发明还涉及所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡可以选择性引起肿瘤细胞免疫原性死亡，对正常细胞毒副作用较低。
本发明还涉及所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫检查点抑制剂中的应用。PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡可以解除PD-1/PD-L1生物轴的免疫抑制功能。
本发明针对目前肿瘤免疫治疗中存在的肿瘤细胞免疫原性不强，免疫抑制通路复杂多变，乏氧物理微环境不利于免疫细胞浸润，治疗药物之间难以有效协同等问题，构建了一种多功能细胞膜衍生化纳米囊泡，选择性引起肿瘤细胞免疫原性死亡并调控免疫抑制微环境，充分调动机体内在的抗肿瘤免疫反应，实现肿瘤多点协同增效治疗。优选的PD-1/TRAIL@CATNVs纳米囊泡具有50～100nm的直径，其等同于存在于人和动物机体中的一些蛋白和生物有机化合物的尺寸，由此便于其在肿瘤部位的递送和吸收。
本发明所构建的PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡可通过任何已知的递送方法方式给药：全身递送(静脉注射)，动脉内，肿瘤内，胃肠外，肺腔内，局部、或局部给药的区域递送形式。如肿瘤内注射能够被用来高效改善肿瘤部位免疫抑制微环境。
本发明的有益效果主要体现在：
一、本发明所构建的PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡来源于生物体内，与目前其他具有肿瘤细胞免疫原性杀伤功能的纳米材料相比，该纳米囊泡具有生物相容性良好、毒副作用低、特异性强等优势。该纳米囊泡仅通过单一剂型即可整合多种免疫调控分子，同时这种仿生合成策略可保留蛋白分子的生物活性。
二、本发明所构建的PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡可引起肿瘤细胞免疫原性死亡，阻断免疫共抑制信号通路，改善肿瘤乏氧微环境促进免疫效应细胞浸润，实现级联增效，充分激活机体内在的抗肿瘤免疫反应。
(四)附图说明
图1为制备PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡所涉及的部分关键表征数据。(A)构建的PD-1-mCherry和TRAIL-EGFP 293FT稳转细胞株的激光共聚焦图像。细胞膜上的mCherry红色和EGFP绿色荧光信号证明两种蛋白均可表达在细胞膜表面。(B)PD-1-mCherry和TRAIL-EGFP 293FT稳转细胞株裂解液的western blot分析结果。(C)PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡的TEM图像。(D)DLS测得PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡的水合粒径分布图。(E)DLS测得PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡的表面电位结果。
图2为PD-1/TRAIL@CAT NVs纳米囊泡与癌细胞表面的PD-L1和DR5受体的结合效果。PD-L1-EGFP和DR5-mCherry的H22瞬转细胞株分别与mCherry tagged PD-1(上图)或者EGFP tagged TRAIL(下图)的纳米囊泡孵育后的激光共聚焦图像。图中白色箭头所示为重合部位。
图3为含有CAT的纳米囊泡(PD-1/TRAIL/CAT NVs)对肿瘤细胞乏氧环境的改善效果。
图4为表面含有TRAIL的纳米囊泡(PD-1/TRAIL NVs)对肿瘤细胞的选择性杀伤效果。
图5为表面含有TRAIL的纳米囊泡(PD-1/TRAIL NVs)对肿瘤细胞的选择性杀伤后，促进DC细胞的成熟效果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
将PD-1、TRAIL蛋白的基因序列分别与mCherry红色荧光蛋白基因序列、EGFP绿色荧光蛋白基因序列通过柔性肽序列(ggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggt)连接构建成新的融合蛋白基因序列。
PD-1-mCherry基因序列如下:
GCCACCATGTGGGTCCGGCAGGTACCCTGGTCATTCACTTGGGCTGTGCTGCAGTTGAGCTGGCAATCAGGGTGGCTTCTAGAGGTCCCCAATGGGCCCTGGAGGTCCCTCACCTTCTACCCAGCCTGGCTCACAGTGTCAGAGGGAGCAAATGCCACCTTCACCTGCAGCTTGTCCAACTGGTCGGAGGATCTTATGCTGAACTGGAACCGCCTGAGTCCCAGCAACCAGACTGAAAAACAGGCCGCCTTCTGTAATGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGGATGCCCGCTTCCAGATCATACAGCTGCCCAACAGGCATGACTTCCACATGAACATCCTTGACACACGGCGCAATGACAGTGGCATCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGCACCCCAAGGCAAAAATCGAGGAGAGCCCTGGAGCAGAGCTCGTGGTAACAGAGAGAATCCTGGAGACCTCAACAAGATATCCCAGCCCCTCGCCCAAACCAGAAGGCCGGTTTCAAGGCATGGTCATTGGTATCATGAGTGCCCTAGTGGGTATCCCTGTATTGCTGCTGCTGGCCTGGGCCCTAGCTGTCTTCTGCTCAACAAGTATGTCAGAGGCCAGAGGAGCTGGAAGCAAGGACGACACTCTGAAGGAGGAGCCTTCAGCAGCACCTGTCCCTAGTGTGGCCTATGAGGAGCTGGACTTCCAGGGACGAGAGAAGACACCAGAGCTCCCTACCGCCTGTGTGCACACAGAATATGCCACCATTGTCTTCACTGAAGGGCTGGGTGCCTCGGCCATGGGACGTAGGGGCTCAGCTGATGGCCTGCAGGGTCCTCGGCCTCCAAGACATGAGGATGGACATTGTTCTTGGCCTCTTGGAGGTTCTGGTGGATCTGGTGGAGGTTCTGGTTCTGGATCAGGTGGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAG
TRAIL-EGFP基因序列如下:
GCCACCATGCCTTCCTCAGGGGCCCTGAAGGACCTCAGCTTCAGTCAGCACTTCAGGATGATGGTGATTTGCATAGTGCTCCTGCAGGTGCTCCTGCAGGCTGTGTCTGTGGCTGTGACTTACATGTACTTCACCAACGAGATGAAGCAGCTGCAGGACAATTACTCCAAAATTGGACTAGCTTGCTTCTCAAAGACGGATGAGGATTTCTGGGACTCCACTGATGGAGAGATCTTGAACAGACCCTGCTTGCAGGTTAAGAGGCAACTGTATCAGCTCATTGAAGAGGTGACTTTGAGAACCTTTCAGGACACCATTTCTACAGTTCCAGAAAAGCAGCTAAGTACTCCTCCCTTGCCCAGAGGTGGAAGACCTCAGAAAGTGGCAGCTCACATTACTGGGATCACTCGGAGAAGCAACTCAGCTTTAATTCCAATCTCCAAGGATGGAAAGACCTTAGGCCAGAAGATTGAATCCTGGGAGTCCTCTCGGAAAGGGCATTCATTTCTCAACCACGTGCTCTTTAGGAATGGAGAGCTGGTCATCGAGCAGGAGGGCCTGTATTACATCTATTCCCAAACATACTTCCGATTTCAGGAAGCTGAAGACGCTTCCAAGATGGTCTCAAAGGACAAGGTGAGAACCAAACAGCTGGTGCAGTACATCTACAAGTACACCAGCTATCCGGATCCCATAGTGCTCATGAAGAGCGCCAGAAACAGCTGTTGGTCCAGAGATGCCGAGTACGGACTGTACTCCATCTATCAGGGAGGATTGTTCGAGCTAAAAAAAAATGACAGGATTTTTGTTTCTGTGACAAATGAACATTTGATGGACCTGGATCAAGAAGCCAGCTTCTTTGGAGCCTTTTTAATTAACGGAGGTTCTGGTGGATCTGGTGGAGGTTCTGGTTCTGGATCAGGTGGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA)，
将PD-1-mCherry和TRAIL-EGFP基因序列分别插入到pCDH-CMV-Puro空载质粒(购自system bioscience)中，获得pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro、pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro两个质粒，通过基因测序确定质粒结构。
实施例2：
pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro和pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro使用293FT细胞(来自ATCC)进行慢病毒包装，包装过程如下：
1.接种293FT细胞至95～99％密度时即可用于慢病毒包装；
2.制备A管：使用Opti-MEMTMI培养基稀释Lipofectamine 3000试剂(0.96mlOpti-MEMTMI培养基：0.96ml Lipofectamine 3000：0.04ml)——充分混匀；
3.制备B管：使用Opti-MEM I培养基稀释PLP/VSVGTM慢病毒包装质粒和目的质粒，然后加入P3000试剂(0.96mlOpti-MEMTMI培养基：0.96ml，PLP1：7.5μg，PLP2：3μg，PLP/VSVG：4μg，目的质粒：10μg，P3000：0.04ml)——充分混匀；
4.将新配置的A管与B管室温孵育5分钟；
5.将A管加入B管并充分混匀，室温孵育10～20分钟；
6.将DNA-脂质体复合物加至细胞中并充分摇匀；
7.在37℃、5％CO2下孵育6小时，更换新鲜的含10％FBS的DMEM培养基；
8.转染24h，48h，72h，96h后分别收集全部的病毒液并更换新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，收集的病毒液置于4℃保存；
9.收集的病毒液离心处理(3000～4000rpm 30min)，通过0.22μm孔径的过滤器过滤病毒液，通过超速离心法(100000g 90min)进行浓缩，使用DMEM培养基重悬，分装后置于-80℃储存备用；
用浓缩后的病毒液感染293FT细胞，感染过程中加入polybrene(购自Santa CruzBiotechnology，工作浓度5μg/ml)增强感染效率，感染两天后用抗性药物Puro进行细胞筛选，最后通过激光共聚焦显微镜观察以及western blot等实验进行验证来确定稳转细胞株的成功构建，证明PD-1、TRAI可表达在细胞膜表面，结果如图1A和1B所示。
实施例3：
将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养(使用含有10％FBS的DMEM培养基，在5％CO237℃培养)，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，按细胞膜抽提试剂盒提供的方法获取细胞膜。用PBS(0.0067M(PO4)PH:7.4)溶解细胞膜，与过氧化氢酶(过表达PD1的细胞膜：过表达TRAIL的细胞膜：过氧化氢酶质量比为1:1:0.5)混溶后，先后用800nm、400nm和200nm孔径的挤膜器处理，离心洗涤3次，最终获取粒径均一的纳米囊泡。全程置于冰上或在低温环境中操作，防止蛋白变性。产物形貌通过TEM表征，结果如图1C所示，结果显示纳米囊泡粒径范围为20～50nm；聚集行为和表面电位通过DLS表征，结果如图1D和1E所示，结果显示纳米囊泡的表面电位在-25mV左右。
实施例4：
H22细胞表面过表达带有EGFP荧光标签的PD-L1，与只含有mCherry tagged PD-1的纳米囊泡孵育，观察两者的荧光共定位效果。结果如图2所示，mCherry tagged PD-1的荧光信号几乎可以完全覆盖PD-L1-mCherry的信号，证明纳米囊泡可以跟细胞表面PD-L1结合。EGFPtagged TRAIL则只能与DR5-mCherry部分重合，这是由于肿瘤细胞表面除了DR5受体外，还存在其他受体(如DR4，DcR1，DcR2)。尽管如此，两者的部分结合也能启动细胞内凋亡信号通路。
实施例5：
纳米囊泡与H22细胞共孵育后，置于细胞缺氧培养装置以模拟体内肿瘤乏氧微环境，分别利用Hydrogen Peroxide Assay Kit(Cell-based)和[Ru(dpp)3]Cl2检测细胞中H2O2和O2，验证纳米囊泡催化效果。结果如图3所示，含有CAT的纳米囊泡(PD-1/TRAIL/CATNVs)可以改善肿瘤细胞乏氧环境。
实施例6：
利用CCK8试剂盒和Annexin v-FITC/PI凋亡试剂盒检测纳米囊泡对小鼠成纤维细胞(NIH 3T3)和肝癌细胞(H22)的增殖影响，同时以表面不含TRAIL的囊泡作为对照组，验证TRAIL对肿瘤细胞的选择性杀伤效果。结果如图4所示，表面含有TRAIL的纳米囊泡(PD-1/TRAIL NVs)可选择性促进小鼠肝癌细胞(H22)凋亡，而对正常小鼠成纤维细胞(NIT3T3)无明显杀伤效果。
实施例7：
纳米囊泡处理过的H22细胞与小鼠骨髓来源的DC细胞共同孵育一段时间后，DC细胞用荧光抗体anti-CD11c-FITC/anti-CD86-PE和anti-CD11c-FITC/anti-CD80-PE进行标记，利用流式细胞术分析其中成熟DC细胞(CD11c+CD86+和CD11c+CD80+)的数量及比值。结果如图5所示，PD-1/TRAILNVs处理的H22细胞凋亡后，可释放肿瘤相关抗原和“危险信号分子”，促进DC细胞成熟。
序列表
<110> 上海瑞可新生物科技有限公司
格源致善（上海）生物科技有限公司
<120> 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1629
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gccaccatgt gggtccggca ggtaccctgg tcattcactt gggctgtgct gcagttgagc 60
tggcaatcag ggtggcttct agaggtcccc aatgggccct ggaggtccct caccttctac 120
ccagcctggc tcacagtgtc agagggagca aatgccacct tcacctgcag cttgtccaac 180
tggtcggagg atcttatgct gaactggaac cgcctgagtc ccagcaacca gactgaaaaa 240
caggccgcct tctgtaatgg tttgagccaa cccgtccagg atgcccgctt ccagatcata 300
cagctgccca acaggcatga cttccacatg aacatccttg acacacggcg caatgacagt 360
ggcatctacc tctgtggggc catctccctg caccccaagg caaaaatcga ggagagccct 420
ggagcagagc tcgtggtaac agagagaatc ctggagacct caacaagata tcccagcccc 480
tcgcccaaac cagaaggccg gtttcaaggc atggtcattg gtatcatgag tgccctagtg 540
ggtatccctg tattgctgct gctggcctgg gccctagctg tcttctgctc aacaagtatg 600
tcagaggcca gaggagctgg aagcaaggac gacactctga aggaggagcc ttcagcagca 660
cctgtcccta gtgtggccta tgaggagctg gacttccagg gacgagagaa gacaccagag 720
ctccctaccg cctgtgtgca cacagaatat gccaccattg tcttcactga agggctgggt 780
gcctcggcca tgggacgtag gggctcagct gatggcctgc agggtcctcg gcctccaaga 840
catgaggatg gacattgttc ttggcctctt ggaggttctg gtggatctgg tggaggttct 900
ggttctggat caggtggtat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 960
gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 1020
gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 1080
aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 1140
aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 1200
ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 1260
gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 1320
ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 1380
atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 1440
ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 1500
cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 1560
atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 1620
tacaagtag 1629
<210> 2
<211> 1647
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
gccaccatgc cttcctcagg ggccctgaag gacctcagct tcagtcagca cttcaggatg 60
atggtgattt gcatagtgct cctgcaggtg ctcctgcagg ctgtgtctgt ggctgtgact 120
tacatgtact tcaccaacga gatgaagcag ctgcaggaca attactccaa aattggacta 180
gcttgcttct caaagacgga tgaggatttc tgggactcca ctgatggaga gatcttgaac 240
agaccctgct tgcaggttaa gaggcaactg tatcagctca ttgaagaggt gactttgaga 300
acctttcagg acaccatttc tacagttcca gaaaagcagc taagtactcc tcccttgccc 360
agaggtggaa gacctcagaa agtggcagct cacattactg ggatcactcg gagaagcaac 420
tcagctttaa ttccaatctc caaggatgga aagaccttag gccagaagat tgaatcctgg 480
gagtcctctc ggaaagggca ttcatttctc aaccacgtgc tctttaggaa tggagagctg 540
gtcatcgagc aggagggcct gtattacatc tattcccaaa catacttccg atttcaggaa 600
gctgaagacg cttccaagat ggtctcaaag gacaaggtga gaaccaaaca gctggtgcag 660
tacatctaca agtacaccag ctatccggat cccatagtgc tcatgaagag cgccagaaac 720
agctgttggt ccagagatgc cgagtacgga ctgtactcca tctatcaggg aggattgttc 780
gagctaaaaa aaaatgacag gatttttgtt tctgtgacaa atgaacattt gatggacctg 840
gatcaagaag ccagcttctt tggagccttt ttaattaacg gaggttctgg tggatctggt 900
ggaggttctg gttctggatc aggtggtatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 960
gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 1020
ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 1080
ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 1140
ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 1200
ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 1260
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 1320
aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 1380
tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 1440
atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1500
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1560
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1620
ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 1647
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ggaggttctg gtggatctgg tggaggttct ggttctggat caggtggt 48

Claims (5)

1.一种基因工程化细胞膜纳米囊泡PD-1/TRAIL@CAT NVs，由生物细胞膜构成，粒径10~200 nm，生物细胞膜表面装配有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）、程序性死亡受体 1（PD-1），内部包埋过氧化氢酶（CAT）；所述的生物细胞膜来源于工程化293 FT细胞株；所述PD-1、TRAIL蛋白和过氧化氢酶质量比为1~3：1~3：0.2~1。
2.如权利要求1所述的纳米囊泡，其特征在于所述纳米囊泡由如下方法构建获得：
（1）将 PD-1、TRAIL 蛋白的基因序列分别与mCherry红色荧光蛋白基因序列、 EGFP绿色荧光蛋白基因序列通过柔性肽序列ggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggt连接构建成新的融合蛋白基因序列，再分别插入到 pCDH-CMV-Puro空载质粒中，获得pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro、pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro两种质粒；
（2）pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro和pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro使用293 FT细胞进行慢病毒包装，收集病毒液进行纯化和浓缩，用浓缩后的病毒液感染 293 FT细胞，感染过程中加入polybrene增强感染效率，感染两天后用抗性药物 Puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；
（3）将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，按细胞膜抽提试剂盒提供的方法获取细胞膜，用PBS溶解细胞膜，与过氧化氢酶混溶后，先后用800 nm、400 nm和 200nm孔径的挤膜器处理，离心洗涤3~5次，最终获取粒径均一的纳米囊泡。
3.一种构建权利要求1所述的纳米囊泡的方法，所述方法包括：
（1）将 PD-1、TRAIL 蛋白的基因序列分别与mCherry红色荧光蛋白基因序列、 EGFP绿色荧光蛋白基因序列通过柔性肽序列ggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggt连接构建成新的融合蛋白基因序列，再分别插入到 pCDH-CMV-Puro空载质粒中，获得pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro、pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro两种质粒；
（2）pCDH-CMV-PD-1-mCherry-Puro和pCDH-CMV-TRAIL-EGFP-Puro使用293 FT细胞进行慢病毒包装，收集病毒液进行纯化和浓缩，用浓缩后的病毒液感染 293 FT细胞，感染过程中加入polybrene增强感染效率，感染两天后用抗性药物 Puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；
（3）将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，按细胞膜抽提试剂盒提供的方法获取细胞膜，用PBS溶解细胞膜，与过氧化氢酶混溶后，先后用800 nm、400 nm和 200nm孔径的挤膜器处理，离心洗涤3~5次，最终获取粒径均一的纳米囊泡。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所用PD-1、TRAIL蛋白和过氧化氢酶质量比为1~3：1~3：0.2~1。
5.权利要求1或2所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
CN201910325394.0A 2019-04-22 2019-04-22 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用 Active CN110215514B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910325394.0A CN110215514B (zh) 2019-04-22 2019-04-22 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910325394.0A CN110215514B (zh) 2019-04-22 2019-04-22 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110215514A CN110215514A (zh) 2019-09-10
CN110215514B true CN110215514B (zh) 2023-09-05

Family

ID=67820046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910325394.0A Active CN110215514B (zh) 2019-04-22 2019-04-22 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110215514B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110974957B (zh) * 2019-12-06 2020-12-29 北京大学 包载过氧化氢酶且连接pd-l1抗体的脂质体在制备肿瘤治疗药物的应用
CN110898012B (zh) * 2019-12-06 2021-08-10 北京大学 一种包载过氧化氢酶且连接pd-l1抗体的脂质体及其制备方法
CN111214646B (zh) * 2019-12-30 2023-08-01 中山大学·深圳 Pd-l1/ctla-4在制备免疫抑制剂中的应用
CN111560352B (zh) * 2020-06-02 2023-03-24 新疆农业大学 一种病毒样囊泡及其制备方法和应用
CN112458119A (zh) * 2020-11-10 2021-03-09 南昌大学 一种递送特定蛋白质的工程化仿生外泌体的制备方法及其应用
CN113234686A (zh) * 2021-04-28 2021-08-10 大连干细胞与精准医学创新研究院 一种靶蛋白递送载体的制备方法
CN114366821A (zh) * 2022-02-09 2022-04-19 台州学院 一种表达受体蛋白的细胞膜纳米囊泡及其制备方法和应用
CN114903870B (zh) * 2022-04-01 2023-08-22 浙江大学 一种工程化细胞膜纳米颗粒及其制备方法和应用
CN114908054B (zh) * 2022-04-27 2023-11-24 中山大学·深圳 一种细胞膜囊泡及其制备方法与应用
CN114748448B (zh) * 2022-04-28 2023-10-24 中山大学·深圳 一种巨噬细胞膜纳米囊泡的制备方法与应用
CN114657145A (zh) * 2022-04-29 2022-06-24 中山大学·深圳 一种基因编辑t细胞的细胞外囊泡的制备方法与应用
CN114807048B (zh) * 2022-05-19 2024-07-23 喜丽生物科技(苏州)有限公司 一种基因工程化的抗原提呈细胞外囊泡及其制备方法和应用
CN115120572B (zh) * 2022-06-28 2023-09-29 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109288875A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 厦门大学 一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106619515A (zh) * 2009-08-27 2017-05-10 工业研究与发展基金会有限公司 脂质体组合物及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109288875A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 厦门大学 一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PD-1 Blockade Cellular Vesicles for Cancer Immunotherapy;Xudong Zhang等;《Adv. Mater.》;20180414;第30卷;第1页右栏第2段，第2页左栏第2段，第3页第1-2段，第7页右栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110215514A (zh) 2019-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110215514B (zh) 一种基因工程化细胞膜纳米囊泡及其制备与应用
CN106146666B (zh) 靶向cldn6的免疫效应细胞及其制备方法和应用
US11932872B2 (en) Dual chimeric antigen receptor-t cell which can be regulated, construction method therefor and use thereof
WO2017184553A1 (en) Cancer gene therapy targeting cd47
CN105950664B (zh) 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
CN110055275A (zh) 一种质粒载体对、其修饰的免疫细胞及其应用
CN104910278B (zh) 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒
CN107400168B (zh) 一种基于cd117的嵌合抗原受体及其应用
CN110423767A (zh) 表达可溶性pd-1的嵌合抗原受体car基因及应用
KR20230117726A (ko) 신규한 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 시스템 및 이의 용도
CN113106070A (zh) 一种能够靶向并阻断趋化因子受体的外泌体及其制备方法与应用
CN109517798B (zh) 一种嵌合cea抗原受体的nk细胞及其制备方法与应用
CN114921496A (zh) 一种具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用
CN111983218A (zh) 一种用于检测活细胞-活细胞表面受体-配体相互作用的试剂盒
CN111704674B (zh) 一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体及其应用
CN110144327A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN105647946B (zh) 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
CN114344472B (zh) 一种利用外源性抗原和治疗剂联合治疗肿瘤的方法
CN115141806B (zh) 靶向Her2并表达PD-L1抗体的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
CN110157674A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2021020526A1 (ja) Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法
US11718827B2 (en) LRFFT2 cell
CN114907485A (zh) 一种以内源性蛋白质分子替代单结构域抗体的嵌合抗原受体
CN113980139B (zh) 自分泌TREM2 scFv的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
WO2024061314A1 (zh) 一种转座子系统及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant