BR112019019426A2 - Biomarcadores e terapias com células t car com eficácia intensificada - Google Patents

Biomarcadores e terapias com células t car com eficácia intensificada Download PDF

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BR112019019426A2
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A. FRAIETTA Joseph
J. Melenhorst Jan
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Novartis Ag
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Abstract

a invenção refere-se a composições e métodos aperfeiçoados de terapias com célula t car. especificamente, a invenção proporciona células com expressão e/ou função alteradas de um ou mais genes, por exemplo, associados a tet2, e seus métodos de uso. a invenção ainda proporciona inibidores do um ou mais genes e métodos de uso dos mesmos em conexão com células t car.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para BIOMARCADORES E TERAPIAS COM CÉLULAS T CAR COM EFICÁCIA INTENSIFICADA.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. NQ. de Série 62/474,991, depositado em 22 de março, 2017, e Pedido U.S. NQ. de Série 62/621,356, depositado em 24 de janeiro, 2018. O conteúdo dos pedidos acima mencionados é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada por referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada a 20 de março, 2018, chama-se N2067-7125WO_SL.txt e tem 509 059 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se geralmente a uso de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) manipuladas para expressarem um Receptor de Antigenos Quimérico (CAR) para tratar uma doença associada a expressão de um antígeno tumoral.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] A terapia de transferência adotiva de células (ACT) com células T autólogas, especialmente com células T transduzidas com Receptores de Antigenos Quiméricos (CARs), demonstrou ser promissora em ensaios de cânceres hematológicos. Há uma necessidade médica de terapias com células T, especialmente terapias com células T CAR com eficácia melhorada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] A presente invenção proporciona, pelo menos em parte,
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2/606 composições e métodos que procedem à disrupção de um ou mais genes associados a um gene metilcitosina dioxigenase, por exemplo, Tet2, e usos de tais composições e métodos para aumentar as atividades funcionais de células manipuladas (por exemplo, células T específicas para antígenos com genes modificados, tais como células T CAR). Em particular, a presente invenção proporciona métodos e composições para reforçar a eficácia terapêutica de células T expressando receptores de antígenos quiméricos (CAR). Embora não pretendendo ficar restringido pela teoria, se crê que, em certas modalidades, a alteração de um ou mais genes descritos aqui pode conduzir, por exemplo, a um fenótipo de memória central e, desse modo, aumenta a proliferação e/ou função de células T CAR.
[0006] Em conformidade, em um aspecto, a presente invenção proporciona uma célula (por exemplo, uma população de células), por exemplo, uma célula efetora imune, expressando um receptor de antígenos quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação a antígenos, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, e em que a célula tem expressão e/ou função alteradas de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2).
[0007] Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um primeiro gene associado a Tet2 e expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um segundo gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, a célula tem adicionalmente expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de Tet2.
[0008] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2
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3/606 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou todos os) genes escolhidos de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou todos os) genes escolhidos de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1.
[0009] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende ICOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende PRDM1.
[0010] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e NOTCH2. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e ICOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e ICOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28 e ICOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IL2RA e PRDM1.
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4/606
[0011] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28 e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, IGOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, IGOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28 e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, IGOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, IGOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, IGOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, IGOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IGOS, IL2RA e PRDM1.
[0012] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, IGOS, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, IGOS, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28,
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IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28 e ICOS.
[0013] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS e IL2RA. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, IL2RA e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1.
[0014] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1.
[0015] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2
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6/606 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 8. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela
8, Coluna B. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 8, Coluna A.
[0016] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna D. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna D. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela
9, Coluna D.
[0017] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes em uma via (por exemplo, uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) vias) escolhidas da Tabela 9, Coluna A. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9,10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna A. Em algumas modalidades, a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna A.
[0018] Em algumas modalidades, a via é escolhida de uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou todas) de: (1) uma via de diferenciação de leucócitos; (2) uma via de regulação positiva do processo do sistema imune; (3) uma via de
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7/606 sinalização de proteína tirosina quinase receptora de transmembrana; (4) uma via de regulação da morfogênese da estrutura anatômica; (5) uma via de sinalização de TNFA através de NFKB; (6) uma via de regulação positiva da atividade de hidrolase; (7) uma via de cicatrização de feridas; (8) uma via de ativação de células T alfa-beta; (9) uma via de regulação do movimento de componentes celulares; (10) uma via da resposta inflamatória; (11) uma via de diferenciação de células mieloides; (12) uma via de produção de citocinas; (13) uma via de subregulação em resposta a UV; (14) uma via de regulação negativa do processo de organismos multicelulares; (15) uma via da morfogênese de vasos sanguíneos; (16) uma via de transcrição dependente de NFAT; (17) uma via de regulação positiva do processo apoptótico; (18) uma via de hipoxia; (19) uma via de sobrerregulação por sinalização de KRAS; ou (20) uma via da cascata de sinalização de proteína quinase ativada pelo estresse.
[0019] Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de diferenciação de leucócitos são escolhidos da Tabela 9, Linha 1. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de regulação positiva do processo do sistema imune são escolhidos da Tabela 9, Linha 56. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de sinalização de proteína tirosina quinase receptora de transmembrana são escolhidos da Tabela 9, Linha 85. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de regulação da morfogênese da estrutura anatômica são escolhidos da Tabela 9, Linha 128. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de sinalização de TNFA através de NFKB são escolhidos da Tabela 9, Linha 134. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de regulação positiva da atividade de hidrolase são escolhidos da Tabela 9, Linha 137. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma
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8/606 via de cicatrização de feridas são escolhidos da Tabela 9, Linha 141. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de ativação de células T alfa-beta são escolhidos da Tabela 9, Linha 149. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de regulação do movimento de componentes celulares são escolhidos da Tabela 9, Linha 180. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via da resposta inflamatória são escolhidos da Tabela 9, Linha 197. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de diferenciação de células mieloides são escolhidos da Tabela 9, Linha 206. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de produção de citocinas são escolhidos da Tabela 9, Linha 221. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de subregulação em resposta a UV são escolhidos da Tabela 9, Linha 233. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de regulação negativa do processo de organismos multicelulares são escolhidos da Tabela 9, Linha 235. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via da morfogênese de vasos sanguíneos são escolhidos da Tabela 9, Linha 237. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de transcrição dependente de NFAT são escolhidos da Tabela 9, Linha 243. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de regulação positiva do processo apoptótico são escolhidos da Tabela 9, Linha 250. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de hipoxia são escolhidos da Tabela 9, Linha 256. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via de sobrerregulação por sinalização de KRAS são escolhidos da Tabela 9, Linha 258. Em algumas modalidades, o um ou mais genes associados a uma via da cascata de sinalização de proteína quinase ativada pelo estresse são escolhidos da Tabela 9, Linha 260.
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[0020] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um gene (por exemplo, um ou mais genes) associado a um fenótipo de memória central. Em algumas modalidades, o fenótipo de memória central é um fenótipo de células T de memória central. Em algumas modalidades, o fenótipo de memória central compreende um nível de expressão mais elevado de CCR7 e/ou CD45RO em comparação com o nível de expressão de CCR7 e/ou CD45RO em uma célula virgem (por exemplo, uma célula T virgem). Em algumas modalidades, o fenótipo de memória central compreende um nível de expressão mais baixo de CD45RA em comparação com o nível de expressão de CD45RA em uma célula virgem (por exemplo, uma célula T virgem). Em algumas modalidades, o fenótipo de memória central compreende proliferação intensificada dependente de antígenos da célula. Em algumas modalidades, o fenótipo de memória central compreende um nível de expressão reduzido de IFN-γ e/ou CD107a, por exemplo, quando a célula é ativada com um anticorpo anti-CD3 ou anti-CD28.
[0021] Em algumas modalidades, a célula compreende um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) do gene associado a Tet2.
[0022] Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor ou ativador) é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico codificando um ou mais componentes do referido sistema de edição genética; ou (3) uma sua combinação. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é selecionado do grupo consistindo em: um sistema CRISPR/Cas9, um sistema de nucleases dedo de zinco, um sistema TALEN e um sistema de meganucleases. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron inicial do
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10/606 gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo do gene associado a Tet2, e a sequência-alvo está a montante do éxon 4, por exemplo, no éxon 1, éxon 2 ou éxon 3. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron tardio do gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo do gene associado a Tet2, e a sequência-alvo está a jusante de um pré-antepenúltimo éxon, por exemplo, está em um antepenúltimo éxon, um penúltimo éxon ou um último éxon. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que híbrida com uma sequência-alvo do gene associado a Tet2.
[0023] Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor) é um siRNA ou shRNA específico para o gene associado a Tet2, ou ácido nucleico codificando o referido siRNA ou shRNA. Em algumas modalidades, o siRNA ou shRNA compreende uma sequência complementar a uma sequência de um mRNA do gene associado a Tet2.
[0024] Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor ou ativador) é uma molécula pequena.
[0025] Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor ou ativador) é uma proteína. Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor) é um parceiro de ligação negativo dominante de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2, ou um ácido nucleico codificando o referido parceiro de ligação negativo dominante. Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor) é uma variante negativa dominante (por exemplo, cataliticamente inativa) de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2, ou um ácido nucleico codificando a referida variante negativa dominante.
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[0026] Em algumas modalidades, a célula compreende um inibidor de um primeiro gene associado a Tet2 e um ativador de um segundo gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, a célula também compreende um inibidor de Tet2.
[0027] Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma célula (por exemplo, uma população de células), por exemplo, uma célula efetora imune, expressando um receptor de antígenos quimérico (CAR), por exemplo, uma célula expressando CAR, em que o CAR compreende um domínio de ligação a antígenos, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, e em que a célula expressando CAR tem uma disrupção de Tet2, por exemplo, expressão e/ou função alteradas de Tet2.
[0028] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR com uma disrupção em Tet2, por exemplo, como descrito aqui, tem uma, duas, três, quatro ou mais (por exemplo, todas) das seguintes características:
(i) potencial de expansão aumentado, por exemplo, pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5 ou 6 vezes a expansão medida por um ensaio do Exemplo 1;
(ii) um ou mais propriedades de células T de memória de vida curta, por exemplo, expressão aumentada de EOMES, expressão decrescida de KLRG1, atividade citotóxica aumentada ou potencial aumentado de células T de memória medido por um ensaio do Exemplo 1;
(iii) função efetora aumentada, por exemplo, desgranulação aumentada de CD107a, granzima B e perforina medida por um ensaio do Exemplo 1;
(iv) atividade citolítica aumentada medida por um ensaio do Exemplo 1; ou (v) capacidade proliferativa aumentada, por exemplo,
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12/606 medida por Ki67 aumentado, medido por um ensaio do Exemplo 1, em comparação com uma célula expressando CAR em tudo o mais idêntica ou similar com Tet2 sem disrupção, por exemplo, Tet2 de tipo selvagem. [0029] Em algumas modalidades, a célula expressando CAR com uma disrupção de Tet2 tem uma disrupção monoalélica de Tet2, por exemplo, a célula tem um alelo de Tet2 com disrupção (por exemplo, como descrito aqui) e um alelo de Tet2 de tipo selvagem.
[0030] Em algumas modalidades, a célula expressando CAR com uma disrupção de Tet2 tem uma disrupção bialélica de Tet2, por exemplo, a célula tem dois alelos de Tet2 com disrupção (por exemplo, como descrito aqui).
[0031] Em algumas modalidades, a disrupção de Tet2 na célula efetora imune ou célula expressando CAR é produzida por uma mutação que altera, por exemplo, reduz, a função de Tet2, por exemplo, uma mutação hipomórfica, por exemplo, uma mutação E1879Q como descrito aqui. Em algumas modalidades, a mutação hipomórfica em Tet2, por exemplo, E1879Q, origina uma proteína Tet2 que tem função reduzida em comparação com uma proteína Tet2 produzida por um alelo de Tet2 de tipo selvagem, como descrito em um ensaio do Exemplo 1.
[0032] Em algumas modalidades, a disrupção de Tet2 na célula efetora imune ou célula expressando CAR é produzida por integração lentiviral, por exemplo, integração de um lentivírus codificando uma molécula CAR, no gene Tet2, por exemplo, no promotor, introns ou éxons do gene Tet2, por exemplo, como descrito no Exemplo 1.
[0033] Em algumas modalidades, a disrupção de Tet2, por exemplo, como descrito aqui, é produzida na população de células efetoras imunes de uma população de células expressando CAR por contato da população de células com um inibidor de Tet2, por exemplo, um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2-hidroxiglutarato); um
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13/606 lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui); uma isoforma de Tet2 negativa dominante, ou um ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante; um agente de RNAi visando Tet2 (por exemplo, siRNA ou shRNA); um CRISPR-Cas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2.
[0034] Em algumas modalidades, a disrupção de Tet2 produzida por quaisquer dos métodos revelados aqui pode ser monoalélica ou bialélica. Em algumas modalidades, uma disrupção de Tet2 produzida em uma célula por quaisquer dos métodos revelados aqui é monoalélica, por exemplo, a célula tem um alelo de Tet2 com disrupção e um alelo de Tet2 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma disrupção de Tet2 produzida em uma célula por quaisquer dos métodos revelados aqui é bialélica, por exemplo, a célula tem dois alelos de Tet2 com disrupção, por exemplo, duas disrupções diferentes, por exemplo, como descrito aqui.
[0035] Em algumas modalidades, uma disrupção de Tet2 está presente na população de células efetoras imunes, por exemplo, antes da expressão de uma molécula CAR. Em algumas modalidades, uma população de células efetoras imunes compreende um alelo de Tet2 com disrupção, por exemplo, uma disrupção monoalélica de Tet2 como descrito aqui, por exemplo, um alelo de Tet2 hipomórfico monoalélico.
[0036] Em algumas modalidades, uma população de células efetoras imunes compreendendo um alelo de Tet2 com disrupção, por exemplo, um alelo de Tet2 hipomórfico, é contatada com um inibidor de Tet2, por exemplo, um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2-hidroxiglutarato); um lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui); uma isoforma de Tet2 negativa dominante; ou um ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante; um agente RNAi visando Tet2; um CRISPRCas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2, desse modo
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14/606 procedendo à disrupção do alelo de Tet2 de tipo selvagem resultando, por exemplo, em disrupção bialélica de Tet2.
[0037] Em algumas modalidades de quaisquer das composições reveladas aqui, o domínio de ligação a antígenos se liga a um antígeno tumoral selecionado de um grupo consistindo em: TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, Mesotelina, IL-11 Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, CD20, Receptor de folato alfa, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor de IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, tirosinase, EphA2, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, Receptor de folato beta, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, Ácido polissiálico, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, legumaína, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, proteína do esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno relacionado com Fos 1, p53, p53 mutante, prosteína, survivina e telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, Ras mutante, hTERT, pontos de quebra de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, Receptor de andrógenos, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OYTES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa de telomerase humana, RU1, RU2, carboxil-esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 e IGLL1.
[0038] Em algumas modalidades de quaisquer das composições reveladas aqui, o antígeno tumoral é CD19.
[0039] Em algumas modalidades de quaisquer das composições
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15/606 reveladas aqui, o domínio de ligação a antigenos é um anticorpo ou fragmento de anticorpo como descrito, por exemplo, em WO2012/079000 ou WO2014/153270. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana compreende: uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 12, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 12; ou a sequência de SEQ ID N2: 12. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antigenos é conetado ao domínio de transmembrana por a região de dobradiça, em que a referida região de dobradiça compreende SEQ ID N2: 2 ou SEQ ID N2: 6, ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquelas.
[0040] Em algumas modalidades de quaisquer das composições reveladas aqui, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização primário e/ou um domínio de sinalização coestimulador, em que o domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína escolhida de CD3 zeta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, FcR gama comum (FCER1G), FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD79a, CD79b, Fcgama Rlla, DAP10 ou DAP12.
[0041] Em algumas modalidades de quaisquer das composições reveladas aqui, o domínio de sinalização primário compreende: uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 18 ou SEQ ID N2: 20 ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 18 ou SEQ ID N2: 20; ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID N2: 18 ou SEQ ID N2: 20.
[0042] Em algumas modalidades de quaisquer das composições
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16/606 reveladas aqui, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador, ou um domínio de sinalização primário e um domínio de sinalização coestimulador, em que o domínio de sinalização coestimulador compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo consistindo em CD27, CD28, 4-1 BB (CD137), 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à função de linfócitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, e NKG2D.
[0043] Em algumas modalidades de quaisquer das composições reveladas aqui, o domínio de sinalização coestimulador compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador compreende uma sequência de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16. Em algumas modalidades, o domínio intracelular compreende a sequência de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16, e a sequência de SEQ ID NQ: 18 ou SEQ ID NQ: 20, em que as sequências compreendendo o domínio de sinalização
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17/606 intracelular são expressas no mesmo quadro e como uma única cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a célula também compreende uma sequência líder que compreende a sequência de SEQ ID NQ: 2.
[0044] Em algumas modalidades, a célula é uma célula efetora imune (por exemplo, uma população de células efetoras imunes). Em algumas modalidades, a célula efetora imune é uma célula T ou uma célula NK. Em algumas modalidades, a célula efetora imune é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ ou uma sua combinação. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana.
[0045] Em algumas modalidades, a célula compreende um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1.
[0046] Em algumas modalidades, o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1 é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1 ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico codificando um ou mais componentes do referido sistema de edição genética; ou (3) uma sua combinação. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é selecionado do grupo consistindo em: um sistema CRISPR/Cas9, um sistema de nucleases dedo de zinco, um sistema TALEN e um sistema de meganucleases. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron inicial de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RAou PRDM1. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1, e a sequência-alvo está a montante do éxon 4, por exemplo, no éxonl, éxon2 ou éxon3, por exemplo, no éxon 3. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron tardio de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas
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18/606 modalidades, o sistema de edição genética se liga a uma sequênciaalvo de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1, e a sequência-alvo está a jusante de um pré-antepenúltimo éxon, por exemplo, está em um antepenúltimo éxon, um penúltimo éxon ou um último éxon. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que híbrida com uma sequência-alvo de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1.
[0047] Em algumas modalidades, o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1 é um siRNA ou shRNA específico para IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1, ou ácido nucleico codificando o referido siRNA ou shRNA. Em algumas modalidades, o siRNA ou shRNA compreende uma sequência complementar a uma sequência de um mRNA de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1.
[0048] Em algumas modalidades, o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1 é uma molécula pequena.
[0049] Em algumas modalidades, o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1 é uma proteína, por exemplo, é um parceiro de ligação negativo dominante de uma proteína codificada por um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1, ou um ácido nucleico codificando o referido parceiro de ligação negativo dominante. Em algumas modalidades, o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1 é uma proteína, por exemplo, é uma variante negativa dominante (por exemplo, cataliticamente inativa) de uma proteína codificada por um gene IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1, ou um ácido nucleico codificando a referida variante negativa dominante.
[0050] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um
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19/606 método para aumentar a eficácia terapêutica de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula descrita aqui, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, CTL019 ou CTL119), compreendendo uma etapa de alterar (por exemplo, decrescer ou aumentar) a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) na referida célula, em que o gene associado a Tet2 é escolhido de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0051] Em algumas modalidades, o método compreende alterar (por exemplo, decrescer) a expressão e/ou função de um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, o método também compreende alterar (por exemplo, decrescer) a expressão e/ou função de Tet2.
[0052] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar a eficácia terapêutica de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula descrita aqui, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, CTL019 ou CTL119), compreendendo uma etapa de contatar a referida célula com um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
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[0053] Em algumas modalidades, a referida etapa compreende contatar as referidas células com um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, o inibidor é selecionado do grupo consistindo em: (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene associado a Tet2, ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA ou shRNA) que inibe a expressão do gene associado a Tet2; (3) uma proteína (por exemplo, uma negativa dominante, por exemplo, cataliticamente inativa) codificada pelo gene associado a Tet2, ou um parceiro de ligação de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2; (4) uma molécula pequena que inibe a expressão e/ou função do gene associado a Tet2; (5) um ácido nucleico codificando quaisquer de (1 )-(3); e (6) qualquer combinação de (1 )-(5). Em algumas modalidades, o método também compreende contatar a referida célula com um inibidor de Tet2.
[0054] Em algumas modalidades, o referido contato ocorre ex vivo. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo antes da administração na célula de ácido nucleico codificando um CAR. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo depois de as células terem sido administradas a um sujeito necessitado.
[0055] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para o tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo administrar ao referido sujeito uma quantidade eficaz de uma célula descrita aqui.
[0056] Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais
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21/606 genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0057] Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
[0058] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar a eficácia terapêutica de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula descrita aqui, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, CTL019 ou CTL119), compreendendo uma etapa de alterar (por exemplo, decrescer) a expressão e/ou função de Tet2 por contato da referida célula com um inibidor de Tet2.
[0059] Em algumas modalidades, o inibidor de Tet2 é escolhido de: um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2hidroxiglutarato); um lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui); uma isoforma de Tet2 negativa dominante, ou um ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante; um agente RNAi visando Tet2 (por exemplo, siRNA ou shRNA); um CRISPR-Cas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2. [0060] Em algumas modalidades, o referido contato ocorre ex vivo. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo antes da administração na célula de ácido nucleico codificando um CAR. Em algumas modalidades, o contato ocorre in vivo depois de as células terem sido administradas a um sujeito necessitado.
[0061] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para o tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo administrar ao referido sujeito uma quantidade eficaz de uma célula descrita aqui.
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[0062] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula para uso em um método de tratamento de um sujeito necessitado, compreendendo administrar ao referido sujeito uma quantidade eficaz de uma célula descrita aqui.
[0063] Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. [0064] Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2, por exemplo, um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2-hidroxiglutarato); um lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui); uma isoforma de Tet2 negativa dominante, ou um ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante; um agente RNAi visando Tet2 (por exemplo, siRNA ou shRNA); um CRISPR-Cas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2.
[0065] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma terapia com células expressando CAR para uso em um método de tratamento de um sujeito necessitado, compreendendo administrar ao referido sujeito a terapia com células expressando CAR e um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou
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PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0066] Em algumas modalidades, o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
[0067] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma terapia com células expressando CAR para uso em um método de tratamento de um sujeito necessitado, compreendendo administrar ao referido sujeito à terapia com células expressando CAR e um inibidor de Tet2.
[0068] Em algumas modalidades, o inibidor de Tet2 é escolhido de: um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2hidroxiglutarato); um lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui), isoformas negativas dominantes de Tet2, e ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante; um agente RNAi visando Tet2 (por exemplo, siRNA ou shRNA); um CRISPR-Cas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2.
[0069] Em algumas modalidades, o sujeito recebe um prétratamento do modulador (por exemplo, inibidor) antes do início da terapia com células expressando CAR. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento concorrente com o modulador (por exemplo, inibidor) e a terapia com células expressando CAR. Em algumas modalidades, o sujeito recebe tratamento com o modulador (por exemplo, inibidor) após a terapia com células expressando CAR.
[0070] Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doença associada a expressão de um antígeno tumoral, por exemplo, uma doença proliferativa, uma condição pré-cancerosa, um câncer e uma
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24/606 indicação não relacionada com câncer associada à expressão do antígeno tumoral.
[0071] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer hematológico ou um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer hematológico escolhido de um ou mais de leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemias agudas, leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia linfoide aguda de células B (B-ALL), leucemia linfoide aguda de células T (T-ALL), leucemia mielógena crônica (CML), leucemia pró-linfocítica de células B, neoplasma de células blásticas dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de pequenas células ou grandes células, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e sindrome mielodisplásica, linfoma de não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom ou pré-leucemia.
[0072] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer do cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer do fígado, carcinoma do pulmão de células não pequenas, câncer do intestino delgado, câncer do esôfago, melanoma, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer da pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer do ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores
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25/606 sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidos pelo ambiente, combinações dos referidos cânceres e lesões metastáticas dos referidos cânceres.
[0073] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de um sujeito, compreendendo administrar ao referido sujeito um modulador (por exemplo, um inibidor ou ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A, ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central, em que o referido sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber terapia compreendendo uma célula expressando CAR.
[0074] Em algumas modalidades, o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
[0075] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de um sujeito, compreendendo administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2. Em algumas modalidades, o inibidor de Tet2 é escolhido de um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2-hidroxiglutarato); um lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui); uma isoforma de Tet2 negativa dominante, ou um ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo
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26/606 dominante; um agente RNAi visando Tet2 (por exemplo, siRNA ou shRNA); um CRISPR-Cas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2.
[0076] Em outro aspecto, a invenção proporciona um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) para uso no tratamento de um sujeito, em que o gene associado a Tet2 é escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A, ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central, e em que o referido sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber terapia compreendendo uma célula expressando CAR.
[0077] Em algumas modalidades, o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas modalidades, o sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber um inibidor de Tet2.
[0078] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um inibidor de Tet2 para uso no tratamento de um sujeito, por exemplo, um sujeito com uma condição ou doença revelada aqui, em que o referido sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber terapia compreendendo uma célula expressando CAR.
[0079] Em um aspecto, é revelado aqui um método de preparação de uma população de células efetoras imunes expressando um Receptor de Antigenos Quimérico (CAR), compreendendo
a) proporcionar uma população de células efetoras imunes, por exemplo, células T;
b) contatar a população de células efetoras imunes com um ácido nucleico codificando um polipeptideo de CAR;
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c) contatar a população de células efetoras imunes com um inibidor de Tet2, por exemplo, como descrito aqui;
e
d) manter as células sob condições que permitem a expressão do polipeptideo de CAR, desse modo preparando uma população de células efetoras imunes expressando CAR.
[0080] Em algumas modalidades, o inibidor de Tet2 é escolhido de: um inibidor de Tet2, por exemplo, um inibidor de molécula pequena de Tet 2 (por exemplo, 2-hidroxiglutarato); um lentivírus (por exemplo, um lentivírus codificando uma molécula CAR como descrito aqui); uma isoforma de Tet2 negativa dominante, ou um ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante; um agente RNAi visando Tet2 (por exemplo, siRNA ou shRNA); um CRISPR-Cas9 visando Tet2; ou um ZFN/TALEN visando Tet2.
[0081] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR preparada com inibidor de Tet 2 como revelado aqui tem uma, duas, três, quatro ou mais (por exemplo, todas) das seguintes características:
(i) potencial de expansão aumentado, por exemplo, pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5 ou 6 vezes a expansão medida por um ensaio do Exemplo 1;
(ii) um ou mais propriedades de células T de memória de vida curta, por exemplo, expressão aumentada de Eomes, expressão decrescida de KLRG1, atividade citotóxica aumentada ou potencial aumentado de células T de memória medido por um ensaio do Exemplo 1;
(iii) função efetora aumentada, por exemplo, desgranulação aumentada de CD107a, granzima B e perforina medida por um ensaio do Exemplo 1;
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28/606 (iv) atividade citolítica aumentada medida por um ensaio do Exemplo 1; ou (v) capacidade proliferativa aumentada, por exemplo, medida por Ki67 aumentado, medido por um ensaio do Exemplo 1, em comparação com uma célula expressando CAR de outro modo similar com Tet2 sem disrupção, por exemplo, Tet2 de tipo selvagem. [0082] Em algumas modalidades de um método de preparação revelado aqui, uma disrupção de Tet2 está presente na população de células efetoras imunes, por exemplo, antes do contato com um ácido nucleico codificando um polipeptideo de CAR. Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes compreende um alelo de Tet2 com disrupção, por exemplo, uma disrupção monoalélica de Tet2 como descrito aqui, por exemplo, um alelo de Tet2 hipomórfico monoalélico. Em algumas modalidades de um método de preparação revelado aqui, o contato de uma população de células efetoras imunes compreendendo uma disrupção monoalélica em Tet2 com um inibidor de Tet2, por exemplo, como descrito aqui, resulta em disrupção bialélica de Tet2, por exemplo, disrupção do alelo de Tet2 de tipo selvagem. [0083] Em algumas modalidades de um método de preparação revelado aqui, uma disrupção de Tet2 está presente na população de células efetoras imunes, por exemplo, antes do contato com um ácido nucleico codificando um polipeptideo de CAR. Em algumas modalidades, a população de células efetoras imunes compreende um ou mais alelos de Tet2 com disrupção, por exemplo, disrupção bialélica em Tet2.
[0084] Em algumas modalidades de um método de preparação revelado aqui, uma disrupção de Tet2 não está presente na população de células efetoras imunes, por exemplo, antes do contato com um ácido nucleico codificando um polipeptideo de CAR. Em algumas modalidades, o contato de uma população de células efetoras imunes
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29/606 compreendendo alelos de Tet2 sem disrupção, por exemplo, compreendendo dois alelos de Tet2 de tipo selvagem, com um inibidor de Tet2, por exemplo, como descrito aqui, resulta em disrupção bialélica de Tet2, por exemplo, disrupção do alelo de Tet2 de tipo selvagem. [0085] Em algumas modalidades, uma população expressando CAR preparada com a população efetora imune compreendendo disrupção bialélica de Tet2 tem uma, duas, três, quatro ou mais (por exemplo, todas) das seguintes características:
(i) potencial de expansão aumentado, por exemplo, pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5 ou 6 vezes a expansão medida por um ensaio do Exemplo 1;
(ii) propriedades de células T de memória de vida curta, por exemplo, expressão aumentada de EOMES, expressão decrescida de KLRG1, atividade citotóxica aumentada ou potencial aumentado de células T de memória medido por um ensaio do Exemplo 1;
(iii) função efetora aumentada, por exemplo, desgranulação aumentada de CD107a, granzima B e perforina medida por um ensaio do Exemplo 1;
(iv) atividade citolítica aumentada medida por um ensaio do Exemplo 1; ou (v) capacidade proliferativa aumentada, por exemplo, medida por Ki67 aumentado, medido por um ensaio do Exemplo 1, em comparação com uma célula expressando CAR de outro modo similar com Tet2 sem disrupção, por exemplo, Tet2 de tipo selvagem. [0086] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos ou composições revelados aqui, uma célula expressando CAR compreendendo uma disrupção em Tet2, por exemplo, disrupção monoalélica ou bialélica em Tet2 (por exemplo, por quaisquer dos métodos revelados aqui), pode popular, por exemplo, desenvolver ou se dividir em, uma população de células expressando CAR, por exemplo,
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30/606 se expandir em uma população clonal de células expressando CAR. Em algumas modalidades, uma população de células expressando CAR derivada de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma população clonal de células expressando CAR, pode ser administrada a um sujeito, por exemplo, para o tratamento de uma doença ou condição, por exemplo, um câncer, por exemplo, um câncer associado a expressão de um antígeno reconhecido pela célula expressando CAR. Em algumas modalidades, uma população clonal de células expressando CAR resulta em tratamento, por exemplo, como descrito aqui, da referida doença.
[0087] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de uma célula expressando CAR, compreendendo introduzir um ácido nucleico codificando um CAR em uma célula de modo que o referido ácido nucleico (ou sua porção codificando CAR) é integrado no genoma da célula dentro de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) (por exemplo, dentro de um íntron ou éxon do gene associado a Tet2), de modo que a expressão e/ou função dos genes associados a Tet2 são alteradas (por exemplo, reduzidas ou eliminadas), em que o gene associado a Tet2 é escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0088] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 é escolhido de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
[0089] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de uma célula expressando CAR, compreendendo contatar a referida célula expressando CAR ex vivo com um modulador (por
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31/606 exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0090] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 é escolhido de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
[0091] Em outro aspecto, a invenção proporciona um vetor compreendendo uma sequência codificando um CAR e uma sequência codificando um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0092] Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor) é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene, ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA ou shRNA) que inibe a expressão do gene associado a Tet2; (3) uma proteína (por exemplo, uma negativa dominante, por exemplo, cataliticamente inativa) codificada pelo gene associado a Tet2, ou um parceiro de ligação de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2; e (4) um ácido nucleico codificando quaisquer de (1 )-(3), ou suas combinações.
[0093] Em algumas modalidades, o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em algumas
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32/606 modalidades, a sequência codificando um CAR e a sequência codificando o inibidor estão separadas por um sítio 2A.
[0094] Em outro aspecto, a invenção proporciona um sistema de edição genética que é específico para uma sequência de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) ou um seu elemento regulador, em que o gene associado a Tet2 é escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0095] Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é específico para uma sequência de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
[0096] Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é um sistema de edição genética CRISPR/Cas, um sistema de nucleases dedo de zinco, um sistema TALEN ou um sistema de meganucleases. Em algumas modalidades, o sistema de edição genética é um sistema de edição genética CRISPR/Cas.
[0097] Em algumas modalidades, o sistema de edição genética compreende: uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador, e uma proteína Cas9; uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador, e um ácido nucleico codificando uma proteína Cas9; um ácido nucleico codificando uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou um seu elemento
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33/606 regulador, e uma proteína Cas9; ou um ácido nucleico codificando uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador, e um ácido nucleico codificando uma proteína Cas9.
[0098] Em algumas modalidades, o sistema de edição genética também compreende um DNA-modelo. Em algumas modalidades, o DNA-modelo compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR, por exemplo, um CAR como descrito aqui.
[0099] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição para a preparação ex vivo de uma célula expressando CAR, compreendendo um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de: (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1; (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8; (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D; (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
[0100] Em algumas modalidades, o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
[0101] Em algumas modalidades, o modulador (por exemplo, inibidor) é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA ou shRNA) que inibe a expressão do gene associado a Tet2; (3) uma proteína (por exemplo, uma negativa dominante, por exemplo, cataliticamente inativa) codificada pelo gene, ou um parceiro de ligação de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2; ou (4) um ácido nucleico codificando quaisquer de (1 )-(3), ou suas combinações.
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[0102] Em algumas modalidades, a composição também compreende um inibidor de Tet2.
[0103] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma população de células compreendendo um ou mais células reveladas aqui, em que a população de células compreende uma percentagem mais elevada (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes mais elevada) de células Tscm (por exemplo, células T CD45RA+CD62L+CCR7+ (opcionalmente CD27+CD95+)) do que uma população de células que não compreende uma ou mais células nas quais a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) na referida célula foram reduzidas ou eliminadas.
[0104] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma população de células compreendendo um ou mais células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-89, em que pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99%) da população de células têm um fenótipo de células T de memória central. [0105] Em algumas modalidades, o fenótipo de células de memória central é um fenótipo de células T de memória central. Em algumas modalidades, pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99%) da população de células expressam CD45RO e/ou CCR7.
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS
[0106] O arquivo da patente ou pedido de patente contém pelo menos uma figura executada a cores. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com figura(s) a cores serão proporcionadas pelo Gabinete por pedido e pagamento da taxa necessária.
[0107] As Figuras 1A-1D ilustram a avaliação de respostas clínicas após transferência adotiva de células T CAR em um paciente com CLL.
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A Figura 1A mostra a expansão e persistência in vivo de células T CAR CTL019 antes e após duas infusões. A frequência de células CTL019 é ilustrada como cópias médias do transgene/pg de DNA. A Figura 1B mostra medições longitudinais de citocinas no soro antes e após infusões de células T CAR. Uma medição absoluta de cada citocina foi derivada de uma curva padrão baseada em concentrações de proteínas recombinantes ao longo de uma série de diluições de oito pontos de três vezes. Cada amostra foi analisada em duplicado com valores médios mostrados (coeficiente de variação menor do que 10%). A Figura 1C mostra o número total de células de CLL em circulação antes e após terapia com CTL019. Os cálculos foram baseados em contagens absolutas de linfócitos de valores de contagens em sangue completo presumindo um volume de 5 litros de sangue periférico. A Figura 1D mostra imagiologia por tomografia computorizada sequencial mostrando resolução de linfadenopatia refratária a quimioterapia. As massas foram progressivamente reduzidas começando dois meses após a segunda infusão de células T CAR, indicado pelas setas, e ficaram resolvidas quando se perfez um ano e para além disso (dados não mostrados).
[0108] A Figura 2 ilustra que o crescimento de células T CAR no Paciente 10 ocorre no compartimento de CD8. A cinética da expansão de células T CAR CTL019 total (gráfico da esquerda) relativamente à expansão de células CD8+ CTL019 (gráfico da direita) é mostrada prée pós-infusão. O número de células CTL019 em circulação foi calculado com base nas frequências de populações CD3+ e CD8+ CAR+ e contagens absolutas de células. Todos os valores observados ficaram acima do limite de detecção por citometria de fluxo (0,1%).
[0109] A Figura 3 ilustra que células T CAR preparadas a partir do Paciente 10 exibem uma composição policlonal. É mostrada a distribuição de TCRVp em células T CAR CD8- (gráfico circular da
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36/606 esquerda) e CD8+ (gráfico circular da direita) no produto de infusão celular do Paciente 10.
[0110] As Figuras 4A-4D ilustram a distribuição da utilização de TCRVp em um paciente com CLL que teve uma expansão clonal de células T CAR. Na Figura 4A é ilustrada a frequência média da utilização do segmento genético TCRVp no sangue periférico de um paciente com CLL um mês (gráfico circular da esquerda) e dois meses (gráfico circular do meio) após a segunda infusão de células T CAR. As frequências de clonótipos de TCRVp em células T CAR CD8+ submetidas à triagem no pico da expansão após a segunda infusão são mostradas no gráfico circular mais à direita. Cada segmento genético TCRVp é representado por uma fatia que é proporcional à sua frequência. A fatia que representa a proporção da utilização de TCRVp5.1 em cada instante está indicada em cada gráfico circular. Na Figura 4B, a análise citométrica de fluxo de PBMC ilustra a grande proporção de células T CAR CD8+ que são positivas para TCRV35.1 relativamente a TCRVpi3.1 (controle negativo). Na Figura 4C, a abundância de clonótipos de TCRVp5.1 em células T CD8+ CAR+ submetidas à triagem no pico da atividade é ilustrada em células CD8+ CTL019 pré-infusão e em sangue completo ao um bem como dois meses após o segundo tratamento com células T CAR determinado por sequenciamento profundo do repertório. O clone de TCRV35.1 dominante (CASSLDGSGQGSDYGYTF) é mostrado como uma mancha vermelha em cada gráfico bivariado. Na Figura 4D, a cinética da expansão clonal de TCRVp5.1 após a segunda infusão de células T CAR é representada graficamente em paralelo com os níveis de proliferação e persistência de CAR. Os níveis do CAR e do clone de TCRVp5.1 dominante (mostrados como percentagem de células com a sequência clonal detectável) foram medidos por qPCR em DNA extraído de sangue completo.
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[0111] As Figuras 5A-5B ilustram a análise de sítios de integração lentiviral de CAR e detecção de transcritos quiméricos de TET2 no Paciente 10. Na Figura 5A, a abundância relativa de clones de células T CAR após a segunda infusão é resumida na forma de um gráfico de barras empilhadas. Barras diferentes indicam os principais clones de células, marcados por sítios de integração. Uma chave para os sítios é mostrada por baixo do gráfico. Cada sítio de integração é denominado pelo gene mais próximo. A abundância relativa foi estimada usando o método SonicLength. Abundâncias relativas estimadas inferiores a 3% são classificadas como Baixa Abundância. A Figura 5B ilustra um diagrama do vetor no lócus do sítio de integração de TET2 ilustrando o encadeamento de transcritos truncados no vetor de provírus que foram detectados no pico da atividade de células T CAR in vivo (Dia 121). Cada um dos eventos de encadeamento recrutou códons de terminação ectópicos na estrutura (designados pelos pequenos asteriscos acima das linhas negras contínuas), que representam os produtos encadeados. Sequências correspondentes às junções de encadeamento para as três mensagens quiméricas (cinco junções no total) são listadas por baixo do diagrama. As regiões sublinhadas na tabela por baixo do diagrama correspondem a doadores e aceptores de encadeamento. LTR, repetição terminal longa; cPPT, trato de polipurina; EF1a, promotor do fator de alongamento 1 alfa.
[0112] As Figuras 6A-6B ilustram a estratégia para a detecção de transcritos quiméricos de TET2 no Paciente 10. Na Figura 6Aé ilustrada a estratégia para a detecção de RNA poliadenilado correspondente a transcritos de TET2 truncados. As caixas representam as regiões genômicas entre os éxons 9 e 10 de TET2 com o vetor integrado presente. Setas azuis e vermelhas indicam localizações gerais dos iniciadores diretos e reversos que são listados por baixo do diagrama. LTR, repetição terminal longa; cPPT, trato de polipurina; EF1a, promotor
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38/606 do fator de alongamento 1 alfa. A Figura 6B mostra a visualização de produtos de RT-PCR de TET2 quiméricos. Os produtos de PCR foram separados em um gel de agarose nativo e corados com brometo de etídio. Os tamanhos esperados dos amplicons são listados acima do gel. Os transcritos truncados são salientados por caixas. Uma chave para as reações de RT-PCR é mostrada por baixo do diagrama.
[0113] As Figuras 7A-7G ilustram que a deficiência de TET2 altera a paisagem epigenética e diferenciação de células T. Na Figura 7A são mostrados níveis totais de 5-hmc em células T CD8+ CAR+ e CARcultivadas do Paciente 10 no pico da resposta à terapia com CTL019. Os histogramas ilustram a intensidade da coloração de 5-hmc intracelular determinada por citometria de fluxo. A Figura 7B mostra diagramas de Venn de regiões de ATAC-seq diferencial (esquerda) e enriquecimento daqueles picos em cada porção dos diagramas (direita) em células T CD8+ CAR+ e CAR- cultivadas do Paciente 10. Na Figura 7C são mostradas perspectivas por pesquisa do genoma do enriquecimento ATAC no lócus de IFNG correspondente às células do paciente acima. A Figura 7D ilustra frequências de células T CD8+ CAR+ bem como CAR- expressando IFNy e CD107a expandidas do Paciente 10 que não foram estimuladas ou foram estimuladas com esférulas revestidas com anticorpo anti-CD3/CD28. As inserções nos gráficos de contorno indicam as frequências de populações de células agrupadas. Na Figura 7E, o fenótipo de diferenciação ex vivo de células T CAR no pico da atividade in vivo é mostrado em dois pacientes com CLL respondedores completos de longa duração (Pacientes 1 e 2) em comparação com o Paciente 10. As fatias representam a frequência relativa de cada subconjunto de células T. Células T do tipo virgems: CCR7+CD45RO-; células T de memória central: CCR7+CD45RO+; células T de memória efetoras: CCR7-CD45RO+; e células T efetoras: CCR7-CD45RO-. O nível de células CTL019 foi determinado por PCR
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39/606 quantitativa e as frequências de células T CAR ativadas expressando HLA-DR (marcador de ativação da superfície celular) no pico da resposta de cada paciente estão listadas por baixo dos gráficos circulares. Na Figura 7F é mostrada a expressão de TET2 em células T CD8+ primárias derivadas de doadores saudáveis que foram transduzidas de modo lentiviral com um shRNA embaralhado (controle) ou sequências de TET2 medida por PCR quantitativa. As barras de erro ilustram m.e.p. Na Figura 7G são ilustradas as frequências de células T CD8+ de memória central (esquerda), de memória efetoras (meio) e efetoras de doadores saudáveis após silenciamento mediado por shRNA de TET2e expansão in vitro. A frequência de cada subconjunto é apresentada relativamente ao seu correspondente que foi transduzido com o shRNA embaralhado (/? = 12). Os valores Pforam determinados usando um teste ide Student emparelhado de duas caudas.
[0114] A Figura 8 ilustra que células T CAR com TET2 com disrupção do Paciente 10 exibem um perfil global de cromatina consistente com diferenciação e atividade efetoras suprimidas. São listados termos de GO associados a regiões de cromatina que estão significativamente mais fechadas em células T CD8+ CAR+ com TET2 com disrupção do Paciente 10 em comparação com as suas contrapartidas de células T CD8+ CAR- correspondentes.
[0115] A Figura 9 ilustra o estado de diferenciação de células T CAR no Paciente 10 ao longo do tempo. Gráficos de contorno representativos de dados citométricos de fluxo ilustrando a frequência de células T CD8+ CAR+ e CAR- no Paciente 10 que expressam HLADR (molécula de superfície indicadora de ativação de células T). São mostradas as proporções destas células que expressam CD45RO e CCR7 como determinantes do estado de diferenciação. As inserções nos gráficos de contorno indicam as frequências das populações de células agrupadas.
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[0116] As Figuras 10A-10C ilustram que o silenciamento de TET2 aumenta a frequência de células T CAR+ e reduz a diferenciação efetora. A Figura 10A mostra gráficos representativos de citometria de fluxo mostrando o estado de diferenciação de células T CD8+ CAR+ de doadores saudáveis após transdução com um shRNA embaralhado (controle) ou um shRNA visando TET2. As inserções definem frequências de populações agrupadas. As Figura 10B e Figura 10C mostram frequências de células T CD8+ CAR+ e células T CD4+ CAR+ de sujeitos saudáveis, respectivamente, de acordo com o fenótipo de diferenciação após transdução com shRNA de controle ou TET2 (n = 10). Os valores P foram calculados usando um teste t de Student emparelhado de duas caudas.
[0117] As Figuras 11A-11E ilustram resultados da pesquisa de sítios lentivirais de integração de CAR e deficiência de TET2 no Paciente 10. A Figura 11A mostra a abundância relativa de clones de células T CAR após a segunda infusão resumida na forma de um gráfico de barras empilhadas. Barras horizontais diferentes indicam os principais clones de células, marcados por sítios de integração. Uma chave para os sítios é mostrada por baixo do gráfico. Abundâncias relativas estimadas inferiores a 3% são classificadas como Baixa Abundância. A Figura 11B mostra a diversidade de células T CAR no Paciente 10 ao longo do tempo usando o índice de Shannon, que descreve o número de sítios de integração únicos diferentes e a uniformidade da distribuição de células submetidas a amostragem entre sítios de integração. A Figura 11C mostra um diagrama do vetor no lócus do sítio de integração de TET2 ilustrando o encadeamento de transcritos truncados no vetor de provírus que foram detectados no pico da atividade de células T CAR in vivo (Dia 121). Cada um dos eventos de encadeamento recrutou códons de terminação ectópicos na estrutura (designados pelos pequenos asteriscos acima das linhas
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41/606 negras contínuas), que representam os produtos encadeados. Sequências correspondentes às junções de encadeamento para as três mensagens quiméricas (cinco junções no total) são listadas por baixo do diagrama. As regiões sublinhadas na tabela por baixo do diagrama correspondem a doadores e aceptores de encadeamento. LTR, repetição terminal longa; cPPT, trato de polipurina; EF1a, promotor do fator de alongamento 1 alfa. A Figura 11D mostra um diagrama das oxidações sequenciais catalisadas por TET2 de 5-mC em 5-hmC e em 5-fC e 5-caC (topo). São mostradas colorações dot de 5-mC, 5-hmC, 5-fC e 5-caC em 600 ng de DNA genômico isolado de células T HEK293 transfectadas com o mutante de TET2 E1879Q. Os controles do ensaio incluem um vetor vazio, TET2 de tipo selvagem e mutante de TET2 cataliticamente inativo (HxD) (em baixo à esquerda). Também é mostrada uma transferência Western usando anticorpo anti-FLAG para detectar hTET2 nas células acima. Hsp90a/p foi usado como controle de carga (em baixo à direita). A Figura 11E mostra níveis genômicos de modificações 5-mC, 5-hmC, 5-fC e 5-caC produzidas pelo mutante de TET2 E1879Q e quantificadas por LC-MS/MS como a percentagem de modificações totais de citosina. São mostradas percentagens derivadas da média de experiências independentes (n = 3) (**P □ 0,01 determinado usando um teste t de Student emparelhado de duas caudas).
[0118] As Figuras 12A-12C ilustram o efeito da deficiência de TET2 na paisagem epigenética de células T CAR. A Figura 12A mostra um enriquecimento de motivos de ligação de fator de transcrição (TF) em regiões de cromatina ganhas ou perdidas em células T CAR+ em comparação com CAR- do Paciente 10. A Figura 12B mostra os fenótipos de diferenciação longitudinal de células T CD8+ CAR+ e CARdo Paciente 10 (painel da esquerda). O fenótipo de diferenciação no pico da atividade in vivo é mostrado em dois pacientes com CLL
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42/606 respondedores completos de longa duração (Pacientes 1 e 2) em comparação com o Paciente 10 (painel da direita). As fatias representam a frequência relativa de cada subconjunto de células T. O nível de células CTL019, conforme determinado por PCR quantitativa, e as frequências de células T CAR ativadas expressando HLA-DR (marcador de ativação da superfície celular) no pico da resposta de cada paciente estão listadas por baixo dos gráficos circulares. A Figura 12C mostra a proliferação de células CTL019 de longa duração em resposta à estimulação repetitiva com células K562 expressando CD19 ou mesotelina (controle negativo). Células T CAR foram transduzidas para expressarem um shRNA de controle embaralhado ou específico de TET2. Cada seta indica quando as células foram expostas ao antígeno. Os valores P foram determinados usando um teste t de Student emparelhado de duas caudas (*P < 0,05).
[0119] A Figura 13 ilustra o crescimento de células T CAR no Paciente 10 no compartimento de CD8. As cinéticas pré- e pós-infusão da expansão de células T CAR (CD3+, CD8+ e CD8-) são mostradas no Paciente 10 em comparação com outros respondedores. O número de células CTL019 em circulação foi calculado com base nas frequências de populações de células T CAR CD3+, CD8+ e CD8- e contagens absolutas de células. Todos os valores observados ficaram acima do limite de detecção por citometria de fluxo (0,1%).
[0120] As Figuras 14A-14D ilustram o estabelecimento do perfil de populações de células imunes e detecção de células T CAR no Paciente 10 em um instante pós-infusão de longa duração. A Figura 14A mostra a estratégia de agrupamento por citometria de fluxo para identificar células T CAR do sangue periférico no Paciente 10. A Figura 14B mostra percentagens relativas de células CTL019 nos compartimentos de CD4 e CD8 deste paciente. Células T de um sujeito saudável serviram de controle negativo. A Figura 14C mostra frequências de
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43/606 células B em circulação no Paciente 10 em comparação com um sujeito saudável. Foi efetuado pré-agrupamento para excluir células mortas bem como dupletos, e todos os limites do agrupamento foram baseados em controles de fluorescência menos um (FMO). A Figura 14D mostra a enumeração de várias populações de células imunes no sangue do Paciente 10. A frequência de cada população é listada em uma coluna separada que corresponde ao seu marcador fenotípico. A Figura 14E mostra a persistência de células T CAR no sangue periférico do Paciente 10 determinada por qPCR. É listado o valor do ciclo limite (Ct) médio obtido de três repetições e o desvio padrão (DP). Os cálculos da abundância de células T CAR são relatados como marca média por célula bem como cópias de transgene por micrograma de DNA genômico.
[0121] A Figura 15 ilustra o estabelecimento do perfil global de cromatina de células T CAR deficientes em TET2 do Paciente 10. São listados termos de ontologia genética (GO) associados a regiões de cromatina que estão significativamente mais abertas em células T CD8+ CAR+ com TET2 com disrupção do Paciente 10 em comparação com as suas contrapartidas de células T CD8+ CAR- correspondentes. [0122] A Figura 16 ilustra o estado de diferenciação de células T CAR no Paciente 10 em comparação com outros respondedores ao longo do tempo. Estratégia de agrupamento exemplificativa usada para determinar o fenótipo de diferenciação de células T CD8+ CAR+ e CARde um respondedor completo (painel de cima à esquerda). Gráficos de linhas ilustram o estado de diferenciação destas populações de células em outros pacientes respondedores ao longo do tempo e são representados graficamente com níveis de células T CAR correspondentes no sangue, determinado por qPCR.
[0123] A Figura 17 ilustra a viabilidade de células T CAR após silenciamento de TET2 e re-estimulação em série com alvos tumorais.
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Viabilidade de células T CAR+ transduzidas com um shRNA de TET2 ou controle embaralhado e re-estimuladas com células K562 expressando CD19 (η = 12). Cada seta indica o instante em que as células foram expostas ao antígeno.
[0124] As Figuras 18A-18B ilustram perfis de citocinas de células T CAR após inibição de TET2. A Figura 18A mostra citometria de fluxo representativa da produção aguda de citocinas intracelulares por células T CAR de doadores saudáveis transduzidas com um shRNA de TET2 ou controle embaralhado (painel da esquerda). É mostrada a produção de IFNy, TNFa e IL-2 por células T CAR CD3+, CD4+ e CD8+ totais. Estas células foram estimuladas com esférulas revestidas com CD3/CD28 (painel de topo da direita) ou anticorpo anti-idiotípico para CAR (painel de baixo da direita). A Figura 18B mostra a produção de IFNy (painel de cima), TNFa (painel do meio) e IL-2 (painel de baixo) por células T CAR deficientes em TET2 ou de controle após reestimulação com antígeno CD19. Cada seta indica quando células T CAR foram expostas a CD19.
[0125] As Figuras 19A-19C ilustram o efeito do silenciamento de TET2 na maquinaria citotóxica de células T CAR. A Figura 19A ilustra gráficos de citometria de fluxo mostrando a frequência de células T CAR com nocaute de TET2 ou de controle expressando CD107a (um marcador de citólise) após estimulação com CD3/CD28 e específica para CAR (painel da esquerda). São mostrados dados resumidos da análise de células T CAR preparadas a partir de n = 6 doadores saudáveis diferentes (painel da direita). A Figura 19B mostra histogramas representativos ilustrando níveis de expressão de granzima B e perforina em células T CAR no cenário de inibição de TET2 em comparação com o seu controle correspondente (painel da esquerda). Dados reunidos células T CAR de n = 5 doadores saudáveis estão resumidos nos painéis da direita. A Figura 19C mostra a
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45/606 capacidade citotóxica de células CTL019 (transduzidas com um shRNA de TET2 ou controle embaralhado) após cocultura durante a noite com células OSU-CLL (painel da esquerda) ou NALM-6 (painel da direita) expressando luciferase. Células T não transduzidas foram incluídas como um grupo adicional para controlar a lise inespecífica. Os valores P foram determinados usando um teste t de Student emparelhado de duas caudas (*P < 0,05; **P < 0,01).
[0126] As Figuras 20A-20B ilustram a expressão de moléculas efetoras e de memória por células T CAR do Paciente 10 em comparação com outros sujeitos respondedores. A Figura 20A mostra expressão de granzima B (painel da esquerda) e a frequência de células T CAR- e CAR+ coexpressando granzima B/Ki-67 (painel da direita) no pico da expansão de CTL019 in vivo no Paciente 10 em comparação com 3 outros respondedores completos. A Figura 20B mostra histogramas representativos da expressão de EOMES intracelular (painel da esquerda) e gráficos de contorno ilustrando frequências de linfócitos expressando CD27 (painéis do meio) e KLRG1 (painéis da direita) nas mesmas populações de células destes pacientes.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições
[0127] A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que é habitualmente entendido pelo perito na técnica à qual pertence a invenção.
[0128] O termo uma e um refere-se a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, um elemento significa um elemento ou mais de um elemento.
[0129] O termo cerca de, quando se refere a um valor mensurável, como uma quantidade, uma duração temporal, e semelhantes, pretende abranger variações de ±20% ou, em alguns casos, ±10%, ou em alguns
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46/606 casos ±5%, ou em alguns casos ±1%, ou em alguns casos ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são apropriadas para realizar os métodos revelados.
[0130] O termo Receptor de Antigenos Quimérico ou alternativamente um CAR se relaciona com um conjunto de polipeptideos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que, quando em uma célula efetora imune, dotam a célula de especificidade para uma célula-alvo, tipicamente uma célula cancerígena, e com geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos um domínio de ligação a antigenos extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático (também referido aqui como um domínio de sinalização intracelular) compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora e/ou molécula coestimuladora como definido abaixo. Em alguns aspectos, no conjunto de polipeptideos, estes são contíguos entre si. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptideos inclui um interruptor de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptideos entre si, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação a antigenos a um domínio de sinalização intracelular. Em um aspecto, a molécula estimuladora é a cadeia zeta associada ao complexo do receptor de células T. Em um aspecto, o domínio de sinalização citoplasmático compreende adicionalmente um ou mais domínios de sinalização funcional derivados de pelo menos uma molécula coestimuladora como definida abaixo. Em um aspecto, a molécula coestimuladora é escolhida das moléculas coestimuladoras descritas aqui, por exemplo, 4-1 BB (isto é, CD137), CD27 e/ou CD28. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação a antigenos extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização funcional
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47/606 derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação a antígenos extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula coestimuladora e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação a antígenos extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo dois domínios de sinalização funcional derivados de uma ou mais molécula(s) coestimuladora(s) e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação a antígenos extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo pelo menos dois domínios de sinalização funcional derivados de uma ou mais molécula(s) coestimuladora(s) e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimuladora. Em um aspecto, o CAR compreende uma sequência líder opcional no terminal amino (N-ter) da proteína de fusão com CAR. Em um aspecto, o CAR compreende adicionalmente uma sequência líder no terminal N do domínio de ligação a antígenos extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação a antígenos (por exemplo, um scFv) durante o processamento celular e localização do CAR na membrana celular. [0131] Um CAR que compreende um domínio de ligação a antígenos (por exemplo, um scFv ou TCR) que visa um marcador tumoral específico X, como os descritos aqui, também é referido como CAR X. Por exemplo, um CAR que compreende um domínio de ligação a antígenos que visa CD19 é referido como CAR CD19.
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[0132] O termo domínio de sinalização se relaciona com a porção funcional de uma proteína que atua por transmissão de informação dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas por geração de segundos mensageiros ou funcionamento como efetores por resposta a tais mensageiros.
[0133] O termo anticorpo, como usado aqui, se relaciona com uma proteína ou sequência polipeptídica derivada de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de cadeia múltipla ou simples, ou imunoglobulinas intatas, e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Os anticorpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulinas.
[0134] O termo fragmento de anticorpo se relaciona com pelo menos uma porção de um anticorpo, que retém a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição espacial) um epitopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab', F(abj2, Fv, fragmentos de anticorpos scFv, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único tais como sdAb (VL ou VH), domínios VHH de camelídeo, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos tais como um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça, e uma CDR isolada ou outros fragmentos de ligação a epítopos de um anticorpo. Um fragmento de ligação a antigenos também pode ser incorporado em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, nanocorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (ver, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Fragmentos de
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49/606 ligação a antigenos podem também ser enxertados em moldes baseados em polipeptídeos como uma fibronectina tipo III (Fn3) (ver Patente U.S. NQ: 6,703,199, que descreve minicorpos de polipeptídeo de fibronectina).
[0135] O termo scFv se relaciona com uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada estão ligadas de modo contíguo, por exemplo, via um ligante sintético, por exemplo, um ligante polipeptídico curto flexível, e podem ser expressas como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intato de onde é derivado. A menos que seja especificado, como usado aqui, um scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, relativamente às extremidades N-terminal e C-terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL-ligante-VH ou pode compreender VH-ligante-VL.
[0136] A porção do CAR da invenção compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo pode existir numa variedade de formas nas quais o domínio de ligação a antigenos é expresso como parte de uma cadeia polipeptídica contígua incluindo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de domínio único (sdAb), um anticorpo de cadeia simples (scFv), um anticorpo humanizado ou anticorpo biespecífico (Harlow et al., 1999, Em: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nl; Harlow et al., 1989, Em: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Em um aspecto, o domínio de ligação a antigenos de uma composição de CAR da invenção compreende um fragmento de anticorpo. Em um aspecto adicional, o
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CAR compreende um fragmento de anticorpo que compreende um scFv. As fronteiras precisas de sequências de aminoácidos de uma dada CDR podem ser determinadas usando qualquer um de alguns esquemas bem conhecidos, incluindo os descritos por Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração de Kabat), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeração de Chothia”) ou uma sua combinação.
[0137] Como usado aqui, o termo domínio de ligação ou molécula de anticorpo se relaciona com uma proteína, por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina ou seu fragmento, compreendendo pelo menos uma sequência de domínio variável de imunoglobulina. O termo domínio de ligação ou molécula de anticorpo abrange anticorpos e fragmentos de anticorpos. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo multiespecífica, por exemplo, compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífica é uma molécula de anticorpo biespecífica. Um anticorpo biespecífico tem especificidade para não mais do que dois antigenos. Uma molécula de anticorpo biespecífica é caracterizada por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo.
[0138] A porção do CAR da invenção compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo pode existir em uma variedade de formas
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51/606 nas quais o domínio de ligação a antígenos é expresso como parte de uma cadeia polipeptídica contígua incluindo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de domínio único (sdAb), um anticorpo de cadeia simples (scFv), um anticorpo humanizado ou anticorpo biespecífico (Harlow et al., 1999, Em: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nl; Harlow et al., 1989, Em: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Em um aspecto, o dominio de ligação a antígenos de uma composição de CAR da invenção compreende um fragmento de anticorpo. Em um aspecto adicional, o CAR compreende um fragmento de anticorpo que compreende um scFv.
[0139] O termo cadeia pesada de anticorpo se relaciona com o maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anticorpos em suas conformações de ocorrência natural, e que normalmente determina a classe à qual o anticorpo pertence.
[0140] O termo cadeia leve de anticorpo se relaciona com o menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes em moléculas de anticorpos em suas conformações de ocorrência natural. Cadeias leves capa (k) e lambda (λ) se relacionam com os dois principais isótipos de cadeias leves de anticorpos.
[0141] O termo anticorpo recombinante se relaciona com um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um anticorpo expresso por um sistema de expressão de bacteriófago ou levedura. Também deve ser considerado que o termo significa um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA codificando o anticorpo e cuja molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos especificando o anticorpo, em que o DNA ou sequência de aminoácidos
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52/606 foi obtido usando tecnologia de DNA recombinante ou sequência de aminoácidos que está disponível e é bem conhecida na técnica.
[0142] O termo antígeno ou Ag se relaciona com uma molécula que provoca uma resposta imune. Esta resposta imune pode envolver a produção de anticorpos ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas ou ambas. O perito na técnica compreenderá que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente todas as proteínas ou peptideos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antigenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. O perito na técnica compreenderá que qualquer DNA, que compreende sequências de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos parcial codificando uma proteína que desencadeia uma resposta imune codifica, por conseguinte, um antígeno tal como o termo é aqui usado. Além disso, o perito na técnica compreenderá que um antígeno não necessita de ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeos completa de um gene. É evidente que a presente invenção inclui, mas não está limitada à, utilização de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que estas sequências de nucleotídeos estão dispostas em várias combinações para codificar polipeptídeos que desencadeiam a resposta imune desejada. Além disso, um perito na técnica compreenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um gene” de modo algum. É prontamente aparente que um antígeno pode ser gerado, sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica, ou pode ser uma macromolécula diferente de um polipeptideo. Uma tal amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a, uma amostra de tecido, uma amostra tumoral, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.
[0143] O termo efeito anticancerígeno se relaciona com um efeito biológico que pode se manifestar por vários meios, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, um decréscimo do volume tumoral, um
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53/606 decréscimo do número de células cancerígenas, um decréscimo do número de metástases, um aumento da esperança de vida, decréscimo da proliferação de células cancerígenas, decréscimo da sobrevivência de células cancerígenas ou melhoria de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerosa. Um efeito anticancerígeno também pode se manifestar pela capacidade dos peptideos, polinucleotídeos, células e anticorpos para prevenir a ocorrência de câncer logo de início. O termo efeito antitumoral refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado de várias formas, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, uma redução no volume tumoral, uma redução do número de células tumorais, uma redução da proliferação de células tumorais ou uma redução da sobrevivência de células tumorais.
[0144] O termo autólogo refere-se a qualquer material derivado do mesmo sujeito no qual será posteriormente reintroduzido no sujeito.
[0145] O termo alogeneico refere-se a qualquer material derivado de um animal diferente da mesma espécie que o sujeito no qual o material é introduzido. Dois ou mais sujeitos são considerados alogeneicos um ao outro quando os genes em um ou mais locais não são idênticos. Em alguns aspectos, material alogeneico de sujeitos da mesma espécie pode ser geneticamente bastante diferente para interagir antigenicamente.
[0146] O termo xenogeneico refere-se a um enxerto derivado de um animal de uma espécie diferente.
[0147] O termo câncer se refere a uma doença caracterizada pelo crescimento descontrolado de células aberrantes. As células cancerígenas podem se disseminar localmente ou através da corrente sanguínea e sistema linfático para outras partes do corpo. Exemplos de vários cânceres são descritos aqui e incluem, mas não se limitam a, câncer da mama, câncer da próstata, câncer dos ovários, câncer do colo do útero, câncer da pele, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer
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54/606 renal, câncer do fígado, câncer do cérebro, linfoma, leucemia, câncer do pulmão e similares. Os termos tumor e câncer são usados indistintamente aqui, por exemplo, ambos os termos abrangem tumores sólidos e líquidos, por exemplo, difusos ou circulantes. Como usado aqui, o termo câncer ou tumor inclui cânceres e tumores prémalignos, bem como malignos.
[0148] Derivado de como o termo é usado aqui, indica uma relação entre uma primeira e uma segunda molécula. Geralmente refere-se à semelhança estrutural entre a primeira molécula e uma segunda molécula e não é conotado nem inclui uma limitação de processo ou fonte numa primeira molécula que é derivada de uma segunda molécula. Por exemplo, no caso de um domínio de sinalização intracelular que é derivado de uma molécula CD3zeta, o domínio de sinalização intracelular retém estrutura suficiente de CD3zeta de modo que tem a função requerida, nomeadamente a capacidade para gerar um sinal nas condições apropriadas. Não é conotado nem inclui uma limitação a um processo particular de produção do domínio de sinalização intracelular, por exemplo, não significa que, para proporcionar o domínio de sinalização intracelular, se deva começar com uma sequência CD3zeta e deletar sequência indesejada, ou impor mutações, para chegar ao domínio de sinalização intracelular.
[0149] A frase doença associada a expressão de um antígeno tumoral como descrito aqui inclui mas não se limita a uma doença associada a expressão de um antígeno tumoral como descrito aqui ou condição associada a células que expressam um antígeno tumoral como descrito aqui, incluindo, por exemplo, doenças proliferativas como um câncer ou malignidade ou uma condição pré-cancerosa tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma préleucemia; ou uma indicação não relacionada com câncer associada a células que expressam um antígeno tumoral como descrito aqui. Em um
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55/606 aspecto, um câncer associado a expressão de um antígeno tumoral como descrito aqui é um câncer hematológico. Em um aspecto, um câncer associado a expressão de um antígeno tumoral como descrito aqui é um câncer sólido. Outras doenças associadas a expressão de um antígeno tumoral descrito aqui incluem, mas não se limitam a, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas associadas a expressão de um antígeno tumoral como descrito aqui. Indicações não relacionadas com câncer associadas à expressão de um antígeno tumoral como descrito aqui incluem, mas não se limitam a, por exemplo, doença autoimune (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma) e transplantação. Em algumas modalidades, as células expressando um antígeno tumoral expressam, ou em qualquer momento expressaram, mRNA codificando o antígeno tumoral. Em uma modalidade, as células expressando um antígeno tumoral produzem a proteína do antígeno tumoral (por exemplo, de tipo selvagem ou mutante), e a proteína do antígeno tumoral pode estar presente em níveis normais ou níveis reduzidos. Em uma modalidade, as células expressando um antígeno tumoral produziram níveis detectáveis de uma proteína do antígeno tumoral em um momento, e subsequentemente produziram substancialmente nenhuma proteína do antígeno tumoral detectável.
[0150] O termo modificações conservatives de sequências se relaciona com modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservatives incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção por técnicas comuns conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese
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56/606 mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos são tais que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos em um CAR da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o CAR alterado pode ser testado usando os ensaios funcionais descritos aqui.
[0151] O termo estimulação se refere a uma resposta primária induzida por ligação de uma molécula estimuladora (por exemplo, um complexo TCR/CD3 ou CAR) ao seu ligante cognato (ou antígeno tumoral no caso de um CAR), mediando desse modo um evento de transdução do sinal, tal como, mas não se limitando a, transdução do sinal via o complexo TCR/CD3 ou transdução do sinal via o receptor de NK apropriado ou domínios de sinalização do CAR. A estimulação pode mediar expressão alterada de certas moléculas.
[0152] O termo molécula estimuladora se relaciona com uma molécula expressa por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK ou célula B) que proporciona a(s) sequência(s) de sinalização citoplasmática(s) que regula(m) a ativação da célula imune em uma via estimuladora para pelo menos algum aspecto da via de sinalização de
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57/606 células imunes. Em um aspecto, o sinal é um sinal primário que é iniciado, por exemplo, por ligação de um complexo TCR/CD3 a uma molécula MHC carregada com peptideo, e que conduz a mediação de uma resposta de células T, incluindo, mas não se limitando a, proliferação, ativação, diferenciação e similares. Uma sequência de sinalização citoplasmática primária (também referida como domínio de sinalização primário) que atua de um modo estimulador pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor ou ITAM. Exemplos de uma sequência de sinalização citoplasmática contendo ITAM que tem uso particular na invenção incluem, mas não se limitam a, os derivados de CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama Rlla, FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 e DAP12. Em um CAR específico da invenção, o domínio de sinalização intracelular em qualquer um ou mais CARS da invenção compreende uma sequência de sinalização intracelular, por exemplo, uma sequência de sinalização primária de CD3-zeta. Em um CAR específico da invenção, a sequência de sinalização primária de CD3zeta é a sequência proporcionada como SEQ ID NQ:18 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares. Em um CAR específico da invenção, a sequência de sinalização primária de CD3-zeta é a sequência proporcionada na SEQ ID NQ: 20, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares.
[0153] O termo célula apresentadora de antígenos ou APC se refere a uma célula do sistema imune tal como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica e similares) que exibe um antígeno estranho complexado com complexos de histocompatibilidade principal (MHCs) na sua superfície. Células T
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58/606 podem reconhecer estes complexos usando seus receptores de células T (TCRs). APCs processam antigenos e apresentam estes a células T. [0154] Um domínio de sinalização intracelular, tal como o termo é usado aqui, se refere a uma porção intracelular de uma molécula. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imune da célula contendo o CAR, por exemplo, uma célula CART. Exemplos da função efetora imune, por exemplo, em uma célula CART, incluem atividade citolítica e atividade auxiliadora, incluindo a secreção de citocinas.
[0155] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização intracelular primário. Domínios de sinalização intracelulares primários exemplificativos incluem os derivados das moléculas responsáveis pela estimulação primária ou estimulação dependente de antigenos. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio intracelular coestimulador. Domínios de sinalização intracelulares coestimuladores exemplificativos incluem os derivados de moléculas responsáveis por sinais coestimuladores ou estimulação independente de antigenos. Por exemplo, no caso de um CART, um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender uma sequência citoplasmática de um receptor de células T, e um domínio de sinalização intracelular coestimulador pode compreender sequência citoplasmática de molécula correceptora ou coestimuladora.
[0156] Um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor ou ITAM. Exemplos de sequências de sinalização citoplasmáticas primárias contendo ITAMs incluem, mas não se limitam às, derivadas de CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama Rlla, FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 e DAP12.
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[0157] O termo zeta ou alternativamente cadeia zeta, CD3-zeta ou TCR-zeta é definido como a proteína proporcionada como GenBan Acesso NQ BAG36664.1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares, e um domínio estimulador de zeta ou alternativamente um domínio estimulador de CD3-zeta ou um domínio estimulador de TCR-zeta é definido como os resíduos de aminoácidos do domínio citoplasmático da cadeia zeta, ou seus derivados funcionais, que são suficientes para transmitir funcionalmente um sinal inicial necessário para a ativação de células T. Em um aspecto, o domínio citoplasmático de zeta compreende os resíduos 52 até 164 de GenBank Acesso NQ BAG36664.1 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares, que são seus ortólogos funcionais. Em um aspecto, o domínio estimulador de zeta ou um domínio estimulador de CD3-zeta é a sequência proporcionada como SEQ ID NQ: 18. Em um aspecto, o domínio estimulador de zeta ou um domínio estimulador de CD3-zeta é a sequência proporcionada como SEQ ID NQ: 20.
[0158] O termo molécula coestimuladora se relaciona com um parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente a um ligante coestimulador, desse modo mediando uma resposta coestimuladora pela célula T, tal como, mas não se limitando a, proliferação. Moléculas coestimuladoras são moléculas da superfície celular diferentes de receptores de antígenos ou seus ligantes que contribuem para uma resposta imune eficiente. Moléculas coestimuladoras incluem, mas não se limitam a, uma molécula MHC de classe I, BTLA e um receptor de ligante Toll, bem como 0X40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) e 4-1 BB (CD137). Outros exemplos de tais moléculas coestimuladoras incluem CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80
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60/606 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD111, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a e um ligante que se liga especificamente a CD83.
[0159] Um domínio de sinalização intracelular coestimulador pode ser a porção intracelular de uma molécula coestimuladora. Uma molécula coestimuladora pode ser representada nas seguintes famílias de proteínas: proteínas receptoras do TNF, proteínas do tipo Imunoglobulina, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de sinalização da ativação linfocítica (proteínas SLAM) e receptores ativadores de células NK. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1 BB (CD137), 0X40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno associado à função de linfócitos-1 (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, e um ligante que se liga especificamente a CD83 e similares.
[0160] O domínio de sinalização intracelular pode compreender a totalidade da porção intracelular, ou a totalidade do domínio de sinalização intracelular nativo, da molécula de onde é derivado, ou um seu fragmento ou derivado funcional.
[0161] O termo 4-1 BB se refere a um membro da superfamília TNFR com uma sequência de aminoácidos proporcionada como GenBank NQ de Acesso AAA62478.2, ou os resíduos equivalentes de
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61/606 uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares; e um domínio coestimulador de 4-1 BB é definido como os resíduos de aminoácidos 214-255 de GenBank NQ de acesso AAA62478.2, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares. Em um aspecto, o domínio coestimulador 4-1 BB é a sequência fornecida como SEQ ID NQ: 14, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares. [0162] Célula efetora imune, tal como o termo é usado aqui, se relaciona com uma célula que está envolvida em uma resposta imune, por exemplo, na promoção de uma resposta imune efetora. Exemplos de células efetoras imunes incluem células T, por exemplo, células T alfa/beta e células T gama/delta, células B, células matadoras naturais (NK), células T matadoras naturais (NKT), mastócitos e fagócitos derivados da linhagem mieloide.
[0163] Função imune efetora ou resposta imune efetora, tal como o termo é usado aqui, se relaciona com função ou resposta, por exemplo, de uma célula efetora imune, que intensifica ou promove um ataque imune de uma célula-alvo. Por exemplo, uma função ou resposta efetora imune se refere a uma propriedade de uma célula T ou NK que promove a morte ou a inibição do crescimento ou proliferação de uma célula-alvo. No caso de uma célula T, estimulação e coestimulação primárias são exemplos de função ou resposta efetora imune.
[0164] O termo codificando se relaciona com a propriedade inerente de sequências específicas de nucleotideos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como moldes para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotideos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas daí resultantes. Assim, um
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62/606 gene, cDNA ou RNA, codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produzirem a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a fita codificadora, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é habitualmente fornecida em listagens de sequências, como a fita não codificadora, utilizada como modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser referidas como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.
[0165] A menos que especificado de outro modo, uma sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácidos inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. A frase sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA também pode incluir introns À medida quea sequência de nucleotídeos codificando a proteína pode, em algumas versões, conter íntron(s).
[0166] Os termos quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz são aqui usados indistintamente, e se relacionam com uma quantidade de um composto, formulação, material ou composição, como aqui descrito, eficaz para alcançar um resultado biológico particular.
[0167] O termo endógeno refere-se a qualquer material de ou produzido dentro de um organismo, célula, tecido ou sistema.
[0168] O termo exógeno refere-se a qualquer material introduzido de ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.
[0169] O termo expressão se relaciona com a transcrição e/ou tradução de uma sequência particular de nucleotídeos dirigida por um promotor.
[0170] O termo vetor de transferência se relaciona com uma composição de matéria que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser utilizada para distribuir o ácido nucleico isolado no interior
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63/606 de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo vetor de transferência inclui um plasmídeo ou um vírus de replicação autônoma. O termo também deve ser entendido como incluindo adicionalmente compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para células, tal como, por exemplo, um composto de polilisina, lipossomo e semelhantes. Exemplos de vetores de transferência virais incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores retrovirais, vetores lentivirais e semelhantes.
[0171] O termo vetor de expressão se relaciona com um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle da expressão operativamente ligadas a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de atuação cis suficientes para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Vetores de expressão incluem todos os conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomos) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovirus, adenovirus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante. [0172] O termo lentivírus se relaciona com um gênero da família Retroviridae. Lentivírus são únicos entre os retrovirus por serem capazes de infectar células não se dividindo; podem fornecer uma quantidade significativa de informação genética ao DNA da célula hospedeira, de modo que são um dos métodos mais eficientes de um vetor de transferência genética. HIV, SIV e FIV são todos exemplos de lentivírus.
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[0173] O termo vetor lentiviral se relaciona com um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de um lentivírus, incluindo especialmente um vetor lentiviral autoinativador como proporcionado em Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus que podem ser usados na clínica, incluem, mas não se limitam a, por exemplo, a tecnologia de transferência genética LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica, o sistema de vetores LENTIMAX™ da Lentigen e similares. Tipos não clínicos de vetores lentivirais também estão disponíveis e serão conhecidos do perito na técnica.
[0174] O termo homólogo ou identidade se relaciona com a identidade da sequência de subunidades entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como, duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas polipeptídicas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dez subunidades de comprimento) das posições em duas sequências forem homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10) forem correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas.
[0175] Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antigenos de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não
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65/606 humana. Na sua maior parte, anticorpos humanizados e seus fragmentos de anticorpos são imunoglobulinas humanas (anticorpo ou fragmento de anticorpo recebedor) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recebedor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de arcabouço (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, um anticorpo/fragmento de anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor nem nas sequências CDR ou de arcabouço importadas. Estas modificações podem adicionalmente refinar e otimizar o desempenho de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado ou seu fragmento de anticorpo compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que a totalidade ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e a totalidade ou uma porção significativa das regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Quanto a mais detalhes ver Jones et al., Nature, 321:522-525,1986; Reichmann etal., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.
[0176] Totalmente humana se relaciona com uma imunoglobulina, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, na qual toda a molécula é de origem humana ou consiste em uma sequência de aminoácidos idêntica a uma forma humana do anticorpo ou imunoglobulina.
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[0177] O termo isolado significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptideo naturalmente presente em um animal vivo não está isolado , mas o mesmo ácido nucleico ou peptideo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural está isolado . Um ácido nucleico ou proteína isolado pode existir em forma substancialmente purificada, ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira.
[0178] No contexto da presente invenção, as seguintes abreviaturas para as bases de ácidos nucleicos de ocorrência comum são usadas. A se refere à adenosina, C se refere à citosina, G se refere à guanosina, T se refere à timidina, e U se refere à uridina.
[0179] O termo operacionalmente ligado ou controle de transcrição refere-se à ligação funcional entre uma sequência reguladora e uma sequência de ácido nucleico heteróloga resultando na expressão da última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Sequências de DNA ligadas operativamente podem ser contíguas entre si e, por exemplo, quando for necessário unir duas regiões codificadoras de proteínas, estão no mesmo quadro de leitura.
[0180] O termo administração parentérica de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, técnicas de injeção subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) ou intraesterno, intratumoral ou de infusão.
[0181] O termo ácido nucleico ou polinucleotídeo se relaciona
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67/606 com ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e seus polímeros na forma de fita simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotideos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotideos de ocorrência natural. A menos que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente variantes conservativamente modificadas destes (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, podem ser obtidas substituições de códons degenerados gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desóxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Bid. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini etal., Md. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0182] Os termos peptídeo, polipeptídeo e proteína são utilizados alternadamente e se relacionam com um composto constituído por resíduos de aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter, pelo menos, dois aminoácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que uma sequência de proteína ou peptídeo pode compreender. Polipeptideos incluem qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Como aqui usado, o termo se relaciona com cadeias curtas, que também são vulgarmente referidas na técnica como peptideos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e com cadeias mais longas, que geralmente são referidas na técnica como proteínas, das quais há muitos tipos. Polipeptideos incluem, por exemplo,
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68/606 fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação destes.
[0183] O termo promotor se relaciona com uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula ou maquinaria sintética introduzida, requerida para iniciar a transcrição específica de uma sequência polinucleotídica.
[0184] O termo sequência promotora/reguladora se relaciona com uma sequência de ácido nucleico que é necessária para expressão de um produto genético operativamente ligado à sequência promotora/reguladora. Em alguns casos, esta sequência pode ser a sequência principal do promotor e, em outros casos, esta sequência pode também incluir uma sequência intensificadora e outros elementos reguladores que são necessários para a expressão do produto genético. A sequência promotora/reguladora pode, por exemplo, ser uma que expresse o produto do gene de um modo específico para o tecido.
[0185] O termo promotor constitutivo se relaciona com uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula na maioria ou em todas as condições fisiológicas da célula.
[0186] O termo promotor induzível” se relaciona com uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.
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[0187] O termo promotor específico para tecidos se relaciona com uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especificado por um gene, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula substancialmente apenas se a célula for uma célula do tipo de tecido correspondente ao promotor.
[0188] Os termos antígeno associado a câncer ou antígeno tumoral se relacionam indistintamente com uma molécula (tipicamente uma proteína, carbo-hidrato ou lipideo) que é expressa na superfície de uma célula cancerígena, quer inteiramente quer como um fragmento (por exemplo, MHC/peptídeo), e que é útil para o direcionamento preferencial de um agente farmacológico para a célula cancerígena. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é um marcador expresso tanto por células normais como por células cancerígenas, por exemplo, um marcador de linhagem, por exemplo, CD19 em células B. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é uma molécula de superfície celular que está sobre-expressa em uma célula cancerígena em comparação com uma célula normal, por exemplo, sobre-expressão de uma vez, sobre-expressão de duas vezes, sobre-expressão de 3 vezes ou mais em comparação com uma célula normal. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral é uma molécula da superfície celular que é sintetizada de forma inapropriada na célula cancerígena, por exemplo, uma molécula que contém deleções, adições ou mutações em comparação com a molécula expressa em uma célula normal. Em algumas modalidades, um antígeno tumoral será expresso exclusivamente na superfície celular de uma célula cancerígena, inteiramente ou como um fragmento (por exemplo, MHC/peptídeo), e não sintetizado ou expresso na superfície de uma célula normal. Em algumas modalidades, os CARs da presente invenção incluem CARs compreendendo um domínio de ligação a antigenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga
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70/606 a um peptídeo apresentado em MHC. Normalmente, peptideos derivados de proteínas endógenas enchem as bolsas de moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I e são reconhecidos por receptores de células T (TCRs) em linfócitos T CD8+. Os complexos de MHC de classe I são constitutivamente expressos por todas as células nucleadas. No câncer, complexos peptídeo/MHC específicos para vírus e/ou específicos para tumor representam uma classe única de alvos de superfície celular para imunoterapia. Foram descritos anticorpos tipo TCR visando peptideos derivados de antigenos virais ou tumorais no contexto de antígeno de leucócitos humanos (HLA)-A1 ou HLA-A2 (ver, por exemplo, Sastry et a!., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):42624272; Verma et a!., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21 ):1601-1608; Dao et al., Sci Trans! Med 2013 5(176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene T/ier 2012 19(2):84-100). Por exemplo, anticorpo tipo TCR pode ser identificado a partir do rastreio de uma biblioteca, tal como uma biblioteca de exibição de fagos de scFv humano.
[0189] O termo antígeno suportando um tumor ou antígeno suportando um câncer se relaciona indistintamente com uma molécula (tipicamente uma proteína, carbo-hidrato ou lipideo) que é expressa na superfície de uma célula que é, ela própria, não cancerígena mas que suporta as células cancerígenas, por exemplo, por promoção do seu crescimento ou sobrevivência, por exemplo, resistência a células imunes. Células exemplificativas deste tipo incluem células estromais e células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs). O próprio antígeno suportando um tumor não necessita de desempenhar um papel no suporte das células tumorais desde que o antígeno esteja presente em uma célula que suporta células cancerígenas.
[0190] O termo ligante polipeptídico flexível ou ligante, como
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71/606 usado no contexto de um scFv, se relaciona com um ligante peptídico que consiste em aminoácidos tais como resíduos glicina e/ou serina usados isoladamente ou em combinação, para ligar em conjunto regiões de cadeia pesada variável e leve variável. Em uma modalidade, o ligante polipeptídico flexível é um ligante Gly/Ser e compreende a sequência de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, em que n é um número inteiro positivo igual a ou maior do que 1. Por exemplo, n = 1,n = 2, n = 3, n = 4, n = 5 e n = 6, n = 7, n = 8, n = 9en = 10 (SEQ ID NQ:28). Em uma modalidade, os ligantes polipeptídicos flexíveis incluem, mas não se limitam a, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NQ:29) ou (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NQ:30). Em outra modalidade, os ligantes incluem múltiplas repetições de (Gly2Ser), (GlySer) ou (Gly3Ser) (SEQ ID NQ:31). Também estão incluídos no escopo da invenção ligantes descritos em WQ2012/138475 (incorporado aqui por referência).
[0191] Como usado aqui, um cap 5' (também denominado cap de RNA, cap 7-metilguanosina de RNA ou um cap m7G de RNA) é um nucleotídeo de guanina modificado que foi adicionado à frente” ou na extremidade 5' de um RNA mensageiro eucariótico logo após o início da transcrição. O cap 5' consiste em um grupo terminal que está ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito. Sua presença é crucial para o reconhecimento pelo ribossomo e proteção de RNases. A adição de cap está acoplada à transcrição e ocorre de modo cotranscrição, de tal forma que cada um influencia o outro. Logo após o início da transcrição, a extremidade 5' do mRNA sendo sintetizado é ligada por um complexo sintetizador de cap associado a RNA polimerase. Este complexo enzimático catalisa as reações químicas que são necessárias para o capping de mRNA. A síntese prossegue como uma reação bioquímica de múltiplos passos. A fração de capping pode ser modificada para modular a funcionalidade de mRNA, tal como a sua estabilidade ou a eficiência da tradução.
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[0192] Como usado aqui, RNA transcrito in vitro se relaciona com RNA, preferencialmente mRNA, que foi sintetizado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitro é gerado a partir de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro compreende um molde que é utilizado para gerar o RNA transcrito in vitro.
[0193] Como usado aqui, uma poli(A)” é uma série de adenosinas ligadas por poliadenilação ao mRNA. Na modalidade preferencial de um construto para expressão transiente, a poli A tem entre 50 e 5000 (SEQ ID NQ: 34), de preferência superior a 64, mais preferencialmente superior a 100, muito preferencialmente superior a 300 ou 400. As sequências poli(A) podem ser modificadas química ou enzimaticamente para modular a funcionalidade do mRNA, tal como localização, estabilidade ou eficiência da tradução.
[0194] Como usado aqui, poliadenilação se relaciona com a ligação covalente de uma fração poliadenilila, ou sua variante modificada, a uma molécula de RNA mensageiro. Em organismos eucarióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) são poliadeniladas na extremidade 3'. A cauda 3’ poli(A) é uma longa sequência de nucleotideos adenina (muitas vezes várias centenas) adicionada ao pré-mRNA através da ação de uma enzima, poliadenilato polimerase. Em eucariotas superiores, a cauda poli(A) é adicionada a transcritos que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadenilação. A cauda poli(A) e a proteína ligada a ela ajudam a proteger o mRNA da degradação por exonucleases. A poliadenilação também é importante para a terminação da transcrição, exportação do mRNA do núcleo e tradução. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição do DNA em RNA, mas adicionalmente também pode ocorrer mais tarde no citoplasma. Após a terminação da transcrição, a cadeia de mRNA é clivada pela ação de um complexo de endonuclease associado a RNA polimerase. O sítio de
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73/606 divagem é geralmente caracterizado pela presença da sequência de bases AAUAAA perto do sítio de divagem. Após a divagem do mRNA, os resíduos de adenosina são adicionados à extremidade 3’ livre no sítio de divagem.
[0195] Como usado aqui, transiente se relaciona com expressão de um transgene não integrado durante um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo da expressão é menor do que o período de tempo para a expressão do gene se integrado no genoma ou contido dentro de um réplicon de plasmídeo estável na célula hospedeira.
[0196] Como usado aqui, os termos tratar”, tratamento” e tratando” referem-se à redução ou melhoria da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença proliferativa, ou a melhoria de um ou mais sintomas (preferencialmente, um ou mais sintomas discerníveis) de uma doença proliferativa resultante da administração de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos, tal como um CAR da invenção). Em modalidades específicas, os termos tratar”, tratamento” e tratando” se referem à melhoria de pelo menos um parâmetro físico mensurável de uma disfunção proliferativa, tal como crescimento de um tumor, não necessariamente discernível pelo paciente. Em outras modalidades, os termos tratar”, tratamento” e tratando” se referem à inibição da progressão de uma disfunção proliferativa, seja fisicamente por, por exemplo, estabilização de um sintoma discernível, fisiologicamente por, por exemplo, estabilização de um parâmetro físico ou ambos. Em outras modalidades, os termos tratar”, tratamento” e tratando” se referem à redução ou estabilização do tamanho tumoral ou contagem de células cancerosas.
[0197] O termo via de transdução de sinal” se relaciona com a relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma
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74/606 porção de uma célula para outra porção de uma célula. A frase receptor da superfície celular” inclui moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e transmitir o sinal através da membrana de uma célula.
[0198] O termo sujeito pretende incluir organismos vivos nos quais uma resposta imune pode ser desencadeada (por exemplo, mamíferos, humano).
[0199] O termo uma célula substancialmente purificada” se relaciona com uma célula que está essencialmente desprovida de outros tipos de células. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos de células com os quais está normalmente associada no seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas refere-se a uma população homogênea de células. Em outros casos, este termo refere-se simplesmente a células que foram separadas das células com as quais estão naturalmente associadas em seu estado natural. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em outros aspectos, as células não são cultivadas in vitro.
[0200] O termo terapêutico como usado aqui significa um tratamento. Um efeito terapêutico é obtido pela redução, supressão, remissão ou erradicação de um estado de doença.
[0201 ] O termo profilaxia” como aqui utilizado significa a prevenção ou tratamento protetor para uma doença ou estado de doença.
[0202] No contexto da presente invenção, antígeno tumoral ou antígeno de distúrbio hiperproliferativo ou antígeno associado a um distúrbio hiperproliferativo se relaciona com antígenos que são comuns a distúrbios hiperproliferativos específicos. Em certos aspectos, os antígenos de distúrbios hiperproliferativos da presente invenção são derivados de cânceres incluindo, mas não se limitando a, melanoma primário ou metastático, timoma, linfoma, sarcoma, câncer do pulmão,
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75/606 câncer do fígado, linfoma de não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, câncer uterino, câncer cervical, câncer da bexiga, câncer do rim e adenocarcinomas tais como câncer da mama, câncer da próstata, câncer do ovário, câncer pancreático e similares.
[0203] O termo transfectado ou transformado ou transduzido se relaciona com um processo pelo qual ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula transfectada” ou transformada” ou transduzida” é tal que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula principal em questão e sua descendência.
[0204] O termo se liga especificamente a se relaciona com um anticorpo, ou um ligante, que reconhece e se liga a uma proteína parceira de ligação (por exemplo, um antígeno tumoral) presente em uma amostra, mas cujo anticorpo ou ligante não reconhece nem se liga substancialmente a outras moléculas da amostra.
[0205] Receptor de antígeno quimérico (RCAR) regulável, tal como o termo é usado aqui, se relaciona com um conjunto de polipeptideos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando em uma célula RCARX, dota a célula RCARX de especificidade para uma célula-alvo, tipicamente uma célula cancerígena, e com geração ou proliferação do sinal intracelular regulável, que pode otimizar uma propriedade efetora imune da célula RCARX. Uma célula RCARX se baseia, pelo menos em parte, em um domínio de ligação a antigenos para proporcionar especificidade para uma célula-alvo que compreende o antígeno ligado pelo domínio de ligação a antigenos. Em uma modalidade, um RCAR inclui um interruptor de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar um domínio de sinalização intracelular ao domínio de ligação a antigenos.
[0206] Âncora de membrana ou domínio de fixação de membrana, tal como o termo é usado aqui, se refere a um polipeptideo
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76/606 ou fração, por exemplo, um grupo miristoíla, suficiente para ancorar um domínio extracelular ou intracelular à membrana plasmática.
[0207] Domínio de interruptor, tal como o termo é usado aqui, por exemplo, quando se refere a um RCAR, se refere a uma entidade, tipicamente uma entidade à base de um polipeptideo, que, na presença de uma molécula de dimerização, se associa a outro domínio de interruptor. A associação resulta em um acoplamento funcional de uma primeira entidade ligada, por exemplo, fundida, a um primeiro domínio de interruptor, e uma segunda entidade ligada, por exemplo, fundida, a um segundo domínio de interruptor. Um primeiro e segundo domínios de interruptor são coletivamente referidos como interruptor de dimerização. Em modalidades, o primeiro e segundo domínios de interruptor são iguais entre si, por exemplo, são polipeptídeos tendo a mesma sequência primária de aminoácidos, e são referidos coletivamente como interruptor de homodimerização. Em modalidades, o primeiro e segundo domínios de interruptor são diferentes entre si, por exemplo, são polipeptídeos tendo diferentes sequências primárias de aminoácidos, e são referidos coletivamente como interruptor de heterodimerização. Em modalidades, o interruptor é intracelular. Em modalidades, o interruptor é extracelular. Em modalidades, o domínio de interruptor é uma entidade baseada em um polipeptideo, por exemplo, baseada em FKBP ou FRB, e a molécula de dimerização é uma molécula pequena, por exemplo, um rapálogo. Em modalidades, o domínio de interruptor é uma entidade baseada em um polipeptideo, por exemplo, um scFv que se liga a um peptídeo myc, e a molécula de dimerização é um polipeptideo, um seu fragmento, ou um multímero de um polipeptideo, por exemplo, um ligante de myc ou multímeros de um ligante de myc que se ligam a um ou mais scFvs de myc. Em modalidades, o domínio de interruptor é uma entidade baseada em um polipeptideo, por exemplo, receptor de myc, e a molécula de
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77/606 dimerização é um anticorpo ou seus fragmentos, por exemplo, anticorpo para myc.
[0208] Molécula de dimerização, tal como o termo é usado aqui, por exemplo, quando se referindo a um RCAR, se refere a uma molécula que promove a associação de um primeiro domínio de interruptor a um segundo domínio de interruptor. Em modalidades, a molécula de dimerização não ocorre naturalmente no sujeito, ou não ocorre em concentrações que irão originar dimerização significativa. Em modalidades, a molécula de dimerização é uma molécula pequena, por exemplo, rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, RAD001.
[0209] O termo bioequivalente refere-se a uma quantidade de um agente diferente do composto de referência (por exemplo, RAD001), necessária para produzir um efeito equivalente ao efeito produzido pela dose de referência ou quantidade de referência do composto de referência (por exemplo, RAD001). Em uma modalidade, o efeito é o nível de inibição de mTOR, por exemplo, como medido por inibição de quinase P70 S6, por exemplo, como avaliado em um ensaio in vivo ou in vitro, por exemplo, como medido por um ensaio aqui descrito, por exemplo, o ensaio de Boulay. Em uma modalidade, o efeito é alteração da proporção de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas, como medido por separação celular. Em uma modalidade, uma quantidade ou dose bioequivalente de um inibidor de mTOR é a quantidade ou dose que alcança o mesmo nível de inibição de quinase P70 S6 da dose de referência ou quantidade de referência de um composto de referência. Em uma modalidade, uma quantidade ou dose bioequivalente de um inibidor de mTOR é a quantidade ou dose que alcança o mesmo nível de alteração da proporção de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas da dose de referência ou quantidade de referência de um composto de referência.
[0210] O termo dose baixa intensificadora de imunidade quando
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78/606 usado em conjunto com um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, RAD001 ou rapamicina, ou um inibidor de mTOR catalítico, refere-se a uma dose de inibidor de mTOR que inibe parcial, mas não totalmente, a atividade de mTOR, por exemplo, como medida pela inibição de atividade de quinase P70 S6. São aqui discutidos métodos para avaliar a atividade de mTOR, por exemplo, por inibição de quinase P70 S6. A dose é insuficiente para resultar em supressão imunológica completa, mas é suficiente para intensificar a resposta imunológica. Em uma modalidade, a dose baixa intensificadora de imunidade de inibidor de mTOR resulta em uma redução do número de células T PD-1 positivas e/ou um aumento do número de células T PD-1 negativas, ou um aumento da proporção de células T PD-1 negativas/células T PD-1 positivas. Em uma modalidade, a dose baixa intensificadora de imunidade de inibidor de mTOR resulta em um aumento do número de células T sem tratamento prévio. Em uma modalidade, a dose baixa intensificadora de imunidade de inibidor de mTOR resulta em um ou mais dos seguintes:
um aumento da expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: CD62Lelevad0, CD127elevad0, CD27+ e BCL2, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de células T de memória;
uma redução na expressão de KLRG1, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de células T de memória; e um aumento no número de precursores de células T de memória, por exemplo, células com qualquer uma ou uma combinação das seguintes características: CD62Lelevad0 aumentado, CD127elevad0 aumentado, CD27+ aumentado, KLRG1 reduzido e BCL2 aumentado;
em que qualquer uma das alterações descritas acima ocorre, por exemplo, pelo menos transitoriamente, por exemplo, em comparação com um sujeito não tratado.
[0211] Refratário, como aqui usado, se relaciona com uma
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79/606 doença, por exemplo, câncer, que não responde a um tratamento. Em modalidades, um câncer refratário pode ser resistente a um tratamento antes ou no início do tratamento. Em outras modalidades, o câncer refratário pode se tornar resistente durante um tratamento. Um câncer refratário também é designado de câncer resistente.
[0212] Recidiva como aqui utilizado refere-se ao retorno de uma doença (por exemplo, câncer) ou aos sinais e sintomas de uma doença, tal como um câncer após um período de melhoria, por exemplo, após tratamento prévio de uma terapia, por exemplo, terapia de câncer.
[0213] Intervalos: ao longo desta revelação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo revelado especificamente todos os possíveis subintervalos, bem como valores numéricos individuais dentro desse intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo tal como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo subintervalos especificamente revelados, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro desse intervalo, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Como outro exemplo, um intervalo tal como 95-99% de identidade, inclui algo com 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade e inclui subintervalos como 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% e 98-99% de identidade. Isso se aplica independentemente da amplitude do intervalo. [0214] Como usado aqui, o termo IFNG, interferon gama ou IFN-γ se relaciona com o gene IFNG e a proteína codificada pelo gene. No genoma humano, o IFNG está localizado no cromossomo 12q15. Uma sequência de IFNG exemplificativa é proporcionada no número da Genebank: NM_000619.2.
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[0215] Como usado aqui, o termo NOTCH2, proteína homóloga de notch de lócus neurogênico 2 ou hN2 se relaciona com o gene NOTCH2 e a proteína codificada pelo gene. No genoma humano, o NOTCH2 está localizado no cromossomo 1p12. Duas isoformas de Notch2 exemplificativas são proporcionadas nos números da Genebank: NM_001200001.1 e NM_024408.3.
[0216] Como usado aqui, o termo IL2RA, receptor de interleucina2 subunidade alfa, IL-2-RA ou IL2-RA se relaciona com o gene IL2RA e a proteína codificada pelo gene. Também é conhecido como CD25, antígeno TAG ou p55. No genoma humano, o IL2RA está localizado no cromossomo 10p15.1. Três isoformas de IL2RA exemplificativas são proporcionadas nos números da Genebank: NM_000417.2, NM_001308242.1 e NM_001308243.1.
[0217] Como usado aqui, o termo PRDM1 ou proteína dedo de zinco do domínio PR 1 se relaciona com o gene PRDM1 e a proteína codificada pelo gene. Também é conhecido como BLIMP-1, Fator de ligação ao domínio regulador positivo I do gene beta interferon, proteína contendo o domínio PR 1, fator de ligação ao domínio regulador positivo I 1, PRDI-BF1 e fator de ligação a PRDI 1. No genoma humano, o PRDM1 está localizado no cromossomo 6q21. Quatro isoformas de PRDM1 exemplificativas são proporcionadas nos números da Genebank: NM_001198.3, NM_182907.2, XM_011536063.2 e XM_017011187.1.
[0218] Tet, tal como o termo é usado aqui, se relaciona com a família de genes, e as proteínas codificadas por tais genes, da família de metilcitosina dioxigenases de dez-onze translocações. Tet inclui, por exemplo, Tet1, Tet2 e Tet3.
[0219] Tet2, como o termo é usado aqui, se relaciona com o gene metilcitosina dioxigenase tet 2, e a proteína codificada pelo referido gene, a metilcitosina dioxigenase tet2, que catalisa a conversão de
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81/606 metilcitosina em 5-hidroximetilcitosina. Por vezes também é referido como KIAA1546, FLJ20032 e membro da família de oncogenes tet 2. A proteína codificada está envolvida na mielopoiese, e defeitos neste gene têm sido associados a vários distúrbios mieloproliferativos. No genoma humano, ο TET2 está localizado no cromossomo 4q24. Presentemente foram descritas seis isoformas de TET2 e os seus números da Genebank são: NM_001127208.2; XM_005263082.1; XM_006714242.2; NM_017628.4; XM_011532044.1; e
XM_011532043.1.
[022 0] Um exemplo da sequência proteica de Tet2 humano é proporcionada como número de acesso da UniProt Q6N021:
10 20 30 40 50
MEQDRTNHVE GNRLSPFLIP SPPICQTEPL ATKLQNGSPL PERAHPEVNG
60 70 80 90 100
DTKWHSFKSY YGIPCMKGSQ NSRVSPDFTQ ESRGYSKCLQ NGGIKRTVSE
110 120 130 140 150
PSLSGLLQIK KLKQDQKANG ERRNFGVSQE RNPGESSQPN VSDLSDKKES
160 170 180 190 200
VSSVAQENAV KDFTSFSTHN CSGPENPELQ ILNEQEGKSA NYHDKNIVLL
210 220 230 240 250
KNKAVLMPNG ATVSASSVEH THGELLEKTL SQYYPDCVSI AVQKTTSHIN
260 270 280 290 300
AINSQATNEL SCEITHPSHT SGQINSAQTS NSELPPKPAA WSEACDADD
310 320 330 340 350
ADNASKLAAM LNTCSFQKPE QLQQQKSVFE ICPSPAENNI QGTTKLASGE
360 370 380 390 400
EFCSGSSSNL QAPGGSSERY LKQNEMNGAY FKQSSVFTKD SFSATTTPPP
410 420 430 440 450
PSQLLLSPPP PLPQVPQLPS EGKSTLNGGV LEEHHHYPNQ SNTTLLREVK
460 470 480 490 500
IEGKPEAPPS QSPNPSTHVC SPSPMLSERP QNNCVNRNDI QTAGTMTVPL
510 520 530 540 550
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CSEKTRPMSE HLKHNPPIFG SSGELQDNCQ QLMRNKEQEI LKGRDKEQTR
560 570 580 590 600
DLVPPTQHYL KPGWIELKAP RFHQAESHLK RNEASLPSIL QYQPNLSNQM
610 620 630 640 650
TSKQYTGNSN MPGGLPRQAY TQKTTQLEHK SQMYQVEMNQ GQSQGTVDQH
660 670 680 690 700
LQFQKPSHQV HFSKTDHLPK AHVQSLCGTR FHFQQRADSQ TEKLMSPVLK
710 720 730 740 750
QHLNQQASET EPFSNSHLLQ HKPHKQAAQT QPSQSSHLPQ NQQQQQKLQI
760 770 780 790 800
KNKEEILQTF PHPQSNNDQQ REGSFFGQTK VEECFHGENQ YSKSSEFETH
810 820 830 840 850
NVQMGLEEVQ NINRRNSPYS QTMKSSACKI QVSCSNNTHL VSENKEQTTH
860 870 880 890 900
PELFAGNKTQ NLHHMQYFPN NVIPKQDLLH RCFQEQEQKS QQASVLQGYK
910 920 930 940 950
NRNQDMSGQQ AAQLAQQRYL IHNHANVFPV PDQGGSHTQT PPQKDTQKHA
960 970 980 990 1000
ALRWHLLQKQ EQQQTQQPQT ESCHSQMHRP IKVEPGCKPH ACMHTAPPEN
1010 1020 1030 1040 1050
KTWKKVTKQE NPPASCDNVQ QKSIIETMEQ HLKQFHAKSL FDHKALTLKS
1060 1070 1080 1090 1100
QKQVKVEMSG PVTVLTRQTT AAELDSHTPA LEQQTTSSEK TPTKRTAASV
1110 1120 1130 1140 1150
LNNFIESPSK LLDTPIKNLL DTPVKTQYDF PSCRCVEQII EKDEGPFYTH
1160 1170 1180 1190 1200
LGAGPNVAAI REIMEERFGQ KGKAIRIERV IYTGKEGKSS QGCPIAKWW
1210 1220 1230 1240 1250
RRSSSEEKLL CLVRERAGHT CEAAVIVILI LVWEGIPLSL ADKLYSELTE
1260 1270 1280 1290 1300
TLRKYGTLTN RRCALNEERT CACQGLDPET CGASFSFGCS WSMYYNGCKF
1310 1320 1330 1340 1350
ARSKIPRKFK LLGDDPKEEE KLESHLQNLS TLMAPTYKKL APDAYNNQIE
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1360 1370 1380 1390 1400
YEHRAPECRL GLKEGRPFSG VTACLDFCAH AHRDLHNMQN GSTLVCTLTR
1410 1420 1430 1440 1450
EDNREFGGKP EDEQLHVLPL YKVSDVDEFG SVEAQEEKKR SGAIQVLSSF
1460 1470 1480 1490 1500
RRKVRMLAEP VKTCRQRKLE AKKAAAEKLS SLENSSNKNE KEKSAPSRTK
1510 1520 1530 1540 1550
QTENASQAKQ LAELLRLSGP VMQQSQQPQP LQKQPPQPQQ QQRPQQQQPH
1560 1570 1580 1590 1600
HPQTESVNSY SASGSTNPYM RRPNPVSPYP NSSHTSDIYG STSPMNFYST
1610 1620 1630 1640 1650
SSQAAGSYLN SSNPMNPYPG LLNQNTQYPS YQCNGNLSVD NCSPYLGSYS
1660 1670 1680 1690 1700
PQSQPMDLYR YPSQDPLSKL SLPPIHTLYQ PRFGNSQSFT SKYLGYGNQN
1710 1720 1730 1740 1750
MQGDGFSSCT IRPNVHHVGK LPPYPTHEMD GHFMGATSRL PPNLSNPNMD
1760 1770 1780 1790 1800
YKNGEHHSPS HIIHNYSAAP GMFNSSLHAL HLQNKENDML SHTANGLSKM
1810 1820 1830 1840 1850
LPALNHDRTA CVQGGLHKLS DANGQEKQPL ALVQGVASGA EDNDEVWSDS
1860 1870 1880 1890 1900
EQSFLDPDIG GVAVAPTHGS ILIECAKREL HATTPLKNPN RNHPTRISLV
1910 1920 1930 1940 1950
FYQHKSMNEP KHGLALWEAK MAERAREKEE ECEKYGPDYV PQKSHGKKVK
1960 1970 1980 1990 2000
REPAEPHETS EPTYLRFIKS LAERTMSVTT DSTVTTSPYA FTRVTGPYNR
2002
Yl
[SEQ ID N2: 1357]
[0221] O gene tet2 está localizado no cromossomo 4, localização GRCh38.p2 (GCF_000001405.28) (NC_000004.12 (105145875 até 105279803); Gene ID 54790.
[0222] Exemplos de sequências de ácidos nucleicos codificando
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Tet2 são proporcionados abaixo. Há 6 isoformas identificadas de Tet2 humano. As sequências de mRNA são proporcionadas abaixo (em modalidades, em cada sequência, T pode ser substituído por U). Em modalidades, Tet2 inclui as proteínas codificadas por cada uma das sequências abaixo:
Nome Sequência de Referência do NCBI Sequência
Metilcitosina dioxigenase tet 2 (TET2) de Homo sapiens, variante de transcrito 1, mRNA [SEQ ID Ns: 1358] NM 0011272 08.2 GGCAGTGGCAGCGGCGAGAGCTTGGGCGGCCGCCGCC GCCTCCTCGCGAGCGCCGCGCGCCCGGGTCCCG CTCGCATGCAAGTCACGTCCGCCCCCTCGGCGCGGCCG CCCCGAGACGCCGGCCCCGCTGAGTGATGAGA ACAGACGTCAAACTGCCTTATGAATATTGATGCGGAGGC TAGGCTGCTTTCGTAGAGAAGCAGAAGGAAG CAAGATGGCTGCCCTTTAGGATTTGTTAGAAAGGAGACC CGACTGCAACTGCTGGATTGCTGCAAGGCTG AGGGACGAGAACGAGGCTGGCAAACATTCAGCAGCACA CCCTCTCAAGATTGTTTACTTGCCTTTGCTCC TGTTGAGTTACAACGCTTGGAAGCAGGAGATGGGCTCAG CAGCAGCCAATAGGACATGATCCAGGAAGAG CAGTAAGGGACTGAGCTGCTGAATTCAACTAGAGGGCA GCCTTGTGGATGGCCCCGAAGCAAGCCTGATG GAACAGGATAGAACCAACCATGTTGAGGGCAACAGACTA AGTCCATTCCTGATACCATCACCTCCCATTT GCCAGACAGAACCTCTGGCTACAAAGCTCCAGAATGGAA GCCCACTGCCTGAGAGAGCTCATCCAGAAGT AAATGGAGACACCAAGTGGCACTCTTTCAAAAGTTATTAT GGAATACCCTGTATGAAGGGAAGCCAGAAT AGTCGTGTGAGTCCTGACTTTACACAAGAAAGTAGAGGG TATTCCAAGTGTTTGCAAAATGGAGGAATAA AACG C AC AGTTAGTG AACCTTCTCTCTCTG GG CTCCTTC AGATCAAGAAATTGAAACAAGACCAAAAGGC
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TAATG GAGAAAGACGTAACTTCGG GGTAAG CCAAGAAAG AAATCCAGGTGAAAGCAGTCAACCAAATGTC TCCGATTTGAGTGATAAGAAAGAATCTGTGAGTTCTGTAG CCCAAGAAAATGCAGTTAAAGATTTCACCA GTTTTTCAACACATAACTGCAGTGGGCCTGAAAATCCAG AGCTTCAGATTCTGAATGAGCAGGAGGGGAA AAGTGCTAATTACCATGACAAGAACATTGTATTACTTAAA AACAAGGCAGTGCTAATGCCTAATGGTGCT ACAGTTTCTGCCTCTTCCGTGGAACACACACATGGTGAA CTCCTGGAAAAAACACTGTCTCAATATTATC CAGATTGTGTTTCCATTGCGGTGCAGAAAACCACATCTC ACATAAATGCCATTAACAGTCAGGCTACTAA TGAGTTGTCCTGTGAGATCACTCACCCATCGCATACCTC AGGGCAGATCAATTCCGCACAGACCTCTAAC TCTGAGCTGCCTCCAAAGCCAGCTGCAGTGGTGAGTGA GGCCTGTGATGCTGATGATGCTGATAATGCCA GTAAACTAGCTGCAATGCTAAATACCTGTTCCTTTCAGAA ACCAGAACAACTACAACAACAAAAATCAGT 1 1 1 1GAGATATGCCCATCTCCTGCAGAAAATAACATCCAG GGAACCACAAAGCTAGCGTCTGGTGAAGAA TTCTGTTCAGGTTCCAGCAGCAATTTGCAAGCTCCTGGT GGCAGCTCTGAACGGTATTTAAAACAAAATG AAATGAATGGTGCTTACTTCAAGCAAAGCTCAGTGTTCAC TAAGGATTCC1 1 1 1 CTGCCACTACCACACC ACCACCACCATCACAATTGCTTCTTTCTCCCCCTCCTCCT CTTCCACAGGTTCCTCAGCTTCCTTCAGAA GGAAAAAGCACTCTGAATGGTGGAG 1 1 1 IAGAAGAACAC CACCACTACCCCAACCAAAGTAACACAACAC 1 1 1 1AAGGGAAGTGAAAATAGAGGGTAAACCTGAGGCAC CACCTTCCCAGAGTCCTAATCCATCTACACA TGTATG C AG CCCTTCTCCG ATGCTTTCTG AAAG G CCTC A GAATAATTGTGTGAACAGGAATGACATACAG ACTGCAGGGACAATGACTGTTCCATTGTGTTCTGAGAAA
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ACAAGACCAATGTCAGAACACCTCAAGCATA ACCCACCAATTTTTGGTAGCAGTGGAGAGCTACAGGACA ACTGCCAGCAGTTGATGAGAAACAAAGAGCA AGAGATTCTGAAGGGTCGAGACAAGGAGCAAACACGAG ATCTTGTGCCCCCAACACAGCACTATCTGAAA CCAGGATGGATTGAATTGAAGGCCCCTCG 1 1 1 1 CACCAA GCGGAATCCCATCTAAAACGTAATGAGGCAT CACTGCCATCAATTCTTCAGTATCAACCCAATCTCTCCAA TCAAATGACCTCCAAACAATACACTGGAAA TTCCAACATGCCTGGGGGGCTCCCAAGGCAAGCTTACA CCCAGAAAACAACACAGCTGGAGCACAAGTCA CAAATGTACCAAGTTGAAATGAATCAAGGGCAGTCCCAA GGTACAGTGGACCAACATCTCCAGTTCCAAA AACCCTCACACCAGGTGCACTTCTCCAAAACAGACCATT TACCAAAAGCTCATGTGCAGTCACTGTGTGG CACTAGATTTCA1 1 1 1 CAACAAAGAGCAGATTCCCAAACT GAAAAACTTATGTCCCCAGTGTTGAAACAG CACTTGAATCAACAGGCTTCAGAGACTGAGCCA1 1 1 1 CA AACTCACACC1111GCAACATAAGCCTCATA AACAGGCAGCACAAACACAACCATCCCAGAGTTCACATC TCCCTC AAAACC AG C AAC AG CAGC AAAAATT ACAAATAAAGAATAAAGAGGAAATACTCCAGAC 1 1 1 1 CCT CACCCCCAAAG CAACAATGATCAG CAAAGA GAAGGATCATTCTTTGGCCAGACTAAAGTGGAAGAATGT TTTCATGGTGAAAATCAGTATTCAAAATCAA GCGAGTTCGAGACTCATAATGTCCAAATGGGACTGGAGG AAGTACAGAATATAAATCGTAGAAATTCCCC TTATAGTCAGACCATGAAATCAAGTGCATGCAAAATACAG GTTTCTTGTTCAAACAATACACACCTAGTT TCAGAGAATAAAGAACAGACTACACATCCTGAACTTTTTG CAGGAAACAAGACCCAAAACTTGCATCACA TGCAATAI 1 1 1 CCAAATAATGTGATCCCAAAGCAAGATCT TCTTC AC AG GTG CTTTC AAG A AC AG G AG C A
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GAAGTCACAACAAGCTTCAGTTCTACAGGGATATAAAAAT AGAAACCAAGATATGTCTGGTCAACAAGCT GCGCAACTTGCTCAGCAAAGGTACTTGATACATAACCAT GCAAATG 1 1 1 1 1CCTGTGCCTGACCAGGGAG GAAGTCACACTCAGACCCCTCCCCAGAAGGACACTCAAA AGCATGCTGCTCTAAGGTGGCATCTCTTACA GAAGCAAGAACAGCAGCAAACACAGCAACCCCAAACTGA GTCTTGCCATAGTCAGATGCACAGGCCAATT AAGGTGGAACCTGGATGCAAGCCACATGCCTGTATGCAC ACAGCACCACCAGAAAACAAAACATGGAAAA AGGTAACTAAGCAAGAGAATCCACCTGCAAGCTGTGATA ATGTGCAGCAAAAGAGCATCATTGAGACCAT GGAGCAGCATCTGAAGCAGTTTCACGCCAAGTCGTTATT TGACCATAAGGCTCTTACTCTCAAATCACAG AAGCAAGTAAAAGTTGAAATGTCAGGGCCAGTCACAGTT TTGACTAGACAAACCACTGCTGCAGAACTTG ATAG CC AC ACCCC AG CTTTAG AG C AG C AAAC AACTTCTT CAGAAAAGACACCAACCAAAAGAACAGCTGC TTCTGTTCTCAATAA1 1 1 1ATAGAGTCACCTTCCAAATTAC TAGATACTCCTATAAAAAATTTATTGGAT ACACCTGTCAAGACTCAATATGATTTCCCATCTTGCAGAT GTGTAGAGCAAATTATTGAAAAAGATGAAG GTCCTTTTTATACCCATCTAGGAGCAGGTCCTAATGTGG CAGCTATTAGAGAAATCATGGAAGAAAGGTT TGGACAGAAGGGTAAAGCTATTAGGATTGAAAGAGTCAT CTATACTGGTAAAGAAGGCAAAAGTTCTCAG GGATGTCCTATTGCTAAGTGGGTGGTTCGCAGAAGCAGC AGTGAAGAGAAGCTACTGTGTTTGGTGCGGG AGCGAGCTGGCCACACCTGTGAGGCTGCAGTGATTGTG ATTCTCATCCTGGTGTGGGAAGGAATCCCGCT GTCTCTGGCTGACAAACTCTACTCGGAGCTTACCGAGAC G CTG AGG AAATACG GC ACG CTC ACC AATCG C CGGTGTGCCTTGAATGAAGAGAGAACTTGCGCCTGTCAG
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GGGCTGGATCCAGAAACCTGTGGTGCCTCCT TCTC1 1 1 1 GGTTGTTCATGGAGCATGTACTACAATGGATG TAAGTTTGCCAGAAGCAAGATCCCAAGGAA GTTTAAGCTGCTTGGGGATGACCCAAAAGAGGAAGAGAA ACTGGAGTCTCATTTGCAAAACCTGTCCACT CTTATGGCACCAACATATAAGAAACTTGCACCTGATGCAT ATAATAATCAGATTGAATATGAACACAGAG CACCAGAGTGCCGTCTGGGTCTGAAGGAAGGCCGTCCA TTCTCAGGGGTCACTGCATGTTTGGACTTCTG TG CTC ATG CCC AC AG AG ACTTG C AC AAC ATG C AG AATG G CAGCACATTGGTATGCACTCTCACTAGAGAA GACAATCGAGAATTTGGAGGAAAACCTGAGGATGAGCAG CTTCACGTTCTGCCTTTATACAAAGTCTCTG ACGTGGATGAGTTTGGGAGTGTGGAAGCTCAGGAGGAG AAAAAACGGAGTGGTGCCATTCAGGTACTGAG TTC1 1 1 1 CGGCGAAAAGTCAGGATGTTAGCAGAGCCAGT CAAGACTTGCCGACAAAGGAAACTAGAAGCC AAGAAAGCTGCAGCTGAAAAGCTTTCCTCCCTGGAGAAC AGCTCAAATAAAAATGAAAAGGAAAAGTCAG CCCCATCACGTACAAAACAAACTGAAAACGCAAGCCAGG CTAAACAGTTGGCAGAAC 1 1 1 1 GCGACTTTC AGGACCAGTCATGCAGCAGTCCCAGCAGCCCCAGCCTC TACAGAAGCAGCCACCACAGCCCCAGCAGCAG CAGAGACCCCAGCAGCAGCAGCCACATCACCCTCAGAC AGAGTCTGTCAACTCTTATTCTGCTTCTGGAT CCACCAATCCATACATGAGACGGCCCAATCCAGTTAGTC CTTATCCAAACTCTTCACACACTTCAGATAT CTATGGAAGCACCAGCCCTATGAACTTCTATTCCACCTC ATCTCAAGCTGCAGGTTCATATTTGAATTCT TCTAATCCCATGAACCCTTACCCTGGGC 1 1 11GAATCAGA ATACCCAATATCCATCATATCAATGCAATG GAAACCTATCAGTGGACAACTGCTCCCCATATCTGGGTT CCTATTCTCCCCAGTCTCAGCCGATGGATCT
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GTATAGGTATCCAAGCCAAGACCCTCTGTCTAAGCTCAG TCTACCACCCATCCATACACTTTACCAGCCA AGGTTTGGAAATAGCCAGAG 1 1 1 1ACATCTAAATACTTAG GTTATGGAAACCAAAATATGCAGGGAGATG GTTTCAGCAGTTGTACCATTAGACCAAATGTACATCATGT AGG G AAATTG CCTCCTTATCCC ACTC ATG A GATGGATGGCCACTTCATGGGAGCCACCTCTAGATTACC ACCC AATCTG AG C AATCCAAAC ATG G ACTAT AAAAATGGTGAACATCATTCACCTTCTCACATAATCCATA ACTAC AGTG C AG CTCCG GGC ATGTTC AAC A GCTCTCTTCATGCCCTGCATCTCCAAAACAAGGAGAATG ACATGCTTTCCCACACAGCTAATGGGTTATC AAAGATGCTTCCAGCTCTTAACCATGATAGAACTGCTTGT GTCCAAGGAGGCTTACACAAATTAAGTGAT GCTAATGGTCAGGAAAAGCAGCCATTGGCACTAGTCCAG GGTGTGGCTTCTGGTGCAGAGGACAACGATG AGGTCTGGTCAGACAGCGAGCAGAGCTTTCTGGATCCT GACATTGGGGGAGTGGCCGTGGCTCCAACTCA TG G GTC AATTCTC ATTG AG TGTG C AA AG CGTG AG CTG C A TGCCACAACCCCTTTAAAGAATCCCAATAGG AATCACCCCACCAGGATCTCCCTCGTC1 1 1 1ACCAGCAT AAGAGCATGAATGAGCCAAAACATGGCTTGG CTCTTTGGGAAGCCAAAATGGCTGAAAAAGCCCGTGAGA AAGAGGAAGAGTGTGAAAAGTATGGCCCAGA CTATGTGCCTCAGAAATCCCATGGCAAAAAAGTGAAACG GGAGCCTGCTGAGCCACATGAAACTTCAGAG CCCACTTACCTGCGTTTCATCAAGTCTCTTGCCGAAAGG ACCATGTCCGTGACCACAGACTCCACAGTAA CTACATCTCCATATGCCTTCACTCGGGTCACAGGGCCTT ACAACAGATATATATGATATCACCCCC 1 1 1 1 GTTGGTTACCTCACTTGAAAAGACCACAACCAACCTGTC AGTAGTATAGTTCTCATGACGTGGGCAGTGG GGAAAGGTCACAGTATTCATGACAAATGTGGTGGGAAAA
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ACCTCAGCTCACCAGCAACAAAAGAGGTTAT CTTACCATAGCACTTAAI 1 1 1 CACTGGCTCCCAAGTGGTC ACAGATGGCATCTAGGAAAAGACCAAAGCA TTCTATGCAAAAAGAAGGTGGGGAAGAAAGTGTTCCGCA ATTTACA Iilll AAACACTGGTTCTATTATT GGACGAGATGATATGTAAATGTGATCCCCCCCCCCCGCT TACAACTCTACACATCTGTGACCAC 1 1 1 1AA TAATATCAAGTTTGCATAGTCATGGAACACAAATCAAACA AGTACTGTAGTATTACAGTGACAGGAATCT TAAAATACCATCTGGTGCTGAATATATGATGTACTGAAAT ACTGGAATTATGGC Iilll GAAATGCAGTT TTTACTGTAATCTTAAC 1 1 1 1ATTTATCAAAATAGCTACAG GAAACATGAATAGCAGGAAAACACTGAAT TTGTTTGGATGTTCTAAGAAATGGTGCTAAGAAAATGGTG TCTTTAATAG CTAAAAATTTAATG CCTTTA TATCATCAAGATGCTATCAGTGTACTCCAGTGCCCTTGAA TAATAGGGGTACC1 1 1 1 CA 1 1 CAAG Iilll ATCATAATTACCTATTCTTACACAAGCTTAGTTTTTAAAAT GTGGACAI 1 1 1AAAGGCC 1 C 1 GGA1 1 1 IG CTCATCCAGTGAAGTCCTTGTAGGACAATAAACGTATATA TGTACATATATACACAAACATGTATATGTG CACACACATGTATATGTATAAATA1 1 1 1 AAA 1 GG 1 G 1 1 1 1A GAAGCACTTTGTCTACCTAAGCTTTGACA ACTTGAACAATGCTAAGGTACTGAGATGTTTAAAAAACAA GTTTACTTTCA1 1 1 1AGAATGCAAAGTTGA llilll 1AAGGAAACAAAGAAAGC 1 1 1 IAAAAIAI 1 1 1 IGC 1 1 1 1AGCCATGCATCTGCTGATGAGCAAT TGTGTCCATTTTTAACACAGCCAGTTAAATCCACCATGGG GCTTACTGGATTCAAGGGAATACGTTAGTC CACAAAACATG1 11 1 CTGGTGCTCATCTCACATGCTATAC TGTAAAACAG11 1 1ATACAAAATTGTATGA CAAGTTCATTGCTCAAAAATGTACAG11 11AAGAA1 1 1 1 CT ATTAACTGCAGGTAATAATTAGCTGCATG
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CTG CAGACTCAACAAAG CTAGTTCACTGAAG CCTATG CT A1 1 1 1ATGGATCATAGGCTCTTCAGAGAACT GAATGGCAGTCTGCCTTTGTGTTGATAATTATGTACATTG TGACGTTGTCATTTCTTAGCTTAAGTGTCC TCTTTAACAAGAGGATTGAGCAGACTGATGCCTGCATAA GATGAATAAACAGGGTTAGTTCCATGTGAAT CTGTCAGTTAAAAAGAAACAAAAACAGGCAGCTGGTTTG CTGTGGTGG 1 1 1 1AAATCATTAATTTGTATA AAGAAGTGAAAGAGTTGTATAGTAAATTAAATTGTAAACA AAAC 1 1 1 1 1 1AATGCAATGCTTTAGTATTT TAGTACTGTAAAAAAATTAAATATATACATATATATATATA TATATATATATATATATATGAGTTTGAAG CAGAATTCACATCATGATGGTGCTACTCAGCCTGCTACA AATATATCATAATGTGAGCTAAGAATTCATT AAATGTTTGAGTGATGTTCCTACTTGTCATATACCTCAAC ACTAGTTTGGCAATAGGATATTGAACTGAG AGTGAAAGCATTGTGTACCATCA1 1 1 1 1 1 1 CCAAGTCCTT 1 1 1 1 1 1ATTGTTAAAAAAAAAAGCATACCT TTTTTCAATACTTGATTTCTTAGCAAGTATAACTTGAACTT CAACC 1 1 1 1 1GTTCTAAAAATTCAGGGAT ATTTCAGCTCATGCTCTCCCTATGCCAACATGTCACCTGT GTTTATGTAAAATTGTTGTAGGTTAATAAA TATATTCTTTGTCAGGGATTTAACCC 1 1 1 IAI 1 1 1 GAATCC CTTCTA1 1 1 1ACTTGTACATGTGCTGATG TAACTAAAACTAA1 111G1 AAA 1G1G11GGC 1 C1 1 1 1 1ATT GTAAAGAAAAGCA1 1 1 1AAAAGTTTGAGG AATC 1 1 1 1 GACTGTTTCAAGCAGGAAAAAAAAATTACATG AAAATAGAATGCACTGAGTTGATAAAGGGA AAAATTGTAAGG C AG G AGTTTGG C AAGTG GCTGTTGG CC AGAGACTTACTTGTAACTCTCTAAATGAAGT 1 1 1 1 1 1 GATCCTGTAATCACTGAAGGTACATACTCCATGT G G ACTTCCCTTAAAC AGG C AAAC ACCTAC A GGTATGGTGTGCAACAGATTGTACAATTACAI 1 1 IGGCCT
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AAATACAI I I I IGC TTACTAGTATTTAAAA TAAATTCTTAATCAGAGGAGGCCTTTGGG I I I IATTGGTC AAATCTTTGTAAGCTGGCI I I IG I C I I I I I AAAAAATTTCTTGAATTTGTGGTTGTGTCCAATTTGCAAA CATTTCCAAAAATGTTTGCTTTGCTTACAA ACCACATGAI I I IAAIGI I I I I IGTATACCATAATATCTAG CCCCAAACATTTGATTACTACATGTGCAT TGGTGAI I I IGATCATCCATTCTTAATATTTGATTTCTGTG TCACCTACTGTCATTTGTTAAACTGCTGG CCAACAAGAACAGGAAGTATAGTTTGGGGGGTTGGGGA GAGTTTACATAAGGAAGAGAAGAAATTGAGTG GCATATTGTAAATATCAGATCTATAATTGTAAATATAAAAC CTG CCTC AGTTAG AATG AATG G AAAG C AG ATCTACAATTTGCTAATATAGGAATATCAGGTTGACTATA TAGCCATACTTGAAAATGCTTCTGAGTGGT GTCAACTTTACTTGAATGAATTTTTCATCTTGATTGACGC ACAGTGATGTACAGTTCACTTCTGAAGCTA GTGGTTAACTTGTGTAGGAAAC I I I I GCAGTTTGACACTA AGATAACTTCTGTGTGCAI I I I I CTATGCT I I I I IAAAAAC I AG 1 I I CA I I I CA I I I I CATGAGATGTTTG GTTTATAAGATCTGAGGATGGTTATAAAT ACTGTAAGTATTGTAATGTTATGAATGCAGGTTATTTGAA AGCTGTTTATTATTATATCATTCCTGATAA TGCTATGTGAGTGTTTTTAATAAAATTTATATTTATTTAAT G CACTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
PREVISTA: Metilcitosina dioxigenase tet 2 (TET2) de Homo sapiens, variante de transcrito X1, mRNA XM 0052630 82.1 AAGCAGAAGGAAGCAAGATGGCTGCCCTTTAGGATTTGT TAGAAAGGAGACCCGACTGCAACTGCTGGAT TGCTGCAAGGCTGAGGGACGAGAACGAGAATTCAACTA GAGGGCAGCCTTGTGGATGGCCCCGAAGCAAG CCTGATGGAACAGGATAGAACCAACCATGTTGAGGGCAA CAGACTAAGTCCATTCCTGATACCATCACCT CCCATTTGCCAGACAGAACCTCTGGCTACAAAGCTCCAG AATGGAAGCCCACTGCCTGAGAGAGCTCATC
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[SEQ ID Ns: 1359] CAGAAGTAAATGGAGACACCAAGTGGCACTCTTTCAAAA GTTATTATGGAATACCCTGTATGAAGGGAAG CCAGAATAGTCGTGTGAGTCCTGACTTTACACAAGAAAG TAGAGGGTATTCCAAGTGTTTGCAAAATGGA GGAATAAAACGCACAGTTAGTGAACCTTCTCTCTCTGGG CTCCTTCAGATCAAGAAATTGAAACAAGACC AAAAGGCTAATGGAGAAAGACGTAACTTCGGGGTAAGCC AAGAAAGAAATCCAGGTGAAAGCAGTCAACC AAATGTCTCCGATTTGAGTGATAAGAAAGAATCTGTGAGT TCTGTAG CCCAAG AAAATG C AGTTAAAG AT TTCACCAGTTTTTCAACACATAACTGCAGTGGGCCTGAAA ATCCAGAGCTTCAGATTCTGAATGAGCAGG AGGGGAAAAGTGCTAATTACCATGACAAGAACATTGTATT ACTT AA AA AC A AG G C AG TG CT A ATG OCT A A TGGTGCTACAGTTTCTGCCTCTTCCGTGGAACACACACA TGGTGAACTCCTGGAAAAAACACTGTCTCAA TATTATCCAGATTGTGTTTCCATTGCGGTGCAGAAAACCA C ATCTC AC ATAAATG CC ATTAAC AGTC AG G CTACTAATGAGTTGTCCTGTGAGATCACTCACCCATCGC ATACCTCAGGGCAGATCAATTCCGCACAGAC CTCTAACTCTGAGCTGCCTCCAAAGCCAGCTGCAGTGGT GAGTGAGGCCTGTGATGCTGATGATGCTGAT AATG CC AGTAAACTAG CTG C AATGCTAAAT ACCTGTTCCT TTCAGAAACCAGAACAACTACAACAACAAA AATCAGTTTTTGAGATATGCCCATCTCCTGCAGAAAATAA CATCCAGGGAACCACAAAGCTAGCGTCTGG TGAAGAATTCTGTTCAGGTTCCAGCAGCAATTTGCAAGC TCCTGGTGGCAGCTCTGAACGGTATTTAAAA CAAAATGAAATGAATGGTGCTTACTTCAAGCAAAGCTCA GTGTTCACTAAGGATTCC I I I I CTGCCACTA CCACACCACCACCACCATCACAATTGCTTCTTTCTCCCC CTCCTCCTCTTCCACAGGTTCCTCAGCTTCC TTCAGAAGGAAAAAGCACTCTGAATGGTGGAG I I I IAGA
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AGAACACCACCACTACCCCAACCAAAGTAAC ACAACAC 1 1 1 1AAGGGAAGTGAAAATAGAGGGTAAACCT GAGGCACCACCTTCCCAGAGTCCTAATCCAT CTAC AC ATGTATG C AG CCCTTCTCCG ATG CTTTCTG AAA GGCCTCAGAATAATTGTGTGAACAGGAATGA CATACAGACTGCAGGGACAATGACTGTTCCATTGTGTTC TGAGAAAACAAGACCAATGTCAGAACACCTC AAGCATAACCCACCAATTTTTGGTAGCAGTGGAGAGCTA CAGGACAACTGCCAGCAGTTGATGAGAAACA AAGAGCAAGAGATTCTGAAGGGTCGAGACAAGGAGCAA ACACGAGATCTTGTGCCCCCAACACAGCACTA TCTGAAACCAGGATGGATTGAATTGAAGGCCCCTCGTTT TCACCAAGCGGAATCCCATCTAAAACGTAAT GAGGCATCACTGCCATCAATTCTTCAGTATCAACCCAATC TCTCCAATCAAATGACCTCCAAACAATACA CTGGAAATTCCAACATGCCTGGGGGGCTCCCAAGGCAA GCTTACACCCAGAAAACAACACAGCTGGAGCA CAAGTCACAAATGTACCAAGTTGAAATGAATCAAGGGCA GTCCCAAGGTACAGTGGACCAACATCTCCAG TTCCAAAAACCCTCACACCAGGTGCACTTCTCCAAAACA GACCATTTACCAAAAGCTCATGTGCAGTCAC TGTGTGGCACTAGATTTCA1 1 1 1 CAACAAAGAGCAGATTC CCAAACTGAAAAACTTATGTCCCCAGTGTT GAAACAGCACTTGAATCAACAGGCTTCAGAGACTGAGCC A1 1 11CAAAC1CACACC1 1 11GCAACATAAG CCTCATAAACAGGCAGCACAAACACAACCATCCCAGAGT TCACATCTCCCTCAAAACCAGCAACAGCAGC AAAAATTACAAATAAAGAATAAAGAGGAAATACTCCAGAC 1 1 1 1CCTCACCCCCAAAGCAACAATGATCA GCAAAGAGAAGGATCATTCTTTGGCCAGACTAAAGTGGA AGAATG 1 1 1 1 CATGGTGAAAATCAGTATTCA AAATCAAGCGAGTTCGAGACTCATAATGTCCAAATGGGA CTGGAGGAAGTACAGAATATAAATCGTAGAA
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ATTCCCCTTATAGTCAGACCATGAAATCAAGTGCATGCAA AATAC AG GTTTCTTGTTCAAAC AATAC AC A CCTAGTTTCAGAGAATAAAGAACAGACTACACATCCTGAA C 1 1 1 1 1 GCAGGAAACAAGACCCAAAACTTG CATCACATGCAATA1 1 1 1CCAAATAATGTGATCCCAAAGC AAGATCTTCTTCACAGGTGCTTTCAAGAAC AGGAGCAGAAGTCACAACAAGCTTCAGTTCTACAGGGAT ATAAAAATAGAAACCAAGATATGTCTGGTCA ACAAGCTGCGCAACTTGCTCAGCAAAGGTACTTGATACA TAACCATGCAAATG1 1 1 1 1 CCTGTGCCTGAC CAGGGAGGAAGTCACACTCAGACCCCTCCCCAGAAGGA CACTCAAAAGCATGCTGCTCTAAGGTGGCATC TCTTACAGAAGCAAGAACAGCAGCAAACACAGCAACCCC AAACTGAGTCTTGCCATAGTCAGATGCACAG GCCAATTAAGGTGGAACCTGGATGCAAGCCACATGCCTG TATGCACACAGCACCACCAGAAAACAAAACA TGGAAAAAGGTAACTAAGCAAGAGAATCCACCTGCAAGC TGTGATAATGTGCAGCAAAAGAGCATCATTG AGACCATGGAGCAGCATCTGAAGCAGTTTCACGCCAAGT CGTTATTTGACCATAAGGCTCTTACTCTCAA ATCACAGAAGCAAGTAAAAGTTGAAATGTCAGGGCCAGT CACAG1 1 11GACTAGACAAACCACTGCTGCA GAACTTGATAGCCACACCCCAGCTTTAGAGCAGCAAACA ACTTCTTCAGAAAAGACACCAACCAAAAGAA CAGCTGCTTCTGTTCTCAATAA1 1 1 1ATAGAGTCACCTTC CAAATTACTAGATACTCCTATAAAAAATTT ATTGGATACACCTGTCAAGACTCAATATGATTTCCCATCT TGCAGATGTGTAGAGCAAATTATTGAAAAA GATGAAGGTCCTTTTTATACCCATCTAGGAGCAGGTCCT AATGTGGCAGCTATTAGAGAAATCATGGAAG AAAGGTTTGGACAGAAGGGTAAAGCTATTAGGATTGAAA GAGTCATCTATACTGGTAAAGAAGGCAAAAG TTCTCAGGGATGTCCTATTGCTAAGTGGGTGGTTCGCAG
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AAGCAGCAGTGAAGAGAAGCTACTGTGTTTG GTGCGGGAGCGAGCTGGCCACACCTGTGAGGCTGCAGT GATTGTGATTCTCATCCTGGTGTGGGAAGGAA TCCCG CTGTCTCTG GCTG AC AAACTCTACTCG G AGCTTA CCGAGACGCTGAGGAAATACGGCACGCTCAC CAATCGCCGGTGTGCCTTGAATGAAGAGAGAACTTGCGC CTGTCAGGGGCTGGATCCAGAAACCTGTGGT GCCTCCTTCTC 1 1 1 1 GGTTGTTCATGGAGCATGTACTACA ATGGATGTAAGTTTGCCAGAAGCAAGATCC CAAGGAAGTTTAAGCTGCTTGGGGATGACCCAAAAGAGG AAG AG AAACTG G AGTCTC ATTTG C AAAACCT GTCCACTCTTATGGCACCAACATATAAGAAACTTGCACCT GATGCATATAATAATCAGATTGAATATGAA CACAGAGCACCAGAGTGCCGTCTGGGTCTGAAGGAAGG CCGTCCATTCTCAGGGGTCACTGCATGTTTGG ACTTCTGTGCTCATGCCCACAGAGACTTGCACAACATGC AGAATGGCAGCACATTGGTATGCACTCTCAC TAGAGAAGACAATCGAGAATTTGGAGGAAAACCTGAGGA TGAGCAGCTTCACGTTCTGCCTTTATACAAA GTCTCTGACGTGGATGAGTTTGGGAGTGTGGAAGCTCA GGAGGAGAAAAAACGGAGTGGTGCCATTCAGG TACTGAGTTC1 1 1 1 CGGCGAAAAGTCAGGATGTTAGCAG AGCCAGTCAAGACTTGCCGACAAAGGAAACT AGAAGCCAAGAAAGCTGCAGCTGAAAAGCTTTCCTCCCT G G AG AAC AG CTC AAATAAAAATG AAAAG G AA AAGTCAGCCCCATCACGTACAAAACAAACTGAAAACGCA AGCCAGGCTAAACAGTTGGCAGAAC 1 1 1 1 GC GACTTTCAGGACCAGTCATGCAGCAGTCCCAGCAGCCC CAGCCTCTACAGAAGCAGCCACCACAGCCCCA GCAGCAGCAGAGACCCCAGCAGCAGCAGCCACATCACC CTCAGACAGAGTCTGTCAACTCTTATTCTGCT TCTGGATCCACCAATCCATACATGAGACGGCCCAATCCA GTTAGTCCTTATCCAAACTCTTCACACACTT
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CAGATATCTATGGAAGCACCAGCCCTATGAACTTCTATTC CACCTCATCTCAAGCTGCAGGTTCATATTT GAATTCTTCTAATCCCATGAACCCTTACCCTGGGC 1 1 1 1G AATCAGAATACCCAATATCCATCATATCAA TGCAATGGAAACCTATCAGTGGACAACTGCTCCCCATAT CTGGGTTCCTATTCTCCCCAGTCTCAGCCGA TGGATCTGTATAGGTATCCAAGCCAAGACCCTCTGTCTA AGCTCAGTCTACCACCCATCCATACACTTTA CCAGCCAAGGTTTGGAAATAGCCAGAG 1 1 1 1ACATCTAA ATACTTAGGTTATGGAAACCAAAATATGCAG GGAGATGGTTTCAGCAGTTGTACCATTAGACCAAATGTA CATCATGTAGGGAAATTGCCTCCTTATCCCA CTCATGAGATGGATGGCCACTTCATGGGAGCCACCTCTA GATTACCACCCAATCTGAGCAATCCAAACAT G G ACTATAAAAATG GTG AAC ATC ATTC ACCTTCTC AC ATA ATCCATAACTACAGTGCAGCTCCGGGCATG TTCAACAGCTCTCTTCATGCCCTGCATCTCCAAAACAAG GAGAATGACATGCTTTCCCACACAGCTAATG GGTTATCAAAGATGCTTCCAGCTCTTAACCATGATAGAAC TG CTTGTGTCC AAGG AG G CTTAC AC AAATT AAGTGATGCTAATGGTCAGGAAAAGCAGCCATTGGCACT AGTCCAGGGTGTGGCTTCTGGTGCAGAGGAC AACGATGAGGTCTGGTCAGACAGCGAGCAGAGCTTTCT GGATCCTGACATTGGGGGAGTGGCCGTGGCTC CAACTCATGGGTCAATTCTCATTGAGTGTGCAAAGCGTG AGCTGCATGCCACAACCCCTTTAAAGAATCC CAATAGGAATCACCCCACCAGGATCTCCCTCGTC1 1 1 1A CCAGCATAAGAGCATGAATGAGCCAAAACAT GGCTTGGCTCTTTGGGAAGCCAAAATGGCTGAAAAAGCC CGTGAGAAAGAGGAAGAGTGTGAAAAGTATG GCCCAGACTATGTGCCTCAGAAATCCCATGGCAAAAAAG TGAAACGGGAGCCTGCTGAGCCACATGAAAC TTCAGAGCCCACTTACCTGCGTTTCATCAAGTCTCTTGCC
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GAAAGGACCATGTCCGTGACCACAGACTCC ACAGTAACTACATCTCCATATGCCTTCACTCGGGTCACA GGGCCTTACAACAGATATATATGATATCACC CCC 1 1 1 1 GTTGGTTACCTCACTTGAAAAGACCACAACCAA CCTGTCAGTAGTATAGTTCTCATGACGTGG GCAGTGGGGAAAGGTCACAGTATTCATGACAAATGTGGT GGGAAAAACCTCAGCTCACCAGCAACAAAAG AGGTTATCTTACCATAGCACTTAA1 1 1 1 CACTGGCTCCCA AGTGGTCACAGATGGCATCTAGGAAAAGAC C AAAG C ATTCTATGC AAAAAG AAG GTG GG G AAG AAAGTG TTCCGCAATTTACA1 1 1 1 1AAACACTGGTTC TATTATTGGACGAGATGATATGTAAATGTGATCCCCCCCC CCCG CTTAC AACTCTAC AC ATCTGTG ACC A C 1 1 1 1AATAATATCAAGTTTGCATAGTCATGGAACACAAA TCAAACAAGTACTGTAGTATTACAGTGACA G G AATCTTAAAATACC ATCTG GTG CTG AATATATG ATGTA CTGAAATACTGGAATTATGGC 1 1 1 1 1GAAA TGCAG 1 1 1 1 1 AC 1G1AA1C1 1AAC 1 1 1 1ATTTATCAAAATA G CT AC AG G AA AC ATG A AT AG C AG G A A AAC ACTGAATTTGTTTGGATGTTCTAAGAAATGGTGCTAAGAA AATG GTGTCTTTAATAG CTAAAAATTTAAT GCCTTTATATCATCAAGATGCTATCAGTGTACTCCAGTGC CCTTGAATAATAGGGGTACC 1 1 1 1 CATTCA AGTTTTTATCATAATTACCTATTCTTACACAAGCTTAGTTT TTAAAATGTGGACA1 1 1 IAAAGGCCTCTG GAI 1 1 IGCTCATCCAGTGAAGTCCTTGTAGGACAATAAAC GTATATATGTACATATATACACAAACATGT ATATGTGCACACACATGTATATGTATAAATA1 1 1 1AAATGG TG 1 1 1 1AGAAGCACTTTGTCTACCTAAGC TTTGACAACTTGAACAATGCTAAGGTACTGAGATGTTTAA AAAACAAGTTTACTTTCA1 1 1 1 AG AATG CA AAGTTGAI 1 1 1 1 1 1AAGGAAACAAAGAAAGC 1 1 1 IAAAATA 1 1 1 1 1GC1 1 1 1AGCCATGCATCTGCTGAT
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GAGCAATTGTGTCCATTTTTAACACAGCCAGTTAAATCCA CCATGGGGCTTACTGGATTCAAGGGAATAC GTTAGTCCACAAAACATG1 1 1 1 CTGGTGCTCATCTCACAT GCTATACTGTAAAACAG 1 1 11ATACAAAAT TGTATGACAAGTTCATTGCTCAAAAATGTACAG11 1 1AAG AA1 1 1 1 CTATTAACTGCAGGTAATAATTAG CTGCATGCTGCAGACTCAACAAAGCTAGTTCACTGAAGC CTATGCTA1 1 1 1ATGGATCATAGGCTCTTCA GAGAACTGAATGGCAGTCTGCCTTTGTGTTGATAATTATG TACATTGTGACGTTGTCATTTCTTAGCTTA AGTGTCCTCTTTAACAAGAGGATTGAGCAGACTGATGCC TG C ATAAG ATG AATAAAC AGG GTTAGTTCC A TGTG AATCTGTC AGTTAAAAAG AAAC AAAAAC AG G C AG C TGGTTTGCTGTGGTGG 1 1 1 IAAATCATTAAT TTGTATAAAGAAGTGAAAGAGTTGTATAGTAAATTAAATT GTAAACAAAAC 1 1 1 1 1 1AATGCAATGCTTT AGTA1 1 1 1AGTACTGTAAAAAAATTAAATATATACATATAT ATATATATATATATATATATATATATGAG TTTGAAGCAGAATTCACATCATGATGGTGCTACTCAGCCT GCTACAAATATATCATAATGTGAGCTAAGA ATTCATTAAATGTTTGAGTGATGTTCCTACTTGTCATATAC CTCAACACTAGTTTGGCAATAGGATATTG AACTGAGAGTGAAAGCATTGTGTACCATCA1 1 1 1 1 1 1 OCA AGTCC1 111 1 1 1 1ATTGTTAAAAAAAAAAG CAT ACC 1 1 1 1 1 1 CAATACTTGATTTCTTAGCAAGTATAACT TGAACTTCAACC 1 111 1GTTCTAAAAATT C AGG G ATATTTC AG CTCATGCTCTCCCTATG CC AAC ATG TCACCTGTGTTTATGTAAAATTGTTGTAGGT TAATAAATATATTCTTTGTCAGGGATTTAACCCI 1 1 IATTT TGAATCCCTTCTA1 1 1 1ACTTGTACATGT GCTGATGTAACTAAAACTAAI111GTAAATCTGTTGGCTC 1 1 1 1 1A1 1G1AAAGAAAAGCA1 1 1 1AAAAG TTTGAGGAATC1 1 1 1 GACTGTTTCAAGCAGGAAAAAAAAA
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TTACATGAAAATAGAATGCACTGAGTTGAT AAAGGGAAAAATTGTAAGGCAGGAGTTTGGCAAGTGGCT GTTGGCCAGAGACTTACTTGTAACTCTCTAA ATGAAG I I I I I I I GATCCTGTAATCACTGAAGGTACATAC TCC ATGTG G ACTTCCCTTAAAC AG GC AAAC ACCTACAGGTATGGTGTGCAACAGATTGTACAATTACATT TTGGCCTAAATACAI I I I I GCTTACTAGTA TTTAAAATAAATTCTTAATCAGAGGAGGCCTTTGGG I I I I ATTGGTCAAATCTTTGTAAGCTGGCI I I I G TCTTTTTAAAAAATTTCTTGAATTTGTGGTTGTGTCCAATT TGCAAACATTTCCAAAAATGTTTGCTTTG CTTACAAACCACATGAI I I IAAIGII I I I IGTATACCATAA TATCTAG CCCC AAAC ATTTG ATTACTAC A TGTGCATTGGTGAI I I I GATCATCCATTCTTAATATTTGAT TTCTGTGTCACCTACTGTCATTTGTTAAA CTG CTG GCC AAC AAG AAC AG G AAGTATAGTTTGGG GG G TTGGGGAGAGTTTACATAAGGAAGAGAAGAAA TTGAGTGGCATATTGTAAATATCAGATCTATAATTGTAAAT ATAAAACCTG CCTC AGTTAG AATG AATG G AAAG C AG ATCTAC AATTTG CTAATATAG G AATATC AG GTT GACTATATAGCCATACTTGAAAATGCTTCT GAGTGGTGTCAACTTTACTTGAATGAATTTTTCATCTTGA TTGACGCACAGTGATGTACAGTTCACTTCT GAAGCTAGTGGTTAACTTGTGTAGGAAAC I I I I GCAGTTT GACACTAAGATAACTTCTGTGTGCAI I I I I CTATGCI I I I I IAAAAAGIAGI IICAIIICAI I I I CATGAG ATGTTTGGTTTATAAGATCTGAGGATGGT TATAAATACTGTAAGTATTGTAATGTTATGAATGCAGGTT ATTTGAAAGCTGTTTATTATTATATCATTC CTGATAATGCTATGTGAGTGTTTTTAATAAAATTTATATTT ATTTAATGCACTCTAA
PREVISTA: Metilcitosina dioxigenase tet XM 0067142 42.2 GTAGAGAAGCAGAAGGAAGCAAGATGGCTGCCCTTTAG GATTTGTTAGAAAGGAGACCCGACTGCAACTG
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2 (TET2) de Homo sapiens, variante de transcrito X2, mRNA [SEQ ID Ns: 1360] CTGGATTGCTGCAAGGCTGAGGGACGAGAACGAGGCTG GCAAACATTCAGCAGCACACCCTCTCAAGATT GTTTACTTGCCTTTGCTCCTGTTGAGTTACAACGCTTGGA AGCAGGAGATGGGCTCAGCAGCAGCCAATA GGACATGATCCAGGAAGAGCAGTAAGGGACTGAGCTGC TG AATTC AACTAG AGGG C AG CCTTGTG G ATG G CCCCGAAGCAAGCCTGATGGAACAGGATAGAACCAACC ATGTTGAGGGCAACAGACTAAGTCCATTCCTG ATACCATCACCTCCCATTTGCCAGACAGAACCTCTGGCT ACAAAGCTCCAGAATGGAAGCCCACTGCCTG AGAGAGCTCATCCAGAAGTAAATGGAGACACCAAGTGGC ACTCTTTCAAAAGTTATTATG G AATACCCTG TATGAAGGGAAGCCAGAATAGTCGTGTGAGTCCTGACTT TACACAAGAAAGTAGAGGGTATTCCAAGTGT TTGCAAAATGGAGGAATAAAACGCACAGTTAGTGAACCT TCTCTCTCTGGGCTCCTTCAGATCAAGAAAT TGAAACAAGACCAAAAGGCTAATGGAGAAAGACGTAACT TCGGGGTAAGCCAAGAAAGAAATCCAGGTGA AAGCAGTCAACCAAATGTCTCCGATTTGAGTGATAAGAA AGAATCTGTGAGTTCTGTAGCCCAAGAAAAT G CAGTTAAAGATTTCACCAG I I I I ICAACACATAACTG CA GTGGGCCTGAAAATCCAGAGCTTCAGATTC TGAATGAGCAGGAGGGGAAAAGTGCTAATTACCATGACA AGAACATTGTATTACTTAAAAACAAGGCAGT GCTAATGCCTAATGGTGCTACAGTTTCTGCCTCTTCCGT GGAACACACACATGGTGAACTCCTGGAAAAA ACACTGTCTCAATATTATCCAGATTGTGTTTCCATTGCGG TGCAGAAAACCACATCTCACATAAATGCCA TTAACAGTCAGGCTACTAATGAGTTGTCCTGTGAGATCA CTCACCCATCGCATACCTCAGGGCAGATCAA TTCCGCACAGACCTCTAACTCTGAGCTGCCTCCAAAGCC AGCTGCAGTGGTGAGTGAGGCCTGTGATGCT GATGATGCTGATAATGCCAGTAAACTAGCTGCAATGCTA
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AATACCTGTTCCTTTCAGAAACCAGAACAAC TACAACAACAAAAATCAGTTTTTGAGATATGCCCATCTCC TGCAGAAAATAACATCCAGGGAACCACAAA GCTAGCGTCTGGTGAAGAATTCTGTTCAGGTTCCAGCAG CAATTTGCAAGCTCCTGGTGGCAGCTCTGAA CGGTATTTAAAACAAAATGAAATGAATGGTGCTTACTTCA AGCAAAGCTCAGTGTTCACTAAGGATTCCT TTTCTGCCACTACCACACCACCACCACCATCACAATTGCT TCTTTCTCCCCCTCCTCCTCTTCCACAGGT TCCTCAGCTTCCTTCAGAAGGAAAAAGCACTCTGAATGG TGGAG11 1 1AGAAGAACACCACCACTACCCC AACCAAAGTAACACAACAC 1 1 1 1AAGGGAAGTGAAAATAG AGGGTAAACCTGAGGCACCACCTTCCCAGA GTCCTAATCCATCTACACATGTATGCAGCCCTTCTCCGAT GCTTTCTGAAAGGCCTCAGAATAATTGTGT GAACAGGAATGACATACAGACTGCAGGGACAATGACTGT TCCATTGTGTTCTGAGAAAACAAGACCAATG TCAGAACACCTCAAG CATAACCCACCAA1 1 1 1 IGGTAGCA GTGGAGAGCTACAGGACAACTGCCAGCAGT TGATGAGAAACAAAGAGCAAGAGATTCTGAAGGGTCGAG ACAAGGAGCAAACACGAGATCTTGTGCCCCC AACACAGCACTATCTGAAACCAGGATGGATTGAATTGAA GGCCCCTCG 1 1 1 1CACCAAGCGGAATCCCAT CTAAAACGTAATGAGGCATCACTGCCATCAATTCTTCAGT ATCAACCCAATCTCTCCAATCAAATGACCT CCAAACAATACACTGGAAATTCCAACATGCCTGGGGGGC TCCCAAGGCAAGCTTACACCCAGAAAACAAC ACAGCTGGAGCACAAGTCACAAATGTACCAAGTTGAAAT GAATCAAGGGCAGTCCCAAGGTACAGTGGAC CAACATCTCCAGTTCCAAAAACCCTCACACCAGGTGCAC TTCTCCAAAACAGACCATTTACCAAAAGCTC ATGTGCAGTCACTGTGTGGCACTAGATTTCA1 1 1 1CAACA AAGAGCAGATTCCCAAACTGAAAAACTTAT
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GTCCCCAGTGTTGAAACAGCACTTGAATCAACAGGCTTC AGAGACTGAGCCA1 1 1 1CAAACTCACACCTT TTGCAACATAAGCCTCATAAACAGGCAGCACAAACACAA CCATCCCAGAGTTCACATCTCCCTCAAAACC AGCAACAGCAGCAAAAATTACAAATAAAGAATAAAGAGG AAATACTCCAGAC1111CCTCACCCCCAAAG CAACAATGATCAGCAAAGAGAAGGATCATTCTTTGGCCA GACTAAAGTGGAAGAATG 1 1 1 1 CATGGTGAA AATCAGTATTCAAAATCAAGCGAGTTCGAGACTCATAATG TCCAAATGGGACTGGAGGAAGTACAGAATA TAAATCGTAGAAATTCCCCTTATAGTCAGACCATGAAATC AAGTGCATGCAAAATACAGGTTTCTTGTTC AAACAATACACACCTAGTTTCAGAGAATAAAGAACAGACT ACACATCCTGAAC1 1 1 1 1GCAGGAAACAAG ACCCAAAACTTGCATCACATGCAATA1 1 1 1 CCAAATAATG TGATCCCAAAGCAAGATCTTCTTCACAGGT GCTTTCAAGAACAGGAGCAGAAGTCACAACAAGCTTCAG TTCTACAGGGATATAAAAATAGAAACCAAGA TATGTCTGGTCAACAAGCTGCGCAACTTGCTCAGCAAAG GTACTTGATACATAACCATGCAAATG11 1 1 1 CCTGTGCCTGACCAGGGAGGAAGTCACACTCAGACCCC TCCCC AG AAG G AC ACTC AAAAG C ATGCTG CTC TAAGGTGGCATCTCTTACAGAAGCAAGAACAGCAGCAAA CACAGCAACCCCAAACTGAGTCTTGCCATAG TCAGATGCACAGGCCAATTAAGGTGGAACCTGGATGCAA GCCACATGCCTGTATGCACACAGCACCACCA G AAAAC AAAAC ATG G AAAAAG GTAACTAAG C AAG AG AAT CC ACCTGC AAG CTGTG ATAATGTG C AG C AAA AGAGCATCATTGAGACCATGGAGCAGCATCTGAAGCAGT TTC ACG CCAAGTCGTT ATTTG ACC AT AAG GC TCTTACTCTCAAATCACAGAAGCAAGTAAAAGTTGAAATG TCAGGGCCAGTCACAG 1 1 1 1 GACTAGACAA ACCACTGCTGCAGAACTTGATAGCCACACCCCAGCTTTA
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GAG C AG C AAAC AACTTCTTC AG AAAAG AC AC CAACCAAAAGAACAGCTGCTTCTGTTCTCAATAA1 1 1 1 AT AGAGTCACCTTCCAAATTACTAGATACTCC TATAAAAAATTTATTGGATACACCTGTCAAGACTCAATAT GATTTCCCATCTTGCAGATGTGTAGGTTTG GACAGAAGGGTAAAGCTATTAGGATTGAAAGAGTCATCT ATACTGGTAAAGAAGGCAAAAGTTCTCAGGG ATGTCCTATTGCTAAGTGGGAGAACTTGCGCCTGTCAGG GGCTGGATCCAGAAACCTGTGGTGCCTCCTT CTC 1 1 1 1 GGTTGTTCATGGAGCATGTACTACAATGGATGT AAGTTTGCCAGAAGCAAGATCCCAAGGAAG TTTAAGCTGCTTGGGGATGACCCAAAAGAGGAAGAGAAA CTGGAGTCTCATTTGCAAAACCTGTCCACTC TTATGGCACCAACATATAAGAAACTTGCACCTGATGCATA TAATAATCAGATTGAATATGAACACAGAGC ACCAGAGTGCCGTCTGGGTCTGAAGGAAGGCCGTCCAT TCTCAGGGGTCACTGCATGTTTGGACTTCTGT GCTCATGCCCACAGAGACTTGCACAACATGCAGAATGGC AGCACATTGGTATGCACTCTCACTAGAGAAG ACAATCGAGAATTTGGAGGAAAACCTGAGGATGAGCAGC TTCACGTTCTGCCTTTATACAAAGTCTCTGA CGTGGATGAGTTTGGGAGTGTGGAAGCTCAGGAGGAGA AAAAACGGAGTGGTGCCATTCAGGTACTGAGT TC 1 1 1 1CGGCGAAAAGTCAGGATGTTAGCAGAGCCAGTC AAGACTTGCCGACAAAGGAAACTAGAAGCCA AGAAAGCTGCAGCTGAAAAGCTTTCCTCCCTGGAGAACA GCTCAAATAAAAATGAAAAGGAAAAGTCAGC CCCATCACGTACAAAACAAACTGAAAACGCAAGCCAGGC TAAACAGTTGGCAGAAC 1 1 1 1 GCGACTTTCA GGACCAGTCATGCAGCAGTCCCAGCAGCCCCAGCCTCT ACAGAAGCAGCCACCACAGCCCCAGCAGCAGC AGAGACCCCAGCAGCAGCAGCCACATCACCCTCAGACA GAGTCTGTCAACTCTTATTCTGCTTCTGGATC
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CACCAATCCATACATGAGACGGCCCAATCCAGTTAGTCC TTATCCAAACTCTTCACACACTTCAGATATC TATG G AAG C ACC AG CCCTATG AACTTCTATTCC ACCTC AT CTCAAGCTGCAGGTTCATATTTGAATTCTT CTAATCCCATGAACCCTTACCCTGGGC 1 1 1 1GAATCAGAA TACCCAATATCCATCATATCAATGCAATGG AAACCTATCAGTGGACAACTGCTCCCCATATCTGGGTTC CTATTCTCCCCAGTCTCAGCCGATGGATCTG TATAGGTATCCAAGCCAAGACCCTCTGTCTAAGCTCAGT CTACCACCCATCCATACACTTTACCAGCCAA GGTTTGGAAATAGCCAGAG 1 1 1 1ACATCTAAATACTTAGG TTATGGAAACCAAAATATGCAGGGAGATGG TTTCAGCAGTTGTACCATTAGACCAAATGTACATCATGTA GGGAAATTGCCTCCTTATCCCACTCATGAG ATGGATGGCCACTTCATGGGAGCCACCTCTAGATTACCA CCCAATCTGAGCAATCCAAACATGGACTATA AAAATGGTGAACATCATTCACCTTCTCACATAATCCATAA CTACAGTGCAGCTCCGGGCATGTTCAACAG CTCTCTTCATGCCCTGCATCTCCAAAACAAGGAGAATGA CATGCTTTCCCACACAGCTAATGGGTTATCA AAGATGCTTCCAGCTCTTAACCATGATAGAACTGCTTGTG TCCAAGGAGGCTTACACAAATTAAGTGATG CTAATG GTC AG G AAAAG C AGCC ATTG GC ACTAGTCC AGG GTGTGGCTTCTGGTGCAGAGGACAACGATGA GGTCTGGTCAGACAGCGAGCAGAGCTTTCTGGATCCTG ACATTGGGGGAGTGGCCGTGGCTCCAACTCAT GGGTCAATTCTCATTGAGTGTGCAAAGCGTGAGCTGCAT GCCACAACCCCTTTAAAGAATCCCAATAGGA ATCACCCCACCAGGATCTCCCTCGTC1 1 1 1ACCAGCATA AGAGCATGAATGAGCCAAAACATGGCTTGGC TCTTTGGGAAGCCAAAATGGCTGAAAAAGCCCGTGAGAA AGAGGAAGAGTGTGAAAAGTATGGCCCAGAC TATGTGCCTCAGAAATCCCATGGCAAAAAAGTGAAACGG
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GAGCCTGCTGAGCCACATGAAACTTCAGAGC CCACTTACCTGCGTTTCATCAAGTCTCTTGCCGAAAGGA CCATGTCCGTGACCACAGACTCCACAGTAAC TACATCTCCATATGCCTTCACTCGGGTCACAGGGCCTTA CAACAGATATATATGATATCACCCCC 1 1 1 1 G TTGGTTACCTCACTTGAAAAGACCACAACCAACCTGTCA GTAGTATAGTTCTCATGACGTGGGCAGTGGG GAAAGGTCACAGTATTCATGACAAATGTGGTGGGAAAAA CCTCAGCTCACCAGCAACAAAAGAGGTTATC TTACCATAGCACTTAA1 1 1 1 CACTGGCTCCCAAGTGGTCA CAGATGGCATCTAGGAAAAGACCAAAGCAT TCTATGCAAAAAGAAGGTGGGGAAGAAAGTGTTCCGCAA TTTACA Mill AAACACTGGTTCTATTATTG GACGAGATGATATGTAAATGTGATCCCCCCCCCCCGCTT ACAACTCTACACATCTGTGACCAC11 1 1AAT AATATCAAGTTTGCATAGTCATGGAACACAAATCAAACAA GTACTGTAGTATTACAGTGACAGGAATCTT AAAATACCATCTGGTGCTGAATATATGATGTACTGAAATA CTGGAATTATGGC Iilll GAAATGCAGTTT TTACTGTAATCTTAAC 1 1 1 1ATTTATCAAAATAGCTACAGG AAAC ATG AATAG C AG G AAAAC ACTG AATT TGTTTGGATGTTCTAAGAAATGGTGCTAAGAAAATGGTGT CTTTAATAGCTAAAAATTTAATGCCTTTAT ATCATCAAGATGCTATCAGTGTACTCCAGTGCCCTTGAAT AATAGGGGTACC 1 1 1 1 CA 1 1 CAAG 1 1 1 1 1A TCATAATTACCTATTCTTACACAAGCTTAGTTTTTAAAATG TGGACAI 1 1 1AAAGGCC1C1GGA1 1 1 IGC TCATCCAGTGAAGTCCTTGTAGGACAATAAACGTATATAT GTACATATATACACAAACATGTATATGTGC ACACACATGTATATGTATAAATA1 1 1 1 AAA 1 GG 1 G 1 1 1 1 AG AAG C ACTTTGTCTACCTAAG CTTTG AC AA CTTGAACAATGCTAAGGTACTGAGATGTTTAAAAAACAAG TTTACTTTCAI 1 1 1AGAATGCAAAGTTGAT
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Mill 1AAGGAAACAAAGAAAGC1 1 1 ΙΑΑΑΑΙΑΙ 1 1 1 1 GCT TTTAGCCATGCATCTGCTGATGAGCAATT GTGTCCATTTTTAACACAGCCAGTTAAATCCACCATGGG GCTTACTGGATTCAAGGGAATACGTTAGTCC ACAAAACATG1 11 1 CTGGTGCTCATCTCACATGCTATACT GTAAAACAG 1 111ATACAAAATTGTATGAC AAGTTCATTGCTCAAAAATGTACAG 1 1 11AAGAA11 1 1CTA TTAACTGCAGGTAATAATTAGCTGCATGC TGCAGACTCAACAAAGCTAGTTCACTGAAGCCTATGCTA 1 1 1 1ATGGATCATAGGCTCTTCAGAGAACTG AATGGCAGTCTGCCTTTGTGTTGATAATTATGTACATTGT GACGTTGTCATTTCTTAGCTTAAGTGTCCT CTTTAACAAGAGGATTGAGCAGACTGATGCCTGCATAAG ATGAATAAACAGGGTTAGTTCCATGTGAATC TGTCAGTTAAAAAGAAACAAAAACAGGCAGCTGGTTTGC TGTGGTGG 1 1 1 1AAATCATTAATTTGTATAA AGAAGTGAAAGAGTTGTATAGTAAATTAAATTGTAAACAA AAC 1 1 1 1 1 1AA1GCAA1GC1 11 AG 1A1 1 1 1 AGTACTGTAAAAAAATTAAATATATACATATATATATATAT ATATATATATATATATATGAGTTTGAAGC AGAATTCACATCATGATGGTGCTACTCAGCCTGCTACAA ATATATCATAATGTGAGCTAAGAATTCATTA AATGTTTGAGTGATGTTCCTACTTGTCATATACCTCAACA CTAGTTTGGCAATAGGATATTGAACTGAGA GTGAAAGCATTGTGTACCATCA1 1 1 1 1 11CCAAGTCCTTT 1 1 1 1 1ATTGTTAAAAAAAAAAGCATACCTT 1 1 1 1 CAATACTTGATTTCTTAGCAAGTATAACTTGAACTTC AACC 1 1 1 1 1 GTTCTAAAAATTCAGGGATA TTTCAGCTCATGCTCTCCCTATGCCAACATGTCACCTGTG TTTATGTAAAATTGTTGTAGGTTAATAAAT ATATTCTTTGTCAGGGATTTAACCC 1 1 1 1A1 1 1 1GAATCCC TTCTA1 1 1 1ACTTGTACATGTGCTGATGT AACTAAAACTAA1 1 11G1 AAA 1C1G11GGC1 C 1 11 11ATTG
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TAAAGAAAAGCAI 1 1 1AAAAGTTTGAGGA ATC 1 1 1 1GACTGTTTCAAGCAGGAAAAAAAAATTACATGA AAATAGAATGCACTGAGTTGATAAAGGGAA AAATTGTAAGGCAGGAGTTTGGCAAGTGGCTGTTGGCCA GAGACTTACTTGTAACTCTCTAAATGAAGTT TTTTTGATCCTGTAATCACTGAAGGTACATACTCCATGTG GACTTCCCTTAAACAGGCAAACACCTACAG GTATGGTGTGCAACAGATTGTACAATTACAI 1 1 IGGCCTA AATACA1 1 11 1 GCTTACTAGTATTTAAAAT AAATTCTTAATCAGAGGAGGCCTTTGGG 1 1 1 IATTGGTCA AATCTTTGTAAGCTGGC IIIIGICIIIIIA AAAAATTTCTTGAATTTGTGGTTGTGTCCAATTTGCAAAC ATTTCCAAAAATGTTTGCTTTGCTTACAAA CCACATGAI 11 IAAIGI11 1 1 1GTATACCATAATATCTAGC CCC AAAC ATTTG ATTACTAC ATGTG C ATT GGTGA1 1 1 1GATCATCCATTCTTAATATTTGATTTCTGTGT CACCTACTGTCATTTGTTAAACTGCTGGC CAACAAGAACAGGAAGTATAGTTTGGGGGGTTGGGGAG AGTTTACATAAGGAAGAGAAGAAATTGAGTGG CATATTGTAAATATCAGATCTATAATTGTAAATATAAAACC TGCCTCAGTTAGAATGAATGGAAAGCAGA TCT AC A ATTTG CT A AT AT AG G A AT ATC AG G TTG ACT AT AT AGCCATACTTGAAAATGCTTCTGAGTGGTG TCAACTTTACTTGAATGAATTTTTCATCTTGATTGACGCAC AGTGATGTACAGTTCACTTCTGAAGCTAG TGGTTAACTTGTGTAGGAAAC 1 1 1 1GCAGTTTGACACTAA GATAACTTCTGTGTGCA1 1 1 1 1 CTATGCTT 1 1 1 1AAAAAC1 AG 1 1 1 CA 1 1 1 CA 1 1 1 1 CATGAGATGTTTGG TTTATAAGATCTGAGGATGGTTATAAATA CTGTAAGTATTGTAATGTTATGAATGCAGGTTATTTGAAA GCTGTTTATTATTATATCATTCCTGATAAT GCTATGTGAGTGTTTTTAATAAAATTTATATTTATTTAATG CACTCTAA
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Metilcitosina dioxigenase tet 2 (TET2) de Homo sapiens, variante de transcrito 2, mRNA [SEQ ID Ns: 1361] NM 017628.4 AAACAGAAGGTGGGCCGGGGCGGGGAGAAACAGAACTC GGTCAATTTCCCAGTTTGTCGGGTCTTTAAAA ATACAGGCCCCTAAAGCACTAAGGGCATGCCCTCGGTG AAAC AG GG G AG CGCTTCTG CTG AATG AG ATTA AAGCGACAGAAAAGGGAAAGGAGAGCGCGGGCAACGG GATCTAAAGGGAGATAGAGACGCGGGCCTCTGA GGGCTGGCAAACATTCAGCAGCACACCCTCTCAAGATTG TTTACTTGCCTTTGCTCCTGTTGAGTTACAA CGCTTGGAAGCAGGAGATGGGCTCAGCAGCAGCCAATA GGACATGATCCAGGAAGAGCAGTAAGGGACTG AG CTG CTG A ATTC AACT AG AG G G C AG CCTTGTG G ATG G C CCCGAAGCAAGCCTGATGGAACAGGATAGAA CCAACCATGTTGAGGGCAACAGACTAAGTCCATTCCTGA TACCATCACCTCCCATTTGCCAGACAGAACC TCTGGCTACAAAGCTCCAGAATGGAAGCCCACTGCCTGA GAGAGCTCATCCAGAAGTAAATGGAGACACC AAGTGGCACTCTTTCAAAAGTTATTATGGAATACCCTGTA TGAAGGGAAGCCAGAATAGTCGTGTGAGTC CTGACTTTACACAAGAAAGTAGAGGGTATTCCAAGTGTTT GCAAAATGGAGGAATAAAACGCACAGTTAG TGAACCTTCTCTCTCTGGGCTCCTTCAGATCAAGAAATTG AAACAAGACCAAAAGGCTAATGGAGAAAGA CGTAACTTCGGGGTAAGCCAAGAAAGAAATCCAGGTGAA AGCAGTCAACCAAATGTCTCCGATTTGAGTG ATAAGAAAGAATCTGTGAGTTCTGTAGCCCAAGAAAATG CAGTTAAAGATTTCACCAG I I I I I CAACACA TAACTGCAGTGGGCCTGAAAATCCAGAGCTTCAGATTCT GAATGAGCAGGAGGGGAAAAGTGCTAATTAC CATGACAAGAACATTGTATTACTTAAAAACAAGGCAGTGC TAATGCCTAATGGTGCTACAGTTTCTGCCT CTTCCGTGGAACACACACATGGTGAACTCCTGGAAAAAA CACTGTCTCAATATTATCCAGATTGTGTTTC CATTGCGGTGCAGAAAACCACATCTCACATAAATGCCAT
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TAACAGTCAGGCTACTAATGAGTTGTCCTGT GAGATCACTCACCCATCGCATACCTCAGGGCAGATCAAT TCCG C AC AG ACCTCTAACTCTG AG CTG CCTC CAAAGCCAGCTGCAGTGGTGAGTGAGGCCTGTGATGCT GATGATGCTGATAATGCCAGTAAACTAGCTGC AATGCTAAATACCTGTTCCTTTCAGAAACCAGAACAACTA CAACAACAAAAATCAG1 1 1 1 1 GAGATATGC CCATCTCCTGCAGAAAATAACATCCAGGGAACCACAAAG CTAGCGTCTGGTGAAGAATTCTGTTCAGGTT CCAGCAGCAATTTGCAAGCTCCTGGTGGCAGCTCTGAAC GGTATTTAAAACAAAATGAAATGAATGGTGC TTACTTCAAGCAAAGCTCAGTGTTCACTAAGGATTCCTTT TCTGCCACTACCACACCACCACCACCATCA C AATTG CTTCTTTCTCCCCCTCCTCCTCTTCC AC AG GTTC CTCAGCTTCCTTCAGAAGGAAAAAGCACTC TGAATGGTGGAG 1 1 11AGAAGAACACCACCACTACCCCA ACCAAAGTAACACAACAC1 1 1 1AAGGGAAGT GAAAATAGAGGGTAAACCTGAGGCACCACCTTCCCAGAG TCCTAATCCATCTACACATGTATGCAGCCCT TCTCCGATGCTTTCTGAAAGGCCTCAGAATAATTGTGTGA ACAGGAATGACATACAGACTGCAGGGACAA TGACTGTTCCATTGTGTTCTGAGAAAACAAGACCAATGTC AGAACACCTCAAGCATAACCCACCAA1 1 1 1 TG GTAG CAGTG GAGAG CTACAGGACAACTG CCAGCAGT TGATGAGAAACAAAGAGCAAGAGATTCTGAAG GGTCGAGACAAGGAGCAAACACGAGATCTTGTGCCCCC AACACAGCACTATCTGAAACCAGGATGGATTG AATTGAAGGCCCCTCG 1 1 1 1 CACCAAGCGGAATCCCATC TAAAACGTAATGAGGCATCACTGCCATCAAT TCTTCAGTATCAACCCAATCTCTCCAATCAAATGACCTCC AAACAATACACTGGAAATTCCAACATGCCT GGGGGGCTCCCAAGGCAAGCTTACACCCAGAAAACAAC ACAGCTGGAGCACAAGTCACAAATGTACCAAG
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 116/678
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TTGAAATGAATCAAGGGCAGTCCCAAGGTACAGTGGACC AACATCTCCAGTTCCAAAAACCCTCACACCA GGTGCACTTCTCCAAAACAGACCATTTACCAAAAGCTCAT GTGCAGTCACTGTGTGGCACTAGATTTCAT TTTCAACAAAGAGCAGATTCCCAAACTGAAAAACTTATGT CCCCAGTGTTGAAACAGCACTTGAATCAAC AGGCTTCAGAGACTGAGCCAI 1 1 1 CAAAC 1 CACACC 1 1 1 1 G C AAC AT AAG CCTC AT AA AC AG G C AG CACA AACACAACCATCCCAGAGTTCACATCTCCCTCAAAACCA GCAACAGCAGCAAAAATTACAAATAAAGAAT AAAGAGGAAATACTCCAGAC1 1 1 1 CCTCACCCCCAAAGC AACAATGATCAGCAAAGAGAAGGATCATTCT TTGGCCAGACTAAAGTGGAAGAATG1111CATGGTGAAA ATCAGTATTCAAAATCAAGCGAGTTCGAGAC TCATAATGTCCAAATGGGACTGGAGGAAGTACAGAATAT AAATCGTAGAAATTCCCCTTATAGTCAGACC ATGAAATCAAGTGCATGCAAAATACAGGTTTCTTGTTCAA ACAATACACACCTAGTTTCAGAGAATAAAG AACAGACTACACATCCTGAACTTTTTGCAGGAAACAAGA CCCAAAACTTGCATCACATGCAATA1 1 1 1 CC AAATAATGTGATCCCAAAGCAAGATCTTCTTCACAGGTGC TTTCAAGAACAGGAGCAGAAGTCACAACAA GCTTCAGTTCTACAGGGATATAAAAATAGAAACCAAGATA TGTCTGGTCAACAAGCTGCGCAACTTGCTC AGCAAAGGTACTTGATACATAACCATGCAAATGTTTTTCC TGTGCCTGACCAGGGAGGAAGTCACACTCA GACCCCTCCCCAGAAGGACACTCAAAAGCATGCTGCTCT AAGGTGGCATCTCTTACAGAAGCAAGAACAG CAGCAAACACAGCAACCCCAAACTGAGTCTTGCCATAGT CAGATGCACAGGCCAATTAAGGTGGAACCTG GATGCAAGCCACATGCCTGTATGCACACAGCACCACCAG AAAACAAAACATGGAAAAAGGTAACTAAGCA AGAGAATCCACCTGCAAGCTGTGATAATGTGCAGCAAAA
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GAGCATCATTGAGACCATGGAGCAGCATCTG AAG CAGTTTC ACG CCAAGTCGTT ATTTG ACC AT AAGG CT CTTACTCTCAAATCACAGAAGCAAGTAAAAG TTGAAATGTCAGGGCCAGTCACAG 1 1 1 1 GACTAGACAAA CCACTGCTG CAGAACTTGATAG CCACACCCC AGCTTTAGAGCAGCAAACAACTTCTTCAGAAAAGACACC AACCAAAAGAACAGCTGCTTCTGTTCTCAAT AA 1 1 1 1ATAGAGTCACCTTCCAAATTACTAGATACTCCTAT AAAAAATTTATTGGATACACCTGTCAAGA CTCAATATGATTTCCCATCTTGCAGATGTGTAGGTAAGTG CCAGAAATGTACTGAGACACATGGCGTTTA TCCAGAATTAGCAAATTTATCTTCAGATATGGGAI 1 1 ICC TTC 1 1 1 1 1 1 1AAATCTTGAGTCTGGCAGCA ATTTGTAAAGGCTCATAAAAATCTGAAGCTTACATTTTTTG TCAAGTTACCGATGCTTGTGTCTTGTGAA AGAGAACTTCACTTACATGCAGTTTTTCCAAAAGAATTAA ATAATCGTGCATGTTTA1 1 1 1 1 CCCTCTCT TCAGATCCTGTAAAATTTGAATGTATCTG 1 1 1 1AGATCAAT TCGCCTATTTAGCTCTTTGTATATTATCT CCTG G AG AG AC AGCTAGG C AG C AAAAAAAC AATCTATTA AAATGAGAAAATAACGACCATAGGCAGTCTA ATGTACGAACTTTAAATA1 1 1 1 1 1AATTCAAGGTAAAATAT ATTAGTTTCACAAGATTTCTGGCTAATAG GGAAATTATTATCTTCAGTCTTCATGAGTTGGGGGAAATG ATAATGCTGACACTCTTAGTGCTCCTAAAG TTTCC 1 1 1 1 CTCCATTTATACATTTGGAATGTTGTGATTTA TATTCA1 111 GA 11CCC 1 1 11CTCTAAAA TTTCATCTTTTTGATTAAAAAATATGATACAGGCATACCTC AGAGATATTGTGGGTTTGGCTCCATACCA CAATAAAATGAATATTACAATAAAGCAAGTTGTAAGGACT 1 11 1GGTTTCTCACTGTATGTAAAAGTTAT TTATATACTATACTGTAAC ATACTAAGTGTG C AAT AG C ATT GTGTCTAAAAAATATATACTTTAAAAATA
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ATTTATTGTTAAAAAAATGCCAACAATTATCTGGGCCTTTA
GTGAGTGCTAATCTTTTTGCTGGTGGAGG
GTCGTGCTTCAGTATTGATCGCTGTGGACTGATCATGGT
GGTAGTTGCTGAAGGTTGCTGGGATGGCTGT
GTGTGTGGCAATTTCTTAAAATAAGACAACAGTGAAGTG
CTGTATCAATTGATTTTTCCATTCACAAAAG
ATTTCTCTGTAGCATGCAATGCTGTTTGATAGCATTTAAC
CCACAGCAGAATTTCTTTGAAAATTGGACT
CAGTCCTCTCAAACTGTGCTGCTGCTTTATCAACTAAGTT
TTTGTAATTTTCTGAATCCTTTGTTGTCAT
TTC AG C AG TTT AC AG C ATCTTC ATTG G A AG T AT ATTCC AT
CTCAAACATTCTTTGTTCATCCATAAGAAG
CAACTTCTTATCAAGTTTTTTCATGACATTGCAGTAACTCA
G CCCC ATCTTC AG GCTCTACTTCTAATTC
TGGTTCTCTTGCTACATCTCCCTCATCTGCAGTGACCTCT
CCACGGAAGTCTTGAACTCCTCAAAGTAAT
CCATGAGGGTTGGAATCAACTTCTAAACTCCTGTTAATGT
TGATATATTGACCCCCTCCCATGAATTATG
AATGTTCTTAATAACTTCTAAATGGTGATACCTTTCCAGA
AGGCTTTCAATGTACTTTGCCCGGATCCAT
CAGAAGACTATCTTGGCAGCTGTAGACTAACAATATATTT
CTTAAATGATAAGACTTGAAAGTCAAAAGT
ACTCCTTAATCCATAGGCTGCAGAATCAATGTTGTATTAA
CAGGCACGAAAACAGCATTAATCTTGTGCA
TCTCCATCGGAGCTCTTGGGTGACTAGGTGCCTTGAGCA
GTAATATTTTGAAAGGAGGTTTTGGTTTTGT
TTTTTGTTTTTTTTTTTTGTTTTTTAGCAGTAAGTCTCAACA CTG G G CTT A AA AT ATTC AGT A AACT ATG
TTGTAAAAAGATGTGTTATCATCCAGACTTTGTTGTTCCA
TTACTCTACACAAGCAGGGTACACTTAGCA
TAATTCTTAAGGGCCTTGGAATTTTCAGAATGGTAAATGA
GTATGGGCTTCAACTTAAAATCATCAACTG
C ATTAG CCTGTAAC AAG AG AGTC AG CCTGTCCTTTG AAG
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CAAGGCATTGACTTCTATCTATGAAAGTCTT AGATGGCACCTTGTTTCAATAGTAGGCTGTTTAGTACAG CCACCTTCATCAGTGATCTTAGCTAGATCTT CTGCATAACTTGCTGCAGCTTCTACATCAGCACTTGCTG CCTCACCTTGTCC1111ATGTTATAGAGACA G CTG CG CTTCTT A AACTTT AT A AACC A ACTTCTG CT AG CT TCC AACTTCTCTTCTG C AG CTTCCTC ATTC TCTTCATAGAACTGAAGGGAGTCAAGGCCTTGCTCTGGA TTAAGCTTTGGCTTAAGGAATGTTGTGGCTG ACGTGATCTTCTATCCAGACCACTAAAGCGCTCTCCATAT CAGCAATAAGGCCG 1 1 1 1 GCTTTCTTACCT TTCATGTGTTCACTGGAGTAATTTCCTTCAAGAATTTTTC CTTTACATTCACAACTTGGCTAACTGGCAT GCAAGGCCTAGCTTTCAGCCTGTCTTGGC1 1 1 1GACATG CCTTCCTCACTTAGCTCGTCATATCTAGCTT TTGATTTAAAGTGGCAGGCATACAACTCTTCCTTTCACTT GAACACTTAGAGGCCACTGTAGGGTTATTA ATTGGCCTAATTTCAATATTGTTGTG 1 1 1 IAGGGAATAGA GAGGCCCAGGGAGAGGGAGAGAGCCCAAAC GGCTGGTTGATAGAGCAGGCAGAATGCACACAACATTTA TCAGATTATGTTTGCACCATTTACCAGATTA TGGGTACGGTTTGTGGCACCCCCCAAAAATTAGAATAGT AACATCAAAGATCACTGATCACAGATCGCCA TAACATAAATAATAATAAACTTTAAAATACTGTGAGAATTA CCAAAATGTGATACAGAGACATGAAGTGA GCACATGCTGTTGAAAAAAATGACACTGATAGACATACTT AACACGTGGGATTGCCACAAACCTTCAGTT TGTAAAAGTCACAGTAACTGTGACTCACAAAAGAACAAA GCACAATAAAACGAGGTATGCCTGTA1 1 1 1 1 AAAAAAAGCTTTTTGTTAAAATTCAGGATATGTAATAGGT CTGTAGGAATAGTGAAATA1 1 1 1 IGCTGAT GGATGTAGATATATACGTGGATAGAGATGAAGATCTTAAT TATAGCTATGCAGCATAGATTTAGTCAAAG
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ACATTTGAAAAGACAAATGTTAAATTAGTGTGGCTAATGA CCTACCCGTGCCATG 1 1 1 1CCCTCTTGCAA TGAGATACCCCACACTGTGTAGAAGGATGGAGGGAGGA CTCCTACTGTCCCTCTTTGCGTGTGGTTATTA AGTTGCCTCACTGGGCTAAAACACCACACATCTCATAGA TAATATTTGGTAAGTTGTAATCGTCTTCACT CTTCTCTTATCACCCACCCCTATCTTCCCAC 1 1 1 1 CCATC TTTGTTGGTTTGCAACAGCCCCTTC 1 1 1 1 1 GCCTGACTCTCCAGGA1 1 1 1 CTCTCATCATAAATTGTTCT AAAGTACATACTAATATGGGTCTGGATTGA CTATTCTTATTTGCAAAACAGCAATTAAATGTTATAGGGA AGTAGGAAGAAAAAGGGGTATCCTTGACAA TAAACCAAGCAATATTCTGGGGGTGGGATAGAGCAGGAA A1 1 1 1A11 1 1 1AA1C1 1 11AAAATCCAAGTA ATAGGTAGGCTTCCAGTTAGCTTTAAATG 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CC AGCTCAAAAAATTGGATTGTAGTTGATAC TACATATAATACATTCTAATTCCCTCACTGTATTCTTTGTT TAGTTTCATTTATTTGGTTTAAAATAATT 1 11 1A1CCCA1A1C1GAAA1G1AA1A1A1 1 1 1 1ATCCAACA ACCAGCATGTACATATACTTAATTATGTG GCACA1 1 1 1 C1 AA 1 AGA 1 CAG 1 CCA 1 CAA1 C 1 AC 1 CA 1 1 1 1 AAAGAAAAAAAAA1 111AAAG1CAC1 1 1 1 AGAGCCCTTAATGTGTAGTTGGGGGTTAAGCTTTGTGGA TGTAGCCTTTATATTTAGTATAATTGAGGTC TAAAATAATAATCTTCTATTATCTCAACAGAGCAAATTATT GAAAAAGATGAAGGTCC1 1 1 1 1ATACCCA TCTAGGAGCAGGTCCTAATGTGGCAGCTATTAGAGAAAT CATGGAAGAAAGGTAATTAACGCAAAGGCAC AGGGCAGATTAACGTTTATCC 1 1 1 1 GTATATGTCAGAATT TTTCCAGCCTTCACACACAAAGCAGTAAAC AATTGTAAATTGAGTAATTATTAGTAGGCTTAGCTATTCTA GGGTTGCCAACACTACACACTGTGCTATT CACCAGAGAGTCACAATATTTGACAGGACTAATAGTCTG
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CTAGCTGGCACAGGCTGCCCACTTTGCGATG GATGCCAGAAAACCCAGGCATGAACAGGAATCGGCCAG CCAGGCTGCCAGCCACAAGGTACTGGCACAGG CTCCAACGAGAGGTCCCACTCTGGCTTTCCCACCTGATA ATAAAGTGTCAAAGCAGAAAGACTGGTAAAG TGTGGTATAAGAAAAGAACCACTGAATTAAATTCACCTAG TGTTGCAAATGAGTACTTATCTCTAAGTTT TC 1 1 1 1ACCATAAAAAGAGAGCAAGTGTGATATGTTGAAT AGAAAGAGAAACATACTATTTACAGCTGCC 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 11CGCTATCAATCACAGGTATACAAGTA CTTGCCTTTACTCCTGCATGTAGAAGACT CTTATGAGCGAGATAATGCAGAGAAGGCCTTTCATATAA ATTTATACAGCTCTGAGCTGTTCTTCTTCTA GGGTGCC 1 1 1 1 CATTAAGAGGTAGGCAGTATTATTATTAA AGTACTTAGGATACATTGGGGCAGCTAGGA CATATTCAGTATCATTCTTGCTCCATTTCCAAATTATTCAT TTCTAAATTAGCATGTAGAAGTTCACTAA ATAATCATCTAGTGGCCTGGCAGAAATAGTGAATTTCCCT AAGTGCC 1 1 1 1 1 1 1 1 G 1 1 G 1 1 1 1 1 1 1GTTT TGTTTTTTAAACAAGCAGTAGGTGGTGCTTTGGTCATAAG GGAAGATATAGTCTATTTCTAGGACTATTC CATAI 1 1 ICCATGTGGCTGGATACTAACTATTTGCCAGCC TCC 1 1 1 1 CTAAATTGTGAGACATTCTTGGA GGAACAGTTCTAACTAAAATCTATTATGACTCCCCAAGTT TTAAAATAGCTAAATTTAGTAAGGGAAAAA ATAGTTTATG 1 1 1 1AGAAGACTGAACTTAGCAAACTAACC TGAA11 11G1GC1 11G1GAAA1 1 11ATATC GAAATGAGCTTTCCCA1 1 1 1 CACCCACATGTAATTTACAA AATAGTTCATTACAATTATCTGTACA1111 GATATTGAGGAAAAACAAGGCTTAAAAACCATTATCCAGT TTGCTTGGCGTAGACCTGTTTAAAAAATAA TAAACCGTTCATTTCTCAGGATGTGGTCATAGAATAAAGT TATG CTC AAATGTTCAAATATTTAAA
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PREVISTA: Metilcitosina dioxigenase tet 2 (TET2) de Homo sapiens, variante de transcrito X9, mRNA [SEQ ID Ns: 1362] XM 0115320 44.1 TCAGGCTCTACTTCTAATTCTGGTTCTCTTGCTACATCTC CCTCATCTGCAGTGACCTCTCCACGGAAGT CTTGAACTCCTCAAAAGCAAATTATTGAAAAAGATGAAGG TCC I I I I IATACCCATCTAGGAGCAGGTCC TAATGTGGCAGCTATTAGAGAAATCATGGAAGAAAGGTT TG G AC AG AAGG GTAAAG CTATTAG G ATTG AA AGAGTCATCTATACTGGTAAAGAAGGCAAAAGTTCTCAG GGATGTCCTATTGCTAAGTGGGTGGTTCGCA GAAGCAGCAGTGAAGAGAAGCTACTGTGTTTGGTGCGG GAGCGAGCTGGCCACACCTGTGAGGCTGCAGT GATTGTGATTCTCATCCTGGTGTGGGAAGGAATCCCGCT GTCTCTGGCTGACAAACTCTACTCGGAGCTT ACCGAGACGCTGAGGAAATACGGCACGCTCACCAATCG CCGGTGTGCCTTGAATGAAGAGAGAACTTGCG CCTGTCAGGGGCTGGATCCAGAAACCTGTGGTGCCTCC TTCTC I I I I GGTTGTTCATGGAGCATGTACTA C AATG G ATGTAAGTTTGCC AG AAG C AAG ATCCC AAG G AA GTTTAAGCTGCTTGGGGATGACCCAAAAGAG GAAGAGAAACTGGAGTCTCATTTGCAAAACCTGTCCACT CTTATGG CACC AAC ATATAAG AAACTTG C AC CTGATGCATATAATAATCAGATTGAATATGAACACAGAGC ACCAGAGTGCCGTCTGGGTCTGAAGGAAGG CCGTCCATTCTCAGGGGTCACTGCATGTTTGGACTTCTG TG CTCATG CCCACAGAGACTTG CACAACATG CAGAATGGCAGCACATTGGTATGCACTCTCACTAGAGAA G AC AATCG AG AATTTG G AG G AAAACCTG AG G ATGAGCAGCTTCACGTTCTGCCTTTATACAAAGTCTCTGA CGTGGATGAGTTTGGGAGTGTGGAAGCTCA GGAGGAGAAAAAACGGAGTGGTGCCATTCAGGTACTGA GTTC I I I I CGGCGAAAAGTCAGGATGTTAGCA GAGCCAGTCAAGACTTGCCGACAAAGGAAACTAGAAGC CAAGAAAGCTGCAGCTGAAAAGCTTTCCTCCC TGGAGAACAGCTCAAATAAAAATGAAAAGGAAAAGTCAG
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CCCCATCACGTACAAAACAAACTGAAAACGC AAGCCAGGCTAAACAGTTGGCAGAAC 1 1 1 1 GCGACTTTC AGGACCAGTCATGCAGCAGTCCCAGCAGCCC CAGCCTCTACAGAAGCAGCCACCACAGCCCCAGCAGCA GCAGAGACCCCAGCAGCAGCAGCCACATCACC CTCAGACAGAGTCTGTCAACTCTTATTCTGCTTCTGGATC CACCAATCCATACATGAGACGGCCCAATCC AGTTAGTCCTTATCCAAACTCTTCACACACTTCAGATATC TATG G AAG C ACC AG CCCTATG AACTTCT AT TCCACCTCATCTCAAGCTGCAGGTTCATATTTGAATTCTT CTAATCCCATGAACCCTTACCCTGGGCTTT TGAATCAGAATACCCAATATCCATCATATCAATGCAATGG AAACCTATCAGTGGACAACTGCTCCCCATA TCTGGGTTCCTATTCTCCCCAGTCTCAGCCGATGGATCT GTATAGGTATCCAAGCCAAGACCCTCTGTCT AAGCTCAGTCTACCACCCATCCATACACTTTACCAGCCA AGGTTTGGAAATAGCCAGAG 1 1 1 1ACATCTA AATACTTAGGTTATGGAAACCAAAATATGCAGGGAGATG GTTTCAGCAGTTGTACCATTAGACCAAATGT ACATCATGTAGGGAAATTGCCTCCTTATCCCACTCATGA GATGGATGGCCACTTCATGGGAGCCACCTCT AGATTACCACCCAATCTGAGCAATCCAAACATGGACTATA AAAATGGTGAACATCATTCACCTTCTCACA TAATCCATAACTACAGTGCAGCTCCGGGCATGTTCAACA G CTCTCTTC ATG CCCTGC ATCTCC AAAAC AA GGAGAATGACATGCTTTCCCACACAGCTAATGGGTTATC AAAGATGCTTCCAGCTCTTAACCATGATAGA ACTGCTTGTGTCCAAGGAGGCTTACACAAATTAAGTGAT GCTAATGGTCAGGAAAAGCAGCCATTGGCAC TAGTCCAGGGTGTGGCTTCTGGTGCAGAGGACAACGAT GAGGTCTGGTCAGACAGCGAGCAGAGCTTTCT GGATCCTGACATTGGGGGAGTGGCCGTGGCTCCAACTC ATGG GTC AATTCTCATTG AGTGTG C AAAG CGT
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GAGCTGCATGCCACAACCCCTTTAAAGAATCCCAATAGG AATCACCCCACCAGGATCTCCCTCGTC1 1 1 1 ACCAGCATAAGAGCATGAATGAGCCAAAACATGGCTTGG CTCTTTGGGAAGCCAAAATGGCTGAAAAAGC CCGTGAGAAAGAGGAAGAGTGTGAAAAGTATGGCCCAG ACTATGTG CCTCAGAAATCCCATGG CAAAAAA GTGAAACGGGAGCCTGCTGAGCCACATGAAACTTCAGA GCCCACTTACCTGCGTTTCATCAAGTCTCTTG CCGAAAGGACCATGTCCGTGACCACAGACTCCACAGTAA CTACATCTCCATATGCCTTCACTCGGGTCAC AGGGCCTTACAACAGATATATATGATATCACCCCC 1 1 1 1 G TTGGTTACCTCACTTGAAAAGACCACAACC AACCTGTCAGTAGTATAGTTCTCATGACGTGGGCAGTGG GGAAAGGTCACAGTATTCATGACAAATGTGG TGGGAAAAACCTCAGCTCACCAGCAACAAAAGAGGTTAT CTTACCATAGCACTTAAI 1 1 ICACTGGCTCC CAAGTGGTCACAGATGGCATCTAGGAAAAGACCAAAGCA TTCTATGCAAAAAGAAGGTGGGGAAGAAAGT GTTCCGCAATTTACATTTTTAAACACTGGTTCTATTATTGG ACGAGATGATATGTAAATGTGATCCCCCC CCCCCGCTTACAACTCTACACATCTGTGACCACI 1 1 IAAT AATATCAAGTTTGCATAGTCATGGAACACA AATCAAACAAGTACTGTAGTATTACAGTGACAGGAATCTT AAAATACCATCTGGTGCTGAATATATGATG TACTGAAATACTGGAATTATGGCTTTTTGAAATGCAGTTT TTACTGTAATCTTAAC111 1ATTTATCAAA ATAGCTACAGGAAACATGAATAGCAGGAAAACACTGAAT TTGTTTGGATGTTCTAAGAAATGGTGCTAAG AAAATGGTGTCTTTAATAGCTAAAAATTTAATGCCTTTATA TCATCAAGATGCTATCAGTGTACTCCAGT GCCCTTGAATAATAGGGGTACC 1 1 1 ICAI 1 CAAG 1 1 1 1 IA TCATAATTACCTATTCTTACACAAGCTTAG 1 1 1 1 1AAAA1 G 1 GGACA1 1 1 1AAAGGCC 1 C 1 GGA1 1 1 IGC
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TCATCCAGTGAAGTCCTTGTAGGACAATAA ACGTATATATGTACATATATACACAAACATGTATATGTGC ACACACATGTATATGTATAAATA1 1 1 1AAA TGGTG 1 1 1 1AGAAGCACTTTGTCTACCTAAGCTTTGACAA CTTGAACAATGCTAAGGTACTGAGATGTTT AAAAAACAAGTTTACTTTCA1 1 1 1AGAATGCAAAGTTGATT 1 1 1 1 1AAGGAAACAAAGAAAGC 1 1 1 1 AAA ATAI 1 1 1 IGCI 1 1 1AGCCATGCATCTGCTGATGAGCAATT GTGTCCAI1 1 1 1AACACAGCCAGTTAAATC CACCATGGGGCTTACTGGATTCAAGGGAATACGTTAGTC CACAAAACATG1 11 1 CTGGTGCTCATCTCAC ATGCTATACTGTAAAACAG11 1 1ATACAAAATTGTATGACA AGTTCATTGCTCAAAAATGTACAG1 11 1A AGAA1 1 1 1 CTATTAACTGCAGGTAATAATTAGCTGCATGC TGCAGACTCAACAAAGCTAGTTCACTGAAG CCTATGCTAI 1 1 1ATGGATCATAGGCTCTTCAGAGAACTG AATGGCAGTCTGCCTTTGTGTTGATAATTA TGTACATTGTGACGTTGTCATTTCTTAGCTTAAGTGTCCT CTTTAACAAGAGGATTGAGCAGACTGATGC CTGCATAAGATGAATAAACAGGGTTAGTTCCATGTGAATC TGTCAGTTAAAAAGAAACAAAAACAGGCAG CTGGTTTGCTGTGGTGG 1 1 1 1AAATCATTAATTTGTATAA AGAAGTGAAAGAGTTGTATAGTAAATTAAA TTGTAAACAAAAC1 1 1 1 1 1AA1GCAA1GC1 11 AG 1A11 1 1A GTACTGTAAAAAAATTAAATATATACATA TATATATATATATATATATATATATATATGAGTTTGAAGCA GAATTCACATCATGATGGTGCTACTCAGC CTGCTACAAATATATCATAATGTGAGCTAAGAATTCATTA AATGTTTGAGTGATGTTCCTACTTGTCATA TACCTCAACACTAGTTTGGCAATAGGATATTGAACTGAGA GTGAAAGCATTGTGTACCATCA1 1 1 1 1 1 1 C CAAGTCC 1 1 1 1 1 1 1 1ATTGTTAAAAAAAAAAGCATACCTTT TTTCAATACTTGATTTCTTAGCAAGTATA
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 126/678
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ACTTGAACTTCAACCTTTTTGTTCTAAAAATTCAGGGATAT TTCAGCTCATGCTCTCCCTATGCCAACAT GTCACCTGTGTTTATGTAAAATTGTTGTAGGTTAATAAAT ATATTCTTTGTCAGGGATTTAACCC 1 1 1 1A 1 1 1 1GAA1 CCC 1 1 C1A1 1 1 1ACTTGTACATGTGCTGATGTA ACTAAAACTAAI111GTAAATCTGTTGGC TC 1 1 1 1 1A1 1 G 1AAAGAAAAGCA1 1 1 1AAAAGTTTGAGGAA TC 1 1 1 1 GACTGTTTCAAGCAGGAAAAAAA AATTACATGAAAATAGAATGCACTGAGTTGATAAAGGGAA AAATTGTAAGGCAGGAGTTTGGCAAGTGGC TGTTGGCCAGAGACTTACTTGTAACTCTCTAAATGAAGTT 1 1 1 1 1GATCCTGTAATCACTGAAGGTACAT ACTCCATGTGGACTTCCCTTAAACAGGCAAACACCTACA GGTATGGTGTGCAACAGATTGTACAATTACA 1 1 1 IGGCCIAAAIACAI 1 1 1 1 GCTTACTAGTATTTAAAATA AATTCTTAATCAGAGGAGGCCTTTGGGTT TTATTGGTCAAATCTTTGTAAGCTGGC1 1 1 1 G 1 C1 1 1 1 1AA AAAATTTCTTGAATTTGTGGTTGTGTCCA ATTTGCAAACATTTCCAAAAATGTTTGCTTTGCTTACAAAC CACATGAI1 1IAAIGI 11 1 1 1 GTATACCA TAATATCTAGCCCCAAACATTTGATTACTACATGTGCATT GGTGA1 1 1 1GATCATCCATTCTTAATATTT GATTTCTGTGTCACCTACTGTCATTTGTTAAACTGCTGGC CAACAAGAACAGGAAGTATAGTTTGGGGGG TTGGGGAGAGTTTACATAAGGAAGAGAAGAAATTGAGTG G C ATATTGTAAATATC AG ATCTATAATTGTA AATATAAAACCTGCCTCAGTTAGAATGAATGGAAAGCAG ATCTACAATTTGCTAATATAGGAATATCAGG TTG ACT AT AT AG CC ATACTTG AAAATG CTTCTG AGTG GTG TCAACTTTACTTGAATGAA1 11 11CATCTT GATTGACGCACAGTGATGTACAGTTCACTTCTGAAGCTA GTGGTTAACTTGTGTAGGAAAC 1 1 1 1 GCAGT TTGACACTAAGATAACTTCTGTGTGCATTTTTCTATGCTTT
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TTTAAAAACTAGTTTCATTTCAI I I I CAT GAGATGTTTGGTTTATAAGATCTGAGGATGGTTATAAATA CTGTAAGTATTGTAATGTTATGAATGCAGG TTATTTGAAAGCTGTTTATTATTATATCATTCCTGATAATG CTATGTGAGTG I I I I IAATAAAATTTATA TTTATTTAATGCACTCTAA
PREVISTA: Metilcitosina dioxigenase tet 2 (TET2) de Homo sapiens, variante de transcrito X7, mRNA [SEQ ID Ns: 1363] XM 0115320 43.1 GTAGAGAAGCAGAAGGAAGCAAGATGGCTGCCCTTTAG GATTTGTTAGAAAGGAGACCCGACTGCAACTG CTGGATTGCTGCAAGGCTGAGGGACGAGAACGAGGCTG GCAAACATTCAGCAGCACACCCTCTCAAGATT GTTTACTTGCCTTTGCTCCTGTTGAGTTACAACGCTTGGA AGCAGGAGATGGGCTCAGCAGCAGCCAATA GGACATGATCCAGGAAGAGCAGTAAGGGACTGAGCTGC TG AATTC AACTAG AGGG C AG CCTTGTG G ATG G CCCCGAAGCAAGCCTGATGGAACAGGATAGAACCAACC ATGTTGAGGGCAACAGACTAAGTCCATTCCTG ATACCATCACCTCCCATTTGCCAGACAGAACCTCTGGCT ACAAAGCTCCAGAATGGAAGCCCACTGCCTG AGAGAGCTCATCCAGAAGTAAATGGAGACACCAAGTGGC ACTCTTTCAAAAGTTATTATG G AATACCCTG TATGAAGGGAAGCCAGAATAGTCGTGTGAGTCCTGACTT TACACAAGAAAGTAGAGGGTATTCCAAGTGT TTGCAAAATGGAGGAATAAAACGCACAGTTAGTGAACCT TCTCTCTCTGGGCTCCTTCAGATCAAGAAAT TGAAACAAGACCAAAAGGCTAATGGAGAAAGACGTAACT TCGGGGTAAGCCAAGAAAGAAATCCAGGTGA AAGCAGTCAACCAAATGTCTCCGATTTGAGTGATAAGAA AGAATCTGTGAGTTCTGTAGCCCAAGAAAAT G CAGTTAAAGATTTCACCAG I I I I ICAACACATAACTG CA GTGGGCCTGAAAATCCAGAGCTTCAGATTC TGAATGAGCAGGAGGGGAAAAGTGCTAATTACCATGACA AGAACATTGTATTACTTAAAAACAAGGCAGT GCTAATGCCTAATGGTGCTACAGTTTCTGCCTCTTCCGT
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GGAACACACACATGGTGAACTCCTGGAAAAA ACACTGTCTCAATATTATCCAGATTGTGTTTCCATTGCGG TG C AG AAAACC AC ATCTC AC ATAAATG CC A TTAACAGTCAGGCTACTAATGAGTTGTCCTGTGAGATCA CTCACCCATCGCATACCTCAGGGCAGATCAA TTCCGCACAGACCTCTAACTCTGAGCTGCCTCCAAAGCC AGCTGCAGTGGTGAGTGAGGCCTGTGATGCT GATGATGCTGATAATGCCAGTAAACTAGCTGCAATGCTA AATACCTGTTCCTTTCAGAAACCAGAACAAC TACAACAACAAAAATCAGTTTTTGAGATATGCCCATCTCC TGCAGAAAATAACATCCAGGGAACCACAAA GCTAGCGTCTGGTGAAGAATTCTGTTCAGGTTCCAGCAG CAATTTGCAAGCTCCTGGTGGCAGCTCTGAA CGGTATTTAAAACAAAATGAAATGAATGGTGCTTACTTCA AGCAAAGCTCAGTGTTCACTAAGGATTCCT TTTCTGCCACTACCACACCACCACCACCATCACAATTGCT TCTTTCTCCCCCTCCTCCTCTTCC AC AG GT TCCTCAGCTTCCTTCAGAAGGAAAAAGCACTCTGAATGG TGGAG11 1 1AGAAGAACACCACCACTACCCC AACCAAAGTAACACAACAC 1 1 1 1AAGGGAAGTGAAAATAG AGGGTAAACCTGAGGCACCACCTTCCCAGA GTCCTAATCCATCTACACATGTATGCAGCCCTTCTCCGAT GCTTTCTGAAAGGCCTCAGAATAATTGTGT GAACAGGAATGACATACAGACTGCAGGGACAATGACTGT TCCATTGTGTTCTGAGAAAACAAGACCAATG TCAGAACACCTCAAG CATAACCCACCAA1 1 1 1 IGGTAGCA GTGGAGAGCTACAGGACAACTGCCAGCAGT TGATGAGAAACAAAGAGCAAGAGATTCTGAAGGGTCGAG ACAAGGAGCAAACACGAGATCTTGTGCCCCC AACACAGCACTATCTGAAACCAGGATGGATTGAATTGAA GGCCCCTCG 1 1 1 1CACCAAGCGGAATCCCAT CTAAAACGTAATGAGGCATCACTGCCATCAATTCTTCAGT ATCAACCCAATCTCTCCAATCAAATGACCT
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CCAAACAATACACTGGAAATTCCAACATGCCTGGGGGGC TCCCAAGGCAAGCTTACACCCAGAAAACAAC ACAGCTGGAGCACAAGTCACAAATGTACCAAGTTGAAAT GAATCAAGGGCAGTCCCAAGGTACAGTGGAC CAACATCTCCAGTTCCAAAAACCCTCACACCAGGTGCAC TTCTCCAAAACAGACCATTTACCAAAAGCTC ATGTGCAGTCACTGTGTGGCACTAGATTTCA1 1 1 1CAACA AAGAGCAGATTCCCAAACTGAAAAACTTAT GTCCCCAGTGTTGAAACAGCACTTGAATCAACAGGCTTC AGAGACTGAGCCA1 1 1 1CAAACTCACACCTT TTGCAACATAAGCCTCATAAACAGGCAGCACAAACACAA CCATCCCAGAGTTCACATCTCCCTCAAAACC AGCAACAGCAGCAAAAATTACAAATAAAGAATAAAGAGG AAATACTCCAGAC1111CCTCACCCCCAAAG CAACAATGATCAGCAAAGAGAAGGATCATTCTTTGGCCA GACTAAAGTGGAAGAATG 1 1 1 1 CATGGTGAA AATCAGTATTCAAAATCAAGCGAGTTCGAGACTCATAATG TCCAAATGGGACTGGAGGAAGTACAGAATA TAAATCGTAGAAATTCCCCTTATAGTCAGACCATGAAATC AAGTGCATGCAAAATACAGGTTTCTTGTTC AAACAATACACACCTAGTTTCAGAGAATAAAGAACAGACT ACACATCCTGAAC1 1 1 1 1GCAGGAAACAAG ACCCAAAACTTGCATCACATGCAATA1 1 1 1 CCAAATAATG TGATCCCAAAGCAAGATCTTCTTCACAGGT GCTTTCAAGAACAGGAGCAGAAGTCACAACAAGCTTCAG TTCTACAGGGATATAAAAATAGAAACCAAGA TATGTCTGGTCAACAAGCTGCGCAACTTGCTCAGCAAAG GTACTTGATACATAACCATGCAAATG11 1 1 1 CCTGTGCCTGACCAGGGAGGAAGTCACACTCAGACCCC TCCCC AG AAG G AC ACTC AAAAG C ATGCTG CTC TAAGGTGGCATCTCTTACAGAAGCAAGAACAGCAGCAAA CACAGCAACCCCAAACTGAGTCTTGCCATAG TCAGATGCACAGGCCAATTAAGGTGGAACCTGGATGCAA
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G CCACATG CCTGTATG CACACAG CACCACCA G AAAAC AAAAC ATG G AAAAAG GTAACTAAG C AAG AG AAT CC ACCTGC AAG CTGTG ATAATGTG C AG C AAA AGAGCATCATTGAGACCATGGAGCAGCATCTGAAGCAGT TTC ACG CC AAGTCGTTATTTG ACC ATAAG GC TCTTACTCTCAAATCACAGAAGCAAGTAAAAGTTGAAATG TCAGGGCCAGTCACAG 1 1 1 1 GACTAGACAA ACCACTGCTGCAGAACTTGATAGCCACACCCCAGCTTTA G AG C AG C AAAC AACTTCTTC AG AAAAG AC AC CAACCAAAAGAACAGCTGCTTCTGTTCTCAATAA1 1 1 1 AT AGAGTCACCTTCCAAATTACTAGATACTCC TATAAAAAATTTATTGGATACACCTGTCAAGACTCAATAT GATTTCCCATCTTGCAGATGTGTAGAGCAA ATTATTGAAAAAGATGAAGGTCCTTTTTATACCCATCTAG G AG C AG GTCCT AATGTG G C AG CT ATT AG AG AAATCATGGAAGAAAGGTATACAAGTACTTGCCTTTACTC CTG C ATGTAG AAG ACTCTTATG AG CG AG AT AATGCAGAGAAGGCCTTTCATATAAATTTATACAGCTCTG AGCTGTTCTTCTTCTAGGGTGCC1 1 1 1 CAT TAAGAGGTAGGCAGTATTATTATTAAAGTACTTAGGATAC ATTGGGGCAGCTAGGACATATTCAGTATCA TTCTTGCTCCATTTCCAAATTATTCATTTCTAAATTAGCAT GTAGAAGTTCACTAAATAATCATCTAGTG GCCTGGCAGAAATAGTGAATTTCCCTAAGTGCC Ilillll TGTTG11 1 1 1 1 1 G 1 1 1 1G 1 1 1 1 1 1AAACAA GCAGTAGGTGGTGCTTTGGTCATAAGGGAAGATATAGTC TATTTCTAGGACTATTCCATA1 1 1 1 CCATGT GGCTGGATACTAACTATTTGCCAGCCTCC1 1 1 1 CTAAATT GTGAGACATTCTTGGAGGAACAGTTCTAAC TAAAATCTATTATGACTCCCCAAG 1 1 1 1AAAATAGCTAAAT TTAGTAAGGGAAAAAATAGTTTATG 1 1 1 1 AGAAGACTGAACTTAGCAAACTAACCTGAAI111GTGCTT TGTGAAA1 1 1 1ATATCGAAATGAGCTTTCC
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CA 1 1 1 1 CACCCACATGTAATTTACAAAATAGTTCATTACAA TTATCTGTACAI 1 1 1 GATATTGAGGAAAA ACAAGGCTTAAAAACCATTATCCAGTTTGCTTGGCGTAGA CCTGTTTAAAAAATAATAAACCGTTCATTT CTCAGGATGTGGTCATAGAATAAAGTTATGCTCAAATGTT CAAA
[0223] O inibidor de Tet ou inibidor de Tet[x] (por exemplo, inibidor de Tet1, inibidor de Tet2 ou inibidor de Tet3), como os termos são usados aqui, se relaciona com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema) que reduz ou elimina a função e/ou expressão do Tet correspondente, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Em modalidades, um inibidor de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 é uma molécula que inibe a expressão de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, por exemplo, reduz ou elimina a expressão de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Em modalidades, o inibidor de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 é uma molécula que inibe a função de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Um exemplo de inibidor de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 que inibe a expressão de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 é um sistema de edição genética, por exemplo, como descrito aqui, que é direcionado para ácido nucleico dentro do gene Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, ou seus elementos reguladores, de modo que a modificação do ácido nucleico no(s) sítio(s) de ligação do sistema de edição genética ou perto deste(s) é modificada para reduzir ou eliminar a expressão de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Outro exemplo de um inibidor de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 que inibe a expressão de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 é uma molécula de ácido
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127/606 nucleico, por exemplo, molécula de RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), capaz de hibridar com mRNA de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 e causar uma redução ou eliminação da tradução de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Inibidores de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 também incluem ácidos nucleicos codificando moléculas que inibem a expressão de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 (por exemplo, ácido nucleico codificando um shRNA ou siRNA anti-Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, ou ácido nucleico codificando um ou mais, por exemplo, todos, dos componentes de um sistema de edição genética anti-Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Um exemplo de uma molécula que inibe a função de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 é uma molécula, por exemplo, uma proteína ou molécula pequena que inibe uma ou mais atividades de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Um exemplo é um inibidor de molécula pequena de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Outro exemplo é uma proteína Tet negativa dominante, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Outro exemplo é uma versão negativa dominante de um parceiro de ligação de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, por exemplo, uma histona desacetilase (HDAC) associada. Outro exemplo é uma molécula, por exemplo, uma molécula pequena, que inibe um parceiro de ligação de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, por exemplo, um inibidor de HDAC associado a Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2. Inibidores de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2 também incluem ácidos nucleicos codificando inibidores da função de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2.
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[0224] Os termos inibidor de IFNG e inibidor de IFN-γ são usados aqui alternadamente e se relacionam com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema), que reduz ou elimina a expressão e/ou função de IFN-γ. Inibidores de IFN-γ incluem todos os antagonistas ou inibidores de todas as formas adequadas de IFN-γ, receptores de IFN-γ (por exemplo, receptor de IFN-γ 1 e/ou receptor de IFN-γ 2) ou efetores de IFN-γ (por exemplo, TNFSF14, TNFRSF3, TNFRSF14 ou TNFRSF6B). Inibidores de IFN-γ exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um sistema de edição genética visando o gene IFN-γ ou um seu elemento regulador; uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, molécula de RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), que reduz a tradução de IFN-γ; e uma proteína, peptideo ou molécula pequena que inibe uma ou mais atividades de IFN-γ.
[0225] Um inibidor de NOTCH2, como o termo é usado aqui, se relaciona com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema), que reduz ou elimina a expressão e/ou função de NOTCH2. Inibidores de Notch2 exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um sistema de edição genética visando o gene NOTCH2 ou um seu elemento regulador; uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, molécula de RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), que reduz a tradução de NOTCH2; e uma proteína, peptideo ou molécula pequena que inibe uma ou mais atividades de NOTCH2.
[0226] Um inibidor de IL2RA, como o termo é usado aqui, se relaciona com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema), que reduz ou elimina a expressão e/ou função de IL2RA. Inibidores de IL2RA exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um sistema de edição genética visando o gene IL2RA ou um seu elemento regulador; uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, molécula de
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RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), que reduz a tradução de IL2RA; e uma proteína, peptídeo ou molécula pequena que inibe uma ou mais atividades de IL2RA.
[0227] Um inibidor de PRDM1, como o termo é usado aqui, se relaciona com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema), que reduz ou elimina a expressão e/ou função de PRDM1. Inibidores de PRDM1 exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um sistema de edição genética visando o gene PRDM1 ou um seu elemento regulador; uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, molécula de RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), que reduz a tradução de PRDM1; e uma proteína, peptídeo ou molécula pequena que inibe uma ou mais atividades de PRDM1.
[0228] Um gene associado a Tet2, como usado aqui, se relaciona com um gene cuja estrutura, expressão e/ou função, ou um gene codificando um produto genético (por exemplo, um mRNA ou um polipeptideo) cuja estrutura, expressão e/ou função, estão associadas a (por exemplo, afetadas ou moduladas por) Tet2. O gene associado a Tet2 não inclui um gene Tet2.
[0229] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes descritos aqui. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes descritos na Tabela 8. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes descritos na Tabela 9.
[0230] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou todos os) genes escolhidos de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
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[0231] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende PRDM1.
[0232] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e NOTCH2. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28 e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IGOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IGOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IL2RA e PRDM1.
[0233] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e CD28. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e IGOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2 e
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PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28 e ICOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28 e ICOS. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende ICOS, IL2RA e PRDM1.
[0234] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, ICOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, ICOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2
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132/606 compreende IFNG, CD28, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, IGOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, IGOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, IL2RA e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, IGOS e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, IGOS e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28 e PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28 e IL2RA. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28 e ICOS.
[0235] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS e IL2RA. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, IL2RA e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1. Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1.
[0236] Em algumas modalidades, o gene associado a Tet2 compreende IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1.
[0237] Em certas modalidades, a expressão e/ou função do gene associado a Tet2 são alteradas quando a expressão e/ou função de Tet2 são inibidas. Em algumas modalidades, a expressão e/ou função do gene associado a Tet2 são reduzidas ou eliminadas quando a expressão e/ou função de Tet2 são inibidas. Em outras modalidades, a expressão e/ou função do gene associado a Tet2 são aumentadas ou
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133/606 ativadas quando a expressão e/ou função de Tet2 são inibidas.
[0238] Em algumas modalidades, o gene ou produto genético associado a Tet2 é um membro de uma via biológica associada a Tet2 (por exemplo, associada a inibição de Tet2). Em certas modalidades, o gene ou produto genético associado a Tet2 está a jusante de Tet2 na via. Em uma modalidade, o gene ou produto genético associado a Tet2 está a montante de Tet2 na via.
[0239] Em certas modalidades, o gene associado a Tet2 codifica um produto genético (por exemplo, um polipeptídeo) que interage, direta ou indiretamente, com Tet2 (por exemplo, um gene ou produto genético Tet2). Em outras modalidades, o gene associado a Tet2 codifica um produto genético (por exemplo, um polipeptídeo) que não interage com Tet2 (por exemplo, um gene ou produto genético Tet2).
[0240] Como usado aqui, um modulador de um gene associado a Tet2 se relaciona com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema) que modula (por exemplo, reduz ou elimina, ou aumenta ou ativa) a função e/ou expressão de um gene associado a Tet2. Em certas modalidades, o modulador reduz ou elimina a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2. Em outra modalidade, o modulador aumenta ou ativa a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2. Em certas modalidades, o modulador é um inibidor de um gene associado a Tet2. Em outras modalidades, o modulador é um ativador de um gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, o modulador é um sistema de edição genética que é direcionado para ácido nucleico dentro do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador, por exemplo, de modo que o ácido nucleico é modificado no(s) sítio(s) de ligação do sistema de edição genética ou perto deste(s) para modular a expressão e/ou função do gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, o modulador é um componente do sistema de edição genética, ou um ácido nucleico codificando um
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134/606 componente do sistema de edição genética. Em outras modalidades, o modulador é uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, molécula de RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), capaz de hibridar com um mRNA do gene associado a Tet2, por exemplo, causando uma redução ou eliminação de um produto genético associado a Tet2. Em outras modalidades, o modulador é um ácido nucleico codificando a molécula de RNA, por exemplo, shRNA ou siRNA. Em algumas modalidades, o modulador é um produto genético de um gene associado a Tet2, ou um ácido nucleico codificando o produto genético, por exemplo, para sobreexpressão do gene associado a Tet2. Em outras modalidades, o modulador é uma molécula pequena que modula a expressão e/ou função do gene associado a Tet2. Em outras modalidades, o modulador é uma proteína que modula a expressão e/ou função do gene associado a Tet2. Por exemplo, o modulador pode ser uma variante (por exemplo, uma variante negativa dominante ou uma variante constitutivamente ativa), ou um parceiro de ligação, de um produto genético do gene associado a Tet2. Em algumas modalidades, o modulador é um ácido nucleico que codifica a proteína acima mencionada. O modulador pode modular (por exemplo, inibir ou ativar) a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2 antes, de modo concorrente com ou após a transcrição do gene associado a Tet2, e/ou antes, de modo concorrente com ou após a tradução do gene associado a Tet2.
[0241] Um gene associado a Tet, como usado aqui, se relaciona com um gene cuja estrutura, expressão e/ou função, ou um gene codificando um produto genético (por exemplo, um mRNA ou um polipeptideo) cuja estrutura, expressão e/ou função, estão associadas a (por exemplo, afetadas ou moduladas por) Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3). O gene associado a Tet não inclui um gene Tet (por exemplo, um gene Tet1, Tet2 e/ou Tet3).
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[0242] Em certas modalidades, a expressão e/ou função do gene associado a Tet são alteradas quando a expressão e/ou função de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) são inibidas. Em algumas modalidades, a expressão e/ou função do gene associado a Tet são reduzidas ou eliminadas quando a expressão e/ou função de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) são inibidas. Em outras modalidades, a expressão e/ou função do gene associado a Tet são aumentadas ou ativadas quando a expressão e/ou função de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) são inibidas.
[0243] Em algumas modalidades, o gene ou produto genético associado a Tet é um membro de uma via biológica associada a um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) (por exemplo, associada a inibição de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3)). Em certas modalidades, o gene ou produto genético associado a Tet está a jusante de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) na via. Em uma modalidade, o gene ou produto genético associado a Tet está a montante de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) na via.
[0244] Em certas modalidades, o gene associado a Tet codifica um produto genético (por exemplo, um polipeptídeo) que interage, direta ou indiretamente, com um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) (por exemplo, um gene ou produto genético Tet). Em outras modalidades, o gene associado a Tet codifica um produto genético (por exemplo, um polipeptídeo) que não interage com um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3) (por exemplo, um gene ou produto genético Tet).
[0245] Como usado aqui, um modulador de um gene associado a Tet se relaciona com uma molécula, ou grupo de moléculas (por exemplo, um sistema) que modula (por exemplo, reduz ou elimina, ou aumenta ou ativa) a função e/ou expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet1, Tet2 e/ou Tet3). Em certas modalidades, o modulador reduz ou elimina a expressão e/ou função de
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136/606 um gene associado a Tet. Em outra modalidade, o modulador aumenta ou ativa a expressão e/ou função de um gene associado a Tet. Em certas modalidades, o modulador é um inibidor de um gene associado a Tet. Em outras modalidades, o modulador é um ativador de um gene associado a Tet. Em algumas modalidades, o modulador é um sistema de edição genética que é direcionado para ácido nucleico dentro do gene associado a Tet ou um seu elemento regulador, por exemplo, de modo que o ácido nucleico é modificado no(s) sítio(s) de ligação do sistema de edição genética ou perto deste(s) para modular a expressão e/ou função do gene associado a Tet. Em algumas modalidades, o modulador é um componente do sistema de edição genética, ou um ácido nucleico codificando um componente do sistema de edição genética. Em outras modalidades, o modulador é uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, molécula de RNA, por exemplo, um RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA interferente curto (siRNA), capaz de hibridar com um mRNA do gene associado a Tet, por exemplo, causando uma redução ou eliminação de um produto genético associado a Tet. Em outras modalidades, o modulador é um ácido nucleico codificando a molécula de RNA, por exemplo, shRNA ou siRNA. Em algumas modalidades, o modulador é um produto genético de um gene associado a Tet, ou um ácido nucleico codificando o produto genético, por exemplo, para sobre-expressão do gene associado a Tet. Em outras modalidades, o modulador é uma molécula pequena que modula a expressão e/ou função do gene associado a Tet. Em outras modalidades, o modulador é uma proteína que modula a expressão e/ou função do gene associado a Tet. Por exemplo, o modulador pode ser uma variante (por exemplo, uma variante negativa dominante ou uma variante constitutivamente ativa), ou um parceiro de ligação, de um produto genético do gene associado a Tet. Em algumas modalidades, o modulador é um ácido nucleico que codifica a proteína acima
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137/606 mencionada. O modulador pode modular (por exemplo, inibir ou ativar) a expressão e/ou função de um gene associado a Tet antes, de modo concorrente com ou após a transcrição do gene associado a Tet, e/ou antes, de modo concorrente com ou após a tradução do gene associado a Tet.
[0246] Um sistema, como o termo é usado aqui em conexão com edição ou modulação (por exemplo, inibição ou ativação) genética de um Tet e/ou um gene associado a Tet, por exemplo, Tet2 e/ou um gene associado a Tet2, se relaciona com um grupo de moléculas, por exemplo, uma ou mais moléculas, que atuam conjuntamente para desempenhar uma função desejada.
[0247] Um sistema de edição genética, como o termo é usado aqui, se relaciona com um sistema, por exemplo, uma ou mais moléculas, que dirigem e efetuam uma alteração, por exemplo, uma deleção, de um ou mais ácidos nucleicos no sítio ou próximo de um sítio de DNA genômico visado pelo referido sistema. Sistemas de edição genética são conhecidos na técnica e são descritos de modo mais completo abaixo.
[0248] Um parceiro de ligação, como o termo é usado aqui no contexto de um Tet e/ou uma molécula associada a Tet, por exemplo, Tet2 e/ou uma molécula associada a Tet2, se relaciona com uma molécula, por exemplo, uma proteína, que interage, por exemplo, se liga a, um Tet e/ou um produto genético associado a Tet, por exemplo, Tet2 e/ou um produto genético associado a Tet2. Sem ficar restringido pela teoria, se crê que Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, se liga a uma ou mais proteínas HDAC. Tais proteínas HDAC são consideradas exemplos de parceiros de ligação Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2.
[0249] Um produto genético ou proteína negativo dominante é tal que interfere na função de outro produto genético ou proteína. O outro
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138/606 produto genético afetado pode ser igual ou diferente da proteína negativa dominante. Produtos genéticos negativos dominantes podem ser de muitas formas, incluindo truncamentos, proteínas completas com mutações pontuais ou seus fragmentos, ou fusões de proteínas completas de tipo selvagem ou mutantes ou seus fragmentos com outras proteínas. O nível de inibição observado pode ser muito baixo. Por exemplo, pode requerer um grande excesso da proteína negativa dominante em comparação com a proteína ou proteínas funcionais envolvidas em um processo de modo a ser observado um efeito. Pode ser difícil observar efeitos sob condições normais de ensaios biológicos. Em uma modalidade, uma variante negativa dominante de um produto genético associado a Tet (por exemplo, um produto genético associado a Tet2) é um produto genético cataliticamente inativo codificado por uma variante de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2). Em outra modalidade, um parceiro de ligação negativo dominante de um produto genético associado a Tet (por exemplo, um produto genético associado a Tet2) é um produto genético cataliticamente inativo codificado por uma variante de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2). Em uma modalidade, um Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, negativo dominante é um Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, cataliticamente inativo. Em outra modalidade, um parceiro de ligação de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, negativo dominante é um inibidor de HDAC que se liga a Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2, cataliticamente inativo.
[0250] Sem pretender ficar restringido pela teoria, uma célula tendo um fenótipo de células T de memória central (Tem) expressa CCR7 e CD45RO. Em uma modalidade, uma célula tendo um fenótipo de células T de memória central expressa CCR7 e CD45RO e/ou não expressa ou expressa níveis mais baixos de CD45RA em comparação com uma
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139/606 célula T virgem. Em uma modalidade, uma célula tendo um fenótipo de células T de memória central expressa CD45RO e CD62L e/ou não expressa ou expressa níveis mais baixos de CD45RA em comparação com uma célula T virgem. Em uma modalidade, uma célula tendo um fenótipo de células T de memória central expressa CCR7, CD45RO e CD62L e/ou não expressa ou expressa níveis mais baixos de CD45RA em comparação com uma célula T virgem.
[0251 ] Sem pretender ficar restringido pela teoria, uma célula tendo um fenótipo de células T de memória efetora (Tem) não expressa ou expressa níveis mais baixos de CCR7 e expressa níveis mais elevados de CD45RO em comparação com uma célula T virgem.
[0252] As vias descritas aqui são descritas, por exemplo, pelo Gene Ontology Consortium (por exemplo, Biological Process Ontology) e/ou pelo Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (por exemplo, conjuntos de genes das vias Hallmark ou Canonical).
[0253] O Biological Process Ontology é descrito, por exemplo, em Ashburner etal. Gene ontology: tool for the unification of biology (2000) Nat Genet 25(1):25-9; The Gene Ontology Consortium. Gene Ontology Consortium: going forward. (2015) Nucl Acids Res 43 Edição da base de dados D1049-D1056. Os conjuntos de genes Hallmark e conjuntos de genes da via Canonical são descritos, por exemplo, em Tamayo, et al. (2005) PA/AS102, 15545-15550; Mootha, Lindgren, etal. (2003) Nat Genet 34, 267-273.
[0254] Como usado aqui, uma via de diferenciação de leucócitos se relaciona com um processo no qual uma célula precursora hematopoiética relativamente não especializada adquire as características especializadas de um leucócito, por exemplo, um ou mais processos classificados em G0:0002521 no Biological Process Ontology.
[0255] Como usado aqui, uma via de regulação positiva do
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140/606 processo do sistema imune se relaciona com um processo que ativa ou aumenta a frequência, velocidade ou extensão de um processo do sistema imune, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO002684 no Biological Process Ontology.
[0256] Como usado aqui, uma via de sinalização de proteína tirosina quinase receptora de transmembrana se relaciona com uma via de sinalização iniciada pela ligação de um ligante extracelular a um receptor da superfície celular, em que o receptor da superfície celular possui uma atividade de tirosina quinase, por exemplo, uma ou mais vias classificadas em GOO007169 no Biological Process Ontology.
[0257] Como usado aqui, uma via de regulação da morfogênese da estrutura anatômica se relaciona com um processo que modula a frequência, velocidade ou extensão da morfogênese da estrutura anatômica, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO022603 no Biological Process Ontology.
[0258] Como usado aqui, uma via de sinalização de TNFA através de NFKB se relaciona com um processo regulado por NFkB em resposta ao TNF, por exemplo, um processo envolvendo um ou mais genes classificados em M5890 nos conjuntos de genes Hallmark (GSEA).
[0259] Como usado aqui, via de regulação positiva da atividade de hidrolase se relaciona com um processo que ativa ou aumenta a frequência, velocidade e/ou extensão de uma atividade de hidrolase, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO051345 no Biological Process Ontology.
[0260] Como usado aqui, via de cicatrização de feridas se relaciona com um processo que restabelece a integridade (por exemplo, integridade parcial ou completa) de um tecido danificado após uma lesão, por exemplo, um ou mais processos classificados em G0:0042060 no Biological Process Ontology.
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[0261] Como usado aqui, uma via de ativação de células T alfabeta se relaciona com um processo envolvendo uma alteração da morfologia e/ou comportamento de uma célula T αβ, por exemplo, resultante de exposição a um mitógeno, citocina, quimiocina, ligante celular ou um antígeno para o qual é específica, por exemplo, uma ou mais alterações classificadas em GOO046631 no Biological Process Ontology.
[0262] Como usado aqui, uma via de regulação do movimento de componentes celulares se relaciona com um processo que modula a frequência, velocidade e/ou extensão do movimento de um componente celular, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO051270 no Biological Process Ontology.
[0263] Como usado aqui, uma via da resposta inflamatória se relaciona com uma reação defensiva (por exemplo, uma reação defensiva imediata), por exemplo, por um tecido de vertebrado, a uma infecção ou lesão causada por um agente químico ou físico, por exemplo, uma ou mais reações classificadas em GOO006954 no Biological Process Ontology. Em algumas modalidades, este processo é caracterizado por vasodilatação local, extravasamento de plasma para espaços intercelulares e/ou acúmulo de leucócitos e macrófagos.
[0264] Como usado aqui, uma via de diferenciação de células mieloides se relaciona com um processo em que uma célula precursora mieloide relativamente não especializada adquire as características especializadas de qualquer célula das linhagens mieloides de leucócitos, megacariócitos, trombócitos ou eritrócitos, por exemplo, um ou mais processos classificados em G0:0030099 no Biological Process Ontology.
[0265] Como usado aqui, uma via de produção de citocinas se relaciona com um processo em que uma citocina é sintetizada ou secretada após um estímulo celular, resultando em um aumento dos
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142/606 seus níveis intracelulares ou extracelulares, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO001816 no Biological Process Ontology.
[0266] Como usado aqui, uma via de subregulação em resposta a UV se relaciona com um processo envolvendo um gene subregulado em resposta a radiação ultravioleta (UV), por exemplo, um ou mais genes classificados em M5942 nos conjuntos de genes Hallmark.
[0267] Como usado aqui, uma via de regulação negativa do processo de organismos multicelulares se relaciona com um processo que trava, previne ou reduz a frequência, velocidade e/ou extensão de processo de organismos, os processos pertinentes à função de um organismo acima do nível celular (por exemplo, os processos integrados de tecidos e órgãos), por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO051241 no Biological Process Ontology.
[0268] Como usado aqui, uma via da morfogênese de vasos sanguíneos se relaciona com um processo no qual as estruturas anatômicas de vasos sanguíneos são geradas e organizadas, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO048514 no Biological Process Ontology.
[0269] Como usado aqui, uma via de transcrição dependente de NFAT se relaciona com um processo relacionado com um gene envolvido na transcrição dependente de NFAT regulada por calcineurina em linfócitos, por exemplo, um ou mais genes classificados em M60 nos conjuntos de genes da via Canonical.
[0270] Como usado aqui, uma via de regulação positiva do processo apoptótico se relaciona com um processo que ativa ou aumenta a frequência, velocidade e/ou extensão de apoptose, por exemplo, um ou mais processos classificados em GOO043065 no Biological Process Ontology.
[0271] Como usado aqui, uma via de hipoxia se relaciona com um
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143/606 processo envolvendo um gene sobrerregulado em resposta a hipoxia, por exemplo, um ou mais genes classificados em M5891 nos conjuntos de genes Hallmark.
[0272] Como usado aqui, uma via de sobrerregulação por sinalização de KRAS se relaciona com um processo envolvendo um gene sobrerregulado por ativação de KRAS, por exemplo, um ou mais genes classificados em M5953 nos conjuntos de genes Hallmark.
[0273] Como usado aqui, uma via da cascata de sinalização de proteína quinases ativadas pelo estresse se relaciona com uma via de sinalização à qual uma cascata de proteína quinases ativadas pelo estresse (SAPK) transmite um ou mais dos sinais, por exemplo, uma ou mais vias de sinalização classificadas em GOO031098 no Biological Process Ontology.
Descrição
[0274] A presente invenção proporciona moduladores (por exemplo, inibidores ou ativadores) de genes associados a Tet (por exemplo, genes associados a Tet2) e inibidores de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3), por exemplo, Tet2, e métodos de uso dos mesmos. Em particular, a invenção proporciona células T expressando CAR compreendendo inibidores de um ou mais genes descritos aqui e o uso do um ou mais genes em conexão com células T CAR. Os inibidores da presente invenção, em conjunto com seus métodos de uso, são descritos em mais detalhe abaixo. CARs, células T CAR e métodos de uso são adicionalmente descritos abaixo.
[0275] Sem pretender ficar restringido pela teoria, se crê que, em certas modalidades, células com expressão e/ou função moduladas de um ou mais genes associados a Tet (por exemplo, associados a Tet2) podem exibir hidroximetilação de DNA reduzida e aquisição de um perfil epigenético consistente com diferenciação de células T alterada. Por exemplo, células T CAR com expressão e/ou função moduladas de um
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144/606 ou mais genes associados a Tet (por exemplo, associados a Tet2) podem exibir um fenótipo de memória inicial que pode diferir de características de diferenciação de memória tardia. Em conformidade, em certas modalidades, a modulação da expressão e/ou função de um ou mais genes na via TET (por exemplo, TET2) pode promover a proliferação de células T, desse modo intensificando o tratamento com células T geneticamente redirecionadas.
Moduladores de Genes Tet e Associados a Tet
[0276] A presente invenção proporciona composições compreendendo, por exemplo, moduladores de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2), opcionalmente, e inibidores de um Tet (Tet1, Tet2, e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) e métodos para intensificar funções de células efetoras imunes, por exemplo, funções de células expressando CAR, por uso de tais composições e/ou outros meios como descrito aqui. Qualquer modulador de um gene associado a Tet (por exemplo, gene associado a Tet2) e qualquer inibidor de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) conhecidos na técnica podem ser usados de acordo com a presente invenção. Exemplos de moduladores de genes associados a Tet (por exemplo, genes associados a Tet2) e inibidores exemplificativos de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) são descritos abaixo.
[0277] Em algumas modalidades, a modulação de quaisquer dos genes associados a Tet2 por quaisquer dos métodos revelados aqui pode ser monoalélica ou bialélica. Em certas modalidades, a modulação é bialélica (por exemplo, dois alelos modulados). Em outras modalidades, a modulação é monoalélica (por exemplo, um alelo modulado e um alelo de tipo selvagem).
Sistemas de Edição Genética
[0278] De acordo com a presente invenção, sistemas de edição
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145/606 genética podem ser usados como moduladores de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou inibidores de um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Também são contemplados pela presente invenção os usos de ácido nucleico codificando um ou mais componentes de um sistema de edição genética visando um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
[0279] Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 é um ou mais (2, 3, 4, 5 ou todos os) genes escolhidos de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 é um ou mais (por exemplo, uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 8. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 é um ou mais (por exemplo, uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna D. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 é um ou mais (por exemplo, uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes associados a uma ou mais (por exemplo, uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) vias escolhidas da Tabela 9, Coluna A. Em uma modalidade, o gene associado a Tet2 é um ou mais genes associados a um fenótipo de células T de memória central.
Sistemas de Edição Genética CRISPR/Cas9
[0280] Os sistemas CRISPR/Cas de ocorrência natural são encontrados em aproximadamente 40% dos genomas de eubactérias sequenciados e 90% das Archaea sequenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Esse sistema é um tipo de sistema imunológico procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos, tais como plasmídeos e fagos, e fornece uma forma de imunidade adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et ai. (2008) Science 322: 1843-1845.
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[0281 ] O sistema CRISPR/Cas foi modificado para uso na edição de genes (silenciamento, intensificação ou alteração de genes específicos) em eucariotas, tais como camundongos ou primatas. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Isso é realizado, por exemplo, por introdução na célula eucariótica de um plasmídeo contendo um CRISPR especificamente projetado e um ou mais Cas apropriados.
[0282] A sequência CRISPR, algumas vezes chamada de lócus CRISPR, compreende repetições e espaçadores alternados. Em um CRISPR de ocorrência natural, os espaçadores compreendem habitualmente sequências estranhas à bactéria, tais como uma sequência plasmídica ou fágica; em um sistema CRISPR/Cas exemplificativo visando um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), os espaçadores são derivados da sequência genética de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), ou uma sequência dos seus elementos reguladores.
[0283] RNA do lócus CRISPR é constitutivamente expresso e processado em pequenos RNAs. Os mesmos compreendem um espaçador flanqueado por uma sequência de repetição. Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos ao nível do RNA ou DNA. Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Os espaçadores servem, assim, como modelos para moléculas de RNA, analogamente a siRNAs. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.
[0284] À medida que os mesmos ocorrem naturalmente em muitos tipos diferentes de bactérias, as disposições exatas do CRISPR e estrutura, função e número de genes Cas e seu produto diferem de algum modo de espécie para espécie. Haft etal. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin etal. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica etal. (2005)
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J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 25512561; Pourcel etal. (2005) Microbiol. 151: 653-663; e Stern etal. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340. Por exemplo, as proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por exemplo, CasA) formam um complexo funcional, Cascata, que processa transcritos de RNA de CRISPR em unidades espaçador-repetição de que a Cascata retém. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. Em outros procariotas, Cas6 processa o transcrito de CRISPR. A inativação fágica baseada em CRISPR em E. coli exige Cascata e Cas3, mas não Cas1 ou Cas2. As proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) em Pyrococcus furiosus e outros procariotas formam um complexo funcional com pequenos RNAs de CRISPR que reconhece e cliva RNAs-alvo complementares. Um sistema CRISPR mais simples depende da proteína Cas9, que é uma nuclease com dois sítios de corte ativos, um para cada fita da hélice dupla. Combinando Cas9 e lócus de CRISPR modificado, o RNA pode ser usado em um sistema para edição de genes. Pennisi (2013) Science 341: 833-836. [0285] O sistema CRISPR/Cas pode assim ser usado para modificar, por exemplo, deletar, um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), ou um elemento genético regulador de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), ou introduzir uma terminação prematura que, assim, decresce a expressão de um funcional de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). O sistema CRISPR/Cas pode ser alternativamente usado como interferência de RNA, desligando o gene associado a Tet (por exemplo, gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) de um modo reversível. Em uma célula de mamífero,
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148/606 por exemplo, o RNA pode guiar a proteína Cas para um promotor de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), bloqueando estericamente RNA polimerases.
[0286] Sistemas CRISPR/Cas para edição genética em células eucarióticas envolvem tipicamente (1) uma molécula de RNA-guia (gRNA) compreendendo uma sequência de direcionamento (que é capaz de hibridar com a sequência-alvo de DNA genômico) e uma sequência que é capaz de se ligar a uma enzima Cas, por exemplo, Cas9, e (2) uma proteína Cas, por exemplo, Cas9. A sequência de direcionamento e a sequência que é capaz de se ligar a uma enzima Cas, por exemplo, Cas9, podem ser dispostas na mesma molécula ou em moléculas diferentes. Se forem dispostas em moléculas diferentes, cada uma inclui um domínio de hibridação que permite que as moléculas se associem, por exemplo, através de hibridação.
[0287] Uma molécula de gRNA exemplificativa da presente invenção compreende, por exemplo, consiste em, um primeiro ácido nucleico tendo a sequência (em que os ns se referem aos resíduos da sequência de direcionamento (por exemplo, como descrito aqui, por exemplo, na Tabela 3), e pode consistir em 15-25 nucleotídeos, por exemplo, consistir em 20 nucleotídeos): nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NQ: 40), e uma segunda sequência de ácido nucleico tendo a sequência: AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC, opcionalmente com 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 (por exemplo, 4 ou 7, por exemplo, 7) nucleotídeos U adicionais na extremidade 3' (SEQ ID NQ: 41).
[0288] A segunda molécula de ácido nucleico pode
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149/606 alternativamente consistir em um fragmento da sequência acima, em que tal fragmento é capaz de hibridar com o primeiro ácido nucleico. Um exemplo de uma tal segunda molécula de ácido nucleico é: AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC, opcionalmente com 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 (por exemplo, 4 ou 7, por exemplo, 7) nucleotídeos U adicionais na extremidade 3' (SEQ ID NQ: 42).
[0289] Outra molécula de gRNA exemplificativa da presente invenção compreende, por exemplo, consiste em, um primeiro ácido nucleico tendo a sequência (em que os ns se referem aos resíduos da sequência de direcionamento (por exemplo, como descrito aqui, por exemplo, na Tabela 3), e pode consistir em 15-25 nucleotídeos, por exemplo, consistir em 20 nucleotídeos):
nnnnnnnnnnnnnnnnnn nGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCG GUGC (SEQ ID NQ: 43), opcionalmente com 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 (por exemplo, 4 ou 7, por exemplo, 4) nucleotídeos U adicionais na extremidade 3'. Podem ser gerados sistemas CRISPR/Cas artificiais que inibem um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), usando tecnologia conhecida na técnica, por exemplo, que são descritos na Publicação U.S. NQ. 20140068797, WQ2015/048577, e Cong (2013) Science 339: 819-823. Também podem ser gerados outros sistemas CRISPR/Cas artificiais que são conhecidos na técnica que inibem um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), por exemplo, que são descritos em Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, Patente U.S. NQ.: 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; e 8,697,359, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
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Podem ser gerados sistemas tais que inibem um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), por exemplo, por manipulação de um sistema CRISPR/Cas de modo a incluir uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que híbrida com uma sequência de um gene-alvo, por exemplo, um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em modalidades, o gRNA compreende uma sequência de direcionamento que é totalmente complementar a 15-25 nucleotideos, por exemplo, 20 nucleotideos, de um gene-alvo, por exemplo, um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em modalidades, os 15-25 nucleotideos, por exemplo, 20 nucleotideos, de um gene-alvo, por exemplo, um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), são dispostos imediatamente 5' a uma sequência de motivo adjacente protoespaçador (PAM) reconhecida pela proteína Cas do sistema CRISPR/Cas (por exemplo, em que o sistema compreende uma proteína Cas9 de S. pyogenes, a sequência PAM compreende NGG, em que N pode ser qualquer de A, T, G ou C). Em modalidades, a sequência de direcionamento do gRNA compreende, por exemplo, consiste em, uma sequência de RNA complementar a uma sequência listada na Tabela 2. Em modalidades, o gRNA compreende uma sequência de direcionamento listada na Tabela 3.
[0290] Em uma modalidade, DNA estranho pode ser introduzido na célula juntamente com o sistema CRISPR/Cas, por exemplo, DNA codificando um CAR, por exemplo, como descrito aqui; dependendo das sequências do DNA estranho e sequência cromossômica, este processo pode ser usado para integrar o DNA codificando o CAR, por
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151/606 exemplo, como descrito aqui, no sítio ou perto do sítio visado pelo sistema CRISPR/Cas. Como mostrado aqui, nos exemplos, mas sem ficar restringido pela teoria, tal integração pode conduzir à expressão do CAR bem como disrupção de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Tal molécula de DNA estranho é referida aqui como DNA-modelo. Em modalidades, o DNA-modelo também compreende braços de homologia a 5', 3' ou a 5' e 3' relativamente ao ácido nucleico do DNA-modelo que codifica a molécula ou moléculas de interesse (por exemplo, que codifica um CAR descrito aqui), em que os referidos braços de homologia são complementares a sequência de DNA genômico flanqueando a sequência-alvo.
[0291] Em uma modalidade, o sistema CRISPR/Cas da presente invenção compreende Cas9, por exemplo, Cas9 de S. pyogenes, e um gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que híbrida com uma sequência de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em uma modalidade, o sistema CRISPR/Cas compreende ácido nucleico codificando um gRNA específico para um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), e um ácido nucleico codificando uma proteína Cas, por exemplo, Cas9, por exemplo, Cas9 de S. pyogenes. Em uma modalidade, o sistema CRISPR/Cas compreende um gRNA específico para um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), e um ácido nucleico codificando uma proteína Cas, por exemplo, Cas9, por exemplo, Cas9 de S. pyogenes.
[0292] Exemplos de sequências genômicas-alvo para Tet2 para as quais podem ser gerados gRNAs compreendendo sequências de
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152/606 direcionamento complementares para uso na presente invenção são listados na Tabela 2 abaixo. Em modalidades, o gRNA compreende um complemento de RNA de uma Sequência-Alvo da tabela abaixo (por exemplo, para sgTET2_1, o gRNA pode compreender CCUUGGACACCUUCUCCUCC (SEQ ID NQ: 44)). Em modalidades, o gRNA compreende o análogo de RNA de uma Sequência-alvo da tabela 2 abaixo (por exemplo, para sgTET2_1, o gRNA pode compreender GGAACCUGUGGAAGAGGAGG (SEQ ID NQ: 45)). Em modalidades, o inibidor de Tet2 é ácido nucleico codificando uma molécula de gRNA específica para Tet2, em que o ácido nucleico compreende a sequência de uma Sequência-Alvo da tabela 2 abaixo, por exemplo, sob o controle de um promotor de U6 ou H1:
Tabela 2
gRNA ID Símbolo do Gene Cromossomo Posição Fita Sequência-Alvo dentro da sequência do gene Tet2
sgTET2_1 TET2 chr4 106156327 - GGAACCTGTGGAAGAGGAGG (SEQ ID Nõ: 46)
sgTET2_2 TET2 chr4 106156339 - GAAGGAAGCTGAGGAACCTG (SEQ ID Ns: 47)
sgTET2_3 TET2 chr4 106156897 + ATGACCTCCAAACAATACAC (SEQ ID Nõ: 48)
sgTET2_4 TET2 chr4 106157189 - CAAGTGCTGTTTCAACACTG (SEQ ID Nõ: 49)
sgTET2_5 TET2 chr4 106157296 - GGGAGATGTGAACTCTGGGA (SEQ ID Ne: 50)
sgTET2_6 TET2 chr4 106155148 - GGAGGTGATGGTATCAGGAA (SEQ ID Ne: 51)
sgTET2_7 TET2 chr4 106155166 - GGTTCTGTCTGGCAAATGGG (SEQ ID Nõ: 52)
sgTET2_8 TET2 chr4 106155217 - GGATGAGCTCTCTCAGGCAG (SEQ ID Ne: 53)
sgTET2_9 TET2 chr4 106155403 - TGAAGGAGCCCAGAGAGAGA (SEQ ID Na: 65)
sgTET2_10 TET2 chr4 106155478 + GTAAGCCAAGAAAGAAATCC (SEQ ID Nõ: 66)
[0293] Exemplos de sequências de direcionamento de gRNA que são úteis nas várias modalidades da presente invenção para inibir um Tet, por exemplo, Tet2, são proporcionados abaixo na Tabela 3. Em modalidades, um sistema CRISPR/Cas da presente invenção compreende uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência
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153/606 de direcionamento compreendendo uma sequência listada na Tabela 3. Em modalidades, um sistema CRISPR/Cas da presente invenção compreende uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que é uma sequência listada na Tabela 3.
Tabela 3
ID ALVO REGIÃO- ALVO FITA Localização da Sequência Genômica-Alvo (hg38) Sequência de direcionamento de gRNA SEQ ID N°:
54790 1 1 TET2 EXON + chr4:105145928-105145948 UGUCGGGUCUUUAAAAAUAC 73
54790 1 3 TET2 EXON + chr4:105145945-105145965 UACAGGCCCCUAAAGCACUA 74
54790 1 4 TET2 EXON + chr4:105145946-105145966 ACAGGCCCCUAAAGCACUAA 75
54790 1 5 TET2 EXON + chr4:105145957-105145977 AAGCACUAAGGGCAUGCCCU 76
54790 1 8 TET2 EXON + chr4:105145966-105145986 GGGCAUGCCCUCGGUGAAAC 77
54790 1 10 TET2 EXON + chr4:105145967-105145987 GGCAUGCCCUCGGUGAAACA 78
54790 1 12 TET2 EXON + chr4:105145968-105145988 GCAUGCCCUCGGUGAAACAG 79
54790 1 20 TET2 EXON + chr4:105146006-105146026 UGAGAUUAAAGCGACAGAAA 80
54790 1 23 TET2 EXON + chr4:105146007-105146027 GAGAUUAAAGCGACAGAAAA 81
54790 1 25 TET2 EXON + chr4:105146012-105146032 UAAAGCGACAGAAAAGGGAA 82
54790 1 30 TET2 EXON + chr4:105146021-105146041 AGAAAAGGGAAAGGAGAGCG 83
54790 1 31 TET2 EXON + chr4:105146022-105146042 GAAAAGGGAAAGGAGAGCGC 84
54790 1 33 TET2 EXON + chr4:105146028-105146048 GGAAAGGAGAGCGCGGGCAA 85
54790 1 35 TET2 EXON + chr4:105146029-105146049 GAAAGGAGAGCGCGGGCAAC 86
54790 1 38 TET2 EXON + chr4:105146038-105146058 GCGCGGGCAACGGGAUCUAA 87
54790 1 39 TET2 EXON + chr4:105146039-105146059 CGCGGGCAACGGGAUCUAAA 88
54790 1 43 TET2 EXON + chr4:105146053-105146073 UCUAAAGGGAGAUAGAGACG 89
54790 1 44 TET2 EXON + chr4:105146054-105146074 CUAAAGGGAGAUAGAGACGC 90
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 159/678
154/606
54790 1 47 TET2 EXON + chr4:105146063-105146083 GAUAGAGACGCGGGCCUCUG 91
54790 1 48 TET2 EXON + chr4:105146064-105146084 AUAGAGACGCGGGCCUCUGA 92
54790 1 49 TET2 EXON + chr4:105146069-105146089 GACGCGGGCCUCUGAGGGUA 93
54790 1 51 TET2 EXON + chr4:105146072-105146092 GCGGGCCUCUGAGGGUAAGG 94
54790 1 52 TET2 EXON + chr4:105146073-105146093 CGGGCCUCUGAGGGUAAGGU 95
54790 1 54 TET2 EXON + chr4:105146082-105146102 GAGGGUAAGGUGGGCGCAAG 96
54790 1 61 TET2 EXON - chr4:105145954-105145974 GCAUGCCCUUAGUGCUUUAG 97
54790 1 62 TET2 EXON - chr4:105145955-105145975 GGCAUGCCCUUAGUGCUUUA 98
54790 1 64 TET2 EXON - chr4:105145956-105145976 GGGCAUGCCCUUAGUGCUUU 99
54790 1 68 TET2 EXON - chr4:105145976-105145996 GCGCUCCCCUGUUUCACCGA 100
54790 1 69 TET2 EXON - chr4:105145977-105145997 AGCGCUCCCCUGUUUCACCG 101
54790 1 87 TET2 EXON - chr4:105146080-105146100 UGCGCCCACCUUACCCUCAG 102
54790 2 1 TET2 EXON + chr4:105146669-105146689 AGAGCCGGCGGUAGCGGCAG 103
54790 2 2 TET2 EXON + chr4:105146675-105146695 GGCGGUAGCGGCAGUGGCAG 104
54790 2 6 TET2 EXON + chr4:105146686-105146706 CAGUGGCAGCGGCGAGAGCU 105
54790 2 7 TET2 EXON + chr4:105146687-105146707 AGUGGCAGCGGCGAGAGCUU 106
54790 2 8 TET2 EXON + chr4:105146690-105146710 GGCAGCGGCGAGAGCUUGGG 107
54790 2 12 TET2 EXON + chr4:105146725-105146745 CCUCGCGAGCGCCGCGCGCC 108
54790 2 13 TET2 EXON + chr4:105146726-105146746 CUCGCGAGCGCCGCGCGCCC 109
54790 2 14 TET2 EXON + chr4:105146761-105146781 GCAAGUCACGUCCGCCCCCU 110
54790 2 15 TET2 EXON + chr4:105146766-105146786 UCACGUCCGCCCCCUCGGCG 111
54790 2 17 TET2 EXON + chr4:105146783-105146803 GCGCGGCCGCCCCGAGACGC 112
54790 2 24 TET2 EXON + chr4:105146836-105146856 CUGCCUUAUGAAUAUUGAUG 113
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 160/678
155/606
54790 2 25 TET2 EXON + chr4:105146839-105146859 CCUUAUGAAUAUUGAUGCGG 114
54790 2 27 TET2 EXON + chr4:105146844-105146864 UGAAUAUUGAUGCGGAGGCU 115
54790 2 34 TET2 EXON + chr4:105146868-105146888 UGCUUUCGUAGAGAAGCAGA 116
54790 2 37 TET2 EXON + chr4:105146879-105146899 AGAAGCAGAAGGAAGCAAGA 117
54790 2 39 TET2 EXON + chr4:105146891-105146911 AAGCAAGAUGGCUGCCCUUU 118
54790-2-44 TET2 EXON + chr4:105146905-105146925 CCCUUUAGGAUUUGUUAGAA 119
54790 2 51 TET2 EXON + chr4:105146926-105146946 GGAGACCCGACUGCAACUGC 120
54790 2 52 TET2 EXON + chr4:105146938-105146958 GCAACUGCUGGAUUGCUGCA 121
54790 2 56 TET2 EXON + chr4:105146944-105146964 GCUGGAUUGCUGCAAGGCUG 122
54790 2 57 TET2 EXON + chr4:105146945-105146965 CUGGAUUGCUGCAAGGCUGA 123
54790 2 62 TET2 EXON + chr4:105146957-105146977 AAGGCUGAGGGACGAGAACG 124
54790 2 64 TET2 EXON - chr4:105146676-105146696 GCUGCCACUGCCGCUACCGC 125
54790 2 65 TET2 EXON - chr4:105146716-105146736 CGCUCGCGAGGAGGCGGCGG 126
54790 2 66 TET2 EXON - chr4:105146719-105146739 CGGCGCUCGCGAGGAGGCGG 127
54790 2 67 TET2 EXON - chr4:105146722-105146742 GCGCGGCGCUCGCGAGGAGG 128
54790 2 68 TET2 EXON - chr4:105146725-105146745 GGCGCGCGGCGCUCGCGAGG 129
54790 2 69 TET2 EXON - chr4:105146728-105146748 CCGGGCGCGCGGCGCUCGCG 130
54790 2 74 TET2 EXON - chr4:105146739-105146759 GCGAGCGGGACCCGGGCGCG 131
54790 2 75 TET2 EXON - chr4:105146746-105146766 CUUGCAUGCGAGCGGGACCC 132
54790 2 76 TET2 EXON - chr4:105146747-105146767 ACUUGCAUGCGAGCGGGACC 133
54790 2 78 TET2 EXON - chr4:105146753-105146773 GACGUGACUUGCAUGCGAGC 134
54790 2 79 TET2 EXON - chr4:105146754-105146774 GGACGUGACUUGCAUGCGAG 135
54790 2 83 TET2 EXON - chr4:105146775-105146795 GGGCGGCCGCGCCGAGGGGG 136
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 161/678
156/606
54790 2 85 TET2 EXON - chr4:105146778-105146798 UCGGGGCGGCCGCGCCGAGG 137
54790 2 86 TET2 EXON - chr4:105146779-105146799 CUCGGGGCGGCCGCGCCGAG 138
54790 2 88 TET2 EXON - chr4:105146780-105146800 UCUCGGGGCGGCCGCGCCGA 139
54790 2 89 TET2 EXON - chr4:105146781-105146801 GUCUCGGGGCGGCCGCGCCG 140
54790 2 93 TET2 EXON - chr4:105146792-105146812 GCGGGGCCGGCGUCUCGGGG 141
54790 2 94 TET2 EXON - chr4:105146795-105146815 UCAGCGGGGCCGGCGUCUCG 142
54790 2 95 TET2 EXON - chr4:105146796-105146816 CUCAGCGGGGCCGGCGUCUC 143
54790 2 97 TET2 EXON - chr4:105146797-105146817 ACUCAGCGGGGCCGGCGUCU 144
54790 2 100 TET2 EXON - chr4:105146805-105146825 UUCUCAUCACUCAGCGGGGC 145
54790 2 101 TET2 EXON - chr4:105146809-105146829 UCUGUUCUCAUCACUCAGCG 146
54790 2 103 TET2 EXON - chr4:105146810-105146830 GUCUGUUCUCAUCACUCAGC 147
54790 2 106 TET2 EXON - chr4:105146811-105146831 CGUCUGUUCUCAUCACUCAG 148
54790 2 109 TET2 EXON - chr4:105146842-105146862 CCUCCGCAUCAAUAUUCAUA 149
54790 2 117 TET2 EXON - chr4:105146908-105146928 CCUUUCUAACAAAUCCUAAA 150
54790 2 118 TET2 EXON - chr4:105146909-105146929 UCCUUUCUAACAAAUCCUAA 151
54790 2 122 TET2 EXON - chr4:105146934-105146954 GCAAUCCAGCAGUUGCAGUC 152
54790 2 123 TET2 EXON - chr4:105146935-105146955 AGCAAUCCAGCAGUUGCAGU 153
54790 3 1 TET2 EXON + chr4:105190341-105190361 AAACUCUGUCUUCUCUAGGC 154
54790 3 13 TET2 EXON + chr4:105190411-105190431 UCCUGUUGAGUUACAACGCU 155
54790 3 16 TET2 EXON + chr4:105190418-105190438 GAGUUACAACGCUUGGAAGC 156
54790 3 19 TET2 EXON + chr4:105190424-105190444 CAACGCUUGGAAGCAGGAGA 157
54790 3 21 TET2 EXON + chr4:105190425-105190445 AACGCUUGGAAGCAGGAGAU 158
54790 3 24 TET2 EXON + chr4:105190444-105190464 UGGGCUCAGCAGCAGCCAAU 159
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 162/678
157/606
54790 3 26 TET2 EXON + chr4:105190456-105190476 CAGCCAAUAGGACAUGAUCC 160
54790 3 30 TET2 EXON + chr4:105190469-105190489 AUGAUCCAGGAAGAGCAGUA 161
54790 3 32 TET2 EXON + chr4:105190470-105190490 UGAUCCAGGAAGAGCAGUAA 162
54790 3 34 TET2 EXON + chr4:105190483-105190503 GCAGUAAGGGACUGAGCUGC 163
54790 3 37 TET2 EXON + chr4:105190494-105190514 CUGAGCUGCUGGUAAGACAG 164
54790 3 46 TET2 EXON - chr4:105190385-105190405 GCAAGUAAACAAUCUUGAGA 165
54790 3 47 TET2 EXON - chr4:105190386-105190406 GGCAAGUAAACAAUCUUGAG 166
54790 3 52 TET2 EXON - chr4:105190407-105190427 UUGUAACUCAACAGGAGCAA 167
54790 3 55 TET2 EXON - chr4:105190415-105190435 UCCAAGCGUUGUAACUCAAC 168
54790 3 60 TET2 EXON - chr4:105190462-105190482 CUUCCUGGAUCAUGUCCUAU 169
54790 3 62 TET2 EXON - chr4:105190477-105190497 CAGUCCCUUACUGCUCUUCC 170
54790 4 7 TET2 EXON + chr4:105233887-105233907 GCUCUUUAGAAUUCAACUAG 171
54790 4 8 TET2 EXON + chr4:105233888-105233908 CUCUUUAGAAUUCAACUAGA 172
54790 4 12 TET2 EXON + chr4:105233899-105233919 UCAACUAGAGGGCAGCCUUG 173
54790-4-14 TET2 EXON + chr4:105233903-105233923 CUAGAGGGCAGCCUUGUGGA 174
54790-4-19 TET2 EXON + chr4:105233923-105233943 UGGCCCCGAAGCAAGCCUGA 175
54790 4 21 TET2 EXON + chr4:105233929-105233949 CGAAGCAAGCCUGAUGGAAC 176
54790 4 25 TET2 EXON + chr4:105233950-105233970 GGAUAGAACCAACCAUGUUG 177
54790 4 26 TET2 EXON + chr4:105233951-105233971 GAUAGAACCAACCAUGUUGA 178
54790 4 30 TET2 EXON + chr4:105234010-105234030 CAUUUGCCAGACAGAACCUC 179
54790 4 37 TET2 EXON + chr4:105234029-105234049 CUGGCUACAAAGCUCCAGAA 180
54790-4-44 TET2 EXON + chr4:105234068-105234088 AGAGCUCAUCCAGAAGUAAA 181
54790-4-45 TET2 EXON + chr4:105234081-105234101 AAGUAAAUGGAGACACCAAG 182
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 163/678
158/606
54790-4-47 TET2 EXON + chr4:105234104-105234124 CACUCUUUCAAAAGUUAUUA 183
54790-4-54 TET2 EXON + chr4:105234121-105234141 UUAUGGAAUACCCUGUAUGA 184
54790 4 57 TET2 EXON + chr4:105234122-105234142 UAUGGAAUACCCUGUAUGAA 185
54790 4 66 TET2 EXON + chr4:105234170-105234190 GACUUUACACAAGAAAGUAG 186
54790 4 67 TET2 EXON + chr4:105234171-105234191 ACUUUACACAAGAAAGUAGA 187
54790 4 72 TET2 EXON + chr4:105234194-105234214 UAUUCCAAGUGUUUGCAAAA 188
54790-4-74 TET2 EXON + chr4:105234197-105234217 UCCAAGUGUUUGCAAAAUGG 189
54790 4 81 TET2 EXON + chr4:105234233-105234253 GUUAGUGAACCUUCUCUCUC 190
54790 4 82 TET2 EXON + chr4:105234234-105234254 UUAGUGAACCUUCUCUCUCU 191
54790 4 89 TET2 EXON + chr4:105234271-105234291 GAAAUUGAAACAAGACCAAA 192
54790 4 93 TET2 EXON + chr4:105234278-105234298 AAACAAGACCAAAAGGCUAA 193
54790 4 97 TET2 EXON + chr4:105234296-105234316 AAUGGAGAAAGACGUAACUU 194
54790 4 99 TET2 EXON + chr4:105234297-105234317 AUGGAGAAAGACGUAACUUC 195
54790 4 100 TET2 EXON + chr4:105234298-105234318 UGGAGAAAGACGUAACUUCG 196
54790 4 106 TET2 EXON + chr4:105234320-105234340 GUAAGCCAAGAAAGAAAUCC 197
54790 4 123 TET2 EXON + chr4:105234437-105234457 UUUUCAACACAUAACUGCAG 198
54790-4-124 TET2 EXON + chr4:105234438-105234458 UUUCAACACAUAACUGCAGU 199
54790-4-134 TET2 EXON + chr4:105234475-105234495 GCUUCAGAUUCUGAAUGAGC 200
54790 4 138 TET2 EXON + chr4:105234478-105234498 UCAGAUUCUGAAUGAGCAGG 201
54790-4-140 TET2 EXON + chr4:105234479-105234499 CAGAUUCUGAAUGAGCAGGA 202
54790-4-141 TET2 EXON + chr4:105234480-105234500 AGAUUCUGAAUGAGCAGGAG 203
54790-4-147 TET2 EXON + chr4:105234529-105234549 CAUUGUAUUACUUAAAAACA 204
54790 4 151 TET2 EXON + chr4:105234548-105234568 AAGGCAGUGCUAAUGCCUAA 205
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 164/678
159/606
54790 4 153 TET2 EXON + chr4:105234574-105234594 UACAGUUUCUGCCUCUUCCG 206
54790 4 157 TET2 EXON + chr4:105234587-105234607 UCUUCCGUGGAACACACACA 207
54790-4-161 TET2 EXON + chr4:105234598-105234618 ACACACACAUGGUGAACUCC 208
54790 4 163 TET2 EXON + chr4:105234643-105234663 UCCAGAUUGUGUUUCCAUUG 209
54790-4-171 TET2 EXON + chr4:105234685-105234705 CAUAAAUGCCAUUAACAGUC 210
54790 4 177 TET2 EXON + chr4:105234734-105234754 ACUCACCCAUCGCAUACCUC 211
54790 4 178 TET2 EXON + chr4:105234735-105234755 CUCACCCAUCGCAUACCUCA 212
54790 4 181 TET2 EXON + chr4:105234793-105234813 GCCUCCAAAGCCAGCUGCAG 213
54790-4-184 TET2 EXON + chr4:105234802-105234822 GCCAGCUGCAGUGGUGAGUG 214
54790 4 200 TET2 EXON + chr4:105234943-105234963 UCCUGCAGAAAAUAACAUCC 215
54790 4 201 TET2 EXON + chr4:105234944-105234964 CCUGCAGAAAAUAACAUCCA 216
54790 4 203 TET2 EXON + chr4:105234965-105234985 GGAACCACAAAGCUAGCGUC 217
54790 4 207 TET2 EXON + chr4:105234983-105235003 UCUGGUGAAGAAUUCUGUUC 218
54790 4 211 TET2 EXON + chr4:105235010-105235030 AGCAGCAAUUUGCAAGCUCC 219
54790 4 212 TET2 EXON + chr4:105235013-105235033 AGCAAUUUGCAAGCUCCUGG 220
54790 4 216 TET2 EXON + chr4:105235026-105235046 CUCCUGGUGGCAGCUCUGAA 221
54790 4 219 TET2 EXON + chr4:105235052-105235072 UUAAAACAAAAUGAAAUGAA 222
54790 4 225 TET2 EXON + chr4:105235087-105235107 GCAAAGCUCAGUGUUCACUA 223
54790 4 235 TET2 EXON + chr4:105235162-105235182 UCCCCCUCCUCCUCUUCCAC 224
54790 4 240 TET2 EXON + chr4:105235184-105235204 GUUCCUCAGCUUCCUUCAGA 225
54790-4-245 TET2 EXON + chr4:105235202-105235222 GAAGGAAAAAGCACUCUGAA 226
54790 4 247 TET2 EXON + chr4:105235205-105235225 GGAAAAAGCACUCUGAAUGG 227
54790 4 256 TET2 EXON + chr4:105235260-105235280 AAAGUAACACAACACUUUUA 228
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 165/678
160/606
54790 4 258 TET2 EXON + chr4:105235261-105235281 AAGUAACACAACACUUUUAA 229
54790 4 262 TET2 EXON + chr4:105235276-105235296 UUUAAGGGAAGUGAAAAUAG 230
54790 4 263 TET2 EXON + chr4:105235277-105235297 UUAAGGGAAGUGAAAAUAGA 231
54790 4 268 TET2 EXON + chr4:105235288-105235308 GAAAAUAGAGGGUAAACCUG 232
54790 4 272 TET2 EXON + chr4:105235356-105235376 CUUCUCCGAUGCUUUCUGAA 233
54790 4 280 TET2 EXON + chr4:105235380-105235400 CUCAGAAUAAUUGUGUGAAC 234
54790 4 284 TET2 EXON + chr4:105235400-105235420 AGGAAUGACAUACAGACUGC 235
54790 4 286 TET2 EXON + chr4:105235401-105235421 GGAAUGACAUACAGACUGCA 236
54790 4 294 TET2 EXON + chr4:105235478-105235498 AAGCAUAACCCACCAAUUUU 237
54790 4 297 TET2 EXON + chr4:105235487-105235507 CCACCAAUUUUUGGUAGCAG 238
54790 4 302 TET2 EXON + chr4:105235498-105235518 UGGUAGCAGUGGAGAGCUAC 239
54790 4 313 TET2 EXON + chr4:105235546-105235566 CAAAGAGCAAGAGAUUCUGA 240
54790 4 314 TET2 EXON + chr4:105235547-105235567 AAAGAGCAAGAGAUUCUGAA 241
54790 4 317 TET2 EXON + chr4:105235558-105235578 GAUUCUGAAGGGUCGAGACA 242
54790-4-324 TET2 EXON + chr4:105235607-105235627 ACACAGCACUAUCUGAAACC 243
54790 4 326 TET2 EXON + chr4:105235611-105235631 AGCACUAUCUGAAACCAGGA 244
54790 4 329 TET2 EXON + chr4:105235624-105235644 ACCAGGAUGGAUUGAAUUGA 245
54790 4 333 TET2 EXON + chr4:105235645-105235665 GGCCCCUCGUUUUCACCAAG 246
54790 4 339 TET2 EXON + chr4:105235669-105235689 AUCCCAUCUAAAACGUAAUG 247
54790-4-343 TET2 EXON + chr4:105235739-105235759 AUGACCUCCAAACAAUACAC 248
54790-4-347 TET2 EXON + chr4:105235757-105235777 ACUGGAAAUUCCAACAUGCC 249
54790-4-349 TET2 EXON + chr4:105235758-105235778 CUGGAAAUUCCAACAUGCCU 250
54790 4 351 TET2 EXON + chr4:105235759-105235779 UGGAAAUUCCAACAUGCCUG 251
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 166/678
161/606
54790 4 352 TET2 EXON + chr4:105235760-105235780 GGAAAUUCCAACAUGCCUGG 252
54790 4 353 TET2 EXON + chr4:105235761-105235781 GAAAUUCCAACAUGCCUGGG 253
54790 4 355 TET2 EXON + chr4:105235770-105235790 ACAUGCCUGGGGGGCUCCCA 254
54790 4 360 TET2 EXON + chr4:105235801-105235821 CACCCAGAAAACAACACAGC 255
54790 4 365 TET2 EXON + chr4:105235841-105235861 UACCAAGUUGAAAUGAAUCA 256
54790 4 366 TET2 EXON + chr4:105235842-105235862 ACCAAGUUGAAAUGAAUCAA 257
54790 4 368 TET2 EXON + chr4:105235853-105235873 AUGAAUCAAGGGCAGUCCCA 258
54790 4 370 TET2 EXON + chr4:105235861-105235881 AGGGCAGUCCCAAGGUACAG 259
54790 4 371 TET2 EXON + chr4:105235897-105235917 GUUCCAAAAACCCUCACACC 260
54790 4 376 TET2 EXON + chr4:105235952-105235972 GCUCAUGUGCAGUCACUGUG 261
54790 4 388 TET2 EXON + chr4:105236038-105236058 GAAACAGCACUUGAAUCAAC 262
54790 4 399 TET2 EXON + chr4:105236098-105236118 GCAACAUAAGCCUCAUAAAC 263
54790 4 407 TET2 EXON + chr4:105236182-105236202 AUUACAAAUAAAGAAUAAAG 264
54790 4 416 TET2 EXON + chr4:105236237-105236257 AACAAUGAUCAGCAAAGAGA 265
54790 4 417 TET2 EXON + chr4:105236249-105236269 CAAAGAGAAGGAUCAUUCUU 266
54790 4 419 TET2 EXON + chr4:105236263-105236283 AUUCUUUGGCCAGACUAAAG 267
54790-4-426 TET2 EXON + chr4:105236279-105236299 AAAGUGGAAGAAUGUUUUCA 268
54790 4 435 TET2 EXON + chr4:105236332-105236352 CGAGACUCAUAAUGUCCAAA 269
54790 4 438 TET2 EXON + chr4:105236333-105236353 GAGACUCAUAAUGUCCAAAU 270
54790-4-440 TET2 EXON + chr4:105236338-105236358 UCAUAAUGUCCAAAUGGGAC 271
54790-4-444 TET2 EXON + chr4:105236341-105236361 UAAUGUCCAAAUGGGACUGG 272
54790 4 452 TET2 EXON + chr4:105236413-105236433 AUCAAGUGCAUGCAAAAUAC 273
54790-4-466 TET2 EXON + chr4:105236486-105236506 ACACAUCCUGAACUUUUUGC 274
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 167/678
162/606
54790-4-475 TET2 EXON + chr4:105236562-105236582 CAAAGCAAGAUCUUCUUCAC 275
54790-4-479 TET2 EXON + chr4:105236578-105236598 UCACAGGUGCUUUCAAGAAC 276
54790 4 486 TET2 EXON + chr4:105236611-105236631 ACAACAAGCUUCAGUUCUAC 277
54790 4 488 TET2 EXON + chr4:105236612-105236632 CAACAAGCUUCAGUUCUACA 278
54790-4-493 TET2 EXON + chr4:105236642-105236662 AAUAGAAACCAAGAUAUGUC 279
54790-4-494 TET2 EXON + chr4:105236673-105236693 CUGCGCAACUUGCUCAGCAA 280
54790 4 498 TET2 EXON + chr4:105236719-105236739 UGUUUUUCCUGUGCCUGACC 281
54790 4 501 TET2 EXON + chr4:105236720-105236740 GUUUUUCCUGUGCCUGACCA 282
54790 4 503 TET2 EXON + chr4:105236723-105236743 UUUCCUGUGCCUGACCAGGG 283
54790 4 511 TET2 EXON + chr4:105236752-105236772 CACUCAGACCCCUCCCCAGA 284
54790 4 512 TET2 EXON + chr4:105236778-105236798 CUCAAAAGCAUGCUGCUCUA 285
54790 4 513 TET2 EXON + chr4:105236781-105236801 AAAAGCAUGCUGCUCUAAGG 286
54790 4 518 TET2 EXON + chr4:105236856-105236876 CUUGCCAUAGUCAGAUGCAC 287
54790 4 520 TET2 EXON + chr4:105236866-105236886 UCAGAUGCACAGGCCAAUUA 288
54790 4 522 TET2 EXON + chr4:105236869-105236889 GAUGCACAGGCCAAUUAAGG 289
54790 4 525 TET2 EXON + chr4:105236876-105236896 AGGCCAAUUAAGGUGGAACC 290
54790 4 531 TET2 EXON + chr4:105236928-105236948 CACCACCAGAAAACAAAACA 291
54790 4 532 TET2 EXON + chr4:105236935-105236955 AGAAAACAAAACAUGGAAAA 292
54790-4-540 TET2 EXON + chr4:105237004-105237024 AAAGAGCAUCAUUGAGACCA 293
54790-4-545 TET2 EXON + chr4:105237052-105237072 CAAGUCGUUAUUUGACCAUA 294
54790 4 553 TET2 EXON + chr4:105237098-105237118 CAAGUAAAAGUUGAAAUGUC 295
54790 4 554 TET2 EXON + chr4:105237099-105237119 AAGUAAAAGUUGAAAUGUCA 296
54790 4 578 TET2 EXON + chr4:105237280-105237300 UACUCCUAUAAAAAAUUUAU 297
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 168/678
163/606
54790 4 582 TET2 EXON + chr4:105237329-105237349 UUCCCAUCUUGCAGAUGUGU 298
54790 4 589 TET2 EXON + chr4:105237359-105237379 CAGAAAUGUACUGAGACACA 299
54790 4 596 TET2 EXON + chr4:105237397-105237417 AGCAAAUUUAUCUUCAGAUA 300
54790 4 597 TET2 EXON + chr4:105237398-105237418 GCAAAUUUAUCUUCAGAUAU 301
54790 4 606 TET2 EXON + chr4:105237430-105237450 CUUUUUUUAAAUCUUGAGUC 302
54790 4 614 TET2 EXON + chr4:105237446-105237466 AGUCUGGCAGCAAUUUGUAA 303
54790 4 657 TET2 EXON + chr4:105237650-105237670 GCUCUUUGUAUAUUAUCUCC 304
54790 4 662 TET2 EXON + chr4:105237663-105237683 UAUCUCCUGGAGAGACAGCU 305
54790 4 668 TET2 EXON + chr4:105237708-105237728 AAUGAGAAAAUAACGACCAU 306
54790 4 670 TET2 EXON + chr4:105237748-105237768 UUUAAAUAUUUUUUAAUUCA 307
54790 4 679 TET2 EXON + chr4:105237778-105237798 UAUUAGUUUCACAAGAUUUC 308
54790 4 682 TET2 EXON + chr4:105237786-105237806 UCACAAGAUUUCUGGCUAAU 309
54790 4 686 TET2 EXON + chr4:105237787-105237807 CACAAGAUUUCUGGCUAAUA 310
54790 4 693 TET2 EXON + chr4:105237817-105237837 UAUCUUCAGUCUUCAUGAGU 311
54790 4 695 TET2 EXON + chr4:105237818-105237838 AUCUUCAGUCUUCAUGAGUU 312
54790 4 697 TET2 EXON + chr4:105237819-105237839 UCUUCAGUCUUCAUGAGUUG 313
54790 4 700 TET2 EXON + chr4:105237820-105237840 CUUCAGUCUUCAUGAGUUGG 314
54790 4 709 TET2 EXON + chr4:105237882-105237902 CUUUUCUCCAUUUAUACAUU 315
54790-4-741 TET2 EXON + chr4:105240332-105240352 AAAGCUUUUUGUUAAAAUUC 316
54790-4-746 TET2 EXON + chr4:105240344-105240364 UAAAAUUCAGGAUAUGUAAU 317
54790 4 750 TET2 EXON + chr4:105240352-105240372 AGGAUAUGUAAUAGGUCUGU 318
54790 4 754 TET2 EXON + chr4:105240377-105240397 UAGUGAAAUAUUUUUGCUGA 319
54790 4 760 TET2 EXON + chr4:105240395-105240415 GAUGGAUGUAGAUAUAUACG 320
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 169/678
164/606
54790 4 770 TET2 EXON + chr4:105240478-105240498 AGACAAAUGUUAAAUUAGUG 321
54790 4 780 TET2 EXON + chr4:105240541-105240561 GAUACCCCACACUGUGUAGA 322
54790 4 783 TET2 EXON + chr4:105240545-105240565 CCCCACACUGUGUAGAAGGA 323
54790 4 785 TET2 EXON + chr4:105240548-105240568 CACACUGUGUAGAAGGAUGG 324
54790 4 787 TET2 EXON + chr4:105240549-105240569 ACACUGUGUAGAAGGAUGGA 325
54790 4 790 TET2 EXON + chr4:105240552-105240572 CUGUGUAGAAGGAUGGAGGG 326
54790 4 791 TET2 EXON + chr4:105240579-105240599 CUACUGUCCCUCUUUGCGUG 327
54790 4 795 TET2 EXON + chr4:105240599-105240619 UGGUUAUUAAGUUGCCUCAC 328
54790 4 796 TET2 EXON + chr4:105240600-105240620 GGUUAUUAAGUUGCCUCACU 329
54790 4 800 TET2 EXON + chr4:105240634-105240654 CACAUCUCAUAGAUAAUAUU 330
54790 4 807 TET2 EXON + chr4:105240703-105240723 UCCCACUUUUCCAUCUUUGU 331
54790 4 818 TET2 EXON + chr4:105240740-105240760 UUCUUUUUGCCUGACUCUCC 332
54790 4 829 TET2 EXON + chr4:105240784-105240804 UUCUAAAGUACAUACUAAUA 333
54790 4 830 TET2 EXON + chr4:105240785-105240805 UCUAAAGUACAUACUAAUAU 334
54790 4 833 TET2 EXON + chr4:105240790-105240810 AGUACAUACUAAUAUGGGUC 335
54790-4-841 TET2 EXON + chr4:105240833-105240853 AAACAGCAAUUAAAUGUUAU 336
54790 4 842 TET2 EXON + chr4:105240834-105240854 AACAGCAAUUAAAUGUUAUA 337
54790-4-845 TET2 EXON + chr4:105240841-105240861 AUUAAAUGUUAUAGGGAAGU 338
54790 4 851 TET2 EXON + chr4:105240851-105240871 AUAGGGAAGUAGGAAGAAAA 339
54790 4 853 TET2 EXON + chr4:105240852-105240872 UAGGGAAGUAGGAAGAAAAA 340
54790 4 855 TET2 EXON + chr4:105240853-105240873 AGGGAAGUAGGAAGAAAAAG 341
54790 4 858 TET2 EXON + chr4:105240885-105240905 CAAUAAACCAAGCAAUAUUC 342
54790 4 861 TET2 EXON + chr4:105240886-105240906 AAUAAACCAAGCAAUAUUCU 343
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 170/678
165/606
54790 4 862 TET2 EXON + chr4:105240887-105240907 AUAAACCAAGCAAUAUUCUG 344
54790 4 863 TET2 EXON + chr4:105240888-105240908 UAAACCAAGCAAUAUUCUGG 345
54790 4 865 TET2 EXON + chr4:105240891-105240911 ACCAAGCAAUAUUCUGGGGG 346
54790 4 867 TET2 EXON + chr4:105240892-105240912 CCAAGCAAUAUUCUGGGGGU 347
54790 4 870 TET2 EXON + chr4:105240902-105240922 UUCUGGGGGUGGGAUAGAGC 348
54790 4 880 TET2 EXON + chr4:105240940-105240960 UCUUUUAAAAUCCAAGUAAU 349
54790 4 881 TET2 EXON + chr4:105240944-105240964 UUAAAAUCCAAGUAAUAGGU 350
54790 4 891 TET2 EXON + chr4:105240991-105241011 UUUUUUCCAGCUCAAAAAAU 351
54790 4 905 TET2 EXON + chr4:105241063-105241083 UUUGUUUAGUUUCAUUUAUU 352
54790 4 929 TET2 EXON + chr4:105241146-105241166 UGUACAUAUACUUAAUUAUG 353
54790-4-945 TET2 EXON + chr4:105241237-105241257 UAGAGCCCUUAAUGUGUAGU 354
54790-4-949 TET2 EXON + chr4:105241238-105241258 AGAGCCCUUAAUGUGUAGUU 355
54790 4 951 TET2 EXON + chr4:105241239-105241259 GAGCCCUUAAUGUGUAGUUG 356
54790 4 953 TET2 EXON + chr4:105241240-105241260 AGCCCUUAAUGUGUAGUUGG 357
54790 4 956 TET2 EXON + chr4:105241253-105241273 UAGUUGGGGGUUAAGCUUUG 358
54790 4 962 TET2 EXON + chr4:105241283-105241303 CUUUAUAUUUAGUAUAAUUG 359
54790 4 973 TET2 EXON + chr4:105241340-105241360 CAAAUUAUUGAAAAAGAUGA 360
54790 4 977 TET2 EXON + chr4:105241361-105241381 GGUCCUUUUUAUACCCAUCU 361
54790 4 979 TET2 EXON + chr4:105241367-105241387 UUUUAUACCCAUCUAGGAGC 362
54790 4 984 TET2 EXON + chr4:105241378-105241398 UCUAGGAGCAGGUCCUAAUG 363
54790 4 990 TET2 EXON + chr4:105241399-105241419 GGCAGCUAUUAGAGAAAUCA 364
54790 4 993 TET2 EXON + chr4:105241407-105241427 UUAGAGAAAUCAUGGAAGAA 365
54790 4 995 TET2 EXON + chr4:105241422-105241442 AAGAAAGGUAAUUAACGCAA 366
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166/606
54790 4 997 TET2 EXON + chr4:105241428-105241448 GGUAAUUAACGCAAAGGCAC 367
54790 4 998 TET2 EXON + chr4:105241429-105241449 GUAAUUAACGCAAAGGCACA 368
54790-4-1014 TET2 EXON + chr4:105241523-105241543 UAAAUUGAGUAAUUAUUAGU 369
54790 4 1019 TET2 EXON + chr4:105241538-105241558 UUAGUAGGCUUAGCUAUUCU 370
54790 4 1020 TET2 EXON + chr4:105241539-105241559 UAGUAGGCUUAGCUAUUCUA 371
54790 4 1029 TET2 EXON + chr4:105241592-105241612 AGAGAGUCACAAUAUUUGAC 372
54790 4 1032 TET2 EXON + chr4:105241612-105241632 AGGACUAAUAGUCUGCUAGC 373
54790 4 1033 TET2 EXON + chr4:105241618-105241638 AAUAGUCUGCUAGCUGGCAC 374
54790 4 1035 TET2 EXON + chr4:105241636-105241656 ACAGGCUGCCCACUUUGCGA 375
54790-4-1040 TET2 EXON + chr4:105241653-105241673 CGAUGGAUGCCAGAAAACCC 376
54790 4 1043 TET2 EXON + chr4:105241663-105241683 CAGAAAACCCAGGCAUGAAC 377
54790 4 1045 TET2 EXON + chr4:105241669-105241689 ACCCAGGCAUGAACAGGAAU 378
54790-4-1046 TET2 EXON + chr4:105241678-105241698 UGAACAGGAAUCGGCCAGCC 379
54790-4-1047 TET2 EXON + chr4:105241693-105241713 CAGCCAGGCUGCCAGCCACA 380
54790 4 1048 TET2 EXON + chr4:105241699-105241719 GGCUGCCAGCCACAAGGUAC 381
54790-4-1049 TET2 EXON + chr4:105241705-105241725 CAGCCACAAGGUACUGGCAC 382
54790 4 1052 TET2 EXON + chr4:105241718-105241738 CUGGCACAGGCUCCAACGAG 383
54790 4 1053 TET2 EXON + chr4:105241729-105241749 UCCAACGAGAGGUCCCACUC 384
54790 4 1058 TET2 EXON + chr4:105241770-105241790 AAGUGUCAAAGCAGAAAGAC 385
54790 4 1059 TET2 EXON + chr4:105241780-105241800 GCAGAAAGACUGGUAAAGUG 386
54790 4 1092 TET2 EXON + chr4:105241946-105241966 UUUUUUUCGCUAUCAAUCAC 387
54790 4 1109 TET2 EXON + chr4:105242012-105242032 UGAGCGAGAUAAUGCAGAGA 388
54790 4 1117 TET2 EXON + chr4:105242057-105242077 CUCUGAGCUGUUCUUCUUCU 389
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 172/678
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54790 4 1118 TET2 EXON + chr4:105242058-105242078 UCUGAGCUGUUCUUCUUCUA 390
54790 4 1123 TET2 EXON + chr4:105242076-105242096 UAGGGUGCCUUUUCAUUAAG 391
54790 4 1124 TET2 EXON + chr4:105242080-105242100 GUGCCUUUUCAUUAAGAGGU 392
54790 4 1130 TET2 EXON + chr4:105242105-105242125 GUAUUAUUAUUAAAGUACUU 393
54790 4 1135 TET2 EXON + chr4:105242114-105242134 UUAAAGUACUUAGGAUACAU 394
54790 4 1136 TET2 EXON + chr4:105242115-105242135 UAAAGUACUUAGGAUACAUU 395
54790 4 1137 TET2 EXON + chr4:105242116-105242136 AAAGUACUUAGGAUACAUUG 396
54790 4 1140 TET2 EXON + chr4:105242124-105242144 UAGGAUACAUUGGGGCAGCU 397
54790 4 1154 TET2 EXON + chr4:105242210-105242230 UUCACUAAAUAAUCAUCUAG 398
54790 4 1156 TET2 EXON + chr4:105242215-105242235 UAAAUAAUCAUCUAGUGGCC 399
54790 4 1162 TET2 EXON + chr4:105242287-105242307 UUGUUUUUUAAACAAGCAGU 400
54790 4 1163 TET2 EXON + chr4:105242290-105242310 UUUUUUAAACAAGCAGUAGG 401
54790 4 1164 TET2 EXON + chr4:105242298-105242318 ACAAGCAGUAGGUGGUGCUU 402
54790 4 1167 TET2 EXON + chr4:105242306-105242326 UAGGUGGUGCUUUGGUCAUA 403
54790 4 1169 TET2 EXON + chr4:105242307-105242327 AGGUGGUGCUUUGGUCAUAA 404
54790 4 1173 TET2 EXON + chr4:105242328-105242348 GGAAGAUAUAGUCUAUUUCU 405
54790 4 1176 TET2 EXON + chr4:105242351-105242371 ACUAUUCCAUAUUUUCCAUG 406
54790 4 1178 TET2 EXON + chr4:105242355-105242375 UUCCAUAUUUUCCAUGUGGC 407
54790 4 1187 TET2 EXON + chr4:105242404-105242424 UCUAAAUUGUGAGACAUUCU 408
54790 4 1193 TET2 EXON + chr4:105242407-105242427 AAAUUGUGAGACAUUCUUGG 409
54790 4 1201 TET2 EXON + chr4:105242469-105242489 UAAAAUAGCUAAAUUUAGUA 410
54790 4 1205 TET2 EXON + chr4:105242470-105242490 AAAAUAGCUAAAUUUAGUAA 411
54790 4 1241 TET2 EXON + chr4:105242625-105242645 AUCUGUACAUUUUGAUAUUG 412
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 173/678
168/606
54790-4-1244 TET2 EXON + chr4:105242635-105242655 UUUGAUAUUGAGGAAAAACA 413
54790 4 1250 TET2 EXON + chr4:105242663-105242683 AAACCAUUAUCCAGUUUGCU 414
54790 4 1258 TET2 EXON + chr4:105242705-105242725 UAAUAAACCGUUCAUUUCUC 415
54790 4 1259 TET2 EXON + chr4:105242711-105242731 ACCGUUCAUUUCUCAGGAUG 416
54790 4 1269 TET2 EXON - chr4:105233886-105233906 UAGUUGAAUUCUAAAGAGCA 417
54790 4 1276 TET2 EXON - chr4:105233917-105233937 UUGCUUCGGGGCCAUCCACA 418
54790 4 1278 TET2 EXON - chr4:105233929-105233949 GUUCCAUCAGGCUUGCUUCG 419
54790 4 1279 TET2 EXON - chr4:105233930-105233950 UGUUCCAUCAGGCUUGCUUC 420
54790 4 1281 TET2 EXON - chr4:105233931-105233951 CUGUUCCAUCAGGCUUGCUU 421
54790 4 1285 TET2 EXON - chr4:105233941-105233961 UGGUUCUAUCCUGUUCCAUC 422
54790 4 1288 TET2 EXON - chr4:105233961-105233981 UCUGUUGCCCUCAACAUGGU 423
54790 4 1289 TET2 EXON - chr4:105233965-105233985 UUAGUCUGUUGCCCUCAACA 424
54790 4 1290 TET2 EXON - chr4:105233990-105234010 GGAGGUGAUGGUAUCAGGAA 425
54790 4 1293 TET2 EXON - chr4:105233995-105234015 AAAUGGGAGGUGAUGGUAUC 426
54790 4 1296 TET2 EXON - chr4:105234002-105234022 GUCUGGCAAAUGGGAGGUGA 427
54790 4 1297 TET2 EXON - chr4:105234008-105234028 GGUUCUGUCUGGCAAAUGGG 428
54790 4 1298 TET2 EXON - chr4:105234011-105234031 AGAGGUUCUGUCUGGCAAAU 429
54790 4 1300 TET2 EXON - chr4:105234012-105234032 CAGAGGUUCUGUCUGGCAAA 430
54790 4 1305 TET2 EXON - chr4:105234019-105234039 UUGUAGCCAGAGGUUCUGUC 431
54790 4 1308 TET2 EXON - chr4:105234029-105234049 UUCUGGAGCUUUGUAGCCAG 432
54790 4 1310 TET2 EXON - chr4:105234046-105234066 CAGGCAGUGGGCUUCCAUUC 433
54790-4-1314 TET2 EXON - chr4:105234058-105234078 GAUGAGCUCUCUCAGGCAGU 434
54790 4 1315 TET2 EXON - chr4:105234059-105234079 GGAUGAGCUCUCUCAGGCAG 435
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 174/678
169/606
54790 4 1319 TET2 EXON - chr4:105234065-105234085 ACUUCUGGAUGAGCUCUCUC 436
54790 4 1322 TET2 EXON - chr4:105234080-105234100 UUGGUGUCUCCAUUUACUUC 437
54790 4 1327 TET2 EXON - chr4:105234099-105234119 ACUUUUGAAAGAGUGCCACU 438
54790-4-1334 TET2 EXON - chr4:105234134-105234154 UUCUGGCUUCCCUUCAUACA 439
54790 4 1335 TET2 EXON - chr4:105234135-105234155 AUUCUGGCUUCCCUUCAUAC 440
54790 4 1337 TET2 EXON - chr4:105234151-105234171 CAGGACUCACACGACUAUUC 441
54790 4 1341 TET2 EXON - chr4:105234170-105234190 CUACUUUCUUGUGUAAAGUC 442
54790 4 1351 TET2 EXON - chr4:105234201-105234221 UCCUCCAUUUUGCAAACACU 443
54790 4 1355 TET2 EXON - chr4:105234245-105234265 UGAAGGAGCCCAGAGAGAGA 444
54790 4 1367 TET2 EXON - chr4:105234262-105234282 GUUUCAAUUUCUUGAUCUGA 445
54790 4 1378 TET2 EXON - chr4:105234289-105234309 GUCUUUCUCCAUUAGCCUUU 446
54790 4 1388 TET2 EXON - chr4:105234328-105234348 UUUCACCUGGAUUUCUUUCU 447
54790 4 1392 TET2 EXON - chr4:105234341-105234361 UUUGGUUGACUGCUUUCACC 448
54790 4 1396 TET2 EXON - chr4:105234359-105234379 UCACUCAAAUCGGAGACAUU 449
54790 4 1399 TET2 EXON - chr4:105234369-105234389 UUCUUUCUUAUCACUCAAAU 450
54790-4-1410 TET2 EXON - chr4:105234408-105234428 AUCUUUAACUGCAUUUUCUU 451
54790-4-1411 TET2 EXON - chr4:105234409-105234429 AAUCUUUAACUGCAUUUUCU 452
54790-4-1416 TET2 EXON - chr4:105234435-105234455 GCAGUUAUGUGUUGAAAAAC 453
54790-4-1422 TET2 EXON - chr4:105234464-105234484 AUCUGAAGCUCUGGAUUUUC 454
54790 4 1423 TET2 EXON - chr4:105234473-105234493 UCAUUCAGAAUCUGAAGCUC 455
54790-4-1435 TET2 EXON - chr4:105234520-105234540 GUAAUACAAUGUUCUUGUCA 456
54790-4-1441 TET2 EXON - chr4:105234566-105234586 GCAGAAACUGUAGCACCAUU 457
54790-4-1444 TET2 EXON - chr4:105234588-105234608 AUGUGUGUGUUCCACGGAAG 458
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 175/678
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54790-4-1448 TET2 EXON - chr4:105234594-105234614 UUCACCAUGUGUGUGUUCCA 459
54790-4-1457 TET2 EXON - chr4:105234619-105234639 AUUGAGACAGUGUUUUUUCC 460
54790 4 1461 TET2 EXON - chr4:105234647-105234667 ACCGCAAUGGAAACACAAUC 461
54790-4-1466 TET2 EXON - chr4:105234660-105234680 UGUGGUUUUCUGCACCGCAA 462
54790 4 1471 TET2 EXON - chr4:105234678-105234698 AAUGGCAUUUAUGUGAGAUG 463
54790-4-1474 TET2 EXON - chr4:105234696-105234716 AUUAGUAGCCUGACUGUUAA 464
54790-4-1475 TET2 EXON - chr4:105234726-105234746 CGAUGGGUGAGUGAUCUCAC 465
54790-4-1479 TET2 EXON - chr4:105234742-105234762 UCUGCCCUGAGGUAUGCGAU 466
54790-4-1480 TET2 EXON - chr4:105234743-105234763 AUCUGCCCUGAGGUAUGCGA 467
54790-4-1482 TET2 EXON - chr4:105234753-105234773 UGCGGAAUUGAUCUGCCCUG 468
54790 4 1485 TET2 EXON - chr4:105234771-105234791 CUCAGAGUUAGAGGUCUGUG 469
54790-4-1490 TET2 EXON - chr4:105234780-105234800 UGGAGGCAGCUCAGAGUUAG 470
54790-4-1493 TET2 EXON - chr4:105234797-105234817 ACCACUGCAGCUGGCUUUGG 471
54790-4-1495 TET2 EXON - chr4:105234800-105234820 CUCACCACUGCAGCUGGCUU 472
54790-4-1497 TET2 EXON - chr4:105234806-105234826 GCCUCACUCACCACUGCAGC 473
54790-4-1499 TET2 EXON - chr4:105234828-105234848 AUCAGCAUCAUCAGCAUCAC 474
54790 4 1505 TET2 EXON - chr4:105234855-105234875 UAGCAUUGCAGCUAGUUUAC 475
54790 4 1510 TET2 EXON - chr4:105234882-105234902 UUCUGGUUUCUGAAAGGAAC 476
54790-4-1514 TET2 EXON - chr4:105234888-105234908 UAGUUGUUCUGGUUUCUGAA 477
54790 4 1521 TET2 EXON - chr4:105234899-105234919 UUUUGUUGUUGUAGUUGUUC 478
54790 4 1526 TET2 EXON - chr4:105234940-105234960 UGUUAUUUUCUGCAGGAGAU 479
54790 4 1527 TET2 EXON - chr4:105234941-105234961 AUGUUAUUUUCUGCAGGAGA 480
54790 4 1531 TET2 EXON - chr4:105234947-105234967 CCCUGGAUGUUAUUUUCUGC 481
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 176/678
171/606
54790 4 1535 TET2 EXON - chr4:105234964-105234984 ACGCUAGCUUUGUGGUUCCC 482
54790 4 1539 TET2 EXON - chr4:105234972-105234992 UUCACCAGACGCUAGCUUUG 483
54790 4 1545 TET2 EXON - chr4:105235011-105235031 AGGAGCUUGCAAAUUGCUGC 484
54790 4 1551 TET2 EXON - chr4:105235031-105235051 UACCGUUCAGAGCUGCCACC 485
54790 4 1569 TET2 EXON - chr4:105235116-105235136 ACCACACCAUCACCCAGAAA 486
54790 4 1577 TET2 EXON - chr4:105235166-105235186 ACCUGUGGAAGAGGAGGAGG 487
54790 4 1579 TET2 EXON - chr4:105235167-105235187 AACCUGUGGAAGAGGAGGAG 488
54790 4 1581 TET2 EXON - chr4:105235168-105235188 GAACCUGUGGAAGAGGAGGA 489
54790 4 1582 TET2 EXON - chr4:105235169-105235189 GGAACCUGUGGAAGAGGAGG 490
54790 4 1586 TET2 EXON - chr4:105235172-105235192 UGAGGAACCUGUGGAAGAGG 491
54790 4 1588 TET2 EXON - chr4:105235175-105235195 AGCUGAGGAACCUGUGGAAG 492
54790 4 1593 TET2 EXON - chr4:105235181-105235201 GAAGGAAGCUGAGGAACCUG 493
54790 4 1600 TET2 EXON - chr4:105235190-105235210 UUUCCUUCUGAAGGAAGCUG 494
54790 4 1606 TET2 EXON - chr4:105235199-105235219 AGAGUGCUUUUUCCUUCUGA 495
54790-4-1617 TET2 EXON - chr4:105235246-105235266 UACUUUGGUUGGGGUAGUGG 496
54790 4 1618 TET2 EXON - chr4:105235249-105235269 UGUUACUUUGGUUGGGGUAG 497
54790 4 1620 TET2 EXON - chr4:105235255-105235275 GUGUUGUGUUACUUUGGUUG 498
54790 4 1621 TET2 EXON - chr4:105235256-105235276 AGUGUUGUGUUACUUUGGUU 499
54790 4 1623 TET2 EXON - chr4:105235257-105235277 AAGUGUUGUGUUACUUUGGU 500
54790 4 1626 TET2 EXON - chr4:105235261-105235281 UUAAAAGUGUUGUGUUACUU 501
54790 4 1633 TET2 EXON - chr4:105235307-105235327 CUCUGGGAAGGUGGUGCCUC 502
54790-4-1634 TET2 EXON - chr4:105235316-105235336 GGAUUAGGACUCUGGGAAGG 503
54790 4 1635 TET2 EXON - chr4:105235319-105235339 GAUGGAUUAGGACUCUGGGA 504
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54790 4 1636 TET2 EXON - chr4:105235323-105235343 UGUAGAUGGAUUAGGACUCU 505
54790 4 1638 TET2 EXON - chr4:105235324-105235344 GUGUAGAUGGAUUAGGACUC 506
54790 4 1641 TET2 EXON - chr4:105235331-105235351 CAUACAUGUGUAGAUGGAUU 507
54790-4-1643 TET2 EXON - chr4:105235337-105235357 GGGCUGCAUACAUGUGUAGA 508
54790-4-1647 TET2 EXON - chr4:105235357-105235377 UUUCAGAAAGCAUCGGAGAA 509
54790-4-1648 TET2 EXON - chr4:105235358-105235378 CUUUCAGAAAGCAUCGGAGA 510
54790 4 1653 TET2 EXON - chr4:105235364-105235384 UGAGGCCUUUCAGAAAGCAU 511
54790 4 1660 TET2 EXON - chr4:105235382-105235402 CUGUUCACACAAUUAUUCUG 512
54790 4 1668 TET2 EXON - chr4:105235439-105235459 CUUGUUUUCUCAGAACACAA 513
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54790 4 1700 TET2 EXON - chr4:105235605-105235625 UUUCAGAUAGUGCUGUGUUG 521
54790 4 1702 TET2 EXON - chr4:105235606-105235626 GUUUCAGAUAGUGCUGUGUU 522
54790 4 1703 TET2 EXON - chr4:105235607-105235627 GGUUUCAGAUAGUGCUGUGU 523
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54790 4 1713 TET2 EXON - chr4:105235652-105235672 GAUUCCGCUUGGUGAAAACG 527
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 178/678
173/606
54790 4 1722 TET2 EXON - chr4:105235663-105235683 GUUUUAGAUGGGAUUCCGCU 528
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Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 179/678
174/606
54790-4-1804 TET2 EXON - chr4:105235918-105235938 CUGUUUUGGAGAAGUGCACC 551
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54790 4 1838 TET2 EXON - chr4:105236032-105236052 UCAAGUGCUGUUUCAACACU 558
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54790 4 1856 TET2 EXON - chr4:105236111-105236131 GUUUGUGCUGCCUGUUUAUG 562
54790 4 1861 TET2 EXON - chr4:105236138-105236158 GGGAGAUGUGAACUCUGGGA 563
54790 4 1862 TET2 EXON - chr4:105236142-105236162 UUGAGGGAGAUGUGAACUCU 564
54790-4-1864 TET2 EXON - chr4:105236143-105236163 UUUGAGGGAGAUGUGAACUC 565
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54790 4 1875 TET2 EXON - chr4:105236159-105236179 UGCUGCUGUUGCUGGUUUUG 567
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54790 4 1896 TET2 EXON - chr4:105236225-105236245 UCAUUGUUGCUUUGGGGGUG 570
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54790 4 1902 TET2 EXON - chr4:105236231-105236251 UGCUGAUCAUUGUUGCUUUG 572
54790-4-1904 TET2 EXON - chr4:105236232-105236252 UUGCUGAUCAUUGUUGCUUU 573
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 180/678
175/606
54790 4 1906 TET2 EXON - chr4:105236233-105236253 UUUGCUGAUCAUUGUUGCUU 574
54790-4-1914 TET2 EXON - chr4:105236275-105236295 AACAUUCUUCCACUUUAGUC 575
54790 4 1931 TET2 EXON - chr4:105236350-105236370 GUACUUCCUCCAGUCCCAUU 576
54790 4 1941 TET2 EXON - chr4:105236394-105236414 UUUCAUGGUCUGACUAUAAG 577
54790-4-1943 TET2 EXON - chr4:105236395-105236415 AUUUCAUGGUCUGACUAUAA 578
54790-4-1944 TET2 EXON - chr4:105236396-105236416 GAUUUCAUGGUCUGACUAUA 579
54790 4 1950 TET2 EXON - chr4:105236409-105236429 UUUGCAUGCACUUGAUUUCA 580
54790 4 1960 TET2 EXON - chr4:105236461-105236481 GUUCUUUAUUCUCUGAAACU 581
54790 4 1966 TET2 EXON - chr4:105236495-105236515 UUGUUUCCUGCAAAAAGUUC 582
54790 4 1972 TET2 EXON - chr4:105236520-105236540 UUGCAUGUGAUGCAAGUUUU 583
54790 4 1973 TET2 EXON - chr4:105236521-105236541 AUUGCAUGUGAUGCAAGUUU 584
54790 4 1982 TET2 EXON - chr4:105236549-105236569 UGCUUUGGGAUCACAUUAUU 585
54790-4-1984 TET2 EXON - chr4:105236563-105236583 UGUGAAGAAGAUCUUGCUUU 586
54790 4 1985 TET2 EXON - chr4:105236564-105236584 CUGUGAAGAAGAUCUUGCUU 587
54790 4 2009 TET2 EXON - chr4:105236653-105236673 CUUGUUGACCAGACAUAUCU 588
54790 4 2017 TET2 EXON - chr4:105236713-105236733 GCACAGGAAAAACAUUUGCA 589
54790 4 2019 TET2 EXON - chr4:105236729-105236749 CUUCCUCCCUGGUCAGGCAC 590
54790 4 2022 TET2 EXON - chr4:105236735-105236755 GUGUGACUUCCUCCCUGGUC 591
54790 4 2023 TET2 EXON - chr4:105236740-105236760 UCUGAGUGUGACUUCCUCCC 592
54790 4 2029 TET2 EXON - chr4:105236763-105236783 UUGAGUGUCCUUCUGGGGAG 593
54790 4 2030 TET2 EXON - chr4:105236764-105236784 UUUGAGUGUCCUUCUGGGGA 594
54790 4 2031 TET2 EXON - chr4:105236765-105236785 UUUUGAGUGUCCUUCUGGGG 595
54790 4 2034 TET2 EXON - chr4:105236768-105236788 UGCUUUUGAGUGUCCUUCUG 596
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 181/678
176/606
54790 4 2037 TET2 EXON - chr4:105236769-105236789 AUGCUUUUGAGUGUCCUUCU 597
54790 4 2039 TET2 EXON - chr4:105236770-105236790 CAUGCUUUUGAGUGUCCUUC 598
54790 4 2053 TET2 EXON - chr4:105236846-105236866 CUAUGGCAAGACUCAGUUUG 599
54790 4 2054 TET2 EXON - chr4:105236847-105236867 ACUAUGGCAAGACUCAGUUU 600
54790 4 2055 TET2 EXON - chr4:105236848-105236868 GACUAUGGCAAGACUCAGUU 601
54790 4 2060 TET2 EXON - chr4:105236863-105236883 UUGGCCUGUGCAUCUGACUA 602
54790 4 2063 TET2 EXON - chr4:105236882-105236902 CAUCCAGGUUCCACCUUAAU 603
54790 4 2064 TET2 EXON - chr4:105236897-105236917 CAGGCAUGUGGCUUGCAUCC 604
54790 4 2065 TET2 EXON - chr4:105236909-105236929 GCUGUGUGCAUACAGGCAUG 605
54790 4 2069 TET2 EXON - chr4:105236916-105236936 UGGUGGUGCUGUGUGCAUAC 606
54790 4 2077 TET2 EXON - chr4:105236933-105236953 UUCCAUGUUUUGUUUUCUGG 607
54790 4 2079 TET2 EXON - chr4:105236936-105236956 UUUUUCCAUGUUUUGUUUUC 608
54790 4 2085 TET2 EXON - chr4:105236978-105236998 ACAUUAUCACAGCUUGCAGG 609
54790 4 2089 TET2 EXON - chr4:105236981-105237001 UGCACAUUAUCACAGCUUGC 610
54790 4 2092 TET2 EXON - chr4:105237024-105237044 CUGCUUCAGAUGCUGCUCCA 611
54790 4 2096 TET2 EXON - chr4:105237054-105237074 CUUAUGGUCAAAUAACGACU 612
54790 4 2099 TET2 EXON - chr4:105237070-105237090 AUUUGAGAGUAAGAGCCUUA 613
54790 4 2112 TET2 EXON - chr4:105237125-105237145 UGUCUAGUCAAAACUGUGAC 614
54790 4 2114 TET2 EXON - chr4:105237150-105237170 GCUAUCAAGUUCUGCAGCAG 615
54790 4 2118 TET2 EXON - chr4:105237172-105237192 GCUGCUCUAAAGCUGGGGUG 616
54790 4 2119 TET2 EXON - chr4:105237177-105237197 UGUUUGCUGCUCUAAAGCUG 617
54790 4 2120 TET2 EXON - chr4:105237178-105237198 UUGUUUGCUGCUCUAAAGCU 618
54790 4 2122 TET2 EXON - chr4:105237179-105237199 GUUGUUUGCUGCUCUAAAGC 619
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 182/678
177/606
54790 4 2135 TET2 EXON - chr4:105237218-105237238 GAAGCAGCUGUUCUUUUGGU 620
54790 4 2137 TET2 EXON - chr4:105237222-105237242 AACAGAAGCAGCUGUUCUUU 621
54790 4 2148 TET2 EXON - chr4:105237266-105237286 GGAGUAUCUAGUAAUUUGGA 622
54790 4 2153 TET2 EXON - chr4:105237270-105237290 UAUAGGAGUAUCUAGUAAUU 623
54790 4 2156 TET2 EXON - chr4:105237287-105237307 GUAUCCAAUAAAUUUUUUAU 624
54790 4 2160 TET2 EXON - chr4:105237311-105237331 AAAUCAUAUUGAGUCUUGAC 625
54790 4 2163 TET2 EXON - chr4:105237334-105237354 UACCUACACAUCUGCAAGAU 626
54790 4 2165 TET2 EXON - chr4:105237335-105237355 UUACCUACACAUCUGCAAGA 627
54790 4 2170 TET2 EXON - chr4:105237361-105237381 CAUGUGUCUCAGUACAUUUC 628
54790 4 2174 TET2 EXON - chr4:105237392-105237412 GAAGAUAAAUUUGCUAAUUC 629
54790 4 2180 TET2 EXON - chr4:105237429-105237449 ACUCAAGAUUUAAAAAAAGA 630
54790 4 2197 TET2 EXON - chr4:105237510-105237530 CUUUCACAAGACACAAGCAU 631
54790 4 2206 TET2 EXON - chr4:105237558-105237578 GCACGAUUAUUUAAUUCUUU 632
54790 4 2213 TET2 EXON - chr4:105237593-105237613 UUUUACAGGAUCUGAAGAGA 633
54790 4 2215 TET2 EXON - chr4:105237594-105237614 AUUUUACAGGAUCUGAAGAG 634
54790 4 2221 TET2 EXON - chr4:105237607-105237627 CAGAUACAUUCAAAUUUUAC 635
54790 4 2225 TET2 EXON - chr4:105237645-105237665 UAAUAUACAAAGAGCUAAAU 636
54790 4 2233 TET2 EXON - chr4:105237671-105237691 UGCUGCCUAGCUGUCUCUCC 637
54790 4 2247 TET2 EXON - chr4:105237727-105237747 UUCGUACAUUAGACUGCCUA 638
54790 4 2270 TET2 EXON - chr4:105237874-105237894 AAUGGAGAAAAGGAAACUUU 639
54790 4 2274 TET2 EXON - chr4:105237884-105237904 CAAAUGUAUAAAUGGAGAAA 640
54790 4 2277 TET2 EXON - chr4:105237892-105237912 CAACAUUCCAAAUGUAUAAA 641
54790 4 2284 TET2 EXON - chr4:105237936-105237956 AGAUGAAAUUUUAGAGAAAA 642
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 183/678
178/606
54790 4 2287 TET2 EXON - chr4:105237937-105237957 AAGAUGAAAUUUUAGAGAAA 643
54790 4 2323 TET2 EXON - chr4:105240511-105240531 AGGGAAAACAUGGCACGGGU 644
54790 4 2325 TET2 EXON - chr4:105240515-105240535 CAAGAGGGAAAACAUGGCAC 645
54790 4 2326 TET2 EXON - chr4:105240516-105240536 GCAAGAGGGAAAACAUGGCA 646
54790 4 2328 TET2 EXON - chr4:105240521-105240541 UCAUUGCAAGAGGGAAAACA 647
54790 4 2330 TET2 EXON - chr4:105240530-105240550 UGGGGUAUCUCAUUGCAAGA 648
54790 4 2331 TET2 EXON - chr4:105240531-105240551 GUGGGGUAUCUCAUUGCAAG 649
54790 4 2336 TET2 EXON - chr4:105240548-105240568 CCAUCCUUCUACACAGUGUG 650
54790 4 2337 TET2 EXON - chr4:105240549-105240569 UCCAUCCUUCUACACAGUGU 651
54790 4 2338 TET2 EXON - chr4:105240550-105240570 CUCCAUCCUUCUACACAGUG 652
54790 4 2342 TET2 EXON - chr4:105240581-105240601 CACACGCAAAGAGGGACAGU 653
54790 4 2345 TET2 EXON - chr4:105240589-105240609 UUAAUAACCACACGCAAAGA 654
54790 4 2347 TET2 EXON - chr4:105240590-105240610 CUUAAUAACCACACGCAAAG 655
54790 4 2353 TET2 EXON - chr4:105240616-105240636 UGUGGUGUUUUAGCCCAGUG 656
54790 4 2357 TET2 EXON - chr4:105240634-105240654 AAUAUUAUCUAUGAGAUGUG 657
54790 4 2365 TET2 EXON - chr4:105240693-105240713 AAAAGUGGGAAGAUAGGGGU 658
54790 4 2366 TET2 EXON - chr4:105240694-105240714 GAAAAGUGGGAAGAUAGGGG 659
54790 4 2368 TET2 EXON - chr4:105240697-105240717 AUGGAAAAGUGGGAAGAUAG 660
54790 4 2369 TET2 EXON - chr4:105240698-105240718 GAUGGAAAAGUGGGAAGAUA 661
54790 4 2370 TET2 EXON - chr4:105240699-105240719 AGAUGGAAAAGUGGGAAGAU 662
54790 4 2373 TET2 EXON - chr4:105240707-105240727 ACCAACAAAGAUGGAAAAGU 663
54790 4 2377 TET2 EXON - chr4:105240708-105240728 AACCAACAAAGAUGGAAAAG 664
54790 4 2380 TET2 EXON - chr4:105240716-105240736 CUGUUGCAAACCAACAAAGA 665
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 184/678
179/606
54790 4 2382 TET2 EXON - chr4:105240739-105240759 GAGAGUCAGGCAAAAAGAAG 666
54790 4 2383 TET2 EXON - chr4:105240740-105240760 GGAGAGUCAGGCAAAAAGAA 667
54790 4 2384 TET2 EXON - chr4:105240741-105240761 UGGAGAGUCAGGCAAAAAGA 668
54790 4 2389 TET2 EXON - chr4:105240752-105240772 AGAGAAAAUCCUGGAGAGUC 669
54790 4 2393 TET2 EXON - chr4:105240761-105240781 UUUAUGAUGAGAGAAAAUCC 670
54790 4 2422 TET2 EXON - chr4:105240882-105240902 UAUUGCUUGGUUUAUUGUCA 671
54790-4-2424 TET2 EXON - chr4:105240895-105240915 CCCACCCCCAGAAUAUUGCU 672
54790-4-2434 TET2 EXON - chr4:105240954-105240974 CUGGAAGCCUACCUAUUACU 673
54790 4 2439 TET2 EXON - chr4:105240973-105240993 AAAAAACAUUUAAAGCUAAC 674
54790-4-2446 TET2 EXON - chr4:105241000-105241020 UACAAUCCAAUUUUUUGAGC 675
54790-4-2454 TET2 EXON - chr4:105241052-105241072 CUAAACAAAGAAUACAGUGA 676
54790 4 2456 TET2 EXON - chr4:105241053-105241073 ACUAAACAAAGAAUACAGUG 677
54790 4 2468 TET2 EXON - chr4:105241107-105241127 AUAUAUUACAUUUCAGAUAU 678
54790 4 2469 TET2 EXON - chr4:105241108-105241128 AAUAUAUUACAUUUCAGAUA 679
54790 4 2475 TET2 EXON - chr4:105241136-105241156 UAUAUGUACAUGCUGGUUGU 680
54790 4 2477 TET2 EXON - chr4:105241143-105241163 AAUUAAGUAUAUGUACAUGC 681
54790 4 2488 TET2 EXON - chr4:105241193-105241213 CUUUAAAAUGAGUAGAUUGA 682
54790 4 2498 TET2 EXON - chr4:105241245-105241265 AACCCCCAACUACACAUUAA 683
54790 4 2499 TET2 EXON - chr4:105241246-105241266 UAACCCCCAACUACACAU UA 684
54790 4 2503 TET2 EXON - chr4:105241285-105241305 CUCAAUUAUACUAAAUAUAA 685
54790 4 2519 TET2 EXON - chr4:105241367-105241387 GCUCCUAGAUGGGUAUAAAA 686
54790 4 2522 TET2 EXON - chr4:105241377-105241397 AUUAGGACCUGCUCCUAGAU 687
54790 4 2523 TET2 EXON - chr4:105241378-105241398 CAUUAGGACCUGCUCCUAGA 688
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 185/678
180/606
54790 4 2527 TET2 EXON - chr4:105241394-105241414 UCUCUAAUAGCUGCCACAUU 689
54790 4 2538 TET2 EXON - chr4:105241470-105241490 AAAAUUCUGACAUAUACAAA 690
54790 4 2546 TET2 EXON - chr4:105241494-105241514 ACUGCUUUGUGUGUGAAGGC 691
54790 4 2548 TET2 EXON - chr4:105241498-105241518 GUUUACUGCUUUGUGUGUGA 692
54790 4 2555 TET2 EXON - chr4:105241568-105241588 AAUAGCACAGUGUGUAGUGU 693
54790 4 2558 TET2 EXON - chr4:105241593-105241613 UGUCAAAUAUUGUGACUCUC 694
54790 4 2563 TET2 EXON - chr4:105241647-105241667 UCUGGCAUCCAUCGCAAAGU 695
54790 4 2564 TET2 EXON - chr4:105241648-105241668 UUCUGGCAUCCAUCGCAAAG 696
54790 4 2568 TET2 EXON - chr4:105241665-105241685 CUGUUCAUGCCUGGGUUUUC 697
54790 4 2569 TET2 EXON - chr4:105241673-105241693 GCCGAUUCCUGUUCAUGCCU 698
54790 4 2570 TET2 EXON - chr4:105241674-105241694 GGCCGAUUCCUGUUCAUGCC 699
54790 4 2573 TET2 EXON - chr4:105241695-105241715 CUUGUGGCUGGCAGCCUGGC 700
54790 4 2574 TET2 EXON - chr4:105241699-105241719 GUACCUUGUGGCUGGCAGCC 701
54790 4 2575 TET2 EXON - chr4:105241707-105241727 CUGUGCCAGUACCUUGUGGC 702
54790 4 2577 TET2 EXON - chr4:105241711-105241731 GAGCCUGUGCCAGUACCUUG 703
54790 4 2578 TET2 EXON - chr4:105241733-105241753 GCCAGAGUGGGACCUCUCGU 704
54790 4 2582 TET2 EXON - chr4:105241745-105241765 UCAGGUGGGAAAGCCAGAGU 705
54790 4 2585 TET2 EXON - chr4:105241746-105241766 AUCAGGUGGGAAAGCCAGAG 706
54790 4 2591 TET2 EXON - chr4:105241759-105241779 UUGACACUUUAUUAUCAGGU 707
54790 4 2595 TET2 EXON - chr4:105241760-105241780 UUUGACACUUUAUUAUCAGG 708
54790 4 2598 TET2 EXON - chr4:105241763-105241783 UGCUUUGACACUUUAUUAUC 709
54790 4 2609 TET2 EXON - chr4:105241819-105241839 ACUAGGUGAAUUUAAUUCAG 710
54790 4 2613 TET2 EXON - chr4:105241836-105241856 AAGUACUCAUUUGCAACACU 711
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 186/678
181/606
54790 4 2622 TET2 EXON - chr4:105241878-105241898 UCACACUUGCUCUCUUUUUA 712
54790 4 2629 TET2 EXON - chr4:105241939-105241959 AUAGCGAAAAAAAAAAAAAA 713
54790 4 2633 TET2 EXON - chr4:105241986-105242006 UCUUCUACAUGCAGGAGUAA 714
54790 4 2635 TET2 EXON - chr4:105241994-105242014 CAUAAGAGUCUUCUACAUGC 715
54790 4 2642 TET2 EXON - chr4:105242038-105242058 GCUGUAUAAAUUUAUAUGAA 716
54790 4 2652 TET2 EXON - chr4:105242086-105242106 CUGCCUACCUCUUAAUGAAA 717
54790 4 2663 TET2 EXON - chr4:105242173-105242193 AGAAAUGAAUAAUUUGGAAA 718
54790 4 2665 TET2 EXON - chr4:105242179-105242199 UAAUUUAGAAAUGAAUAAUU 719
54790 4 2679 TET2 EXON - chr4:105242236-105242256 GGAAAUUCACUAUUUCUGCC 720
54790 4 2681 TET2 EXON - chr4:105242257-105242277 GUUGUUUUUUUUGGCACUUA 721
54790 4 2683 TET2 EXON - chr4:105242258-105242278 UGUUGUUUUUUUUGGCACUU 722
54790 4 2685 TET2 EXON - chr4:105242266-105242286 UGUUUUUUUGUUGUUUUUUU 723
54790 4 2694 TET2 EXON - chr4:105242360-105242380 AUCCAGCCACAUGGAAAAUA 724
54790 4 2697 TET2 EXON - chr4:105242369-105242389 AUAGUUAGUAUCCAGCCACA 725
54790 4 2701 TET2 EXON - chr4:105242395-105242415 CACAAUUUAGAAAAGGAGGC 726
54790 4 2702 TET2 EXON - chr4:105242399-105242419 GUCUCACAAUUUAGAAAAGG 727
54790 4 2703 TET2 EXON - chr4:105242402-105242422 AAUGUCUCACAAUUUAGAAA 728
54790 4 2721 TET2 EXON - chr4:105242462-105242482 UUUAGCUAUUUUAAAACUUG 729
54790 4 2723 TET2 EXON - chr4:105242463-105242483 AUUUAGCUAUUUUAAAACUU 730
54790 4 2726 TET2 EXON - chr4:105242464-105242484 AAUUUAGCUAUUUUAAAACU 731
54790 4 2742 TET2 EXON - chr4:105242539-105242559 UUUCACAAAGCACAAAAUUC 732
54790 4 2749 TET2 EXON - chr4:105242583-105242603 AAUUACAUGUGGGUGAAAAU 733
54790 4 2752 TET2 EXON - chr4:105242584-105242604 AAAUUACAUGUGGGUGAAAA 734
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 187/678
182/606
54790 4 2755 TET2 EXON - chr4:105242593-105242613 CUAUUUUGUAAAUUACAUGU 735
54790 4 2756 TET2 EXON - chr4:105242594-105242614 ACUAUUUUGUAAAUUACAUG 736
54790 4 2769 TET2 EXON - chr4:105242669-105242689 ACGCCAAGCAAACUGGAUAA 737
54790 4 2772 TET2 EXON - chr4:105242676-105242696 CAGGUCUACGCCAAGCAAAC 738
54790 4 2780 TET2 EXON - chr4:105242695-105242715 CGGUUUAUUAUUUUUUAAAC 739
54790 4 2781 TET2 EXON - chr4:105242715-105242735 ACCACAUCCUGAGAAAUGAA 740
54790 5 3 TET2 EXON + chr4:105242816-105242836 CUGUGGGUUUCUUUAAGGUU 741
54790 5 7 TET2 EXON + chr4:105242824-105242844 UUCUUUAAGGUUUGGACAGA 742
54790 5 8 TET2 EXON + chr4:105242825-105242845 UCUUUAAGGUUUGGACAGAA 743
54790 5 15 TET2 EXON + chr4:105242838-105242858 GACAGAAGGGUAAAGCUAUU 744
54790 5 20 TET2 EXON + chr4:105242861-105242881 AUUGAAAGAGUCAUCUAUAC 745
54790 5 23 TET2 EXON + chr4:105242870-105242890 GUCAUCUAUACUGGUAAAGA 746
54790 5 26 TET2 EXON + chr4:105242884-105242904 UAAAGAAGGCAAAAGUUCUC 747
54790 5 27 TET2 EXON + chr4:105242885-105242905 AAAGAAGGCAAAAGUUCUCA 748
54790 5 30 TET2 EXON + chr4:105242904-105242924 AGGGAUGUCCUAUUGCUAAG 749
54790 5 31 TET2 EXON + chr4:105242905-105242925 GGGAUGUCCUAUUGCUAAGU 750
54790 5 51 TET2 EXON - chr4:105242915-105242935 ACACUUACCCACUUAGCAAU 751
54790 6 1 TET2 EXON + chr4:105243550-105243570 GGAAUGGUGAUCCACGCAGG 752
54790 6 7 TET2 EXON + chr4:105243589-105243609 UGAAGAGAAGCUACUGUGUU 753
54790 6 9 TET2 EXON + chr4:105243594-105243614 AGAAGCUACUGUGUUUGGUG 754
54790 6 12 TET2 EXON + chr4:105243595-105243615 GAAGCUACUGUGUUUGGUGC 755
54790-6-14 TET2 EXON + chr4:105243605-105243625 UGUUUGGUGCGGGAGCGAGC 756
54790 6 18 TET2 EXON + chr4:105243619-105243639 GCGAGCUGGCCACACCUGUG 757
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 188/678
183/606
54790 6 19 TET2 EXON + chr4:105243646-105243666 AGUGAUUGUGAUUCUCAUCC 758
54790 6 21 TET2 EXON + chr4:105243651-105243671 UUGUGAUUCUCAUCCUGGUG 759
54790 6 24 TET2 EXON + chr4:105243652-105243672 UGUGAUUCUCAUCCUGGUGU 760
54790 6 27 TET2 EXON + chr4:105243656-105243676 AUUCUCAUCCUGGUGUGGGA 761
54790 6 30 TET2 EXON + chr4:105243673-105243693 GGAAGGAAUCCCGCUGUCUC 762
54790 6 32 TET2 EXON + chr4:105243691-105243711 UCUGGCUGACAAACUCUACU 763
54790 6 37 TET2 EXON + chr4:105243711-105243731 CGGAGCUUACCGAGACGCUG 764
54790 6 39 TET2 EXON + chr4:105243719-105243739 ACCGAGACGCUGAGGAAAUA 765
54790 6 41 TET2 EXON + chr4:105243738-105243758 ACGGCACGCUCACCAAUCGC 766
54790 6 48 TET2 EXON + chr4:105243771-105243791 AUGAAGAGUAAGUGAAGCCC 767
54790 6 49 TET2 EXON + chr4:105243772-105243792 UGAAGAGUAAGUGAAGCCCA 768
54790 6 51 TET2 EXON - chr4:105243564-105243584 GCUUCUGCGAACCACCUGCG 769
54790 6 56 TET2 EXON - chr4:105243631-105243651 UCACUGCAGCCUCACAGGUG 770
54790 6 57 TET2 EXON - chr4:105243636-105243656 CACAAUCACUGCAGCCUCAC 771
54790 6 62 TET2 EXON - chr4:105243667-105243687 GCGGGAUUCCUUCCCACACC 772
54790 6 66 TET2 EXON - chr4:105243685-105243705 GUUUGUCAGCCAGAGACAGC 773
54790 6 67 TET2 EXON - chr4:105243686-105243706 AGUUUGUCAGCCAGAGACAG 774
54790 6 75 TET2 EXON - chr4:105243723-105243743 GCCGUAUUUCCUCAGCGUCU 775
54790 6 80 TET2 EXON - chr4:105243753-105243773 AUUCAAGGCACACCGGCGAU 776
54790 6 82 TET2 EXON - chr4:105243760-105243780 ACUCUUCAUUCAAGGCACAC 777
54790 6 84 TET2 EXON - chr4:105243768-105243788 CUUCACUUACUCUUCAUUCA 778
54790 7 10 TET2 EXON + chr4:105259615-105259635 CAGGAGAACUUGCGCCUGUC 779
54790 7 12 TET2 EXON + chr4:105259616-105259636 AGGAGAACUUGCGCCUGUCA 780
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 189/678
184/606
54790-7-14 TET2 EXON + chr4:105259617-105259637 GGAGAACUUGCGCCUGUCAG 781
54790 7 16 TET2 EXON + chr4:105259621-105259641 AACUUGCGCCUGUCAGGGGC 782
54790 7 20 TET2 EXON + chr4:105259637-105259657 GGGCUGGAUCCAGAAACCUG 783
54790 7 21 TET2 EXON + chr4:105259655-105259675 UGUGGUGCCUCCUUCUCUUU 784
54790 7 23 TET2 EXON + chr4:105259665-105259685 CCUUCUCUUUUGGUUGUUCA 785
54790 7 31 TET2 EXON + chr4:105259682-105259702 UCAUGGAGCAUGUACUACAA 786
54790 7 35 TET2 EXON + chr4:105259713-105259733 UUGCCAGAAGCAAGAUCCCA 787
54790 7 41 TET2 EXON + chr4:105259730-105259750 CCAAGGAAGUUUAAGCUGCU 788
54790 7 42 TET2 EXON + chr4:105259731-105259751 CAAGGAAGUUUAAGCUGCUU 789
54790-7-44 TET2 EXON + chr4:105259732-105259752 AAGGAAGUUUAAGCUGCUUG 790
54790 7 48 TET2 EXON + chr4:105259747-105259767 GCUUGGGGAUGACCCAAAAG 791
54790 7 53 TET2 EXON - chr4:105259632-105259652 UUCUGGAUCCAGCCCCUGAC 792
54790 7 54 TET2 EXON - chr4:105259649-105259669 AAGGAGGCACCACAGGUUUC 793
54790 7 56 TET2 EXON - chr4:105259656-105259676 AAAAGAGAAGGAGGCACCAC 794
54790 7 57 TET2 EXON - chr4:105259665-105259685 UGAACAACCAAAAGAGAAGG 795
54790 7 58 TET2 EXON - chr4:105259668-105259688 CCAUGAACAACCAAAAGAGA 796
54790 7 72 TET2 EXON - chr4:105259719-105259739 CUUCCUUGGGAUCUUGCUUC 797
54790 7 73 TET2 EXON - chr4:105259732-105259752 CAAGCAGCUUAAACUUCCUU 798
54790 7 74 TET2 EXON - chr4:105259733-105259753 CCAAGCAGCUUAAACUUCCU 799
54790 7 80 TET2 EXON - chr4:105259762-105259782 GAAGUAAACAAACCUCUUUU 800
54790 7 81 TET2 EXON - chr4:105259763-105259783 GGAAGUAAACAAACCUCUUU 801
54790 8 8 TET2 EXON + chr4:105261748-105261768 CUUUAUACAGGAAGAGAAAC 802
54790 8 12 TET2 EXON + chr4:105261781-105261801 GCAAAACCUGUCCACUCUUA 803
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 190/678
185/606
54790 8 18 TET2 EXON + chr4:105261826-105261846 ACCUGAUGCAUAUAAUAAUC 804
54790 8 27 TET2 EXON - chr4:105261790-105261810 UUGGUGCCAUAAGAGUGGAC 805
54790 8 30 TET2 EXON - chr4:105261795-105261815 AUAUGUUGGUGCCAUAAGAG 806
54790 8 34 TET2 EXON - chr4:105261809-105261829 GGUGCAAGUUUCUUAUAUGU 807
54790 8 38 TET2 EXON - chr4:105261830-105261850 ACCUGAU UAU UAUAUGCAUC 808
54790-9-14 TET2 EXON + chr4:105269623-105269643 CAGAGCACCAGAGUGCCGUC 809
54790 9 15 TET2 EXON + chr4:105269624-105269644 AGAGCACCAGAGUGCCGUCU 810
54790 9 19 TET2 EXON + chr4:105269632-105269652 AGAGUGCCGUCUGGGUCUGA 811
54790 9 20 TET2 EXON + chr4:105269636-105269656 UGCCGUCUGGGUCUGAAGGA 812
54790 9 22 TET2 EXON + chr4:105269651-105269671 AAGGAAGGCCGUCCAUUCUC 813
54790 9 24 TET2 EXON + chr4:105269652-105269672 AGGAAGGCCGUCCAUUCUCA 814
54790 9 25 TET2 EXON + chr4:105269653-105269673 GGAAGGCCGUCCAUUCUCAG 815
54790 9 27 TET2 EXON + chr4:105269668-105269688 CUCAGGGGUCACUGCAUGUU 816
54790 9 35 TET2 EXON + chr4:105269714-105269734 GACUUGCACAACAUGCAGAA 817
54790 9 37 TET2 EXON + chr4:105269725-105269745 CAUGCAGAAUGGCAGCACAU 818
54790 9 39 TET2 EXON + chr4:105269733-105269753 AUGGCAGCACAUUGGUAAGU 819
54790 9 40 TET2 EXON + chr4:105269734-105269754 UGGCAGCACAUUGGUAAGUU 820
54790 9 43 TET2 EXON + chr4:105269740-105269760 CACAUUGGUAAGUUGGGCUG 821
54790 9 49 TET2 EXON - chr4:105269633-105269653 UUCAGACCCAGACGGCACUC 822
54790 9 50 TET2 EXON - chr4:105269641-105269661 GGCCUUCCUUCAGACCCAGA 823
54790 9 51 TET2 EXON - chr4:105269662-105269682 CAGUGACCCCUGAGAAUGGA 824
54790 9 52 TET2 EXON - chr4:105269666-105269686 CAUGCAGUGACCCCUGAGAA 825
54790 9 61 TET2 EXON - chr4:105269709-105269729 CAUGUUGUGCAAGUCUCUGU 826
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 191/678
186/606
54790 9 62 TET2 EXON - chr4:105269710-105269730 GCAUGUUGUGCAAGUCUCUG 827
54790 10 10 TET2 EXON + chr4:105272578-105272598 AGAGAAGACAAUCGAGAAUU 828
54790 10 13 TET2 EXON + chr4:105272581-105272601 GAAGACAAUCGAGAAUUUGG 829
54790 10 16 TET2 EXON + chr4:105272592-105272612 AGAAUUUGGAGGAAAACCUG 830
54790 10 23 TET2 EXON + chr4:105272637-105272657 UUUAUACAAAGUCUCUGACG 831
54790 10 29 TET2 EXON + chr4:105272647-105272667 GUCUCUGACGUGGAUGAGUU 832
54790 10 30 TET2 EXON + chr4:105272648-105272668 UCUCUGACGUGGAUGAGUUU 833
54790 10 33 TET2 EXON + chr4:105272655-105272675 CGUGGAUGAGUUUGGGAGUG 834
54790 10 36 TET2 EXON + chr4:105272664-105272684 GUUUGGGAGUGUGGAAGCUC 835
54790 10 40 TET2 EXON + chr4:105272667-105272687 UGGGAGUGUGGAAGCUCAGG 836
54790 10 46 TET2 EXON + chr4:105272678-105272698 AAGCUCAGGAGGAGAAAAAA 837
54790 10 48 TET2 EXON + chr4:105272683-105272703 CAGGAGGAGAAAAAACGGAG 838
54790 10 49 TET2 EXON + chr4:105272694-105272714 AAAACGGAGUGGUGCCAUUC 839
54790 10 51 TET2 EXON + chr4:105272711-105272731 UUCAGGUACUGAGUUCUUUU 840
54790 10 55 TET2 EXON + chr4:105272723-105272743 GUUCUUUUCGGCGAAAAGUC 841
54790 10 64 TET2 EXON + chr4:105272759-105272779 CAGUCAAGACUUGCCGACAA 842
54790 10 71 TET2 EXON + chr4:105272805-105272825 AGCUGAAAAGCUUUCCUCCC 843
54790 10 78 TET2 EXON + chr4:105272832-105272852 CAGCUCAAAUAAAAAUGAAA 844
54790 10 81 TET2 EXON + chr4:105272880-105272900 ACAAACUGAAAACGCAAGCC 845
54790 10 82 TET2 EXON + chr4:105272892-105272912 CGCAAGCCAGGCUAAACAGU 846
54790 10 83 TET2 EXON + chr4:105272896-105272916 AGCCAGGCUAAACAGUUGGC 847
54790 10 85 TET2 EXON - chr4:105272557-105272577 GUGAGAGUGCAUACCUGGUA 848
54790 10 87 TET2 EXON - chr4:105272558-105272578 AGUGAGAGUGCAUACCUGGU 849
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 192/678
187/606
54790 10 91 TET2 EXON - chr4:105272562-105272582 CUCUAGUGAGAGUGCAUACC 850
54790 10 99 TET2 EXON - chr4:105272611-105272631 ACGUGAAGCUGCUCAUCCUC 851
54790 10 105 TET2 EXON - chr4:105272638-105272658 ACGUCAGAGACUUUGUAUAA 852
54790 10 114 TET2 EXON - chr4:105272711-105272731 AAAAGAACUCAGUACCUGAA 853
54790 10 127 TET2 EXON - chr4:105272761-105272781 CUUUGUCGGCAAGUCUUGAC 854
54790 10 132 TET2 EXON - chr4:105272775-105272795 UGGCUUCUAGUUUCCUUUGU 855
54790 10 136 TET2 EXON - chr4:105272795-105272815 CUUUUCAGCUGCAGCUUUCU 856
54790 10 145 TET2 EXON - chr4:105272822-105272842 AUUUGAGCUGUUCUCCAGGG 857
54790 10 147 TET2 EXON - chr4:105272825-105272845 UUUAUUUGAGCUGUUCUCCA 858
54790 10 150 TET2 EXON - chr4:105272826-105272846 UUUUAUUUGAGCUGUUCUCC 859
54790 10 167 TET2 EXON - chr4:105272867-105272887 AGUUUGUUUUGUACGUGAUG 860
54790 10 168 TET2 EXON - chr4:105272868-105272888 CAGUUUGUUUUGUACGUGAU 861
54790 10 169 TET2 EXON - chr4:105272869-105272889 UCAGUUUGUUUUGUACGUGA 862
54790 10 177 TET2 EXON - chr4:105272901-105272921 UACCUGCCAACUGUUUAGCC 863
54790 11_9 TET2 EXON + chr4:105275178-105275198 GUCAACUCUUAUUCUGCUUC 864
54790 11 14 TET2 EXON + chr4:105275203-105275223 CCACCAAUCCAUACAUGAGA 865
54790 11 19 TET2 EXON + chr4:105275256-105275276 UCACACACUUCAGAUAUCUA 866
54790 11-24 TET2 EXON + chr4:105275304-105275324 UCCACCUCAUCUCAAGCUGC 867
54790 11-34 TET2 EXON + chr4:105275346-105275366 AAUCCCAUGAACCCUUACCC 868
54790 11 35 TET2 EXON + chr4:105275347-105275367 AUCCCAUGAACCCU UACCCU 869
54790 11-44 TET2 EXON + chr4:105275391-105275411 UAUCCAUCAUAUCAAUGCAA 870
54790 11-47 TET2 EXON + chr4:105275405-105275425 AUGCAAUGGAAACCUAUCAG 871
54790 11-49 TET2 EXON + chr4:105275426-105275446 GGACAACUGCUCCCCAUAUC 872
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 193/678
188/606
54790 11 50 TET2 EXON + chr4:105275427-105275447 GACAACUGCUCCCCAUAUCU 873
54790 11 53 TET2 EXON + chr4:105275456-105275476 UUCUCCCCAGUCUCAGCCGA 874
54790 11 55 TET2 EXON + chr4:105275467-105275487 CUCAGCCGAUGGAUCUGUAU 875
54790 11 56 TET2 EXON + chr4:105275533-105275553 UCCAUACACUUUACCAGCCA 876
54790 11 59 TET2 EXON + chr4:105275538-105275558 ACACUUUACCAGCCAAGGUU 877
54790 11 65 TET2 EXON + chr4:105275571-105275591 AGUUUUACAUCUAAAUACUU 878
54790 11 68 TET2 EXON + chr4:105275577-105275597 ACAUCUAAAUACUUAGGUUA 879
54790 11-74 TET2 EXON + chr4:105275594-105275614 UUAUGGAAACCAAAAUAUGC 880
54790 11 77 TET2 EXON + chr4:105275595-105275615 UAUGGAAACCAAAAUAUGCA 881
54790 11 79 TET2 EXON + chr4:105275601-105275621 AACCAAAAUAUGCAGGGAGA 882
54790 11 85 TET2 EXON + chr4:105275643-105275663 AGACCAAAUGUACAUCAUGU 883
54790 11 86 TET2 EXON + chr4:105275644-105275664 GACCAAAUGUACAUCAUGUA 884
54790 11 92 TET2 EXON + chr4:105275675-105275695 UCCUUAUCCCACUCAUGAGA 885
54790 11 93 TET2 EXON + chr4:105275679-105275699 UAUCCCACUCAUGAGAUGGA 886
54790 11 96 TET2 EXON + chr4:105275690-105275710 UGAGAUGGAUGGCCACUUCA 887
54790 11 99 TET2 EXON + chr4:105275691-105275711 GAGAUGGAUGGCCACUUCAU 888
54790 11 104 TET2 EXON + chr4:105275735-105275755 CAAUCUGAGCAAUCCAAACA 889
54790 11 105 TET2 EXON + chr4:105275748-105275768 CCAAACAUGGACUAUAAAAA 890
54790_11_110 TET2 EXON + chr4:105275798-105275818 CCAUAACUACAGUGCAGCUC 891
54790 11_111 TET2 EXON + chr4:105275799-105275819 CAUAACUACAGUGCAGCUCC 892
54790_11_116 TET2 EXON + chr4:105275843-105275863 UGCCCUGCAUCUCCAAAACA 893
54790 11 120 TET2 EXON + chr4:105275874-105275894 AUGCUUUCCCACACAGCUAA 894
54790 11 121 TET2 EXON + chr4:105275875-105275895 UGCUUUCCCACACAGCUAAU 895
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 194/678
189/606
54790 11 129 TET2 EXON + chr4:105275928-105275948 GAUAGAACUGCUUGUGUCCA 896
54790 11 131 TET2 EXON + chr4:105275931-105275951 AGAACUGCUUGUGUCCAAGG 897
54790 11 133 TET2 EXON + chr4:105275958-105275978 CACAAAUUAAGUGAUGCUAA 898
54790 11 137 TET2 EXON + chr4:105275963-105275983 AUUAAGUGAUGCUAAUGGUC 899
54790 11 139 TET2 EXON + chr4:105275978-105275998 UGGUCAGGAAAAGCAGCCAU 900
54790 11 141 TET2 EXON + chr4:105275990-105276010 GCAGCCAUUGGCACUAGUCC 901
54790 11 142 TET2 EXON + chr4:105275991-105276011 CAGCCAUUGGCACUAGUCCA 902
54790 11 143 TET2 EXON + chr4:105275996-105276016 AUUGGCACUAGUCCAGGGUG 903
54790 11 145 TET2 EXON + chr4:105276003-105276023 CUAGUCCAGGGUGUGGCUUC 904
54790 11 148 TET2 EXON + chr4:105276011-105276031 GGGUGUGGCUUCUGGUGCAG 905
54790 11 150 TET2 EXON + chr4:105276023-105276043 UGGUGCAGAGGACAACGAUG 906
54790 11 152 TET2 EXON + chr4:105276028-105276048 CAGAGGACAACGAUGAGGUC 907
54790 11 156 TET2 EXON + chr4:105276053-105276073 AGACAGCGAGCAGAGCUUUC 908
54790 11 158 TET2 EXON + chr4:105276066-105276086 AGCUUUCUGGAUCCUGACAU 909
54790 11 160 TET2 EXON + chr4:105276067-105276087 GCUUUCUGGAUCCUGACAUU 910
54790 11 162 TET2 EXON + chr4:105276068-105276088 CUUUCUGGAUCCUGACAUUG 911
54790 11 165 TET2 EXON + chr4:105276069-105276089 UUUCUGGAUCCUGACAUUGG 912
54790 11 168 TET2 EXON + chr4:105276074-105276094 GGAUCCUGACAUUGGGGGAG 913
54790 11 169 TET2 EXON + chr4:105276080-105276100 UGACAUUGGGGGAGUGGCCG 914
54790 11 172 TET2 EXON + chr4:105276093-105276113 GUGGCCGUGGCUCCAACUCA 915
54790 11 173 TET2 EXON + chr4:105276094-105276114 UGGCCGUGGCUCCAACUCAU 916
54790 11 182 TET2 EXON + chr4:105276160-105276180 CCCCUUUAAAGAAUCCCAAU 917
54790 11 186 TET2 EXON + chr4:105276175-105276195 CCAAUAGGAAUCACCCCACC 918
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 195/678
190/606
54790 11 193 TET2 EXON + chr4:105276225-105276245 AGCAUGAAUGAGCCAAAACA 919
54790 11 194 TET2 EXON + chr4:105276230-105276250 GAAUGAGCCAAAACAUGGCU 920
54790 11 196 TET2 EXON + chr4:105276238-105276258 CAAAACAUGGCUUGGCUCUU 921
54790 11 199 TET2 EXON + chr4:105276239-105276259 AAAACAUGGCUUGGCUCUUU 922
54790 11 200 TET2 EXON + chr4:105276251-105276271 GGCUCUUUGGGAAGCCAAAA 923
54790 11 210 TET2 EXON + chr4:105276275-105276295 UGAAAAAGCCCGUGAGAAAG 924
54790 11 214 TET2 EXON + chr4:105276294-105276314 GAGGAAGAGUGUGAAAAGUA 925
54790 11 217 TET2 EXON + chr4:105276324-105276344 UAUGUGCCUCAGAAAUCCCA 926
54790 11 221 TET2 EXON + chr4:105276340-105276360 CCCAUGGCAAAAAAGUGAAA 927
54790 11 223 TET2 EXON + chr4:105276341-105276361 CCAUGGCAAAAAAGUGAAAC 928
54790 11_231 TET2 EXON + chr4:105276409-105276429 UCAUCAAGUCUCUUGCCGAA 929
54790 11 236 TET2 EXON + chr4:105276466-105276486 CAUCUCCAUAUGCCUUCACU 930
54790 11 237 TET2 EXON + chr4:105276467-105276487 AUCUCCAUAUGCCUUCACUC 931
54790 11 239 TET2 EXON + chr4:105276474-105276494 UAUGCCUUCACUCGGGUCAC 932
54790 11-240 TET2 EXON + chr4:105276475-105276495 AUGCCUUCACUCGGGUCACA 933
54790 11-243 TET2 EXON + chr4:105276515-105276535 AUGAUAUCACCCCCUUUUGU 934
54790 11 252 TET2 EXON + chr4:105276573-105276593 GUAGUAUAGUUCUCAUGACG 935
54790 11 253 TET2 EXON + chr4:105276574-105276594 UAGUAUAGUUCUCAUGACGU 936
54790 11 256 TET2 EXON + chr4:105276580-105276600 AGUUCUCAUGACGUGGGCAG 937
54790 11 258 TET2 EXON + chr4:105276581-105276601 GUUCUCAUGACGUGGGCAGU 938
54790 11 259 TET2 EXON + chr4:105276582-105276602 UUCUCAUGACGUGGGCAGUG 939
54790 11 262 TET2 EXON + chr4:105276587-105276607 AUGACGUGGGCAGUGGGGAA 940
54790 11 263 TET2 EXON + chr4:105276611-105276631 CACAGUAUUCAUGACAAAUG 941
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 196/678
191/606
54790 11 265 TET2 EXON + chr4:105276614-105276634 AGUAUUCAUGACAAAUGUGG 942
54790 11 267 TET2 EXON + chr4:105276615-105276635 GUAUUCAUGACAAAUGUGGU 943
54790 11 271 TET2 EXON + chr4:105276646-105276666 CAGCUCACCAGCAACAAAAG 944
54790 11 273 TET2 EXON + chr4:105276677-105276697 CCAUAGCACUUAAUUUUCAC 945
54790 11 275 TET2 EXON + chr4:105276688-105276708 AAUUUUCACUGGCUCCCAAG 946
54790 11 280 TET2 EXON + chr4:105276698-105276718 GGCUCCCAAGUGGUCACAGA 947
54790 11 283 TET2 EXON + chr4:105276706-105276726 AGUGGUCACAGAUGGCAUCU 948
54790 11 285 TET2 EXON + chr4:105276738-105276758 AAGCAUUCUAUGCAAAAAGA 949
54790 11 288 TET2 EXON + chr4:105276741-105276761 CAUUCUAUGCAAAAAGAAGG 950
54790 11 289 TET2 EXON + chr4:105276742-105276762 AUUCUAUGCAAAAAGAAGGU 951
54790 11 291 TET2 EXON + chr4:105276743-105276763 UUCUAUGCAAAAAGAAGGUG 952
54790 11 297 TET2 EXON + chr4:105276780-105276800 CAAUUUACAUUUUUAAACAC 953
54790 11 302 TET2 EXON + chr4:105276792-105276812 UUAAACACUGGUUCUAUUAU 954
54790 11 316 TET2 EXON + chr4:105276885-105276905 AUAUCAAGUUUGCAUAGUCA 955
54790 11 321 TET2 EXON + chr4:105276925-105276945 UACUGUAGUAUUACAGUGAC 956
54790 11 323 TET2 EXON + chr4:105276945-105276965 AGGAAUCUUAAAAUACCAUC 957
54790 11 329 TET2 EXON + chr4:105276975-105276995 UAUAUGAUGUACUGAAAUAC 958
54790 11 330 TET2 EXON + chr4:105276983-105277003 GUACUGAAAUACUGGAAUUA 959
54790 11-344 TET2 EXON + chr4:105277042-105277062 UUAUUUAUCAAAAUAGCUAC 960
54790 11 352 TET2 EXON + chr4:105277058-105277078 CUACAGGAAACAUGAAUAGC 961
54790 11 356 TET2 EXON + chr4:105277078-105277098 AGGAAAACACUGAAUUUGUU 962
54790 11 359 TET2 EXON + chr4:105277094-105277114 UGUUUGGAUGUUCUAAGAAA 963
54790 11 367 TET2 EXON + chr4:105277108-105277128 AAGAAAUGGUGCUAAGAAAA 964
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 197/678
192/606
54790 11 377 TET2 EXON + chr4:105277187-105277207 CUCCAGUGCCCUUGAAUAAU 965
54790 11 378 TET2 EXON + chr4:105277188-105277208 UCCAGUGCCCUUGAAUAAUA 966
54790 11 379 TET2 EXON + chr4:105277189-105277209 CCAGUGCCCUUGAAUAAUAG 967
54790 11 393 TET2 EXON + chr4:105277255-105277275 CAAGCUUAGUUUUUAAAAUG 968
54790 11 395 TET2 EXON + chr4:105277267-105277287 UUAAAAUGUGGACAUUUUAA 969
54790 11 401 TET2 EXON + chr4:105277274-105277294 GUGGACAUUUUAAAGGCCUC 970
54790 11 410 TET2 EXON + chr4:105277304-105277324 UCAUCCAGUGAAGUCCUUGU 971
54790 11 419 TET2 EXON + chr4:105277438-105277458 UGACAACUUGAACAAUGCUA 972
54790 11 437 TET2 EXON + chr4:105277501-105277521 AUGCAAAGUUGAUUUUUUUA 973
54790 11-465 TET2 EXON + chr4:105277599-105277619 ACAGCCAGUUAAAUCCACCA 974
54790 11-466 TET2 EXON + chr4:105277600-105277620 CAGCCAGUUAAAUCCACCAU 975
54790 11-467 TET2 EXON + chr4:105277601-105277621 AGCCAGUUAAAUCCACCAUG 976
54790 11-469 TET2 EXON + chr4:105277609-105277629 AAAUCCACCAUGGGGCUUAC 977
54790 11-472 TET2 EXON + chr4:105277617-105277637 CAUGGGGCUUACUGGAUUCA 978
54790 11-474 TET2 EXON + chr4:105277618-105277638 AUGGGGCUUACUGGAUUCAA 979
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54790 11-492 TET2 EXON + chr4:105277753-105277773 AAGAAUUUUCUAUUAACUGC 981
54790 11 503 TET2 EXON + chr4:105277818-105277838 CUGAAGCCUAUGCUAUUUUA 982
54790 11-504 TET2 EXON + chr4:105277826-105277846 UAUGCUAUUUUAUGGAUCAU 983
54790 11 511 TET2 EXON + chr4:105277846-105277866 AGGCUCUUCAGAGAACUGAA 984
54790 11-524 TET2 EXON + chr4:105277924-105277944 UAAGUGUCCUCUUUAACAAG 985
54790 11 532 TET2 EXON + chr4:105277963-105277983 CCUGCAUAAGAUGAAUAAAC 986
54790 11 533 TET2 EXON + chr4:105277964-105277984 CUGCAUAAGAUGAAUAAACA 987
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 198/678
193/606
54790 11 539 TET2 EXON + chr4:105278008-105278028 AGUUAAAAAGAAACAAAAAC 988
54790 11_541 TET2 EXON + chr4:105278015-105278035 AAGAAACAAAAACAGGCAGC 989
54790 11-542 TET2 EXON + chr4:105278025-105278045 AACAGGCAGCUGGUUUGCUG 990
54790 11-543 TET2 EXON + chr4:105278028-105278048 AGGCAGCUGGUUUGCUGUGG 991
54790 11-574 TET2 EXON + chr4:105278210-105278230 AAGCAGAAUUCACAUCAUGA 992
54790 11 587 TET2 EXON + chr4:105278310-105278330 CAUAUACCUCAACACUAGUU 993
54790 11 589 TET2 EXON + chr4:105278317-105278337 CUCAACACUAGUUUGGCAAU 994
54790 11 627 TET2 EXON + chr4:105278467-105278487 CCUUUUUGUUCUAAAAAUUC 995
54790 11 628 TET2 EXON + chr4:105278468-105278488 CUUUUUGUUCUAAAAAUUCA 996
54790 11 637 TET2 EXON + chr4:105278532-105278552 UGUUUAUGUAAAAUUGUUGU 997
54790 11-643 TET2 EXON + chr4:105278556-105278576 UAAUAAAUAUAUUCUUUGUC 998
54790 11-645 TET2 EXON + chr4:105278557-105278577 AAUAAAUAUAUUCUUUGUCA 999
54790 11-664 TET2 EXON + chr4:105278640-105278660 AACUAAUUUUGUAAAUCUGU 1000
54790 11 679 TET2 EXON + chr4:105278680-105278700 AAAAGCAUUUUAAAAGUUUG 1001
54790 11 686 TET2 EXON + chr4:105278704-105278724 AUCUUUUGACUGUUUCAAGC 1002
54790 11 700 TET2 EXON + chr4:105278748-105278768 AGAAUGCACUGAGUUGAUAA 1003
54790 11 701 TET2 EXON + chr4:105278749-105278769 GAAUGCACUGAGUUGAUAAA 1004
54790 11 703 TET2 EXON + chr4:105278762-105278782 UGAUAAAGGGAAAAAUUGUA 1005
54790 11 707 TET2 EXON + chr4:105278766-105278786 AAAGGGAAAAAUUGUAAGGC 1006
54790 11 708 TET2 EXON + chr4:105278773-105278793 AAAAUUGUAAGGCAGGAGUU 1007
54790 11 710 TET2 EXON + chr4:105278780-105278800 UAAGGCAGGAGUUUGGCAAG 1008
54790 11 711 TET2 EXON + chr4:105278787-105278807 GGAGUUUGGCAAGUGGCUGU 1009
54790 11 721 TET2 EXON + chr4:105278846-105278866 UUUGAUCCUGUAAUCACUGA 1010
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 199/678
194/606
54790 11 728 TET2 EXON + chr4:105278862-105278882 CUGAAGGUACAUACUCCAUG 1011
54790 11 729 TET2 EXON + chr4:105278878-105278898 CAUGUGGACUUCCCUUAAAC 1012
54790 11_731 TET2 EXON + chr4:105278892-105278912 UUAAACAGGCAAACACCUAC 1013
54790 11 733 TET2 EXON + chr4:105278897-105278917 CAGGCAAACACCUACAGGUA 1014
54790 11 734 TET2 EXON + chr4:105278927-105278947 CAGAUUGUACAAUUACAUUU 1015
54790 11 748 TET2 EXON + chr4:105278978-105278998 UAAAAUAAAUUCUUAAUCAG 1016
54790 11_751 TET2 EXON + chr4:105278981-105279001 AAUAAAUUCUUAAUCAGAGG 1017
54790 11 753 TET2 EXON + chr4:105278988-105279008 UCUUAAUCAGAGGAGGCCUU 1018
54790 11 754 TET2 EXON + chr4:105278989-105279009 CUUAAUCAGAGGAGGCCUUU 1019
54790 11 757 TET2 EXON + chr4:105278998-105279018 AGGAGGCCUUUGGGUUUUAU 1020
54790 11 762 TET2 EXON + chr4:105279017-105279037 UUGGUCAAAUCUUUGUAAGC 1021
54790 11 772 TET2 EXON + chr4:105279052-105279072 UAAAAAAUUUCUUGAAUUUG 1022
54790 11 799 TET2 EXON + chr4:105279173-105279193 UUUGAUUACUACAUGUGCAU 1023
54790 11 813 TET2 EXON + chr4:105279240-105279260 ACUGUCAUUUGUUAAACUGC 1024
54790 11 818 TET2 EXON + chr4:105279254-105279274 AACUGCUGGCCAACAAGAAC 1025
54790 11 822 TET2 EXON + chr4:105279267-105279287 CAAGAACAGGAAGUAUAGUU 1026
54790 11 825 TET2 EXON + chr4:105279268-105279288 AAGAACAGGAAGUAUAGUUU 1027
54790 11 827 TET2 EXON + chr4:105279269-105279289 AGAACAGGAAGUAUAGUUUG 1028
54790 11 828 TET2 EXON + chr4:105279270-105279290 GAACAGGAAGUAUAGUUUGG 1029
54790 11 829 TET2 EXON + chr4:105279271-105279291 AACAGGAAGUAUAGUUUGGG 1030
54790 11 832 TET2 EXON + chr4:105279275-105279295 GGAAGUAUAGUUUGGGGGGU 1031
54790 11 833 TET2 EXON + chr4:105279276-105279296 GAAGUAUAGUUUGGGGGGUU 1032
54790 11 836 TET2 EXON + chr4:105279277-105279297 AAGUAUAGUUUGGGGGGUUG 1033
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 200/678
195/606
54790 11_841 TET2 EXON + chr4:105279292-105279312 GGUUGGGGAGAGUUUACAUA 1034
54790 11_851 TET2 EXON + chr4:105279311-105279331 AAGGAAGAGAAGAAAUUGAG 1035
54790 11 859 TET2 EXON + chr4:105279373-105279393 CCUGCCUCAGUUAGAAUGAA 1036
54790 11-864 TET2 EXON + chr4:105279402-105279422 GAUCUACAAUUUGCUAAUAU 1037
54790 11 865 TET2 EXON + chr4:105279411-105279431 UUUGCUAAUAUAGGAAUAUC 1038
54790 11 871 TET2 EXON + chr4:105279449-105279469 UACUUGAAAAUGCUUCUGAG 1039
54790 11 886 TET2 EXON + chr4:105279524-105279544 CAGUUCACUUCUGAAGCUAG 1040
54790 11 890 TET2 EXON + chr4:105279538-105279558 AGCUAGUGGUUAACUUGUGU 1041
54790 11 912 TET2 EXON + chr4:105279632-105279652 UUUCAUUUUCAUGAGAUGUU 1042
54790 11 920 TET2 EXON + chr4:105279648-105279668 UGUUUGGUUUAUAAGAUCUG 1043
54790 11 921 TET2 EXON + chr4:105279652-105279672 UGGUUUAUAAGAUCUGAGGA 1044
54790 11 928 TET2 EXON + chr4:105279691-105279711 UAUUGUAAUGUUAUGAAUGC 1045
54790 11-954 TET2 EXON - chr4:105275038-105275058 UCGCAAAAGUUCUGUGGACA 1046
54790 11 955 TET2 EXON - chr4:105275039-105275059 GUCGCAAAAGUUCUGUGGAC 1047
54790 11 957 TET2 EXON - chr4:105275044-105275064 ACAAAGUCGCAAAAGUUCUG 1048
54790 11 960 TET2 EXON - chr4:105275165-105275185 AGUUGACAGACUCUGUCUGA 1049
54790 11 961 TET2 EXON - chr4:105275166-105275186 GAGUUGACAGACUCUGUCUG 1050
54790 11 970 TET2 EXON - chr4:105275206-105275226 CCGUCUCAUGUAUGGAUUGG 1051
54790 11 972 TET2 EXON - chr4:105275209-105275229 GGGCCGUCUCAUGUAUGGAU 1052
54790 11 973 TET2 EXON - chr4:105275214-105275234 GGAUUGGGCCGUCUCAUGUA 1053
54790 11 977 TET2 EXON - chr4:105275229-105275249 GGAUAAGGACUAACUGGAUU 1054
54790 11 978 TET2 EXON - chr4:105275230-105275250 UGGAUAAGGACUAACUGGAU 1055
54790 11 980 TET2 EXON - chr4:105275235-105275255 GAGUUUGGAUAAGGACUAAC 1056
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 201/678
196/606
54790 11 982 TET2 EXON - chr4:105275244-105275264 GUGUGUGAAGAGUUUGGAUA 1057
54790 11-984 TET2 EXON - chr4:105275250-105275270 UCUGAAGUGUGUGAAGAGUU 1058
54790 11 991 TET2 EXON - chr4:105275287-105275307 GGAAUAGAAGUUCAUAGGGC 1059
54790 11 992 TET2 EXON - chr4:105275291-105275311 AGGUGGAAUAGAAGUUCAUA 1060
54790 11 993 TET2 EXON - chr4:105275292-105275312 GAGGUGGAAUAGAAGUUCAU 1061
54790 11 999 TET2 EXON - chr4:105275308-105275328 ACCUGCAGCUUGAGAUGAGG 1062
54790 11 1001 TET2 EXON - chr4:105275311-105275331 UGAACCUGCAGCUUGAGAUG 1063
54790 11 1012 TET2 EXON - chr4:105275352-105275372 AGCCCAGGGUAAGGGUUCAU 1064
54790 11 1013 TET2 EXON - chr4:105275353-105275373 AAGCCCAGGGUAAGGGUUCA 1065
54790 11 1017 TET2 EXON - chr4:105275360-105275380 GAUUCAAAAGCCCAGGGUAA 1066
54790 11 1018 TET2 EXON - chr4:105275361-105275381 UGAUUCAAAAGCCCAGGGUA 1067
54790 11 1021 TET2 EXON - chr4:105275366-105275386 UAUUCUGAUUCAAAAGCCCA 1068
54790 11 1022 TET2 EXON - chr4:105275367-105275387 GUAUUCUGAUUCAAAAGCCC 1069
54790 11 1026 TET2 EXON - chr4:105275389-105275409 GCAUUGAUAUGAUGGAUAUU 1070
54790 11 1027 TET2 EXON - chr4:105275390-105275410 UGCAUUGAUAUGAUGGAUAU 1071
54790 11 1031 TET2 EXON - chr4:105275397-105275417 UUUCCAUUGCAUUGAUAUGA 1072
54790 11 1034 TET2 EXON - chr4:105275420-105275440 GGGAGCAGUUGUCCACUGAU 1073
54790 11 1035 TET2 EXON - chr4:105275440-105275460 AGAAUAGGAACCCAGAUAUG 1074
54790 11 1037 TET2 EXON - chr4:105275441-105275461 GAGAAUAGGAACCCAGAUAU 1075
54790 11 1040 TET2 EXON - chr4:105275442-105275462 GGAGAAUAGGAACCCAGAUA 1076
54790 11 1042 TET2 EXON - chr4:105275455-105275475 CGGCUGAGACUGGGGAGAAU 1077
54790 11 1046 TET2 EXON - chr4:105275463-105275483 AGAUCCAUCGGCUGAGACUG 1078
54790 11 1049 TET2 EXON - chr4:105275464-105275484 CAGAUCCAUCGGCUGAGACU 1079
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 202/678
197/606
54790 11 1050 TET2 EXON - chr4:105275465-105275485 ACAGAUCCAUCGGCUGAGAC 1080
54790 11 1055 TET2 EXON - chr4:105275475-105275495 GGAUACCUAUACAGAUCCAU 1081
54790 11 1058 TET2 EXON - chr4:105275496-105275516 UUAGACAGAGGGUCUUGGCU 1082
54790 11 1060 TET2 EXON - chr4:105275501-105275521 UGAGCUUAGACAGAGGGUCU 1083
54790 11 1061 TET2 EXON - chr4:105275507-105275527 GUAGACUGAGCUUAGACAGA 1084
54790 11 1062 TET2 EXON - chr4:105275508-105275528 GGUAGACUGAGCUUAGACAG 1085
54790 11 1067 TET2 EXON - chr4:105275529-105275549 UGGUAAAGUGUAUGGAUGGG 1086
54790 11 1068 TET2 EXON - chr4:105275532-105275552 GGCUGGUAAAGUGUAUGGAU 1087
54790 11 1069 TET2 EXON - chr4:105275533-105275553 UGGCUGGUAAAGUGUAUGGA 1088
54790 11 1072 TET2 EXON - chr4:105275537-105275557 ACCUUGGCUGGUAAAGUGUA 1089
54790 11 1075 TET2 EXON - chr4:105275549-105275569 GGCUAUUUCCAAACCUUGGC 1090
54790 11 1076 TET2 EXON - chr4:105275553-105275573 CUCUGGCUAUUUCCAAACCU 1091
54790 11 1079 TET2 EXON - chr4:105275570-105275590 AGUAUUUAGAUGUAAAACUC 1092
54790 11 1085 TET2 EXON - chr4:105275606-105275626 AACCAUCUCCCUGCAUAUUU 1093
54790 11 1089 TET2 EXON - chr4:105275641-105275661 AUGAUGUACAUUUGGUCUAA 1094
54790 11 1092 TET2 EXON - chr4:105275649-105275669 UUCCCUACAUGAUGUACAUU 1095
54790 11 1093 TET2 EXON - chr4:105275676-105275696 AUCUCAUGAGUGGGAUAAGG 1096
54790 11 1095 TET2 EXON - chr4:105275679-105275699 UCCAUCUCAUGAGUGGGAUA 1097
54790 11 1097 TET2 EXON - chr4:105275685-105275705 UGGCCAUCCAUCUCAUGAGU 1098
54790 11 1098 TET2 EXON - chr4:105275686-105275706 GUGGCCAUCCAUCUCAUGAG 1099
54790 11 1102 TET2 EXON - chr4:105275705-105275725 UAGAGGUGGCUCCCAUGAAG 1100
54790 11 1105 TET2 EXON - chr4:105275719-105275739 AUUGGGUGGUAAUCUAGAGG 1101
54790 11 1107 TET2 EXON - chr4:105275722-105275742 CAGAUUGGGUGGUAAUCUAG 1102
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 203/678
198/606
54790 11_1111 TET2 EXON - chr4:105275733-105275753 UUUGGAUUGCUCAGAUUGGG 1103
54790 11 1112 TET2 EXON - chr4:105275736-105275756 AUGUUUGGAUUGCUCAGAUU 1104
54790 11 1113 TET2 EXON - chr4:105275737-105275757 CAUGUUUGGAUUGCUCAGAU 1105
54790 11 1120 TET2 EXON - chr4:105275751-105275771 CCAUUUUUAUAGUCCAUGUU 1106
54790 11 1125 TET2 EXON - chr4:105275787-105275807 UAGUUAUGGAUUAUGUGAGA 1107
54790 11 1129 TET2 EXON - chr4:105275801-105275821 CCGGAGCUGCACUGUAGUUA 1108
54790 11 1133 TET2 EXON - chr4:105275820-105275840 AGAGAGCUGUUGAACAUGCC 1109
54790 11 1144 TET2 EXON - chr4:105275848-105275868 CUCCUUGUUUUGGAGAUGCA 1110
54790 11 1145 TET2 EXON - chr4:105275849-105275869 UCUCCUUGUUUUGGAGAUGC 1111
54790 11 1148 TET2 EXON - chr4:105275858-105275878 GCAUGUCAUUCUCCUUGUUU 1112
54790 11 1154 TET2 EXON - chr4:105275884-105275904 UGAUAACCCAUUAGCUGUGU 1113
54790 11 1155 TET2 EXON - chr4:105275885-105275905 UUGAUAACCCAUUAGCUGUG 1114
54790 11 1161 TET2 EXON - chr4:105275916-105275936 GUUCUAUCAUGGUUAAGAGC 1115
54790 11 1165 TET2 EXON - chr4:105275927-105275947 GGACACAAGCAGUUCUAUCA 1116
54790 11 1169 TET2 EXON - chr4:105275948-105275968 UUAAUUUGUGUAAGCCUCCU 1117
54790 11 1175 TET2 EXON - chr4:105275997-105276017 ACACCCUGGACUAGUGCCAA 1118
54790 11 1176 TET2 EXON - chr4:105276011-105276031 CUGCACCAGAAGCCACACCC 1119
54790 11 1182 TET2 EXON - chr4:105276081-105276101 ACGGCCACUCCCCCAAUGUC 1120
54790 11 1186 TET2 EXON - chr4:105276100-105276120 UGACCCAUGAGUUGGAGCCA 1121
54790 11 1188 TET2 EXON - chr4:105276108-105276128 AUGAGAAUUGACCCAUGAGU 1122
54790 11 1200 TET2 EXON - chr4:105276157-105276177 GGGAUUCUUUAAAGGGGUUG 1123
54790 11 1202 TET2 EXON - chr4:105276163-105276183 CCUAUUGGGAUUCUUUAAAG 1124
54790 11 1203 TET2 EXON - chr4:105276164-105276184 UCCUAUUGGGAUUCUUUAAA 1125
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 204/678
199/606
54790 11 1205 TET2 EXON - chr4:105276165-105276185 UUCCUAUUGGGAUUCUUUAA 1126
54790 11 1207 TET2 EXON - chr4:105276177-105276197 CUGGUGGGGUGAUUCCUAUU 1127
54790 11 1209 TET2 EXON - chr4:105276178-105276198 CCUGGUGGGGUGAUUCCUAU 1128
54790 11J211 TET2 EXON - chr4:105276191-105276211 AGACGAGGGAGAUCCUGGUG 1129
54790 11 1212 TET2 EXON - chr4:105276192-105276212 AAGACGAGGGAGAUCCUGGU 1130
54790 11 1214 TET2 EXON - chr4:105276193-105276213 AAAGACGAGGGAGAUCCUGG 1131
54790 11 1216 TET2 EXON - chr4:105276196-105276216 GUAAAAGACGAGGGAGAUCC 1132
54790 11 1219 TET2 EXON - chr4:105276205-105276225 CUUAUGCUGGUAAAAGACGA 1133
54790 11 1221 TET2 EXON - chr4:105276206-105276226 UCUUAUGCUGGUAAAAGACG 1134
54790 11 1228 TET2 EXON - chr4:105276218-105276238 GCUCAUUCAUGCUCUUAUGC 1135
54790 11 1230 TET2 EXON - chr4:105276240-105276260 CAAAGAGCCAAGCCAUGUUU 1136
54790 11 1241 TET2 EXON - chr4:105276268-105276288 ACGGGCUUUUUCAGCCAUUU 1137
54790 11 1246 TET2 EXON - chr4:105276286-105276306 ACACUCUUCCUCUUUCUCAC 1138
54790 11 1247 TET2 EXON - chr4:105276287-105276307 CACACUCUUCCUCUUUCUCA 1139
54790 11 1251 TET2 EXON - chr4:105276320-105276340 AUUUCUGAGGCACAUAGUCU 1140
54790 11 1252 TET2 EXON - chr4:105276321-105276341 GAUUUCUGAGGCACAUAGUC 1141
54790 11 1260 TET2 EXON - chr4:105276333-105276353 UUUUUGCCAUGGGAUUUCUG 1142
54790 11 1263 TET2 EXON - chr4:105276343-105276363 CCGUUUCACUUUUUUGCCAU 1143
54790 11 1265 TET2 EXON - chr4:105276344-105276364 CCCGUUUCACUUUUUUGCCA 1144
54790 11 1269 TET2 EXON - chr4:105276369-105276389 GAAGUUUCAUGUGGCUCAGC 1145
54790 11 1270 TET2 EXON - chr4:105276378-105276398 GUGGGCUCUGAAGUUUCAUG 1146
54790 11 1273 TET2 EXON - chr4:105276396-105276416 UUGAUGAAACGCAGGUAAGU 1147
54790 11 1274 TET2 EXON - chr4:105276397-105276417 CUUGAUGAAACGCAGGUAAG 1148
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 205/678
200/606
54790 11 1277 TET2 EXON - chr4:105276404-105276424 CAAGAGACUUGAUGAAACGC 1149
54790 11 1281 TET2 EXON - chr4:105276427-105276447 GGUCACGGACAUGGUCCUUU 1150
54790 11 1282 TET2 EXON - chr4:105276436-105276456 GGAGUCUGUGGUCACGGACA 1151
54790 11 1284 TET2 EXON - chr4:105276442-105276462 UACUGUGGAGUCUGUGGUCA 1152
54790 11 1286 TET2 EXON - chr4:105276448-105276468 UGUAGUUACUGUGGAGUCUG 1153
54790 11 1288 TET2 EXON - chr4:105276457-105276477 AUAUGGAGAUGUAGUUACUG 1154
54790 11 1290 TET2 EXON - chr4:105276474-105276494 GUGACCCGAGUGAAGGCAUA 1155
54790 11 1294 TET2 EXON - chr4:105276481-105276501 AGGCCCUGUGACCCGAGUGA 1156
54790 11 1297 TET2 EXON - chr4:105276501-105276521 UAUCAUAUAUAUCUGUUGUA 1157
54790 11 1300 TET2 EXON - chr4:105276527-105276547 GUGAGGUAACCAACAAAAGG 1158
54790 11 1301 TET2 EXON - chr4:105276528-105276548 AGUGAGGUAACCAACAAAAG 1159
54790 11 1303 TET2 EXON - chr4:105276529-105276549 AAGUGAGGUAACCAACAAAA 1160
54790 11 1305 TET2 EXON - chr4:105276530-105276550 CAAGUGAGGUAACCAACAAA 1161
54790 11 1310 TET2 EXON - chr4:105276544-105276564 GGUUGUGGUCUUUUCAAGUG 1162
54790 11 1312 TET2 EXON - chr4:105276559-105276579 UACUACUGACAGGUUGGUUG 1163
54790 11 1313 TET2 EXON - chr4:105276565-105276585 GAACUAUACUACUGACAGGU 1164
54790 11 1314 TET2 EXON - chr4:105276569-105276589 AUGAGAACUAUACUACUGAC 1165
54790 11 1331 TET2 EXON - chr4:105276646-105276666 CUUUUGUUGCUGGUGAGCUG 1166
54790 11 1334 TET2 EXON - chr4:105276656-105276676 AAGAUAACCUCUUUUGUUGC 1167
54790 11 1336 TET2 EXON - chr4:105276680-105276700 CCAGUGAAAAUUAAGUGCUA 1168
54790 11 1339 TET2 EXON - chr4:105276705-105276725 GAUGCCAUCUGUGACCACUU 1169
54790 11 1344 TET2 EXON - chr4:105276706-105276726 AGAUGCCAUCUGUGACCACU 1170
54790 11 1354 TET2 EXON - chr4:105276738-105276758 UCUUUUUGCAUAGAAUGCUU 1171
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 206/678
201/606
54790 11 1363 TET2 EXON - chr4:105276780-105276800 GUGUUUAAAAAUGUAAAUUG 1172
54790 11 1370 TET2 EXON - chr4:105276841-105276861 AGAGUUGUAAGCGGGGGGGG 1173
54790 11 1371 TET2 EXON - chr4:105276842-105276862 UAGAGUUGUAAGCGGGGGGG 1174
54790 11 1374 TET2 EXON - chr4:105276843-105276863 GUAGAGUUGUAAGCGGGGGG 1175
54790 11 1376 TET2 EXON - chr4:105276844-105276864 UGUAGAGUUGUAAGCGGGGG 1176
54790 11 1378 TET2 EXON - chr4:105276845-105276865 GUGUAGAGUUGUAAGCGGGG 1177
54790 11 1379 TET2 EXON - chr4:105276846-105276866 UGUGUAGAGUUGUAAGCGGG 1178
54790 11 1382 TET2 EXON - chr4:105276847-105276867 AUGUGUAGAGUUGUAAGCGG 1179
54790 11 1383 TET2 EXON - chr4:105276848-105276868 GAUGUGUAGAGUUGUAAGCG 1180
54790 11 1386 TET2 EXON - chr4:105276849-105276869 AGAUGUGUAGAGUUGUAAGC 1181
54790 11 1388 TET2 EXON - chr4:105276850-105276870 CAGAUGUGUAGAGUUGUAAG 1182
54790 11 1394 TET2 EXON - chr4:105276876-105276896 AAACUUGAUAUUAUUAAAAG 1183
54790 11 1406 TET2 EXON - chr4:105276963-105276983 AUCAUAUAUUCAGCACCAGA 1184
54790 11 1440 TET2 EXON - chr4:105277160-105277180 AUAGCAUCUUGAUGAUAUAA 1185
54790 11 1444 TET2 EXON - chr4:105277192-105277212 CCCCUAUUAUUCAAGGGCAC 1186
54790 11 1446 TET2 EXON - chr4:105277198-105277218 AAGGUACCCCUAUUAUUCAA 1187
54790 11 1447 TET2 EXON - chr4:105277199-105277219 AAAGGUACCCCUAUUAUUCA 1188
54790 11 1451 TET2 EXON - chr4:105277217-105277237 UGAUAAAAACUUGAAUGAAA 1189
54790 11 1457 TET2 EXON - chr4:105277246-105277266 AACUAAGCUUGUGUAAGAAU 1190
54790 11 1463 TET2 EXON - chr4:105277293-105277313 ACUGGAUGAGCAAAAUCCAG 1191
54790 11 1469 TET2 EXON - chr4:105277311-105277331 UUGUCCUACAAGGACUUCAC 1192
54790 11 1471 TET2 EXON - chr4:105277321-105277341 AUAUCGUUUAUUGUCCUACA 1193
54790 11 1478 TET2 EXON - chr4:105277432-105277452 UGUUCAAGUUGUCAAAGCUU 1194
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 207/678
202/606
54790 11 1501 TET2 EXON - chr4:105277563-105277583 AUUGCUCAUCAGCAGAUGCA 1195
54790 11 1505 TET2 EXON - chr4:105277591-105277611 UUAACUGGCUGUGUUAAAAA 1196
54790 11 1507 TET2 EXON - chr4:105277606-105277626 AGCCCCAUGGUGGAUUUAAC 1197
54790 11 1509 TET2 EXON - chr4:105277616-105277636 GAAUCCAGUAAGCCCCAUGG 1198
54790 11 1512 TET2 EXON - chr4:105277619-105277639 CUUGAAUCCAGUAAGCCCCA 1199
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203/606
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Sistemas de Edição Genética TALEN
[0294] TALENs são produzidas artificialmente fundindo um domínio de ligação de DNA efetor TAL a um domínio de divagem de DNA. Efeitos do tipo ativador da transcrição (TALEs) podem ser modificados para se ligarem a qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma porção do gene HLA ou TCR. Combinando um TALE modificado com um domínio de divagem de DNA, uma enzima de restrição pode ser produzida que é específica para qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma sequência de HLA ou TCR. Estas podem, então, ser introduzidas em uma célula onde podem ser usadas para edição de genoma. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; e Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.
[0295] TALEs são proteínas secretadas por bactérias Xanthomonas. O domínio de ligação de DNA contém uma sequência de 33-34 aminoácidos altamente conservada repetida, com a exceção do 122 e 132 aminoácidos. Essas duas posições são altamente variáveis, mostrando uma correlação forte com reconhecimento de nucleotídeos específico. Estas podem ser, assim, manipuladas para se ligarem a uma sequência de DNA desejada.
[0296] Para produzir uma TALEN, uma proteína TALE é fundida a uma nuclease (N), que é, por exemplo, uma endonuclease Fokl do tipo selvagem ou mutada. Diversas mutações a Fokl foram realizadas para seu uso em TALENs; essas, por exemplo, aprimoram a especificidade ou a atividade de divagem. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29:731-734; Wood etal. (2011) Science 333:307; Doyon
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205/606 et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; e Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.
[0297] O domínio Fokl funciona como um dimero, exigindo dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma-alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação de DNA de TALE e o domínio de divagem de Fokl quanto o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais parecem ser parâmetros importantes para atingir níveis altos de atividade. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.
[0298] Um TALEN específico para um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) pode ser usado dentro de uma célula para produzir uma quebra na fita dupla (DSB). Uma mutação pode ser introduzida no sítio de quebra se os mecanismos de reparo repararem inadequadamente a quebra por meio da união de extremidades não homólogas. Por exemplo, o reparo inadequado pode introduzir uma mutação de deslocamento de quadro. Alternativamente, DNA estranho pode ser introduzido na célula juntamente com o TALEN, por exemplo, DNA codificando um CAR, por exemplo, como descrito aqui; dependendo das sequências do DNA estranho e sequência cromossômica, este processo pode ser usado para integrar o DNA codificando o CAR, por exemplo, como descrito aqui, no sítio ou perto do sítio visado pelo TALEN. Como mostrado aqui, nos exemplos, mas sem ficar restringido pela teoria, tal integração pode conduzir à expressão do CAR bem como disrupção de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Tal molécula de DNA estranho é referida aqui como DNA-modelo. Em modalidades, o DNAmodelo também compreende braços de homologia a 5', 3' ou a 5' e 3'
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206/606 relativamente ao ácido nucleico do DNA-modelo que codifica a molécula ou moléculas de interesse (por exemplo, que codifica um CAR descrito aqui), em que os referidos braços de homologia são complementares a sequência de DNA genômico flanqueando a sequência-alvo.
[0299] TALENs específicos para sequências em um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) podem ser construídos usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo vários esquemas usando componentes modulares. Zhang etal. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509; US 8,420,782; US 8,470,973, cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade.
Nucleases Dedo de Zinco
[0300] ZFN ou Nuclease Dedo de Zinco se relaciona com uma nuclease dedo de zinco, uma nuclease artificial que pode ser usada para modificar, por exemplo, deletar, um ou mais ácidos nucleicos de uma sequência de ácido nucleico desejada, por exemplo, um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
[0301] Como uma TALEN, uma ZFN compreende um domínio de nuclease de Fokl (ou derivado do mesmo) fundido a um domínio de ligação a DNA. No caso de uma ZFN, o domínio de ligação a DNA compreende um ou mais dedos de zinco. Carroll etal. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; e Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.
[0302] Um dedo de zinco é um motivo estrutural de proteína pequena estabilizado por um ou mais íons de zinco. Um dedo de zinco pode compreender, por exemplo, Cys2His2, e pode reconhecer uma sequência de aproximadamente 3 pb. Vários dedos de zinco de especificidade conhecida podem ser combinados para produzir
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207/606 polipeptídeos de múltiplos dedos que reconhecem sequências de cerca de 6, 9, 12, 15 ou 18 pares de bases. Várias técnicas de seleção e montagem modular estão disponíveis para gerar dedos de zinco (e combinações dos mesmos) que reconhecem sequências específicas, incluindo exibição em fagos, sistemas de um híbrido de levedura, sistemas de um híbrido e dois híbridos bacterianos e células de mamífero.
[0303] Como uma TALEN, uma ZFN precisa dimerizar para clivar DNA. Assim, um par de ZFNs é necessário para visar sítios de DNA não palindrômicos. As duas ZFNs individuais precisam se ligar a fitas opostas do DNA com suas nucleases adequadamente afastadas. Bitinaite etal. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 10570-5.
[0304] Também como um TALEN, uma ZFN pode criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de deslocamento de quadro se reparada inadequadamente, levando a uma diminuição da expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) em uma célula. ZFNs também podem ser usadas com recombinação homóloga para mutar um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) ou para introduzir ácido nucleico codificando um CAR em um sítio na sequência visada ou próximo desta. Como discutido acima, o ácido nucleico codificando um CAR pode ser introduzido como parte de um DNA-modelo. Em modalidades, o DNA-modelo também compreende braços de homologia a 5', 3' ou a 5' e 3' relativamente ao ácido nucleico do DNA-modelo que codifica a molécula ou moléculas de interesse (por exemplo, que codifica um CAR descrito aqui), em que os referidos braços de homologia são complementares a sequência de DNA genômico flanqueando a sequência-alvo.
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[0305] ZFNs específicas para sequências em um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) podem ser construídas usando qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen etal. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; e Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96; Publicação de Patente U.S. 2011/0158957; e Publicação de Patente U.S. 2012/0060230, cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade. Em modalidades, o sistema de edição genética ZFN também pode compreender ácido nucleico codificando um ou mais componentes do sistema de edição genética ZFN, por exemplo, um sistema de edição genética ZFN direcionado para um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
[0306] Sem ficar restringido pela teoria, se crê que o uso de sistemas de edição genética (por exemplo, sistemas de edição genética CRISPR/Cas) que visam um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) pode permitir modular (por exemplo, inibir) uma ou mais funções de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), por exemplo, ao causar um evento de edição que resulta em expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) truncado e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) truncado. Mais uma vez, sem ficar restringido pela teoria, tal produto genético associado a Tet (por exemplo, um produto genético associado a Tet2) truncado e/ou produto genético Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) truncado pode preservar uma ou mais funções do produto genético associado a Tet (por
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209/606 exemplo, um produto genético associado a Tet2) e/ou produto genético Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) (por exemplo, uma função de suporte), ao mesmo tempo que inibe uma ou mais funções diferentes do produto genético associado a Tet (por exemplo, um produto genético associado a Tet2) e/ou produto genético Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) (por exemplo, uma função catalítica) e, como tal, pode ser preferencial. Sistemas de edição genética que visam um éxon ou íntron tardio de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) podem ser particularmente preferenciais a este respeito. Em um aspecto, o sistema de edição genética da invenção visa um éxon ou íntron tardio de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em um aspecto, o sistema de edição genética da invenção visa um éxon ou íntron a jusante do éxon 8. Em um aspecto, o sistema de edição genética visa o éxon 8 ou éxon 9, por exemplo, éxon 9, de um gene Tet2.
[0307] Sem ficar restringido pela teoria, também pode ser preferencial, em outras modalidades, visar um éxon ou íntron inicial de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), por exemplo, para introduzir um códon de terminação prematuro no gene visado que resulta em ausência de expressão do produto genético, ou expressão de um produto genético completamente não funcional. Sistemas de edição genética que visam um éxon ou íntron inicial de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) podem ser particularmente preferenciais a este respeito. Em um aspecto, o sistema de edição genética da invenção visa um éxon ou íntron inicial de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene
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210/606 associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em um aspecto, o sistema de edição genética da invenção visa um éxon ou intron a montante do éxon 4. Em modalidades, o sistema de edição genética visa o éxon 1, éxon 2 ou éxon 3, por exemplo, éxon 3, de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
[0308] Sem ficar restringido pela teoria, também pode ser preferencial, em outras modalidades, visar uma sequência de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) que é específica para uma ou mais isoformas do gene, mas não afeta uma ou mais isoformas diferentes do gene. Em modalidades, pode ser preferencial visar especificamente uma isoforma de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) que contenha um domínio catalítico.
Moduladores de RNA de Fita Dupla, por exemplo, SiRNA ou ShRNA [0309] De acordo com a presente invenção, RNA de fita dupla (dsRNA), por exemplo, siRNA ou shRNA, pode ser usado como modulador (por exemplo, inibidor) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Também são contemplados pela presente invenção os usos de ácido nucleico codificando os referidos moduladores (por exemplo, inibidores) dsRNA de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
[0310] Em uma modalidade, o modulador (por exemplo, inibidor) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é
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211/606 um ácido nucleico, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, específico para ácido nucleico codificando um gene ou produto genético associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene ou produto genético Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), por exemplo, DNA genômico ou mRNA codificando um produto genético associado a Tet (por exemplo, um produto genético associado a Tet2) e/ou um produto genético Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
[0311] Um aspecto da invenção proporciona uma composição compreendendo um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos, por exemplo, 21 nucleotídeos contíguos, que são complementares (por exemplo, 100% complementares) a uma sequência de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA genômico ou mRNA codificando um produto genético associado a Tet (por exemplo, um produto genético associado a Tet2) e/ou um produto genético Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2)). Em modalidades, os pelo menos 15 nucleotídeos contíguos, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos contíguos, por exemplo, 21 nucleotídeos contíguos, incluem nucleotídeos contíguos de uma sequência-alvo de shRNA ou ácido nucleico codificando shRNA de Tet2 listado na Tabela 4. É entendido que algumas das sequências-alvo e/ou moléculas de shRNA são apresentadas como DNA, mas os agentes de dsRNA visando estas sequências ou compreendendo estas sequências podem ser RNA, ou qualquer nucleotídeo, nucleotídeo modificado ou substituto revelados aqui e/ou conhecidos na técnica, desde que a molécula ainda possa mediar a interferência de RNA.
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[0312] Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de urn gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é operavelmente ligada a um promotor, por exemplo, um promotor derivado de H1 ou U6, de modo que a molécula de dsRNA que inibe a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é expressa dentro de uma célula expressando CAR. Ver, por exemplo, Tiscornia G., Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA, Capítulo 3, em Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (editores Friedmann e Rossi), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI, EUA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19:497-500. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de urn gene associado a Tet (por exemplo, urn gene associado a Tet2) e/ou urn gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) está presente no mesmo vetor, por exemplo, um vetor lentiviral, que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes, do CAR. Em uma tal modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), está localizada no vetor, por exemplo, no vetor lentiviral, a 5’ ou 3’ relativamente ao ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes, do CAR. A molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por
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213/606 exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) pode ser transcrita na mesma direção ou em uma direção diferente do ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes, do CAR. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) está presente em um vetor diferente do vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes, do CAR. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é transientemente expressa dentro de uma célula expressando CAR. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA que inibe a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é estavelmente integrada no genoma de uma célula expressando CAR.
[0313] Exemplos de sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências de shRNA são proporcionados abaixo. A sequência-alvo se relaciona com a sequência dentro do DNA genômico de Tet2 (ou DNA envolvente). O ácido nucleico codificando shRNA de Tet2 codifica moléculas de shRNA úteis na presente invenção. Em modalidades, o inibidor de Tet2 é um siRNA ou shRNA específico para uma sequênciaalvo listada abaixo, ou específico para o seu complemento de mRNA. Em modalidades, o inibidor de Tet2 é um shRNA codificado pelo Ácido Nucleico codificando shRNA de Tet2 da tabela 4 abaixo. Em modalidades, o inibidor de Tet2 é ácido nucleico compreendido pelo ácido nucleico codificando shRNA Tet2 da tabela 4 abaixo, por exemplo,
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SHRNA NOME
TET2 TET23838_76472_insert (TET2 shRNA #1)
TET2 TET2_NM_017628.4_25 616_concept (TET2 shRNA #2)
TET2 TET2_NM_017628.4_25 625_concept (TET2 shRNA #3)
TET2 TET26571 _76471 _target (TET2 shRNA #4)
TET2 TET2_NM_017628.4_25 619_target (TET2 shRNA #5)
TET2 TET2shRNA#6 que está sob o controle de um promotor de U6 ou H1 de modo que é produzido um shRNA de Tet2. Em modalidades, a invenção proporciona uma sequência compreendendo siRNA ou shRNA que é o análogo de RNA (isto é, todos os resíduos de ácido nucleico T substituídos por resíduos de ácido nucleico U) da sequência-alvo de shRNA, por exemplo, a sequência-alvo de shRNA de quaisquer dos shRNAs da Tabela 4.
Tabela 4
Sequência-alvo de Ácido Nucleico codificando shRNA de Tet2 shRNA
CACATGGCGTTTA CACATGGCGTTTATCCAGAAT TCCAGAAT (SEQ CTCGAGATTCTGGATAAACGCCATGTGTT ID Na: 1244) TTTTGAATTCGCACCAGCACGCTACGCAC ACACAGTACACACACTGACGTTTCGCCGT CTTC (SEQ ID Na: 1253)
CAGATGCACAGGCGAAGACGCACCGGCAGATGTACAGGCTA CAATTAAG (SEQ ID ATTAAGGTTAATATTCATAGCCTTAATTGG Na: 1245) CCTGTGCATCTGTTTTTTGAATTCGCACC
AGCACGCTACGCAACACGTCAACCAGTG TCAGTGTTTCGCCGT (SEQ ID Na: 1254)
GAGCTGCTGAATT GAAGACGCACCGGGAGCTGCTGAATTCA CAACTAGA (SEQ ATTAGAGTTAATATTCATAGCTCTAGTTGA ID Na: 1246) ATTCAGCAGCTCTTTTTTGAATTCGCACCA GCACGCTACGCATGCAGTCAACCAGTGT CAACCATTCGCCGT (SEQ ID Na: 1255)
CAGATCGCCATAA CAGATCGCCATAACATAAATACTCGAGTATTTA CATAAATA (SEQ ID TGTTATGGCGATCTGTTTTTTGAATTCGCACCA
N°· 1247) GCACGCTACGCATGACCAGTACACACACTGCA
TGTTCGCCGTCTTC (SEQ ID Ns: 1256)
GACCATGGAGCA GAAGACGCACCGGGACCATGGAGTAGCA GCATCTGAA (SEQ TTTGAAGTTAATATTCATAGCTTCAGATGC ID Na: 1248) TGCTCCATGGTCTTTTTTGAATTCGCACC AGCACGCTACGCATGGTGTCAACCAGTG TCAGTTGTTCGCCGT (SEQ ID Na: 1257)
GCCAAGTCATTAT GCCAAGTCATTATTTGACCATCTCGAGAT TTGACCAT (SEQ ID GGTCAAATAATGACTTGGCTTTTTTGA Na: 1249) (SEQ ID Na: 1258)
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TET2
TET2shRNA #7
CCTCAGAGATATT CCTCAGAGATATTGTGGGTTTCTCGAGAA
GTGGGTTT (SEQ ACCCACAATATCTCTGAGGTTTTTTGA
ID Na: 1250) (SEQ ID Na: 1259)
TET2
TET2shRNA #8
GGGTAAGCCAAGAGGGTAAGCCAAGAAAGAAACTCGAGTTTC
AAGAAA (SEQ ID TTTCTTGGCTTACCCTTTTTTGA (SEQ ID
Na: 1251) Na: 1260)
TET2
TET2 8 long
GGGTAAGCCAAGA GAAGACGCACCGGGGGTAAGCCAAGAAA (TET2 shRNA #9)
AAGAAA (SEQ ID GAAAGTTAATATTCATAGCTTTCTTTCTTG
Na: 1252) GCTTACCCTTTTTTGAATTCGCACCAGCA
CGCTACGCAACACGTCAACCAGTGTCAGT
GTTTCGCCGT (SEQ ID Na: 1261)
[0314] Inibidor dsRNA adicional de Tet2, por exemplo, moléculas de shRNA e siRNA, pode ser planejado e testado usando métodos conhecidos na técnica e como descrito aqui. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de SEQ ID N2: 1358. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de SEQ ID N2: 1359. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de SEQ ID N2: 1360. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de SEQ ID N2: 1361. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de SEQ ID N2: 1362. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de SEQ ID N2: 1363. Em modalidades, o dsRNA inibidor de Tet2, por exemplo, shRNA ou siRNA, visa uma sequência de um mRNA codificando Tet2.
[0315] Em algumas modalidades, o dsRNA inibidor é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1. Por exemplo, dsRNAs inibidores exemplificativos de PRDM1, por exemplo, moléculas de shRNA e siRNA, são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em WO 2013/070563, incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.
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[0316] Em modalidades, o inibidor é um ácido nucleico, por exemplo, DNA, codificando um dsRNA inibidor, por exemplo, shRNA ou siRNA, de quaisquer das modalidades acima. Em modalidades, o ácido nucleico, por exemplo, DNA, é disposto em um vetor, por exemplo, qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, como descrito aqui, por exemplo, um vetor lentiviral.
[0317] Sem ficar restringido pela teoria, um dsRNA inibidor (por exemplo, siRNA ou shRNA) que visa uma sequência de um mRNA de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), que é específico para uma ou mais isoformas do gene mas não afeta uma ou mais isoformas diferentes do gene (por exemplo, devido a abordagem seletiva de uma junção de encadeamento única, ou abordagem seletiva de um domínio que está presente em uma ou mais isoformas do gene mas não está presente em uma ou mais isoformas diferentes do gene). Em modalidades, pode ser preferencial visar especificamente uma isoforma de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) que contenha um domínio catalítico.
Moléculas Pequenas
[0318] Em alguma modalidade, o modulador de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é uma molécula pequena. Moduladores (por exemplo, inibidores) exemplificativos que são moléculas pequenas são descritos abaixo.
Inibidores de IFN-γ
[0319] Em modalidades, um inibidor de IFN-γ é uma molécula pequena que inibe ou reduz a expressão e/ou função de IFN-γ. Em um exemplo, um inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é uma molécula pequena que inibe ou reduz a síntese de IFN-γ, por
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217/606 exemplo, um composto bisfenol ou fenóxi, ou um seu derivado. Ver, por exemplo, US 5,880,146, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. Em outro exemplo, um inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é uma molécula pequena que inibe IFN-γ ao decrescer a produção de fator indutor de IFN-γ (IGIF) ou inibir a enzima conversora de interleucina-ΐβ (ICE). Ver, por exemplo, US 5.985.863, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
Inibidores de NOTCH2
[0320] Em modalidades, um inibidor de NOTCH2 é uma molécula pequena que inibe ou reduz a expressão e/ou função de Notch2.
[0321] Em um exemplo, um inibidor de NOTCH2 de acordo com a presente invenção é gliotoxina ou um seu derivado, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em acetilgliotoxina, 6-C1-3alcoxigliotoxina, 6-C2-3-acilóxi-gliotoxina, 6-di-hidro-gliotoxina, 6-dihidróxi-gliotoxina, 6-[(metoxicarbonil)metóxi]-gliotoxina ou 6cianometóxi-gliotoxina, ou um seu sal. Ver, por exemplo, US 7.981.878, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
[0322] Em um exemplo, um inibidor de NOTCH2 de acordo com a presente invenção é 6-4[-(terc-butil)-fenóxi]piridino-3-amina, ou um seu derivado, ver, por exemplo, US 9,296,682, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
[0323] Em um exemplo, um inibidor de NOTCH2 de acordo com a presente invenção é um inibidor de γ-secretase, por exemplo, MK-0752 (Merck & Co.), RO4929097 (Roche), semagacestat (LY-450139; Eli Lilly & Co.), avagacestat (BMS-708163; Bristol-Myers Squib), DAPT (éster de t-Butila de N-[N-(3,5-Difluorofenilacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina), L685,458, composto E ((s,s)-2-(3,5-Difluorofenil)-acetilamino]-N-(1-metil2-oxo-5-fenil-2,3-di-hidro-1 H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-propionamida), DBZ (dibenzazepina), JLK6 (7-amino-4-cloro-3-metóxi-isocumarina) ou Composto 18 ([11-endo]-N-(5,6,7,8,9,10-hexa-hidro-6,9
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218/606 metanobenzo[9][8]anulen-11-il)-tiofeno-2-sulfonamida). Ver, por exemplo, Purow B. Adv Exp Med Biol. 2012;727:305-19, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
Inibidores de CD28
[0324] Em modalidades, um inibidor de CD28 é uma molécula pequena que inibe ou reduz a expressão e/ou função de CD28.
Inibidores de ICOS
[0325] Em modalidades, um inibidor de ICOS é uma molécula pequena que inibe ou reduz a expressão e/ou função de ICOS.
Inibidores de IL2RA
[0326] Em modalidades, um inibidor de IL2RA é uma molécula pequena que inibe ou reduz a expressão e/ou função de IL2RA.
[0327] Em um exemplo, um inibidor de IL2RA de acordo com a presente invenção é uma molécula pequena que reduz a ligação entre IL-2 e IL2RA, por exemplo, análogos de acilfenilalanina, por exemplo, Ro26-4550 (Roche) ou um seu derivado. Ver, por exemplo, Thanos et al., Proc Natl Acad Sei USA. 2006, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
Inibidores de PRDM1
[0328] Em modalidades, um inibidor de PRDM1 é uma molécula pequena que inibe ou reduz a expressão e/ou função de PRDM1.
Inibidores de Tet
[0329] Em modalidades, um inibidor de Tet é uma molécula pequena que inibe a expressão e/ou uma função de Tet, por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2.
Inibidores de Tet2
[0330] Em modalidades, um inibidor de Tet2 é uma molécula pequena que inibe a expressão e/ou função de Tet2. Por exemplo, um inibidor de Tet2 de acordo com a presente invenção é 2-hidroxiglutarato (CAS #2889-31-8).
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[0331] Em outro exemplo, um inibidor de Tet2 de acordo com a presente invenção tem a estrutura seguinte:
Figure BR112019019426A2_D0001
Pkmpctma SC1
[0332] Em outro exemplo, um inibidor de Tet2 de acordo com a presente invenção é N-[3-[7-(2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilamino)-1-metil2-oxo-1,4-di-hidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metilfenil]-3trifluorometil-benzamida (CAS #839707-37-8), e tem a estrutura seguinte:
Figure BR112019019426A2_D0002
[0333] Em outro exemplo, um inibidor de Tet2 de acordo com a presente invenção é ácido 2-[(2,6-dicloro-3-metilfenil)amino]benzoico (CAS # 644-62-2), e tem a estrutura seguinte:
.-N ácido meciofenâmico
[0334] Em modalidades, o inibidor de Tet2 da presente invenção é um sal farmaceuticamente aceitável de quaisquer dos anteriores.
Inibidores de HDAC
[0335] Quaisquer inibidores de HDAC conhecidos podem ser usados de acordo com a presente invenção. Exemplos não limitadores de inibidores de HDAC incluem Voninostat (Zolinza®); Romidepsina (Istodax®); Treicostatina A (TSA); Oxamflatina; Vorinostat (Zolinza®,
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Suberoilanilida do ácido hidroxâmico); Piroxamida (siberoil-3aminopiridinoamida do ácido hidroxâmico); Trapoxina A (RF-1023A); Trapoxina B (RF-10238); Ciclo[(aS,2S)-a-amino-q-oxo-2-oxiranooctanoi l-O-meti I-D-ti rosi I-L- iso leuci l-L-prol i la] (Cyl-1); Ciclo[(aS,2S)-aamino-q-oxo-2-oxirano-octanoil-O-metil-D-tirosil-L-isoleucil-(2S)-2-piperidinocarbonila] (Cil-2); [L-alanil-D-alanil-(2S)-q-oxo-L-a-amino-oxiranooctanoil-D-prolila] Cíclica (toxina HC); Ciclo[(aS,2S)-a-amino-q-oxo-2oxirano-octanoil-D-fenilalanil-L-leucil-(2S)-2-piperidinocarbonila] (WF3161); Clamidocina ((S)-(2-metilalanil-L-fenilalanil-D-prolil-q-oxo-L-a-aminooxirano-octanoíla) Cíclica; Apicidina (Ciclo(8-oxo-L-2-aminodecanoil-1metóxi-L-triptofil-L-isoleucil-D-2-piperidinocarbonila); Romidepsina (Istodax®, FR-901228); 4-Fenilbutirato; Espirucostatina A; Milproína (Ácido valproico); Entinostat (MS-275, N-(2-Aminofenil)-4-[N-(piridino-3-ilmetoxicarbonil)-amino-metil]-benzamida); Depudecina (4,5:8,9-dianidro1,2,6,7,11-pentadesóxi-D-treo-D-ido-Undeca-1,6-dienitol); 4-(Acetilamino)N-(2-aminofenil)-benzamida (também conhecido como CI-994); N1-(2Aminofenil)-N8-fenil-octanodiamida (também conhecido como BML-210); 4-(Dimetilamino)-N-(7-(hidroxiamino)-7-oxo-heptil)benzamida (também conhecido como M344); (E)-3-(4-(((2-(1 H-indol-3-il)etil)(2hidroxietil)amino)-metil)fenil)-N-hidroxiacrilamida (NVP-LAQ824); Panobinostat (Farydak®); Mocetinostat, e Belinostat.
Proteínas
[0336] Em alguma modalidade, o modulador de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) é uma proteína. Moduladores (por exemplo, inibidores) exemplificativos de proteínas são descritos abaixo.
Inibidores de IFN-γ
[0337] Em modalidades, um inibidor de IFN-γ é uma proteína que inibe ou reduz a expressão e/ou função de IFN-γ. Em um exemplo, um
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221/606 inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é um anticorpo anti-IFN-γ ou seu fragmento, ou um anticorpo antirreceptor do IFN-γ ou seu fragmento. Ver, por exemplo, WO 2013/078378, WO 2011/061700, US 6.329.511, US 6.558.661 e US 4.897.264, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.
[0338] Em outro exemplo, um inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é receptor de IFN-γ ou seu fragmento, por exemplo, como descrito em WO 2011/061700, US 6.558.661 e US 7.608.430, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.
[0339] Em outro exemplo, um inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é IFN-γ, ou um fragmento de IFN-γ, modificado ou inativado, por exemplo, como descrito em US 5.451.658 e US 7.973.133, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.
[0340] Em outro exemplo, um inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é uma citocina que é um antagonista de IFN-γ, por exemplo, como descrito em US 5.612.195, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
[0341] Em outro exemplo, um inibidor de IFN-γ de acordo com a presente invenção é uma proteína BCRF1 que inibe ou reduz a produção de IFN-γ, por exemplo, como descrito em US 5.736.390, aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
Inibidores de NOTCH2
[0342] Em modalidades, um inibidor de NOTCH2 é uma proteína que inibe ou reduz a expressão e/ou função de NOTCH2. Em um exemplo, um inibidor de Notch2 de acordo com a presente invenção é um anticorpo anti-NOTCH2 ou seu fragmento, ver, por exemplo, WO 2014/141064, WO 2008/091641, US 7.919.092, US 8.226.943 e US 8.404.239, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.
Inibidores de IL2RA
[0343] Em modalidades, um inibidor de IL2RA é uma proteína que
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222/606 inibe ou reduz a expressão e/ou função de IL2RA. Em um exemplo, um inibidor de IL2RA de acordo com a presente invenção é um anticorpo anti-IL2RA ou seu fragmento, ver, por exemplo, WO 1990/007861, WO 2000/030679, WO 2014/144935 e US 7.438.907, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade. Anticorpos anti-IL2RA exemplificativos incluem Daclizumab, Basiliximab e BT563.
[0344] Em outro exemplo, um inibidor de IL2RA de acordo com a presente invenção é um antagonista peptídico de IL2RA, ver, por exemplo, US 5.635.597 e Emerson et aí., Protein Sei. 2003 abril;12(4):811-22, aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.
Inibidores de PRDM1
[0345] Em modalidades, um inibidor de PRDM1 é uma proteína ou peptideo que inibe ou reduz a expressão e/ou função de PRDM1. Em um exemplo, um inibidor de PRDM1 de acordo com a presente invenção é um anticorpo anti-PRDM1 ou seu fragmento. Em um exemplo, um inibidor de PRDM1 de acordo com a presente invenção é um peptideo bloqueador que se liga a PRDM1.
Tet2 Negativo Dominante
[0346] De acordo com a presente invenção, isoformas negativas dominantes de Tet2, e ácido nucleico codificando o referido Tet2 negativo dominante, podem ser usados como inibidores de Tet2. Em modalidades, o Tet2 negativo dominante não tem função catalítica de Tet2. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação R1261G, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação R1262A, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em
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SEQ ID NQ: 1357 com a mutação S1290A, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação WSMYYN (aminoácidos 1291-1296 de SEQ ID NQ: 1357) para GGSGGS (SEQ ID NQ: 67), de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação M1293A e Y1294A, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação Y1295A, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação S1303N, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação H1382Y, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação D1384A, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Um exemplo de um Tet2 negativo dominante é uma proteína compreendendo ou consistindo em SEQ ID NQ: 1357 com a mutação D1384V, de acordo com a numeração de SEQ ID NQ: 1357. Em modalidades, o Tet2 negativo dominante pode incluir combinações de quaisquer das mutações acima mencionadas. Tais mutações são adicionalmente descritas, por exemplo, em Chen etal., Nature, 493:561564 (2013); Hu etal, Cell, 155:1545-1555 (2013), cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade.
Parceiros de ligação de Tet2 Negativo Dominante
[0347] Sem ficar restringido pela teoria, se crê que Tet2 interage, por exemplo, se liga, com um ou mais HDAC, por exemplo, um ou mais
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HDAC expressos em células efetoras imunes, por exemplo, em células T, e que tais complexos Tet2:HDAC podem contribuir para a atividade de Tet2 na célula. Em modalidades, um inibidor de Tet2 da invenção é um parceiro de ligação de Tet2 negativo dominante, por exemplo, um HDAC de ligação a Tet2 negativo dominante. Em outras modalidades, um inibidor de Tet2 da invenção compreende ácido nucleico codificando um parceiro de ligação de Tet2 negativo dominante, por exemplo, um HDAC de ligação a Tet2 negativo dominante.
Vetores
[0348] Como descrito aqui, a invenção proporciona vetores, por exemplo, como descrito aqui, que codificam moduladores (por exemplo, inibidores) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado aTet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), tais como o sistemas de edição genética, shRNA ou siRNA inibidores, moduladores (por exemplo, inibidores) de molécula pequena, peptídeo ou proteína de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) (por exemplo, como descrito aqui).
[0349] Em modalidades também compreendendo, por exemplo, um CAR, o ácido nucleico pode adicionalmente compreender uma sequência codificando um CAR, por exemplo, como descrito aqui. Em algumas modalidades, a invenção proporciona um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um inibidor de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) descrito aqui e compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma molécula CAR descrita aqui. Em modalidades, sequências de ácidos nucleicos são dispostas em vetores separados. Em outras modalidades, as duas ou mais sequências de ácidos nucleicos são codificadas por uma única molécula nucleica no mesmo
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225/606 quadro e como uma única cadeia polipeptidica. Neste aspecto, os dois ou mais CARs podem, por exemplo, estar separados por um ou mais sítios de divagem peptídica (por exemplo, um sítio de autoclivagem ou um substrato para uma protease intracelular). Exemplos de sítios de divagem de peptideos incluem os seguintes, nos quais os resíduos GSG são opcionais:
T2A: (GSG) EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID Ns: 68) P2A: (GSG) ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID Ns: 69) E2A: (GSG) QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID Ns: 70) F2A: (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID Ns: 71). [0350] Estes sítios de divagem peptídica são coletivamente referidos aqui como sítios 2A. Em modalidades, o vetor compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui e sequência de ácido nucleico codificando um shRNA ou siRNA inibidor de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), descrito aqui. Em modalidades, o vetor compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui e sequência de ácido nucleico codificando um modulador (por exemplo, inibidor) de um sistema de edição do genoma (por exemplo, um sistema CRISPR/Cas) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), descrito aqui.
Métodos de Uso de Moduladores
[0351] A invenção proporciona métodos para aumentar a eficácia terapêutica de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula expressando um CAR como descrito aqui, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, CTL019 ou CTL119), compreendendo uma etapa de alterar a expressão e/ou função de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2).
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[0352] Em certas modalidades, o método compreende reduzir ou eliminar a expressão e/ou função de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em outras modalidades, o método compreende aumentar ou ativar a expressão e/ou função de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em algumas modalidades, o método compreende contatar as referidas células com um modulador (por exemplo, um inibidor) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), como descrito aqui. Em algumas modalidades, o método compreende decrescer o nível de 5-hidroximetilcitosina na referida célula.
[0353] A invenção também proporciona métodos de preparação de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula expressando CAR tendo função melhorada (por exemplo, tendo eficácia melhorada, por exemplo, abordagem seletiva de tumores ou proliferação tumoral) compreendendo a etapa de alterar (por exemplo, reduzir ou eliminar, ou aumentar ou ativar) a expressão ou função de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) na referida célula. Em modalidades, o método compreende contatar as referidas células com um modulador (por exemplo, um inibidor ou ativador) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), como descrito aqui. Em algumas modalidades, o contato é efetuado ex vivo. Em algumas modalidades, o contato é efetuado in vivo. Em algumas modalidades, o contato é efetuado antes, simultaneamente ou após as referidas células serem modificadas para expressar um CAR, por exemplo, um CAR como descrito aqui.
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[0354] Em modalidades, a invenção proporciona um método para alterar (por exemplo, inibir ou ativar) a expressão e/ou função de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) em uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula expressando um CAR como descrito aqui, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, célula expressando CTL019 ou CTL119), o método compreendendo uma etapa de alterar (por exemplo, reduzir ou eliminar, ou aumentar ou ativar) a expressão e/ou função de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em modalidades, o método compreende contatar as referidas células com um modulador (por exemplo, um inibidor ou ativador) de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), como descrito aqui. Em algumas modalidades, o método compreende decrescer o nível de 5-hidroximetilcitosina na referida célula.
[0355] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método, por exemplo, um método descrito acima, que compreende introduzir ácido nucleico codificando um CAR em uma célula, por exemplo, uma célula efetora imune, por exemplo, uma célula T, em um sítio dentro de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), ou seus elementos reguladores, de modo que a expressão de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) sofre disrupção. A integração em um sítio dentro de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2) pode ser alcançada, por exemplo, usando um sistema de edição genética visando um gene
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228/606 associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), como descrito acima.
[0356] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método, por exemplo, um método descrito acima, compreendendo uma etapa de introduzir em uma célula um sistema de edição genética, por exemplo, um sistema de edição genética CRISPR/Cas, que visa um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2), por exemplo, um sistema CRISPR/Cas compreendendo um gRNA que tem uma sequência de direcionamento complementar a uma sequência-alvo de um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em modalidades, o sistema CRISPR/Cas é introduzido na referida célula como um complexo proteico ribonuclear de gRNA e enzima Cas, por exemplo, é introduzido via eletroporação. Em uma modalidade, o método compreende introduzir ácido nucleico codificando um ou mais dos componentes do sistema CRISPR/Cas na referida célula. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico é disposto no vetor codificando um CAR, por exemplo, um CAR como descrito aqui.
[0357] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método, por exemplo, um método descrito acima, compreendendo uma etapa de introduzir na célula um dsRNA inibidor, por exemplo, um shRNA ou siRNA, que visa um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em uma modalidade, o método compreende introduzir na referida célula ácido nucleico codificando um dsRNA inibidor, por exemplo, um shRNA ou siRNA, que visa um gene associado a Tet (por exemplo, um gene associado a Tet2) e/ou um gene Tet (por exemplo, Tet1, Tet2 e/ou Tet3, por exemplo, Tet2). Em uma
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229/606 modalidade, o referido ácido nucleico é disposto no vetor codificando um CAR, por exemplo, um CAR como descrito aqui.
[0358] Componentes adicionais de CARs e células T CAR, e métodos respeitantes à invenção, são descritos abaixo.
[0359] São proporcionadas aqui composições de matéria e métodos de uso para o tratamento de uma doença tal como câncer usando células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) manipuladas com CARs da invenção.
[0360] Em um aspecto, a invenção proporciona alguns receptores de antigenos quiméricos (CAR) compreendendo um domínio de ligação a antigenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, TCR ou fragmento de TCR) manipulado para ligação específica a um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral descrito aqui. Em um aspecto, a invenção proporciona uma célula efetora imune (por exemplo, célula T, célula NK) manipulada para expressar um CAR, em que a célula efetora imune manipulada exibe uma propriedade anticancerígena. Em um aspecto, uma célula é transformada com o CAR e o CAR é expresso na superfície da célula. Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, célula T, célula NK) é transduzida com um vetor viral codificando um CAR. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algumas de tais modalidades, a célula pode expressar de modo estável o CAR. Em outra modalidade, a célula (por exemplo, célula T, célula NK) é transfectada com um ácido nucleico, por exemplo, mRNA, cDNA, DNA, codificando um CAR. Em algumas de tais modalidades, a célula pode expressar de modo transiente o CAR.
[0361] Em um aspecto, o domínio de ligação a antigenos de um CAR descrito aqui é um fragmento de anticorpo scFv. Em um aspecto, tais fragmentos de anticorpos são funcionais no sentido em que retêm a afinidade de ligação equivalente, por exemplo, se ligam ao mesmo
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230/606 antígeno com afinidade comparável, à do anticorpo IgG de onde são derivados. Em outras modalidades, o fragmento de anticorpo tem uma afinidade de ligação menor, por exemplo, se liga ao mesmo antígeno com uma afinidade de ligação menor do que o anticorpo de onde é derivado, mas é funcional no sentido de que proporciona uma resposta biológica descrita aqui. Em uma modalidade, a molécula CAR compreende um fragmento de anticorpo que tem uma afinidade de ligação KD de 10-4 M até 10-8 M, por exemplo, 10-5 M até 10-7 M, por exemplo, 10-6 M ou 10-7 M, para o antígeno-alvo. Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo tem uma afinidade de ligação que é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou 1 000 vezes menor do que a de um anticorpo de referência, por exemplo, um anticorpo descrito aqui.
[0362] Em um aspecto, tais fragmentos de anticorpos são funcionais no sentido de que proporcionam uma resposta biológica que pode incluir, mas não se limita a, ativação de uma resposta imune, inibição da origem da transdução do sinal a partir do seu antígeno-alvo, inibição da atividade de quinases e similares, como será entendido pelo perito.
[0363] Em um aspecto, o domínio de ligação a antígenos do CAR é um fragmento de anticorpo scFv que é humanizado em comparação com a sequência murina do scFv de onde é derivado.
[0364] Em um aspecto, o domínio de ligação a antígenos de um CAR da invenção (por exemplo, um scFv) é codificado por uma molécula de ácido nucleico cuja sequência foi otimizada quanto a códons para expressão em uma célula de mamífero. Em um aspecto, o construto de CAR completo da invenção é codificado por uma molécula de ácido nucleico cuja sequência completa foi otimizada quanto a códons para expressão em uma célula de mamífero. Otimização de códons se relaciona com a descoberta de que a frequência da
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231/606 ocorrência de códons sinônimos (isto é, códons que codificam o mesmo aminoácido) em DNA codificador está distorcida em diferentes espécies. Tal degenerescência de códons permite que um polipeptídeo idêntico seja codificado por uma variedade de sequências de nucleotideos. Uma variedade de métodos de otimização de códons é conhecida na técnica, e inclui, por exemplo, métodos revelados pelo menos nas Patentes US Números 5,786,464 e 6,114,148.
[0365] Em um aspecto, os CARs da invenção combinam um domínio de ligação a antigenos de um anticorpo específico com uma molécula de sinalização intracelular. Por exemplo, em alguns aspectos, a molécula de sinalização intracelular inclui, mas não se limita a, módulos de sinalização da cadeia CD3-zeta, 4-1 BB e CD28 e suas combinações. Em um aspecto, o domínio de ligação a antigenos se liga a um antígeno tumoral como descrito aqui.
[0366] Adicionalmente, a presente invenção proporciona CARs e células expressando CAR e o seu uso em medicamentos ou métodos para tratar, entre outras doenças, câncer ou qualquer malignidade ou doenças autoimunes envolvendo células ou tecidos que expressam um antígeno tumoral como descrito aqui.
[0367] Em um aspecto, o CAR da invenção pode ser usado para erradicar uma célula normal que expressa um antígeno tumoral como descrito aqui, desse modo aplicável para uso como terapia de condicionamento celular antes da transplantação de células. Em um aspecto, a célula normal que expressa um antígeno tumoral como descrito aqui é uma célula-tronco normal e a transplantação de células é uma transplantação de células-tronco.
[0368] Em um aspecto, a invenção proporciona uma célula efetora imune (por exemplo, célula T, célula NK) manipulada para expressar um receptor de antigenos quimérico (CAR), em que a célula efetora imune manipulada exibe uma propriedade antitumoral. Um antígeno
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232/606 preferencial é um antígeno associado a câncer (isto é, antígeno tumoral) descrito aqui. Em um aspecto, o domínio de ligação a antígenos do CAR compreende um fragmento de anticorpo parcialmente humanizado. Em um aspecto, o domínio de ligação a antígenos do CAR compreende um scFv parcialmente humanizado. Em conformidade, a invenção proporciona CARs que compreendem um domínio de ligação a antígenos humanizado e é manipulado em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, e métodos do seu uso para terapia adotiva.
[0369] Em um aspecto, os CARs da invenção compreendem pelo menos um domínio intracelular selecionado do grupo de um domínio de sinalização de CD137 (4-1 BB), um domínio de sinalização de CD28, um domínio de sinal de CD27, um domínio de sinal de CD3zeta, e qualquer combinação destes. Em um aspecto, os CARs da invenção compreendem pelo menos um domínio de sinalização intracelular que provém de uma ou mais moléculas coestimuladoras diferentes de um CD137 (4-1 BB) ou CD28.
[0370] Sequências de alguns exemplos de vários componentes de CARs da presente invenção são listadas na Tabela 1, onde aa designa aminoácidos, e na designa ácidos nucleicos que codificam o peptídeo correspondente.
Tabela 1. Sequências de vários componentes de CAR (aa aminoácidos, na - ácidos nucleicos que codificam a proteína correspondente)
SEQ descrição Sequência Corresp.
ID N° a huCD19
Promotor CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTC 100 de EF-1 CCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAG GTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTT TTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAAC GTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTG TGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTT GAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGG GTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTC
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GCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGC
GAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTA
GCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGA
TAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTG
GGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCG
AGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA
AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCC
CGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAA
AGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG
GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCT
TTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCG
TCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGG
TTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGG
AGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTT
GCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGT TCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
Líder MALPVTALLLPLALLLHAARP (aa)
Líder ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCA (na) TGCCGCTAGACCC
Dobradiça TTTPAPRPPTPAPTLASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD de CD 8 (aa)
Dobradiça ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTC de CD8 GCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCG (na) CAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
Dobradiça ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ de Ig4 EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE (aa) YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL
VKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ
EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
Dobradiça GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCT de Ig4 GGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGA (na) TGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAG
GAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA
CAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGG
TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAA
TACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAAC
CATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGC
CCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTG
GTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGG
CCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACG
102
103
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GCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAG GAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
Dobradiça RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEK 47 de IgD EEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFWGSDLK (aa) DAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVT
CTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSG FSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSP
QPATYTCWSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
Dobradiça AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACA 48 de IgD GCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTA (na) CGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAA
GAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATAC
CCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGC
TTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAG
GATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGT
TGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACT
CAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACA
TGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAG
AGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCA
GTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGC
TTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGT
GAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTA
CCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCC
CAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCT GCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT
Dobradiça GGGGSGGGGS49 /ligante de GS (aa)
Dobradiça GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC50 /ligante de GS (na)
CD8TM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC15 (aa)
CD8 TM ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTC 56 (na) ACTGGTTATCACCCTTTACTGC
Dominio KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL16 intracelu lar de 41BB (aa)
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235/606
Dominio AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAG 60
intracelu ACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAG lar de 4-AAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
1BB (na)
CD27 (aa) QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP 51
CD27 (na) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCC 52 CCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCAC GCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
CD3-zeta RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR 17
(aa) RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR
CD3-zeta AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCA 101
(na) GAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATG TTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGA AGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGAT GGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCA AGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACC TACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CD3-zeta RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR 4 3
(aa) RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR
CD3-zeta AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCA 4 4
(na) G AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGT TT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGG A AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCG G AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGG C ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGAC GC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ligante GGGGS 18
ligante GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC 50
Dominio PgwfIdspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcs fsntsesfvlnwyrm
extracelu spsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgt
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236/606 lar de ylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv PD-1 (aa)
Dominio Cccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaacctt extracelu ctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgt lar de gctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatg PD-1 (na) agcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtc gcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggca gagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacc tacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagag cttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactg cacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtc
CAR PD-1 Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdn (aa) com atftcs fsntses fvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtq sinal Ipngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterra evptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrp aaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyi fkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqn qlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkma eayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
CAR PD-1 Atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctcca (na) cgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtgga atcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataat gcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaa ctggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttc cggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaa ctgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaa cgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggccc aaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagct gaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtt tcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccc caactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccct gccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacat ctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccc tggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacatt ttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacgg ttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcg tgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaac cagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgct ggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaa agaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggcc gaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggg gcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacg atgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 242/678
237/606
28 ligante (Gly-Gly-Gly-Ser)n, em que n = 1-10 105
29 ligante (Gly4 Ser)4 106
30 ligante (Gly4 Ser)3 107
31 ligante (Gly3Ser) 108
32 poliA aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa118
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
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33 poliA aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa104
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34 poliA aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa109
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241/606 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
35 poliA tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt110
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt
36 poliA tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt111
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 247/678
242/606 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 248/678
243/606 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 249/678
244/606 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt poliA aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa112
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247/606 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
9 CAR P D1 PgwfIdspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcs fsntsesfvlnwyrm (aa) spsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgt ylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwa plagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcs or fpeeeeggcelrvkfs rsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrr grdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgl yqglstatkdtydalhmqalppr
Antígenos Associados a Câncer
[0371] A presente invenção proporciona células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para conterem um ou mais CARs que dirigem as células efetoras imunes para câncer. Tal é alcançado através de um domínio de ligação a antígenos no CAR que é específico para um antígeno associado a câncer. Há duas classes de antígenos associados a câncer (antígenos tumorais) que podem ser visados pelos CARs da presente invenção: (1) antígenos associados a câncer que são expressos na superfície de células cancerígenas; e (2) antígenos associados a câncer que são, eles próprios, intracelulares, no entanto, um fragmento de tal antígeno (peptídeo) é apresentado na superfície das células cancerígenas por MHC (complexo de histocompatibilidade principal).
[0372] Em conformidade, a presente invenção proporciona CARs que visam os seguintes antígenos associados a câncer (antígenos tumorais): CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1 (CLECL1), CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2,
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Mesotelina, IL-11 Ra, PSCA, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, PRSS21, SSEA-4, CD20, Receptor de folato alfa, ERBB2 (Her2/neu), MLJC1, EGFR, NOAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor de IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, tirosinase, EphA2, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, Receptor de folato beta, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, Ácido polissiálico, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NYESO-1, LAGE-1 a, legumaína, HPV E6,E7, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6AML, proteína do esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno relacionado com Fos 1, p53, p53 mutante, prosteina, survivina e telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, Ras mutante, hTERT, pontos de quebra de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, Receptor de andrógenos, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OYTES1, LOK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa de telomerase humana, RU1, RU2, carboxil-esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 e IGLL1.
Antigenos Suportando Tumores
[0373] Um CAR descrito aqui pode compreender um domínio de ligação a antigenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, TCR ou fragmento de TCR) que se liga a um antígeno suportando um tumor (por exemplo, um antígeno suportando um tumor como descrito aqui). Em algumas modalidades, o antígeno suportando um tumor é um antígeno presente em uma célula estromal ou uma célula supressora derivada de mieloide (MDSC). Células estromais podem secretar fatores de crescimento para promover a divisão de células no microambiente. Células MDSC podem inibir a proliferação e ativação de células T. Sem pretender ficar restringido pela teoria, em algumas
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249/606 modalidades, as células expressando CAR destroem as células suportando um tumor, desse modo inibindo indiretamente o crescimento ou sobrevivência tumoral.
[0374] Em modalidades, o antígeno de células estromais é escolhido de um ou mais de: antígeno de células estromais da medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e tenascina. Em uma modalidade, o anticorpo específico para FAP é, compete pela ligação a, ou tem as mesmas CDRs do, sibrotuzumab. Em modalidades, o antígeno de MDSC é escolhido de um ou mais de: CD33, CD11 b, C14, CD15 e CD66b. Em conformidade, em algumas modalidades, o antígeno suportando um tumor é escolhido de um ou mais de: antígeno de células estromais da medula óssea 2 (BST2), proteína de ativação de fibroblastos (FAP) ou tenascina, CD33, CD11 b, C14, CD15 e CD66b. Receptor de Antigenos Quimérico (CAR)
[0375] A presente invenção abrange um construto de DNA recombinante compreendendo sequências codificando um CAR, em que o CAR compreende um domínio de ligação a antigenos (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, TCR ou fragmento de TCR) que se liga especificamente a um antígeno associado a câncer descrito aqui, em que a sequência do domínio de ligação a antigenos é contígua com e está no mesmo quadro de leitura de uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio de sinalização intracelular. O domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização coestimulador e/ou um domínio de sinalização primário, por exemplo, uma cadeia zeta. O domínio de sinalização coestimulador se refere a uma porção do CAR compreendendo pelo menos uma porção do domínio intracelular de uma molécula coestimuladora.
[0376] Em aspectos específicos, um construto de CAR da invenção compreende um domínio de scFv, em que o scFv pode ser precedido de uma sequência líder opcional, tal como proporcionado em SEQ ID Ns:
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2, e seguido de uma sequência de dobradiça opcional como proporcionado em SEQ ID Ns:4 ou SEQ ID Ns:6 ou SEQ ID Ns:8 ou SEQ ID Ns:10, uma região transmembrana como proporcionado em SEQ ID Ns:12, um domínio de sinalização intracelular que inclui SEQ ID Ns:14 ou SEQ ID Ns:16 e uma sequência CD3 zetaque inclui SEQ ID Ns:18 ou SEQ ID Ns:20, por exemplo, em que os domínios são contíguos com e estão no mesmo quadro de leitura para formar uma única proteína de fusão. [0377] Em um aspecto, construtos CAR exemplificativos compreendem uma sequência líder opcional (por exemplo, uma sequência líder aqui descrita), um domínio de ligação a antigenos extracelular (por exemplo, um domínio de ligação a antigenos aqui descrito), uma dobradiça (por exemplo, uma região de dobradiça aqui descrita), um domínio de transmembrana (por exemplo, um domínio de transmembrana aqui descrito) e um domínio estimulador intracelular (por exemplo, um domínio estimulador intracelular aqui descrito). Em um aspecto, um construto de CAR exemplificativo compreende uma sequência líder opcional (por exemplo, uma sequência líder aqui descrita), um domínio de ligação a antigenos extracelular (por exemplo, um domínio de ligação a antigenos aqui descrito), uma dobradiça (por exemplo, uma região de dobradiça aqui descrita), um domínio de transmembrana (por exemplo, um domínio de transmembrana aqui descrito), um domínio de sinalização coestimulador intracelular (por exemplo, um domínio de sinalização coestimulador aqui descrito) e/ou um domínio de sinalização primário intracelular (por exemplo, um domínio de sinalização primário aqui descrito).
[0378] Uma sequência líder exemplificativa é proporcionada como SEQ ID NQ: 2. Uma sequência de dobradiça/espaçadora exemplificativa é proporcionada como SEQ ID NQ: 4 ou SEQ ID NQ:6 ou SEQ ID NQ:8 ou SEQ ID NQ:10. Uma sequência de domínio de transmembrana exemplificativa é proporcionada como SEQ ID NQ:12. Uma sequência
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251/606 exemplificativa do domínio de sinalização intracelular da proteína 4-1 BB é proporcionada como SEQ ID N2: 14. Uma sequência exemplificativa do domínio de sinalização intracelular de CD27 é proporcionada como SEQ ID N2:16. Uma sequência do domínio CD3zeta exemplificativa é proporcionada como SEQ ID N2: 18 ou SEQ ID N2:20.
[0379] Em um aspecto, a presente invenção abrange um construto de ácido nucleico recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um CAR, em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico codificando um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, descrito aqui, que é contíguo a e está no mesmo quadro de leitura de uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio de sinalização intracelular.
[0380] Em um aspecto, a presente invenção abrange um construto de ácido nucleico recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um CAR, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio de ligação a antigenos, em que a sequência é contígua a e está no mesmo quadro de leitura da sequência de ácido nucleico codificando um domínio de sinalização intracelular. Um domínio de sinalização intracelular exemplificativo que pode ser usado no CAR inclui, mas não se limita a, um ou mais domínios de sinalização intracelulares, por exemplo, de CD3-zeta, CD28, CD27, 4-1 BB e similares. Em alguns casos, o CAR pode compreender qualquer combinação de CD3-zeta, CD28, 4-1 BB, e similares.
[0381] As sequências de ácido nucleico codificando as moléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, por rastreio de bibliotecas de células expressando a molécula de ácido nucleico, por derivação da molécula de ácido nucleico de um vetor que é conhecido por incluir aquela ou por isolamento diretamente a partir de células e
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252/606 tecidos contendo aquela, usando técnicas comuns. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de ser clonado.
[0382] A presente invenção inclui construtos de vetores retrovirais e lentivirais expressando um CAR que podem ser diretamente transduzidos em uma célula.
[0383] A presente invenção também inclui um construto de RNA que pode ser diretamente transfectado em uma célula. Um método para gerar mRNA para uso em transfecção envolve transcrição in vitro (IVT) de um modelo com iniciadores especialmente planejados, seguido de adição de poli A, para produzir um construto contendo sequências 3' e 5' não traduzidas (UTR) (por exemplo, uma UTR 3' e/ou 5' descritas aqui), um cap 5' (por exemplo, um cap 5' descrito aqui) e/ou Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES) (por exemplo, um IRES descrito aqui), o ácido nucleico a ser expresso e uma cauda poliA, tipicamente com 50-2000 bases de comprimento (SEQ ID NQ:32). O RNA produzido deste modo pode transfectar eficientemente diferentes tipos de células. Em uma modalidade, o modelo inclui sequências para o CAR. Em uma modalidade, um vetor de RNA de CAR é transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, por eletroporação.
Domínio de Ligação a Antígenos
[0384] Em um aspecto, o CAR da invenção compreende um elemento de ligação específico para um alvo também referido como um domínio de ligação a antígenos. A escolha da fração depende do tipo e número de ligantes que definem a superfície de uma célula-alvo. Por exemplo, o domínio de ligação a antígenos pode ser escolhido para reconhecer um ligante que atua como um marcador da superfície celular em células-alvo associadas a um estado de doença particular. Assim, exemplos de marcadores da superfície celular que podem atuar como
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253/606 ligantes para o domínio de ligação a antigenos em um CAR da invenção incluem os associados a infecções virais, bacterianas e parasitárias, doença autoimune e células cancerígenas.
[0385] Em um aspecto, a resposta de células T mediada por CAR pode ser dirigida a um antígeno de interesse por manipulação de um domínio de ligação a antigenos que se liga especificamente a um antígeno desejado no CAR.
[0386] Em um aspecto, a porção do CAR que compreende o domínio de ligação a antigenos compreende um domínio de ligação a antigenos que visa um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral descrito aqui.
[0387] O domínio de ligação a antigenos pode ser qualquer domínio que se ligue ao antígeno incluindo, mas não se limitando a, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, e um seu fragmento funcional, incluindo, mas não se limitando a, um anticorpo de domínio único tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia leve (VL) e um domínio variável (VHH) de nanocorpo derivado de camelídeo, e um esqueleto alternativo que é conhecido na técnica como atuando como domínio de ligação a antigenos, tal como um domínio de fibronectina recombinante, um receptor de células T (TCR), ou um seu fragmento, por exemplo, TCR de cadeia simples e similares. Em alguns casos, é benéfico que o domínio de ligação a antigenos seja derivado da mesma espécie na qual o CAR será em última instância usado. Por exemplo, para uso em humanos, poderá ser benéfico que o domínio de ligação a antigenos do CAR compreenda resíduos humanos ou humanizados para o domínio de ligação a antigenos de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.
[0388] Em uma modalidade, o CAR CD19 é um CAR CD19 descrito na Pat. US No. 8,399,645; Pat. US NQ. 7,446,190; Xu et al., Leuk
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Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz etal., B/ood 122(17):29652973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); ou 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (15-18 de maio, Salt Lake City) 2013, Resumo 10 (cada um dos quais é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade). Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD19 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um CAR, anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígenos descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2012/079000 (incorporada aqui a título de referência na sua totalidade). Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD19 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um CAR, anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígenos descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2014/153270; Kochenderfer, J.N. etal., J. Immunother. 32 (7), 689702 (2009); Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010); publicação PCT WO2014/031687; Bejcek, Cancer Research, 55,2346-2351,1995; ou Patente U.S. NQ. 7,446,190 (cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade).
[0389] Em uma modalidade, o domínio de ligação a antígenos contra mesotelina é ou pode ser derivado de um domínio de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, scFv ou VH e VL, de um anticorpo, fragmento de ligação a antígenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2015/090230 (em uma modalidade, o CAR é um CAR descrito em WO2015/090230, cujo conteúdo é incorporado aqui na sua totalidade). Em modalidades, o domínio de ligação a antígenos contra mesotelina é ou é derivado de uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, scFV ou VH e VL, de um anticorpo, fragmento de ligação a antígenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO1997/025068, WO1999/028471, WG2005/014652,
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W02006/099141, W02009/045957, W02009/068204,
WO2013/142034, WO2013/040557 ou WO2013/063419 (cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade).
[0390] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD123 é ou é derivado de uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, scFv ou VH e VL, de um anticorpo, fragmento de ligação a antígenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2014/130635 (incorporada aqui a título de referência na sua totalidade). Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD123 é ou é derivado de uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, scFv ou VH e VL, de um anticorpo, fragmento de ligação a antígenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2016/028896 (incorporada aqui a título de referência na sua totalidade); em modalidades, o CAR é um CAR descrito em WO2016/028896. Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD123 é ou é derivado de uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, scFv ou VL e VH, de um anticorpo, fragmento de ligação a antígenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO1997/024373, W02008/127735 (por exemplo, um domínio de ligação a CD123 de 26292, 32701, 37716 ou 32703), WO2014/138805 (por exemplo, um domínio de ligação a CD123 de CSL362), WO2014/138819, WO2013/173820, WO2014/144622, W02001/66139, WO2010/126066 (por exemplo, o domínio de ligação a CD123 de qualquer um de Old4, Old5, Old 17, Old 19, New102 ou Old6), WO2014/144622 ou US2009/0252742 (cada um dos quais é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade).
[0391] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD22 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903
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256/606 (2010); Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P).
[0392] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CS-1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de Elotuzumab (BMS), ver, por exemplo, Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37; Tai etal., 2007, Blood. 110(5):1656-63.
[0393] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CLL-1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs ou VH e VL, de um anticorpo, fragmento de ligação a antígenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2016/014535, cujo conteúdo é incorporado aqui na sua totalidade. Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CLL-1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo disponibilizado pela R&D, ebiosciences, Abeam, por exemplo, PECLL1-hu Cat# 353604 (BioLegend); e PE-CLL1 (CLEC12A) Cat# 562566 (BD).
[0394] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD33 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Bross etal., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001) (Gemtuzumab Ozogamicina, hP67.6), Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992) (Lintuzumab, HuM195), Lapusan etal., /nvesi Λ/ew Drugs 30(3):1121-1131 (2012) (AVE9633), Aigner etal., Leukemia27(5): 1107-1115 (2013) (AMG330, CD33 BiTE), Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012), e Pizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014). Moléculas CAR exemplificativas que visam CD33 são descritas aqui, e são proporcionadas em WO2016/014576, por exemplo, na Tabela 2 de WO2016/014576 (incorporado a título de referência na sua totalidade).
[0395] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra GD2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs,
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257/606 de um anticorpo descrito, por exemplo, em Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985), Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998), Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992). Em algumas modalidades, um domínio de ligação a antigenos contra GD2 é uma porção de ligação a antigenos de um anticorpo selecionado de mAb 14.18, 14G2a, ch14.18, hu14.18, 3F8, hu3F8, 3G6, 8B6, 60C3, 10B8, ME36.1 e 8H9, ver, por exemplo, WO2012033885, WO2013040371, WO2013192294, WO2013061273, WO2013123061, WO2013074916 e WO201385552. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a antigenos contra GD2 é uma porção de ligação a antigenos de um anticorpo descrito na Publicação US N2.: 20100150910 ou Publicação PCT N2.: WO 2011160119.
[0396] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra BCMA é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em WO2012163805, WC200112812 e W02003062401. Em modalidades, construtos CAR para BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, scFv ou sequências VH e VL da Publicação PCT WO2012/0163805 (cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade). Em modalidades, construtos CAR para BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, scFv ou sequências VH e VL da Publicação PCT WO2016/014565 (cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade). Em modalidades, construtos CAR para BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, scFv ou sequências VH e VL da Publicação PCT WO2014/122144 (cujo conteúdo é deste modo
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258/606 incorporado a título de referência na sua totalidade). Em modalidades, construtos CAR para BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando as moléculas CAR, e/ou os domínios de ligação a BCMA (por exemplo, CDRs, scFv ou sequências VH e VL) da Publicação PCT WO2016/014789 (cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade). Em modalidades, construtos CAR para BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando as moléculas CAR, e/ou os domínios de ligação a BCMA (por exemplo, CDRs, scFv ou sequências VH e VL) da Publicação PCT WO2014/089335 (cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade). Em modalidades, construtos CAR para BCMA exemplificativos adicionais são gerados usando as moléculas CAR, e/ou os domínios de ligação a BCMA (por exemplo, CDRs, scFv ou sequências VH e VL) da Publicação PCT WO2014/140248 (cujo conteúdo é deste modo incorporado a título de referência na sua totalidade).
[0397] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra o antígeno Tn é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US 2014/0178365, US8,440,798, Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010), e Stone etal., Oncolmmunology 1(6):863-873(2012).
[0398] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra PSMA é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013), US 20110268656 (J591 ScFv); Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013) (scFvD2B); WO 2006125481 (mAbs 3/A12, 3/E7 e 3/F11) e fragmentos de anticorpos de cadeia simples (scFv A5 e D7).
[0399] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra ROR1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Hudecek et al., Clin Cancer
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Res 19(12):3153-3164 (2013); WO 2011159847, e US20130101607. [0400] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra FLT3 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em WO2011076922, US5777084, EP0754230, US20090297529, e vários anticorpos de catálogos comerciais (R&D, eBiosciences, Abeam).
[0401] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra TAG72 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Hornbach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997); e Abeam ab691.
[0402] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra FAP é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Ostermann et al., Clinicai Cancer Research 14:4584-4592 (2008) (FAP5), Publicação de Pat. US No. 2009/0304718; sibrotuzumab (ver, por exemplo, Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003); e Tran et al., J Exp Mee/210(6):1125-1135 (2013).
[0403] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD38 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de daratumumab (ver, por exemplo, Groen et al., Blood 116(21 ):1261 1262 (2010)); MOR202 (ver, por exemplo, US 8.263.746), ou anticorpos descritos em US 8.362.211.
[0404] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD44v6 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Casucci etal., Blood 122(20):3461-3472 (2013).
[0405] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CEA é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Chmielewski et al., Gastroenterology 143(4):1095-1107 (2012).
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[0406] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra EPCAM é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRS, de um anticorpo selecionado de MT110, Ab biespecifico para EpCAM-CD3 (ver, por exemplo, clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596); Edrecolomab; 3622W94; ING-1; e adecatumumab (MT201).
[0407] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra PRSS21 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito na Patente US N2.: 8,080,650.
[0408] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra B7H3 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo MGA271 (Macrogenics).
[0409] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra KIT é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US7915391, US20120288506, e vários anticorpos de catálogos comerciais.
[0410] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra IL-13Ra2 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em W02008/146911, W02004087758, vários anticorpos de catálogos comerciais e W02004087758.
[0411] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD30 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US7090843 B1 e EP0805871.
[0412] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra GD3 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US7253263; US 8,207,308; US 20120276046; EP1013761; W02005035577; e US6437098.
[0413] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD171 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo,
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CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014).
[0414] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra IL-11 Ra é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo disponibilizado pela Abeam (cat# ab55262) ou Novus Biologicals (cat# EPR5446). Em outra modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra IL-11 Ra é um peptídeo, ver, por exemplo, Huang etal., Cancer Res 72(1):271-281 (2012).
[0415] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra PSCA é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007) (scFv 7F5); Nejatollahi etal., J of Oncology 2013(2013), artigo ID 839831 (scFv C5-II); e Publicação de Pat US No. 20090311181.
[0416] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra VEGFR2 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Chinnasamy etal., J Clin Investi20(11):3953-3968 (2010).
[0417] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra LewisY é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008) (hu3S193 Ab (scFvs)); Dolezal etal., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003) (NC10 scFv).
[0418] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD24 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012).
[0419] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra PDGFR-beta é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo Abeam ab32570.
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[0420] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra SSEA-4 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo MC813 (Cell Signaling) ou outros anticorpos comercialmente disponíveis.
[0421 ] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD20 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo Rituximab, Ofatumumab, Ocrelizumab, Veltuzumab ou GA101.
[0422] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra o Receptor de folato alfa é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo IMGN853 ou um anticorpo descrito em US20120009181; US4851332, LK26: US5952484.
[0423] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra ERBB2 (Her2/neu) é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo trastuzumab ou pertuzumab.
[0424] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra MUC1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo SAR566658.
[0425] Em uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos contra EGFR é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab ou matuzumab. Em uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos contra EGFRvIII é ou pode ser derivado de um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, scFv ou VH e VL, de um anticorpo, fragmento de ligação a antigenos ou CAR descrito, por exemplo, na publicação PCT WO2014/130657 (em uma modalidade, o CAR é um CAR descrito em WO2014/130657, cujo conteúdo é incorporado aqui na sua totalidade).
[0426] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra NCAM é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo clone 2-2B: MAB5324 (EMD Millipore).
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[0427] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra Efrina B2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Abengozar et al., B/ooc/119(19):4565-4576 (2012).
[0428] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra o receptor de IGF-I é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US8344112 B2; EP2322550 A1; WO 2006/138315, ou PCT/US2006/022995.
[0429] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CAIX é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo clone 303123 (R&D Systems).
[0430] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra LMP2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US 7.410.640 ou US20050129701.
[0431] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra gp 100 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo HMB45, NKIbetaB, ou um anticorpo descrito em WO2013165940 ou US20130295007.
[0432] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra tirosinase é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US5843674; ou US19950504048.
[0433] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra EphA2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Yu etaL, Mol Ther22(1 ):102111 (2014).
[0434] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra GD3 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US7253263; US 8,207,308; US 20120276046; EP1013761 A3; 20120276046; WC2005035577; ou US6437098.
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264/606
[0435] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra fucosil GM1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US20100297138; ou W02007/067992.
[0436] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra sLe é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo G193 (para Lewis Y), ver Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000), também como descrito em Neeson et al, J Immunol maio de 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177.10.
[0437] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra GM3 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo CA 2523449 (mAb 14F7).
[0438] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra HMWMAA é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Kmiecik et a!., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014) (PMID: 24575382) (mAb9.2.27); US6528481; WO2010033866; ou US 20140004124.
[0439] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra o-acetil-GD2 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo 8B6.
[0440] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra TEM1/CD248 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Marty et al., Cancer Lett235(2):298-308 (2006); Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221232 (2011).
[0441] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CLDN6 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo IMAB027 (Ganymed Pharmaceuticals), ver, por exemplo, clinicaltrial.gov/show/NCT02054351.
[0442] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos
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265/606 contra TSHR é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US 8.603.466; US 8.501.415; ou US 8.309.693.
[0443] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra GPRC5D é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo FAB6300A (R&D Systems); ou LS-A4180 (Lifespan Biosciences).
[0444] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD97 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em US 6.846.911; de Groot etal., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009); ou um anticorpo de R&D:MAB3734. [0445] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra ALK é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010).
[0446] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra ácido polissiálico é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Nagae et al.,JBiol Chem 288(47):33784-33796 (2013).
[0447] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra PLAC1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi: 10.1002/bab.1177.
[0448] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra GloboH é uma porção de ligação a antigenos do anticorpo VK9; ou um anticorpo descrito, por exemplo, em Kudryashov V etal, Glycoconj J. 15(3):243-9 (1998), Lou etal., Proc Natl Acad Sei USA 111(7):2482-2487 (2014); MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984). [0449] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra NY-BR-1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo,
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266/606
CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Jager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1 ):77-83 (2007).
[0450] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra WT-1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Dao et al., Sei Transi Med 5(176):176ra33 (2013); ou WO2012/135854.
[0451] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra MAGE-A1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Willemsen et al., J /mmt/no/174(12):7853-7858 (2005) (scFv do tipo TCR).
[0452] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra a proteína do esperma 17 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Song et al., Target Oncol 14 de agosto de 2013 (PMID: 23943313); Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012).
[0453] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra Tie 2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo AB33 (Cell Signaling Technology).
[0454] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra MAD-CT-2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em PMID: 2450952; US7635753.
[0455] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra o antígeno relacionado com Fos 1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo 12F9 (Novus Biologicals). [0456] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra MelanA/MART1 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito em EP2514766 A2; ou US 7,749,719.
[0457] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos
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267/606 contra pontos de quebra de translocação de sarcoma é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012).
[0458] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra TRP-2 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996).
[0459] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CYP1B1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, de um anticorpo descrito, por exemplo, em Maecker etal, Blood 102 (9):3287-3294 (2003).
[0460] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra RAGE-1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo MAB5328 (EMD Millipore).
[0461] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra transcriptase reversa de telomerase humana é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo cat no: LS-B95100 (Lifespan Biosciences).
[0462] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra carboxil-esterase intestinal é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo 4F12: cat no: LS-B6190-50 (Lifespan Biosciences).
[0463] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra mut hsp70-2 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo Lifespan Biosciences: monoclonal: cat no: LSC133261-100 (Lifespan Biosciences).
[0464] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD79a é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo Anti-CD79a [HM47/A9] (ab3121), disponibilizado pela Abeam; Anticorpo CD79A #3351 disponibilizado pela Cell
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Signalling Technology; ou anticorpo HPA017748 - anticorpo Anti-CD79A produzido em coelhos, disponibilizado pela Sigma Aldrich.
[0465] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD79b é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo polatuzumab vedotin, anti-CD79b descrito em Dornan et al., Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma Blood. 24 de setembro de 2009;114(13):2721-9. doi: 10.1182/blood-2009-02-205500. Epub 2009 24 de julho, ou o anticorpo biespecífico Anti-CD79b/CD3 descrito em 4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody AntiCD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Malignancies Resumos do 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, CA 6-9 de dezembro de 2014.
[0466] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra CD72 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo J3-109 descrito em Myers, e Uckun, An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma. 1995 junho;18(1-2):119-22, ou anti-CD72 (10D6.8.1, mlgG1) descrito em Polson etal., Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection Cancer Hes 15 de março, 2009 69; 2358.
[0467] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra LAIR1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo ANT-301 LAIR1, disponibilizado pela ProSpec; ou Anticorpo anti-CD305 humano (LAIR1), disponibilizado pela BioLegend. [0468] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra FCAR é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do Anticorpo CD89/FCAR (Catálogo#10414-H08H), disponibilizado pela Sino Biological Inc.
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[0469] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra LILRA2 é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo monoclonal para LILRA2 (M17), clone 3C7, disponibilizado pela Abnova, ou anticorpo Anti-LILRA2 de Camundongo, Monoclonal (2D7), disponibilizado pela Lifespan Biosciences.
[0470] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CD300LF é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo molécula do tipo Anti-CMRF35 de Camundongo 1, Monoclonal [UP-D2], disponibilizado pela BioLegend, ou anticorpo molécula do tipo Anti-CMRF35 de Rato 1, Monoclonal [234903], disponibilizado pela R&D Systems.
[0471] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra CLEC12A é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo scFv Engajador Biespecífico de células T (BiTE) e ADC descrito em Noordhuis et al., Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL1 xCD3 BiTE Antibody 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, 10-13 de dezembro, 2011, e MCLA-117 (Merus).
[0472] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra BST2 (também denominado CD317) é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo Anti-CD317 de Camundongo, Monoclonal [3H4], disponibilizado pela Antibodies-Online ou anticorpo Anti-CD317 de Camundongo, Monoclonal [696739], disponibilizado pela R&D Systems.
[0473] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígenos contra EMR2 (também denominado CD312) é uma porção de ligação a antígenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo Anti-CD312 de Camundongo, Monoclonal [LS-B8033] disponibilizado pela Lifespan Biosciences, ou anticorpo Anti-CD312 de Camundongo, Monoclonal [494025] disponibilizado pela R&D Systems.
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[0474] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra LY75 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo Anti-Antígeno linfocitário 75 de Camundongo, Monoclonal [HD30] disponibilizado pela EMD Millipore ou anticorpo Anti-Antígeno linfocitário 75 de Camundongo, Monoclonal [A15797] disponibilizado pela Life Technologies.
[0475] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra GPC3 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo hGC33 descrito em Nakano K, Ishiguro T, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 novembro; 21(10):907-916, ou MDX-1414, HN3 ou YP7, em que os três são descritos em Feng et al., Glypican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer. FEBS Lett. 2014 21 de janeiro; 588(2):377-82.
[0476] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra FCRL5 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo anti-FcRL5 descrito em Elkins et al., FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma Mol Cancer Ther. 2012 outubro;11 (10):2222-32.
[0477] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antigenos contra IGLL1 é uma porção de ligação a antigenos, por exemplo, CDRs, do anticorpo polipeptideo do tipo Anti-lmunoglobulina lambda 1 de Camundongo, Monoclonal [AT1G4] disponibilizado pela Lifespan Biosciences, anticorpo polipeptideo do tipo Anti-lmunoglobulina lambda 1 de Camundongo, Monoclonal [HSL11] disponibilizado pela BioLegend. [0478] Em uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos compreende uma, duas, três (por exemplo, as três) CDRs de cadeia pesada, HC CDR1, HC CDR2 e HC CDR3, de um anticorpo listado acima, e/ou uma, duas, três (por exemplo, as três) CDRs de cadeia leve, LC CDR1, LC CDR2 e LC CDR3, de um anticorpo listado acima. Em
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271/606 uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos compreende uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo listado acima.
[0479] Em outro aspecto, o domínio de ligação a antigenos compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo humanizado. Em alguns aspectos, um anticorpo não humano é humanizado, em que sequências ou regiões específicas do anticorpo são modificadas para aumentar a similaridade com um anticorpo naturalmente produzido em um humano ou seu fragmento. Em um aspecto, o domínio de ligação a antigenos é humanizado.
[0480] Um anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, enxertia de CDR (ver, por exemplo, Patente Européia NQ. EP 239,400; Publicação Internacional NQ. WO 91/09967; e Pat. U.S. NQS. 5.225.539, 5.530.101, e 5.585.089, cada um dos quais é incorporado aqui na sua totalidade por referência), mascaramento ou mutação de resíduos superficiais (ver, por exemplo, Patentes Européias NQS. EP 592,106 e EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805814; e Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, cada um dos quais é incorporado aqui na sua totalidade por referência), embaralhamento de cadeias (ver, por exemplo, Pat. U.S. NQ. 5,565,332, que é incorporado aqui na sua totalidade a título de referência), e técnicas reveladas, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. NQ. US2005/0042664, Publicação do Pedido de Patente U.S. NQ. US2005/0048617, Pat. U.S. NQ 6.407.213, Pat. U.S. NQ. 5,766,886, Publicação Internacional NQ. WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904
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272/606 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Sup):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), cada um dos quais é incorporado aqui na sua totalidade por referência. Frequentemente, resíduos de arcabouço nas regiões de arcabouço serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, por exemplo, melhorar, a ligação a antígenos. Estas substituições de arcabouço são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações dos resíduos de CDR e arcabouço, para identificar resíduos de arcabouço importantes para a ligação a antígenos, e comparação de sequências, para identificar resíduos de arcabouço invulgares em posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen et al., Pat. U.S. NQ. 5.585.089; e Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade).
[0481 ] Um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos que aí permanecem de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos importados, que são tipicamente recolhidos de um domínio variável importado. Como proporcionado aqui, anticorpos ou fragmentos de anticorpos humanizados compreendem uma ou mais CDRs de moléculas de imunoglobulinas e regiões arcabouço não humanas em que os resíduos de aminoácidos compreendendo o arcabouço são derivados completa ou majoritariamente da linha germinativa humana. Múltiplas técnicas para a humanização de anticorpos ou fragmentos de anticorpos são bem conhecidas na técnica e podem ser essencialmente realizadas seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones etal., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann etal., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen etal., Science, 239:1534-1536 (1988)), por substituição de CDRs ou
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273/606 sequências de CDR de roedor pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano, isto é, enxertia de CDR (EP 239,400; Publicação PCT NQ. WO 91/09967; e Pat. U.S. NQS. 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência aqui na sua totalidade). Em tais anticorpos e fragmentos de anticorpos humanizados, substancialmente menos do que um domínio variável humano intato foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Anticorpos humanizados são muitas vezes anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de arcabouço (FR) estão substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor. A humanização de anticorpos e fragmentos de anticorpos também pode ser alcançada por mascaramento ou mutação de resíduos superficiais (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); e Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) ou embaralhamento de cadeias (Pat. U.S. NQ. 5,565,332), cujo conteúdo é incorporado aqui por referência aqui na sua totalidade.
[0482] A escolha de domínios variáveis humanos, leves e pesados, a serem usados na preparação dos anticorpos humanizados se destina a reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método do melhor ajustamento, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que é mais próxima da do roedor é então aceite como arcabouço (FR) humano para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia etal., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), cujo conteúdo é incorporado aqui por referência na sua totalidade). Outro método usa um arcabouço particular derivado da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O
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274/606 mesmo arcabouço pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (ver, por exemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade). Em algumas modalidades, a região de arcabouço, por exemplo, as quatro regiões de arcabouço, da região variável de cadeia pesada são derivadas de uma sequência VH4_4-59 da linha germinativa. Em uma modalidade, a região de arcabouço pode compreender uma, duas, três, quatro ou cinco modificações, por exemplo, substituições, por exemplo, do aminoácido na sequência murina correspondente. Em uma modalidade, a região de arcabouço, por exemplo, as quatro regiões de arcabouço da região variável de cadeia leve são derivadas de uma sequência VK3_1.25 da linha germinativa. Em uma modalidade, a região de arcabouço pode compreender uma, duas, três, quatro ou cinco modificações, por exemplo, substituições, por exemplo, do aminoácido na sequência murina correspondente.
[0483] Em alguns aspectos, a porção de uma composição de CAR da invenção que compreende um fragmento de anticorpo é humanizada com retenção de elevada afinidade para o antígeno-alvo e outras propriedades biológicas favoráveis. De acordo com um aspecto da invenção, anticorpos e fragmentos de anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências paternas e vários produtos humanizados conceptuais usando modelos tridimensionais das sequências paternas e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão correntemente disponíveis e são familiares aos peritos na técnica. Estão disponíveis programas computacionais que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas
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275/606 exibições permite análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, por exemplo, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao antígeno-alvo. Deste modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências recebedoras e importadas de modo que a característica desejada do anticorpo ou fragmento de anticorpo, tal como afinidade aumentada para o antígeno-alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e muito substancialmente envolvidos em influenciar a ligação a antigenos.
[0484] Um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado pode reter uma especificidade antigênica similar à do anticorpo original, por exemplo, na presente invenção, a capacidade para se ligar a um antígeno associado a câncer humano como descrito aqui. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado pode ter afinidade e/ou especificidade melhorada de ligação a um antígeno associado a câncer humano como descrito aqui.
[0485] Em um aspecto, o domínio de ligação a antigenos da invenção é caracterizado por aspectos ou propriedades funcionais particulares de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Por exemplo, em um aspecto, a porção de uma composição de CAR da invenção que compreende um domínio de ligação a antigenos se liga especificamente a um antígeno tumoral como descrito aqui.
[0486] Em um aspecto, o domínio de ligação de anti-antígeno associado a câncer como descrito aqui é um fragmento, por exemplo, um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Em um aspecto, o domínio de ligação de anti-antígeno associado a câncer como descrito aqui é um Fv, um Fab, um (Fab')2 ou um anticorpo híbrido bifuncional (por exemplo, biespecífico) (por exemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). Em um aspecto, os anticorpos e seus
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276/606 fragmentos da invenção se ligam a uma proteína de antígeno associado a câncer como descrito aqui com afinidade de tipo selvagem ou intensificada.
[0487] Em alguns casos, scFvs podem ser preparados de acordo com um método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Moléculas scFv podem ser produzidas por ligação em conjunto de regiões VH e VL usando ligantes polipeptídicos flexíveis. As moléculas scFv compreendem um ligante (por exemplo, um ligante Ser-Gly) com um comprimento e/ou composição de aminoácidos otimizados. O comprimento do ligante pode afetar muito o modo como as regiões variáveis de um scFv se dobram e interagem. De fato, se for empregue um ligante polipeptídico curto (por exemplo, entre 5-10 aminoácidos), o dobramento intracadeias é prevenido. O dobramento intracadeias também é requerido para unir as duas regiões variáveis de modo a formarem um sítio de ligação de epitopos funcional. Quanto a exemplos da orientação e tamanho de ligantes ver, por exemplo, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicações de Pedidos de Patentes U.S. NQS. 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, e publicações PCT Nos.
W02006/020258 e W02007/024715, são incorporados aqui por referência.
[0488] Um scFv pode compreender um ligante de pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais resíduos de aminoácidos entre as suas regiões VL e VH. A sequência do ligante pode compreender qualquer aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência do ligante compreende os aminoácidos glicina e serina. Em outra modalidade, a sequência do ligante compreende conjuntos de repetições de glicina e serina tais como (Gly4Ser)n, onde n é um número inteiro positivo igual
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277/606 ou maior do que 1 (SEQ ID NQ:22). Em uma modalidade, o ligante pode ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NQ:29) ou (Gly4Ser)3 (SEQ ID NQ:30). Uma variação do comprimento do ligante pode reter ou intensificar a atividade, dando origem a eficácia superior em estudos de atividade. [0489] Em outro aspecto, o domínio de ligação a antígenos é um receptor de células T (TOR) ou um seu fragmento, por exemplo, um TCR de cadeia simples (scTCR). Métodos para preparar tais TCRs são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Willemsen RA et al, Gene Therapy 7·. 1369-1377 (2000); Zhang T et al., Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al., Gene Ther. 19(4):365-74 (2012) (as referências são incorporadas aqui na sua totalidade). Por exemplo, scTCR pode ser manipulado de modo a conter os genes Va e Vp de um clone de célula T ligados por um ligante (por exemplo, um peptideo flexível). Esta abordagem é muito útil para um alvo associado a câncer em que o próprio é intracelular, no entanto, um fragmento de tal antígeno (peptideo) é apresentado na superfície das células cancerígenas por MHC.
CA Rs biespecíficos
[0490] Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífica é uma molécula de anticorpo biespecífica. Um anticorpo biespecífico tem especificidade para não mais do que dois antígenos. Uma molécula de anticorpo biespecífica é caracterizada por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, os primeiro e segundo epitopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, a mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, os primeiro e segundo epitopos se sobrepõem. Em uma modalidade, os primeiro e segundo epitopos não
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278/606 se sobrepõem. Em uma modalidade, os primeiro e segundo epítopos estão em diferentes antígenos, por exemplo, proteínas diferentes (ou subunidades diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia leve que têm especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia leve que têm especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende metade de um anticorpo tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo e metade de um anticorpo tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende metade de um anticorpo ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo e metade de um anticorpo ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende um scFv ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo e um scFV ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo. [0491] Em certas modalidades, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo multiespecífica (por exemplo, biespecífica ou triespecífica). Protocolos para gerar moléculas de anticorpo biespecíficas ou heterodiméricas são conhecidos na técnica; incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, a abordagem manipulo em orifícios” descrita em, por exemplo, US 5731168; o emparelhamento Fc de direção eletrostática conforme descrito em, por exemplo, WO 09/089004, WO 06/106905 e WO 2010/129304; formação de heterodímeros por Domínios Manipulados de Troca de Cadeia (Strand Exchange Engineered Domains - SEED) conforme descrito em, por
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279/606 exemplo, WO 07/110205; troca de braços de Fab conforme descrito em, por exemplo, WO 08/119353, WO 2011/131746 e WO 2013/060867; conjugado de anticorpo duplo, por exemplo, por reticulação de anticorpo para gerar uma estrutura biespecífica usando um reagente heterobifuncional tendo um grupo aminorreativo e um grupo sulfidrilreativo conforme descrito em, por exemplo, US 4433059; determinantes de anticorpo biespecíficos gerados recombinando metades de anticorpos (pares de cadeia pesada-leve ou Fabs) de diferentes anticorpos através do ciclo de redução e oxidação de ligações dissulfeto entre as duas cadeias pesadas, conforme descrito em, por exemplo, US 4444878; anticorpos trifuncionais, por exemplo, três fragmentos Fab' reticulados através de grupos sulfidril-reativos, conforme descrito em, por exemplo, US5273743; proteínas de ligação biossintéticas, por exemplo, um par de scFvs reticulados através de caudas C-terminais de preferência através de reticulação química com dissulfeto ou aminorreativa, conforme descrito em, por exemplo, US5534254; anticorpos bifuncionais, por exemplo, fragmentos Fab com diferentes especificidades de ligação dimerizados através de zíperes de leucina (por exemplo, c-fos e c-jun) que substituíram o domínio constante, conforme descrito em, por exemplo, US5582996; receptores mono- e oligovalentes biespecíficos e oligoespecíficos, por exemplo, regiões VHCH1 de dois anticorpos (dois fragmentos Fab) ligadas através de um espaçador polipeptídico entre a região de CH1 de um anticorpo e a região de VH do outro anticorpo, tipicamente com cadeias leves associadas, conforme descrito em, por exemplo, US5591828; conjugados DNA-anticorpo biespecíficos, por exemplo, reticulação de anticorpos ou fragmentos Fab através de uma porção de DNA de fita dupla, conforme descrito em, por exemplo, US5635602; proteínas de fusão biespecíficas, por exemplo, um construto de expressão contendo dois scFvs com um ligante peptídico helicoidal hidrofílico entre aqueles
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280/606 e uma região constante completa, conforme descrito em, por exemplo, US5637481; proteínas de ligação multivalentes e multiespecíficas, por exemplo, dimero de polipeptideos tendo o primeiro domínio com região de ligação de região variável de cadeia pesada de Ig, e o segundo domínio com região de ligação de região variável de cadeia leve de Ig, geralmente designados diacorpos (são também abrangidas estruturas de ordem superior criando moléculas biespecíficas, triespecíficas ou tetraespecíficas, conforme descrito em, por exemplo, US5837242; construtos de minicorpo com cadeias VL e VH ligadas adicionalmente conetadas com espaçadores peptídicos a uma região de dobradiça de anticorpo e região CH3, que podem ser dimerizados para formarem moléculas biespecíficas/multivalentes, conforme descrito em, por exemplo, US5837821; domínios VH e VL ligados com um ligante peptídico curto (por exemplo, 5 ou 10 aminoácidos) ou sem qualquer ligante em qualquer uma das orientações, que podem formar dimeros para formar diacorpos biespecíficos; trímeros e tetrâmeros, conforme descrito em, por exemplo, US5844094; Cadeia de domínios VH (ou domínios VL em membros da família) ligados por ligações peptídicas a grupos reticuláveis no C terminal adicionalmente associados a domínios VL para formar uma série de FVs (ou scFvs), conforme descrito em, por exemplo, US5864019; e polipeptideos de ligação de cadeia única com um domínio VH e um VL ligados através de um ligante peptídico são combinados em estruturas multivalentes através de reticulação não covalente ou química para formar, por exemplo, estruturas homobivalentes, heterobivalentes, trivalentes e tetravalentes, usando tanto scFV como formato tipo diacorpo, conforme descrito em, por exemplo, US5869620. Moléculas multiespecíficas e biespecíficas exemplificativas adicionais e métodos de preparação das mesmas são encontrados, por exemplo, em US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396,
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US6476198,
US6833441,
US7534866,
US6511663, US7129330, US7612181,
US2002103345A1, US2004219643A1, US2005003403A1, US2005079170A1, US2005136051A1, US2006083747A1, US2006263367A1, US2007128150A1, US2007274985A1, US2008152645A1, US2008254512A1, US2009148905A1, US2009162360A1, US2009232811A1, US2009274649A1, W004081051A1, W02007095338A2, W02009021754A2,
US6670453, US6743896,
US7183076, US7521056,
US2002004587A1,
US2003207346A1,
US2004220388A1,
US2005004352A1,
US2005100543A1,
US2005163782A1,
US2006120960A1,
US2007004909A1,
US2007141049A1,
US2008050370A1,
US2008171855A1,
US2008260738A1,
US2009155275A1,
US2009175851A1,
US2009234105A1,
US6809185,
US7527787, US2002076406A1, US2003211078A1, US2004242847A1, US2005069552A1, LJS2005136049A1, US2005266425A1, US2006204493A1, US2007087381A1, US2007154901A1, US2008069820A1, US2008241884A1, US2009130106A1, LJS2009162359A1, US2009175867A1, US2009263392A1,
EP346087A2, W00006605A2, WO02072635A2, W02007044887A2, W02008119353A1, WO9103493A1,
W006020258A2,
W02007137760A2,
W02009068630A1,
WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1. Os conteúdos dos pedidos acima referenciados são incorporados aqui por referência na sua totalidade. [0492] Dentro de cada anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, scFv) de uma molécula de anticorpo biespecífica, o VH pode estar a montante ou a jusante do VL. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, scFv) a montante é disposto com o seu VH (VHi) a montante do seu VL (VLi) e o anticorpo ou fragmento de anticorpo(por exemplo, scFv) a jusante é disposto com
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282/606 o seu VL (VL2) a montante do seu VH (VH2), de modo que a molécula de anticorpo biespecífica global tenha a disposição VH1-VL1-VL2-VH2. Em outras modalidades, 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, scFv) a montante é disposto com 0 seu VL (VL1) a montante do seu VH (VH1) e 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, scFv) a jusante é disposto com 0 seu VH (VH2) a montante do seu VL (VL2), de modo que a molécula de anticorpo biespecífica global tenha a disposição VL1-VH1-VH2-VL2. Opcionalmente, um ligante está disposto entre os dois anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFvs), por exemplo, entre VL1 e VL2 se 0 construto estiver disposto como VH1-VL1-VL2-VH2, ou entre VH1 e VH2 se 0 construto estiver disposto como VL1-VH1-VH2-VL2. O ligante pode ser um ligante como descrito aqui, por exemplo, um ligante (Gly4-Ser)n, em que n é 1,2, 3, 4, 5 ou 6, preferencialmente 4 (SEQ ID NQ: 72). Em geral, 0 ligante entre os dois scFvs será suficientemente longo para evitar emparelhamento defeituoso entre os domínios dos dois scFvs. Opcionalmente, um ligante está disposto entre 0 VL e 0 VH do primeiro scFv. Opcionalmente, um ligante está disposto entre 0 VL e 0 VH do segundo scFv. Em construtos que têm vários ligantes, quaisquer dois ou mais dos ligantes podem ser os mesmos ou diferentes. Em conformidade, em algumas modalidades, um CAR biespecífico compreende VLs, VHs e opcionalmente um ou mais ligantes em uma disposição como descrita aqui.
Estabilidade e Mutações
[0493] A estabilidade de um domínio de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer como descrito aqui, por exemplo, moléculas de scFv (por exemplo, scFv solúvel) pode ser avaliada em referência às propriedades biofísicas (por exemplo, estabilidade térmica) de uma molécula de scFv de controle convencional ou um anticorpo completo. Em uma modalidade, 0 scFv humanizado tem uma estabilidade térmica que é maior do que cerca de 0,1, cerca de 0,25,
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283/606 cerca de 0,5, cerca de 0,75, cerca de 1, cerca de 1,25, cerca de 1,5, cerca de 1,75, cerca de 2, cerca de 2,5, cerca de 3, cerca de 3,5, cerca de 4, cerca de 4,5, cerca de 5, cerca de 5,5, cerca de 6, cerca de 6,5, cerca de 7, cerca de 7,5, cerca de 8, cerca de 8,5, cerca de 9, cerca de 9,5, cerca de 10 graus, cerca de 11 graus, cerca de 12 graus, cerca de 13 graus, cerca de 14 graus ou cerca de 15 graus Celsius em relação a uma molécula de ligação de controle (por exemplo, uma molécula de scFv convencional) nos ensaios descritos.
[0494] A estabilidade térmica melhorada do domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer como descrito aqui, por exemplo, scFv, é subsequentemente conferida ao construto de CAR completo, conduzindo a propriedades terapêuticas melhoradas do construto de CAR. A estabilidade térmica do domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer como descrito aqui, por exemplo, scFv, pode ser melhorada em pelo menos cerca de 2°C ou 3°C em comparação com um anticorpo convencional. Em uma modalidade, o domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, tem uma estabilidade térmica melhorada em 1°C em comparação com um anticorpo convencional. Em outra modalidade, o domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, tem uma estabilidade térmica melhorada em 2°C em comparação com um anticorpo convencional. Em outra modalidade, o scFv tem uma estabilidade térmica melhorada em 4, 5, 6, 7,8,9,10,11, 12, 13, 14, 15°C em comparação com um anticorpo convencional. Podem ser feitas comparações, por exemplo, entre as moléculas scFv reveladas aqui e moléculas scFv ou fragmentos Fab de um anticorpo de onde foram derivadas as VH e VL do scFv. A estabilidade térmica pode ser medida com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, a Tf pode ser medida. Os métodos para medir a
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Tf e outros métodos para determinar a estabilidade de proteínas são descritos em mais detalhe abaixo.
[0495] Mutações em scFv (que surgem através de humanização ou mutagênese direta do scFv solúvel) podem alterar a estabilidade do scFv e melhorar a estabilidade global do scFv e do construto de CAR. A estabilidade do scFv humanizado é comparada contra o scFv murino usando medições tais como Tf, temperatura de desnaturação e temperatura de agregação.
[0496] A capacidade de ligação dos scFvs mutantes pode ser determinada usando ensaios conhecidos na técnica e descritos aqui.
[0497] Em uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, compreende pelo menos uma mutação que surge do processo de humanização de modo que o scFv mutado confere estabilidade melhorada ao construto de CAR. Em outra modalidade, o domínio de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, compreende pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mutações que surgem do processo de humanização de modo que o scFv mutado confere estabilidade melhorada ao construto de CAR. Métodos para Avaliar a Estabilidade de Proteínas
[0498] A estabilidade de um domínio de ligação a antigenos pode ser avaliada com o uso, por exemplo, dos métodos descritos abaixo. Tais métodos permitem a determinação de múltiplas transições de desdobramento térmico em que o domínio menos estável desdobra primeiro ou limita o limiar de estabilidade geral de uma unidade de múltiplos domínios que desdobra cooperativamente (por exemplo, uma proteína de múltiplos domínios que exibe uma única transição de desdobramento). O domínio menos estável pode ser identificado de vários modos adicionais. A mutagênese pode ser realizada para sondar qual domínio limita a estabilidade geral. Adicionalmente, a resistência a
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285/606 proteases de uma proteina com múltiplos domínios pode ser avaliada sob condições nas quais se sabe que o domínio menos estável é intrinsecamente desdobrado via DSC ou outros métodos espectroscópicos (Fontana, etaL, (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et aí. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692). Uma vez que o domínio menos estável é identificado, a sequência que codifica esse domínio (ou uma porção do mesmo) pode ser empregue como uma sequência de teste nos métodos.
a) Estabilidade térmica
[0499] A estabilidade térmica das composições pode ser analisada com o uso de várias técnicas biofísicas ou bioquímicas não limitantes conhecidas na técnica. Em certas modalidades, a estabilidade térmica é avaliada por espectroscopia analítica.
[0500] Um método de espectroscopia analítica exemplificativo é Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). DSC emprega um calorímetro que é sensível às absorbâncias de calor que acompanham o desdobramento da maioria das proteínas ou domínios de proteínas (consultar, por exemplo, Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 164852, 1988). Para determinar a estabilidade térmica de uma proteína, uma amostra da proteína é inserida no calorímetro e a temperatura é elevada até o Fab ou scFv desdobrar. A temperatura à qual a proteína desdobra é indicativa da estabilidade da proteína geral.
[0501] Outro método de espectroscopia analítica exemplificativo é espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD). A espectrometria CD mede a atividade óptica de uma composição como uma função de temperatura crescente. A espectroscopia de dicroísmo circular (CD) mede as diferenças na absorção de luz polarizada esquerda versus luz polarizada direita que surgem devido à assimetria estrutural. Uma estrutura desordenada ou desdobrada resulta em um espectro CD muito diferente do de uma estrutura ordenada ou dobrada. O espectro CD
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286/606 reflete a sensibilidade das proteínas aos efeitos desnaturantes da temperatura crescente e é, portanto, indicativo da estabilidade térmica de uma proteína (consultar van Mierlo e Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000).
[0502] Outro método de espectroscopia analítica exemplificativo para medir a estabilidade térmica é Espectroscopia de Emissão de Fluorescência (consultar van Mierlo e Steemsma, supra). Ainda outro método de espectroscopia analítica exemplificativo para medir a estabilidade térmica é espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) (consultar, por exemplo, van Mierlo e Steemsma, supra). [0503] A estabilidade térmica de uma composição pode ser medida bioquimicamente. Um método bioquímico exemplificativo para avaliar a estabilidade térmica é um ensaio de desafio térmico. Em um ensaio de desafio térmico, uma composição é submetida a uma faixa de temperaturas elevadas por um período de tempo definido. Por exemplo, em uma modalidade, as moléculas de scFv de teste ou moléculas que compreendem moléculas de scFv são submetidas a uma faixa de temperaturas crescentes, por exemplo, durante 1-1,5 horas. A atividade da proteína é, então, avaliada por um ensaio bioquímico relevante. Por exemplo, se a proteína for uma proteína de ligação (por exemplo, um scFv ou polipeptídeo contendo scFv), a atividade de ligação da proteína de ligação pode ser determinada por um ELISA funcional ou quantitativo.
[0504] Tal ensaio pode ser feito em um formato de alto rendimento e aqueles revelados nos Exemplos com o uso de E. coli e triagem de alto rendimento. Uma biblioteca de domínios de ligação a antigenos, por exemplo, que inclui um domínio de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, variantes de scFv, pode ser criada usando métodos conhecidos na técnica. A expressão de um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, para um
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287/606 antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, pode ser induzida e o domínio de ligação a antigenos, por exemplo, para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, pode ser sujeito a provocação térmica. As amostras de teste provocadas podem ser avaliadas quanto à ligação e aqueles domínios de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFvs, que são estáveis podem ser escalados positivamente e adicionalmente caracterizados.
[0505] A estabilidade térmica é avaliada medindo a temperatura de fusão (Tf) de uma composição com o uso de qualquer uma das técnicas acima (por exemplo, técnicas de espectroscopia analítica). A temperatura de fusão é a temperatura do ponto médio de uma curva de transição térmica em que 50% das moléculas de uma composição estão em um estado dobrado (consultar, por exemplo, Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692). Em uma modalidade, os valores de Tf para um domínio de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, são cerca de 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C,
66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71 °C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C,76°C,
77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81 °C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C,87°C,
88°C, 89°C, 90°C, 91 °C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C,98°C,
99°C, 100°C. Em uma modalidade, os valores de Tf para uma IgG são cerca de 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C,60°C, °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71 °C,
72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81 °C,82°C,
83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91 °C, 92°C,93°C,
94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C. Em uma modalidade, os valores de Tf para um anticorpo multivalente são cerca de 40°C, 41°C,
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42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C,63°C,
64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71 °C, 72°C, 73°C,74°C,
75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81 °C, 82°C, 83°C, 84°C,85°C,
86°C, 87°C, 88°C, 89°C, 90°C, 91 °C, 92°C, 93°C, 94°C, 95°C,96°C,
97°C, 98°C, 99°C, 100°C.
[0506] A estabilidade térmica é também avaliada medindo o calor específico ou a capacidade térmica (Cp) de uma composição com o uso de uma técnica calorimétrica analítica (por exemplo, DSC). O calor específico de uma composição é a energia (por exemplo, em kcal/mol) que é exigida para elevar por 1 °C a temperatura de 1 mol de água. Uma Cp grande é um marco de uma composição de proteína desnaturada ou inativa. A alteração da capacidade térmica (ACp) de uma composição é medida determinando o calor específico de uma composição antes e após a sua transição térmica. A estabilidade térmica pode também ser avaliada medindo ou determinando outros parâmetros da estabilidade termodinâmica, incluindo energia livre de Gibbs do desdobramento (AG), entalpia do desdobramento (ΔΗ) ou entropia do desdobramento (AS). Um ou mais dos ensaios bioquímicos acima (por exemplo, um ensaio de desafio térmico) são usados para determinar a temperatura (isto é, o valor de Tc) à qual 50% da composição retém sua atividade (por exemplo, atividade de ligação).
[0507] Adicionalmente, mutações no domínio de ligação a antígenos de um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, podem ser efetuadas para alterar a estabilidade térmica do domínio de ligação a antígenos de um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, em comparação com o domínio de ligação a antígenos não mutado de um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv. Quando o domínio de ligação a antígenos humanizado de um antígeno associado a câncer descrito
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289/606 aqui, por exemplo, scFv, é incorporado em um construto de CAR, o domínio de ligação a antígenos do antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv humanizado, confere estabilidade térmica aos CARs globais da presente invenção. Em uma modalidade, o domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, compreende uma única mutação que confere estabilidade térmica ao domínio de ligação a antígenos para o antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv. Em outra modalidade, o domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, compreende múltiplas mutações que conferem estabilidade térmica ao domínio de ligação a antígenos para o antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv. Em uma modalidade, as múltiplas mutações no domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, têm um efeito aditivo na estabilidade térmica do domínio de ligação a antígenos para o antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv.
b) % de Agregação
[0508] A estabilidade de uma composição pode ser determinada medindo sua propensão a agregar. A agregação pode ser medida por várias técnicas bioquímicas ou biofísicas não limitantes. Por exemplo, a agregação de uma composição pode ser avaliada com o uso de cromatografia, por exemplo, Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC). A SEC separa as moléculas com base no tamanho. Uma coluna é preenchida com microesferas semissólidas de um gel polimérico que admitirá íons e pequenas moléculas em seu interior, mas não as grandes. Quando uma composição de proteínas é aplicada no topo da coluna, as proteínas dobradas compactas (isto é, proteínas não agregadas) são distribuídas através de um volume maior de solvente do que está disponível aos agregados de proteínas grandes.
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Consequentemente, os agregados grandes se movem mais rapidamente através da coluna e, desse modo, a mistura pode ser separada ou fracionada em seus componentes. Cada fração pode ser separadamente quantificada (por exemplo, por dispersão de luz) à medida que elui do gel. Consequentemente, a % de agregação de uma composição pode ser determinada comparando a concentração de uma fração com a concentração total de proteína aplicada ao gel. As composições estáveis eluem da coluna essencialmente como uma única fração e aparecem essencialmente como um único pico no perfil de eluição ou cromatograma.
c) Afinidade de Ligação
[0509] A estabilidade de uma composição pode ser avaliada determinando sua afinidade de ligação para ao alvo. Uma ampla variedade de métodos para determinar a afinidade de ligação é conhecida na técnica. Um método exemplificativo para determinar a afinidade de ligação emprega a ressonância de plásmon de superfície. Ressonância de plásmon de superfície é um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações em concentrações de proteína dentro uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J). Quanto a descrições adicionais ver Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., etal. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., etal. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
[0510] Em um aspecto, o domínio de ligação a antigenos do CAR compreende uma sequência de aminoácidos que é homóloga a uma sequência de aminoácidos do domínio de ligação a antigenos descrita aqui, e o domínio de ligação a antigenos retém as propriedades funcionais desejadas do domínio de ligação a antigenos descrito aqui.
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[0511] Em um aspecto específico, a composição de CAR da invenção compreende um fragmento de anticorpo. Em um aspecto adicional, o fragmento de anticorpo compreende um scFv.
[0512] Em vários aspectos, o domínio de ligação a antigenos do CAR é manipulado por modificação de um ou mais aminoácidos em uma ou nas duas regiões variáveis (por exemplo, VH e/ou VL), por exemplo, em uma ou mais regiões CDR e/ou em uma ou mais regiões de arcabouço. Em um aspecto específico, a composição de CAR da invenção compreende um fragmento de anticorpo. Em um aspecto adicional, o fragmento de anticorpo compreende um scFv.
[0513] Será entendido pelo perito na técnica que o anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção pode ser adicionalmente modificado, de modo que varia no que se refere à sequência de aminoácidos (por exemplo, relativamente ao tipo selvagem), mas não no que se refere à atividade desejada. Por exemplo, substituições de nucleotídeos adicionais conducentes a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos não essenciais podem ser feitas na proteína. Por exemplo, um resíduo de aminoácido não essencial em uma molécula pode ser substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeias laterais. Em outra modalidade, uma fiada de aminoácidos pode ser substituída por uma fiada estruturalmente similar que difere quanto à ordem e/ou composição de membros da família de cadeias laterais, por exemplo, pode ser efetuada uma substituição conservativa, em que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.
[0514] Famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina,
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292/606 serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[0515] Percentagem de identidade, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, se relaciona com duas ou mais sequências que são iguais. Duas sequências são substancialmente idênticas se duas sequências tiverem uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotideos que são iguais (por exemplo, 60% de identidade, opcionalmente 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade ao longo de uma região especificada, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação, ou região designada, medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 nucleotideos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou mais preferencialmente ao longo de uma região que tem 100 até 500 ou 1000 ou mais nucleotideos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de comprimento.
[0516] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, são designadas coordenadas de subsequências, se necessário, e são designados parâmetros do
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293/606 programa de algoritmo de sequências. Parâmetros predefinidos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências então calcula a percentagem de identidades de sequências para as sequências de teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento para homologia de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).
[0517] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; e Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Software para realizar análises de BLAST é publicamente disponibilizado pelo National Center for Biotechnology Information.
[0518] A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de pesos PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalos de 12 e uma penalidade de intervalos de 4. Adicionalmente, a percentagem de
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294/606 identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), usando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5 ou 6.
[0519] Em um aspecto, a presente invenção contempla modificações da sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento (por exemplo, scFv) de partida que geram moléculas funcionalmente equivalentes. Por exemplo, a VH ou VL de um domínio de ligação a antigenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv, compreendido no CAR pode ser modificada de modo a reter pelo menos cerca de 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade da região de arcabouço de VH ou VL de partida do domínio de ligação a antigenos para o antígeno associado a câncer descrito aqui, por exemplo, scFv. A presente invenção contempla modificações de todo o construto CAR, por exemplo, modificações em uma ou mais sequências de aminoácidos dos vários domínios do construto CAR de forma a gerar moléculas funcionalmente equivalentes. O construto de CAR pode ser modificado de modo a reter pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade do construto de CAR de partida.
Domínio de Transmembrana
[0520] Em relação ao domínio de transmembrana, em várias modalidades, um CAR pode ser concebido para compreender um domínio de transmembrana que está ligado ao domínio extracelular do CAR. Um domínio de transmembrana pode incluir um ou mais
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295/606 aminoácidos adicionais adjacentes à região transmembrana, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados à região extracelular da proteína de onde a transmembrana foi derivada (por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região extracelular) e/ou um ou mais aminoácidos adicionais associados à região intracelular da proteína de onde a proteína transmembrana é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região intracelular). Em um aspecto, o domínio de transmembrana está associado a um dos outros domínios do CAR, por exemplo, em uma modalidade, o domínio de transmembrana pode ser da mesma proteína de onde o domínio de sinalização, domínio coestimulador ou o domínio dobradiça são derivados. Em outro aspecto, o domínio de transmembrana não é derivado da mesma proteína da qual qualquer outro domínio do CAR é derivado. Em alguns casos, o domínio de transmembrana pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrana das mesmas ou diferentes proteínas de membrana de superfície, por exemplo, para minimizar interações com outros membros do complexo receptor. Em um aspecto, o domínio de transmembrana é capaz de homodimerização com outro CAR na superfície celular de uma célula expressando CAR. Em um aspecto diferente, a sequência de aminoácidos do domínio de transmembrana pode ser modificada ou substituída de modo a minimizar interações com os domínios de ligação do parceiro de ligação nativo presente na mesma célula expressando o CAR.
[0521] O domínio de transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma recombinante. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada a membrana ou transmembrana. Em um aspecto, o domínio de transmembrana é capaz de sinalizar o(s) domínio(s) intracelular(es) sempre que o CAR se tenha
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296/606 ligado a um alvo. Um domínio de transmembrana de uso particular nesta invenção pode incluir pelo menos a(s) região(ões) transmembrana, por exemplo, da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD27, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Em algumas modalidades, um domínio de transmembrana pode incluir pelo menos a(s) região(ões) transmembrana, por exemplo, de KIRDS2, 0X40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1 BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C.
[0522] Em alguns casos, o domínio de transmembrana pode ser ligado à região extracelular do CAR, por exemplo, o domínio de ligação a antigenos do CAR, via uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça de uma proteína humana. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça pode ser uma dobradiça de lg (imunoglobulina) humana (por exemplo, uma dobradiça de lgG4, uma dobradiça de IgD), um ligante de GS (por exemplo, um ligante de GS aqui descrito), uma dobradiça de KIR2DS2 ou uma dobradiça de CD8a. Em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador compreende (por exemplo, consiste em) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ:4. Em um aspecto, o domínio de transmembrana compreende (por exemplo, consiste em) um domínio de transmembrana de SEQ ID NQ: 12.
[0523] Em um aspecto, a dobradiça ou espaçador compreende uma
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297/606 dobradiça de lgG4. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador compreende uma região de dobradiça da sequência de aminoácidos ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NQ:6). Em algumas modalidades, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça codificada por uma sequência de nucleotídeos de
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCG AGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCC AAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGT GGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGC CCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGT GCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACA AGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAA ACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGT ACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG ACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTA CAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAAC GTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTA CACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NQ:7).
[0524] Em um aspecto, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça de IgD. Por exemplo, em uma modalidade, a dobradiça ou espaçador compreende uma região de dobradiça da sequência de aminoácidos
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RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKK EKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCF VVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLP RSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSD PPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPG STTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYV TDH (SEQ ID NQ:8). Em algumas modalidades, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça codificada por uma sequência de nucleotídeos de
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACT GCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGC ACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGA AAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAG ACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTC TTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACC TTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTG ACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGA AGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACT CAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCT GTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTG ATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAG CCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCT GGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGC TCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTC GCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTG GGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGC CAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCC TGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACC ATT (SEQ ID NQ:9).
[0525] Em um aspecto, o domínio de transmembrana pode ser
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299/606 recombinante, em cujo caso compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, tais como leucina e valina. Em um aspecto, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina pode ser encontrado em cada extremidade de um domínio de transmembrana recombinante.
[0526] Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, com entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio de transmembrana e a região citoplasmática do CAR. Um dupleto glicina-serina proporciona um ligante particularmente adequado. Por exemplo, em um aspecto, o ligante compreende a sequência de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NQ: 10). Em algumas modalidades, o ligante é codificado por uma sequência de nucleotideos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NQ: 11).
[0527] Em um aspecto, a dobradiça ou espaçador compreende uma dobradiça de KIR2DS2.
Domínio Citoplasmático
[0528] O domínio ou região citoplasmática do CAR inclui um domínio de sinalização intracelular. Um domínio de sinalização intracelular é geralmente responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune onde o CAR foi introduzido. O termo função efetora se relaciona com uma função especializada de uma célula. A função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser atividade citolítica ou atividade auxiliadora incluindo a secreção de citocinas. Assim, o termo domínio de sinalização intracelular se relaciona com a porção de uma proteína que procede à transdução do sinal da função efetora e dirige a célula para desempenhar uma função especializada. Não obstante habitualmente poder ser empregue o domínio de sinalização intracelular completo, em muitos casos não é necessário usar toda a cadeia. Tanto quanto uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, tal porção truncada pode ser usada em vez da cadeia intata desde que
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300/606 proceda à transdução do sinal da função efetora. Assim, o termo domínio de sinalização intracelular inclui qualquer porção truncada do domínio de sinalização intracelular suficiente para proceder à transdução do sinal da função efetora.
[0529] Exemplos de domínios de sinalização intracelulares para uso no CAR da invenção incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e correceptores que atuam concertadamente para iniciar a transdução do sinal após engrenagem do receptor de antigenos, bem como qualquer derivado ou variante destas sequências e qualquer sequência recombinante que tenha a mesma capacidade funcional.
[0530] É conhecido que sinais gerados através do TCR isoladamente são insuficientes para ativação completa da célula T e que também é requerido um sinal secundário e/ou coestimulador. Assim, pode ser afirmado que a ativação de células T é mediada por duas classes distintas de sequências de sinalização citoplasmática: as que iniciam a ativação primária dependente de antigenos através do TCR (domínios de sinalização intracelular primários) e as que atuam de um modo independente de antigenos para proporcionar um sinal secundário ou coestimulador (domínio citoplasmático secundário, por exemplo, um domínio coestimulador).
[0531] Um domínio de sinalização primário regula a ativação primária do complexo de TCR de um modo estimulador ou de um modo inibidor. Domínios de sinalização intracelulares primários que atuam de um modo estimulador podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação baseados em tirosina do imunorreceptor ou ITAMs.
[0532] Exemplos de domínios de sinalização intracelular primários contendo ITAM que são de uso particular na invenção incluem os de CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama Rlla, FcR beta (Fc
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Épsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 e DAP12. Em uma modalidade, urn CAR da invenção compreende um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização primário de CD3 zeta.
[0533] Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio de ITAM modificado, por exemplo, um domínio de ITAM mutado que tem atividade alterada (por exemplo, aumentada ou decrescida) em comparação com o domínio de ITAM nativo. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM modificado, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM otimizado e/ou truncado. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primário compreende um, dois, três, quatro ou mais motivos ITAM.
[0534] O domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta por si só ou pode ser combinado com qualquer(quaisquer) outro(s) domínio(s) de sinalização intracelular(es) desejado(s) útil(úteis) no contexto de um CAR da invenção. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender uma porção de cadeia CD3 zeta e um domínio de sinalização coestimulador. O domínio de sinalização coestimulador se refere a uma porção do CAR compreendendo o domínio intracelular de uma molécula coestimuladora. Uma molécula coestimuladora é uma molécula da superfície celular que não um receptor de antigenos ou seus ligantes que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 41BB (CD137), 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à função de linfócitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, e um ligante que se liga especificamente a CD83 e similares. Por exemplo, foi demonstrado que coestimulação com CD27 intensifica a expansão,
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302/606 função efetora e sobrevivência de células CART humanas in vitro e aumenta a persistência e atividade antitumoral de células T humanas in vivo (Song etal. Blood. 2012; 119(3):696-706). Outros exemplos de tais moléculas coestimuladoras incluem CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, e CD19a.
[0535] As sequências de sinalização intracelular dentro da porção citoplasmática do CAR da invenção podem ser ligadas entre si de um modo aleatório ou em uma ordem especificada. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, com entre 2 e 10 aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) de comprimento, pode formar a ligação entre sequências de sinalização intracelular. Em uma modalidade, um dupleto glicina-serina pode ser usado como ligante adequado. Em uma modalidade, um único aminoácido, por exemplo, uma alanina, uma glicina, pode ser usado como ligante adequado.
[0536] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é planejado de modo a compreender dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, domínios de sinalização coestimuladores. Em uma modalidade, os dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, domínios de sinalização coestimuladores são separados por uma molécula ligadora, por exemplo, uma molécula ligadora descrita aqui. Em uma
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303/606 modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende dois domínios de sinalização coestimuladores. Em algumas modalidades, a molécula ligadora é um resíduo glicina. Em algumas modalidades, o ligante é um resíduo alanina.
[0537] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é planejado de modo a compreender o domínio de sinalização de CD3zeta e o domínio de sinalização de CD28. Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é planejado de modo a compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-1 BB. Em um aspecto, o domínio de sinalização de 4-1 BB é um domínio de sinalização de SEQ ID NQ: 14. Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD3-zeta é um domínio de sinalização de SEQ ID NQ: 18.
[0538] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é concebido para compreender o domínio de sinalização de CD3 zeta e o domínio de sinalização de CD27. Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD27 compreende uma sequência de aminoácidos de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACS P (SEQ ID NQ: 16). Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD27 é codificado por uma sequência de ácido nucleico de AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACAT GACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCT ATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NQ: 17).
[0539] Em um aspecto, a célula expressando CAR descrita aqui pode compreender adicionalmente um segundo CAR, por exemplo, um segundo CAR que inclui um domínio de ligação a antígenos diferente, por exemplo, para o mesmo alvo ou um alvo diferente (por exemplo, um alvo diferente de um antígeno associado a câncer descrito aqui ou um antígeno associado a câncer diferente descrito aqui). Em uma modalidade, o segundo CAR inclui um domínio de ligação a antígenos
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304/606 para um alvo expresso no mesmo tipo de célula cancerígena da do antígeno associado a câncer. Em uma modalidade, a célula expressando CAR compreende um primeiro CAR que visa um primeiro antígeno e inclui um domínio de sinalização intracelular tendo um domínio de sinalização coestimulador, mas não um domínio de sinalização primário, e um segundo CAR que visa um segundo antígeno diferente e inclui um domínio de sinalização intracelular tendo um domínio de sinalização primário, mas não um domínio de sinalização coestimulador. Sem pretender ficar restringido pela teoria, a colocação de um domínio de sinalização coestimulador, por exemplo, 4-1 BB, CD28, CD27 ou OX-40, no primeiro CAR, e do domínio de sinalização primário, por exemplo, CD3 zeta, no segundo CAR pode limitar a atividade de CAR a células onde os dois alvos são expressos. Em uma modalidade, a célula expressando CAR compreende um primeiro CAR para um antígeno associado a câncer que inclui um domínio de ligação a antigenos que se liga a um antígeno-alvo descrito aqui, um domínio de transmembrana e um domínio coestimulador, e um segundo CAR que visa um antígeno-alvo diferente (por exemplo, um antígeno expresso nesse mesmo tipo de células cancerígenas do primeiro antígeno-alvo) e inclui um domínio de ligação a antigenos, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização primário. Em outra modalidade, a célula expressando CAR compreende um primeiro CAR que inclui um domínio de ligação a antigenos que se liga a um antígenoalvo descrito aqui, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização primário, e um segundo CAR que visa um antígeno diferente do primeiro antígeno-alvo (por exemplo, um antígeno expresso no mesmo tipo de células cancerígenas das do primeiro antígeno-alvo) e inclui um domínio de ligação a antigenos para o antígeno, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização coestimulador.
[0540] Em uma modalidade, a célula expressando CAR
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305/606 compreende um CAR X descrito aqui e um CAR inibidor. Em uma modalidade, o CAR inibidor compreende um domínio de ligação a antigenos que liga um antígeno encontrado em células normais, mas não células cancerígenas, por exemplo, células normais que também expressam CLL. Em uma modalidade, o CAR inibidor compreende o domínio de ligação a antigenos, um domínio de transmembrana e um domínio intracelular de uma molécula inibidora. Por exemplo, o domínio intracelular do CAR inibidor pode ser um domínio intracelular de PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGF beta.
[0541] Em uma modalidade, quando a célula expressando CAR compreende dois ou mais CARs diferentes, os domínios de ligação a antigenos dos diferentes CARs podem ser de modo a que os domínios de ligação a antigenos não interajam entre si. Por exemplo, uma célula expressando um primeiro e um segundo CAR pode ter um domínio de ligação a antigenos do primeiro CAR, por exemplo, como um fragmento, por exemplo, um scFv, que não forma uma associação com o domínio de ligação a antigenos do segundo CAR, por exemplo, o domínio de ligação a antigenos do segundo CAR é um VHH.
[0542] Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antigenos compreende moléculas de ligação a antigenos de domínio único (SDAB), incluindo moléculas cujas regiões determinantes de complementaridade fazem parte de um polipeptídeo de domínio único. Exemplos incluem, mas não se limitam a, domínios variáveis de cadeia pesada, moléculas de ligação naturalmente desprovidas de cadeias leves, domínios únicos derivados de anticorpos convencionais de 4 cadeias, domínios manipulados e suportes de domínio único que não os derivados de anticorpos. As moléculas SDAB podem ser quaisquer da técnica, ou quaisquer futuras moléculas de domínio único. As moléculas
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SDAB podem ser derivadas de qualquer espécie, incluindo, mas não se limitando a, camundongo, humano, camelo, lhama, lampreia, peixe, tubarão, cabra, coelho e bovino. Este termo também inclui moléculas de anticorpo de domínio único de ocorrência natural de espécies que não Camelídeos e tubarões.
[0543] Em um aspecto, uma molécula SDAB pode ser derivada de uma região variável da imunoglobulina encontrada em peixes tais como, por exemplo, a derivada do isótipo de imunoglobulina conhecido como Novel Antigen Receptor (NAR - Novo Receptor de Antigenos) encontrado no soro de tubarão. Métodos de produção de moléculas de domínio único derivados de uma região variável de NAR (IgNARs) são descritos em WO 03/014161 e Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.
[0544] De acordo com outro aspecto, uma molécula SDAB é uma molécula de ligação a antigenos de domínio único de ocorrência natural conhecida como cadeia pesada desprovida de cadeias leves. Tais moléculas de domínio único são reveladas em WO 9404678 e HamersCasterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, por exemplo. Por questões de clareza, este domínio variável derivado de uma molécula de cadeia pesada naturalmente desprovida de cadeia leve é conhecido aqui como um VHH ou nanocorpo para distingui-lo de VH convencional de imunoglobulinas de quatro cadeias. Tal molécula VHH pode ser derivada de espécies de Camelídeos, por exemplo, em camelo, lhama, dromedário, alpaca e guanaco. Outras espécies para além de Camelídeos podem produzir moléculas de cadeia pesada naturalmente desprovidas de cadeia leve; tais VHHs encontram-se dentro do escopo da invenção.
[0545] As moléculas SDAB podem ser recombinantes, enxertadas com CDR, humanizadas, camelizadas, desimunizadas e/ou geradas in vitro (por exemplo, selecionadas por exibição em fagos).
[0546] Foi também descoberto que, em células tendo vários
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307/606 receptores quiméricos incorporados em membrana compreendendo um domínio de ligação a antigenos, interações entre o domínio de ligação a antigenos dos receptores podem ser indesejáveis, por exemplo, porque isso inibe a capacidade de um ou mais domínios de ligação a antigenos se ligarem ao seu antígeno cognato. Em conformidade, são aqui reveladas células tendo um primeiro e um segundo receptor quimérico incorporado em membrana de ocorrência não natural compreendendo domínios de ligação a antigenos que minimizam tais interações. Também são revelados aqui ácidos nucleicos codificando um primeiro e um segundo receptor quimérico embutido em membrana não ocorrendo naturalmente compreendendo domínios de ligação a antigenos que minimizam tais interações, bem como métodos de preparação e uso de tais células e ácidos nucleicos. Em uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos de um dos referidos primeiro e segundo receptores quiméricos embutidos em membrana não ocorrendo naturalmente compreende um scFv, e o outro compreende um domínio VH simples, por exemplo, um domínio VH simples de camelídeo, tubarão ou lampreia, ou um domínio VH simples derivado de uma sequência humana ou de camundongo.
[0547] Em algumas modalidades, a invenção reivindicada compreende um primeiro e um segundo CAR, em que o domínio de ligação a antigenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR não compreende um domínio leve variável e um domínio pesado variável. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antigenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR é um scFv, e o outro não é um scFv. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antigenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR compreende um domínio VH simples, por exemplo, um domínio VH simples de camelídeo, tubarão ou lampreia, ou um domínio VH simples derivado de uma sequência humana ou de camundongo. Em algumas
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308/606 modalidades, o domínio de ligação a antígenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR compreende um nanocorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR compreende um domínio VHH de camelídeo.
[0548] Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR compreende um scFv, e o outro compreende um domínio VH simples, por exemplo, um domínio VH simples de camelídeo, tubarão ou lampreia, ou um domínio VH simples derivado de uma sequência humana ou de camundongo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR compreende um scFv, e o outro compreende um nanocorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação a antígenos de um dentre o dito primeiro CAR e o dito segundo CAR compreende um scFv, e o outro compreende um domínio VHH de camelídeo.
[0549] Em algumas modalidades, quando presente na superfície de uma célula, a ligação do domínio de ligação a antígenos do dito primeiro CAR ao seu antígeno cognato não é substancialmente reduzida pela presença do dito segundo CAR. Em algumas modalidades, a ligação do domínio de ligação a antígenos do dito primeiro CAR ao seu antígeno cognato na presença do dito segundo CAR é 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da ligação do domínio de ligação a antígenos do dito primeiro CAR ao seu antígeno cognato na ausência do dito segundo CAR.
[0550] Em algumas modalidades, quando presentes na superfície de uma célula, os domínios de ligação a antígenos do dito primeiro CAR e do dito segundo CAR se associam menos entre si do que se ambos fossem domínios de ligação a antígenos scFv. Em algumas modalidades, os domínios de ligação a antígenos do referido primeiro
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CAR e referido segundo CAR se associam entre si 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% menos do que se ambos fossem domínios de ligação a antígenos scFv.
[0551] Em outro aspecto, a célula expressando CAR descrita aqui pode expressar adicionalmente outro agente, por exemplo, um agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibidora. Moléculas inibidoras, por exemplo, PD1, podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR para montar uma resposta imune efetora. Os exemplos de moléculas inibidoras incluem PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGF beta. Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula inibidora, por exemplo, é uma molécula descrita aqui, por exemplo, um agente que compreende um primeiro polipeptideo, por exemplo, uma molécula inibidora, associado a um segundo polipeptideo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptideo, por exemplo, de uma molécula inibidora tal como PD1, PDL1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGF beta, ou um fragmento de quaisquer destes (por exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular de qualquer um destes), e um segundo polipeptideo que é um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, compreendendo um domínio coestimulador (por exemplo, 41 BB, CD27 ou CD28, por exemplo, como descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primário (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui)). Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptideo de PD1 ou um seu fragmento (por
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310/606 exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular de PD1), e um segundo polipeptideo de um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito aqui e/ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui). PD1 é um membro inibidor da família de receptores CD28 que também inclui CD28, CTLA-4, ICOS e BTLA. PD-1 é expresso em células B, células T e células mieloides ativadas (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Foi mostrado que dois ligantes para PD1, PD-L1 e PD-L2 subregulam a ativação de células T por ligação a PD1 (Freeman etal. 2000JExpMed 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 é abundante em cânceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). A supressão imune pode ser revertida por inibição da interação local de PD1 com PD-L1.
[0552] Em uma modalidade, o agente compreende o domínio extracelular (ECD) de uma molécula inibidora, por exemplo, Morte Programada 1 (PD1), fundido a um domínio de transmembrana e domínios de sinalização intracelulares tais como 41 BB e CD3 zeta (também referido aqui como CAR PD1). Em uma modalidade, o CAR PD1, quando usado em combinações com um CAR X descrito aqui, melhora a persistência da célula T. Em uma modalidade, o CAR é um CAR PD1 compreendendo o domínio extracelular de PD1 indicado sublinhado na SEQ ID NQ: 26. Em uma modalidade, o CAR PD1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 26.
Malpvtal I Iplal I IhaaroDqwfldsDdrDwnDDtfsDalIvvteqdnatftcsfsntsesfvInwyr msDsnqtdklaafDedrsqDqqdcrfrvtqlDnqrdfhmsvvrarrndsqtylcqaislaDkaqik eslraelrvterraevDtahDSDSDrDaqqfqtlvtttDaorDDtDaDtiasq plslrpeacrpaagga vhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeee ggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglyn
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311/606 elqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NQ:26).
[0553] Em uma modalidade, o CAR PD1 compreende a sequência de aminoácidos fornecida abaixo (SEQ ID NQ: 39).
DqwfldsDdrDwnDDtfsDallvvteqdnatftcsfsntsesfvInwvrmsDsngtdklaafDedrs qDqqdcrfrvtqlDnqrdfhmsvvrarrndsqtylcqaislaDkaqikesIraelrvterraevDtah DSDSDrDaqqfqtlvtttDaDrDDtDaDtiasqDlsIrDeacroaaqqavhtrqldfacdiviwaDla gtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapa ykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseig mkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NQ:39).
[0554] Em uma modalidade, o agente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o CAR PD1, por exemplo, o CAR PD1 descrito aqui. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico para o CAR PD1 é mostrada abaixo, com o ECD de PD1 sublinhado abaixo na SEQ ID NQ: 27.
atg g ccctccctg tcactg ccctg cttctccccctcg cactcctg ctccacg ccqctaqaccacccq q atq q tttctq q actctccq q atcq cccq tq q aatcccccaaccttctcaccq q cactcttq q ttq tq actq aq q q cg ataatq cg accttcacq tq ctcq ttctccaacacctccq aatcattcq tq ctq aact qqtaccqcatqaqcccqtcaaaccaqaccqacaaqctcqccqcqtttccqqaaqatcqqtcqc aaccq q q acaq q attq tcq q ttccq cg tq actcaactq ccq aatq q caq aq acttccacatq aq cqtqqtccqcqctaqqcqaaacqactccqqqacctacctqtqcqqaqccatctcqctqqcqcct aaq q cccaaatcaaaq aq aq cttq aq q q ccq aactq aq aq tq accq aq cg caq aq ctqaq q tq ccaactq cacatccatccccatcq cctcq q cctq cg q q q caq tttcaq accctq q tcacq acc actccg g cg ccg cg cccaccg actccg g ccccaactatcg cg ag ccag cccctg tcg ctg ag g ccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcg acatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgta ctg caag cg g g g tcg g aaaaag cttctg tacattttcaag cag cccttcatg ag g cccg tg caaa ccacccag g ag g ag g acg g ttg ctcctg ccg g ttccccg aag ag g aag aag g ag g ttg cg ag ctg cg cg tg aag ttctcccg g ag cg ccg acg cccccg cctataag cag g g ccag aaccag ctg tacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggcc
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312/606 g g g accccg aaatg g g eg g g aag cctag aag aaag aaccctcag g aag g cctg tataacg a g etg cag aag g acaag atg g ccg ag g cctactccg aaattg g g atg aag g g ag ag eg g eg g ag g g g aaag g g g cacg acg g cctg taccaag g actg tccaccg ccaccaag g acacatacg atgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NQ: 27).
[0555] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma população de células expressando CAR, por exemplo, células CART. Em algumas modalidades, a população de células expressando CAR compreende uma mistura de células expressando diferentes CARs. Por exemplo, em uma modalidade, a população de células CART pode incluir uma primeira célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, e uma segunda célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação a antígenos diferente, por exemplo, um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer diferente descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui que difere do antígeno associado a câncer ligado pelo domínio de ligação a antígenos do CAR expresso pela primeira célula. Como outro exemplo, a população de células expressando CARs pode incluir uma primeira célula expressando um CAR que inclui um domínio de ligação a antígenos para um antígeno associado a câncer descrito aqui, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de ligação a antígenos para um alvo diferente de um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em uma modalidade, a população de células expressando CAR inclui, por exemplo, uma primeira célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização intracelular primário, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização secundário. [0556] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma população de células em que pelo menos uma célula da população expressa um CAR tendo um domínio de ligação a antígenos para um
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313/606 antígeno associado a câncer descrito aqui, e uma segunda célula expressando outro agente, por exemplo, um agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibidora. Moléculas inibidoras, por exemplo, PD-1, podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR para montar uma resposta imune efetora. Os exemplos de moléculas inibidoras incluem PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGF beta. Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula inibidora, por exemplo, é uma molécula descrita aqui, por exemplo, um agente que compreende um primeiro polipeptideo, por exemplo, uma molécula inibidora, associado a um segundo polipeptideo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptideo, por exemplo, de uma molécula inibidora tal como PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGF beta, ou um fragmento de quaisquer destes, e um segundo polipeptideo que é um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, compreendendo um domínio coestimulador (por exemplo, 41 BB, CD27, 0X40 ou CD28, por exemplo, como descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primário (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui)). Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptideo de PD-1 ou um seu fragmento, e um segundo polipeptideo de um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito aqui e/ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui).
[0557] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos
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314/606 compreendendo administrar uma população de células expressando CARs, por exemplo, células CART, por exemplo, uma mistura de células expressando CARs diferentes, em combinação com outro agente, por exemplo, um inibidor de quinases, tal como um inibidor de quinases descrito aqui. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos compreendendo administrar uma população de células em que pelo menos uma célula da população expressa um CAR tendo um domínio de ligação a antígenos de um antígeno associado a câncer descrito aqui, e uma segunda célula expressando outro agente, por exemplo, um agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR, em combinação com outro agente, por exemplo, um inibidor de quinases, tal como um inibidor de quinases descrito aqui.
Receptores de Antígenos Quiméricos Reguláveis
[0558] Em algumas modalidades, um CAR regulável (RCAR) em que a atividade do CAR pode ser controlada é desejável para otimizar a segurança e eficácia de uma terapia com CAR. Há muitos modos pelos quais as atividades de CARs podem ser reguladas. Por exemplo, a apoptose induzível com o uso de, por exemplo, uma caspase fundida a um domínio de dimerização (consultar, por exemplo, Di etaL, N Egnl. J. Med. 3 de novembro de 2011; 365(18):1673-1683), pode ser usada como um interruptor de segurança na terapia com CAR da presente invenção. Em um aspecto, um RCAR compreende um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, em que os componentes de um CAR padrão descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação a antígenos e um domínio de sinalização intracelular, são particionados em polipeptídeos ou membros separados. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos inclui um interruptor de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos entre si, por exemplo, pode acoplar um
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315/606 domínio de ligação a antigenos a um domínio de sinalização intracelular. [0559] Em um aspecto, um RCAR compreende dois polipeptídeos ou membros: 1) um membro de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário descrito aqui, e um primeiro domínio de interruptor; 2) um membro de ligação a antigenos que compreende um domínio de ligação a antigenos, por exemplo, que visa um antígeno tumoral descrito aqui, conforme descrito aqui, e um segundo domínio de interruptor. Opcionalmente, o RCAR compreende um domínio de transmembrana descrito no presente documento. Em uma modalidade, um domínio de transmembrana pode ser disposto no membro de sinalização intracelular, no membro de ligação a antigenos ou em ambos. (A não ser que indicado de outro modo, quando os membros ou elementos de um RCAR são descritos no presente documento, a ordem pode ser conforme fornecido, mas outras ordens estão também incluídas. Por outras palavras, em uma modalidade, a ordem é conforme definido no texto, mas, em outras modalidades, a ordem pode ser diferente. Por exemplo, a ordem dos elementos em um lado de uma região transmembrana pode ser diferente do exemplo, por exemplo, a colocação de um domínio de interruptor em relação a um domínio de sinalização intracelular pode ser diferente, por exemplo, reversa).
[0560] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo domínios de interruptor podem formar um interruptor de dimerização intracelular ou extracelular. Em uma modalidade, o interruptor de dimerização pode ser um interruptor de homodimerização, por exemplo, em que o primeiro e o segundo domínios de interruptor são iguais, ou um interruptor de heterodimerização, por exemplo, em que o primeiro e o segundo domínios de interruptor são diferentes um do outro.
[0561] Nas modalidades, um RCAR pode compreender um multiinterruptor. Um multi-interruptor pode compreender domínios de
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316/606 interruptor de heterodimerização ou domínios de interruptor de homodimerização. Um multi-interruptor compreende uma pluralidade de, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, domínios de interruptor, independentemente, em um primeiro membro, por exemplo, um membro de ligação a antigenos, e um segundo membro, por exemplo, um membro de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o primeiro membro pode compreender uma pluralidade de primeiros domínios de interruptor, por exemplo, domínios de interruptor baseados em FKBP, e o segundo membro pode compreender uma pluralidade de segundos domínios de interruptor, por exemplo, domínios de interruptor baseados em FRB. Em uma modalidade, o primeiro membro pode compreender um primeiro e um segundo domínios de interruptor, por exemplo, um domínio de interruptor baseado em FKBP e um domínio de interruptor baseado em FRB, e o segundo membro pode compreender um primeiro e um segundo domínio de interruptor, por exemplo, um domínio de interruptor baseado em FKBP e um domínio de interruptor baseado em FRB.
[0562] Em uma modalidade, o membro de sinalização intracelular compreende um ou mais domínios de sinalização intracelulares, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário e um ou mais domínios de sinalização coestimuladores.
[0563] Em uma modalidade, o membro de ligação a antigenos pode compreender um ou mais domínios de sinalização intracelulares, por exemplo, um ou mais domínios de sinalização coestimuladores. Em uma modalidade, o membro de ligação a antigenos compreende uma pluralidade de, por exemplo, 2 ou 3 domínios de sinalização coestimuladores descritos no presente documento, por exemplo, selecionados dentre 41 BB, CD28, CD27, ICOS e 0X40, e, em modalidades, nenhum domínio de sinalização intracelular primário. Em uma modalidade, o membro de ligação a antigenos compreende os
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317/606 seguintes domínios de sinalização coestimuladores, na direção extracelular para intracelular: 41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; ou 41BB-CD28. Em tais modalidades, o membro de ligação intracelular compreende um domínio CD3zeta. Em tal uma modalidade, o RCAR compreende (1) um membro de ligação a antígenos que compreende um domínio de ligação a antígenos, um domínio de transmembrana e dois domínios coestimuladores e um primeiro domínio de interruptor; e (2) um domínio de sinalização intracelular que compreende um domínio de transmembrana ou domínio de ligação de membrana e pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário e um segundo domínio de interruptor.
[0564] Uma modalidade fornece RCARs em que o membro de ligação a antígenos não é ligado à superfície da célula CAR. Isso permite que uma célula que tem um membro de sinalização intracelular seja convenientemente pareada com um ou mais domínios de ligação a antígenos, sem transformar a célula com uma sequência que codifica o membro de ligação a antígenos. Em tais modalidades, o RCAR compreende: 1) um membro de sinalização intracelular que compreende: um primeiro domínio de interruptor, um domínio de transmembrana, um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário, e um primeiro domínio de interruptor; e 2) um membro de ligação a antígenos que compreende: um domínio de ligação a antígenos e um segundo domínio de interruptor, em que o membro de ligação a antígenos não compreende um domínio de transmembrana ou domínio de ligação de membrana e, opcionalmente, não compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o RCAR pode compreender adicionalmente 3) um segundo membro de ligação a antígenos que compreende: um segundo domínio de ligação a antígenos, por exemplo,
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318/606 um segundo domínio de ligação a antigenos que se liga a um antígeno diferente que é ligado pelo domínio de ligação a antigenos; e um segundo domínio de interruptor.
[0565] São também fornecidos no presente documento RCARs em que o membro de ligação a antigenos compreende ativação biespecífica e capacidade de alvejamento. Nessa modalidade, o membro de ligação a antigenos pode compreender uma pluralidade de, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 domínios de ligação a antigenos, por exemplo, scFvs, em que cada domínio de ligação a antigenos se liga a um antígeno-alvo, por exemplo, diferentes antigenos ou ao mesmo antígeno, por exemplo, epítopos iguais ou diferentes no mesmo antígeno. Em uma modalidade, a pluralidade de domínios de ligação a antigenos está em tandem, e, opcionalmente, um ligante ou região de dobradiça é disposta entre cada um dos domínios de ligação a antigenos. Os ligantes e regiões de dobradiça adequados são descritos no presente documento.
[0566] Uma modalidade fornece RCARs com uma configuração que permite a comutação da proliferação. Nessa modalidade, o RCAR compreende: 1) um membro de sinalização intracelular que compreende: opcionalmente, um domínio de transmembrana ou domínio de ligação de membrana; um ou mais domínios de sinalização coestimuladores, por exemplo, selecionados dentre 41 BB, CD28, CD27, ICOS e 0X40, e um domínio de interruptor; e 2) um membro de ligação a antigenos que compreende: um domínio de ligação a antigenos, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular primário, por exemplo, um domínio CD3zeta, em que o membro de ligação a antigenos não compreende um domínio de interruptor ou não compreende um domínio de interruptor que dimeriza com um domínio de interruptor no membro de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o membro de ligação a antigenos não compreende um domínio de sinalização coestimulador. Em uma modalidade, o membro
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319/606 de sinalização intracelular compreende um domínio de interruptor de um interruptor de homodimerização. Em uma modalidade, o membro de sinalização intracelular compreende um primeiro domínio de interruptor de um interruptor de heterodimerização e o RCAR compreende um segundo membro de sinalização intracelular que compreende um segundo domínio de interruptor do interruptor de heterodimerização. Em tais modalidades, o segundo membro de sinalização intracelular compreende os mesmos domínios de sinalização intracelulares do membro de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o interruptor de dimerização é intracelular. Em uma modalidade, o interruptor de dimerização é extracelular.
[0567] Em quaisquer configurações de RCAR descritas aqui, o primeiro e o segundo domínios de interruptor compreendem um interruptor baseado em FKBP-FRB conforme descrito no presente documento.
[0568] São também fornecidas aqui células que compreendem um RCAR descrito no presente documento. Qualquer célula que é modificada para expressar um RCAR pode ser usada como uma célula RCARX. Em uma modalidade, a célula RCARX é uma célula T, e é referida como uma célula RCART. Em uma modalidade, a célula RCARX é uma célula NK e é referida como uma célula RCARN.
[0569] São também fornecidos no presente documento ácidos nucleicos e vetores que compreendem sequências de codificação de RCAR. A sequência que codifica vários elementos de um RCAR pode ser disposta na mesma molécula de ácido nucleico, por exemplo, o mesmo plasmídeo ou vetor, por exemplo, vetor viral, por exemplo, vetor lentiviral. Em uma modalidade, (i) a sequência que codifica um membro de ligação a antigenos e (ii) a sequência que codifica um membro de sinalização intracelular podem estar presentes no mesmo ácido nucleico, por exemplo, vetor. A produção das proteínas correspondentes pode ser
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320/606 alcançada, por exemplo, pelo uso de promotores separados ou pelo uso de um produto de transcrição bicistrônica (que pode resultar na produção de duas proteínas pela divagem de um único produto de tradução ou pela tradução de dois produtos de proteína separados). Em uma modalidade, uma sequência que codifica um peptídeo clivável, por exemplo, uma sequência P2A ou F2A, é disposta entre (i) e (ii). Exemplos de sítios de divagem de peptídeos incluem os seguintes, nos quais os resíduos GSG são opcionais:
T2A: (GSG) EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID Ns: 68) P2A: (GSG) ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID Ns: 69) E2A: (GSG) QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID Ns: 70) F2A: (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID Ns: 71) [0570] Em uma modalidade, uma sequência que codifica um IRES, por exemplo, um IRES EMCV ou EV71, é disposta entre (i) e (ii). Nessas modalidades, (i) e (ii) são transcritos como um único RNA. Em uma modalidade, um primeiro promotor é ligado de maneira funcional a (i) e um segundo promotor é ligado de maneira funcional a (ii), de modo que (i) e (ii) sejam transcritos como mRNAs separados.
[0571 ] Alternativamente, a sequência que codifica vários elementos de um RCAR pode ser disposta nas diferentes moléculas de ácido nucleico, por exemplo, diferentes plasmídeos ou vetores, por exemplo, vetor viral, por exemplo, vetor lentiviral. Por exemplo, a sequência (i) que codifica um membro de ligação a antigenos pode estar presente em um primeiro ácido nucleico, por exemplo, um primeiro vetor, e a sequência (ii) que codifica um membro de sinalização intracelular pode estar presente no segundo ácido nucleico, por exemplo, o segundo vetor.
Interruptores de Dimerizacão
[0572] Os interruptores de dimerização podem ser não covalentes ou covalentes. Em um interruptor de dimerização não covalente, a molécula de dimerização promove uma interação não covalente entre
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321/606 os domínios de interruptor. Em um interruptor de dimerização covalente, a molécula de dimerização promove uma interação covalente entre os domínios de interruptor.
[0573] Em uma modalidade, o RCAR compreende um interruptor de dimerização baseado em FKBP/FRAP ou FKBP/FRB. FKBP12 (FKBP ou proteína de ligação de FK506) é uma proteína citoplasmática abundante que serve como o alvo intracelular inicial para o fármaco imunossupressor de produto natural, rapamicina. A rapamicina se liga a FKBP e ao FRAP de homólogo de PI3K grande (RAFT, mTOR). FRB é uma porção de 93 aminoácidos de FRAP, que é suficiente para se ligar ao complexo de FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycinassociated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci US A 92: 4947-51).
[0574] Nas modalidades, um interruptor baseado em FKBP/FRAP, por exemplo, FKBP/FRB, pode usar uma molécula de dimerização, por exemplo, rapamicina ou um análogo de rapamicina.
[0575] A sequência de aminoácidos de FKBP é a seguinte: DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGD GRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNK PFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTIS PDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY (SEQ ID N2: 54)
[0576] Em modalidades, um domínio de interruptor de FKBP pode compreender um fragmento de FKBP tendo a capacidade para se ligar a FRB, ou um seu fragmento ou análogo, na presença de rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, a porção sublinhada de SEQ ID N2: 54, que é:
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGK
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KFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMS VGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDV ELLKLETS (SEQ ID N2:55)
[0577] A sequência de aminoácidos de FRB é a seguinte: ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID N2: 56)
[0578] Interruptor baseado em FKBP/FRAP, por exemplo, FKBP/FRB, como esse termo é usado no presente documento, referese a um interruptor de dimerização que compreende: um primeiro domínio de interruptor, que compreende um fragmento de FKBP ou seu análogo tendo a capacidade para se ligar a FRB, ou um seu fragmento ou análogo, na presença de rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, RAD001, e tem pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com, ou difere em não mais do que 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácidos de, a sequência FKBP de SEQ ID N2: 54 ou 55; e um segundo domínio de interruptor, que compreende um fragmento de FRB ou seu análogo tendo a capacidade para se ligar a FRB, ou um seu fragmento ou análogo, na presença de rapamicina ou um rapálogo, e tem pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com, ou difere em não mais do que 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácidos de, a sequência FRB de SEQ ID N2: 56. Em uma modalidade, um RCAR descrito no presente documento compreende um domínio de interruptor que compreende os resíduos de aminoácido revelados na SEQ ID N2: 54 (ou SEQ ID N2: 55), e um domínio de interruptor compreende resíduos de aminoácidos revelados em SEQ ID N2: 56.
[0579] Nas modalidades, o interruptor de dimerização FKBP/FRB compreende um domínio de interruptor FRB modificado que exibe formação de complexo alterada, por exemplo, intensificada, entre um
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323/606 domínio de interruptor baseado em FRB, por exemplo, o domínio de interruptor FRB modificado, um domínio de interruptor baseado em FKBP e a molécula de dimerização, por exemplo, rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, RAD001. Em uma modalidade, o domínio de interruptor FRB modificado compreende uma ou mais mutações, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, selecionadas das mutações na(s) posição(ões) de aminoácidos L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 e F2108, em que o aminoácido do tipo selvagem é mutado para qualquer outro aminoácido de ocorrência natural. Em uma modalidade, uma FRB mutante compreende uma mutação em E2032, em que E2032 é mutado para fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por exemplo, SEQ ID NQ: 57, ou leucina (E2032L), por exemplo, SEQ ID NQ: 58. Em uma modalidade, uma FRB mutante compreende uma mutação em T2098, em que T2098 é mutado para fenilalanina (T2098F) ou leucina (T2098L), por exemplo, SEQ ID NQ: 59. Em uma modalidade, uma FRB mutante compreende uma mutação em E2032 e em T2098, em que E2032 é mutado para qualquer aminoácido, e em que T2098 é mutado para qualquer aminoácido, por exemplo, SEQ ID NQ: 60. Em uma modalidade, uma FRB mutante compreende uma mutação E2032I e T2098L, por exemplo, SEQ ID NQ: 61. Em uma modalidade, uma FRB mutante compreende uma mutação E2032L e T2098L, por exemplo, SEQ ID NQ: 62.
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Tabela 10. FRB mutantes exemplificativas tendo afinidade aumentada para uma molécula de dimerização
Mutante de FRB Sequência de Aminoácidos SEQ ID N2:
E2032I mutante ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQ TLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYY HVFRRISKTS 57
E2032L mutante ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQ TLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYY HVFRRISKTS 58
T2098L mutante ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGP QTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLY YHVFRRISKTS 59
E2032, T2098 mutante ILWHEMWHEGLXEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGP QTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLXQAWDLY YHVFRRISKTS 60
E2032I, T2098L mutante ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQ TLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYY HVFRRISKTS 61
E2032L, T2098L mutante ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQ TLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYY HVFRRISKTS 62
[0580] Outros interruptores de dimerização adequados incluem um interruptor de dimerização baseado em GyrB-GyrB, um interruptor de dimerização baseado em Giberelina, um interruptor de dimerização de etiqueta/aglutinante e um interruptor de dimerização de etiqueta halo/etiqueta snap. Seguindo a orientação fornecida no presente documento, tais interruptores e moléculas de dimerização relevantes serão evidentes para uma pessoa de habilidade comum na técnica. Molécula de Dimerização
[0581] A associação entre os domínios de interruptor é promovida pela molécula de dimerização. Na presença da molécula de dimerização, a interação ou associação entre os domínios de interruptor permite a transdução de sinal entre um polipeptideo associado, por exemplo, fundido, a um primeiro domínio de interruptor e um
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325/606 polipeptídeo associado, por exemplo, fundido, a um segundo domínio de interruptor. Na presença de níveis não limitantes de molécula de dimerização, a transdução de sinal é aumentada em 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 vezes, por exemplo, conforme medido em um sistema descrito no presente documento.
[0582] Rapamicina e análogos de rapamicina (algumas vezes denominados rapálogos), por exemplo, RAD001, podem ser usados como moléculas de dimerização em um interruptor de dimerização baseado em FKBP/FRB descrito no presente documento. Em uma modalidade, a molécula de dimerização pode ser selecionada dentre rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), zotarolimus, temsirolimus, AP-23573 (ridaforolimus), biolimus e AP21967. Análogos de rapamicina adicionais adequados para uso com interruptores de dimerização baseados em FKBP/FRB são adicionalmente descritos na seção intitulada Terapias de Combinação ou na subseção intitulada Inibidores de mTOR exemplificativos.
CAR dividido
[0583] Em algumas modalidades, a célula expressando CAR usa um CAR dividido. A abordagem de CAR dividido é descrita em mais detalhe nas publicações WO2014/055442 e WO2014/055657. Em resumo, um sistema CAR dividido compreende uma célula expressando um primeiro CAR tendo um primeiro domínio de ligação a antígenos e um domínio coestimulador (por exemplo, 41 BB), e a célula também expressa um segundo CAR tendo um segundo domínio de ligação a antígenos e um domínio de sinalização intracelular (por exemplo, CD3 zeta). Quando a célula encontra o primeiro antígeno, o domínio coestimulador é ativado, e a célula prolifera. Quando a célula encontra o segundo antígeno, o domínio de sinalização intracelular é ativado e a atividade de morte celular começa. Assim, a célula expressando CAR é totalmente ativada apenas na presença de ambos os antígenos.
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Transfecção de RNA
[0584] São aqui revelados métodos para produzir um RNA de CAR transcrito in vitro. A presente invenção também inclui um construto de RNA codificando CAR que pode ser diretamente transfectado em uma célula. Um método para gerar mRNA para uso em transfecção pode envolver transcrição in vitro (IVT) de um modelo com iniciadores especialmente planejados, seguido de adição de poliA, para produzir um construto contendo sequências 3' e 5' não traduzidas (UTR), um cap 5' e/ou Sítio Interno de Entrada do Ribossomo (IRES), o ácido nucleico a ser expresso, e uma cauda poliA, tipicamente com 50-2000 bases de comprimento (SEQ ID NQ:32) O RNA produzido deste modo pode transfectar eficientemente diferentes tipos de células. Em um aspecto, o modelo inclui sequências para o CAR.
[0585] Em um aspecto, um CAR da presente invenção é codificado por um RNA mensageiro (mRNA). Em um aspecto, o mRNA codificando um CAR descrito aqui é introduzido em uma célula efetora imune, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, para produção de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula CART ou uma célula NK CAR.
[0586] Em uma modalidade, o RNA de CAR transcrito in vitro pode ser introduzido em uma célula como uma forma de transfecção transiente. O RNA é produzido por transcrição in vitro usando um modelo gerado por reação em cadeia de polimerase (PCR). DNA de interesse de qualquer fonte pode ser diretamente convertido por PCR em um modelo para síntese de mRNA in vitro usando iniciadores apropriados e RNA polimerase. A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA genômico, DNA plasmídico, DNA fágico, cDNA, sequência de DNA sintética ou qualquer outra fonte apropriada de DNA. O modelo desejado para transcrição in vitro é um CAR descrito aqui. Por exemplo, o modelo para o RNA de CAR compreende uma região extracelular
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327/606 compreendendo um domínio variável de cadeia simples de um anticorpo para um antígeno associado a tumor descrito aqui; uma região de dobradiça (por exemplo, uma região de dobradiça descrita aqui), um domínio de transmembrana (por exemplo, um domínio de transmembrana descrito aqui tal como um domínio de transmembrana de CD8a); e uma região citoplasmática que inclui um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui, por exemplo, compreendendo o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-1 BB.
[0587] Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR contém um quadro de leitura aberto. O DNA pode provir de uma sequência de DNA de ocorrência natural do genoma de um organismo. Em uma modalidade, o ácido nucleico pode incluir algumas ou todas as regiões 5' e/ou 3' não traduzidas (UTRs). O ácido nucleico pode incluir éxons e introns. Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR é uma sequência de ácido nucleico humana. Em outra modalidade, o DNA a ser usado para PCR é uma sequência de ácido nucleico humana incluindo as 5' e 3' UTRs. O DNA pode alternativamente ser uma sequência de DNA artificial que não é normalmente expressa em um organismo de ocorrência natural. Uma sequência de DNA artificial exemplificativa é tal que contém porções de genes que são ligadas em conjunto para formar um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína de fusão. As porções de DNA que são ligadas em conjunto podem provir de um único organismo ou de mais do que um organismo. [0588] PCR é usada para gerar um modelo para transcrição in vitro de mRNA que é usado para transfecção. Métodos para realizar PCR são bem conhecidos na técnica. Iniciadores para uso em PCR são planejados de modo a terem regiões que são substancialmente complementares a regiões do DNA a ser usado como modelo para a PCR. Substancialmente complementares, como usado aqui, se
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328/606 relaciona com sequências de nucleotídeos nas quais a maioria ou todas as bases da sequência iniciadora são complementares, ou uma ou mais bases não são complementares, ou emparelham de modo defeituoso. Sequências substancialmente complementares são capazes de emparelhar ou hibridar com o alvo de DNA pretendido sob condições de emparelhamento usadas para PCR. Os iniciadores podem ser planejados de modo a serem substancialmente complementares a qualquer porção do modelo de DNA. Por exemplo, os iniciadores podem ser planejados para amplificarem a porção de um ácido nucleico que é normalmente transcrita em células (o quadro de leitura aberto), incluindo 5' e 3' UTRs. Os iniciadores também podem ser planejados para amplificarem uma porção de um ácido nucleico que codifica um domínio de interesse particular. Em uma modalidade, os iniciadores são planejados para amplificarem a região codificadora de um cDNA humano, incluindo a totalidade ou porções das 5' e 3' UTRs. Iniciadores úteis para PCR podem ser gerados por métodos sintéticos que são bem conhecidos na técnica. Iniciadores diretos são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a nucleotídeos no modelo de DNA que estão a montante da sequência de DNA a ser amplificada. A montante é usado aqui para referir uma localização 5' à sequência de DNA a ser amplificada relativamente à fita codificadora. Iniciadores reversos são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a um modelo de DNA de fita dupla que estão a jusante da sequência de DNA a ser amplificada. A jusante é usado aqui para referir uma localização 3' à sequência de DNA a ser amplificada relativamente à fita codificadora.
[0589] Qualquer DNA polimerase útil para PCR pode ser usada nos métodos revelados aqui. Os reagentes e polimerase são disponibilizados comercialmente por algumas fontes.
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[0590] Estruturas químicas com capacidade para promover a estabilidade e/ou eficiência da tradução também podem ser usadas. O RNA tem preferencialmente 5' e 3' UTRs. Em uma modalidade, a 5' UTR tem entre um e 3000 nucleotídeos de comprimento. O comprimento de sequências 5' e 3' UTR a serem adicionadas à região codificadora pode ser alterado por diferentes métodos, incluindo, mas não se limitando a, planejamento de iniciadores para PCR que emparelham com diferentes regiões das UTRs. Usando esta abordagem, o perito na técnica pode modificar os comprimentos das 5' e 3' UTR requeridos para se obter uma eficiência ótima da tradução após transfecção do RNA transcrito.
[0591] As 5' e 3' UTRs podem ser as 5' e 3' UTRs endógenas de ocorrência natural para o ácido nucleico de interesse. Alternativamente, sequências UTR que não são endógenas ao ácido nucleico de interesse podem ser adicionadas por incorporação das sequências UTR nos iniciadores diretos e reversos ou por quaisquer outras modificações do modelo. O uso de sequências UTR que não são endógenas ao ácido nucleico de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou eficiência da tradução do RNA. Por exemplo, é conhecido que elementos ricos em AU em sequências 3' UTR podem decrescer a estabilidade de mRNA. Em consequência, 3' UTRs podem ser selecionadas ou planejadas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base em propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.
[0592] Em uma modalidade, a 5' UTR pode conter a sequência de Kozak do ácido nucleico endógeno. Alternativamente, quando uma 5' UTR que não é endógena ao ácido nucleico de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito acima, uma sequência de consenso de Kozak pode ser replanejada por adição da sequência 5' UTR. Sequências de Kozak podem aumentar a eficiência da tradução de alguns transcritos de RNA, mas não aparentam ser requeridas para
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330/606 todos os RNAs para permitir uma tradução eficiente. O requisito de sequências de Kozak para muitos mRNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades, a 5' UTR pode ser 5'UTR de um vírus RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeos podem ser usados na 3' ou 5' UTR para impedir a degradação do mRNA por exonucleases.
[0593] Para permitir a síntese de RNA a partir de um modelo de DNA sem a necessidade de clonagem de genes, um promotor da transcrição deve ser adicionado ao modelo de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Quando uma sequência que atua como um promotor para uma RNA polimerase é adicionada à extremidade 5' do iniciador direto, o promotor de RNA polimerase fica incorporado no produto de PCR a montante do quadro de leitura aberto a ser transcrito. Em uma modalidade preferencial, o promotor é um promotor de polimerase de T7, como descrito aqui noutro local. Outros promotores úteis incluem, mas não se limitam a, promotores de RNA polimerase de T3 e SP6. Sequências de nucleotídeos de consenso para promotores de T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica.
[0594] Em uma modalidade preferencial, o mRNA tem um cap na extremidade 5' e uma cauda 3' poli(A) que determinam a ligação de ribossomos, iniciação da tradução e estabilidade do mRNA na célula. Em um modelo de DNA circular, por exemplo, DNA plasmídico, RNA polimerase origina um produto concatamérico longo que não é adequado para expressão em células eucarióticas. A transcrição de DNA plasmídico linearizado na extremidade da 3' UTR origina mRNA de tamanho normal que não é eficaz em transfecção eucariótica mesmo que seja poliadenilado após a transcrição.
[0595] Em um modelo de DNA linear, RNA polimerase do fago T7 pode prolongar a extremidade 3' do transcrito para além da última base do modelo (Schenborn e Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985);
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Nacheva e Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)).
[0596] O método convencional de integração de extensões poliA/T em um modelo de DNA é clonagem molecular. No entanto, uma sequência poliA/T integrada em DNA plasmídico pode causar instabilidade do plasmídeo, motivo pelo qual modelos de DNA plasmídico obtidos de células bacterianas são muitas vezes altamente contaminados com deleções e outras aberrações. Tal torna os procedimentos de clonagem não só trabalhosos e demorados, mas muitas vezes não fiáveis. É por isso que é altamente desejável um método que permita a construção de modelos de DNA com extensão 3' poliA/T sem clonagem.
[0597] O segmento poliA/T do modelo de DNA de transcrição pode ser produzido durante PCR por uso de um iniciador reverso contendo uma cauda poliT, tal como cauda 100T (SEQ ID NQ: 35) (o tamanho pode ser 50-5000 T (SEQ ID NQ: 36)), ou após PCR por qualquer outro método, incluindo, mas não se limitando a, ligação de DNA ou recombinação in vitro. Caudas poli(A) também proporcionam estabilidade a RNAs e reduzem a sua degradação. Geralmente, o comprimento de uma cauda poli(A) está positivamente correlacionado com a estabilidade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda poli(A) tem entre 100 e 5000 adenosinas (SEQ ID NQ: 37).
[0598] Caudas poli(A) de RNAs podem ser adicionalmente estendidas após transcrição in vitro com o uso de uma poli(A) polimerase, tal como poliA polimerase de E. coli (E-PAP). Em uma modalidade, o aumento do comprimento de uma cauda poli(A) de 100 nucleotideos para entre 300 e 400 nucleotideos (SEQ ID NQ: 38) origina um aumento de cerca de duas vezes da eficiência da tradução do RNA. Adicionalmente, a ligação de diferentes grupos químicos à extremidade 3' pode aumentar a estabilidade do mRNA. Tal ligação pode conter nucleotideos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por
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332/606 exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda poli(A) usando poli(A) polimerase. Análogos de ATP podem aumentar adicionalmente a estabilidade do RNA.
[0599] Caps 5' também proporcionam estabilidade a moléculas de RNA. Em uma modalidade preferencial, RNAs produzidos pelos métodos revelados aqui incluem um cap 5'. O cap 5' é proporcionado usando técnicas conhecidas na técnica e descritas aqui (Cougot, etal., Trends in Biochem. Sei., 29:436-444 (2001); Stepinski, et ai., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et ai., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
[0600] Os RNAs produzidos pelos métodos revelados aqui também podem conter uma sequência de sítio interno de entrada do ribossomo (IRES). A sequência IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossômica ou artificialmente planejada que inicia ligação do ribossomo independente de cap a mRNA e facilita a iniciação da tradução. Podem ser incluídos quaisquer solutos adequados para a eletroporação de células, que podem conter fatores que facilitam a permeabilidade e viabilidade celulares, tais como açúcares, peptideos, lipídeos, proteínas, antioxidantes e surfactantes.
[0601] RNA pode ser introduzido em células-alvo usando qualquer um de alguns métodos diferentes, por exemplo, métodos comercialmente disponíveis que incluem, mas não se limitam a, eletroporação (Amaxa Nucleofector-ll (Amaxa Biosystems, Colônia, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) ou o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo Alemanha), transfecção mediada por lipossomos catiônicos usando lipofecção, encapsulação de polímeros, transfecção mediada por peptideos ou sistemas de administração biolística de partículas tais como armas de genes (ver, por exemplo, Nishikawa, etal. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).
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Métodos de Administração Não Virais
[0602] Em alguns aspectos, métodos não virais podem ser usados para administrar um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui em uma célula ou tecido ou um sujeito.
[0603] Em algumas modalidades, o método não viral inclui o uso de um transposon (também denominado elemento de transposição). Em algumas modalidades, um transposon é um pedaço de DNA que pode se inserir em uma localização em um genoma, por exemplo, um pedaço de DNA que é capaz de se autorreplicar e inserir a sua cópia em um genoma, ou um pedaço de DNA que pode ser removido de um ácido nucleico mais longo e inserido em outro lugar em um genoma. Por exemplo, um transposon compreende uma sequência de DNA constituída por repetições invertidas flanqueando genes para transposição.
[0604] Métodos exemplificativos de administração de ácidos nucleicos usando um transposon incluem um sistema de transposon Bela Adormecida (SBTS) e um sistema de transposon PiggyBac (PB). Ver, por exemplo, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 2O.R1(2O11 ):R1420; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):12001209; Kebriaei et al. Blood. 122.21 (2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):315365; e Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83, todos os quais são incorporados aqui por referência.
[0605] O SBTS inclui dois componentes: 1) um transposon contendo um transgene e 2) uma fonte de enzima transposase. A transposase pode efetuar transposição do transposon de um plasmídeo transportador (ou outro DNA doador) para um DNA-alvo, tal como cromossomo/genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, a transposase se liga ao plasmídeo transportador/DNA doador, corta o
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334/606 transposon (incluindo transgene(s)) removendo-o do plasmídeo, e insere-o no genoma da célula hospedeira. Ver, por exemplo, Aronovich et al. supra.
[0606] Transpósons exemplificativos incluem um transposon à base de pT2. Ver, por exemplo, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; e Singh etal. Cancer Res. 68.8(2008):2961-2971, todos os quais são incorporados aqui por referência. Transposases exemplificativas incluem uma transposase do tipo Tc1/mariner, por exemplo, a transposase SB10 ou a transposase SB11 (uma transposase hiperativa que pode ser expressa, por exemplo, a partir de um promotor de citomegalovírus). Ver, por exemplo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; e Grabundzija et al., todos os quais são incorporados aqui por referência.
[0607] O uso do SBTS permite integração e expressão eficientes de um transgene, por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui. São proporcionados aqui métodos de geração de uma célula, por exemplo, célula T ou célula NK, que expressa de modo estável um CAR descrito aqui, por exemplo, usando um sistema de transposon tal como SBTS.
[0608] De acordo com métodos descritos aqui, em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, plasmídeos, contendo os componentes de SBTS são administrados a uma célula (por exemplo, célula T ou NK). Por exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s) é(são) administrado(s) por métodos padrão de administração de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA plasmídico), por exemplo, métodos descritos aqui, por exemplo, eletroporação, transfecção ou lipofecção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transposon compreendendo um transgene, por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transposon compreendendo um transgene (por
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335/606 exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui) bem como uma sequência de ácido nucleico codificando uma enzima transposase. Em outras modalidades é proporcionado um sistema com dois ácidos nucleicos, por exemplo, um sistema plasmídico dual, por exemplo, em que um primeiro plasmídeo contém um transposon compreendendo um transgene, e um segundo plasmídeo contém uma sequência de ácido nucleico codificando uma enzima transposase. Por exemplo, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são coadministrados em uma célula hospedeira.
[0609] Em algumas modalidades, células, por exemplo, células T ou NK, são geradas que expressam um CAR descrito aqui por uso de uma combinação de inserção de genes usando o SBTS e edição genética usando uma nuclease (por exemplo, nucleases dedos de Zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras do Tipo Ativador da Transcrição (TALENs), o sistema CRISPR/Cas ou endonucleases de endereçamento remanipuladas por meganuclease manipulada).
[0610] Em algumas modalidades, o uso de um método não viral de administração permite a reprogramação de células, por exemplo, células T ou NK, e infusão direta das células em um sujeito. Vantagens de vetores não virais incluem, mas não se limitam à, facilidade e custo relativamente baixo da produção de quantidades suficientes requeridas para prover uma população de pacientes, estabilidade durante a armazenagem e ausência de imunogenicidade.
Construtos de Ácido Nucleico Codificando um CAR
[0611] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam um ou mais construtos de CAR descritos no presente documento. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é proporcionada como um transcrito de RNA mensageiro. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é proporcionada como um construto de DNA.
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[0612] Em conformidade, em um aspecto, a invenção se relaciona com uma molécula de ácido nucleico codificando um receptor de antígenos quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação a antígenos que se liga a um antígeno tumoral descrito aqui, um domínio de transmembrana (por exemplo, um domínio de transmembrana descrito aqui), e um domínio de sinalização intracelular (por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui) compreendendo um domínio estimulador, por exemplo, um domínio de sinalização coestimulador (por exemplo, um domínio de sinalização coestimulador descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primário (por exemplo, um domínio de sinalização primário descrito aqui, por exemplo, uma cadeia zeta descrita aqui). Em uma modalidade, o domínio de transmembrana é o domínio de transmembrana de uma proteína selecionada do grupo consistindo na cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154. Em algumas modalidades, um domínio de transmembrana pode incluir pelo menos a(s) região(ões) transmembrana, por exemplo, de KIRDS2, 0X40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1 BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp.
[0613] Em uma modalidade, o domínio de transmembrana
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337/606 compreende uma sequência de SEQ ID N2: 12, ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquela. Em uma modalidade, o domínio de ligação a antígenos é conectado ao domínio de transmembrana por uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça descrita aqui. Em uma modalidade, a região de dobradiça compreende a SEQ ID N2:4 ou SEQ ID N2:6 ou SEQ ID N2:8 ou SEQ ID N2:10, ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquelas. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada compreende adicionalmente uma sequência codificando um domínio coestimulador. Em uma modalidade, o domínio coestimulador é um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo consistindo em 0X40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278); e 4-1 BB (CD137). Exemplos adicionais de tais moléculas coestimuladoras incluem CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76 e PAG/Cbp. Em uma modalidade, o domínio coestimulador compreende uma sequência de SEQ ID N2:16, ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquela. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de 4-1 BB e um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID N2: 14 ou SEQ ID
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NQ:16, ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquelas, e a sequência de SEQ ID NQ: 18 ou SEQ ID NQ:20, ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquelas, em que as sequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas no mesmo quadro e como uma única cadeia polipeptídica.
[0614] Em outro aspecto, a invenção se relaciona com uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um construto de CAR compreendendo uma sequência líder de SEQ ID NQ: 2, um domínio scFv como descrito aqui, uma região de dobradiça de SEQ ID NQ:4 ou SEQ ID NQ:6 ou SEQ ID NQ:8 ou SEQ ID NQ:10 (ou uma sequência com 9599% de identidade com aquelas), um domínio de transmembrana tendo uma sequência de SEQ ID NQ: 12 (ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquela), um domínio coestimulador de 4-1 BB tendo uma sequência de SEQ ID NQ:14 ou um domínio coestimulador de CD27 tendo uma sequência de SEQ ID NQ:16 (ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquela), e um domínio estimulador de CD3 zeta tendo uma sequência de SEQ ID NQ:18 ou SEQ ID NQ:20 (ou uma sequência com 95-99% de identidade com aquelas).
[0615] Em outro aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico codificando uma molécula de receptor de antígenos quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação a antígenos, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio estimulador, e em que o referido domínio de ligação a antígenos se liga a um antígeno tumoral selecionado do grupo consistindo em: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL1 (CLECL1), CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL13Ra2, Mesotelina, IL-11 Ra, PSCA, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFRbeta, SSEA-4, CD20, Receptor de folato alfa, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PRSS21, PAP, ELF2M, Efrina B2,
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339/606 receptor de IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, tirosinase, EphA2, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, Receptor de folato beta, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, Ácido polissiálico, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1 a, MAGE-A1, legumaína, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, proteína do esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno relacionado com Fos 1, p53, p53 mutante, prosteina, survivina e telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, Ras mutante, hTERT, pontos de quebra de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, Receptor de andrógenos, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OYTES1, LOK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa de telomerase humana, RU1, RU2, carboxil-esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 e IGLL1.
[0616] Em uma modalidade, a molécula CAR codificada compreende ainda uma sequência codificando um domínio coestimulador. Em uma modalidade, o domínio coestimulador é um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo consistindo em 0X40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) e 4-1 BB (CD137). Em uma modalidade, o domínio coestimulador compreende uma sequência de SEQ ID NQ: 14. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana é um domínio de transmembrana de uma proteína selecionada do grupo consistindo na cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana compreende uma sequência de SEQ ID NQ:12. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um
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340/606 domínio de sinalização funcional de 4-1 BB e um domínio de sinalização funcional de zeta. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NQ: 14 e a sequência de SEQ ID NQ: 18, em que as sequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas no mesmo quadro e como uma única cadeia polipeptídica. Em uma modalidade, o domínio de ligação de anti-antígeno associado a câncer como descrito aqui é conetado ao domínio de transmembrana por uma região de dobradiça. Em uma modalidade, a região de dobradiça compreende SEQ ID NQ:4. Em uma modalidade, a região de dobradiça compreende SEQ ID NQ:6 ou SEQ ID NQ:8 ou SEQ ID NQ:10.
[0617] As sequências de ácido nucleico codificando as moléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, por rastreio de bibliotecas de células expressando o gene, por derivação do gene a partir de um vetor que é conhecido incluir o mesmo, ou por isolamento diretamente a partir de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas comuns. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido de modo sintético, em vez de ser clonado.
[0618] A presente invenção também fornece vetores nos quais é inserido um DNA da presente invenção. Vetores derivados de retrovirus tais como o lentivírus são ferramentas adequadas para alcançar transferência de genes de longo prazo, uma vez que permitem integração estável de longo prazo de um transgene e a sua propagação em células descendentes. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicional, em relação a vetores derivados de onco-retrovírus tais como vírus de leucemia murina, de poderem transduzir células não proliferativas, tais como hepatócitos. Também têm a vantagem adicional de possuírem baixa imunogenicidade. Um vetor retroviral pode também ser, por exemplo, um vetor gamarretroviral. Um vetor gamarretroviral
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341/606 pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacotamento (ψ), um local de ligação de iniciador (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR) e um transgene de interesse, por exemplo, um gene codificando um CAR. Um vetor gamarretroviral pode não ter genes estruturas virais como gag, pol e env. Vetores gamarretrovirais exemplificativos incluem Vírus da Leucemia Murina (MLV), Vírus de Formação com Foco no Baço (SFFV) e Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV) e vetores daí derivados. Outros vetores gamarretrovirais são descritos, por exemplo, em Tobias Maetzig et al., Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application Viruses, junho de 2011; 3(6): 677-713.
[0619] Em outra modalidade, o vetor compreendendo o ácido nucleico codificando o CAR desejado da invenção é um vetor adenoviral (A5/35). Em outra modalidade, a expressão de ácidos nucleicos codificando CARs pode ser alcançada usando transposons tais como Bela Adormecida, Crisper, CAS9 e nucleases dedos de zinco. Ver abaixo June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716, é incorporado aqui por referência.
[0620] Resumindo brevemente, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos codificando CARs é tipicamente alcançada por ligação operável de um ácido nucleico codificando o polipeptídeo CAR, ou suas porções, a um promotor, e incorporação do construto em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração em eucariotas. Vetores de clonagem típicos contêm terminadores da transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejada.
[0621] Os construtos de expressão da presente invenção podem também ser usados para imunização de ácido nucleico e terapia genética, usando protocolos-padrão de transferência genética. Métodos
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342/606 para transferência genética são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as Patentes U.S. NQS 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466, incorporadas aqui por referência na sua totalidade. Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de terapia genética.
[0622] O ácido nucleico pode ser clonado em vários tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, mas não se limitando a, um plasmídeo, fagemídeo, um derivado de fago, um vírus animal e um cosmídeo. Vetores de particular interesse incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sondas e vetores de sequenciamento.
[0623] Além disso, o vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia de vetores virais é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NI), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Vírus que são úteis como vetores incluem, mas não se limitam a, retrovirus, adenovirus, vírus adenoassociados, vírus herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem da replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios de endonucleases de restrição convenientes e um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Pat. U.S. NQ 6.326.193).
[0624] Um número de sistemas de base viral foi desenvolvido para transferência genética para dentro de células de mamíferos. Por exemplo, retrovirus providenciam uma plataforma conveniente para sistemas de transferência genética. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e empacotado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas da técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e transferido para células do sujeito In vivo ou ex vivo. São conhecidos na técnica vários sistemas retrovirais. Em algumas modalidades, são usados vetores de
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343/606 adenovirus. São conhecidos na técnica vários vetores de adenovirus. Em uma modalidade são usados vetores de lentivírus.
[0625] Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensificadores, regulam a frequência de iniciação transcricional. Tipicamente, estes estão localizados na região 30-110 pb a montante do sítio de início, apesar de se ter verificado que vários promotores contêm também elementos funcionais a jusante do sítio de início. O espaçamento entre elementos promotores é frequentemente flexível, de modo que a função promotora seja preservada quando elementos são invertidos ou deslocados em relação uns aos outros. No promotor de timidina quinase (tk), o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado para 50 pb antes de a atividade começar a declinar. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar cooperativa ou independentemente para ativar a transcrição. Promotores exemplificativos incluem promotores do gene IE do CMV, EF-1a, ubiquitina C ou fosfogliceroquinase (PGK).
[0626] Um exemplo de um promotor que é capaz de expressar uma molécula de ácido nucleico codificando CAR em uma célula T de mamífero é o promotor de EF1a. O promotor de EF1a nativo conduz a expressão da subunidade alfa do complexo do fator de alongamento-1, que é responsável pela administração enzimática de aminoacil-tRNAs no ribossomo. O promotor de EF1a tem sido extensamente usado em plasmídeos de expressão de mamíferos e foi mostrado que é eficaz na condução da expressão de CAR a partir de moléculas de ácidos nucleicos clonadas em um vetor lentiviral. Ver, por exemplo, Milone et aí., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Em um aspecto, o promotor de EF1 a compreende a sequência proporcionada como SEQ ID NQ: 1.
[0627] Outro exemplo de um promotor é a sequência do promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV). Esta sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de dirigir níveis
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344/606 elevados de expressão de qualquer sequência polinucleotídica operavelmente ligada a ela. No entanto, outras sequências de promotores constitutivos também podem ser usadas, incluindo, mas não se limitando ao, promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetições terminais longas (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor inicial imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos tais como, mas não se limitando a, o promotor da actina, o promotor de miosina, o promotor do fator de alongamento-ΐβ, o promotor de hemoglobina e o promotor de creatina quinase. Além disso, a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção. O uso de um promotor induzível proporciona um interruptor molecular capaz de ligar a expressão da sequência polinucleotídica que é operavelmente ligada quando tal expressão é desejada, ou de desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, um promotor da metalotioneína, um promotor de glucocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.
[0628] Um vetor também pode incluir, por exemplo, uma sequência sinal para facilitar a secreção, um sinal de poliadenilação e terminador da transcrição (por exemplo, do gene do Hormônio de Crescimento Bovino (BGH)), um elemento permitindo replicação epissômica e replicação em procariotas (por exemplo, origem do SV40 e ColE1 ou outros conhecidos na técnica) e/ou elementos para permitir a seleção (por exemplo, gene de resistência à ampicilina e/ou marcador de zeocina).
[0629] De forma a avaliar a expressão de um polipeptídeo CAR ou
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345/606 suas porções, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula pode também conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos, para facilitar identificação e seleção de células de expressão da população de células a serem transfectadas ou infectadas através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção. Tanto os marcadores selecionáveis como os genes repórter podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, tais como neo e similares.
[0630] Genes repórter são usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente no nem é expresso pelo organismo ou tecido recebedor e que codifica um polipeptideo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é avaliada em um momento adequado depois de o DNA ter sido introduzido nas células recebedoras. Genes repórter adequados podem incluir genes codificando luciferase, betagalactosidase, cloranfenicol acetil-transferase, fosfatase alcalina secretada ou o gene da proteína verde fluorescente (por exemplo, UiTei et aí., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, o construto com a região flanqueadora 5' mínima exibindo o nível mais elevado de expressão do gene repórter é identificado como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar agentes quanto à capacidade de modular a transcrição conduzida por promotores.
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[0631 ] Métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser prontamente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bacteriana, levedura ou inseto por qualquer método da técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.
[0632] Métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeamento de partículas, microinjeção, eletroporação e similares. Métodos para produzir células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NI). Um método preferencial para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira é transfecção com fosfato de cálcio.
[0633] Métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Vetores virais, e especialmente vetores retrovirais, se tornaram no método mais amplamente usado para inserir genes em células de mamífero, por exemplo, humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvirus, vírus herpes simplex I, adenovirus e vírus adenoassociados e similares. Ver, por exemplo, Patentes U.S. NQS. 5.350.674 e 5.585.362.
[0634] Meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esférulas e sistemas à base de lipídeos incluindo emulsões óleo-em-água, micélios, micélios mistos e lipossomos. Um sistema coloidal exemplificativo para uso como veículo de administração in vitro e in vivo
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347/606 é um lipossomo (por exemplo, uma vesícula membranar artificial). Outros métodos de administração dirigida de ácidos nucleicos comuns na técnica estão disponíveis, tais como administração de polinucleotídeos com nanopartículas direcionadas ou outro sistema de administração adequado à escala de submícrones.
[0635] No caso de ser utilizado um sistema de administração não viral, um veículo de administração exemplificativo é um lipossomo. O uso de formulações lipídicas é contemplado para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (/7? vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossomo, intercalado na bicamada lipídica de um lipossomo, ligado a um lipossomo via uma molécula de ligação que está associada ao lipossomo e ao oligonucleotídeo, encerrado em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com um micélio ou associado de qualquer outro modo a um lipídeo. Composições associadas a lipídeos, lipídeo/DNA ou lipídeo/vetor de expressão não se limitam a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micélios ou com uma estrutura colapsada. Também podem ser simplesmente intercaladas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes no tamanho ou forma. Lipídeos são substâncias graxas que podem ser lipídeos de ocorrência natural ou sintéticos. Por exemplo, lipídeos incluem as gotículas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonatos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos.
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[0636] Lipídeos adequados para uso podem ser obtidos de fontes comerciais. Por exemplo, dimiristil-fosfatidilcolina (DMPC) pode ser obtida da Sigma, St. Louis, MO; fosfato de dicetila (DCP) pode ser obtido da K & K Laboratories (Plainview, NI); colesterol (Choi) pode ser obtido da Calbiochem-Behring; dimiristil-fosfatidilglicerol (DMPG) e outros lipídeos podem ser obtidos da Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Soluções de estoque de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20 °C. Clorofórmio é usado como o único solvente uma vez que é mais prontamente evaporado do que metanol. Lipossomo é um termo genérico abrangendo uma variedade de veículos lipídicos uni- e multilamelares formados pela geração de bicamadas ou agregados lipídicos encerrados. Os lipossomos podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bicamada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Lipossomos multilamelares têm múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Se formam espontaneamente quando fosfolipídeos são suspensos em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e encerram água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). No entanto, composições que têm diferentes estruturas em solução relativamente à estrutura vesicular normal também estão abrangidas. Por exemplo, os lipídeos podem assumir uma estrutura micelar ou existir meramente como agregados não uniformes de moléculas lipídicas. Também são contemplados complexos lipofectamina-ácido nucleico.
[0637] Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou expor de qualquer outro modo uma célula ao inibidor da presente invenção, para confirmar a presença da sequência DNA recombinante na célula hospedeira, uma
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349/606 variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de biologia molecular bem conhecidos dos peritos na técnica, tais como transferência Southern e Northern, RT-PCR e PCR; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença ou ausência de um peptídeo particular, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e transferências Western) ou por ensaios descritos aqui para identificar agentes que caem no escopo da invenção.
[0638] A presente invenção proporciona ainda um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando CAR. Em um aspecto, um vetor CAR pode ser diretamente transduzido para dentro de uma célula, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK. Em um aspecto, o vetor é um vetor de clonagem ou expressão, por exemplo, um vetor incluindo, mas não se limitando a, um ou mais plasmideos (por exemplo, plasmideos de expressão, vetores de clonagem, minicírculos, minivetores, cromossomos double minute), construtos de vetores retrovirais e lentivirais. Em um aspecto, o vetor é capaz de expressar o construto de CAR em células efetoras imunes de mamífero (por exemplo, células T, células NK). Em um aspecto, a célula T de mamífero é uma célula T humana. Em um aspeto, a célula NK de mamífero é uma célula NK humana.
Fontes de Células
[0639] Antes da expansão e modificação genética ou outra modificação, uma fonte de células, por exemplo, células T ou células exterminadoras naturais (NK), pode ser obtida a partir de um sujeito. É pretendido que o termo sujeito inclua organismos vivos nos quais pode ser induzida uma resposta imune (por exemplo, mamíferos). Exemplos de sujeitos incluem seres humanos, macacos, chimpanzés, cães, gatos, camundongos, ratos e suas espécies transgênicas. Células T podem ser obtidas de algumas fontes, incluindo células mononucleares do
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350/606 sangue periférico, medula óssea, tecido de gânglios linfáticos, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um sítio de infecção, ascites, efusão pleural, tecido do baço e tumores.
[0640] Em certos aspectos da presente revelação, células efetoras imunes, por exemplo, células T, podem ser obtidas de uma unidade de sangue recolhido de um sujeito usando quaisquer técnicas conhecidas do perito, tais como separação com Ficoll™. Em um aspecto preferencial, células do sangue em circulação de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto da aférese contém tipicamente linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros leucócitos nucleados, eritrócitos e plaquetas. Em um aspecto, as células recolhidas por aférese podem ser lavadas para remover a fração do plasma e, opcionalmente, para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para passos de processamento subsequentes. Em uma modalidade, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem está desprovida de cálcio e pode estar desprovida de magnésio ou pode estar desprovida de muitos se não de todos os cátions divalentes.
[0641] Passos de ativação inicial na ausência de cálcio podem conduzir a ativação amplificada. Como será prontamente apreciado pelos peritos na técnica, um passo de lavagem pode ser efetuado por métodos conhecidos dos peritos na técnica, tais como por uso de um centrifugador de fluxo contínuo semiautomatizado (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, o Baxter CytoMate ou o Haemonetics Cell Saver 5) de acordo com as instruções do fabricante. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como, por exemplo, PBS sem Ca, sem Mg, PlasmaLyte A, ou outra solução salina com ou sem tampão. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra da aférese
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351/606 podem ser removidos e as células podem ser diretamente ressuspensas em meio de cultura.
[0642] É reconhecido que os métodos do pedido podem empregar condições de meio de cultura compreendendo 5% ou menos, por exemplo, 2%, de soro AB humano, e empregar condições e composições do meio de cultura conhecidas, por exemplo, as descritas em Smith et al., Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.
[0643] Em um aspecto, as células T são isoladas de linfócitos de sangue periférico por lise de glóbulos vermelhos e esgotando os monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL™ ou por elutriação centrífuga de contrafluxo.
[0644] Os métodos descritos aqui podem incluir, por exemplo, seleção de uma subpopulação específica de células efetoras imunes, por exemplo, células T, que são uma população depletada de células T reguladoras, células depletadas de CD25+, usando, por exemplo, uma técnica de seleção negativa, por exemplo, descrita aqui. Preferencialmente, a população de células depletadas de T reguladoras contém menos de 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.
[0645] Em uma modalidade, células T reguladoras, por exemplo, células T CD25+, são removidas da população usando um anticorpo anti-CD25 ou seu fragmento, ou um ligante de ligação a CD25, IL-2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD25 ou seu fragmento, ou ligante de ligação a CD25 é conjugado a um substrato, por exemplo, uma esférula, ou é revestido de outro modo sobre um substrato, por exemplo, uma esférula. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD25 ou seu fragmento é conjugado a um substrato como descrito aqui.
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[0646] Em uma modalidade, as células T reguladoras, por exemplo, células T CD25+, são removidas da população usando reagente de depleção de CD25 da Miltenyi™. Em uma modalidade, a proporção de células para reagente de depleção de CD25 é de 1e7 células para 20 uL, ou 1e7 células para 15 uL, ou 1e7 células para 10 uL, ou 1e7 células para 5 uL, ou 1 e7 células para 2,5 uL, ou 1 e7 células para 1,25 uL. Em uma modalidade, por exemplo, para células reguladoras T, é usada, por exemplo, depleção de CD25+ superior a 500 milhões de células/mL. Em um aspecto adicional, é usada uma concentração de células de 600, 700, 800 ou 900 milhões de células/mL.
[0647] Em uma modalidade, a população de células efetoras imunes a ser esgotada inclui cerca de 6 x 109 células T CD25+. Em outros aspectos, a população de células efetoras imunes a ser esgotada inclui cerca de 1 x 109a 1 x 101° células T CD25+ e qualquer valor inteiro intermédio. Em uma modalidade, a população resultante de células reguladoras T depletadas tem 2 x 109 células reguladoras T, por exemplo, células CD25+, ou menos (por exemplo, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107 ou menos células CD25+).
[0648] Em uma modalidade, as células reguladoras T, por exemplo, células CD25+, são removidas da população usando o sistema CliniMAC com um conjunto de tubulação de depleção, como, por exemplo, tubulação 162-01. Em uma modalidade, o sistema CliniMAC é executado em uma definição de depleção como, por exemplo, DEPLETION2.1.
[0649] Sem querer estar limitado por uma teoria particular, diminuir o nível de reguladores negativos de células imunes (por exemplo, diminuir o número de células imunes indesejadas, por exemplo, células Treg) em um sujeito antes de aférese ou durante fabrico de um produto de célula expressando CAR pode reduzir o risco de recaída em um sujeito. Por exemplo, métodos de esgotar células Treg são conhecidos
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353/606 na técnica. Métodos de reduzir células Treg incluem, mas não se limitam a, ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR (um anticorpo anti-GITR aqui descrito), depleção de CD25 e suas combinações.
[0650] Em algumas modalidades, os métodos de fabrico compreendem reduzir o número (por exemplo, por depleção) de células Treg antes do fabrico da célula expressando CAR. Por exemplo, métodos de fabrico compreendem contatar a amostra, por exemplo, a amostra de aférese, com um anticorpo anti-GITR e/ou um anticorpo antiCD25 (ou seu fragmento, ou um ligando de ligação de CD25), por exemplo, para esgotar células Treg antes do fabrico do produto de célula expressando CAR (por exemplo, célula T, célula NK).
[0651] Em uma modalidade, um sujeito é pré-tratado com uma ou mais terapias que reduzem células Treg antes da recolha de células para fabrico de produto de célula expressando CAR, reduzindo assim o risco de recaída do sujeito no tratamento com células expressando CAR. Em uma modalidade, métodos de reduzir células Treg incluem, mas não se limitam a, administração ao sujeito de um ou mais de ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, depleção de CD25 ou uma sua combinação. Administração de um ou mais de ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, depleção de CD25 ou uma sua combinação, pode ocorrer antes, durante ou após uma infusão do produto de célula expressando CAR.
[0652] Em uma modalidade, um sujeito é pré-tratado com ciclofosfamida antes da recolha de células para fabrico de produto de célula expressando CAR, reduzindo assim o risco de recaída do sujeito no tratamento com células expressando CAR. Em uma modalidade, um sujeito é pré-tratado com anticorpo anti-GITR antes da recolha de células para fabrico de produto de célula expressando CAR, reduzindo assim o risco de recaída do sujeito no tratamento com células expressando CAR.
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[0653] Em uma modalidade, a população de células a ser removida não consiste nas células T reguladoras nem células tumorais, mas células que afetam negativamente de qualquer outro modo a expansão e/ou função de células CART, por exemplo, células expressando CD 14, CD11b, CD33, CD15 ou outros marcadores expressos por células potencialmente imunossupressoras. Em uma modalidade, é contemplado que tais células são removidas concorrentemente com células T reguladoras e/ou células tumorais, ou após a referida depleção, ou em outra ordem.
[0654] Os métodos descritos aqui podem incluir mais do que um passo de seleção, por exemplo, mais do que um passo de depleção. O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser alcançado, por exemplo, com uma combinação de anticorpos dirigidos para marcadores de superfície únicos às células negativamente selecionadas. Um método consiste em triagem e/ou seleção de células via imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais dirigidos para marcadores da superfície celular presentes nas células negativamente selecionadas. Por exemplo, para enriquecimento quanto a células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais pode incluir anticorpos para CD14, CD20, CD11 b, CD16, HLA-DR e CD8.
[0655] Os métodos descritos aqui podem adicionalmente incluir remover células da população que expressam um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno tumoral que não compreende CD25, por exemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 ou CD11b, para assim proporcionar uma população depletada de T reguladoras, por exemplo, depletada de CD25+, e células depletadas de antigenos tumorais que são adequadas para expressão de um CAR, por exemplo, um CAR descrito aqui. Em uma modalidade, células expressando antigenos tumorais são removidas simultaneamente com as células T
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355/606 reguladoras, por exemplo, CD25+. Por exemplo, um anticorpo antiCD25 ou seu fragmento, e um anticorpo anti-antígeno tumoral ou seu fragmento, podem ser ligados ao mesmo substrato, por exemplo, esférula, que pode ser usado para remover as células ou um anticorpo anti-CD25 ou seu fragmento, ou o anticorpo anti-antígeno tumoral ou seu fragmento, pode ser ligado a esférulas separadas, uma mistura das quais pode ser usada para remover as células. Em outras modalidades, a remoção de células T reguladoras, por exemplo, células CD25+, e a remoção das células expressando antígeno tumoral são sequenciais, e podem ocorrer, por exemplo, em qualquer ordem.
[0656] Também são fornecidos métodos que incluem remover células da população que expressam um inibidor de ponto de verificação, por exemplo, um inibidor de ponto de verificação aqui descrito, por exemplo, uma ou mais de células PD1+, células LAG3+ e células TIM3+, para assim fornecer uma população de células reguladoras T depletadas, por exemplo, células depletadas quanto a CD25+, e células depletadas de inibidor de ponto de verificação, por exemplo, células depletadas de PD1+, LAG3+ e/ou TIM3+. Inibidores de pontos de verificação exemplificativos incluem B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM3 e/ou CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA e LAIR1. Em uma modalidade, células expressando inibidor de pontos de verificação são removidas simultaneamente com as células T reguladoras, por exemplo, CD25+. Por exemplo, um anticorpo anti-CD25 ou seu fragmento, e um anticorpo anti-inibidor de pontos de verificação ou seu fragmento, pode ser ligado à mesma esférula que pode ser usada para remover as células, ou um anticorpo anti-CD25 ou seu fragmento, e o anticorpo anti-inibidor de pontos de verificação ou seu fragmento, podem ser ligados a esférulas separadas, uma mistura das quais pode ser usada para remover as células. Em outras modalidades, a remoção
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356/606 de células T reguladoras, por exemplo, células CD25+, e a remoção das células expressando inibidor de pontos de verificação são sequenciais, e podem ocorrer, por exemplo, em qualquer ordem.
[0657] Os métodos descritos no presente documento podem incluir uma etapa de seleção positiva. Por exemplo, células T podem ser isoladas por incubação com esférulas conjugadas a anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, 3x28), tais como T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450, durante um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células T desejadas. Em uma modalidade, o período de tempo é cerca de 30 minutos. Em uma modalidade adicional, o período de tempo varia desde 30 minutos até 36 horas ou mais e todos os valores inteiros entre aqueles. Em uma modalidade adicional, o período de tempo é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Ainda em outra modalidade, o período de tempo é 10 até 24 horas, por exemplo, 24 horas. Tempos de incubação mais longos podem ser usados para isolar células T em qualquer situação em que haja poucas células T em comparação com outros tipos de células, tais como no isolamento de linfócitos infiltrantes em tumores (TIL) de tecido tumoral ou de indivíduos imunocomprometidos. Além disso, o uso de tempos de incubação mais longos pode aumentar a eficiência da captura de células T CD8+. Assim, simplesmente encurtando ou prolongando o tempo em que células T são deixadas se ligar às esférulas CD3/CD28 e/ou aumentando ou decrescendo a razão entre esférulas e células T (como adicionalmente descrito aqui), subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecionadas positiva ou negativamente na iniciação da cultura ou em outros momentos durante o processo. Adicionalmente, aumentando ou decrescendo a razão de anticorpos anti-CD3 e/ou antiCD28 nas esférulas ou outra superfície, subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecionadas positiva ou negativamente na iniciação da cultura ou em outros momentos desejados.
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[0658] Em uma modalidade, pode ser selecionada uma população de células T que expressa um ou mais de IFN-v, TNFa, IL-17A, IL-2, IL3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B e perforina, ou outras moléculas apropriadas, por exemplo, outras citocinas. Métodos de rastreio da expressão de células podem ser determinados, por exemplo, pelos métodos descritos na Publicação PCT No.: WO 2013/126712.
[0659] Para isolamento de uma população desejada de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partículas, tais como esférulas) podem ser variadas. Em certos aspectos, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual esférulas e células são misturadas em conjunto (por exemplo, aumentar a concentração de células), para assegurar contato máximo de células e esférulas. Por exemplo, em um aspecto, é usada uma concentração de 10 bilhões de células/mL, 9 bilhões/mL, 8 bilhões/mL, 7 bilhões/mL, 6 bilhões/mL ou 5 bilhões/mL. Em um aspecto, uma concentração de 1 bilhão de células/mL é usada. Ainda em um aspecto, uma concentração de células desde 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/mL é usada. Em aspectos adicionais, concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL podem ser usadas.
[0660] O uso de concentrações elevadas pode resultar em rendimento de células, ativação de células e expansão de células aumentados. Além disso, o uso de elevadas concentrações de células permite uma captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente antígenos-alvo de interesse, tais como células T negativas para CD28, ou de amostras onde estão presentes muitas células tumorais (por exemplo, sangue leucêmico, tecido tumoral, etc.). Tais populações de células podem ter valor terapêutico e será desejável obter as mesmas. Por exemplo, o uso de uma concentração elevada de células permite uma seleção mais eficiente de células T CD8+ que
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358/606 normalmente têm expressão mais fraca de CD28.
[0661] Em um aspecto relacionado, pode ser desejável usar concentrações menores de células. Ao diluir significativamente a mistura de células T e superfície (por exemplo, partículas tais como esférulas), interações entre as partículas e células são minimizadas. Tal seleciona células que expressam quantidades elevadas de antigenos desejados a serem ligados às partículas. Por exemplo, células T CD4+ expressam níveis mais elevados de CD28 e são mais eficientemente capturadas do que células T CD8+ em concentrações diluídas. Em um aspecto, a concentração de células usada é 5 x 106/ml_. Em outros aspectos, a concentração usada pode ir desde cerca de 1 x 105/mL até 1 x 106/ml_, e qualquer valor inteiro entre aqueles.
[0662] Em outros aspectos, as células podem ser incubadas em um rotador durante extensões de tempo variáveis a velocidades variáveis a 2-10°C ou à temperatura ambiente.
[0663] Células T para estimulação também podem ser congeladas após um passo de lavagem. Sem pretender ficar restringido pela teoria, o passo de congelação e descongelação subsequente proporciona um produto mais uniforme por remoção de granulócitos e, em alguma extensão, monócitos da população de células. Após o passo de lavagem, que remove plasma e plaquetas, as células podem ser suspensas em uma solução de congelação. Não obstante muitas soluções e parâmetros de congelação serem conhecidos na técnica e serem úteis neste contexto, um método envolve usar PBS contendo DMSO 20% e albumina do soro humano 8%, ou meio de cultura contendo Dextrano 40 10% e Dextrose 5%, Albumina de Soro Humano 20% e DMSO 7,5% ou Plasmalyte-A 31,25%, Dextrose 5% 31,25%, NaCI 0,45%, Dextrano 40 10% e Dextrose 5%, Albumina do Soro Humano 20% e DMSO 7,5% ou outro meio de congelação de células adequado contendo, por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, as células
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359/606 são então congeladas para -80°C a uma velocidade de 1o por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenagem de nitrogênio líquido. Outros métodos de congelação controlada podem ser usados, bem como congelação descontrolada imediatamente a -20°C ou em nitrogênio líquido.
[0664] Em certos aspectos, células crioconservadas são descongeladas e lavadas como descrito aqui e deixadas repousar durante uma hora à temperatura ambiente antes da ativação usando os métodos da presente invenção.
[0665] Também é contemplada, no contexto da invenção, a recolha de amostras de sangue ou produto de aférese de um sujeito em um período de tempo antes de poderem ser necessárias as células expandidas como descrito aqui. Como tal, a fonte das células a serem expandidas pode ser recolhida em qualquer instante necessário, e células desejadas, tais como células T, podem ser isoladas e congeladas para uso posterior em terapia com células efetoras imunes para quaisquer doenças ou afecções que beneficiem da terapia com células efetoras imunes, tais como as descritas aqui. Em um aspecto, uma amostra de sangue ou uma aférese é recolhida de um sujeito geralmente saudável. Em certos aspectos, uma amostra de sangue ou uma aférese é recolhida de um sujeito geralmente saudável que está em risco de desenvolver uma doença, mas que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em certos aspectos, as células T podem ser expandidas, congeladas, e usadas em um instante posterior. Em certos aspectos, amostras são recolhidas de um paciente pouco tempo após o diagnóstico de uma doença particular como descrito aqui, mas antes de quaisquer tratamentos. Em um aspecto adicional, as células são isoladas de uma amostra de sangue ou uma aférese de um sujeito antes de quaisquer modalidades de tratamento relevantes, incluindo, mas não
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360/606 se limitando a, tratamento com agentes tais como natalizumab, efalizumab, agentes antivirais, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, e FK506, anticorpos ou outros agentes de imunoablação tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiação.
[0666] Em um aspecto adicional da presente invenção, células T são obtidas de um paciente diretamente após tratamento que deixa o sujeito com células T funcionais. A este respeito, foi observado que, após certos tratamentos para câncer, em particular tratamentos com fármacos que danificam o sistema imune, pouco tempo após o tratamento e durante o período no qual pacientes estão normalmente recuperando do tratamento, a qualidade de células T obtidas pode ser ótima ou melhorada quanto à sua capacidade de expansão ex vivo. De igual modo, após manipulação ex vivo usando os métodos descritos aqui, estas células podem estar em um estado preferencial para enxertia e expansão in vivo intensificadas. Assim, é contemplado, no contexto da presente invenção, recolher células sanguíneas, incluindo células T, células dendriticas, ou outras células da linhagem hematopoiética, durante esta fase de recuperação. Além disso, em certos aspectos, regimes de mobilização (por exemplo, mobilização com GM-CSF) e condicionamento podem ser usados para criar uma condição em um sujeito em que repopulação, recirculação, regeneração e/ou expansão de tipos de células particulares são favorecidos, especialmente durante uma janela de tempo definida após terapia. Tipos de células ilustrativos incluem células T, células B, células dendriticas e outras células do sistema imune.
[0667] Em uma modalidade, as células imunoefetoras que expressam uma molécula CAR, por exemplo, uma molécula CAR
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361/606 descrita no presente documento, são obtidas a partir de um sujeito que recebeu uma dose baixa intensificadora de imunidade de um inibidor de mTOR. Em uma modalidade, a população de células imunoefetoras, por exemplo, células T, a ser manipulada para expressar um CAR, é coletada após um tempo suficiente ou após dosagem suficiente de baixa dose de intensificação imune de um inibidor de mTOR, de modo que o nível de células efetoras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T, ou a razão de células efetoras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T/células efetoras imunes positivas para PD1, por exemplo, células T, no sujeito ou coletadas do sujeito foi, pelo menos temporariamente, aumentada.
[0668] Em outras modalidades, a população de células efetoras imunes, por exemplo, células T, que foi ou será manipulada para expressar um CAR, pode ser tratada ex vivo por contato com uma quantidade de um inibidor de mTOR que aumenta o número de células efetoras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T, ou aumenta a razão de células efetoras imunes negativas para PD1, por exemplo, células T/células efetoras imunes positivas para PD1, por exemplo, células T.
[0669] Em uma modalidade, uma população de células T é deficiente em diaglicerol quinase (DGK). Células deficientes em DGK incluem células que não expressam RNA ou proteína de DGK, ou têm atividade de DGK reduzida ou inibida. Células deficientes em DGK podem ser geradas por abordagens genéticas, por exemplo, administração de agentes de interferência de RNA, por exemplo, siRNA, shRNA, miRNA, para reduzir ou prevenir a expressão de DGK. Alternativamente, células deficientes em DGK podem ser geradas por tratamento com inibidores de DGK descritos aqui.
[0670] Em uma modalidade, uma população de células T é deficiente em Ikaros. Células deficientes em Ikaros incluem células que
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362/606 não expressam RNA ou proteína de Ikaros, ou têm atividade de Ikaros reduzida ou inibida, células deficientes em Ikaros podem ser geradas por abordagens genéticas, por exemplo, administração de agentes de interferência de RNA, por exemplo, siRNA, shRNA, miRNA, para reduzir ou prevenir a expressão de Ikaros. Alternativamente, células deficientes em Ikaros podem ser geradas por tratamento com inibidores de Ikaros, por exemplo, lenalidomida.
[0671] Em modalidades, uma população de células T é deficiente em DGK e deficiente em Ikaros, por exemplo, não expressa DGK nem Ikaros, ou tem atividade de DGK e Ikaros reduzida ou inibida. Tais células deficientes em DGK e Ikaros podem ser geradas por quaisquer dos métodos descritos aqui.
[0672] Em uma modalidade, as células NK são obtidas do sujeito. Em outra modalidade, as células NK são uma linhagem de células NK, por exemplo, linhagem de células NK-92 (Conkwest).
CAR Alogeneico
[0673] Em modalidades descritas aqui, a célula efetora imune pode ser uma célula efetora imune alogeneica, por exemplo, célula T ou célula NK. Por exemplo, a célula pode ser uma célula T alogeneica, por exemplo, uma célula T alogeneica desprovida de expressão de um receptor de células T (TCR) e/ou antígeno leucocitário humano (HLA) funcionais, por exemplo, HLA de classe I e/ou HLA de classe II.
[0674] Uma célula T desprovida de um TCR funcional pode ser manipulada, por exemplo, de modo que não expressa nenhum TCR funcional na sua superfície, manipulada de modo que não expressa uma ou mais subunidades que compreendem um TCR funcional ou manipulada de modo que produz muito pouco TCR funcional na sua superfície. Alternativamente, a célula T pode expressar um TCR substancialmente enfraquecido, por exemplo, por expressão de formas mutadas ou truncadas de uma ou mais das subunidades do TCR. O
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363/606 termo TCR substancialmente enfraquecido significa que este TCR não irá induzir uma reação imune adversa em um hospedeiro.
[0675] Uma célula T descrita aqui pode ser manipulada, por exemplo, de modo que não expressa um HLA funcional na sua superfície. Por exemplo, uma célula T descrita aqui pode ser manipulada de modo que o HLA de expressão na superfície celular, por exemplo, HLA de classe I e/ou HLA de classe II, é subregulado.
[0676] Em algumas modalidades, a célula T pode estar desprovida de um TCR funcional e um HLA funcional, por exemplo, HLA de classe I e/ou HLA de classe II.
[0677] Células T modificadas desprovidas de expressão de um TCR e/ou HLA funcionais podem ser obtidas por quaisquer meios adequados, incluindo um nocaute ou silenciamento de uma ou mais subunidades do TCR ou HLA. Por exemplo, a célula T pode incluir um silenciamento de TCR e/ou HLA usando siRNA, shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intervaladas (CRISPR), nuclease efetora do tipo ativador da transcrição (TALEN), ou endonuclease dedos de zinco (ZFN).
[0678] Em algumas modalidades, a célula alogeneica pode ser uma célula que não expressa ou expressa em níveis baixos uma molécula inibidora, por exemplo, por qualquer método descrito aqui. Por exemplo, a célula pode ser uma célula que não expressa ou expressa em níveis baixos uma molécula inibidora, por exemplo, que pode decrescer a capacidade de uma célula expressando CAR para montar uma resposta efetora imune. Os exemplos de moléculas inibidoras incluem PD1, PDL1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGF beta. A inibição de uma molécula inibidora, por exemplo, por inibição ao nível do DNA, RNA ou proteína, pode otimizar o desempenho de uma célula expressando CAR. Em modalidades, pode
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364/606 ser usado um ácido nucleico inibidor, por exemplo, um ácido nucleico inibidor, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intervaladas (CRISPR), uma nuclease efetora do tipo ativador da transcrição (TALEN), ou uma endonuclease dedos de zinco (ZFN), por exemplo, como descrito aqui.
siRNA e shRNA para inibir TCR ou HLA
[0679] Em algumas modalidades, a expressão de TCR e/ou expressão de HLA podem ser inibidas usando siRNA ou shRNA que visa um ácido nucleico codificando um TCR e/ou HLA em uma célula T. [0680] A expressão de siRNA e shRNAs em células T pode ser alcançada com o uso de qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, tal como um sistema de expressão lentiviral.
[0681 ] Os shRNAs exemplificativos que regulam decrescentemente a expressão de componentes do TCR são descritos, por exemplo, na Publicação NQ US: 2012/0321667. O siRNA e shRNA exemplificativos que regulam decrescentemente a expressão de genes HLA de classe I e/ou HLA de classe II são descritos, por exemplo, na publicação NQ U.S.: US 2007/0036773.
CRISPR para inibir TCR ou HLA
[0682] CRISPR ou CRISPR para TCR e/ou HLA ou CRISPR para inibir TCR e/ou HLA, como usado aqui, se refere a um conjunto de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intervaladas, ou um sistema compreendendo tal conjunto de repetições. Cas, como usado aqui, se refere a uma proteína associada à CRISPR. Um sistema CRISPR/Cas se refere a um sistema derivado de CRISPR e Cas que pode ser usado para silenciar ou mutar um gene TCR e/ou HLA.
[0683] Os sistemas CRISPR/Cas de ocorrência natural são encontrados em aproximadamente 40% dos genomas de eubactérias
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365/606 sequenciados e 90% das Archaea sequenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema é um tipo de sistema imune procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos, tais como plasmídeos e fagos, e proporciona uma forma de imunidade adquirida. Barrangou etal. (2007) Science 315:1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845.
[0684] O sistema CRISPR/Cas foi modificado para uso na edição de genes (silenciamento, intensificação ou alteração de genes específicos) em eucariotas, tais como camundongos ou primatas. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Tal é alcançado introduzindo na célula eucariótica um plasmídeo contendo um CRISPR especificamente projetado e um ou mais Cas apropriados.
[0685] A sequência CRISPR, algumas vezes chamada de lócus CRISPR, compreende repetições e espaçadores alternados. Em uma CRISPR de ocorrência natural, os espaçadores compreendem usualmente sequências estranhas à bactéria, tais como uma sequência de plasmídeo ou fago; no sistema CRISPR/Cas para TCR e/ou HLA, os espaçadores são derivados da sequência do gene TCR ou HLA.
[0686] RNA do lócus CRISPR é constitutivamente expresso e processado por proteínas Cas em pequenos RNAs. Os mesmos compreendem um espaçador flanqueado por uma sequência de repetição. Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos ao nível do RNA ou DNA. Horvath etal. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Assim, os espaçadores servem de modelos para moléculas de RNA, analogamente a siRNAs. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.
[0687] À medida queos mesmos ocorrem naturalmente em muitos tipos diferentes de bactérias, as disposições exatas do CRISPR e estrutura, função e número de genes Cas e seu produto diferem de algum modo de espécie para espécie. Haft etal. (2005) PLoS Comput.
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Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica etal. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 25512561; Pourcel etal. (2005) Microbiol. 151: 653-663; e Stern etal. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340. Por exemplo, as proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por exemplo, CasA) formam um complexo funcional, Cascata, que processa transcritos de RNA de CRISPR em unidades espaçador-repetição de que a Cascata retém. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. Em outros procariotas, Cas6 processa o transcrito de CRISPR. A inativação fágica baseada em CRISPR em E. coli exige Cascata e Cas3, mas não Cas1 ou Cas2. As proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) em Pyrococcus furiosus e outros procariotas formam um complexo funcional com pequenos RNAs de CRISPR que reconhece e cliva RNAs-alvo complementares. Um sistema CRISPR mais simples depende da proteína Cas9, que é uma nuclease com dois sítios de corte ativos, um para cada fita da hélice dupla. Combinando Cas9 e lócus de CRISPR modificado, o RNA pode ser usado em um sistema para edição de genes. Pennisi (2013) Science 341: 833-836. [0688] Assim, o sistema CRISPR/Cas pode ser usado para editar um gene TCR e/ou HLA (adicionando ou deletando um par de bases) ou introduzir uma terminação prematura que, assim, decresce a expressão de um TCR e/ou HLA. O sistema CRISPR/Cas pode ser alternativamente usado como interferência de RNA, desativando o gene TCR e/ou HLA de uma maneira reversível. Em uma célula de mamífero, por exemplo, o RNA pode guiar a proteína Cas para um promotor de TCR e/ou HLA, bloqueando estericamente RNA polimerases.
[0689] Podem ser gerados sistemas CRISPR/Cas artificiais que inibem TCR e/ou HLA, usando tecnologia conhecida na técnica, por exemplo, a descrita na Publicação U.S. NQ. 20140068797, e Cong (2013) Science 339: 819-823. Também podem ser gerados outros sistemas CRISPR/Cas artificiais, que são conhecidos na técnica, que
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367/606 inibem TCR e/ou HLA, por exemplo, o descrito em Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, Patente U.S. N2.: 8.871.445; 8.865.406; 8.795.965; 8.771.945; e 8.697.359.
TALEN para inibir TCR e/ou HLA
[0690] TALEN ou TALEN para HLA e/ou TCR ou TALEN para inibir HLA e/ou TCR refere-se a uma nuclease efetora do tipo ativador da transcrição, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene HLA e/ou TCR.
[0691] TALENs são produzidas artificialmente fundindo um domínio de ligação de DNA efetor TAL a um domínio de divagem de DNA. Efeitos do tipo ativador da transcrição (TALEs) podem ser modificados para se ligarem a qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma porção do gene HLA ou TCR. Combinando um TALE modificado com um domínio de divagem de DNA, uma enzima de restrição pode ser produzida que é específica para qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma sequência de HLA ou TCR. Estas podem, então, ser introduzidas em uma célula onde podem ser usadas para edição de genoma. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; e Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou etal. (2009) Science 326: 3501.
[0692] TALEs são proteínas secretadas por bactérias Xanthomonas. O domínio de ligação de DNA contém uma sequência de 33-34 aminoácidos altamente conservada repetida, com a exceção do 122 e 132 aminoácidos. Essas duas posições são altamente variáveis, mostrando uma correlação forte com reconhecimento de nucleotídeos específico. Estas podem ser, assim, manipuladas para se ligarem a uma sequência de DNA desejada.
[0693] Para produzir uma TALEN, uma proteína TALE é fundida a uma nuclease (N), que é uma endonuclease Fokl do tipo selvagem ou com mutação. Diversas mutações a Fokl foram realizadas para seu uso em TALENs; essas, por exemplo, aprimoram a especificidade ou
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368/606 a atividade de divagem. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; e Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.
[0694] O domínio Fokl funciona como um dimero, exigindo dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma-alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto ο número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação de DNA de TALE e o domínio de divagem de Fokl quanto o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais parecem ser parâmetros importantes para atingir níveis altos de atividade. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.
[0695] Uma TALEN HLA ou TCR pode ser usado dentro de uma célula para produzir uma quebra de fita dupla (DSB). Uma mutação pode ser introduzida no sítio de quebra se os mecanismos de reparo repararem inadequadamente a quebra por meio da união de extremidades não homólogas. Por exemplo, o reparo inadequado pode introduzir uma mutação de deslocamento de quadro. Alternativamente, DNA estranho pode ser introduzido na célula juntamente com a TALEN; dependendo das sequências do DNA estranho e da sequência cromossômica, esse processo pode ser usado para corrigir um defeito no gene HLA ou TCR ou introduz um defeito em um gene HLA ou TCR ts, diminuindo, assim, a expressão de HLA ou TCR.
[0696] TALENs específicas para as sequências em HLA ou TCR podem ser construídas com o uso de qualquer método conhecido na técnica, incluindo vários esquemas com o uso de componentes modulares. Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.
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Nuclease dedo de zinco para inibir HLA e/ou TCR
[0697] ZFN ou Nuclease de Dedo de Zinco ou ZFN para HLA e/ou TCR ou ZFN para inibir HLA e/ou TCR refere-se a uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene HLA e/ou TCR.
[0698] Como uma TALEN, uma ZFN compreende um domínio de nuclease de Fokl (ou derivado do mesmo) fundido a um domínio de ligação a DNA. No caso de uma ZFN, o domínio de ligação a DNA compreende um ou mais dedos de zinco. Carroll etal. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; e Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.
[0699] Um dedo de zinco é um motivo estrutural de proteína pequena estabilizado por um ou mais íons de zinco. Um dedo de zinco pode compreender, por exemplo, Cys2His2, e pode reconhecer uma sequência de aproximadamente 3 pb. Vários dedos de zinco de especificidade conhecida podem ser combinados para produzir polipeptídeos de múltiplos dedos que reconhecem sequências de cerca de 6, 9, 12, 15 ou 18 pares de bases. Várias técnicas de seleção e montagem modular estão disponíveis para gerar dedos de zinco (e combinações dos mesmos) que reconhecem sequências específicas, incluindo exibição em fagos, sistemas de um híbrido de levedura, sistemas de um híbrido e dois híbridos bacterianos e células de mamífero.
[0700] Como uma TALEN, uma ZFN precisa dimerizar para clivar DNA. Assim, um par de ZFNs é necessário para visar sítios de DNA não palindrômicos. As duas ZFNs individuais precisam se ligar a fitas opostas do DNA com suas nucleases adequadamente afastadas. Bitinaite etal. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5.
[0701] Além disso, como uma TALEN, uma ZFN pode criar uma quebra de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de
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370/606 deslocamento de quadro se reparada inadequadamente, levando a uma diminuição na expressão e na quantidade de HLA e/ou TCR em uma célula. As ZFNs podem ser também usadas com recombinação homóloga para gerar mutação no gene HLA ou TCR.
[0702] ZFNs específicas para as sequências em HLA e/ou TCR podem ser construídas com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122:1341-1349; Cathomen etal. (2008) Mol. Ther. 16:1200-7; Guo etal. (2010) J. Mol. Biol. 400:96; Publicação de Patente U.S. 2011/0158957; e Publicação de Patente U.S. 2012/0060230.
Expressão de Telomerase
[0703] Não pretendendo ficar restringido por qualquer teoria particular, em algumas modalidades, uma célula T terapêutica tem persistência de curta duração em um paciente, devido a telômeros encurtados na célula T; em conformidade, transfecção com um gene de telomerase pode estender os telômeros da célula T e melhorar a persistência da célula T no paciente. Ver Carl June, Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Assim, em uma modalidade, uma célula efetora imune, por exemplo, uma célula T, expressa ectopicamente uma subunidade de telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica de telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. Em alguns aspectos, esta revelação proporciona um método de produção de uma célula expressando CAR, compreendendo contatar uma célula com um ácido nucleico codificando uma subunidade de telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica de telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. A célula pode ser contatada com o ácido nucleico antes, simultaneamente ou depois de ser contatada com um construto codificando um CAR.
[0704] Em um aspecto, a revelação apresenta um método de
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371/606 preparação de uma população de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK). Em uma modalidade, o método compreende: proporcionar uma população de células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK), contatar a população de células efetoras imunes com um ácido nucleico codificando um CAR; e contatar a população de células efetoras imunes com um ácido nucleico codificando uma subunidade de telomerase, por exemplo, hTERT, sob condições que permitem a expressão do CAR e telomerase.
[0705] Em uma modalidade, o ácido nucleico codificando a subunidade de telomerase é DNA. Em uma modalidade, o ácido nucleico codificando a subunidade de telomerase compreende um promotor capaz de conduzir a expressão da subunidade de telomerase. [0706] Em uma modalidade, hTERT tem a sequência de aminoácidos do GenBank Proteína ID AAC51724.1 (Meyerson et al., hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is UpRegulated in Tumor Cells and during Immortalization Cell Volume 90, Fascicule 4, 22 de agosto de 1997, Páginas 785-795) como se segue: MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVA QCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALL
DGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARC ALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVR EAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPG RTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSR PPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETI FLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLR AAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPΕΕEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRAC LRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWL RRS PGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRS FFYVTE TT FQKNR LFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFI PKPDGLRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLL GASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEV
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IASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHL QETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIP QGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFL RTLVRGVPEYGCWNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLD TRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLD LQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTA SLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPL LGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NQ:63) [0707] Em uma modalidade, a hTERT tem uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NQ: 63. Em uma modalidade, a hTERT tem uma sequência de SEQ ID NQ: 63. Em uma modalidade, a hTERT compreende uma deleção (por exemplo, de não mais do que 5, 10, 15, 20 ou 30 aminoácidos) no N terminal, no C terminal ou ambos. Em uma modalidade, a hTERT compreende uma sequência de aminoácidos transgênica (por exemplo, com não mais do que 5, 10, 15, 20 ou 30 aminoácidos) no N terminal, no C terminal ou ambos.
[0708] Em uma modalidade, a hTERT é codificada pela sequência de ácido nucleico de GenBank NQ de Acesso AF018167 (Meyerson et al., hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells e during Immortalization Cell Volume 90, Fascicule 4, 22 de agosto de 1997, Páginas 785-795):
caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac egegaggtge
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc etgeetgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gegegaagaa cgtgctggcc tteggetteg
361 egetgetgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg egaegaegtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
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601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
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2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa (SEQ ID Ne: 64)
[0709] Em uma modalidade, a hTERT é codificada por um ácido nucleico tendo uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID Ns: 64. Em uma modalidade, a hTERT é codificada por um ácido nucleico de SEQ ID Ns: 64.
Ativação e Expansão de Células Efetoras Imunes (por exemplo, Células T)
[0710] Células efetoras imunes, tais como células T, podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes N22 U.S. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7,144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.32.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6,867,041; e Publicação do Pedido de Patente N2 U.S. 20060121005.
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[0711] Geralmente, uma população de células efetoras imunes, por exemplo, células depletadas de células T reguladoras, pode ser expandida por contato com uma superfície tendo ligado um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligante que estimula uma molécula coestimuladora na superfície das células T. Em particular, populações de células T podem ser estimuladas como descrito aqui, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou seu fragmento de ligação a antigenos, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície, ou por contato com um ativador de proteína quinase C (por exemplo, briostatina) em conjunção com um ionóforo de cálcio. Para a coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T é usado um ligante que se liga à molécula acessória. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T. Para estimular a proliferação de células T CD4+ ou células T CD8+, podem ser usados um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, França) que podem ser usados, bem como outros métodos habitualmente conhecidos na técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen etal., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
[0712] Em certos aspectos, o sinal estimulador primário e o sinal coestimulador para a célula T podem ser proporcionados por protocolos diferentes. Por exemplo, os agentes proporcionando cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem estar acoplados à mesma superfície (isto é, em formação cis) ou a superfícies separadas (isto é, em formação trans). Alternativamente, um agente pode estar acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em um aspecto, o agente
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376/606 proporcionando o sinal coestimulador está ligado a uma superfície celular e o agente proporcionando o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em certos aspectos, os dois agentes podem estar em solução. Em um aspecto, os agentes podem estar em forma solúvel, e então serem reticulados a uma superfície, tal como uma célula expressando receptores de Fc ou um anticorpo ou outro agente de ligação que irá se ligar aos agentes. Nesse sentido, ver, por exemplo, Publicações dos Pedidos de Patentes N22 U.S. 20040101519 e 20060034810 quanto a células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e expansão de células T na presente invenção.
[0713] Em um aspecto, os dois agentes são imobilizados em esférulas, na mesma esférula, isto é, cis ou em esférulas separadas, isto é, trans. A título exemplificativo, o agente proporcionando o sinal de ativação primário é um anticorpo anti-CD3 ou um seu fragmento de ligação a antígenos e o agente proporcionando o sinal coestimulador é um anticorpo anti-CD28 ou seu fragmento de ligação a antígenos; e os dois agentes são coimobilizados na mesma esférula em quantidades moleculares equivalentes. Em um aspecto, é usada uma razão 1:1 de cada anticorpo ligado às esférulas para expansão de células T CD4+ e crescimento de células T. Em certos aspectos da presente invenção, é usada uma razão de anticorpos anti CD3:CD28 ligados às esférulas de modo a ser observado um aumento da expansão de células T em comparação com a expansão observada usando uma razão de 1:1. Em um aspecto particular, um aumento de cerca de 1 a cerca de 3 vezes é observado em comparação com a expansão observada usando uma razão de 1:1. Em um aspecto, a razão de anticorpos para CD3:CD28 ligados às esférulas varia desde 100:1 até 1:100 e todos os valores inteiros entre estes. Em um aspecto, mais anticorpo anti-CD28 é ligado às partículas do que anticorpo anti-CD3, isto é, a razão de CD3:CD28 é
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377/606 menor do que um. Em certos aspectos, a razão de anticorpo anti-CD28 para anticorpo anti-CD3 ligados às esférulas é maior do que 2:1. Em um aspecto particular, é usada uma razão 1:100 de CD3:CD28 de anticorpos ligados a esférulas. Em um aspecto é usada uma razão 1:75 de CD3:CD28 de anticorpos ligados a esférulas. Em um aspecto adicional, é usada uma razão 1:50 de CD3:CD28 de anticorpos ligados a esférulas. Em um aspecto, é usada uma razão 1:30 de CD3:CD28 de anticorpos ligados a esférulas. Em um aspecto preferencial, é usada uma razão 1:10 de CD3:CD28 de anticorpos ligados a esférulas. Em um aspecto, é usada uma razão 1:3 de CD3:CD28 de anticorpos ligados às esférulas. Ainda em um aspecto, é usada uma razão 3:1 de CD3:CD28 de anticorpos ligados às esférulas.
[0714] Razões de partículas para células desde 1:500 até 500:1 e quaisquer valores inteiros entre estes podem ser usadas para estimular células T ou outras células-alvo. Como será prontamente apreciado pelos peritos na técnica, a razão de partículas para células pode depender do tamanho das partículas relativamente à célula-alvo. Por exemplo, esférulas de pequeno tamanho podem ligar somente algumas células, ao passo que esférulas maiores podem ligar muitas. Em certos aspectos, a razão de células para partículas varia desde 1:100 até 100:1 e quaisquer valores inteiros entre estes e, em aspectos adicionais, a razão compreende 1:9 até 9:1 e quaisquer valores inteiros entre estes também podem ser usados para estimular células T. A razão de partículas acopladas a anti-CD3 e anti-CD28 para células T que resulta em estimulação de células T pode variar como notado acima, no entanto, certos valores preferenciais incluem 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10,1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1, 7:1,8:1,9:1,10:1 e 15:1, com uma razão preferencial sendo pelo menos 1:1 partículas por célula T. Em um aspecto é usada uma razão de partículas para células de 1:1 ou menos. Em um aspecto particular, uma
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378/606 razão preferencial partícula:célula é 1:5. Em aspectos adicionais, a razão de partículas para células pode ser variada dependendo do dia da estimulação. Por exemplo, em um aspecto, a razão de partículas para células vai desde 1:1 até 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células todos os dias ou em dias alternados daí em diante durante um período até 10 dias, a razões finais desde 1:1 até 1:10 (com base em contagens de células no dia da adição). Em um aspecto particular, a razão de partículas para células é 1:1 no primeiro dia da estimulação e é ajustada para 1:5 no terceiro e quinto dias da estimulação. Em um aspecto, partículas são adicionadas em uma base diária ou de dias alternados para uma razão final de 1:1 no primeiro dia, e 1:5 no terceiro e quinto dias da estimulação. Em um aspecto, a razão de partículas para células é 2:1 no primeiro dia da estimulação e é ajustada para 1:10 no terceiro e quinto dias da estimulação. Em um aspecto, partículas são adicionadas em uma base diária ou de dias alternados para uma razão final de 1:1 no primeiro dia, e 1:10 no terceiro e quinto dias da estimulação. O perito na técnica perceberá que uma variedade de outras razões pode ser adequadas para uso na presente invenção. Em particular, as razões irão variar dependendo do tamanho das partículas e do tamanho e tipo de células. Em um aspecto, as razões mais típicas para uso se encontram na vizinhança de 1:1,2:1 e 3:1 no primeiro dia.
[0715] Em aspectos adicionais, as células, tais como células T, são combinadas com esférulas revestidas com agentes, as esférulas e as células são subsequentemente separadas, e então as células são cultivadas. Em um aspecto alternativo, antes da cultura, as esférulas revestidas com agentes e células não são separadas mas são cultivadas em conjunto. Em um aspecto adicional, as esférulas e células são primeiramente concentradas por aplicação de uma força, tal como uma força magnética, resultando em ligação acrescida de marcadores
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379/606 da superfície celular, desse modo induzindo estimulação de células. [0716] A título exemplificative, proteínas da superfície celular podem ser ligadas ao permitir que esférulas paramagnéticas às quais estão ligados o anti-CD3 e anti-CD28 (3x28 esférulas) contatem as células T. Em um aspecto, as células (por exemplo, 104 até 109 células T) e esférulas (por exemplo, esférulas paramagnéticas T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450 a uma razão de 1:1) são combinadas em um tampão, por exemplo, PBS (sem cátions divalentes tais como cálcio e magnésio). Mais uma vez, os peritos na técnica podem prontamente apreciar que qualquer concentração de células pode ser usada. Por exemplo, a célula-alvo pode ser muito rara na amostra e compreender somente 0,01% da amostra ou a totalidade da amostra (isto é, 100%) pode compreender a célula-alvo de interesse. Em conformidade, qualquer número de células está dentro do contexto da presente invenção. Em certos aspectos, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual partículas e células são misturadas em conjunto (isto é, aumentar a concentração de células), para assegurar contato máximo de células e partículas. Por exemplo, em um aspecto, é usada uma concentração de cerca de 10 bilhões de células/mL, 9 bilhões/mL, 8 bilhões/mL, 7 bilhões/mL, 6 bilhões/mL, 5 bilhões/mL ou 2 bilhões/mL. Em um aspecto são usadas mais de 100 milhões de células/mL. Em um aspecto adicional, uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/mL é usada. Ainda em um aspecto, uma concentração de células desde 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 milhões de células/mL é usada. Em aspectos adicionais, concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL podem ser usadas. O uso de concentrações elevadas pode resultar em rendimento de células, ativação de células, e expansão de células aumentados. Além disso, o uso de concentrações elevadas de células permite uma captura mais eficiente de células que podem expressar
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380/606 fracamente antígenos-alvo de interesse, tais como células T negativas para CD28. Tais populações de células podem ter valor terapêutico e será desejável obtê-las em certos aspectos. Por exemplo, o uso de uma concentração elevada de células permite uma seleção mais eficiente de células T CD8+ que normalmente têm expressão mais fraca de CD28. [0717] Em uma modalidade, células transduzidas com um ácido nucleico codificando um CAR, por exemplo, um CAR descrito aqui, são expandidas, por exemplo, por um método descrito aqui. Em uma modalidade, as células são expandidas em cultura durante um período de várias horas (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) até cerca de 14 dias (por exemplo, 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias). Em uma modalidade, as células são expandidas durante um período de 4 até 9 dias. Em uma modalidade, as células são expandidas durante um período de 8 dias ou menos, por exemplo, 7, 6 ou 5 dias. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula CAR CD19 descrita aqui, são expandidas em cultura durante 5 dias, e as células resultantes são mais potentes do que as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. A potência pode ser definida, por exemplo, por várias funções de células T, por exemplo, proliferação, morte de células-alvo, produção de citocinas, ativação, migração, ou suas combinações. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula CAR CD19 descrita aqui, expandidas durante 5 dias exibem um aumento de pelo menos uma, duas, três ou quatro vezes em duplicações de células por estimulação com antigenos em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. Em uma modalidade, as células, por exemplo, as células expressando um CAR CD19 descrito aqui, são expandidas em cultura durante 5 dias, e as células resultantes exibem produção mais elevada de citocinas pró-inflamatórias, por exemplo, níveis de IFN-γ e/ou GM
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CSF, em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula CAR CD19 descrita aqui, expandidas durante 5 dias exibem um aumento de pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, dez vezes ou mais em pg/mL de produção de citocinas pró-inflamatórias, por exemplo, níveis de IFN-γ e/ou GM-CSF, em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura.
[0718] Também podem ser desejados vários ciclos de estimulação, de modo que o tempo de cultura de células T pode ser 60 dias ou mais. Condições apropriadas para cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, Meio Mínimo Essencial ou meio RPMI 1640 ou X-vivo 15 (Lonza)) que pode conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal de bovino ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-γ, IL-4, IL-7, GMCSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp e TNF-α ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos do perito. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não se limitam a, tensoativo, Plasmanate e agentes redutores tais como N-acetil-cisteína e 2mercaptoetanol. Meio pode incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, aMEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vitaminas, sem soro ou suplementado com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios, e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e expansão de células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos somente em culturas experimentais, não em culturas de células a serem infundidas em um sujeito. As células-alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura (por exemplo, 37 °C) e atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2) apropriadas.
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[0719] Em uma modalidade, as células são expandidas em um meio apropriado (por exemplo, meio descrito aqui) que inclui uma ou mais interleucinas que resultam em um aumento de pelo menos 200 vezes (por exemplo, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes) em células ao longo de um período de expansão de 14 dias, por exemplo, medido por um método descrito aqui tal como citometria de fluxo. Em uma modalidade, as células são expandidas na presença de IL-15 e/ou IL-7 (por exemplo, IL-15 e IL-7).
[0720] Em modalidades, métodos descritos aqui, por exemplo, métodos de preparação de células expressando CAR, compreendem remover células T reguladoras, por exemplo, células T CD25+, de uma população de células, por exemplo, usando um anticorpo anti-CD25, ou seu fragmento, ou um ligante de ligação a CD25, IL-2. Métodos para remover células T reguladoras, por exemplo, células T CD25+, de uma população de células são descritos aqui. Em modalidades, os métodos, por exemplo, métodos de preparação, compreendem adicionalmente contatar uma população de células (por exemplo, uma população de células na qual células T reguladoras, tais como células T CD25+, foram depletadas; ou uma população de células que foi previamente contatada com um anticorpo anti-CD25, seu fragmento, ou ligante de ligação a CD25) com IL-15 e/ou IL-7. Por exemplo, a população de células (por exemplo, que foi previamente contatada com um anticorpo anti-CD25, seu fragmento ou ligante de ligação a CD25) é expandida na presença de IL-15 e/ou IL-7.
[0721] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo um polipeptideo de interleucina-15 (IL-15), um polipeptideo do receptor de interleucina-15 alfa (IL-15Ra), ou uma combinação de um polipeptideo de IL-15 e um polipeptideo de IL-15Ra, por exemplo, hetlL-15, durante a preparação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em
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383/606 modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de IL-15 durante a preparação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo uma combinação de um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15 Ra durante a preparação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo hetlL-15 durante a preparação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo.
[0722] Em uma modalidade, a célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo hetlL-15 durante expansão ex vivo. Em uma modalidade, a célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de IL-15 durante expansão ex vivo. Em uma modalidade, a célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15Ra durante expansão ex vivo. Em uma modalidade, o contato resulta na sobrevivência e proliferação de uma subpopulação de linfócitos, por exemplo, células T CD8+.
[0723] Células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem exibir diferentes características. Por exemplo, produtos típicos de células do sangue ou de células mononucleares do sangue periférico submetidas a aférese têm uma população de células T auxiliadoras (TH, CD4+) que é maior do que a população de células T citotóxicas ou supressoras (TC, CD8+). A expansão ex vivo de células T por estimulação dos receptores CD3 e CD28 produz uma população de células T que, antes de cerca de 8-9 dias, consiste predominantemente em células TH, ao passo que, passados cerca de 8-9 dias, a população de células T compreende uma população cada
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384/606 vez maior de células TC. Em conformidade, dependendo do propósito do tratamento, a infusão de um sujeito com uma população de células T compreendendo predominantemente células TH pode ser vantajosa. Similarmente, se um subconjunto de células TC específicas para antígeno tiver sido isolado, pode ser benéfico expandir este subconjunto em um grau maior.
[0724] Além disso, para além de marcadores de CD4 e CD8, outros marcadores fenotípicos variam significativamente mas, em grande parte, de modo reproduzível durante o processo da expansão celular. Assim, tal caráter reproduzível permite personalizar um produto de células T ativadas para propósitos específicos.
[0725] Depois de construído um CAR descrito aqui, vários ensaios podem ser usados para avaliar a atividade da molécula, tais como, mas não se limitando à, capacidade de expandir células T após estimulação por antígenos, sustentar a expansão de células T na ausência de reestimulação, e atividades anticancerígenas em modelos in vitro e animais apropriados. Ensaios para avaliar os efeitos de um CAR da presente invenção são descritos em mais detalhe abaixo
[0726] A análise por transferência Western da expressão de CAR em células T primárias pode ser usada para detectar a presença de monômeros e dímeros. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muito brevemente, as células T (mistura 1:1 de células T CD4+ e CD8+) que expressam os CARs são expandidas in vitro por mais de 10 dias, seguido de lise e SDS-PAGE sob condições de redução. CARs contendo o domínio citoplasmático de TCR-ζ completo e a cadeia TCR-ζ endógena são detectados por transferência Western com o uso de um anticorpo para a cadeia TCR-ζ. Os mesmos subconjuntos de células T são usados para análise SDSPAGE sob condições não redutoras para permitir a avaliação da formação de dímeros covalentes.
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[0727] A expansão in vitro de células T CAR+ após a estimulação com antígeno pode ser medida por citometria de fluxo. Por exemplo, uma mistura de células T CD4+ e CD8+ é estimulada com aAPCs aCD3/aCD28 seguido por transdução com vetores lentivirais que expressam GFP sob o controle dos promotores a serem analisados. Promotores exemplificativos incluem promotores do gene IE do CMV, EF-1a, ubiquitina C ou fosfogliceroquinase (PGK). A fluorescência de GFP é avaliada no dia 6 de cultura nos subconjuntos de células T CD4+ e/ou CD8+ por citometria de fluxo. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Alternativamente, uma mistura de células T CD4+ e CD8+ é estimulada com microesferas magnéticas revestidas com aCD3/aCD28 no dia 0 e transduzida com CAR no dia 1 com o uso de um vetor lentiviral bicistrônico que expressa CAR juntamente com eGFP com o uso de sequência de omissão ribossômica 2A. As culturas são estimuladas novamente com um antígeno associado a câncer como descrito aqui+ células K562 (K562 expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui), células K562 de tipo selvagem (K562 de tipo selvagem) ou células K562 expressando hCD32 e 4-1BBL na presença de anticorpo anti-CD3 e anti-CD28 (K562-BBL-3/28) após lavagem. IL-2 exógena é adicionada às culturas em dias alternados a 100 lU/mL. As células T GFP+ são enumeradas por citometria de fluxo com o uso de contagem baseada em microesfera. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).
[0728] A expansão sustentada de células T CAR+ na ausência de re-estimulação pode ser também medida. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Em resumo, o volume médio de células T (fl) é medido no dia 8 da cultura usando um contador de partículas Coulter Multisizer III, um Nexcelom Cellometer Vision ou Millipore Scepter, após estimulação com esférulas magnéticas
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386/606 revestidas com aCD3/aCD28 no dia 0 e transdução com o CAR indicado no dia 1.
[0729] Modelos de animal podem ser também usados para medir uma atividade de CART. Por exemplo, pode ser usado um modelo de xenoenxerto usando células T CAR+ específicas para um antígeno associado a câncer humano descrito aqui para tratar uma ALL pré-B humana primária em camundongos imunodeficientes. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muito brevemente, após estabelecimento de ALL, os camundongos são randomizados quanto aos grupos de tratamento. Diferentes números de células T manipuladas com CAR específico para um antígeno associado a câncer são coinjetadas a uma razão de 1:1 em camundongos NODSCID-y_/“ com ALL Β. O número de cópias de um vetor de CAR específico para um antígeno associado a câncer em DNA de baço de camundongos é avaliado em vários momentos após a injeção de células T. Os animais são avaliados quanto a leucemia em intervalos semanais. Contagens de blastócitos de ALL B do sangue periférico com um antígeno associado a câncer descrito aqui+ são medidas em camundongos que são injetados com células T ζ CAR+ com um antígeno associado a câncer descrito aqui ou células T pseudotransduzidas. As curvas de sobrevida para os grupos são comparadas com o uso do teste de log-rank. Adicionalmente, contagens absolutas de células T CD4+ e CD8+ de sangue periférico 4 semanas após a injeção de células T em camundongos NOD-SCID-γ-7- podem ser também analisadas. Os camundongos recebem por injeção células leucêmicas e 3 semanas depois recebem por injeção células T manipuladas para expressarem CAR por um vetor lentiviral bicistrônico que codifica o CAR ligado a eGFP. As células T são normalizadas para 45-50% de células T GFP+ de entrada por mistura com células com transdução simulada antes da injeção e confirmadas por citometria de fluxo. Os animais são avaliados
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387/606 quanto a leucemia em intervalos de uma semana. As curvas de sobrevida para os grupos de células T CAR+ são comparadas com o uso do teste de log-rank.
[0730] A resposta ao tratamento com CAR dependente de dose pode ser avaliada. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Por exemplo, sangue periférico é obtido 35 a 70 dias após o estabelecimento de leucemia em camundongos que receberam injeção no dia 21 de células T CAR, um número equivalente de células T com transdução simulada ou sem células T. Os camundongos de cada grupo são aleatoriamente sangrados para a determinação de contagens de blastócitos de ALL do sangue periférico com antígeno associado a câncer descrito aqui+ e, então, são mortos nos dias 35 e 49. Os animais remanescentes são avaliados nos dias 57 e 70.
[0731] A avaliação da proliferação celular e produção de citocinas foi previamente descrita, por exemplo, em Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Em resumo, a avaliação da proliferação mediada por CAR é realizada em placas de microtitulação misturando células T lavadas com células K562 que expressam um antígeno associado a câncer descrito aqui (K19) ou CD32 e CD137 (KT32-BBL) para uma razão final de células T:K562 de 2:1. As células K562 são irradiadas com radiação gama antes do uso. Anticorpos monoclonais anti-CD3 (clone OKT3) e anti-CD28 (clone 9.3) são adicionados a culturas com células KT32-BBL para servir como um controle positivo para estimular a proliferação de células T visto que esses sinais suportam expansão de células T CD8+ a longo prazo ex vivo. As células T são enumeradas em culturas com o uso de microesferas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) e citometria de fluxo, conforme descrito pelo fabricante. As células T CAR+ são identificadas por expressão de GFP com o uso de células T que são
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388/606 manipuladas com vetores lentivirais que expressam CAR ligados a eGFP-2A. Para células T CAR+ que não expressam GFP, as células T CAR+ são detectadas com proteína recombinante biotinilada de um antígeno associado a câncer descrito aqui e um conjugado de avidinaPE secundário. A expressão de CD4+ e CD8+ em células T é também simultaneamente detectada com anticorpos monoclonais específicos (BD Biosciences). As medições de citocinas são realizadas em sobrenadantes recolhidos 24 horas após nova estimulação usando o kit de arranjo de esférulas citométricas de citocinas TH1/TH2 humanas (BD Biosciences, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência é avaliada usando um citômetro de fluxo FACScalibur e os dados são analisados de acordo com as instruções do fabricante. [0732] A citotoxicidade pode ser avaliada por um ensaio de liberação de 51 Cr padrão. Ver, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Em resumo, as células-alvo (linhagens K562 e células de ALL pró-B primárias) são carregadas com 51 Cr (como NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) a 37°C por duas horas com agitação frequente, lavadas duas vezes em RPMI completo e colocadas em placas de microtitulação. As células T efetoras são misturadas com células-alvo nos poços em RPMI completo em razões variáveis de célula efetora:célula-alvo (E:T). Poços adicionais contendo meio apenas (liberação espontânea, SR) ou uma solução a 1% de detergente triton-X 100 (liberação total, TR) são também preparados. Após 4 horas de incubação a 37°C, o sobrenadante de cada poço é coletado. O 51 Cr liberado é, então, medido com o uso de um contador de partículas gama (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condição é realizada pelo menos em triplicado, e a percentagem de lise é calculada com o uso da fórmula: % de Lise = (ER- SR) / (TR - SR), em que ER representa o 51 Cr médio liberado para cada condição experimental.
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[0733] Tecnologias de imagiologia podem ser usadas para avaliar o tráfego específico e a proliferação de CARs em modelos de animais portadores de tumor. Tais ensaios foram descritos, por exemplo, em Barrett etal., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Em resumo, os camundongos NOD/SCID/yc_/_ (NSG) receberam por injeção IV células Nalm-6 seguidas por células T 7 dias depois 4 horas após eletroporação com construtos CAR. As células T são transfectadas estavelmente com um construto lentiviral para expressar luciferase de vagalume, e os camundongos são visualizados quanto à bioluminescência. Alternativamente, a eficácia e a especificidade terapêutica de uma única injeção de células T CAR+ em modelo de xenoenxerto de Nalm-6 podem ser medidas do modo seguinte: Os camundongos NSG são injetados com Nalm-6 transduzidas para expressarem estavelmente luciferase de vagalume, seguido de uma única injeção na veia da cauda de células T eletroporadas com CARs da presente invenção 7 dias depois. Os animais são visualizados em vários momentos após a injeção. Por exemplo, podem ser gerados mapas térmicos de densidade de fótons de leucemia positiva para luciferase de vagalume em camundongos representativos no dia 5 (2 dias antes do tratamento) e no dia 8 (24 horas após PBLs CAR+).
[0734] Outros ensaios, incluindo os descritos na seção Exemplos aqui bem como os que são conhecidos na técnica também podem ser usados para avaliar os CARs descritos aqui.
Aplicação Terapêutica
[0735] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para o tratamento de uma doença associada a expressão de um antígeno associado a câncer descrito aqui.
[0736] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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390/606 manipuladas para expressarem um CAR X, em que X representa um antígeno tumoral como descrito aqui, e em que as células cancerígenas expressam o referido antígeno tumoral X.
[0737] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer ao proporcionar ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR X descrito aqui, em que as células cancerígenas expressam X. Em uma modalidade, X é expresso em células normais e células cancerígenas, mas é expresso em níveis mais baixos em células normais. Em uma modalidade, o método também compreende selecionar um CAR que se liga a X com uma afinidade que permite que o CAR X se ligue e mate as células cancerígenas expressando X, mas menos do que 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou menos das células normais expressando X são mortas, por exemplo, como determinado por um ensaio descrito aqui. Por exemplo, pode ser usado o ensaio descrito nas FIGURAS 13A e 13B ou um ensaio de morte tal como citometria de fluxo baseado em Cr51 CTL. Em uma modalidade, o CAR selecionado tem um domínio de ligação a antigenos que tem uma afinidade de ligação KD de 10-4 M até 10-8 M, por exemplo, 10-5 M até 10-7 M, por exemplo, 10-6 M ou 10-7 M, para o antígeno-alvo. Em uma modalidade, o domínio de ligação a antigenos selecionado tem uma afinidade de ligação que é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou 1 000 vezes menor do que a de um anticorpo de referência, por exemplo, um anticorpo descrito aqui.
[0738] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem CAR CD19, em que as células cancerígenas expressam CD19. Em uma modalidade, o câncer
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391/606 a ser tratado é ALL (leucemia linfoblástica aguda), CLL (leucemia linfocítica crônica), DLBCL (linfoma difuso de grandes células B), MCL (Linfoma de células do manto) ou MM (mieloma múltiplo).
[0739] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR EGFRvIII, em que as células cancerígenas expressam EGFRvIII. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é glioblastoma.
[0740] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR mesotelina, em que as células cancerígenas expressam mesotelina. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é mesotelioma, câncer pancreático ou câncer do ovário.
[0741] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD123, em que as células cancerígenas expressam CD123. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é AML.
[0742] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD22, em que as células cancerígenas expressam CD22. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em malignidades de células B.
[0743] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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392/606 manipuladas para expressarem um CAR CS-1, em que as células cancerígenas expressam CS-1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é mieloma múltiplo.
[0744] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CLL-1, em que as células cancerígenas expressam CLL-1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é AML.
[0745] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD33, em que as células cancerígenas expressam CD33. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é AML.
[0746] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GD2, em que as células cancerígenas expressam GD2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é neuroblastoma.
[0747] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR BCMA, em que as células cancerígenas expressam BCMA. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é mieloma múltiplo.
[0748] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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393/606 manipuladas para expressarem um CAR Τη, em que as células cancerígenas expressam o antígeno Tn. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do ovário.
[0749] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PSMA, em que as células cancerígenas expressam PSMA. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata.
[0750] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ROR1, em que as células cancerígenas expressam ROR1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em malignidades de células B.
[0751] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR FLT3, em que as células cancerígenas expressam FLT3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é AML.
[0752] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TAG72, em que as células cancerígenas expressam TAG72. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer gastrointestinal.
[0753] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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394/606 manipuladas para expressarem um CAR CD38, em que as células cancerígenas expressam CD38. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é mieloma múltiplo.
[0754] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD44v6, em que as células cancerígenas expressam CD44v6. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer cervical, AML ou MM.
[0755] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CEA, em que as células cancerígenas expressam CEA. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer gastrointestinal ou câncer pancreático.
[0756] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR EPCAM, em que as células cancerígenas expressam EPCAM. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer gastrointestinal.
[0757] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR B7H3, em que as células cancerígenas expressam B7H3.
[0758] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR KIT, em que as células
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395/606 cancerígenas expressam KIT. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer gastrointestinal.
[0759] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR IL-13Ra2, em que as células cancerígenas expressam IL-13Ra2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é glioblastoma.
[0760] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PRSS21, em que as células cancerígenas expressam PRSS21. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é selecionado de câncer do ovário, pancreático, do pulmão e mama.
[0761] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD30, em que as células cancerígenas expressam CD30. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em linfomas ou leucemias.
[0762] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GD3, em que as células cancerígenas expressam GD3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
[0763] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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396/606 manipuladas para expressarem um CAR CD171, em que as células cancerígenas expressam CD171. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é neuroblastoma, câncer do ovário, melanoma, câncer da mama, câncer pancreático, cânceres do cólon ou NSCLC (câncer do pulmão de células não pequenas).
[0764] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR IL-11 Ra, em que as células cancerígenas expressam IL-11 Ra. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é osteossarcoma.
[0765] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PSCA, em que as células cancerígenas expressam PSCA. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata.
[0766] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR VEGFR2, em que as células cancerígenas expressam VEGFR2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é um tumor sólido.
[0767] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LewisY, em que as células cancerígenas expressam LewisY. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do ovário ou AML.
[0768] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos
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397/606 de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD24, em que as células cancerígenas expressam CD24. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer pancreático.
[0769] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PDGFR-beta, em que as células cancerígenas expressam PDGFR-beta. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da mama, câncer da próstata, GIST (tumor estromal gastrointestinal), CML, DFSP (dermatofibrossarcoma protuberante) ou glioma.
[0770] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR SSEA-4, em que as células cancerígenas expressam SSEA-4. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é glioblastoma, câncer da mama, câncer do pulmão ou câncer de células-tronco.
[0771] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD20, em que as células cancerígenas expressam CD20. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em malignidades de células B.
[0772] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Receptor de folato alfa, em que
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398/606 as células cancerígenas expressam receptor de folato alfa. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do ovário, NSCLC, câncer endometrial, câncer renal ou outros tumores sólidos.
[0773] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ERBB2, em que as células cancerígenas expressam ERBB2 (Her2/neu). Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do pulmão ou outros tumores sólidos.
[0774] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MUC1, em que as células cancerígenas expressam MUC1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da mama, câncer do pulmão ou outros tumores sólidos. [0775] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR EGFR, em que as células cancerígenas expressam EGFR. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é glioblastoma, SCLC (câncer do pulmão de células pequenas), SCCHN (carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço), NSCLC ou outros tumores sólidos.
[0776] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR NCAM, em que as células cancerígenas expressam NCAM. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é neuroblastoma ou outros tumores sólidos.
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[0777] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CAIX, em que as células cancerígenas expressam CAIX. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer renal, CRC, câncer cervical ou outros tumores sólidos.
[0778] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR EphA2, em que as células cancerígenas expressam EphA2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é GBM.
[0779] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GD3, em que as células cancerígenas expressam GD3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
[0780] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Fucosil GM1, em que as células cancerígenas expressam Fucosil GM.
[0781] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR sLe, em que as células cancerígenas expressam sLe. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é NSCLC ou AML.
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[0782] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GM3, em que as células cancerígenas expressam GM3.
[0783] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TGS5, em que as células cancerígenas expressam TGS5.
[0784] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR HMWMAA, em que as células cancerígenas expressam HMWMAA. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma, glioblastoma ou câncer da mama.
[0785] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR o-acetil-GD2, em que as células cancerígenas expressam o-acetil-GD2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é neuroblastoma ou melanoma.
[0786] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD19, em que as células cancerígenas expressam CD19. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é AML que expressa Receptor de folato beta, mieloma.
[0787] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células
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401/606 efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TEM1/CD248, em que as células cancerígenas expressam TEM1/CD248. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é um tumor sólido.
[0788] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TEM7R, em que as células cancerígenas expressam TEM7R. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é um tumor sólido.
[0789] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CLDN6, em que as células cancerígenas expressam CLDN6. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do ovário, câncer do pulmão ou câncer da mama.
[0790] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TSHR, em que as células cancerígenas expressam TSHR. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da tireoide ou mieloma múltiplo.
[0791] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GPRC5D, em que as células cancerígenas expressam GPRC5D. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é mieloma múltiplo.
[0792] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células
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402/606 efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CXORF61, em que as células cancerígenas expressam CXORF61.
[0793] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD97, em que as células cancerígenas expressam CD97. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em malignidades de células B, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer esofágico, glioblastoma, câncer da mama ou câncer colorretal.
[0794] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD179a, em que as células cancerígenas expressam CD179a. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em malignidades de células B.
[0795] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ALK, em que as células cancerígenas expressam ALK. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é NSCLC, ALCL (linfoma anaplásico de grandes células), IMT (tumor miofibroblástico inflamatório) ou neuroblastoma.
[0796] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Ácido polissiálico, em que as células cancerígenas expressam Ácido polissiálico. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do pulmão de células pequenas.
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403/606
[0797] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PLAC1, em que as células cancerígenas expressam PLAC1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é HCC (carcinoma hepatocelular).
[0798] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GloboH, em que as células cancerígenas expressam GloboH. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do ovário, câncer gástrico, câncer da próstata, câncer do pulmão, câncer da mama ou câncer pancreático.
[0799] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR NY-BR-1, em que as células cancerígenas expressam NY-BR-1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da mama.
[0800] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR UPK2, em que as células cancerígenas expressam UPK2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da bexiga.
[0801] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR HAVCR1, em que as células
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404/606 cancerígenas expressam HAVCR1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer renal.
[0802] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ADRB3, em que as células cancerígenas expressam ADRB3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é sarcoma de Ewing.
[0803] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PANX3, em que as células cancerígenas expressam PANX3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é osteossarcoma.
[0804] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GPR20, em que as células cancerígenas expressam GPR20. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é GIST.
[0805] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LY6K, em que as células cancerígenas expressam LY6K. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da mama, câncer do pulmão, câncer do ovário ou câncer do colo do útero.
[0806] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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405/606 manipuladas para expressarem um CAR OR51E2, em que as células cancerígenas expressam OR51E2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata.
[0807] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TARP, em que as células cancerígenas expressam TARP. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata.
[0808] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR WT1, em que as células cancerígenas expressam WT1.
[0809] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR NY-ESO-1, em que as células cancerígenas expressam NY-ESO-1.
[0810] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LAGE-1a, em que as células cancerígenas expressam LAGE-1a.
[0811] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MAGE-A1, em que as células cancerígenas expressam MAGE-A1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
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406/606
[0812] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MAGE A1, em que as células cancerígenas expressam MAGE A1.
[0813] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ETV6-AML, em que as células cancerígenas expressam ETV6-AML.
[0814] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR proteína do esperma 17, em que as células cancerígenas expressam proteína do esperma 17. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do ovário, HCC ou NSCLC.
[0815] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR XAGE1, em que as células cancerígenas expressam XAGE1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer de Ewing ou rabdocâncer.
[0816] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Tie 2, em que as células cancerígenas expressam Tie 2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é um tumor sólido.
[0817] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos
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407/606 de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MAD-CT-1, em que as células cancerígenas expressam MAD-CT-1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata ou melanoma.
[0818] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MAD-CT-2, em que as células cancerígenas expressam MAD-CT-2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata, melanoma.
[0819] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR antígeno relacionado com Fos 1, em que as células cancerígenas expressam antígeno relacionado com Fos 1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é glioma, câncer de células escamosas ou câncer pancreático.
[0820] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR p53, em que as células cancerígenas expressam p53.
[0821] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR prosteína, em que as células cancerígenas expressam prosteína.
[0822] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células
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408/606 efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR survivina e telomerase, em que as células cancerígenas expressam survivina e telomerase.
[0823] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PCTA-1/Galectina 8, em que as células cancerígenas expressam PCTA-1/Galectina 8.
[0824] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MelanA/MART1, em que as células cancerígenas expressam MelanA/MART 1.
[0825] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Ras mutante, em que as células cancerígenas expressam Ras mutante.
[0826] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR p53 mutante, em que as células cancerígenas expressam p53 mutante.
[0827] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR hTERT, em que as células cancerígenas expressam hTERT.
[0828] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células
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409/606 efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR pontos de quebra de translocação de sarcoma, em que as células cancerígenas expressam pontos de quebra de translocação de sarcoma. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é sarcoma.
[0829] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ML-IAP, em que as células cancerígenas expressam ML-IAP. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
[0830] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR ERG, em que as células cancerígenas expressam ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS).
[0831] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR NA17, em que as células cancerígenas expressam NA17. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
[0832] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PAX3, em que as células cancerígenas expressam PAX3. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é rabdomiossarcoma alveolar.
[0833] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células
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410/606 efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR receptor de andrógenos, em que as células cancerígenas expressam receptor de andrógenos. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da próstata metastático. [0834] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Ciclina B1, em que as células cancerígenas expressam Ciclina B1.
[0835] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR MYCN, em que as células cancerígenas expressam MYCN.
[0836] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR RhoC, em que as células cancerígenas expressam RhoC.
[0837] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR TRP-2, em que as células cancerígenas expressam TRP-2. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
[0838] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CYP1B1, em que as células cancerígenas expressam CYP1B1. Em uma modalidade, o câncer a ser
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411/606 tratado é câncer da mama, câncer do cólon, câncer do pulmão, câncer do esôfago, câncer da pele, câncer de gânglios linfáticos, câncer do cérebro ou câncer do testículo.
[0839] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR BORIS, em que as células cancerígenas expressam BORIS. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer do pulmão.
[0840] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR SART3, em que as células cancerígenas expressam SART3.
[0841] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PAX5, em que as células cancerígenas expressam PAX5.
[0842] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR OY-TES1, em que as células cancerígenas expressam OY-TES1.
[0843] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LCK, em que as células cancerígenas expressam LCK.
[0844] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos
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412/606 de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR AKAP-4, em que as células cancerígenas expressam AKAP-4.
[0845] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR SSX2, em que as células cancerígenas expressam SSX2.
[0846] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR RAGE-1, em que as células cancerígenas expressam RAGE-1. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é RCC (câncer de células renais) ou outros tumores sólidos.
[0847] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR transcriptase reversa de telomerase humana, em que as células cancerígenas expressam transcriptase reversa de telomerase humana. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado consiste em tumores sólidos.
[0848] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR RU1, em que as células cancerígenas expressam RU1.
[0849] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são
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413/606 manipuladas para expressarem um CAR RU2, em que as células cancerígenas expressam RU2.
[0850] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR carboxil-esterase intestinal, em que as células cancerígenas expressam carboxil-esterase intestinal. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é câncer da tireoide, RCC, CRC (câncer colorretal), câncer da mama ou outros tumores sólidos.
[0851] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Prostase, em que as células cancerígenas expressam Prostase.
[0852] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR PAP, em que as células cancerígenas expressam PAP.
[0853] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR receptor de IGF-I, em que as células cancerígenas expressam receptor de IGF-I.
[0854] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR gp100, em que as células cancerígenas expressam gp100.
[0855] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos
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414/606 de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR bcr-abl, em que as células cancerígenas expressam bcr-abl.
[0856] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR tirosinase, em que as células cancerígenas expressam tirosinase.
[0857] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR Fucosil GM1, em que as células cancerígenas expressam Fucosil GM1.
[0858] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR hsp70-2 mut, em que as células cancerígenas expressam hsp70-2 mut. Em uma modalidade, o câncer a ser tratado é melanoma.
[0859] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD79a, em que as células cancerígenas expressam CD79a.
[0860] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD79b, em que as células cancerígenas expressam CD79b.
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[0861] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD72, em que as células cancerígenas expressam CD72.
[0862] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LAIR1, em que as células cancerígenas expressam LAIR1.
[0863] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR FCAR, em que as células cancerígenas expressam FCAR.
[0864] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LILRA2, em que as células cancerígenas expressam LILRA2.
[0865] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CD300LF, em que as células cancerígenas expressam CD300LF.
[0866] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR CLEC12A, em que as células cancerígenas expressam CLEC12A.
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[0867] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR BST2, em que as células cancerígenas expressam BST2.
[0868] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR EMR2, em que as células cancerígenas expressam EMR2.
[0869] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR LY75, em que as células cancerígenas expressam LY75.
[0870] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR GPC3, em que as células cancerígenas expressam GPC3.
[0871] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR FCRL5, em que as células cancerígenas expressam FCRL5.
[0872] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de câncer proporcionando ao sujeito necessitado células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) que são manipuladas para expressarem um CAR IGLL1, em que as células cancerígenas expressam IGLL1.
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417/606
[0873] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com o tratamento de um sujeito in vivo usando um CAR PD1 de modo que o crescimento de tumores cancerosos é inibido. Um CAR PD1 pode ser usado isoladamente para inibir o crescimento de tumores cancerosos. Alternativamente, CAR PD1 pode ser usado em conjunção com outros CARs, agentes imunogênicos, tratamentos padrão para câncer ou outros anticorpos. Em uma modalidade, o sujeito é tratado com um CAR PD1 e um CAR X descrito aqui. Em uma modalidade, um CAR PD1 é usado em conjunção com outro CAR, por exemplo, um CAR descrito aqui, e um inibidor de quinases, por exemplo, um inibidor de quinases descrito aqui.
[0874] Em outro aspecto, é proporcionado um método de tratamento de um sujeito, por exemplo, redução ou melhoria de uma condição ou distúrbio hiperproliferativo (por exemplo, um câncer), por exemplo, tumor sólido, um tumor de tecido mole ou uma lesão metastática em um sujeito. Como usado aqui, é pretendido que o termo câncer inclua todos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos transformados de modo maligno, independentemente do tipo histopatológico ou estágio da invasão. Exemplos de tumores sólidos incluem malignidades, por exemplo, sarcomas, adenocarcinomas e carcinomas, dos vários sistemas de órgãos, tais como os que afetam o fígado, pulmão, mama, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato genitourinário (por exemplo, células renais, uroteliais), próstata e faringe. Adenocarcinomas incluem malignidades tais como a maior parte dos cânceres do cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer do fígado, carcinoma do pulmão de células não pequenas, câncer do intestino delgado e câncer do esôfago. Em uma modalidade, o câncer é um melanoma, por exemplo, um melanoma em estágio avançado. Lesões metastáticas dos cânceres acima mencionados
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418/606 também podem ser tratadas ou prevenidas usando os métodos e composições da invenção. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados incluem câncer ósseo, câncer pancreático, câncer da pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer do ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de células escamosas, linfoma de células T, cânceres induzidos pelo ambiente incluindo os induzidos por asbesto, e combinações dos referidos cânceres. O tratamento de cânceres metastáticos, por exemplo, cânceres metastáticos que expressam PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144) pode ser efetuado usando as moléculas de anticorpos descritas aqui.
[0875] Cânceres exemplificativos cujo crescimento pode ser inibido incluem cânceres tipicamente responsivos a imunoterapia. Exemplos não limitadores de cânceres para tratamento incluem melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer da próstata (por exemplo,
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419/606 adenocarcinoma da próstata refratário a hormônios), câncer da mama, câncer do cólon e câncer do pulmão (por exemplo, câncer do pulmão de células não pequenas). Adicionalmente, malignidades refratárias ou recorrentes podem ser tratadas usando as moléculas descritas aqui. [0876] Em um aspecto, a invenção diz respeito a um vetor compreendendo um CAR operavelmente ligado a um promotor para expressão em células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) de mamífero. Em um aspecto, a invenção proporciona uma célula efetora imune recombinante expressando um CAR da presente invenção para uso no tratamento de câncer expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em um aspecto, células expressando um CAR da invenção são capazes de contatar uma célula tumoral com pelo menos um antígeno associado a câncer expresso na sua superfície, de modo que a célula expressando CAR visa a célula cancerígena e o crescimento do câncer é inibido.
[0877] Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de inibição do crescimento de um câncer, compreendendo contatar a célula cancerígena com uma célula expressando CAR da presente invenção de modo que o CART é ativado em resposta ao antígeno e visa a célula cancerígena, em que o crescimento do tumor é inibido.
[0878] Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de tratamento de câncer em um sujeito. O método compreende administrar ao sujeito uma célula expressando CAR da presente invenção de modo que o câncer é tratado no sujeito. Em um aspecto, o câncer associado a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui é um câncer hematológico. Em um aspecto, o câncer hematológico é uma leucemia ou um linfoma. Em um aspecto, um câncer associado a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui inclui cânceres e malignidades incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, uma ou mais leucemias agudas incluindo, mas não se
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420/606 limitando a, por exemplo, Leucemia Linfoide aguda de células B (BALL”), Leucemia Linfoide aguda de células T (TALL”), leucemia Linfoide aguda (ALL); uma ou mais leucemias crônicas, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, leucemia mielógena crônica (CML), Leucemia Linfoide Crônica (CLL). Cânceres ou afecções hematológicas adicionais associados a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui incluem, mas não se limitam a, por exemplo, leucemia pró-linfocítica de células B, neoplasma blástico de células dendríticas plasmacitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, Linfoma folicular, Leucemia de células pilosas, linfoma folicular de pequenas células ou grandes células, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, Linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma de não Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom e pré-leucemia que são um conjunto diversificado de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e similares. Outras doenças associadas a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui incluem, mas não se limitam a, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas associadas a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui.
[0879] Em algumas modalidades, um câncer que pode ser tratado com uma célula expressando CAR da presente invenção é mieloma múltiplo. Mieloma múltiplo é um câncer do sangue, caracterizado por acúmulo de um clone de célula plasmática na medula óssea. Terapias correntes para mieloma múltiplo incluem, mas não se limitam a, tratamento com lenalidomida, que é um análogo da talidomida. A lenalidomida tem atividades que incluem atividade antitumoral, inibição
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421/606 da angiogênese e imunomodulação. Geralmente se crê que células de mieloma são negativas para expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui por citometria de fluxo. Assim, em algumas modalidades, um CAR CD19, por exemplo, como descrito aqui, pode ser usado para visar células de mieloma. Em algumas modalidades, terapia com CARs da presente invenção pode ser usada em combinação com uma ou mais terapias adicionais, por exemplo, tratamento com lenalidomida.
[0880] A invenção inclui um tipo de terapia celular no qual células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) são geneticamente modificadas para expressarem um receptor de antigenos quimérico (CAR) e a célula T ou célula NK expressando CAR é infundida em um recebedor necessitado. A célula infundida é capaz de matar células tumorais no recebedor. Ao contrário de terapias com anticorpos, células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) modificadas com CAR são capazes de se replicar in vivo, resultando em persistência de longa duração que pode conduzir a controle tumoral sustentado. Em vários aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) administradas ao paciente, ou sua progênie, persistem no paciente durante pelo menos quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze mês, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos ou cinco anos após a administração da célula T ou célula NK ao paciente.
[0881] A invenção também inclui um tipo de terapia celular no qual células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) são modificadas, por exemplo, por RNA transcrito in vitro, para expressarem de modo transiente um receptor de antigenos quimérico (CAR) e a
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422/606 célula T ou célula NK CAR é infundida em um recebedor necessitado. A célula infundida é capaz de matar células tumorais no recebedor. Assim, em vários aspectos, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) administradas ao paciente estão presentes durante menos de um mês, por exemplo, três semanas, duas semanas, uma semana, após a administração da célula T ou célula NK ao paciente.
[0882] Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria particular, a resposta de imunidade antitumoral induzida pelas células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) modificadas com CAR pode ser uma resposta imune ativa ou passiva, ou alternativamente pode se dever a uma resposta imune direta versus indireta. Em um aspecto, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) transduzidas com CAR exibem secreção de citocinas pró-inflamatórias específicas e atividade citolítica potente em resposta a células cancerígenas humanas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui, resistem a inibição de um antígeno associado a câncer solúvel como descrito aqui, medeiam a morte de espectadores e medeiam a regressão de um tumor humano estabelecido. Por exemplo, células tumorais sem antígenos em um campo heterogêneo de um tumor expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui podem ser suscetíveis a destruição indireta por células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) redirecionadas para um antígeno associado a câncer como descrito aqui que reagiram previamente contra células cancerígenas positivas para antígenos adjacentes.
[0883] Em um aspecto, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) modificadas com CAR totalmente humanas da invenção podem ser um tipo de vacina para imunização ex vivo e/ou terapia in vivo em um mamífero. Em um aspecto, o mamífero é um humano.
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[0884] No que se refere a imunização ex vivo, pelo menos um dos seguintes ocorre in vitro antes da administração da célula a um mamífero: i) expansão das células, ii) introdução nas células de um ácido nucleico codificando um CAR ou iii) crioconservação das células. [0885] Procedimentos ex vivo são bem conhecidos na técnica e são discutidos mais completamente abaixo. Em resumo, células são isoladas de um mamífero (por exemplo, um humano) e geneticamente modificadas (isto é, transduzidas ou transfectadas in vitro) com um vetor expressando um CAR revelado aqui. A célula modificada com CAR pode ser administrada a um recebedor mamífero para proporcionar um benefício terapêutico. O recebedor mamífero pode ser um humano e a célula modificada com CAR pode ser autóloga relativamente ao recebedor. Alternativamente, as células podem ser alogeneicas, singeneicas ou xenogeneicas relativamente ao recebedor.
[0886] O procedimento para expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras é descrito na Pat. U.S. No. 5,199,942, incorporada aqui por referência, e pode ser aplicado às células da presente invenção. Outros métodos adequados são conhecidos na técnica, consequentemente a presente invenção não está limitada a qualquer método de expansão ex vivo particular das células. Em resumo, cultura e expansão ex vivo de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) compreendem: (1) recolher célulastronco hematopoiéticas e progenitoras CD34+ de um mamífero a partir de recolha de sangue periférico ou explantes de medula óssea; e (2) expandir tais células ex vivo. Para além dos fatores de crescimento celular descritos na Pat. U.S. NQ. 5,199,942, outros fatores, tais como flt3-L, IL-1, IL-3 e ligante de c-kit, podem ser usados para a cultura e expansão das células.
[0887] Para além do uso de uma vacina à base de células em termos de imunização ex vivo, a presente invenção também proporciona
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424/606 composições e métodos para imunização in vivo para induzir uma resposta imune dirigida contra um antígeno em um paciente.
[0888] Geralmente, as células ativadas e expandidas como descrito aqui podem ser utilizadas no tratamento e prevenção de doenças que surgem em indivíduos que estão imunocomprometidos. Em particular, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) modificadas com CAR da invenção são usadas no tratamento de doenças, distúrbios e afecções associados a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em certos aspectos, as células da invenção são usadas no tratamento de pacientes em risco de desenvolver doenças, distúrbios e afecções associados à expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Assim, a presente invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção de doenças, distúrbios e afecções associados a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui, compreendendo administrar a um sujeito necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) modificadas com CAR da invenção.
[0889] Em um aspecto, as células que expressam CAR das invenções podem ser usadas para tratar uma doença proliferativa, tal como um câncer ou malignidade, ou que é uma condição pré-cancerosa tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma préleucemia. Além disso, uma doença associada a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui inclui, mas não se limita a, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Indicações não relacionadas com câncer associadas à expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui incluem, mas não se limitam a, por exemplo, doença autoimune (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma) e transplantação.
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[0890] As células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) modificadas com CAR da presente invenção podem ser administradas isoladamente ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes tais como IL2 ou outras citocinas ou populações de células.
Câncer Hematológico
[0891 ] Afecções de cânceres hematológicos são os tipos de câncer tais como leucemia, linfoma e afecções linfoproliferativas malignas que afetam o sangue, medula óssea e o sistema linfático.
[0892] Leucemia pode ser classificada como leucemia aguda e leucemia crônica. Leucemia aguda pode ser adicionalmente classificada como leucemia mielógena aguda (AML) e leucemia linfoide aguda (ALL). Leucemia crônica inclui leucemia mielógena crônica (CML) e leucemia linfoide crônica (CLL). Outras afecções relacionadas incluem síndrome mielodisplásicas (MDS, anteriormente conhecidas como préleucemia) que são um conjunto diversificado de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e risco de transformação em AML.
[0893] Linfoma é um grupo de tumores de células sanguíneas que se desenvolvem a partir de linfócitos. Linfomas exemplificativos incluem linfoma de não Hodgkin e linfoma de Hodgkin.
[0894] A presente invenção proporciona composições e métodos para o tratamento de câncer. Em um aspecto, o câncer é um câncer hematológico, incluindo, mas não se limitando a, o câncer hematológico é uma leucemia ou um linfoma. Em um aspecto, as células expressando CAR da invenção podem ser usadas para tratar cânceres e malignidades tais como, mas não se limitando a, por exemplo, leucemias agudas incluindo mas não se limitando a, por exemplo, leucemia linfoide aguda de células B (BALL), leucemia linfoide aguda de células T (TALL), leucemia linfoide aguda (ALL); uma ou mais
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426/606 leucemias crônicas incluindo mas não se limitando a, por exemplo, leucemia mielógena crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL); cânceres hematológicos ou afecções hematológicas adicionais incluindo mas não se limitando a, por exemplo, leucemia pró-linfocítica de células B, neoplasma blástico de células dendriticas plasmacitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, Linfoma folicular, Leucemia de células pilosas, linfoma folicular de pequenas células ou grandes células, afecções linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células do manto, Linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma de não Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de células dendriticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom e pré-leucemia que são um conjunto diversificado de afecções hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e similares. Além disso, uma doença associada a expressão de um antígeno associado a câncer como descrito aqui inclui mas não se limita a, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, afecções pré-cancerosas ou doenças proliferativas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui.
[0895] A presente invenção também proporciona métodos para inibir a proliferação ou reduzir uma população de células expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui, os métodos compreendendo contatar uma população de células compreendendo uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui com uma célula T ou célula NK expressando CAR da invenção que se liga à célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em um aspecto específico, a presente invenção proporciona métodos para inibir a proliferação ou reduzir a população de células cancerígenas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui, os métodos compreendendo contatar uma
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427/606 população de células cancerígenas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui com uma célula T ou célula NK expressando CAR da invenção que se liga a uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos para inibir a proliferação ou reduzir a população de células cancerígenas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui, os métodos compreendendo contatar uma população de células cancerígenas expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui com uma célula T ou célula NK expressando CAR da invenção que se liga a uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em certos aspectos, uma célula T ou célula NK expressando CAR da invenção reduz a quantidade, número, quantia ou percentagem de células e/ou células cancerígenas em pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em um sujeito com ou modelo animal para leucemia mieloide ou outro câncer associado a células expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui relativamente a um controle negativo. Em um aspecto, o sujeito é um humano.
[0896] A presente invenção também proporciona métodos para prevenir, tratar e/ou gerenciar uma doença associada a células expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui (por exemplo, um câncer hematológico ou câncer atípico expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui), os métodos compreendendo administrar a um sujeito necessitado uma célula T ou célula NK CAR da invenção que se liga a uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em um aspecto, o sujeito é um humano. Exemplos não limitadores de distúrbios associados a células expressando um antígeno associado a câncer
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428/606 como descrito aqui incluem distúrbios autoimunes (tais como lúpus), distúrbios inflamatórios (tais como alergias e asma) e cânceres (tais como cânceres hematológicos ou cânceres atípicos expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui).
[0897] A presente invenção também proporciona métodos para prevenir, tratar e/ou gerenciar uma doença associada a células expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui, os métodos compreendendo administrar a um sujeito necessitado uma célula T ou célula NK CAR da invenção que se liga a uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em um aspecto, o sujeito é um humano.
[0898] A presente invenção proporciona métodos para prevenir a recidiva de câncer associado a células expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui, os métodos compreendendo administrar a um sujeito necessitado uma célula T ou célula NK CAR da invenção que se liga a uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui. Em um aspecto, os métodos compreendem administrar ao sujeito necessitado uma quantidade eficaz de uma célula T ou célula NK expressando CAR descrita aqui que se liga a uma célula expressando um antígeno associado a câncer como descrito aqui em combinação com uma quantidade eficaz de outra terapia.
Terapias de Combinação
[0899] Uma célula que expressa CAR descrita no presente documento pode ser usada em combinação com outros agentes e terapias conhecidos. Administrado em combinação, como usado aqui, significa que dois (ou mais) tratamentos diferentes são administrados ao sujeito durante a aflição do sujeito com o distúrbio, por exemplo, os dois ou mais tratamentos são administrados depois de o sujeito ter sido diagnosticado com o distúrbio e antes de o distúrbio ter sido curado ou
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429/606 eliminado ou o tratamento ter cessado por outros motivos. Em algumas modalidades, a administração de um tratamento ainda está ocorrendo quando a administração do segundo começa, de modo que ocorre sobreposição em termos da administração. Tal é por vezes referido aqui como administração simultânea ou concorrente. Em outras modalidades, a administração de um tratamento termina antes de a administração do outro tratamento começar. Em algumas modalidades de qualquer um dos casos, o tratamento é mais eficaz devido à administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, é observado um efeito equivalente com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz sintomas em maior extensão, do que seria observado se o segundo tratamento fosse administrado na ausência do primeiro tratamento, ou a situação análoga é observada com o primeiro tratamento. Em algumas modalidades, a administração é tal que a redução em um sintoma, ou outro parâmetro relacionado com o distúrbio, é maior do que seria observado com um tratamento administrado na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou mais do que aditivo. A administração pode ser tal que um efeito do primeiro tratamento administrado ainda é detectável quando o segundo é administrado.
[0900] Uma célula expressando CAR descrita aqui e o pelo menos um agente terapêutico adicional podem ser administrados simultaneamente, na mesma composição ou em composições separadas ou sequencialmente. Para administração sequencial, a célula expressando CAR descrita aqui pode ser administrada em primeiro lugar, e o agente adicional pode ser administrado em segundo lugar, ou a ordem da administração pode ser invertida.
[0901] A terapia com CAR e/ou outros agentes, procedimentos ou modalidades terapêuticos podem ser administrados durante períodos
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430/606 de disfunção ativa ou durante um período de remissão ou doença menos ativa. A terapia com CAR pode ser administrada antes do outro tratamento, em simultâneo com o tratamento, pós-tratamento ou durante remissão da disfunção.
[0902] Quando administrados em combinação, a terapia com CAR e o agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente) ou todos, podem ser administrados em uma quantidade ou dose que é maior, menor ou igual à quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em certas modalidades, a quantidade ou dosagem administrada da terapia com CAR, do agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente), ou todos, é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em outras modalidades, a quantidade ou dosagem da terapia com CAR, do agente adicional (por exemplo, segundo ou terceiro agente) ou todos, que resulta em um efeito desejado (por exemplo, tratamento de câncer) é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% menor) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia, requerida para alcançar o mesmo efeito terapêutico.
[0903] Em aspectos adicionais, uma célula expressando CAR descrita aqui pode ser usada em um regime de tratamento em combinação com cirurgia, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos, ou outros agentes imunoablativos como CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias com anticorpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiação, vacina de
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431/606 peptideo, como a descrita em Izumoto etal. 2008 JNeurosurg 108:963971.
[0904] Em uma modalidade, uma célula expressando CAR descrita aqui pode ser usada em combinação com um agente quimioterapêutico. Agentes quimioterapêuticos exemplificativos incluem uma antraciclina (por exemplo, doxorrubicina (por exemplo, doxorrubicina lipossômica)), um alcalóide de vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfamida, dacarbazina, melfalano, ifosfamida, temozolomida), um anticorpo para células imunes (por exemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab), um antimetabólito (incluindo, por exemplo, antagonistas do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase (por exemplo, fludarabina)), um inibidor de mTOR, um agonista da proteína relacionada com o TNFR induzida por glucocorticoides (GITR) TNFR, um inibidor de proteassomos (por exemplo, aclacinomicina A, gliotoxina ou bortezomib), um imunomodulador tal como talidomida ou um derivado de talidomida (por exemplo, lenalidomida).
[0905] Agentes quimioterapêuticos gerais considerados para uso em terapias de combinação incluem anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), bussulfano (Myleran®), injeção de bussulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desóxi-5-fluorocitidina, carboplatina (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®), cisplatina (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® ou Neosar®), citarabina, citosina arabinosídeo (Cytosar-U®), injeção de lipossomo de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), hidrocloreto de daunorrubicina (Cerubidine®), injeção de lipossomo de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®),
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432/606 hidrocloreto de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etoposida (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracila (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiureia (Hydrea®), Idarrubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecano (Camptosar®), L-asparaginase (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalano (Alkeran®), 6mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), fênix (ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 com implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposida (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), hidrocloreto de topotecano para injeção (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) e vinorrelbina (Navelbine®).
[0906] Agentes alquilantes exemplificativo incluem, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos: mostarda de uracila (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamina®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetino (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™), ifosfamida (Mitoxana®), melfalano (Alkeran®), Clorambucil (Leukeran®), pipobromano (Amedel®, Vercyte®), trietilenomelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilenotiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), bussulfano (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®) e Dacarbazina (DTIC-Dome®). Agentes alquilantes exemplificativos adicionais incluem, sem limitação, Oxaliplatina (Eloxatin®); Temozolomida (Temodar® e Temodal®); Dactinomicina (também conhecido como actinomicina-D, Cosmegen®); Melfalano (também conhecido como L-PAM, L-sarcolisina, e mostarda
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433/606 de fenilalanina, Alkeran®); Altretamina (também conhecido como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Carmustina (BiCNU®); Bendamustina (Treanda®); Bussulfano (Busulfex® e Myleran®); Carboplatina (Paraplatin®); Lomustina (também conhecido como CCNU, CeeNU®); Cisplatina (também conhecido como CDDP, Platinol® e Platinol®-AQ); Clorambucil (Leukeran®); Ciclofosfamida (Cytoxan® e Neosar®); Dacarbazina (também conhecido como DTIC, DIC e imidazolcarboxamida, DTIC-Dome®); Altretamina (também conhecido como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); Prednumustina; Procarbazina (Matulane®); Mecloretamina (também conhecido como mostarda de nitrogênio, mustina e cloridrato de mecloroetamina, Mustargen®); Estreptozocina (Zanosar®); Tiotepa (também conhecido como tiofosfoamida, TESPA e TSPA, Thioplex®); Ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); e Bendamustina HCI (Treanda®).
[0907] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com fludarabina, ciclofosfamida e/ou rituximab. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com fludarabina, ciclofosfamida e rituximab (FCR). Em modalidades, o sujeito tem CLL. Por exemplo, o sujeito tem uma deleção no braço curto do cromossomo 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o sujeito não tem uma del(17p). Em modalidades, o sujeito compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em outras modalidades, o sujeito não compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em modalidades, a fludarabina é administrada a uma dosagem de cerca de 10-50 mg/m2 (por exemplo, cerca de 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35,
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35-40, 40-45 ou 45-50 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, a ciclofosfamida é administrada a uma dosagem de cerca de 200-300 mg/m2 (por exemplo, cerca de 200-225, 225-250, 250-275 ou 275-300 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, o rituximab é administrado a uma dosagem de cerca de 400-600 mg/m2 (por exemplo, 400-450, 450-500, 500-550 ou 550-600 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.
[0908] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com bendamustina e rituximab. Em modalidades, o sujeito tem CLL. Por exemplo, o sujeito tem uma deleção no braço curto do cromossomo 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o sujeito não tem uma del(17p). Em modalidades, o sujeito compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em outras modalidades, o sujeito não compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVn). Em modalidades, a bendamustina é administrada a uma dosagem de cerca de 70-110 mg/m2 (por exemplo, 70-80, 80-90, 90-100 ou 100-110 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, o rituximab é administrado a uma dosagem de cerca de 400-600 mg/m2 (por exemplo, 400-450, 450-500, 500-550 ou 550-600 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.
[0909] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e/ou um corticosteroide (por exemplo, prednisona). Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona (R-CHOP). Em modalidades, o sujeito tem linfoma difuso de grandes células B
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435/606 (DLBCL). Em modalidades, o sujeito tem DLBCL não volumoso em estágio limitado (por exemplo, compreende um tumor tendo um tamanho/diâmetro menor do que 7 cm). Em modalidades, o sujeito é tratado com radiação em combinação com R-CHOP. Por exemplo, ao sujeito é administrado R-CHOP (por exemplo, 1-6 ciclos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ciclos de R-CHOP), seguido de radiação. Em alguns casos, ao sujeito é administrado R-CHOP (por exemplo, 1-6 ciclos, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 ciclos de R-CHOP) após radiação.
[0910] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com etoposida, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina e/ou rituximab. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com etoposida, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina e rituximab (EPOCH-R). Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com EPOCH-R com dose ajustada (DA-EPOCH-R). Em modalidades, o sujeito tem um linfoma de células B, por exemplo, um linfoma de células B agressivo com Myc rearranjado.
[0911 ] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com rituximab e/ou lenalidomida. Lenalidomida ((F?S)-3-(4-Amino-1-oxo 1,3-di-hidro-2Hisoindol- 2-il)piperidino-2,6-diona) é um imunomodulador. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com rituximab e lenalidomida. Em modalidades, o sujeito tem linfoma folicular (FL) ou linfoma de células do manto (MCL). Em modalidades, o sujeito tem FL e não foi previamente tratado com uma terapia para câncer. Em modalidades, lenalidomida é administrada a uma dosagem de cerca de 10-20 mg (por exemplo, 10-15 ou 15-20 mg), por exemplo, diariamente. Em
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436/606 modalidades, rituximab é administrado a uma dosagem de cerca de 350-550 mg/m2 (por exemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 ou 475-500 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.
[0912] Inibidores de mTOR exemplificativos incluem, por exemplo, temsirolimus; ridaforolimus (formalmente conhecido como deferolimus (dimetilfosfinato de 1 fí,2fí,4S)-4-[(2fl)-2 [(1 fí,9S,12S,15fí,16E,18fí,19fí,21 R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35fl)-1,18-di-hidróxi-19,30-dimetóxi15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4azatriciclo[30.3.1.04’9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2metoxiciclo-hexila, também conhecido como AP23573 e MK8669, e descrito na Publicação PCT No. WO 03/064383); everolimus (Afinitor® ou RAD001); rapamicina (AY22989, Sirolimus®); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus (5-{2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4il]pirido[2,3-c/]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-Amino8-[fra/?s-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-c/]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4) e Λ^-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4/-/-1-benzopiran-2-il)morfolínio-4il]metóxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-L-serina, sal interno (SF1126, CAS 936487-67-1) (SEQ ID NQ: 1262), e XL765.
[0913] Exemplos de imunomoduladores incluem, por exemplo, afutuzumab (comercializado pela Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomida (CC-5013, Revlimid®); talidomida (Thalomid®), actimida (CC4047); e IRX-2 (mistura de citocinas humanas incluindo interleucina 1, interleucina 2 e interferon γ, CAS 951209-71-5, comercializado pela IRX Therapeutics).
[0914] Exemplos de antraciclinas incluem, por exemplo, doxorrubicina (Adriamycin® e Rubex®); bleomicina (lenoxane®); daunorrubicina (cloridrato de daunorrubicina, daunomicina e cloridrato de rubidomicina, Cerubidine®); daunorrubicina lipossômica (lipossomo de citrato de daunorrubicina, DaunoXome®); mitoxantrona (DHAD,
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Novantrone®); epirrubicina (Ellence™); idarrubicina (Idamycin®, Idamycin PFS®); mitomicina C (Mutamycin®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; e desacetilravidomicina.
[0915] Exemplos de alcalóides da vinca incluem, por exemplo, tartarato de vinorelbina (Navelbine®), Vincristina (Oncovin®) e Vindesina (Eldisine®); vinblastina (também conhecida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina e VLB, Alkaban-AQ® e Velban®); e vinorelbina (Navelbine®).
[0916] Exemplos de inibidores de proteossomos incluem bortezomib (Velcade®); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4-Metil-A/-((S)-1(((S)-4-meti I-1 -((F?)-2-meti loxi ran-2-i I)-1 -oxopentan-2-il)amino)-1 -oxo-3fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); e 0-Metil-A/-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-Lseril-O-metil-A/-[( 1 S)-2-[(2F?)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1 -(fenilmetil)etil]L-serinamida (ONX-0912).
[0917] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com brentuximab. Brentuximab é um conjugado de anticorpo e fármaco de anticorpo antiCD30 e monometilauristatina E. Em modalidades, o sujeito tem linfoma de Hodgkin (HL), por exemplo, HL recidivado ou refratário. Em modalidades, o sujeito compreende HL CD30+. Em modalidades, o sujeito foi submetido a um transplante de células-tronco autólogas (ASCT). Em modalidades, o sujeito não foi submetido a um ASCT. Em modalidades, brentuximab é administrado a uma dosagem de cerca de 1-3 mg/kg (por exemplo, cerca de 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 ou 2,5-3 mg/kg), por exemplo, por via intravenosa, por exemplo, a cada 3 semanas.
[0918] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com brentuximab e dacarbazina ou em combinação com brentuximab e bendamustina.
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Dacarbazina é um agente alquilante com o nome químico de 5-(3,3Dimetil-1-triazenil)imidazol-4-carboxamida. Bendamustina é um agente alquilante com o nome químico de ácido 4-[5-[Bis(2-cloroetil)amino]-1metilbenzimidazol-2-il]butanoico. Em modalidades, o sujeito tem linfoma de Hodgkin (HL). Em modalidades, o sujeito não foi previamente tratado com uma terapia para câncer. Em modalidades, o sujeito tem pelo menos 60 anos de idade, por exemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou mais anos de idade. Em modalidades, dacarbazina é administrada a uma dosagem de cerca de 300-450 mg/m2 (por exemplo, cerca de 300-325, 325-350, 350375, 375-400, 400-425 ou 425-450 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, bendamustina é administrada a uma dosagem de cerca de 75-125 mg/m2 (por exemplo, 75-100 ou 100-125 mg/m2, por exemplo, cerca de 90 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, brentuximab é administrado a uma dosagem de cerca de 1-3 mg/kg (por exemplo, cerca de 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 ou 2,5-3 mg/kg), por exemplo, por via intravenosa, por exemplo, a cada 3 semanas.
[0919] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de CD20, por exemplo, um anticorpo anti-CD20 (por exemplo, anticorpo anti-CD20 mono- ou biespecífico) ou um seu fragmento. Exemplos de anticorpos anti-CD20 incluem, mas não se limitam a, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, veltuzumab, obinutuzumab, TRU015 (Trubion Pharmaceuticals), ocaratuzumab e Pro131921 (Genentech). Ver, por exemplo, Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43.
[0920] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD20 compreende rituximab. Rituximab é um anticorpo monoclonal quimérico camundongo/humano IgG 1 capa que se liga a CD20 e provoca citólise de uma célula expressando CD20, por exemplo, como descrito em www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s53111bl.
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439/606 pdf. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com rituximab. Em modalidades, o sujeito tem CLL ou SLL.
[0921 ] Em algumas modalidades, rituximab é administrado de forma intravenosa, por exemplo, como infusão intravenosa. Por exemplo, cada infusão proporciona cerca de 500-2000 mg (por exemplo, cerca de 500550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900,
900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400,
1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, ou 1900
2000 mg) de rituximab. Em algumas modalidades, rituximab é administrado a uma dose de 150 mg/m2 a 750 mg/m2, por exemplo, cerca de 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400-425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2 ou 675-700 mg/m2, onde m2 indica a área de superfície corporal do sujeito. Em algumas modalidades, rituximab é administrado com um intervalo de dosagens de pelo menos 4 dias, por exemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 dias ou mais. Por exemplo, rituximab é administrado com um intervalo de dosagens de pelo menos 0,5 semanas, por exemplo, 0,5,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas ou mais. Em algumas modalidades, rituximab é administrado a uma dose e com um intervalo de dosagens descrito aqui durante um período de tempo, por exemplo, pelo menos 2 semanas, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6,7,8,9,10,11,12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas ou maior. Por exemplo, rituximab é administrado a uma dose e com um intervalo de dosagens descrito aqui durante um total de pelo menos 4 doses por ciclo de tratamento (por exemplo, pelo menos 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou mais doses por ciclo de tratamento).
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[0922] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD20 compreende ofatumumab. Ofatumumab é um anticorpo monoclonal humano IgGlK anti-CD20 com um peso molecular de aproximadamente 149 kDa. Por exemplo, ofatumumab é gerado usando camundongo transgênico e tecnologia de hibridoma e é expresso e purificado a partir de uma linhagem de células murinas recombinantes (NSO). Ver, por exemplo, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; e Identificador do Ensaio Clínico número NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 e NCT01397591. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com ofatumumab. Em modalidades, o sujeito tem CLL ou SLL.
[0923] Em algumas modalidades, ofatumumab é administrado como infusão intravenosa. Por exemplo, cada infusão proporciona cerca de 150-3000 mg (por exemplo, cerca de 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 10001200,1200-1400, 1400-1600,1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 22002400, 2400-2600, 2600-2800, ou 2800-3000 mg) de ofatumumab. Em modalidades, ofatumumab é administrado a uma dosagem de partida de cerca de 300 mg, seguido de 2000 mg, por exemplo, durante cerca de 11 doses, por exemplo, durante 24 semanas. Em algumas modalidades, ofatumumab é administrado com um intervalo de dosagens de pelo menos 4 dias, por exemplo, 4, 7, 14, 21,28, 35 dias ou mais. Por exemplo, ofatumumab é administrado com um intervalo de dosagens de pelo menos 1 semana, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 semanas ou mais. Em algumas modalidades, ofatumumab é administrado a uma dose e com um intervalo de dosagens descrito aqui durante um período de tempo,
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441/606 por exemplo, pelo menos uma semana, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 semanas ou maior, ou 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12 meses ou maior, ou 1, 2, 3, 4, 5 anos ou maior. Por exemplo, ofatumumab é administrado a uma dose e com um intervalo de dosagens descrito aqui durante um total de pelo menos duas doses por ciclo de tratamento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 ou mais doses por ciclo de tratamento).
[0924] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende ocrelizumab. Ocrelizumab é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado, por exemplo, como descrito nos Identificadores dos Ensaios Clínicos Nos. NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570 e Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87.
[0925] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende veltuzumab. Veltuzumab é um anticorpo monoclonal humanizado contra CD20. Ver, por exemplo, Identificador do Ensaio Clínico No. NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581 e Goldenberg etal. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55.
[0926] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende GA101. GA101 (também denominado obinutuzumab ou RO5072759) é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado e glico-manipulado. Ver, por exemplo, Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):58896; Identificadores de Ensaios Clínicos NQs: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 e NCT01414205; e www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.
[0927] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende AME133v. AME-133v (também chamado LY2469298 ou ocaratuzumab) é um anticorpo monoclonal IgG 1 humanizado contra CD20 com afinidade intensificada para o receptor FcvRIlIa e uma atividade aumentada de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em
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442/606 comparação com rituximab. Ver, por exemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; e Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403.
[0928] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende PRO131921. PRO131921é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado manipulado para ter melhor ligação a FcvRIIIa e ADCC intensificada em comparação com rituximab. Ver, por exemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1 (2011 ):13-25; e Casulo et al. Clin Immunol. 154.1 (2014):37-46; e Identificador de Ensaios Clínicos NQ NCT00452127.
[0929] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende TRU015. TRU-015 é uma proteína de fusão anti-CD20 derivada de domínios de um anticorpo contra CD20. TRU-015 é menor do que anticorpos monoclonais, mas retém funções efetoras mediadas por Fc. Ver, por exemplo, Robak etal. BioDrugs25.1(2011):13-25. TRU-015 contém um fragmento variável de cadeia simples (scFv) anti-CD20 ligado a domínios de dobradiça de IgG 1 humana, CH2 e CH3 mas não tem os domínios CH1 e CL.
[0930] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD20 aqui descrito é conjugado ou ligado de outra forma a um agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterapêutico (por exemplo, citoxano, fludarabina, inibidor de histona desacetilase, agente de desmetilação, vacina de peptideo, antibiótico antitumoral, inibição de tirosina quinase, agente alquilante, agente antimicrotúbulos ou antimitótico), agente antialérgico, agente antináusea (ou antiemético), analgésico ou agente citoprotetor aqui descrito.
[0931 ] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de linfoma de células B 2 (BCL-2) (por exemplo, venetoclax, também denominado ABT-199 ou GDC-0199) e/ou rituximab. Em modalidades, uma célula
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443/606 expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com venetoclax e rituximab. Venetoclax é uma molécula pequena que inibe a proteína antiapoptótica BCL-2. A estrutura do venetoclax (4-(4-{[2-(4-clorofen i l)-4,4-di meti Iciclo-hex-1 -en-1 -i I] meti I} piperazin-1 -il)-A/-({3-nitro-4-[(tetra-hidro-2/-/-piran-4-ilmetil)amino]fenil} sulfonil)-2-( 1 /-/-pirrolo[2,3-b]pi ridin-5-ilóxi)benzamida) é mostrada abaixo.
Figure BR112019019426A2_D0003
[0932] Em modalidades, o sujeito tem CLL. Em modalidades, o sujeito tem CLL recidivado, por exemplo, o sujeito recebeu previamente terapia contra o câncer. Em modalidades, venetoclax é administrado a uma dosagem de cerca de 15-600 mg (por exemplo, 15-20, 20-50, 5075, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500 ou 500-600 mg), por exemplo, diariamente. Em modalidades, rituximab é administrado a uma dosagem de cerca de 350-550 mg/m2 (por exemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 ou 475-500 mg/m2), por exemplo, intravenosamente, por exemplo, mensalmente.
[0933] Em uma modalidade, células expressando um CAR aqui descrito são administradas a um sujeito em combinação com uma molécula que diminui a população de células Treg. Métodos que diminuem o número de (por exemplo, esgotam) células Treg são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, depleção de CD25, administração de ciclofosfamida, modulação da função de GITR. Sem querer estar limitados pela teoria, acredita-se que reduzir o número de células Treg em um sujeito antes de aférese ou antes da administração de uma célula expressando CAR aqui descrita reduz o número de
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444/606 células imunes indesejadas (por exemplo, Tregs) no microambiente tumoral e reduz o risco de recaída do sujeito. Em uma modalidade, células expressando um CAR descrito aqui são administradas a um sujeito em combinação com uma molécula visando GITR e/ou modulando funções de GITR, tal como um agonista de GITR e/ou um anticorpo para GITR que procede à depleção de células T reguladoras (Tregs). Em modalidades, células expressando um CAR descrito aqui são administradas a um sujeito em combinação com ciclofosfamida. Em uma modalidade, as moléculas de ligação a GITR e/ou moléculas modulando funções de GITR (por exemplo, agonista de GITR e/ou anticorpos para GITR que procedem à depleção de Treg) são administradas antes da administração da célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agonista de GITR pode ser administrado antes de aférese das células. Em modalidades, ciclofosfamida é administrada a o sujeito antes da administração (por exemplo, infusão ou reinfusão) da célula expressando CAR ou antes de aférese das células. Em modalidades, ciclofosfamida e um anticorpo anti-GITR são administrados ao sujeito antes da administração (por exemplo, infusão ou reinfusão) da célula expressando CAR ou antes de aférese das células. Em uma modalidade, o sujeito tem câncer (por exemplo, um câncer sólido ou um câncer hematológico tal como ALL ou CLL). Em uma modalidade, o sujeito tem CLL. Em modalidades, o sujeito tem ALL. Em modalidades, o sujeito tem um câncer sólido, por exemplo, um câncer sólido descrito aqui. Exemplos de agonistas de GITR incluem, por exemplo, proteínas de fusão com GITR e anticorpos anti-GITR (por exemplo, anticorpos anti-GITR bivalentes) tais como, por exemplo, uma proteína de fusão com GITR descrita na Patente U.S. NQ: 6.111.090, Patente Européia NQ: 090505B1, Patente U.S. NQ: 8.586.023, Publicações PCT NQS.: WO 2010/003118 e 2011/090754, ou um anticorpo anti-GITR descrito, por exemplo, na Patente U.S. NQ:
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7.025.962, Patente Européia NQ: 1947183B1, Patente U.S. NQ: 7.812.135, Patente U.S. NQ: 8.388.967, Patente U.S. NQ: 8.591.886, Patente Européia NQ: EP 1866339, Publicação PCT NQ: WO 2011/028683, Publicação PCT lf:WO 2013/039954, Publicação PCT NQ: W02005/007190, Publicação PCT NQ: WO 2007/133822, Publicação PCT NQ: W02005/055808, Publicação PCT NQ: WO 99/40196, Publicação PCT NQ: WO 2001/03720, Publicação PCT NQ: WO99/20758, Publicação PCT NQ: W02006/083289, Publicação PCT NQ: WO 2005/115451, Patente U.S. NQ: 7.618.632 e Publicação PCT NQ: WO 2011/051726.
[0934] Em uma modalidade, uma célula que expressa CAR descrita no presente documento é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR descrito no presente documento, por exemplo, um rapálogo, tal como everolimus. Em uma modalidade, o inibidor de mTOR é administrado antes da célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o inibidor de mTOR pode ser administrado antes de aférese das células. Em uma modalidade, o sujeito tem CLL.
[0935] Em uma modalidade, uma célula que expressa CAR descrita no presente documento é administrada a um sujeito em combinação com um agonista de GITR, por exemplo, um agonista de GITR descrito no presente documento. Em uma modalidade, o agonista de GITR é administrado antes da célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agonista de GITR pode ser administrado antes de aférese das células. Em uma modalidade, o sujeito tem CLL.
[0936] Em uma modalidade, uma célula expressando CAR aqui descrita pode ser usada em combinação com um inibidor de quinases. Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de CDK4, por exemplo, um inibidor de CDK4 aqui descrito, por exemplo, um inibidor de CD4/6, tal como, por exemplo, cloridrato de 6-Acetil-8-ciclopentil-5
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446/606 metil-2-(5-piperazin-1 -il-piridin-2-ilamino)-8/-/-pirido[2,3-c/]pirimidin-7ona (também referido como palbociclib ou PD0332991). Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de BTK, por exemplo, um inibidor de BTK aqui descrito, tal como, por exemplo, ibrutinib. Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR aqui descrito, tal como, por exemplo, rapamicina, um análogo de rapamicina, OSI-027. O inibidor de mTOR pode ser, por exemplo, um inibidor de mTORCI e/ou um inibidor de mTORC2, por exemplo, um inibidor de mTORCI e/ou inibidor de mTORC2 aqui descrito. Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de MNK, por exemplo, um inibidor de MNK aqui descrito, tai como, por exemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-cf] pirimidina. O inibidor de MNK pode ser, por exemplo, um inibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a e/ou MNK2b. Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de PI3K/mTOR duplo aqui descrito, tal como, por exemplo, PF-04695102.
[0937] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de CDK4 selecionado de aloisina A; flavopiridol ou HMR-1275, 2-(2clorofenil)-5,7-di-hidróxi-8-[(3S,4R)-3-hidróxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066); cloridrato de 2-(2-Clorofenil)-5,7-dihidróxi-8-[(2F?,3S)-2-(hidroximetil)-1 -metil-3-pirrolidinil]-4/-/-1 -benzopiran4-ona (P276-00); 1 -metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1 /-/-imidazol-2-il]-4piridinil]óxi]-A/-[4-(trifluorometil)fenil]-1 /-/-benzimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[[(5-fórc-butiloxazol-2-il)metil]tio]tiazol-2il]piperidino-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6difluorofenil)-5/-/-pirimido[5,4-c/][2]benzazepin-2-il]amino]-benzoico (MLN8054); 5-[3-(4,6-difluoro-1 H-benzimidazol-2-il)-1 H-indazol-5-il]-Netil-4-metil-3-piridinometanamina (AG-024322); N-(piperidin-4-il)amida do ácido 4-(2,6-diclorobenzoilamino)-1 H-pirazol-3-carboxílico (AT7519);
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4-[2-meti I-1 -(1 - meti leti I)-1 H-i m idazol-5-i I]-Λ/-[4-(meti Isu Ifon i I )fen i l]-2pirimidinamina (AZD5438); e XL281 (BMS908662).
[0938] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de CDK4, por exemplo, palbociclib (PD0332991), e o palbociclib é administrado a uma dose de cerca de 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por exemplo, 75 mg, 100 mg ou 125 mg) diariamente durante urn periodo de tempo, por exemplo, diariamente durante 14-21 dias de um ciclo de 28 dias, ou diariamente durante 7-12 dias de um ciclo de 21 dias. Em uma modalidade, são administrados 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de palbociclib.
[0939] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de quinase dependente de ciclina (CDK) 4 ou 6, por exemplo, um inibidor de CDK4 ou um inibidor de CDK6 descrito aqui. Em modalidades, uma célula expressando CAR aqui descrita é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de CDK4/6 (por exemplo, um inibidor que visa tanto CDK4 como CDK6), por exemplo, um inibidor de CDK4/6 aqui descrito. Em uma modalidade, o sujeito tem MCL. MCL é um câncer agressivo que não responde bem a terapias atualmente disponíveis, ou seja, essencialmente incurável. Em muitos casos de MCL, ciclina D1 (um regulador de CDK4/6) é expresso (por exemplo, devido a translocação cromossômica envolvendo genes de imunoglobulina e ciclina D1) em células de MCL. Assim, sem querer estar limitado pela teoria, pensa-se que células de MCL são altamente sensíveis a inibição de CDK4/6 com elevada especificidade (ou seja, efeito mínimo em células imunes normais). Inibidores de CDK4/6 isolados têm tido alguma eficácia no tratamento de MCL, mas apenas atingiram remissão parcial com uma elevada taxa de recaída. Um exemplo de inibidor de CDK4/6 é LEE011 (também chamado de ribociclib), cuja estrutura é mostrada abaixo.
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Figure BR112019019426A2_D0004
[0940] Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que a administração de uma célula expressando CAR aqui descrita com um inibidor de CDK4/6 (por exemplo, LEE011 ou outro inibidor de CDK4/6 aqui descrito) pode atingir maior responsividade, por exemplo, com taxas de remissão mais elevadas e/ou taxas de recaída mais baixas, por exemplo, em comparação com um inibidor de CDK4/6 isolado.
[0941] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de BTK selecionado de ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; e LFM-A13. Em uma modalidade preferencial, o inibidor de BTK não reduz nem inibe a atividade de quinase de quinase induzível por interleucina-2 (ITK), e é selecionado de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; e LFM-A13.
[0942] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de BTK, por exemplo, ibrutinib (PCI-32765). Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinib). Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com ibrutinib (também denominado PCI-32765). A estrutura do ibrutinib (1-[(3F?)-3-[4-Amino-3(4-fenoxifen i I)-1 /-7-pi razolo[3,4-d]pi ri m idi n-1 -i l]piperidi n-1 -i l]prop-2-en-1 ona) é mostrada abaixo.
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[0943] Em modalidades, o sujeito tem CLL, linfoma de células do manto (MCL) ou linfoma linfocítico de pequenas células (SLL). Por exemplo, o sujeito tem uma deleção no braço curto do cromossomo 17 (dei(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o sujeito não tem uma del(17p). Em modalidades, o sujeito tem CLL ou SLL recidivado, por exemplo, o sujeito foi previamente administrado com uma terapia contra câncer (por exemplo, previamente administrado com uma, duas, três ou quatro terapias contra câncer anteriores). Em modalidades, o sujeito tem CLL ou SLL refratário. Em outras modalidades, o sujeito tem linfoma folicular, por exemplo, linfoma folicular recidivado ou refratário. Em algumas modalidades, ibrutinib é administrado a uma dosagem de cerca de 300-600 mg/dia (por exemplo, cerca de 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550 ou 550-600 mg/dia, por exemplo, cerca de 420 mg/dia ou cerca de 560 mg/dia), por exemplo, oralmente. Em modalidades, o ibrutinib é administrado a uma dose de cerca de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por exemplo, 250 mg, 420 mg ou 560 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante um ciclo de 21 dias, ou diariamente durante um ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, são administrados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de ibrutinib. Sem ficar restringido pela teoria, se crê que a adição de ibrutinib intensifica a resposta proliferativa de células T e pode desviar células T de um fenótipo T-auxiliador-2 (Th2) para T-auxiliador-1 (Th1). Th1 e Th2 são fenótipos de células T auxiliadoras, com Th1 i/erst/sTh2 dirigindo diferentes vias de resposta imunológica. Um fenótipo Th1 está associado a respostas pró-inflamatórias, por exemplo, para exterminar células, como patógenos/vírus intracelulares ou células cancerígenas, ou perpetuando respostas autoimunes. Um fenótipo Th2 está associado ao acúmulo eosinofílico e respostas anti-inflamatórias.
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[0944] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de mTOR selecionado de temsirolimus; ridaforolimus (dimetilfosfinato de 1 F?,2F?,4S)-4-[(2F?)-2 [(1 F?,9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19 R,21 R,
23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35F?)-1,18-di-hidróxi-19,30-dimetóxi15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4azatriciclo[30.3.1.04’9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2metoxiciclo-hexila, também conhecido como AP23573 e MK8669; everolimus (RAD001); rapamicina (AY22989); simapimod; (5-{2,4bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-c/]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil) metanol (AZD8055); 2-amino-8-[íra/?s-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6metóxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-c/]pirimidin-7(8/-/)-ona (PF04691502) e Λ^-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1 -benzopiran-2-il)morfolínio-4il]metóxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-L-serina, sal interno (SF1126) (SEQ ID N2: 1262) e XL765.
[0945] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de mTOR, por exemplo, rapamicina, e a rapamicina é administrada a uma dose de cerca de 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por exemplo, 6 mg) diariamente por um período de tempo, por exemplo, diariamente por ciclo de 21 dias ou diariamente por ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de rapamicina são administrados. Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de mTOR, por exemplo, everolimus, e o everolimus é administrado a uma dose de cerca de 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por exemplo, 10 mg) diariamente por um período de tempo, por exemplo, diariamente por ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de everolimus são administrados.
[0946] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é um inibidor de MNK selecionado de CGP052088; 4-amino-3-(p-fluorofenilamino)
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451/606 pirazolo[3,4-c/]pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-17804452; e 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo[3,4-c/]pirimidina.
[0947] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) (por exemplo, um inibidor de PI3K descrito aqui, por exemplo, idelalisib ou duvelisib) e/ou rituximab. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com idelalisib e rituximab. Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com duvelisib e rituximab. Idelalisib (também denominado GS-1101 ou CAL-101; Gilead) é uma molécula pequena que bloqueia a isoforma delta de PI3K. A estrutura de idelalisib (5-Fluoro-3-fenil-2-[(1 S)-1-(7/-/-purin-6-ilamino)propil]4(3/-/)-quinazolinona) é mostrada abaixo.
Figure BR112019019426A2_D0005
[0948] Duvelisib (também chamado IPI-145; Infinity Pharmaceuticals e Abbvie) é uma molécula pequena que bloqueia PI3Kδ,γ. A estrutura de duvelisib (8-Cloro-2-fenil-3-[(1S)-1-(9H-purin-6ilamino)etil]-1(2H)-isoquinolinona) é mostrada abaixo.
o
Λ ..
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[0949] Em modalidades, o sujeito tem CLL. Em modalidades, o sujeito tem CLL recidivante, por exemplo, o sujeito foi previamente administrado com uma terapia para câncer (por exemplo, previamente administrado com um anticorpo anti-CD20 ou previamente administrado com ibrutinib). Por exemplo, o sujeito tem uma deleção no braço curto do cromossomo 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o sujeito não tem uma del(17p). Em modalidades, o sujeito compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em outras modalidades, o sujeito não compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em modalidades, o sujeito tem uma deleção no braço longo do cromossomo 11 (del(11q)). Em outras modalidades, o sujeito não tem uma del(11q). Em modalidades, idelalisib é administrado a uma dosagem de cerca de 100-400 mg (por exemplo, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, ou 375-400 mg), por exemplo, BID. Em modalidades, duvelisib é administrado a uma dosagem de cerca de 15-100 mg (por exemplo, cerca de 15-25, 25-50, 50-75 ou 75-100 mg), por exemplo, duas vezes ao dia. Em modalidades, rituximab é administrado a uma dosagem de cerca de 350-550 mg/m2 (por exemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, ou 475500 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.
[0950] Em uma modalidade, o inibidor de quinases é uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) dual e inibidor de mTOR selecionado de 2-Amino-8-[íra/?s-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metóxi-3pi ridi n i l)-4-meti l-pi rido[2,3-d] pi ri m idi n-7(8 H)-ona (PF-04691502); Λ/-[4[[4-(Dimetilamino)-1 -piperidinil]carbonil]fenil]-/V-[4-(4,6-di-4-morfolinil1,3,5-triazin-2-il)fenil]ureia (PF-05212384, PKI-587); 2-Metil-2-{4-[3metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-di-hidro-1 /-/-imidazo[4,5-c]quinolin-1
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453/606 il]fenil}propanonitrila (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4Difluoro-N-{2-(metilóxi)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenossulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipi ridi n-3-i l)-3-meti I-1 -(4(piperazin-1 -il)-3-(trifluorometil)fenil)-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)ona, ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-Morfolinilpirido[3',2':4,5] furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol (PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343) e N-[2-[(3,5Dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil] aminofenilsulfonamida (XL765).
[0951 ] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de linfoma quinase anaplásica (ALK). Quinases ALK exemplificativas incluem, mas não se limitam a, crizotinib (Pfizer), ceritinib (Novartis), alectinib (Chugai), brigatinib (também denominado AP26113; Ariad), entrectinib (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (ver, por exemplo, Identificador de Ensaio Clínico NQ NCT02048488), CEP-37440 (Teva), e X-396 (Xcovery). Em algumas modalidades, o sujeito tem um câncer sólido, por exemplo, um câncer sólido descrito aqui, por exemplo, câncer do pulmão.
[0952] O nome químico de crizotinib é 3-[(1 F?)-1-(2,6-dicloro-3fIuorofenil)etóxi]-5-( 1 -piperidin-4-iIpirazol-4-il)piridin-2-amina. O nome químico de ceritinib é 5-Cloro-AA[2-isopropóxi-5-metil-4-(4piperidinil)fenil]-A/4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. O nome químico de alectinib é 9-etil-6,6-dimetil-8-(4-morfolinopiperidin-1 il)-11-oxo-6,11-di-hidro-5H-benzo[b]carbazol-3-carbonitrila. O nome químico de brigatinib é 5-Cloro-N2-{4-[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]-2metoxifenil}-N4-[2-(dimetilfosforil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. O nome químico de entrectinib é N-(5-(3,5-difluorobenzil)-1 H-indazol-3-il)-4-(4metilpiperazin-1-il)-2-((tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)benzamida. O nome químico de PF-06463922 é (10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16
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454/606 tri meti I -15-oxo-10,15,16,17-tetra-hidro-2H-8,4-(meteno)pirazolo[4,3-h] [2,5,11]-benzoxadiazaciclotetradecino-3-carbonitrila. A estrutura química de CEP-37440 é (S)-2-((5-cloro-2-((6-(4-(2-hidroxietil) piperazin1-il)-1-metóxi-6,7,8,9-tetra-hidro-5H-benzo[7]anulen-2-il)amino)pirimidin-4il)amino)-N-metilbenzamida. O nome químico de X-396 é (R)-6-amino-5(1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etóxi)-N-(4-(4-metilpiperazino-1-carbonil)fenil)piridazino-3-carboxamida.
[0953] Fármacos que inibem a fosfatase dependente de cálcio calcineurina (ciclosporina e FK506) ou inibem a p70S6 quinase que é importante para sinalização induzida pelo fator de crescimento (rapamicina) (Liu etal., Ce//66:807-815,1991; Henderson etal., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer etal., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993) podem também ser usados. Em um aspecto adicional, as composições celulares da presente invenção podem ser administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) transplante de medula óssea, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterapêuticos como fludarabina, terapia com radiação de feixe externo (XRT), ciclofosfamida e/ou anticorpos como OKT3 ou CAMPATH. Em um aspecto, as composições celulares da presente invenção são administradas a seguir a terapia ablativa de células B como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em uma modalidade, sujeitos podem ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia de dose elevada seguido de transplantação de células-tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, a seguir ao transplante, os sujeitos recebem uma infusão das células imunes expandidas da presente invenção. Em uma modalidade adicional, células expandidas são administradas antes ou após cirurgia.
[0954] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um inibidor de indolamina 2,3-dioxigenase (IDO). IDO é uma enzima que catalisa a
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455/606 degradação do aminoácido, L-triptofano, em quinurenina. Muitos cânceres sobre-expressam IDO, por exemplo, câncer prostático, colorretal, pancreático, cervical, gástrico, do ovário, cabeça e do pulmão. pDCs, macrófagos, e células dendríticas (DCs) podem expressar IDO. Sem ficar limitado pela teoria, se crê que um decréscimo em L-triptofano (por exemplo, catalisado por IDO) resulta em um meio imunossupressor por indução de anergia e apoptose de células T. Assim, sem ficar limitado pela teoria, se crê que um inibidor de IDO pode intensificar a eficácia de uma célula expressando CAR descrita aqui, por exemplo, por decréscimo da supressão ou morte de uma célula imune expressando CAR. Em modalidades, o sujeito tem um tumor sólido, por exemplo, um tumor sólido descrito aqui, por exemplo, câncer prostático, colorretal, pancreático, cervical, gástrico, do ovário, cabeça ou do pulmão. Inibidores de IDO exemplificativos incluem, mas não se limitam a, 1-metil-triptofano, indoximod (NewLink Genetics) (ver, por exemplo, Identificadores de Ensaios Clínicos Nos. NCT01191216; NCT01792050) e INCB024360 (Incyte Corp.) (ver, por exemplo, Identificadores de Ensaios Clínicos Nos. NCT01604889; NCT01685255).
[0955] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um modulador de células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs). MDSCs se acumulam na periferia e no sítio tumoral de muitos tumores sólidos. Estas células suprimem respostas de células T, desse modo restringindo a eficácia da terapia com células expressando CAR. Sem ficar limitado pela teoria, se crê que a administração de um modulador de MDSC intensifica a eficácia de uma célula expressando CAR descrita aqui. Em uma modalidade, o sujeito tem um tumor sólido, por exemplo, um tumor sólido descrito aqui, por exemplo, glioblastoma. Moduladores de MDSCs exemplificativos incluem, mas não se limitam a, MCS110 e BLZ945. MCS110 é um anticorpo monoclonal (mAb) contra o fator
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456/606 estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). Ver, por exemplo, Identificador de Ensaios Clínicos NQ NCT00757757. BLZ945 é um inibidor de molécula pequena do receptor do fator estimulador de colônias 1 (CSF1R). Ver, por exemplo, Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72. A estrutura de BLZ945 é mostrada abaixo.
Figure BR112019019426A2_D0006
[0956] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com uma célula T CAR CD19 (por exemplo, CTL019, por exemplo, como descrito em WO2012/079000, incorporado aqui a título de referência, ou CTL119). Em modalidades, o sujeito tem um linfoma CD19+, por exemplo, um Linfoma de não Hodgkin (NHL) CD19+, um FL CD19+ ou um DLBCL CD19+. Em modalidades, o sujeito tem um linfoma CD19+ com recidiva ou refratário. Em modalidades, uma quimioterapia com linfodepleção é administrada ao sujeito antes, de modo concorrente ou após a administração (por exemplo, infusão) de células T CAR CD19. Em um exemplo, a quimioterapia com linfodepleção é administrada ao sujeito antes da administração de células T CAR CD19. Por exemplo, a quimioterapia com linfodepleção termina 1-4 dias (por exemplo, 1,2, 3 ou 4 dias) antes da infusão de células T CAR CD19. Em modalidades, múltiplas doses de células T CAR CD19 são administradas, por exemplo, como descrito aqui. Por exemplo, uma única dose compreende cerca de 5 x 108 células T CAR CD19. Em modalidades, uma quimioterapia com linfodepleção é administrada ao sujeito antes, de modo concorrente ou após a administração (por exemplo, infusão)
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457/606 de uma célula expressando CAR descrita aqui, por exemplo, uma célula expressando CAR não CD19. Em modalidades, uma CART CD19 é administrada ao sujeito antes, de modo concorrente ou após a administração (por exemplo, infusão) de uma célula expressando CAR não CD19, por exemplo, uma célula expressando CAR não CD19 descrita aqui.
[0957] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui é administrada a um sujeito em combinação com um polipeptídeo de interleucina-15 (IL-15), um polipeptídeo de receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra) ou uma combinação de um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15Ra, por exemplo, hetlL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetlL-15 é um complexo não covalente heterodimérico de IL-15 e IL-15Ra. hetlL-15 é descrito, por exemplo, em U.S. 8.124.084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413 e U.S. 2011/0081311, incorporados aqui a título de referência. Em modalidades, het-IL-15 é administrado subcutaneamente. Em modalidades, o sujeito tem um câncer, por exemplo, câncer sólido, por exemplo, melanoma ou câncer do cólon. Em modalidades, o sujeito tem um câncer metastático.
[0958] Em uma modalidade, ao sujeito pode ser administrado um agente que reduz ou melhora um efeito secundário associado à administração de uma célula expressando CAR. Efeitos secundários associados à administração de uma célula expressando CAR incluem, mas não se limitam a, CRS e linfo-histiocitose hemafagocítica (HLH), também designada Sindrome de Ativação de Macrófagos (MAS). Os sintomas de CRS incluem febres altas, náusea, hipotensão transitória, hipoxia e similares. CRS pode incluir sinais e sintomas constitucionais clínicos como febre, fadiga, anorexia, mialgias, artralgias, náusea, vômitos e cefaleias. CRS pode incluir sinais e sintomas clínicos ao nível da pele como erupções cutâneas. CRS pode incluir sinais e sintomas
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458/606 gastrointestinais clínicos tais como náusea, vômitos e diarréia. CRS pode incluir sinais e sintomas respiratórios clínicos tais como taquipneia e hipoxemia. CRS pode incluir sinais e sintomas cardiovasculares clínicos tais como taquicardia, pressão arterial aumentada, hipotensão, aumento do débito cardíaco (início) e potencialmente redução do débito cardíaco (tardio). CRS pode incluir sinais e sintomas clínicos de coagulação tais como dímero D elevado, hipofibrinogenemia com ou sem hemorragia. CRS pode incluir sinais e sintomas clínicos renais tais como azotemia. CRS pode incluir sinais e sintomas hepáticos clínicos tais como transaminite e hiperbilirrubinemia. CRS pode incluir sinais e sintomas neurológicos clínicos tais como cefaleia, alterações do estado mental, confusão, delírio, dificuldade em encontrar as palavras ou afasia clara, alucinações, tremuras, dimetria, motricidade alterada e convulsões.
[0959] Em conformidade, os métodos aqui descritos podem compreender administrar uma célula expressando CAR aqui descrita a um sujeito e administrar adicionalmente um ou mais agentes para gerenciar níveis elevados de um fator solúvel resultante de tratamento com uma célula expressando CAR. Em uma modalidade, o fator solúvel elevado no sujeito é um ou mais de IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL-6. Em uma modalidade, o fator elevado no sujeito é um ou mais de IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 e fractalquina. Assim, um agente administrado para tratar este efeito secundário pode ser um agente que neutraliza um ou mais destes fatores solúveis. Em uma modalidade, o agente que neutraliza uma ou mais destas formas solúveis é um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigenos. Exemplos de tais agentes incluem, mas não se limitam a, um esteroide (por exemplo, corticosteroide), um inibidor de TNFa e um inibidor de IL-6. Um exemplo de um inibidor de TNFa é uma molécula de anticorpo anti-TNFa tal como infliximab, adalimumab, certolizumab pegol e golimumab. Outro exemplo de um
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459/606 inibidor de TNFa é uma proteína de fusão como etanercept. Inibidores de moléculas pequenas de TNFa incluem, mas não se limitam a, derivados de xantina (por exemplo, pentoxifilina) e bupropiona. Um exemplo de um inibidor de IL-6 é uma molécula de anticorpo anti-IL-6 ou uma molécula de anticorpo anti-receptor de IL-6 tal como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 e FM101. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-receptor de IL-6 é tocilizumab. Um exemplo de um inibidor de base IL-1R é anaquinra.
[0960] Em uma modalidade, ao sujeito pode ser administrado um agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibidora. Moléculas inibidoras, por exemplo, Morte Programada 1 (PD-1), podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR para montar uma resposta imune efetora. Os exemplos de moléculas inibidoras incluem PD-1, PDL1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGF beta. A inibição de uma molécula inibidora, por exemplo, por inibição ao nível do DNA, RNA ou proteína, pode otimizar o desempenho de uma célula expressando CAR. Em modalidades, um ácido nucleico inibidor, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intervaladas (CRISPR), uma nuclease efetora do tipo ativador da transcrição (TALEN) ou uma endonuclease dedo de zinco (ZFN), por exemplo, como descrito aqui, pode ser usado para inibir a expressão de uma molécula inibidora na célula expressando CAR. Em uma modalidade, o inibidor é um shRNA. Em uma modalidade, a molécula inibidora é inibida dentro de uma célula que expressa CAR. Nessas modalidades, uma molécula de dsRNA que inibe a expressão
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460/606 da molécula inibidora está ligada ao ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes, do CAR. Em uma modalidade, o inibidor de um sinal inibidor pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a uma molécula inibidora. Por exemplo, o agente pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a PD-1, PD-L1, PD-L2 ou CTLA4 (por exemplo, ipilimumab (também referido como MDX-010 e MDX-101, e comercializado como Yervoy®; Bristol-Myers Squibb; Tremelimumab (anticorpo monoclonal lgG2 comercializado pela Pfizer, anteriormente conhecido como ticilimumab, CP-675,206)). Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a TIM3. Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5). Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a LAG3.
[0961] PD-1 é um membro inibidor da família de receptores CD28 que também inclui CD28, CTLA-4, ICOS e BTLA. PD-1 é expresso em células B, células T e células mieloides ativadas (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Foi mostrado que dois ligantes para PD-1, PD-L1 e PD-L2 subregulam a ativação de células T por ligação a PD-1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latch man et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 é abundante em cânceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med&\ :281 7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). A supressão imune pode ser revertida por inibição da interação local de PD-1 com PD-L1. Anticorpos, fragmentos de anticorpos e outros inibidores de PD-1, PD-L1 e PD-L2 estão disponíveis na técnica e podem ser usados em combinação com CARs da presente invenção descritos aqui. Por exemplo, nivolumab (também referido como BMS-936558 ou MDX1106; Bristol-Myers
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Squibb) é um anticorpo monoclonal lgG4 totalmente humano que bloqueia especificamente PD-1. Nivolumab (clone 5C4) e outros anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente a PD-1 são revelados em US 8,008,449 e W02006/121168. Pidilizumab (CT011; Cure Tech) é um anticorpo monoclonal IgG 1 k humanizado que se liga a PD-1. Pidilizumab e outros anticorpos monoclonais anti-PD-1 humanizados são revelados em W02009/101611. Pembrolizumab (anteriormente conhecido como lambrolizumab, e também referido como MK03475; Merck) é um anticorpo monoclonal lgG4 humanizado que se liga a PD-1. Pembrolizumab e outros anticorpos anti-PD-1 humanizados são revelados em US 8.354.509 e W02009/114335. MEDI4736 (Medimmune) é um anticorpo monoclonal humano que se liga a PDL1 e inibe a interação do ligante com PD1. MDPL3280A (Genentech/Roche) é um anticorpo monoclonal IgG 1 otimizado em Fc humano que se liga a PD-L1. MDPL3280A e outros anticorpos monoclonais humanos para PD-L1 são revelados na Patente U.S. Ns.: 7,943,743 e Publicação U.S. Ns.: 20120039906. Outros agentes de ligação anti-PD-L1 incluem YW243.55.S70 (as regiões variáveis das cadeias pesada e leve são mostradas em SEQ ID NQS 20 e 21 em WO2010/077634) e MDX-1 105 (também referido como BMS-936559 e, por exemplo, agentes de ligação anti-PD-L1 revelados em W02007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por exemplo, revelado em W02010/027827 e WO2011/066342) é um receptor solúvel de fusão de Fc PD-L2 que bloqueia a interação entre PD-1 e B7H1. Outros anticorpos anti-PD-1 incluem AMP 514 (Amplimmune), entre outros, por exemplo, anticorpos anti-PD-1 revelados em US 8,609,089, US 2010028330 e/ou US 20120114649.
[0962] TIM-3 (imunoglobulina-3 de células T) também regula negativamente a função de células T, em particular em células T CD4+ 1 auxiliadoras e T CD8+ 1 citotóxicas segregando IFN-g e desempenha
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462/606 um papel crítico na exaustão de células T. A inibição da interação entre TIM3 e os seus ligantes, por exemplo, galectina-9 (Gal9), fosfotidilserina (PS) e HMGB1, pode aumentar a resposta imunológica. Anticorpos, fragmentos de anticorpos e outros inibidores de TIM3 e seus ligantes estão disponíveis na técnica e podem ser usados em combinação com um CAR CD19 descrito aqui. Por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo, moléculas pequenas ou inibidores peptídicos que visam TIM3 se ligam ao domínio IgV de TIM3 para inibir a interação com os seus ligantes. Anticorpos e peptideos que inibem TIM3 são revelados em WO2013/006490 e US20100247521. Outros anticorpos anti-TIM3 incluem versões humanizadas de RMT3-23 (reveladas em Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551), e clone 8B.2C12 (revelado em Monney etal., 2002, Nature, 415:536-541). Anticorpos biespecíficosque inibem TIM3 e PD-1 são revelados em US20130156774.
[0963] Em outras modalidades, o agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR é um inibidor de CEACAM (por exemplo, inibidor de CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5). Em uma modalidade, o inibidor de CEACAM é uma molécula de anticorpo anti-CEACAM. Anticorpos anti-CEACAM-1 exemplificativos são descritos em WO 2010/125571, WO 2013/082366, WO 2014/059251 e WO 2014/022332, por exemplo, um anticorpo monoclonal 34B1, 26H7 e 5F4; ou uma sua forma recombinante, como descrito, por exemplo, em US 2004/0047858, US 7,132,255 e WO 99/052552. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CEACAM liga-se a CEACAM-5 como descrito em, por exemplo, Zheng et al. PLoS One. 2 de setembro de 2010;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), ou tem reatividade cruzada com CEACAM-1 e CEACAM-5 como descrito em, por exemplo, WO 2013/054331 e US 2014/0271618.
[0964] Sem pretender ficar restringido pela teoria, se crê que moléculas de adesão de células a antigenos carcinoembriônicos
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463/606 (CEACAM), tais como CEACAM-1 e CEACAM-5, mediam, pelo menos em parte, a inibição de uma resposta imune antitumoral (ver, por exemplo, Markel et al. J Immunol. 15 de março de 2002;168(6):2803-10; Markel etal. J Immunol. 1 de novembro de 2006;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology, fevereiro de 2009;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. Fevereiro de 2010;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. junho de 2012;11 (6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 1 de junho de 2005;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2 de setembro de 2010;5(9). pii: e12529). Por exemplo, CEACAM-1 foi descrito como um ligante heterofílico para TIM-3 e como desempenhando um papel em tolerância e exaustão de células T mediadas por TIM-3 (ver, por exemplo, WO 2014/022332; Huang, etal. (2014) Naturedoi:10.1038/nature13848). Em modalidades, foi mostrado que o cobloqueio de CEACAM-1 e TIM-3 intensifica uma resposta imune antitumoral em modelos de xenoenxerto de câncer colorretal (ver, por exemplo, WO 2014/022332; Huang, et al. (2014), supra). Em outras modalidades, o cobloqueio de CEACAM-1 e PD-1 reduz a tolerância a células T como descrito, por exemplo, em WO 2014/059251. Assim, inibidores de CEACAM podem ser usados com os outros imunomoduladores descritos aqui (por exemplo, inibidores anti-PD-1 e/ou anti-TIM-3) para intensificar uma resposta imune contra um câncer, por exemplo, um melanoma, um câncer do pulmão (por exemplo, NSCLC), um câncer da bexiga, um câncer do cólon, um câncer do ovário e outros cânceres como descrito aqui.
[0965] LAG-3 (gene-3 de ativação de linfócitos ou CD223) é uma molécula de superfície celular expressa em células T e células B ativadas que se tem demonstrado que desempenha um papel na exaustão de células T CD8+. Anticorpos, fragmentos de anticorpos e outros inibidores de LAG-3 e seus ligantes estão disponíveis na técnica e podem ser usados em combinação com um CAR CD19 descrito aqui.
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Por exemplo, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) é um anticorpo monoclonal que visa LAG3. IMP701 (Immutep) é um anticorpo antagonista de LAG-3 e IMP731 (Immutep e GlaxoSmithKline) é um anticorpo de depleção de LAG-3. Outros inibidores de LAG-3 incluem IMP321 (Immutep), que é uma proteína de fusão recombinante de uma porção solúvel de LAG3 e lg que se liga a moléculas MHC de classe II e ativa células apresentadoras de antigenos (APC). Outros anticorpos são revelados, por exemplo, em WO2010/019570.
[0966] Em algumas modalidades, o agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR pode ser, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo um primeiro domínio e um segundo domínio, em que o primeiro domínio é uma molécula inibidora, ou um seu fragmento, e o segundo domínio é um polipeptídeo que está associado a um sinal positivo, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização intracelular como descrito aqui. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que está associado a um sinal positivo pode incluir um domínio coestimulador de CD28, CD27, ICOS, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular de CD28, CD27 e/ou ICOS, e/ou um domínio de sinalização primário, por exemplo, de CD3 zeta, por exemplo, como descrito neste documento. Em uma modalidade, a proteína de fusão é expressa pela mesma célula que expressou o CAR. Em outra modalidade, a proteína de fusão é expressa por uma célula, por exemplo, uma célula T que não expressa um CAR da presente invenção.
[0967] Em uma modalidade, o agente que intensifica a atividade de uma célula expressando CAR aqui descrita é miR-17-92.
[0968] Em uma modalidade, o agente que intensifica a atividade de um CAR aqui descrito é uma citocina. As citocinas têm funções importantes relacionadas com a expansão, diferenciação, sobrevivência e homeostase de células T. As citocinas que podem ser administradas
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465/606 ao sujeito recebendo uma célula expressando CAR aqui descrita incluem: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 e IL-21, ou uma sua combinação. Em modalidades preferenciais, a citocina administrada é IL-7, IL-15 ou IL-21, ou uma sua combinação. A citocina pode ser administrada uma vez por dia ou mais do que uma vez por dia, por exemplo, duas vezes por dia, três vezes por dia ou quatro vezes por dia. A citocina pode ser administrada durante mais de um dia, por exemplo, a citocina é administrada durante 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, uma semana, duas semanas, 3 semanas ou 4 semanas. Por exemplo, a citocina é administrada uma vez por dia durante 7 dias.
[0969] Em modalidades, a citocina é administrada em combinação com células T expressando CAR. A citocina pode ser administrada simultânea ou concomitantemente com as células T expressando CAR, por exemplo, administrada no mesmo dia. A citocina pode ser preparada na mesma composição farmacêutica das células T expressando CAR ou pode ser preparada em uma composição farmacêutica separada. Em alternativa, a citocina pode ser administrada pouco depois da administração das células T expressando CAR, por exemplo, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias após a administração das células T expressando CAR. Em modalidades em que a citocina é administrada em um regime de dosagem que ocorre durante mais de um dia, o primeiro dia do regime de dosagem de citocina pode ser no mesmo dia da administração com as células T expressando CAR, ou o primeiro dia do regime de dosagem de citocina pode ser 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias após a administração das células T expressando CAR. Em uma modalidade, no primeiro dia, as células T expressando CAR são administradas ao sujeito, e, no segundo dia, uma citocina é administrada uma vez ao dia durante os 7 dias que se seguem. Em uma modalidade preferencial, a citocina a ser administrada em combinação com células T expressando CAR é IL-7, IL-15 ou IL-21.
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[0970] Em outras modalidades, a citocina é administrada um período de tempo após a administração de células expressando CAR, por exemplo, pelo menos duas semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses ou 1 ano ou mais após administração de células expressando CAR. Em uma modalidade, a citocina é administrada após avaliação da resposta do sujeito às células expressando CAR. Por exemplo, ao sujeito são administradas células expressando CAR de acordo com a dosagem e regimes aqui descritos. A resposta do sujeito à terapia com células expressando CAR é avaliada às 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses ou 1 ano ou mais após administração de células expressando CAR, usando qualquer um dos métodos aqui descritos, incluindo inibição de crescimento tumoral, redução de células tumorais em circulação ou regressão tumoral. A sujeitos que não exibem uma resposta suficiente à terapia de células expressando CAR pode ser administrada uma citocina. A administração da citocina ao sujeito que tem resposta subótima à terapia com células expressando CAR melhora a eficácia de células expressando CAR ou a atividade anticancerígena. Em uma modalidade preferencial, a citocina administrada após administração das células expressando CAR é IL-7.
Combinação com uma dose baixa de um inibidor de mTOR
[0971] Em uma modalidade, as células expressando uma molécula CAR, por exemplo, uma molécula CAR aqui descrita, são administradas em combinação com uma dose baixa intensificadora de imunidade de um inibidor de mTOR.
[0972] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas
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467/606 não maior que 90%, pelo menos 10, mas não maior que 90%, pelo menos 15, mas não maior que 90%, pelo menos 20, mas não maior que 90%, pelo menos 30, mas não maior que 90%, pelo menos 40, mas não maior que 90%, pelo menos 50, mas não maior que 90%, pelo menos 60, mas não maior que 90% ou pelo menos 70, mas não maior que 90%. [0973] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas não maior que 80%, pelo menos 10, mas não maior que 80%, pelo menos 15, mas não maior que 80%, pelo menos 20, mas não maior que 80%, pelo menos 30, mas não maior que 80%, pelo menos 40, mas não maior que 80%, pelo menos 50, mas não maior que 80% ou pelo menos 60, mas não maior que 80%.
[0974] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas não maior que 70%, pelo menos 10, mas não maior que 70%, pelo menos 15, mas não maior que 70%, pelo menos 20, mas não maior que 70%, pelo menos 30, mas não maior que 70%, pelo menos 40, mas não maior que 70% ou pelo menos 50, mas não maior que 70%.
[0975] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas não maior que 60%, pelo menos 10, mas não maior que 60%, pelo menos 15, mas não maior que 60%, pelo menos 20, mas não maior que 60%, pelo menos 30, mas não maior que 60% ou pelo menos 40, mas não maior que 60%.
[0976] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas não maior que 50%, pelo menos 10, mas não maior que 50%, pelo menos 15, mas não maior que 50%, pelo menos 20, mas não maior que 50%, pelo menos 30, mas não maior que 50% ou pelo menos 40, mas não maior que 50%.
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[0977] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas não maior que 40%, pelo menos 10, mas não maior que 40%, pelo menos 15, mas não maior que 40%, pelo menos 20, mas não maior que 40%, pelo menos 30, mas não maior que 40% ou pelo menos 35, mas não maior que 40%.
[0978] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 5, mas não maior que 30%, pelo menos 10, mas não maior que 30%, pelo menos 15, mas não maior que 30%, pelo menos 20, mas não maior que 30% ou pelo menos 25, mas não maior que 30%.
[0979] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 1,2, 3, 4 ou 5, mas não maior que 20%, pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, mas não maior que 30%, pelo menos 1,2, 3, 4 ou 5, mas não maior que 35, pelo menos 1,2, 3, 4 ou 5, mas não maior que 40% ou pelo menos 1,2, 3, 4 ou 5, mas não maior que 45%.
[0980] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR está associada a ou fornece inibição de mTOR de pelo menos 1,2, 3, 4 ou 5, mas não maior que 90%.
[0981] Conforme discutido no presente documento, a extensão da inibição de mTOR pode ser expressa como a extensão de inibição de quinase P70 S6, por exemplo, a extensão de inibição de mTOR pode ser determinada pelo nível de diminuição da atividade de quinase P70 S6, por exemplo, pela diminuição da fosforilação de um substrato de quinase P70 S6. O nível de inibição de mTOR pode ser avaliado por um método descrito no presente documento, por exemplo, pelo ensaio de Boulay ou medição de níveis de S6 fosforilado por transferência Western.
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Inibidores exemplificativos de mTOR
[0982] Como usado aqui, o termo inibidor de mTOR” se refere a um composto ou ligante, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, que inibe a quinase mTOR em uma célula. Em uma modalidade, um inibidor de mTOR é um inibidor alostérico. Em uma modalidade, um inibidor de mTOR é um inibidor catalítico.
[0983] Inibidores de mTOR alostéricos incluem o composto tricíclico neutro rapamicina (sirolimus), compostos relacionados com rapamicina, isto é, compostos tendo similaridade estrutural e funcional com rapamicina, incluindo, por exemplo, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina (também referidos como rapálogos) e outros compostos macrolídeos que inibem a atividade de mTOR.
[0984] A rapamicina é um antibiótico macrolídeo conhecido produzido por Streptomyces hygroscopicus que tem a estrutura mostrada na Fórmula A.
Figure BR112019019426A2_D0007
(A)
[0985] Ver, por exemplo, McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; Patente U.S. NQ. 3,929,992. Há vários esquemas de numeração
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470/606 propostos para rapamicina. Para evitar confusão, quando análogos de rapamicina específicos são indicados no presente documento, os nomes são dados em referência à rapamicina com o uso do esquema de numeração da fórmula A.
[0986] Análogos de rapamicina úteis na invenção são, por exemplo, análogos O-substituídos, em que o grupo hidroxila no anel ciclo-hexila da rapamicina é substituído por OR1, em que Ri é hidroxialquila, hidroxialcoxialquila, acilaminoalquila ou aminoalquila; por exemplo, RAD001, também conhecido como everolimus, como descrito em US 5.665.772 e W094/09010, cujo conteúdo é incorporado a título de referência. Outros análogos de rapamicina adequados incluem aqueles substituídos na posição 26 ou 28. O análogo de rapamicina pode ser um epímero de um análogo mencionado acima, particularmente um epímero de um análogo substituído na posição 40, 28 ou 26 e pode ser opcionalmente, ainda, hidrogenado, por exemplo, conforme descrito nos documentos N22 US 6.015.815, WO95/14023 e WO99/15530, cujo conteúdo está incorporado a título de referência, por exemplo, ABT578 também conhecido como zotarolimus ou um análogo de rapamicina descrito nos documentos N22 US 7.091.213, WO98/02441 e WO01/14387, cujo conteúdo está incorporado a título de referência, por exemplo, AP23573 também conhecido como ridaforolimus.
[0987] Os exemplos de análogos de rapamicina adequados para uso na presente invenção do documento N2 US 5,665,772 incluem, porém sem limitação, 40-O-benzil-rapamicina, 40-O-(4'-hidroximetil) benzil-rapamicina, 40-O-[4'-(1,2-di-hidroxietil)]benzil-rapamicina, 40-0alil-rapamicina, 40-O-[3'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-1 'il]-rapamicina, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-di-hidroxipent-2'-en-1'-il)rapamicina, 40-O-(2-hidróxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina, 40-0-(2hidróxi)etil-rapamicina, 40-O-(3-hidróxi)propil-rapamicina, 40-0-(6hidróxi)hexil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidróxi)etóxi]etil-rapamicina, 40-0Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 476/678
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[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina, 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1 -il]-rapamicina, 40-O-(2-acetóxi)etil-rapamicina, 40-0-(2nicotinoilóxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-morfolino)acetóxi]etilrapamicina, 40-O-(2-N-imidazolilacetóxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(Nmetil-N'-piperazinil)acetóxi]etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-0,0etileno-rapamicina, (26R)-26-di-hidro-40-O-(2-hidróxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, 40O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina, 40-O-(2-(N-metil-imidazo-2'ilcarbetoxamido)etil)-rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina e 40-O-[2-(4',5'dicarboetóxi-T,2',3'-triazol-1 '-il)-etil]-rapamicina.
[0988] Outros análogos da rapamicina úteis na presente invenção são análogos em que o grupo hidroxila no anel ciclo-hexila da rapamicina e/ou o grupo hidróxi na posição 28 são substituídos por um grupo hidroxiéster, são conhecidos, por exemplo, análogos da rapamicina presentes em US RE44,768, por exemplo, temsirolimus.
[0989] Outros análogos de rapamicina úteis na presente invenção incluem aqueles em que o grupo metóxi na posição 16 é substituído por outro substituinte, de preferência, alquinilóxi, benzila, ortometoxibenzila ou clorobenzila (opcionalmente hidróxi-substituídos) e/ou em que o grupo metóxi na posição 39 é deletado juntamente com o carbono 39, de modo que o anel ciclo-hexila de rapamicina se torna em um anel ciclopentila sem o grupo metóxi da posição 39; por exemplo, como descrito em WO95/16691 e WO96/41807, cujo conteúdo é incorporado a título de referência. Os análogos podem ser, ainda, modificados de modo que o hidróxi na posição 40 de rapamicina seja alquilado e/ou o carbonila em 32 seja reduzido.
[0990] Análogos de rapamicina de WO95/16691 incluem, porém sem limitação, 16-desmetóxi-16-(pent-2-inil)óxi-rapamicina, 16desmetóxi-16-(but-2-inil)óxi-rapamicina, 16-desmetóxi-16Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 477/678
472/606 (proparg i l)óxi-rapam ici na, 16-desmetóxi-16-(4-h idróxi-but-2-i n i l)óxirapamicina, 16-desmetóxi-16-benzilóxi-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 16-desmetóxi-16-benzilóxi-rapamicina, 16-desmetóxi-16-ortometoxibenzil-rapamicina, 16-desmetóxi-40-O-(2-metoxietil)-16-pent-2inil)óxi-rapamicina, 39-desmetóxi-40-desóxi-39-formil-42-norrapamicina, 39-desmetóxi-40-desóxi-39-hidroximetil-42-nor-rapamicina,
39- desmetóxi-40-desóxi-39-carbóxi-42-nor-rapamicina, 39-desmetóxi-
40- desóxi-39-(4-metil-piperazin-1-il)carbonil-42-nor-rapamicina, 39desmetóxi-40-desóxi-39-(morfolin-4-il)carbonil-42-nor-rapamicina, 39desmetóxi-40-desóxi-39-[N-metil-N-(2-piridin-2-il-etil)]carbamoil-42-norrapamicina e 39-desmetóxi-40-desóxi-39-(p-toluenossulfonilhidrazonometil)-42-nor-rapamicina.
[0991] Análogos de rapamicina de WO96/41807 incluem, porém sem limitação, 32-desoxo-rapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-desoxorapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-desoxo-40-O-(2-hidróxi-etil)rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-(S)-di-hidro-40-O-(2-hidroxietil)rapamicina, 32(S)-di-hidro-40-O-(2-metóxi)etil-rapamicina e 32(S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina.
[0992] Outro análogo de rapamicina adequado é umirolimus como descrito em US2005/0101624, cujo conteúdo é incorporado a título de referência.
[0993] RAD001, conhecido de outro modo como everolimus (Afinitor®), tem o nome químico (1 R,9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19R,21 R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)1,18-di-hidróxi-12-{(1 R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietóxi)-3-metoxiciclohexi I]-1 -meti leti I}-19,30-di metóxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36dioxa-4-aza-triciclo[30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno2,3,10,14,20-pentanona.
[0994] Outros exemplos de inibidores de mTOR alostéricos incluem sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2
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473/606 metilpropanoato]-rapamicina (também chamado de temsirolimus ou CCI-779) e ridaforolimus (AP-23573/MK-8669). Outros exemplos de inibidores de mTor alostéricos incluem zotarolimus (ABT578) e umirolimus.
[0995] Alternativa ou adicionalmente, inibidores de mTOR competitivos por ATP catalíticos mostraram visar o domínio de quinase de mTOR diretamente e visam tanto mTORCI quanto mTORC2. Esses são também inibidores mais efetivos de mTORCI do que tais inibidores de mTOR alostéricos, como rapamicina, devido ao fato de que modulam saídas de mTORCI resistentes à rapamicina, tal como fosforilação de 4EBP1-T37/46 e tradução dependente de cap.
[0996] Os inibidores catalíticos incluem: BEZ235 ou 2-metil-2-[4(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-di-hidro-imidazo[4,5-c]quinolin-1 -il)fenil]-propionitrila, ou a forma de sal monotosilato, a síntese de BEZ235 é descrita em W02006/122806; CCG168 (conhecido de outro modo como AZD-8055, Chresta, C.M., et al., Cancer Fies, 2010, 70(1), 288298) que tem o nome químico {5-[2,4-bis-((S)-3-metil-morfolin-4-il)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-2-metóxi-fenil}-metanol; 3-[2,4-bis[(3S)-3metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N-metilbenzamida (WO09104019); 3-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)-1 - isopropi I-1Hpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (WO10051043 e WO2013023184); Uma N-(3-(N-(3-((3,5-dimetoxifenil)amino)quinoxalino-2-il)sulfamoil) fenil)-3-metóxi-4-metilbenzamida (WO07044729 e WO12006552); PKI587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645) que tem o nome químico 1 -[4-[4-(dimetilamino)piperidino-1-carbonil]fenil]-3-[4(4,6-dimorfolino-1,3,5-triazin-2-il)fenil]ureia; GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1,39-43) que tem o nome químico 2,4-difluoro-N-{2metóxi-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenossulfonamida; 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (WO10114484); (E)-N-(8-(6-amino-5-(trifluorometil)piridin-3-il)-1 -(6-(2
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474/606 cianopropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)ilideno)cianamida (WO12007926).
[0997] Outros exemplos de inibidores de mTOR catalíticos incluem 8-(6-metóxi-piridin-3-il)-3-metil-1 -(4-piperazin-1 -il-3-trifluorometil-fenil)1,3-di-hidro-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (W02006/122806) e Ku0063794 (Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42. Ku-0063794 é um inibidor específico do alvo de mamífero de rapamicina (mTOR)). WYE-354 é outro exemplo de um inibidor de mTOR catalítico (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).
[0998] Os inibidores de mTOR úteis de acordo com a presente invenção também incluem pró-fármacos, derivados, sais farmaceuticamente aceitáveis ou análogos dos mesmos de qualquer um dos anteriores.
[0999] Os inibidores de mTOR, tal como RAD001, podem ser formulados para administração com base em métodos bem estabelecidos na técnica com base nas dosagens particulares descritas no presente documento. Em particular, a Patente US 6,004,973 (incorporada aqui a título de referência) proporciona exemplos de formulações utilizáveis com os inibidores de mTOR descritos aqui. Avaliação de inibição de mTOR
[1000] mTOR fosforila a quinase P70 S6, ativando, assim, a quinase P70 S6 e permitindo que a mesma fosforile seu substrato. A extensão da inibição de mTOR pode ser expressa como a extensão de inibição de quinase P70 S6, por exemplo, a extensão de inibição de mTOR pode ser determinada pelo nível de diminuição da atividade de quinase P70 S6, por exemplo, pela diminuição da fosforilação de um substrato de quinase P70 S6. Pode-se determinar o nível de inibição de mTOR medindo a atividade de quinase P70 S6 (a capacidade da quinase P70
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S6 de fosforilar um substrato), na ausência de inibidor, por exemplo, antes da administração do inibidor, e na presença de inibidor, ou após a administração de inibidor. O nível de inibição de quinase P70 S6 gera o nível de inibição de mTOR. Assim, se a quinase P70 S6 for inibida em 40%, a atividade de mTOR, conforme medido por atividade de quinase P70 S6, é inibida em 40%. A extensão ou o nível de inibição referido no presente documento é o nível médio de inibição ao longo do intervalo de dosagem. A título de exemplo, se o inibidor for administrado uma vez por semana, o nível de inibição é dado pelo nível médio de inibição ao longo desse intervalo, a saber, uma semana.
[1001] Boulay etal., Cancer Fies, 2004, 64:252-61, incorporado aqui a título de referência, ensina um ensaio que pode ser usado para avaliar o nível de inibição de mTOR (referido aqui como ensaio de Boulay). Em uma modalidade, o ensaio se baseia na medição de atividade de quinase P70 S6 de amostras biológicas antes e depois da administração de um inibidor de mTOR, por exemplo, RAD001. As amostras podem ser recolhidas em instantes pré-selecionados após o tratamento com um inibidor de mTOR, por exemplo, 24, 48 e 72 horas após o tratamento. Amostras biológicas, por exemplo, de pele ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), podem ser usadas. Os extratos de proteína total são preparados a partir das amostras. A quinase P70 S6 é isolada dos extratos de proteína por imunoprecipitação com o uso de um anticorpo que reconhece especificamente a quinase P70 S6. A atividade da quinase P70 S6 isolada pode ser medida em um ensaio de quinase in vitro. A quinase isolada pode ser incubada com substratos de subunidade ribossômica 40S (que é um substrato endógeno de quinase P70 S6) e gama-32P sob condições que permitem a fosforilação do substrato. Então, a mistura de reação pode ser separada em um gel de SDS-PAGE, e o sinal de 32P analisado com o uso de um Phosphorlmager. Um sinal de 32P correspondente ao tamanho da
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476/606 subunidade ribossômica 40S indica substrato fosforilado e a atividade de quinase P70 S6. Aumentos e diminuições da atividade de quinase podem ser calculados quantificando a área e a intensidade do sinal de 32P do substrato fosforilado (por exemplo, com o uso de ImageQuant, Molecular Dynamics), atribuindo valores unitários arbitrários ao sinal quantificado e comparando os valores após a administração com valores antes da administração ou com um valor de referência. Por exemplo, a inibição percentual de atividade de quinase pode ser calculada com a seguinte fórmula: 1-(valor obtido após a administração/valor obtido antes da administração) X 100. Conforme descrito acima, a extensão ou o nível de inibição referido no presente documento é o nível médio de inibição ao longo do intervalo de dosagem.
[1002] Métodos para a avaliação da atividade de quinase, por exemplo, atividade de quinase P70 S6, também são proporcionados em US 7,727,950, aqui incorporado a título de referência.
[1003] O nível de inibição de mTOR pode também ser avaliado por uma alteração na razão entre células T negativas para PD1 e positivas para PD1. As células T de sangue periférico podem ser identificadas como negativas ou positivas para PD1 por métodos conhecidos na técnica.
Inibidores de mTOR de Baixa Dose
[1004] Os métodos descritos no presente documento usam inibidores de mTOR de baixa dose de intensificação imune, doses de inibidores de mTOR, por exemplo, inibidores de mTOR alostéricos, incluindo rapálogos, tal como RAD001. Em contrapartida, os níveis de inibidor que inibem completamente ou quase completamente a via de mTOR são imunossupressores e são usados, por exemplo, para prevenir rejeição de transplante de órgão. Adicionalmente, altas doses de rapálogos que inibem completamente mTOR também inibem o
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477/606 crescimento de células tumorais e são usados para tratar uma variedade de cânceres (Ver, por exemplo, Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvador! M. World J Transplant. 24 de outubro de 2012;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer, novembro de 2012;1 (3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornellà H, Villanueva A. Liver Cancer, setembro de 2012;1 (2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 20 de setembro de 2013; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2 de outubro de 2013).
[1005] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta surpreendente de que doses de inibidores de mTOR bem abaixo daquelas usadas em cenários clínicos atuais tiveram um efeito superior no aumento de uma resposta imunológica em um sujeito e aumento na razão de células T negativas para PD-1/células T positivas para PD-1. Foi surpreendente que baixas doses de inibidores de mTOR, que produzem apenas inibição parcial de atividade de mTOR, tivessem capacidades para aprimorar efetivamente respostas imunológicas em sujeitos humanos e aumentar a razão de células T negativas para PD1/células T positivas para PD-1.
[1006] Alternativa ou adicionalmente, sem pretender ficar restringido a qualquer teoria, se crê que uma baixa dose de intensificação imune de um inibidor de mTOR pode aumentar os números de células T virgens, por exemplo, pelo menos transientemente, por exemplo, em comparação com um sujeito não tratado. Alternativa ou adicionalmente, novamente sem pretender ficar
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478/606 restringido a qualquer teoria, acredita-se que o tratamento com um inibidor de mTOR após uma quantidade suficiente de tempo ou dosagem suficiente resulta em um ou mais dos seguintes:
um aumento da expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: CD62Lelevad0, CD127elevad0, CD27+ e BCL2, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de células T de memória;
uma redução na expressão de KLRG1, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de células T de memória; e um aumento no número de precursores de células T de memória, por exemplo, células com qualquer uma ou uma combinação das seguintes características: CD62Lelevad0 aumentado, CD127elevad0 aumentado, CD27+ aumentado, KLRG1 reduzido e BCL2 aumentado;
e em que qualquer uma das alterações descritas acima ocorre, por exemplo, pelo menos transitoriamente, por exemplo, em comparação com um sujeito não tratado (Araki, K etal. (2009) Nature 460:108-112). Os precursores de células T de memória são células T de memória que são precoces no programa de diferenciação. Por exemplo, as células T de memória têm uma ou mais das seguintes características: CD62Lelevad0 aumentado, CD127elevad0 aumentado, CD27+ aumentado, KLRG1 reduzido e/ou BCL2 aumentado.
[1007] Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição, ou forma de dosagem, de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, um rapálogo, rapamicina, ou RAD001, ou um inibidor de mTOR catalítico, que, quando administrado em um regime de dosagem selecionado, por exemplo, uma vez ao dia ou uma vez por semana, está associado a: um nível de inibição de mTOR que não está associado à supressão imunológica completa ou significativa, mas está associado à intensificação da resposta imunológica.
[1008] Um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR
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479/606 alostérico, por exemplo, um rapálogo, rapamicina, ou RAD001, ou um inibidor de mTOR catalítico, pode ser fornecido em uma formulação com liberação sustentada. Qualquer uma das composições ou formas de dosagem unitárias descritas no presente documento pode ser fornecida em uma formulação com liberação sustentada. Em algumas modalidades, uma formulação com liberação sustentada terá biodisponibilidade mais baixa que uma formulação com liberação imediata. Por exemplo, em modalidades, para obter um efeito terapêutico similar de uma formulação de liberação imediata, uma formulação com liberação sustentada terá de cerca de 2 a cerca de 5, cerca de 2,5 a cerca de 3,5 ou cerca de 3 vezes a quantidade de inibidor fornecida na formulação com liberação imediata.
[1009] Em uma modalidade, são fornecidas formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por semana, que têm 0,1 a 20, 0,5 a 10, 2,5 a 7,5, 3 a 6 ou cerca de 5 mg por forma de dosagem unitária. Para administrações uma vez por semana, essas formulações com liberação imediata correspondem às formas com liberação sustentada, que têm, respectivamente, 0,3 a 60, 1,5 a 30, 7,5 a 22,5, 9 a 18 ou cerca de 15 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001. Em modalidades, ambas as formas são administradas em uma base uma vez/semana.
[1010] Em uma modalidade, são fornecidas formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por dia, que têm 0,005 a 1,5, 0,01 a 1,5, 0,1 a 1,5, 0,2 a 1,5, 0,3 a 1,5, 0,4 a 1,5, 0,5 a 1,5, 0,6 a 1,5, 0,7 a 1,5, 0,8 a 1,5, 1,0 a 1,5, 0,3 a 0,6 ou cerca de 0,5 mg por forma de dosagem unitária. Para administrações uma vez por dia, essas formas de liberação imediata correspondem às formas com liberação sustentada, que têm, respectivamente, 0,015 a 4,5, 0,03 a 4,5, 0,3 a 4,5, 0,6 a 4,5, 0,9 a 4,5,
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1,2 a 4,5, 1,5 a 4,5, 1,8 a 4,5, 2,1 a 4,5, 2,4 a 4,5, 3,0 a 4,5, 0,9 a 1,8 ou cerca de 1,5 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001. Para administrações uma vez por semana, essas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, que têm, respectivamente, 0,1 a 30, 0,2 a 30, 2 a 30, 4 a 30, 6 a 30, 8 a 30, 10 a 30, 1,2 a 30, 14 a 30, 16a 30, 20 a 30, 6 a 12 ou cerca de 10 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001.
[1011] Em uma modalidade, são fornecidas formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por dia, que têm 0,01 a 1,0 mg por forma de dosagem unitária. Para administrações uma vez por dia, essas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, que têm, respectivamente, 0,03 a 3 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001. Para administrações uma vez por semana, essas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, que têm, respectivamente, 0,2 a 20 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001.
[1012] Em uma modalidade, são fornecidas formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por semana, que têm 0,5 a 5,0 mg por forma de dosagem unitária. Para administrações uma vez por semana, essas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, que têm, respectivamente, 1,5 a 15 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001.
[1013] Conforme descrito acima, um alvo da via de mTOR é a
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481/606 quinase P70 S6. Assim, as doses de inibidores de mTOR que são úteis nos métodos e composições descritos no presente documento são aquelas que são suficientes para atingir no máximo 80% de inibição de atividade de quinase P70 S6 em relação à atividade da quinase P70 S6 na ausência de um inibidor de mTOR, por exemplo, conforme medidas por um ensaio descrito no presente documento, por exemplo, o ensaio de Boulay. Em outro aspecto, a invenção fornece uma quantidade de um inibidor de mTOR suficiente para atingir no máximo 38% de inibição de atividade de quinase P70 S6 em relação à atividade de quinase P70 S6 na ausência de um inibidor de mTOR.
[1014] Em um aspecto, a dose de inibidor de mTOR útil nos métodos e composições da invenção é suficiente para atingir, por exemplo, quando administrada a um sujeito humano, 90 +/-5% (isto é, 85-95%), 89+/-5%, 88+/-5%, 87+/-5%, 86+/-5%, 85+/-5%, 84+/-5%, 83+/-5%, 82+/-5%, 81+/-5%, 80+/-5%, 79+/-5%, 78+/-5%, 77+/-5%, 76+/-5%, 75+/·-5%, 74+/-5%, 73+/-5%, 72 +/-5%, 71 +/-5%, 70 +/-5%, 69 +/-5%, 68 +/-5%, 67 +/-5%, 66 +/-5%, 65 +/-5%, 64 +/-5%, 63 +/-5%, 62 +/-5%, 61 +/-5%, 60 +/-5%, 59 +/-5%, 58 +/-5%, 57 +/-5%, 56 +/-5%, 55 +/-5%, 54 +/-5%, 54 +/-5%, 53 +/-5%, 52 +/-5%, 51 +/-5%, 50 +/-5%, 49 +/-5%, 48 +/-5%, 47 +/-5%, 46 +/-5%, 45 +/-5%, 44 +/-5%, 43 +/-5%, 42 +/-5%, 41 +/-5%, 40 +/-5%, 39 +/-5%, 38 +/-5%, 37 +/-5%, 36 +/-5%, 35 +/-5%, 34 +/-5%, 33 +/-5%, 32 +/-5%, 31 +/-5%, 30 +/-5%, 29 +/-5%, 28 +/-5%, 27 +/-5%, 26 +/-5%, 25 +/-5%, 24 +/-5%, 23 +/-5%, 22 +/-5%, 21 +/-5%, 20 +/-5%, 19 +/-5%, 18 +/-5%, 17 +/-5%, 16 +/-5%, 15 +/-5%, 14 +/-5%, 13 +/-5%, 12 +/-5%, 11 +/-5%, ou 10 +/-5% de inibição de atividade de quinase P70 S6, por exemplo, como medido por um ensaio descrito aqui, por exemplo, o ensaio de Boulay.
[1015] A atividade de quinase P70 S6 em um sujeito pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, de acordo com os métodos descritos na Pat. U.S. 7.727.950,
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482/606 por análise de imunocoloração de níveis de fosfoP70 S6K e/ou níveis de fosfoP70 S6 ou por ensaios de atividade de quinase in vitro.
[1016] Conforme usado no presente documento, o termo cerca de em referência a uma dose de inibidor de mTOR refere-se a uma variabilidade de até +/- 10% na quantidade de inibidor de mTOR, mas pode não incluir nenhuma variabilidade em relação à dose determinada. [1017] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos que compreendem administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem dentro de um nível mínimo-alvo. Em algumas modalidades, o nível mínimo é significativamente mais baixo que os níveis mínimos associados aos regimes de dosagem usados em transplante de órgão e pacientes com câncer. Em uma modalidade, inibidor de mTOR, por exemplo, RAD001, ou rapamicina, é administrado para resultar em um nível mínimo que é menor que V2, 1/4, 1/10 ou 1/20 do nível mínimo que resulta em imunossupressão ou um efeito anticancerígeno. Em uma modalidade, 0 inibidor de mTOR, por exemplo, RAD001 ou rapamicina, é administrado para resultar em um nível mínimo que é menor que V2, 1/4, 1/10 ou 1/20 do nível mínimo fornecido na bula aprovada pelo FDA para uso em imunossupressão ou indicações anticancerígenas.
[1018] Em uma modalidade, um método revelado no presente documento compreende administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem que fornece um nível mínimo-alvo de 0,1 a 10 ng/mL, 0,1 a 5 ng/mL, 0,1 a 3 ng/mL, 0,1 a 2 ng/mL ou 0,1 a 1 ng/mL.
[1019] Em uma modalidade, um método revelado no presente documento compreende administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem que fornece um nível mínimo-alvo de 0,2 a 10 ng/mL, 0,2 a 5 ng/mL, 0,2 a 3 ng/mL, 0,2 a 2 ng/mL ou 0,2 a 1 ng/mL.
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[1020] Em uma modalidade, um método revelado no presente documento compreende administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem que fornece um nível mínimo-alvo de 0,3 a 10 ng/mL, 0,3 a 5 ng/mL, 0,3 a 3 ng/mL, 0,3 a 2 ng/mL ou 0,3 a 1 ng/mL.
[1021] Em uma modalidade, um método revelado no presente documento compreende administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem que fornece um nível mínimo-alvo de 0,4 a 10 ng/mL, 0,4 a 5 ng/mL, 0,4 a 3 ng/mL, 0,4 a 2 ng/mL ou 0,4 a 1 ng/mL.
[1022] Em uma modalidade, um método revelado no presente documento compreende administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem que fornece um nível mínimo-alvo de 0,5 a 10 ng/mL, 0,5 a 5 ng/mL, 0,5 a 3 ng/mL, 0,5 a 2 ng/mL ou 0,5 a 1 ng/mL.
[1023] Em uma modalidade, um método revelado no presente documento compreende administrar a um sujeito um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, a uma dosagem que fornece um nível mínimo-alvo de 1 a 10 ng/mL, 1 a 5 ng/mL, 1 a 3 ng/mL ou 1 a 2 ng/mL.
[1024] Conforme usado no presente documento, o termo nível mínimo refere-se à concentração de um fármaco no plasma pouco antes da dose seguinte ou a concentração mínima de fármaco entre duas doses.
[1025] Em algumas modalidades, um nível mínimo-alvo de RAD001 está em uma faixa entre cerca de 0,1 e 4,9 ng/mL. Em uma modalidade, o nível mínimo-alvo está abaixo de 3 ng/mL, por exemplo, está entre 0,3 ou menos e 3 ng/mL. Em uma modalidade, o nível mínimo-alvo está abaixo de 3 ng/mL, por exemplo, está entre 0,3 ou menos e 1 ng/mL.
[1026] Em outro aspecto, a invenção pode utilizar um inibidor de
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484/606 mTOR diferente de RAD001 em uma quantidade que está associada a um nível mínimo-alvo que é bioequivalente ao nível mínimo-alvo especificado para RAD001. Em uma modalidade, o nível mínimo-alvo para um inibidor de mTOR diferente de RAD001 é um nível que gera o mesmo nível de inibição de mTOR (por exemplo, conforme medido por um método descrito no presente documento, por exemplo, a inibição de P70 S6) que um nível mínimo de RAD001 descrito no presente documento.
Composições farmacêuticas: inibidores de mTOR
[1027] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR conforme descrito no presente documento, formulado para uso em combinação com células CAR descritas no presente documento.
[1028] Em algumas modalidades, o inibidor de mTOR é formulado para administração em combinação com um adicional, por exemplo, conforme descrito no presente documento.
[1029] Em geral, os compostos da invenção serão administrados em quantidades terapeuticamente eficazes, conforme descrito acima, por meio de qualquer um dos modos usuais e aceitáveis conhecidos na técnica, isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos.
[1030] As formulações farmacêuticas podem ser preparadas usando procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Por exemplo, a substância de fármaco em volume (por exemplo, um inibidor de mTOR ou forma estabilizada do composto (por exemplo, complexo com um derivado de ciclodextrina ou outro agente de complexação conhecido)) é dissolvida em um solvente adequado na presença de um ou mais dos excipientes descritos no presente documento. O inibidor de mTOR é tipicamente formulado em formas de dosagem farmacêuticas
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485/606 para proporcionar uma dosagem facilmente controlável do fármaco e para dar ao paciente um produto elegante e facilmente manuseável. [1031] Os compostos da invenção podem ser administrados como composições farmacêuticas por qualquer via convencional, em particular, por via entérica, por exemplo, via oral, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas, ou por via parenteral, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injetáveis, por via tópica, por exemplo, na forma de loções, géis, pomadas ou cremes, ou em uma forma nasal ou de supositório. Quando um inibidor de mTOR é administrado em combinação com (simultaneamente com ou separadamente de) outro agente, conforme descrito no presente documento, em um aspecto, ambos os componentes podem ser administrados pela mesma via (por exemplo, por via parenteral). Alternativamente, outro agente pode ser administrado por uma via diferente em relação ao inibidor de mTOR. Por exemplo, um inibidor de mTOR pode ser administrado por via oral, e o outro agente pode ser administrado por via parenteral.
LIBERAÇÃO SUSTENTADA
[1032] Os inibidores de mTOR, por exemplo, inibidores de mTOR alostéricos ou inibidores de mTOR catalíticos, revelados no presente documento podem ser fornecidos como formulações farmacêuticas como formas de dosagem sólidas orais que compreendem um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001, que satisfazem os requisitos de estabilidade de produto e/ou têm propriedades farmacocinéticas favoráveis em relação aos comprimidos de liberação imediata (IR), tais como concentrações de pico plasmáticas médias reduzidas, variabilidade inter e intrapacientes reduzida na extensão da absorção do fármaco e da concentração de pico plasmática, razão Cmax/Cmin reduzida e/ou efeitos alimentícios reduzidos. As formulações farmacêuticas fornecidas podem permitir um
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486/606 ajuste de dose mais preciso e/ou reduzir a frequência de eventos adversos, fornecendo, assim, tratamentos mais seguros para os pacientes com um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001.
[1033] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001, que são sistemas de múltiplos particulados e podem ter camadas e revestimentos funcionais.
[1034] O termo formulação de múltiplos particulados de liberação estendida” conforme usado no presente documento refere-se a uma formulação que possibilita a liberação de um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001, durante um período de tempo estendido, por exemplo, durante pelo menos 1,2, 3, 4, 5 ou 6 horas. A formulação de liberação estendida pode conter matrizes e revestimentos produzidos a partir de excipientes especiais, por exemplo, conforme descrito no presente documento, que são formulados de uma maneira que torne o ingrediente ativo disponível durante um período de tempo estendido após a ingestão.
[1035] O termo liberação estendida pode ser usado de forma intercambiável com os termos liberação sustentada (SR) ou liberação prolongada. O termo liberação estendida refere-se a uma formulação farmacêutica que não libera substância farmacêutica ativa imediatamente após a dosagem oral, mas durante um período estendido, em conformidade com a definição nas farmacopeias Ph. Eur. (7a edição), monografia para comprimidos e cápsulas, e USP capítulo geral <1151> para formas de dosagem farmacêuticas. O termo Liberação Imediata (IR), conforme usado no presente documento, refere-se a uma formulação farmacêutica que libera 85% da substância farmacêutica ativa dentro de menos de 60 minutos em conformidade
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487/606 com a definição do documento Guidance for Industry: Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms (FDA ODER, 1997). Em algumas modalidades, o termo liberação imediata significa liberação de everolimus de comprimidos no período de tempo de 30 minutos, por exemplo, como medido no ensaio de dissolução descrito aqui.
[1036] As formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001, podem ser caracterizadas por um perfil de liberação in vitro com o uso de ensaios conhecidos na técnica, tais como um ensaio de dissolução conforme descrito no presente documento: um recipiente de dissolução cheio com 900 mL de tampão fosfato pH 6,8 contendo dodecilsulfato de sódio 0,2% a 37°C, e a dissolução é realizada com o uso de um método de pá a 75 rpm de acordo com o documento USP em conformidade com a monografia de teste USP 711, e Ph.Eur. Monografia de teste 2.9.3., respectivamente.
[1037] Em algumas modalidades, as formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001, liberam o inibidor de mTOR no ensaio de liberação in vitro de acordo com as seguintes especificações de liberação:
0,5 h: <45% ou <40, por exemplo, <30% h: 20-80%, por exemplo, 30-60% h: >50% ou >70%, por exemplo, >75% h: >60% ou >65%, por exemplo, >85%, por exemplo, >90%.
[1038] Em algumas modalidades, formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR revelado no presente documento, por exemplo, rapamicina ou RAD001, liberam 50% do inibidor de mTOR não antes de 45, 60, 75, 90, 105 min ou 120 min no ensaio de dissolução in vitro.
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Métodos de Administração de Biopolímero
[1039] Em algumas modalidades, uma ou mais células que expressam CAR, conforme revelado no presente documento, podem ser administradas ou distribuídas ao sujeito por meio de um arcabouço de biopolímero, por exemplo, um implante de biopolímero. Os arcabouços de biopolímero podem sustentar ou intensificar a distribuição, a expansão e/ou a dispersão das células que expressam CAR descritas no presente documento. Um arcabouço de biopolímero compreende um polímero biocompatível (por exemplo, não induz substancialmente uma resposta inflamatória ou imunológica) e/ou biodegradável que pode ser de ocorrência natural ou sintético.
[1040] Os exemplos de biopolímeros adequados incluem, porém sem limitação, ágar, agarose, alginato, alginato/cimento de fosfato de cálcio (CPC), beta-galactosidase (β-GAL), (1,2,3,4,6-penta-acetil-a-Dgalactose), celulose, quitina, quitosana, colágeno, elastina, gelatina, colágeno de ácido hialurônico, hidroxiapatita, poli(3-hidroxibutirato-co3-hidróxi-hexanoato) (PHBHHx), poli(láctido), poli(caprolactona) (PCL), poli(láctido-co-glicólido) (PLG), óxido de polietileno (PEO), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polipropileno (PPO), álcool polivinílico (PVA), seda, proteína de soja e isolado de proteína de soja, sozinhos ou em combinação com qualquer outra composição polimérica, em qualquer concentração e em qualquer razão. O biopolímero pode ser aumentado ou modificado com moléculas promotoras de adesão ou migração, por exemplo, peptideos miméticos de colágeno que se ligam ao receptor de colágeno de linfócitos e/ou moléculas estimuladoras para intensificar a distribuição, a expansão ou a função, por exemplo, atividade anticancerígena, das células a serem distribuídas. O arcabouço de biopolímero pode ser um injetável, por exemplo, um gel ou uma composição semissólida ou sólida.
[1041] Em algumas modalidades, as células que expressam CAR
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489/606 descritas no presente documento são inoculadas no arcabouço de biopolímero antes da distribuição ao sujeito. Em modalidades, o arcabouço de biopolímero compreende, ainda, um ou mais agentes terapêuticos adicionais descritos no presente documento (por exemplo, outra célula que expressa CAR, um anticorpo ou uma molécula pequena) ou agentes que intensificam a atividade de uma célula que expressa CAR, por exemplo, incorporados ou conjugados nos biopolímeros do arcabouço. Em modalidades, o arcabouço de biopolímero é injetado, por exemplo, por via intratumoral, ou cirurgicamente implantado no tumor ou dentro de uma proximidade do tumor suficiente para mediar um efeito antitumoral. Exemplos adicionais de composições de biopolímeros e métodos para sua administração são descritos em Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101; e WO2014/110591.
Composições Farmacêuticas e Tratamentos
[1042] Composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender uma célula expressando CAR, por exemplo, uma pluralidade de células expressando CAR, como descrito aqui, em combinação com um ou mais transportadores, diluentes ou excipientes farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos, tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptideos ou aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições da presente invenção são em um aspecto formuladas para administração intravenosa.
[1043] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de uma maneira apropriada à doença a ser tratada
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490/606 (ou prevenida). A quantidade e a frequência da administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e o tipo e a gravidade da doença do paciente, embora dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.
[1044] Em uma modalidade, a composição farmacêutica está substancialmente desprovida, por exemplo, não há níveis detectáveis de um contaminante, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em endotoxina, micoplasma, lentivírus competente para replicação (ROL), p24, ácido nucleico de VSV-G, HIV gag, esférulas revestidas com antiCD3/anti-CD28 residual, anticorpos de camundongo, soro humano reunido, albumina de soro bovino, soro bovino, componentes do meio de cultura, componentes de células de empacotamento ou plasmídeos de vetores, uma bactéria e um fungo. Em uma modalidade, a bactéria é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes do grupo A.
[1045] Quando é indicada uma quantidade imunologicamente eficaz, uma quantidade eficaz antitumoral, uma quantidade eficaz inibidora de tumores ou quantidade terapêutica, a quantidade precisa das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada por um médico considerando diferenças individuais na idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase, e condição do paciente (sujeito). Pode ser geralmente afirmado que uma composição farmacêutica compreendendo as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) descritas aqui pode ser administrada a uma dosagem de 104 até 109 células/kg de peso do corpo, em alguns casos 105 até 106 células/kg de peso do corpo, incluindo todos os valores inteiros dentro desses intervalos.
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Composições de células T também podem ser administradas múltiplas vezes a estas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão que são habitualmente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).
[1046] Em certos aspectos, pode ser desejado administrar células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) ativadas a um sujeito e então subsequentemente recolher novamente sangue (ou efetuar uma aférese), ativar células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) daquele de acordo com a presente invenção e infundir novamente no paciente estas células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) ativadas e expandidas. Este processo pode ser realizado múltiplas vezes a cada período de algumas semanas. Em certos aspectos, células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) podem ser ativadas a partir de recolhas de sangue desde 10 cc até 400 cc. Em certos aspectos, células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) são ativadas a partir de recolhas de sangue de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc ou 100 cc.
[1047] A administração das composições em questão pode ser efetuada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplantação. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente transarterialmente, subcutaneamente, intradermicamente, intratumoralmente, intranodalmente, intramedularmente, intramuscularmente, por injeção intravenosa (i.v.) ou intraperitonealmente. Em um aspecto, as composições de células T da presente invenção são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Num aspecto, as composições de células T da presente invenção são administradas por injeção i.v. As
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492/606 composições de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) podem ser injetadas diretamente em um tumor, gânglio linfático ou sítio da infecção.
[1048] Em um aspecto exemplificativo particular, sujeitos podem ser submetidos a leucaférese, em que leucócitos são recolhidos, enriquecidos ou depletados ex vivo para selecionar e/ou isolar as células de interesse, por exemplo, células T. Estes isolados de células T podem ser expandidos por métodos conhecidos na técnica e tratados de modo que um ou mais construtos de CAR da invenção podem ser introduzidos, desse modo criando uma célula T CAR da invenção. Os sujeitos necessitados podem ser subsequentemente submetidos a tratamento-padrão com quimioterapia de dose elevada seguido de transplantação de células-tronco do sangue periférico. Em certos aspectos, após ou de modo concorrente com o transplante, os sujeitos recebem uma infusão das células T CAR expandidas da presente invenção. Em um aspecto adicional, células expandidas são administradas antes ou após cirurgia.
[1049] A dosagem dos tratamentos acima a ser administrada a um paciente irá variar com a natureza precisa da condição sendo tratada e o recebedor do tratamento. O escalamento de dosagens para administração humana pode ser realizado de acordo com práticas aceites na técnica. A dose para CAMPATH, por exemplo, irá geralmente se situar na gama de 1 até cerca de 100 mg para um paciente adulto, habitualmente administrada diariamente durante um período entre 1 e 30 dias. A dose diária preferencial é 1 até 10 mg por dia apesar de, em alguns casos, doses maiores até 40 mg por dia poderem ser usadas (descrito na Patente U.S. NQ. 6,120,766).
[1050] Em uma modalidade, o CAR é introduzido em células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK), por exemplo, usando transcrição in vitro, e o sujeito (por exemplo, humano) recebe
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493/606 uma administração inicial de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR da invenção, e uma ou mais administrações subsequentes das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR da invenção, em que a uma ou mais administrações subsequentes são administradas menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13,12,11,10,9,8,7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior. Em uma modalidade, mais do que uma administração das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR da invenção são administradas ao sujeito (por exemplo, humano) por semana, por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR da invenção são administradas por semana. Em uma modalidade, o sujeito (por exemplo, sujeito humano) recebe mais do que uma administração das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR por semana (por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações por semana) (também referido aqui como ciclo), seguido de uma semana sem administrações de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR, e então uma ou mais administrações adicionais das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR (por exemplo, mais do que uma administração das células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR por semana) são administradas ao sujeito. Em outra modalidade, o sujeito (por exemplo, sujeito humano) recebe mais do que um ciclo de células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR, e o tempo entre cada ciclo é menor do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 dias. Em uma modalidade, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR são administradas em dias alternados para 3 administrações por semana. Em uma modalidade, as células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) CAR da invenção são administradas durante pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas.
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[1051] Em um aspecto, células expressando CAR da presente invenção são geradas usando vetores virais lentivirais, tais como lentivírus. Células, por exemplo, CARTs, geradas desse modo exibirão expressão estável de CAR.
[1052] Em um aspecto, células expressando CAR, por exemplo, CARTs, são geradas usando um vetor viral tal como um vetor gamaretroviral, por exemplo, um vetor gama-retroviral descrito aqui. CARTs geradas usando estes vetores podem ter expressão estável de CAR.
[1053] Em um aspecto, CARTs expressam transientemente vetores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 dias após a transdução. A expressão transiente de CARs pode ser efetuada por administração de vetores RNA CAR. Em um aspecto, o RNA CAR é transduzido na célula T por eletroporação.
[1054] Uma questão potencial que pode surgir em pacientes sendo tratados usando células efetoras imunes (por exemplo, células T, células NK) expressando transientemente CAR (particularmente com CARTs contendo scFv murino) é anafilaxia após múltiplos tratamentos. [1055] Sem ficar restringido por esta teoria, se crê que tal resposta anafilática poderá ser causada pelo fato de um paciente desenvolver uma resposta anti-CAR humoral, isto é, anticorpos anti-CAR tendo um isótipo anti-lgE. Se crê que células produtoras de anticorpos em um paciente sofrem uma troca de classe do isótipo IgG (que não causa anafilaxia) para o isótipo IgE quando há uma pausa de dez até quatorze dias de exposição ao antígeno.
[1056] Se um paciente estiver em risco elevado de gerar uma resposta de anticorpos anti-CAR durante a terapia com CAR transiente (como os gerados por transduções de RNA), pausas na infusão de CART não devem durar mais do que dez até quatorze dias.
EXEMPLOS
[1057] A invenção é adicionalmente descrita em detalhe com
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495/606 referência aos seguintes exemplos experimentais. Estes exemplos são proporcionados somente para propósitos ilustrativos, e não se destinam a ser limitadores salvo se especificado de outro modo. Assim, a invenção não deve de modo nenhum ser considerada como estando limitada aos seguintes exemplos, ao invés, deve ser considerada como abrangendo quaisquer e todas as variações que se tornarem evidentes em resultado dos ensinamentos proporcionados aqui.
Exemplo 1: Disrupção da Metilcitosina Dioxigenase TET2 Promove a Eficácia Terapêutica de células T visando CD19
Sumário
[1058] Imunoterapia de câncer baseada em redirecionamento genético de células T do paciente pode ser usada com êxito para tratar leucemias e linfomas de células B. Nesta abordagem, o genoma de células T é modificado por integração de vetores virais ou transposons codificando receptores de antigenos quiméricos (CARs) que dirigem o reconhecimento e morte de células tumorais. No entanto, o êxito desta abordagem pode por vezes ser limitado pela extensão da expansão e persistência das células manipuladas, focando a atenção em mecanismos de direcionamento da proliferação, função efetora e sobrevivência de células T CAR. Este Exemplo proporciona discernimentos mecanísticos de estudos de um paciente com leucemia linfocítica crônica (CLL) que foi tratado com células T CAR que visam a proteína CD19 em células B. Por infusão de células T CAR foi evidente atividade antitumoral no sangue periférico, gânglios linfáticos e medula óssea, e foi acompanhada de remissão completa. Inesperadamente, no pico da resposta antitumoral, 94% das células T CAR foram originadas de um único clone onde a inserção mediada pelo vetor lentiviral do transgene CAR procedeu à disrupção do gene codificando a metilcitosina dioxigenase TET2. Análise adicional revelou uma nova mutação hipomórfica no segundo alelo de TET2 deste paciente. Células
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496/606 com deficiência bialélica de TET2 exibiram hidroximetilação de DNA reduzida e um perfil epigenético consistente com diferenciação e função alteradas de células T. Na expansão do pico, células T CAR com TET2 com disrupção exibiram um fenótipo de memória central, que difere de pacientes típicos que exibiram respostas duráveis de longo prazo que, ao invés, foram caracterizadas por diferenciação tardia memória/efetora. O silenciamento experimental de TET2 recapitulou o efeito da perda de TET2 no destino de linfócitos T CAR e potência antitumoral. Os resultados indicam que a inibição de TET2 neste paciente promoveu a proliferação de células T e intensificou a função efetora, e que a progênie de uma única célula T CAR induziu remissão. Estes dados enfatizam a importância de TET2 na determinação do destino de células T humanas e sugerem que a modificação da via do TET2 pode ser usada para intensificar o tratamento com células T geneticamente redirecionadas.
Introdução
[1059] O sistema imune humano evoluiu para reconhecer e eliminar células expressando antigenos estranhos. Apesar de células malignas poderem gerar neo - não auto epitopos que podem induzir imunidade antitumoral por células T, estas respostas são frequentemente limitadas por tolerância de células T ao tumor. Uma abordagem para ultrapassar a tolerância consiste em redirecionar geneticamente linfócitos T para atacarem células cancerígenas. Células T podem ser transduzidas com genes que codificam receptores de antigenos quiméricos (CARs) compostos por frações de ligação derivadas de anticorpos ligadas ao domínio intracelular da cadeia CD3< e endodomínios coestimuladores opcionais (Gross, G., Waks, T. & Eshhar, Z. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 10024-10028 (1989); Irving, B. A. & Weiss, A. Cell 64, 891-901 (1991)). Um antígeno tumoral é a proteína CD19, que se encontra em cânceres derivados de
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497/606 células B e tem sido visada em imunoterapia bem-sucedida. Por exemplo, células T CAR autólogas anti-CD19 que incorporam o domínio de sinalização coestimulador 4-1 BB (CTL019) podem ser usadas para tratar malignidades de células B, tais como CLL e leucemia linfocítica aguda (ALL). Em alguns casos, o êxito da terapia com células T CAR pode depender de ser alcançada uma enxertia suficiente e sobrevivência de células transferidas de modo adoptive in vivo. Foi observado que indivíduos com CLL que respondem a terapia com CTL019 podem ter uma expansão e persistência significativas de células T CAR após infusão, ao passo que em pacientes não respondedores, estas células exibem capacidade proliferativa diminuída. Sem pretender ficar restringido pela teoria, se crê que os mecanismos envolvidos na superior potência antitumoral e sobrevivência de longa duração de células T CAR em pacientes respondedores incluem, por exemplo, fatores intrínsecos e extrínsecos a células T. Uma vez que apenas um subconjunto de pacientes com CLL apresentam níveis terapêuticos de expansão de células T CAR (Porter, D. L. et al., Science translational medicine 7, 303ra139, doi:10.1126 (2015)), entender os determinantes da proliferação e persistência bem-sucedidas em casos de remissão durável é de importância crítica.
[1060] Neste Exemplo foi avaliado um paciente com leucemia linfocítica crônica (CLL) que foi tratado com células T CAR que visam a proteína CD19 em células B. Por infusão de células T CAR foi evidente atividade antitumoral no sangue periférico, gânglios linfáticos e medula óssea, e foi acompanhada de remissão completa. No pico da resposta antitumoral, 94% das células T CAR foram originadas de um único clone onde a inserção mediada pelo vetor lentiviral do transgene CAR procedeu à disrupção do gene codificando a metileitosina dioxigenase TET2. Células albergando esta inserção exibiram hidroximetilação de
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DNA reduzida e aquisição de um perfil epigenético consistente com diferenciação alterada de células T. Na expansão do pico, células T CAR com a inserção TET2exibiram um fenótipo de memória inicial, que difere de pacientes típicos com respostas duráveis de longo prazo que, ao invés, são caracterizadas por diferenciação de memória tardia. O silenciamento experimental de TET2em células T doadoras saudáveis recapitulou o efeito de disrupção de TET2 mediada por integração no destino de linfócitos T CAR. Se concluiu que a atividade reduzida de TET2, por exemplo, disrupção bialélica, estava associada a mutagênese de inserção que promoveu a proliferação de células T, e que a progênie de uma única célula T CAR induziu remissão neste paciente, isto é, referido aqui como paciente 10. Estes dados enfatizam a importância de TET2 na diferenciação de células T e sugerem que a modificação da via do TET2 pode ser útil para intensificar o tratamento com células T geneticamente redirecionadas.
Resultados
[1061] Um homem com setenta e oito anos de idade com CLL avançado que progrediu através de múltiplos regimes de quimioterapia e tratamento biológico (Paciente 10; Tabela 6) foi inscrito em um ensaio clínico para terapia com CTL019 (NCT01029366). O paciente foi submetido a duas transferências adotivas de 3,75 χ 108 e 5,61 χ 108 células CTL019 autólogas, separadas por dois meses. Após a primeira infusão de dose dividida de células T CAR, se tornou persistentemente febril. Não foi identificada nenhuma fonte de infecção. O Paciente 10 foi diagnosticado com síndrome de liberação de citocinas (CRS) e recebeu terapia de bloqueio de receptores interleucina (IL)-6, após o qual os sinais e sintomas de CRS se resolveram rapidamente. O Paciente 10 continuou a exibir progressão na sua adenopatia volumosa e infiltração extensa na medula óssea com CLL seis semanas depois de receber a sua primeira dose de células T CAR. A maior parte dos pacientes que
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499/606 respondem ao tratamento com CTL019 exibem proliferação rápida de células T concomitante com CRS e uma redução sustentada da carga tumoral no primeiro mês de infusão, ver, por exemplo, Porter, D. L. etal. Science translational medicine 7, 303ra139, (2015), e tal não ocorreu no Paciente 10 (FIGURAS 1A-1C).
Tabela 6. Características de referência do Paciente 10
Características Paciente Idade/Sexo do Tumor CLL
Deleção de ATM
78/Masculino (dei); deli 1q;
de!17p
Envolvimento de CLL na Terapias Anteriores Referência
- Rituxan-CVP* x6 ciclos
- Rituxan Isoladamente
Fludarabina/Rituxan;
Excelente Resposta 80% de Parcial medula; - Clorambucil;
adenopatia Progressão volumosa com- Bendamustina;
a maior massa Progressão χ1 ciclo no mesentério - CHOP χ8 ciclos medindo 13,5 - PCRA com progressão x 6,8 cm estável até ligeira em
PET/CT# 2 semanas mais tarde
Pentastatina/Citoxan pré-CTL019 ’ciclofosfamida, vincristina e prednisolona ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona Apentostatina, rituximab e ciclofosfamida #tomografia por emissão de pósitrons-tomografia computorizada
[1062] Uma vez que havia a preocupação de o bloqueio inicial da sinalização mediada por IL-6 poder ter diminuído a resposta deste paciente a terapia com células T CAR, foi administrada uma segunda dose do produto celular (5,61 χ 108 células T CAR, 70 dias após a
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500/606 primeira infusão). As infusões foram novamente complicadas por CRS manifestada por febres altas, hipotensão e hipoxia, que se resolveram passados vários dias sem intervenção. A avaliação da sua medula óssea um mês mais tarde revelou infiltração extensa persistente de CLL e varreduras de tomografia computorizada (CT) exibiram melhorias mínimas em adenopatia extensa. Aproximadamente dois meses após a segunda infusão, a expansão de células CTL019 alcançou o máximo no sangue periférico, seguido de contração durante os dias e semanas seguintes (Figura 1A). O crescimento de células CTL019 ocorreu no compartimento de células T CD8+, que é típico em pacientes com CLL que respondem a esta terapia (Figura 2 e Figura 13). Esta resposta foi acompanhada de CRS de alto grau que requereu intervenção clínica, com níveis elevados em circulação de interferon (ΙΡΝ)-γ, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), IL-6, IL-8 e IL-10 (Figura 1B). Ao mesmo tempo, e coincidente com o surgimento de febres altas, o paciente exibiu eliminação rápida de células CLL (Figura 1C). O sequenciamento de geração seguinte de produtos de rearranjo no lócus de cadeia pesada de imunoglobulina (IGH), que permite seguir o clone leucêmico, mostrou uma redução de um log na carga tumoral aos 51 dias após a segunda infusão, com erradicação completa deste clone do sangue um mês mais tarde (Tabela 7). Varreduras de CT mostraram melhoria dramática na adenopatia mediastinal e axilar (69% de alteração; Figura 1 D). Seis meses após a segunda infusão de células CTL019, o Paciente 10 alcançou uma resposta completa sem evidência de CLL na sua medula óssea (Tabela 7) e resolução de toda a adenopatia anormal (Figura 1D). A sua avaliação de seguimento de longa duração mais recente (>4,2 anos após infusão de células CTL019) revelou a presença de células T CAR no sangue periférico, aplasia decorrente de células B (Figura 14A-14C) e nenhuma evidência de doença em circulação ou infiltração na medula. Populações de células
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501/606 imunes adicionais no sangue apresentaram uma frequência normal, sem sinais observados de anormalidades linfoproliferativas (Figura 14A14C). A remissão completa tem-se prolongado durante mais de cinco anos no momento deste Exemplo.
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Tabela 7. Carga tumoral avaliada por análise de sequenciamento profundo de IgH de sangue periférico e medula óssea do Paciente 10
Informações das Amostras
Avaliação do Repertório de IgH
Clone Tumoral
Tipo de Amostra Primeira Infusão1 Segunda Infusão2 Entropia3 Clonalidade4 Frequência Máx (%)5 Rearranjos Genéticos6 Fração de Nudeadas7 # Estimado de Genomas8 Redução Log (Primeira Infusão)9 Redução Log (Segunda Infusão)10
-29 0,078583 0,990387 99,4 110710 0,343804 109271
14 0,067824 0,991416 99,46 157699 0,321995 156371 0,028
28 0,164639 0,967638 98,13 10303 0,025852 10034 1,124
63 -7 0,154459 0,973519 98,33 60725 0,11781 59601 0,465
69 -1 0,149261 0,971558 98,31 47691 0,132377 46809 0,415
84 14 0,152248 0,97316 98,34 115697 0,176816 113715 0,289 -0,176
Sangue 121 51 0,096938 0,978857 98,93 5126 0,014364 5011 1,379 0,965
Periférico 147 77 1,479932 0,260034 15,07 22 0 0 5,499 5,084
259 189 2,613258 0,175609 14,98 40 0 0 5,532 5,117
351 281 2,613371 0,213297 15,02 60 0 0 5,532 5,117
526 456 2,278436 0,240522 16,07 39 0 0 5,503 5,088
619 549 1,829257 0,348405 13,84 54 0 0 5,491 5,076
710 640 NA NA 38,33 12 0 0 5,528 5,113
1177 1107 2,611971 0,213718 12,09 69 0 0 5,479 5,065
101 31 0,015523 0,997597 99,79 139042 0,301654 138663 NA
Medula Óssea 442 372 2,336592 0,167689 11,21 31 0 0 5,458
801 731 1,351141 0,32443 17,71 16 0 0 5,247
502/606 1Dia relativo à primeira infusão; 2Dia relativo à segunda infusão; 3Entropia de Shannon, uma medida da forma da distribuição das contagens de leituras com uma entropia baixa designando uma composição de amostra clonal; 4Clonalidade = 1-(entropia/log2 rearranjos únicos produtivos). A donalidade varia entre 0-1, com 1 designando uma amostra clonal e 0 uma policlonal; 5Frequência máxima para cada amostra; 6O número de rearranjos únicos de IgH; 7 A proporção do clone leucêmico perfaz a massa genômica total de todas as células B de entrada; 8O número estimado de genomas (ou células) diploides com este rearranjo de leucemia; 9Redução Log10 do clonótipo leucêmico relativamente à amostra de referência; 10Redução Log 10 relativamente à amostra de referência da segunda infusão; NA, Não disponível
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[1063] Em seguida, a arquitetura clonal do repertório de células T em células CTL019 foi examinada antes do tratamento e após transferência adotiva. O sequenciamento profundo do repertório de receptores de células T beta revelou que células CTL019 CD8+ préinfundidas e o compartimento de células T CD8+ um mês após a infusão eram policlonais, com múltiplos clonótipos TCRX/β distintos similares entre as amostras (Figura 3; Figura 4A). Aproximadamente dois meses após a segunda infusão, um clone TCRVp5.1+ que dominou a população de células CTL019 estava presente a mais do que 50 por cento dos linfócitos T CD8+ totais no sangue periférico (Figuras 4A-4B). Análise subsequente revelou que 94 por cento do repertório de células T CAR CD8+ consistiu neste único clone que não foi detectado no momento da transferência ou no mês seguinte após a segunda infusão (Figura 4C). Após a erradicação do tumor, a expansão de células TCRVp5.1+ declinou, coincidente com a cinética do decaimento de células T CAR (Figura 4D). Assim, a leucemia foi eliminada neste paciente principalmente pela progênie de uma única célula T CAR que demonstrou expansão in vivo massiva.
[1064] Para determinar o mecanismo subjacente à superior capacidade proliferativa e eficácia antitumoral desta população clonal, foram examinados sítios de integração lentiviral em sangue periférico ou células T CD8+ CAR+ após transferência adotiva e no produto de células com transdução de CAR antes da infusão. Uma vez que DNA lentiviral fica integrado em muitos sítios do genoma humano, o sequenciamento de sítios aceptores de integração pode ser usado para seguir a proliferação de clones de células e investigar potencial mutagênese de inserção.
[1065] A amostragem longitudinal de amostras de sangue do Paciente 10 revelou um clone de célula com um sítio de integração no intron 9 de TET2, que foi expandido em células T CAR no pico da
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504/606 atividade clínica e não em instantes anteriores (Figura 5A). Este grau elevado de dominância clonal não foi observado até à data em nenhum paciente tratado com células T direcionadas para CD19. Em CLL e ALL, o acúmulo de células T CAR in vivo resulta tipicamente da expansão de um repertório diversificado policlonal ou pauciclonal dentro da população de células T transduzidas. Células com integrantes TET2 exibiram persistência de longa duração (Figura 5A) e estavam presentes no sangue periférico a uma abundância relativa de 14% aos 4,2 anos após a infusão (Figura 11 A). A população clonal se contraiu ao longo do tempo e aparentou estar sob controle homeostático, sem sinais de ter ocorrido oncogênese de inserção (Figuras 14A-14C).
[1066] TET2 é um regulador importante da formação de células sanguíneas e a haploinsuficiência ou deleção deste gene desempenha um papel na hematopoiese clonal normal (Busque, L. et al. Nature genetics 44, 1179-1181, doi:10.1038/ng.2413 (2012)) bem como no início de linfoma e leucemia, incluindo malignidades associadas ao vírus linfotrópico-T humano de tipo 1 (HTLV-1) e de surgimento natural (Yeh, C. H. et al. Molecular cancer 15, 15, doi:10.1186/s12943-016-0500-z (2016)). Não obstante a inativação de TET2 poder contribuir para a autorrenovação aumentada de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, é pouco frequente que conduza a oncogênese clara, sugerindo que mutações genéticas adicionais são requeridas para transformação maligna completa (Zang, S. et al. The Journal of clinical investigation 127, 2998-3012, doi:10.1172/JCI92026 (2017)). A análise de populações de RNA de TET2 poliadeniladas mostrou o aparecimento de novos RNAs quiméricos que sofreram encadeamento a partir do éxon 9 7ET2para o vetor e terminaram, truncando a proteína codificada (Figuras 5B, 6A e 6B). Apesar de ser possível que a expressão específica em células T CAR de mRNA de TET2 de fusão truncado e correspondente proteína possa ter um efeito negativo dominante na
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505/606 atividade de TET2 normal, foi demonstrado que mutantes de TET2 não suprimem a função da proteína de tipo selvagem e consequentemente não exibem características negativas dominantes. Adicionalmente, avaliações de mutações de TET2 in vitro e in vivo apontam consistentemente para um fenótipo perda-de-função.
[1067] Para determinar se a disrupção monoalélica de TET2 por integração lentiviral foi maioritariamente responsável por este grau sem precedentes de proliferação clonal de células T CAR, sequenciamos células T CD8+ CAR+ (com disrupção de TET2 por integração lentiviral) e CAR- deste sujeito e examinamos genes envolvidos em malignidades hematológicas ou lesões precursoras. Em ambas as amostras estava presente uma variante de sentido trocado no aminoácido 1879 (éxon 11) no domínio catalítico de TET2, convertendo o resíduo de tipo selvagem, ácido glutâmico, em glutamina (Figura 11C). De modo notável, variações genéticas em TET2 envolvendo uma alteração da sequência de aminoácidos na posição 1879 de ácido glutâmico em lisina, ácido aspártico ou alanina foram associadas a neoplasmas mielodisplásicos-mieloproliferativos. A mutação C.5635C estava presente no alelo de TET2 sem o transgene de CAR integrado, pois esse cromossomo continha a sequência de referência de tipo selvagem (C.5635G). Não foram encontradas outras mutações no painel de 67 genes adicionais.
[1068] TET2 codifica metilcitosina dioxigenase, uma enzima que catalisa a conversão de 5-metilcitosina (5mC) em 5-hidroximetilcitosina (5hmC), desse modo mediando a desmetilação de DNA (Tahiliani, M. et al. Science 324, 930-935 (2009); Iyer, L. M., et al. Cell Cycle 8, 16981710 (2009)). A metilação na posição C5 de citosina normalmente reprime a transcrição e, portanto, é esperado que a desmetilação ative a expressão genética. A importância funcional da mutação E1879Q foi interrogada usando plasmídeos codificando TET2 de tipo selvagem ou
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506/606 esta variante de TET2 que foram transientemente transfectados em células T HEK293. A análise de DNA genômico isolado destas células usando coloração dot revelou que E1879Q trava a oxidação em 5hmC, com uma redução significativa da formação de 5-fC e 5-caC (Figura 11 D). Tal contrastou com células nas quais não ocorreu oxidação de 5-mC devido à introdução de um TET2 cataliticamente inativo (HxD) (Figura 11 D). A sobre-expressão uniforme da proteína TET2 foi verificada por transferência Western de lisados celulares (Figura 11 D). Para confirmar estas descobertas ao nível genômico, DNA de células transfectadas foi degradado em componentes nucleosídicos que foram analisados usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem. De fato, células sobre-expressando E1879Q exibiram uma redução de duas vezes na produção de 5-fC e 5-caC em comparação com o seu correspondente de tipo selvagem (Figura 11E). Estas descobertas suportam a noção de que o alelo de TET2 que não sofreu disrupção por integração lentiviral em células T CD8+ CAR clonalmente expandidas do Paciente 10 era hipomórfico.
[1069] Células T CD8+ νβ5.1+ CAR+ com disrupção bialélica de TET2 ex vivo exibiram menores níveis totais de 5hmC em comparação com as suas correspondentes células T CD8+ Vp5.1- CAR(haploinsuficientes em TET2) (Figura 7A). Tal resultou presumivelmente de deficiência de TET2 após mutagênese de inserção, pois a variante E1879Q não afetou a geração de 5-hmc (Figuras 11D-11E).
[1070] Para interrogar o mecanismo de mutagênese de inserção de TET2 na função de células T CAR, foi realizado ATAC-seq, que monitora a acessibilidade de DNA (Buenrostro, J. D., etal. Nat Methods 10, 1213-1218 (2013), incorporado aqui a título de referência na sua totalidade) (Tabela 10). Apesar de, globalmente, as alterações epigenéticas entre células T CD8+ haploinsuficientes em TET2 (CAR-) e bialelicamente deficientes (CAR+) deste paciente terem sido
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507/606 modestas (Figura 7B), a análise de ontologia genética baseada em perfis de acessibilidade de cromatina revelou acessibilidade ganha para genes em vias que regulam o ciclo celular e sinalização de receptores de células T (Figura 15 e Tabela 8), e acessibilidade reduzida para genes em vias que regulam a diferenciação, ativação de células T e função efetora (Figura 7C; Figura 8; Tabela 8; Tabela 9 no Apêndice). Genes perto de leituras de ATAC-seq que foram substancialmente reduzidos ou perdidos após disfunção bialélica de TET2, por exemplo, mutagênese de inserção, incluíram vários reguladores da diferenciação efetora e função de células T, tais como IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA e PRDM1 (Figura 7C; Tabela 8).
[1071] Para determinar se estas alterações na paisagem de cromatina global de células T CAR clonalmente expandidas poderão ter afetado circuitos específicos de transcrição que são mediadores centrais de diferenciação e função de linfócitos T, identificamos motivos de fatores de transcrição (TF) ganhos ou perdidos em células T CD8+ CAR+ relativamente a células T CD8+ CAR- (Figura 12A). Os motivos de TF adquiridos em células T CAR+ incluíram sítios de ligação específicos de transformação de E26 (ETS) (GABPa, ELF1, Elk4) e de TF de dedos de zinco (ZF) (Sp1) que caracterizam células T CD8+ humanas virgens e de memória inicial 44 (Figura 12A e Tabela 11). De modo notável, foi demonstrado que TFs de ETS são requeridos para o desenvolvimento, ativação e sobrevivência de células T normais (Muthusamy, N., Barton, K. & Leiden, J. M. Nature 377, 639-642, doi:10.1038/377639a0 (1995)). Em contraste, motivos de TF que estavam menos acessíveis (Figura 12A e Tabela 11) em células T CAR+ (NF-κΒ, IRF1, NFAT:AP1 e CTCF) do Paciente 10 são enriquecidos em células T efetoras terminalmente diferenciadas e exaustas e têm papéischave conhecidos na formação da paisagem epigenética que programa a sua biologia. Picos que se fecharam no cenário de perda bialélica de
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TET2 também incluíram um motivo que é reconhecido pelo TF de zíper de leucina básico (bZIP), BACH2 (Figura 12A e Tabela 11). Não obstante ter sido relatado que BACH2 inibe a expressão de genes relacionados com a função efetora para manter um estado não manipulado em células T CD8+ murinas (Tsukumo, S. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmericallO, 10735-10740, doi:10.1073/pnas.1306691110 (2013), a sua disrupção por integração lentiviral também foi ligada a expansão clonal e persistência de células T infectadas com o HIV em vários estudos (Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A. & Matsushita, S. The Journal of infectious diseases 195, 716-725, doi:10.1086/510915 (2007)). Adicionalmente, BACH2 é um alvo de integrações pró-virais em linfomas de células B induzidos pelo vírus da leucemia murina e a sua perda é um mecanismo direto subjacente à atividade clonogênica e persistência de células imunes. Globalmente, as diferenças significativas na acessibilidade da cromatina e motivos de ligação de TF associados de reguladores bem definidos da diferenciação, desenvolvimento, expansão clonal e persistência de células T suportam a nossa inferência de que a deficiência de TET2 deslocou programas reguladores ativos nas células T CAR altamente potentes presentes no Paciente 10.
[1072] De acordo com estas descobertas, a análise funcional de células T CAR+ com TET2 bialelicamente deficiente, por exemplo, com disrupção, cultivadas a partir deste paciente revelou uma capacidade decrescida para expressar IFN-γ e CD107a (marcador substituto para desgranulação) quando ativadas (Figura 7D), consistente com um estado menos diferenciado. Assim, a integração lentiviral em TET2 juntamente com uma mutação hipomórfica no segundo alelo reprogramou a paisagem epigenética de células T CAR de um modo que foi consistente com o destino alterado de linfócitos T.
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Tabela 8. Genes associados a regiões de pico de ATAC mais abertas ou fechadas em células T CD8+CAR+ (com disrupção de TET2) em comparação com CD8+CAR- do Paciente 10
Coluna A Coluna B
Regiões de Cromatina Mais Abertas Regiões de Cromatina Mais Fechadas em em CD8+CAR+ CD8+CAR+
RPL37A, MIR5092, CBX3P2, CHFR, MIR4668, LINC01461, TMEM218, KCTD18, KMT2E, WASH5P, NCR2, ZNF205-AS1, B2M.NLRP3, NOTCH2, IL1RN, C11orf73, CHGB, NAT10, KCNQ1OT1, C18orf54, PTGR2.KLF7, SH3BP5, MIR4464, GALNT2, LINC00332, LOC102467080, CCDC152, TUG1.PTPRG, CSF2, LPP, LOC102659288, RMI2, CENPJ, GSS, MIR4489, TOM1L2, INPP4B, KLHL29, FOXD2, DLEU1-AS1, MXI1, PRSS38, SP2, ZNF318, PDPK1, LINC00865, PTGER4, HSBP1L1, RD3, KCNS2, TMEM43, DOCK8, TMEM70, AZIN1, AQP7P1, NRP2, RGS1, ETS1, SPATA4, SLC22A16, NFIB, MGAT5, ALG10B, ZNF107, IL13, ARHGAP26-AS1, RUNX1-IT1, LINC01395, TMEM134, EGLN3, PHF20L1, NUPL2,NR3C1, MED7, LSMEM1, CD226, DLC1, CAMK2D, PPCDC, SLC2A11, CCNB1, LOC100507144, HACE1, SGMS1, RUNX1, KLF6,
IRAKI BP1, MCPH1, VWA8, KIAA0040, LGC400997, PHTF2, LINC01257, LOC101927557, CES1P1, ITM2C, SOGA1, SHFM1, SMIM20, ZMYND11, CCDC81, CLIC5, BCL6, NHS, TEF, IFI27L2, XYLT2, MRPS33, GLRX3, EZH2, C1orf131, INSIG1, SYNE2, ICA1, METTL20, GPD1L, LRRC27, RPL36, LOC100506700, MIR1260B, LONRF2, BACH2, LOC100507406, SNRNP70, MAP3K7, LOC389831, SNORA14B, CCR4, DUSP6,
CEBPZOS, PLXNA4, C1orf159, C3orf67-AS1, SYT14, SP140, TMEM131, GPR150, TMEM39A, ZBTB38, IRF7, CYTH2, PCSK1, MIR4272, MACF1, GLDC, RAMP3, LINC01030, C21orf91-OT1, API5, LOC339862, LOC101927780, ECT2L, ADIPOQMPPE1, IDUA, LINC00426, TRIB1.AS1, BCKDHB, SMARCA2, EVA1A, MTMR2, GABRR3, CCDC80, CSGALNACT1, MIR4697HG, GJA10, SLC4A10, BHLHE40-AS1, SLC12A9, LOC101927406, YTHDF2, AQP7P3, LINC00636, MGME1, HTRA1, C6orf132, RNF6, CXCR4, ZNF251, C11orf73, MIR5708, KCNQ3, CARS2, MAP7, PDE4D, IMPG2, DUSP1, NUDT15, LOC100507316, GNA12, TGFBR3, LINC00673, MIR583, TAGLN3, SLC25A6, PSME1, RCCD1, MAP3K7CL, MIR1208, DUSP5, ICOS, SSBP3-AS1, LOC101927482, PYCR2, TXN2, MTRNR2L1, C21 orf91-OT1, LOC286114, SSTR1, CARD11, CROCC, F2R, GCNT1, VWA8, MIR30B, SLC1A1, PLSCR2, LOC101927560, LINC01091, CX3CR1, SHISA5, CCR8, MIR1206, VPS53, LRRC8B, EFHB, GTSF1L, PYROXD1, TTC22, PML, ANKRD7, SGMS2, CASC11, CHSY1, PTPN14, LINC01125, TTC27, ACOXL, TTC37, PBX4, SEL1L, ZFAT, TMEM106B, C4orf51, MIR6132, TAF1B, MYBL1, SOX6, C1 orf21, SAMD9, PPP2R2D, CSF1, WWTR1, ZP4, PRDM1, SLC43A2, LOC101927780, GNPNAT1, TSTD3, LOC102724550, ATP10A, RAB6B, CARD17, BBS10, KIAA1841, C21 orf119, FEM1C, DOCK9-AS1, PCCA-AS1, GFRA2,
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FAM73A, ERCC6, USP19, SPA17, ARHGEF3-AS1, CLDN18, FAM105A, TMEM261, KHDC1, MICU2, LINC00501, MYO16-SNTB2, PDLIM4, STARD8, LCP2, EPAS1, AS1, CH25H, FAM114A2, GGCT, PRKCDBP, PLA1 A, MICAL2, MIR5197, VAV3-AS1, IGF2BP3, MIR21, RSRC1, TOX2.NUMB, LOC285762, FDX1, PRKAG2, LINC01031, FAM156A, MYB, LYST, ANKRD31, LTV1, LINC00589, PXYLP1, SLC9A7P1, VKORC1, FKTN, COPS7A, DNAJB11, GABRA4, STAMBPL1, ITPR2, HRH1, GEMIN8, UACA, TLE3, SGCB, IYD, TTC14, ZNF704, RAD54B, MYCBP2, LRAT, LRRC32, TNFSF18, MAEA, GCLC, RAD50, LOC283575, HDAC9, SV2C, PCNX, KIAA1217, ZCCHC5, FYN, DENND4C, LOC101593348, ABCA13, CLEC4D, ARHGAP21, CHMP4B, NCALD,
SLC38A9, APBB1IP, STIM2, CGRRF1, HMGB3, PTENP1-AS, LOC101927543, SLC25A51, IVNS1ABP, PAK1, NAGA, GTF3C5,CA12, PIP5K1C, MIR4637, WARS2, CNIH3, PDGFRL, ST3GAL5, RETSAT, LOC101929715, MIR6876, NIPAL3, LOC101928001, PANK2, C5orf51, LOC154449, NEK10,HHLA2, PLB1, SLC25A13, KIF5C, ISM1, MTDH, SH2B1, LYSMD4, ZNF688, GAB3,CCNG2, TNFSF10, SUMF1, DOCK2, EPB41L3, PAIP2B, THYN1, ATXN1L, RAB22A, UCP3, TRG-AS1, MOXD1, LINC00581, PPA2, SATB2, ZC3H10, PRKCH, SEC61A1, LOC101929551, TNFSF8, ALK, GIMAP5, MIR101-2, PDHB, DBP, WFS1, CCDC141, CMKLR1, TRABD2A, LOC100129520, THADA, CDC20, DERL1, RFESD, OR10AD1, EIF1B-AS1, MIR146A, LINC00607, FAM178B, CACTIN, SYTL2, GPR146, GPR56,CHST7, MIR1913, SNX9, DTX2P1-UPK3BP1PGAM5, CDKL5, IL12RB2, DCXR, PMS2P11, TMPRSS4, LOC101929241, DHRS4, BFSP1, ZNF408, TOMM20L, ZNF891, ADAP1, ANKRD11, C4orf32, DNAJC19, LINC00548, C1GALT1C1, HUS1, LLGL2, C2orf40, PRKY, MIR875, WNT7A, ERVFRD-1, FAM126B, CCDC132, GINS3, NFIA-CCR7, NT5E, TIAM2, CXCR4, LGC100128176, AS1, DTHD1, ISCA2, PDP2, CMC1,THEG, BZW1, LINC01358, LOC100506860, IKZF1, SLC27A1, FAM227B, C15orf41, ASXL1, LBH, LOC101927865, LOC286190, APAF1, MDM1, HNRNPA1 L2, NUDT9, PGAP2, LOC100506457, MYO3B, THEMIS, NEDD9, RNU6-31P, ALG10, PIK3R1, RBM47, FAM53B-AS1, ZNF496, BCL2L14, PLEKHA8P1, TBC1D23, HSD17B7, NUDC, TIGIT, SCIN, LINC00892, CETN4P, ZNF292, TNP1, FGF12, ASPH, TLDC1, ZBED2, YPEL1, CBX7, ATP6V1B2, LOC101927950, TSEN15, IL20RA, CMPK2, MIR4465, WDR27, ENPP2, RIPK2, MIR1301, PTPN20B, GAB1, NCK2, ZNF648, PRSS8, KIAA0408, ARHGAP26-AS1, PDE4B, USP46, GFI1, OR1K1, ASAP1-IT2, DHRS9, GJA10, RNU6-2, POLR2D, FAM69A, PTEN, BMP1, TNS3, PTPRD, CDCA7L, CTU1, RNF141, EXOC2, MOCS2, LMNA, HIVEP2, DUSP10, OTOGL, LMO1, AREG, EPSTI1, BHLHE22, ZC3H12C, MED15, STEAP4, GHSR, UPP1, ANXA1, LINCRRASL11B, OAF, TRAPPC11, CREG1,0001, SYK, COPS8, SLC38A6, MKKS, MIR6124, IPCEF1, MYPOP, TTC1, ZNF808, CHST2, NRBP1, LOC728730, FLJ21408, 42434, PON2, FAM63B, CBLB, SYNE1-AS1, SEMA6A, DOT1L, FLJ27354, RHBDD1, LINC00888, DHRS13, NDUFB5, GNAI3, FLJ33360, ZMIZ1-AS1, PLAGL2, MIR92A1, ITGB1, LINC00924, RPLP1, SLITRK1, CASP3, ANXA5, RABGAP1L, RLBP1, TNFAIP8, ASAP1-IT1,
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GCC1, ASPHD2, GUCY1B3, ACTN4, DPYSL2, ARHGEF3, RBMS3-AS3, RYBP, TBC1D32, PC, GNA12, PDE4D, LOC100130298, ADRB2, RBPJ, MIR4526, NFATC1, AASDH, SATB1-AS1, SBSPON, IL5RA, CCDC91, LINC-PINT, ANKRD20A3, ZADH2, ZBTB11-AS1, PRICKLE3, LOC101928436, BACH1-IT2, CHMP2B, MIR4729, NDUFAF5, ZMPSTE24, RPRD1 A, PTPN3, PRTFDC1, LAPTM4B, CRCP, LINC00423, ZNF669, CLIP4, PCNXL3, RCN2, ANKRD33B, TP63, LOC100507420, GNA14-AS1, CXorf57, PRDM13, LOC441666, TNFSF11, LOC101927243, HIPK2, C1orf106, GPALPP1, MRPS14, AAMP, JMJD4, ARHGAP31-AS1, PSMD14, SPTY2D1, CDH17, GOT1, N6AMT2, ZC3H7A, NEMF, LOC441204, SHQ1, CCND2, LINC00824, ITGA2, MIR6871, SAP18, ABCA1, U2AF1, APOD, ZC3H12C, CD58, C2orf57, SVILP1, BCL9L, NSDHL, RNF223, NR5A2, RTTN, MIR1976, LOC152578, KHDC1, LINC00969, PLS3, PMM1, HIVEP1, DTX2, PLEC, SNORA62, AGFG2, LOC101928105, SERTAD2, LOC101929517, C20orf196, EDN1, PMEPA1, DSE, C1 Oorfl 31, LINC00540,
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PLAGL1, MINA, TNFAIP1, COPG2, CDK5RAP2, CD247, CD44, PIK3AP1, ZADH2, DZANK1, CHST2, TMEM126A, CCDC83, HULC, KLF13, SYTL3, MMP20, NBEAL1, KHSRP, C10orf99, ANO10, LOC100507195, TP53BP2, LOC101927416, SATB1, MIR4458HG, FAM175B, TPRKB.NRCAM, LOC392452, SMIM3, IL37, CCDC147-AS1, USMG5, PTP4A1, ABHD2, ENTPD3-NSUN7, WDR1, SMAP2, LOC102724323, HHAT, AS1, RAET1K, CAMTA1, CEP131, MYADM, CTHRC1, SMCR5, NABP1, YWHAQ, SPIDR, EIF3D, TMEM161B, NCOA4, ADAM6, MTHFD1L, MALSU1, TRIB2, SFXN4, MIR4744, SNX19, FAM161A, VWA5A, MIR1200, CSGALNACT2, RSPO3, PKI55, GPR87, ABLIM2, DDX10, ZNF84, MOSPD3, IER5, STK39, CD5, NUAK1, CD200R1, RNU5D-1, ABCB8, GTPBP3, LOC729218, ELP4, MIR1343, RANBP9, MIR6743, RNLS, RGS10, SP4, MCM10, SACS, AP2M1, ERCC4,LDHD, SYCE1L, GPR171, HECA, WT1, HDAC8, DGCR6L, PSMA6, TIMM10, ZNF692, ICAM2, AKAP13, SSPN, SENP6, COPG1, CRTAM, SLC7A11, FOXK1, COG2, LOC100128993, IL12RB2, ETV1, GBE1, IQSEC2, COMMD2, CLU, OSBPL3, CUTA, STON2, DSTN, STK4, UBXN10, TRIM36, RABL2A, ASMT, FAM105A, CCL3, ZNF430, TACR3, MIR6729, FLJ20021, FAM196B, ANK1, MIR4269, SMARCAL1, ST3GAL1, ZBTB17, SVIL, NBPF20, LINC01132, SNORA72, DDX50, TET3, L3MBTL1, DLGAP5, ISM1-AS1, FAM129A, LINC01359, ELMO1, OGG1, THEMIS, ACO2, GNG2, BCOR, LRRFIP1, RAB31, ANTXR2, XRCC5, ASIC3, GTPBP8, NDUFS8, CPOX, LPAR3, C11orf58, SMKR1, NFKB1, RIMS2, SKI, MIR4786, GFPT1, PTPRM, LOC100132529, SLC37A3, SERPINE3, RAD23B, LOC101929153, BTBD6, FAM45B, PPP1 R21, CTD-2201118,1, LINC00900, STARD13, MIR604, LINC01031, CHMP4A, SGMS1JRS2, LOC102724467, FLJ36777, ANKRD44-IT1, ZSWIM3, RANBP10, FZD6, PRTFDC1, ACOXL, GOLGB1, SP140L, BTBD11, PTPRE, MBD1, SPAG16, TLE3, MAP2K6, ANKRD46, CSGALNACT1, PRORY, ABCB4, RERGL, DUSP11, SMARCAD1, C12orf42, CYP11A1, EIF1, NAV2-AS5, PIK3CA, AMFR, RNFT2, COMMD6, MIR4473, G2E3, KIAA0825, R3HCC1, IRF4, LOC101928731, CCDC7, YY1, SDHAP3, YIPF5, LOC728084, PPP1R3G, MSH4, ADTRP, ATP1A1, FAM175A, ATP5G1, KLHL20, TBC1D23, DDX11, ZNF267, DRAM1, DUSP22, DOPEY1, YIF1A, TTC23L, UBXN2B, C1orf229, MIR6516, CIAO1, NCOA7, RGS2, TBC1D22B, MTMR9, RPL39L, OR13A1, EDN2, GPR183, LINC01510, CYFIP2, KIAA1191, TRIM21, CD34, LGC100129316, HBS1L, ITGAL, JARID2, ZNF595,
PHOSPHO2, LOC101929057, INTS3, LOC646736, TNFRSF18, MIR3194, MIR2355, MCCC2, MORN1, ZFAND2B, LINC01140, MIR4435-1, EBF1, TRUB1, MYO1B, UBASH3B, RUNX3, GTF2E1, LOC100130476, ID3, RUNX3, ZNF365, SLC25A38, HNRNPC, BLM, LOH12CR1, LINC01091, APBB1 IP, XCR1, TSC22D1, FAM46C,
EPB41L4A-AS1, CKAP5, MIR548Z, ABHD2, CR2, FAM86B3P, LRRK2, TMPPE, CD55,
EIF1AY, MAF, USP11, MIR6731, TAOK3, C1orf105, SAMD3, IFNG, POMT2,
SPHK2, KIAA1462, RAPGEF1, MIR4782, SLA, CCNY, MT2A, NFKBIA, SPSB1,
PDE4B, TCEANC, ZDHHC13, SUGP1,CXCR3, SCARB1, UCP2, C9orf72, PSMD5-AS1,
Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 518/678
513/606
DDHD1, ECT2, SPAG1, AKAP13, GSTO1, LOC101927482, TRANK1, C10orf71, ACN9, APEX2, KIAA1919, MIR3714, CMC1, EPHA2, MIR1244-1, PRSS55, COL6A4P1, SLC25A3P1, TP53RK, FAM53B-AS1, MIR548I3, ADORA3, C10orf128, PEX2, SEC31A, TMEM5, ACYP2, LINC01395, SPATA24, FUT8, PKN2-AS1, GK3P,
HSD17B7P2, PGK1, PDHA1, CCNT1, LOC100288911, REREP3, CD86, MYL4, ANXA6, PLRG1, SNRNP48, UBE2C, PITPNC1.MBP, RAB32, LINC00152, STK31, MINA, DUSP4, NUMB, FOXO1,CALU, PAF1, TMEM2, LRRC8C, RFT1, NLRC5, MIR5188, C14orf64, FKSG29, TSHR, PROSER3, GCSH, MIR548AN, IQGAP1, PALM2-AKAP2, RFESD, CASC21, BCKDHB, COPE, KLHL26, ITPR1, BTBD3, MIR1205, MDFIC, BTD, FAM72B, POT1-AS1, CCDC64, PDK3, ELK1.ZNF254, MAEL, KATNBL1P6, BIRC3, PRDM14, ADIPOR1, CHMP4B, ZNF750, AEBP2, AGPAT9, MEGF10, TNC, KLHL3, PDK4, LOC728730, POU4F1, KIZ, GRHPR.ADA, PLXNC1, ENAM, HOMER2, PLEKHA7, ELAC1, COX8A, CCZ1B, CEP164, FRMD4B, PKIA, NFATC2, PVT1, NDFIP1, GNPTAB, MPHOSPH6, LINC00595, BHLHE40-MAP6, PGAP1, MBNL1, NT5M, MICU3, ASF1A, AS1, ADRB2, PLXNA1, RSL24D1, SPTSSA, DIABLO, BRD7, GNAI1, MTRNR2L6, MIR4724, MAT1A, FAM122A, RBM20, NDUFV2, BBS10, LYPLAL1, PIM1, SNORA75, DGCR6, RBM27, PSMD8, LINC01252, ITPKB, LOC100505887, ANKRD20A4, FLRT3, UTRN, ITGB1, SLC45A4, MIR5703, ZBTB10, ARL14EPL, FGGY, MIR7854, SNORA26, DCTN4, PROSC, TMPRSS11E, TOB2P1, SCML1, CHRNA1, CDKN2D, EOMES, MIR146A, RNASET2, RIN3, GLS, LINC00598, PILRA, LINC00298, NUPL1, LYRM7, NRL, ZC3H12D, BATF3, AFF2, KIF13B, TG, LINC01160, ANKRD20A11P, RSU1, ZNF286A, LDHA, CLEC16A, RGS9, SPRED2, GALNT18, PACRGL, TMEM67, TWISTNB, MMP19, FAM13A, TRIM25, TNFRSF10D, PGPEP1L, EPDR1, AURKAIP1, ANKDD1B, IL15RA, SEMA4D, OR4N3P, SH3RF1, ZNF736, TBCC, PARP11, EIF2AK1, ETV6, LSM6, NAB1, GAT A3, LOC100506990, SDCBP2, NPRL2, LOC102723895, CCR3, MIR4681, IDS, ZBTB7A, NOP14-AS1, TBC1D4, HMG20B, EPHB1, CD69.CELF2, ARL6IP5, SRGAP3, NTPCR, HNRNPAO, TFDP2, AGO2, DAPK2, NAT1, LMO7, ACER2, ALG1L2, IL21-AS1, GGA3, ABTB2, TIMMDC1, STX17, PDXP, SEC22A, BCAR3, LOC728613, AKAP2, RAPGEF1, ATXN1, PARS2, MAGT1, LINC00536, PREP, P2RX4, MIR4461, SMAD3, NFIA-AS1, HNRNPD, SS18L2, ERMP1, LOC100505478, FOXO1, SMAD1, MAFIP, CD28,
DNAJC19, SNORD50A, EIF3F, GSR, CALCOCO1, MIR648, FAM126A, S1PR1,
MRPL16, BUB1, LOC101927592, LOC100288778, HS1BP3-IT1, ANKRD18DP, PROSER1, CALCOCO1, IFT27, GOLGA8B, TTLL1, GTF2B, NEB, DYNC2H1, MALSU1, ATP6V0A4, SLC25A26, OR52W1, GPI, RASGRF2, ITM2B, EPS8, ALS2, SLC46A3, C16orf91, BCL2, LOC283788, TATDN2, SPEF2, HIVEP3, SNAI3-AS1, RABGGTA, SLC2A8, LOC151475, CASC23, KANK3, MRPS30, ZDHHC19, PITRM1, SFMBT2, LOC100507406, MBNL2, TGFB2-AS1, MCF2L2, ALDH4A1, STK39, LOC101928530, MRPL33, PRKAR1A, SLC26A4, RNF165, DAZAP1,
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SSR3, TMEM41A, ABCF2, ANKRD6, CCDC64, TMEM200C, ALLC, ZFP36L1,
AGGF1, NOC3L,
SPRY2, TBL2,
GRAMD3,
C5orf64, ZNF32,
TAOK3,
CLCN5, I
LOC100132891,
HAVCR1, GOLGA8A, LYZ, LOC101928370, ITPRIPL2,
C7orf50, CACNA1E, CD59, PTPRC, DLGAP1-AS2, GDNF,
CARM1,FGD2, HNF1A-AS1, SLC8A3, HSP90AB1, CUBN, , GHITM, CTNNA3, GPHN, MIR1207, ILDR1, SLC35G2,
RNGTT, LINC01010, PGS1, LINC01250, TLDC1, MIR6723, DHTKD1,SERPINB6, PPARG, ZDHHC19, COX17, ODF1,
SIDT2, GYG1, RRAS2, FAM21 OB, CDV3, GPATCH2, NEK6,
NGDN,
PCTP,
PEX7,
MYO9B,
KIAA0141,
C1orf52,
LOC388942,
SPINK2,
ARHGAP22, RFWD3, ELL, MOSPD2, LOC101928988, LOC101928730, RFC3, RASGRP1,
LOC100996286, TMEM115, ARMC1, RASAL2-AS1,
LINC00598, POC5, NFATC2IP, PER1, B4GALT1-AS1,
LOC100288911, ZNF138, LOC151484, LOC102724957,
TTC30B, LINC00221, ROBO3, CRB2, LOC100506178,
RNU6-16P, NFKBIB, GGACT, ZNF133, LOC100133050,
LINC01222, SRPR, PSMD3, WARS2, SLAMF1, PCSK6, RLIM, MIR548AV,
TDRKH, CST7, WASH7P, ORMDL2, DNAJB5-AS1, CHEK2P2, ZNF592, LOC101928453,
WNT10A, SLA,
PTK2B,
PRR5L,
HINT1,
EVI5L,
HLX, PLAC1,
ST3GAL6,
MCOLN2,
CERS6,
NAPG,
NES, LDLRAD4,
TBL1X,
TTPAL,
PDP2,
TSC22D2,
AGK,
MIR593,
MIR568,
HSD17B8,
MIR6874,
LAMTOR4, RPN1, MIR3143, PCDH1, EHD1, UNC45A, PLEKHA6,
DHRS4,
0SBPL8,
AP2A1,
MIR9-2,
ABLIM1,
ARL13B,
MAP9, APOO,
TFAP2A-AS1,
SFXN1,
FSCN1,
S100A2,
AHR,
TRPS1,
SPC25,
CDC25C,
PDCD4-AS1,
LOC439933,
GLCCI1,
MIR8086,
LOC100130451, MIR7160, ADPRHL1, ACOX3
N6AMT1, USP25, ARHGDIB, USP3, LMOD3,
FBXO33, TSPAN13, CDH13, LOC100507412,
TAGAP, LINC00114, SNX13, MIR4316,
LMBR1L, LOC101926963, C9orf24, MIR7848, MEF2D, GOPC,
ZNF680, PPP1R16B, ITGB7, KRBA1, AP5M1, ARGLU1,
CERS5, TMEM154, RASGRP3, SMG5, EFHD2, SAMD5,
CSF1 R, SH3RF2, LINC01366, CAMK1, ZNF815P, C5orf63,
ZNF124, P2RY14, CLLU1OS, ZIC3, LHX9, KCNJ1, BPESC1,
LINC00461, CD84, IL1R2, LYPD6B, MTRNR2L2, DCAF12L1,
ITGAD, EBLN2, MRPL36, FAS-AS1,
LOC101928386, PVR, LRRC7, C10orf40, KLF10,
FTO, GPR132, GMPR, SOWAHD, STIP1, ZFP36L2,
DDAH1, NMBR, SLC4A7, GAP43, MIR1245B,
TRPV2, G0S2, APBB2, UQCRBP1, ZC3HAV1,
CTSB, PHLDA3, CD2, DUSP2, FTL,
LOC100506801, STAT4, NSMCE2,
CCDC12, GFOD1, CLCN4, GCNT4,
LPGAT1, TMSB10, HPCAL1, LOC101927391,
BCL2, PRDX4, TTN-AS1, LOC101927406, POLI,
CTNNB1, NPPC, CDK5R1, MCTP2, CCDC102A,
STK24, SH3TC2, CFC1, SLED1, GPR174, ZNF827,
LAG3, PVRL3-AS1, MARCKS, KCNQ5-IT1,
SMCO1,
IL10RA,
PTPN13,
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TRERF1, FZD8, BCL2A1, ANK3, JAG1, ASAH2, OR1 F1, BCAT1, LRRK1, POLR2J2, PTDSS1, CD3E, MIR3945, RHOH, GNG2, IQGAP2, BTBD19, C1GALT1C1, RGS20, CCDC6, EFTUD1, RBMS1, MIR155, VCAN, GTF2H5, LOC101927651, STX2, IGFBP5, NVL, MSN, RASGRF2-AS1, LOC401585, MGST2, TBX21, MCF2L-AS1, CLDN12, LIMA1, SREBF2, EMC2, AFAP1L2, NOD2, DNM3OS, CLN8, ZNF311, PIK3CG, CP, CCDC85A, ZCRB1, PCDHGC5, FURIN, WNT16, DOCK10, MIR129-1, ZCCHC18, OR2V2, LOC102723703, MEX3C, DNAJC5, PIGB, FAM71B, WIPF1, FNBP1, LINC00603, SH2D1A, GGTLC2, POLR2J, AKNA, AMICA1, PPP1R1C, ST6GAL1, RUNX2, DGKA, CUL4A, BCL11B, MIR155HG, MIR3188, GABRR3, SMAD7, GRAMD1B, CRTAM, AGBL3, CASR, RUNDC3B, DTNA, METTL21EP, LOC727896, TMOD1, SLC4A4, LINC00708, GPR64, ASB4, SETD7, RIF1, SFMBT1, PAX8-AS1, VPS8, FCER1G, TOP1, CPEB2-AS1, TPTE2P6, PYROXD1, IL1RAP, ARHGEF12, CTLA4, STK17B, PPP2R5C, NLRP6, MTRNR2L8, SGK1, MIR4471, BEX5, GRAP2, FIGNL1, MTNR1B, CAPN13, COLEC12
A Tabela 9 é mostrada no Apêndice, que faz parte da revelação, e é incorporada aqui a título de referência na sua totalidade.
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Tabela 10. Resumo da estatística para ATAC-seq. de células T CD8+
CAR+ e CD8+ CAR- do Paciente 10
Leituras Totais
Nome da Amostra índice Nextera (extremidades emparelhadas 2 x 75 pb) Alinhamento Concordante Único # % Alinhadas de Modo Concordante
células T CD8+ CAGAGAG 98,139,264 89,411,351 91,1
CAR+ (Repetição 1) G
células T CD8+ CTCTCTAC 78,513,260 75,702,498 96,4
CAR+ (Repetição 2)
células T CD8+ GGACTCC 220,099,187 204,644,381 93,0
CAR- (Repetição 1) T
células T CD8+ TAGGCAT 98,975,732 91,325,785 92,3
CAR- (Repetição 2) G
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Tabela 11. Lista de motivos de ligação de fator de transcrição unicamente enriquecidos presentes em picos ganhos em células T CD8+ CAR+ em comparação com CD8+ CAR- do Paciente 10
Nome do Motivo Consenso Valor P Log valor P valor (Benjamini)
NFY(CCAAT)/Promotor/ RGCCAATSRG 1.00E-18 -4,37E+01 0
Homer
GABPA(ETS)/Jurkat- RACCGGAAGT 1.00E-15 -3.49E+01 0
GABPa-ChlP- Seq(GSE17954)/Homer ELF1(ETS)/Jurkat-ELF1ChlP- Seq(SRA014231)/Home AVCCGGAAGT 1.00E-14 -3,39E+01 0
r
Elk1 (ETS)/Hela-Elk1 - HACTTCCGGY 1.00E-12 -2,77E+01 0
ChlP- Seq(GSE31477)/Homer Elk4(ETS)/Hela-Elk4- ChlP- Seq(GSE31477)/Homer NRYTTCCGGY 1.00E-11 -2,55E+01 0
Sp1 (Zf)/Promotor/Homer GGCCCCGCCCCC 1.00E-05 -1J8E+01 0,0001
ELF5(ETS)/T47D-ELF5- ACVAGGAAGT 1.00E-04 -1J4E+01 0,0002
ChlPSeq(GSE30407)/Homer
q N2 de% deN2 de % de
Sequências-Alvo Sequências-Alvo Sequências de Sequências de
com Motivo (de com Motivo Referência com Referência com
817) Motivo (de Motivo
46637)
84 10,28% 1529,7 3,28%
106 12,97% 2573,3 5,52%
91 11,14% 2059,7 4,42%
90 11,02% 2265,4 4,86%
87 10,65% 2243,5 4,81%
71 8,69% 2341,6 5,02%
52 6,36% 1557,7 3,34%
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ETS:RUNX(ETS,Runt)/J RCAGGATGTGGT 1.00E-04 -1J2E+01 0,0002
urkat-RUNX1-ChlP- Seq(GSE17954)/Homer MYB(HTH)/ERMYBMyb- ChlPSeq(GSE22095)/H GGCVGTTR 1.00E-04 -9,52E+00 0,0008
omer
KLF5(Zf)/LoVo-KLF5- DGGGYGKGGC 1.00E-04 -9,27E+00 0,001
ChlP-
Seq(GSE49402)/Homer
GFY- RACTACAATTCCC 1.00E-03 -8,82E+00 0,0015
Staff?,Zf)/Promotor/Hom AGAAKGC
er
BMYB(HTH)/Hela- NHAACBGYYV 1.00E-03 -8,36E+00 0,0022
BMYB-ChlP- Seq(GSE27030)/Homer AMYB(HTH)/TestesAMYB-ChlP- Seq(GSE44588)/Homer TGGCAGTTGG 1.00E-02 -6,74E+00 0,0092
GFY(?)/Promotor/Homer ACTACAATTCCC 1.00E-02 -6J2E+00 0,0161
14 1,71% 195,8
99 12,12% 3825
145 17,75% 6109
13 1,59% 215,9
73 8,94% 2714,3
74 9,06% 2928,3
10 1,22% 189,3
0,42%
8,20%
13,10%
0,46%
5,82%
6,28%
0,41%
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[1073] Seguidamente se analisou o estado de diferenciação de células CTL019 in vivo do Paciente 10 e foi comparado com células T CAR de seis outros pacientes que responderam a esta terapia, incluindo dois sujeitos com CLL (Pacientes 1 e 2) que tiveram remissões duráveis de longo prazo (>6 anos) e não exibiram integrações de TET2. No pico da enxertia in vivo e expressão de marcadores de ativação (Figura 9), mais de 65% das células T CAR exibiram um fenótipo de memória central, que diferiu destes outros respondedores completos cujos repertórios foram dominados por células CTL019 CD8+ de memória efetoras e efetoras no máximo da resposta (Figura 7E). O silenciamento de TET2 recapitulou o efeito da sua perda no Paciente 10, por exemplo, disrupção de inserção, no estado de diferenciação de células T humanas totais e CD8 bem como CD4 CAR+ de sujeitos saudáveis (Figuras 7F-G; Figuras 10A-10C), implicando TET2 como um regulador epigenético do destino de linfócitos T.
[1074] A regulação mediada por TET2 da diferenciação de células T CD8+ pode não ocorrer ao nível da transcrição, pois não observamos expressão de mRNA de TET2 diferencial entre subconjuntos não manipulados e de memória. Estas descobertas podem ser explicadas pela observação de que, apesar de a expressão do gene TET2 ser rápida e transientemente aumentada por desencadeamento de receptores de células T de um modo dependente de Ca2+, a calendarização da indução de 5-hmC ocorre mais depressa do que alterações na expressão de mRNA. Os sinais de receptores de antigenos que regulam a transcrição de TET2 bem como a atividade enzimática de TET durante a ativação/diferenciação de células T aparentam estar fortemente controlados e podem atuar através de múltiplos mecanismos independentes.
[1075] Para pesquisar a importância funcional desta alteração do estado de diferenciação de células T resultante de deficiência de TET2
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520/606 realizou-se um ensaio de re-estimulação em série in vitro para prever a potência clínica de células T CAR. A estimulação repetida com células tumorais expressando CD19 permitiu que células T CAR deficientes em TET2 continuassem a se expandir de um modo dependente de antigenos, ao passo que a re-estimulação de células T CAR com TET2 inalterado resultou em paragem do crescimento da cultura (Figura 12C) sem afetar a sua viabilidade (Figura 17). Estes resultados demonstram que o 2-hidroxiglutarato, um inibidor de TET2, mantém a sobrevivência de células T CD8+ murinas ex vivo, que por sua vez pode mediar a atividade antitumoral in vivo destes linfócitos que, de outro modo, estaria diminuída pela diferenciação efetora. Apesar de o nocaute de TET2 em células T CD8+ murinas exibir um desvio similar do fenótipo de memória central, a sua atividade intensificada, no contexto de respostas imunoinflamatórias e antivirais, não é atribuída a uma vantagem proliferativa (Carty, S. A. et al. J Immunol, doi:10.4049/jimmunol. 1700559 (2017)). Tal sublinha o efeito diferencial da deficiência de TET2 na função de células T CD8+ humanas relativamente a camundongo.
[1076] Para abordar adicionalmente o efeito da inibição de TET2 na função de células T CAR examinou-se a produção de citocinas após estimulação aguda (Figura 18A) e crônica (Figura 18B) com antigenos in vitro. Consistente com a nossa análise de células T CD8+ CAR+ no Paciente 10, a produção de IFNy após ativação de CD3/CD28 foi decrescida em células T CD8+ bem como CD4+ com níveis reduzidos de TET2 (Figura 18A). Foi observado um decréscimo similar para a geração de TNFa (Figura 18B). Em contraste, a produção aguda de TNFa e IL-2 por células T CD4+ foi aumentada por indução específica de CAR (Figura 18A). Não obstante a exposição repetida de células CTL019 em volume a alvos tumorais expressando CD19 também ter conduzido a um decréscimo da elaboração de IFNy (Figura 18B), a
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521/606 inibição de TET2 resultou na produção sustentada de várias outras citocinas estimuladoras, inflamatórias e reguladoras após múltiplas rondas de estimulação (Figura 18B). Estas observações sugerem que TET2 pode controlar a produção de citocinas específicas de subconjuntos de células T humanas de um modo dependente de receptores de antigenos e/ou sinais coestimuladores.
[1077] Para além da regulação de loci genéticos de citocinas, a metilação de DNA é um processo epigenético dinâmico, importante que influencia a formação e manutenção do estado de células T CD8+ efetoras. Com base na nossa avaliação funcional de células T CAR+ deficientes em TET2 expandidas do Paciente 10 e descobertas de outros estudos, previmos que o silenciamento de TET2 iria decrescer a expressão de moléculas efetoras em linfócitos CTL019. A estimulação específica de CAR, mas não de CD3/CD28 aumentou a expressão de CD107a (Figura 19A). Tal pode ser atribuído, pelo menos em parte, a capacidade citolítica intensificada mediada por coestimulação de 4-1 BB relativamente a CD28 devido a sobrerregulação de NKG2D. Uma vez que a diferenciação de células T CD8+ é acompanhada de metilação decrescida e expressão genética sobrerregulada em loci de genes efetores, incluindo GZMB (codificando granzima B) e IFNG, exploramos subsequentemente se a inibição de TET2 influencia componentes críticos da maquinaria citotóxica. Em contraste com IFNy, a redução de TET2 em células T CD8+ CAR+ aumentou os níveis de expressão de granzima B e perforina (Figura 19B). Estas alterações foram associadas à atividade citotóxica reforçada de células T CAR com silenciamento de TET2 por cocultura com alvos leucêmicos expressando CD19 (Figura 19C).
[1078] As descobertas acima sugerem que a deficiência de TET2 pode produzir células T CAR altamente potentes com propriedades de células de memória de vida curta que podem se expandir rapidamente
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522/606 e induzir respostas efetoras robustas, bem como células de memória de longa duração que persistem de modo durável. Assim, marcadores adicionais da função efetora/de memória foram examinados em células T CD8+ CAR+ e CAR- usando amostras pós-infusão retrospectivas do Paciente 10 e pacientes com CLL respondedores de longo prazo. No máximo da resposta, células T CAR+ reativas para tumor do Paciente 10 possuíam níveis mais elevados de granzima B (Figura 20A) e Eomesodermina (EOMES; fator de transcrição envolvido na formação e manutenção da reunião de células T de memória CD8+; Figura 20B, painel da esquerda) em comparação com células T CARcorrespondentes, o que foi distinto de outros respondedores que exibiram remissões duráveis. Todas as células T CD8+ CAR+ clinicamente ativas em pacientes respondedores, incluindo as do Paciente 10, expressaram CD27, um receptor coestimulador envolvido na geração de memória de células T (Figura 20B, painel do meio). A frequência de células CTL019 expressando KLRG1, um marcador da senescência de linfócitos T que se sabe ser regulado por metilação de DNA, foi significativamente menor em células T CAR deficientes em TET2 do Paciente 10 em comparação com a de outros sujeitos (Figura 20B, painel da direita). De acordo com as nossas observações anteriores, uma frequência elevada de células T CAR+ positivas para Ki-67 foi observada no pico da expansão in vivo no Paciente 10 (Figura 20A, painel da direita), sugerindo adicionalmente que TET2 é requerido para a proliferação e expansão de células T CD8+ específicas para CAR. Estas observações suportam coletivamente a ideia de que a perda de TET2 promove o desenvolvimento de células T CAR de memória humanas capazes de induzir respostas efetoras antitumorais fortes.
[1079] Em resumo, a expansão clonal profunda de uma única célula T transduzida com CAR com deficiência bialélica de TET2, por exemplo, em que a integração lentiviral procedeu à disrupção de TET2,
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523/606 transformou uma resposta não curativa em uma remissão molecular profunda em um paciente com CLL com setenta e oito anos de idade. A caracterização desta população de linfócitos T revelou que mesmo alterações moderadas no ambiente epigenético podem alterar o destino da diferenciação, bem como a função efetora, e se traduzir em um efeito terapêutico considerável. Apesar de os estudos iniciais se terem baseado em uma análise extensa de um sujeito, a recapitulação do efeito da deficiência de TET2 no destino de células T CAR, diferenciação de linfócitos T e atividade antitumoral em sistemas de cultura relevantes envolvendo células T humanas primárias de 12 indivíduos saudáveis suporta a descoberta de uma via epigenética modificável que pode modelar a resposta imune. Assim, visar o epigenoma usando moléculas pequenas, estratégias de integração transgênica dirigida a sítios altamente eficientes ou outras abordagens de engenharia genética podem melhorar a eficácia e persistência de células T CAR em terapia para câncer. Adicionalmente, esta pesquisa proporciona o ímpeto para estender o mapeamento da paisagem epigenética a células T CAR e um enquadramento mecanístico para determinar como TET2 pode regular parcialmente (ou completamente) o seu potencial de diferenciação/potência efetora através de vias catalíticas e/ou não catalíticas. Por fim, os resultados indicam que a progênie de uma única célula T CAR é suficiente para mediar efeitos antitumorais potentes em leucemia avançada.
Métodos
Amostras de pacientes
[1080] Os pacientes foram inscritos em um protocolo clínico aprovado pelo Institutional Review Board (IRB): Genetically Engineered Lymphocyte Therapy in Treating Patients With B-Cell Leukemia or Lymphoma That is Resistant or Refractory to Chemotherapy (ClinicalTrials.gov número: NCT01029366) que foi planejado para avaliar
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524/606 a segurança e eficácia da transferência adotiva de células T autólogas expressando receptores de antigenos quiméricos CD19 que incorporam domínios coestimuladores de TCR Zeta e 4-1 BB (CTL019). Todos os participantes deram o seu consentimento informado escrito de acordo com a Declaração de Helsínquia e a International Conference on Harmonization Guidelines for Good Clinical Practice. O presente estudo é uma investigação secundária usando amostras de pacientes recolhidas de ensaios clínicos existentes. Em consequência, os tamanhos das amostras neste Exemplo foram determinados pelos planejamentos dos ensaios clínicos originais e disponibilidade das amostras; não foram aplicados nenhuns critérios de inclusão/exclusão adicionais.
Linhagens de Células
[1081] A linhagem de células NALM-6 foi originalmente obtida da American Type Culture Collection (ATCC). Células OSU-CLL foram obtidas da Universidade do Estado do Ohio. As células foram expandidas em meio RPMI contendo soro fetal de bovino (FBS) 10%, penicilina e estreptomicina a baixa passagem e testadas quanto a micoplasma usando o kit de detecção MycoAlert seguindo as instruções do fabricante (Lonza). A autenticação das linhagens de células foi efetuada pelo Genetics Core da Universidade do Arizona (EUA) com base em critérios estabelecidos pelo International Cell Line Authentication Committee. O estabelecimento do perfil de repetições curtas em tandem (STR) revelou que estas linhagens de células estavam bem acima do limiar de correspondência de 80%. As células NALM-6 e OSU-CLL foram manipuladas para expressarem constitutivamente luciferase do besouro elaterídeo verde (CBG)/GFP intensificada (eGFP) e submetidas à triagem em um FACSAria (BD) para se obter uma população >99% pura. Testes de micoplasma e autenticação são rotineiramente realizados antes e após engenharia molecular.
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Preparação de células T CAR e estudos correlativos
[1082] Células T do sangue periférico para a preparação de CTL019 foram obtidas por leucaférese como previamente descrito (Fraietta, J.
A. et al. Blood 127, 1117-1127 (2016); Kalos, M. et al. Science translational medicine 3, 95ra73, (2011); Porter, D. L. et al. The New England journal of medicine 365, 725-733, (2011), Porter, D. L. etal. Science translational medicine?, 303ra139, (2015)). O processamento, avaliação citométrica de fluxo, quantificação de citocinas no soro e análises de PCR quantitativa de amostras pré- e pós-infusão de CTL019 foram conduzidos como previamente relatado (Maude, S. L. et al. The New England journal of medicine 371, 1507-1517, (2014)). O sequenciamento de geração seguinte de rearranjos de cadeias pesadas de imunoglobulina (IGH) foi realizado em DNA isolado de amostras do sangue e medula. Em resumo, iniciadores específicos para os segmentos genéticos variável e de junção da terceira região determinante de complementaridade da IGH foram usados para amplificação e sequenciamento profundo com o propósito de identificar o clone leucêmico relativamente a amostras de referência (Adaptive Biotechnologies). A frequência do clone leucêmico em cada amostra foi calculada usando o número de leituras totais e produtivas únicas. Estes ensaios correlativos foram realizados em instantes definidos pelos protocolos clínicos respectivos em paralelo com avaliações da resposta à doença. Este ensaio clínico foi um estudo de tratamento único; as comparações entre pacientes no presente estudo foram definidas pelas respostas clínicas observadas. Os pesquisadores estavam cegos quanto às respostas clínicas, pois os ensaios correlativos foram conduzidos usando amostras de sujeitos com a identificação removida.
Citometria de Fluxo
[1083] Avaliações de rotina da expansão e persistência de CTL019 bem como carga de B-CLL no sangue e medula foram conduzidas de
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526/606 acordo com métodos previamente publicados usando um citômetro de fluxo Accuri C6 de seis parâmetros (BD) (Kalos, M. et al. Science translational medicine 3, 95ra73, (2011); Porter, D. L. et al. Science translational medicine 7, 303ra139, (2015)). A imunofenotipagem de células T foi realizada em produtos de infusão de CTL019 ou amostras de PBMC pós-infusão por coloração de superfície com anticorpos de citometria de fluxo imediatamente após pré-incubação com corante de exclusão de células mortas Aqua Blue (Invitrogen). O anticorpo monoclonal conjugado a Alexa Fluor 647 que foi usado para detectar a molécula CAR foi descrito (Jena, B. etal. PLoS One 8, e57838, (2013)). Os anticorpos de citometria de fluxo comercialmente disponíveis usados no estudo são os seguintes: CD3 aloficocianina (APC) H7, CCR7 PE/CF594 (BD Biosciences); CD107a APC, (BD Biosciences); CD45RO violeta brilhante (BV) 570, CD8 BV650, CD4 BV785 (Biolegend); Perforina BV421, Ki-67 Alexa Fluor (AF) 700, TNFa BV605 (Biolegend); IFNy PE, IL-2 PerCP-eFluor 710, Eomes FITC (eBioscience); Granzima B PE/Cianina5.5 (Invitrogen) e TCRV35.1 APC (eBioscience). O inibidor do transporte de proteínas GolgiStop contendo monensina e inibidor do transporte de proteínas GolgiPlug contendo brefeldina A (BD Biosciences) foram usados na coloração quanto à produção de citocinas intracelulares. Todos os reagentes de citometria de fluxo foram titulados antes do uso. As amostras foram adquiridas em um LSRFortessa (BD) e os dados foram analisados usando software FlowJo (TreeStar).
Sequenciamento profundo de TCRVfi
[1084] DNA genômico de células T pré-infusão, amostras de sangue periférico ou células T pós-infusão submetidas à triagem foram isolados usando o Kit de Sangue e Tecido DNeasy (Qiagen). O sequenciamento profundo de TCRVp foi efetuado por immunoSEQ (Adaptive Biotechnologies). Apenas rearranjos produtivos de TCR foram usados na avaliação das frequências dos clonótipos de TCR.
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Análise de Sítios de Integração
[1085] Os sítios de integração vetorial foram detectados a partir de DNA genômico como descrito previamente (Brady, T. et al., Nucleic Acids Res 39, e72 (2011); Berry, C. et al., PLoS Comput Biol 2, e157 (2006); Berry, C. C. etal., Bioinformatics 28, 755-762 (2012); Berry, C. C. et al., Bioinformatics 30, 1493-1500 (2014)). As sequências genômicas foram alinhadas com o genoma humano por BLAT (hg18, versão 36.1, >95% de identidade) e métodos estatísticos para análise de distribuições de sítios de integração foram empregues como previamente descrito (Scholler, J. etal., Science translational medicine 4, 132ra153 (2012)). O método SonicAbundance foi usado para inferir a abundância de clones de células a partir de dados de sítios de integração (Berry, C. C. et al., Bioinformatics 28, 755-762 (2012)). Todas as amostras foram analisadas independentemente em quadruplicado para suprimir efeitos fundadores na PCR e estocástica da amostragem.
Detecção de Transcritos Quiméricos de TET2
[1086] RNA de amostras foi isolado e usado como modelo com o Kit de RT-PCR Qiagen One-Step. Iniciadores foram planejados para visarem as fronteiras dos éxons 9 e 10 de TET2, flanqueando o sítio de integração vetorial e sequências internas ao vetor lentiviral antiCD19BBζ CAR. Estes incluíram várias regiões da sequência vetorial (Figura 6A). As reações foram conduzidas seguindo as especificações do fabricante. As temperaturas da aplicação de ciclos térmicos e momento para a transcrição reversa e ativação por PCR foram conduzidos seguindo as diretrizes do fabricante, com as seguintes condições de aplicação de ciclos: 30 segundos a 94°C para a fusão, 30 segundos a 57°C para o emparelhamento de iniciadores e 1,5 minutos a 72°C para a extensão de iniciadores (35 ciclos). Uma extensão final a 72°C foi mantida durante 10 minutos para cada amostra. Os produtos
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528/606 de PCR foram visualizados em géis de agarose com brometo de etídio (1,5% em peso) via eletroforese e imagiologia com UV.
Sequenciamento de geração seguinte de amostras de células T CAR pós-infusão
[1087] Células T CD8+ CAR+ e CAR- foram purificadas de amostras de PBMC pós-infusão correspondentes ao pico da expansão in vivo no Paciente 10. As células T foram submetidas à triagem usando um FACSAria (BD) e DNA genômico foi isolado destes linfócitos como descrito acima. Um painel de sequenciamento de geração seguinte direcionado customizado de 68 genes associados a malignidades hematológicas foi então utilizado (TruSeq Custom Amplicon, Illumina Inc.) e sequenciado no Illumina MiSeq (Illumina, Inc.). Foi alcançada uma profundidade média mínima de 2110 leituras para os espécimes sequenciados, com o ensaio e bioinformática realizados como previamente descrito, por exemplo, ver Daber, R., Sukhadia, S. & Morrissette, J. J. Cancer Genet 206, 441-448. Os dados apresentados são baseados na sequência de referência humana UCSC versão hg 19 (NCBI versão 37.1).
Determinação da integração do vetor albergando alelos de TET2 [1088] Foi desenvolvido um ensaio de PCR para amplificar a região de DNA (aproximadamente 4 kB) entre a integração do vetor e o lócus da mutação c.5635G>C. Foram planejados iniciadores para emparelharem com a sequência do vetor (MKL-3: 5'CTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAG-3') e múltiplas localizações a jusante da mutação, chr4:105,276,145 (50 pb: 5'
GCTGGTAAAAGACGAGGGAGATCCTG-3’, 99 pb: 5'GGCTTCCCAAAGAGCCAAGCCATG-3', 120 pb: 5'CACGGGCTTTTTCAGCCATTTTGGC-3'). Amostras de DNA genômico de células T CD8+ CAR+ e CAR- submetidas à triagem correspondentes ao pico da expansão clonal no Paciente 10 foram
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529/606 selecionadas para amplificação. Foram conduzidas reações de PCR com Taq polimerase Long Amp (New England BioLabs) e 100 - 400 ng de DNA de amostras, de acordo com recomendações do fabricante. A amplificação foi conduzida do modo seguinte: 94°C durante 30 segundos, 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos e 65°C durante 3 minutos e 20 segundos e uma extensão final de 65°C durante 10 minutos. Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em um gel de agarose e brometo de etídio 1,0% e bandas predominantes com tamanho de 4 kb foram isoladas usando o Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen). As bandas isoladas foram ligadas em vetores pCR2.1 e clonadas em células quimicamente competentes TOP-10 usando o Kit de Clonagem TOPO TA (Invitrogen). Os plasmídeos purificados foram sequenciados usando os iniciadores direto e reverso M13 usando tecnologia Sanger padrão. Os resultados do sequenciamento foram alinhados com a sequência do vetor e genoma de referência.
Caracterização da mutação de TET2 E1879Q
[1089] A variante TET2-CS humana previamente caracterizada e cristalizada (1129-1936 Δ1481-1843) foi expressa usando um vetor de expressão pLEXm. A mutação E1879Q ou mutação dos H1382Y e D1384A catalíticos (mutante HxD) foi gerada por meios comuns. Células T HEK293 foram cultivadas em DMEM com GlutaMAX (ThermoFisher Scientific) e FBS 10% (Sigma). As células foram transfectadas com hTET2-CS de tipo selvagem (TS), mutante ou um controle de vetor pLEXm vazio usando Lipofectamina 2000 (ThermoFisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. O meio foi mudado 24 horas após a transfecção e células foram recolhidas por tripsinização 48 horas após a transfecção e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato. DNA genômico foi isolado de quatro quintos das células usando o Kit de Sangue e Tecido DNeasy (Qiagen) e o restante um quinto das
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530/606 células foram submetidas a lise usando o Reagente de Extração de Proteínas CytoBuster (EMD Millipore) para análise de transferência Western.
[1090] Colorações de DNA para modificações de citosina foram realizadas de acordo com protocolos estabelecidos. DNA purificado de células T HEK293 foi diluído para 15, 7,5 e 3,5 ng/pL em tampão Tris— EDTA (TE), pH 8,0 para diluições de duas vezes de cada amostra. Um quarto do volume de NaOH 2 M-EDTA 50 mM foi adicionado a cada amostra. O DNA foi desnaturado durante 10 minutos a 95°C e transferido rapidamente para gelo, seguido da adição de 1:1 acetato de amônio 2 M gelado. Membranas de Difluoreto de Polivinilideno (PVDF) foram cortadas ao tamanho, molhadas com MeOH e equilibradas em tampão TE e depois montadas no PR 648 Slot Blot Manifold (GE Healthcare Life Sciences). Cada poço foi lavado com 400 pL de TE aspirado com vácuo suave, e 600, 300 ou 150 ng de DNA genômico foram carregados, seguido de outra lavagem com TE. As membranas foram bloqueadas durante duas horas em leite 5%-TBST, lavadas três vezes com TBST e coradas a 4°C durante a noite com anticorpos primários contra cada citosina modificada — 1:5 000 anti-5-mC de camundongo (Abeam); 1:10 000 anti-5-hmC de coelho (Active Motif); 1:5 000 anti-5-fC de coelho (Active Motif); 1:10 000 anti-5-caC de coelho (Active Motif). As colorações foram depois lavadas, incubadas com uma diluição 1:2 000 de um anti-camundongo de cavalo secundário peroxidase de rábano picante (HRP; Cell Signaling Technology) ou 1:5 000 anti-coelho de cabra-HRP (Santa Cruz Biotechnology) durante 2 horas, lavadas e visualizadas por imagiologia usando o Substrato de HRP Quimioluminescente Immobilon Western (Millipore) e o Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences).
[1091] Para a detecção de proteínas, lisados celulares clarificados foram processados em géis de poliacrilamida com dodecilsulfato de
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531/606 sódio (SDS-PAGE) 8%. Os géis foram transferidos em conjunto para uma membrana de PVDF usando o Dispositivo de Transferência de Gel iBlot 2 (ThermoFisher Scientific). As membranas foram bloqueadas durante 2 horas à temperatura ambiente com leite 5% (p/v) em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBST) 0,1% (v/v), lavadas x3 com TBST e coradas com anticorpos primários 1:10 000 anti-FLAG M2 (Sigma) ou 1:1 000 anti-Hsp90a/p (Santa Cruz Biotechnology) a 4°C durante a noite. Após a incubação, as membranas foram lavadas e coradas com uma diluição 1:5 000 de um anti-camundongo de cabra secundário-HRP (Santa Cruz Biotechnology) durante duas horas, lavadas e visualizadas por imagiologia com Substrato de HRP Quimioluminescente Immobilon Western (Millipore) em um Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences).
[1092] Para cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS), 1-2 pg de DNA genômico de cada amostra foram degradados em nucleosídeos componentes com 1 U de DNA Degradase Plus (Zymo Research Corporation) a 37°C durante a noite. A mistura de nucleosídeos foi diluída dez vezes em ácido fórmico 0,1% e injetada em um HPLC Agilent Série 1200 com uma coluna analítica LC-18-S Supelcosil 5 pm, 2,1 x 250 mm (Sigma) equilibrada para 45°C em Tampão A (formato de amônio 5 mM, pH 4,0). Os nucleosídeos foram separados em um gradiente de 0-15% de Tampão B (formato de amônio 4 mM, pH 4,0, metanol 20% (v/v)) ao longo de 8 minutos a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/minuto. MS/MS em tandem foi realizado no modo ESI de íons positivos em um espectrômetro de massa de triplo quadripole 6460 (Agilent) com uma temperatura do gás de 250°C, um fluxo de gás de 12 L/minuto, uma pressão no nebulizador de 35 psi, uma temperatura do gás de bainha de 300°C, um fluxo do gás de bainha de 11 L/minuto, uma voltagem do capilar de 3 500 V, uma voltagem no fragmentador de 70 V e um EMV delta de +1 000 V. As energias de
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532/606 colisão foram otimizadas para 10 V para 5-mC e 5-fC; 15 V para 5-caC; e 25 V para 5-hmC. As transições de massa da monitoração de múltiplas reações (MRM) foram 5-mC 242,11 126,066 m/z; 5-hmC 258,11 124,051; 5-fC 256,09 140,046; 5-caC 272,09 156,041; e T 243,10 127,050. Foram geradas curvas-padrão usando nucleosídeos-padrão (Berry & Associates, Inc.) variando desde 2,5 μΜ até 610 pM (12,5 pmol até 3 fmol no total). Oligonucleotídeos digeridos contendo quantidades equimolares de cada citosina modificada foram usados como amostras de controle de qualidade. As áreas dos picos das amostras foram ajustadas à curva padrão, ajustadas pelas amostras de controle de qualidade para determinar a quantidade de cada citosina modificada na amostra de DNA genômico. As quantidades são expressas em percentagem de modificações de citosinas totais.
Medição dos níveis totais de 5-hidroximetilcitosina
[1093] Células T CD8+ foram purificadas de amostras de PBMC pós-infusão usando o Kit de Seleção Negativa Imunomagnética de Células T CD8+ Humanas EasySep (StemCell Technologies) e expandidas ex vivo usando um protocolo de expansão rápida previamente relatado (Jin, J. et al. J Immunother 35, 283-292, (2012)). Após a cultura, células T CD8+ CAR+ TCRV35.1+ e CD8+ CARTCRVp5.1- foram submetidas à triagem em um FACSAria (BD). As células foram permeabilizadas e tratadas com 300 pg/mL de DNase I durante 60 minutos a 37°C. Após lavagem, as amostras foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-5hmc ou um controle de isótipo durante 30 minutos, seguido de coloração com um anticorpo secundário conjugado a Alexa Fluor 647. As células foram imediatamente adquiridas em um LSRFortessa (BD).
Estabelecimento do perfil global de cromatina por ATAC-seq [1094] Após a cultura, células T CD8+ CAR+ TCRV35.1+ e CD8+ CAR- TCRVp5.1- foram submetidas à triagem em um FACSAria (BD).
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ATAC-seq foi realizado como previamente descrito (Buenrostro, J. D. et al. Nat Methods 10,1213-1218, (2013); Pauken, K. E. etal. Science 354, 1160-1165, (2016)). Efetuaram-se duas repetições para cada culturas de células T CD8+ CAR+ TCRV35.1 + e CD8+ CAR- TCRVp5.1expandidas ex vivo. Em resumo, núcleos foram isolados de 200 000 células T CD8+ submetidas à triagem para cada repetição, seguido da reação de transposição na presença de Tn5 transposase (Illumina) durante 45 minutos a 37°C. A purificação de DNA transposto foi subsequentemente completada com um Kit MinElute (Qiagen) e aos fragmentos foram atribuídos códigos de barras com índices duais (Illumina Nextra). O sequenciamento de extremidades emparelhadas (leituras 2 χ 75 pb) foi realizado usando o Illumina NextSeq 500. Dados brutos do sequenciamento foram processados e alinhados com o genoma de referência GRC37h/hg19 usando Bowtie2 e regiões de enriquecimento significativo foram identificadas usando MACS v1.4.2. Foram criadas listas de picos incorporados usando BedTools, o enriquecimento de marcadores de sequenciamento (sequencing tag enrichment) foi realizado usando HOMER e análise GO/Pathway foi realizada com Metascape. Apenas picos com elevado grau de confiança foram usados para ontologia genética e análises de motivos de DNA. Para estas avaliações, picos com uma pontuação de enriquecimento menor do que 5 foram descartados por filtração como previamente estabelecido.
Análise de citocinas intracelulares
[1095] Células T CD8+ expandidas ex vivo foram estimuladas 3:1 com esférulas paramagnéticas de poliestireno revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 durante 6 horas na presença de um anticorpo monoclonal para CD107a e os inibidores de Golgi brefeldina A e monensina. As células foram lavadas, coradas com corante de viabilidade vivo/morto, seguido de coloração de superfície quanto a CD3,
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CD8 e TCRV35.1+. Estes linfócitos foram subsequentemente fixados/permeabilizados e corados intracelularmente quanto a IFN-γ. As células foram analisadas em um LSRFortessa (BD).
Ensaio da potência da diferenciação e expansão de células T CAR [1096] Células T humanas primárias em volume foram ativadas com esférulas paramagnéticas de poliestireno revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 como previamente descrito (Laport, G. G. et al. Blood 102, 2004-2013 (2003)) e transduzidas com vetores lentivirais codificando as sequências em grampo de anti-CD19BB< CAR e shRNA visando TET2 ou um controle embaralhado com coexpressão de GFP (Cellecta). A eficiência do silenciamento em células T após transdução de shRNA foi determinada por PCR quantitativa em tempo real com ensaios de expressão genética Taqman (Applied Biosistemas) quanto a TET2 (ensaio Hs00325999_m1) e GAPDH (ensaio (Hs03929097_g1) bem como GUSB (Hs99999908_m1) que serviram de controles de carga e normalização. Após 14 dias de cultura, o fenótipo de diferenciação destas células foi determinado por citometria de fluxo. Células T CAR+ GFP+ foram submetidas à triagem em um FACSAria (BD) e combinadas 1:1 com células K562 irradiadas manipuladas para expressarem CD196 ou mesotelina como controle negativo. Células CTL019 foram novamente estimuladas em série com alvos de K562 irradiados em um total de 3 vezes, com avaliações de contagens absolutas e viabilidade efetuadas em intervalos regulares ao longo de 17 dias. As medições de contagens de células e viabilidade foram obtidas usando o Contador de Células Automatizado LUNA (Logos Biosystems). Duplicações da população foram calculadas usando a equação At = Ao2n, em que néo número de duplicações da população, Ao é o número de células de entrada e At é o número total de células. Sobrenadantes foram recolhidos 24 horas após cada re-estimulação para medições longitudinais de níveis de citocinas em culturas.
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Análise de citocinas, perforina e granzima B intracelulares.
[1097] Células T CD8+ do Paciente 10 foram estimuladas 3:1 com esférulas paramagnéticas de poliestireno revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 durante 6 horas na presença de um anticorpo monoclonal para CD107a e os inibidores de Golgi brefeldina A e monensina. As células foram lavadas, coradas com corante de viabilidade vivo/morto, seguido de coloração de superfície quanto a CD3, CD8 e TCRVp5.1+. Estes linfócitos foram subsequentemente fixados/permeabilizados e corados intracelularmente quanto a ΙΡΝγ. Células T CAR geradas a partir de doadores saudáveis (silenciamento de TET2 ou controle) foram estimuladas do mesmo modo com esférulas de CD3/CD28 ou esférulas revestidas com um anticorpo anti-idiotípico contra CAR19. As células foram então coradas quanto a marcadores de superfície (CD3, CD4, CD8 e CAR19). Após fixação e permeabilização foi efetuada coloração intracelular quanto a ΙΡΝγ, TNFa e IL-2.
[1098] Para a análise de perforina e granzima B, células CTL019 que haviam sido transduzidas com um shRNA de TET2 ou de controle embaralhado foram expandidas durante 14 dias e crioconservadas. Estas células T CAR foram então descongeladas e repousaram durante 4 horas, seguido de coloração vivo/morto e de superfície quanto a CD3, CD8 bem como CAR19. A coloração intracelular quanto a perforina e granzima foi efetuada após fixação e permeabilização. As células foram analisadas em um LSRFortessa (BD).
Ensaio de citotoxicidade.
[1099] Células CTL019 de doadores saudáveis transduzidas com um shRNA dirigido contra TET2 ou um controle embaralhado foram cocultivadas com linhagens de células NALM-6 e OSU-CLL expressando CBG luciferase nas razões indicadas durante 16 horas. Foram criados extratos celulares usando o Sistema de Ensaio de Luciferase Bright-Glo (Promega Corporation) e substrato foi adicionado
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536/606 de acordo com as instruções do fabricante. As medições de luciferase foram tiradas em um leitor de microplacas de luminescência SpectraMax (Molecular Devices) e a lise específica foi calculada.
Análise de níveis de expressão do gene TET2 em subconjuntos de células T.
[1100] Os níveis de expressão do gene TET2 foram determinados analisando um conjunto de dados de expressão genética publicado quanto a subconjuntos de células T CD8+ (Virgens, TN; Células-Tronco de Memória, TSCM; Memória Central, TCM; e Memória Efetora, TEM) isoladas de 3 sujeitos humanos saudáveis diferentes. Os dados de Genechip (Affymetrix) foram processados com o pacote de software Bioconductor Oligo (tiragem 3.6, Bioconductor) usando o método RMA.
Análises estatísticas
[1101] A normalidade foi avaliada para todos os dados usando o teste Omnibus de D'Agostino-Pearson. Quando o tamanho das amostras foi demasiado pequeno para examinar adequadamente a normalidade, foi usada estatística não paramétrica. Para a análise de dados de sítios de integração, comparações de dados de características genômicas foram efetuadas como previamente descrito usando X2, testes exatos de Fisher ou uma combinação de cálculo de médias do modelo Bayesiano, logit condicional e regressão (Berry, C. et al. PLoS Comput Biol 2, e157 (2006); Brady, T. et al. Genes Dev 23, 633-642, (2009); Berry, C. et al. PLoS Comput Biol 2, e157, (2006); Ocwieja, K. E. etal. PLoS Pathog7, e1001313, (2011)). A avaliação de fenótipos de diferenciação de células T em experiências de silenciamento de TET2 mediado por shRNA foi realizada usando um teste t de Student emparelhado. Com 12 doadores normais é alcançada uma potência de 88% para detectar um tamanho de efeito mínimo de 1,0 (na unidade do desvio padrão) usando um teste t de Student emparelhado de dois lados. As estimativas da variação dentro de cada grupo de dados são
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537/606 apresentadas como barras de erro nas figuras. As análises foram realizadas com SAS (SAS Institute Inc.), Stata 13.0 (StataCorp) ou GraphPad Prism 6 (GraphPad Software). Todos os testes tiveram dois lados. Um valor P< 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. [1102] Sem descrição adicional, se crê que o perito na técnica pode, usando a descrição precedente e os seguintes exemplos ilustrativos, preparar e utilizar os compostos da presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os seguintes exemplos de trabalho salientam especificamente vários aspectos da presente invenção, e não devem ser considerados limitadores de modo nenhum do restante da revelação.
EQUIVALENTES
[1103] As descrições de cada uma e todas as patentes, pedidos de patentes e publicações citados aqui são deste modo incorporadas aqui a título de referência na sua totalidade. Embora esta invenção tenha sido revelada com referência a aspectos específicos, é evidente que outros aspectos e variações desta invenção podem ser concebidos por outros peritos na técnica sem abandonar o verdadeiro espírito e escopo da invenção. É pretendido que seja considerado que as reivindicações adjuntas incluem todos esses aspectos e variações equivalentes.
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Claims (147)

  1. (1) uma via de diferenciação de leucócitos;
    1. Célula (por exemplo, uma população de células), por exemplo, uma célula efetora imune, expressando um receptor de antigenos quiméricos (CAR), caracterizada pelo fato de que o CAR compreende um domínio de ligação a antigenos, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular, e em que a célula tem expressão e/ou função alteradas de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2).
  2. (2) uma via de regulação positiva do processo do sistema imune;
    2/29 eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou todos os) genes escolhidos de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
    2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um gene associado a Tet2.
  3. (3) uma via de sinalização de proteína tirosina quinase receptora de transmembrana
    3/29
    3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um gene associado a Tet2.
  4. 4/29
    (4) uma via de regulação da morfogênese da estrutura anatômica;
    4. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um primeiro gene associado a Tet2 e expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um segundo gene associado a Tet2.
  5. 5/29
    (5) uma via de sinalização de TNFA através de NFKB;
    5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a célula tem adicionalmente expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de Tet2.
  6. 6/29 negativa do processo de organismos multicelulares são escolhidos da Tabela 9, Linha 235.
    (6) uma via de regulação positiva da atividade de hidrolase;
    6, 7, 8, 9, 10 ou mais) vias) escolhida da Tabela 9, Coluna A.
    6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou todos os) genes escolhidos de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  7. 7/29
    (7) uma via de cicatrização de feridas;
    7. Célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou
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  8. 8/29 pelo fato de que o sistema de edição genética é selecionado do grupo consistindo em: um sistema CRISPR/Cas9, um sistema de nucleases dedo de zinco, um sistema TALEN e um sistema de meganucleases.
    (8) uma via de ativação de célula T alfa-beta;
    8. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 8.
  9. 9/29
    (9) uma via de regulação do movimento de componente celular;
    9. Célula, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9,10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 8, Coluna B.
  10. 10/29 consistindo em: TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL13Ra2, Mesotelina, IL-11 Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, CD20, Receptor de folato alfa, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor de IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, tirosinase, EphA2, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, Receptor de folato beta, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, Ácido polissiálico, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, legumaína, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, proteína do esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno relacionado com Fos 1, p53, p53 mutante, prosteína, survivina e telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanA/MART1, Ras mutante, hTERT, pontos de quebra de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, Receptor de andrógenos, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa de telomerase humana, RU1, RU2, carboxil-esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 e IGLL1.
    (10) uma via da resposta inflamatória;
    10. Célula, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 8, Coluna A.
  11. 11/29
    (11) uma via de diferenciação de célula mieloide;
    11. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna D.
  12. 12/29
    (12) uma via de produção de citocinas;
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 615/678
    12. Célula, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9,10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna D.
  13. 13/29
    (13) uma via de subregulação em resposta a UV;
    13. Célula, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna D.
  14. 14/29
    PRDM1 ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico codificando um ou mais componentes do referido sistema de edição genética; ou (3) sua combinação.
    (14) uma via de regulação negativa do processo de organismos multicelulares;
    14. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o gene associado a Tet2 compreende um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes em uma via (por exemplo, uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5,
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 614/678
  15. 15/29 uma sequência-alvo de urn gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
    (15) uma via da morfogênese de vaso sanguíneo;
    15. Célula, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função reduzidas ou eliminadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9,10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna A.
  16. 16/29 compreendendo uma etapa de alterar (por exemplo, diminuir ou aumentar) a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) na referida célula, caracterizado pelo fato de que o gene associado a Tet2 é escolhido de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
    (16) uma via de transcrição dependente de NFAT;
    16. Célula, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a célula tem expressão e/ou função aumentadas ou ativadas de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) genes escolhidos da Tabela 9, Coluna A.
  17. 17/29 (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A, ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
    (17) uma via de regulação positiva do processo apoptótico;
    17. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que a via é escolhida de uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou todas) de:
  18. 18/29 pelo fato de que o contato ocorre in vivo antes da administração na célula de ácido nucleico codificando um CAR.
    18. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de diferenciação de leucócitos são escolhidos da Tabela 9, Linha 1.
    (18) uma via de hipoxia;
  19. 19/29
    19. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de regulação positiva do processo do sistema imune são escolhidos da Tabela 9, Linha 56.
    (19) uma via de sobrerregulação por sinalização de KRAS, ou (20) uma via da cascata de sinalização de proteína quinase ativada pelo estresse.
  20. 20/29 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
    20. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de sinalização de proteína tirosina quinase receptora de transmembrana são escolhidos da Tabela 9, Linha 85.
  21. 21/29 pelo fato de que o sujeito recebe tratamento com o modulador (por exemplo, inibidor) após terapia com células expressando CAR.
    21. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de regulação da morfogênese da estrutura anatômica são escolhidos da Tabela 9, Linha 128.
  22. 22/29 de célula não pequena, câncer do intestino delgado, câncer do esôfago, melanoma, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer do ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cânceres induzidos pelo ambiente, combinações dos referidos cânceres e lesões metastáticas dos referidos cânceres.
    22. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de sinalização de TNFA através de NFKB são escolhidos da Tabela 9, Linha 134.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 616/678
  23. 23/29 em que o referido sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber terapia compreendendo uma célula expressando CAR.
    23. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de regulação positiva da atividade de hidrolase são escolhidos da Tabela 9, Linha 137.
  24. 24/29
    24. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de cicatrização de feridas são escolhidos da Tabela 9, Linha 141.
  25. 25/29 (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
    25. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de ativação de célula T alfa-beta são escolhidos da Tabela 9, Linha 149.
  26. 26/29
    26. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de regulação do movimento de componente celular são escolhidos da Tabela 9, Linha 180.
  27. 27/29 sistema de edição genética é um sistema de edição genética CRISPR/Cas.
    27. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via da resposta inflamatória são escolhidos da Tabela 9, Linha 197.
  28. 28/29 escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
    28. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de diferenciação de células mieloides são escolhidos da Tabela 9, Linha 206.
  29. 29/29 uma população de células que não compreende uma ou mais células nas quais a expressão e/ou função de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) na referida célula foram reduzidas ou eliminadas.
    29. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de produção de citocinas são escolhidos da Tabela 9, Linha 221.
  30. 30. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de subregulação em resposta a UV são escolhidos da Tabela 9, Linha 233.
  31. 31. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de regulação
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 617/678
  32. 32. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via da morfogênese de vaso sanguíneo são escolhidos da Tabela 9, Linha 237.
  33. 33. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de transcrição dependente de NFAT são escolhidos da Tabela 9, Linha 243.
  34. 34. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de regulação positiva do processo apoptótico são escolhidos da Tabela 9, Linha 250.
  35. 35. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de hipoxia são escolhidos da Tabela 9, Linha 256.
  36. 36. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via de sobrerregulação por sinalização de KRAS são escolhidos da Tabela 9, Linha 258.
  37. 37. Célula, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o um ou mais genes associados a uma via da cascata de sinalização de proteína quinase ativada pelo estresse são escolhidos da Tabela 9, Linha 260.
  38. 38. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o gene associado a Tet2 compreende um gene (por exemplo, um ou mais genes) associado a um fenótipo de memória central.
  39. 39. Célula, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o fenótipo de memória central é um fenótipo de células T de memória central.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 618/678
  40. 40. Célula, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizada pelo fato de que o fenótipo de memória central compreende um nível de expressão mais elevado de CCR7 e/ou CD45RO em comparação com o nível de expressão de CCR7 e/ou CD45RO em uma célula virgem (por exemplo, uma célula T virgem).
  41. 41. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizada pelo fato de que o fenótipo de memória central compreende um nível de expressão mais baixo de CD45RA em comparação com o nível de expressão de CD45RA em uma célula virgem (por exemplo, uma célula T virgem).
  42. 42. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 41, caracterizada pelo fato de que o fenótipo de memória central compreende proliferação da célula dependente de antígeno intensificada.
  43. 43. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 42, caracterizada pelo fato de que o fenótipo de memória central compreende um nível de expressão reduzido de IFN-γ e/ou CD107a, por exemplo, quando a célula é ativada com um anticorpo anti-CD3 ou anti-CD28.
  44. 44. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) do gene associado a Tet2.
  45. 45. Célula, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor ou ativador) é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene associado a Tet2 ou um seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico codificando um ou mais componentes do referido sistema de edição genética; ou (3) uma sua combinação.
  46. 46. Célula, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 619/678
  47. 47. Célula, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron inicial do gene associado a Tet2.
  48. 48. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo do gene associado a Tet2, e a sequênciaalvo está a montante do éxon 4, por exemplo, no éxon 1, éxon 2 ou éxon 3.
  49. 49. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 48, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron tardio do gene associado a Tet2.
  50. 50. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo do gene associado a Tet2, e a sequênciaalvo está a jusante de um pré-antepenúltimo éxon, por exemplo, está em um antepenúltimo éxon, um penúltimo éxon ou um último éxon.
  51. 51. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 50, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética é um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que híbrida para uma sequência-alvo do gene associado a Tet2.
  52. 52. Célula, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor) é um siRNA ou shRNA específico para o gene associado a Tet2, ou ácido nucleico codificando o referido siRNA ou shRNA.
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  53. 53. Célula, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende uma sequência complementar a uma sequência de um mRNA do gene associado a Tet2.
  54. 54. Célula, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor ou ativador) é uma molécula pequena.
  55. 55. Célula, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor ou ativador) é uma proteína.
  56. 56. Célula, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor) é um parceiro de ligação negativo dominante de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2, ou um ácido nucleico codificando o referido parceiro de ligação negativo dominante.
  57. 57. Célula, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor) é uma variante negativa dominante (por exemplo, cataliticamente inativa) de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2, ou um ácido nucleico codificando a referida variante negativa dominante.
  58. 58. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um inibidor de um primeiro gene associado a Tet2 e um ativador de um segundo gene associado a Tet2.
  59. 59. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um inibidor de Tet2.
  60. 60. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a antígeno se liga a um antígeno tumoral que é selecionado de um grupo
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  61. 61. Célula, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral é CD19.
  62. 62. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a antígeno é um anticorpo ou fragmento de anticorpo como descrito, por exemplo, em WO2012/079000 ou WO2014/153270.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 622/678
  63. 63. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, caracterizada pelo fato de que o domínio de transmembrana compreende:
    uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 12, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 12, ou a sequência de SEQ ID NQ: 12.
  64. 64. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a antígeno é conectado ao domínio de transmembrana por uma região de dobradiça, em que a referida região de dobradiça compreende a SEQ ID NQ: 2 ou SEQ ID NQ: 6, ou uma sequência com 95-99% de identidade das mesmas.
  65. 65. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização primário e/ou um domínio de sinalização coestimulador, em que o domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína escolhida de CD3 zeta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, FcR gama comum (FCER1G), FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD79a, CD79b, Fcgama Rlla, DAP10 ou DAP12.
  66. 66. Célula, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização primário compreende: uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 18 ou SEQ ID NQ: 20, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 18 ou SEQ ID NQ: 20; ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 18 ou SEQ ID NQ: 20.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 623/678
  67. 67. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulador, ou um domínio de sinalização primário e um domínio de sinalização coestimulador, em que o domínio de sinalização coestimulador compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo consistindo em CD27, CD28, 4-1 BB (CD137), 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à função de linfócito-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11I, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, e NKG2D.
  68. 68. Célula, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização coestimulador compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16.
  69. 69. Célula, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização coestimulador compreende uma sequência de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 624/678
  70. 70. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizada pelo fato de que o domínio intracelular compreende a sequência de SEQ ID NQ: 14 ou SEQ ID NQ: 16, e a sequência de SEQ ID NQ: 18 ou SEQ ID NQ: 20, em que as sequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas no mesmo quadro e como uma única cadeia polipeptídica.
  71. 71. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 70, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência líder que compreende a sequência de SEQ ID NQ: 2.
  72. 72. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula efetora imune (por exemplo, uma população de células efetoras imunes).
  73. 73. Célula, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a célula efetora imune é uma célula T ou uma célula NK.
  74. 74. Célula, de acordo com a reivindicação 72 ou 73, caracterizada pelo fato de que a célula efetora imune é uma célula T.
  75. 75. Célula, de acordo com a reivindicação 73 ou 74, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ ou uma sua combinação.
  76. 76. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula humana.
  77. 77. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 76, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  78. 78. Célula, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1 é (1) um sistema de edição genética dirigido para um ou mais sítios dentro de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 625/678
  79. 79. Célula, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética é selecionado do grupo consistindo em: um sistema CRISPR/Cas9, um sistema de nucleases dedo de zinco, um sistema TALEN e um sistema de meganucleases.
  80. 80. Célula, de acordo com a reivindicação 78 ou 79, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron inicial de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  81. 81. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 80, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1, e a sequência-alvo está a montante do éxon 4, por exemplo, no éxonl, éxon2 ou éxon3, por exemplo, no éxon 3.
  82. 82. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 81, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo em um éxon ou íntron tardio de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  83. 83. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética se liga a uma sequência-alvo de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1, e a sequência-alvo está a jusante de um préantepenúltimo éxon, por exemplo, está em um antepenúltimo éxon, um penúltimo éxon ou um último éxon.
  84. 84. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 83, caracterizada pelo fato de que o sistema de edição genética é um sistema CRISPR/Cas compreendendo uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento que híbrida para
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 626/678
  85. 85. Célula, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de que o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1 é urn siRNA ou shRNA específico para IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1, ou ácido nucleico codificando o referido siRNA ou shRNA.
  86. 86. Célula, de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que o siRNA ou shRNA compreende uma sequência complementar a uma sequência de urn mRNA de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  87. 87. Célula, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1 é uma molécula pequena.
  88. 88. Célula, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1 é uma proteína, por exemplo, é um parceiro de ligação negativo dominante de uma proteína codificada por um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1, ou um ácido nucleico codificando o referido parceiro de ligação negativo dominante.
  89. 89. Célula, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1 é uma proteína, por exemplo, é uma variante negativa dominante (por exemplo, cataliticamente inativa) de uma proteína codificada por um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1, ou um ácido nucleico codificando a referida variante negativa dominante.
  90. 90. Método para aumentar a eficácia terapêutica de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 89, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, CTL019 ou CTL119),
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 627/678
  91. 91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que compreende alterar (por exemplo, diminuir) a expressão e/ou função de um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  92. 92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 e 91, caracterizado pelo fato de que compreende ainda alterar (por exemplo, diminuir) a expressão e/ou função de Tet2.
  93. 93. Método para aumentar a eficácia terapêutica de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 92, por exemplo, uma célula expressando CAR19 (por exemplo, CTL019 ou CTL119), caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de contatar a referida célula com um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 628/678
  94. 94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a referida etapa compreende contatar as referidas células com um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  95. 95. Método, de acordo com a reivindicação 93 ou 94, caracterizado pelo fato de que o inibidor é selecionado do grupo consistindo em: (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene associado a Tet2, ou seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA ou shRNA) que inibe a expressão do gene associado a Tet2; (3) uma proteína (por exemplo, uma negativa dominante, por exemplo, cataliticamente inativa) codificada pelo gene associado a Tet2, ou um parceiro de ligação de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2; (4) uma molécula pequena que inibe a expressão e/ou função do gene associado a Tet2; (5) um ácido nucleico codificando quaisquer de (1 )-(3); e (6) qualquer combinação de (1)-(5).
  96. 96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 93 a 95, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar a referida célula com um inibidor de Tet2.
  97. 97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 93 a 96, caracterizado pelo fato de que o referido contato ocorre ex vivo.
  98. 98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 93 a 97, caracterizado pelo fato de que o contato ocorre in vivo.
  99. 99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 629/678
  100. 100. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o contato ocorre in vivo depois de as células terem sido administradas a um sujeito necessitado.
  101. 101. Método para tratamento de câncer em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade eficaz da célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 91.
  102. 102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao referido sujeito um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhidos de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
  103. 103. Método, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao referido sujeito um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  104. 104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 101 a 103, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 630/678
  105. 105. Célula para uso em um método de tratamento de um sujeito necessitado do mesmo, caracterizada pelo fato de que compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade eficaz da célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 91.
  106. 106. Célula para uso, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao referido sujeito um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhidos (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
  107. 107. Célula para uso, de acordo com a reivindicação 105 ou 106, caracterizada pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao referido sujeito um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  108. 108. Célula para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 105 a 107, caracterizada pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
  109. 109. Terapia com células expressando CAR caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de um sujeito necessitado do mesmo, o método compreendendo administrar ao referido sujeito a terapia com células expressando CAR e um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 631/678
  110. 110. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com a reivindicação 109, caracterizada pelo fato de que o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  111. 111. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizada pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
  112. 112. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 111, caracterizada pelo fato de que o sujeito recebe um pré-tratamento do modulador (por exemplo, inibidor) antes do início da terapia com células expressando CAR.
  113. 113. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 112, caracterizada pelo fato de que o sujeito recebe tratamento concorrente com o modulador (por exemplo, inibidor) e a terapia com células expressando CAR.
  114. 114. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 113, caracterizada
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 632/678
  115. 115. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 114, caracterizada pelo fato de que o sujeito tem uma doença associada à expressão de um antígeno tumoral, por exemplo, uma doença proliferativa, uma condição pré-cancerosa, um câncer e uma indicação não relacionada com câncer associada à expressão do antígeno tumoral.
  116. 116. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com a reivindicação 115, caracterizada pelo fato de que o câncer é um câncer hematológico ou um tumor sólido.
  117. 117. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com a reivindicação 115 ou 116, caracterizada pelo fato de que o câncer é um câncer hematológico escolhido de um ou mais de leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemias agudas, leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia linfoide aguda de célula B (B-ALL), leucemia linfoide aguda de célula T (T-ALL), leucemia mielógena crônica (CML), leucemia pró-linfocítica de célula B, neoplasma de célula dendrítica plasmocitoide blástica, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de célula grande B, linfoma folicular, leucemia de célula pilosa, linfoma folicular de célula pequena ou célula grande, condições linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de célula do manto, linfoma da zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma de não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de céluls dendrítica plasmocitoide, macroglobulinemia de Waldenstrom ou pré-leucemia.
  118. 118. Terapia com células expressando CAR para uso, de acordo com a reivindicação 115 ou 116, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer do cólon, câncer retal, carcinoma de célula renal, câncer do fígado, carcinoma do pulmão
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 633/678
  119. 119. Método de tratamento de um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao referido sujeito um modulador (por exemplo, um inibidor ou ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhidos (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, IGOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central,
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 634/678
  120. 120. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  121. 121. Método, de acordo com a reivindicação 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao referido sujeito um inibidor de Tet2.
  122. 122. Modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) para uso no tratamento de um sujeito, caracterizado pelo fato de que o gene associado a Tet2 é escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central, e em que o referido sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber terapia compreendendo uma célula expressando CAR.
  123. 123. Modulador para uso, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  124. 124. Modulador para uso, de acordo com a reivindicação 122 ou 123, caracterizado pelo fato de que o sujeito recebeu, está recebendo ou está prestes a receber um inibidor de Tet2.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 635/678
  125. 125. Método de fabricação de uma célula expressando CAR, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir um ácido nucleico codificando um CAR em uma célula de modo que o referido ácido nucleico (ou sua porção codificando CAR) é integrado no genoma da célula dentro de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) (por exemplo, dentro de um íntron ou éxon do gene associado a Tet2), de modo que a expressão e/ou função dos genes associados a Tet2 são alteradas (por exemplo, reduzidas ou eliminadas), em que o gene associado a Tet2 é escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
  126. 126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que o gene associado a Tet2 é escolhido de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  127. 127. Método de fabricação de uma célula expressando CAR, caracterizada pelo fato de que compreende contatar a referida célula expressando CAR ex vivo com um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 636/678
  128. 128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que o gene associado a Tet2 é escolhido de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  129. 129. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência codificando um CAR e uma sequência codificando um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
  130. 130. Vetor, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor) é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene, ou seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA ou shRNA) que inibe a expressão do gene associado a Tet2; (3) uma proteína (por exemplo, uma negativa dominante, por exemplo, cataliticamente inativa) codificada pelo gene associado a Tet2, ou um parceiro de ligação de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2; e (4) um ácido nucleico codificando quaisquer de (1)-(3), ou suas combinações.
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 637/678
  131. 131. Vetor, de acordo com a reivindicação 129 ou 130, caracterizado pelo fato de que o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  132. 132. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 131, caracterizado pelo fato de que a sequência codificando um CAR e a sequência codificando o inibidor estão separadas por um sítio 2A.
  133. 133. Sistema de edição genética que é específico para uma sequência de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2) ou seu elemento regulador, caracterizado pelo fato de que o gene associado a Tet2 é escolhido (por exemplo, 2, 3, 4 ou todos) de:
    (i) um ou mais de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1;
    (ii) um ou mais genes listados na Tabela 8;
    (iii) um ou mais genes listados na Tabela 9, Coluna D;
    (iv) um ou mais genes associados a uma ou mais vias listadas na Tabela 9, Coluna A; ou (v) um ou mais genes associados a um fenótipo de memória central.
  134. 134. Sistema de edição genética, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição genética é específico para uma sequência de um gene IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  135. 135. Sistema de edição genética, de acordo com a reivindicação 133 ou 134, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição genética é um sistema de edição genética CRISPR/Cas, um sistema de nucleases dedo de zinco, um sistema TALEN ou um sistema de meganucleases.
  136. 136. Sistema de edição genética, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 135, caracterizado pelo fato de que o
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 638/678
  137. 137. Sistema de edição genética, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que compreende:
    uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou seu elemento regulador, e uma proteína Cas9;
    uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou seu elemento regulador, e um ácido nucleico codificando uma proteína Cas9;
    um ácido nucleico codificando uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou seu elemento regulador, e uma proteína Cas9, ou um ácido nucleico codificando uma molécula de gRNA compreendendo uma sequência de direcionamento específica para uma sequência do gene associado a Tet2 ou seu elemento regulador, e um ácido nucleico codificando uma proteína Cas9.
  138. 138. Sistema de edição genética, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 137, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um DNA-modelo.
  139. 139. Sistema de edição genética, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que o DNA-modelo compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR, por exemplo, um CAR como descrito aqui.
  140. 140. Composição para fabricação ex vivo de uma célula expressando CAR, caracterizada pelo fato de que compreende um modulador (por exemplo, um inibidor ou um ativador) de um gene associado a Tet2 (por exemplo, um ou mais genes associados a Tet2)
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 639/678
  141. 141. Composição, de acordo com a reivindicação 140, caracterizada pelo fato de que o modulador é um inibidor de IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA ou PRDM1.
  142. 142. Composição, de acordo com a reivindicação 140 ou 141, caracterizada pelo fato de que o modulador (por exemplo, inibidor) é (1) um sistema de edição genética direcionado para um ou mais sítios dentro do gene associado a Tet2 ou seu elemento regulador; (2) um ácido nucleico (por exemplo, um siRNA ou shRNA) que inibe a expressão do gene associado a Tet2; (3) uma proteína (por exemplo, uma negativa dominante, por exemplo, cataliticamente inativa) codificada pelo gene ou um parceiro de ligação de uma proteína codificada pelo gene associado a Tet2; ou (4) um ácido nucleico codificando quaisquer de (1 )-(3), ou suas combinações.
  143. 143. Composição, de acordo com a reivindicação 142, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um inibidor de Tet2.
  144. 144. População de células compreendendo uma ou mais células, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 89, caracterizada pelo fato de que a população de células compreende uma percentagem mais elevada (por exemplo, pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes mais elevada) de células Tscm (por exemplo, células T CD45RA+CD62L+CCR7+ (opcionalmente CD27+CD95+)) do que
    Petição 870190117962, de 14/11/2019, pág. 640/678
  145. 145. População de células compreendendo uma ou mais células, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 89, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99%) da população de células têm um fenótipo de células T de memória central.
  146. 146. População de células, de acordo com a reivindicação 145, caracterizada pelo fato de que o fenótipo de células de memória central é um fenótipo de célula T de memória central.
  147. 147. População de células, de acordo com a reivindicação 145 ou 146, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99%) da população de células expressam CD45RO e/ou CCR7.
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