KR20230117726A - 신규한 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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푸후이 쑤
첸 황
씽밍 마
티안위 리우
씨아오천 구오
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상하이 준셀 테라퓨틱스 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 일종의 핵산 구축물을 제공하며, 여기에는 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터 요소가 포함된다. 상기 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포 또는 약학 조성물 및 이의 용도를 더 제공한다.

Description

신규한 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 시스템 및 이의 용도
본 발명은 트랜스포존 벡터 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 시스템 및 이의 용도에 관한 것이다.
외래 유전자를 표적 세포 내에 도입해 안정적으로 발현시킴으로써 표적 세포의 형질전환 조작을 구현하는 것은 면역 세포 치료를 비롯한 많은 세포 치료 기술 구현의 필요 조건이다. 일과성 발현에 비해, 안정적으로 발현되는 외래 유전자는 표적 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 다중 세포 계대 또는 배양 조건의 변화에도 장시간 안정적인 발현을 유지할 수 있다. 일반적으로 사용되는 형질전환 시스템에는 바이러스 기반 벡터, 진핵 발현 플라스미드 벡터 및 트랜스포존 벡터가 포함된다. 비바이러스 벡터 기반의 방법을 사용하여 1차 인간 T 세포에 유전적 조작 및 변형을 수행하는 것은 매우 어려운 것으로 입증되었다. 따라서 전 세계적으로, 대부분의 실험실에서는 세포의 형질전환 변형을 위해 여전히 렌티바이러스 벡터 시스템과 같은 레트로바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터 시스템을 사용하고 있다. 바이러스 벡터 시스템이 줄곧 널리 사용되고 있으나, 바이러스 제조 및 조작이 복잡하고, 안전 리스크가 상대적으로 비교적 높으며, 생산 비용이 비교적 높은 단점 등의 극복하기 어려운 문제가 있다.
최근 몇 년 동안, 트랜스포존 벡터 시스템은 면역 세포를 변형하여 종양 면역 치료를 수행하는 데 점점 더 많이 사용되고 있다. 최초로 포유동물에 사용된 트랜스포존은 어류에서 유래한 "잠자는 숲속의 미녀(Sleeping Beauty)" 트랜스포존이었으나, 과도한 억제 효과 및 작은(약 5kb) 운반 단편 등의 결함이 존재하여, 포유동물 세포의 형질전환 조작에 대한 적용이 심각하게 제한되었다. 피기백 트랜스포존은 나비목 곤충에서 유래한 다른 유형의 트랜스포존 시스템으로, 더 큰 단편을 운반할 수 있고, 다양한 진핵 숙주 세포를 통합할 수 있다. 피기백(PB) 트랜스포존 시스템은 주로 "절단-접합(cut-paste)" 메커니즘을 통해 전위하며, 전위가 발생한 후 원래 부위에 풋프린트(footprint)를 남기지 않아, 조작 후에, 게놈 연구, 유전자 치료, 세포 치료, 줄기 세포 유도 및 유도 후 분화 등의 분야에 점점 더 많이 사용되고 있다.
WO2019046815A1은 종래의 피기백 트랜스포존 기반의 이원 시스템을 개시하였으며, 여기에는 피기백 트랜스포사제를 함유하는 벡터와 5' ITR 및 3' ITR을 함유하는 보조 벡터가 포함된다. 해당 피기백 트랜스포존 시스템은 전기천공법과 결합되어 외래 유전자를 T 세포, NK 세포 및 HSPC 세포에 도입할 수 있다. 그러나 이원 시스템은 피기백 트랜스포사제 벡터와 보조 벡터가 동시에 세포 내로 이동한 후에만 전위가 일어나므로, 트랜스펙션에 대한 요구가 비교적 높고 난이도가 비교적 높다. 또한, 피기백 전위 시스템의 메커니즘 피기백 트랜스포사제는 "절단-접합(cut-paste)" 메커니즘을 통해 전위 단편을 게놈에 삽입하는데, 이 과정은 가역적이므로, 피기백 효소의 발현이 계속되는 한, 게놈에 이미 통합된 전위 단편이 다시 절단될 수 있어, 게놈이 불안정해지므로, 실질적으로 전위 효율을 감소시킨다. T 세포에서 일반적인 피기백 이원 전위 시스템의 전위 효율은 통상적으로 약 10% 수준으로, 효율이 비교적 낮다. 또한 WO2019046815A1에는 또 플라스미드 DNA가 T 세포에 대한 독성이 비교적 강하며, T 세포에 대한 이의 독성은 전기천공에 사용되는 DNA의 양과 관련이 있다고 기재되어 있다. 이원 시스템은 의심할 여지 없이 전기천공에 필요한 플라스미드 DNA의 용량을 확장하였고, 세포, 특히 T 세포에 대한 독성을 증가시켰으며, 플라스미드 DNA로 트랜스펙션된 T 세포의 생존율을 감소시켰다.
CN105154473B는 일원 피기백 트랜스포존 벡터를 개시하였는데, 해당 벡터는 종래의 이원 피기백 전위 시스템에서 피기백 트랜스포사제 벡터와 보조 벡터를 하나의 벡터에 합치며, 동일한 발현 벡터에서 피기백 발현 카세트와 외래 유전자 발현 카세트가 동일한 양방향 polyA 서열을 공유하고, 통합 후 피기백 트랜스포사제 발현 카세트의 polyA가 절단되어 자가 불활성화(self-inactivating)되는 메커니즘을 설정함으로써, 조성형 피기백 트랜스포사제의 지속적인 발현을 효과적으로 감소시켰고, 피기백 트랜스포사제의 전위 효율을 향상시키는 동시에, 이원 시스템이 일원 단일 벡터로 단순화되어 DNA 총량을 크게 줄이고, T 세포에 대한 외래 DNA의 독성을 줄였다. 그러나 피기백 트랜스포사제 발현 카세트와 외래 유전자 발현 카세트가 동일한 양방향 polyA 서열을 공유하여 두 방향이 대향하는 발현 카세트 사이에 상호 영향을 미칠 수 있고, 일부 유형의 세포에서는 해당 일원 트랜스포존 벡터가 매개하는 통합 효율이 여전히 더 개선되어야 한다.
따라서, 현재 외래 유전자를 높은 효율로 통합하는 동시에 통합 기능을 제때 차단할 수 있는 고효율의 일원 트랜스포존 시스템이 여전히 부족하다.
발명자는 피기백 트랜스포존 기반의 통합 시스템을 구축하였으며, 해당 시스템은 숙주 세포 내에서 외래 유전자의 고효율 통합 및 안정적인 고효율 발현을 매개할 수 있다.
본 발명의 일 양상은 핵산 구축물에 관한 것으로, 여기에는 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 요소가 포함되거나 이로 구성된다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포사제 암호화 서열, 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR, 제2 polyA 서열 및 관심 외래 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함한다.
본 발명은 핵산 구축물을 더 제공하며, 여기에는 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터 요소가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR, 제2 polyA 서열 및 관심 외래 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포사제 암호화 서열, 상기 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 상기 5' UTR 및 상기 제2 polyA 서열 중 어느 하나 이상은 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이의 영역 밖에 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 다클론 삽입 부위는 상기 외래 유전자의 암호화 서열 및 임의 선택된 외래 유전자 발현을 제어하는 프로모터를 작동 가능하도록 삽입하는 데 사용된다.
하나 이상의 구현예에서, 제1 polyA 서열과 제2 polyA 서열의 테일링 신호 기능의 방향은 동일하거나 반대이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포사제의 발현 카세트의 방향과 외래 유전자 발현 카세트의 방향은 동일하거나 반대이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포사제의 발현 카세트의 방향과 트랜스포존 3' 말단 반복 서열 및 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이 서열의 방향은 동일하거나 반대이다.
하나 이상의 구현예에서, 상술한 각각의 요소는 각각 독립적으로 단일 카피(single-copy) 또는 다중 카피(multy-copy)이다.
하나 이상의 구현예에서, 상술한 각각의 요소는 직접 연결되거나 링커 또는 효소 절단 부위를 통해 연결된다.
본 발명의 어느 하나에 따른 핵산 구축물에서, 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 위치는 서로 호환될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열이 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열이다. 바람직한 구현예에서, 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 다클론 삽입 부위의 서열은 SEQ ID NO: 2로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 제1 polyA 서열은 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 제2 polyA 서열은 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 인핸서는 CMV 인핸서 서열, SV40 인핸서 서열, 인간 ε 글로불린 5' HS2 인핸서, 닭 β 글로불린 유전자 5' HS4 인핸서로부터 선택된다. 바람직하게는, 인핸서 서열은 SEQ ID NO: 4, 26 내지 28 중 어느 하나로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열은 SEQ ID NO: 5 또는 15로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열은 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열이다. 바람직한 구현예에서, 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제이다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 피기백 트랜스포사제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 36으로 표시되고, 바람직하게는, 상기 피기백 트랜스포사제의 암호화 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 5' UTR 서열은 C3 유전자, ORM1 유전자, HPX 유전자, FGA 유전자, AGXT 유전자, ASL 유전자, APOA2 유전자, ALB 유전자의 5' UTR로부터 선택된다. 바람직하게는, 5' UTR 서열은 SEQ ID NO: 8, 17 내지 24 중 어느 하나로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, miniCMV 프로모터, CMV53 프로모터, miniSV40 프로모터, miniTK 프로모터, MLP 프로모터, pJB42CAT5 프로모터, YB_TATA 프로모터, EF1α 프로모터, SV40 프로모터, UbiquitinB 프로모터, CAG 프로모터, HSP70 프로모터, PGK-1 프로모터, β-actin 프로모터, TK 프로모터 및 GRP78 프로모터로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 miniCMV 프로모터, CMV53 프로모터, miniSV40 프로모터, miniTK 프로모터, MLP 프로모터, pJB42CAT5 프로모터 및 YB_TATA로부터 선택된다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 9, 37 내지 42 중 어느 하나로 표시된다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 miniCMV 프로모터이며, 이의 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포사제 암호화 서열은 단일 카피 또는 다중 카피의 핵 위치 신호 암호화 서열을 포함하거나 작동 가능하도록 연결된다. 하나 이상의 구현예에서, 핵 위치 신호는 c-myc 핵 위치 신호이며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 35로 표시되는 서열을 갖는다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 10 또는 14로 표시되는 서열을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 재조합 벡터이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 재조합 클로닝 벡터 또는 재조합 발현 벡터이다.
본 발명은 숙주 세포를 더 제공하며, 여기에는 (1) 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물, 및/또는 (2) 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물의 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이의 서열이 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 숙주 세포는 면역 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, CIK 세포, LAK 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(CTL), 수지상 세포(DC), 종양 침윤 림프구(TIL), 대식 세포, NK T 세포 및 γδT 세포 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물 또는 숙주 세포 및 약학적으로 허용 가능한 보조제가 포함된다.
본 발명은 약물, 시약 또는 도구로서 또는 이의 제조에서 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물 또는 숙주 세포의 용도를 더 제공하며, 상기 약물, 시약 또는 도구는 외래 유전자 발현 카세트를 표적 세포 게놈에 통합하는 데 사용되거나, 유전자 치료, 세포 치료, 줄기 세포 유도 또는 분화에 사용된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 표적 세포는 포유동물 세포이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 표적 세포는 T 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로부터 선택된다.
본 발명은 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 방법을 더 제공하며, 여기에는 외래 유전자와 임의 선택된 그 프로모터를 함유하는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물을 상기 세포에 도입하는 단계, 및 임의 선택된 트랜스포사제가 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 도입은 바이러스 매개의 형질전환, 미세 주사, 입자 충격, 유전자총 형질전환, 전기천공 등을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 도입은 전기천공이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 세포는 적어도 3회 계대 배양한다.
본 발명은 본원에 따른 방법으로 획득한 게놈에 외래 유전자 또는 그 발현 카세트가 통합된 세포를 더 제공한다.
도 1a 및 도 1b는 본원에 따른 핵산 구축물의 개략도이다.
도 2는 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP로 각각 전기천공된 Jurkat 세포의 형광 사진이다.
도 3은 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 각각 전기천공된 Jurkat 세포의 유세포 분석 결과이다.
도 4는 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP로 각각 전기천공된 Jurkat 세포의 생세포 수이다.
도 5는 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 각각 전기천공된 Jurkat 세포에서 PB 트랜스포사제의 발현 수준이다.
도 6은 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP으로 각각 전기천공된 K562 세포의 형광 사진이다.
도 7은 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP으로 각각 전기천공된 K562 세포의 생세포 수이다.
도 8은 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP와 pKB202-EGFP으로 각각 전기천공된 K562 세포의 유세포 분석 결과이다.
도 9는 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP으로 각각 전기천공된 K562 세포의 형광 양성률이다.
도 10은 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP로 각각 전기천공된 1차 T 세포의 형광 사진이다.
도 11은 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 각각 전기천공된 T 세포의 유세포 분석 결과이다.
도 12는 이중 플라스미드 PB 전위 시스템 전기천공된 Jurkat 세포의 양성률 결과이다.
도 13은 이중 플라스미드 PB 전위 시스템 전기천공된 1차 T 세포의 양성률 결과이다.
도 14는 감소된 플라스미드 용량을 사용하여 pKB20-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포의 양성률이다.
도 15는 시간 경과에 따른 세포 내 벡터의 잔류 카피 수의 변화이다.
도 16은 pKB2003-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포의 양성률이다.
도 17은 pKB205-EGFP로 전기천공된 1차 T 세포의 양성률이다.
도 18은 K562 샘플 1에서 pKB20 벡터에 의해 매개된 게놈 통합 부위의 개략도이다.
도 19는 K562 샘플 2에서 pKB20 벡터에 의해 매개된 게놈 통합 부위의 개략도이다.
도 20은 Jurkat 샘플 1에서 pKB20 벡터에 의해 매개된 게놈 통합 부위의 개략도이다.
도 21은 Jurkat 샘플 2에서 pKB20 벡터에 의해 매개된 게놈 통합 부위의 개략도이다.
도 22는 pKB20-HER2CAR로 전기천공된 1차 T 세포의 양성률의 유세포 분석 결과이다.
도 23은 HER2CAR-T 세포의 표적 세포 SKOV-3에 대한 생체외 RTCA 사멸 결과이다.
도 24는 pKB20-NY-ESO-1 TCR로 전기천공된 1차 T 세포의 양성률의 유세포 분석 결과이다.
도 25는 NY-ESO-1 TCR-T의 표적 세포 A375에 대한 생체외 RTCA 사멸 결과이다.
도 26은 pNB328-EGFP로 전기천공된 K562 세포의 양성률 유세포 분석 결과이다.
도 27은 pNB328-EGFP로 전기천공된 1차 T 세포의 양성률 유세포 분석 결과이다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상술한 각각의 기술적 특징과 이하(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명하는 각각의 기술적 특징은 모두 서로 조합되어, 바람직한 기술적 해결책을 구성할 수 있음을 유의해야 한다.
문맥상 달리 설명되지 않는 한, 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태 "하나", "한 종류" 및 "상기"는 복수의 의미를 포함한다. 마찬가지로, 용어 "하나"(또는 "한 종류"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 서로 호환될 수 있다. 용어 "포함" 및 이의 변화 형태는 제한적 의미를 갖지 않으며, 여기에서 이러한 용어는 본 명세서와 청구범위에 출현한다. 따라서, 용어 "포함", "포괄" 및 "함유"는 서로 호환될 수 있다.
핵산 구축물과 세포
용어 "핵산 구축물"은, 본원에서 단일 결합 또는 이중 결합 핵산 분자로 정의되며, 바람직하게는 인공 구축된 핵산 분자를 의미한다. 선택적으로, 상기 핵산 구축물은 작동 가능하도록 연결된 1개 이상의 조절 서열을 더 포함하며, 상기 조절 서열은 그 상용성 조건 하에서 적합한 숙주 세포에서 암호화 서열이 발현되도록 지도할 수 있다. 발현은 단백질 또는 폴리펩티드의 생산에 관련된 임의 단계를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 여기에는 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원에 따른 전위 시스템은 바람직하게는 일원 핵산 구축물이며, 즉 하나의 핵산 구축물이 고효율 전위를 구현할 수 있다.
본 발명에서, 특별한 설명이 없는 경우, 트랜스포사제 발현 카세트의 방향을 역방향으로 한다. 상술한 "하기 요소를 순차적으로 포함"에서 "순차적"이 가리키는 방향 및/또는 순서는 업스트림으로부터 다운스트림까지를 의미한다. 본 발명에서, 특별한 설명이 없는 한, 상술한 "정방향"을 따르는 방향은 업스트림으로부터 다운스트림까지이며, 상술한 "역방향"을 따르는 방향은 다운스트림으로부터 업스트림까지이다.
본 발명에서, 용어 "발현 카세트"는 하나의 유전자를 발현하는 데 필요한 완전한 요소이며, 여기에는 프로모터, 유전자 암호화 서열, PolyA 테일링 신호 서열이 포함된다.
용어 "조작 가능하도록 삽입/연결"은 본원에서, 조절 서열이 단백질 또는 폴리펩티드의 발현을 지도하도록, 조절 서열이 DNA 서열의 암호화 서열에 상대적인 적절한 위치에 위치하는 형태로 정의된다. 본 발명의 핵산 구축물에서, 다클론 부위는 DNA 재조합 기술을 통해 하나 이상의 동일하거나 상이한 외래 유전자 및 외래 유전자 발현을 제어하는 선택적 프로모터가 작동 가능하도록 삽입되거나, 그 다클론 부위가 하나 이상의 동일하거나 상이한 외래 유전자 암호화 서열 및 외래 유전자 발현을 제어하는 선택적 프로모터로 치환된다. 상기 "작동 가능하도록 연결"은 DNA 재조합의 수단을 통해 구현할 수 있으며, 구체적으로, 상기 핵산 구축물은 재조합 핵산 구축물이다.
본원에 따른 "외래 유전자"는 숙주 세포 게놈에 전위된 후 발현되거나 기능하는, 임의 유래의 핵산 분자일 수 있다. 외래 유전자의 비제한적인 예시에는 루시페라아제 리포터 유전자(예를 들어 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 등), 루시페라아제 유전자(예를 들어 파이어플라이 루시페라아제, 레닐라 루시페라아제 등), 천연 기능성 단백질 유전자, RNAi 유전자 및 인공 키메라 유전자(예를 들어 키메라 항원 수용체 유전자, Fc 융합 단백질 유전자, 전장 항체 유전자)가 포함된다.
용어 "암호화 서열"은 본원에서 핵산 서열 중 그 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 결정하는 부분으로 정의된다. 암호화 서열의 경계는 통상적으로 mRNA 5' 말단 오픈 리딩 프레임 업스트림에 바로 인접한 리보솜 결합 부위(원핵 세포에 대해)와 mRNA 3' 말단 오픈 리딩 프레임 다운스트림에 바로 인접한 전사 종결 서열에 의해 결정된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "조절 서열"은 본 발명의 펩티드 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각각의 조절 서열은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 대해 자연적으로 함유된 것이거나 외부에서 유래된 것일 수 있다. 이러한 조절 서열은 선도 서열, polyA 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열 및 전사 터미네이터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 최소한, 조절 서열은 프로모터 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함해야 한다. 특정한 제한 부위를 도입하여 조절 서열과 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 암호화 영역을 연결하기 용이하도록, 링커를 휴대한 조절 서열을 제공할 수 있다.
조절 서열은 적합한 프로모터 서열, 즉 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포에 의해 식별될 수 있는 핵산 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 단백질 또는 폴리펩티드 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터 서열은 통상적으로 발현될 단백질의 암호화 서열과 작동 가능하도록 연결된다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 여기에는 돌연변이된 프로모터, 절단된 프로모터 및 하이브리드 프로모터가 포함되며, 해당 숙주 세포와 상동성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 획득할 수 있다.
조절 서열은 적합한 전사 종결 서열, 즉 숙주 세포에 의해 식별되어 전사를 종결시킬 수 있는 한 단락의 서열일 수도 있다. 종결 서열은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동 가능하도록 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 임의의 종결자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
조절 서열은 적합한 선도 서열, 즉 숙주 세포 번역에 매우 중요한 mRNA 비번역 영역일 수도 있다. 선도 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동 가능하도록 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 임의의 종결자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
조절 서열은 신호 펩티드 암호화 영역일 수도 있으며, 해당 영역은 단백질 또는 폴리펩티드 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 암호화하며, 암호화된 폴리펩티드를 세포 분비 경로에 진입하도록 안내할 수 있다. 핵산 서열 암호화 영역의 5' 말단은 번역 리딩 프레임과 일치하며 분비된 폴리펩티드의 암호화 영역 단편과 자연적으로 연결된 신호 펩티드 암호화 영역을 자연적으로 함유할 수 있다. 또는 암호화 영역의 5' 말단은 암호화 서열에 대해 외래 신호 펩티드 암호화 영역을 포함할 수 있다. 암호화 서열이 정상적인 상황에서 신호 펩티드 암호화 영역을 포함하지 않을 때, 외래 신호 펩티드 암호화 영역을 추가할 필요가 있을 수 있다. 또는, 외래 신호 펩티드 암호화 영역을 이용하여 자연의 신호 펩티드 암호화 영역을 간단히 치환하여 폴리펩티드 분비를 강화할 수 있다. 그러나, 사용된 숙주 세포의 분비 경로로 발현된 폴리펩티드가 유입되도록 안내할 수 있는 임의의 신호 펩티드 암호화 영역은 모두 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 포함한다. 상기 핵산 구축물은 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR 및 제2 polyA 서열로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함할 수 있다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하며, 이는 도 1a에 도시된 바와 같다. 특히 바람직한 다른 일 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하며, 이는 도 1b에 도시된 바와 같다. 본원에 따른 핵산 구축물에서 각각의 요소는 각각 독립적으로 단일 카피 또는 다중 카피이다.
본원에서, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 위치는 호환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열은 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열이고; 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열은 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열이다.
본원에서, 트랜스포사제는 바람직하게는 피기백 트랜스포사제이고, 이의 암호화 서열은 단일 카피 또는 다중 카피의 핵 위치 신호 암호화 서열을 함유하거나 작동 가능하도록 연결되어, 전위 효율을 향상시킨다. 예시적으로 피기백 트랜스포사제 암호화 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시된다. 예시적으로 핵 위치 신호 암호화 서열은 SEQ ID NO: 35로 표시된다.
본 발명의 핵산 구축물은 트랜스포사제와 외래 유전자에 대해 polyA 서열을 사용할 수 있다. 이러한 설계는 어느 정도 핵산 구축물의 전장을 단축시킬 수 있으며, 더욱 긴 외래 유전자를 편입시켜 전위를 수행하는 데 도움이 된다. 또는, 본 발명의 핵산 구축물은 트랜스포사제와 외래 유전자에 대해 분리된 polyA 서열을 사용할 수도 있으며, 이들 둘의 테일링 신호 기능의 방향은 동일하거나 반대일 수 있다. 이러한 설계는 동일한 양방향 polyA 서열을 공유하여 두 방향이 대향하는 발현 카세트의 상호간 영향을 방지한다. 본원에 사용된 polyA 서열은 양방향 전사 종결 기능을 가질 수도 있고, 갖지 않을 수도 있다. 바람직하게는, polyA 서열은 독립적으로 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로부터 선택된다.
본 발명의 핵산 구축물은 트랜스포사제와 외래 유전자에 대해 전사 종결을 위해 인슐레이터 서열을 사용할 수도 있거나, 추가로 사용할 수 있다. 따라서, 임의 polyA 서열의 임의 말단에 인슐레이터 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 인슐레이터 서열은 트랜스포존 5' 말단 반복 서열과 트랜스포존 3' 말단 반복 서열 사이에 위치한다. 본원에 사용된 인슐레이터 서열은 전사 종결 기능을 가지며, 해당 서열은 당업계에 공지된 전사 종결 기능을 갖는 임의 서열일 수 있다. 바람직하게는, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열은 SEQ ID NO: 5 또는 15로 표시된다.
따라서, 트랜스포사제는 polyA 서열, 인슐레이터 서열, 또는 polyA 서열과 인슐레이터 서열을 사용하여 전사 종결을 구현할 수 있고; 외래 유전자는 polyA 서열, 인슐레이터 서열, 또는 polyA 서열과 인슐레이터 서열을 사용하여 전사 종결을 구현할 수 있다. 바람직하게는, 임의의 상기 인슐레이터 서열은 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열과 트랜스포존 3' 말단 반복 서열 사이에 위치한다.
본 발명의 핵산 구축물에서, 적합한 트랜스포사제의 프로모터 서열은 작동 가능하도록 그 위에 연결된 트랜스포사제가 높은 수준으로 발현되도록 유도할 수 있는 프로모터 서열이며, 여기에는 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, EB 바이러스 즉시형 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 및 인간 유전자 프로모터가 포함되나 이에 한정되지 않으며, 인간 유전자프로모터에는 예를 들어 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헴 프로모터 및 크레아틴 키나아제 프로모터가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 구현예에서, 트랜스포사제의 프로모터는 CMV 프로모터, miniCMV 프로모터, CMV53 프로모터, miniSV40 프로모터, miniTK 프로모터, MLP 프로모터, pJB42CAT5 프로모터, YB_TATA 프로모터, EF1α 프로모터, SV40 프로모터, UbiquitinB 프로모터, CAG 프로모터, HSP70 프로모터, PGK-1 프로모터, β-actin 프로모터, TK 프로모터 및 GRP78 프로모터로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 miniCMV 프로모터, CMV53 프로모터, miniSV40 프로모터, miniTK 프로모터, MLP 프로모터, pJB42CAT5 프로모터 및 YB_TATA 프로모터로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 프로모터는 miniCMV 프로모터이다. miniCMV프로모터는 CMV 프로모터보다 훨씬 짧아, 벡터 길이가 더욱 짧으므로, 더 큰 외래 유전자를 통합하는 데 유리하다. 하나 이상의 구현예에서, miniCMV프로모터와 트랜스포사제 사이에 5' UTR 서열을 추가하여 전사 및 번역을 강화한다. 5' UTR 서열은 SEQ ID NO: 8, 17 내지 24 중 어느 하나로 표시될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물은 인핸서를 포함할 수 있으며, 해당 인핸서는 본원에 따른 핵산 구축물에서 인핸서를 제외한 임의 요소의 임의 말단에 위치할 수 있다. 바람직하게는, 인핸서는 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이에 위치한다. 보다 바람직하게는, 인핸서는 제1 polyA 서열의 다운스트림에 위치한다. 인핸서 서열은 SEQ ID NO: 4, 25 내지 28 중 어느 하나로 표시될 수 있다. 본원에서, 핵산 구축물은 상기 5' UTR 서열과 인핸서 서열을 포함하지 않거나, 둘 중 하나를 포함하거나, 둘 다 포함할 수 있으며, 획득된 핵산 구축물은 모두 외래 유전자를 세포 게놈에 고효율로 통합할 수 있다.
숙주 세포의 성장 상황에 따라 폴리펩티드 발현을 조절하는 조절 서열의 추가가 필요할 수도 있다. 조절 시스템의 예시는 화학적 또는 물리적 자극물(조절 화합물이 있는 경우 포함)에 반응하여, 유전자 발현을 개방하거나 차단할 수 있는 시스템이다. 조절 서열의 기타 예시는 유전자를 증폭시킬 수 있는 조절 서열이다. 이러한 예시에서, 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 조절 서열과 작동 가능하도록 연결해야 한다.
1개의 polyA 신호 서열을 함유한 구체적인 구현예에서, 본 발명의 핵산 구축물은 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열(3' ITR)(SEQ ID NO: 1), 다클론 부위(SEQ ID NO: 2), polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 3, 13 또는 16), 임의 선택된 인핸서 모티프 서열(SEQ ID NO: 4, 25 내지 28 중 어느 하나), 인슐레이터 서열(SEQ ID NO: 5 또는 15), 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열(5' ITR)(SEQ ID NO: 6)의 역방향 상보적 서열, 피기백 트랜스포사제 암호화 서열(SEQ ID NO: 7)의 역방향 상보적 서열, 임의 선택된 5' UTR 서열(SEQ ID NO: 8, 17 내지 24 중 어느 하나)의 역방향 상보적 서열 및 miniCMV 프로모터 서열(SEQ ID NO: 9)의 역방향 상보적 서열을 순차적으로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열을 포함한다.
2개의 polyA 신호 서열을 함유한 구체적인 구현예에서, 본 발명의 핵산 구축물은 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열(3' ITR)(SEQ ID NO: 1), 다클론 부위(SEQ ID NO: 2), 제1 polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 3, 13 또는 16), 임의 선택된 인핸서 모티프 서열(SEQ ID NO: 4, 25 내지 28 중 어느 하나), 인슐레이터 서열(SEQ ID NO: 5 또는 15), 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열(5' ITR)(SEQ ID NO: 6), miniCMV 프로모터 서열(SEQ ID NO: 9), 임의 선택된 5' UTR 서열(SEQ ID NO: 8, 17 내지 24 중 어느 하나), 피기백 트랜스포사제 암호화 서열(SEQ ID NO: 7) 및 제2 polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 3, 13 또는 16)을 순차적으로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 본 발명의 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 14로 표시되는 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 구축물은 재조합 벡터이다. 재조합 벡터는 재조합 클로닝 벡터일 수 있으며, 재조합 발현 벡터일 수도 있다. 본 발명의 핵산 구축물의 각각의 요소는 많은 유형의 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드로 로딩될 수 있다. 통상적으로, 적합한 벡터는 적어도 일종의 유기체에서 작용하는 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 효소 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다.
운반된 유전자의 발현을 평가하기 위해, 세포에 도입된 벡터는 세포군으로부터 세포를 동정 및 선택하기 용이하도록, 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 어느 하나 또는 둘을 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커는 단독으로 일 단락의 DNA에 휴대되어 코트랜스펙션(cotransfecti) 과정에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커와 리포터 유전자는 숙주 세포에서 발현이 용이하도록 이들 둘의 측면에 모두 적당한 조절 서열을 가질 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커에는 Flag, HA 또는 V5가 포함된다. 리포터 유전자는 잠재적으로 트랜스펙션된 세포를 동정하고 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. DNA가 수용체 세포에 도입된 후, 리포터 유전자의 발현은 적절한 시기에 측정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라아제(luciferase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 클로람페니콜아세틸 전달효소(chloramphenicol acetyltransferase), 분비형 알칼라인 포스파타제(secreted alkaline phosphatase) 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
재조합 클로닝 벡터는 본 발명의 핵산 구축물의 각각의 요소와 선택 가능한 외래 유전자를 함유하는 암호화 서열을 제공하는 데 사용될 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 본 발명의 핵산 구축물의 각각의 요소와 pUC18, pUC19, pMD18-T, pMD19-T, pGM-T 벡터, pUC57, pMAX 또는 pDC315 계열 벡터가 재조합을 거쳐 획득된 재조합 벡터일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 적합한 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구축물의 각각의 요소를 통해 외래 유전자 발현 카세트를 게놈에 통합하고 발현시키는 데 사용될 수 있다. 상기 벡터는 진핵 세포의 복제와 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열 발현을 조절하는 데 사용할 수 있는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 본 발명의 핵산 구축물의 각각의 요소와 pCDNA3 계열 벡터, pCDNA4 계열 벡터, pCDNA5 계열 벡터, pCDNA6 계열 벡터, pRL 계열 벡터, pUC57 벡터, pMAX 벡터 또는 pDC315 계열 벡터가 재조합을 거쳐 획득된 재조합 벡터이다.
재조합 벡터(재조합 클로닝 벡터 또는 재조합 발현 벡터)는 재조합 바이러스 벡터일 수 있으며, 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 단순 포진 바이러스 벡터 또는 재조합 백시니아 바이러스 벡터가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 공지된 것이며, 예를 들어 Sambrook 등(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학과 분자 생물학 매뉴얼에 설명되어 있다.
본원에 따른 핵산 구축물은 통상적으로 PCR 증폭 방법에 의해 수득될 수 있다. 구체적으로 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열, 특히 오픈리딩프레임 서열에 따라 설계할 수 있으며, 시판되는 cDNA 라이브러리 또는 당업자에게 공지된 통상적인 방법으로 제조된 cDNA 라이브러리를 템플릿으로 사용하여 관련 서열을 증폭시킬 수 있다. 서열이 비교적 긴 경우, 종종 2회 이상의 PCR 증폭을 수행한 후, 다시 매회 증폭된 단편을 올바른 순서에 따라 함께 스플라이싱해야 한다. 또는 본원에 따른 핵산 구축물을 직접 합성할 수도 있다.
본 발명은 본원에서 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. 숙주 세포는 포유동물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 구축물 또는 벡터를 제공하기 위한, 대장균 세포와 같은 포유동물 세포 생성 과정에서 사용되는 각종 세포도 포함한다. 일부 구현예에서, 본원은 본원에 따른 핵산 구축물 또는 벡터를 함유하는 포유동물 세포를 제공하며, 여기에는 T 세포, B 세포, CIK 세포, LAK 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(CTL), 수지상 세포(DC), 종양 침윤 림프구(TIL), 대식 세포, NK T 세포, γδT 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
약학 조성물
본 발명의 약학 조성물은 본원에 따른 핵산 구축물 또는 세포 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함한다. 본 발명에서, "약학적으로 허용 가능한 보조제"는 본 발명의 핵산 구축물 또는 세포를 동물 또는 사람에게 전달하는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 담체, 용제, 현탁제 또는 부형제이다. 본원에서, 약학적으로 허용 가능한 보조제는 사용되는 용량과 농도에서 상기 조성물의 수용자에게 무독한 것이다. 당업계에서 공지된 치료에서 생물학적 제제 전달에 일반적으로 사용되는 다양한 유형의 담체 또는 부형제가 포함될 수 있다. 예시적으로 보조제는 액체 또는 고체일 수 있으며, pH 조절제, 계면활성제, 탄수화물, 아쥬반트, 항산화제, 킬레이트제, 이온강도 증강제, 방부제, 담체, 유동화제, 감미료, 염료/착색제, 향미 증진제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장제, 용제 또는 유화제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 보조제는 하나 이상의 비활성 성분을 포함할 수 있으며, 안정제, 방부제, 첨가제, 아쥬반트, 분무제, 압축 공기 또는 기타 적합한 가스, 또는 기타 적합한 약효 화합물과 함께 사용되는 비활성 성분을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 적합한 보조제는 당업계에서 전위 시스템 또는 이를 함유한 세포 투여에 일반적으로 사용되는 보조제일 수 있다. 보조제의 예시에는 다양한 젖당, 마니톨, 옥수수유와 같은 오일, 피기백S, 식염수, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 폴리프로필렌 글리콜, 디메틸술폭시드와 같은 완충제, 디메틸아세트아미드와 같은 아미드, 알부민과 같은 단백질, 폴리솔베이트 80과 같은 세정제, 포도당, 젖당, 시클로덱스트린 및 전분과 같은 단당류 및 올리고다당류가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
기타 약학 조성물은 당업자에게 자명할 것이며, 지속적 또는 제어적 방출 전달 제제에는 본원에 따른 핵산 구축물 또는 세포의 제제가 포함된다. 다양한 기타 지속적 또는 제어적 전달 방식을 제형화하는 기술(예를 들어 리포솜 비히클, 생분해성 미립자 또는 다공성 비드, 및 데포 주사)도 당업자에게 공지된 것이다.
생체내 투여용 약학 조성물은 통상적으로 멸균 제제 형태로 제공된다. 멸균 여과막을 거친 여과를 통해 멸균을 구현한다. 조성물 동결 건조 시, 동결 건조 및 재수화 전 또는 후에 이 방법을 사용하여 멸균을 수행할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결 건조 형태 또는 용액으로 보관할 수 있다. 비경구 조성물은 통상적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어 피하 주사바늘로 구멍을 뚫을 수 있는 마개가 구비된 정맥 내 용액 스트립 또는 바이알에 넣는다.
통상적으로, 조성물에는 치료 유효량의 본원에 따른 시약이 함유된다. 치료 유효량은 피험자에게서 질병 또는 증상을 치료, 예방, 경감 및/또는 완화할 수 있는 용량을 의미한다. 이러한 효과는 상응하는 기능을 가진 외래 유전자를 삽입함으로써 구현할 수 있으며, 상기 상응하는 기능의 외래 유전자는 치료 기능 또는 유도 기능과 같은 구체적인 용도에 상응하는 기능을 갖는다. 환자의 연령, 성별, 질병 및 그 중증도, 환자의 기타 신체적 상태 등과 같은 요인에 따라 치료 유효량을 결정할 수 있다. 치료 유효량은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 유효한 치료 방안에 따라 다중 용량으로 투여될 수 있다. 본원에서, 피험자 또는 환자는 통상적으로 포유동물, 특히 사람을 의미한다. 예시적으로, 상기 조성물은 예를 들어 0.001% 내지 50%, 바람직하게는 0.01% 내지 30%, 보다 바람직하게는 0.05% 내지 10%의 중량비에 따라 본원에 기술된 핵산 구축물 또는 세포를 함유한다.
본원에 따른 조성물은 상기 외래 유전자에 의해 구현되는 기능과 유사하거나 상응하는 기능을 갖는 기타 시약과 병용될 수 있다. 예를 들어 상기 외래 유전자에 의해 치료되는 질병 또는 증상을 치료하는 시약과 병용된다. 당업자는 기타 시약의 투여 용량을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 제형은 다양할 수 있으며, 활성 성분이 포유동물 유기체에 효과적으로 도달할 수 있는 제형이라면 모두 가능하고, 단위 제형의 형태로 제조될 수 있다. 제형은 예를 들어 겔, 에어로졸, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 시럽, 용액, 현탁액, 주사제, 산제, 환제, 방출 조절제, 수액제, 현탁제 등으로부터 선택될 수 있다. 본원에 따른 핵산 구축물 또는 세포에 의해 예방 및 치료되는 질병 유형에 따라, 당업자는 적용하기 용이한 제형을 선택할 수 있다. 제조 및 보관 용이성 측면에서 볼 때, 바람직한 조성물은 고체 상태 조성물이며, 특히 정제 및 고체 충전 또는 액체 충전 캡슐이다. 본원에 따른 핵산 구축물 또는 세포 또는 이의 조성물은 주사 또는 점적에 적합한 소독 기구에 보관될 수도 있다. 본원에 따른 핵산 구축물 또는 세포 또는 이의 조성물은 적당한 용기에 보관되고, 키트 또는 약 상자에 놓일 수도 있다.
방법 및 용도
본 발명자는 연구 과정에서, 본원의 핵산 구축물이 제어 가능한 방식으로 외래 유전자의 게놈 통합을 고효율로 구현할 수 있음을 발견하였다. 외래 유전자가 게놈에 통합된 후, 피기백 트랜스포사제의 전사 발현을 효과적으로 종결할 수 있으며, 동시에 외래 유전자 발현 카세트 인슐레이터 기능을 발휘하여, 통합된 외래 유전자 발현 카세트가 통합 부위 근처 유전자 발현에 미치는 영향을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 방법에 관한 것으로, 여기에는 외래 유전자와 임의 선택된 그 프로모터를 포함하는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물을 상기 세포에 도입하는 단계, 및 임의 선택된 피기백 트랜스포사제가 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계가 포함된다. 본 발명은 상술한 방법으로 획득한 게놈에서 외래 유전자 또는 그 발현 카세트가 통합된 세포를 더 제공한다.
핵산 구축물을 세포에 도입하는 방법은 당업계에 이미 공지된 것이다. 벡터는 당업계에서 임의 방법을 통해 용이하게 숙주 세포, 예를 들어 포유 동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단을 통해 숙주 세포에 이동될 수 있다. 예시적으로 물리적 또는 화학적 방법에는 인산칼슘 침전, 리포펙션, 현미주사, 입자 충격, 미세주입, 유전자총 형질전환, 전기천공, 콜로이드 분산 시스템, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 지질 기반 시스템(수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜)이 포함된다. 핵산 구축물을 숙주 세포에 도입하는 생물학적 방법에는 바이러스 매개의 형질전환, 특히 레트로바이러스 벡터가 포함된다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 선택된 핵산 서열을 벡터에 삽입하고 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 상기 재조합 바이러스는 이어서 분리되어 생체내 또는 생체외 대상 세포에 전달될 수 있다. 바이러스 패키징에 사용되는 시약은 당업계에 공지된 것이며, 예를 들어 일반적인 렌티바이러스 벡터 시스템에는 pRsv-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G 및 표적 간섭 플라스미드가 포함된다.
본 발명은 약물, 시약 또는 도구로서 또는 이의 제조에서 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 구축물 또는 숙주 세포의 용도를 더 제공하며, 상기 약물, 시약 또는 도구는 외래 유전자 발현 카세트를 표적 세포 게놈에 통합하는 데 사용되거나, 유전자 치료, 세포 치료, 줄기 세포 유도 또는 분화에 사용된다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 표적 세포는 포유동물 세포이며, 여기에는 T 세포, B 세포, CIK 세포, LAK 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(CTL), 수지상 세포(DC), 종양 침윤 림프구(TIL), 대식 세포, NK T 세포, γδT 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
예시적 구현예
항목 1. 핵산 구축물로서, 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 요소를 포함하거나 이로 구성된다.
바람직하게는, 상기 핵산 구축물은 트랜스포사제 암호화 서열, 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR, 제2 polyA 서열 및 관심 외래 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 트랜스포사제 암호화 서열, 상기 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 상기 5' UTR 및 상기 제2 polyA 서열 중 어느 하나 이상은 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이의 영역 밖에 있다.
항목 2. 항목 1에 따른 핵산 구축물에 있어서, 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터 요소를 포함한다.
바람직하게는, 상기 핵산 구축물은 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR, 제2 polyA 서열 및 관심 외래 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함한다.
항목 3. 항목 2에 따른 핵산 구축물도 다음과 같은 특징을 갖는다:
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하고,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함한다.
항목 4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 핵산 구축물은 다음과 같은 특징들 중 선택된 하나 이상의 특징을 갖는다:
상기 트랜스포사제의 발현 카세트의 방향과 외래 유전자의 발현 카세트의 방향이 동일하거나 반대이다;
상기 트랜스포사제의 발현 카세트의 방향과 트랜스포존 3' 말단 반복 서열 및 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이 서열의 방향이 동일하거나 반대이다;
상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 위치가 상호 호환될 수 있다;
상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열은 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열이다;
상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열은 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열이다;
상기 인핸서는 CMV 인핸서 서열, SV40 인핸서 서열, 인간 ε 글로불린 5' HS2 인핸서, 닭 β 글로불린 유전자 5' HS4 인핸서로부터 선택된다;
상기 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제이다;
상기 5' UTR은 C3 유전자, ORM1 유전자, HPX 유전자, FGA 유전자, AGXT 유전자, ASL 유전자, APOA2 유전자, ALB 유전자의 5' UTR로부터 선택된다;
상기 프로모터는 CMV 프로모터, miniCMV 프로모터, CMV53 프로모터, miniSV40 프로모터, miniTK 프로모터, MLP 프로모터, pJB42CAT5 프로모터, YB_TATA 프로모터, EF1α 프로모터, SV40 프로모터, UbiquitinB 프로모터, CAG 프로모터, HSP70 프로모터, PGK-1 프로모터, β-actin 프로모터, TK 프로모터 및 GRP78 프로모터로부터 선택된다; 그리고
상기 트랜스포사제 암호화 서열은 단일 카피 또는 다중 카피의 핵 위치 신호 암호화 서열을 포함하거나 작동 가능하도록 연결된다.
항목 5. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 핵산 구축물은 다음과 같은 특징들 중 선택된 하나 이상의 특징을 갖는다:
상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 1로 표시된다;
상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6으로 표시된다;
상기 다클론 삽입 부위의 서열이 SEQ ID NO: 2로 표시된다;
상기 제1 polyA 서열이 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로 표시된다;
상기 제2 polyA 서열이 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로 표시된다;
상기 인핸서 서열이 SEQ ID NO: 4, 26 내지 28 중 어느 하나로 표시된다;
상기 인슐레이터 서열이 SEQ ID NO: 5 또는 15로 표시된다;
상기 피기백 트랜스포사제의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 36으로 표시되고, 바람직하게는, 상기 피기백 트랜스포사제의 암호화 서열이 SEQ ID NO: 7로 표시된다;
상기 5' UTR 서열이 SEQ ID NO: 8, 17 내지 24 중 어느 하나로 표시된다;
상기 프로모터의 서열이 SEQ ID NO: 9, 37 내지 42 중 어느 하나로 표시된다; 그리고
상기 핵 위치 신호가 c-myc 핵 위치 신호이고, 바람직하게는, 상기 핵 위치 신호가 SEQ ID NO: 35로 표시되는 서열을 갖는다:
항목 6. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 10 또는 14로 표시되는 서열을 포함하거나,
상기 핵산 구축물은 재조합 벡터이고, 바람직하게는, 상기 핵산 구축물은 재조합 클로닝 벡터 또는 재조합 발현 벡터인 것을 특징으로 한다.
항목 7. 일종의 숙주 세포에 있어서,
(1) 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 따른 핵산 구축물, 및/또는
(2) 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 따른 핵산 구축물의 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이의 서열을 포함하고,
바람직하게는, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이고,
보다 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 T 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로부터 선택된다.
항목 8. 일종의 약학 조성물에 있어서, 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 따른 핵산 구축물 또는 항목 7에 따른 숙주 세포 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함한다.
항목 9. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 따른 핵산 구축물 또는 항목 7에 따른 숙주 세포의 약물, 시약 또는 도구의 제조에서의 용도 또는 약물, 시약 또는 도구의 용도로서, 상기 약물, 시약 또는 도구는 외래 유전자 발현 카세트를 표적 세포 게놈에 통합하는 데 사용되거나, 유전자 치료, 세포 치료, 줄기 세포 유도 또는 분화에 사용되고,
바람직하게는, 상기 표적 세포는 포유동물 세포이고,
보다 바람직하게는, 상기 표적 세포는 면역 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로부터 선택되고,
보다 바람직하게는, 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, CIK 세포, LAK 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(CTL), 수지상 세포(DC), 종양 침윤 림프구(TIL), 대식 세포, NK T 세포 및 γδT 세포 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다.
항목 10. 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 방법에 있어서, 외래 유전자와 임의 선택된 그 프로모터의 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 따른 핵산 구축물을 상기 세포에 도입하는 단계, 및 임의 선택된 트랜스포사제가 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 외래 유전자와 임의 선택된 그 프로모터는 상기 핵산 구축물의 다클론 삽입 부위에 위치하고,
바람직하게는, 상기 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제이다.
본 발명의 장점은 하기와 같다:
1) 본 발명의 트랜스포존 벡터 시스템은 다중 조절 요소를 구비하며, 피기백의 발현 및 이에 의해 매개되는 외래 유전자의 통합을 다층적으로 조절한다. 본원에 사용된 피기백 트랜스포사제 발현을 구동하는 프로모터는 발현 강도를 낮추고 DNA 길이를 줄였다. 동시에 인핸서 요소를 도입하여, 완전한 플라스미드 상태에서, 트랜스포사제의 발현을 일시적으로 향상시키고, 피기백 트랜스포사제의 절단과 통합 기능을 발휘하며; 외래 유전자 발현 카세트가 완전한 플라스미드로부터 절단된 후, 인핸서는 프로모터에 대한 강화 작용을 상실하여, 피기백 트랜스포사제의 효율적인 개방과 폐쇄를 구현하여, 트랜스포사제 수준의 단시간 발현이 피크에 도달한 후 감소하고, 외래 유전자 완전 통합을 매개하는 동시에 세포 독성을 대폭 감소시킨다.
2) 프로모터 다운스트림에 5' UTR 서열이 추가되어, 인핸서 요소와 협력하여 트랜스포사제의 발현 강도를 일시적으로 향상시켜, 피기백 효소의 발현 강도가 충분히 높아져, 전체 통합 효율이 향상된다. 하기 실시예와 같이, 본 발명의 트랜스포존 벡터 시스템의 통합 효율은 매우 유의하게 향상된다.
3) 피기백 발현 카세트는 전사 종결 작용을 갖는 인슐레이터 서열을 채택하며, 외래 유전자 통합 발생 전에 효과적으로 전사를 종결하고, 트랜스포사제 유전자를 발현시키며; 외래 유전자가 게놈에 통합된 후, 전사 종결 작용을 갖는 인슐레이터 서열의 결실은 피기백 트랜스포사제의 전사 발현을 효과적으로 종결시킬 수 있다. 동시에, 전사 종결 작용을 갖는 인슐레이터 서열이 외래 유전자 발현 카세트와 함께 게놈에 통합된 후 인슐레이터가 외래 유전자의 발현이 게놈의 인접 영역에 미치는 영향도 차단하여, 통합된 외래 유전자 발현 카세트가 통합 부위 근처 유전자 발현에 미치는 영향을 감소시킨다.
4) 본 발명의 트랜스포존 벡터 시스템은 게놈에서 삽입 부위가 비교적 적고, 유전자 내 삽입 부위가 적어, 게놈 안정성에 미치는 영향이 비교적 작다.
5) mRNA 수준에서 유전자 발현 프로파일에 미치는 영향이 비교적 작다.
이하에서는 실시예를 함께 참조하여 본 발명에 언급된 구현예을 상세하게 설명한다. 당업자게 있어서, 이하의 실시예가 본 발명을 설명하기 위한 목적으로만 사용되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주할 수 없음은 자명한 것이다. 실시예에 구체적인 기술이나 조건이 명시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 설명된 기술이나 조건을 따르거나(예를 들어 Joseph Sambrook 등 편저, Huang Peitang 등 번역, <Molecular Cloning: A Laboratory Manual>, 3판, 과학출판사 참조) 제품 설명서를 따른다. 사용된 시약 또는 기기에 제조사가 명시되지 않은 경우, 모두 시중에서 획득할 수 있는 일반적인 제품을 사용할 수 있다. 이하의 실시예에 사용된 세포주는 모두 ATCC에서 구입하였다.
실시예
실시예 1. 벡터의 구축
pKB20: 순서에 따라 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열(3' ITR)(SEQ ID NO: 1), 다클론 부위(SEQ ID NO: 2), bGH polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 3), 인핸서 모티프 서열(SEQ ID NO: 4), 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열(C2 전사 정지 부위, SEQ ID NO: 5), 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열(5' ITR)(SEQ ID NO: 6)의 역방향 상보적 서열, 피기백 트랜스포사제 암호화 서열(SEQ ID NO: 7)의 역방향 상보적 서열, 5' UTR 서열(SEQ ID NO: 8)의 역방향 상보적 서열 및 miniCMV 프로모터 서열(SEQ ID NO: 9)의 역방향 상보적 서열을, 하나의 긴 서열(SEQ ID NO: 10)로 스플라이싱하고, Shanghai Generay Biotech사에 위탁하여 합성하였으며, 양단에 각각 AgeI와 AscI 효소 절단 부위를 추가하고, pUC57(Shanghai Generay Biotech사에서 구입)을 로딩하여, pKB20으로 명명하였다. 플라스미드 개략도는 도 1a에 도시된 바와 같다.
pKB20-EGFP: pKB20의 다클론 부위의 XbaI와 EcoRI 부위 사이에 NFAT 모티프를 가진 EF1A 프로모터 서열(SEQ ID NO: 11)을 삽입하고, EcoRI와 SalI 부위 사이에 EGFP 암호화 서열(SEQ ID NO: 12)을 삽입하여, pKB20-EGFP로 명명하였으며, NFAT 모티프를 가진 EF1A 프로모터 서열과 EGFP 암호화 서열은 Shanghai Generay Biotech사에 위탁하여 합성하였다.
pKB205: 순서에 따라 피기백 트랜스포존 3' 말단 반복 서열(3' ITR)(SEQ ID NO: 1), 다클론 부위 MCS(SEQ ID NO: 2), bGH polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 3), 인핸서 모티프 서열(SEQ ID NO: 4), 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열(C2 전사 정지 부위, SEQ ID NO: 5), 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열(5' ITR)(SEQ ID NO: 6), miniCMV 프로모터 서열(SEQ ID NO: 9), 5' UTR 서열(SEQ ID NO: 8), 피기백 트랜스포사제 암호화 서열(SEQ ID NO: 7) 및 SV40 polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 13)을 하나의 긴 서열(SEQ ID NO: 14)로 스플라이싱하고, Shanghai Generay Biotech사에 위탁하여 합성하였으며, 양단에 AgeI와 AscI 효소 절단 부위를 각각 추가하고, pUC57(Shanghai Generay Biotech사에서 구입)을 로딩하여, pKB205로 명명하였다. 플라스미드는 도 1b에 도시된 바와 같다.
pKB205-EGFP: pKB205의 다클론 부위의 XbaI와 EcoRI 부위 사이에 NFAT 모티프를 가진 EF1A 프로모터 서열(SEQ ID NO: 11)을 삽입하고, EcoRI와 SalI 부위 사이에 EGFP 암호화 서열(SEQ ID NO: 12)을 삽입하여, pKB205-EGFP로 명명하였으며, NFAT 모티프를 가진 EF1A 프로모터 서열과 EGFP 암호화 서열은 Shanghai Generay Biotech사에 위탁하여 합성하였다.
동일한 방법을 채택하여 하기 플라스미드를 각각 획득하였다:
pKB201-EGFP: pKB20-EGFP 서열에서 인핸서 모티프 서열을 제거하여 획득하였다.
pKB202-EGFP: pKB20-EGFP 서열에서 5' UTR 서열을 제거하여 획득하였다.
pKB2003-EGFP: pKB20-EGFP 서열에서 인핸서 모티프 서열과 5' UTR 서열을 제거하여 획득하였다.
pKC20-EGFP: pKB20-EGFP 서열에서 miniCMV 프로모터 서열, 5' UTR 서열, 핵 위치 신호를 함유한 피기백 트랜스포사제 암호화 서열을 제거하여 획득하였다.
pK201-PB: pKB20 서열에서 5' UTR, 5' ITR, 인핸서 모티프, bGH polyA 신호 서열, 다클론 부위 및 3' ITR을 제거하고, miniCMV, 핵 위치 신호를 함유한 피기백 트랜스포사제 암호화 서열 및 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열만 남겨 획득하였다.
pKB20I1-EGFP: pKB20-EGFP에서 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열을 인간 α2 globin 유전자 전사 정지 부위(SEQ ID NO: 15)로 치환하여 획득하였다.
pKB20A1-EGFP: pKB20-EGFP에서 bGH polyA를 SEQ ID NO: 16으로 치환하여 획득하였다.
pKB20A2-EGFP: pKB20-EGFP에서 bGH polyA를 SV40 polyA 신호 서열(SEQ ID NO: 13)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U1-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 C3 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 17)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U2-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 ORM1 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 18)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U3-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 HPX 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 19)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U4-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 FGA 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 20)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U5-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 AGXT 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 21)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U6-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 ASL 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 22)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U7-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 APOA2 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 23)로 치환하여 획득하였다.
pKB20U8-EGFP: pKB20-EGFP에서 5' UTR 서열을 ALB 유전자의 5' UTR(SEQ ID NO: 24)로 치환하여 획득하였다.
pKB20E1-EGFP: pKB20-EGFP에서 인핸서 모티프 서열을 CMV 인핸서 서열(SEQ ID NO: 25)로 치환하여 획득하였다.
pKB20E2-EGFP: pKB20-EGFP에서 인핸서 모티프 서열을 SV40 인핸서 서열(SEQ ID NO: 26)로 치환하여 획득하였다.
pKB20E3-EGFP: pKB20-EGFP에서 인핸서 모티프 서열을 인간 ε-globin 5' HS2 인핸서 서열(SEQ ID NO: 27)로 치환하여 획득하였다.
pKB20E4-EGFP: pKB20-EGFP에서 인핸서 모티프 서열을 닭 β-globin 유전자 5' HS4 인핸서 서열(SEQ ID NO: 28)로 치환하여 획득하였다.
pKB20P1-EGFP: pKB20-EGFP에서 miniCMV 서열을 CMV53 프로모터(SEQ ID NO: 37)로 치환하여 획득하였다.
pKB20P2-EGFP: pKB20-EGFP에서 miniCMV 서열을 miniSV40 프로모터(SEQ ID NO: 38)로 치환하여 획득하였다.
pKB20P3-EGFP: pKB20-EGFP에서 miniCMV 서열을 miniTK 프로모터(SEQ ID NO: 39)로 치환하여 획득하였다.
pKB20P4-EGFP: pKB20-EGFP에서 miniCMV 서열을 MLP 프로모터(SEQ ID NO: 40)로 치환하여 획득하였다.
pKB20P5-EGFP: pKB20-EGFP에서 miniCMV 서열을 pJB42CAT5 프로모터(SEQ ID NO: 41)로 치환하여 획득하였다.
pKB20P6-EGFP: pKB20-EGFP에서 miniCMV 서열을 YB_TATA(SEQ ID NO: 42)로 치환하여 획득하였다.
실시예 2. Jurkat 세포에서 EGFP 발현 카세트 함유 pKB 벡터의 통합
5×106개의 왕성하게 성장하는 낮은 계대 Jurkat 세포를 준비하고, Lonza2b-Nucleofector 기기를 통해, 질량이 모두 5μg인 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP를 세포핵에 각각 트랜스펙션시키고(기기 조작 설명서에 따름), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 성장이 완료되면, 1:10의 비율에 따라 계대 배양한다. 전기천공 후 7일째, 10일째, 14일째에 형광현미경으로 사진을 촬영하여 관찰하였고, 전기천공 후 7일째, 10일째, 14일째(3계대 후)에 유세포 분석기로 EGFP 양성 세포의 비율 변화를 측정하였으며, 플라스미드로 트랜스펙션되지 않은 Jurkat 세포를 유세포 분석을 위한 대조군으로 사용하였다. 전기천공 전 과정에서 형광현미경으로 세포 형광 강도를 관찰하였다. 전기천공 후 5일째, 7일째, 10일째, 14일째에 생세포를 계수하였고, 전기천공 pKB 벡터가 Jurkat 세포 증식에 미치는 영향을 관찰하였다.
1:10의 비율로 희석하여 계대하였으며, 통합되지 않은 플라스미드는 세포가 분열함에 따라, 플라스미드가 매우 빠르게 손실되었다. 3계대(약 13일) 이후, 녹색 형광 양성의 세포는 녹색 형광 발현 카세트가 이미 안정적으로 통합된 것으로 볼 수 있다. 유세포 분석을 통해 녹색 형광 양성 세포 비율을 측정하여, 통합 효율을 결정할 수 있다.
결과는 도 2 내지 도 4에 도시된 바와 같다. 도 2는 전기천공 후 10일째에, pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포에서 높은 형광 밝기를 가진 다량의 세포를 관찰할 수 있음을 나타낸다. 피기백 트랜스포사제 발현 카세트가 결실된 pKC20-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포는 기본적으로 형광이 보이지 않았다. 이는 피기백 트랜스포사제 발현 카세트가 있는 벡터가 EGFP를 Jurkat 세포의 게놈에 성공적으로 통합하였음을 보여준다. 반면 피기백 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하지 않는 벡터는 외래 유전자 EGFP의 통합을 효과적으로 매개할 수 없다.
도 3은 전기천공 후 7일째에 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포의 유세포 분석 결과이다. 결과에 따르면, pKB20-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포는 7일째 및 10일째의 양성 세포 비율이 모두 최고 67% 이상에 달하였고, 3계대 세포 배양 후 14일째의 양성률은 여전히 65%의 높은 수준으로 유지되었다. pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 세포 양성률은 7일째에 약 48%였으며, 3계대 배양 후 14일째에는 27% 및 26%를 각각 초과하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, PB 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포는 PB 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하지 않는 pKC20-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포에 비해, 전기천공 후 5일째, 7일째, 10일째 및 14일째의 생세포 수에 유의한 차이가 없었다. 이는 PB 트랜스포사제 발현 카세트의 도입이 Jurkat 세포의 증식에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
상기 결과에 따르면 pKB20-EGFP가 Jurkat 세포에 전기천공된 후 모두 매우 높은 통합률과 외래 유전자 양성 발현율을 나타냈으며, pKB201-EGFP와 pKB202-EGFP가 Jurkat 세포에 전기천공된 후에도 비교적 높은 통합률과 외래 유전자 양성 발현율을 나타냈으나, pKB20-EGFP 전기천공 후의 수준보다는 낮았다. 또한 pKB 계열 벡터의 통합은 세포의 증식에 기본적으로 영향을 미치지 않는다.
실시예 3. pKB 벡터의 Jurkat 세포 전기천공 후 PB 트랜스포사제 발현의 시간 곡선
5×106개의 왕성하게 성장하는 낮은 계대 Jurkat 세포를 준비하고, Lonza2b-Nucleofector 기기를 통해, 질량이 모두 5μg인 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP를 세포핵에 각각 트랜스펙션시키고(기기 조작 설명서에 따름), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 전기천공 후 6시간째, 12시간??, 24시간째, 48시간째, 96시간째 및 15일째에 세포를 수집한 후 RNA를 추출하였고, PB 트랜스포사제의 발현 수준을 β-actin을 내부 기준으로 RT-PCR 정량 측정을 수행하였으며, 결과는 도 5에 도시된 바와 같다.
도 5에서 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포에서 PB 트랜스포사제의 발현 수준이 모두 6시간째에 피크에 도달하였으며, 이후 유의하게 낮아지기 시작한 것으로 나타났다. pKB20-EGFP 및 pKB201-EGFP로 전기천공된 세포는 6시간째에 피크일 때의 PB 트랜스포사제 발현 수준이 pKB202-EGFP로 전기천공된 세포의 PB 트랜스포사제 발현 수준보다 현저하게 높았다. 여기에서 pKB20-EGFP 및 pKB201-EGFP로 전기천공된 세포는 24시간째에서 PB 트랜스포사제의 발현 수준이 급격하게 낮아졌다. 모든 세포는 96시간째에 PB 트랜스포사제의 발현 수준이 모두 매우 낮게 하강하였으며, 15일째에는 모두 검출되지 않았다.
실시예 4. K562 세포에서 EGFP 발현 카세트 함유 pKB 벡터의 통합
5×106개의 왕성하게 성장하는 낮은 계대 K562 세포를 준비하고, Lonza2b-Nucleofector 기기를 통해, 질량이 모두 5μg인 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP를 세포핵에 각각 트랜스펙션시키고(기기 조작 설명서에 따름), 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 성장이 완료되면, 1:10의 비율에 따라 계대 배양한다. 전기천공 후 1일째, 7일째, 10일째에 형광현미경으로 사진을 촬영하여 관찰하였고, 전기천공 후 10일째, 14일째(3계대 후)에 유세포 분석기로 EGFP 양성 세포의 비율 변화를 측정하였으며, 플라스미드로 트랜스펙션되지 않은 K562 세포를 유세포 분석을 위한 대조군으로 사용하였다. 전기천공 전 과정에서 형광현미경으로 세포 형광 강도를 관찰하였다. 전기천공 후 5일째, 7일째, 10일째, 14일째에 생세포를 계수하였고, 전기천공 pKB 벡터가 K562 세포 증식에 미치는 영향을 관찰하였다.
1:10의 비율로 희석하여 계대하였으며, 통합되지 않은 플라스미드는 세포가 분열함에 따라, 플라스미드가 매우 빠르게 손실되었다. 3계대(약 13일) 이후, 녹색 형광 양성의 세포는 녹색 형광 발현 카세트가 이미 안정적으로 통합된 것으로 볼 수 있다. 유세포 분석을 통해 녹색 형광 양성 세포 비율을 측정하여, 통합 효율을 결정할 수 있다.
결과는 도 6 내지 도 9에 도시된 바와 같다. 도 6은 전기천공 후 10일째에, pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP로 전기천공된 K562 세포에서 높은 형광 밝기를 가진 다량의 세포를 관찰할 수 있음을 나타낸다. 피기백 트랜스포사제 발현 카세트가 결실된 pKC20-EGFP로 전기천공된 K562 세포는 기본적으로 높은 형광 밝기의 세포가 보이지 않았다. 이는 피기백 트랜스포사제 발현 카세트가 있는 벡터가 EGFP를 K562 세포의 게놈에 성공적으로 통합하였음을 보여준다. 반면 피기백 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하지 않는 벡터는 외래 유전자 EGFP의 통합을 효과적으로 매개할 수 없다.
도 7에 도시된 바와 같이, PB 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 세포는, PB 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하지 않는 pKC20-EGFP로 전기천공된 세포에 비해, 전기천공 후 5일째, 7일째, 10일째 및 14일째의 생세포 수에 유의한 차이가 없었다. 이는 PB 트랜스포사제 발현 카세트의 도입이 K562 세포의 증식에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 8은 전기천공 후 10일째 및 14일째에 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP와 pKB202-EGFP로 전기천공된 세포의 유세포 분석 결과이다. 결과에 따르면, pKB20-EGFP 및 pKB201-EGFP로 전기천공된 세포는 10일째의 세포 형광 양성률이 75% 및 73%를 각각 초과하였고, 전기천공 후 14일째(3계대 배양 초과)의 형광 양성률이 여전히 70% 이상으로 유지되어, 매우 높은 통합 효율을 나타냈다. pKB202-EGFP로 전기천공된 세포는 전기천공 후 10일째의 형광 양성률도 70%에 근접하였고, 전기천공 후 14일째(3계대 배양 초과)의 형광 양성률도 여전히 70%에 근접한 수준으로 유지되었다.
도 9에서 전기천공 후 10일째 내지 14일째에, pKB20-EGFP 및 pKB201-EGFP 벡터로 전기천공된 K562 세포의 형광 양성률은 큰 변화 없이, 모두 70% 이상으로, 75%에 근접하였고; pKB202-EGFP 벡터로 전기천공된 K562 세포의 형광 양성률은 전기천공 후 10일째 내지 14일째 사이에 하강이 뚜렷하지 않았으며, 70%보다 약간 낮은 것으로 나타났다.
상기 결과는 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 K562 세포 전기천공 후 모두 매우 높은 통합률과 외래 유전자 양성 발현율을 가짐을 나타낸다.
실시예 5. 1차 T 세포에서 EGFP 발현 카세트 함유 pKB 벡터의 통합
새로 분리된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 4개 군을 준비하였으며, 각각의군은 5×106개이고, Lonza Nucleofector-2b 전기천공 기기를 이용하여 질량이 모두 5μg인 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP를 세포핵에 각각 전기천공하고(기기 조작 설명서에 따름), 전기천공 후 세포를 AIM-V 배지에 넣고 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 배양하였다. 6시간 후 30ng/mL 항-CD3 항체 및 3000IU/mL IL-2(Novoprotein에서 구입)를 포함하는 6-웰 플레이트로 옮기고, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 성장이 완료된 후, 1:10의 비율로 희석하여 계대하였고, 전기천공 후 1일째, 7일째 및 10일째에 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP 및 pKC20-EGFP로 전기천공된 세포를 각각 형광현미경으로 관찰하고 사진을 촬영하였으며, 전기천공 후 7일째, 10일째 및 14일째에 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 세포에 대해 유세포 분석을 수행하였고, 그 결과는 도 10 및 도 11에 도시된 바와 같다.
도 10은 전기천공 후 10일째에, pKB20-EGFP, pKB201-EGFP, pKB202-EGFP로 전기천공된 T 세포에서 높은 형광 밝기를 가진 다량의 세포를 관찰할 수 있음을 나타낸다. 피기백 트랜스포사제 발현 카세트가 결실된 pKC20-EGFP로 전기천공된 T 세포는 기본적으로 높은 형광 밝기의 세포가 보이지 않았다. 이는 피기백 트랜스포사제 발현 카세트가 있는 벡터가 EGFP를 T 세포의 게놈에 성공적으로 통합하였음을 보여준다. 반면 피기백 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하지 않는 벡터는 외래 유전자 EGFP의 통합을 효과적으로 매개할 수 없다.
도 11은 전기천공 후 7일째 내지 14일째에 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP와 pKB202-EGFP로 각각 전기천공된 T 세포의 유세포 분석 결과이다. 결과에 따르면, pKB20-EGFP로 전기천공된 T 세포는 7일째의 세포 양성률이 74%에 근접하였고, 전기천공 후 14일째에(3계대 배양) 여전히 72%에 근접하게 유지되었다. pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP로 전기천공된 T 세포는 전기천공 후 7일째의 양성률도 모두 최고 70%에 근접하였으며, 전기천공 후 14일째에(3계대 배양) 양성률이 여전히 66% 및 62% 이상으로 각각 유지되었다.
상기 결과는 1차 T 세포에 전기천공한 후 pKB20-EGFP, pKB201-EGFP 및 pKB202-EGFP는 모두 매우 높은 통합률과 외래 유전자 양성 발현율을 가짐을 나타낸다.
실시예 6. 이중 플라스미드 PB 전위 시스템의 Jurkat 세포 전기천공 후 통합 효율 측정
1×107개의 왕성하게 성장하는 낮은 계대수의 Jurkat 세포를 준비하였으며, A, B의 2개 군으로 나누었고, 각각의 군의 세포 수는 5×106개이다. 4 μg의 pK201-PB + 3μg의 pKC20-EGFP 혼합액과 3μg의 pK201-PB + 4μg의 pKC20-EGFP 혼합액을 각각 준비하여, Lonza2b-Nucleofector 기기를 통해 A, B의 2개 군 세포의 세포핵에 각각 전기천공하고(기기 조작 설명서에 따름), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 성장이 완료되면, 1:10의 비율에 따라 계대 배양한다. 전기천공 후 7일째, 10일째, 14일째에 형광현미경으로 사진을 촬영하여 관찰하였고; 전기천공 후 7일째, 10일째, 14일째(3계대 후)에 유세포 분석기로 EGFP 양성 세포의 비율 변화를 측정하였으며, 플라스미드로 트랜스펙션되지 않은 Jurkat 세포를 유세포 분석을 위한 대조군으로 사용하였다.
결과는 도 12에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 4μg의 pK201-PB + 3μg의 pKC20-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포는 전기천공 후 7일째 세포 양성률이 43%를 초과하였고, 전기천공 후 14일째(3계대 배양 후)의 세포 양성률이 13.31%까지 낮아졌다. 이와 유사하게, 3μg의 pK201-PB + 4μg의 pKC20-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포는 전기천공 후 7일째 세포 양성률이 52%를 초과하였고, 전기천공 후 14일째(3계대 배양 후)의 세포 양성률이 10.57%까지 낮아졌다.
상기 결과에 따르면, PB 트랜스포사제와 외래 유전자를 각각 발현하는 이중 벡터 전위 시스템은 Jurkat 세포에서의 통합 효율이 전술한 단일 벡터 pKB 시스템의 통합 효율보다 훨씬 낮다.
실시예 7. 이중 플라스미드 PB 전위 시스템의 1차 T 세포 전기천공 후 통합 효율 측정
5×106개의 새로 분리된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 준비하고, 4 μg의 pK201-PB + 3μg의 pKC20-EGFP 혼합액을 준비하여, Lonza Nucleofector-2b 전기천공 기기를 이용하여 세포핵에 전기천공하고(기기 조작 설명서에 따름), 전기천공 후 세포를 AIM-V 배지에 넣고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 6시간 후 30ng/mL 항-CD3 항체 및 3000IU/mL IL-2(Novoprotein에서 구입)를 포함하는 6-웰 플레이트로 옮기고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 성장이 완료된 후, 1:10의 비율로 희석하여 계대 배양하였고, 각각 전기천공 후 7일째와 14일째에 세포에 대해 유세포 분석을 수행하였다.
결과는 도 13에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 4μg의 pK201-PB + 3μg의 pKC20-EGFP로 전기천공된 1차 세포는 전기천공 후 7일째 세포 양성률이 16.20%였고, 전기천공 후 14일째(3계대 배양 후)의 세포 양성률이 15.34%까지 낮아졌다.
상기 결과에 따르면, PB 트랜스포사제와 외래 유전자를 각각 발현하는 이중 벡터 전위 시스템은 1차 T 세포에서의 통합 효율이 전술한 단일 벡터 pKB 시스템의 통합 효율보다 현저하게 낮다.
실시예 8. 플라스미드 용량이 감소된 pKB 벡터의 Jurkat 세포 전기천공 후 통합 효율 측정
5×106개의 왕성하게 성장하는 낮은 계대 Jurkat 세포를 준비하고, 3μg의 pKB20-EGFP 플라스미드를 준비하여, Lonza2b-Nucleofector 기기를 통해 세포핵에 전기천공시키고(기기 조작 설명서에 따름), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포 성장이 완료되면, 1:10의 비율에 따라 계대 배양한다. 전기천공 후 7일째, 10일째, 14일째(3계대 배양 후)에 유세포 분석기로 EGFP 양성 세포의 비율 변화를 측정하였으며, 플라스미드가 트랜스펙션되지 않은 Jurkat 세포를 유세포 분석을 위한 대조군으로 사용하였다.
결과는 도 14에 도시된 바와 같다. 결과에 따르면, 3μg의 pKB20-EGFP 플라스미드로 전기천공된 Jurkat 세포는 전기천공 후 7일째 세포 양성률이 66%를 초과하였고, 전기천공 후 14일째(3계대 배양 후)의 세포 배양율이 여전히 63%에 근접하도록 유지되었으며, 실시예 2에서 6μg pKB20-EGFP 플라스미드로 Jurkat 세포를 전기천공한 후 14일째의 세포 양성률과 유사하였다.
상기 결과에 따르면, 실시예 2를 기반으로 전기천공에 사용된 pKB20-EGFP 플라스미드 용량을 반으로 줄인 후에도, pKB 벡터 시스템은 세포에서의 통합 효율이 기본적으로 변하지 않았는데, 이는 본 발명의 pKB 벡터 시스템이 DNA량이 감소한 경우에도 동등한 효과의 통합 효율을 구현할 수 있음을 설명하며, 이는 전기천공에서 DNA 용량을 줄여 T 세포에 대한 DNA의 독성을 줄이고 전기천공 후 세포에 잔류하는 플라스미드 DNA를 줄이는 데에 매우 유익하다.
실시예 9. 세포 내 pKB 벡터 잔류 플라스미드 카피 수 측정
실시예 2 및 실시예 4의 방법에 따라, Jurkat 세포 및 K562에 대해 각각 5㎍의 pKB20-EGFP를 전기천공하고, 전기천공 후 10일째, 14일째 및 20일째에 각각 세포를 수확하였으며; 실시예 8의 방법에 따라, Jurkat 세포에 대해 3μg의 pKB20-EGFP를 전기천공하였고, 모두 기기 조작 설명서에 따라 수행하였으며, 전기천공 후 10일째, 12일째 및 14일째에 각각 세포를 수확하였고; 실시예 5의 방법에 따라, 새로운 PBMC에 대해 5㎍의 pKB20-EGFP를 전기천공하고, 전기천공 후 10일째, 12일째 및 14일째에 각각 세포를 수확하였다. 모든 조작은 3회 반복하였다. Taqman 프로브 형광 정량 PCR 방법을 사용하여 PB 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하는 상술한 모든 수확된 세포에 대해 상이한 시점에서 잔류 플라스미드의 양을 측정하였다:
1) PB 트랜스포사제 발현 카세트를 포함하는 pKB20-EGFP 플라스미드를 표준품으로 사용하고, 내부 기준 유전자 Actin을 포함하는 플라스미드를 내부 표준품으로 사용하여, 10배 구배 희석된 표준품을 각각 제조하였다.
2) pKB20-EGFP 전기천공 후 지정된 일수에 세포 총 DNA를 추출하여, PB 트랜스포사제 유전자 및 Actin 유전자를 검출하기 위한 시료로 사용하였다.
3) PCR 반응 시스템을 구성하고, 검출할 샘플에 대해 PB 트랜스포사제 유전자와 내부 기준 Actin 유전자 증폭을 각각 수행하였으며; PB 유전자 구배 희석 표준품과 Actin 유전자 구배 희석 표준품을 증폭하여, PB 유전자와 Actin 유전자 각각의 표준 곡선을 제작하여 준비하였다. PB 유전자 및 Actin 유전자 증폭을 위한 프라이머, 프로브 서열 및 반응 시스템은 각각 하기와 같다:
PB 유전자 증폭:
PB-F: 5' ggacgagatctacgccttct(SEQ ID NO:29)
PB-R: 5' ctcatcacgctcacgtacac(SEQ ID NO:30)
PB-프로브: 5' tgcgcacggcggtcatcacc(SEQ ID NO:31)
Actin 유전자 증폭:
Actin-F: 5' gggacctgactgactacctc(SEQ ID NO:32)
Actin-R: 5' aatgtcacgcacgatttccc(SEQ ID NO:33)
Actin-프로브: 5' caccgagcgcggctacagct(SEQ ID NO:34)
4) 실시간 형광 정량 PCR을 이용하여 검출할 샘플 및 표준품에 대해 증폭 반응을 수행하였으며, 반응 시스템은 표 1과 같고, 반응 프로세스는 1. 50℃ 2분; 2. 95℃ 10분, 3. 95℃ 15분, 60℃ 1분이고, 총 40회 순환시켰다. 표준 곡선을 제작하였으며, 표준 곡선에 따라 플라스미드 잔류량을 계산하였다. 카피 수 계산 공식은 PB 카피 수/Actin카피 수*2이다.
결과는 도 15에 도시된 바와 같다. 전기천공 플라스미드 용량이 5μg의 정상 용량인 경우, 세포 내의 잔류 플라스미드의 카피 수는 시간이 경과함에 따라 급감하였으며, 전기천공 후 14일째(3계대 후)까지 세포를 배양한 후, 각각의 Jurkat 세포에서 평균 잔류 플라스미드 카피 수는 이미 10보다 작았고, 각각의 K562 세포 및 1차 T 세포 내에서 평균 잔류 플라스미드 카피 수는 이미 5보다 작았고; 전기천공 후 20일째까지 배양했을 때, Jurkat 세포 및 K562 세포에서 각각의 세포의 평균 잔류 플라스미드 카피 수는 이미 1보다 작았다. 전기천공 플라스미드의 용량을 3μg으로 감소시킨 경우, 전기천공 후 Jurkat 세포 내 잔류한 플라스미드 함량은 5μg 플라스미드 전기천공의 경우보다 더욱 현저하게 감소하였으며, 10일째에 각각의 세포 내에서 평균 플라스미드 카피 수는 이미 10보다 낮았고, 14일째에는 카피 수가 1에 못 미쳤다.
상기 결과는 본 발명의 벡터가 그 게놈 통합 기능을 충분히 발휘하는 동시에 숙주 세포에서의 잔류 수준이 매우 낮음을 보여준다. 동시에 실시예 8의 결과와 함께 분석하면, 본 발명의 pKB 계열 벡터는 전기천공 후 높은 통합 효율을 보장한다는 전제 하에서 플라스미드 DNA의 용량을 감소시키고, 나아가 전기천공 후 플라스미드 DNA의 세포 내 잔류를 더욱 줄일 수 있는 것으로 나타난다.
실시예 10. pKB2003-EGFP 벡터 전기천공 후 세포에서의 통합
상술한 실시예 2와 실시예 4에 기재된 방법에 따라, Jurkat 세포와 K562 세포에 대해 pKB2003-EGFP 플라스미드 전기천공을 각각 수행하였으며, 전기천공 후 7일째, 10일째, 14일째에 유세포 분석으로 세포 양성률을 측정하였다. 결과는 도 16에 도시된 바와 같다. pKB2003-EGFP로 전기천공된 Jurkat 세포는 7일째 및 10일째의 양성 세포 비율이 각각 최고 49% 및 48% 이상에 달하였고, 3계대 세포 배양 후 14일째 양성률이 여전히 48%의 높은 수준으로 유지되었다. pKB2003-EGFP로 전기천공된 K562세포는 7일째 및 10일째의 양성 세포 비율이 모두 70%에 근접하였고, 3계대 세포 배양 후 14일째 양성률이 여전히 66%를 초과하는 높은 수준으로 유지되었다.
상기 결과에 따르면, pKB2003 벡터는 세포에서 외래 유전자를 고효율로 통합하고 발현할 수 있다.
실시예 11. 조절 요소 서열에 의해 치환된 pKB 계열 벡터의 전기천공 후 세포 내 통합
각각 실시예 2, 실시예 4 및 실시예 5에 기재된 방법에 따라, 전기천공 중 플라스미드의 용량을 3μg로 낮추고, 각각 Jurkat 세포, K562 세포 및 건강한 사람 혈액에서 유래한 PBMC에 대해 pKB20I1-EGFP, pKB20A1-EGFP, pKB20A2-EGFP, pKB20U1-EGFP, pKB20U2-EGFP, pKB20U3-EGFP, pKB20U4-EGFP, pKB20U5-EGFP, pKB20U6-EGFP, pKB20U7-EGFP, pKB20U8-EGFP, pKB20E1-EGFP, pKB20E2-EGFP, pKB20E3-EGFP, pKB20E4-EGFP, pKB20P1-EGFP, pKB20P2-EGFP, pKB20P3-EGFP, pKB20P4-EGFP, pKB20P5-EGFP 및 pKB20P6-EGFP 플라스미드를 전기천공하였고, 전기천공 후 14일째에 유세포 분석으로 세포 양성률을 측정하였으며, 결과는 표 2와 같다.
표 2의 결과에서 알 수 있듯이, 상기 조절 요소 서열에 의해 치환된 pKB 계열 플라스미드 벡터는 모두 상이한 세포의 게놈에 고효율로 통합되었으며, 상기 각각의 유형의 세포에서 pKB20-EGFP의 통합률과 동일한 수준이었다.
실시예 12. pKB205-EGFP 벡터에 의한 1차 T 세포 전기천공 후 통합 효율 측정
실시예 5에 기재된 방법에 따라, 전기천공 중 플라스미드의 용량을 3μg까지 낮추고, 건강한 사람 혈액에서 유래된 PBMC에 대해 pKB205-EGFP를 전기천공하였으며, 전기천공 후 7일째 및 14일째에 유세포 분석으로 세포 양성률을 측정하였다.
결과는 도 17에 도시된 바와 같다. pKB205-EGFP로 전기천공된 T 세포는 7일째의 세포 양성률이 42%를 초과하였고, 전기천공 후 14일째에(3계대 배양) 여전히 36%로 유지되었다. 이는 pKB205-EGFP 벡터가 1차 T 세포 전기천공 후 비교적 높은 통합률 및 외래 유전자 양성 발현율을 가짐을 의미한다.
실시예 13. Jurkat 세포 및 K562 세포에서 pKB 벡터의 통합 부위 분석
Jurkat 세포와 K562 세포를 각각 2부씩 준비하고, 각각 실시예 2와 실시예 4에 기재된 방법에 따라 2가지 세포에 대해 pKB20-EGFP 플라스미드 전기천공을 수행하였으며, 전기천공 후 14일째에, 세포를 수집하고 게놈 DNA를 추출하였고, Genergy Bio-technology(Shanghai)사에 위탁하여 전체 게놈 시퀀싱을 수행하여, 게놈에서 EGFP 삽입 부위의 분포 상태를 분석하였다. 결과는 도 18 내지 도 21 및 표 3에 도시된 바와 같다. 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21은 각각 K562 샘플 1, K562 샘플 2, Jurkat 샘플 1 및 Jurkat 샘플 2에서 pKB20 벡터에 의해 매개된 게놈 통합부위의 개략도이다.
도 18 내지 도 21 및 표 3의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 pKB20 벡터에 의해 매개된 외래 유전자 세포 게놈 통합은 주로 유전자 간 영역과 인트론 영역에서 집중적으로 발생하였으며, 엑손 영역과 유전자 발현 조절 관련 영역(예를 들어 3' UTR)에서는 통합 부위가 비교적 적었다. 이는 세포 게놈 상에서 pKB20 벡터에 의해 매개된 외래 유전자의 통합이 세포 자체 유전자 발현에 미치는 영향이 매우 적음을 나타낸다.
실시예 14. Jurkat 세포와 K562 세포에서 pKB 벡터 통합 후 mRNA 발현 프로파일 분석
상술한 실시예 2와 실시예 4에 기재된 방법에 따라, Jurkat 세포와 K562 세포에 대해 pKB20-EGFP 플라스미드 전기천공을 각각 수행하였으며, 플라스미드 용량은 4μg였다. 전기천공 후 14일째에 세포를 수확하여 mRNA 시퀀싱과 발현 프로파일 분석을 수행하였으며, 플라스미드가 전기천공되지 않은 Jurkat 세포 및 K562 세포의 mRNA 발현 프로파일과 비교하였다. K562와 Jurkat는 모두 샘플을 2부씩 이송하여 분석하였다.
시퀀싱과 분석 결과에 따르면, 각각 플라스미드가 전기천공되지 않은 대조군 세포에 비해, pKB20-EGFP로 전기천공된 후 pKB20 통합 부위의 인접 유전자 mRNA 발현 변화가 크지 않았으며, 관련 유전자 차이 발현 상황은 표 4 내지 표 7과 같다. 이는 게놈 상에서 본 발명의 pKB 벡터의 통합이 세포 게놈의 안정성과 유전자 발현 프로파일에 미치는 영향이 비교적 작음을 나타낸다.
실시예 15. pKB20-HER2CAR 벡터 및 HER2CAR-T 세포의 제조
pKB20의 다클론 부위의 XbaI와 EcoRI 부위 사이에 NFAT 모티프를 가진 EF1A 프로모터 서열(SEQ ID NO: 11)을 삽입하고, EcoRI와 SalI 부위 사이에 HER2CAR의 암호화 서열(SEQ ID NO: 43)을 삽입하여, pKB20-HER2CAR로 명명하였으며, NFAT 모티프를 가진 EF1A 프로모터 서열과 HER2CAR의 암호화 서열은 Shanghai Generay Biotech사에 위탁하여 합성하였다.
이하의 단계에 따라 pKB20-HER2CAR 벡터를 이용해 말초혈액으로부터 분리한 PBMC에 대해 전기천공을 수행하여, HER2 표적의 CAR-T 세포를 제조하였으며, 사용된 PBMC는 AllCells사에서 구입하였고, 이는 건강한 성인의 말초혈액에서 유래하였다.
1) 현탁 세포를 50ml 원심분리관에 수집하고, 1200rmp으로, 3분 동안 원심분리하였다.
2) 상청액을 버리고, 생리식염수를 넣어 재현탁하였으며, 1200rpm으로, 3분 동안 원심분리하고, 생리식염수를 버리며, 이 단계를 반복하여, 세포를 계수하였다.
3) 2개의 1.5ml 원심분리관을 취하고, 각 관에 5×106개 세포를 첨가하였으며, 1200rpm으로, 3분 동안 원심분리하였다.
4) 상청액을 버리고, 전기천공 키트(Lonza사에서 구입)를 취하여, 18μL의 solution I 시약과 82μl의 solution II 시약을 첨가하였으며, 제1관에는 5μg의 pKB20이 빈 플라스미드를 첨가하여 대조군으로 사용하고, 제2관에는 5μg의 pKB20- HER2CAR 플라스미드를 첨가하였다.
5) 원심분리관에 플라스미드가 혼합된 세포 현탁액을 전기천공 컵에 옮기고, 전기천공 기기에 넣어, 프로그램 T020을 선택하여, 전기충격을 가하였다.
6) 키트의 마이크로피펫을 사용하여 전기천공된 세포 현탁액을 AIM-V 배양액이 첨가된 12-웰 플레이트(2% FBS를 포함하는 AIM-V 배양액)로 옮기고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며; 동시에 5μg/mL HER2 세포외 영역 항원(Sino Biological 10004-H08H) 및 5μg/mL CD28 항체(ThermoFisher 14-0281-82)가 포함된 혼합액을 이용해 6-웰 플레이트의 2개 웰을 코팅하였고, 각각의 웰에 1mL를 첨가하고, 6-웰 플레이트를 37℃에서 배양하였다.
7) 6시간 후, 전기천공 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 세포를 HER2 세포외 영역 항원과 CD28 항체가 코팅된 6-웰 플레이트에 옮겼으며, 최종 농도가 100 IU/mL인 IL-2를 첨가하고, 배양액을 3ml까지 보충하여, 4일 내지 5일간 배양한 후, T 세포의 성장 상태를 관찰하였으며, 활성화된 세포를 2% FBS가 함유된 AIM-V 배양액에 옮겨 필요한 양까지 계속 배양하여, HER2CAR-T 세포를 획득하였으며; pKB20이 빈 세포에 옮겨 대조군의 Mock-T 세포로 사용하였다.
실시예 16. HER2CAR-T 세포 중 CAR 발현 양성 세포의 측정
1) 실시예 15에서 제조한 HER2CAR-T 세포 1×106개를 수집하였으며, 1000rpm으로, 3분간 원심분리하였다.
2) 상청액을 버리고, 각각 생리식염수를 첨가하여 세포를 재현탁하였으며, 1000rpm으로, 3분간 원심분리하였다.
3) 상청액을 버리고, 각각 100μL의 생리식염수를 첨가하여 세포를 재현탁하였으며, 각각의 관에 각각 1μL의 비오틴 마커의 HER2 항원(Kactus Biosystems에서 구입, 제품번호: HER-HM402)을 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다.
4) 각각 적정량의 생리식염수를 첨가하고, 1000rpm으로, 3분간 원심분리하였으며, 2회 세척하고, 상청액을 버렸다.
5) 각각 100μL의 생리식염수를 첨가하여 세포를 재현탁하고, 1μL의 PE 마커의 스트렙타비딘(ThermoFisher에서 구입, 제품 번호: S20982)을 첨가하였으며, 균일하게 혼합하여, 4℃에서 30분 동안 배양하였다.
6) 각각 적정량의 생리식염수를 첨가하고, 1000rpm으로, 3분간 원심분리하였으며, 2회 세척하고, 상청액을 버렸다.
7) 400μL의 생리식염수를 이용해 재현탁하고, 유세포 분석기로 측정하였다.
결과는 도 22에 도시된 바와 같이, 최고 93.41%에 달하는 세포가 PE 양성으로 나타났는데, 이는 pKB20-HER2CAR 플라스미드를 통해 PBMC를 전기천공하여 획득한 HER2CAR-T 세포에서 CAR 발현 양성의 세포가 차지하는 비중이 90% 이상임을 나타낸다.
실시예 17. HER2-CAR-T의 세포 사멸 기능 테스트
ACEA Biosciences사의 RTCA(real-time label-free cell function analyzer)를 이용하여 실시예 15에서 획득한 HER2CAR-T 세포의 생체외 사멸 활성을 검출하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다.
(1) 영점 조정: 각각의 웰에 50μL의 DMEM 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, 1단계를 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: 인간 난소암 세포 SKOV-3(ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입, HER2 발현 양성), 검출 전극을 포함하는 플레이트의 각각의 웰에 104개 세포/50μL로 도말하고, 몇 분 동안 방치하였으며, 세포가 안정된 다음 기기에 넣고, 2단계를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 표적 세포를 18시간 동안 배양한 후, 대조군 세포 Mock-T 및 이펙터 세포 HER2CAR-T를 웰당 50μL씩 각각 첨가하였고, HER2CAR-T는 각각 1:1, 2:1, 4:1의 3개 효과 표적비로 설정하였으며, Mock-T는 효과 표적비 4:1로 설정하였고, 효과 표적비의 설정은 생세포 총수에 따라 계산하고, 공동 배양을 시작하여, 60시간이 초과된 후, 세포 증식 곡선을 관찰하였다.
결과는 도 23에 도시된 바와 같이, 대조군 Mock-T 세포군의 사멸 곡선은 SKOV-3 종양 세포 곡선의 변화 추세에 근접하였는데, 이는 Mock-T 세포의 SKOV-3 세포에 대한 사멸 효과가 비교적 작음을 나타낸다. HER2CAR-T는 1:1, 2:1, 4:1의 3개 효과 표적비 하에서 SKOV-3 세포에 대한 사멸 효과가 모두 매우 현저하였으며, 사멸 효과는 효과 표적비가 높아질수록 유의하게 향상되었다.
실시예 18. pKB20-NY-ESO-1-TCR 및 NY-ESO-1 TCR-T 세포의 제조
pKB20-NY-ESO-1-TCR 벡터의 구축:
NY-ESO-1 항원 펩티드 SLLMWITQC(HLA-*02:01)를 식별하는 TCR의 α 사슬과 β 사슬을 암호화하는 유전자 DNA 서열을 합성하였는데, 이들 둘은 P2A 펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 의해 연결되며, 스플라이싱된 서열은 SEQ ID NO: 44로 표시된다. 다시 SEQ ID NO: 44의 3' 말단에서 P2A 펩타이드를 암호화하는 DNA를 통해 EGFP를 암호화하는 DNA 서열을 연결하여, EGFP 리딩 프레임에 공유 결합된 NY-ESO-1-TCR 유전자를 획득하였으며, 획득된 서열은 SEQ ID NO: 45로 표시된다. pKB20의 다클론 부위의 XbaI와 EcoRI 부위 사이에 NFAT 모티프를 갖는 EF1A 프로모터 서열(SEQ ID NO: 11)을 삽입하였고, EcoRI와 SalI 부위 사이에 EGFP 리딩 프레임에 공유 결합된 NY-ESO-1-TCR 유전자의 암호화 서열(SEQ ID NO: 45)을 삽입하였고, 이를 pKB20-NY-ESO-1-TCR로 명명하였으며, NFAT 모티프를 갖는 EF1A 프로모터 서열과 EGFP 리딩 프레임에 공유 결합된 NY-ESO-1-TCR 유전자의 암호화 서열은 Shanghai Generay Biotech사에 위탁하여 합성하였다.
NY-ESO-1 TCR-T 세포의 제조:
5 μg/ml의 항-CD3 항체(ThermoFisher 14-0037-82) 및 5μg/ml의 항-CD28 항체(ThermoFisher 14-0281-82)를 함유하는 코팅액을 이용하여 6-웰 플레이트를 실온에서 2시간 내지 4시간 동안 코팅하였으며, 코팅액을 흡인한 후 생리식염수로 웰 플레이트를 1회 내지 3회 세척하였고, 2% FBS가 함유된 AIM-V 배지를 첨가하여 준비하였고; 인간 말초혈액 PBMC(HLA-*02:01, ALLCELLS사에서 구입)는 37℃ 수조에서 회복시키고, PBMC를 벽에 부착하여 2시간 내지 4시간 동안 배양하였으며, 여기에서 벽에 부착되지 않은 현탁 세포가 바로 초기 T 세포이며, 현탁 세포를 15ml 원심분리관에 수집하고, 1200rpm으로 3분 동안 원심분리하여, 상청액을 버리고, 생리식염수를 첨가하였으며, 1200rpm으로 3분 동안 원심분리하여, 상청액을 버리며, 이 단계를 반복하였고, 다시 세척된 초기 T 세포를 사용될 배지가 담긴 항체 코팅 웰에 옮겨, 37℃, 5% CO2에서 3일 내지 4일 동안 배양한 후 후속 실험을 수행하였다.
전기천공으로 발현 NY-ESO-1 TCR-T 세포를 제조하는 단계를 하기와 같다.
1) AIM-V 배지를 12-웰 플레이트의 2개 웰에 미리 웰당 2mL씩 첨가한 후, 세포 인큐베이터 내로 옮겨 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 예열하였다.
2) 하기 표 8에 따라 각각의 웰에 1회 용량의 전기천공액 배합비를 준비하여, 2개 웰을 준비하였다.
3) 획득된 활성화된 T 세포를 취하여 2개의 EP관 내에 넣었으며, 각각의 EP관 내에는 5×106개 세포를 첨가하였고, 1200rpm으로 5분 동안 원심분리하였으며, 상청액을 버리고, 500μL 생리식염수로 세포를 재현탁하고, 원심분리 단계를 반복하여 세포 침전을 세척하였다.
4) 2)에서 구성된 2개 웰의 전기천공 액체계에 플라스미드 pKB20-NY-ESO-1-TCR 및 pKB20-EGFP 벡터를 각각 4μg씩 첨가한 후, 실온에서 30분 이내로 정치시켰다.
5) 4)에서 구성된 플라스미드가 함유된 전기천공액이 재현탁된 2개 관의 활성화된 T 세포를 사용하였으며, 각각의 관은 100μL이고, 세포 재현탁액을 조심스럼게 흡인하여 LONZA 100μL 전기천공 컵에 넣고, 전기천공 컵을 LONZA Nucleofector™ 2b 전기천공 홈 내에 넣어, 전기천공 프로그램을 가동하였으며, 전기천공 프로그램은 T-020을 선택하였다.
6) 전기천공이 완료된 후 전기천공 컵을 조심스럽게 꺼내고, 세포 현탁액을 흡인하여 EP관으로 옮겼으며, 각각의 관에는 예열된 AIM-V 배지 200μL를 첨가한 다음, 1)에서 12-웰 플레이트 내에 예열된 AIM-V 배지가 담긴 웰로 옮겼으며, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양한 후, 화합물 G150(MedChemExpress사에서 구입)을 최종 농도 5μM이 되도록 첨가한 후, 계속해서 13일 동안 배양하였고, 기간은 세포 증식에 따라 계대하였으며, 13일 후 각각의 전기천공 샘플의 세포 수와 세포 생존율을 측정하였고, 각각 NY-ESO-1 TCR-T 세포와 Mock-T 세포를 제조하였다.
실시예 19. NY-ESO-1 TCR-T 세포 NY-ESO-1 TCR 발현 양성 세포의 검출
1) 실시예 18에서 제조한 NY-ESO-1 TCR-T 세포 1×106개를 수집하였으며, 1000rpm으로, 3분간 원심분리하였다.
2) 상청액을 버리고, 각각 생리식염수를 첨가하여 세포를 재현탁하였으며, 1000rpm으로, 3분간 원심분리하였다.
3) 유세포 분석기로 검출하였다.
결과는 도 24에 도시된 바와 같으며, EGFP 발현 양성의 세포 비율은 37.57%였다. NY-ESO-1 TCR의 α 사슬과 β 사슬의 유전자 DNA 서열 및 EGFP의 암호화 DNA 서열은 이들 셋 사이가 P2A 펩티드 암호화 서열에 의해 연결되며, EGFP 발현 양성의 세포는 NY-ESO-1 TCR 유전자의 발현을 간접적으로 반영할 수 있다. NY-ESO-1 TCR 발현 양성의 세포 비율은 약 37%로 추측할 수 있다.
실시예 20. NY-ESO-1 TCR-T의 세포 사멸 기능 테스트
ACEA Biosciences사의 RTCA를 이용하여 실시예 18에서 획득한 NY-ESO-1 TCR-T 세포의 생체외 사멸 활성을 측정하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다.
(1) 영점 조정: 각 웰에 50μL의 DMEM 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, 1단계를 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: 인간 악성 흑색종 세포주 A375(ATCC에서 구입, NY-ESO-1 발현 양성), 검출 전극을 포함하는 플레이트의 각 웰에 104개 세포/50μL로 도말하고, 몇 분 동안 방치하였으며, 세포가 안정된 다음 기기에 넣고, 2단계를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 표적 세포를 18시간 동안 배양한 후, 세포 지수를 관찰하였으며, 세포 지수가 1일 때, 대조군 세포 Mock-T 및 이펙터 세포 NY-ESO-1 TCR-T를 웰당 50μL씩 각각 첨가하였고, NY-ESO-1 TCR-T는 0.25:1 및 0.5:1의 2개 효과 표적비로 설정하였으며, Mock-T는 효과 표적비 0.5:1로 설정하였고, 효과 표적비의 설정은 NY-ESO-1 TCR 발현 양성 세포 수에 따라 계산하고, 3단계 공동 배양을 시작하여, 70시간이 초과된 후, 세포 증식 곡선을 관찰하였다.
결과는 도 25에 도시된 바와 같이, 대조군 Mock-T 세포군의 사멸 곡선은 A375 종양 세포 곡선과 기본적으로 중첩되었는데, 이는 Mock-T 세포가 A375 세포에 대해 기본적으로 사멸 효과가 없음을 나타낸다. NY-ESO-1 TCR-T는 0.25:1 및 0.5:1의 2개 효과 표적비에서 A375 세포에 대한 사멸 효과가 모두 현저하였으며, 사멸 효과는 효과 표적비가 높아짐에 따라 유의하게 향상되었다.
비교예 1. K562 세포에서 EGFP 발현 카세트 함유 pNB 벡터의 통합
중국 특허 CN105154473B의 명세서 15페이지 실시예 1 및 명세서 16페이지 실시예 2에 기재된 방법에 따라, pNB 벡터와 pNB328-EGFP를 각각 구축하였다. 본 출원 실시예 4에 기재된 방법에 따라, pNB328-EGFP를 이용하여 전기천공법을 통해 EGFP를 안정적으로 통합 및 발현하는 K562를 제조하였으며, 전기천공 후 14일째(3계대 배양)에 EGFP 발현 양성의 세포를 유세포 분석으로 검출하였다.
결과는 도 26에 도시된 바와 같이, 전기천공 후 14일째에 EGFP 발현 양성의 K562 세포 비율은 45.54%였다.
비교예 2. 1차 T 세포에서 EGFP 발현 카세트 함유 pNB 벡터의 통합
본 출원 실시예 5에 기재된 방법에 따라, pNB328-EGFP를 이용하여 전기천공법을 통해 EGFP를 안정적으로 통합 및 발현하는 1차 T 세포를 제조하였으며, 전기천공 후 14일째(3계대 세포 배양)에 EGFP 발현 양성의 세포를 유세포 분석으로 검출하였다. 전기천공에 사용된 PBMC는 실시예 5에 사용된 PBMC와 동일한 배치의 PBMC이다. 전기천공 후 14일째에(3계대 배양) EGFP 발현 양성의 세포를 유세포 분석으로 검출하였다.
결과는 도 27에 도시된 바와 같이, 전기천공 후 14일째에 EGFP 발현 양성의 T 세포 비율은 34.60%였다.
본 발명의 구체적인 구현예을 상세하게 설명하였으나, 당업자라면 이해할 것이다. 개시된 모든 교시를 기반으로, 이러한 세부 내용을 다양하게 수정 및 치환할 수 있으며, 이러한 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 속한다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 의해 한정된다.

Claims (10)

  1. 일종의 핵산 구축물에 있어서,
    트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 요소를 포함하거나 이로 구성되고;
    바람직하게는, 상기 핵산 구축물은 트랜스포사제 암호화 서열, 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR, 제2 polyA 서열 및 관심 외래 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함하고,
    바람직하게는, 상기 트랜스포사제 암호화 서열, 상기 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 상기 5' UTR 및 상기 제2 polyA 서열 중 어느 하나 이상은 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이의 영역 밖에 있는 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  2. 제1항에 있어서,
    트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터 요소를 포함하고,
    바람직하게는, 상기 핵산 구축물은 다클론 삽입 부위, 인핸서, 5' UTR, 제2 polyA 서열 및 관심 외래 유전자로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 암호화 서열, 5' UTR 및 해당 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터를 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 인핸서, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 트랜스포존 3' 말단 반복 서열, 인핸서, 전사 종결 기능을 갖는 인슐레이터 서열, 다클론 삽입 부위, 제1 polyA 서열, 트랜스포존 5' 말단 반복 서열, 트랜스포사제 발현을 제어하는 프로모터, 5' UTR, 트랜스포사제 암호화 서열 및 제2 polyA 서열을 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 구축물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스포사제의 발현 카세트의 방향과 외래 유전자의 발현 카세트의 방향이 동일하거나 반대이거나;
    상기 트랜스포사제의 발현 카세트의 방향과 트랜스포존 3' 말단 반복 서열 및 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이 서열의 방향이 동일하거나 반대이거나;
    상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열과 상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 위치가 상호 호환될 수 있거나;
    상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열이 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 3' 말단 반복 서열이거나;
    상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열이 피기백 트랜스포존 5' 말단 반복 서열이거나;
    상기 인핸서는 CMV 인핸서 서열, SV40 인핸서 서열, 인간 ε 글로불린 5' HS2 인핸서, 닭 β 글로불린 유전자 5' HS4 인핸서로부터 선택되거나;
    상기 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제이거나;
    상기 5' UTR은 C3 유전자, ORM1 유전자, HPX 유전자, FGA 유전자, AGXT 유전자, ASL 유전자, APOA2 유전자, ALB 유전자의 5' UTR로부터 선택거나;
    상기 프로모터는 CMV 프로모터, miniCMV 프로모터, CMV53 프로모터, miniSV40 프로모터, miniTK 프로모터, MLP 프로모터, pJB42CAT5 프로모터, YB_TATA 프로모터, EF1α 프로모터, SV40 프로모터, UbiquitinB 프로모터, CAG 프로모터, HSP70 프로모터, PGK-1 프로모터, β-actin 프로모터, TK 프로모터 및 GRP78 프로모터로부터 선택되거나;
    상기 트랜스포사제 암호화 서열은 단일 카피 또는 다중 카피의 핵 위치 신호 암호화 서열을 포함하거나 작동 가능하도록 연결되는 것으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트랜스포존 3' 말단 반복 서열의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 1로 표시되거나;
    상기 트랜스포존 5' 말단 반복 서열의 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6으로 표시되거나;
    상기 다클론 삽입 부위의 서열이 SEQ ID NO: 2로 표시되거나;
    상기 제1 polyA 서열이 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로 표시되거나;
    상기 제2 polyA 서열이 SEQ ID NO: 3, 13 또는 16으로 표시되거나;
    상기 인핸서 서열이 SEQ ID NO: 4, 26 내지 28 중 어느 하나로 표시되거나;
    상기 인슐레이터 서열이 SEQ ID NO: 5 또는 15로 표시되거나;
    상기 피기백 트랜스포사제의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 36으로 표시되고, 바람직하게는, 상기 피기백 트랜스포사제의 암호화 서열이 SEQ ID NO: 7로 표시되거나;
    상기 5' UTR 서열이 SEQ ID NO: 8, 17 내지 24 중 어느 하나로 표시되거나;
    상기 프로모터의 서열이 SEQ ID NO: 9, 37 내지 42 중 어느 하나로 표시되거나; 그리고
    상기 핵 위치 신호가 c-myc 핵 위치 신호이고, 바람직하게는, 상기 핵 위치 신호가 SEQ ID NO: 35로 표시되는 서열을 갖는것으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 구비하는 것을 특징으로 하는, 핵산 구축물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 10 또는 14로 표시되는 서열을 포함하거나,
    상기 핵산 구축물은 재조합 벡터이고, 바람직하게는, 상기 핵산 구축물은 재조합 클로닝 벡터 또는 재조합 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  7. 일종의 숙주 세포에 있어서,
    (1) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물, 및/또는
    (2) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물의 트랜스포존 3' 말단 반복 서열과 트랜스포존 5' 말단 반복 서열 사이의 서열을 포함하고,
    바람직하게는, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포이고,
    보다 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 T 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로부터 선택되는 숙주 세포.
  8. 일종의 약학 조성물에 있어서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물 또는 제7항에 따른 숙주 세포 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물 또는 제7항에 따른 숙주 세포의, 약물, 시약 또는 도구 제조에서의 용도, 또는 약물, 시약 또는 도구로서의 용도에 있어서,
    상기 약물, 시약 또는 도구는 외래 유전자 발현 카세트를 표적 세포 게놈에 통합하는 데 사용되거나, 유전자 치료, 세포 치료, 줄기 세포 유도 또는 분화에 사용되고,
    바람직하게는, 상기 표적 세포는 포유동물 세포이고,
    보다 바람직하게는, 상기 표적 세포는 면역 세포, Jurkat 세포, K562 세포, 배아 줄기 세포, 종양 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로부터 선택되고,
    보다 바람직하게는, 상기 면역 세포는 T 세포, B 세포, CIK 세포, LAK 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(CTL), 수지상 세포(DC), 종양 침윤 림프구(TIL), 대식 세포, NK T 세포 및 γδT 세포 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 용도.
  10. 일종의 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 방법에 있어서,
    외래 유전자와 임의 선택된 그 프로모터의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물을 상기 세포에 도입하는 단계, 및
    임의 선택된 트랜스포사제가 외래 유전자 또는 그 발현 카세트를 세포 게놈에 통합하는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    상기 외래 유전자와 임의 선택된 그 프로모터는 상기 핵산 구축물의 다클론 삽입 부위에 위치하고,
    바람직하게는, 상기 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제인 것을 특징으로 하는 방법.
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