JP2022531231A - Ｃｄ８改変ｔ細胞療法を使用するがんの治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Ｃｄ８改変ｔ細胞療法を使用するがんの治療のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022531231000001
ＣＤ８発現コンストラクトと共にｎｅｏＴＣＲベース細胞療法を使用する、がんの治療のための組成物及び方法。所定の実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、少なくとも一種の単量体を含む。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８の少なくとも一種の単量体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む。
【選択図】図１７Ｂ

Description

［関連出願との相互参照］
この出願は、その内容がその全体について援用され、且つ優先権が主張される、２０１９年５月１日に出願された米国仮出願第６２／８４１７４８号と２０１９年５月１日に出願された米国仮出願第６２／８４１７５３号に基づく優先権を主張する。
［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、出典明示によりその全体がここに援用される配列表を含む。２０２０年４月３０日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、０８７５２０＿０１４５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、１２０２９４バイトのサイズである。
Ｔ細胞の活性化には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とその共受容体分子を介したシグナル伝達が必要とされる。ＣＤ４及びＣＤ８は、ペプチド－主要組織適合抗原（ｐＭＨＣ）リガンドとＴＣＲの間の相互作用を安定化することによってＴＣＲシグナル伝達を増強する共受容体として機能するＴヘルパー細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球上に発現される膜タンパク質である（Ｌｉ ＱＪ等（２００４）ＣＤ４ ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ Ｌｃｋ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：７９１－７９９；Ｈｏｌｌｅｒ ＰＤ，Ｋｒａｎｚ ＤＭ（２００３）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ／ｐｅｐＭＨＣ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ＣＤ８ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８：２５５－２６４）。具体的には、ＣＤ４及びＣＤ８共受容体は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体へのキナーゼの動員を促進するため、シグナル伝達の開始に必須である。更に、研究では、ＣＤ４及びＣＤ８共受容体は両方ともそのリガンドに対するＴ細胞の感受性を増強するが、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用の安定化にはＣＤ８のみが役割を果たすことが示されている。
更に、天然に生じるＭＨＣ－Ｉ ＴＣＲは、同時発生的なＣＤ８共受容体がペプチド－ＭＨＣ結合を安定化するのを助けることを必要とすると推定されるが、高親和性ＴＣＲは、ＣＤ８非依存性の標的結合とＴ細胞活性化を駆動する。従って、ＣＤ４ Ｔ細胞は、高親和性ＮｅｏＴＣＲで改変されると、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ標的を認識し、エフェクターＴ細胞機能をトリガーすることができる。しかしながら、低親和性ＴＣＲは、Ｔ細胞活性化をトリガーするにはＣＤ８共受容体に依存する。
従って、ＣＤ８共受容体を発現するように改変されたＮｅｏＴＣＲ細胞治療法は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用を安定させ、そのようなＣＤ８共受容体に依存する低親和性ＴＣＲを含むＮｅｏＴＣＲ細胞治療法の有効性を高めうる。
所定の実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、少なくとも一種の単量体を含む。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８の少なくとも一種の単量体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む。所定の実施態様では、細胞外ドメインは、ＣＤ８α細胞外ドメイン又はＣＤ８β細胞外ドメインを含む。所定の実施態様では、膜貫通はＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ８β膜貫通ドメインである。所定の実施態様では、細胞内ドメインは、ＣＤ８α細胞内ドメイン又はＣＤ８β細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、細胞内ドメインは、ＣＤ４細胞内ドメインを含む。
所定の実施態様では、少なくとも一種の単量体は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、少なくとも一種の単量体は、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、少なくとも一種の単量体は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、少なくとも一種の単量体は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、少なくとも一種の単量体は、シグナルペプチドを含む。所定の実施態様では、シグナルペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチドである。
所定の実施態様では、細胞外ドメインは、配列番号：１４０、又は配列番号：１４５に記載のアミノ酸配列を含む。所定の実施態様では、膜貫通ドメインは、配列番号：１４１、又は配列番号：１４６に記載のアミノ酸配列を含む。所定の実施態様では、細胞内ドメインは、配列番号：１４２、配列番号：１４７、又は配列番号：１４８に記載のアミノ酸配列を含む。所定の実施態様では、シグナルペプチドは、配列番号：１３９、又は配列番号：１４４に記載のアミノ酸配列を含む。
所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、２Ａ配列を含む。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８はリンカーを含む。所定の実施態様では、リンカーは、配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列を含む。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、プロテアーゼ切断部位を含む。所定の実施態様では、プロテアーゼ切断部位は、フューリン切断部位である。
所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは患者由来のＴＣＲである。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲはがん抗原を認識する。所定の実施態様では、がん抗原はネオ抗原である。所定の実施態様では、がん抗原は患者特異的抗原である。
所定の実施態様では、細胞は初代細胞である。所定の実施態様では、細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞はリンパ球である。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、細胞は幼若Ｔ細胞である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である。
所定の実施態様では、細胞は、細胞持続性を増強するため、及び／又はメモリー細胞分化を増強するための遺伝子改変を更に含む。所定の実施態様では、細胞の殺傷活性は、外因性ＣＤ８を有していない細胞の殺傷活性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。所定の実施態様では、ＴＣＲの抗原への結合時の細胞の増殖は、外因性ＣＤ８を有していない細胞の増殖と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。所定の実施態様では、細胞による抗原へのＴＣＲの結合時の炎症誘発性サイトカインの分泌は、外因性ＣＤ８を有していない細胞による分泌と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。所定の実施態様では、細胞のＬＣＫ親和性は、外因性ＣＤ８を有していない細胞のＬＣＫ親和性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。所定の実施態様では、細胞の持続性は、外因性ＣＤ８を有していない細胞の持続性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。所定の実施態様では、細胞の腫瘍浸潤能力は、外因性ＣＤ８を有していない細胞の腫瘍浸潤能力と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。
所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは、ＣＤ８依存性ＴＣＲである。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは、ＣＤ８非依存性ＴＣＲである。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４によってコードされる。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法を提供し、該方法は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む工程と、ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＣＤ８遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列、ＣＤ８遺伝子配列の下流でＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第二の２Ａコード配列、及びＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第三の２Ａコード配列を含み；ここで、第一、第二、及び第三の２Ａコード配列は、同じアミノ酸配列をコードし、且つ互いにコドンが異なる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一、第二、及び／又は第三の２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一、第二、及び／又は第三の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を更に含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲ遺伝子配列及び／又はＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置するシグナル配列をコードする配列を更に含む。
所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第三の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一のＴＣＲ遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第一のシグナル配列をコードする配列と、第二のＴＣＲ遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第二のシグナル配列をコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二の２Ａコード配列との間に位置する第二のＣＤ８遺伝子配列を含む。所定の実施態様では、２Ａコード配列は、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する。所定の実施態様では、アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列は、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する。所定の実施態様では、フューリン切断部位をコードする配列は、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する。
所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、細胞外ドメインをコードする配列、細胞内ドメインをコードする配列、細胞内ドメインをコードする配列、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む。所定の実施態様では、細胞外ドメインをコードする配列は、ＣＤ８α細胞外ドメイン又はＣＤ８β細胞外ドメインをコードする配列を含む。所定の実施態様では、膜貫通ドメインをコードする配列は、ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ８β膜貫通ドメインをコードする配列を含む。所定の実施態様では、細胞内ドメインをコードする配列は、ＣＤ８α細胞内ドメイン又はＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む。所定の実施態様では、細胞内ドメインをコードする配列は、ＣＤ４細胞内ドメインをコードする配列を含む。
所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインをコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインをコードする配列を含む。
所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、第一のＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第一のシグナル配列をコードする配列と、第二のＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第二のシグナル配列をコードする配列を含む。所定の実施態様では、シグナル配列は、ＣＤ８シグナル配列、ヒト成長ホルモンシグナル配列、それらの断片、又はそれらの組み合わせである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型の第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型の第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である。
所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは患者由来のＴＣＲである。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲは、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む。所定の実施態様では、外因性ＴＣＲはがん抗原を認識する。所定の実施態様では、がん抗原はネオ抗原である。所定の実施態様では、がん抗原は患者特異的抗原である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は非ウイルス性である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は環状ＤＮＡである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は直鎖ＤＮＡである。所定の実施態様では、導入は、エレクトロポレーションを介して生じる。
所定の実施態様では、組換えは、ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断、及び相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換えを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である。所定の実施態様では、ヌクレアーゼはｇＲＮＡを更に含む。
所定の実施態様では、方法は、細胞を培養することを更に含む。所定の実施態様では、培養は、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる。所定の実施態様では、培養は、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる。所定の実施態様では、培養はＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる。所定の実施態様では、方法は、細胞持続性を増強し、及び／又はメモリー細胞分化を増強する遺伝子改変を含む。
所定の実施態様では、細胞は初代細胞である。所定の実施態様では、細胞は患者由来の細胞である。所定の実施態様では、細胞はリンパ球である。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、細胞は幼若Ｔ細胞である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である。所定の実施態様では、細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である。
所定の実施態様では、細胞の殺傷活性は、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の殺傷活性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加する。所定の実施態様では、ＴＣＲの抗原への結合時の細胞の増殖は、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の増殖と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している。所定の実施態様では、細胞による抗原へのＴＣＲの結合時の炎症誘発性サイトカインの分泌は、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞による分泌と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している。所定の実施態様では、細胞のＬＣＫ親和性は、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞のＬＣＫ親和性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している。細胞の持続性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の持続性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４３－９５の何れか一の方法。所定の実施態様では、細胞の腫瘍浸潤能力は、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の腫瘍浸潤能力と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している。
所定の実施態様では、ＴＣＲ遺伝子は、ＣＤ８依存性ＴＣＲをコードする。所定の実施態様では、ＴＣＲ遺伝子は、ＣＤ８非依存性ＴＣＲをコードする。所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４によってコードされる。所定の実施態様では、ＣＤ８遺伝子配列は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む。所定の実施態様では、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示された方法の何れかによって改変された細胞を提供する。
所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示された細胞の有効量を含む組成物を提供する。所定の実施態様では、組成物は、薬学的に許容される添加物を更に含む薬学的組成物である。所定の実施態様では、組成物は、がんの治療のために治療を必要とする患者に投与される。所定の実施態様では、組成物は凍結保存剤を含む。所定の実施態様では、組成物は血清アルブミンを含む。所定の実施態様では、組成物は、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、ＨＳＡ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、ここに開示された細胞又は組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
所定の実施態様では、治療有効量の細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される。所定の実施態様では、がんは固形腫瘍である。所定の実施態様では、がんは液体腫瘍である。所定の実施態様では、固形腫瘍は、メラノーマ、胸部がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、婦人科がん、中枢神経系がん、皮膚がん、ＨＰＶ＋がん、食道がん、甲状腺がん、胃がん、肝細胞がん、胆管がん、腎細胞がん、精巣がん、肉腫、及び結腸直腸がんからなる群から選択される。所定の実施態様では、液体腫瘍は、濾胞性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示された細胞、ここに開示された方法を実施するための試薬、又はここに開示された組成物を含むキットを提供する。所定の実施態様では、キットは、がんを治療するための書面による説明書を更に含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；並びにＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。
所定の実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；並びにＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。
所定の実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法を提供し、該方法は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む、工程；並びにＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程であって、ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、工程を含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法を提供し、該方法は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む、工程；並びにＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程であって、ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、工程を含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、細胞を含む組成物を提供し、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、細胞を含む組成物を提供し、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の細胞を投与することを含み、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む。
所定の実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の細胞を投与することを含み、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８は、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む。
図１Ａ－１Ｃは、ＮｅｏＴＣＲ生成物を作製するために使用できるＮｅｏＥ ＴＣＲカセット及び遺伝子編集方法の例を示している。図１Ａは、ネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクト（ｎｅｏＴＣＲ）をＴＣＲα遺伝子座に組み込むために使用される一般的なターゲティング戦略を表す概略図を示す。 図１Ｂ及び１Ｃは、ＮｅｏＴＣＲをＴＣＲα遺伝子座に組み込むために使用されるネオ抗原特異的ＴＣＲコンストラクトのデザインを示し、カセットはシグナル配列（「ＳＳ」）、プロテアーゼ切断部位（「Ｐ」）、及び２Ａペプチド（「２Ａ」）と共に示されている。図１Ｂは、標的ＴＣＲα遺伝子座（内因性ＴＲＡＣ、上部パネル）とそのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的部位（水平縞、切断部位は矢印で示される）、及び組込み前は左右の相同性アーム（それぞれ「ＬＨＡ」及び「ＲＨＡ」）の間に位置する、ｎｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドと共に環状プラスミドＨＲ鋳型（下部パネル）を示している。 図１Ｃは、ＴＣＲα遺伝子座に組み込まれたｎｅｏＴＣＲ（上部パネル）、転写され且つスプライシングされたｎｅｏＴＣＲ ｍＲＮＡ（中央パネル）、及び発現されたｎｅｏＴＣＲの翻訳且つプロセシング（下部パネル）を示している。 図２Ａ－２Ｄは、ＣＤ８コンストラクト１、２、３、及び４をコードするために使用される環状プラスミドを示す。図２Ａは、ＣＤ８生成物１を産生するために使用されるＣＤ８コンストラクト１を示す。図２Ｂは、ＣＤ８生成物２を産生するために使用されるＣＤ８コンストラクト２を示す。図２Ｃは、ＣＤ８生成物３を産生するために使用されるＣＤ８コンストラクト３を示す。図２Ｄは、ＣＤ８生成物４を産生するために使用されるＣＤ８コンストラクト４を示す。図２Ａ－２Ｄに示される場合、ＳＳはシグナル配列を表す。図６、７、８、及び９に記載されるように、ＳＳはＨＧＨでありうる；しかしながら、適切な輸送のために必要ならば他のシグナル配列を使用してもよい。図２Ａ－２Ｄに示される場合、Ｐはプロテアーゼ切断部位を表す。図６、７、８、及び９に記載されるように、Ｐはフューリンでありうる；しかしながら、ここに記載の切断作用をもたらすために適切ならば他のプロテアーゼ切断部位を使用してもよい。図２Ａ－２Ｄに示される場合、２Ａは２Ａペプチドを表す。図６、７、８、及び９に記載されるように、２ＡはＰ２Ａペプチドでありうる；しかしながら、他の２Ａペプチドを使用してもよい。 上記 上記 上記 図３Ａ－３Ｄは、ＣＤ８生成物１、２、３、及び４を生成するためのＣＤ８コンストラクト１、２、３、及び４の各々の転写／スプライシング及び翻訳プロセシングを示す。図３Ａ－３Ｄに示される場合、ＳＳはシグナル配列を表す。図６、７、８、及び９に記載されるように、ＳＳはＨＧＨでありうる；しかしながら、適切な輸送のために必要ならば他のシグナル配列を使用してもよい。図３Ａ－３Ｄに示される場合、Ｐはプロテアーゼ切断部位を表す。図６、７、８、及び９に記載されるように、Ｐはフューリンでありうる；しかしながら、ここに記載の切断作用をもたらすために適切ならば他のプロテアーゼ切断部位を使用してもよい。図３Ａ－３Ｄに示される場合、２Ａは２Ａペプチドを表す。図６、７、８、及び９に記載されるように、２ＡはＰ２Ａペプチドでありうる；しかしながら、他の２Ａペプチドを使用してもよい。 上記 上記 上記 図４Ａは、ＣＤ８生成物１とＣＤ８生成物２の翻訳産物を示す。 図４Ｂは、ＣＤ８生成物３とＣＤ８生成物４の翻訳産物を示す。 図５は、図１Ａ－１Ｃに記載されたＮｅｏＴＣＲコンストラクトの例示的ＤＮＡ配列を提供する。核酸の保存的置換を全体を通して使用して、同じ翻訳産物を得ることができる。更に、機能変化なしにアミノ酸を置換できる場合、図５に提供される核酸の置換をまた使用して、翻訳されたタンパク質の実質的に類似の又は同一の機能をもたらす置換アミノ酸を実現することができる。 上記 上記 上記 図６は、図２Ａ、３Ａ、及び４Ａに記載されているＣＤ８コンストラクト１（及び翻訳されたＣＤ８生成物１）の例示的なＤＮＡ配列を提供する。核酸の保存的置換を全体を通して使用して、同じ翻訳産物を得ることができる。更に、機能変化なしにアミノ酸を置換できる場合、図６に提供される核酸の置換をまた使用して、翻訳されたタンパク質の実質的に類似の又は同一の機能をもたらす置換アミノ酸を実現することができる。 上記 上記 上記 上記 図７は、図２Ｂ、３Ｂ、及び４Ａに記載されているＣＤ８コンストラクト２（及び翻訳されたＣＤ８生成物２）の例示的なＤＮＡ配列を提供する。核酸の保存的置換を全体を通して使用して、同じ翻訳産物を得ることができる。更に、機能変化なしにアミノ酸を置換できる場合、図７に提供される核酸の置換をまた使用して、翻訳されたタンパク質の実質的に類似の又は同一の機能をもたらす置換アミノ酸を実現することができる。 上記 上記 上記 上記 上記 図８は、図２Ｃ、３Ｃ、及び４Ｂに記載されているＣＤ８コンストラクト３（及び翻訳されたＣＤ８生成物３）の例示的なＤＮＡ配列を提供する。核酸の保存的置換を全体を通して使用して、同じ翻訳産物を得ることができる。更に、機能変化なしにアミノ酸を置換できる場合、図８に提供される核酸の置換をまた使用して、翻訳されたタンパク質の実質的に類似の又は同一の機能をもたらす置換アミノ酸を実現することができる。 上記 上記 上記 上記 図９は、図２Ｄ、３Ｄ、及び４Ｂに記載されているＣＤ８コンストラクト４（及び翻訳されたＣＤ８生成物４）の例示的なＤＮＡ配列を提供する。核酸の保存的置換を全体を通して使用して、同じ翻訳産物を得ることができる。更に、機能変化なしにアミノ酸を置換できる場合、図９に提供される核酸の置換をまた使用して、翻訳されたタンパク質の実質的に類似の又は同一の機能をもたらす置換アミノ酸を実現することができる。 上記 上記 上記 上記 図１０は、ＣＤ８生成物１、２、３、及び４の視覚的描写を、ＣＤ８生成物１、２、３、及び４のそれぞれの予測ＬＣＫ活性と共に提示する。 図１１Ａは、ＣＤ８生成物１の例示的な発現コンストラクトを提供する。 図１１Ｂは、ＣＤ８生成物２の例示的な発現コンストラクトを提供する。 図１１Ｃは、ＣＤ８生成物３の例示的な発現コンストラクトを提供する。 図１１Ｄは、ＣＤ８生成物４の例示的な発現コンストラクトを提供する。 図１２は、ＣＤ８生成物の殺傷能力を示すＩｎｃｕｃｙｔｅ実験のデザインを図示している。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞集団における、ＣＤ８生成物４と同じＮｅｏＴＣＲを有するＮｅｏＴＣＲ生成物と比較しての、ＣＤ８生成物４の腫瘍殺傷能力の増加を示している。具体的には、ＣＤ８生成物４とＮｅｏＴＣＲ生成物の両方がＴＣＲ０９７を発現する。しかし、ＣＤ８生成物４は、ＣＤ８αの細胞外ドメインとＣＤ４の細胞内ドメインを含むＣＤ８コンストラクト４をまた発現する。エフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は１：１（図１３Ａ）又は２：１（図１３Ｂ）であり、それぞれを細胞株毎に遺伝子編集のために正規化した。この実験において使用したＳＷ６２０ ＣＯＸ６Ｃ Ｒ２０Ｑヘテロ接合性腫瘍細胞は、ＴＣＲ０９７（ＣＤ８依存性ＴＣＲ）の同族抗原を発現する細胞株であった。これは、ＣＤ８αの細胞外ドメインとＣＤ４の細胞内ドメインを共発現させることにより、ＴＣＲ０９７の低親和性結合を保存できることを示している。 上記 図１４は、ＣＤ４ Ｔ細胞集団における、ＣＤ８生成物４と同じＮｅｏＴＣＲを有するＮｅｏＴＣＲ生成物と比較しての、ＣＤ８生成物４の腫瘍殺傷能力の増加を示している。具体的には、ＣＤ８生成物４とＮｅｏＴＣＲ生成物の両方がＴＣＲ０９７を発現する。しかし、ＣＤ８生成物４は、ＣＤ８ａの細胞外ドメインとＣＤ４の細胞内ドメインを含むＣＤ８コンストラクト４をまた発現する。エフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は１：１、１：２、又は１：４であり、それぞれを細胞株毎に遺伝子編集のために正規化した。この実験において使用したＳＷ６２０ ＣＯＸ６Ｃ Ｒ２０Ｑホモ接合性腫瘍細胞は、ＴＣＲ０９７の同族抗原を発現する細胞株であった。細胞株は同族抗原の発現に対してホモ接合性であるため、図１３Ａ及び１３Ｂに示されているものと比較して、この実験では殺傷の増加が見られる；よって、ＴＣＲ９７は低親和性ＴＣＲであるが、同族抗原の量の増加が低親和性の制限を克服した。 図１５Ａ及び１５Ｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞（図１５Ａ及び１５Ｂの上のグラフ）又はＣＤ８ Ｔ細胞（図１５Ａ及び１５Ｂの下のグラフ）の集団においてＣＤ８生成物４と同じＮｅｏＴＣＲを有するＮｅｏＴＣＲ生成物と比較してＣＤ８生成物４の腫瘍殺傷能力が増加していることと、ＣＤ８生成物４が、ＣＤ８ Ｔ細胞においてＮｅｏＴＣＲコンストラクト及びＣＤ８生成物４を単に発現させるよりも腫瘍殺傷についてより効果的であることを示している例示的な対照実験を提供する。図１５Ａは２：１のＥ：Ｔ比を示し、図１５Ｂは１：１のＥ：Ｔ比を示している。 図１６は、ＣＤ８コンストラクト４の表面発現を示している。ピーク＃１は、（ＴＣＲ０８９を発現する）ＣＤ４＋／ＣＤ８－Ｔ細胞におけるＮｅｏＴＣＲ生成物である。ピーク＃２は、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８生成物４である。ピーク＃３は、ＣＤ８＋／ＣＤ４－Ｔ細胞におけるＮｅｏＴＣＲ生成物である。示されているように、ＣＤ８コンストラクト４は、ＮｅｏＴＣＲ生成物と同等の適切な表面発現を示した。他のＣＤ８コンストラクトでも同様の結果が達成された（データは示さず）。 図１７Ａ及び１７Ｂは、ＣＤ８αの発現が特異性を維持しながらＣＤ４ Ｔ細胞の感受性をブーストすることを示している。図１７Ａは、ＣＤ８コンストラクト１－４の発現が、Ｔ細胞の感受性を高め、ＮｅｏＴＣＲに対するＣＤ８生成物の特異性を変化させないことを示している。示されているように、ＣＤ８コンストラクトの共発現はＥＣ５０を減少させ、これはＮｅｏＴＣＲに対する感受性の増加を示す。図１７Ｂは、同族抗原の存在下でＣＤ８生成物１－４のＣＤ８細胞によるＩＮＦγ産生のみが存在する（つまり、ミスマッチ抗原の存在下でのＣＤ８生成物１－４のＣＤ８細胞によるＩＮＦγ産生がない）ため、ＣＤ８生成物１－４がＮｅｏＴＣＲ０９７に対する同族抗原に特異的であることを示している。図１７Ａ及び１７Ｂに示されるものと同じ実験を、ＩＮＦγの代わりにＣＤ１０７ａで実施し、ＮｅｏＴＣＲへの特異性を維持したまま同じ感受性の増加が示され（データは示さず）、ＩＮＦγでの結果を確認した。 図１８は、ＣＤ８αの発現がＣＤ８非依存性ＮｅｏＴＣＲのなかでＣＤ４ Ｔ細胞感受性をブーストすることを示している。この図は、ＣＤ８非依存性ＮｅｏＴＣＲ０８９のデータを示している。これは、ＮｅｏＴＣＲがＣＤ８非依存性である場合でも、ＣＤ８生成物４の感受性が増加することを示している。これは、ＣＤ８非依存性ＴＣＲでも感受性を増加しうることを発見した驚くべき結果であった。ＣＤ８生成物１－３でも同様の結果が達成された（データは示さず）。よって、ＣＤ８依存性（例えば、ＮｅｏＴＣＲ０９７）及びＣＤ８非依存性（例えば、ＮｅｏＴＣＲ０８９）は、同じＮｅｏＴＣＲを発現するＮｅｏＴＣＲ生成物と比較して増加した感受性を示す。
［定義］
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本開示の主題で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここで使用される場合、次の用語は、特に明記しない限り、以下の定義に帰する意味を有している。
ここに記載の本発明の態様及び実施態様は、「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」態様及び実施態様を含むことが理解される。「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」という用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することを意図しており、「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味しうる。
ここで使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、値がどのように測定され又は決定されるかに、すなわち、測定系の制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行に従って、３又は３を超える標準偏差内を意味しうる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味しうる。あるいは、特に生物システム又はプロセスに関して、この用語は、値の一桁分以内、例えば、値の５倍以内又は２倍以内を意味しうる。
ここで使用される「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性及び三重特異性抗体）、及びそれらが所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片（例えば、ビス－Ｆａｂ）を含む、様々な抗体構造を包含する。ここで使用される「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、ビス－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
「がん」及び「腫瘍」という用語は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用される場合、「がん」又は「腫瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、全ての新生物細胞の成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。該用語は、更に、典型的には未制御の細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を参照し又は記述するために使用される。がんは、限定されないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、ファロピウス管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器、尿管、尿道、子宮、及び膣、又はその組織若しくは細胞型からなる群から選択される器官を含む、様々な細胞型、組織、又は器官を罹患させうる。がんには、肉腫、癌腫、又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが含まれる。がんの例には、限定されないが、ここに記載されているものが含まれる。「がん」又は「腫瘍」及び「増殖性疾患」という用語は、ここで使用される場合、相互に排他的ではない。
「ＣＤ８」は、免疫系内の効率的な細胞間相互作用を媒介する殆どの細胞傷害性Ｔリンパ球に見出される細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ８抗原は、Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体と共に共受容体として作用し、クラスＩ ＭＨＣ分子との関連で抗原提示細胞によってディスプレイされる抗原を認識する。
ここで使用される「ＣＤ８細胞」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ８コンストラクトを発現するように精密に改変された一又は複数の細胞を意味する。
ここで使用される「ＣＤ８コンストラクト」は、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４の何れか一を意味する。
ここで使用される「ＣＤ８生成物」は、ＣＤ８細胞を含む生成物を意味する。
「ＣＤ８コンストラクト１」及び「ＣＤ８生成物１」は、ＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ８α（ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン）を含むコンストラクトと、発現されたＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ８αを含む生じた生成物を指す。ＣＤ８生成物１の非限定的な例は、図２Ａ、３Ａ、及び６に提供される。ＣＤ８生成物１の非限定的な例は、図４Ａに提供される。
「ＣＤ８コンストラクト２」及び「ＣＤ８生成物２」は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α（ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン）、及びＣＤ８β（ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン）を含むコンストラクトと、発現されたＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α、及びＣＤ８βを含む生じた生成物を指す。ＣＤ８生成物２の非限定的な例は、図２Ｂ、３Ｂ、及び７に提供される。ＣＤ８生成物１の非限定的な例は、図４Ａに提供される。
「ＣＤ８コンストラクト３」及び「ＣＤ８生成物３」は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含むコンストラクトと、発現されたＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む生じた生成物を指す。ＣＤ８生成物３の非限定的な例は、図２Ｃ、３Ｃ、及び８に提供される。ＣＤ８生成物１の非限定的な例は、図４Ｂに提供される。
「ＣＤ８コンストラクト４」及び「ＣＤ８生成物４」は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含むコンストラクトと、発現したＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む生じた生成物を指す。ＣＤ８生成物４の非限定的な例は、図２Ｄ、３Ｄ、及び９に提供される。ＣＤ８生成物１の非限定的な例は、図４Ｂに提供される。
「保存的置換」又は「保存的アミノ酸」は、アミノ酸の化学的又は機能的に類似したアミノ酸による置換を指す。類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該技術分野でよく知られている。
所定の実施態様では、酸性アミノ酸Ｄ及びＥは、互いの保存的置換であり；塩基性アミノ酸Ｋ、Ｒ、及びＨは、互いに保存的置換であり；親水性の非荷電アミノ酸Ｓ、Ｔ、Ｎ、及びＱは、互いに保存的置換であり；脂肪族の非荷電アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、及びＩは、互いに保存的置換であり；非極性の非荷電アミノ酸Ｃ、Ｍ、及びＰは、互いに保存的置換であり；芳香族アミノ酸Ｆ、Ｙ、及びＷは、互いに保存的置換であり；Ａ、Ｓ、及びＴは、互いに保存的置換であり；Ｄ及びＥは、互いに保存的置換であり；Ｎ及びＱは、互いに保存的置換であり；Ｒ及びＫは、互いに保存的置換であり；Ｉ、Ｌ、及びＭは、互いに保存的置換であり；Ｆ、Ｙ、及びＷは、互いに保存的置換であり；Ａ及びＧは、互いに保存的置換であり；Ｄ及びＥは、互いに保存的置換であり；Ｎ及びＱは、互いに保存的置換であり；Ｒ、Ｋ、及びＨは、互いに保存的置換であり；Ｉ、Ｌ、Ｍ、及びＶは、互いに保存的置換であり；Ｆ、Ｙ、及びＷは、互いに保存的置換であり；Ｓ及びＴは、互いに保存的置換であり；並びにＣ及びＭは、互いに保存的置換である。
追加の保存的置換は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２版（１９９３）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに見出されうる。
「治療する（Treat）」、「治療（Treatment）」、及び「治療すること（treating）」は互換的に使用され、ここで使用される場合、臨床結果を含む有益な又は望ましい結果を得ることを意味する。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的病理的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。幾つかの実施態様では、本発明のＮｅｏＴＣＲ生成物は、増殖性疾患（例えば、がん）の発症を遅らせるために、又はそのような疾患の進行を遅らせるために使用される。
ここで使用される「デキストラマー」は、その同族ＮｅｏＴＣＲに特異的に結合する多量体化されたネオエピトープ－ＨＬＡ複合体を意味する。
ここで使用される場合、「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」又は「ｎｅｏＥ」という用語は、例えば、体細胞変異から生じ、「非自己」として認識される、新しく形成された抗原決定基を指す。「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」又は「ｎｅｏＥ」を生じさせる変異には、フレームシフト又は非フレームシフトインデル、ミスセンス又はナンセンス置換、スプライス部位変化（例えば、選択的スプライシングされた転写物）、ゲノム再編成又は遺伝子融合、何らかのゲノム又は発現変化、又は何らかの翻訳後修飾が含まれうる。
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ」、「ＮｅｏＥ ＴＣＲ」及び「外因性ＴＣＲ」は、例えば遺伝子編集法によって、Ｔ細胞に導入されるネオエピトープ特異的Ｔ細胞受容体を意味する。ここで使用される場合、「ＴＣＲ遺伝子配列」という用語は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子配列を指す。
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ細胞」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲを発現するように精密に改変された一又は複数の細胞を意味する。所定の実施態様では、細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。所定の実施態様では、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が投与される患者の自己細胞である。「ＮｅｏＴＣＲ細胞」及び「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１ Ｔ細胞」及び「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１細胞」という用語は、ここでは交換可能に使用される。
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲ生成物」は、一又は複数のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む薬学的製剤を意味する。ＮｅｏＴＣＲ生成物は、自己の精密ゲノム改変されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。標的ＤＮＡを介した非ウイルス精密ゲノム工学アプローチを使用して、内因性ＴＣＲの発現が排除され、腫瘍排他的ネオエピトープを標的とする末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離された患者特異的ＮｅｏＴＣＲによって置換される。所定の実施態様では、得られた改変ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞は、天然発現レベル、天然ＴＣＲ機能で、天然配列のその表面上にＮｅｏＴＣＲを発現する。ＮｅｏＴＣＲ外部結合ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの配列は、天然ＣＤ８＋Ｔ細胞から単離されたＴＣＲから未修飾である。ＮｅｏＴＣＲ遺伝子発現の調節は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子カセットがゲノムに組み込まれている場所の上流に位置する天然の内因性ＴＣＲプロモーターによって駆動される。このアプローチにより、ＮｅｏＴＣＲ発現の天然のレベルは、未刺激の抗原活性化Ｔ細胞状態で観察される。
各患者向けに製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物は、その同じ患者の末梢血から個別に単離されたｎｅｏＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からクローン化された単一のｎｅｏＥ特異的ＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変された自己ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞の定まった用量を表す。
ここで使用される「ＮｅｏＴＣＲウイルス生成物」は、ゲノム改変がウイルス媒介法を使用して実施されることを除いて、ＮｅｏＴＣＲ生成物と同じ定義を有する。
「薬学的製剤」は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性を有効であるようにする形態であって、製剤が投与されうる対象に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含まない製剤を指す。明確にするために、ＮｅｏＴＣＲ生成物において使用される量のＤＭＳＯは許容できないほど毒性であるとはみなされない。
治療の目的での「対象」、「患者」、又は「個体」は、ヒト、家畜動物、飼育動物、及び動物園動物、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで使用される「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を意味する。
ここで使用される「腫瘍抗原」という用語は、正常又は非腫瘍性細胞と比較して腫瘍細胞上に独特に又は差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を指す。所定の実施態様では、腫瘍抗原には、抗原認識受容体を介して免疫応答を活性化又は誘導することができ、あるいは受容体－リガンド結合を介して免疫応答を抑制することができる、腫瘍によって発現される任意のポリペプチドが含まれる。
「２Ａ」及び「２Ａペプチド」は、ここでは交換可能に使用され、真核細胞での翻訳中にペプチドの切断を媒介することができる１８－２２アミノ酸長のウイルスの自己切断型ペプチドのクラスを意味する。
２Ａペプチドクラスの四種のよく知られたメンバーは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａである。Ｔ２Ａペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａにおいて最初に同定された。Ｐ２Ａペプチドは、ブタのテッショウウイルス－１ ２Ａで最初に同定された。Ｅ２Ａペプチドは、ウマ鼻炎Ａウイルスで最初に同定された。Ｆ２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルスで最初に同定された。
２Ａペプチドの自己切断メカニズムは、リボソームが２ＡのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の形成をスキップした結果である。具体的には、２Ａペプチドは、立体障害の作成とリボソームスキッピングに必要なＣ末端保存配列を有している。リボソームスキッピングは、次の三つの選択肢の一つをもたらしうる：１）スキッピングが成功し、翻訳が再開し、二つの切断タンパク質（Ｃ末端プロリンを除く完全な２Ａペプチドに結合する２Ａタンパク質の上流とＮ末端で一つのプロリンに結合する２Ａタンパク質の下流）が生じ；２）スキッピングは成功するが、リボソームの脱落により翻訳が中断され、２Ａの上流のタンパク質のみが生じ；あるいは３）スキッピングが失敗し、翻訳が継続する（すなわち、融合タンパク質）。
ここで使用される「内因性」という用語は、通常は、細胞又は組織において発現される核酸分子又はポリペプチドを指す。
ここで使用される「外因性」という用語は、細胞内に内因的には存在しない核酸分子又はポリペプチドを指す。従って、「外因性」という用語は、外来、異種、及び過剰発現された核酸分子及びポリペプチドなど、細胞内で発現される任意の組換え核酸分子又はポリペプチドを包含するであろう。「外因性」核酸とは、天然の野生型細胞に存在しない核酸を意味する；例えば、外因性核酸は、配列、位置（position）／位置（location）、又はその両方によって内因性の対応物とは異なりうる。明確にするために、外因性核酸は、その天然の内因性対応物と比較して同じ又は異なる配列を有しうる；それは、遺伝子工学によって細胞自体又はその前駆細胞に導入され得、任意選択的に、非天然プロモーター又は分泌配列などの代替制御配列に連結されうる。
Ｔ細胞に関連する場合、「幼若」又は「より幼若の」又は「幼若Ｔ細胞」は、メモリー幹細胞（ＴＭＳＣ）及びセントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）を意味する。これらの細胞は、特異的活性化時にＴ細胞増殖を示し、複数の細胞分裂に対してコンピテントである。それらはまた、再注入後に生着し、それらの同族抗原への曝露時にエフェクターＴ細胞に迅速に分化し、腫瘍細胞を標的にして殺すだけでなく、進行中のがんの監視及び制御のために持続する能力を有する。
［ＮｅｏＴＣＲ生成物］
幾つかの実施態様では、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている遺伝子編集技術及びｎｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲは、ｎｅｏＴＣＲを発現するように（図１Ａ－１Ｃに記載されているＤＮＡ媒介（非ウイルス）法を使用して）精密ゲノム改変された同じがん患者からの自己ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にクローン化される。言い換えれば、腫瘍特異的であるＮｅｏＴＣＲは、がん患者において同定され、そのようなＮｅｏＴＣＲは次にクローン化され、次にクローン化されたＮｅｏＴＣＲはがん患者のＴ細胞に挿入される。次に、ＮｅｏＴＣＲを発現するＴ細胞は、「幼若」Ｔ細胞表現型を維持する形で増殖され、Ｔ細胞の大部分がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を示すＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１生成物（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）を生じる。
これらの「幼若」又は「より幼若の」又は低分化のＴ細胞表現型は、改善された生着能及び注入後の長期持続性を与えると記述される。従って、「幼若」Ｔ細胞表現型から有意に構成されるＮｅｏＴＣＲ生成物の投与は、生着可能性の改善、注入後の持続性の延長、及びエフェクターＴ細胞への迅速な分化を通して、体全体の腫瘍細胞を根絶する利益をがん患者にもたらす可能性がある。
エクスビボでの作用機序研究は、がん患者のＴ細胞で製造されたＮｅｏＴＣＲ生成物でも実施された。Ｔ細胞殺傷活性、増殖、及びサイトカイン産生の抗原特異性によって測定される、同等の遺伝子編集効率及び機能的活性が観察され、ここに記載の製造方法が、出発物質としてがん患者からのＴ細胞を用いて生成物を作製することに成功したことを実証している。
所定の実施態様では、ＮｅｏＴＣＲ生成物の製造方法は、ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボヌクレオタンパク質種のエレクトロポレーションを含み、各種がゲノムＴＣＲα及びゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを各ゲノム遺伝子座にターゲティングする特異性は、以前に文献において高度に特異的であると記載されている。ＮｅｏＴＣＲ生成物の包括的な試験は、それぞれＣＯＳＭＩＤ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を調査するインビトロ及びインシリコ分析で実施された。健康なドナーからの複数のＮｅｏＴＣＲ生成物又は同等の細胞生成物を、ディープシーケンシングによって候補オフターゲット部位の切断について評価し、選択されたヌクレアーゼが高度に特異的であるという公表された証拠を裏付けた。
精密ゲノム工学法の更なる態様は、安全性について評価されている。精密ゲノム改変後のゲノム不安定性の証拠は、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）又は標準的ＦＩＳＨ細胞遺伝学による複数のＮｅｏＴＣＲ生成物の評価では見出されなかった。ＮｅｏＴＣＲ配列のゲノムへのオフターゲット組込みは検出されなかった。細胞生成物にＣａｓ９が残っている証拠は見出されなかった。
ＮｅｏＴＣＲ生成物と精密ゲノム工学法の包括的な評価は、ＮｅｏＴＣＲ生成物が患者への注入後に十分に許容されることを示している。
ここに記載のゲノム改変アプローチは、固形及び液体腫瘍を有する患者のための個別化された養子細胞治療法のための特注のＮｅｏＴＣＲ Ｔ細胞（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ生成物）の非常に効率的な作製を可能にする。更に、改変手法はＴ細胞での使用に限定されず、ナチュラルキラー細胞及び造血幹細胞を含む他の初代細胞型にも成功裡に適用された。
［ＣＤ８生成物］
精密ゲノム改変されたＣＤ４ Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩ制限ｎｅｏＴＣＲ及び異所性ＣＤ８受容体の共発現は、抗原特異的エフェクター機能を著しく増強する。
腫瘍排他的変異からのネオエピトープは、固形腫瘍患者のための個別化されたｎｅｏＥ特異的自己ＴＣＲ－Ｔ細胞療法の納得できる標的を表す。その全体が出典明示により援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７に記載されているｉｍＰＡＣＴ単離技術は、固形がん患者の血液からｎｅｏＥ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を捕捉するための超高感度で高スループットの方法である。この技術を活用して、ネオエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＴＣＲ（「ＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲ」）を、個別に捕捉されたＣＤ８ Ｔ細胞からクローン化した。実施例１に記載されるようなＤＮＡ媒介（非ウイルス）遺伝子編集を使用して、同じがん患者からの新鮮なＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞を、（内因性ＴＣＲの除去と同時に）ＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲを発現するように改変した。
天然に生じるＭＨＣ－Ｉ ＴＣＲは、ペプチド－ＭＨＣ結合を安定化するには、ＣＤ８共受容体の同時の助けを必要とすると推定されたが、親和性の高いＴＣＲは、ＣＤ８非依存性の標的結合とＴ細胞活性化を促進することができた。従って、ＣＤ４ Ｔ細胞は、高親和性ｎｅｏＴＣＲで改変されると、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ標的を認識し、エフェクターＴ細胞機能をトリガーすることができた。しかし、低親和性ＴＣＲは、Ｔ細胞活性化をトリガーするにはＣＤ８共受容体に依存していた。ＣＤ８共受容体遺伝子をｎｅｏＴＣＲと共にＣＤ４ Ｔ細胞中に精密ゲノム改変することにより、ＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲを、抗原特異的エフェクターＴ細胞機能をトリガーする能力があるようにした。
ＣＤ８は、ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用を安定させ、結合活性についてＴＣＲと相乗作用する。ＣＤ８はまた低親和性ＴＣＲからの結合活性を高める働きをするが、ＣＤ８αの細胞内ドメインはＴ細胞活性化を高めるために重要である。ＣＤ８の発現は、生理的濃度のｐＭＨＣに応答しない可能性があるＣＤ４ Ｔ細胞応答を増強しうる。ＭＨＣへのＣＤ８の結合の破壊は、キャッチボンドＴＣＲ－ｐＭＨＣをスリップボンドに転換させ得、ＣＤ８とは無関係にｐＭＨＣに結合するＴＣＲに対してさえもＣＤ８－ＭＨＣ相互作用の重要性を強調する。
ＣＤ８αはＣＤ８βよりもＬＣＫに対する親和性が低く、ＣＤ８αとＣＤ８βの両方の共発現又は細胞外ＣＤ８αとＣＤ８βの細胞内ドメインを含むキメラＣＤ８α－ＣＤ８β分子の作製の何れかが有効性を改善できることを示唆している。ここに記載のＣＤ８コンストラクトは、次の通りである：
１．ＣＤ８αホモ二量体（ＣＤ８コンストラクト１）
２．ＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β（ＣＤ８コンストラクト２）
３．ＣＤ８β細胞内ドメインを含むＣＤ８α（ＣＤ８コンストラクト３）
４．ＣＤ４細胞内ドメインを含むＣＤ８αホモ二量体（ＣＤ８コンストラクト４）
幾つかの実施態様では、上述のＮｅｏＴＣＲ生成物は、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４（それぞれＣＤ８生成物）の発現を含む追加の改変を含む。具体的には、それらの全体がここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている遺伝子編集技術及びｎｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲが、ｎｅｏＴＣＲを発現するように（図１Ａ－１Ｃに記載されているＤＮＡ媒介（非ウイルス）法を使用して）精密ゲノム改変されて同じがん患者の自己ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞にクローン化される。
ＣＤ８コンストラクトのそれぞれは、発現されると、ＣＤ８生成物になる。表１には、各コンストラクト及び生成物の説明が提供される。
Figure 2022531231000002
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物１は、ＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ８ホモ二量体を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物１は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインの発現を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物１は、ＣＤ８αシグナルペプチドの発現を更に含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物１は、図３Ａに提示される翻訳されたエレメントを含む。非限定的な例示的実施態様では、ＣＤ８生成物１は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインの配列改変は、各エレメントの機能を保存するか又は実質的に保存するようにすることができる。所定の実施態様では、そのような配列改変は、アミノ酸の保存的置換である。
非限定的な実施態様では、ＣＤ８生成物１は、図６に提供されるＣＤ８コンストラクト１から製造される。所定の実施態様では、図６に提供されるＣＤ８コンストラクト１の配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインの翻訳が各エレメントを保存された機能を保ったまま残す限り、任意の数の方法で改変されうる。所定の実施態様では、図６のＣＤ８コンストラクト１の各エレメントの順序は同じままであるが、核酸がコードするアミノ酸が同じままであるか、又は保存的置換のみを含む限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。所定の実施態様では、図６のＣＤ８コンストラクト１の各エレメントの順序は同じままであるが、コードされたタンパク質の機能が実質的に変化しない限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物２は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α、及びＣＤ８βを含む。所定の実施態様では、ＣＤ８α及びＣＤ８βは、発現のためにＣＤ８生成物２コンストラクト中のプロテアーゼ切断部位及び２Ａペプチドによって分離されている。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物２は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインの発現を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物２は、ＣＤ８αシグナルペプチドの発現を更に含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、ＣＤ８βシグナルペプチドの発現を更に含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、ＣＤ８αシグナルペプチド及びＣＤ８βシグナルペプチドの発現を更に含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物２は、図３Ｂに提示される翻訳されたエレメントを含む。非限定的な例示的実施態様では、ＣＤ８生成物２は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインの配列改変は、各エレメントの機能を保存し又は実質的に保存するようにすることができる。所定の実施態様では、そのような配列改変は、アミノ酸の保存的置換である。
非限定的な実施態様では、ＣＤ８生成物２は、図７に提供されるＣＤ８コンストラクト２から製造される。所定の実施態様では、図７に提供されるＣＤ８コンストラクト２の配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインの翻訳が各エレメントを保存された機能を保ったまま残す限り、任意の数の方法で改変されうる。所定の実施態様では、図７のＣＤ８コンストラクト２の各エレメントの順序は同じままであるが、核酸がコードするアミノ酸が同じままであるか、又は保存的置換のみを含む限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。所定の実施態様では、図７のＣＤ８コンストラクト２の各エレメントの順序は同じままであるが、コードされたタンパク質の機能が実質的に変化しない限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物３は、ＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ８β細胞内ドメインと共にＣＤ８αを含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物３は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインの発現を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物３は、ＣＤ８αシグナルペプチドの発現を更に含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物３は、図３Ｃに提示される翻訳されたエレメントを含む。非限定的な例示的実施態様では、ＣＤ８生成物３は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインの配列改変は、各エレメントの機能を保存し又は実質的に保存するようにすることができる。所定の実施態様では、そのような配列改変は、アミノ酸の保存的置換である。
非限定的な実施態様では、ＣＤ８生成物３は、図８に提供されるＣＤ８コンストラクト３から製造される。所定の実施態様では、図８に提供されるＣＤ８コンストラクト３の配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインの翻訳が各エレメントを保存された機能を保ったまま残す限り、任意の数の方法で改変されうる。所定の実施態様では、図８のＣＤ８コンストラクト３の各エレメントの順序は同じままであるが、核酸がコードするアミノ酸が同じままであるか、又は保存的置換のみを含む限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。所定の実施態様では、図８のＣＤ８コンストラクト３の各エレメントの順序は同じままであるが、コードされたタンパク質の機能が実質的に変化しない限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物４は、ＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ４細胞内ドメインと共にＣＤ８αホモ二量体を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物４は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインの発現を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物４は、ＣＤ８αシグナルペプチドの発現を更に含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物４は、図３Ｄに提示される翻訳されたエレメントを含む。非限定的な例示的実施態様では、ＣＤ８生成物４は、ＮｅｏＴＣＲ、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインの配列改変は、各エレメントの機能を保存し又は実質的に保存するようにすることができる。所定の実施態様では、そのような配列改変は、アミノ酸の保存的置換である。
非限定的な実施態様では、ＣＤ８生成物４は、図９に提供されるＣＤ８コンストラクト４から製造される。所定の実施態様では、図９に提供されるＣＤ８コンストラクト４の配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインの翻訳が各エレメントを保存された機能を保ったまま残す限り、任意の数の方法で改変されうる。所定の実施態様では、図９のＣＤ８コンストラクト４の各エレメントの順序は同じままであるが、核酸がコードするアミノ酸が同じままであるか、又は保存的置換のみを含む限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。所定の実施態様では、図９のＣＤ８コンストラクト４の各エレメントの順序は同じままであるが、コードされたタンパク質の機能が実質的に変化しない限り、各個々のエレメントの配列を変化させることができる。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、ＴＥＴ２ノックアウト又はＴＥＴ２ノックダウンを含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物の細胞は、非ウイルス法を使用して、ＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように更に改変される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物の細胞は、ウイルス法を使用してＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように更に改変される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物の細胞は、非ウイルス法を使用して、Ｔ細胞持続性に関連する遺伝子の機能をノックアウトし、ノックダウンし、又は改変することによって、Ｔ細胞持続性を増加させるように更に改変される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物の細胞は、ウイルス法を使用して、Ｔ細胞持続性に関連する遺伝子の機能をノックアウトし、ノックダウンし、又は改変することによって、Ｔ細胞持続性を増加させるように更に改変される。
幾つかの実施態様では、ＣＤ８生成物は、ウイルス法を使用してＮｅｏＴＣＲ及びＣＤ８コンストラクトを発現するように改変された細胞（すなわち、ＣＤ８ウイルス生成物）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８ウイルス生成物の細胞は、非ウイルス法を使用して、ＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように更に改変される。所定の実施態様では、ＣＤ８ウイルス生成物の細胞は、ウイルス法を使用して、ＴＥＴ２遺伝子をノックアウトするように更に改変される。所定の実施態様では、ＣＤ８ウイルス生成物の細胞は、非ウイルス法を使用して、Ｔ細胞持続性に関連する遺伝子の機能をノックアウトし、ノックダウンし、又は改変することによって、Ｔ細胞持続性を増加させるように更に改変される。所定の実施態様では、ＣＤ８ウイルス生成物の細胞は、ウイルス法を使用して、Ｔ細胞持続性に関連する遺伝子の機能をノックアウトし、ノックダウンし、又は改変することによって、Ｔ細胞持続性を増加させるように更に改変される。
所定の実施態様では、ノックアウトされ、ノックダウンされ、又は改変された機能を有するＴ細胞持続性遺伝子は、Ｔ細胞活性のダウンレギュレーションをもたらす遺伝子である。所定の実施態様では、ノックアウトされ、ノックダウンされ、又は改変される遺伝子は、Ｔ細胞メモリー機能をダウンレギュレートする遺伝子である。所定の実施態様では、ノックアウトされ、ノックダウンされ、又は改変される遺伝子は、Ｔ細胞の機能、増殖、及び／又は生存を低下させる遺伝子である。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物及びそのＣＤ８細胞に対する追加の改変には、腫瘍微小環境のレジリエンスを増大させ、Ｔ細胞活性を増大させ、腫瘍微小環境のホーミング／保持を増大させ、Ｔ細胞持続性を増大させ、そしてＴ細胞の異所性エフェクター機能を増大させる改変が含まれる。所定の実施態様では、腫瘍微小環境レジリエンスには、限定されないが、ネガティブ環境シグナルを変換／対抗することが含まれる。所定の実施態様では、ＴＣＲ媒介性シグナル増強には、限定されないが、Ｔ細胞活性の増加が含まれる。所定の実施態様では、腫瘍微小環境のホーミング／保持には、限定されないが、腫瘍浸潤の増強が含まれる。所定の実施態様では、機能的Ｔ細胞持続性には、限定されないが、代謝及び転写調節が含まれる。所定の実施態様では、異所性エフェクター機能には、限定されないが、ＴＣＲ誘導性抗体、サイトカイン、又はペプチド分泌が含まれる。
所定の実施態様では、機能的Ｔ細胞持続性は、（ここに記載されるように少なくともｎｅｏＴＣＲを組込むように改変された）改変Ｔ細胞の機能的Ｔ細胞持続性を改善する薬剤の同時投与によって、また（ここに記載されるように少なくともｎｅｏＴＣＲを組み込むように改変された）改変Ｔ細胞の製造及び培養条件によって、ここに記載される遺伝子工学により達成されうる。
所定の実施態様では、異所性エフェクター機能を改善するために使用されるＴＣＲ誘導性抗体は、ここに記載される抗体又はその機能的断片の何れか一つである。所定の実施態様では、異所性エフェクター機能を改善するために使用されるＴＣＲ誘導性サイトカインは、天然に生じるサイトカイン、修飾サイトカイン、サイトカインの融合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせである。所定の実施態様では、ＴＣＲ誘導性サイトカインは、サイトカインではなく、むしろ内因性サイトカイン産生を誘導する他の補因子又は発現エレメントである。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物及びそのＣＤ８細胞への追加の改変には、一又は複数の追加の遺伝子及び／又は機能性タンパク質をノックインする改変が含まれる。所定の実施態様では、ノックインされる遺伝子及び／又は機能性タンパク質には、限定されないが、ｃ－Ｍｙｂ、ドミナントネガティブＦＡＳ、ＦＡＳトランケーション、ＦＢＸＷ７、ＣＴＰ１Ａ、ＯＰＡ１、ＧＬＵＴ１、ＣＡ－ＳＴＡＴ５Ａ、ドミナントネガティブＴＧＦβＲ、ＤＮＭＴ３ａ、ドミナントネガティブＰＤ－１Ｒ、ドミナントネガティブＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２、ドミナントネガティブＳＨＩＰ－１タンパク質、インテグリン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びインターロイキンが含まれる。所定の実施態様では、遺伝子のドミナントネガティブ形態は、遺伝子のアンタゴニストである抗体又はその機能的断片である。例えば、ドミナントネガティブＰＤ－１は、抗ＰＤ－１抗体又はその機能的断片でありうる。所定の実施態様では、ノックイン遺伝子及び／又は機能性タンパク質の何れかは、遺伝子及び／又はタンパク質の機能的断片（限定されないが、トランケーションを含む）である。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物及びそのＣＤ８細胞に対する追加の改変には、一又は複数の追加の遺伝子及び／又は機能性タンパク質をノックアウト又はノックダウンする改変が含まれる。所定の実施態様では、ノックアウトされ又はノックダウンされる遺伝子及び／又は機能性タンパク質には、限定されないが、ＴＥＴ２、ＩＦＮＧＲ１、ＲＩＣＴＯＲ、ＮＲ４Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＰＰＰ２ＲＤ、アデノシン２Ａ受容体、ＰＰ２Ａ３、及びＰＰ２Ａ４が含まれる。
所定の実施態様では、機能的タンパク質の発現のために遺伝子をノックインする代わりに、そうでなければノックインされるであろう遺伝子の発現をアップレギュレートする、異なる遺伝子をここに記載の遺伝子工学によって調節することができる。
所定の実施態様では、遺伝子をノックアウト又はノックアウトする代わりに、そうでなければノックアウトされるであろう遺伝子の発現をダウンレギュレートする、異なる遺伝子をここに記載の遺伝子工学によって調節することができる。
ＣＤ８生成物の製造方法は、ガイドＲＮＡ配列に結合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボヌクレオタンパク質種のエレクトロポレーションを含み、各種はゲノムＴＣＲα及びゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。各ゲノム遺伝子座にＣａｓ９ヌクレアーゼを標的化する特異性は、以前に文献において非常に特異的であると記載されている。ＣＤ８生成物の包括的な試験は、それぞれＣＯＳＭＩＤ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を調べるインビトロ及びインシリコ分析で実施した。健康なドナーからの複数のＣＤ８生成物又は同等の細胞生成物を、ディープシーケンシングによって候補オフターゲット部位の切断について評価し、選択されたヌクレアーゼが非常に特異的であるという公表された証拠を裏付けた。
所定の実施態様では、ここに記載のＣＤ８生成物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＨＳＣに由来する細胞、又は樹状／抗原提示細胞でありうる。
所定の実施態様では、ＣＤ８細胞は、「幼若」Ｔ細胞表現型を維持するように増殖され、Ｔ細胞の大部分がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を示すＣＤ８生成物が生じる。
これらの「幼若」又は「より幼若の」又は低分化のＴ細胞表現型は、改善された生着能及び注入後の長期持続性をもたらすと記述される。従って、「幼若」Ｔ細胞表現型から有意に構成されるＣＤ８生成物の投与は、生着可能性の改善、注入後の持続性の延長、及びエフェクターＴ細胞への迅速な分化を通して、体全体の腫瘍細胞を根絶する利益をがん患者にもたらす可能性がある。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞は、主にメモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも２５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも３０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも３５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも４０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも４５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも５０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも５５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも６０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも６５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも７０％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の少なくとも７５％が、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物のＣＤ８細胞の７５％より多くが、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）及び／又はセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を含む。Ｔｍｓｃは、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋、及びＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋である細胞として特徴付けられる。Ｔｃｍは、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋ＣＤ９５＋、及びＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋である細胞として特徴付けられる。ＴｍｓｃとＴｃｍは両方とも、エフェクターＴ細胞の機能が弱く、増殖性が強く、生着性が強く、テロメアが長いと特徴付けられる。
所定の実施態様では、ここに開示されるＣＤ８細胞は、ＣＤ８コンストラクトを有していない細胞と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、又は約５００％改善された特性（例えば、殺傷活性、細胞増殖性、サイトカイン分泌性、ＬＣＫ親和性、持続性、腫瘍浸潤能力）を示す。
［幼若表現型を持つＣＤ８生成物を産生する方法］
所定の実施態様では、本開示は、部分的には、改変された「幼若」Ｔ細胞の産生に関する。所定の実施態様では、本開示は、元々対象から得られた、又はそのようなサンプルから単離された抗原特異的細胞を活性化し、操作し、及び増殖することを含む、エクスビボでの抗原特異的細胞、例えばＴ細胞を産生するための方法を含む。
所定の実施態様では、細胞を活性化するための方法は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を活性化する工程を含む。例えば、限定されないが、Ｔ細胞は、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、又はそれらの組み合わせと共にインキュベートされ、及び／又は培養されうる。
所定の実施態様では、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば、改変された活性化Ｔ細胞は、サイトカイン、ケモカイン、可溶性ペプチド、又はそれらの組み合わせと共に、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば、Ｔ細胞を培養することによって増殖させることができる。所定の実施態様では、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば改変された活性化Ｔ細胞は、一又は複数のサイトカインと共に培養されうる。所定の実施態様では、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの組み合わせでありうる。例えば、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば改変された活性化Ｔ細胞は、ＩＬ７及びＩＬ１５と共に培養されうる。所定の実施態様では、改変された活性化抗原特異的細胞、例えば改変された活性化Ｔ細胞の培養に関連して使用されるサイトカインは、約１ｐｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、及びその間の任意の値の濃度で存在しうる。
［薬学的製剤］
ＣＤ８生成物の薬学的製剤は、凍結保存された状態で細胞の「幼若」表現型を保存できる溶液中でＣＤ８細胞を組み合わせることによって調製される。表１は、そのような一薬学的製剤の例を提供する。あるいは、ＣＤ８生成物の薬学的製剤は、生成物を凍結し又は凍結保存する必要なしに、細胞の「幼若」表現型を保存できる溶液中でＣＤ８細胞を組み合わせることによって調製されうる（つまり、ＣＤ８生成物は水溶液中に又は非凍結／凍結保存細胞ペレットとして維持される）。
追加の薬学的に許容される担体、緩衝液、安定剤、及び／又は保存料もまた、凍結保存溶液又は水性貯蔵溶液（ＣＤ８生成物が凍結保存されていない場合）に加えることができる。限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ、及び場合によってはＤＭＳＯを含む特注の凍結保存培地を含む、任意の凍結保存剤及び／又は培地を使用して、ＣＤ８生成物を凍結保存することができる。
［遺伝子編集方法］
所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞を改変する方法、例えば、改変されたＴ細胞又は改変されたヒト幹細胞を含む。所定の実施態様では、本開示は、部分的に、ヒト細胞、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＨＳＣに由来する細胞、又は樹状／抗原提示細胞を改変する方法を含む。所定の実施態様では、そのような改変はゲノム編集を含む。例えば、限定ではないが、そのようなゲノム編集は、一又は複数の内因性遺伝子座、例えば、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を標的とするヌクレアーゼを用いて達成することができる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、内因性標的配列に一本鎖ＤＮＡニック又は二本鎖ＤＮＡ切断を生成しうる。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ゲノムのコーディング部分又は非コーディング部分、例えば、エクソン、イントロンを標的としうる。所定の実施態様では、ここで考えられるヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、切断活性の効率を高めるために、例えば、アミノ酸置換及び／又は欠失の導入により、それ自体が改変されうる。
所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、ヒト細胞を改変するために使用される。所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｃａｓヌクレアーゼと、Ｃａｓヌクレアーゼを内因性標的配列に動員する一又は複数のＲＮＡ、例えば、単一のガイドＲＮＡとを含む。所定の実施態様では、ＣａｓヌクレアーゼとＲＮＡは、異なるベクター又は組成物を使用して別々に、又は例えば、ポリシストロニックコンストラクト又は単一タンパク質－ＲＮＡ複合体で一緒に、細胞に導入される。所定の実施態様では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９又はＣａｓ１２ａである。所定の実施態様では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、限定されないが、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）又は髄膜炎菌（Neisseria menengitidis）を含む細菌種から得られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の追加の例は当該技術分野で知られている。それが教示する全てについて出典明示によりここに援用される、Ａｄｌｉ，Ｍａｚｈａｒ．“Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．”Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌ．９，１ １９１１（２０１８）を参照のこと。
所定の実施態様では、ゲノム編集は、免疫応答を調節する一又は複数のゲノム遺伝子座で行われる。所定の実施態様では、遺伝子座には、限定されないが、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座、ＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座、ＴＣＲガンマ（ＴＣＲγ）、及びＴＣＲデルタ（ＴＣＲδ）が含まれる。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトを挿入するための遺伝子座は、ゲノムのどこかにある。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトを挿入するための遺伝子座は、ＴＲＡＣ遺伝子座である。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトを挿入するための遺伝子座は、二つのＴＲＢＣ遺伝子座のうちの一つである。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトを挿入するための遺伝子座は、ＴＲＡＣ遺伝子座又はＴＲＡＢ遺伝子座以外の遺伝子座である。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトを挿入するための遺伝子座は、そのような遺伝子がノックアウトされる遺伝子座に挿入される。非限定的な例として、ＣＤ８生成物の所望の表現型がＮｅｏＴＣＲの発現、ＣＤ８コンストラクトの発現、及びＴＥＴ２遺伝子又はＡＡＶＳ１遺伝子のノックアウトである場合、ＣＤ８コンストラクトをＴＥＴ２遺伝子座又はＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することができる。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトの挿入は、ＮｅｏＴＣＲ挿入と並行している。所定の実施態様では、ＣＤ８コンストラクトの挿入は、ＮｅｏＴＣＲ挿入とは別個の遺伝子座である。
所定の実施態様では、ゲノム編集は、非ウイルス送達系を使用して実施される。例えば、リポフェクションの存在下での核酸の投与（Ｆｅｉｇｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）、又は手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益でありうる。対象の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、正常核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に導入することによって達成することができ、その後、細胞（又はその子孫）は標的組織に注入されるか、又は全身的に注入される。
所定の実施態様では、ゲノム編集は、ウイルス送達系を使用して実施される。所定の実施態様では、ウイルス法には、標的組込み（限定されないが、ＡＡＶを含む）とランダム組込み（限定されないが、レンチウイルスアプローチを含む）が含まれる。所定の実施態様では、ウイルス送達は、ヌクレアーゼの組込みなしに達成されるであろう。そのような実施態様では、ウイルス送達系は、Ｌｅｎｔｉｆｌａｓｈ又は別の同様の送達系でありうる。
［相同組換え鋳型］
所定の実施態様では、本開示は、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞の内因性遺伝子座に導入して組換えることにより、細胞のゲノム編集を提供する。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は直鎖状である。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は環状である。所定の実施態様では、環状ＨＲ鋳型は、プラスミド、ミニサークル、又はナノプラスミドでありうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型核酸配列は、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームを含む。所定の実施態様では、相同性アームは、約３００塩基から約２０００塩基でありうる。例えば、各相同性アームは１０００塩基でありうる。所定の実施態様では、相同性アームは、細胞の第一の内因性配列及び第二の内因性配列に相同でありうる。所定の実施態様では、内因性遺伝子座はＴＣＲ遺伝子座である。例えば、第一の内因性配列及び第二の内因性配列は、ＴＣＲアルファ遺伝子座又はＴＣＲベータ遺伝子座内にある。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はＴＣＲ遺伝子配列を含む。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、患者特異的なＴＣＲ遺伝子配列である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は腫瘍特異的である。非限定的な実施態様では、ＴＣＲ遺伝子配列は、その内容が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７８８７に記載された方法を使用して同定され取得されうる。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、ＴＣＲアルファ遺伝子配列とＴＣＲベータ遺伝子配列を含む。
所定の実施態様では、ＨＲ鋳型はポリシストロニックポリヌクレオチドである。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、可動性ポリペプチド配列をコードする配列（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ配列）を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする配列を含む。所定の実施態様では、ＨＲ鋳型は２Ａペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ）を含む。ＨＲ鋳型核酸及びその細胞を改変する方法に関する追加の情報は、その内容が出典明示によりここに援用される国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８２３０に見出すことができる。
［治療方法］
本開示の主題は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導し及び／又は増加させるための方法を提供する。ＣＤ８生成物は、対象のがんを治療し及び／又は予防するために使用できる。ＣＤ８生成物は、がんに罹患した対象の生存を延長するために使用できる。ＣＤ８生成物はまた、対象のがんを治療し及び／又は予防するために使用できる。ＣＤ８生成物はまた、対象の腫瘍負荷を軽減するために使用できる。そのような方法は、有効量のＣＤ８生成物、又はそれを含む組成物（例えば、薬学的組成物）を投与して、既存の状態の緩和であろうと再発防止であろうと、所望の効果を達成することを含む。治療では、投与される量は、所望の効果を生み出すのに有効な量である。有効量は、一回又は一連の投与で提供されうる。有効量は、ボーラス又は連続灌流によって提供されうる。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物を、ウイルス性又は細菌性疾患を治療するために使用することができる。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物を、自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
所定の実施態様では、有効量のＣＤ８生成物は、ＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、単回投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、複数回投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、二回以上の投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、二回の投与でＩＶ投与により送達される。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物は、三回投与でＩＶ投与により送達される。
本開示の主題は、対象のがんを治療し及び／又は予防するための方法を提供する。所定の実施態様では、本方法は、がんを患っている対象に有効量のＣＤ８生成物を投与することを含む。
がんの非限定的な例には、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、咽頭がん、メラノーマ、神経芽腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫、及び様々な癌腫（前立腺がん及び小細胞肺がんを含む）が含まれる。適切な癌腫には更に、限定されないが、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨肉腫、膵管腺癌、小細胞及び大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮がん、気管支肺胞がん、上皮腺癌、及びそれらの肝転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝細胞腫、胆管細胞がん、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、基底細胞がん、汗腺がん、乳頭がん、皮脂腺がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び重鎖病、乳房腫瘍、例えば乳管及び小葉腺癌、子宮頸部の扁平上皮及び腺癌、子宮及び卵巣上皮がん、前立腺腺癌、膀胱の移行扁平上皮がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫（結節性及びびまん性）形質細胞腫、急性及び慢性白血病、悪性メラノーマ、軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫を含む腫瘍学の分野で知られている任意のものが含まれる。所定の実施態様では、がんは、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、及び咽頭がんからなる群から選択される。所定の実施態様では、本開示の幼若Ｔ細胞及びそれを含む組成物は、一般的な治療的介入が受け入れられない血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）又は卵巣がんを治療し及び／又は予防するために使用することができる。
所定の実施態様では、がんは固形がん又は固形腫瘍である。所定の実施態様では、固形腫瘍又は固形がんは、神経膠芽腫、前立腺腺癌、腎臓乳頭細胞がん、肉腫、卵巣がん、膵臓腺癌、直腸腺癌、結腸腺癌、食道がん、子宮体部類内膜がん、乳がん、皮膚メラノーマ、肺腺癌、胃腺癌、頸部及び子宮頸部がん、腎臓明細胞がん、精巣胚細胞腫瘍、及び侵攻性Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。
対象は、進行形態の疾患を有する可能性があり、その場合、治療目的は、疾患進行の緩和又は逆転、及び／又は副作用の改善を含みうる。対象は、既に治療された状態の病歴を有する可能性があり、その場合、治療目的は、典型的には、再発のリスクの減少又は遅延を含むであろう。
治療に適したヒト対象は、典型的には、臨床基準によって区別することができる二種の治療群を含む。「進行した疾患」又は「高腫瘍負荷」の対象は、臨床的に測定可能な腫瘍を有する対象である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍量に基づいて検出できる腫瘍である（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、超音波検査、マンモグラム、又はＸ線による；陽性の生化学的又は病理組織マーカーだけでは、この集団を特定するには不十分である）。薬学的組成物は、これらの対象に、その状態を緩和する目的で、抗腫瘍応答を誘発するために投与される。理想的には、結果として腫瘍量の減少が起こるが、何らかの臨床的改善は利点を構成する。臨床的改善には、進行のリスク又は速度の低下あるいは腫瘍の病理的帰結の低下が含まれる。
［製造品］
ＣＤ８生成物は、製造品と組み合わせて使用されうる。そのような製造品は、増殖性疾患（例えば、がん）の予防又は治療に有用でありうる。製造品の例には、限定されないが、容器（例えば、注入バッグ、ボトル、貯蔵容器、フラスコ、バイアル、注射器、チューブ、及びＩＶ溶液バッグ）、及び容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書が含まれる。容器は、ＣＤ８生成物内のＣＤ８細胞の貯蔵及び保存に受け入れられる任意の材料で作製されうる。所定の実施態様では、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルでありうる。例えば、容器は、ＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグでありうる。ラベル又は添付文書は、ＣＤ８生成物が、選択された状態及び端緒の患者を治療するために使用されることを示している。ＣＤ８生成物は自己細胞から作製され、患者特異的な個別化された治療剤として設計されているため、患者はＣＤ８生成物の容器上で特定される。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）第一の容器と同じＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。場合によっては、第一の容器及び第二の容器と同じＣＤ８生成物を含む追加の容器が準備され作製されうる。場合によっては、異なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む組成物を含む追加の容器がまた、上述の容器と組み合わせられうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）二種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；及び３）場合によっては、組成物がその中に含まれる第三の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第三の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一のＣＤ８生成物及び第二のＣＤ８生成物は異なるＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、第一のＣＤ８生成物及び第二のＣＤ８生成物は同じＣＤ８生成物である。
製造品は、１）三種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＣＤ８生成物がその中に含まれる第三の容器；及び４）場合によっては、組成物がその中に含まれる第四の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第四の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一、第二、第三のＣＤ８生成物は、異なるＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三のＣＤ８生成物は、同じＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三のＣＤ８生成物のうち二種は同じＣＤ８生成物である。
製造品は、１）四種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＣＤ８生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＣＤ８生成物がその中に含まれる第四の容器；及び５）場合によっては、組成物がその中に含まれる第五の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第五の容器を含みうる。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＣＤ８生成物は、異なるＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＣＤ８生成物は、同じＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＣＤ８生成物のうち二種は同じＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、第一、第二、第三、第四のＣＤ８生成物のうち三種は同じＣＤ８生成物である。
製造品は、１）五種以上のＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；及び２）場合によっては、組成物がその中に含まれる第二の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、第二の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＣＤ８生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＣＤ８生成物がその中に含まれる第四の容器；５）第五のＣＤ８生成物がその中に含まれる第五の容器；６）場合によっては、第六以上のＣＤ８生成物がその中に含まれる第六以上の追加の容器；及び７）場合によっては、組成物がその中に含まれる追加の容器であって、組成物が更なる細胞傷害性又は他の治療剤を含む、追加の容器を含みうる。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物の容器の全てが、異なるＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、ＣＤ８生成物の容器の全てが、同じＣＤ８生成物である。所定の実施態様では、患者の腫瘍サンプル中の検出可能なＣＤ８の利用可能性、患者のための複数のＣＤ８生成物の必要性及び／又は要望、及び一又は複数の容器を必要とするかそれから利益をうる場合がある何れか一種のＣＤ８生成物の利用可能性に基づいて、五以上の容器内に同じ又は異なるＣＤ８生成物の任意の組み合わせが存在しうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；及び３）第三のＣＤ８生成物がその中に含まれる第三の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＣＤ８生成物がその中に含まれる第三の容器；及び４）場合によっては、第四のＣＤ８生成物がその中に含まれる第四の容器を含みうる。
製造品は、１）ＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器；２）第二のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器；３）第三のＣＤ８生成物がその中に含まれる第三の容器；４）第四のＣＤ８生成物がその中に含まれる第四の容器；及び５）場合によっては、第四のＣＤ８生成物がその中に含まれる第五の容器を含みうる。
製造品は、一種のＣＤ８生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、二種のＣＤ８生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、三種のＣＤ８生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、四種のＣＤ８生成物がその中に含まれる容器を含みうる。製造品は、五種のＣＤ８生成物がその中に含まれる容器を含みうる。
製造品は、１）一種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器、及び２）二種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。製造品は、１）二種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第一の容器、及び２）一種のＣＤ８生成物がその中に含まれる第二の容器を含みうる。上記の例では、一又は複数の追加のＣＤ８生成物を含む第三及び／又は第四の容器が、製造品に含まれうる。加えて、一又は複数の追加のＣＤ８生成物を含む第五の容器が、製造品に含まれうる。
更に、ここに記載のＣＤ８生成物の任意の容器が、複数の投与時点のために、及び／又は患者の適切な用量に基づいて、二、三、又は四の別個の容器に分割できる。
所定の実施態様では、ＣＤ８生成物はキットで提供される。キットには、非限定的な例として、添付文書、ラベル、ＣＤ８生成物の使用説明書、注射器、廃棄説明書、投与説明書、チューブ、針、及びＣＤ８生成物を適切に管理するために臨床医が必要とするその他のものを含めることができる。
［治療用組成物及び製造方法］
ここに記載されるように、ＣＤ８生成物の優良製造規範（ＧＭＰ）製造のためのプラスミドＤＮＡ媒介精密ゲノム工学法を開発した。患者特異的ｎｅｏＴＣＲの標的組込みを、プラスミドＤＮＡによってコードされた、個別化されたｎｅｏＴＣＲ遺伝子カセットと共にＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を電気穿孔することによって、達成した。ｎｅｏＴＣＲに加えて、ＣＤ８コンストラクトを、それらをｎｅｏＴＣＲベクター中に導入し、ついで上述のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）で電気穿孔することによって、挿入した。
ＣＤ８生成物は、臨床製造方法を使用して医薬品に製剤化されうる。この方法では、ＣＤ８生成物はＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグで凍結保存される。患者の必要性に応じて、一又は複数のバッグが各患者のために現場に出荷されうる。この生成物は、その患者の腫瘍細胞の表面に排他的に存在する内因性ＨＬＡ受容体の一つと複合体を形成したネオエピトープを標的とする一又は複数の自己ｎｅｏＴＣＲを発現するように精密ゲノム改変されている、アフェレーシス由来の患者自己ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞で構成されている。
最終生成物は、５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヒト血清アルブミン、及びＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅを含むであろう。最終細胞生成物は、表２に提供されるリストの成分を含むであろう。
Figure 2022531231000003
［組成物及びベクター］
本開示の主題は、ここに開示される細胞（例えば、免疫応答性細胞）を含む組成物を提供する。
所定の実施態様では、本開示の主題は、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。所定の実施態様では、ここに開示される核酸組成物は、ここに開示されるＣＤ８コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含む。また提供されるのは、そのような核酸組成物を含む細胞である。
所定の実施態様では、核酸組成物は、ここに開示されるＮｅｏＴＣＲに作用可能に連結されているプロモーターを更に含む。所定の実施態様では、核酸組成物は、ここに開示されるＣＤ８コンストラクトに作用可能に連結されているプロモーターを更に含む。
所定の実施態様では、プロモーターは内因性又は外因性である。所定の実施態様では、外因性プロモーターは、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター及びメタロチオネインプロモーターからなる群から選択される。所定の実施態様では、プロモーターは誘導性プロモーターである。所定の実施態様では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーター、ＩＬ－２プロモーター、ＩＬ－１２プロモーター、ｐ４０プロモーター、及びＢｃｌ－ｘＬプロモーターからなる群から選択される。
組成物及び核酸組成物は、当該技術分野で知られている方法によって又はここに記載されるように、対象に投与され、及び／又は細胞に送達されうる。細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変は、組換えＤＮＡコンストラクトで実質的に均質な細胞組成物を形質導入することによって達成することができる。所定の実施態様では、ＤＮＡコンストラクトを細胞に導入するために、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの何れか）が用いられる。非ウイルスベクターもまた使用されうる。
可能な形質導入方法には、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ等（１９９２） Ｂｌｏｏｄ ８０：１４１８－１４２２の方法による、プロデューサー細胞との細胞の直接共培養、あるいは例えば、Ｘｕ等（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３－２３０；及びＨｕｇｈｅｓ等（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による、ウイルス上清のみ、又は適切な成長因子及びポリカチオンを含むか又は含まない濃縮ベクターストックを用いた培養が含まれる。
他の形質導入ウイルスベクターを使用して細胞を改変することができる。所定の実施態様では、選択ベクターは、高い感染効率と安定した組込み及び発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ等，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７，１９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７を参照のこと）。使用できる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルスが含まれる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ等，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：５５－６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０，１９８９；ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０，１９９３；及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－８３Ｓ，１９９５のベクターを参照）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床現場で使用されてている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ等，米国特許第５３９９３４６号）。
非ウイルスアプローチをまた細胞の遺伝子改変に使用できる。例えば、リポフェクションの存在下で（Ｆｅｉｇｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ等，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）の存在下で、又は手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を投与することにより、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益でありうる。対象の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、正常核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己又は異種の初代細胞又はその子孫）に導入することによって達成することができ、その後、細胞（又はその子孫）は標的組織に注入されるか、又は全身的に注入される。
ポリヌクレオチド治療法は、任意の適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）から方向づけられ、任意の適切な哺乳動物調節エレメント又はイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節されうる。例えば、所望されるならば、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に方向づけることが知られているエンハンサーを使用して、核酸の発現を方向づけることができる。使用されるエンハンサーには、限定されないが、組織特異的又は細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものが含まれうる。あるいは、ゲノムクローンが治療コンストラクトとして使用される場合、調節は、同族調節配列によって、又は所望されるならば、上記のプロモーター又は調節エレメントの何れかを含む異種源由来の調節配列によって媒介されうる。
得られた細胞は、未改変細胞と同様の条件下で増殖させることができ、それにより、改変細胞を増殖させ、様々な目的に使用することができる。
［キット］
本開示の主題は、対象における免疫応答を誘導し、及び／又は増強し、及び／又はがん若しくは病原体感染を治療し、及び／又は予防するためのキットを提供する。所定の実施態様では、キットは、有効量の本開示の細胞又はそれを含む薬学的組成物を含む。所定の実施態様では、キットは滅菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で知られている他の適切な容器形態でありうる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬を保持するのに適した他の材料で作製されうる。所定の非限定的な実施態様では、キットは、本開示のＨＲ鋳型をコードする単離された核酸分子を含む。
所望されるならば、細胞及び／又は核酸分子は、がん又は病原体又は免疫不全を有するか又は発症するリスクのある対象に細胞又は核酸分子を投与するための説明書（インストラクション）と共に提供される。説明書は一般にがん又は病原体感染の治療及び／又は予防のための組成物の使用に関する情報を含む。所定の実施態様では、説明書は、次のうちの少なくとも一を含む：治療薬の説明；新生物、病原体感染、又は免疫不全あるいはそれらの症状の治療又は予防のための投与スケジュール及び投与；注意；警告；適応症；禁忌；過量投与情報；有害反応；動物薬理；臨床試験；及び／又は参考文献。説明書は、容器（存在する場合）に直接に印刷され、又は容器に貼付されるラベルとして、又は容器内に若しくは容器と共に提供される別のシート、パンフレット、カード、又はフォルダーとして印刷されうる。得られた細胞は、未改変細胞と同様の条件下で増殖させることができ、それにより、改変細胞を増殖させ、様々な目的に使用することができる。
［例示的実施態様］
Ａ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。
Ａ１． 外因性ＣＤ８が、少なくとも一種の単量体を含む、Ａの前述の細胞。
Ａ２． 外因性ＣＤ８の少なくとも一種の単量体が、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む、Ａ１の前述の細胞。
Ａ３． 細胞外ドメインが、ＣＤ８α細胞外ドメイン又はＣＤ８β細胞外ドメインを含む、Ａ２の前述の細胞。
Ａ４． 膜貫通がＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ８β膜貫通ドメインである、Ａ２又はＡ３の前述の細胞。
Ａ５． 細胞内ドメインが、ＣＤ８α細胞内ドメイン又はＣＤ８β細胞内ドメインを含む、Ａ２－Ａ４の前述の細胞。
Ａ６． 細胞内ドメインが、ＣＤ４細胞内ドメインを含む、Ａ２－Ａ４の前述の細胞。
Ａ７． 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインを含む、Ａ１－Ａ５の前述の細胞。
Ａ８． 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む、Ａ１－Ａ５の前述の細胞。
Ａ９． 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む、Ａ１－Ａ５の前述の細胞。
Ａ１０． 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、Ａ１－Ａ６の前述の細胞。
Ａ１１． 少なくとも一種の単量体が、シグナルペプチドを含む、Ａ１－Ａ１０の前述の細胞。
Ａ１２． シグナルペプチドが、ＣＤ８シグナルペプチドである、Ａ１１の前述の細胞。
Ａ１３． 細胞外ドメインが、配列番号：１４０、又は配列番号：１４５に記載のアミノ酸配列を含む、Ａ２－Ａ１２の前述の細胞。
Ａ１４． 膜貫通ドメインが、配列番号：１４１、又は配列番号：１４６に記載のアミノ酸配列を含む、Ａ２－Ａ１３の前述の細胞。
Ａ１５． 細胞内ドメインが、配列番号：１４２、配列番号：１４７、又は配列番号：１４８に記載のアミノ酸配列を含む、Ａ２－Ａ１４の前述の細胞。
Ａ１６． シグナルペプチドが、配列番号：１３９、又は配列番号：１４４に記載のアミノ酸配列を含む、Ａ１１－Ａ１５の前述の細胞。
Ａ１７． 外因性ＣＤ８が、２Ａ配列を含む、Ａ－Ａ１６の前述の細胞。
Ａ１８． 外因性ＣＤ８がリンカーを含む、Ａ－Ａ１７の前述の細胞。
Ａ１９． リンカーが、配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列を含む、Ａ１８の前述の細胞。
Ａ２０． 外因性ＣＤ８が、プロテアーゼ切断部位を含む、Ａ－Ａ１９の前述の細胞。
Ａ２１． プロテアーゼ切断部位が、フューリン切断部位である、Ａ－Ａ２０の前述の細胞。
Ａ２２． 外因性ＴＣＲが患者由来のＴＣＲである、Ａ－Ａ２１の前述の細胞。
Ａ２３． 外因性ＴＣＲが、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む、Ａ－Ａ２２の前述の細胞。
Ａ２４． 外因性ＴＣＲが、がん抗原を認識する、Ａ－Ａ２３の前述の細胞。
Ａ２５． がん抗原がネオ抗原である、Ａ２４の前述の細胞。
Ａ２６． がん抗原が患者特異的抗原である、Ａ２４の前述の細胞。
Ａ２７． 細胞が初代細胞である、Ａ－Ａ２６の前述の細胞。
Ａ２８． 細胞が患者由来の細胞である、Ａ－Ａ２６の前述の細胞。
Ａ２９． 細胞がリンパ球である、Ａ－Ａ２６の前述の細胞。
Ａ３０． 細胞がＴ細胞である、Ａ－Ａ２６の前述の細胞。
Ａ３１． 細胞が幼若Ｔ細胞である、Ａ－Ａ２６の前述の細胞。
Ａ３２． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、Ａ３１の前述の細胞。
Ａ３３． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、Ａ３１の前述の細胞。
Ａ３４． 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、Ａ３１の前述の細胞。
Ａ３５． 細胞持続性を増強するため、及び／又はメモリー細胞分化を増強するための遺伝子改変を更に含む、Ａ－Ａ３４の前述の細胞。
Ａ３６． 細胞の殺傷活性が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の殺傷活性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ａ－Ａ３５の前述の細胞。
Ａ３７． ＴＣＲの抗原への結合時の細胞の増殖が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の増殖と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ａ－Ａ３６の前述の細胞。
Ａ３８． 細胞による抗原へのＴＣＲの結合時の炎症誘発性サイトカインの分泌が、外因性ＣＤ８を有していない細胞による分泌と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ａ－Ａ３７の前述の細胞。
Ａ３９． 細胞のＬＣＫ親和性が、外因性ＣＤ８を有していない細胞のＬＣＫ親和性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ａ－Ａ３８の前述の細胞。
Ａ４０． 細胞の持続性が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の持続性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ａ－Ａ３９の前述の細胞。
Ａ４１． 細胞の腫瘍浸潤能力が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の腫瘍浸潤能力と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ａ－Ａ４０の前述の細胞。
Ａ４２． 外因性ＴＣＲが、ＣＤ８依存性ＴＣＲである、Ａ－Ａ４１の前述の細胞。
Ａ４３． 外因性ＴＣＲが、ＣＤ８非依存性ＴＣＲである、Ａ－Ａ４１の前述の細胞。
Ａ４４． 外因性ＣＤ８が、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４によってコードされる、Ａ－Ａ４３の前述の細胞。
Ａ４５． 外因性ＣＤ８が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、Ａ－Ａ４３の前述の細胞。
Ａ４６． 外因性ＣＤ８が、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、Ａ－Ａ４３の前述の細胞。
Ｂ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法において、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム、第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列、及び第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む、工程、並びにＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程を含む、方法を提供する。
Ｂ１． ＨＲ鋳型が、ＣＤ８遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列、ＣＤ８遺伝子配列の下流でＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第二の２Ａコード配列、及びＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第三の２Ａコード配列を含み；ここで、第一、第二、及び第三の２Ａコード配列は、同じアミノ酸配列をコードし、且つ互いにコドンが異なる、Ｂの前述の方法。
Ｂ２． ＨＲ鋳型が、第一、第二、及び／又は第三の２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列を含む、Ｂ又はＢ１の前述の方法。
Ｂ３． ＨＲ鋳型が、第一、第二、及び／又は第三の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を更に含む、Ｂ１又はＢ２の前述の方法。
Ｂ４． ＨＲ鋳型が、ＴＣＲ遺伝子配列及び／又はＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置するシグナル配列をコードする配列を更に含む、Ｂ－Ｂ３の前述の方法。
Ｂ５． ＨＲ鋳型が、第三の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む、Ｂ－Ｂ４の前述の方法。
Ｂ６． ＨＲ鋳型が、第一のＴＣＲ遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第一のシグナル配列をコードする配列；及び第二のＴＣＲ遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第二のシグナル配列をコードする配列を含む、Ｂ５の前述の方法。
Ｂ７． ＨＲ鋳型が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二の２Ａコード配列との間に位置する第二のＣＤ８遺伝子配列を含む、Ｂ－Ｂ６の前述の方法。
Ｂ８． ２Ａコード配列が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する、Ｂ７の前述の方法。
Ｂ９． アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する、Ｂ７又はＢ８の前述の方法。
Ｂ１０． フューリン切断部位をコードする配列が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する、Ｂ７－Ｂ９の前述の方法。
Ｂ１１． ＣＤ８遺伝子配列が、細胞外ドメインをコードする配列、細胞内ドメインをコードする配列、細胞内ドメインをコードする配列、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む、Ｂ－Ｂ１０の前述の方法。
Ｂ１２． 細胞外ドメインをコードする配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン又はＣＤ８β細胞外ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１の前述の方法。
Ｂ１３． 膜貫通ドメインをコードする配列が、ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ８β膜貫通ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１又はＢ１２の前述の方法。
Ｂ１４． 細胞内ドメインをコードする配列が、ＣＤ８α細胞内ドメイン又はＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１－Ｂ１３の前述の方法。
Ｂ１５． 細胞内ドメインをコードする配列が、ＣＤ４細胞内ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１－Ｂ１４の前述の方法。
Ｂ１６． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１－Ｂ１５の前述の方法。
Ｂ１７． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１－Ｂ１５の前述の方法。
Ｂ１８． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１－Ｂ１５の前述の方法。
Ｂ１９． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインをコードする配列を含む、Ｂ１１－Ｂ１５の前述の方法。
Ｂ２０． ＨＲ鋳型が、第一のＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第一のシグナル配列をコードする配列；及び第二のＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第二のシグナル配列をコードする配列を含む、Ｂ７－Ｂ１９の前述の方法。
Ｂ２１． シグナル配列が、ＣＤ８シグナル配列、ヒト成長ホルモンシグナル配列、それらの断片、又はそれらの組み合わせである、Ｂ４－Ｂ２０の前述の方法。
Ｂ２２． ＨＲ鋳型の第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、Ｂ－Ｂ２１の前述の方法。
Ｂ２３． ＨＲ鋳型の第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である、Ｂ－Ｂ２２の前述の方法。
Ｂ２４． 外因性ＴＣＲが患者由来のＴＣＲである、Ｂ－Ｂ２３の前述の方法。
Ｂ２５． 外因性ＴＣＲが、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む、Ｂ－Ｂ２４の前述の方法。
Ｂ２６． 外因性ＴＣＲががん抗原を認識する、Ｂ－Ｂ２５の前述の方法。
Ｂ２７． がん抗原がネオ抗原である、Ｂ２６の前述の方法。
Ｂ２８． がん抗原が患者特異的抗原である、Ｂ２６の前述の方法。
Ｂ２９． ＨＲ鋳型が非ウイルス性である、Ｂ－Ｂ２８の前述の方法。
Ｂ３０． ＨＲ鋳型が環状ＤＮＡである、Ｂ－Ｂ２９の前述の方法。
Ｂ３１． ＨＲ鋳型が直鎖ＤＮＡである、Ｂ－Ｂ２９の前述の方法。
Ｂ３２． 導入が、エレクトロポレーションを介して生じる、Ｂ－Ｂ３１の前述の方法。
Ｂ３３． 組換えが、ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換えを含む、Ｂ－Ｂ３２の前述の方法。
Ｂ３４． ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、Ｂ３３の前述の方法。
Ｂ３５． ｇＲＮＡを更に含む、Ｂ３４の前述の方法。
Ｂ３６． 細胞を培養することを更に含む、Ｂ－Ｂ３５の前述の方法。
Ｂ３７． 培養が、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる、Ｂ３６の前述の方法。
Ｂ３８． 培養が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる、Ｂ３６又はＢ３７の前述の方法。
Ｂ３９． 培養が、ＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる、Ｂ３６又はＢ３７の前述の方法。
Ｂ４０． 細胞持続性を増強し、及び／又はメモリー細胞分化を増強する遺伝子改変を更に含む、Ｂ－Ｂ３９の前述の方法。
Ｂ４１． 細胞が初代細胞である、Ｂ－Ｂ４０の前述の方法。
Ｂ４２． 細胞が患者由来の細胞である、Ｂ－Ｂ４０の前述の方法。
Ｂ４３． 細胞がリンパ球である、Ｂ－Ｂ４０の前述の方法。
Ｂ４４． 細胞がＴ細胞である、Ｂ－Ｂ４０の前述の方法。
Ｂ４５． 細胞が幼若Ｔ細胞である、Ｂ－Ｂ４０の前述の方法。
Ｂ４６． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、Ｂ４５の前述の方法。
Ｂ４７． 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、Ｂ４５の前述の方法。
Ｂ４８． 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、Ｂ４５の前述の方法。
Ｂ４９． 細胞の殺傷活性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の殺傷活性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ｂ－Ｂ４８の前述の方法。
Ｂ５０． ＴＣＲの抗原への結合時の細胞の増殖が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の増殖と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ｂ－Ｂ４９の前述の方法。
Ｂ５１． 細胞による抗原へのＴＣＲの結合時の炎症誘発性サイトカインの分泌が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞による分泌と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ｂ－Ｂ５０の前述の方法。
Ｂ５２． 細胞のＬＣＫ親和性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞のＬＣＫ親和性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ｂ－Ｂ５１の前述の方法。
Ｂ５３． 細胞の持続性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の持続性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ｂ－Ｂ５２の前述の方法。
Ｂ５４． 細胞の腫瘍浸潤能力が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の腫瘍浸潤能力と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、Ｂ－Ｂ５３の前述の方法。
Ｂ５５． ＴＣＲ遺伝子が、ＣＤ８依存性ＴＣＲをコードする、Ｂ－Ｂ５４の前述の方法。
Ｂ５６． ＴＣＲ遺伝子が、ＣＤ８非依存性ＴＣＲをコードする、Ｂ－Ｂ５４の前述の方法。
Ｂ５７． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４によってコードされる、Ｂ－Ｂ５６の前述の方法。
Ｂ５８． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ４細胞内ドメインを含む、Ｂ－Ｂ５６の前述の方法。
Ｂ５９． ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、Ｂ－Ｂ５６の前述の方法。
Ｃ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、Ｂ－Ｂ５７の方法によって改変された細胞を提供する。
Ｄ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、Ａ－Ａ４６の細胞又はＣの細胞の有効量を含む組成物を提供する。
Ｄ１． 組成物が、薬学的に許容される添加物を更に含む薬学的組成物である、Ｄの前述の組成物。
Ｄ２． 組成物が、がんの治療のために治療を必要とする患者に投与される、Ｄ又はＤ１の前述の組成物。
Ｄ３． 組成物が凍結保存剤を含む、Ｄ－Ｄ２の前述の組成物。
Ｄ４． 組成物が血清アルブミンを含む、Ｄ－Ｄ３の前述の組成物。
Ｄ５． 組成物が、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、ＨＳＡ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む、Ｄ－Ｄ４の前述の組成物。
Ｅ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、Ａ－Ａ４６の細胞、又は請求項Ｃの細胞、又はＤ－Ｄ５の組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
Ｅ１． 治療有効量の細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、Ｅの前述の方法。
Ｅ２． がんが固形腫瘍である、Ｅ又はＥ１の前述の方法。
Ｅ３． がんが液体腫瘍である、Ｅ又はＥ１の前述の方法。
Ｅ４． 固形腫瘍が、メラノーマ、胸部がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、婦人科がん、中枢神経系がん、皮膚がん、ＨＰＶ＋がん、食道がん、甲状腺がん、胃がん、肝細胞がん、胆管がん、腎細胞がん、精巣がん、肉腫、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、Ｅ２の前述の方法。
Ｅ５． 液体腫瘍が、濾胞性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、Ｅ３の前述の方法。
Ｆ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、Ａ－Ａ４６の細胞、Ｂ－Ｂ５７の方法を実施するための試薬、Ｃの細胞、又はＤ－Ｄ５の組成物を含むキットを提供する。
Ｆ１． キットが、がんを治療するための書面による説明書を更に含む、Ｆの前述のキット。
Ｇ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；並びにＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。
Ｈ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；並びにＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む外因性ＣＤ８を含む細胞を提供する。
Ｉ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法において、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む、工程；並びにＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程であって、ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、工程を含む、方法を提供する。
Ｊ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、細胞を改変する方法において、相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む工程；並びにＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程であって、ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、工程を含む、方法を提供する。
Ｋ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、細胞を含む組成物であって、細胞が、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、組成物を提供する。
Ｉ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、細胞を含む組成物であって、細胞が、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８が、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、組成物を提供する。
Ｍ． 所定の非限定的実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の細胞を投与することを含み、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、外因性ＣＤ８が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又はＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、方法を提供する。
Ｎ． 治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の細胞を投与することを含み、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、外因性ＣＤ８が、ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又はＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、方法。
次は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供した一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様を実施できることが理解される。
実施例１ ＮｅｏＴＣＲ生成物の作製
ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７（出典明示によりその全体がここに援用される）に記載されているｉｍＰＡＣＴ単離技術によって同定されたネオエピトープ特異的ＴＣＲを使用して、相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ鋳型を作製した。これらのＨＲ鋳型を、部位特異的ヌクレアーゼとタンデムで初代ヒトＴ細胞にトランスフェクトした（図１Ａ－１Ｃを参照）。一段階の非ウイルス精密ゲノム改変により、内因性ＴＣＲを、内因性プロモーターによって発現される患者のネオエピトープ特異的ＴＣＲでシームレスに置換した。表面に発現されるＴＣＲは配列が完全に天然である。
ｎｅｏＴＣＲ－Ｔ細胞ゲノム改変の精度を、オフターゲット組込みホットスポット又は転座について標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）によって、また次世代シーケンシングベースのオフターゲット切断アッセイによって評価し、意図しない結果の証拠がないことを見出した。
図１Ａ－１Ｃに示されるように、目的の遺伝子を含むコンストラクトを内因性遺伝子座に挿入した。これは、左右のＨＲアームに隣接する目的の遺伝子のコード配列を含む相同修復鋳型を使用して達成した。ＨＲアームに加えて、目的の遺伝子を、２Ａペプチド、目的の上流の翻訳遺伝子から２Ａペプチドを除去するための２Ａペプチドの上流にあるプロテアーゼ切断部位、及びシグナル配列の間に挟んだ（図１Ｂ）。ゲノムに組込まれると、目的の発現遺伝子カセットの遺伝子は、単一メッセンジャーＲＮＡとして転写された。メッセンジャーＲＮＡにおけるこの目的の遺伝子の翻訳中に、隣接領域は、自己切断２Ａペプチドによって目的の遺伝子から切り離され、プロテアーゼ切断部位は、翻訳された目的の遺伝子の上流の２Ａペプチドの除去のために切断された（図１Ｃ）。２Ａペプチド及びプロテアーゼ切断部位に加えて、ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙ（ＧＳＧ）リンカーを各２Ａペプチドの前に挿入して、発現カセット内の他のエレメントからの目的の遺伝子の分離を更に促進した。
Ｐ２Ａペプチドは、その効率的な切断のために、細胞生成物の他の２Ａペプチドよりも優れていたと判断された。従って、二つ（２）のＰ２Ａペプチド及びコドン分岐を使用して、Ｐ２Ａペプチドからの目的の遺伝子の何れの末端にも残りのアミノ酸からの何らかの外因性エピトープを導入することなく、目的の遺伝子を発現させた。外因性エピトープを持たない（すなわち、目的の遺伝子の両側に隣接するＰ２Ａペプチドアミノ酸がない）遺伝子編集細胞の利点は、免疫原性が強烈に低下し、遺伝子編集細胞に対して免疫反応を起こす遺伝子編集細胞を含む細胞生成物が患者に注入される可能性が低くなることである。
ＰＣＴ／ＵＳ／２０１８／０５８２３０に記載されているように、ＮｅｏＴＣＲをＴ細胞のＴＣＲα遺伝子座に組み込んだ。具体的には、左右のＨＲアームに隣接するＮｅｏＴＣＲコード配列を含む相同修復鋳型を使用した。加えて、内因性ＴＣＲβ遺伝子座を破壊し、ＮｅｏＴＣＲコンストラクトによってコードされるＴＣＲ配列のみを発現させた。一般的な戦略を、環状ＨＲ鋳型並びに直鎖状鋳型を使用して適用した。
標的ＴＣＲα遺伝子座（Ｃα）がプラスミドＨＲ鋳型と共に示され、得られた編集配列と下流のｍＲＮＡ／タンパク質生成物が図１Ｂ及び１Ｃに示される。標的ＴＣＲα遺伝子座（内因性ＴＲＡＣ）とそのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的部位（水平縞、矢印で示された切断部位）が示される（図１Ａ－１Ｃ）。ＮｅｏＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む環状プラスミドＨＲ鋳型が、左右の相同性アーム（それぞれ「ＬＨＡ」と「ＲＨＡ」）の間に位置する。コドン最適化されたＨＲ鋳型によって導入されたＴＲＡＣの領域が示される（縦縞）。ＴＣＲβ定常ドメインは、ＴＲＢＣ１と機能的に同等であることが示されているＴＲＢＣ２から誘導した。ＮｅｏＴＣＲカセットにおける他のエレメントには次のものが含まれる：２Ａ＝２Ａリボソームスキッピングエレメント（非限定的な例では、カセットで使用される２Ａペプチドは両方ともＰ２Ａ配列であり、コドン分岐と組み合わせて使用され、翻訳産物における何らかの他の形で生じる非内因性エピトープを排除する）；Ｐ＝上流のＴＣＲβタンパク質から２Ａタグを除去する２Ａの上流のプロテアーゼ切断部位（非限定的な例では、プロテアーゼ切断部位は、フューリンプロテアーゼ切断部位でありうる）；ＳＳ＝シグナル配列（非限定的な例では、プロテアーゼ切断部位は、ヒト成長ホルモンシグナル配列でありうる）。ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットのＨＲ鋳型には、ＴＣＲαガイドＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＲＮＰの標的となるＴＣＲαゲノム遺伝子座への挿入を方向づける二つの隣接する相同性アームが含まれる。これらの相同性アーム（ＬＨＡ及びＲＨＡ）は、ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットのｎｅｏＥ特異的ＴＣＲ配列に隣接している。この実施例において使用されたプロテアーゼ切断部位はフューリンプロテアーゼ切断部位であったが、当業者に知られている任意の適切なプロテアーゼ切断部位を使用することができる。同様に、ＨＧＨがこの実施例のために選択されたシグナル配列であったが、当業者に知られている任意のシグナル配列を、所望の輸送に基づいて選択し、使用することができる。
ゲノムに組み込まれると（図１Ｃ）、ＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットは、その個々のＴ細胞からの内因性ＴＣＲαポリペプチドの一部をなおも含む（図１Ｃ）、内因性ＴＣＲαプロモーターから単一メッセンジャーＲＮＡとして転写される。この単一ＮｅｏＴＣＲメッセンジャーＲＮＡのリボソームポリペプチド翻訳中に、ＮｅｏＴＣＲ配列は、Ｐ２Ａペプチドでの自己切断によって内因性のＣＲＩＳＰＲ破壊されたＴＣＲαポリペプチドから分離される（図１Ｃ）。コードされたＮｅｏＴＣＲα及びＮｅｏＴＣＲβポリペプチドはまた内因性細胞性ヒトフューリンプロテアーゼによる切断及びＮｅｏＴＣＲ発現遺伝子カセットに含まれる第二の自己切断Ｐ２Ａ配列モチーフを通して互いに分離される（図１Ｃ）。ＮｅｏＴＣＲα及びＮｅｏＴＣＲβポリペプチドは、多量体構築及びＴ細胞表面へのＮｅｏＴＣＲタンパク質複合体の輸送のために、シグナルリーダー配列（ヒト成長ホルモン、ＨＧＨに由来）によって別々に小胞体に標的化される。フューリンプロテアーゼ切断部位を含めることにより、上流のＴＣＲβ鎖からの２Ａ配列の除去が促進され、ＴＣＲβ機能との潜在的な干渉が減少する。各２Ａの前にｇｌｙ－ｓｅｒ－ｇｌｙリンカーを含めると（図示せず）、三つのポリペプチドの分離が更に促進される。
加えて、三つの反復タンパク質配列は、ゲノム安定性を促進するためにＨＲ鋳型内でコドン分岐される。二つのＰ２Ａは、エクスビボ改変Ｔ細胞のゲノム内に導入されたＮｅｏＴＣＲカセット配列の安定性を促進するためにＴＣＲ遺伝子カセット内で、二つのＨＧＨシグナル配列も互いに同様に、互いにコドン分岐される。同様に、ＴＲＡＣエクソン１の再導入された５’末端（縦縞）は、二つの直接リピートの介在配列を除去することにより、カセット全体が経時的に失われる可能性を低減させる。
ＮｅｏＴＣＲ生成物に加えて、この方法は任意のＣＤ８生成物に対して使用できる。
Ｉｎ－Ｏｕｔ ＰＣＲを使用して、ＮｅｏＥ ＴＣＲカセットの正確な標的組込みを確認した。アガロースゲルは、組込みカセットに特異的なプライマーを使用し、部位がヌクレアーゼ及びＤＮＡ鋳型（ＫＯＫＩとＫＯＫＩＫＯ）の両方で処理された細胞に対してのみ予想されたサイズの生成物を産生するＰＣＲの結果を示しており、部位特異的で正確な組込みを証明している。
更に、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）を使用して、標的組込みの特異性を確認した。架橋、ライゲーション、及びＮｅｏＴＣＲ挿入断片に特異的なプライマーの使用によって、組み込み部位周辺の配列を取得した。ゲノムにマッピングされたリードを、１０ｋｂ間隔でビニングする。有意なリードデプスは、１４番染色体上の組込み部位の目的部位周囲でのみ得られ、一般的なオフターゲット挿入部位の証拠がないことが示された。
内因性ＴＣＲの抗体染色とｎｅｏＴＣＲのペプチド－ＨＬＡ染色は、改変がＮｅｏＴＣＲの高頻度のノックインをもたらし、一部のＴＣＲ細胞と少しのＷＴ Ｔ細胞が残っていることを明らかにした。ノックインは、外因性プロモーターの非存在下でのｎｅｏＴＣＲ発現によって証明される。同じｎｅｏＴＣＲを使用して改変を複数回実施したところ、同様の結果が得られた。従って、ＮｅｏＴＣＲの効率的且つ一貫した発現と改変されたＴ細胞における内因性ＴＣＲのノックアウトが達成された。
実施例２ ＣＤ８生成物１の作製
［Ｔ細胞単離及び編集］ ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐｒｏｄｉｇｙ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ分離カラムを製造元の説明書に従って使用して、健康なドナーＰＢＭＣから単離した。陽性として選択されたＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗体と分離カラムを使用）を、１％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ）、４９％ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ）、及び５０％ＣＳ１０（Ｓｉｇｍａ）で新鮮又は凍結保存して使用した。凍結保存した細胞を解凍し、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）＋１０％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で洗浄し、ＴｅｘＭＡＣＳ＋３％ヒトＡＢ血清（培地）に１ｍＬ当たり２×１０６細胞の密度で播種した。解凍の１日後、又は新鮮な状態で使用する場合は直ぐに、細胞を洗浄し、培地＋１２．５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ７＋１２．５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ１５＋容量で１：１７．５の比率のＴｒａｎｓＡＣＴ Ｔ細胞活性化試薬（全ての試薬がＭｉｌｔｅｎｙｉ）において１ｍＬ当たり１．４６×１０６細胞の密度で再播種した。活性化の二日後、Ｔ細胞を、ｉ）ＮｅｏＴＣＲ生成物の産生のためのプラスミド（例えば、図１Ｂを参照）又はｉｉ）ＣＤ８コンストラクト１（例えば、ｎｅｏＴＣＲベータ及びアルファ配列の上流のＰ２Ａ部位に隣接するＣＤ８αのコード配列とＴＣＲアルファ及びベータ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰからなる；例えば図２Ａを参照）で電気穿孔した。ＣＤ８コンストラクト１の例示的な発現コンストラクトを図１１Ａに示す。Ｔ細胞を、１００μＬキュベットでＬｏｎｚａ Ｘユニット及びプログラムＥＯ－１１５を使用して電気穿孔した。Ｔ細胞は、１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７＋１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５を補充した培地で増殖させる。補充培地は、活性化の１３日後の研究の終わりまで２－３日毎に交換した。
［ｃｏｍＰＡＣＴ及びｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーの調製］ ネオ抗原特異的ペプチド－ＨＬＡ複合体ポリペプチド（それぞれ「ｃｏｍＰＡＣＴ」）を、出典明示によりその全体がここに援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載されている方法に従って調製した。ｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマー複合体を、ｎｅｏＴＣＲ発現Ｔ細胞の標識化のために作製した。ビオチン化ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をストレプトアビジン結合フルオロフォアと共に室温（ＲＴ）において１０分間インキュベートした。ビオチン－４０－デキストラン（ＮＡＮＯＣＳ）を混合物に加え、ＲＴにおいて更に１０分間インキュベートした。ｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーを４℃で保存した。
［ｎｅｏＴＣＲ編集Ｔ細胞へのｃｏｍＰＡＣＴの結合の確認］ Ｔ細胞をフローサイトメトリーのために染色した。細胞を最初に生死判別色素で４℃において２０分間染色した後、洗浄し、ｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーで４℃において１０分間染色した。細胞とｃｏｍＰＡＣＴ－デキストラマーの懸濁液に表面抗体（抗ＣＤ８α、抗ＣＤ８β、抗ＣＤ４）を加え、細胞を４℃において更に２０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、細胞内固定バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。全ての細胞をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得し、データをＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ又はＦｌｏｗＪｏの何れかで解析した。
［サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）］ ストレプトアビジン被覆プレート（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を洗浄バッファー（１％ＢＳＡ及び０．０５％トゥイーン２０を補充したＰＢＳ）で三回洗浄した後、１００－０．０１ｎｇ／ウェルの範囲の様々な濃度でｃｏｍＰＡＣＴで被覆した。ｃｏｍＰＡＣＴのないウェルとミスマッチｃｏｍＰＡＣＴで被覆したウェルを対照として使用した。プレートを室温において２時間インキュベートし、洗浄バッファーで三回洗浄した後、３％ヒトＡＢ血清を補充したＴｅｘＭＡＣＳで三回洗浄して、トゥイーン２０を除去した。Ｔ細胞を、３％ヒトＡＢ血清を補充したＴｅｘＭＡＣＳで二回洗浄し、３％ヒトＡＢ血清と１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液を補充したＴｅｘＭＡＣＳに１００万細胞／ｍＬで再懸濁させた。Ｔ細胞をｃｏｍＰＡＣＴ被覆プレートに１００μＬ／ウェルで蒔き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、上清を収集し、ＢＤサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（カタログ番号５５１８０９）を製造元のプロトコルに従って使用して、サイトカイン濃度を分析した。キャプチャービーズを培養上清と混合し、検出試薬と共に光から保護してＲＴにおいて３時間インキュベートし、洗浄し、洗浄バッファーに再懸濁させた。サンプルをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターでアッセイし、データをＦｌｏｗＪｏで解析した。ＥＣ５０は、最大応答の５０％を誘発する同族ｃｏｍＰＡＣＴの濃度を表し、ある範囲のｃｏｍＰＡＣＴ濃度にわたるＩＦＮγ分泌の最小二乗適合を利用して計算される。
［細胞内染色］ 示された日にＴ細胞をフローサイトメトリーのために染色した。Ｔ細胞を最初に生死判別色素で４℃において２０分間染色し、次に洗浄し、表面抗体（抗ＣＤ８α、抗ＣＤ８β、抗ＣＤ４）と共に４℃において更に２０分間インキュベートする。次に、Ｔ細胞を洗浄し、細胞内染色のために透過処理する。Ｔ細胞を４℃において２０分間、透過バッファー中、抗２Ａペプチド、又は抗ＩＦＮγ、抗ＴＮＦ、又は抗ＩＬ２で染色する。Ｔ細胞を細胞内固定バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定する。サンプルを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でアッセイし、データをＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ又はＦｌｏｗＪｏで解析する。
［Ｔ細胞増殖アッセイ］ 編集ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、製造元の説明書に従ってｅ４５０増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識する。標識細胞を、上記の濃度範囲でｃｏｍＰＡＣＴ被覆プレート上で刺激した。Ｔ細胞を４８－９６時間かけて収集し、ｅ４５０色素の希釈によって測定して増殖を分析した。
［Ｔ細胞殺傷アッセイ］ ＨＬＡ適合細胞株に、同族ネオ抗原ペプチド又は不適合ペプチドを３７℃において５％ＣＯ２で１時間パルスした。細胞を培地で３回洗浄して未結合ペプチドを除去した後、上記のｅ４５０増殖色素で標識されている編集ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞と共培養した。共培養物を、収集前に５％ＣＯ２で３７℃において４８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定可能な生死判別色素で染色して、殺傷効率を決定した。ｅ４５０増殖色素を、編集Ｔ細胞と標的細胞を区別するために使用した。
［ＣＤ８生成物１の作製と検証］ ｎｅｏＴＣＲベータ及びアルファ配列の上流にあるＰ２Ａ部位に隣接するＣＤ８αのコード配列（ＣＤＳ）からなる発現コンストラクトを合成する。簡単に説明すると、ヒトＣＤ８αのＣＤＳを、制限部位の上流に隣接するＧＳＧリンカー及びＰ２Ａ部位で合成する。目的のｎｅｏＴＣＲ発現ベクターと合成されたＣＤ８αコンストラクトを制限酵素と共にインキュベートし、一緒にライゲーションして、最終のＨＤＲコンストラクトを作製した。ＣＤ８コンストラクト１を、ＴＣＲα及びβ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ＲＮＰと共に電気穿孔した。ＣＤ８ Ｔ細胞の間でデキストラマーに結合するがＣＤ４ Ｔ細胞では結合しないことが知られているモデルｎｅｏＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ０９７）を使用して、ＣＤ８α導入遺伝子の発現によりこれらのＴＣＲがＣＤ４ Ｔ細胞の間でデキストラマーに結合できることを証明した。
ＣＤ４ Ｔ細胞の表面でのＣＤ８αの遺伝子導入と発現の効率を試験するために、改変されたＣＤ４ Ｔ細胞を抗ＣＤ８α抗体で染色し、上述のようにフローサイトメトリーで導入遺伝子の表面発現を確認する。ＣＤ８ Ｔ細胞の間でのみデキストラマーに結合することが知られているＮｅｏＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ０９７）を使用して、ＣＤ８α導入遺伝子の発現によりこれらのＴＣＲがＣＤ４ Ｔ細胞間でデキストラマーに結合できるようになることを実証した。図１３Ａ、１３Ｂ、１４、１５Ａ、及び１５Ｂを参照のこと。更に、野生型及び遺伝子操作されたＣＤ８α Ｔ細胞でのＣＤ８α発現を評価して、ＣＤ８α導入遺伝子の付加がＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＤ８αの表面レベルを増加させたかどうかを決定した。ＣＤ８α導入遺伝子を発現するように改変されたＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ４とＣＤ８αに対して二重陽性であった。
ＣＤ８α導入遺伝子を発現するようにＣＤ８ Ｔ細胞をまた改変し、上記のように特徴付けた。図１５Ａ及び１５Ｂ。相対的なＣＤ８α遺伝子発現をまたＲＴ－ｑＰＣＲによって定量し、対照の非改変ＣＤ８ Ｔ細胞と比較した。ＣＤ８α導入遺伝子を発現するＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８α発現の内因性レベルよりも高かった。
［同族抗原に遭遇したときのＴ細胞増殖に対するＣＤ８発現の効果］
編集Ｔ細胞を上述のように増殖色素で染色した。染色後、Ｔ細胞を、ある範囲の濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質で刺激した。４８－７２時間後、Ｔ細胞を収集し、上述のように抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及び抗２Ａペプチドで染色した。編集Ｔ細胞を２Ａ発現によって同定した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の増殖は、増殖色素の希釈を定量化することによって決定した。ＣＤ８α導入遺伝子を欠くＮｅｏＴＣＲ発現Ｔ細胞を陰性対照として使用した。ＣＤ８α導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α発現を欠くＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答して増殖した。
［同族抗原に遭遇したときのサイトカイン産生に対するＣＤ８α発現の効果］
増殖に加えて、細胞内サイトカイン染色によるエフェクターサイトカイン産生を測定した。このアッセイでは、ＮｅｏＴＣＲ生成物とＣＤ８生成物１を、ブレフェルジンＡの存在下で５時間、様々な濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴで刺激した。刺激後、Ｔ細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８αで染色した。細胞を透過処理し、抗Ｐ２Ａペプチド、抗ＩＦＮｙ、抗ＴＮＦ、及び抗ＩＬ２で染色した。ＣＤ８α導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α発現を欠くｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答してエフェクターサイトカインを産生した。
［同族抗原に遭遇したときの殺傷活性に対するＣＤ８α発現の効果］
エフェクター機能を評価するために、編集ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を、上述のように同族ペプチドでパルスしたＨＬＡ適合標的細胞と共に培養した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を別々に編集して、ＣＤ８αを発現するＣＤ４ Ｔ細胞が標的細胞を殺す能力を評価した。ＣＤ８α導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α発現を欠くｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４Ｔ細胞よりも同族ペプチドを提示する標的細胞のより多くの割合を死滅させた。
実施例３ ＣＤ８生成物２の作製
ＣＤ８αを発現するように改変されたＣＤ４ Ｔ細胞はＣＤ８βの発現を欠く。しかし、ＣＤ８βはＬＣＫに対してより高い親和性を有している（Ｉｒｉｅ等，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１（１），１８３－１９１）。従って、Ｔ細胞を、ＣＤ８αと共にＣＤ８βを共発現するように編集した（すなわち、ＣＤ８生成物２）。Ｐ２Ａ部位に隣接するＣＤ８β、Ｐ２Ａ部位に隣接するＣＤ８α、それに続く先に記載されたＴＲＢ及びＴＲＡ対立遺伝子を含む追加のコンストラクトが作製される。ＣＤ８α及びＣＤ８βを発現するＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を、上述と同じアッセイを使用して評価する。ＣＤ８α及びＣＤ８β配列を含む例示的な発現コンストラクトを図１１Ｂに示す。
ＣＤ８βの発現を、編集ＣＤ４ Ｔ細胞においてまた評価した。ＣＤ８α及びＣＤ８β導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α導入遺伝子のみを発現するＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答して増殖した。ＣＤ８α及びＣＤ８β導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α導入遺伝子のみを発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答してエフェクターサイトカインをまた産生した。また、ＣＤ８α及びＣＤ８β導入遺伝子を発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α導入遺伝子のみを発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも同族ペプチドを提示する標的細胞のより多くの割合を死滅させた。
実施例４ キメラＣＤ８α及びＣＤ８βコンストラクト並びにＣＤ８生成物３及び４の作製
Ｔ細胞の効率的な編集とｎｅｏＴＣＲの発現を確実にするために、ＣＤ８βの細胞内ドメインに連結されたＣＤ８αの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのコード配列で構成されるキメラタンパク質を作製した。ＣＤ８β配列の細胞内ドメインに連結されたＣＤ８αの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する例示的な発現コンストラクト（すなわち、ＣＤ８生成物３）を図１１Ｃに示す。
更に、ＣＤ４の細胞内ドメインはＣＤ８よりもＬＣＫに対して更に高い親和性を有している（Ｉｒｉｅ等，１９９８）。従って、ＣＤ４の細胞内ドメインに連結されたＣＤ８αの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインのコード配列を含む第二のキメラタンパク質を作製した。ＣＤ４配列の細胞内ドメインに連結されたＣＤ８αの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する例示的な発現コンストラクト（すなわち、ＣＤ８生成物４）を図１１Ｄに示す。
ＣＤ８生成物３及び４を発現するＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を、上述と同じアッセイを使用して評価した。
ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α導入遺伝子のみを発現するＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答して増殖した。ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α導入遺伝子のみを発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答してエフェクターサイトカインを産生した。ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも同族ペプチドを提示する標的細胞のより多くの割合を死滅させた。
ＣＤ８α－ＣＤ４－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答して増殖した。ＣＤ８α－ＣＤ４導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答してエフェクターサイトカインを産生した。
ＣＤ８α－ＣＤ４－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＩＤ導入遺伝子を発現するｎｅｏＴＣＲ ＣＤ４ Ｔ細胞よりも同族ペプチドを提示する標的細胞のより多くの割合を死滅させた。ＣＤ８α－ＣＤ４－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞は、導入遺伝子を欠くｎｅｏＴＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答して増殖した。ＣＤ８α－ＣＤ４導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞は、導入遺伝子を欠くｎｅｏＴＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞よりも低濃度の同族ｃｏｍＰＡＣＴに応答してエフェクターサイトカインを産生した。ＣＤ８α－ＣＤ４－ＩＤ導入遺伝子を発現するＮｅｏＴＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞は、導入遺伝子を欠くｎｅｏＴＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞よりも同族ペプチドを提示する標的細胞のより多くの割合を死滅させた。
実施例５ ＣＤ８生成物はｎｅｏＥ－ＨＬＡ標的認識に対して増加した感受性を有し、炎症誘発性及び細胞傷害性機能をトリガーする
ＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲを、結腸直腸がん患者の血液から捕捉されたｎｅｏＥ特異的Ｔ細胞からクローン化した。健康なドナーＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞を、クローン化されたＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲを単独で発現するように、又は遺伝子編集Ｔ細胞に異所性ＣＤ８共受容体の改変を含めるように精密ゲノム改変した。フローサイトメトリー分析を使用して、ｎｅｏＴＣＲ及び異所性ＣＤ８共受容体（すなわち、ＣＤ８コンストラクト１－４のＣＤ８及びＣＤ４成分）それぞれの表面発現を評価した。より低い親和性のＣＤ８依存性ｎｅｏＴＣＲに対するＣＤ４ Ｔ細胞間のｎｅｏＴＣＲ結合のレスキューが観察された。重要なことに、同族抗原による刺激に応答して、ＣＤ１０７ａ及び細胞内ＩＦＮｙ染色は、特異性に影響を与えることなく、ＣＤ４ Ｔ細胞によるＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲ誘導エフェクター機能の感受性の１０－１００倍の増加を明らかにした。ＣＤ８ Ｔ細胞には、追加のＣＤ８共受容体の発現による機能性又は感受性の変化は見られなかった。
これらの結果は、ＣＤ４ Ｔ細胞へＣＤ８依存性ＭＨＣ－Ｉ ｎｅｏＴＣＲと共にＣＤ８共受容体を同時に精密ゲノム改変することにより（すなわち、ＣＤ８生成物１－４）、ｎｅｏＥ－ＨＬＡ標的認識に対するそれらの感受性が大幅に高められ、炎症誘発性及び細胞傷害性機能がトリガーされるが、抗原特異性を損なうことはないことを実証する。
実施例６ 様々なＬＣＫ親和性を有するＣＤ８生成物の作製とデザイン
ここに記載されるように、四種のクラスのＣＤ８生成物を作製した：
１．ＣＤ８αホモ二量体（ＣＤ８コンストラクト１）
２．ＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β（ＣＤ８コンストラクト２）
３．ＣＤ８β細胞内ドメインを含むＣＤ８α（ＣＤ８コンストラクト３）
４．ＣＤ４細胞内ドメインを含むＣＤ８αホモ二量体（ＣＤ８コンストラクト４）
図１０に示されるように、これらのＣＤ８コンストラクトとその結果として得られるＣＤ８生成物を、様々な度合いのＬＣＫ親和性を可能にするようにデザインした。予測通り、ＣＤ８生成物１は最も低いＬＣＫ親和性を有しており、次にＣＤ８生成物２、ＣＤ８生成物３、及びＣＤ８生成物４がその順で続き、ＣＤ８生成物４が最も高いＬＣＫ親和性を有していることが示された。
ＣＤ８生成物４の高い親和性に基づいて、この生成物を、ＮｅｏＴＣＲ生成物と比較してＣＤ８生成物１－４の細胞殺傷能力の増加を実証するための細胞殺傷アッセイで使用した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、図２Ｄ及び３Ｄに記載されているＣＤ８生成物４（生成物にＮｅｏＴＣＲとしてＴＣＲ０９７を含む）を発現するように、ここに記載されているように改変した。Ｒ２０Ｑ変異（ＴＣＲ０９７の同族抗原）を異種発現するようにＳＷ６２０細胞株を改変した。ＮｅｏＴＣＲ０９７を発現するＣＤ８生成物４を、ＳＷ６２０異種細胞と組み合わせた。図１３Ａ及び１３Ｂに示されるように、ＣＤ８生成物４は、ＴＣＲ０９７をまた発現するＮｅｏＴＣＲ生成物よりも、ＳＷ６２０細胞を発現する同族抗原の実質的により良好な殺傷をもたらした。図１３Ａに示される実験は、１：１のＥ：Ｔ比で行われ、グラフに示されているように、ＴＣＲ０９７を発現するＮｅｏＴＣＲ生成物は、ＳＷ６２０細胞を発現する同族抗原の殺傷において何ら効果を示さなかった。図１３Ｂに示される実験は、２：１のＥ：Ｔ比で行われ、ＴＣＲ０９７を発現するＮｅｏＴＣＲ生成物はＳＷ６２０細胞を発現する同族抗原を殺す幾らかの能力を示したが、実験から、ＴＣＲ０９７を発現するＣＤ８生成物４が優れた効果を有していたことは明らかであった。
図１３Ａ及び１３Ｂに提供されたデータを用いて上記の実験において使用されたものと同じ改変ＣＤ４＋細胞を、Ｒ２０Ｑ変異をホモ接合的に発現するように改変されたＳＷ６２０細胞株でも試験した。この実験では、同族抗原の高発現が低親和性ＮｅｏＴＣＲ０９７を補うことができ、ＴＣＲ０９７を発現するＮｅｏＴＣＲ生成物とＴＣＲ０９７を発現するＣＤ８生成物４の両方がＳＷ６２０細胞の殺傷について効果を示した。しかしながら、ホモ接合性ＳＷ６２０細胞での同族抗原の高発現は生理学的に関連性がなく、この実験は、ＣＤ４細胞内ドメインを伴うＣＤ８αホモ二量体（すなわち、ＣＤ８生成物４）をまた含むようにそれらを改変することによって、腫瘍細胞に効果的に関与して死滅させることができない低親和性ＴＣＲを伴うＮｅｏＴＣＲ生成物をレスキューする能力を強調するのに役立つ。
ＣＤ８生成物の最終的な対照及び有効性の証明として、ＣＤ８ Ｔ細胞をまたトランスフェクトして、ＮｅｏＴＣＲ０９７とＣＤ４細胞内ドメインを有するＣＤ８αホモ二量体（すなわち、ＣＤ４ Ｔ細胞の代わりにＣＤ８ Ｔ細胞を使用するＣＤ８生成物４）を発現させた。図１５Ａ及び１５Ｂの上のグラフに示されるように、ＣＤ８生成物４は、生成物がＣＤ４ Ｔ細胞から作製された場合、ＮｅｏＴＣＲ生成物よりもＳＷ６２０細胞の実質的に良好な殺傷をもたらした。しかしながら、ＣＤ８生成物４及びＮｅｏＴＣＲ生成物がＣＤ８ Ｔ細胞から作製された場合（図１５Ａ及び１５Ｂの下のグラフ）、ＣＤ８ Ｔ細胞における内因性ＣＤ８発現のため、ＮｅｏＴＣＲ生成物の能力がレスキューされた。グラフのオーバーレイは示されていないが、図１５Ａ及び１５Ｂの上のグラフに示されているＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ８生成物４が、下の二つのグラフにおけるＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ８生成物４よりも優れた効果を有するように見え；腫瘍細胞の同族抗原と結合して腫瘍死をもたらし、治療を必要とするがん患者の効果的な治療をもたらす、ここに記載のＣＤ８生成物の優れた能力を示唆していることにまた留意されたい。
実施例６ ＣＤ８生成物はＮｅｏＴＣＲ感受性を維持しながらＣＤ４ Ｔ細胞の感受性を増加させた
ＣＤ８コンストラクトが適切に発現したことを確認するために、ＣＤ８生成物１、２、３、及び４を試験してＣＤ８αの表面発現を決定した。ＣＤ８生成物１、２、３、及び４のそれぞれが正常なＣＤ８α表面発現を示したことが示された。ＣＤ８生成物４の代表的なデータを図１６に示す。
ＣＤ８コンストラクトがＣＤ４ Ｔ細胞の感受性とＣＤ８生成物において発現されたＮｅｏＴＣＲの同族抗原に対する特異性にどのように影響するかを決定することもまた重要であった。感受性の実験を実施し、ＣＤ８生成物１－４がＣＤ４ Ｔ細胞感受性の増加を示したことが示された（図１７Ａ）。特異性の実験をまたＣＤ８生成物１－４で実施した。ＣＤ８生成物１、２、３、及び４はＮｅｏＴＣＲ０９７を用いて作製した。ＣＤ８生成物１、２、３、及び４（ＮｅｏＴＣＲ０９７を発現）を試験して、ＮｅｏＴＣＲ０９７の同族抗原に対するこれらの生成物の特異性を評価する実験を実施した。図１７Ｂに示されるように、ＣＤ８生成物１、２、３、及び４（ＮｅｏＴＣＲ０９７を発現）はＮｅｏＴＣＲ０９７の同族抗原に特異的であり、ミスマッチ抗原に曝露したとき活性を示さなかった。特異性は、Ｔ細胞活性化の証拠であるＩＮＦγ及びＣＤ１０７産生によって決定した。よって、ここに記載のＣＤ８生成物は、同じＮｅｏＴＣＲを発現するＮｅｏＴＣＲ生成物と比較して、ＣＤ４ Ｔ細胞に対する増加した感受性を有しており、発現されたＮｅｏＴＣＲの同族抗原に対するその特異性を維持する。
最後に、ＣＤ８コンストラクトがＣＤ８依存性及びＣＤ８非依存性ＮｅｏＴＣＲに与える影響を調べるための実験を実施した。ＣＤ８細胞はＣＤ８αを発現するように改変されるため、ＣＤ８依存性ＮｅｏＴＣＲは同族抗原に対する感受性の増加を示し、ＣＤ８非依存性ＮｅｏＴＣＲはＮｅｏＴＣＲの独立性のために感受性の増加を示さないと予想された。しかしながら、ＮｅｏＴＣＲ生成物１、２、３、及び４は、ＣＤ８依存性（例えば、ＮｅｏＴＣＲ０９７）及びＣＤ８非依存性（例えば、ＮｅｏＴＣＲ０８９）ＮｅｏＴＣＲの感受性を驚くほど増加させたことが示された。従って、ＣＤ８コンストラクト１、２、３、及び４は、それらがＣＤ８依存性かＣＤ８非依存性かに関係なく、全てのＮｅｏＴＣＲの同族ＮｅｏＴＣＲ抗原による腫瘍細胞のＮｅｏＴＣＲ結合とＴ細胞殺傷を改善しうることが示された。
本発明は、ある程度の長さで、幾つかの記載された実施態様に関してある程度の特殊性をもって記載されたが、何らかのそのような詳細又は実施態様又は何らかの特定の実施態様に限定されるべきとは意図されておらず、先行技術に照らしてそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、従って、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して、解釈されるべきである。
ここで言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が出典明示により援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、セクションの見出し、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。

Claims (130)

  1. ａ．外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；及び
    ｂ．外因性ＣＤ８
    を含む細胞。
  2. 外因性ＣＤ８が、少なくとも一種の単量体を含む、請求項１に記載の細胞。
  3. 外因性ＣＤ８の少なくとも一種の単量体が、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の細胞。
  4. 細胞外ドメインが、ＣＤ８α細胞外ドメイン又はＣＤ８β細胞外ドメインを含む、請求項３に記載の細胞。
  5. 膜貫通がＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ８β膜貫通ドメインである、請求項３又は４に記載の細胞。
  6. 細胞内ドメインが、ＣＤ８α細胞内ドメイン又はＣＤ８β細胞内ドメインを含む、請求項３から５の何れか一項に記載の細胞。
  7. 細胞内ドメインが、ＣＤ４細胞内ドメインを含む、請求項３から５の何れか一項に記載の細胞。
  8. 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインを含む、請求項２から６の何れか一項に記載の細胞。
  9. 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む、請求項２から６の何れか一項に記載の細胞。
  10. 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインを含む、請求項２から６の何れか一項に記載の細胞。
  11. 少なくとも一種の単量体が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインを含む、請求項２から７の何れか一項に記載の細胞。
  12. 少なくとも一種の単量体が、シグナルペプチドを含む、請求項２から１１の何れか一項に記載の細胞。
  13. シグナルペプチドが、ＣＤ８シグナルペプチドである、請求項１２に記載の細胞。
  14. 細胞外ドメインが、配列番号：１４０、又は配列番号：１４５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３から１３の何れか一項に記載の細胞。
  15. 膜貫通ドメインが、配列番号：１４１、又は配列番号：１４６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３から１４の何れか一項に記載の細胞。
  16. 細胞内ドメインが、配列番号：１４２、配列番号：１４７、又は配列番号：１４８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３から１５の何れか一項に記載の細胞。
  17. シグナルペプチドが、配列番号：１３９、又は配列番号：１４４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２から１６の何れか一項に記載の細胞。
  18. 外因性ＣＤ８が、２Ａ配列を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の細胞。
  19. 外因性ＣＤ８がリンカーを含む、請求項１から１８の何れか一項に記載の細胞。
  20. リンカーが、配列番号：１３７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の細胞。
  21. 外因性ＣＤ８が、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項１から２０の何れか一項に記載の細胞。
  22. プロテアーゼ切断部位が、フューリン切断部位である、請求項２１に記載の細胞。
  23. 外因性ＴＣＲが患者由来のＴＣＲである、請求項１から２２の何れか一項に記載の細胞。
  24. 外因性ＴＣＲが、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む、請求項１から２３の何れか一項に記載の細胞。
  25. 外因性ＴＣＲが、がん抗原を認識する、請求項１から２４の何れか一項に記載の細胞。
  26. がん抗原がネオ抗原である、請求項２５に記載の細胞。
  27. がん抗原が患者特異的抗原である、請求項２５に記載の細胞。
  28. 細胞が初代細胞である、請求項１から２７の何れか一項に記載の細胞。
  29. 細胞が患者由来の細胞である、請求項１から２７の何れか一項に記載の細胞。
  30. 細胞がリンパ球である、請求項１から２７の何れか一項に記載の細胞。
  31. 細胞がＴ細胞である、請求項１から２７の何れか一項に記載の細胞。
  32. 細胞が幼若Ｔ細胞である、請求項１から２７の何れか一項に記載の細胞。
  33. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、請求項３２に記載の細胞。
  34. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、請求項３２に記載の細胞。
  35. 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、請求項３２に記載の細胞。
  36. 細胞持続性を増強するため、及び／又はメモリー細胞分化を増強するための遺伝子改変を更に含む、請求項１から３５の何れか一項に記載の細胞。
  37. 細胞の殺傷活性が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の殺傷活性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項１から３６の何れか一項に記載の細胞。
  38. ＴＣＲの抗原への結合時の細胞の増殖が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の増殖と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項１から３７の何れか一項に記載の細胞。
  39. 細胞による抗原へのＴＣＲの結合時の炎症誘発性サイトカインの分泌が、外因性ＣＤ８を有していない細胞による分泌と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項１から３８の何れか一項に記載の細胞。
  40. 細胞のＬＣＫ親和性が、外因性ＣＤ８を有していない細胞のＬＣＫ親和性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項１から３９の何れか一項に記載の細胞。
  41. 細胞の持続性が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の持続性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項１から４０の何れか一項に記載の細胞。
  42. 細胞の腫瘍浸潤能力が、外因性ＣＤ８を有していない細胞の腫瘍浸潤能力と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項１から４１の何れか一項に記載の細胞。
  43. 外因性ＴＣＲが、ＣＤ８依存性ＴＣＲである、請求項１から４２の何れか一項に記載の細胞。
  44. 外因性ＴＣＲが、ＣＤ８非依存性ＴＣＲである、請求項１から４２の何れか一項に記載の細胞。
  45. 外因性ＣＤ８が、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４によってコードされる、請求項１から４４の何れか一項に記載の細胞。
  46. 外因性ＣＤ８が、
    ａ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；
    ｂ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；
    ｃ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又は
    ｄ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメイン
    を含む、請求項１から４４の何れか一項に記載の細胞。
  47. 外因性ＣＤ８が、
    ａ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；
    ｂ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；
    ｃ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又は
    ｄ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）
    を含む、請求項１から４４の何れか一項に記載の細胞。
  48. 細胞を改変する方法において、
    ａ． 相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、
    ｉ． 第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
    ｉｉ． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
    ｉｉｉ． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列
    を含む、工程と、
    ｂ． ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程
    を含む、方法。
  49. ＨＲ鋳型が、ＣＤ８遺伝子配列の上流に位置する第一の２Ａコード配列、ＣＤ８遺伝子配列の下流でＴＣＲ遺伝子配列の上流に位置する第二の２Ａコード配列、及びＴＣＲ遺伝子配列の下流に位置する第三の２Ａコード配列を含み；ここで、第一、第二、及び第三の２Ａコード配列は、同じアミノ酸配列をコードし、且つ互いにコドンが異なる、請求項４８に記載の方法。
  50. ＨＲ鋳型が、第一、第二、及び／又は第三の２Ａコード配列の直ぐ上流に位置するアミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列を含む、請求項４８又は４９に記載の方法。
  51. ＨＲ鋳型が、第一、第二、及び／又は第三の２Ａコード配列の上流に位置するフューリン切断部位をコードする配列を更に含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. ＨＲ鋳型が、ＴＣＲ遺伝子配列及び／又はＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置するシグナル配列をコードする配列を更に含む、請求項４８から５１の何れか一項に記載の方法。
  53. ＨＲ鋳型が、第三の２Ａコード配列と第二の相同性アームとの間に位置する第二のＴＣＲ配列を含む、請求項４８から５２の何れか一項に記載の方法。
  54. ＨＲ鋳型が、
    ａ． 第一のＴＣＲ遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第一のシグナル配列をコードする配列；及び
    ｂ． 第二のＴＣＲ遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第二のシグナル配列をコードする配列
    を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. ＨＲ鋳型が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二の２Ａコード配列との間に位置する第二のＣＤ８遺伝子配列を含む、請求項４８から５４の何れか一項に記載の方法。
  56. ２Ａコード配列が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する、請求項５５に記載の方法。
  57. アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙをコードする配列が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. フューリン切断部位をコードする配列が、第一のＣＤ８遺伝子配列と第二のＣＤ８遺伝子配列との間に位置する、請求項５５から５７の何れか一項に記載の方法。
  59. ＣＤ８遺伝子配列が、細胞外ドメインをコードする配列、細胞内ドメインをコードする配列、細胞内ドメインをコードする配列、それらの断片、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４８から５８の何れか一項に記載の方法。
  60. 細胞外ドメインをコードする配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン又はＣＤ８β細胞外ドメインをコードする配列を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 膜貫通ドメインをコードする配列が、ＣＤ８α膜貫通ドメイン又はＣＤ８β膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項５９又は６０に記載の方法。
  62. 細胞内ドメインをコードする配列が、ＣＤ８α細胞内ドメイン又はＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む、請求項５９から６１の何れか一項に記載の方法。
  63. 細胞内ドメインをコードする配列が、ＣＤ４細胞内ドメインをコードする配列を含む、請求項５９から６１の何れか一項に記載の方法。
  64. ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメインをコードする配列を含む、請求項５９から６２の何れか一項に記載の方法。
  65. ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む、請求項５９から６２の何れか一項に記載の方法。
  66. ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメインをコードする配列を含む、請求項５９から６２の何れか一項に記載の方法。
  67. ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメインをコードする配列を含む、請求項５９から６３の何れか一項に記載の方法。
  68. ＨＲ鋳型が、
    ａ． 第一のＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第一のシグナル配列をコードする配列；及び
    ｂ． 第二のＣＤ８遺伝子配列の直ぐ上流に位置する第二のシグナル配列をコードする配列
    を含む、請求項５５から６７の何れか一項に記載の方法。
  69. シグナル配列が、ＣＤ８シグナル配列、ヒト成長ホルモンシグナル配列、それらの断片、又はそれらの組み合わせである、請求項５２から６８の何れか一項に記載の方法。
  70. ＨＲ鋳型の第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約３００塩基長から約２０００塩基長である、請求項４８から６９の何れか一項に記載の方法。
  71. ＨＲ鋳型の第一の相同性アーム及び第二の相同性アームが、それぞれ約６００塩基長から約２０００塩基長である、請求項４８から７０の何れか一項に記載の方法。
  72. 外因性ＴＣＲが患者由来のＴＣＲである、請求項４８から７１の何れか一項に記載の方法。
  73. 外因性ＴＣＲが、シグナル配列、第一の２Ａ配列及び第二の２Ａ配列、並びにＴＣＲポリペプチド配列を含む、請求項４８から７２の何れか一項に記載の方法。
  74. 外因性ＴＣＲががん抗原を認識する、請求項４８から７３の何れか一項に記載の方法。
  75. がん抗原がネオ抗原である、請求項７４に記載の方法。
  76. がん抗原が患者特異的抗原である、請求項７４に記載の方法。
  77. ＨＲ鋳型が非ウイルス性である、請求項４８から７６の何れか一項に記載の方法。
  78. ＨＲ鋳型が環状ＤＮＡである、請求項４８から７７の何れか一項に記載の方法。
  79. ＨＲ鋳型が直鎖ＤＮＡである、請求項４８から７７の何れか一項に記載の方法。
  80. 導入が、エレクトロポレーションを介して生じる、請求項４８から７９の何れか一項に記載の方法。
  81. 組換えが、
    ａ． ヌクレアーゼによる内因性遺伝子座の切断；及び
    ｂ． 相同性指向修復によるＨＲ鋳型核酸配列の内因性遺伝子座への組換え
    を含む、請求項４８から８０の何れか一項に記載の方法。
  82. ヌクレアーゼが、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、又はその誘導体である、請求項８１に記載の方法。
  83. ｇＲＮＡを更に含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 細胞を培養することを更に含む、請求項４８から８３の何れか一項に記載の方法。
  85. 培養が、少なくとも一種のサイトカインの存在下で行われる、請求項８４に記載の方法。
  86. 培養が、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、又はそれらの任意の組み合わせの存在下で行われる、請求項８４又は８５に記載の方法。
  87. 培養が、ＩＬ７及びＩＬ１５の存在下で行われる、請求項８４又は８５に記載の方法。
  88. 細胞持続性を増強し、及び／又はメモリー細胞分化を増強する遺伝子改変を更に含む、請求項４８から８７の何れか一項に記載の方法。
  89. 細胞が初代細胞である、請求項４８から８８の何れか一項に記載の方法。
  90. 細胞が患者由来の細胞である、請求項４８から８８の何れか一項に記載の方法。
  91. 細胞がリンパ球である、請求項４８から８８の何れか一項に記載の方法。
  92. 細胞がＴ細胞である、請求項４８から８８の何れか一項に記載の方法。
  93. 細胞が幼若Ｔ細胞である、請求項４８から８８の何れか一項に記載の方法。
  94. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５－、ＣＣＲ７＋、及びＣＤ２７＋である、請求項９３に記載の方法。
  95. 細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ２７＋、ＣＣＲ７＋である、請求項９３に記載の方法。
  96. 細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋である、請求項９３に記載の方法。
  97. 細胞の殺傷活性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の殺傷活性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４８から９６の何れか一項に記載の方法。
  98. ＴＣＲの抗原への結合時の細胞の増殖が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の増殖と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４８から９７の何れか一項に記載の方法。
  99. 細胞による抗原へのＴＣＲの結合時の炎症誘発性サイトカインの分泌が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞による分泌と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４８から９８の何れか一項に記載の方法。
  100. 細胞のＬＣＫ親和性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞のＬＣＫ親和性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４８から９９の何れか一項に記載の方法。
  101. 細胞の持続性が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の持続性と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４８から１００の何れか一項に記載の方法。
  102. 細胞の腫瘍浸潤能力が、ＣＤ８遺伝子配列を有していない細胞の腫瘍浸潤能力と比較して、約１０％から約５００％の間で増加している、請求項４８から１０１の何れか一項に記載の方法。
  103. ＴＣＲ遺伝子が、ＣＤ８依存性ＴＣＲをコードする、請求項４８から１０２の何れか一項に記載の方法。
  104. ＴＣＲ遺伝子が、ＣＤ８非依存性ＴＣＲをコードする、請求項４８から１０２の何れか一項に記載の方法。
  105. ＣＤ８遺伝子配列が、ＣＤ８コンストラクト１、ＣＤ８コンストラクト２、ＣＤ８コンストラクト３、又はＣＤ８コンストラクト４によってコードされる、請求項４８から１０４の何れか一項に記載の方法。
  106. ＣＤ８遺伝子配列が、
    ａ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；
    ｂ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；
    ｃ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又は
    ｄ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ４細胞内ドメイン
    を含む、請求項４８から１０４の何れか一項に記載の方法。
  107. ＣＤ８遺伝子配列が、
    ａ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；
    ｂ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；
    ｃ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又は
    ｄ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）
    を含む、請求項４８から１０４の何れか一項に記載の方法。
  108. 請求項４８から１０７の何れか一項に記載の方法によって改変された細胞。
  109. 請求項１から４７の何れか一項に記載の細胞又は請求項１０８に記載の細胞の有効量を含む組成物。
  110. 組成物が、薬学的に許容される添加物を更に含む薬学的組成物である、請求項１０９に記載の組成物。
  111. 組成物が、がんの治療のために治療を必要とする患者に投与される、請求項１０９又は１１０に記載の組成物。
  112. 組成物が凍結保存剤を含む、請求項１０９から１１１の何れか一項に記載の組成物。
  113. 組成物が血清アルブミンを含む、請求項１０９から１１２の何れか一項に記載の組成物。
  114. 組成物が、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、ＨＳＡ、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む、請求項１０９から１１３の何れか一項に記載の組成物。
  115. 治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、請求項１から４７の何れか一項に記載の細胞、請求項１０８に記載の細胞、又は請求項１０９から１１４の何れか一項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  116. 治療有効量の細胞を投与する前に、非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に施される、請求項１１５に記載の方法。
  117. がんが固形腫瘍である、請求項１１５又は１１６に記載の方法。
  118. がんが液体腫瘍である、請求項１１５又は１１６に記載の方法。
  119. 固形腫瘍が、メラノーマ、胸部がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、婦人科がん、中枢神経系がん、皮膚がん、ＨＰＶ＋がん、食道がん、甲状腺がん、胃がん、肝細胞がん、胆管がん、腎細胞がん、精巣がん、肉腫、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
  120. 液体腫瘍が、濾胞性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
  121. 請求項１から４７の何れか一項に記載の細胞、請求項４８から１０７の何れか一項に記載の方法を実施するための試薬、請求項１０８に記載の細胞、又は請求項１０９から１１４の何れか一項に記載の組成物を含むキット。
  122. キットが、がんを治療するための書面による説明書を更に含む、請求項１２１に記載のキット。
  123. ａ． 外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；並びに
    ｂ． 外因性ＣＤ８であって、
    ｉ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン；
    ｉｉ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；
    ｉｉｉ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又は
    ｉｖ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメイン
    を含む外因性ＣＤ８
    を含む細胞。
  124. ａ． 外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；並びに
    ｂ． 外因性ＣＤ８であって、
    ｉ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；
    ｉｉ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；
    ｉｉｉ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又は
    ｉｖ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）
    を含む外因性ＣＤ８
    を含む細胞。
  125. 細胞を改変する方法において、
    ａ． 相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、
    ｉ． 第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
    ｉｉ． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
    ｉｉｉ． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む、工程；並びに
    ｂ． ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程であって、ＣＤ８遺伝子配列が、
    ｉ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；
    ｉｉ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；
    ｉｉｉ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８β細胞内ドメイン；又は
    ｉｖ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメイン
    を含む、工程
    を含む、方法。
  126. 細胞を改変する方法において、
    ａ． 相同組換え（ＨＲ）鋳型核酸配列を細胞に導入する工程であって、ＨＲ鋳型が、
    ｉ． 第一の標的核酸配列及び第二の標的核酸配列に相同な第一の相同性アーム及び第二の相同性アーム；
    ｉｉ． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＴＣＲ遺伝子配列；
    ｉｉｉ． 第一の相同性アーム及び第二の相同性アームの間に位置するＣＤ８遺伝子配列を含む、工程；並びに
    ｂ． ＨＲ鋳型核酸を細胞の内因性遺伝子座に組換える工程であって、ＣＤ８遺伝子配列が、
    ｉ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；
    ｉｉ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；
    ｉｉｉ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又は
    ｉｖ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）を含む、
    工程を含む、方法。
  127. 細胞を含む組成物であって、細胞が、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８が、
    ａ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；
    ｂ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；
    ｃ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又は
    ｄ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメイン
    を含む、組成物。
  128. 細胞を含む組成物であって、細胞が、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、ここで、外因性ＣＤ８が、
    ａ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；
    ｂ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；
    ｃ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又は
    ｄ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）
    を含む、組成物。
  129. 治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の細胞を投与することを含み、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、外因性ＣＤ８が、
    ａ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞内ドメイン；
    ｂ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ８α細胞内ドメイン、ＣＤ８β細胞外ドメイン、ＣＤ８β膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；
    ｃ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８β細胞内ドメイン；又は
    ｄ． ＣＤ８α細胞外ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ４細胞内ドメイン
    を含む、方法。
  130. 治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の細胞を投与することを含み、ここで、細胞は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と外因性ＣＤ８を含み、外因性ＣＤ８が、
    ａ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）；
    ｂ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、ＣＤ８α細胞内ドメイン（配列番号：１４２）、ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号：１４４）、ＣＤ８β細胞外ドメイン（配列番号：１４５）、ＣＤ８β膜貫通ドメイン（配列番号：１４６）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；
    ｃ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ８β細胞内ドメイン（配列番号：１４７）；又は
    ｄ． ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号：１３９）、ＣＤ８α細胞外ドメイン（配列番号：１４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号：１４１）、及びＣＤ４細胞内ドメイン（配列番号：１４８）
    を含む、方法。
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