KR20190127892A - 바이오마커 및 효능이 증진된 car t 세포 요법 - Google Patents

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KR20190127892A
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조셉 에이. 프라이에타
잔 제이. 멜렌호스트
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노파르티스 아게
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 조성물 및 방법(개선된 CAR T 세포 요법)을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 유전자(예를 들어, Tet2 관련 유전자)의 발현 및/또는 기능이 변경된 세포, 및 이에 따른 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로, 상기 하나 이상의 유전자의 억제자, 및 이에 따른 사용 방법을 CAR T 세포와 관련하여 제공한다.

Description

바이오마커 및 효능이 증진된 CAR T 세포 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 3월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/474,991호, 및 2018년 1월 24일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/621,356호에 대한 우선권을 주장한다. 전술한 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되고, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2018년 3월 20일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 N2067-7125WO_SL.txt이며, 크기가 509,059 바이트이다.
기술분야
일반적으로 본 발명은 종양 항원의 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한, 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 용도에 관한 것이다.
자가 T-세포, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질도입된 T-세포를 이용한 입양 세포 이식(ACT) 요법은 혈액암 시험에서 가능성을 보여주었다. T 세포 요법, 특히, 증진된 효능을 갖는 CAR T 세포 요법에 대한 의료 요구가 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 메틸시토신 디옥시게나아제 유전자와 관련된 하나 이상의 유전자, 예를 들어, Tet2를 파괴하는 조성물 및 방법, 및 조작된 세포(예를 들어, 유전자-변형 항원-특이성 T 세포, 예컨대 CAR T 세포)의 기능적 활성을 증가시키는 데 있어서의 이러한 조성물 및 방법의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 치료 효능을 강화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이론에 구애됨이 없이, 특정 실시 형태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 유전자의 변경은 예를 들어 중심 기억 표현형으로 이어질 수 있으며 이에 의해 CAR T 세포 증식 및/또는 기능을 증가시킨다고 믿어진다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, 세포 집단), 예를 들어, 면역 이펙터 세포를 제공하며, 여기서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 세포는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 변경된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 세포는 Tet2-관련 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 Tet2-관련 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 제1 Tet2-관련 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 가지며, 제2 Tet2-관련 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 추가로, Tet2의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개의, 또는 전부의) 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개의, 또는 전부의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 PRDM1을 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 NOTCH2를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IL2RA 및 PRDM1을 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, 및 ICOS를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 8로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 표 8, 컬럼 B로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 표 8, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 경로(예를 들어, 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 경로) 내의 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 경로는 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 전부)으로부터 선택된다: (1) 백혈구 분화 경로; (2) 면역계 과정의 양성 조절의 경로; (3) 막관통 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호전달 경로; (4) 해부 구조 형태 형성 조절 경로; (5) NFKB를 통한 TNFA 신호전달 경로; (6) 히드롤라아제 활성의 양성 조절의 경로; (7) 창상 치유 경로; (8) 알파-베타 T 세포 활성화 경로; (9) 세포 구성요소 이동 조절 경로; (10) 염증 반응 경로; (11) 골수성 세포 분화 경로; (12) 사이토카인 생성 경로; (13) UV 반응 하향조절 경로; (14) 다세포 유기체 과정의 음성 조절의 경로; (15) 혈관 형태 형성 경로; (16) NFAT-의존성 전사 경로; (17) 아폽토시스 과정의 양성 조절의 경로; (18) 저산소증 경로; (19) KRAS 신호전달에 의한 상향조절의 경로; 또는 (20) 스트레스-활성화 단백질 키나아제 신호전달 캐스케이드 경로.
일부 실시 형태에서, 백혈구 분화 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제1열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 면역계 과정의 양성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제56열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 막관통 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호전달 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제85열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 해부 구조 형태 형성 조절 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제128열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, NFKB를 통한 TNFA 신호전달 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제134열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 히드롤라아제 활성의 양성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제137열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 창상 치유 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제141열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 알파-베타 T 세포 활성화 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제149열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 세포 구성요소 이동 조절 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제180열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 염증 반응 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제197열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 골수성 세포 분화 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제206열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인 생성 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제221열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, UV 반응 하향조절 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제233열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 다세포 유기체 과정의 음성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제235열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 혈관 형태 형성 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제237열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-의존성 전사 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제243열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 아폽토시스 과정의 양성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제250열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 저산소증 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제256열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, KRAS 신호전달에 의한 상향조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제258열로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 스트레스-활성화 단백질 키나아제 신호전달 캐스케이드 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제260열로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 중심 기억 표현형과 관련된 유전자(예를 들어, 하나 이상의 유전자)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중심 기억 표현형은 중심 기억 T 세포 표현형이다. 일부 실시 형태에서, 중심 기억 표현형은 나이브(
Figure pct00001
) 세포(예를 들어, 나이브 T 세포)에서의 CCR7 및/또는 CD45RO의 발현 수준과 비교하여 CCR7 및/또는 CD45RO의 더 높은 발현 수준을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중심 기억 표현형은 나이브 세포(예를 들어, 나이브 T 세포)에서의 CD45RA의 발현 수준과 비교하여 CD45RA의 더 낮은 발현 수준을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중심 기억 표현형은 세포의 항원-의존성 증식의 증진을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 중심 기억 표현형은, 예를 들어, 세포가 항-CD3 또는 항-CD28 항체로 활성화될 때, IFN-γ 및/또는 CD107a의 감소된 발현 수준을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포는 Tet2-관련 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)는 (1) Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) 상기 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 핵산; 또는 (3) 이들의 조합이다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템, 및 메가뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 초기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 엑손 4의 상류에, 예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 후기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 끝에서 네 번째의 엑손의 하류에 있으며, 예를 들어, 끝에서 세 번째의 엑손, 끝에서 두 번째의 엑손, 또는 마지막 엑손 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템이다.
일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 Tet2-관련 유전자에 특이적인 siRNA 또는 shRNA, 또는 상기 siRNA 또는 shRNA를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 Tet2-관련 유전자의 mRNA의 서열에 대하여 상보성인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)는 소분자이다.
일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)는 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브 결합 파트너, 또는 상기 우성적 네거티브 결합 파트너를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브(예를 들어, 촉매적 불활성) 변이체, 또는 상기 우성적 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산이다.
일부 실시 형태에서, 세포는 제1 Tet2-관련 유전자의 억제자 및 제2 Tet2-관련 유전자의 활성자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 추가로 Tet2의 억제자를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, 세포 집단), 예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, CAR-발현 세포를 제공하며, 여기서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, CAR-발현 세포는 Tet2의 파괴, 예를 들어, Tet2의 변경된 발현 및/또는 기능을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은, Tet2가 파괴된 CAR-발현 세포는 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 그 이상의(예를 들어, 전부의) 다음 특성을 갖는다:
비-파괴 Tet2, 예를 들어, 야생형 Tet2를 가지는 점 외에는 동일하거나 유사한 CAR-발현 세포와 비교하여,
(i) 증가된 확장 잠재력, 예를 들어, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 또는 6배의 확장력(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(ii) 단수명 기억 T 세포의 하나 이상의 특성, 예를 들어, EOMES의 발현 증가, KLRG1의 발현 감소, 세포독성 활성의 증가, 또는 기억 T 세포 잠재력의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(iii) 이펙터 기능의 증가, 예를 들어, CD107a, 그랜자임 B 및 퍼포린의 탈과립화의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(iv) 세포용해 활성의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음); 또는
(v) 예를 들어 증가된 Ki67로 측정되는 바와 같은, 증식 능력의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음).
일부 실시 형태에서, Tet2가 파괴된 CAR-발현 세포는 Tet2의 단일 대립유전자 파괴를 가지며, 예를 들어, 세포는 파괴된 하나의 Tet2 대립유전자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음) 및 하나의 야생형 Tet2 대립유전자를 갖는다.
일부 실시 형태에서, Tet2가 파괴된 CAR-발현 세포는 Tet2의 이중 대립유전자 파괴를 가지며, 예를 들어, 세포는 파괴된 2개의 Tet2 대립유전자를 갖는다(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음).
일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포 또는 CAR-발현 세포에서의 Tet2의 파괴는 Tet2의 기능을 변경시키는, 예를 들어 감소시키는 돌연변이, 예를 들어, 기능저하 돌연변이(hypomorphic mutation), 예를 들어, E1879Q 돌연변이에 의해 생성되며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 일부 실시 형태에서, Tet2에서의 기능저하 돌연변이, 예를 들어, E1879Q는, 실시예 1의 분석법에서 기술된 바와 같이, 야생형 Tet2 대립유전자에 의해 생성되는 Tet2 단백질과 비교하여 감소된 기능을 갖는 Tet2 단백질을 생성한다.
일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포 또는 CAR-발현 세포에서의 Tet2의 파괴는 Tet2 유전자 내에서의, 예를 들어, Tet2 유전자의 프로모터, 인트론 또는 엑손 내에서의 렌티바이러스 통합, 예를 들어 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스의 통합에 의해 생성되며, 이는 예를 들어 실시예 1에 기술된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 Tet2 파괴는 면역 이펙터 세포 집단 또는 CAR-발현 세포 집단을 Tet2 억제자, 예를 들어, Tet 2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스); 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 또는 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN과 접촉시킴으로써 면역 이펙터 세포 집단 또는 CAR-발현 세포 집단에서 생성된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성되는 Tet2 파괴는 단일 대립유전자성 또는 이중 대립유전자성일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 세포에서 생성되는 Tet2 파괴는 단일 대립유전자성이며, 예를 들어, 세포는 하나의 파괴된 Tet2 대립유전자 및 하나의 야생형 Tet2 대립유전자를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 세포에서 생성되는 Tet2 파괴는 이중 대립유전자성이며, 예를 들어, 세포는 2개의 파괴된 Tet2 대립유전자, 예를 들어, 2개의 상이한 파괴를 가지며, 이는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, Tet2 파괴는, 예를 들어 CAR 분자의 발현 전, 면역 이펙터 세포 집단에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포 집단은 Tet2 파괴 대립유전자, 예를 들어, 단일 대립유전자 Tet2 파괴(본원에 기술된 바와 같음), 예를 들어, 단일 대립유전자 기능저하 Tet2 대립유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2 파괴 대립유전자, 예를 들어, 기능저하 Tet2 대립유전자를 포함하는 면역 이펙터 세포 집단을, Tet2 억제자, 예를 들어, Tet2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스); 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 또는 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트; Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN과 접촉시킴으로써 Tet2의 야생형 대립유전자를 파괴하여 예를 들어 Tet2의 이중 대립유전자 파괴를 생성한다.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원에 결합한다: TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린(Mesothelin), IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y(LewisY), CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타아제(Prostase), PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H(GloboH), NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인(legumain), HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인(prostein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라아제, PCTA-1/갈렉틴(Galectin) 8, 멜란A(MelanA)/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린(Cyclin) B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카르복실 에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 종양 항원은 CD19이다.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 국제 공개 제2012/079000호 또는 국제 공개 제2014/153270호에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은 서열 번호 12의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개 이상이자 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열에 대하여 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는 서열 번호 12의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결되며, 여기서, 상기 힌지 영역은 서열 번호 2 또는 서열 번호 6, 또는 이와의 동일성이 95 내지 99%인 서열을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, 공통 FcR 감마(FCER1G), FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, 또는 DAP12로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 일차 신호전달 도메인은 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개 이상이자 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열 또는 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열에 대하여 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인, 또는 일차 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서, 공동자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일(Tactile)), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 조성물의 일부 실시 형태에서, 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개 이상이자 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열에 대하여 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 도메인은 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 서열, 및 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 구성하는 서열은 동일한 프레임 내에서 그리고 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 서열 번호 2의 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포는 면역 이펙터 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포 집단)이다. 일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인간 세포이다.
일부 실시 형태에서, 세포는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 (1) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) 상기 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 핵산; 또는 (3) 이들의 조합이다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템, 및 메가뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 초기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 엑손 4의 상류에, 예를 들어, 엑손1, 엑손2, 또는 엑손3 내에, 예를 들어 엑손 3 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 후기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 끝에서 네 번째의 엑손의 하류에 있으며, 예를 들어, 끝에서 세 번째의 엑손, 끝에서 두 번째의 엑손, 또는 마지막 엑손 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템이다.
일부 실시 형태에서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1에 특이적인 siRNA 또는 shRNA, 또는 상기 siRNA 또는 shRNA를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 mRNA의 서열에 대하여 상보성인 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 소분자이다.
일부 실시 형태에서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 단백질이며, 예를 들어, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브 결합 파트너, 또는 상기 우성적 네거티브 결합 파트너를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 단백질이며, 예를 들어, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브(예를 들어, 촉매적 불활성) 변이체, 또는 상기 우성적 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019 또는 CTL119)의 치료 효능을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 세포에서 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키거나 증가시키는) 단계를 포함하고, 여기서, Tet2-관련 유전자는 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부)으로부터 선택된다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키는) 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 Tet2의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키는) 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019 또는 CTL119)의 치료 효능을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 세포를 다음 중에서(예를 들어 2가지, 3가지, 4가지 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)와 접촉시키는 단계를 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 상기 단계는 상기 세포를 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 억제자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: (1) Tet2-관련 유전자, 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) Tet2-관련 유전자의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어, 우성적 네거티브, 예를 들어, 촉매적 불활성), 또는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 결합 파트너; (4) Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1)~(3) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산; 및 (6) (1)~(5)의 임의의 조합. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 세포를 Tet2의 억제자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 생체 외에서(ex vivo) 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 생체 내에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 CAR 코딩 핵산의 세포 내로의 전달 전에 생체 내에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 후 생체 내에서 일어난다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 대상체에게 본원에 개시된 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부)으로부터 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019 또는 CTL119)의 치료 효능을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 세포를 Tet2 억제자와 접촉시킴으로써 Tet2의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키는) 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2 억제자는 다음으로부터 선택된다: Tet2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스); 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 또는 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN.
일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 생체 외에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 생체 내에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 CAR 코딩 핵산의 세포 내로의 전달 전에 생체 내에서 일어난다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 후 생체 내에서 일어난다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 대상체에게 본원에 개시된 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 세포를 제공하며, 이는 상기 대상체에게 본원에 개시된 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자, 예를 들어, Tet2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스); 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 또는 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 CAR-발현 세포 요법제를 제공하며, 이는 상기 대상체에게 CAR-발현 세포 요법제 및 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 것을 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자이다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 CAR-발현 세포 요법제를 제공하며, 이는 상기 대상체에게 CAR-발현 세포 요법제 및 Tet2의 억제자를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2 억제자는 다음으로부터 선택된다: Tet2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스), 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 및 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN.
일부 실시 형태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법의 시작 전에 조정자(예를 들어, 억제자)의 전치료제를 받는다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 조정자(예를 들어, 억제자) 및 CAR-발현 세포 요법제를 이용한 병행 치료를 받는다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법제 후 조정자(예를 들어, 억제자)를 이용한 치료를 받는다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 종양 항원의 발현과 관련된 질환, 예를 들어, 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 및 종양 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 징후를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 암은 혈액암 또는 고형 종양이다. 일부 실시 형태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B-세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 또는 전백혈병 중 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암이다.
일부 실시 형태에서, 암은 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 비소세포 폐암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유발된 암, 상기 암들의 조합, 및 상기 암들의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 대상체에게 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자(여기서, 상기 대상체는 CAR-발현 세포를 포함하는 요법제를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 함).
일부 실시 형태에서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자이다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2 억제자는 다음으로부터 선택된다: Tet2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스); 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 또는 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 치료에서 사용하기 위한 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 제공하며, 여기서, Tet2-관련 유전자는 (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되고, 상기 대상체는 CAR-발현 세포를 포함하는 요법제를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 한다.
일부 실시 형태에서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 Tet2의 억제자를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체, 예를 들어 본원에 개시된 병태 또는 질환을 갖는 대상체의 치료에서 사용하기 위한 Tet2 억제자를 제공하며, 여기서, 상기 대상체는 CAR-발현 세포를 포함하는 요법제를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 한다.
일 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)-발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 방법이 본원에 개시되며, 본 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포의 집단을 제공하는 단계;
b) 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR 폴리펩티드 코딩 핵산과 접촉시키는 단계;
c) 면역 이펙터 세포의 집단을 Tet2 억제자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음)와 접촉시키는 단계;
및
d) 상기 세포를 CAR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 유지하고,
이에 의해 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 집단을 제조하는 단계.
일부 실시 형태에서, Tet2 억제자는 다음으로부터 선택된다: Tet2 억제자, 예를 들어, Tet2의 소분자 억제자(예를 들어, 2-히드록시글루타레이트); 렌티바이러스(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자를 코딩하는 렌티바이러스); 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 또는 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산; Tet2를 표적화하는 RNAi 에이전트(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); Tet2를 표적화하는 CRISPR-Cas9; 또는 Tet2를 표적화하는 ZFN/TALEN.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 Tet2 억제자를 이용하여 제조된 CAR-발현 세포는 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 그 이상의(예를 들어, 전부의) 다음 특성을 갖는다:
비-파괴 Tet2, 예를 들어, 야생형 Tet2를 가지는 점 외에는 유사한 CAR-발현 세포와 비교하여,
(i) 증가된 확장 잠재력, 예를 들어, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 또는 6배의 확장력(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(ii) 단수명 기억 T 세포의 하나 이상의 특성, 예를 들어, Eomes의 발현 증가, KLRG1의 발현 감소, 세포독성 활성의 증가, 또는 기억 T 세포 잠재력의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(iii) 이펙터 기능의 증가, 예를 들어, CD107a, 그랜자임 B 및 퍼포린의 탈과립화의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(iv) 세포용해 활성의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음); 또는
(v) 예를 들어 증가된 Ki67로 측정되는 바와 같은, 증식 능력의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음).
본원에 개시된 제조 방법의 일부 실시 형태에서, Tet2 파괴는, 예를 들어 CAR 폴리펩티드 코딩 핵산과의 접촉 전, 면역 이펙터 세포 집단에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포 집단은 Tet2 파괴 대립유전자, 예를 들어, 단일 대립유전자 Tet2 파괴(본원에 기술된 바와 같음), 예를 들어, 단일 대립유전자 기능저하 Tet2 대립유전자를 포함한다. 본원에 개시된 제조 방법의 일부 실시 형태에서, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, Tet2에서의 단일 대립유전자 파괴를 포함하는 면역 이펙터 세포 집단을 Tet2의 억제자와 접촉시키면 Tet2의 이중 대립유전자 파괴, 예를 들어, Tet2의 야생형 대립유전자의 파괴가 생성된다.
본원에 개시된 제조 방법의 일부 실시 형태에서, Tet2 파괴는, 예를 들어 CAR 폴리펩티드 코딩 핵산과의 접촉 전, 면역 이펙터 세포 집단에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포 집단은 하나 이상의 Tet2 파괴 대립유전자, 예를 들어, Tet2에서의 이중 대립유전자 파괴를 포함한다.
본원에 개시된 제조 방법의 일부 실시 형태에서, Tet2 파괴는, 예를 들어 CAR 폴리펩티드 코딩 핵산과의 접촉 전, 면역 이펙터 세포 집단에 존재하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 파괴된 Tet2 대립유전자를 전혀 포함하지 않는, 예를 들어, 2개의 야생형 Tet2 대립유전자를 포함하는 면역 이펙터 세포 집단을 Tet2의 억제자와 접촉시키면 Tet2의 이중 대립유전자 파괴, 예를 들어, Tet2의 야생형 대립유전자의 파괴가 생성된다.
일부 실시 형태에서, Tet2의 이중 대립유전자 파괴를 포함하는 면역 이펙터 집단을 이용하여 제조된 CAR-발현 집단은 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 그 이상의(예를 들어, 전부의) 다음 특성을 갖는다:
비-파괴 Tet2, 예를 들어, 야생형 Tet2를 가지는 점 외에는 유사한 CAR-발현 세포와 비교하여,
(i) 증가된 확장 잠재력, 예를 들어, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 또는 6배의 확장력(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(ii) 단수명 기억 T 세포의 특성, 예를 들어, EOMES의 발현 증가, KLRG1의 발현 감소, 세포독성 활성의 증가 또는 기억 T 세포 잠재력의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(iii) 이펙터 기능의 증가, 예를 들어, CD107a, 그랜자임 B 및 퍼포린의 탈과립화의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음);
(iv) 세포용해 활성의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음); 또는
(v) 예를 들어 증가된 Ki67로 측정되는 바와 같은, 증식 능력의 증가(실시예 1의 분석법으로 측정되는 바와 같음).
본원에 개시된 임의의 방법 또는 조성물의 일부 실시 형태에서, (예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의한) Tet2에서의 파괴, 예를 들어, Tet2에서의 단일 대립유전자 또는 이중 대립유전자 파괴를 포함하는 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포 집단을 채울 수 있으며, 예를 들어 CAR-발현 세포 집단을 발생시키거나 이로 분열될 수 있으며, 예를 들어, 클론성 CAR-발현 세포 집단으로 확장될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나의 CAR-발현 세포로부터 유래된 CAR-발현 세포 집단, 예를 들어, 클론성 CAR-발현 세포 집단이 예를 들어 질환 또는 병태, 예를 들어 암, 예를 들어 CAR-발현 세포에 의해 인식되는 항원의 발현과 관련된 암의 치료를 위하여 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 클론성 CAR-발현 세포 집단은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 상기 질환의 치료로 이어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 CAR 코딩 핵산(또는 이의 CAR-코딩 부분)이 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자) 내의(예를 들어, Tet2-관련 유전자의 인트론 또는 엑손 내의) 세포 게놈 내로 통합되도록 CAR 코딩 핵산을 세포 내로 도입하여서, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능이 변경되도록(예를 들어, 감소되거나 제거되도록) 하는 단계를 포함하고, 여기서, Tet2-관련 유전자는 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택된다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 생체 외에서 상기 CAR-발현 세포를 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)와 접촉시키는 단계를 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 서열, 및 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 (1) 유전자, 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) Tet2-관련 유전자의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어, 우성적 네거티브, 예를 들어, 촉매적 불활성), 또는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 결합 파트너; 및 (4) (1)~(3) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시 형태에서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자이다. 일부 실시 형태에서, CAR을 코딩하는 서열과 상기 억제자를 코딩하는 서열은 2A 부위에 의해 분리된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자) 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 유전자 편집 시스템을 제공하며, 여기서, Tet2-관련 유전자는 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택된다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 서열에 특이적이다.
일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템, 또는 메가뉴클레아제 시스템이다. 일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템이다.
일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 다음을 포함한다: Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질을 포함하는 gRNA 분자; Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 gRNA 분자; Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질을 포함하는 gRNA 분자를 코딩하는 핵산; Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 gRNA 분자를 코딩하는 핵산.
일부 실시 형태에서, 유전자 편집 시스템은 주형 DNA를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주형 DNA는 CAR, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포의 생체 외 제조를 위한 조성물을 제공하며, 이는 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 포함한다: (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상; (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자; (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자; (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는 (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
일부 실시 형태에서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자이다.
일부 실시 형태에서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 (1) Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) Tet2-관련 유전자의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어, 우성적 네거티브, 예를 들어, 촉매적 불활성), 또는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 결합 파트너; 또는 (4) (1)~(3) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 Tet2의 억제자를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 세포를 하나 이상 포함하는 세포 집단을 제공하며, 여기서, 세포 집단은, 세포에서 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거된 하나 이상의 상기 세포를 포함하지 않는 세포 집단보다 더 큰(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 큰) 백분율의 Tscm 세포(예를 들어, CD45RA+CD62L+CCR7+ (선택적으로 CD27+CD95+) T 세포)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 청구항 1 내지 청구항 89 중 임의의 청구항의 세포를 하나 이상 포함하는 세포 집단을 제공하며, 여기서, 세포 집단의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%)는 중심 기억 T 세포 표현형을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 중심 기억 세포 표현형은 중심 기억 T 세포 표현형이다. 일부 실시 형태에서, 세포 집단의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%)는 CD45RO 및/또는 CCR7을 발현한다.
본 특허 또는 특허 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 납부시에 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1a~도 1d에는 CLL 환자에서의 CAR T-세포의 입양 전달 후의 임상 반응의 평가가 도시되어 있다. 도 1a는 2회 주입 전 및 후의 CTL019 CAR T-세포의 생체 내 확장 및 지속을 나타낸다. CTL019 세포의 빈도는 DNA 1 μg당 평균 트랜스진 카피로 도시되어 있다. 도 1b는 CAR T-세포 주입 전 및 후의 혈청중 사이토카인의 종적 측정을 나타낸다. 각각의 사이토카인의 절대 측정치는 3배 8-포인트 희석 시리즈에 대한 재조합 단백질 농도를 기반으로 한 표준 곡선으로부터 유도되었다. 각각의 샘플은 이중으로 분석되었으며, 이때 평균값을 나타냈다(변동 계수: 10% 미만). 도 1c는 CTL019 요법 전 및 후 순환 CLL 세포의 총 수를 나타낸다. 계산은 말초 혈액의 부피를 5 리터로 가정한 전혈구 계수 값으로부터의 절대 림프구 계수치를 기반으로 하였다. 도 1d는 화학요법-불응성 림프절병증의 해상을 나타내는 순차적 컴퓨터 단층 촬영 영상을 나타낸다. 종괴(mass)는 화살표로 나타낸 바와 같이, 2개월에 시작하여 CAR T-세포의 제2 주입 후 점진적으로 감소되었으며, 1년 이상 분석되었다(데이터는 예시되어 있지 않음).
도 2에는 환자 10에서의 CAR T-세포의 생장이 CD8 구획에서 나타남이 도시되어 있다. CD8+ CTL019 세포 확장(우측 그래프)에 대한 전체 CTL019 CAR T-세포 확장(좌측 그래프)의 동역학적 특성이 주입 전 및 주입 후에 예시되어 있다. 순환 CTL019 세포의 수는 CD3+ 및 CD8+ CAR+ 집단의 빈도 및 절대 세포 계수치를 기반으로 하여 계산되었다. 모든 관찰된 값은 유세포 분석법에 의한 검출 한계치(0.1%)를 초과하였다.
도 3에는 환자 10으로부터 제조된 CAR T-세포가 다클론 조성을 나타냄이 도시되어 있다. 환자 10의 세포 주입 생성물에서의 CD8-(좌측 파이 차트) 및 CD8+(우측 파이 차트) CAR T- 세포에서의 TCRVβ 분포가 예시되어 있다.
도 4a~도 4d에는 CAR T-세포의 클론 확장을 가진 CLL 환자에서의 TCRVβ 사용의 분포가 도시되어 있다. 도 4a에는, CAR T-세포를 두 번째 주입한지 1개월 후(좌측 파이 차트) 및 2개월 후(중간 파이 차트) CLL 환자의 말초 혈액에서의 TCRVβ 유전자 절편의 평균 사용 빈도가 도시되어 있다. 상기 제2 주입 후 확장 피크에서의 분류된 CD8+ CAR T-세포에서의 TCRVβ 클로노타입 빈도가 가장 우측의 파이 차트에 예시되어 있다. 각각의 TCRVβ 유전자 절편은 그의 빈도에 비례하는 조각으로 표시된다. 각각의 시점에서의 TCRVβ5.1 사용의 비율을 표시하는 조각을 각각의 파이 차트에 나타낸다. 도 4b에서, PBMC의 유세포 분석법에 의한 분석은 TCRVβ13.1(음성 대조군)에 대한 TCRVβ5.1 양성인 CD8+ CAR T-세포의 큰 비율을 예시한다. 도 4c에는, 심층 레퍼토리 서열결정에 의해 결정되는 바와 같이, 제2 CAR T-세포 처리 후 1개월 및 2개월에 전혈에서, 그리고 주입 전 CD8+ CTL019 세포에서 활성의 피크에서의 분류 CD8+ CAR+ T-세포에서의 TCRVβ5.1 클로노타입의 풍부도가 도시되어 있다. 우점 TCRVβ5.1 클론(CASSLDGSGQGSDYGYTF)을 각각의 이변량 플롯에서 적색 점으로 나타낸다. 도 4d에는, CAR T-세포의 제2 주입 후 TCRVβ5.1 클론 확장의 동역학적 특성이 CAR 증식 및 지속 수준과 병행하여 도시되어 있다. CAR 및 우점 TCRVβ5.1 클론의 수준(검출가능한 클론 서열을 갖는 서열의 백분율로 나타냄)은 전혈로부터 추출된 DNA에서의 qPCR에 의해 측정되었다.
도 5a~도 5b에는 CAR 렌티바이러스 통합 부위의 분석 및 TET2 키메라 전사체의 검출(환자 10에서)이 도시되어 있다. 도 5a에는, 제2 주입 후 CAR T-세포 클론의 상대적 풍부도가 누적 막대 그래프로 요약되어 있다. 상이한 막대들은, 통합 부위에 의해 표시되는 바와 같이, 주요 세포 클론들을 나타낸다. 상기 부위에 대한 기호 해설은 그래프 아래에 예시되어 있다. 각각의 통합 부위는 가장 가까운 유전자에 의해 명명된다. 상대적 풍부도는 SonicLength법을 이용하여 개산되었다. 3% 미만의 개산된 상대적 풍부도는 "낮은 풍부도"로 넣어져 있다. 도 5b에는 생체 내 CAR T-세포 활성의 피크(제121일)에서 검출된 절두형 전사체의 벡터 프로바이러스로의 스플라이싱을 예시하는 TET2 통합 부위 유전자좌에서의 벡터의 다이어그램이 도시되어 있다. 각각의 스플라이싱 이벤트에 의해, 스플라이싱된 생성물을 대표하는 이소성 프레임내 종결 코돈(흑색 실선 위에 작은 별표로 나타냄)이 영입되었다. 3개의 키메라 메시지를 위한 스플라이스 접합부(총 5개의 접합부)에 상응하는 서열이 다이어그램 아래에 열거되어 있다. 다이어그램 아래의 표 내의 밑줄이 그어진 영역은 스플라이스 도너(donor) 및 억셉터(acceptor)에 상응한다. LTR, 긴 말단 반복체; cPPT, 폴리퓨린 트랙; EF1α, 신장 인자 1 알파 프로모터.
도 6a~도 6b에는 환자 10에서의 TET2 키메라 전사체의 검출 전략이 도시되어 있다. 도 6a에는, 절두형 TET2 전사체에 상응하는 폴리아데닐화 RNA의 검출 전략이 도시되어 있다. 박스는 통합된 벡터가 존재하는 TET2 엑손 9 및 10 사이의 게놈 영역을 나타낸다. 청색 및 적색 화살표는 다이어그램 아래에 열거된 정방향 및 역방향 프라이머의 일반적인 위치를 나타낸다. LTR, 긴 말단 반복체; cPPT, 폴리퓨린 트랙; EF1α, 신장 인자 1 알파 프로모터. 도 6b는 키메라 TET2 RT-PCR 생성물을 가시화한 것을 나타낸다. PCR 생성물을 천연 아가로스 겔에서 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 앰플리콘의 예상 크기가 겔 위에 열거되어 있다. 절두형 전사체는 박스로 강조되어 있다. RT-PCR 반응에 대한 기호 해설은 다이어그램 아래에 예시되어 있다.
도 7a~도 7g에는 TET2 결손이 후성유전학적 지형 및 T-세포 분화를 변경시킴이 도시되어 있다. 도 7a에는, CTL019 요법에 대한 반응의 피크에서의 환자 10으로부터 배양된 CAR+ 및 CAR- CD8+ T-세포에서의 총 5-hmc 수준이 도시되어 있다. 히스토그램은 유세포 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 세포내 5-hmc 염색의 강도를 도시한다. 도 7b는 환자 10으로부터 배양된 CAR+ 및 CAR- CD8+ T-세포에 있어서 차등적 ATAC-서열 영역의 벤다이어그램 및 상기 벤다이어그램의 각각의 부분에서의 피크의 농축(우측)을 나타낸다. 도 7c에는 상기 환자 세포에 상응하는 IFNG 유전자좌에서의 ATAC 농축의 게놈 브라우저 뷰(genome browser view)가 예시되어 있다. 도 7d에는 비자극되거나 항-CD3/CD28 항체-코팅 비드로 자극된, 환자 10으로부터 확장된 IFNg 및 CD107a 발현 CD8+ CAR+ 및 CAR- T-세포의 빈도가 도시되어 있다. 등고선 그래프 삽도는 게이팅된(gated) 세포 집단의 빈도를 나타낸다. 도 7e에는, 환자 10과 비교하여 2명의 장기간 완전 반응 CLL 환자(환자 1 및 2)에서의 생체 내 활성의 피크에서의 CAR T-세포의 생체 외 분화 표현형이 예시되어 있다. 파이 조각은 각각의 T-세포 하위세트의 상대 빈도를 나타낸다. 천연-유사 T 세포: CCR7+CD45RO-; 중심 기억 T 세포: CCR7+CD45RO+; 이펙터 기억 T 세포: CCR7-CD45RO+; 및 이펙터 T 세포: CCR7-CD45RO-. 각각의 환자의 반응의 피크에서의, HLA-DR(세포 표면 활성화 마커)을 발현하는 활성화 CAR T-세포의 빈도, 및 정량적 PCR에 의해 결정되는 바와 같은 CTL019 세포 수준이 파이 차트 아래에 열거되어 있다. 도 7f에는, 스크램블드(scrambled) shRNA(대조군) 또는 TET2 서열을 이용하여 렌티바이러스에 의해 형질도입한 건강한 공여자 유래의 일차 CD8+ T-세포에서의 TET2 발현이 예시되어 있으며, 이는 정량적 PCR에 의해 측정되는 바와 같다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(s.e.m.)를 나타낸다. 도 7g에는, TET2의 shRNA-매개 넉다운(knock-down) 후의 건강한 공여자로부터의 중심 기억(좌측), 이펙터 기억(중간) 및 이펙터 CD8+ T 세포의 빈도 및 시험관 내 확장이 도시되어 있다. 각각의 하위세트의 빈도는 스크램블드 shRNA(n = 12)로 형질도입된 그의 대응물에 대하여 제시된다. P 값은 양측 대응 스튜던트 t-검정(two-tailed, paired student's t-test)을 이용하여 결정하였다.
도 8에는 환자 10 유래의 TET2-파괴 CAR T-세포가 억제된 이펙터 분화 및 활성과 일치하는 포괄적 염색질 프로파일을 나타냄이 도시되어 있다. 환자 10 유래의 TET2-파괴 CD8+ CAR+ T-세포에서, 그의 매칭되는 CD8+ CAR- T-세포 대응물과 비교하여 유의하게 더 닫힌 염색질 영역과 관련된 GO 용어가 열거되어 있다.
도 9에는 시간이 지남에 따른 환자 10에서의 CAR T-세포의 분화 상태가 도시되어 있다. 유세포 분석 데이터의 대표적인 등고선 그래프는 환자 10에서의 CAR+ 및 CAR- CD8+ T-세포(HLA-DR(T-세포 활성화를 나타내는 표면 분자)을 발현함)의 빈도를 나타낸다. 분화 상태의 결정자로서 CD45RO 및 CCR7을 발현하는 이러한 세포의 비율이 예시되어 있다. 등고선 그래프 삽도는 게이팅된 세포 집단의 빈도를 나타낸다.
도 10a~도 10c에는 TET2의 넉다운이 CAR+ T 세포의 빈도를 증가시키고 이펙터 분화를 감소시킴이 도시되어 있다. 도 10a는 스크램블드 shRNA(대조군) 또는 TET2를 표적화하는 shRNA를 이용한 형질도입 후 건강한 공여자의 CD8+ CAR+ T 세포의 분화 상태를 나타내는 대표적인 유세포 분석법의 플롯을 나타낸다. 삽도에는 게이팅된 집단의 빈도가 정해져 있다. 도 10b 및 도 10c는 대조군 또는 TET2 shRNA 형질도입(n = 10) 후 분화 표현형에 따른, 각각 건강한 대상체의 CAR+ CD8+ T 세포 및 CAR+ CD4+ T-세포의 빈도를 나타낸다. P 값은 양측 대응 스튜던트 t-검정을 이용하여 계산하였다.
도 11a~도 11e에는 환자 10에서의 CAR 렌티바이러스 통합 부위 및 TET2 결손의 조사 결과가 도시되어 있다. 도 11a는 누적 막대 그래프로 요약되어 있는, 제2 주입 후 CAR T-세포 클론의 상대적 풍부도를 나타낸다. 상이한 수평 막대들은, 통합 부위에 의해 표시되는 바와 같이, 주요 세포 클론들을 나타낸다. 상기 부위에 대한 기호 해설은 그래프 아래에 예시되어 있다. 3% 미만의 개산된 상대적 풍부도는 "낮은 풍부도"로 넣어져 있다. 도 11b는 섀논 지수(Shannon index)를 이용한 시간이 지남에 따른 환자 10에서의 CAR T-세포 다양성을 나타내는데, 이는 통합 부위들 중에서 샘플링된 세포의 분포의 균일성 및 상이한 독특한 통합 부위들의 수 둘 다를 설명한다. 도 11c는 생체 내 CAR T-세포 활성의 피크(제121일)에서 검출된 절두형 전사체의 벡터 프로바이러스로의 스플라이싱을 예시하는 TET2 통합 부위 유전자좌에서의 벡터의 다이어그램을 나타낸다. 각각의 스플라이싱 이벤트에 의해, 스플라이싱된 생성물을 대표하는 이소성 프레임내 종결 코돈(흑색 실선 위에 작은 별표로 나타냄)이 영입되었다. 3개의 키메라 메시지를 위한 스플라이스 접합부(총 5개의 접합부)에 상응하는 서열이 다이어그램 아래에 열거되어 있다. 다이어그램 아래의 표 내의 밑줄이 그어진 영역은 스플라이스 도너 및 억셉터에 상응한다. LTR, 긴 말단 반복체; cPPT, 폴리퓨린 트랙; EF1α, 신장 인자 1 알파 프로모터. 도 11d는 5-mC의 5-hmC로의 산화 및 5-fC 및 5-caC로의 산화의 TET2-촉매작용된 순차적 산화(상부)의 다이어그램을 나타낸다. E1879Q TET2 돌연변이체로 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 단리된 600 ng의 게놈 DNA에서의 5-mC, 5-hmC, 5-fC 및 5-caC에 대한 도트 블롯이 예시되어 있다. 분석 대조군은 공벡터, 야생형 TET2 및 촉매적 불활성(HxD) TET2 돌연변이체(하부 좌측)를 포함한다. 상기 세포에서 hTET2를 검출하기 위한 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블롯도 예시되어 있다. Hsp90α/β가 로딩 대조군으로 사용되었다(하부 우측). 도 11e는 E1879Q TET2 돌연변이체에 의해 생성되고 전체 시토신 변형의 퍼센트로서 LC-MS/MS에 의해 정량화된 5-mC, 5-hmC, 5-fC, 및 5-caC 변형의 게놈 수준을 나타낸다. 독립 실험(n = 3)의 평균으로부터 유도된 백분율이 예시되어 있다(양측 대응 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정할 경우, **P 0.01).
도 12a~도 12c에는 CAR T-세포의 후성유전학적 지형에 대한 TET2 결손의 영향이 도시되어 있다. 도 12a는 환자 10 유래의 CAR- T-세포와 비교하여 CAR+에서 얻어지거나 상실된 염색질 영역에서의 전사 인자(TF) 결합 모티프의 농축을 나타낸다. 도 12b는 환자 10 유래의 CD8+ CAR+ 및 CAR- T-세포의 종적 분화 표현형을 나타낸다(좌측 패널). 환자 10과 비교하여 2명의 장기간 완전 반응 CLL 환자(환자 1 및 2)에서의 생체 내 활성의 피크에서의 분화 표현형이 예시되어 있다. 파이 조각은 각각의 T-세포 하위세트의 상대 빈도를 나타낸다. 각각의 환자의 반응의 피크에서의, HLA-DR(세포 표면 활성화 마커)을 발현하는 활성화 CAR T-세포의 빈도, 및 정량적 PCR에 의해 결정되는 바와 같은 CTL019 세포 수준이 파이 차트 아래에 열거되어 있다. 도 12c는 CD19 또는 메소텔린(음성 대조군)을 발현하는 K562 세포를 이용한 반복적 자극에 반응하는 CTL019 세포의 장기간 증식을 나타낸다. CAR T-세포는 스크램블드 대조 shRNA 또는 TET2-특이적 shRNA 중 어느 하나를 발현하도록 형질도입되었다. 각각의 화살표는 세포를 항원에 노출시킨 때를 나타낸다. P 값은 양측 대응 스튜던트 t-검정을 이용하여 결정하였다(*P < 0.05).
도 13에는 CD8 구획에서의 환자 10에서의 CAR T-세포의 생장이 도시되어 있다. 다른 반응자와 비교하여 환자 10에서의 주입 전 및 주입 후의 CAR T-세포 확장(CD3+, CD8+ 및 CD8-)의 동역학적 특성이 예시되어 있다. 순환 CTL019 세포의 수는 CD3+, CD8+ 및 CD8- CAR T-세포 집단의 빈도 및 절대 세포 계수치를 기반으로 하여 계산되었다. 모든 관찰된 값은 유세포 분석법에 의한 검출 한계치(0.1%)를 초과하였다.
도 14a~도 14d에는 장기간 주입 후 시점에서의 환자 10에서의 면역 세포 집단의 프로파일링 및 CAR T-세포 검출이 도시되어 있다. 도 14a는 환자 10에서의 말초 혈액 CAR T-세포의 확인을 위한 유세포 분석법 게이팅 전략을 나타낸다. 도 14b는 이 환자의 CD4 및 CD8 구획에서의 CTL019 세포의 상대 백분율을 나타낸다. 건강한 대상체 유래의 T-세포는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 도 14c는 건강한 대상체와 비교한 환자 10에서의 순환 B-세포의 빈도를 나타낸다. 예비게이팅(pre-gating)을 수행하여 죽은 세포 및 이중선을 배제하였으며, 모든 게이팅 역치는 FMO(fluorescence minus one) 대조군을 기반으로 하였다. 도 14d는 환자 10의 혈액에서의 다양한 면역 세포 집단들을 열거한 것을 나타낸다. 각각의 집단의 빈도는 그의 표현형 마커에 상응하는 별개의 컬럼에 열거되어 있다. 도 14e는 qPCR에 의해 결정되는 바와 같은 환자 10의 말초 혈액에서의 CAR T-세포의 지속성을 나타낸다. 3회 반복으로부터 얻어진 평균 임계 사이클(Ct) 값 및 표준 편차(SD)가 열거되어 있다. CAR T-세포 풍부도의 계산은 세포당 평균 마킹과, 게놈 DNA 1 마이크로그램당 트랜스진 카피로서 보고된다.
도 15에는 환자 10 유래의 TET2-결함 CAR T-세포의 포괄적 염색질 프로파일링이 도시되어 있다. 환자 10 유래의 TET2-파괴 CD8+ CAR+ T-세포에서, 그의 매칭되는 CD8+ CAR- T-세포 대응물과 비교하여 유의하게 더 열린 염색질 영역과 관련된 GO(Gene ontology) 용어가 열거되어 있다.
도 16에는 시간이 지남에 따른 환자 10에서의 CAR T-세포의 분화 상태가 다른 반응자와 비교하여 도시되어 있다. 완전 반응자 유래의 CD8+ CAR+ 및 CAR- T-세포의 분화 표현형을 결정하는 데 사용되는 예시적인 게이팅 전략(상부 좌측 패널). 선 그래프는 시간이 지남에 따른 다른 반응 환자에서의 이러한 세포 집단들의 분화 상태를 도시하며, 혈액 중 상응하는 CAR T-세포 수준과 함께 도시되는데, 이는 qPCR에 의해 결정되는 바와 같다.
도 17에는 TET2 넉다운 및 종양 표적을 이용한 연속 재자극 후 CAR T-세포 생존성이 도시되어 있다. TET2 shRNA 또는 스크램블드 대조군으로 형질도입되고 CD19 발현 K562 세포로 재자극된 CAR+ T-세포의 생존성(n = 12). 각각의 화살표는 세포를 항원에 노출시킨 시점을 나타낸다.
도 18a~도 18b에는 TET2 억제 후 CAR T-세포 사이토카인 프로파일이 도시되어 있다. 도 18a는 TET2 shRNA 또는 스크램블드 대조군(좌측 패널)으로 형질도입된 건강한 공여자의 CAR T-세포에 의한 급성 세포내 사이토카인 생성의 대표적인 유세포 분석을 나타낸다. 전체 CD3+, CD4+ 및 CD8+ CAR T-세포에 의한 IFNγ, TNFα 및 IL-2의 생성이 예시되어 있다. 이러한 세포들을 CD3/CD28(상부 우측 패널) 또는 CAR 항-이디오타입 항체(하부 우측 패널) 코팅 비드로 자극하였다. 도 18b는 CD19 항원을 이용한 재자극 후 TET2-결함 또는 대조 CAR T-세포에 의한 IFNγ(상부 패널), TNFα(중간 패널) 및 IL-2(하부 패널)의 생성을 나타낸다. 각각의 화살표는 CAR T-세포를 항원에 노출시킨 때를 나타낸다.
도 19a~도 19c에는 CAR T-세포의 세포독성 기구(cytotoxic machinery)에 대한 TET2 넉다운의 영향이 도시되어 있다. 도 19a에는 CD3/CD28 및 CAR-특이적 자극(좌측 패널) 후 Cd107a(세포용해의 마커)를 발현하는 TET2 넉아웃 또는 대조 CAR T-세포의 빈도를 나타내는 유세포 분석 플롯이 도시되어 있다. n = 6의 상이한 건강한 공여자로부터 제조된 CAR T-세포의 분석으로부터의 요약 데이터가 예시되어 있다(우측 패널). 도 19b는 TET2 억제의 세팅에서의 CAR T-세포에서의 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현 수준을 그의 대응 대조군(좌측 패널)과 비교하여 예시하는 대표적인 히스토그램을 나타낸다. n = 5의 건강한 공여자의 CAR T-세포로부터 모은 데이터가 우측 패널에 요약되어 있다. 도 19c는 루시퍼라아제-발현 OSU-CLL(좌측 패널) 또는 NALM-6(우측 패널) 세포와 함께 하룻밤 공동배양한 후의 CTL019 세포(TET2 또는 스크램블드 대조 shRNA로 형질도입됨)의 세포독성 능력을 나타낸다. 비-특이적 용해에 대하여 대조하기 위하여 비형질도입 T-세포를 추가 군으로서 포함시켰다. P 값은 양측 대응 스튜던트 t-검정을 이용하여 결정하였다(*P < 0.05; **P ≤ 0.01).
도 20의 A~도 20의 B에는 환자 10 CAR T-세포에 의한 이펙터 및 기억 분자 발현을 다른 반응 대상체와 비교한 것이 도시되어 있다. 도 20의 A는 환자 10에서의 생체 내 CTL019 확장의 피크에서의 그랜자임 B의 발현(좌측 패널) 및 그랜자임 B/Ki-67 공동발현 CAR- 및 CAR+ T-세포의 빈도(우측 패널)를 3명의 다른 완전 반응자와 비교한 것을 나타낸다. 도 20의 B는 이들 환자의 동일 세포 집단들에서의 세포내 EOMES 발현의 대표적인 히스토그램(좌측 패널), 및 CD27(중간 패널) 및 KLRG1-발현(우측 패널) 림프구의 빈도를 도시하는 등고선 그래프를 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "a" 및 "an"의 관사는 1개 또는 1개 초과의(즉, 적어도 1개의) 관사의 문법적 대상을 나타낸다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "약"은, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간적 기간 등을 언급하는 경우에 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄함을 의미하고, 이는 이러한 변동이 개시된 방법의 수행에 적절하기 때문이다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 면역 이펙터 세포 내에 존재하는 경우에 상기 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성, 및 세포내 신호 생성을 제공하는, 폴리펩티드들, 전형적으로 가장 단순한 실시 형태에서 2가지의 폴리펩티드들의 세트를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, CAR은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하기 정의된 바와 같은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 연접한다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재시에 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일 양태에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 쇄이다. 일 양태에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일 양태에서, 공동자극 분자는 본원에 기술된 공동자극 분자, 예를 들어 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능성 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능성 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일 양태에서 CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단(N-ter)에서 선택적인 리더 서열을 포함한다. 일 양태에서, CAR은 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 CAR의 세포 프로세싱 및 세포막으로의 국재화 동안 항원 결합 도메인(예를 들어 scFv)으로부터 선택적으로 절단된다.
특정 종양 마커 X, 예컨대 본원에 기술된 것을 표적화하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, 또는 TCR)을 포함하는 CAR은 XCAR로도 지칭된다. 예를 들어, CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 CD19CAR로 지칭된다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 또는 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하도록 정보를 세포 내로 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능성 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론 또는 단클론, 다중 또는 단쇄, 또는 무손상 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 하나의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디술피드-결합된 Fv(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 항체 단편, 예컨대 힌지 영역에서 디술피드 가교체에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로 형성된 다중 특이성 항체, 및 단리된 CDR 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내에 혼입될 수 있다(예를 들어 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한, 폴리펩티드, 예컨대 피브로넥틴 III형(Fn3)을 기반으로 한 스캐폴드 내로 그라프트될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술한 미국 특허 제6,703,199호 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 유연성 폴리펩티드 링커를 통해 연접하여 연결되고, 단쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 scFv는 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여, VL 및 VH 가변 영역을 어느 하나의 순서로 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단쇄 항체(scFv), 인간화 항체 또는 이중특이성 항체를 포함하는 연접 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다(문헌[Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]; 문헌[Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]; 문헌[Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-426]). 일 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("카바트(Kabat)" 넘버링 스킴), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948]("초티아(Chothia)" 넘버링 스킴)에 기술된 것들, 또는 이들의 조합을 비롯하여, 잘 알려진 다수의 스킴 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 적어도 1개의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 일 실시 형태에서, 항체 분자는 다중특이성 항체 분자이고, 예를 들어 이는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 여기서 복수개 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고, 복수개 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다. 일 실시 형태에서, 다중특이성 항체 분자는 이중특이성 항체 분자이다. 이중특이성 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 여기서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단쇄 항체(scFv), 인간화 항체 또는 이중특이성 항체를 포함하는 연접 폴리펩티드 쇄의 부분으로서 발현된다(문헌[Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]; 문헌[Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York]; 문헌[Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-426]). 일 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체 중쇄"는 그의 자연 발생 입체형태의 항체 분자에 존재하고 통상적으로 항체가 속하는 클래스를 결정하는, 상기 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 것을 지칭한다.
용어 "항체 경쇄"는 그의 자연 발생 입체형태의 항체 분자에 존재하는 상기 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2가지의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예컨대, 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 본 기술 분야에서 이용 가능하고 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특이적 면역 적격(competent) 세포의 활성화, 또는 이들 둘 다를 수반할 수 있다. 숙련자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 마크로분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 숙련자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에 사용된 용어 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 코딩하도록 다양한 조합으로 배열되는 것이 분명하다. 또한, 숙련자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 이외의 마크로분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "항암 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 암 세포 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 먼저 암 발생의 예방에서의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다. 용어 "항-종양 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "자가"는 이후에 개체에게 재도입될, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우에 둘 이상의 개체가 서로 동종이계인 것으로 언급된다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원과 관련하여 상호작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 그라프트를 지칭한다.
용어 "암"은 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예가 본원에 기술되어 있고, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 이들 둘 다의 용어는 고형 및 액상, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 전암성 및 악성 암 및 종양을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "~로부터 유래되는"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이것은 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며, 제2 분자로부터 유래되는 제1 분자에 대한 공정 또는 공급원 상의 제한은 내포하지 않거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래되는 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 요구되는 기능, 즉, 적절한 조건 하에 신호를 생성하는 능력을 갖도록 하기에 충분한 CD3제타 구조를 보유한다. 이것은 세포내 신호전달 도메인의 특정한 생성 방법에 대한 제한을 내포하지 않거나 포함하지 않으며, 예를 들어, 이것은 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위하여 CD3제타 서열로 시작하여 원하지 않는 서열을 결실시키거나, 또는 돌연변이를 시행하여, 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 함을 의미하는 것이 아니다.
어구 "본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환"은, 예를 들어, 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양 또는 전암성 병태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 비롯하여 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 병태 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 질환; 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 비암 관련 증후를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 암은 고형암이다. 본원에 기술된 종양 항원의 발현과 관련된 추가의 질환은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 증후는, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알러지 및 천식) 및 이식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원을 코딩하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 일 실시 형태에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, 종양 항원 발현 세포는 검출가능한 수준의 종양 항원 단백질을 한 시점에 생산하였고, 이후에 실질적으로 검출가능하지 않은 종양 항원 단백질을 생산하였다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 본 기술 분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 위치-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 본 기술 분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 CAR은 본원에 기술된 기능적 분석법을 사용하여 테스트될 수 있다.
용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CAR)가 그의 동족 리간드(또는 CAR의 경우에 종양 항원)와 결합하여 신호 전달 사건, 예컨대 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 적절한 NK 수용체 또는 CAR의 신호전달 도메인을 통한 신호 전달을 매개함으로써 유도되는 일차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대한 자극 방식에서 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일 양태에서, 신호는 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 시작되는 일차 신호이고, 이것은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포 반응의 매개를 초래한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열("일차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 1가지 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 일차 신호전달 서열은 서열 번호 18로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 일차 신호전달 서열은 서열 번호 20으로 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체화된 외래 항원을 디스플레이하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포(예를 들어 B-세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T-세포는 그의 T-세포 수용체(TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하여 T-세포에 제시한다.
본원에 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어 CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차 세포내 신호전달 도메인은 일차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어 CART의 경우에, 일차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 젠뱅크 등록 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄 또는 이의 기능성 유도체의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 일 양태에서, 제타의 세포질 도메인은 젠뱅크 등록 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 이의 기능적 오르토로그(ortholog)인 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다. 일 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열 번호 18로서 제공된 서열이다. 일 양태에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열 번호 20으로 제공된 서열이다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 이의 리간드이다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체와, OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 및 4-1BB (CD137)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 공동자극 분자의 추가의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 하기의 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 고유 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능성 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 젠뱅크 등록 번호 AAA62478.2로서 제공된 아미노산 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 갖는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원을 지칭하고; "4-1BB 공동자극 도메인"은 젠뱅크 등록 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214 내지 255, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의된다. 일 양태에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열 번호 14로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포 및 골수 유래 식세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은, 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 증진시키거나 촉진하는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 그의 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우에, 일차 자극 및 공동-자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "코딩하는"은 뉴클레오티드(예를 들어 rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로부터 초래된 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 마크로분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA 또는 RNA는 그러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성하는 경우에 단백질을 코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것으로서 언급될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기술된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 유효한 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의, 또는 그 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 수많은 벡터가 본 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드이거나 또는 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 본 기술 분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특한 것이고; 렌티바이러스는 유의한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어, 그들이 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이게 한다. HIV, SIV 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히, 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009)]에 제공된 바와 같은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 비롯한, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부분으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 Oxford BioMedica로부터의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen으로부터의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다 내의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유된 경우; 예를 들어 각각의 2개의 DNA 분자 내의 위치가 아데닌에 의해 점유된 경우에, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭되는 위치 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어 2개의 서열 내의 위치의 절반(예를 들어 중합체의 10개 서브유닛 길이 내의 5개의 위치)이 상동성일 경우에, 상기 2개의 서열은 50% 상동성이고; 90%의 위치(예를 들어 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성인 경우에, 상기 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비-인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 "인간화" 형태로는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이 있다. 대개, 인간화 항체 및 이의 항체 단편은 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개량하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 유의한 일부의 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가의 상세 사항에 대해서는, 문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986]; 문헌[Reichmann et al., Nature, 332:323-329, 1988]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992]을 참조한다.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원의 것이거나 또는 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 면역글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 꺼내어진 것을 의미한다. 예를 들어 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 상기 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-고유 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 이는 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 DNA 서열들은 서로 연접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기법을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려져 있는 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보성 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대하여 제한을 두지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 본 기술 분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 본 기술 분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 생성물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 유전자 생성물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도자가 세포에 존재할 때에만 유전자 생성물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 코딩되거나 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 생성물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "암 관련 항원" 또는 "종양 항원"은 전체로 또는 단편(예를 들어 MHC/펩티드)으로서 암 세포의 표면 상에서 발현되고, 약리학적 에이전트의 암 세포에 대한 우선적인 표적화에 유용한 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 상호교환가능하게 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암 세포 둘 다에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계통 마커, 예를 들어 B 세포 상의 CD19이다. 일부 실시 형태에서, 종양 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과발현되는, 예를 들어 정상 세포와 비교하여 1배 과발현, 2배 과발현, 3배 과발현되거나 그 이상으로 과발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 실시 형태에서, 종양 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성된 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포 상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 부가 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 실시 형태에서, 종양 항원은 암 세포의 세포 표면 상에서 전체로 또는 단편(예를 들어 MHC/펩티드)으로서 배타적으로 발현될 것이고, 정상 세포의 표면 상에서는 합성되지 않거나 발현되지 않을 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CAR은 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR을 포함한다. 통상적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구 상의 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는 모든 유핵 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역요법을 위한 독특한 부류의 세포 표면 표적을 나타낸다. 인간 백혈구 항원(HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드를 표적화하는 TCR-유사 항체가 기술된 바 있다(예를 들어 문헌[Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942]; 문헌[Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272]; 문헌[Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165]; 문헌[Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21): 1601-1608]; 문헌[Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176): 176ra33]; 문헌[Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100] 참조). 예를 들어 TCR-유사 항체는 라이브러리, 예컨대 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
용어 "종양-지지 항원" 또는 "암-지지 항원"은, 그 자체가 암성은 아니지만, 예를 들어 암 세포의 성장 또는 생존, 예를 들어 면역 세포에 대한 저항성을 촉진함으로써 암 세포를 지지하는 세포의 표면 상에서 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 상호교환가능하게 지칭한다. 이러한 유형의 예시적인 세포는 기질 세포 및 골수-유래 억제 세포(MDSC)를 포함한다. 종양-지지 항원 그 자체는, 항원이 암 세포를 지지하는 세포 상에 존재하기만 한다면, 종양 세포를 지지하는 데 있어서 일정한 역할을 할 필요가 없다.
scFv와 관련하여 사용된 용어 "유연성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 아미노산, 예컨대 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 일 실시 형태에서, 유연성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다(서열 번호 28). 일 실시 형태에서, 유연성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4(서열 번호 29) 또는 (Gly4 Ser)3(서열 번호 30)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)(서열 번호 31)의 다중 반복체를 포함한다. 또한, 본원에 참고로 포함되는 국제 공개 제2012/138475호에 기술된 링커가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 사용된 5' 캡(RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 지칭됨)은 전사 시작 직후에 진핵 메신저 RNA의 "전방" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사 뉴클레오티드에 연결된 말단 기로 이루어진다. 그의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호에 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 전사와 동시에 일어나서, 각각은 서로 영향을 미치게 된다. 전사 시작 직후에, 합성 중인 mRNA의 5' 말단에는 RNA 폴리머라아제와 회합된 캡-합성 복합체가 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매작용한다. 합성은 다단계 생화학 반응으로서 진행된다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대 그의 안정성 또는 번역 효율을 조정하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "시험관 내 전사 RNA"는 시험관 내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관 내 전사 RNA는 시험관 내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관 내 전사 벡터는 시험관 내 전사 RNA를 생성하는 데 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구축물의 바람직한 실시 형태에서, 폴리A는 50 내지 5000개(서열 번호 34), 바람직하게는 64개 초과, 더욱 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 국재화, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 그의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자에의 공유 결합을 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라아제의 작용을 통해 프리(pre)-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드(종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 테일 및 그에 결합된 단백질은 mRNA를 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, mRNA의 핵으로부터의 유출, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후에 핵에서 일어나지만, 추가로 이후에 세포질에서도 일어날 수 있다. 전사가 종결된 후에, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라아제와 회합된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후에, 아데노신 잔기는 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
본원에 사용된 "일시적"은 수시간, 수일 또는 수주의 기간 동안의 비-통합된 트랜스진의 발현을 지칭하고, 여기서 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 포함된 경우의 유전자의 발현을 위한 기간 미만이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법제(예를 들어 하나 이상의 치료제, 예컨대 본 발명의 CAR)의 투여로부터 초래되는 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속 기간의 감소 또는 개선, 또는 이의 하나 이상의 증상(바람직하게는, 하나 이상의 식별가능한 증상)의 개선을 지칭한다. 구체적 실시 형태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 환자에 의해 반드시 식별가능할 필요는 없는 증식성 장애의 적어도 하나의 측정가능한 물리적 파라미터, 예컨대 종양의 성장의 개선을 지칭한다. 다른 실시 형태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은, 예를 들어 식별가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 이들 둘 다로의 증식성 장애의 진행의 억제를 지칭한다. 다른 실시 형태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 종양 크기 또는 암성 세포 계수의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전달하는데 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달하는 것이 가능한 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어 포유동물, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 그의 자연 발생 상태에서 보통 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 그들의 천연 상태에서 천연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료적"은 치료를 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 관해 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 예방 또는 보호적 처치를 의미한다.
본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과다증식성 장애 항원" 또는 "과다증식성 장애와 관련된 항원"은 특정 과다증식성 장애에 통상적인 항원을 지칭한다. 특정 양태에서, 본 발명의 과다증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 트랜스펙션되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 결합 파트너(예를 들어, 종양 항원) 단백질을 인식하고 이와 결합하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조절성 키메라 항원 수용체(RCAR)"는 RCARX 세포에 존재하는 경우에 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성 및 조절가능한 세포내 신호 생성 또는 증식을 RCARX 세포에 제공하는(이는 RCARX 세포의 면역 이펙터 특성을 최적화시킬 수 있음), 가장 단순한 실시 형태에서 전형적으로 2개의, 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. RCARX 세포는 적어도 부분적으로, 항원 결합 도메인에 의존하여, 항원 결합 도메인이 결합된 항원을 포함하는 표적 세포에 대한 특이성을 제공한다. 일 실시 형태에서, RCAR은 이량체화 분자의 존재시 세포내 신호전달 도메인을 항원 결합 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "막 앵커" 또는 "막 테더링 도메인"은 세포외 또는 세포내 도메인을 원형질 막에 고정시키기에 충분한 폴리펩티드 또는 모이어티, 예를 들어 미리스토일 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "스위치 도메인"은, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 이량체화 분자의 존재 하에 또 다른 스위치 도메인과 회합하는 엔티티, 전형적으로 폴리펩티드-기반의 엔티티를 지칭한다. 회합은 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제1 엔티티, 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제2 엔티티의 기능적 커플링을 초래한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 이량체화 스위치로 총칭된다. 실시 형태들에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들어 그들은 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 동종이량체화 스위치로 총칭된다. 실시 형태들에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 상이하고, 예를 들어 그들은 상이한 일차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 이종이량체화 스위치로 총칭된다. 실시 형태들에서, 스위치는 세포내에 존재한다. 실시 형태들에서, 스위치는 세포외에 존재한다. 실시 형태들에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반의 엔티티, 예를 들어 FKBP 또는 FRB-기반의 것이고, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파로그(rapalogue)이다. 실시 형태들에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반의 엔티티, 예를 들어 myc 펩티드에 결합하는 scFv이고, 이량체화 분자는 폴리펩티드, 이의 단편, 또는 폴리펩티드, 예를 들어 myc 리간드의 다량체 또는 하나 이상의 myc scFv에 결합하는 myc 리간드의 다량체이다. 실시 형태들에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반의 엔티티, 예를 들어 myc 수용체이고, 이량체화 분자는 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 myc 항체이다.
본원에 사용된 용어 "이량체화 분자"는, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 실시 형태들에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연 발생되지 않거나, 또는 유의한 이량체화를 초래할 농도로 발생되지 않는다. 실시 형태들에서, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001이다.
용어 "생물학적 등가(bioequivalent)"는 기준 용량 또는 기준량의 기준 화합물(예를 들어 RAD001)에 의해 생성된 효과와 동등한 효과를 생성하는 데 요구되는 기준 화합물(예를 들어 RAD001) 이외의 에이전트의 양을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 효과는 예를 들어 P70 S6 키나아제 억제에 의해 측정된 바와 같은, 예를 들어 생체 내 또는 시험관 내 분석법에서 평가된 바와 같은, 예를 들어 본원에 기술된 분석법, 예를 들어 불레이(Boulay) 분석법에 의해 측정된 바와 같은 mTOR 억제의 수준이다. 일 실시 형태에서, 효과는 세포 분류에 의해 측정되는 바와 같은 PD-1 양성/PD-1 음성 T 세포의 비의 변경이다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 생물학적 등가인 양 또는 용량은 기준 용량 또는 기준량의 기준 화합물과 동일한 수준의 P70 S6 키나아제 억제를 달성하는 양 또는 용량이다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 생물학적 등가인 양 또는 용량은 기준 용량 또는 기준량의 기준 화합물과 동일한 수준의 PD-1 양성/PD-1 음성 T 세포의 비의 변경을 달성하는 양 또는 용량이다.
용어 "낮은, 면역 증진 용량"은, mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신, 또는 촉매적 mTOR 억제자와 함께 사용된 경우에, 예를 들어 P70 S6 키나아제 활성의 억제에 의해 측정된 바와 같이 부분적으로 mTOR 활성을 억제하지만, 완전히 억제하지는 않는 mTOR 억제자의 용량을 지칭한다. 예를 들어 P70 S6 키나아제의 억제에 의해 mTOR 활성을 평가하는 방법이 본원에서 논의된다. 상기 용량은 완전한 면역 억제를 초래하기에는 불충분하지만, 면역 반응을 증진시키기에는 충분하다. 일 실시 형태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제자는 PD-1 양성 T 세포의 수의 감소 및/또는 PD-1 음성 T 세포의 수의 증가, 또는 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 T 세포의 비의 증가를 초래한다. 일 실시 형태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제자는 나이브 T 세포의 수의 증가를 초래한다. 일 실시 형태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제자는
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2 중 하나 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 갖는 세포의 수의 증가 중 하나 이상을 초래하며,
여기서 임의의 상기 기술된 변화는, 예를 들어 비-치료 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
본원에 사용된 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 실시 형태들에서, 불응성 암은 치료 이전 또는 치료의 시작시에 치료에 저항성일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 불응성 암은 치료 동안 저항성이 될 수 있다. 불응성 암은 저항성 암으로도 칭해진다.
본원에 사용된 "재발된"은 개선 기간 이후, 예를 들어 요법, 예를 들어 암 요법의 선행 치료 이후 질환(예를 들어 암) 또는 질환, 예컨대 암의 징후 및 증상의 복귀를 지칭한다.
범위: 본 명세서 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 단지 편의 및 간결함을 위한 것이고, 본 발명의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기술은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위와, 그 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과, 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95 내지 99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 하위범위, 예컨대 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97 내지 98% 및 98 내지 99% 동일성을 포함한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
본원에 사용된 용어 "IFNG", "인터페론 감마" 또는 "IFN-γ"는 유전자 IFNG 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 인간 게놈에서, IFNG는 염색체 12q15 상에 위치한다. 예시적인 IFNG 서열이 젠뱅크 번호 NM_000619.2로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "NOTCH2", "신경발생 유전자좌 노치 상동 단백질 2" 또는 "hN2"는 유전자 NOTCH2 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 인간 게놈에서, NOTCH2는 염색체 1p12 상에 위치한다. 2가지의 예시적인 Notch2 이소형이 젠뱅크 번호 NM_001200001.1 및 NM_024408.3로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "IL2RA", "인터류킨-2 수용체 서브유닛 알파", "IL-2-RA", 또는 "IL2-RA"는 유전자 IL2RA 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 이것은 "CD25", "TAC 항원" 또는 "p55"로도 공지되어 있다. 인간 게놈에서, IL2RA는 염색체 10p15.1 상에 위치한다. 3가지의 예시적인 IL2RA 이소형이 젠뱅크 번호 NM_000417.2, NM_001308242.1, 및 NM_001308243.1로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "PRDM1" 또는 "PR 도메인 징크 핑거 단백질 1"은 유전자 PRDM1 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 이것은 "BLIMP-1", "베타-인터페론 유전자 양성 조절 도메인 I-결합 인자", "PR 도메인-함유 단백질 1", "양성 조절 도메인 I-결합 인자 1", "PRDI-BF1", 및 "PRDI-결합 인자 1"로도 공지되어 있다. 인간 게놈에서, PRDM1은 염색체 6q21 상에 위치한다. 4가지의 예시적인 PRDM1 이소형이 젠뱅크 번호 NM_001198.3, NM_182907.2, XM_011536063.2, 및 Xm_017011187.1로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "Tet"는 10-11 전좌 메틸시토신 디옥시게나아제 패밀리의 유전자 패밀리, 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. Tet는 예를 들어 Tet1, Tet2 및 Tet3을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Tet2"는 유전자인 tet 메틸시토신 디옥시게나아제 2, 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질인 tet2 메틸시토신 디옥시게나아제(이는 메틸시토신의 5-히드록시메틸시토신으로의 전환을 촉매작용함)를 지칭한다. 이것은 때때로 "KIAA1546", "FLJ20032" 및 "tet 발암유전자 패밀리 멤버 2"로도 지칭된다. 상기 코딩된 단백질은 골수조혈에 관여하며, 이 유전자의 결함은 몇몇 골수증식성 장애와 관련되었다. 인간 게놈에서, TET2는 염색체 4q24 상에 위치한다. 현재, 6가지의 TET2 이소형이 개시되었으며, 이들의 젠뱅크 번호는 NM_001127208.2; XM_005263082.1; XM_006714242.2; NM_017628.4; XM_011532044.1; 및 XM_011532043.1이다.
인간 Tet2의 단백질 서열의 일례가 UniProt 등록 번호 Q6N021로 제공된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Tet2 유전자는 염색체 4, 위치 GRCh38.p2(GCF_000001405.28)(NC_000004.12)(105145875 내지 105279803)에 위치하며; 유전자 ID는 54790이다.
Tet2를 코딩하는 핵산 서열의 예가 하기에 제공된다. 인간 Tet2의 6가지의 확인된 이소형이 확인되었다. 그 mRNA 서열이 하기에 제공된다(실시 형태들에서, 각각의 서열에서, T는 U로 대체될 수 있다). 실시 형태들에서, Tet2는 각각의 하기 서열에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다:
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본원에 사용된 용어 "Tet 억제자" 또는 "Tet[x] 억제자"(예를 들어, "Tet1 억제자", "Tet2 억제자", 또는 "Tet3 억제자")는 상응하는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 기능 및/또는 발현을 감소시키거나 제거하는 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. 실시 형태들에서, Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 억제자는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 발현을 억제하는, 예를 들어, Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 발현을 감소시키거나 제거하는 분자이다. 실시 형태들에서, Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 억제자는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 기능을 억제하는 분자이다. Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 발현을 억제하는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 억제자의 일례로는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 유전자, 또는 그의 조절 요소 내의 핵산을 표적화하여서, 유전자 편집 시스템 결합 부위(들)에서의 또는 그 근처의 핵산의 변형이 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형되게 하는 유전자 편집 시스템이 있다. Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 발현을 억제하는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 억제자의 또 다른 예로는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 mRNA와 혼성화되고 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 번역이 감소되게 하거나 제거되게 하는 것이 가능한 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)가 있다. Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 억제자는 또한 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 발현을 억제하는 분자를 코딩하는 핵산(예를 들어, 항-Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 shRNA 또는 siRNA를 코딩하는 핵산, 또는 항-Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 유전자 편집 시스템의 하나 이상의, 예를 들어, 전부의 구성요소를 코딩하는 핵산)을 포함한다. Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 기능을 억제하는 분자의 일례로는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 하나 이상의 활성을 억제하는 분자, 예를 들어 단백질 또는 소분자가 있다. 일례로는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 소분자 억제자가 있다. 또 다른 예로는 우성적 네거티브 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 단백질이 있다. 또 다른 예로는 우성적 네거티브 버전의 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 결합 파트너, 예를 들어, 회합된 히스톤 데아세틸라아제(HDAC)가 있다. 또 다른 예로는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 결합 파트너를 억제하는 분자, 예를 들어, 소분자, 예를 들어, Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2-회합 HDAC 억제자가 있다. Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 억제자는 또한 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 기능의 억제자를 코딩하는 핵산을 포함한다.
용어 "IFNG 억제자" 및 "IFN-γ 억제자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, IFN-γ의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거하는 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. IFN-γ 억제자는 모든 적합한 형태의 IFN-γ, IFN-γ 수용체(예를 들어, IFN-γ 수용체 1 및/또는 IFN-γ 수용체 2), 또는 IFN-γ 이펙터(예를 들어, TNFSF14, TNFRSF3, TNFRSF14, 또는 TNFRSF6B)의 모든 길항제 또는 억제자를 포함한다. 예시적인 IFN-γ 억제자는 IFN-γ 유전자 또는 이의 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; IFN-γ 번역을 감소시키는 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA); 및 IFN-γ의 하나 이상의 활성을 억제하는 단백질, 펩티드, 또는 소분자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "NOTCH2 억제자"는 NOTCH2의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거하는 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. 예시적인 Notch2 억제자는 Notch2 유전자 또는 이의 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; NOTCH2 번역을 감소시키는 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA); 및 NOTCH2의 하나 이상의 활성을 억제하는 단백질, 펩티드, 또는 소분자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "IL2RA 억제자"는 IL2RA의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거하는 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. 예시적인 IL2RA 억제자의 예는 IL2RA 유전자 또는 이의 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; IL2RA 번역을 감소시키는 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA); 및 IL2RA의 하나 이상의 활성을 억제하는 단백질, 펩티드, 또는 소분자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "PRDM1 억제자"는 PRDM1의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거하는 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. 예시적인 PRDM1 억제자는 PRDM1 유전자 또는 이의 조절 요소를 표적화하는 유전자 편집 시스템; PRDM1 번역을 감소시키는 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA); 및 PRDM1의 하나 이상의 활성을 억제하는 단백질, 펩티드, 또는 소분자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "Tet2-관련 유전자"는 구조, 발현 및/또는 기능이 Tet2와 관련된(예를 들어, Tet2에 의해 영향을 받거나 조정되는) 유전자, 또는 구조, 발현 및/또는 기능이 Tet2와 관련된(예를 들어, Tet2에 의해 영향을 받거나 조정되는) 유전자 생성물(예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드)을 코딩하는 유전자를 지칭한다. Tet2-관련 유전자는 Tet2 유전자를 포함하지 않는다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의), 본원에 기술된 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 8에 기술된 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 9에 기술된 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개의, 또는 전부의) 유전자를 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 PRDM1을 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 NOTCH2를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IL2RA 및 PRDM1을 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 CD28을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, 및 ICOS를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, 및 PRDM1을 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, 및 IL2RA를 포함한다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, 및 ICOS를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, 및 IL2RA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 및 PRDM1을 포함한다.
특정 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능은 Tet2의 발현 및/또는 기능이 억제될 경우 변경된다. 일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능은 Tet2의 발현 및/또는 기능이 억제될 경우 감소되거나 제거된다. 다른 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능은 Tet2의 발현 및/또는 기능이 억제될 경우 증가되거나 활성화된다.
일부 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자 또는 유전자 생성물은 Tet2와 관련된(예를 들어, Tet2의 억제와 관련된) 생물학적 경로의 구성원이다. 특정 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자 또는 유전자 생성물은 상기 경로에서 Tet2의 하류에 있다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자 또는 유전자 생성물은 상기 경로에서 Tet2의 상류에 있다.
특정 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 Tet2(예를 들어, Tet2 유전자 또는 유전자 생성물)와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 유전자 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 코딩한다. 다른 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 Tet2(예를 들어, Tet2 유전자 또는 유전자 생성물)와 상호작용하지 않는 유전자 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 코딩한다.
본원에 사용된 "Tet2-관련 유전자"의 "조정자"는 Tet2-관련 유전자의 기능 및/또는 발현을 조정하는(예를 들어, 감소시키거나 제거하거나, 또는 증가시키거나 활성화시키는) 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거한다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 증가시키거나 활성화시킨다. 특정 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 억제자이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 활성자이다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 핵산을 표적화하여서, 예를 들어 상기 핵산이 Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정하도록 유전자 편집 시스템 결합 부위(들)에서 또는 그 근처에서 변형되게 하는 유전자 편집 시스템이다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 유전자 편집 시스템의 구성요소, 또는 유전자 편집 시스템의 구성요소를 코딩하는 핵산이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 mRNA와 혼성화되어, 예를 들어 Tet2-관련 유전자 생성물의 감소 또는 제거를 야기할 수 있는 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 상기 RNA 분자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 유전자 생성물, 또는 이 유전자 생성물을 코딩하는 핵산(예를 들어, Tet2-관련 유전자의 과다발현을 위한 것)이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정하는 소분자이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정하는 단백질이다. 예를 들어, 조정자는 Tet2-관련 유전자의 유전자 생성물의 변이체(예를 들어, 우성적 네거티브 변이체 또는 구성적 활성 변이체), 또는 결합 파트너일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 상기 단백질을 코딩하는 핵산이다. 조정자는 Tet2-관련 유전자의 전사 전에, 이와 함께, 또는 그 후에, 및/또는 Tet2-관련 유전자의 번역 전에, 이와 함께, 또는 그 후에, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정할(예를 들어, 억제하거나 활성화시킬) 수 있다.
본원에 사용된 "Tet2-관련 유전자"는 구조, 발현 및/또는 기능이 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)와 관련된(예를 들어, Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)에 의해 영향을 받거나 조정되는) 유전자, 또는 구조, 발현 및/또는 기능이 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)와 관련된(예를 들어, Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)에 의해 영향을 받거나 조정되는) 유전자 생성물(예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드)을 코딩하는 유전자를 지칭한다. Tet-관련 유전자는 Tet 유전자(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3 유전자)를 포함하지 않는다.
특정 실시 형태에서, Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능은 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)의 발현 및/또는 기능이 억제될 경우 변경된다. 일부 실시 형태에서, Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능은 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)의 발현 및/또는 기능이 억제될 경우 감소되거나 제거된다. 다른 실시 형태에서, Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능은 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)의 발현 및/또는 기능이 억제될 경우 증가되거나 활성화된다.
일부 실시 형태에서, Tet-관련 유전자 또는 유전자 생성물은 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)와 관련된(예를 들어, Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)의 억제와 관련된) 생물학적 경로의 구성원이다. 특정 실시 형태에서, Tet-관련 유전자 또는 유전자 생성물은 상기 경로에서 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)의 하류에 있다. 일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자 또는 유전자 생성물은 상기 경로에서 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)의 상류에 있다.
특정 실시 형태에서, Tet-관련 유전자는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)(예를 들어, Tet 유전자 또는 유전자 생성물)와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 유전자 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 코딩한다. 다른 실시 형태에서, Tet-관련 유전자는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3)(예를 들어, Tet 유전자 또는 유전자 생성물)와 상호작용하지 않는 유전자 생성물(예를 들어, 폴리펩티드)을 코딩한다.
본원에 사용된 "Tet-관련 유전자"의 "조정자"는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3과 관련된 유전자)의 기능 및/또는 발현을 조정하는(예를 들어, 감소시키거나 제거하거나, 또는 증가시키거나 활성화시키는) 분자, 또는 분자의 군(예를 들어, 시스템)을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거한다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 증가시키거나 활성화시킨다. 특정 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 억제자이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 활성자이다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 핵산을 표적화하여서, 예를 들어 상기 핵산이 Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정하도록 유전자 편집 시스템 결합 부위(들)에서 또는 그 근처에서 변형되게 하는 유전자 편집 시스템이다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 유전자 편집 시스템의 구성요소, 또는 유전자 편집 시스템의 구성요소를 코딩하는 핵산이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 mRNA와 혼성화되어, 예를 들어 Tet-관련 유전자 생성물의 감소 또는 제거를 야기할 수 있는 핵산 분자, 예를 들어, RNA 분자, 예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 상기 RNA 분자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 유전자 생성물, 또는 이 유전자 생성물을 코딩하는 핵산(예를 들어, Tet2-관련 유전자의 과다발현을 위한 것)이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정하는 소분자이다. 다른 실시 형태에서, 조정자는 Tet-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정하는 단백질이다. 예를 들어, 조정자는 Tet-관련 유전자의 유전자 생성물의 변이체(예를 들어, 우성적 네거티브 변이체 또는 구성적 활성 변이체), 또는 결합 파트너일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조정자는 상기 단백질을 코딩하는 핵산이다. 조정자는 Tet-관련 유전자의 전사 전에, 이와 함께, 또는 그 후에, 및/또는 Tet-관련 유전자의 번역 전에, 이와 함께, 또는 그 후에, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 조정할(예를 들어, 억제하거나 활성화시킬) 수 있다.
Tet 및/또는 Tet-관련 유전자, 예를 들어, Tet2 및/또는 Tet2-관련 유전자의 조정(예를 들어, 억제 또는 활성화) 또는 유전자 편집과 관련하여 본원에 사용된 용어 "시스템"은, 함께 작용하여 원하는 기능을 행하는 분자들, 예를 들어, 하나 이상의 분자들의 군을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유전자 편집 시스템"은 표적으로 하는 게놈 DNA의 부위에서 또는 그 근처에서 하나 이상의 핵산의 변경, 예를 들어 결실을 유도하고 초래하는 시스템, 예를 들어 하나 이상의 분자를 지칭한다. 유전자 편집 시스템은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 하기에 더 상세하게 기술된다.
Tet 및/또는 Tet-관련 분자, 예를 들어, Tet2 및/또는 Tet2-관련 분자와 관련하여 본원에 사용된 용어 "결합 파트너"는 Tet 및/또는 Tet-관련 유전자 생성물, 예를 들어, Tet2 및/또는 Tet2-관련 유전자 생성물과 상호작용하는, 예를 들어 이에 결합하는 분자, 예를 들어, 단백질을 지칭한다. 이론에 구애됨이 없이, Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2는 하나 이상의 HDAC 단백질에 결합하는 것으로 믿어진다. 이러한 HDAC 단백질은 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 결합 파트너의 예로 간주된다.
"우성적 네거티브" 유전자 생성물 또는 단백질은 또 다른 유전자 생성물 또는 단백질의 기능을 간섭하는 것이다. 영향을 받는 다른 유전자 생성물은 우성적 네거티브 단백질과 동일하거나 상이할 수 있다. 우성적 네거티브 유전자 생성물은 절두형인 것, 점 돌연변이를 갖는 전장 단백질 또는 이의 단편, 또는 전장 야생형 또는 돌연변이형 단백질 또는 이의 단편과 다른 단백질의 융합물을 비롯하여 많은 형태의 것일 수 있다. 관찰된 억제 수준은 매우 낮을 수 있다. 예를 들어, 이것은 효과를 보기 위하여 과정에 관여하는 기능성 단백질(들)과 비교하여 많은 과량의 우성적 네거티브 단백질을 필요로 할 수 있다. 보통의 생물학적 분석 조건 하에서는 효과를 보는 것이 어려울 수 있다. 일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자 생성물(예를 들어, Tet2-관련 유전자 생성물)의 우성적 네거티브 변이체는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 변이체에 의해 코딩되는 촉매적 불활성 유전자 생성물이다. 또 다른 실시 형태에서, Tet-관련 유전자 생성물(예를 들어, Tet2-관련 유전자 생성물)의 우성적 네거티브 결합 파트너는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 변이체에 의해 코딩되는 촉매적 불활성 유전자 생성물이다. 일 실시 형태에서, 우성적 네거티브 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2는 촉매적 불활성 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2이다. 또 다른 실시 형태에서, 우성적 네거티브 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2 결합 파트너는 촉매적 불활성 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2-결합 HDAC 억제자이다.
이론에 구애되고자 함이 없이, "중심 기억 T 세포(Tcm) 표현형"을 갖는 세포는 CCR7 및 CD45RO를 발현한다. 일 실시 형태에서, 중심 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포는 나이브 T 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 CD45RA를 발현하거나 CD45RA를 발현하지 않고/않거나, CCR7 및 CD45RO를 발현한다. 일 실시 형태에서, 중심 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포는 나이브 T 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 CD45RA를 발현하거나 CD45RA를 발현하지 않고/않거나, CD45RO 및 CD62L을 발현한다. 일 실시 형태에서, 중심 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포는 나이브 T 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 CD45RA를 발현하거나 CD45RA를 발현하지 않고/않거나, CCR7, CD45RO, 및 CD62L을 발현한다.
이론에 구애되고자 함이 없이, "이펙터 기억 T 세포(Tem) 표현형"을 갖는 세포는 나이브 T 세포와 비교하여 더 높은 수준의 CD45RO를 발현하고, 더 낮은 수준의 CCR7을 발현하거나 CCR7을 발현하지 않는다.
본원에 기술된 경로는 예를 들어 Gene Ontology Consortium(예를 들어, Biological Process Ontology) 및/또는 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)(예를 들어, Hallmark 또는 Canonical pathway gene sets)에 설명되어 있다.
Biological Process Ontology는 예를 들어 문헌[Ashburner et al. Gene ontology: tool for the unification of biology (2000) Nat Genet 25(1):25-9]; 문헌[The Gene Ontology Consortium. Gene Ontology Consortium: going forward. (2015) Nucl Acids Res 43 Database issue D1049-D1056]에 기술되어 있다. Hallmark gene sets 및 Canonical pathway gene sets는 문헌[Tamayo, et al. (2005) PNAS 102, 15545-15550]; 문헌[Mootha, Lindgren, et al. (2003) Nat Genet 34, 267-273]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "백혈구 분화 경로"는 상대적으로 분화되지 않은 조혈 전구 세포가 백혈구의 특화된 특징을 획득하는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0002521로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "면역계 과정의 양성 조절 경로"는 면역계 과정의 빈도, 속도 또는 정도를 활성화시키거나 증가시키는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0002684로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "막관통 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호전달 경로"는 세포외 리간드가 세포-표면 수용체에 결합함으로써 시작되는 신호전달 경로(여기서, 세포-표면 수용체는 티로신 키나아제 활성을 보유함), 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0007169로 분류된 하나 이상의 경로를 지칭한다.
본원에 사용된 "해부 구조 형태 형성의 조절 경로"는 해부 구조 형태 형성의 빈도, 속도 또는 정도를 조정하는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0022603으로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "NFKB를 통한 TNFA 신호전달 경로"는 TNF에 반응하여 NFκB에 의해 조절되는 과정, 예를 들어 Hallmark gene sets(GSEA)에서 M5890으로 분류되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "히드롤라아제 활성의 양성 조절 경로"는 히드롤라아제 활성의 빈도, 속도, 및/또는 정도를 활성화시키거나 증가시키는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0051345로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "창상 치유 경로"는 상해 후 손상 조직에 대하여 무결성(integrity)(예를 들어, 부분 또는 완전 무결성)을 회복시키는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0042060으로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "알파-베타 T 세포 활성화 경로"는 예를 들어, 미토겐, 사이토카인, 케모카인, 세포 리간드, 또는 항원(이에 대하여 αβ T 세포가 특이적임)에의 노출에 의해 생기는 αβ T 세포의 형태 및/또는 거동의 변화를 포함하는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0046631로 분류된 하나 이상의 변화를 지칭한다.
본원에 사용된 "세포 구성요소 이동 조절 경로"는 세포 구성요소의 이동의 빈도, 속도, 및/또는 정도를 조정하는 경로, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0051270로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "염증 반응 경로"는 화학적 또는 물리적 에이전트에 의해 야기되는 감염 또는 상해에 대한, 예를 들어 척추동물 조직에 의한 방어 작용(예를 들어, 즉각적인 방어 작용), 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0006954로 분류되는 하나 이상의 반응을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 이 과정은 국소적 혈관확장, 혈장의 세포간 공간 내로의 유출, 및/또는 백혈구 세포 및 대식세포의 축적을 특징으로 한다.
본원에 사용된 "골수성 세포 분화 경로"는 상대적으로 분화되지 않은 골수성 전구 세포가 골수성 백혈구, 거핵구, 혈소판, 또는 백혈구 계통의 임의의 세포의 특화된 특징을 획득하는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0030099로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "사이토카인 생성 경로"는 사이토카인이 세포 자극 후 합성되거나 분비되어 그의 세포내 또는 세포외 수준이 증가하게 되는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0001816으로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "UV 반응 하향조절 경로"는 자외(UV) 방사선에 반응하여 하향조절되는 유전자, 예를 들어 Hallmark gene sets에서 M5942로 분류된 하나 이상의 유전자를 포함하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "다세포 유기체 과정의 음성 조절 경로"는 유기체 과정(세포 수준보다 더 높은 유기체의 기능과 관련된 과정)(예를 들어, 조직과 기관의 통합된 과정)의 빈도, 속도 및/또는 정도를 중지시키거나, 방지하거나, 감소시키는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0051241로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "혈관 형태 형성 경로"는 혈관의 해부 구조가 생성되고 조직되는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0048514로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에서 사용된 "NFAT-의존성 전사 경로"는 림프구에서 칼시뉴린-조절 NFAT-의존성 전사에 관여하는 유전자, 예를 들어 Canonical pathway gene sets에서 M60으로 분류된 하나 이상의 유전자와 관련된 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "아폽토시스 과정의 양성 조절의 경로"는 아폽토시스의 빈도, 속도, 및/또는 정도를 활성화시키거나 증가시키는 과정, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0043065로 분류된 하나 이상의 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "저산소증 경로"는 저산소증에 반응하여 상향조절되는 유전자, 예를 들어 Hallmark gene sets에서 M5891로 분류된 하나 이상의 유전자를 포함하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "KRAS 신호전달에 의한 상향조절의 경로"는 KRAS 활성화에 의해 상향조절되는 유전자, 예를 들어 Hallmark gene sets에서 M5953으로 분류된 하나 이상의 유전자를 포함하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "스트레스-활성화 단백질 키나아제 신호전달 캐스케이드 경로"는 스트레스-활성화 단백질 키나아제(SAPK) 캐스케이드가 신호들 중 하나 이상을 전하는 신호전달 경로, 예를 들어 Biological Process Ontology에서 GO:0031098로 분류된 하나 이상의 신호전달 경로를 지칭한다.
설명
본 발명은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자), 및 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3), 예를 들어, Tet2의 억제자, 및 그에 따른 사용 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 유전자의 억제자를 포함하는 CAR-발현 T 세포, 및 CAR T 세포와 관련된 상기 하나 이상의 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 억제자는, 그의 사용 방법과 함께, 하기에 더 상세하게 기술된다. CAR, CAR T 세포, 및 사용 방법이 하기에 추가로 기술된다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 특정 실시 형태에서, 하나 이상의 Tet-관련(예를 들어, Tet2-관련) 유전자의 발현 및/또는 기능이 조정된 세포는 T-세포 분화의 변경과 일치하는 후성유전학적 프로파일의 획득 및 DNA 히드록시메틸화 감소를 나타낼 수 있다고 믿어진다. 예를 들어, 하나 이상의 Tet-관련(예를 들어, Tet2-관련) 유전자의 발현 및/또는 기능이 조정된 CAR T-세포는 후기 기억 분화의 특성과는 상이할 수 있는 초기 기억 표현형을 나타낼 수 있다. 따라서, 특정 실시 형태에서, TET(예를 들어, TET2) 경로에서의 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 기능의 조정은 T-세포 증식을 촉진할 수 있고, 따라서 유전적-방향수정 T-세포를 이용한 치료를 증진시킬 수 있다.
Tet 및 Tet-관련 유전자의 조정자
본 발명은 예를 들어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자)의 조정자, 및 선택적으로 Tet(Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 억제자를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 다른 수단을 이용하여 면역 이펙터 세포 기능, 예를 들어 CAR-발현 세포 기능을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 기술 분야에 공지된 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자)의 임의의 조정자, 및 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 임의의 억제자가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자)의 조정자의 예, 및 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 예시적인 억제자가 하기에 기술되어 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의한 임의의 Tet2-관련 유전자의 조정은 단일 대립유전자성 또는 이중 대립유전자성일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 조정은 이중 대립유전자성(예를 들어, 2개의 조정된 대립유전자)이다. 다른 실시 형태에서, 상기 조정은 단일 대립유전자성(예를 들어, 하나의 조정된 대립유전자 및 하나의 야생형 대립유전자)이다.
유전자 편집 시스템
본 발명에 따르면, 유전자 편집 시스템은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자)의 조정자 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 억제자로 사용될 수 있다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)를 표적화하는 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 핵산의 용도가 또한 본 발명에 의해 고려된다.
일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택되는 하나 이상의(2개, 3개, 4개, 5개의, 또는 전부의) 유전자이다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 8로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 조합 또는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자이다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 조합 또는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자이다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 조합 또는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 경로와 관련된 하나 이상의(예를 들어, 조합 또는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자이다. 일 실시 형태에서, Tet2-관련 유전자는 중심 기억 T 세포 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자이다.
CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템
자연-발생 CRISPR/Cas 시스템은 대략적으로 서열결정 진정세균 게놈의 40% 및 서열결정 고세균의 90%에서 발견된다. 문헌[Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172]. 이러한 시스템은 외래 유전 요소, 예컨대 플라스미드 및 파지에 저항성을 부여하는 원핵 면역계의 유형이고, 후천성 면역 형태를 제공한다. 문헌[Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712]; 문헌[Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845].
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물, 예컨대 마우스 또는 영장류에서의 유전자 편집(특정 유전자를 침묵, 증진 또는 변화시키는 것)에 사용하기 위해 변형된 바 있다. 문헌[Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8]. 이는 예를 들어 특이적으로 설계된 CRISPR 및 하나 이상의 적절한 Cas를 함유하는 플라스미드를 진핵 세포 내로 도입함으로써 달성된다.
때때로 CRISPR 유전자좌로 불리는 CRISPR 서열은 교대 반복체 및 스페이서를 포함한다. 자연-발생 CRISPR에서, 스페이서는 대개 박테리아에 대하여 외래인 서열, 예컨대 플라스미드 또는 파지 서열을 포함하며; Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)를 표적화하는 예시적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 유전자 서열, 또는 그의 조절 요소의 서열로부터 유래된다.
CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 구성적으로 발현되고, 작은 RNA로 프로세싱된다. 이들은 반복 서열이 측면에 존재하는 스페이서를 포함한다. RNA는 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전 요소를 침묵시키도록 다른 Cas 단백질을 이끈다. 문헌[Horvath et al. (2010) Science 327:167-170]; 문헌[Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7]. 이에 따라, 스페이서는 siRNA와 유사하게 RNA 분자를 위한 주형으로서의 역할을 한다. 문헌[Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
이들은 많은 상이한 유형의 박테리아에서 자연 발생하기 때문에, CRISPR의 정확한 배열 및 Cas 유전자 및 그의 생성물의 구조, 기능, 및 수는 종마다 다소 상이하다. 문헌[Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60]; 문헌[Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61]; 문헌[Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182]; 문헌[Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561]; 문헌[Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663]; 및 문헌[Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340]. 예를 들어 Cse(Cas 하위유형, 이. 콜라이(E. coli)) 단백질(예를 들어 CasA)은 기능성 복합체인 Cascade를 형성하는데, 이는 CRISPR RNA 전사체를 상기 Cascade가 보유하는 스페이서-반복체 단위로 프로세싱한다. 문헌[Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964]. 다른 원핵생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 이. 콜라이에서의 CRISPR-기반 파지 불활성화는 Cascade 및 Cas3을 필요로 하지만, Cas1 또는 Cas2는 필요로 하지 않는다. 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 및 다른 원핵생물에서 Cmr(Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보성 표적 RNA들을 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA와 기능성 복합체를 형성한다. 보다 단순한 CRISPR 시스템은 이중 나선의 각각의 가닥에 대해 1개씩, 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제인 단백질 Cas9에 의존한다. Cas9 및 변형된 CRISPR 유전자좌 RNA의 조합이 유전자 편집을 위한 시스템에서 사용될 수 있다. 문헌[Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
따라서 CRISPR/Cas 시스템은 하나 이상의 핵산, 예를 들어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2), 또는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 유전자 조절 요소를 조정하는 데, 예를 들어 결실시키는 데 사용되거나, 또는 조기 종결을 도입하는(따라서 이는 기능성 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 발현을 감소시킴) 데 사용될 수 있다. 대안적으로 CRISPR/Cas 시스템은 RNA 간섭과 같이 사용되어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)를 가역적 방식으로 턴오프(turn off)할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서, RNA는 Cas 단백질을 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2)의 프로모터로 인도하여, RNA 폴리머라아제를 입체적으로 차단할 수 있다.
진핵 세포에서의 유전자 편집을 위한 CRISPR/Cas 시스템은 전형적으로 (1) 표적화 서열(이는 게놈 DNA 표적 서열에 혼성화될 수 있음), 및 Cas, 예를 들어, Cas9 효소에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 가이드 RNA 분자(gRNA), 및 (2) Cas, 예를 들어, Cas9 단백질을 포함한다. 상기 표적화 서열 및 Cas, 예를 들어, Cas9 효소에 결합할 수 있는 서열은 동일 분자 또는 상이한 분자 상에 배치될 수 있다. 상이한 분자 상에 배치될 경우, 각각은 분자들이 예를 들어 혼성화를 통하여 회합되게 하는 혼성화 도메인을 포함한다.
본 발명의 예시적인 gRNA 분자는 다음 서열:
Figure pct00030
(서열 번호 40)(여기서, "n"은 표적화 서열(예를 들어, 본원에, 예를 들어 표 3에 기술된 바와 같음)의 잔기를 지칭하며, 15~25개 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 예를 들어 20개 뉴클레오티드로 이루어질 수 있음)을 갖는 제1 핵산;
및 다음 서열:
Figure pct00031
Figure pct00032
(선택적으로, 3’ 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의(예를 들어, 4개 또는 7개, 예를 들어, 7개의) 추가 U 뉴클레오티드를 포함함)(서열 번호 41)을 포함하며, 예를 들어 상기 제1 핵산 및 상기 제2 핵산으로 이루어진다.
상기 제2 핵산 분자는 대안적으로 상기 서열의 단편으로 이루어지며, 여기서, 이러한 단편은 제1 핵산에 혼성화될 수 있다. 이러한 제2 핵산 분자의 예로는 다음이 있다:
Figure pct00033
Figure pct00034
(선택적으로, 3’ 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의(예를 들어, 4개 또는 7개, 예를 들어, 7개의) 추가 U 뉴클레오티드를 포함함)(서열 번호 42).
본 발명의 또 다른 예시적인 gRNA 분자는 다음 서열(여기서, "n"은 표적화 서열(예를 들어, 본원에, 예를 들어 표 3에 기술된 바와 같음)의 잔기를 지칭하며, 15~25개 뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 예를 들어 20개 뉴클레오티드로 이루어질 수 있음)을 갖는 제1 핵산을 포함하며, 예를 들어 이로 이루어진다:
Figure pct00035
Figure pct00036
(서열 번호 43)(선택적으로, 3’ 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의(예를 들어, 4개 또는 7개, 예를 들어, 4개의) 추가 U 뉴클레오티드를 포함함). Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템이 본 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있는데, 이들은 예를 들어 미국 특허 공개 제20140068797호, 국제 공개 제2015/048577호, 및 문헌[Cong (2013) Science 339: 819-823]에 기술되어 있다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 억제하는, 본 기술 분야에 공지된 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템이 또한 생성될 수 있는데, 이는 예를 들어, 문헌[Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 미국 특허 제8,871,445호; 미국 특허 제8,865,406호; 미국 특허 제8,795,965호; 미국 특허 제8,771,945호; 및 미국 특허 제8,697,359호(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 억제하는 이러한 시스템은, 예를 들어, 표적 유전자, 예를 들어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 서열에 혼성화되는 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함하도록 CRISPR/Cas 시스템을 조작함으로써 생성될 수 있다. 실시 형태들에서, gRNA는 표적 유전자, 예를 들어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 15~25개 뉴클레오티드, 예를 들어 20개 뉴클레오티드에 대하여 완전 상보성인 표적화 서열을 포함한다. 실시 형태들에서, 표적 유전자, 예를 들어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 상기 15~25개 뉴클레오티드, 예를 들어, 20개 뉴클레오티드는, CRISPR/Cas 시스템의 Cas 단백질에 의해 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif; PAM) 서열의 5’ 부근에 배치된다(예를 들어, 상기 시스템이 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질을 포함하는 경우, PAM 서열은 NGG(여기서, N은 A, T, G 또는 C 중 임의의 것일 수 있음)를 포함한다). 실시 형태들에서, gRNA의 표적화 서열은 표 2에 열거된 서열에 대하여 상보성인 RNA 서열을 포함하며, 예를 들어 이로 이루어진다. 실시 형태들에서, gRNA는 표 3에 열거된 표적화 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 외래 DNA가 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, CRISPR/Cas 시스템, 예를 들어, CAR 코딩 DNA와 함께 세포 내로 도입될 수 있으며; 염색체 서열 및 외래 DNA의 서열에 따라, 이 과정은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 CAR 코딩 DNA를 CRISPR/Cas 시스템이 표적화하는 부위에 또는 그 근처에 통합시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 실시예에서, 그러나 이론에 구애됨이 없이, 이러한 통합은 CAR의 발현과, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 파괴를 초래할 수 있다. 이러한 외래 DNA 분자는 본원에서 "주형 DNA"로 지칭된다실시 형태들에서, 주형 DNA는 관심있는 분자(들)를 코딩하는(예를 들어, 본원에 기술된 CAR을 코딩하는) 주형 DNA의 핵산의 5’에, 3’에, 또는 5’ 및 3’ 둘 다에 상동성 아암(arm)을 추가로 포함하며, 여기서, 상기 상동성 아암은 표적 서열의 측면에 위치하는 게놈 DNA 서열에 대하여 상보성이다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 Cas9, 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9, 및 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 서열에 혼성화되는 표적화 서열을 포함하는 gRNA를 포함한다. 일 실시 형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자에 특이적인 gRNA를 코딩하는 핵산, 및 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9, 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일 실시 형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자에 특이적인 gRNA, 및 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9, 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 코딩하는 핵산을 포함한다.
Tet2에 대한 게놈 표적 서열(이에 대하여, 본 발명에서 사용하기 위한 상보성 표적화 서열을 포함하는 gRNA가 생성될 수 있음)의 예는 하기 표 2에 열거되어 있다. 실시 형태들에서, gRNA는 하기 표의 표적 서열의 RNA 상보체를 포함한다(예를 들어, sgTET2_1에 있어서, gRNA는
Figure pct00037
(서열 번호 44)를 포함할 것이다). 실시 형태들에서, gRNA는 하기 표 2의 표적 서열의 RNA 유사체를 포함한다(예를 들어, sgTET2_1에 있어서, gRNA는
Figure pct00038
(서열 번호 45)를 포함할 것이다). 실시 형태들에서, Tet2 억제자는 Tet2에 특이적인 gRNA 분자를 코딩하는 핵산이며, 여기서, 상기 핵산은, 예를 들어, U6- 또는 H1- 프로모터의 제어 하의, 하기 표 2로부터의 표적 서열의 서열을 포함한다:
[표 2]
Figure pct00039
Tet, 예를 들어, Tet2를 억제하기 위한 본 발명의 다양한 실시 형태에서 유용한 gRNA 표적화 서열의 예가 하기 표 3에 제공되어 있다. 실시 형태들에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표 3에 열거된 서열을 포함하는 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함한다. 실시 형태들에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표 3에 열거된 서열인 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함한다.
[표 3]
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TALEN 유전자 편집 시스템
TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생성된다. TALE(Transcription activator-like effect)는 HLA 또는 TCR 유전자의 부분을 포함하는 임의의 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, HLA 또는 TCR 서열을 포함하는 임의의 원하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생성될 수 있다. 이어서, 이들은 세포 내로 도입될 수 있고, 여기서 이들은 게놈 편집에 사용될 수 있다. 문헌[Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6]; 및 문헌[Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12]; 문헌[Moscou et al. (2009) Science 326: 3501].
TALE는 잔토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 제12 및 제13 아미노산을 제외하고, 반복된, 고도로 보존된 33~34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 보여준다. 따라서, 이들은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생성하기 위해, TALE 단백질은 예를 들어 야생형 또는 돌연변이된 FokI 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제(N)에 융합된다. TALEN에서의 사용을 위해 FokI에 대한 몇몇의 돌연변이가 이루어진 바 있고; 상기 돌연변이는 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. 문헌[Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82]; 문헌[Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8]; 문헌[Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734]; 문헌[Wood et al. (2011) Science 333: 307]; 문헌[Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79]; 문헌[Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793]; 및 문헌[Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96].
FokI 도메인은 이량체로서 기능을 하여서, 적당한 배향 및 이격으로 표적 게놈 내의 부위에 대해 특유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구축물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 상기 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 다는 높은 활성 수준의 달성에 중요한 파라미터인 것으로 보인다. 문헌[Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8].
Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자에 특이적인 TALEN은 세포 내부에서 사용되어 이중-가닥 파단(Double-Stranded break; DSB)을 생성할 수 있다. 돌연변이는 복구 메커니즘이 비-상동 말단 연결을 통해 상기 파단을 부적절하게 복구하는 경우에 파단 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어 부적절한 복구는 프레임 이동 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA가 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, TALEN, 예를 들어 CAR 코딩 DNA와 함께 세포 내로 도입될 수 있으며; 염색체 서열 및 외래 DNA의 서열에 따라, 이 과정은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 CAR 코딩 DNA를 TALEN이 표적화하는 부위에 또는 그 근처에 통합시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 실시예에서, 그러나 이론에 구애됨이 없이, 이러한 통합은 CAR의 발현과, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 파괴를 초래할 수 있다. 이러한 외래 DNA 분자는 본원에서 "주형 DNA"로 지칭된다실시 형태들에서, 주형 DNA는 관심있는 분자(들)를 코딩하는(예를 들어, 본원에 기술된 CAR을 코딩하는) 주형 DNA의 핵산의 5’에, 3’에, 또는 5’ 및 3’ 둘 다에 상동성 아암(arm)을 추가로 포함하며, 여기서, 상기 상동성 아암은 표적 서열의 측면에 위치하는 게놈 DNA에 대하여 상보성이다.
Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자에서의 서열들에 특이적인 TALEN들은 모듈형 구성요소를 이용한 다양한 스킴을 비롯하여 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 문헌[Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53]; 문헌[Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509]; 미국 특허 제8,420,782호; 미국 특허 제8,470,973호(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
징크 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "징크 핑거 뉴클레아제"는 원하는 핵산 서열, 예를 들어 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 하나 이상의 핵산을 변형시키는 데, 예를 들어, 결실시키는 데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 징크 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 FokI 뉴클레아제 도메인(또는 이의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거를 포함한다. 문헌[Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782]; 및 문헌[Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160].
징크 핑거는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 징크 핑거는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 징크 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 비롯하여, 특정 서열을 인식하는 징크 핑거(및 이의 조합)를 생성하기 위한 다양한 선택 및 모듈 어셈블리 기술이 이용가능하다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화되어야 한다. 따라서, 한 쌍의 ZFN이 비-팔린드롬(palindromic) DNA 부위를 표적화하는 데 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 DNA의 반대되는 가닥들에 결합해야 하고, 이때 이들의 뉴클레아제는 적절하게 이격된다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5].
또한, TALEN처럼, ZFN은 DNA에 이중-가닥 파단을 생성할 수 있는데, 이것은 부적절하게 복구되는 경우에 프레임-이동 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 세포에서의 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현의 감소로 이어질 수 있다. ZFN은 또한 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 돌연변이시키기 위한, 또는 CAR 코딩 핵산을 상기 표적화된 서열에서의 부위 또는 그 근처의 부위에 도입하기 위한 상동 재조합과 함께 사용될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, CAR을 코딩하는 핵산은 주형 DNA의 일부로서 도입될 수 있다. 실시 형태들에서, 주형 DNA는 관심있는 분자(들)를 코딩하는(예를 들어, 본원에 기술된 CAR을 코딩하는) 주형 DNA의 핵산의 5’에, 3’에, 또는 5’ 및 3’ 둘 다에 상동성 아암을 추가로 포함하며, 여기서, 상기 상동성 아암은 표적 서열의 측면에 위치하는 게놈 DNA 서열에 대하여 상보성이다.
Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자에서의 서열들에 특이적인 ZFN들은 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815]; 문헌[Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349]; 문헌[Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7]; 및 문헌[Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96]; 미국 특허 공개 제2011/0158957호; 및 미국 특허 공개 제2012/0060230호(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. 실시 형태들에서, ZFN 유전자 편집 시스템은 또한 ZFN 유전자 편집 시스템, 예를 들어, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자에 표적화된 ZFN 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 표적화하는 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템)의 사용은, 예를 들어, 절두형 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 절두형 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현으로 이어지는 편집 이벤트를 야기함으로써, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 하나 이상의 기능을 조절하게(예를 들어, 억제하게) 할 수 있다고 믿어진다. 또한, 이론에 구애됨이 없이, 이러한 절두형 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 생성물 및/또는 절두형 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 생성물은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 생성물 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 생성물의 하나 이상의 기능(예를 들어, 스캐폴딩 기능)을 보존할 수 있는 한편, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 생성물 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 생성물의 하나 이상의 다른 기능(예를 들어, 촉매 기능)은 억제하며, 따라서, 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 후기 엑손 또는 인트론을 표적화하는 유전자 편집 시스템이 특히 바람직할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 후기 엑손 또는 인트론을 표적화한다. 일 양태에서, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 엑손 8의 하류의 엑손 또는 인트론을 표적화한다. 일 양태에서, 유전자 편집 시스템은 Tet2 유전자의 엑손 8 또는 엑손 9, 예를 들어, 엑손 9를 표적화한다.
이론에 구애됨이 없이, 다른 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 초기 엑손 또는 인트론을 표적화하는 것, 예를 들어, 표적화된 유전자 내에 조기 종결 코돈을 도입하는 것(이는 유전자 생성물의 비발현, 또는 완전히 비-기능적인 유전자 생성물의 발현으로 이어짐)이 또한 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 초기 엑손 또는 인트론을 표적화하는 유전자 편집 시스템이 특히 바람직할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 초기 엑손 또는 인트론을 표적화한다. 일 양태에서, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 엑손 4의 상류의 엑손 또는 인트론을 표적화한다. 실시 형태들에서, 유전자 편집 시스템은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3, 예를 들어, 엑손 3을 표적화한다.
이론에 구애됨이 없이, 다른 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 서열을 표적화하는 것이 또한 바람직할 수 있는데, 이는 상기 유전자의 하나 이상의 이소형에 대해서는 특이적이지만, 상기 유전자의 하나 이상의 다른 이소형에는 영향을 주지 않는다. 실시 형태들에서, 촉매 도메인을 포함하는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 이소형을 특이적으로 표적화하는 것이 바람직할 수 있다.
이중-가닥 RNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA 조정자
본 발명에 따르면, 이중 가닥 RNA("dsRNA"), 예를 들어, siRNA 또는 shRNA가 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자)로서 사용될 수 있다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 상기 dsRNA 조정자(예를 들어, 억제자)를 코딩하는 핵산의 용도가 또한 본 발명에 의해 고려된다.
일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자)는 핵산, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA(Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 또는 유전자 생성물 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 또는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산, 예를 들어, Tet-관련 유전자 생성물(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 생성물을 코딩하는 게놈 DNA 또는 mRNA에 특이적임)이다.
본 발명의 일 양태는 핵산 서열(예를 들어, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 생성물 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 생성물을 코딩하는 게놈 DNA 또는 mRNA), Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 서열에 대하여 상보성인(예를 들어, 100% 상보성인) 적어도 15개의 연접 뉴클레오티드, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연접 뉴클레오티드, 예를 들어, 21개의 연접 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 실시 형태들에서, 상기 적어도 15개의 연접 뉴클레오티드, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연접 뉴클레오티드, 예를 들어, 21개의 연접 뉴클레오티드는, 표 4에 열거된 Tet2 shRNA를 코딩하는 핵산 또는 shRNA의 표적 서열의 연접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부의 표적 서열 및/또는 shRNA 분자는 DNA로서 제공되지만, 이러한 서열들을 표적화하거나 이러한 서열들을 포함하는 dsRNA 에이전트는 RNA, 또는 본원에 개시되고/되거나 본 기술 분야에 공지된 임의의 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 치환물일 수 있되, 단, 이 분자는 여전히 RNA 간섭을 매개할 수 있음이 이해된다.
일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자가 CAR-발현 세포 내에서 발현되도록, 프로모터, 예를 들어, H1- 또는 U6-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 문헌[TiscorniaG.,"Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA", Chapter 3, Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007]; 문헌[Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553]; 문헌[Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500]을 참조한다. 일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는, CAR의 구성요소, 예를 들어 모든 구성요소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 동일 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 존재한다. 이러한 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 구성요소, 예를 들어 모든 구성요소를 코딩하는 핵산에 대하여 5’- 또는 3’-로 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 위치한다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 구성요소, 예를 들어 모든 구성요소를 코딩하는 핵산과 동일하거나 상이한 방향으로 전사될 수 있다. 일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는, CAR의 구성요소, 예를 들어 모든 구성요소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 이외의 벡터 상에 존재한다. 일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 일 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
shRNA 서열을 코딩하는 핵산 서열의 예가 하기에 제공된다. 표적 서열은 Tet2 게놈 DNA(또는 주위 DNA) 내의 서열을 지칭한다. Tet2 shRNA를 코딩하는 핵산은 본 발명에 유용한 shRNA 분자를 코딩한다. 실시 형태들에서, Tet2 억제자는 하기에 열거된 표적 서열에 특이적이거나, 그의 mRNA 상보체에 특이적인 siRNA 또는 shRNA이다. 실시 형태들에서, Tet2 억제자는 하기 표 4의 Tet2 shRNA를 코딩하는 핵산에 의해 코딩되는 shRNA이다. 실시 형태들에서, Tet2 억제자는 하기 표 4의 Tet2 shRNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산인데, 이는 예를 들어 Tet2 shRNA가 생성되도록 하는 U6 또는 H1 프로모터의 제어 하에 있다. 실시 형태들에서, 본 발명은 shRNA의 표적 서열, 예를 들어, 표 4의 shRNA 중 임의의 것의 shRNA의 표적 서열의 RNA 유사체(즉, 모든 T 핵산 잔기가 U 핵산 잔기로 대체된 것)인 서열을 포함하는 siRNA 또는 shRNA를 제공한다.
[표 4]
Figure pct00090
Figure pct00091
Tet2의 추가의 dsRNA 억제자, 예를 들어, shRNA 및 siRNA 분자는 본원에 기술된 바와 같은 그리고 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 설계되고 테스트될 수 있다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 서열 번호 1358의 서열을 표적화한다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 서열 번호 1359의 서열을 표적화한다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 서열 번호 1360의 서열을 표적화한다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 서열 번호 1361의 서열을 표적화한다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 서열 번호 1362의 서열을 표적화한다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 서열 번호 1363의 서열을 표적화한다. 실시 형태들에서, dsRNA Tet2 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA는 Tet2를 코딩하는 mRNA의 서열을 표적화한다.
일부 실시 형태에서, dsRNA 억제자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자이다. 예를 들어, PRDM1의 예시적인 dsRNA 억제자, 예를 들어, shRNA 및 siRNA 분자는 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2013/070563호에 기술된 바와 같다.
실시 형태들에서, 상기 억제자는 상기 실시 형태 중 임의의 것의, dsRNA 억제자, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA를 코딩하는 핵산, 예를 들어, DNA이다. 실시 형태들에서, 본 핵산, 예를 들어, DNA는 벡터, 예를 들어, 임의의 통상적인 발현 시스템(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음), 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 상에 배치된다.
이론에 구애됨이 없이, dsRNA 억제자(예를 들어, siRNA 또는 shRNA)는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 mRNA의 서열을 표적화하는데, 이는 상기 유전자의 하나 이상의 이소형에는 특이적이지만 상기 유전자의 하나 이상의 다른 이소형에는 영향을 주지 않는다(예를 들어, 상기 유전자의 하나 이상의 이소형에는 존재하지만 상기 유전자의 하나 이상의 다른 이소형에는 존재하지 않는 도메인을 표적화하거나, 독특한 스플라이스 접합부를 표적화하기 때문임). 실시 형태들에서, 촉매 도메인을 포함하는 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 이소형을 특이적으로 표적화하는 것이 바람직할 수 있다.
소분자
일부 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자는 소분자이다. 예시적인 소분자 조정자(예를 들어, 억제자)가 하기에 기술되어 있다.
IFN-γ 억제자
실시 형태들에서, IFN-γ 억제자는 IFN-γ의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 소분자이다. 하나의 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 IFN-γ의 합성을 억제하거나 감소시키는 소분자, 예를 들어, 비스 페놀 또는 페녹시 화합물, 또는 이들의 유도체이다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,880,146호를 참조한다. 또 다른 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 IFN-γ 유도 인자(IGIF)의 생성을 감소시키거나 인터류킨-1β 전환 효소(ICE)를 억제함으로써 IFN-γ를 억제하는 소분자이다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,985,863호를 참조한다.
NOTCH2 억제자
실시 형태들에서, NOTCH2 억제자는 Notch2의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 소분자이다.
하나의 예에서, 본 발명에 따른 NOTCH2 억제자는 글리오톡신 또는 이의 유도체(예를 들어, 아세틸글리오톡신, 6-C1-3-알콕시글리오톡신, 6-C2-3-아실옥시-글리오톡신, 6-디히드로-글리오톡신, 6-디히드록시-글리오톡신, 6-[(메톡시카르보닐)메톡시]-글리오톡신 또는 6-시아노메톡시-글리오톡신, 또는 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택됨)이다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,981,878호를 참조한다.
하나의 예에서, 본 발명에 따른 NOTCH2 억제자는 6-4[-(tert부틸)-페녹시] 피리딘-3-아민, 또는 이의 유도체이며, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제9,296,682호를 참조한다.
하나의 예에서, 본 발명에 따른 NOTCH2 억제자는 γ-세크레타아제 억제자, 예를 들어, MK-0752(Merck & Co.), RO4929097(Roche), 세마가세스타트(semagacestat)(LY-450139; Eli Lilly & Co.), 아바가세스타트(avagacestat)(BMS-708163; Bristol-Myers Squib), DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로페닐아세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르), L685,458, 화합물 E((s,s)-2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노]-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-프로피온아미드), DBZ(디벤즈아제핀), JLK6(7-아미노-4-클로로-3-메톡시이소쿠마린), 또는 화합물 18([11-엔도]-N-(5,6,7,8,9,10-헥사히드로- 6,9-메타노 벤조[9][8]아눌렌-11-일)-티오펜-2-술폰아미드)이다. 예를 들어, 문헌[Purow B. Adv Exp Med Biol. 2012;727:305-19]을 참조하는데, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
CD28 억제자
실시 형태들에서, CD28 억제자는 CD28의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 소분자이다.
ICOS 억제자
실시 형태들에서, ICOS 억제자는 ICOS의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 소분자이다.
IL2RA 억제자
실시 형태들에서, IL2RA 억제자는 IL2RA의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 소분자이다.
하나의 예에서, 본 발명에 따른 IL2RA 억제자는 IL-2와 IL2RA 사이의 결합을 감소시키는 소분자, 예를 들어, 아실페닐알라닌 유사체, 예를 들어, Ro26-4550(Roche) 또는 이의 유도체이다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Thanos et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006]을 참조한다.
PRDM1 억제자
실시 형태들에서, PRDM1 억제자는 PRDM1의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 소분자이다.
Tet 억제자
실시 형태들에서, Tet 억제자는 Tet, 예를 들어, Tet1, Tet2 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자이다.
Tet2 억제자
실시 형태들에서, Tet2 억제자는 Tet2의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 Tet2 억제자는 2-히드록시글루타레이트(CAS #2889-31-8)이다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 Tet2 억제자는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00092
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 Tet2 억제자는 N-[3-[7-(2,5-디메틸-2H-피라졸-3-일아미노)-1-메틸-2-옥소-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d]피리미딘-3-일]-4-메틸페닐]-3-트리플루오로메틸-벤즈아미드(CAS #839707-37-8)이며, 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00093
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 Tet2 억제자는 2-[(2,6-디클로로-3-메틸페닐)아미노]벤조산(CAS # 644-62-2)이며, 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00094
실시 형태들에서, 본 발명의 Tet2 억제자는 전술한 것 중 임의의 것의 제약상 허용가능한 염이다.
HDAC 억제자
임의의 공지된 HDAC 억제자가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. HDAC 억제자의 비제한적 예는 보니노스타트(Voninostat)(Zolinza®); 로미뎁신(Romidepsin)(Istodax®); 트레이코스타틴(Treichostatin) A(TSA); 옥삼플라틴(Oxamflatin); 보리노스타트(Vorinostat)(Zolinza®, 수베로일아닐리드 히드록삼산); 피록사미드(Pyrox아미드)(시베로일-3-아미노피리딘아미드 히드록삼산); 트라폭신(Trapoxin) A(RF-1023A); 트라폭신 B(RF-10238); 시클로[(αS,2S)-α-아미노-η-옥소-2-옥시란옥타노일-O-메틸-D-티로실-L-이소류실-L-프롤릴](Cyl-1); 시클로[(αS,2S)-α-아미노-η-옥소-2-옥시란옥타노일-O-메틸-D-티로실-L-이소류실-(2S)-2-피페리딘카르보닐] (Cyl-2); 시클릭[L-알라닐-D-알라닐-(2S)-η-옥소-L-α-아미노옥시란옥타노일-D-프롤릴](HC-톡신); 시클로[(αS,2S)-α-아미노-η-옥소-2-옥시란옥타노일-D-페닐알라닐-L-류실-(2S)-2-피페리딘카르보닐](WF-3161); 클라마이도신(Chlamydocin)((S)-시클릭(2-메틸알라닐-L-페닐알라닐-D-프롤릴-η-옥소-L-α-아미노옥시란옥타노일); 아피시딘(Apicidin)(시클로(8-옥소-L-2-아미노데카노일-1-메톡시-L-트립토필-L-이소류실-D-2-피페리딘카르보닐); 로미뎁신(Istodax®, FR-901228); 4-페닐부티레이트; 스피루코스타틴(Spiruchostatin) A; 밀프로인(Mylproin)(발프로산); 엔티노스타트(Entinostat)(MS-275, N-(2-아미노페닐)-4-[N-(피리딘-3-일-메톡시카르보닐)-아미노-메틸]-벤즈아미드); 데퓨데신(Depudecin)(4,5:8,9-디언히드로-1,2,6,7,11-펜타데옥시- D-트레오-D-이도-운데카-1,6-디에니톨); 4-(아세틸아미노)-N-(2-아미노페닐)-벤즈아미드(CI-994로도 공지됨); N1-(2-아미노페닐)-N8-페닐-옥탄디아미드(BML-210으로도 공지됨); 4-(디메틸아미노)-N-(7-(히드록시아미노)-7-옥소헵틸)벤즈아미드(M344로도 공지됨); (E)-3-(4-(((2-(1H-인돌-3-일)에틸)(2-히드록시에틸)아미노)-메틸)페닐)-N-히드록시아크릴아미드(NVP-LAQ824); 파노비노스타트(Panobinostat)(Farydak®); 모세티노스타트(Mocetinostat), 및 벨리노스타트(Belinostat)를 포함한다.
단백질
일부 실시 형태에서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자는 단백질이다. 예시적인 단백질 조정자(예를 들어, 억제자)가 하기에 기술되어 있다.
IFN-γ 억제자
실시 형태들에서, IFN-γ 억제자는 IFN-γ의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 단백질이다. 하나의 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 항-IFN-γ 항체 또는 이의 단편, 또는 항-IFN-γ 수용체 항체 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2013/078378호, 국제 공개 제2011/061700호, 미국 특허 제6,329,511호, 미국 특허 제6,558,661호, 및 미국 특허 제4,897,264호를 참조한다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 IFN-γ 수용체 또는 이의 단편(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2011/061700호, 미국 특허 제6,558,661호, 및 미국 특허 제7,608,430호에 기술된 바와 같음)이다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 변형되거나 불활성화된 IFN-γ, 또는 IFN-γ의 단편(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,451,658호 및 미국 특허 제7,973,133호에 기술된 바와 같음)이다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 IFN-γ의 길항제인 사이토카인(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,612,195호에 기술된 바와 같음)이다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 IFN-γ 억제자는 IFN-γ의 생성을 억제하거나 감소시키는 BCRF1 단백질(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,736,390호에 기술된 바와 같음)이다.
NOTCH2 억제자
실시 형태들에서, NOTCH2 억제자는 NOTCH2의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 단백질이다. 하나의 예에서, 본 발명에 따른 NOTCH2 억제자는 항-NOTCH2 항체 또는 이의 단편이며, 에를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2014/141064호, 국제 공개 제2008/091641호, 미국 특허 제7,919,092호, 미국 특허 제8,226,943호, 및 미국 특허 제8,404,239호를 참조한다.
IL2RA 억제자
실시 형태들에서, IL2RA 억제자는 IL2RA의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 단백질이다. 하나의 예에서, 본 발명에 따른 IL2RA 억제자는 항-IL2RA 항체 또는 이의 단편이며, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제1990/007861호, 국제 공개 제2000/030679호, 국제 공개 제2014/144935호, 및 미국 특허 제7,438,907호를 참조한다. 예시적인 항-IL2RA 항체는 다클리주맙(Daclizumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 및 BT563을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 IL2RA 억제자는 IL2RA의 펩티드 길항제이며, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,635,597호 및 문헌[Emerson et al., Protein Sci. 2003 (4):811-22]을 참조한다.
PRDM1 억제자
실시 형태들에서, PRDM1 억제자는 PRDM1의 발현 및/또는 기능을 억제하거나 감소시키는 단백질 또는 펩티드이다. 하나의 예에서, 본 발명에 따른 PRDM1 억제자는 항-PRDM1 항체 또는 이의 단편이다. 하나의 예에서, 본 발명에 따른 PRDM1 억제자는 PRDM1에 결합하는 차단 펩티드이다.
우성적 네거티브 Tet2
본 발명에 따르면, 우성적 네거티브 Tet2 이소형, 및 상기 우성적 네거티브 Tet2를 코딩하는 핵산이 Tet2 억제자로서 사용될 수 있다. 실시 형태들에서, 우성적 네거티브 Tet2는 Tet2의 촉매 기능이 결여되어 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링을 따라 돌연변이 R1261G를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링을 따라 돌연변이 R1262A를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링을 따라 돌연변이 S1290A를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링을 따라 WSMYYN(서열 번호 1357의 아미노산 1291~1296)에서 GGSGGS(서열 번호 67)로의 돌연변이를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링에 따라 돌연변이 M1293A 및 Y1294A를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링에 따라 돌연변이 Y1295A를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링에 따라 돌연변이 S1303N을 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링에 따라 돌연변이 H1382Y를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링에 따라 돌연변이 D1384A를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 우성적 네거티브 Tet2의 일례로는 서열 번호 1357의 넘버링에 따라 돌연변이 D1384V를 갖는 서열 번호 1357의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단백질이 있다. 실시 형태들에서, 우성적 네거티브 Tet2는 전술한 돌연변이들 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 문헌[Chen et al., Nature, 493:561-564 (2013)]; 문헌[Hu et al, Cell, 155:1545-1555 (2013)]에 추가로 기술되어 있으며, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
우성적 네거티브 Tet2 결합 파트너
이론에 구애됨이 없이, Tet2는 하나 이상의 HDAC, 예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포에서 발현되는 하나 이상의 HDAC와 상호작용하며, 예를 들어 이와 결합하며, 이러한 Tet2:HDAC 복합체는 상기 세포에서 Tet2 활성에 기여할 수 있다고 믿어진다. 실시 형태들에서, 본 발명의 Tet2 억제자는 우성적 네거티브 Tet2 결합 파트너, 예를 들어, 우성적 네거티브 Tet2-결합 HDAC이다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 Tet2 억제자는 우성적 네거티브 Tet2 결합 파트너, 예를 들어, 우성적 네거티브 Tet2-결합 HDAC를 코딩하는 핵산을 포함한다.
벡터
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자), 예컨대 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 유전자 편집 시스템, shRNA 또는 siRNA 억제자, 소분자, 펩티드, 또는 단백질 조정자(예를 들어, 억제자)(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음)를 코딩하는 벡터(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음)를 제공한다.
예를 들어 CAR을 추가로 포함하는 실시 형태들에서, 핵산은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 억제자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 본원에 기술된 CAR 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 실시 형태들에서, 핵산 서열들은 별개의 벡터 상에 배치된다. 다른 실시 형태에서, 상기 2개 이상의 핵산 서열은 동일한 프레임 내 단일 핵산 분자에 의해 단일 폴리펩티드 쇄로서 코딩된다. 이러한 양태에서, 상기 2개 이상의 CAR은, 예를 들어 하나 이상의 펩티드 절단 부위(예를 들어, 세포내 프로테아제에 대한 기질 또는 자동 절단 부위)에 의해 분리될 수 있다. 펩티드 절단 부위의 예는 다음을 포함하고, 여기서, GSG 잔기는 선택적이다:
Figure pct00095
이들 펩티드 절단 부위는 본원에서 "2A 부위"로 총칭된다. 실시 형태들에서, 벡터는 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산 서열, 및 본원에 기술된 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 shRNA 또는 siRNA 억제자를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 실시 형태들에서, 벡터는 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산 서열, 및 본원에 기술된 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 게놈 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템) 조정자(예를 들어, 억제자)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
조정자의 사용 방법
본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019 또는 CTL119)의 치료 효능을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현 및/또는 기능을 변경시키는 단계를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 방법은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시키거나 제거하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현 및/또는 기능을 증가시키거나 활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 세포를 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 세포에서의 5-히드록시메틸시토신의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
추가로 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, 개선된 기능을 갖는(예를 들어, 개선된 효능, 예를 들어, 종양 표적화, 또는 증식을 갖는) CAR-발현 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 상기 세포에서 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현 또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키거나 제거하거나, 또는 증가시키거나 활성화시키는) 단계를 포함한다. 실시 형태들에서, 본 방법은 상기 세포를 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 생체 외에서 행해진다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 생체 내에서 행해진다. 일부 실시 형태에서, 상기 접촉은 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 발현하도록 상기 세포를 변형시키기 전에, 상기 변형과 동시에, 또는 상기 변형 후에 행해진다.
실시 형태들에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019- 또는 CTL119-발현 세포)에서 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 억제하거나 활성화시키는) 방법을 제공하며, 본 방법은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키거나 제거하거나, 또는 증가시키거나 활성화시키는) 단계를 포함한다. 실시 형태들에서, 본 방법은 상기 세포를 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 본원에 기술된 바와 같다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 세포에서의 5-히드록시메틸시토신의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 CAR 코딩 핵산을 세포, 예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포 내로, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자, 또는 그의 조절 요소 내의 부위에 도입하여서, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 발현이 파괴되도록 하는 단계를 포함하는 방법, 예를 들어, 상기에 기술된 방법을 제공한다. Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자 내의 부위에서의 통합은, 예를 들어, 상기에 기술된 바와 같이, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 표적화하는 유전자 편집 시스템을 사용하여 성취될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 유전자 편집 시스템, 예를 들어, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 표적화하는 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템, 예를 들어, Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자의 표적 서열에 대하여 상보성인 표적화 서열을 갖는 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법, 예를 들어 상기에 기술된 방법을 제공한다. 실시 형태들에서, CRISPR/Cas 시스템은 gRNA 및 Cas 효소의 리보핵 단백질 복합체로서 상기 세포 내로 도입되며, 예를 들어, 전기천공법을 통하여 도입된다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 CRISPR/Cas 시스템의 구성요소들 중 하나 이상을 코딩하는 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 핵산은 CAR, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 코딩하는 벡터 상에 배치된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 표적화하는 억제성 dsRAN, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법, 예를 들어, 상기에 기술된 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 Tet-관련 유전자(예를 들어, Tet2-관련 유전자) 및/또는 Tet(예를 들어, Tet1, Tet2, 및/또는 Tet3, 예를 들어, Tet2) 유전자를 표적화하는 억제성 dsRNA, 예를 들어, shRNA 또는 siRNA를 코딩하는 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 핵산은 CAR, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 코딩하는 벡터 상에 배치된다.
추가적인 CAR의 구성요소 및 CAR T 세포, 및 본 발명과 관련된 방법이 하기에 기술된다.
본 발명의 CAR을 이용하여 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 이용한 암과 같은 질환의 치료를 위한 물질의 조성물 및 사용 방법이 본원에 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 종양 항원, 예를 들어 본원에 기술된 종양 항원에의 특이적 결합을 위하여 조작된 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함하는 다수의 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하며, 여기서, 조작된 면역 이펙터 세포는 항암 특성을 나타낸다. 일 양태에서 세포는 CAR로 형질전환되고, CAR은 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시 형태에서, 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이러한 실시 형태에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 CAR을 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 트랜스펙션된다. 일부 이러한 실시 형태에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기술된 CAR의 항원 결합 도메인은 scFv 항체 단편이다. 일 양태에서, 이러한 항체 단편은 동등한 결합 친화도를 보유한다는 점에서, 예를 들어 그것이 유래되는 IgG 항체와 동일한 항원에 비슷한 친화도로 결합한다는 점에서 기능적이다. 다른 실시 형태에서, 항체 단편은 더 낮은 결합 친화도를 가지며, 예를 들어 그것은 그것이 유래된 항체보다 더 낮은 결합 친화도로 동일 항원에 결합하지만, 그것이 본원에 기술된 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다. 일 실시 형태에서, CAR 분자는 표적 항원에 대해 10-4 M 내지 10-8 M, 예컨대, 10-5 M 내지 10-7 M, 예컨대, 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항체 단편을 포함한다. 일 실시 형태에서, 항체 단편은 기준 항체, 예를 들어 본원에 기술된 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 적은 결합 친화도를 갖는다.
일 양태에서, 이러한 항체 단편은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그들이 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터의 신호-전달 기원의 억제, 키나아제 활성의 억제 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다.
일 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 그것이 유래되는 scFv의 쥣과 서열과 비교하여 인간화된 scFv 항체 단편이다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 서열이 포유동물 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 코딩된다. 일 양태에서, 본 발명의 전체 CAR 구축물은 전체 서열이 포유동물 세포에서의 발현용으로 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA 내의 동의 코돈(즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 말한다. 이러한 코돈 축퇴성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 제5,786,464호 및 제6,114,148호에 개시된 방법을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR은 특정 항체의 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 분자와 조합한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 세포내 신호전달 분자는 CD3-제타 쇄, 4-1BB 및 CD28 신호전달 모듈 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 양태에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원에 결합한다.
더욱이, 본 발명은 CAR 및 CAR-발현 세포와, 다른 질환 중에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 포함하는, 암 또는 임의의 악성 종양 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약 또는 방법에서의 이의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR은 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 정상 세포를 퇴치하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 세포 이식 전에 세포 컨디셔닝 요법으로서 사용하는 데 적용가능할 수 있다. 일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 정상 세포는 정상 줄기 세포이고, 세포 이식은 줄기 세포 이식이다.
일 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하며, 여기서, 조작된 면역 이펙터 세포는 항종양 특성을 나타낸다. 바람직한 항원은 본원에 기술된 암 관련 항원(즉, 종양 항원)이다. 일 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분적 인간화 항체 단편을 포함한다. 일 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 부분적 인간화 scFv를 포함한다. 따라서, 본 발명은 인간화 항원 결합 도메인을 포함하고 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 내로 들어가 이것이 조작되게 하는 CAR, 및 입양 요법을 위한 이들의 사용 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR은 CD137(4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD27 신호 도메인, CD3제타 신호 도메인 및 이들의 임의의 조합의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명의 CAR은 CD137(4-1BB) 또는 CD28 이외의 하나 이상의 공동자극 분자(들)로부터의 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명의 CAR의 다양한 구성요소의 일부 예의 서열이 표 1에 열거되어 있으며, 여기서, aa는 아미노산을 나타내고, na는 상응하는 펩티드를 코딩하는 핵산을 나타낸다.
[표 1]
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암 관련 항원
본 발명은 면역 이펙터 세포를 암으로 안내하는 하나 이상의 CAR을 포함하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공한다. 이것은 암 관련 항원에 특이적인 CAR 상의 항원 결합 도메인을 통하여 달성된다. 본 발명의 CAR이 표적화할 수 있는 두 부류의 암 관련 항원(종양 항원)이 있다: (1) 암 세포의 표면 상에 발현되는 암 관련 항원; 및 (2) 암 관련 항원으로서, 그 자신은 세포내에 있지만 이러한 항원(펩티드)의 단편이 MHC(주요 조직적합성 복합체)에 의해 암 세포의 표면 상에 제시되는, 암 관련 항원.
따라서, 본 발명은 하기 암 관련 항원(종양 항원)을 표적화하는 CAR을 제공한다: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1(CLECL1), CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, PRSS21, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타아제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라아제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카르복실 에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1.
종양-지지 항원
본원에 기술된 CAR은 종양-지지 항원(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 종양-지지 항원)에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 종양-지지 항원은 기질 세포 또는 골수-유래 억제 세포(MDSC) 상에 존재하는 항원이다. 기질 세포는 미세환경에서 세포 분열을 촉진하도록 성장 인자를 분비할 수 있다. MDSC 세포는 T 세포의 증식 및 활성화를 억제할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 일부 실시 형태에서, CAR-발현 세포는 종양-지지 세포를 파괴함으로써 종양의 성장 또는 생존을 간접적으로 억제한다.
실시 형태들에서, 기질 세포 항원은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 골수 기질 세포 항원 2(BST2), 섬유모세포 활성화 단백질(FAP) 및 테나신. 일 실시 형태에서, FAP-특이적 항체는 시브로투주맙과의 결합에 대하여 경쟁하거나 시브로투주맙과 동일한 CDR을 갖는다. 실시 형태들에서, MDSC 항원은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: CD33, CD11b, C14, CD15, 및 CD66b. 따라서, 일부 실시 형태에서, 종양-지지 항원은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 골수 기질 세포 항원 2(BST2), 섬유모세포 활성화 단백질(FAP) 또는 테나신, CD33, CD11b, C14, CD15, 및 CD66b.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 발명은 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 포괄하며, 여기서, CAR은 본원에 기술된 암 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편)을 포함하고, 항원 결합 도메인의 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 연접하여, 이와 동일한 리딩 프레임 내에 있다. 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인의 적어도 일부를 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다.
특정 양태들에서, 본 발명의 CAR 구축물은 scFv 도메인을 포함하며, 여기서, scFv는 서열 번호 2로 제공되는 것과 같은 선택적 리더 서열이 선행하고, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10으로 제공되는 것과 같은 선택적 힌지 서열, 서열 번호 12로 제공되는 것과 같은 막관통 영역 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 CD3 제타 서열이 뒤따르며, 예를 들어, 상기 도메인들은 단일 융합 단백질을 형성하도록 연접하여 동일 리딩 프레임 내에 있다.
일 양태에서, 예시적인 CAR 구축물은 선택적인 리더 서열(예를 들어 본원에 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인(예를 들어 본원에 기술된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어 본원에 기술된 힌지 영역), 막관통 도메인(예를 들어 본원에 기술된 막관통 도메인) 및 세포내 자극 도메인(예를 들어 본원에 기술된 세포내 자극 도메인)을 포함한다. 일 양태에서, 예시적인 CAR 구축물은 선택적인 리더 서열(예를 들어 본원에 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인(예를 들어 본원에 기술된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어 본원에 기술된 힌지 영역), 막관통 도메인(예를 들어 본원에 기술된 막관통 도메인), 세포내 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기술된 공동자극 신호전달 도메인) 및/또는 세포내 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기술된 일차 신호전달 도메인)을 포함한다.
예시적인 리더 서열은 서열 번호 2로서 제공된다. 예시적인 힌지/스페이서 서열은 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10으로서 제공된다. 예시적인 막관통 도메인 서열은 서열 번호 12로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열 번호 14로서 제공된다. CD27의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열 번호 16으로 제공된다. 예시적인 CD3제타 도메인 서열은 서열 번호 18 또는 서열 번호 20으로 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하며, 여기서, 핵산 분자는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 이와 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는, 예를 들어 본원에 기술된 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포함하며, 여기서, 핵산 분자는 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 연접하고 이와 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어 CD3-제타, CD28, CD27, 4-1BB 등의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
원하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 본 기술 분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 이 핵산 분자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이 핵산 분자를, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝되기 보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
본 발명은 세포를 직접적으로 형질도입되게 할 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함한다.
본 발명은 또한, 세포를 직접적으로 트랜스펙션시킬 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 트랜스펙션에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은, 3' 및 5' 비번역 서열("UTR")(예를 들어, 본원에 기술된 3’ 및/또는 5’ UTR), 5' 캡(예를 들어, 본원에 기술된 5’ 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(예를 들어, 본원에 기술된 IRES), 발현시킬 핵산 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50 내지 2000개 염기 길이의 구축물(서열 번호 32)을 생성하기 위하여, 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관 내 전사(IVT)에 이은 폴리A 부가를 수반한다. 이렇게 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 트랜스펙션시킬 수 있다. 일 실시 형태에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, RNA CAR 벡터는 전기천공법에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 형질도입시킨다.
항원 결합 도메인
일 양태에서, 본 발명의 CAR은 다르게 항원 결합 도메인으로 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 따라 달라진다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR에서 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 관련된 것을 포함한다.
일 양태에서, CAR-매개 T-세포 반응은 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 CAR로 조작함으로써 관심 항원에 대하여 유도될 수 있다.
일 양태에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 종양 항원, 예를 들어 본원에 기술된 종양 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 단일-도메인 항체, 예컨대, 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 낙타과 유래 나노바디의 가변 도메인(VHH)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 이들의 기능성 단편, 및 항원 결합 도메인으로서의 기능을 하는 것으로 본 기술 분야에 공지된 대안적인 스캐폴드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인, T 세포 수용체(TCR), 또는 이의 단편, 예를 들어 단쇄 TCR 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어 인간에 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인을 위한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
일 실시 형태에서, CD19 CAR은 미국 특허 제8,399,645호; 미국 특허 제7,446,190호; 문헌[Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012)]; 문헌[Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013)]; 문헌[Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011)]; 문헌[Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010)]; 문헌[Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013)]; 또는 문헌[16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10(이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 CD19 CAR이다. 일 실시 형태에서, CD19에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2012/079000호에 기술된 CAR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다. 일 실시 형태에서, CD19에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2014/153270호; 문헌[Kochenderfer, J.N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009)]; 문헌[Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)]; 국제 공개 제2014/031687호; 문헌[Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995]; 또는 미국 특허 제7,446,190호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CAR의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 메소텔린에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 항체, 항원 결합 단편 또는 CAR의 항원 결합 도메인, 예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL이거나 이로부터 유래될 수 있다(일 실시 형태에서 CAR은 국제 공개 제2015/090230호에 기술된 CAR이며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다). 실시 형태에서, 메소텔린에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 국제 공개 제1997/025068호, 국제 공개 제1999/028471호, 국제 공개 제2005/014652호, 국제 공개 제2006/099141호, 국제 공개 제2009/045957호, 국제 공개 제2009/068204호, 국제 공개 제2013/142034호, 국제 공개 제2013/040557호, 또는 국제 공개 제2013/063419호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 항체, 항원 결합 단편, 또는 CAR의 항원 결합 부분, 예컨대, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL이거나 이로부터 유래된다.
일 실시 형태에서, CD123에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2014/130635호에 기술된 항체, 항원 결합 단편 또는 CAR의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR, scFv 또는 VH 및 VL이거나 이로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, CD123에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어 국제 공개 제2016/028896호(그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 항체, 항원 결합 단편 또는 CAR의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR, scFv 또는 VH 및 VL이거나 이로부터 유래되며; 실시 형태들에서, CAR은 국제 공개 제2016/028896호에 기술된 CAR이다. 일 실시 형태에서, CD123에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어 국제 공개 제1997/024373호, 국제 공개 제2008/127735호(예를 들어, 26292, 32701, 37716 또는 32703의 CD123 결합 도메인), 국제 공개 제2014/138805호(예를 들어, CSL362의 CD123 결합 도메인), 국제 공개 제2014/138819호, 국제 공개 제2013/173820호, 국제 공개 제2014/144622호, 국제 공개 제2001/66139호, 국제 공개 제2010/126066호(예를 들어, Old4, Old5, Old17, Old19, New102 또는 Old6 중 임의의 것의 CD123 결합 도메인), 국제 공개 제2014/144622호 또는 미국 특허 공개 제2009/0252742호에 기술된 항체, 항원 결합 단편 또는 CAR의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR, scFv, 또는 VL 및 VH이거나 이로부터 유래된다.
일 실시 형태에서, CD22에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013)]; 문헌[Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010)]; 문헌[Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013)]; 문헌[Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다.
일 실시 형태에서, CS-1에 대한 항원 결합 도메인은 엘로투주맙(BMS)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이며, 예를 들어 문헌[Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37]; 문헌[Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63]을 참조한다.
일 실시 형태에서, CLL-1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2016/014535호(이의 내용은 그 전체가 본원에 포함됨)에 기술된 항체, 항원 결합 단편 또는 CAR의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR 또는 VH 및 VL이다. 일 실시 형태에서, CLL-1에 대한 항원 결합 도메인은 R&D, ebiosciences, Abcam으로부터 입수가능한 항체, 예를 들어 PE-CLL1-hu(카탈로그 번호 353604(BioLegend)); 및 PE-CLL1(CLEC12A)(카탈로그 번호 562566(BD))의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다.
일 실시 형태에서, CD33에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001)]에 기술된 항체(겜투주맙 오조가미신(Gemtuzumab Ozogamicin), hP67.6), 문헌[Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992)]에 기술된 항체(린투주맙(Lintuzumab), HuM195), 문헌[Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012)]에 기술된 항체(AVE9633), 문헌[Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013)]에 기술된 항체(AMG330, CD33 BiTE), 문헌[Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012)] 및 문헌[Pizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다. CD33을 표적화하는 예시적인 CAR 분자는 본원에 기술되어 있고, (그 전체가 참고로 포함된) 국제 공개 제2016/014576호, 예컨대, 국제 공개 제2016/014576호의 표 2에 제공되어 있다.
일 실시 형태에서, GD2에 대한 항원 결합 도메인은 예컨대, 문헌[Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987)]; 문헌[Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985)], 문헌[Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987)], 문헌[Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998)], 문헌[Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예컨대, CDR이다. 일부 실시 형태에서, GD2에 대한 항원 결합 도메인은 mAb 14.18, 14G2a, ch14.18, hu14.18, 3F8, hu3F8, 3G6, 8B6, 60C3, 10B8, ME36.1, 및 8H9로부터 선택된 항체의 항원 결합 부분이며, 예컨대, 국제 공개 제2012033885호, 국제 공개 제2013040371호, 국제 공개 제2013192294호, 국제 공개 제2013061273호, 국제 공개 제2013123061호, 국제 공개 제2013074916호, 및 국제 공개 제201385552호를 참조한다. 일부 실시 형태에서, GD2에 대한 항원 결합 도메인은 미국 특허 공개 제20100150910호 또는 국제 공개 제2011160119호에 기술된 항체의 항원 결합 부분이다.
일 실시 형태에서, BCMA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2012163805호, 국제 공개 제200112812호, 및 국제 공개 제2003062401호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다. 실시 형태들에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물은 국제 공개 제2012/0163805호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터의 항원 결합 도메인, 예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성된다. 실시 형태들에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물은 국제 공개 제2016/014565호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터의 항원 결합 도메인, 예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성된다. 실시 형태들에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물은 국제 공개 제2014/122144호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터의 항원 결합 도메인, 예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성된다. 실시 형태들에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물은 국제 공개 제2016/014789호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터의 CAR 분자, 및/또는 BCMA 결합 도메인(예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL 서열)을 사용하여 생성된다. 실시 형태들에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물은 국제 공개 제2014/089335호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터의 CAR 분자, 및/또는 BCMA 결합 도메인(예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL 서열)을 사용하여 생성된다. 실시 형태들에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물은 국제 공개 제2014/140248호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터의 CAR 분자, 및/또는 BCMA 결합 도메인(예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL 서열)을 사용하여 생성된다.
일 실시 형태에서, Tn 항원에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 미국 특허 공개 제2014/0178365호, 미국 특허 제8,440,798호, 문헌[Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)], 및 문헌[Stone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, PSMA에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 문헌[Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)], 미국 특허 공개 제20110268656호(J591 ScFv); 문헌[Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)](scFvD2B); 국제 공개 제2006125481호(mAb 3/A12, 3/E7 및 3/F11)에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR 및 단쇄 항체 단편(scFv A5 및 D7)이다.
일 실시 형태에서, ROR1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)]; 국제 공개 제2011159847호; 및 미국 특허 공개 제20130101607호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다.
일 실시 형태에서, FLT3에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2011076922호, 미국 특허 제5777084호, 유럽 특허 제0754230호, 미국 특허 공개 제20090297529호에 기술된 항체, 및 여러 상업적 카탈로그의 항체(R&D, ebiosciences, Abcam)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, TAG72에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Hombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)]에 기술된 항체; 및 Abcam ab691의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, FAP에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 문헌[Ostermann et al., Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)](FAP5), 미국 특허 공개 제2009/0304718호에 기술된 항체; 시브로투주맙(예를 들어, 문헌[Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003)]; 및 문헌[Tran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)] 참조)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD38에 대한 항원 결합 도메인은 다라투무맙(예를 들어, 문헌[Groen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)] 참조); MOR202(예를 들어, 미국 특허 제8,263,746호 참조); 또는 미국 특허 제8,362,211호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD44v6에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Casucci et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CEA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Chmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, EPCAM에 대한 항원 결합 도메인은 MT110, EpCAM-CD3 이중특이성 Ab(예를 들어, clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596 참조); 에드레콜로맙; 3622W94; ING-1; 및 아데카투무맙(MT201)으로부터 선택되는 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, PRSS21에 대한 항원 결합 도메인은 미국 특허 제8,080,650호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, B7H3에 대한 항원 결합 도메인은 MGA271(Macrogenics)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, KIT에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 미국 특허 제7915391호, 미국 특허 공개 제20120288506호에 기술된 항체, 및 여러 상업적 카탈로그의 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, IL-13Ra2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제2008/146911호, 국제 공개 제2004087758호에 기술된 항체, 여러 상업적 카탈로그의 항체, 및 국제 공개 제2004087758호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD30에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7090843 B1호, 및 유럽 특허 제0805871호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, GD3에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7253263호; 미국 특허 제8,207,308호; 미국 특허 공개 제20120276046호; 유럽 특허 제1013761호; 국제 공개 제2005035577호; 및 미국 특허 제6437098호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD171에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, IL-11Ra에 대한 항원 결합 도메인은, Abcam(카탈로그 번호 ab55262) 또는 Novus Biologicals(카탈로그 번호 EPR5446)로부터 입수가능한 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다. 또 다른 실시 형태에서, IL-11Ra에 대한 항원 결합 도메인은 펩티드이며, 예를 들어, 문헌[Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)]을 참조한다.
일 실시 형태에서, PSCA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)](scFv 7F5); 문헌[Nejatollahi et al., J of Oncology 2013(2013), 논문 ID 839831](scFv C5-II)]; 및 미국 특허 공개 제20090311181호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, VEGFR2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Chinnasamy et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 루이스Y에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)](hu3S193 Ab (scFvs)); 문헌[Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)](NC10 scFv)에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다.
일 실시 형태에서, CD24에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, PDGFR-베타에 대한 항원 결합 도메인은 항체 Abcam ab32570의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, SSEA-4에 대한 항원 결합 도메인은 항체 MC813(Cell Signaling), 또는 다른 상업적으로 입수가능한 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD20에 대한 항원 결합 도메인은 항체 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙 또는 GA101의 항원 결합 부분, 예를 들어 CDR이다.
일 실시 형태에서, 폴레이트 수용체 알파에 대한 항원 결합 도메인은 항체 IMGN853, 또는 미국 특허 공개 제20120009181호; 미국 특허 제4851332호에 기술된 항체, LK26(미국 특허 제5952484호)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, ERBB2(Her2/neu)에 대한 항원 결합 도메인은 항체 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, MUC1에 대한 항원 결합 도메인은 항체 SAR566658의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, EGFR에 대한 항원 결합 도메인은 항체 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙 또는 마투주맙의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다. 일 실시 형태에서, EGFRvIII에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 국제 공개 제2014/130657호에 기술된 항체, 항원 결합 단편 또는 CAR의 항원 결합 도메인, 예를 들어, CDR, scFv, 또는 VH 및 VL이거나 이로부터 유래될 수 있다(일 실시 형태에서 CAR은 국제 공개 제2014/130657호에 기술된 CAR이며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다).
일 실시 형태에서, NCAM에 대한 항원 결합 도메인은 항체 클론 2-2B: MAB5324(EMD Millipore)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 에프린(Ephrin) B2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Abengozar et al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, IGF-I 수용체에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제8344112 B2호; 유럽 특허 제2322550 A1호; 국제 공개 제2006/138315호, 또는 PCT/US2006/022995에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CAIX에 대한 항원 결합 도메인은 항체 클론 303123(R&D Systems)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, LMP2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7,410,640호, 또는 미국 특허 공개 제20050129701호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, gp100에 대한 항원 결합 도메인은 항체 HMB45, NKI베타B, 또는 국제 공개 제2013165940, 또는 미국 특허 공개 제20130295007호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 티로시나아제에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제5843674호; 또는 미국 특허 공개 제19950504048호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, EphA2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Yu et al., Mol Ther 22(1):102-111 (2014)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, GD3에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제7253263호; 미국 특허 제8,207,308호; 미국 특허 공개 제20120276046호; 유럽 특허 제1013761 A3호; 미국 특허 공개 제2020120276046호; 국제 공개 제2005035577호; 또는 미국 특허 제6437098호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 푸코실 GM1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20100297138호; 또는 국제 공개 제2007/067992호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, sLe에 대한 항원 결합 도메인은 항체 G193(루이스 Y의 경우)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이며, 문헌[Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000)]을 참조하는데, 이는 또한 문헌[Neeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177.10]에 기술된 바와 같다.
일 실시 형태에서, GM3에 대한 항원 결합 도메인은 항체 CA 2523449(mAb 14F7)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, HMWMAA에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Kmiecik et al., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014)](PMID: 24575382)(mAb9.2.27); 미국 특허 제6528481호; 국제 공개 제2010033866호; 또는 미국 특허 공개 제20140004124호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, o-아세틸-GD2에 대한 항원 결합 도메인은 항체 8B6의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, TEM1/CD248에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006)]; 문헌[Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221-232 (2011)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CLDN에 대한 항원 결합 도메인은 항체 IMAB027(Ganymed Pharmaceuticals)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이며, 예를 들어, clinicaltrial.gov/show/NCT02054351을 참조한다.
일 실시 형태에서, TSHR에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 제8,603,466호; 미국 특허 제8,501,415호; 또는 미국 특허 제8,309,693호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, GPRC5D에 대한 항원 결합 도메인은 항체 FAB6300A(R&D Systems); 또는 LS-A4180(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD97에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 미국 특허 제6,846,911호; 문헌[de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)]에 기술된 항체; 또는 R&D로부터의 항체: MAB3734의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, ALK에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 폴리시알산에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Nagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, PLAC1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 글로보H에 대한 항원 결합 도메인은 항체 VK9; 또는 예를 들어 문헌[Kudryashov V et al., Glycoconj J.15(3):243-9 (1998)], 문헌[Lou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014)]; 문헌[MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분이다.
일 실시 형태에서, NY-BR-1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Jager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, WT-1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 문헌[Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)]; 또는 국제 공개 제2012/135854호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, MAGE-A1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Willemsen et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)](TCR-유사 scFv)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 정자 단백질 17에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Song et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313)]; 문헌[Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, Tie 2에 대한 항원 결합 도메인은 항체 AB33(Cell Signaling Technology)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, MAD-CT-2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 PMID: 2450952; 미국 특허 제7635753호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, Fos-관련 항원 1에 대한 항원 결합 도메인은 항체 12F9(Novus Biologicals)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 멜란A/MART1에 대한 항원 결합 도메인은 유럽 특허 제2514766 A2호; 또는 미국 특허 제7,749,719호에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 육종 전좌 중단점에 대한 항원 결합 도메인은 예를 들어, 문헌[Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, TRP-2에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CYP1B1에 대한 항원 결합 도메인은, 예를 들어 문헌[Maecker et al., Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)]에 기술된 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, RAGE-1에 대한 항원 결합 도메인은 항체 MAB5328(EMD Millipore)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 인간 텔로머라아제 역전사효소에 대한 항원 결합 도메인은 항체 카탈로그 번호 LS-B95-100(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 장 카르복실 에스테라아제에 대한 항원 결합 도메인은 항체 4F12: 카탈로그 번호 LS-B6190-50(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, mut hsp70-2에 대한 항원 결합 도메인은 항체 Lifespan Biosciences: 단클론: 카탈로그 번호 LS-C133261-100(Lifespan Biosciences)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD79a에 대한 항원 결합 도메인은 Abcam으로부터 입수가능한 항체 항-CD79a 항체[HM47/A9](ab3121); Cell Signalling Technology로부터 입수가능한 항체 CD79A 항체 #3351; 또는 Sigma Aldrich로부터 입수가능한, 토끼에서 생성된 항-CD79A 항체인 항체 HPA017748의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD79b에 대한 항원 결합 도메인은 항체 폴라투주맙 베도틴, 문헌[Dornan et al., "Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma" Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9. doi: 10.1182/Blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24]]에 기술된 항-CD79b, 또는 문헌["4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Malignancies" Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, CA December 6-9 2014]에 기술된 이중특이성 항체 항-CD79b/CD3의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CD72에 대한 항원 결합 도메인은 문헌[Myers, and Uckun, "An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia". Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22]에 기술된 항체 J3-109, 또는 문헌[Polson et al., "Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection" Cancer Res March 15, 2009 69; 2358]에 기술된 항-CD72(10D6.8.1, mIgG1)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, LAIR1에 대한 항원 결합 도메인은 항체, ProSpec으로부터 입수가능한 ANT-301 LAIR1 항체; 또는 BioLegend로부터 입수가능한 항-인간 CD305(LAIR1) 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, FCAR에 대한 항원 결합 도메인은 Sino Biological Inc.로부터 입수가능한 항체 CD89/FCARAntibody(카탈로그 번호 10414-H08H)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, LILRA2에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Abnova로부터 입수가능한 LILRA2 단클론 항체(M17), 클론 3C7, 또는 Lifespan Biosciences로부터 입수가능한 마우스 항-LILRA2 항체, 단클론(2D7)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다
일 실시 형태에서, CD300LF에 대한 항원 결합 도메인은 항체, BioLegend로부터 입수가능한 마우스 항-CMRF35-유사 분자 1 항체, 단클론[UP-D2], 또는 R&D Systems로부터 입수가능한 래트 항-CMRF35-유사 분자 1 항체, 단클론[234903]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, CLEC12A에 대한 항원 결합 도메인은 항체, 이중특이성 T 세포 관여항체(BiTE) scFv-항체 및 문헌[Noordhuis et al., "Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody" 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, December 10-13, 2011, and MCLA-117 (Merus)]에 기술된 ADC의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, BST2(CD317로도 칭해짐)에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Antibodies-Online으로부터 입수가능한 마우스 항-CD317 항체, 단클론[3H4], 또는 R&D Systems로부터 입수가능한 마우스 항-CD317 항체, 단클론[696739]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, EMR2(CD312로도 칭해짐)에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Lifespan Biosciences로부터 입수가능한 마우스 항-CD312 항체, 단클론[LS-B8033], 또는 R&D Systems로부터 입수가능한 마우스 항-CD312 항체, 단클론[494025]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, LY75에 대한 항원 결합 도메인은 항체, EMD Millipore로부터 입수가능한 마우스 항-림프구 항원 75 항체, 단클론[HD30], 또는 Life Technologies로부터 입수가능한 마우스 항-림프구 항원 75 항체, 단클론[A15797]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, GPC3에 대한 항원 결합 도메인은 문헌[Nakano K, Ishiguro T, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916]]에 기술된 항체 hGC33, 또는 MDX-1414, HN3, 또는 Yp7(이 3가지 모두는 문헌[Feng et al., "Glypican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer". FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):377-82]에 기술됨)의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, FCRL5에 대한 항원 결합 도메인은 문헌[Elkins et al., "FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma" Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32.]에 기술된 항-FcRL5 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, IGLL1에 대한 항원 결합 도메인은 항체, Lifespan Biosciences로부터 입수가능한 마우스 항-면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 항체, 단클론[AT1G4], BioLegend로부터 입수가능한 마우스 항-면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 항체, 단클론[HSL11]의 항원 결합 부분, 예를 들어, CDR이다.
일 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 위에 열거된 항체로부터의 1개, 2개, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 및/또는 위에 열거된 항체로부터의 1개, 2개, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함한다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 비-인간 항체는 인간화되며, 여기서 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생산된 항체 또는 이의 단편에 대한 유사성을 증가시키도록 변형된다. 일 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화 항체는 CDR-그라프팅(예를 들어, 유럽 특허 제239,400호; 국제 공개 제91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 미국 특허 제5,530,101호, 및 미국 특허 제5,585,089호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 참조), 베니어링 또는 재표면화(예를 들어, 유럽 특허 제592,106호 및 유럽 특허 제519,596호; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498]; 문헌[Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814]; 및 문헌[Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973](이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 참조), 쇄 셔플링(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호(그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 참조), 및 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2005/0042664호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0048617호, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허제5,766,886호, 국제 공개 제9317105호, 문헌[Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002)], 문헌[Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)], 문헌[Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000)], 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)], 문헌[Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)], 문헌[Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)], 문헌[Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)], 문헌[Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)], 및 문헌[Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기술을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 본 기술 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위하여, 예를 들어 개선하기 위하여 CDR 도너 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 이들 프레임워크 치환은 본 기술 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서 비통상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. (예를 들어, Queen 등의 미국 특허 제5,585,089호; 및 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323](이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 참조).
인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간인 공급원 유래의 1개 이상의 아미노산 잔기가 그 안에 남아 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 본원에 제공된 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 면역글로불린 분자로부터의 하나 이상의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하며, 여기서 프레임워크를 구성하는 아미노산 잔기는 완전히 또는 대부분 인간 생식세포 계열로부터 유래된다. 항체 또는 항체 단편의 인간화를 위한 다수의 기술은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 즉 CDR-그라프팅(유럽 특허 제239,400호; 국제 공개 제91/09967호; 및 미국 특허 제4,816,567호; 미국 특허 제6,331,415호; 미국 특허 제5,225,539호; 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제6,548,640호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 의해 본질적으로 Winter와 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다(문헌[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]). 이러한 인간화 항체 및 항체 단편에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 것이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 바 있다. 인간화 항체는 종종 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 프레임워크(FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 또한, 베니어링 또는 재표면화(유럽 특허 제592,106호; 유럽 특허 제519,596호; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498]; 문헌[Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)]; 및 문헌[Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)]) 또는 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)(이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 의해 달성될 수 있다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 경쇄 가변 도메인 및 인간 중쇄 가변 도메인 둘 다의 선택은 항원성을 감소시키기 위한 것이다. 소위 "최적-피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 그런 다음, 설치류의 서열과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크(FR)로서 수용된다(문헌[Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)](이의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]; 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)](이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨) 참조). 일부 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VH4_4-59 생식세포 계열 서열로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 쥣과 서열에서의 아미노산으로부터의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VK3_1.25 생식세포 계열 서열로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 쥣과 서열에서의 아미노산으로부터의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 표적 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화된다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 인간화 항체 및 항체 단편은 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어 후보 면역글로불린이 표적 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용 서열(recipient sequence) 및 유입 서열로부터의 FR 잔기들이 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체 또는 항체 단편은 원래 항체와 유사한 항원 특이성, 예를 들어 본 발명에서, 본원에 기술된 바와 같은 인간 암 관련 항원에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간화 항체 또는 항체 단편은 본원에 기술된 바와 같은 인간 암 관련 항원에 대한 개선된 결합 특이성 및/또는 친화성을 가질 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 특정한 기능적 특징 또는 성질을 특징으로 한다. 예를 들어, 일 양태에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
일 양태에서, 항-암 관련 항원(본원에 기술된 바와 같음) 결합 도메인은 단편, 단편, 예를 들어 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일 양태에서, 항-암 관련 항원(본원에 기술된 바와 같음) 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중기능성(예를 들어 이중특이성) 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌[Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 일 양태에서, 본 발명의 항체 및 이의 단편은 야생형 또는 증진된 친화도로 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원에 결합한다.
일부 예에서, scFv는 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 문헌[Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조).scFv 분자는 유연성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어 Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 사용되면(예를 들어 5 내지 10개 아미노산), 쇄내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad.Sci. U.S.A. 90:6444-6448], 미국 특허 출원 공개 제2005/0100543호, 제2005/0175606호, 제2007/0014794호 및 국제 공개 제2006/020258호 및 국제 공개 제2007/024715호를 참조하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
scFv는 그의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복체의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(서열 번호 22). 일 실시 형태에서, 링커는 (Gly4Ser)4(서열 번호 29) 또는 (Gly4Ser)3(서열 번호 30)일 수 있다. 링커 길이의 변이는 활성을 유지시키거나 증진시켜, 활성 연구에서 뛰어난 효능을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체("TCR"), 또는 이의 단편, 예를 들어 단쇄 TCR(scTCR)이다. 이러한 TCR을 제조하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000)]; 문헌[Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004)]; 문헌[Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)](참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다. 예를 들어, 링커(예를 들어, 유연성 펩티드)에 의해 연결된 T 세포 클론으로부터의 Vα 및 Vβ 유전자를 함유하는 scTCR이 조작될 수 있다. 이러한 접근법은 그 자체는 세포내에 있으나 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC에 의해 암 세포의 표면 상에 제시되는 암 관련 표적에 매우 유용하다.
이중특이성 CAR
일 실시 형태에서, 다중특이성 항체 분자는 이중특이성 항체 분자이다. 이중특이성 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질(또는 다량체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질(또는 다량체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반(half) 항체 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항체 분자는 다중특이성(예를 들어 이중특이성 또는 삼중특이성) 항체 분자이다. 이중특이성 또는 이종이량체 항체 분자를 생성하기 위한 프로토콜은 본 기술 분야에 공지되어 있고; 이는 예를 들어 미국 특허 제5731168호에 기술된 "놉 인 홀(knob in a hole)" 접근법; 예를 들어 국제 공개 제09/089004호, 국제 공개 제06/106905호 및 국제 공개 제2010/129304호에 기술된 정전기적 스티어링 Fc 쌍형성; 예를 들어 국제 공개 제07/110205호에 기술된 바와 같은 가닥 교환 조작 도메인(SEED) 이종이량체 형성; 예를 들어 국제 공개 제08/119353호, 국제 공개 제2011/131746호, 및 국제 공개 제2013/060867호에 기술된 바와 같은 Fab 아암 교환; 예를 들어 미국 특허 제4433059호에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 아민 반응기 및 술프히드릴 반응기를 갖는 헤테로이작용성 시약을 사용하여 이중특이성 구조를 생성하기 위한 항체 가교에 의한 이중 항체 콘쥬게이트; 예를 들어 미국 특허 제4444878호에 기술된 바와 같은, 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합의 환원 및 산화의 사이클을 통한 상이한 항체들로부터의 절반 항체들(중쇄-경쇄 쌍 또는 Fab들)의 재조합에 의해 생성된 이중특이성 항체 결정기; 삼중기능성 항체, 예를 들어 술프히드릴 반응기를 통해 가교된 3개의 Fab' 단편(예를 들어 미국 특허 제5273743호에 기술된 바와 같음); 생합성 결합 단백질, 예를 들어 C-말단 테일을 통해, 바람직하게는 디술피드 또는 아민-반응성 화학적 가교을 통해 가교된 scFv의 쌍(예를 들어 미국 특허 제5534254호에 기술된 바와 같음); 이중기능성 항체, 예를 들어 불변 도메인을 대체한 류신 지퍼(예를 들어, c-fos 및 c-jun)를 통해 이량체화된, 상이한 결합 특이성을 갖는 Fab 단편(예를 들어 미국 특허 제5582996호에 기술된 바와 같음); 이중특이성 및 올리고특이성 1가- 및 올리고가 수용체, 예를 들어 한 항체의 CH1 영역과 전형적으로 경쇄와 회합된 다른 항체의 VH 영역 사이에 폴리펩티드 스페이서를 통해 연결된 2개의 항체(2개의 Fab 단편)의 VH-CH1 영역(예를 들어 미국 특허 제5591828호에 기술된 바와 같음); 이중특이성 DNA-항체 콘쥬게이트, 예를 들어 DNA의 이중 가닥 조각을 통한 항체들 또는 Fab 단편들의 가교(예를 들어 미국 특허 제5635602호에 기술된 바와 같음); 이중특이성 융합 단백질, 예를 들어 2개의 scFv를, 이들과 전체 불변 영역 사이의 친수성 나선형 펩티드 링커와 함께 함유하는 발현 구축물(예를 들어 미국 특허 제5637481호에 기술된 바와 같음); 다가 및 다중특이성 결합 단백질, 예를 들어 일반적으로 디아바디로 불리는, Ig 중쇄 가변 영역의 결합 영역을 갖는 제1 도메인, 및 Ig 경쇄 가변 영역의 결합 영역을 갖는 제2 도메인을 갖는 폴리펩티드의 이량체(예를 들어 미국 특허 제5837242호에 기술된 바와 같은, 이중특이성, 삼중특이성 또는 사중특이성 분자를 생성하는 보다 고차원의 구조가 또한 포함됨); 예를 들어 미국 특허 제5837821호에 기술된 바와 같은, 연결된 VL 및 VH 쇄가 항체 힌지 영역 및 CH3 영역에 펩티드 스페이서에 의해 추가로 연결된(이는 이량체화되어 이중특이성/다가 분자를 형성할 수 있음), 미니바디 구축물; 이중특이성 디아바디를 형성하기 위한 이량체를 형성할 수 있는, 짧은 펩티드 링커(예를 들어, 5개 또는 10개 아미노산)를 사용하거나 또는 링커가 전혀 없이 어느 하나의 배향으로 연결된 VH 및 VL 도메인; 예를 들어 미국 특허 제5844094호에 기술된 바와 같은, 삼량체 및 사량체; 예를 들어 미국 특허 제5864019호에 기술된 바와 같은, 일련의 FV(또는 scFv)를 형성하기 위해 VL 도메인과 추가로 회합된, C-말단에서 가교 가능한 기와의 펩티드 연결에 의해 연결된 VH 도메인(또는 패밀리 구성원 내의 VL 도메인)의 스트링; 및 예를 들어 미국 특허 제5869620호에 기술된 바와 같은, scFv 또는 디아바디 유형 포맷 둘 다를 사용하여, 예를 들어 동종2가, 이종2가, 3가 및 4가 구조를 형성하기 위해 비-공유 또는 화학적 가교를 통해 다가 구조로 조합된, 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 및 VL 도메인 둘 다를 갖는 단쇄 결합 폴리펩티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 추가의 예시적인 다중특이성 및 이중특이성 분자 및 그의 제조 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5910573호, 미국 특허 제5932448호, 미국 특허 제5959083호, 미국 특허 제5989830호, 미국 특허 제6005079호, 미국 특허 제6239259호, 미국 특허 제6294353호, 미국 특허 제6333396호, 미국 특허 제6476198호, 미국 특허 제6511663호, 미국 특허 제6670453호, 미국 특허 제6743896호, 미국 특허 제6809185호, 미국 특허 제6833441호, 미국 특허 제7129330호, 미국 특허 제7183076호, 미국 특허 제7521056호, 미국 특허 제7527787호, 미국 특허 제7534866호, 미국 특허 제7612181호, 미국 특허 공개 제2002004587A1호, 미국 특허 공개 제2002076406A1호, 미국 특허 공개 제2002103345A1호, 미국 특허 공개 제2003207346A1, 미국 특허 공개 제2003211078A1호, 미국 특허 공개 제2004219643A1호, 미국 특허 공개 제2004220388A1호, 미국 특허 공개 제2004242847A1호, 미국 특허 공개 제2005003403A1호, 미국 특허 공개 제2005004352A1호, 미국 특허 공개 제2005069552A1호, 미국 특허 공개 제2005079170A1호, 미국 특허 공개 제2005100543A1호, 미국 특허 공개 제2005136049A1호, 미국 특허 공개 제2005136051A1호, 미국 특허 공개 제2005163782A1호, 미국 특허 공개 제2005266425A1호, 미국 특허 공개 제2006083747A1호, 미국 특허 공개 제2006120960A1호, 미국 특허 공개 제2006204493A1호, 미국 특허 공개 제2006263367A1호, 미국 특허 공개 제2007004909A1호, 미국 특허 공개 제2007087381A1호, 미국 특허 공개 제2007128150A1호, 미국 특허 공개 제2007141049A1호, 미국 특허 공개 제2007154901A1호, 미국 특허 공개 제2007274985A1호, 미국 특허 공개 제2008050370A1호, 미국 특허 공개 제2008069820A1호, 미국 특허 공개 제2008152645A1호, 미국 특허 공개 제2008171855A1호, 미국 특허 공개 제2008241884A1호, 미국 특허 공개 제2008254512A1호, 미국 특허 공개 제2008260738A1호, 미국 특허 공개 제2009130106A1호, 미국 특허 공개 제2009148905A1호, 미국 특허 공개 제2009155275A1호, 미국 특허 공개 제2009162359A1호, 미국 특허 공개 제2009162360A1호, 미국 특허 공개 제2009175851A1호, 미국 특허 공개 제2009175867A1호, 미국 특허 공개 제2009232811A1호, 미국 특허 공개 제2009234105A1호, 미국 특허 공개 제2009263392A1호, 미국 특허 공개 제2009274649A1호, 유럽 특허 제346087A2호, 국제 공개 제0006605A2호, 국제 공개 제02072635A2호, 국제 공개 제04081051A1호, 국제 공개 제06020258A2호, 국제 공개 제2007044887A2호, 국제 공개 제2007095338A2호, 국제 공개 제2007137760A2호, 국제 공개 제2008119353A1호, 국제 공개 제2009021754A2호, 국제 공개 제2009068630A1호, 국제 공개 제9103493A1호, 국제 공개 제9323537A1호, 국제 공개 제9409131A1호, 국제 공개 제9412625A2호, 국제 공개 제9509917A1호, 국제 공개 제9637621A2호, 국제 공개 제9964460A1호에서 발견된다. 상기에 언급된 특허 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
이중특이성 항체 분자의 각각의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv) 내에서, VH는 VL의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그의 VH(VH1)가 그의 VL(VL1)의 상류에 있게 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그의 VL(VL2)이 그의 VH(VH2)의 상류에 있게 배열되어, 전체 이중특이성 항체 분자가 배열 VH1-VL1-VL2-VH2를 갖도록 한다. 다른 실시 형태에서, 상류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그의 VL(VL1)이 그의 VH(VH1)의 상류에 있게 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)은 그의 VH(VH2)가 그의 VL(VL2)의 상류에 있게 배열되어, 전체 이중특이성 항체 분자가 배열 VL1-VH1-VH2-VL2를 갖도록 한다. 선택적으로, 링커는 상기 2개의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv) 사이, 예를 들어 구축물이 VH1-VL1-VL2-VH2로 배열된 경우에 VL1과 VL2 사이, 또는 구축물이 VL1-VH1-VH2-VL2로 배열된 경우에 VH1과 VH2 사이에 배치된다. 링커는 본원에 기술된 바와 같은 링커, 예를 들어 (Gly4-Ser)n 링커일 수 있으며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 바람직하게는 4이다(서열 번호 72). 일반적으로, 상기 2개의 scFv 사이의 링커는 2개의 scFv의 도메인 사이의 쌍형성오류를 피하기에 충분히 길어야 한다. 선택적으로, 링커는 제1 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 선택적으로, 링커는 제2 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 다수의 링커를 갖는 구축물에서, 링커 중 임의의 2개 이상은 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 이중특이성 CAR은 VL, VH, 및 선택적으로 1개 이상의 링커를 본원에 기술된 바와 같은 배열로 포함한다.
안정성 및 돌연변이
본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인(예를 들어 가용성 scFv)의 안정성은 통상적인 대조 scFv 분자 또는 전장 항체의 생물물리학적 특성(예를 들어 열안정성)을 기준으로 하여 평가될 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간화 scFv는 기술된 분석법에서 대조 결합 분자(예를 들어 종래의 scFv 분자)보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 또는 약 15℃ 더 큰 열안정성을 갖는다.
본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 개선된 열안정성은 후속적으로 전체 CART20 구축물에 부여되어, CAR 구축물의 개선된 치료 특성을 초래한다. 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열안정성은 종래의 항체와 비교하여 적어도 약 2℃ 또는 3℃ 개선될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 종래의 항체와 비교하여 1℃ 개선된 열안정성을 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 종래의 항체와 비교하여 2℃ 개선된 열안정성을 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 scFv는 종래의 항체와 비교하여 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15℃ 개선된 열안정성을 갖는다. 비교는 예를 들어 본원에 개시된 scFv 분자와, 이 scFv의 VH 및 VL이 유래된 항체의 scFv 분자 또는 Fab 단편 사이에서 이루어질 수 있다. 열안정성은 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어 일 실시 형태에서, Tm이 측정될 수 있다. Tm 측정 방법 및 단백질 안정성을 결정하는 다른 방법이 하기에 보다 상세하게 기술되어 있다.
scFv의 돌연변이(가용성 scFv의 인간화 또는 직접적 돌연변이 유발을 통하여 생김)는 scFv의 안정성을 변경시키고 scFv 및 CAR 구축물의 전체 안정성을 개선시킬 수 있다. 인간화 scFv의 안정성을 Tm, 변성 온도 및 응집 온도와 같은 측정치를 사용하여 쥣과 scFv와 비교한다.
돌연변이 scFv의 결합능은 본 기술 분야에 공지되고 본원에 기술된 분석법을 사용하여 결정될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 인간화 과정에서 생긴 적어도 하나의 돌연변이를 포함하여, 돌연변이된 scFv가 CAR 구축물에 개선된 안정성을 부여하게 한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 예를 들어 인간화 과정에서 생긴 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 돌연변이를 포함하여, 돌연변이된 scFv가 CAR 구축물에 개선된 안정성을 부여하게 한다.
단백질 안정성의 평가 방법
항원 결합 도메인의 안정성은 예를 들어 하기 기술된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 가장 덜 안정한 도메인이 먼저 폴딩해제되거나 또는 협동적으로 폴딩해제되는 다중도메인 유닛(예를 들어 단일의 폴딩해제 전이를 나타내는 다중도메인 단백질)의 전체적인 안정성 역치를 제한하는 다중 열적 폴딩해제 전이의 결정을 가능하게 한다. 가장 덜 안정한 도메인은 수많은 추가의 방식으로 확인될 수 있다. 돌연변이 유발은 어떤 도메인이 전체 안정성을 제한하는지를 프로빙하기 위해 수행될 수 있다. 추가로, 다중도메인 단백질의 프로테아제 저항성은, 가장 덜 안정한 도메인이 DSC 또는 다른 분광학적 방법을 통해 본질적으로 폴딩해제되는 것으로 공지된 조건 하에 수행될 수 있다(문헌[Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26]; 문헌[Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692]). 일단 가장 덜 안정한 도메인이 확인되면, 이러한 도메인(또는 그의 부분)을 코딩하는 서열을 방법에서 테스트 서열로서 사용할 수 있다.
a) 열안정성
조성물의 열안정성은 본 기술 분야에 공지된 수많은 비-제한적 생물물리학적 또는 생화학적 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 열안정성은 분석적 분광법에 의해 평가된다.
예시적인 분석적 분광분석 방법으로는 시차 주사 열량측정법(DSC)이 있다. DSC는 대부분의 단백질 또는 단백질 도메인의 폴딩해제를 수반하는 열 흡수에 감수성인 열량계를 사용한다(예를 들어 문헌[Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988]). 단백질의 열안정성을 결정하기 위해, 단백질의 샘플을 열량계 내로 삽입하고, 온도를 Fab 또는 scFv가 폴딩해제될 때까지 상승시킨다. 단백질이 폴딩해제되는 온도는 전체적인 단백질 안정성을 나타낸다.
또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법으로는 원편광 이색성(CD) 분광법이 있다. CD 분광분석법은 온도 증가의 함수로서 조성물의 광학 활성을 측정한다. 원편광 이색성(CD) 분광법은 구조적 비대칭으로 인해 발생하는 좌선회 편광 대 우선회 편광의 흡광도의 차이를 측정한다. 불규칙적 또는 폴딩해제 구조는 규칙적 또는 폴딩 구조의 것과 매우 상이한 CD 스펙트럼을 초래한다. CD 스펙트럼은 증가하는 온도의 변성 효과에 대한 단백질의 감수성을 반영하고, 따라서 단백질의 열안정성을 나타낸다(문헌[van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000] 참조).
열안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법으로는 형광 방출 분광법이 있다(상기 문헌[van Mierlo and Steemsma] 참조). 열안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법으로는 핵자기 공명(NMR) 분광법이 있다(예를 들어 상기 문헌[van Mierlo and Steemsma] 참조).
조성물의 열안정성은 생화학적으로 측정될 수 있다. 열안정성을 평가하기 위한 예시적인 생화학적 방법으로는 열 챌린지 분석법이 있다. "열 챌린지 분석법"에서, 조성물은 설정된 기간 동안 소정의 범위의 상승된 온도로 처리된다. 예를 들어 일 실시 형태에서, 테스트 scFv 분자 또는 scFv 분자 함유 분자는 소정의 범위의 증가하는 온도로, 예를 들어 1 내지 1.5시간 동안 처리된다. 이어서, 단백질의 활성을 관련 생화학적 분석법에 의해 분석한다. 예를 들어 단백질이 결합 단백질(예를 들어 scFv 또는 scFv-함유 폴리펩티드)인 경우에, 결합 단백질의 결합 활성은 기능적 또는 정량적 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
이러한 분석법은 에스케리키아 콜라이 및 고처리량 스크리닝을 사용하여 고처리량 포맷 및 실시예에 개시된 포맷으로 수행될 수 있다. 예를 들어 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인의 라이브러리, 예를 들어, scFv 변이체는 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 발현이 유도될 수 있고, 예를 들어 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv에 열 챌린지를 가할 수 있다. 챌린지된 테스트 샘플을 결합에 대해 분석할 수 있고, 안정한, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 규모 확대하여 추가로 특성화할 수 있다.
열안정성은 임의의 상기 기술(예를 들어 분석적 분광분석 기술)을 사용하여 조성물의 용융 온도(Tm)를 측정함으로써 평가된다. 용융 온도는 조성물의 분자의 50%가 폴딩된 상태로 존재하는 열 전이 곡선의 중간점의 온도이다(예를 들어 문헌[Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692] 참조). 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 일 실시 형태에서, IgG의 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 일 실시 형태에서, 다가 항체의 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다.
열안정성은 또한 분석적 열량측정 기술(예를 들어 DSC)을 사용하여 조성물의 비열 또는 열용량(Cp)을 측정함으로써 평가된다. 조성물의 비열은 1 mol의 물의 온도를 1℃ 상승시키기 위해 필요한 에너지(예를 들어 kcal/mol 단위)이다. 큰 Cp는 변성 또는 불활성 단백질 조성물의 특징이다. 조성물의 열용량의 변화(ΔCp)는 그의 열 전이 이전 및 이후에 조성물의 비열을 결정함으로써 측정된다. 열안정성은 또한 폴딩해제의 깁스(Gibbs) 자유 에너지(ΔG), 폴딩해제의 엔탈피(ΔH), 또는 폴딩해제의 엔트로피(ΔS)를 비롯한 열역학적 안정성의 다른 파라미터를 측정하거나 결정함으로써 평가될 수 있다. 상기 생화학적 분석법 중 하나 이상(예를 들어 열 챌린지 분석법)이, 조성물의 50%가 그의 활성(예를 들어 결합 활성)을 보유하는 온도(즉, TC 값)를 결정하는데 사용된다.
게다가, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 돌연변이는, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 비돌연변이 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv와 비교하여, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 열안정성을 변경하도록 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 인간화 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv가 CAR 구축물 내로 포함되는 경우, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, 인간화 scFv는 본 발명의 전체 CAR에 열안정성을 부여한다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv에 열안정성을 부여하는 단일 돌연변이를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv에 열안정성을 부여하는 다중 돌연변이를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv에서의 다중 돌연변이는 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 열안정성에 대하여 상가 효과를 갖는다.
b) 응집 %
조성물의 안정성은 그의 응집 성향을 측정함으로써 결정될 수 있다. 응집은 수많은 비-제한적인 생화학적 또는 생물물리학적 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 크로마토그래피, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 조성물의 응집을 평가할 수 있다. SEC는 크기에 기초하여 분자를 분리한다. 컬럼은, 이온 및 소분자를 내부에 수용하지만 큰 것은 수용하지 않을 중합체 겔의 반-고체 비드로 채워진다. 단백질 조성물이 컬럼의 상단에 적용되는 경우에, 콤팩트 폴딩 단백질(즉, 비-응집된 단백질)은 큰 단백질 응집체가 이용할 수 있는 것보다 더 큰 부피의 용매의 도처에 분포된다. 그 결과, 큰 응집체는 컬럼을 관통하여 보다 신속하게 이동하고, 이러한 방식으로 혼합물이 그의 성분으로 분리되거나 분획화될 수 있다. 각각의 분획은 그것이 겔로부터 용리됨에 따라 개별적으로 정량화될 수 있다(예를 들어 광 산란에 의해). 따라서, 조성물의 응집 %는 분획의 농도를 겔에 적용된 단백질의 총 농도와 비교함으로써 결정될 수 있다. 안정한 조성물은 컬럼으로부터 본질적으로 단일의 분획으로서 용리되고, 용리 프로파일 또는 크로마토그램에서 본질적으로 단일 피크로 나타난다.
c) 결합 친화도
조성물의 안정성은 그의 표적 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 매우 다양한 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용한다. 표면 플라즈몬 공명은 예를 들어 비아코어(BIAcore) 시스템(Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상이다. 추가의 설명에 대해서는, 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26]; 문헌[Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627]; 문헌[Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131]; 및 문헌[Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다.
일 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 항원 결합 도메인 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 항원 결합 도메인의 원하는 기능적 특성을 보유한다.
하나의 구체적 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가적인 양태에서, 항체 단편은 scFv를 포함한다.
다양한 양태에서, CAR의 항원 결합 도메인은 하나의 또는 둘 다의 가변 영역(예를 들어 VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 조작된다. 하나의 구체적 양태에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가적인 양태에서, 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 아미노산 서열은 변경되지만 (예를 들어 야생형으로부터) 원하는 활성은 변경되지 않도록 추가로 변형될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어 "비필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 야기하는 추가의 뉴클레오티드 치환이 단백질에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어 분자 내 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있고, 예를 들어 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 보존적 치환이 이루어질 수 있다.
염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 본 기술 분야에 정의되어 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 동일성 백분율은 동일한 2개 이상의 서열을 언급한다. 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응을 위해 비교 및 정렬된 경우, 2개의 서열이 명시된 백분율(예를 들어, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에 전체 서열에 걸쳐, 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성)의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 경우에, 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다".선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드(또는 10개의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20개, 50개, 200개 이상의 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 테스트 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 테스트 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 그런 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 Genetics Computer Group의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해(예를 들어 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘의 2가지 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있고, 이들은 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내에 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열들 사이의 동일성(%)은 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있는데, 이는 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 포함된 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 기능적으로 등가인 분자를 생성하는 출발 항체 또는 단편(예를 들어 scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, CAR 내에 포함된, 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 VH 또는 VL은 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 출발 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 기능적으로 등가인 분자를 생성하기 위하여 전체 CAR 구축물의 변형, 예를 들어 CAR 구축물의 다양한 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열에서의 변형을 고려한다. CAR 구축물은 출발 CAR 구축물의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다.
막관통 도메인
막관통 도메인과 관련하여, 다양한 실시 형태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 부착된 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막관통 영역이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산(예를 들어 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가의 아미노산(예를 들어 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나와 관련된 것이고, 예를 들어 일 실시 형태에서, 막관통 도메인은 신호전달 도메인, 공동자극 도메인 또는 힌지 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터의 것일 수 있다. 또 다른 양태에서, 막관통 도메인은 CAR의 임의의 다른 도메인이 유래된 동일한 단백질로부터 유래되지 않는다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 CAR-발현 세포의 세포 표면 상의 또 다른 CAR과의 동종이량체화가 가능하다. 상이한 양태에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포에 존재하는 고유 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 변형되거나 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 상기 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에의 신호전달이 가능하다. 본 발명에서 특정 용도의 막관통 도메인은 적어도, 예를 들어 T 세포 수용체인 CD28, CD27, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은 적어도, 예를 들어 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어 일 실시 형태에서, 힌지는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지(예를 들어 IgG4 힌지, IgD 힌지), GS 링커(예를 들어 본원에 기술된 GS 링커), KIR2DS2 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 일 실시 형태에서, 힌지 또는 스페이서는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다(예를 들어, 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어진다). 일 양태에서, 막관통 도메인은 서열 번호 12의 막관통 도메인을 포함한다(예를 들어, 서열 번호 12의 막관통 도메인으로 이루어진다).
일 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00104
일 실시 형태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00105
일 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00106
일 실시 형태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00107
일 양태에서, 막관통 도메인은 재조합 도메인일 수 있고, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 주로 포함할 것이다. 일 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 재조합 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
선택적으로 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 일 양태에서, 링커는 GGGGSGGGGS(서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(서열 번호 11)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
일 양태에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
세포질 도메인
CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일반적으로 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 도입된 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에서 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 경우에, 이러한 절두된 부분은, 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 무손상 쇄 대신 사용될 수 있다. 이에 따라, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함함을 의미한다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공동수용체 및 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열과, 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 재조합 서열을 포함한다.
단독의 TCR을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에는 불충분하고, 이차 및/또는 공동자극 신호가 또한 필요함이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 다음의 2개의 별개의 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것(일차 세포내 신호전달 도메인) 및 이차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것(이차 세포질 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인).
일차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 일차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에 특히 유용한 일차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, 통상적인 FcR 감마(FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12의 것을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시 형태에서, 일차 신호전달 도메인은 고유 ITAM 도메인과 비교하여 변경된(예를 들어 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 일차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화된 및/또는 절두된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 일차 신호전달 도메인은 1, 2, 3 또는 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 자체적으로 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나, 본 발명의 CAR의 맥락에 유용한 임의의 기타 원하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어 CD27 공동자극은 시험관 내에서 인간 CART 세포의 확장, 이펙터 기능, 및 생존을 증진시키고, 생체 내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증강시키는 것으로 입증된 바 있다(문헌[Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706]). 이러한 공동자극 분자의 추가적인 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, 및 CD19a를 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 서로 무작위로 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 세포내 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일 실시 형태에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 실시 형태에서, 상기 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기술된 링커 분자에 의해 분리된다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열 번호 14의 신호전달 도메인이다. 일 양태에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열 번호 18의 신호전달 도메인이다.
일 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 양태에서, CD27의 신호전달 도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00108
(서열 번호 16). 일 양태에서, CD27의 신호전달 도메인은 다음의 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00109
일 양태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적 또는 상이한 표적(예를 들어 본원에 기술된 암 관련 항원 또는 본원에 기술된 상이한 암 관련 항원 이외의 표적)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 제2 CAR은 암 관련 항원과 동일한 암 세포 유형에 의해 발현된 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, CAR-발현 세포는 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 일차 신호전달 도메인을 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 일차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인을 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27 또는 OX-40을 제1 CAR에, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 둘 다의 표적이 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 일 실시 형태에서, CAR 발현 세포는 본원에 기술된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 암 관련 항원 CAR, 및 상이한 표적 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하며, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, CAR 발현 세포는, 본원에 기술된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제1 표적 항원 이외의 항원(예를 들어, 제1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에서 발현되는 항원)을 표적화하며, 상기 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
일 실시 형태에서, CAR-발현 세포는 본원에 기술된 XCAR 및 억제성 CAR을 포함한다. 일 실시 형태에서, 억제성 CAR은 암 세포에서는 발견되지 않지만, 정상 세포, 예를 들어 또한 CLL을 발현하는 정상 세포에서 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 억제성 CAR은 억제성 분자의 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어 억제성 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어 CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGF 베타의 세포내 도메인일 수 있다.
일 실시 형태에서, CAR-발현 세포가 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 경우에, 상이한 CAR의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어 제1 및 제2 CAR을 발현하는 세포는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 회합을 형성하지 않는 단편, 예를 들어 scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 VHH이다.
일부 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 그의 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 분자를 포함하는 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함한다. 예는 중쇄 가변 도메인, 천연적으로 경쇄가 결여된 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인, 조작된 도메인 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. SDAB 분자는 본 기술 분야의 것, 또는 임의의 장래의 단일 도메인 분자 중 임의의 것일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일 양태에서, SDAB 분자는 어류에서 관찰되는 면역글로불린, 예컨대, 예를 들어 상어의 혈청에서 발견되는 신규 항원 수용체(NAR)로서 공지된 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래된 것의 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR("IgNAR")의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자를 생성하는 방법은 국제 공개 제03/014161호 및 문헌[Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909]에 기술되어 있다.
또 다른 양태에 따르면, SDAB 분자는 경쇄가 없는 중쇄로서 공지된 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어 국제 공개 제9404678호 및 문헌[Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 천연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 4쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로 공지된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종으로부터, 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 유래될 수 있다. 낙타과 외의 다른 종이 천연적으로 경쇄가 없는 중쇄 분자를 생성할 수 있고; 이러한 VHH는 본 발명의 범주 내에 있다.
SDAB 분자는 재조합, CDR-그라프팅, 인간화, 낙타화, 탈-면역화 및/또는 시험관 내 생성될(예를 들어 파지 디스플레이에 의해 선발될) 수 있다.
또한, 수용체의 항원 결합 도메인 사이의 상호작용은 예를 들어 항원 결합 도메인 중 하나 이상이 그의 동족 항원에 결합하는 능력을 억제하기 때문에, 항원 결합 도메인을 포함하는 복수의 키메라 막 임베딩된 수용체를 갖는 세포는 바람직하지 않을 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비-자연 발생 키메라 막 임베딩 수용체를 갖는 세포가 본원에 개시된다. 또한, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비-자연 발생 키메라 막 임베딩 수용체를 코딩하는 핵산과, 이러한 세포 및 핵산의 제조 및 사용 방법이 본원에 개시된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및 상기 제2 비-자연 발생 키메라 막 임베딩 수용체 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 청구된 발명은 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR을 포함하며, 여기서 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv이고, 다른 하나는 scFv가 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 나노바디를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 나노바디를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에의 결합은 상기 제2 CAR의 존재에 의해서는 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 CAR의 존재 하의 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에의 결합은 상기 제2 CAR의 부재 하의 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에의 결합의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 실시 형태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 덜 회합한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 적게 회합한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 또 다른 에이전트, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 억제성 분자를 억제하는 에이전트일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어 PD1은 일부 실시 형태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF 베타를 포함한다. 일 실시 형태에서, 억제성 분자를 억제하는 에이전트는 예를 들어 본원에 기술된 분자, 예를 들어, 제1 폴리펩티드(예를 들어, 억제성 분자)가, 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인)와 회합된 것을 포함하는 에이전트이다. 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 예를 들어 억제성 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어 CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGF 베타 또는 이들 중 임의의 것의 단편(예를 들어 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 공동자극 도메인(예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 PD1의 제1 폴리펩티드 또는 그의 단편(예를 들어 PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부), 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA도 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제성 분자이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수성 세포 상에서 발현된다(문헌[Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75]). PD1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD1에의 결합시에 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(문헌[Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34]; 문헌[Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8]; 문헌[Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43]). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다(문헌[Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7]; 문헌[Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314]; 문헌[Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094]). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국소적 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 막관통 도메인 및 41BB와 CD3 제타와 같은 세포내 신호전달 도메인에 융합된 억제성 분자(예를 들어 PD1(Programmed Death 1)의 세포외 도메인(ECD)을 포함한다(본원에서 PD1 CAR이라고도 지칭됨). 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 XCAR과 조합하여 사용되는 경우 PD1 CAR은 T 세포의 지속성을 증진시킨다. 일 실시 형태에서, CAR은 서열 번호 26에 밑줄로 표시한 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 CAR이다. 일 실시 형태에서, PD1 CAR은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00110
일 실시 형태에서, PD1 CAR은 하기에 제공된 아미노산 서열(서열 번호 39)을 포함한다.
Figure pct00111
일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 PD1 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 PD1 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, PD1 CAR의 핵산 서열을 하기에 나타내며, 이때 PD1 ECD는 하기 서열 번호 27에서 밑줄이 그어져 있다.
Figure pct00112
또 다른 양태에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어, CART 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시 형태에서, CAR-발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, CART 세포의 집단은 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 상이한 항원 결합 도메인, 예를 들어, 본원에 기술된 상이한 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인(예를 들어, 제1 세포에 의해 발현된 CAR의 항원 결합 도메인이 결합하는 암 관련 항원과는 상이한 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인)을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR 발현 세포의 집단은 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 본원에 기술된 암 관련 항원 이외의 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포 및 이차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 집단 내의 적어도 하나의 세포가 본원에 기술된 암 관련 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하고, 제2 세포가 또 다른 에이전트(예를 들어, CAR 발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트)를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 예를 들어 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 억제성 분자를 억제하는 에이전트일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어 PD-1은 일부 실시 형태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF 베타를 포함한다. 일 실시 형태에서, 억제성 분자를 억제하는 에이전트는 예를 들어 본원에 기술된 분자, 예를 들어, 제1 폴리펩티드(예를 들어, 억제성 분자)가, 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인)와 회합된 것을 포함하는 에이전트이다. 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 예를 들어 억제성 분자, 예컨대 PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어 CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGF 베타 또는 이들 중 임의의 것의 단편의 제1 폴리펩티드 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어 공동자극 도메인(예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, OX40 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 PD-1 또는 그 단편의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 또 다른 에이전트, 예를 들어 키나아제 억제제, 예컨대 본원에 기술된 키나아제 억제제와 조합하여 CAR-발현 세포의 집단, 예를 들어 CAR-발현 세포, 예를 들어 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또 다른 에이전트(예를 들어, 본원에 기술된 키나아제 억제제와 같은 키나아제 억제제)와 조합하여 세포의 집단을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서, 집단 내의 적어도 하나의 세포는 본원에 기술된 암 관련 항원의 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하고, 제2 세포는 또 다른 에이전트(예를 들어, CAR 발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트)를 발현한다.
조절가능한 키메라 항원 수용체
일부 실시 형태에서, CAR 활성이 제어될 수 있는 조절가능한 CAR(RCAR)은 CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는데 바람직하다. CAR 활성을 조절할 수 있는 많은 방식이 존재한다. 예를 들어 이량체화 도메인에 융합된 카스파아제를 사용한 유도가능한 아폽토시스(예를 들어 문헌[Di et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683] 참조)는 본 발명의 CAR 요법에서 안전성 스위치로서 사용될 수 있다. 일 양태에서, RCAR은 가장 단순한 실시 형태에서 전형적으로 2개인 폴리펩티드의 세트를 포함하며, 여기서 본원에 기술된 표준 CAR의 구성요소, 예를 들어 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 개별 폴리펩티드 또는 구성원 상에서 분할되어 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재시에 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다.
일 양태에서, RCAR은 다음의 2가지의 폴리펩티드 또는 구성원을 포함한다: 1) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 일차 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 2) 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, 본원에 기술된 종양 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원. 선택적으로 RCAR은 본원에 기술된 막관통 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 막관통 도메인은 세포내 신호전달 구성원에, 항원 결합 구성원에, 또는 둘 다에 배치될 수 있다. (달리 나타내지 않는 한, RCAR의 구성원 또는 요소가 본원에 기술된 경우에, 순서는 제공된 바와 같을 수 있지만, 다른 순서가 또한 포함된다. 다시 말해서, 일 실시 형태에서 순서는 텍스트에 제시된 바와 같지만, 일부 실시 형태에서 순서는 상이할 수 있다. 예를 들어 막관통 영역의 한 면 상의 요소의 순서는 실시예와 상이할 수 있고, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인에 대한 스위치 도메인의 배치는 상이할 수 있고, 예를 들어 역전될 수 있다).
일 실시 형태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 세포내 또는 세포외 이량체화 스위치를 형성할 수 있다. 일 실시 형태에서, 이량체화 스위치는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 동일한 동종이량체화 스위치, 또는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 서로 상이한 이종이량체화 스위치일 수 있다.
실시 형태들에서, RCAR은 "다중 스위치"를 포함할 수 있다. 다중 스위치는 이종이량체화 스위치 도메인 또는 동종이량체화 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 다중 스위치는 제1 구성원, 예를 들어 항원 결합 구성원, 및 제2 구성원, 예를 들어 세포내 신호전달 구성원 상에 독립적으로 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 스위치 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 구성원은 복수의 제1 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반의 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 복수의 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FRB-기반의 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 제1 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반의 스위치 도메인 및 FRB-기반의 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반의 스위치 도메인 및 FRB-기반의 스위치 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 구성원은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 일차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시 형태에서, 항원 결합 구성원은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 구성원은 본원에 기술된, 예를 들어 41BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 복수의, 예를 들어 2 또는 3개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 실시 형태들에서 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 구성원은 세포외로부터 세포내 방향으로 하기 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다:41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; 또는 41BB-CD28. 이러한 실시 형태에서, 세포내 결합 구성원은 CD3제타 도메인을 포함한다. 하나의 이러한 실시 형태에서, RCAR은 (1) 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 2개의 공동자극 도메인 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원; 및 (2) 막관통 도메인 또는 막 테더링 도메인 및 적어도 하나의 일차 세포내 신호전달 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시 형태는 항원 결합 구성원이 CAR 세포의 표면에 테더링되지 않은 RCAR을 제공한다. 이는, 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열로 세포를 형질전환시키지 않고서도, 하나 이상의 항원 결합 도메인과 편리하게 쌍을 형성하는 세포내 신호전달 구성원을 세포가 갖게 한다. 이러한 실시 형태에서, RCAR은 1) 제1 스위치 도메인, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 일차 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원을 포함하며, 여기서 항원 결합 구성원은 막관통 도메인 또는 막 테더링 도메인을 포함하지 않고, 선택적으로, 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, RCAR은 3) 제2 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인이 결합하는 것과는 상이한 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인; 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 구성원을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 항원 결합 구성원이 이중특이적 활성화 및 표적화 능력을 포함하는 RCAR이 본원에 제공된다. 이러한 실시 형태에서, 항원 결합 구성원은 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개의 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 표적 항원, 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다. 일 실시 형태에서, 복수의 항원 결합 도메인은 탠덤으로 존재하고, 선택적으로 링커 또는 힌지 영역이 각각의 항원 결합 도메인 사이에 배치된다. 적합한 링커 및 힌지 영역이 본원에 기술되어 있다.
일 실시 형태는 증식의 전환을 가능하게 하는 구성을 갖는 RCAR을 제공한다. 이러한 실시 형태에서, RCAR은 1) 선택적으로, 막관통 도메인 또는 막 테더링 도메인; 예를 들어 41BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 일차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3제타 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원을 포함하며, 여기서 항원 결합 구성원은 스위치 도메인을 포함하지 않거나, 또는 세포내 신호전달 구성원 상의 스위치 도메인과 이량체화하는 스위치 도메인을 포함하지 않는다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 구성원은 공동자극 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 구성원은 동종이량체화 스위치로부터의 스위치 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 구성원은 이종이량체화 스위치의 제1 스위치 도메인을 포함하고, RCAR은 이종이량체화 스위치의 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 구성원을 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 제2 세포내 신호전달 구성원은 세포내 신호전달 구성원과 동일한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이량체화 스위치는 세포내에 존재한다. 일 실시 형태에서, 이량체화 스위치는 세포외에 존재한다.
본원에 기술된 임의의 RCAR 구성에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 FKBP-FRB-기반의 스위치를 포함한다.
또한, 본원에 기술된 RCAR을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. RCAR을 발현하도록 조작된 임의의 세포가 RCARX 세포로서 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서 RCARX 세포는 T 세포이고, RCART 세포로서 지칭된다. 일 실시 형태에서, RCARX 세포는 NK 세포이고, RCARN 세포로서 지칭된다.
또한, RCAR 코딩 서열을 포함하는 핵산 및 벡터가 본원에 제공된다. RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 일 실시 형태에서, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열 및 (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 동일한 핵산, 예를 들어 벡터 상에 존재할 수 있다. 상응하는 단백질의 생성은, 예를 들어 개별 프로모터의 사용에 의해, 또는 이중시스트론성 전사 생성물(단일 번역 생성물의 절단에 의해 또는 2개의 개별 단백질 생성물의 번역에 의해 2가지의 단백질의 생성을 초래할 수 있음)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 절단가능한 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어 P2A 또는 F2A 서열은 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 펩티드 절단 부위의 예는 다음을 포함하고, 여기서, GSG 잔기는 선택적이다:
Figure pct00113
일 실시 형태에서, IRES, 예를 들어 EMCV 또는 EV71 IRES를 코딩하는 서열이 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 이들 실시 형태에서, (i) 및 (ii)는 단일 RNA로서 전사된다. 일 실시 형태에서, (i) 및 (ii)가 개별 mRNA로서 전사되도록, 제1 프로모터는 (i)에 작동가능하게 연결되고, 제2 프로모터는 (ii)에 작동가능하게 연결된다.
대안적으로, RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자, 예를 들어 상이한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 예를 들어 (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열은 제1 핵산, 예를 들어 제1 벡터 상에 존재할 수 있고, (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 제2 핵산, 예를 들어 제2 벡터 상에 존재할 수 있다.
이량체화 스위치
이량체화 스위치는 비-공유적이거나 공유적일 수 있다. 비-공유적 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 비-공유적 상호작용을 촉진한다. 공유적 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 공유적 상호작용을 촉진한다.
일 실시 형태에서, RCAR은 FKBP/FRAP 또는 FKBP/FRB-기반의 이량체화 스위치를 포함한다. FKBP12(FKBP 또는 FK506 결합 단백질)는 천연 생성물 면역억제 약물인 라파마이신에 대한 초기 세포내 표적으로서의 역할을 하는 풍부한 세포질 단백질이다. 라파마이신은 FKBP 및 대형 PI3K 상동체 FRAP(RAFT, mTOR)에 결합한다. FRB는 FKBP-라파마이신 복합체에 결합하기에 충분한 FRAP의 93개의 아미노산 부분이다(문헌[Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51]).
실시 형태들에서, FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반의 스위치는 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 사용할 수 있다.
FKBP의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00114
실시 형태들에서, FKBP 스위치 도메인은 다음의 것인, 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB 또는 그의 단편 또는 유사체와 결합하는 능력을 갖는 FKBP의 단편(예를 들어, 서열 번호 54의 밑줄이 그어진 부분)을 포함할 수 있다:
Figure pct00115
FRB의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00116
본원에 사용된 용어 "FKBP/FRAP, 예를 들어, FKBP/FRB 기반의 스위치"는 다음을 포함하는 이량체화 스위치를 지칭한다: 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001의 존재 하에, FRB, 또는 이의 단편 또는 유사체와 결합하는 능력을 갖는 FKBP 단편 또는 이의 유사체를 포함하고, 서열 번호 54 또는 55의 FKBP 서열과의 동일성이 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%이거나, 또는 서열 번호 54 또는 55의 FKBP 서열과는 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 상이한 제1 스위치 도메인; 및 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에, FRB, 또는 이의 단편 또는 유사체와 결합하는 능력을 갖는 FRB 단편 또는 이의 유사체를 포함하고, 서열 번호 56의 FRB 서열과의 동일성이 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%이거나, 또는 서열 번호 56의 FRB 서열과는 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 상이한 제2 스위치 도메인.일 실시 형태에서, 본원에 기술된 RCAR은 서열 번호 54(또는 서열 번호 55)에 개시된 아미노산 잔기를 포함하며, 하나의 스위치 도메인은 서열 번호 56에 개시된 아미노산 잔기를 포함한다.
실시 형태들에서, FKBP/FRB 이량체화 스위치는 FRB-기반 스위치 도메인, 예를 들어 변형된 FRB 스위치 도메인, FKBP-기반 스위치 도메인과 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001 사이에 변경된, 예를 들어 증진된 복합체 형성을 나타내는 변형된 FRB 스위치 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 변형된 FRB 스위치 도메인은 아미노산 위치(들) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105, 및 F2108에서의 돌연변이로부터 선택된, 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 야생형 아미노산은 임의의 다른 자연-발생 아미노산으로 돌연변이된다. 일 실시 형태에서, 돌연변이 FRB는 E2032에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 페닐알라닌(E2032F), 메티오닌(E2032M), 아르기닌(E2032R), 발린(E2032V), 티로신(E2032Y), 이소류신(E2032I), 예를 들어 서열 번호 57, 또는 류신(E2032L), 예를 들어 서열 번호 58로 돌연변이된다. 일 실시 형태에서, 돌연변이 FRB는 T2098에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 T2098은 페닐알라닌(T2098F) 또는 류신(T2098L), 예를 들어 서열 번호 59로 돌연변이된다. 일 실시 형태에서, 돌연변이 FRB는 E2032 및 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 임의의 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 T2098은 임의의 아미노산, 예를 들어 서열 번호 60으로 돌연변이된다. 일 실시 형태에서, 돌연변이 FRB는 E2032I 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열 번호 61을 포함한다. 일 실시 형태에서, 돌연변이 FRB는 E2032L 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열 번호 62를 포함한다.
[표 10]
Figure pct00117
다른 적합한 이량체화 스위치는 GyrB-GyrB 기반 이량체화 스위치, 지베렐린-기반 이량체화 스위치, 태그/바인더 이량체화 스위치, 및 할로-태그/스냅-태그 이량체화 스위치를 포함한다. 본원에 제공된 안내에 따르면, 이러한 스위치 및 관련 이량체화 분자는 숙련자에게 명백할 것이다.
이량체화 분자
스위치 도메인 사이의 회합은 이량체화 분자에 의해 촉진된다. 이량체화 분자의 존재 하에, 스위치 도메인 사이의 상호작용 또는 회합은 제1 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 이에 융합된 폴리펩티드와 제2 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 이에 융합된 폴리펩티드 사이의 신호 전달을 허용한다. 비-제한적 수준의 이량체화 분자의 존재 하에, 신호 전달은 예를 들어 본원에 기술된 시스템에서 측정할 경우 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 5, 10, 50, 100배 증가된다.
라파마이신 및 라파마이신 유사체(때때로 라파로그로 지칭됨), 예를 들어 RAD001은 본원에 기술된 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치에서 이량체화 분자로서 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 이량체화 분자는 라파마이신(시롤리무스(sirolimus)), RAD001(에베롤리무스(everolimus)), 조타롤리무스(zotarolimus), 템시롤리무스(temsirolimus), AP-23573(리다포롤리무스(ridaforolimus)), 비올리무스(biolimus) 및 AP21967로부터 선택될 수 있다. FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치와 함께 사용하기에 적합한 추가의 라파마이신 유사체는 섹션 표제 "병용 요법", 또는 서브섹션 표제 "예시적인 mTOR 억제자"에 추가로 기술되어 있다.
스플릿 CAR
일부 실시 형태에서, CAR-발현 세포는 스플릿 CAR을 사용한다. 스플릿 CAR 접근법은 국제 공개 제2014/055442호 및 국제 공개 제2014/055657호에 보다 상세히 설명되어 있다. 간단히 말하자면, 스플릿 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인(예를 들어, 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하며, 이 세포는 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 또한 발현한다. 세포가 제1 항원을 만난 경우에, 공동자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원을 만난 경우에, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포-사멸 활성이 시작된다. 따라서, CAR-발현 세포는 오직 둘 다의 항원의 존재 하에서만 완전히 활성화된다.
RNA 트랜스펙션
시험관 내 전사된 RNA CAR을 생성하는 방법이 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 세포를 직접 트랜스펙션시킬 수 있는 CAR 코딩 RNA 구축물을 포함한다. 트랜스펙션에 사용하기 위한 mRNA의 생성 방법은 특수 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관 내 전사(IVT)에 이어서 폴리A 부가를 수반하여, 3' 및 5' 비번역 서열("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 발현될 핵산 및 전형적으로 50 내지 2000개 염기 길이인 폴리A 테일을 함유하는 구축물(서열 번호 32)을 생성할 수 있다. 이렇게 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 트랜스펙션시킬 수 있다. 일 양태에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR은 메신저 RNA(mRNA)에 의해 코딩된다. 일 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 mRNA는 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR NK 세포의 생성을 위해 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 도입된다.
일 실시 형태에서, 시험관 내 전사된 RNA CAR은 일시적 트랜스펙션의 형태로 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)으로 생성된 주형을 이용한 시험관 내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR에 의해 시험관 내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관 내 전사를 위한 원하는 주형은 본원에 기술된 CAR이다. 예를 들어, RNA CAR을 위한 주형은 본원에 기술된 종양 관련 항원에 대한 항체의 단쇄 가변 도메인; 힌지 영역(예를 들어, 본원에 기술된 힌지 영역), 막관통 도메인(예를 들어, CD8a의 막관통 도메인과 같은 본원에 기술된 막관통 도메인)을 포함하는 세포외 영역; 및 예를 들어, CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
일 실시 형태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터의 자연 발생 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 일 실시 형태에서, 핵산은 일부의 또는 모든 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 실시 형태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 자연 발생 유기체에서 정상적으로는 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열로는 함께 라이게이션되어 융합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 형성하는 유전자의 부분을 함유하는 것이 있다. 함께 라이게이션되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 1가지 초과의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 트랜스펙션을 위해 사용되는 mRNA의 시험관 내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 내 염기의 대부분 또는 전부가 상보적이거나, 또는 하나 이상의 염기가 비-상보적이거나 미스매치된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건에서 의도된 DNA 표적과 어닐링 또는 혼성화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분(오픈 리딩 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정한 관심 도메인을 코딩하는 핵산의 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다. 일 실시 형태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계될 수 있다. PCR에 유용한 프라이머는 본 기술 분야에 잘 알려진 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열에 대해 5' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류에 있는 이중 가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열에 대해 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라아제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라아제는 수많은 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조도 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 실시 형태에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 트랜스펙션 후에 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내로 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율의 변형에 유용할 수 있다. 예를 들어 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있음이 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 본 기술 분야에 잘 알려진 UTR의 특성을 기초로 하여 전사되는 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 실시 형태에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기술된 바와 같이 PCR에 의해 부가되는 경우에, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열에 대한 요건은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 다른 실시 형태에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 실시 형태에서, mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키기 위해 3' 또는 5' UTR에 다양한 뉴클레오티드 유사체가 사용될 수 있다.
유전자 클로닝을 필요로 하지 않으면서 RNA를 DNA 주형으로부터 합성할 수 있기 위해, 전사 프로모터는 전사시킬 서열의 상류의 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라아제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 부가되는 경우에, RNA 폴리머라아제 프로모터는 전사되는 오픈 리딩 프레임의 상류의 PCR 생성물 내로 혼입된다. 하나의 바람직한 실시 형태에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 T7 폴리머라아제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라아제 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터의 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 본 기술 분야에 알려져 있다.
바람직한 실시 형태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 상의 캡 및 3' 폴리(A) 테일 둘 다를 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라아제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카타머 생성물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화되는 경우에도 진핵 트랜스펙션에 유효하지 않은 정상 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라아제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 연장할 수 있다(문헌[Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)]; 문헌[Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)]).
폴리A/T 스트레치의 DNA 주형 내로의 통상적인 통합 방법으로는 분자 클로닝이 있다. 그러나, 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 이것은 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상에 의해 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 절차를 어렵고 시간 소모적으로 만들 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 이러한 이유 때문에, 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치를 갖는 DNA 주형의 구축를 가능하게 하는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 폴리T 테일, 예컨대 100T 테일(서열 번호 35)(크기는 50~5000 T(서열 번호36)일 수 있음)을 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 중에, 또는 DNA 라이게이션 또는 시험관 내 재조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 RNA에 안정성을 제공하고, 그들의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 일 실시 형태에서, poly(A) 테일은 100 내지 5000개의 아데노신(예를 들어, 서열 번호 37)이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 폴리(A) 폴리머라아제, 예컨대 에스케리키아 콜라이 폴리A 폴리머라아제(E-PAP)를 사용하여 시험관 내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 일 실시 형태에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개 뉴클레오티드로부터 300 내지 400개 뉴클레오티드(서열 번호 38)로 증가시키면 RNA의 번역 효율이 약 2배 증가한다. 추가로, 상이한 화학기의 3' 말단에의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어 ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라아제를 사용하여 폴리(A) 테일 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 본 기술 분야에 공지되고 본원에 설명된 기술을 이용하여 제공된다(문헌[Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)]; 문헌[Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)]; 문헌[Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)]).
본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA로의 캡-비의존성 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적 설계 서열일 수 있다. 세포 투과성 및 생존력을 촉진하는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 여러 상이한 방법, 예를 들어, 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, 독일 쾰른 소재)), (ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재) 또는 Gene Pulser II(BioRad, 미국 콜로라도주 덴버 소재), Multiporator(Eppendort, 독일 함부르크 소재), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개 트랜스펙션, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 트랜스펙션, 또는 "유전자총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 상업적으로 이용 가능한 방법 중 임의의 방법을 이용해 표적 세포에 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조).
비-바이러스 전달 방법
일부 양태에서, 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산을 세포 또는 조직 또는 대상체 내로 전달하는데 비-바이러스 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 비-바이러스 방법은 트랜스포손(전위 가능 요소로도 불림)의 사용을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트랜스포손은 게놈 내 위치에 그 자체를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자기-복제 및 그의 카피의 게놈 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산으로부터 스플라이싱되고, 게놈 내의 또 다른 위치 내로 삽입될 수 있는 DNA 조각이다. 예를 들어 트랜스포손은 전위를 위한 유전자의 측면에 있는 역전 반복체로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포슨을 이용한 예시적인 핵산 전달 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포슨 시스템(SBTS) 및 피기백(PB) 트랜스포슨 시스템을 포함한다. 예를 들어 문헌[Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20]; 문헌[Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971]; 문헌[Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589]; 문헌[Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209]; 문헌[Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166]; 문헌[Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16]; 문헌[Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65]; 및 문헌[Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83]을 참조하는데, 이들 전부는 본원에 참고로 포함된다.
SBTS는 다음의 2가지 구성요소를 포함한다: 1) 트랜스진을 함유하는 트랜스포손 및 2) 트랜스포사아제 효소의 공급원.트랜스포사아제는 트랜스포손을 운반 플라스미드(또는 다른 도너 DNA)로부터 표적 DNA, 예컨대 숙주 세포 염색체/게놈으로 전위시킬 수 있다. 예를 들어 트랜스포사아제는 운반 플라스미드/도너 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포손(트랜스진(들) 포함)을 절단하고, 이를 숙주 세포의 게놈 내로 삽입한다. 예를 들어 상기 문헌 문헌[Aronovich et al.]을 참조한다.
예시적인 트랜스포손은 pT2-기반 트랜스포손을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47]; 및 문헌[Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971]을 참조하는데, 이들 전부는 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 트랜스포사아제는 Tc1/마리너-유형 트랜스포사아제, 예를 들어 SB10 트랜스포사아제 또는 SB11 트랜스포사아제(예를 들어 사이토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과다활성 트랜스포사아제)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Aronovich et al.]; 문헌[Kebriaei et al.]; 및 문헌[Grabundzija et al.]을 참조하는데, 이들 전부는 본원에 참고로 포함된다.
SBTS의 사용은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산의 효율적인 통합 및 발현을 허용한다. 예를 들어 트랜스포손 시스템, 예컨대 SBTS를 사용하여 본원에 기술된 CAR을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 방법에 따라, 일부 실시 형태에서, SBTS 구성요소를 함유하는 하나 이상의 핵산, 예를 들어 플라스미드가 세포(예를 들어 T 또는 NK 세포)에게 전달된다. 예를 들어 핵산(들)은 핵산(예를 들어 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본원에 기술된 방법, 예를 들어 전기천공, 트랜스펙션 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 트랜스진(예를 들어 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산)뿐만 아니라 트랜스포사아제 효소를 코딩하는 핵산 서열도 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 다른 실시 형태에서, 2가지의 핵산을 갖는 시스템, 예를 들어 이중 플라스미드 시스템이 제공되며, 예를 들어 제1 플라스미드는 트랜스진을 포함하는 트랜스포슨을 함유하고 제2 플라스미드는 트랜스포사아제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 예를 들어 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포 내로 공동-전달된다.
일부 실시 형태에서, SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제(예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작 메가뉴클레아제 재조작된 호밍(homing) 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집의 조합을 사용하는 것에 의해, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포가 생성된다.
일부 실시 형태에서, 비-바이러스 전달 방법의 사용은 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포의 재프로그래밍 및 대상체 내로의 세포의 직접적인 주입을 허용한다. 비-바이러스 벡터의 장점은 환자 집단을 충족시키는데 필요한 충분한 양을 생성하는 것의 용이성 및 상대적으로 낮은 비용, 보관 동안의 안정성, 및 면역원성의 결여를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
CAR을 코딩하는 핵산 구축물
본 발명은 또한 본원에 기술된 하나 이상의 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일 양태에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 일 양태에서, 핵산 분자는 DNA 구축물로서 제공된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서, CAR은 본원에 기술된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 막관통 도메인), 및 자극 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 공동자극 신호전달 도메인) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 제타 쇄)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다. 일 실시 형태에서, 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인이다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은 적어도, 예를 들어 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, 및 NKG2C의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 막관통 도메인은 서열 번호 12의 서열, 또는 이와의 동일성이 95 내지 99%인 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기술된 힌지에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일 실시 형태에서, 힌지 영역은 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 서열, 또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인이다. 이러한 공동자극 분자의 추가의 예는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76 및 PAG/Cbp를 포함한다. 일 실시 형태에서, 공동자극 도메인은 서열 번호 16의 서열, 또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호 14 또는 16의 서열, 또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열, 및 서열 번호 18 또는 20의 서열, 또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 구성하는 서열은 동일한 프레임 내에서 그리고 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 2의 리더 서열, 본원에 기술된 scFv 도메인, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 서열(또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열)의 힌지 영역, 서열 번호12의 서열(또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열)을 갖는 막관통 도메인, 서열 번호 14의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열 번호 16의 서열(또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열)을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 서열(또는 이와의 동일성이 95~99%인 서열)을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인(자극 도메인을 포함함)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서, 상기 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원에 결합한다: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1 (CLECL1), CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, 루이스Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타아제, PRSS21, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라아제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카르복실 에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1.
일 실시 형태에서, 코딩된 CAR 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인이다. 일 실시 형태에서, 공동자극 도메인은 서열 번호 14의 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인이다. 일 실시 형태에서, 막관통 도메인은 서열 번호 12의 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및 제타의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 번호 14의 서열 및 서열 번호 18의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 구성하는 서열은 동일한 프레임 내에서 그리고 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 일 실시 형태에서, 항-암 관련 항원(본원에 기술된 바와 같음) 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일 실시 형태에서, 힌지 영역은 서열 번호 4의 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 힌지 영역은 서열 번호 6 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 10의 서열을 포함한다.
원하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 본 기술 분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝하기 보다는 합성적으로 생성할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서 트랜스진의 장기간의 안정한 통합 및 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간의 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 쥣과 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 장점을 갖는다. 렌티바이러스 벡터는 또한, 낮은 면역원성의 추가의 장점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한, 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 프로모터, 패키징 신호(Ψ), 프라이머 결합 부위(PBS), 하나 이상(예를 들어 2개)의 긴 말단 반복체(LTR), 및 관심 트랜스진, 예를 들어 CAR을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 바이러스 구조 유전자, 예컨대 gag, pol, 및 env가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 쥣과 백혈병 바이러스(MLV), 비장-병소 형성 바이러스(SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 그로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터가, 예를 들어 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기술되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 원하는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터(A5/35)이다. 또 다른 실시 형태에서, CAR을 코딩하는 핵산의 발현은 트랜스포손, 예컨대 슬리핑 뷰티, crisper, CAS9, 및 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성할 수 있다. 다음을 참조한다: 문헌[June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716](본원에 참고로 포함됨).
간단히 요약하면, CAR을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵생물에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 발현 구축물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호, 미국 특허 제5,580,859호, 미국 특허 제5,589,466호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)를 참조한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열결정 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 바이러스는 적어도 하나의 유기체에서의 기능적 복제 기점, 프로모터 서열, 간편한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선발가능 마커를 포함한다(예를 들어, 국제 공개 제01/96584호; 국제 공개 제01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호).
수많은 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포내로의 유전자 전달을 위해 개발된 바 있다. 예를 들어 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다(본 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여). 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 대상체의 세포로 전달될 수 있다(생체 내에서 또는 생체 외에서). 수많은 레트로바이러스 시스템이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터가 본 기술 분야에 공지되어 있다. 일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 30 내지 110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터는 또한 출발 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. 프로모터 요소 사이의 이격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나아제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 이격은, 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp 떨어질 때까지 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나아제(PGK) 프로모터를 포함한다.
포유동물 T 세포에서 CAR 코딩 핵산 분자를 발현할 수 있는 프로모터의 예로는 EF1α 프로모터가 있다. 고유 EF1α 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 유도한다. EF1α 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되었으며, 렌티바이러스 벡터에 클로닝된 핵산 분자로부터 CAR 발현을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 일 양태에서, EF1α 프로모터는 서열 번호 1로서 제공되는 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예로는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이 있다. 이 프로모터 서열은 그에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인바(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스육종 바이러스 프로모터와, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나아제 프로모터와 같은, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 인간 유전자 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요망되는 경우에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 개시시킬 수 있거나, 또는 발현이 요망되지 않는 경우에 발현을 종료시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
벡터는 또한, 예를 들어 분비를 용이하게 하기 위한 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자(예를 들어 소 성장 호르몬(BGH) 유전자 유래), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소(예를 들어 SV40 원점 및 ColE1 또는 본 기술 분야에 공지되어 있는 다른 것) 및/또는 선발을 가능하게 하기 위한 요소(예를 들어 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함할 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 트랜스펙션되거나 감염될 것이 추구되는 세포의 집단으로부터 발현 세포를 확인 및 선발하는 것을 용이하게 하기 위한 선발가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이들 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선발가능한 마커는 DNA의 개별 조각 상에 보유되고, 공동-트랜스펙션 절차에 사용될 수 있다. 선발가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열 측면에 배치될 수 있다. 유용한 선발가능한 마커는 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 트랜스펙션된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로 리포터 유전자는, 수용 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 그의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용 세포 내로 도입된 후 적합한 시점에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 분비형 알칼리 포스파타아제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는, 최소 5' 측면 배치 영역을 갖는 구축물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-유도 전사를 조정하는 능력에 대해 에이전트를 평가하는 데 사용될 수 있다.
세포 내로의 유전자의 도입 및 발현 방법은 본 기술 분야에 알려져 있다. 발현 벡터에 관하여, 벡터는 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전법, 리포펙션, 입자 충격법, 미세주입법, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, Ny)]을 참조한다. 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 트랜스펙션이다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 미국 특허 제5,585,362호를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관 내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템으로는 리포솜(예를 들어 인공 막 소포)이 있다. 핵산의 현재 기술 상태의 표적화 전달, 예컨대 표적화 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터-미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클로는 리포솜이 있다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입(시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)을 위해 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합되는 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀에 함유되거나 또는 이와 복합체화되거나, 또는 다르게는 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조에 한정되지 않는다. 예를 들어 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 산재되어서, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적과, 장쇄 지방족 탄화수소 및 그들의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 수득할 수 있다. 예를 들어 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Chol")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc(미국 앨라배마주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에, 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸는 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중라멜라 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중라멜라 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 다중라멜라 리포솜은 인지질이 과량의 수성 용액 중에 현탁될 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조의 형성 전에 자기 재배열을 거치고, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(문헌[Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10]). 그러나, 정상 소포 구조와 상이한 용액 중 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제자에 노출시키기 위해 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석법을 수행할 수 있다. 이러한 분석법은, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석법, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 포함되는 에이전트를 확인하기 위해 본원에 기술된 분석법에 의해, 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 분석법을 포함한다.
본 발명은 핵산 분자를 코딩하는 CAR을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 일 양태에서, CAR 벡터는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 직접 형질도입시킬 수 있다. 일 양태에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어 하나 이상의 플라스미드(예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 소형고리, 미니벡터, 이중 미소 염색체), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 벡터이다. 일 양태에서, 벡터는 포유동물 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)에서 CAR 구축물을 발현할 수 있다. 일 양태에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다. 일 양태에서, 포유동물 T 세포는 인간 NK 세포이다.
세포의 공급원
확장 및 유전자 변형 또는 다른 변형 이전에, 세포, 예를 들어 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포의 공급원을 대상체로부터 수득할 수 있다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 숙련자에게 공지된 많은 기술, 예컨대 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 수득될 수 있다. 바람직한 일 양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출술에 의해 수득된다. 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 포함한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 일 양태에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속 프로세싱 단계를 위해 세포를 적절한 완충제 또는 배지에 넣을 수 있다. 일 실시 형태에서, 세포는 인산 완충 염수(PBS)로 세척된다. 대안적 실시 형태에서, 세척액에는 칼슘이 없고, 마그네슘이 없을 수 있거나, 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 없을 수 있다.
칼슘의 부재 하의 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래할 수 있다. 당업자가 용이하게 인식하는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반-자동화 "유통식(flow-through)" 원심분리기(예를 들어 코브(Cobe) 2991 세포 처리기, 백스터 사이토메이트(Baxter CytoMate), 또는 헤모네틱스 셀 세이버 5(Haemonetics Cell Saver 5))를 제조업체의 설명에 따라 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트 A(PlasmaLyte A), 또는 완충제를 포함하거나 포함하지 않는 다른 염수 용액 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 내에 직접 재현탁시킬 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하(예를 들어 2%)의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 활용할 수 있고, 공지의 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌[Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement"Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31]에 기술된 것들을 이용할 수 있는 것으로 인식된다.
일 양태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 일루트리에이션(elutriation)에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
본원에 기술된 방법은 예를 들어 본원에 기술된, 예를 들어 음성 선발 기술을 사용한, 예를 들어 T 조절 세포-고갈 집단, CD25+ 고갈 세포인 면역 이펙터 세포의 특정 하위집단, 예를 들어 T 세포의 선발을 포함할 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
일 실시 형태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일 실시 형태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기재, 예를 들어 비드에 콘쥬게이트되거나, 또는 다르게는 기재, 예를 들어 비드 상에 코팅된다. 일 실시 형태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편은 본원에 기술된 바와 같은 기재에 콘쥬게이트된다.
일 실시 형태에서, T 조절 세포(예를 들어, CD25+ T 세포)는 밀테니이(Miltenyi)TM의 CD25 고갈 시약을 사용해 집단으로부터 제거된다. 일 실시 형태에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1e7개 세포 대 20 uL, 또는 1e7개 세포 대 15 uL, 또는 1e7개 세포 대 10 uL, 또는 1e7개 세포 대 5 uL, 또는 1e7개 세포 대 2.5 uL, 또는 1e7개 세포 대 1.25 uL이다. 일 실시 형태에서, 예를 들어 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 고갈을 위해, 5억개 초과의 세포/㎖가 사용된다. 추가의 양태에서, 6억, 7억, 8억 또는 9억개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다.
일 실시 형태에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 1 x 109 내지 1x 1010개의 CD25+ T 세포, 및 그 사이의 임의의 정수값을 포함한다. 일 실시 형태에서, 생성된 T 조절 고갈 세포 집단은 2 x 109개 이하의 T 조절 세포(예를 들어, CD25+ 세포)(예를 들어, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107개 이하의 CD25+ 세포)를 갖는다.
일 실시 형태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포는 고갈 튜빙 세트, 예컨대, 예를 들어 튜빙 162-01이 구비된 CliniMAC 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일 실시 형태에서, CliniMAC 시스템은 고갈 세팅, 예컨대, 예를 들어 DEPLETION2.1에서 진행된다.
특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 분리반출 전에 또는 CAR 발현 세포 생성물의 제조 중에 대상체에서 면역 세포의 음성 조정자의 수준을 감소시키면(예를 들어, 원치 않는 면역세포(예를 들어 TREG 세포)의 수를 감소시키면) 대상체의 재발 위험을 줄일 수 있다. 예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체(본원에 기술된 항-GITR 항체), CD25-고갈, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 제조 방법은 CAR 발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소(예를 들어, 고갈)시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은, 예를 들어 CAR 발현 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포) 생성물을 제조하기 전에 TREG 세포를 고갈시키기 위해, 샘플(예를 들어, 분리반출 샘플)을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편, 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, CAR 발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 TREG 세포를 감소시키는 하나 이상의 요법으로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR 발현 세포 처치에 대한 대상체 재발 위험이 감소된다. 일 실시 형태에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 대상체에 투여하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 하나 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 이들의 조합은 CAR-발현 세포 생성물의 주입 이전, 그 동안 또는 그 이후에 일어날 수 있다.
일 실시 형태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 대상체를 시클로포스파미드로 사전 처치되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처치에 대한 대상체 재발의 위험이 감소된다. 일 실시 형태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 사전 처치되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처치에 대한 대상체 재발의 위험이 감소된다.
일 실시 형태에서, 제거될 세포의 집단은 조절 T 세포 또는 종양 세포 중 어느 것도 아니며, CART 세포의 확장 및/또는 기능에 달리 부정적인 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적으로 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 일 실시 형태에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 동시에, 또는 상기 고갈 이후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본원에 기술된 방법은 1개 초과의 선발 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선발에 의한 T 세포 집단의 농축은, 예를 들어 음성 선발된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 하나의 방법으로는 음성 선발된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 유세포 분석법 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선발이 있다. 예를 들어 음성 선발에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 발현하는 세포를 집단으로부터 제거하여, 그에 의해 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항-종양 항원 항체 또는 그의 단편은 동일한 기재, 예를 들어 비드에 부착될 수 있고, 이는 세포를 제거하는데 사용될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항-종양 항원 항체 또는 그의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있고, 이의 혼합물은 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
또한, 체크 포인트 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 체크 포인트 억제자를 발현하는 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 하나 이상을 집단으로부터 제거하여, 그에 의해 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크 포인트 억제자 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+ 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크 포인트 억제자는 B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA 및 LAIR1을 포함한다. 일 실시 형태에서, 체크 포인트 억제자 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항-체크 포인트 억제자 항체 또는 그의 단편은 동일한 비드에 부착될 수 있고, 이는 세포를 제거하는데 사용될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항-체크 포인트 억제자 항체 또는 그의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있으며, 이의 혼합물은 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 체크 포인트 억제자 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
본원에 기술된 방법은 양성 선발 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 T 세포는 항-CD3/항-CD28(예를 들어 3x28)-콘쥬게이트된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께, 원하는 T 세포의 양성 선발에 충분한 기간 동안 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 기간은 약 30분이다. 추가적인 실시 형태에서, 상기 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 그 사이의 모든 정수값의 범위이다. 추가적인 실시 형태에서, 상기 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 기간은 10 내지 24시간, 예를 들어, 24시간이다. 다른 세포 유형에 비하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는데 있어서, T 세포를 단리하기 위해 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 시간을 단축하거나 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하고/거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써(본원에 추가로 기술되는 바와 같음), T 세포의 하위집단을 우선적으로 배양 개시 시에 또는 그 과정 동안의 다른 시점에 그에 대하여 또는 그에 반하여 선발할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단을 우선적으로 배양 개시 시에 또는 다른 원하는 시점에 그에 대하여 또는 그에 반하여 선발할 수 있다.
일 실시 형태에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 사이토카인 중 하나 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선발될 수 있다. 세포 발현에 대한 스크리닝 방법은, 예를 들어 국제 공개 제 2013/126712호에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선발에 의한 세포의 원하는 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면(예를 들어 입자, 예컨대 비드)은 달라질 수 있다. 특정 양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(예를 들어 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 100억개 세포/㎖, 90억개/㎖, 80억개/㎖, 70억개/㎖, 60억개/㎖ 또는 50억개/㎖의 농도가 사용된다. 일 양태에서, 10억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가의 일 양태에서 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(예를 들어 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선발을 가능하게 한다.
관련 양태에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들어 입자, 예컨대 비드)의 혼합물을 유의하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이에 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선발한다. 예를 들어 CD4+ T 세포는 희석 농도에서 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일 양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 x 106/ml이다. 다른 양태에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105/ml 내지 1 x 106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
다른 양태에서, 세포를 2 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 길이의 시간 동안 회전기 상에서 인큐베이션시킬 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 이후에 냉동시킬 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도까지의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 냉동 용액 중에 현탁시킬 수 있다. 많은 냉동 용액 및 파라미터가 본 기술 분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트(Plasmalyte)-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO, 또는 예를 들어 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 매질을 함유하는 배양 배지를 사용하는 것을 수반하고, 이어서, 세포를 1분당 1℃의 속도로 -80℃까지 냉동시키고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에서 보관한다. 다른 제어된 냉동 방법 뿐만 아니라 -20℃에서의 또는 액체 질소에서의 비제어된 즉각적인 냉동이 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 동결보존된 세포를 본원에 기술된 바와 같이 해동 및 세척하고, 1시간 동안 실온에서 휴지되도록 한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시킨다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기술된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있을 때 이전의 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출술 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 이와 같이, 확장시킬 세포의 공급원을 필요한 임의의 시점에 수집할 수 있고, 원하는 세포, 예컨대 T 세포를 단리하고, 면역 이펙터 세포 요법으로부터 이익을 얻을 많은 질환 또는 병태, 예컨대 본원에 기술된 것에 대한 면역 이펙터 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 냉동시킬 수 있다. 일 양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출물을 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취한다. 특정 양태에서, 혈액 샘플 또는 분리반출물을 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취하고, 관심 세포를 단리하고, 나중의 사용을 위해 냉동시킨다. 특정 양태에서, T 세포를 확장시키고, 냉동시키고, 나중에 사용할 수 있다. 특정 양태에서, 샘플은 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 이전에 환자로부터 수집된다. 추가의 양태에서, 세포는 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선조사와 같은 에이전트를 이용한 치료를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 많은 관련 치료 양식 이전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출물로부터 단리된다.
본 발명의 추가의 양태에서, T 세포는 기능성 T 세포를 사용한 대상체의 치료 직후에 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복 중인 기간 동안의 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 생체 외에서 확장되는 그의 능력을 위하여 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기술된 방법을 사용한 생체 외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체 내 확장을 위한 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 추가로, 특정 양태에서, 특히 요법 후의 규정된 시간 윈도우 동안 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 유리한 조건을 대상체에서 생성하기 위해 동원(예를 들어 GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 요법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
일 실시 형태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기술된 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제자를 제공받은 대상체로부터 수득된다. 일 실시 형태에서, CAR을 발현하도록 조작될 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 집단은 대상체 내의 또는 대상체로부터 수확된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가되도록 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제자의 충분한 투약 후에 또는 충분한 시간 후에 수확된다.
다른 실시 형태에서, CAR을 발현하도록 조작되었거나 또는 조작될 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 집단은 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수를 증가시키거나 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비를 증가시키는 양의 mTOR 억제자와의 접촉에 의해 생체 외에서 처리될 수 있다.
일 실시 형태에서, T 세포 집단은 디아글리세롤 키나아제(DGK)-결함성이다. DGK-결함 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소되거나 억제된 DGK 활성을 갖는 세포를 포함한다. DGK-결함 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭 에이전트, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소시키거나 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결함 세포는 본원에 기술된 DGK 억제자를 이용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
일 실시 형태에서, T 세포 집단은 이카로스(Ikaros)-결함성이다. 이카로스-결함 세포는 이카로스 RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소되거나 억제된 이카로스 활성을 갖는 세포를 포함하고, 이카로스-결함 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭 에이전트, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 이카로스 발현을 감소시키거나 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 이카로스-결함 세포는 이카로스 억제자, 예를 들어 레날리도미드(lenalidomide)를 이용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
실시 형태들에서, T 세포 집단은 DGK-결함성 및 이카로스-결함성이고, 예를 들어 DGK 및 이카로스를 발현하지 않거나 또는 감소되거나 억제된 DGK 및 이카로스 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 이카로스-결함 세포는 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
일 실시 형태에서, NK 세포는 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시 형태에서, NK 세포는 NK 세포주, 예를 들어 NK-92 세포주(Conkwest)이다.
동종이계 CAR
본원에 기술된 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포는 동종이계 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어 세포는 동종이계 T 세포, 예를 들어 기능성 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원(HLA), 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 결여된 동종이계 T 세포일 수 있다.
기능성 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 임의의 기능성 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능성 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나, 또는 그의 표면 상에 매우 적은 기능성 TCR을 생성하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 서브유닛 중 하나 이상의 돌연변이된 또는 절두된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 유도하지 않을 것임을 의미한다.
본원에 기술된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 기능성 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어 본원에 기술된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 1 및/또는 HLA 클래스 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다.
일부 실시 형태에서, T 세포는 기능성 TCR 및 기능성 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 결여될 수 있다.
기능성 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체(CRISPR) 전사-활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 동종이계 세포는, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 억제성 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들어 세포는 예를 들어 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 억제성 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF 베타를 포함한다. 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제성 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시 형태들에서, 억제성 핵산, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체(CRISPR), 전사-활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 사용될 수 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 siRNA 및 shRNA
일부 실시 형태에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 T 세포에서 TCR 및/또는 HLA를 코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
T 세포에서의 siRNA 및 shRNA의 발현은 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다.
TCR의 구성요소의 발현을 하항조절하는 예시적인 shRNA는 예를 들어 미국 특허 공개 제2012/0321667호에 기술되어 있다. HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 유전자의 발현을 하향조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는 예를 들어 미국 특허 공개 제2007/0036773호에 기술되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
본원에 사용된 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체의 세트, 또는 이러한 반복체의 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas"는 CRISPR-회합 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 침묵화 또는 돌연변이시키기 위해 사용될 수 있는, CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
자연-발생 CRISPR/Cas 시스템은 대략적으로 서열결정 진정세균 게놈의 40% 및 서열결정 고세균의 90%에서 발견된다. 문헌[Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172]. 이러한 시스템은 외래 유전 요소, 예컨대 플라스미드 및 파지에 저항성을 부여하는 원핵 면역계의 유형이고, 후천성 면역 형태를 제공한다. 문헌[Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712]; 문헌[Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845].
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물, 예컨대 마우스 또는 영장류에서의 유전자 편집(특정 유전자를 침묵, 증진 또는 변화시키는 것)에 사용하기 위해 변형된 바 있다. 문헌[Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8]. 이는 특이적으로 설계된 CRISPR 및 하나 이상의 적절한 Cas를 함유하는 플라스미드를 진핵 세포 내로 도입함으로써 달성된다.
때때로 CRISPR 유전자좌로 불리는 CRISPR 서열은 교대 반복체 및 스페이서를 포함한다. 자연-발생 CRISPR에서, 스페이서는 통상적으로 박테리아에 외래인 서열, 예컨대 플라스미드 또는 파지 서열을 포함하고; TCR 및/또는 HLA CRISPR/Cas 시스템에서 스페이서는 TCR 또는 HLA 유전자 서열로부터 유래된다.
CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 구성적으로 발현되고, Cas 단백질에 의해 작은 RNA로 프로세싱된다. 이들은 반복 서열이 측면에 존재하는 스페이서를 포함한다. RNA는 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전 요소를 침묵시키도록 다른 Cas 단백질을 이끈다. 문헌[Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170]; 문헌[Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7]. 이에 따라, 스페이서는 siRNA와 유사하게 RNA 분자를 위한 주형으로서의 역할을 한다. 문헌[Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
이들은 많은 상이한 유형의 박테리아에서 자연 발생하기 때문에, CRISPR의 정확한 배열 및 Cas 유전자 및 그의 생성물의 구조, 기능, 및 수는 종마다 다소 상이하다. 문헌[Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60]; 문헌[Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61]; 문헌[Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182]; 문헌[Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561]; 문헌[Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663]; 및 문헌[Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340]. 예를 들어 Cse(Cas 하위유형, 에스케리키아 콜라이) 단백질(예를 들어 CasA)은 기능성 복합체인 Cascade를 형성하는데, 이것은 CRISPR RNA 전사체를 Cascade가 보유하는 스페이서-반복체 단위로 프로세싱한다. 문헌[Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964]. 다른 원핵생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 이. 콜라이에서의 CRISPR-기반 파지 불활성화는 Cascade 및 Cas3을 필요로 하지만, Cas1 또는 Cas2는 필요로 하지 않는다. 피로코쿠스 푸리오수스 및 다른 원핵생물에서 Cmr(Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보성 표적 RNA들을 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA와 기능성 복합체를 형성한다. 보다 단순한 CRISPR 시스템은 이중 나선의 각각의 가닥에 대해 1개씩, 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제인 단백질 Cas9에 의존한다. Cas9 및 변형된 CRISPR 유전자좌 RNA의 조합이 유전자 편집을 위한 시스템에서 사용될 수 있다. 문헌[Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
이에 따라, CRISPR/Cas 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자의 편집(염기쌍의 부가 또는 결실), 또는 TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는 조기 중단의 도입을 위해 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 대안적으로 RNA 간섭처럼 사용되어, TCR 및/또는 HLA 유전자를 가역적인 방식으로 턴오프할 수 있다. 포유동물 세포에서, 예를 들어 RNA는 Cas 단백질을 TCR 및/또는 HLA 프로모터로 안내하여, RNA 폴리머라아제를 입체적으로 차단할 수 있다.
본 기술 분야에 공지된, 예를 들어 미국 특허 공개 제20140068797, 및 문헌[Cong (2013) Science 339: 819-823]에 설명된 기술을 사용하여, TCR 및/또는 HLA를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템이 생성될 수 있다. TCR 및/또는 HLA를 억제하는, 본 기술 분야에 공지된 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템, 예를 들어, 문헌[Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 미국 특허 제8,871,445호; 미국 특허 제8,865,406호; 미국 특허 제8,795,965호; 미국 특허 제8,771,945호; 및 미국 특허 제8,697,359호에 기술된 것이 또한 생성될 수 있다.
TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN
"TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 TALEN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생성된다. TALE(Transcription activator-like effect)는 HLA 또는 TCR 유전자의 부분을 포함하는 임의의 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, HLA 또는 TCR 서열을 포함하는 임의의 원하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생성될 수 있다. 이어서, 이들은 세포 내로 도입될 수 있고, 여기서 이들은 게놈 편집에 사용될 수 있다. 문헌[Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6]; 및 문헌[Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12]; 문헌[Moscou et al. (2009) Science 326: 3501].
TALE는 잔토모나스 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 제12 및 제13 아미노산을 제외하고, 반복된, 고도로 보존된 33~34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 보여준다. 따라서, 이들은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생성하기 위해, TALE 단백질은 야생형 또는 돌연변이된 FokI 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제(N)에 융합된다. TALEN에서의 사용을 위해 FokI에 대한 몇몇의 돌연변이가 이루어진 바 있고; 상기 돌연변이는 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. 문헌[Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82]; 문헌[Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8]; 문헌[Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech.29: 731-734]; 문헌[Wood et al. (2011) Science 333: 307]; 문헌[Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79]; 문헌[Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793]; 및 문헌[Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96].
FokI 도메인은 이량체로서 기능을 하여서, 적당한 배향 및 이격으로 표적 게놈 내의 부위에 대해 특유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구축물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 상기 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 다는 높은 활성 수준의 달성에 중요한 파라미터인 것으로 보인다. 문헌[Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8].
HLA 또는 TCR TALEN은 이중-가닥 파단(DSB)을 생성하기 위해 세포 내에서 사용될 수 있다. 돌연변이는 복구 메커니즘이 비-상동 말단 연결을 통해 상기 파단을 부적절하게 복구하는 경우에 파단 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어 부적절한 복구는 프레임 이동 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA가 TALEN과 함께 세포 내로 도입될 수 있고; 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이러한 과정은 HLA 또는 TCR 유전자 내의 결손을 교정하거나 또는 이러한 결손을 wt HLA 또는 TCR 유전자 내에 도입하여, 이에 따라 HLA 또는 TCR의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
HLA 또는 TCR 내의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈 구성요소를 사용하는 다양한 스킴을 비롯하여 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 문헌[Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53]; 문헌[Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509].
HLA 및/또는 TCR을 억제하는 징크 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "징크 핑거 뉴클레아제" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 ZFN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 ZFN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 징크 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 FokI 뉴클레아제 도메인(또는 이의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거를 포함한다. 문헌[Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782]; 및 문헌[Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160].
징크 핑거는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 징크 핑거는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 징크 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 비롯하여, 특정 서열을 인식하는 징크 핑거(및 이의 조합)를 생성하기 위한 다양한 선택 및 모듈 어셈블리 기술이 이용가능하다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화되어야 한다. 따라서, 한 쌍의 ZFN이 비-팔린드롬(palindromic) DNA 부위를 표적화하는 데 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 DNA의 반대되는 가닥들에 결합해야 하고, 이때 이들의 뉴클레아제는 적절하게 이격된다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5].
또한, TALEN처럼, ZFN은 DNA에 이중-가닥 파단을 생성할 수 있고, 이것은 부적절하게 복구되는 경우에 프레임-시프트 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 세포내 HLA 및/또는 TCR의 발현 및 양의 감소로 이어질 수 있다. ZFN은 또한 HLA 또는 TCR 유전자를 돌연변이시키기 위해 상동 재조합과 함께 사용될 수 있다.
HLA 및/또는 TCR 내의 서열에 특이적인 ZFN은 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815]; 문헌[Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349]; 문헌[Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7]; 문헌[Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96; 미국 특허 공개 제2011/0158957호; 및 미국 특허 공개 제2012/0060230호를 참조한다.
텔로머라아제 발현
어떠한 특정한 이론에 구애되고자 함이 없이, 일부 실시 형태에서, 치료적 T 세포는 T 세포 내에서의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖고; 이에 따라, 텔로머라아제 유전자를 이용한 트랜스펙션은 T 세포의 텔로미어를 연장시키고 환자에서의 T 세포의 지속성을 개선시킬 수 있다. 문헌[Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)]을 참조한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 텔로머라아제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라아제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소적으로 발현한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포를 텔로머라아제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라아제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, CAR-발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 세포를, CAR을 코딩하는 구축물과의 접촉 이전에, 그와 동시에, 또는 이후에 핵산과 접촉시킬 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)의 집단을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제공하는 단계, 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR을 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계; 및 CAR 및 텔로머라아제 발현을 가능하게 하는 조건 하에서, 면역 이펙터 세포의 집단을 텔로머라아제 서브유닛, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 텔로머라아제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 DNA이다. 일 실시 형태에서, 텔로머라아제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 텔로머라아제 서브유닛의 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 포함한다.
일 실시 형태에서, hTERT는 다음과 같은 젠뱅크 단백질 ID AAC51724.1의 아미노산 서열을 갖는다(문헌[Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]):
Figure pct00118
일 실시 형태에서, hTERT는 서열 번호 63의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, hTERT는 서열 번호 63의 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 결실(예를 들어 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산의 결실)을 포함한다. 일 실시 형태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 트랜스제닉 아미노산 서열(예를 들어 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다.
일 실시 형태에서, hTERT는 젠뱅크 등록 번호 AF018167의 핵산 서열에 의해 코딩된다(문헌[Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]):
Figure pct00119
Figure pct00120
일 실시 형태에서, hTERT는 서열 번호 64의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 일 실시 형태에서, hTERT는 서열 번호 64의 핵산에 의해 코딩된다.
면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포)의 활성화 및 확장
면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 조절 세포 고갈 세포의 집단은 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 에이전트 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성자(예를 들어 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어 T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함하고, 본 기술 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998]; 문헌[Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999]; 문헌[Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
특정 양태에서, T 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어 각각의 신호를 제공하는 에이전트는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우에, 에이전트는 동일한 표면(즉, "시스" 형성에서) 또는 개별 표면(즉, "트랜스" 형성에서)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 한 에이전트는 표면에 커플링되고 다른 한 에이전트는 용액 중에 존재할 수 있다. 일 양태에서, 공동자극 신호를 제공하는 에이전트는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 에이전트는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정 양태에서, 둘 다의 에이전트가 용액 중에 존재할 수 있다. 일 양태에서, 에이전트는 가용성 형태로 존재하고, 이어서, 표면, 예컨대 Fc 수용체 또는 항체 또는 에이전트에 결합할 다른 결합 에이전트를 발현하는 세포에 가교될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
일 양태에서, 상기 2가지의 에이전트는 동일한 비드 상에, 즉 "시스"로 또는 개별 비드에, 즉 "트랜스"로 비드 상에 고정된다. 예로서, 일차 활성화 신호를 제공하는 에이전트는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 에이전트는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 둘 다의 에이전트는 동일한 비드에 당량 분자량으로 공동-고정된다. 일 양태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 1:1의 비의 비드에 결합된 각각의 항체가 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정한 양태에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 일 양태에서, 항-CD3 항체보다 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합된다(즉 CD23:CD28의 비는 1 미만임). 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 하나의 특정 양태에서, 비드에 결합된 1:100의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:75의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 추가의 양태에서, 비드에 결합된 1:50의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:30의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 바람직한 일 양태에서, 비드에 결합된 1:10의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 1:3의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다. 일 양태에서, 비드에 결합된 3:1의 CD3:CD28의 비의 항체가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 당업자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있지만, 보다 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가의 양태에서 상기 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, 이는 또한 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. T 세포 자극을 발생시키는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 달라질 수 있지만, 바람직한 특정 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 바람직한 비는 적어도 1:1의 입자/T 세포이다. 일 양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특정한 양태에서, 바람직한 입자:세포의 비는 1:5이다. 추가의 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 입자 대 세포의 비는 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자는 이후에 최대 10일 동안 매일 또는 격일로, 1:1 내지 1:10의 최종 비(첨가 일의 세포 수 기준)로 세포에 첨가된다. 하나의 특정한 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 1:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:5로 조정된다. 일 양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 일 양태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 일 양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 당업자라면 다양한 다른 비가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자의 크기 및 세포의 크기 및 유형에 따라 달라질 것이다. 일 양태에서, 사용하기에 가장 전형적인 비는 제1일에 대략 1:1, 2:1 및 3:1이다.
추가적인 양태에서, 세포, 예컨대, T 세포는 에이전트-코팅 비드와 조합되고, 비드와 세포는 이후 분리되고, 이어서 세포가 배양된다. 다른 양태에서, 배양 전에, 에이전트-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가의 양태에서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대 자력을 인가하여 농축함으로써, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드(3x28 비드)가 T 세포에 접촉하도록 함으로써 라이게이션될 수 있다. 일 양태에서, 세포(예를 들어 104 내지 109개 T 세포) 및 비드(예를 들어 1:1 비의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 예를 들어 PBS(2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘 미함유) 내에서 조합한다. 다시, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어 표적 세포는 샘플에 매우 드물 수 있고, 단지 샘플의 0.01%만을 이루거나 또는 전체 샘플(즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 양태에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 약 100억개 세포/㎖, 90억개/㎖, 80억개/㎖, 70억개/㎖, 60억개/㎖, 50억개/㎖ 또는 20억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일 양태에서, 1억개 세포/㎖ 초과의 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가의 일 양태에서 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억개 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 특정 양태에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선발을 가능하게 한다.
일 실시 형태에서, CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 코딩하는 핵산을 형질도입시킨 세포는, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 확장된다. 일 실시 형태에서, 세포는 수시간(예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일)의 기간 동안 배양 중 확장된다. 일 실시 형태에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 확장된다. 일 실시 형태에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6 또는 5일의 기간 동안 확장된다. 일 실시 형태에서, 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 CD19 CAR 세포는 5일 동안 배양 중 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T 세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 사이토카인 생산, 활성화, 이동, 또는 그의 조합에 의해 규정될 수 있다. 일 실시 형태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기술된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포와 비교하여 항원 자극 시 세포 배가의 적어도 1, 2, 3 또는 4배 증가를 보인다. 일 실시 형태에서, 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 CD19 CAR을 발현하는 세포는 5일 동안 배양 중 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포와 비교하여 더 높은 전염증성 사이토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에서 9일 동안 배양 중 확장된 동일한 세포와 비교하여 전염증성 사이토카인 생산(pg/ml), 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 이상의 증가를 보인다.
또한, T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 사이클의 자극이 요구될 수 있다. T 세포 배양을 위해 적절한 조건은 혈청(예를 들어 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 숙련자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지(예를 들어 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 첨가된, 무혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 최적화제를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험적 배양에만 포함되고, 대상체 내에 주입되어야 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하기 위해 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어 37℃) 및 분위기(예를 들어 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다.
일 실시 형태에서, 세포는, 예를 들어 본원에 기술된 방법, 예컨대 유세포 분석법에 의해 측정 시 14일 확장 기간에 걸쳐 세포의 적어도 200배(예를 들어 200배, 250배, 300배, 350배) 증가를 초래하는, 하나 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지(예를 들어 본원에 기술된 배지) 중에서 확장된다. 일 실시 형태에서, 세포는 IL-15 및/또는 IL-7(예를 들어, IL-15 및 IL-7)의 존재 하에 확장된다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 방법, 예를 들어 CAR-발현 세포 제조 방법은 예를 들어 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 세포 집단으로부터의 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포의 제거 방법은 본원에 기술되어 있다. 실시 형태들에서, 방법, 예를 들어 제조 방법은 세포 집단(예를 들어 T 조절 세포, 예컨대 CD25+ T 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 이전에 항-CD25 항체, 그의 단편 또는 CD25-결합 리간드와 접촉시킨 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, (예를 들어 이전에 항-CD25 항체, 그의 단편 또는 CD25-결합 리간드와 접촉시킨) 세포 집단은 IL-15 및/또는 IL-7의 존재 하에 확장된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드, 예를 들어 hetIL-15 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체 외에서 접촉된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체 외에서 접촉된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15 Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체 외에서 접촉된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체 외에서 접촉된다.
일 실시 형태에서 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 생체 외 확장 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 생체 외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 생체 외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일 실시 형태에서, 상기 접촉은 림프구 하위집단, 예를 들어 CD8+ T 세포의 생존 및 증식을 초래한다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어 전형적인 혈액 또는 분리반출술을 거친 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제자 T 세포 집단(TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체 외 확장은 T 세포의 집단을 생성하는데, T 세포의 집단은 제8일~제9일 이전에는 주로 TH 세포로 이루어진 반면, 대략 제8일~제9일 이후에는 T 세포의 집단은 점점 더 큰 TC 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 대상체에게 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 이와 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 하위세트가 단리되었으면, 이 하위세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유리할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커가 세포 확장 과정 동안 유의하게, 그러나 대부분 재현가능하게 달라진다. 따라서, 그러한 재현가능성은, 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 조정하는 능력을 가능하게 한다.
일단 본원에 기술된 CAR이 구축되면, 분자의 활성, 예컨대 항원 자극 후 T 세포를 확장시키는 능력, 재자극의 부재 하에서의 T 세포 확장의 지속 능력, 및 적절한 시험관 내 및 동물 모델에서의 항암 활성(이에 한정되지는 않음)을 평가하기 위해 다양한 분석법이 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR의 효과를 평가하기 위한 분석법은 하기에 더욱 상세히 기술되어 있다.
일차 T 세포에서의 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 아주 간략하게, CAR을 발현하는 T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)를 10일 넘게 시험관 내에서 확장시킨 후, 용해 및 환원 조건 하의 SDS-PAGE를 수행한다. 전장 TCR-ζ 세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ 쇄를 포함하는 CAR은 TCR-ζ 쇄에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 상기 T 세포 하위세트는 공유적 이량체 형성의 평가를 허용하는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE 분석을 위해 사용된다.
항원 자극 후에 CAR+ T 세포의 시험관 내 확장은 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 aAPC로 자극한 후, 분석할 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질도입한다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나아제(PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유세포 분석법에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 하위세트에서 배양 제6일에 평가된다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드로 자극하고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 사용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 2시스트론성 렌티바이러스 벡터를 사용하여 제1 일에 CAR을 이용하여 형질도입한다. 배양물은 세척 후에 본원에 기술된 암 관련 항원+ K562 세포(본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 K562), 야생형 K562 세포(K562 야생형) 또는 항CD3 및 항-CD28 항체의 존재 하에 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포(K562-BBL-3/28) 중 어느 하나로 재자극한다. 외인성 IL-2를 배양물에 격일로 100 IU/㎖로 첨가한다. GFP+ T 세포를 비드-기반 카운팅을 사용하여 유세포 분석법에 의해 카운팅한다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다.
재자극의 부재 하에 지속되는 CAR+ T 세포 확장을 또한 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간략하게, 평균 T 세포 부피(fl)는 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드를 사용한 자극, 및 제1일에 나타낸 CAR을 사용한 형질도입 후에 쿨터 멀티사이저 III(Coulter Multisizer III) 입자 계수기, 넥셀롬 셀로미터 비전(Nexcelom Cellometer Vision) 또는 밀리포어 셉터(Millipore Scepter)를 사용하여 배양 제8일에 측정한다.
CART 활성을 측정하기 위해 동물 모델을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 면역결핍 마우스에서 원발성 인간 전-B ALL을 치료하기 위해 본원에 기술된 인간 암 관련 항원-특이적 CAR+ T 세포를 사용하는 이종이식 모델을 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 매우 간략하게, ALL의 확립 후에, 마우스를 처리군과 관련하여 무작위화한다. 상이한 수의 암 관련 항원-특이적 CAR 조작 T 세포를 1:1의 비로 B-ALL를 보유하는 NOD-SCID-γ-/- 마우스 내에 공동주사한다. 마우스로부터의 비장 DNA 내의 암 관련 항원-특이적 CAR 벡터의 카피수를 T 세포 주사 후에 다양한 시점에 평가한다. 동물을 백혈병에 대해 매주 간격으로 평가한다. 말초 혈액 암 관련 항원(본원에 기술된 바와 같음)+ B-ALL 모세포 계수를 본원에 기술된 암 관련 항원-ζ CAR+ T 세포 또는 모크(mokc)-형질도입 T 세포를 주사한 마우스에서 측정한다. 군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다. 또한, NOD-SCID-γ -/- 마우스에서 T 세포 주사 4주 후에 절대 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 계수를 또한 분석할 수 있다. 마우스에게 백혈병 세포를 주사하고, 3주 후에 eGFP에 연결된 CAR을 코딩하는 2시스트론성 렌티바이러스 벡터에 의해 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포를 주사한다. T 세포를 주사 전에 모크-형질도입 세포와 혼합함으로써 45~50% 투입 GFP+ T 세포로 정규화하고, 유세포 분석법에 의해 확인한다. 1주 간격으로 백혈병에 대해 동물을 평가한다. CAR+ T 세포군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다.
용량 의존성 CAR 처치 반응을 평가할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 예를 들어 제21일에 CAR T 세포, 동등한 수의 모크-형질도입된 T 세포를 주입하거나 또는 T 세포를 주입하지 않은 마우스에서 백혈병 확립 35~70일 후에 말초 혈액을 수득한다. 각각의 군으로부터의 마우스를 말초 혈액 암 관련 항원(본원에 기술된 바와 같음)+ ALL 모세포 계수의 결정을 위해 무작위로 채혈한 후, 제35일 및 제49일에 죽인다. 남아있는 동물을 제57일 및 제70일에 평가한다.
세포 증식 및 사이토카인 생산의 평가는 예를 들어 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]에 이전에 기술된 바 있다. 간략하게, CAR-매개 증식의 평가는 세척된 T 세포를 본원에 기술된 암 관련 항원을 발현하는 K562 세포(K19) 또는 CD32 및 Cd137을 발현하는 K562 세포(KT32-BBL)와 2:1의 최종 T-세포:K562 비로 혼합함으로써 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다. K562 세포는 사용 전 감마-방사선으로 조사된다. 항-CD3(클론 OKT3) 및 항-CD28(클론 93) 단클론 항체는 T-세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로의 역할을 하도록 KT32-BBL 세포를 포함하는 배양물에 첨가되며, 그 이유는 이들 신호가 생체 외에서 장기간 CD8+ T 세포 확장을 지지하기 때문이다. T 세포는 제조업체에 의해 기술된 바와 같이 카운트브라이트(CountBright)™ 형광 비드(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 유세포 분석법을 사용하여 배양물에서 계수된다. CAR+ T 세포는 eGFP-2A 연결된 CAR-발현 렌티바이러스 벡터로 조작된 T 세포를 사용한 GFP 발현에 의해 확인된다. GFP를 발현하지 않는 CAR+ T 세포에 있어서, 상기 CAR+ T 세포는 비오티닐화 재조합 암 관련 항원(본원에 기술된 바와 같음) 단백질 및 2차 아비딘-PE 콘쥬게이트로 검출된다. T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ 발현은 또한 특이적 단클론 항체(BD Biosciences)로 동시에 검출된다. 사이토카인 측정은 제조업체의 설명에 따라 인간 TH1/TH2 사이토카인 세포측정 비드 어레이 키트(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 사용하여 재자극한지 24시간 후에 수집된 상청액에서 수행된다. 형광을 FACScalibur 유세포 측정기를 사용하여 평가하고, 데이터를 제조업체의 설명에 따라 분석한다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 분석법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간략하게, 표적 세포(K562 주 및 일차 전-B-ALL 세포)를 37℃에서 2시간 동안 빈번하게 교반하면서 51Cr(NaCrO4로서, New England Nuclear, 미국 매사추세츠주 보스턴 소재)을 로딩하고, 완전 RPMI에서 2회 세척하고, 마이크로타이터 플레이트 내로 도말한다. 이펙터 T 세포를 웰 내에서 완전 RPMI 내에서 표적 세포와, 이펙터 세포:표적 세포(E:T)의 다양한 비로 혼합한다. 배지만 함유하는(자발적 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 세제의 1% 용액(총 방출, TR)을 함유하는 추가의 웰을 또한 제조한다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 각각의 웰로부터 상청액을 수확한다. 이어서, 방출된 51Cr을 감마 입자 계수기(Packard Instrument Co, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 측정한다. 각각의 조건은 적어도 삼중으로 수행되고, 용해 백분율은 하기 식을 사용하여 계산된다: 용해% = (ER - SR)/(TR - SR)(여기서, ER은 각각의 실험 조건의 경우에 방출된 평균 51Cr을 나타낸다).
영상화 기술이 종양-보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 트래픽킹 및 증식을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 예를 들어 문헌[Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)]에 기술되어 있다. 간략하게, NOD/SCID/γc-/-(NSG) 마우스에게 Nalm-6 세포를 정맥내 주사하고, 7일 후에 CAR 구축물을 사용한 전기천공 4시간 후에 T 세포를 주사한다. T 세포를 반딧불이 루시퍼라아제를 발현하도록 렌티바이러스 구축물로 안정하게 트랜스펙션시키고, 마우스를 생체발광에 대해 영상화한다. 대안적으로, Nalm-6 이종이식 모델에서 CAR+ T 세포의 단일 주사의 치료 효능 및 특이성은 다음과 같이 측정할 수 있다: NSG 마우스에게 반딧불이 루시퍼라아제를 안정하게 발현하도록 형질도입된 Nalm-6을 주사한 후, 7일 후에 CAR로 전기천공된 T 세포를 꼬리-정맥에 단회 주사한다. 동물을 주사 후 다양한 시점에서 영상화한다. 예를 들어 제5일(치료 2일 전) 및 제8일(CAR+ PBL 24시간 후)에 대표적인 마우스에서 반딧불이 루시퍼라아제 양성 백혈병의 광자-밀도 열 지도를 생성할 수 있다.
본원의 실시예 섹션에 기술된 것뿐만 아니라 본 기술 분야에 알려진 것들을 비롯한 다른 분석법도 본원에 기술된 CAR을 평가하는 데 사용될 수 있다.
치료적 응용
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 XCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, X는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 나타내고, 암 세포는 상기 X 종양 항원을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 XCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 X를 발현한다. 일 실시 형태에서, X는 정상 세포 및 암 세포 둘 다에서 발현되지만, 정상 세포 상에서 더 낮은 수준으로 발현된다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 XCAR이 X를 발현하는 암 세포에 결합하여 이를 사멸시키지만 X를 발현하는 정상 세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 미만의 암 세포 또는 이보다 더 적은 암 세포가 사멸되게 하는 친화도로 X에 결합하는 CAR을 선발하는 단계를 추가로 포함하며, 이는 예를 들어 본원에 기술된 분석법에 의해 결정되는 바와 같다. 예를 들어, 도 13a 및 도 13b에 설명된 분석법 또는 Cr51 CTL을 기반으로 하는 유세포 분석법과 같은 사멸 분석법이 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 선발된 CAR은 표적 항원에 대해 10-4 M 내지 10-8 M, 예컨대, 10-5 M 내지 10-7 M, 예컨대, 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 갖는다. 일 실시 형태에서, 선발된 항원 결합 도메인은 기준 항체, 예를 들어 본원에 기술된 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 더 적은 결합 친화도를 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD19 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD19를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 ALL(급성 림프모구성 백혈병), CLL(만성 림프구성 백혈병), DLBCL(미만성 거대 B-세포 림프종), MCL(맨틀 세포 림프종), 또는 MM (다발성 골수종)이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 EGFRvIIICAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 EGFRvIII을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 교모세포종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 메소텔린CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 메소텔린을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 중피종, 췌장암, 또는 난소암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD123CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD123을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 AML이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD22CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD22를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 B 세포 악성 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CS-1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CS-1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 다발성 골수종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CLL-1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CLL-1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 AML이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD33CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD33을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 AML이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GD2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GD2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신경모세포종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 BCMACAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 BCMA를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 다발성 골수종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TnCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 Tn 항원을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PSMACAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PSMA를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전립선암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ROR1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ROR1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 B 세포 악성 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 FLT3 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 FLT3을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 AML이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TAG72CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TAG72를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 위장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD38CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD38을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 다발성 골수종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD44v6CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD44v6을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 자궁경부암, AML, 또는 MM이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CEACAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CEA를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 위장암, 또는 췌장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 EPCAMCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 EPCAM을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 위장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 B7H3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 B7H3을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 KITCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 KIT를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 위장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 IL-13Ra2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 IL-13Ra2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 교모세포종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PRSS21CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PRSS21을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암, 췌장암, 폐암 및 유방암으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD30CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD30을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 림프종, 또는 백혈병이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GD3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GD3을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD171CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD171을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신경모세포종, 난소암, 흑색종, 유방암, 췌장암, 결장암, 또는 NSCLC(비소세포 폐암)이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 IL-11RaCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 IL-11Ra를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 골육종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PSCACAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PSCA를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전립선암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 VEGFR2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 VEGFR2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 루이스YCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 루이스Y를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암, 또는 AML이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD24CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD24를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 췌장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PDGFR-베타CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PDGFR-베타를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유방암, 전립선암, GIST(위장관 기질 종양), CML, DFSP(융기성 피부섬유육종), 또는 신경교종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 SSEA-4CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 SSEA-4를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 교모세포종, 유방암, 폐암, 또는 줄기세포암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD20CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD20을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 B 세포 악성 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 폴레이트 수용체 알파CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 폴레이트 수용체 알파를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암, NSCLC, 자궁내막암, 신장암, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ERBB2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ERBB2(Her2/neu)를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유방암, 위암, 결장직장암, 폐암, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 MUC1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 MUC1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유방암, 폐암, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 EGFRCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 EGFR을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 교모세포종, SCLC(소세포 폐암), SCCHN(두경부 편평 세포 암종), NSCLC, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 NCAMCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 NCAM을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신경모세포종, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CAIXCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CAIX를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신장암, CRC, 자궁경부암, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 EphA2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 EphA2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 GBM이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GD3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GD3을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 푸코실 GM1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 푸코실 GM을 발현한다
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 sLeCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 sLe를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 NSCLC, 또는 AML이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GM3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GM3을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TGS5CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TGS5를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 HMWMAACAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 HMWMAA를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종, 교모세포종, 또는 유방암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 o-아세틸-GD2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 o-아세틸-GD2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신경모세포종, 또는 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD19CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD19를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 폴레이트 수용체 베타 AML, 골수종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TEM1/CD248CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TEM1/CD248을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TEM7RCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TEM7R을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CLDN6CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CLDN6을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암, 폐암, 또는 유방암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TSHRCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TSHR을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 갑상선암, 또는 다발성 골수종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GPRC5DCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GPRC5D를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 다발성 골수종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CXORF61CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CXORF61을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD97CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD97을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 B 세포 악성 종양, 위암, 췌장암, 식도암, 교모세포종, 유방암, 또는 결장직장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD179aCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD179a를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 B 세포 악성 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ALK CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ALK를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 NSCLC, ALCL(역형성 대세포 림프종), IMT(염증성 근섬유모세포 종양), 또는 신경모세포종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 폴리시알산 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 폴리시알산을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 소세포 폐암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PLAC1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PLAC1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 HCC(간세포 암종)이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 글로보HCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 글로보H를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암, 위암, 전립선암, 폐암, 유방암, 또는 췌장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 NY-BR-1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 NY-BR-1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유방암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 UPK2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 UPK2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 방광암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 HAVCR1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 HAVCR1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ADRB3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ADRB3을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유잉 육종(Ewing sarcoma)이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PANX3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PANX3을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 골육종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GPR20CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GPR20을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 GIST이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 LY6KCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 LY6K를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유방암, 폐암, 난소암, 또는 자궁경부암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 OR51E2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 OR51E2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전립선암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TARPCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TARP를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전립선암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 WT1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 WT1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 NY-ESO-1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 NY-ESO-1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 LAGE-1a CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 LAGE-1a를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 MAGE-A1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 MAGE-A1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 MAGE A1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 MAGE A1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ETV6-AML CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ETV6-AML을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 정자 단백질 17 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 정자 단백질 17을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 난소암, HCC, 또는 NSCLC이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 XAGE1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 XAGE1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유잉 육종 또는 랍도(rhabdo) 암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 Tie 2 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 Tie 2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 MAD-CT-1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 MAD-CT-1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전립선암, 또는 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 MAD-CT-2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 MAD-CT-2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전립선암, 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 Fos-관련 항원 1 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 Fos-관련 항원 1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 신경교종, 편평세포암, 또는 췌장암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 p53CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 p53을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 프로스테인 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 프로스테인을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 서바이빈 및 텔로머라아제 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 서바이빈 및 텔로머라아제를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PCTA-1/갈렉틴 8 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PCTA-1/갈렉틴 8을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 멜란A/MART1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 멜란A/MART1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 Ras 돌연변이체 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 Ras 돌연변이체를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 p53 돌연변이체 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 p53 돌연변이체를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 hTERT CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 hTERT를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 육종 전좌 중단점 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 육종 전좌 중단점을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 육종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ML-IAP CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ML-IAP를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 ERGCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자)를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 NA17CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 NA17을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PAX3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PAX3을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 폐포형 횡문근육종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 안드로겐 수용체 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 안드로겐 수용체를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 전이성 전립선암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 사이클린 B1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 사이클린 B1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 MYCNCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 MYCN을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 RhoC CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 RhoC를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 TRP-2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 TRP-2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CYP1B1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CYP1B1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 유방암, 결장암, 폐암, 식도암, 피부암, 림프절암, 뇌암, 또는 고환암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 BORIS CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 BORIS를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 폐암이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 SART3CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 SART3을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PAX5CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PAX5를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 OY-TES1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 OY-TES1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 LCK CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 LCK를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 AKAP-4CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 AKAP-4를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 SSX2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 SSX2를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 RAGE-1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 RAGE-1을 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 RCC(신세포암), 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 인간 텔로머라아제 역전사효소 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 인간 텔로머라아제 역전사효소를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 RU1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 RU1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 RU2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 RU2를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 장 카르복실 에스테라아제 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 장 카르복실 에스테라아제를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 갑상선암, RCC, CRC(결장직장암), 유방암, 또는 기타 고형 종양이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 프로스타아제 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 프로스타아제를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 PAPCAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 PAP를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 IGF-I 수용체 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 IGF-I 수용체를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 gp100 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 gp100을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 bcr-abl CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 bcr-abl을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 티로시나아제 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 티로시나아제를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 푸코실 GM1CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 푸코실 GM1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 mut hsp70-2CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 mut hsp70-2를 발현한다. 일 실시 형태에서, 치료될 암은 흑색종이다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD79a CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD79a를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD79b CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD79b를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 CD72 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 암 세포는 CD72를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 LAIR1 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 LAIR1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 FCAR CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 FCAR을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 LILRA2 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 LILRA2를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CD300LF CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CD300LF를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 CLEC12A CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 CLEC12A를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 BST2 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 BST2를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 EMR2 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 EMR2를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 LY75 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 LY75를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 GPC3 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 GPC3을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 FCRL5 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 FCRL5를 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 IGLL1 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 제공하여 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 암 세포는 IGLL1을 발현한다.
일 양태에서, 본 발명은 암성 종양의 성장이 억제되도록 PD1 CAR을 사용하여 생체 내에서 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. PD1 CAR은 암성 종양의 성장을 억제하기 위하여 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, PD1 CAR은 다른 CAR, 면역원(immunogenic agent), 표준 암 치료제, 또는 다른 항체와 함께 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 대상체는 PD1 CAR 및 XCAR(본원에 기술됨)로 치료받는다. 일 실시 형태에서, PD1 CAR은 또 다른 CAR, 예를 들어, 본원에 기술된 CAR, 및 키나아제 억제자, 예를 들어, 본원에 기술된 키나아제 억제자와 함께 사용된다.
또 다른 양태에서, 대상체를 치료하는 방법, 예를 들어, 대상체에서 과다증식성 병태 또는 장애(예를 들어, 암), 예를 들어, 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변을 감소시키거나 개선시키는 방법이 제공된다. 본원에 사용된 용어 "암"은 조직병리학적 유형 또는 침윤성 단계와 무관하게 모든 유형의 암 성장 또는 발암 과정, 전이 조직 또는 악성 형질전환 세포, 조직 또는 기관을 포함함을 의미한다. 고형 종양의 예는 다양한 기관계의 악성 종양, 예를 들어, 육종, 선암종, 및 암종, 예컨대 간, 폐, 유방, 림프, 위장관(예를 들어, 결장), 비뇨생식관(예를 들어, 신장, 요로상피 세포), 전립선, 및 인두에 영향을 미치는 것들을 포함한다. 선암종은 대부분의 결장암, 직장암, 신장세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함한다. 일 실시 형태에서, 암은 흑색종, 예를 들어 진행된 병기의 흑색종이다. 전술한 암들 중 전이성 병변 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. 치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유발된 암을 포함하는, 환경적으로 유발된 암, 및 상기 암들의 조합을 포함한다. 전이성 암, 예를 들어, PD-L1을 발현하는 전이성 암(문헌[Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144])의 치료는 본원에 기술된 항체 분자를 이용하여 이루어질 수 있다.
성장이 억제될 수 있는 예시적인 암은 전형적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위한 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들어, 투명 세포 암종), 전립선암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장암 및 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암)을 포함한다. 또한, 난치성 또는 재발성 악성 종양은 본원에 기술된 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 포유동물 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)에서의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된 CAR을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CAR을 발현하는 재조합 면역 이펙터 세포를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포는, CAR-발현 세포가 암 세포를 표적화하고 암의 성장을 억제하도록, 종양 세포를 그의 표면 상에서 발현되는 적어도 하나의 암 관련 항원과 접촉시킬 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 CART가 항원에 반응하여 활성화되고 암 세포를 표적화하도록, 암 세포를 본 발명의 CAR-발현 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 종양의 성장이 억제된다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 암의 치료 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암이 대상체에서 치료되도록, 본 발명의 CAR-발현 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 암은 혈액암이다. 일 양태에서, 혈액암은 백혈병 또는 림프종이다. 일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 암은 예를 들어 B 세포 급성 림프성 백혈병("BALL"), T 세포 급성 림프성 백혈병("TALL"), 급성 림프성 백혈병(ALL)을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 예를 들어 1가지 이상의 급성 백혈병; 예를 들어, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프성 백혈병(CLL)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 1가지 이상의 만성 백혈병을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암 및 악성 종양을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 추가적인 암 또는 혈액 병태는, 예를 들어, B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성증)에 의해 통합된 다양한 혈액 병태의 집합인 "전백혈병" 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포로 치료될 수 있는 암은 다발성 골수종이다. 다발성 골수종은, 골수에서의 형질 세포 클론의 축적을 특징으로 하는 혈액의 암이다. 다발성 골수종에 대한 현재의 요법은 탈리도미드의 유사체인 레날리도미드를 이용한 치료를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 레날리도미드는 항종양 활성, 혈관형성 억제, 및 면역조절을 포함하는 활성을 갖는다. 일반적으로, 골수종 세포는 유세포 분석법에 의하면 본원에 기술된 암 관련 항원의 발현에 대하여 음성인 것으로 생각된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 CD19 CAR은 골수종 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 요법의 CAR은 하나 이상의 추가의 요법, 예를 들어 레날리도미드 치료법과 병용될 수 있다.
본 발명은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)가 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 변형되고 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 유형의 세포 요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과는 달리, CAR-변형된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 생체 내에서 복제할 수 있어서 장기간 지속하고, 이는 지속된 종양 제어로 이어질 수 있다. 다양한 양태에서, 환자에 투여된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포), 또는 그의 자손은 환자에게 T 세포 또는 NK 세포를 투여한 후 환자 내에서 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 지속된다.
본 발명은 또한, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)가 키메라 항원 수용체(CAR)를 일시적으로 발현하도록, 예를 들어 시험관 내 전사된 RNA에 의해, 변형되고, CAR T 세포 또는 NK 세포가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입되는 유형의 세포 요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 양태에서, 환자에게 투여된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 T 세포 또는 NK 세포가 환자에게 투여된 후 1개월 미만(예를 들어, 3주, 2주, 1주) 동안 존재한다.
특정 이론에 구애되고자 함이 없이, CAR 변형 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)에 의해 유발되는 항-종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접 대 간접 면역 반응으로 인한 것일 수 있다. 일 양태에서, CAR 형질도입된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 본원에 기술된 암 관련 항원을 발현하는 인간 암 세포에 반응하여 특이적 전염증성 사이토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성을 나타내고, 본원에 기술된 가용성 암 관련 항원의 억제에 저항하고, 방관자 사멸을 매개하고, 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 종양의 불균일 영역 내의, 항원이 더 적은 종양 세포는 인접한 항원-양성 암 세포에 대해 이전에 반응한, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원에 의해 방향수정된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)에 의해 간접 파괴되기 쉬울 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 완전-인간 CAR-변형 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 포유동물에서의 생체 외 면역화 및/또는 생체 내 요법을 위한 백신의 유형일 수 있다. 일 양태에서, 포유동물은 인간이다.
생체 외 면역화와 관련하여, 하기 중 적어도 하나가 세포를 포유동물 내로 투여하기 전 시험관 내에서 일어난다: i) 세포의 확장, ii) CAR을 코딩하는 핵산의 세포로의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체 외 절차는 본 기술 분야에 잘 알려져 있고, 하기에 보다 상세하게 논의된다. 간단히 말하자면, 포유동물(예를 들어, 인간)로부터 세포가 단리되고, 이 세포는 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전자 변형된다(즉, 시험관 내에서 형질도입되거나 트랜스펙션된다). CAR 변형 세포는 포유동물 수용자에게 투여되어 치료상의 이익을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자와 관련하여 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자와 관련하여 동종이계, 동계 또는 이종계일 수 있다.
조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 생체 외 확장을 위한 절차는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,199,942호에 기술되어 있고, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있고, 따라서 본 발명은 세포의 생체 외 확장의 임의의 특정한 방법에 한정되지 않는다. 간략하게, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 생체 외 배양 및 확장은 (1) 포유동물로부터 말초 혈액 수확물 또는 골수 이식편으로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 것; 및 (2) 이러한 세포를 생체 외 확대시키는 것을 포함한다. 미국 특허 제5,199,942호에 기술된 세포 성장 인자에 더하여, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.
생체 외 면역화와 관련하여 세포-기반 백신을 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 유도된 면역 반응을 야기하는 생체 내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환, 장애 및 병태의 치료에 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명의 세포는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환, 장애 및 병태의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
일 양태에서 본 발명의 CAR-발현 세포는 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양, 또는 전암성 병태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 증후는, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알러지 및 천식) 및 이식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 조합하여 제약 조성물로서 투여될 수 있다.
혈액암
혈액암 병태는 백혈병, 림프종 및 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 미치는 악성 림프구증식 병태와 같은 유형의 암이다.
백혈병은 급성 백혈병 및 만성 백혈병으로 분류될 수 있다. 급성 백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프성 백혈병(ALL)으로 추가로 분류될 수 있다. 만성 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 림프성 백혈병(CLL)을 포함한다. 다른 관련 병태는 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성증) 및 AML로의 변환 위험에 의해 통합된 다양한 혈액 병태의 집합인 골수이형성 증후군(MDS, 이전에 "전백혈병"으로 공지됨)을 포함한다.
림프종은 림프구에서 발생하는 혈액 세포 종양 그룹이다. 예시적인 림프종은 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 포함한다.
본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 양태에서, 암은 백혈병 또는 림프종인 혈액암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 혈액암이다. 일 양태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포는, 예를 들어 다음과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 암 및 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다: 예를 들어, B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병(ALL)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 급성 백혈병; 예를 들어, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 만성 백혈병; 예를 들어, B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성증)에 의해 통합된 다양한 혈액 병태의 집합인 "전백혈병" 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 추가의 혈액암 또는 혈액 병태. 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 관련된 질환은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성 종양, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포 집단의 증식의 억제 또는 감소 방법을 제공하며, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포를 포함하는 세포의 집단을 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 암 세포의 집단의 증식의 억제 또는 감소 방법을 제공하며, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 암 세포 집단을 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 암 세포의 집단의 증식의 억제 또는 감소 방법을 제공하며, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포는 골수성 백혈병, 또는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포와 관련된 또 다른 암을 갖는 대상체 또는 이를 위한 동물 모델에서, 음성 대조군에 비해 세포 및/또는 암 세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킨다. 일 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포와 관련된 질환(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)의 예방, 치료 및/또는 관리 방법을 제공하며, 본 방법은 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR T 세포 또는 NK 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 대상체는 인간이다. 본원에 기술된 암 관련 항원-발현 세포와 관련된 장애의 비제한적인 예는 자가면역 장애(예컨대, 루푸스), 염증성 장애(예컨대, 알러지 및 천식) 및 암(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)을 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포와 관련된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리 방법을 제공하며, 본 방법은 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR T 세포 또는 NK 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포와 관련된 암의 재발의 예방 방법을 제공하며, 본 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR T 세포 또는 NK 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 본 방법은 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-발현 세포에 결합하는 본원에 기술된 CAR-발현 T 세포 또는 NK 세포의 유효량을 또 다른 요법제의 유효량과 조합하여 투여하는 단계를 포함한다.
병용 요법
본원에 기술된 CAR-발현 세포는 다른 공지된 에이전트 및 요법제와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "조합하여" 투여된은, 2가지(또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체가 장애를 앓는 동안 대상체에게 전달됨을 의미하고, 예를 들어 대상체가 장애로 진단된 이후 및 장애가 치유 또는 제거되기 이전 또는 치료가 다른 이유로 중지되기 이전에 2가지 이상의 치료가 전달된다. 일부 실시 형태에서, 하나의 치료의 전달은 제2 전달이 시작될 때 여전히 일어나고 있는 중이어서, 투여 면에서 중첩이 존재한다. 이것은 때때로 본원에서 "동시" 또는 "병행 전달"로 지칭된다. 다른 실시 형태에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 이전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 실시 형태에서, 조합 투여로 인해 치료가 보다 효과적이다. 예를 들어 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에 의해 등가의 효과가 관찰되거나, 또는 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우에 관찰되는 것보다 더 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 일부 실시 형태에서, 전달은, 증상의 감소, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터가 다른 것의 부재 하에 전달된 하나의 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 하는 것이다. 상기 2가지의 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 완전히 상가적이거나, 또는 상가적인 것보다 클 수 있다. 전달은, 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출 가능하도록 하는 것일 수 있다.
본원에 기술된 CAR-발현 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 개별 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기술된 CAR-발현 세포가 먼저 투여되고, 추가의 에이전트가 두번째로 투여될 수 있거나, 투여의 순서가 역전될 수 있다.
CAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 활동성 장애의 기간 동안, 또는 관해의 기간 또는 덜 활동성인 질환의 기간 동안 투여될 수 있다. CAR 요법은 장애의 다른 치료 전, 치료와 동시적으로, 치료 후, 또는 관해 동안 투여될 수 있다.
조합되어 사용되는 경우에, CAR 요법 및 추가의 에이전트(예를 들어 제2 또는 제3 에이전트), 또는 이들 전부는 개별적으로, 예를 들어 단일요법제로서 사용되는 각각의 에이전트의 양 또는 투여량보다 높거나, 낮거나, 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시 형태에서, CAR 요법, 추가의 에이전트(예를 들어 제2 또는 제3 에이전트), 또는 이들 전부의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어 단일요법제로서 사용되는 각각의 에이전트의 양 또는 투여량보다 낮다(예를 들어 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮다). 다른 실시 형태에서, CAR 요법, 추가적 에이전트(예를 들어, 제2 또는 제3 에이전트), 또는 이들 전부의, 원하는 효과(예를 들어 암의 치료)를 발생시키는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어 단일요법제로서 사용되는 각각의 에이전트가 동일한 치료 효과를 달성하는 데 필요한 양 또는 투여량보다 낮다(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮다).
추가의 양태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 시톡신, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선조사, 펩티드 백신, 예컨대 문헌[Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기술된 것과 조합되어 치료 요법에서 사용될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 화학요법제와 조합되어 사용될 수 있다. 예시적인 화학요법제는 안트라사이클린(예컨대, 독소루비신(예를 들어, 리포솜성 독소루비신)), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제(예를 들어, 시클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드), 면역 세포 항체(예를 들어, 알렘투자맙, 젬투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙), 대사길항물질(예를 들어, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나아제 억제제(예를 들어, 플루다라빈) 포함), mTOR 억제자, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR) 작용제, 프로테아좀 억제제(예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉), 면역조절제, 예컨대 탈리도미드 또는 탈리도미드 유도체(예를 들어 레날리도미드)를 포함한다.
병용 요법에서의 사용을 위해 고려되는 일반적인 화학요법제는 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®), 블레오마이신 설페이트(Blenoxane®), 부설판(Myleran®), 부설판 주사제(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴(Paraplatin®), 카르무스틴(BiCNU®), 클로람부실(Leukeran®), 시스플라틴(Platinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 시클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 사이타라빈, 사이토신 아라비노시드(Cytosar-U®), 사이타라빈 리포솜 주사제(DepoCyt®), 다카르바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(Actinomycin D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사제(DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 히드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포시드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 젬시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아(Hydrea®), 아이다루비신(Idamycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar®), L-아스파라기나아제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-머캅토퓨린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론(Novantrone®), 마일로타그, 파클리탁셀(Taxol®), 피닉스(Yttrium90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카무스틴 임플란트가 있는 폴리페프로산 20(Gliadel®), 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포시드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 비노렐빈(Navelbine®)을 포함한다.
예시적인 알킬화제는 제한 없이, 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠: 우라실 머스타드(Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), 클로르메틴(Mustargen®), 시클로포스파미드(Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, RevimmuneTM), 이포스파미드(Mitoxana®), 멜팔란(Alkeran®), 클로람부실(Leukeran®), 피포브로만(Amedel®, Vercyte®), 트리에틸렌멜라민(Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), 트리에틸렌티오포스포라민, 테모졸로미드(Temodar®), 티오테파(Thioplex®), 부설판(Busilvex®, Myleran®), 카르무스틴(BiCNU®), 로무스틴(CeeNU®), 스트렙토조신(Zanosar®), 및 다카르바진(DTIC-Dome®)을 포함한다. 추가의 예시적인 알킬화제는 제한 없이, 옥살리플라틴(Eloxatin®); 테모졸로미드(Temodar® 및 Temodal®); 닥티노마이신(악티노마이신-D로도 알려짐, Cosmegen®); 멜팔란(L-PAM, L-사르콜리신, 및 페닐알라닌 머스타드로도 알려짐, Alkeran®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 알려짐, Hexalen®); 카르무스틴(BiCNU®); 벤다무스틴(Treanda®); 부설판(Busulfex® and Myleran®); 카르보플라틴(Paraplatin®); 로무스틴(CCNU로도 알려짐, CeeNU®); 시스플라틴(CDDP로도 알려짐, Platinol® 및 Platinol®-AQ); 클로람부실(Leukeran®); 시클로포스파미드(Cytoxan® 및 Neosar®); 다카르바진(DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복사미드로도 알려짐, DTIC-Dome®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 알려짐, Hexalen®); 이포스파미드(Ifex®); 프레드누무스틴; 프로카르바진(Matulane®); 메클로레타민(질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 하이드로클로라이드로도 알려짐, Mustargen®); 스트렙토조신(Zanosar®); 티오테파(티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA로도 알려짐, Thioplex®); 시클로포스파미드(Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); 및 벤다무스틴 HCl(Treanda®)을 포함한다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 리툭시맙(FCR)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실(del(17p), 예를 들어 백혈병 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시 형태들에서, 대상체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(IgV H ) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 백혈병 세포를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(IgV H ) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 백혈병 세포를 포함하지 않는다. 실시 형태들에서, 플루다라빈은 약 10~50 ㎎/㎡(예를 들어 약 10~15, 15~20, 20~25, 25~30, 30~35, 35~40, 40~45, 또는 45~50 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시 형태들에서, 시클로포스파미드는 약 200~300 ㎎/㎡(예를 들어, 약 200~225, 225~250, 250~275, 또는 275~300 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시 형태들에서, 리툭시맙은 약 400~600 ㎎/㎡(예를 들어, 400~450, 450~500, 500~550, 또는 550~600 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 벤다무스틴 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실(del(17p), 예를 들어 백혈병 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시 형태들에서, 대상체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(IgV H ) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 백혈병 세포를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(IgV H ) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 백혈병 세포를 포함하지 않는다. 실시 형태들에서, 벤다무스틴은 약 70~110 ㎎/㎡(예를 들어, 70~80, 80~90, 90~100, 또는 100~110 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시 형태들에서, 리툭시맙은 약 400~600 ㎎/㎡(예를 들어, 400~450, 450~500, 500~550, 또는 550~600 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및/또는 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손(R-CHOP)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 비벌키 제한-병기(nonbulky limited-stage) DLBCL을 갖는다(예를 들어, 7 cm 미만의 크기/직경을 갖는 종양을 포함한다). 실시 형태들에서, 대상체는 R-CHOP와 조합된 방사선으로 치료받는다. 예를 들어, 대상체는 R-CHOP(예를 들어, 1~6 사이클, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 사이클의 R-CHOP), 이어서 방사선이 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 R-CHOP(예를 들어, 1~6 사이클, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 사이클의 R-CHOP), 이어서 방사선이 투여된다.
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신, 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신, 및 리툭시맙(EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는용량-조정된 EPOCH-R(DA-EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 B 세포 림프종, 예를 들어, Myc-재배열 침습 B 세포 림프종을 갖는다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및/또는 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 레날리도미드 ((RS)-3-(4-아미노-1-옥소 1,3-디히드로-2H-이소인돌- 2-일)피페리딘-2,6-디온)은 면역조절제이다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 여포성 림프종(FL) 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 Fl을 가지며, 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시 형태들에서, 레날리도미드는 약 10~20 mg(예를 들어, 10~15 또는 15~20 mg)의 투여량으로, 예를 들어, 매일 투여된다. 실시 형태들에서, 리툭시맙은 약 350~5500 mg/m2(예를 들어, 350~375, 375~400, 400~425, 425~450, 450~475, 또는 475~500 mg/m2)의 용량으로, 예를 들어 정맥내 투여된다.
예시적인 mTOR 억제자는, 예를 들어 템시롤리무스; 리다포롤리무스(공식적으로 데포롤리무스로서 공지됨, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, 또한 AP23573 및 MK8669로도 공지되고 국제 공개 제03/064383호에 기술됨); 에베롤리무스(Afinitor® 또는 RAD001); 라파마이신(AY22989, Sirolimus®); 시마피모드(CAS 164301-51-3); 엠시롤리무스, (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올(AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린-, 내부 염(SF1126, CAS 936487-67-1)(서열 번호 1262), 및 XL765를 포함한다.
예시적인 면역조절자는 예를 들어 아푸투주맙(Roche®로부터 입수가능함); 페그필그라스팀(Neulasta®); 레날리도미드(CC-5013, Revlimid®); 탈리도미드(Thalomid®), 악티미드(CC4047); 및 IRX-2(인터류킨 1, 인터류킨 2, 및 인터페론 γ를 포함한 인간 사이토카인의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX Therapeutics로부터 입수가능함)을 포함한다.
예시적인 안트라사이클린은 예를 들어 독소루비신(Adriamycin® 및 Rubex®); 블레오마이신(lenoxane®); 다우노루비신(다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노마이신, 및 루비도마이신 하이드로클로라이드, Cerubidine®); 다우노루비신 리포솜(다우노루비신 시트레이트 리포솜, DaunoXome®); 미톡산트론(DHAD, Novantrone®); 에피루비신(Ellence™); 이다루비신(Idamycin®, Idamycin PFS®); 미토마이신 C(Mutamycin®); 겔다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데스아세틸라비도마이신을 포함한다.
예시적인 빈카 알칼로이드는 예를 들어 비노렐빈 타르트레이트(Navelbine®), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 빈데신(Eldisine®)); 빈블라스틴(빈블라스틴 설페이트, 빈카류코블라스틴 및 VLB, Alkaban-AQ® 및 Velban®으로도 공지됨); 및 비노렐빈(Navelbine®)을 포함한다.
예시적인 프로테오솜 억제자는 보르테조밉(Velcade®); 카르필조밉(PX-171-007, (S)-4-메틸-N-((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-모르폴리노아세트아미도)-4-페닐부탄아미도)-펜탄아미드); 마리조밉(NPI-0052); 익사조밉 시트레이트(MLN-9708); 델란조밉(CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드(ONX-0912)를 포함한다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 브렌툭시맙은 항-CD30 항체 및 모노메틸 아우리스타틴 E의 항체-약물 콘쥬게이트이다. 실시 형태들에서, 대상체는 호지킨 림프종(HL), 예를 들어 재발성 또는 불응성 HL을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 CD30+ HL을 포함한다. 실시 형태들에서, 대상체는 자가 줄기 세포 이식(ASCT)을 받은 바 있다. 실시 형태들에서, 대상체는 ASCT를 받은 바 없다. 실시 형태들에서, 브렌툭시맙은 약 1~3 ㎎/㎏(예를 들어 약 1~1.5, 1.5~2, 2~2.5, 또는 2.5~3 ㎎/㎏)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙 및 다카르바진과 조합되어, 또는 브렌툭시맙 및 벤다무스틴과 조합되어 대상체에게 투여된다. 다카르바진은 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카르복스아미드의 화학명을 갖는 알킬화제이다. 벤다무스틴은 4-[5-[비스(2-클로로에틸)아미노]-1-메틸벤즈이미다졸-2-일]부탄산의 화학명을 갖는 알킬화제이다. 실시 형태들에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL)을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시 형태들에서, 대상체는 적어도 60세, 예를 들어 60, 65, 70, 75, 80, 85세 이상이다. 실시 형태들에서, 다카르바진은 약 300~450 ㎎/㎡(예를 들어 약 300~325, 325~350, 350~375, 375~400, 400~425, 또는 425~450 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시 형태들에서, 벤다무스틴은 약 75~125 ㎎/㎡(예를 들어 75~100 또는 100~125 ㎎/㎡, 예를 들어 약 90 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시 형태들에서, 브렌툭시맙은 약 1~3 ㎎/㎏(예를 들어 약 1~1.5, 1.5~2, 2~2.5, 또는 2.5~3 ㎎/㎏)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CD20 억제자, 예를 들어 항-CD20 항체(예를 들어 항-CD20 단일- 또는 이중특이성 항체) 또는 그의 단편과 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙, 오비누투주맙, TRU-015(Trubion Pharmaceuticals), 오카라투주맙, 및 Pro131921(Genentech)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 문헌[Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43]을 참조한다.
일부 실시 형태에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙을 포함한다. 리툭시맙은 예를 들어 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf에 기술된 바와 같은, CD20에 결합하고 CD20 발현 세포의 세포용해를 유발하는 키메라 마우스/인간 단클론 항체 IgG1 카파이다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 리툭시맙은 정맥내로, 예를 들어 정맥내 주입으로서 투여된다. 예를 들어 각각의 주입은 약 500~2000 ㎎(예를 들어 약 500~550, 550~600, 600~650, 650~700, 700~750, 750~800, 800~850, 850~900, 900~950, 950~1000, 1000~1100, 1100~1200, 1200~1300, 1300~1400, 1400~1500, 1500~1600, 1600~1700, 1700~1800, 1800~1900, 또는 1900~2000 ㎎)의 리툭시맙을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 리툭시맙은 150 mg/m2 내지 750 mg/m2, 예를 들어 약 150 내지 175 mg/m2, 175 내지 200 mg/m2, 200 내지 225 mg/m2, 225 내지 250 mg/m2, 250 내지 300 mg/m2, 300 내지 325 mg/m2, 325 내지 350 mg/m2, 350 내지 375 mg/m2, 375 내지 400 mg/m2, 400 내지 425 mg/m2, 425 내지 450 mg/m2, 450 내지 475 mg/m2, 475 내지 500 mg/m2, 500 내지 525 mg/m2, 525 내지 550 mg/m2, 550 내지 575 mg/m2, 575 내지 600 mg/m2, 600 내지 625 mg/m2, 625 내지 650 mg/m2, 650 내지 675 mg/m2, 또는 675 내지 700 mg/m2의 용량으로 투여되며, 여기서 m2는 대상체의 체표면적을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 리툭시맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일, 또는 그 초과의 투약 간격으로 투여된다. 예를 들어 리툭시맙은 적어도 0.5주, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 이상의 투약 간격으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 리툭시맙은, 예를 들어 적어도 2주, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20주 이상의 기간 동안 본원에 기술된 용량 및 투약 간격으로 투여된다. 예를 들어 리툭시맙은 치료 사이클당 적어도 총 4회 투약(예를 들어 치료 사이클당 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16회 이상의 투약) 동안 본원에 기술된 용량 및 투약 간격으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 항-CD20 항체는 오파투무맙을 포함한다. 오파투무맙은 대략 149 kDa의 분자량을 갖는 항-CD20 IgG1κ 인간 단클론 항체이다. 예를 들어 오파투무맙은 트랜스제닉 마우스 및 하이브리도마 기술을 사용하여 생성되고, 재조합 쥣과 세포주(NS0)로부터 발현 및 정제된다. 예를 들어 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352, 및 NCT01397591을 참조한다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 오파투무맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 오파투무맙은 정맥내 주입으로 투여된다. 예를 들어 각각의 주입은 약 150~3000 ㎎(예를 들어 약 150~200, 200~250, 250~300, 300~350, 350~400, 400~450, 450~500, 500~550, 550~600, 600~650, 650~700, 700~750, 750~800, 800~850, 850~900, 900~950, 950~1000, 1000~1200, 1200~1400, 1400~1600, 1600~1800, 1800~2000, 2000~2200, 2200~2400, 2400~2600, 2600~2800, 또는 2800~3000 ㎎)의 오파투무맙을 제공한다. 실시 형태들에서, 오파투무맙은, 예를 들어 약 11회 투약 동안, 예를 들어 24주 동안 약 300 ㎎의 출발 투여량, 이어서 2000 ㎎으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 오파투무맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일 이상의 투약 간격으로 투여된다. 예를 들어 오파투무맙은 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30주 이상의 투약 간격으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 오파투무맙은 일정 기간, 예를 들어 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60주 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5년 이상 동안 본원에 기술된 용량 및 투약 간격으로 투여된다. 예를 들어 오파투무맙은 치료 사이클당 적어도 총 2회 투약(예를 들어 치료 사이클당 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20회 이상의 투약) 동안 본원에 기술된 용량 및 투약 간격으로 투여된다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 오크렐리주맙을 포함한다. 오크렐리주맙은, 예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, 및 문헌[Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87]에 기술된 바와 같은 인간화 항-CD20 단클론 항체이다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 벨투주맙을 포함한다. 벨투주맙은 CD20에 대한 인간화 단클론 항체이다. 예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, 및 문헌[Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 GA101을 포함한다. GA101(오비누투주맙 또는 RO5072759로도 불림)는 인간화되고 글리코-조작된 항-CD20 단클론 항체이다. 예를 들어 문헌[Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96]; 임상 시험 식별자 번호: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422, 및 NCT01414205; 및 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf를 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 AME-133v를 포함한다. AME-133v(LY2469298 또는 오카라투주맙으로도 불림)는 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa 수용체에 대해 증가된 친화도 및 증진된 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 활성을 갖는 CD20에 대한 인간화 IgG1 단클론 항체이다. 예를 들어 문헌[Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25]; 및 문헌[Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 PRO131921을 포함한다. PRO131921은 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 보다 우수한 결합 및 증진된 ADCC를 갖도록 조작된 인간화 항-CD20 단클론 항체이다. 예를 들어 문헌[Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25]; 및 문헌[Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46]; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT00452127을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 TRU-015를 포함한다. TRU-015는 CD20에 대한 항체의 도메인으로부터 유래된 항-CD20 융합 단백질이다. TRU-015는 단클론 항체보다 작지만, Fc-매개 이펙터 기능을 보유한다. 예를 들어 문헌[Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25]을 참조한다. TRU-015는 인간 IgG1 힌지, CH2, 및 CH3 도메인에 연결된 항-CD20 단쇄 가변 단편(scFv)을 함유하지만, CH1 및 CL 도메인은 결여되어 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 항-CD20 항체는 치료제, 예를 들어 본원에 기술된 화학요법제(예를 들어 시톡산, 플루다라빈, 히스톤 데아세틸라아제 억제제, 탈메틸화제, 펩티드 백신, 항종양 항생제, 티로신 키나아제 억제제, 알킬화제, 항미세관제 또는 항유사분열제), 항알러지제, 항오심제(또는 항구토제), 통증 완화제 또는 세포보호제에 콘쥬게이트되거나 달리 결합된다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 B-세포 림프종 2(BCL-2) 억제자(예를 들어 베네토클락스, ABT-199 또는 GDC-0199로도 불림) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 베네토클락스 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 베네토클락스는 항아폽토시스 단백질, BCL-2를 억제하는 소분자이다. 베네토클락스 (4-(4-{[2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸시클로헥스-1-엔-1-일]메틸}피페라진-1-일)-N-({3-니트로-4-[(테트라히드로-2H-피란-4-일메틸)아미노]페닐}술포닐)-2-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일옥시)벤즈아미드)의 구조는 하기에 예시되어 있다.
Figure pct00121
실시 형태들에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다. 실시 형태들에서, 베네토클락스는 약 15~600 ㎎(예를 들어 15~20, 20~50, 50~75, 75~100, 100~200, 200~300, 300~400, 400~500, 또는 500~600 ㎎)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시 형태들에서, 리툭시맙은 약 350~550 ㎎/㎡(예를 들어 350~375, 375~400, 400~425, 425~450, 450~475, 또는 475~500 ㎎/㎡)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 매월 투여된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포는 Treg 세포 집단을 감소시키는 분자와 조합되어 대상체에게 투여된다. Treg 세포의 수를 감소시키는(예를 들어 고갈시키는) 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드 투여, GITR 기능 조정을 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 분리반출술 전 또는 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 투여 전에 대상체에서 Treg 세포의 수를 감소시키는 것은 종양 미세환경에서 원치않는 면역 세포(예를 들어 Treg)의 수를 감소시키고 대상체의 재발 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다. 일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포는 GITR을 표적화하고/하거나 GITR 기능을 조정하는 분자, 예컨대 조절 T 세포(Treg)를 고갈시키는 GITR 작용제 및/또는 GITR 항체와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포는 시클로포스파미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일 실시 형태에서, GITR 결합 분자 및/또는 GITR 기능을 조정하는 분자(예를 들어 GITR 작용제 및/또는 Treg 고갈 GITR 항체)는 CAR-발현 세포의 투여 전에 투여된다. 예를 들어 일 실시 형태에서, GITR 작용제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 실시 형태들에서, 시클로포스파미드는 CAR-발현 세포의 투여(예를 들어, 주입 또는 재주입) 전에 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 시클로포스파미드 및 항-GITR 항체는 CAR-발현 세포의 투여(예를 들어, 주입 또는 재주입) 전에 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 일 실시 형태에서, 대상체는 암(예를 들어, 고형 암 또는 혈액암, 예컨대 ALL 또는 CLL)을 갖는다. 일 실시 형태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 ALL을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기술된 고형 암을 갖는다. 예시적인 GITR 작용제는 예를 들어 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체(예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예를 들어, 미국 특허 제6,111,090호, 유럽 특허 제090505B1호, 미국 특허 제8,586,023호, 국제 공개 제2010/003118호 및 국제 공개 제2011/090754호에 기술된 GITR 융합 단백질, 또는 예를 들어 미국 특허 제7,025,962호, 유럽 특허 제1947183B1호, 미국 특허 제7,812,135호, 미국 특허 제8,388,967호, 미국 특허 제8,591,886호, 유럽 특허 제1866339호, 국제 공개 제2011/028683호, 국제 공개 제2013/039954호, 국제 공개 제2005/007190호, 국제 공개 제2007/133822호, 국제 공개 제2005/055808호, 국제 공개 제99/40196호, 국제 공개 제2001/03720호, 국제 공개 제99/20758호, 국제 공개 제2006/083289호, 국제 공개 제2005/115451호, 미국 특허 제7,618,632호 및 국제 공개 제2011/051726호에 기술된 항-GITR 항체를 포함한다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 mTOR 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파로그(rapalog), 예컨대 에베롤리무스(everolimus)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자는 CAR-발현 세포 이전에 투여된다. 예를 들어 일 실시 형태에서, mTOR 억제자는 세포의 분리반출술 이전에 투여될 수 있다. 일 실시 형태에서, 대상체는 CLL을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR 발현 세포는 GITR 작용제, 예를 들어 본원에 기술된 GITR 작용제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일 실시 형태에서, GITR 작용제는 CAR-발현 세포 이전에 투여된다. 예를 들어 일 실시 형태에서, GITR 작용제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 일 실시 형태에서, 대상체는 CLL을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 키나아제 억제자와 조합되어 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 CDK4 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 CDK4 억제자, 예를 들어 CD4/6 억제자, 예컨대 예를 들어 6-아세틸-8-시클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노)-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 하이드로클로라이드(팔보시클립 또는 PD0332991로도 지칭됨)이다. 일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 BTK 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 BTK 억제자, 예컨대 예를 들어 이브루티닙(ibrutinib)이다. 일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 mTOR 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 mTOR 억제자, 예컨대 예를 들어 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제자는, 예를 들어 mTORC1 억제자 및/또는 mTORC2 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 mTORC1 억제자 및/또는 mTORC2 억제자일 수 있다. 일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 MNK 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 MNK 억제자, 예컨대 예를 들어 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제자는, 예를 들어 MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제자일 수 있다. 일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 본원에 기술된 이중 PI3K/mTOR 억제자, 예컨대, 예를 들어 PF-04695102이다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 알로이신 A; 플라보피리돌 또는 HMR-1275, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논; 크리조티닙(PF-02341066); 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(2R,3S)-2-(히드록시메틸)-1-메틸-3-피롤리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온, 하이드로클로라이드(P276-00); 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-벤즈이미다졸-2-아민(RAF265); 인디술람(E7070); 로스코비틴(CYC202); 팔보시클립(PD0332991); 디나시클립(SCH727965); N-[5-[[(5-tert-부틸옥사졸-2-일)메틸]티오]티아졸-2-일]피페리딘-4-카르복스아미드(BMS 387032); 4-[[9-클로로-7-(2,6-디플루오로페닐)-5H-피리미도[5,4-d][2]벤즈아제핀-2-일]아미노]-벤조산(MLN8054); 5-[3-(4,6-디플루오로-1H-벤즈이미다졸-2-일)-1H-인다졸-5-일]-N-에틸-4-메틸-3-피리딘메탄아민(AG-024322); 4-(2,6-디클로로벤조일아미노)-1H-피라졸-3-카르복실산 N-(피페리딘-4-일)아미드(AT7519); 4-[2-메틸-1-(1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸술포닐)페닐]-2-피리미딘아민(AZD5438); 및 XL281(BMS908662)로부터 선택된 CDK4 억제자이다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 CDK4 억제자, 예를 들어 팔보시클립(PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클의 14~21일 동안 매일 또는 21일 사이클의 7~12일 동안 매일 약 50 ㎎, 60 ㎎, 70 ㎎, 75 ㎎, 80 ㎎, 90 ㎎, 100 ㎎, 105 ㎎, 110 ㎎, 115 ㎎, 120 ㎎, 125 ㎎, 130 ㎎, 135 ㎎(예를 들어 75 ㎎, 100 ㎎ 또는 125 ㎎)의 용량으로 투여된다. 일 실시 형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상의 사이클의 팔보시클립이 투여된다.
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 사이클린-의존성 키나아제(CDK) 4 또는 6 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 CDK4 억제자 또는 CDK6 억제자와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CDK4/6 억제자(예를 들어 CDK4 및 CDK6 둘 다를 표적화하는 억제자), 예를 들어 본원에 기술된 CDK4/6 억제자와 조합되어 대상체에게 투여된다. 일 실시 형태에서, 대상체는 MCL을 갖는다. MCL은 현행 이용가능한 요법에 대해 불량한 반응성의, 즉 본질적으로 치유불가능한 침습 암이다. MCL의 많은 사례에서, 사이클린 D1(CDK4/6의 조절자)이 MCL 세포에서 발현된다(예를 들어 면역글로불린 및 사이클린 D1 유전자를 수반하는 염색체 전위로 인함). 따라서, 이론에 구애됨이 없이, MCL 세포는 높은 특이성으로 CDK4/6을 억제하는 것에 대해 고도로 감수성인 것으로 생각된다(즉, 정상 면역 세포에 대해서는 최소 효과). CDK4/6 억제자 단독은 MCL을 치료하는데 있어서 약간의 효능을 갖지만, 높은 재발률을 갖는 부분적 관해만이 달성된다. 예시적인 CDK4/6 억제자로는 LEE011(리보시클립으로도 불림)이 있으며, 그의 구조가 하기에 예시된다.
Figure pct00122
이론에 구애됨이 없이, CDK4/6 억제자(예를 들어 LEE011 또는 본원에 기술된 다른 CDK4/6 억제자)와 함께 본원에 기술된 CAR-발현 세포를 투여하는 것은, 예를 들어 CDK4/6 억제자 단독과 비교하여, 예를 들어 더 높은 관해율 및/또는 더 낮은 재발률을 갖는 더 높은 반응성을 달성할 수 있는 것으로 여겨진다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 이브루티닙(PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제자이다. 일 실시 형태에서, BTK 억제자는 인터류킨-2-유도성 키나아제(ITK)의 키나아제 활성을 감소시키지 않거나 억제하지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 BTK 억제자, 예를 들어 이브루티닙(PCI-32765)이다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 BTK 억제자(예를 들어 이브루티닙)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 이브루티닙(PCI-32765라고도 함)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이브루티닙 1-[(3R)-3-[4-아미노-3-(4-페녹시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일]피페리딘-1-일]프로프-2-엔-1-온)의 구조가 하기에 예시된다.
Figure pct00123
실시 형태들에서, 대상체는 CLL, 맨틀 세포 림프종(MCL), 또는 소림프구성 림프종(SLL)을 갖는다. 예를 들어 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실(del(17p), 예를 들어 백혈병 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시 형태들에서, 대상체는 재발성 CLL 또는 SLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다(예를 들어 이전에 1, 2, 3, 또는 4종의 선행 암 요법을 투여받은 바 있음). 실시 형태들에서, 대상체는 불응성 CLL 또는 SLL을 갖는다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 여포성 림프종, 예를 들어 재발성 또는 불응성 여포성 림프종을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이브루티닙은 약 300~600 ㎎/일(예를 들어 약 300~350, 350~400, 400~450, 450~500, 500~550 또는 550~600 ㎎/일, 예를 들어 약 420 ㎎/일 또는 약 560 ㎎/일)의 투여량으로 예를 들어 경구 투여된다. 실시 형태들에서, 이브루티닙은 약 250 ㎎, 300 ㎎, 350 ㎎, 400 ㎎, 420 ㎎, 440 ㎎, 460 ㎎, 480 ㎎, 500 ㎎, 520 ㎎, 540 ㎎, 560 ㎎, 580 ㎎, 600 ㎎(예를 들어 250 ㎎, 420 ㎎ 또는 560 ㎎)의 용량으로 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일의 사이클의 사이클 동안 매일, 또는 28일의 사이클 동안 매일 투여된다. 일 실시 형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 사이클 이상의 사이클의 이브루티닙이 투여된다. 이론에 구애됨이 없이, 이브루티닙의 첨가는 T 세포 증식 반응을 증진시키고, T 세포를 T-헬퍼-2(Th2)로부터 T-헬퍼-1(Th1) 표현형으로 바꿀 수 있다고 생각된다. Th1 및 Th2는 헬퍼 T 세포의 표현형으로, Th1 대 Th2는 상이한 면역 반응 경로를 지시한다. Th1 표현형은 예를 들어 세포, 예컨대 세포내 병원체/바이러스 또는 암성 세포를 사멸시키거나 자가면역 반응을 영속시키는 전염증 반응과 관련된다. Th2 표현형은 호산구 축적 및 항-염증 반응과 관련된다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 하기로부터 선택된 mTOR 억제자이다: 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9] 헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, AP23573 및 MK8669로도 공지됨; 에베롤리무스(RAD001); 라파마이신(AY22989); 세마피모드; (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올(AZD8055); 2-미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린-, 내부 염(SF1126)(서열 번호 1262); 및 XL765.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신이고, 라파마이신은 약 3 ㎎, 4 ㎎, 5 ㎎, 6 ㎎, 7 ㎎, 8 ㎎, 9 ㎎, 10 ㎎(예를 들어 6 ㎎)의 용량으로 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일의 사이클의 사이클 동안 매일, 또는 28일의 사이클 동안 매일 투여된다. 일 실시 형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 사이클 이상의 사이클의 라파마이신이 투여된다. 일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 mTOR 억제자, 예를 들어 에베롤리무스이고, 에베롤리무스는 약 2 ㎎, 2.5 ㎎, 3 ㎎, 4 ㎎, 5 ㎎, 6 ㎎, 7 ㎎, 8 ㎎, 9 ㎎, 10 ㎎, 11 ㎎, 12 ㎎, 13 ㎎, 14 ㎎, 15 ㎎(예를 들어 10 ㎎)의 용량으로 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일의 사이클 동안 매일 투여된다. 일 실시 형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 사이클 이상의 사이클의 에베롤리무스가 투여된다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 CGP052088; 4-아미노-3-(p-플루오로페닐아미노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘 (CGP57380); 세르코스포라미드; ETC-1780445-2; 및 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제자이다.
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는, 포스포이노시티드 3-키나아제(PI3K) 억제자(예를 들어, 본원에 기술된 PI3K 억제자, 예를 들어 이델라리시브 또는 두벨리시브) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 이델라리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 두벨리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이델라리시브(GS-1101 또는 CAL-101라고도 함; Gilead)는 PI3K의 델타 이소형을 차단하는 소분자이다. 이델라리시브 (5-플루오로-3-페닐-2-[(1S)-1-(7H-퓨린-6-일아미노)프로필]-4(3H)-퀴나졸리논)의 구조가 하기에 예시된다.
Figure pct00124
두벨리십(IPI-145로도 불림; Infinity Pharmaceuticals 및 Abbvie)은 PI3K-δ,γ를 차단하는 소분자이다. 두벨리십 (8-클로로-2-페닐-3-[(1S)-1-(9H-퓨린-6-일아미노)에틸]-1(2H)-이소퀴놀리논)의 구조가 하기에 예시된다.
Figure pct00125
실시 형태들에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다(예를 들어 이전에 항-CD20 항체를 투여받은 바 있거나, 또는 이전에 이브루티닙을 투여받은 바 있음). 예를 들어 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실(del(17p), 예를 들어 백혈병 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시 형태들에서, 대상체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(IgV H ) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 백혈병 세포를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(IgV H ) 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 백혈병 세포를 포함하지 않는다. 실시 형태들에서, 대상체는 긴 아암의 염색체 11에서 결실(del(11q))을 갖는다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 del(11q)을 갖지 않는다. 실시 형태들에서, 이델라리십은 약 100~400 ㎎(예를 들어 100~125, 125~150, 150~175, 175~200, 200~225, 225~250, 250~275, 275~300, 325~350, 350~375, 또는 375~400 ㎎)의 투여량으로, 예를 들어 BID 투여된다. 실시 형태들에서, 두벨리십은 약 15~100 ㎎(예를 들어 약 15~25, 25~50, 50~75, 또는 75~100 ㎎)의 투여량으로, 예를 들어 1일 2회 투여된다. 실시 형태들에서, 리툭시맙은 약 350~5500 mg/m2(예를 들어, 350~375, 375~400, 400~425, 425~450, 450~475, 또는 475~500 mg/m2)의 용량으로, 예를 들어 정맥내 투여된다.
일 실시 형태에서, 키나아제 억제자는 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF-04691502); N-[4-[[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]카보닐]페닐]-N'-[4-(4,6-디-4-모르폴리닐-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아(PF-05212384, PKI-587); 2-메틸-2-{4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐}프로판니트릴(BEZ-235); 아피톨리십(GDC-0980, RG7422); 2,4-디플루오로-N-{2-(메틸옥시)-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드(GSK2126458); 8-(6-메톡시피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-온 말레산(NVP-BGT226); 3-[4-(4-모르폴리닐피리도[3',2':4,5]푸로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀(PI-103); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-푸린-6-일)피리미딘-2-아민(VS-5584, SB2343); 및 N-[2-[(3,5-디메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-3-일]-4-[(4-메틸-3-메톡시페닐)카보닐]아미노페닐술폰아미드(XL765)로부터 선택되는 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 및 mTOR 억제자이다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 역형성 림프종 키나아제(ALK) 억제자와 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적 ALK 키나아제는 크리조티닙(Pfizer), 세리티닙(Novartis), 알렉티닙(Chugai), 브리가티닙(AP26113AP26113이라고도 함; Ariad), 엔트렉티닙(Ignyta), PF-06463922(Pfizer), TSR-011(Tesaro) (예를 들어, 임상 시험 식별 번호 NCT02048488 참조), CEP-37440(Teva), 및 X-396(Xcovery)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기술된 고형 암, 예를 들어 폐암을 갖는다.
크리조티닙의 화학명은 3-[(1R)-1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민이다. 세리티닙의 화학명은 5-클로로-N 2-[2-이소프로폭시-5-메틸-4-(4-피페리디닐)페닐]-N 4-[2-(이소프로필설포닐)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 알렉티닙의 화학명은 9-에틸-6,6-디메틸-8-(4-모르폴리노피페리딘-1-일)-11-옥소-6,11-디하이드로-5H-벤조[b]카르바졸-3-카르보니트릴이다. 브리가티닙의 화학명은 5-클로로-N2-{4-[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]-2-메톡시페닐}-N4-[2-(디메틸포스포릴)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 엔트렉티닙의 화학명은 N-(5-(3,5-디플루오로벤질)-1H-인다졸-3-일)-4-(4-메틸피페라진-1-일)-2-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)벤즈아미드이다. PF-06463922의 화학명은 (10R)-7-아미노-12-플루오로-2,10,16-트리메틸-15-옥소-10,15,16,17-테트라히드로-2H-8,4-(메테노)피라졸로[4,3-h][2,5,11]-벤족사디아자시클로테트라데신-3-카르보니트릴이다. CEP-37440의 화학 구조는 (S)-2-((5-클로로-2-((6-(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일)-1-메톡시-6,7,8,9-테트라히드로-5H-벤조[7]아눌렌-2-일)아미노)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아미드이다. X-396의 화학명은 (R)-6-아미노-5-(1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-N-(4-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)페닐)피리다진-3-카르복사미드이다.
칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(시클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나아제를 억제하는 약물(라파마이신)(문헌[Liu et al., Cell 66:807-815, 1991]; 문헌[Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991]; 문헌[Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993])이 또한 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 제거 요법, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 시클로포스파미드, 및/또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH와 공동으로(예를 들어 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 제거 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 에이전트, 예를 들어 리툭산 후에 투여된다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이은 말초 혈액 줄기 세포 이식을 이용한 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시 형태에서, 이식 후에, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가적 양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 수술 후에 투여된다.
실시 형태들에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO) 억제자와 조합되어 대상체에게 투여된다. IDO는 아미노산, L-트립토판의 키누레닌으로의 분해를 촉매하는 효소이다. 많은 암, 예를 들어 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 자궁경부암, 위암, 난소암, 두부암 및 폐암이 IDO를 과다발현한다. pDC, 대식세포 및 수지상 세포(DC)는 IDO를 발현할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, L-트립토판의 감소(예를 들어 IDO에 의해 촉매됨)는 T-세포 무반응 및 아폽토시스를 유도함으로써 면역억제 환경을 발생시키는 것으로 생각된다. 따라서, 이론에 구애됨이 없이, IDO 억제자는 예를 들어 CAR-발현 면역 세포의 억제 또는 사멸을 감소시킴으로써 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 실시 형태들에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기술된 고형 종양, 예를 들어 전립선암, 결장직장암, 췌장암, 자궁경부암, 위암, 난소암, 두부암 또는 폐암을 갖는다. IDO의 예시적인 억제자는 1-메틸-트립토판, 인독시모드(NewLink Genetics)(예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT01191216; NCT01792050 참조), 및 INCB024360(Incyte Corp.)(예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT01604889; NCT01685255 참조)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포은 골수-유래 억제 세포(MDSC)의 조정자와 조합되어 대상체에게 투여된다. MDSC는 많은 고형 종양의 주변 및 종양 부위에 축적된다. 이들 세포는 T 세포 반응을 억제함으로써 CAR-발현 세포 요법의 효능을 방해한다. 이론에 구애됨이 없이, MDSC 조정자의 투여는 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시키는 것으로 생각된다. 일 실시 형태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기술된 고형 종양, 예를 들어 교모세포종을 갖는다. MDSC의 예시적인 조정자는 MCS110 및 BLZ945를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. MCS110은 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF)에 대한 단클론 항체(mAb)이다. 예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT00757757을 참조한다. BLZ945는 콜로니 자극 인자 1 수용체(CSF1R)의 소분자 억제자이다. 예를 들어 문헌[Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72]을 참조한다. BLZ945의 구조는 하기에 예시된다.
Figure pct00126
실시 형태들에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 CD19 CART 세포(예를 들어, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2012/079000호에 기술된 바와 같은 CTL019, 또는 CTL119)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 CD19+ 림프종, 예를 들어, CD19+ 비-호지킨 림프종 (NHL), CD19+ FL, 또는 CD19+ DLBCL을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 재발성 또는 불응성 CD19+ 림프종을 갖는다. 실시 형태들에서, 림프고갈 화학요법제는 CD19 CART 세포의 투여(예를 들어, 주입) 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 하나의 예에서, 림프고갈 화학요법제는 CD19 CART 세포의 투여 전에 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 림프고갈 화학요법제는 CD19 CART 세포를 주입하기 1~4일(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4일) 전에 끝난다. 실시 형태들에서, 다회 용량의 CD19 CART 세포가 투여되며, 이는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같다. 예를 들어, 단회 용량은 약 5 x 108개의 CD19 CART 세포를 포함한다. 실시 형태들에서, 림프고갈 화학요법제는 본원에 개시된 CAR-발현 세포, 예를 들어, 비-CD19 CAR-발현 세포의 투여(예를 들어, 주입) 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 실시 형태들에서, CD19 CART는 비-CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 비-CD19 CAR-발현 세포의 투여(예를 들어, 주입) 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는, 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드와 IL-15Ra 폴리펩티드의 조합, 예를 들어, hetIL-15(Admune Therapeutics, LLC)와 조합되어 대상체에게 투여된다. hetIL-15는 IL-15와 IL-15Ra의 이종이량체 비공유 복합체이다. hetIL-15는, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 U.S. 8,124,084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, 및 U.S. 2011/0081311에 기술되어 있다. 실시 형태들에서, het-IL-15는 피하로 투여된다. 실시 형태들에서, 대상체는 암, 예를 들어 고형 암, 예를 들어 흑색종 또는 결장암을 갖는다. 실시 형태들에서, 대상체는 전이성 암을 갖는다.
일 실시 형태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 투여와 관련된 부작용을 감소 또는 개선시키는 에이전트를 투여할 수 있다. CAR-발현 세포의 투여와 관련된 부작용은 CRS, 및 대식세포 활성화 증후군(MAS)으로도 불리는 혈구포식성 림프조직구증식증(HLH)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. CRS의 증상은 고열, 오심, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. CRS는 임상적 구성성 징후 및 증상, 예컨대 열, 피로, 식욕부진, 근육통, 관절통, 오심, 구토 및 두통을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 피부 징후 및 증상, 예컨대 발진을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 위장 징후 및 증상, 예컨대 오심, 구토 및 설사를 포함할 수 있다. CRS는 임상적 호흡 징후 및 증상, 예컨대 빈호흡 및 저산소증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 심혈관 징후 및 증상, 예컨대 빈맥, 넓어진 맥압, 저혈압, 심박출량 증가(조기) 및 잠재적으로 감소된 심박출량(후기)을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 응고 징후 및 증상, 예컨대, 상승된 d-이량체, 출혈이 존재하거나, 존재하지 않는 저섬유소원혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 신장 징후 및 증상, 예컨대 질소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 간 징후 및 증상, 예컨대 트랜스아미니티스(transaminitis) 및 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 신경 징후 및 증상, 예컨대 두통, 정신 상태 변화, 혼동, 섬망, 낱말 찾기 장애 또는 프랭크 실어증(frank aphasia), 환각, 진전, 겨냥이상, 보행 변경 및 발작을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 방법은 본원에 기술된 CAR-발현 세포를 대상체에게 투여하는 단계 및 CAR-발현 세포를 이용한 치료로부터 초래되는 상승된 수준의 가용성 인자를 관리하기 위하여 하나 이상의 에이전트를 추가로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 대상체에서 상승되는 가용성 인자는 IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-6 중 하나 이상이다. 일 실시 형태에서, 대상체에서 상승되는 인자는 IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 및 프랙탈킨(fraktalkine) 중 하나 이상이다. 따라서, 이러한 부작용을 치료하기 위해 투여되는 에이전트는 이들 가용성 인자 중 하나 이상을 중화시키는 에이전트일 수 있다. 일 실시 형태에서, 이들 가용성 형태 중 하나 이상을 중화시키는 에이전트는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이러한 에이전트의 예는 스테로이드(예를 들어 코르티코스테로이드), TNFα의 억제자, 및 IL-6의 억제자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. TNFα 억제자의 예로는 항-TNFα 항체 분자, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 골리무맙이 있다. TNFα 억제자의 또 다른 예로는 융합 단백질, 예컨대 에타너셉트(etanercept)가 있다. TNFα의 소분자 억제자는 잔틴 유도체(예를 들어 펜톡시필린) 및 부프로피온을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. IL-6 억제자의 예로는 항-IL-6 항체 분자 또는 항-IL-6 수용체 항체 분자, 예컨대 토실리주맙(toc), 사릴루맙(sarilumab), 엘실리모맙(elsilimomab), CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, 및 FM101이 있다. 일 실시 형태에서, 항-IL-6 수용체 항체 분자는 토실리주맙이다. IL-1R 기반 억제자의 예로는 아나킨라(anakinra)가 있다.
일 실시 형태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트가 투여될 수 있다. 예를 들어 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 억제성 분자를 억제하는 에이전트일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어 프로그래밍된 사멸 1(PD-1)은 일부 실시 형태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGF 베타를 포함한다. 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제성 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시 형태들에서, 억제성 핵산, 예를 들어 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 또는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복체(CRISPR), 전사-활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)와 같은 억제성 핵산이 CAR-발현 세포에서 억제성 분자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 억제자는 shRNA이다. 일 실시 형태에서, 억제성 분자는 CAR-발현 세포 내에서 억제된다. 이들 실시 형태에서, 억제성 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 구성요소, 예를 들어 모든 구성요소를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일 실시 형태에서, 억제 신호의 억제자는 예를 들어 억제성 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어 상기 에이전트는 PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다(예를 들어 이필리무맙(MDX-010 및 MDX-101로도 지칭되며, Yervoy®로서 시판됨; Bristol-Myers Squibb); 트레멜리무맙(Pfizer로부터 입수가능하며, 이전에 티실리무맙으로 알려져 있는 IgG2 단클론 항체, CP-675,206)). 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5)에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 실시 형태에서, 상기 에이전트는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포에서 발현된다(문헌[Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75]). PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD-1에의 결합시에 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(문헌[Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34]; 문헌[Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8]; 문헌[Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43]). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다(문헌[Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7]; 문헌[Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314]; 문헌[Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094]). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다. PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편 및 다른 억제자는 본 기술 분야에서 이용가능하며, 본원에 기술된 본 발명의 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어 니볼루맙(BMS-936558 또는 MDX1106으로도 지칭됨; Bristol-Myers Squibb)은 PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 단클론 항체이다. PD-1에 특이적으로 결합하는 니볼루맙(클론 5C4) 및 다른 인간 단클론 항체는 미국 특허 제8,008,449호 및 국제 공개 제2006/121168호에 개시되어 있다. 피딜리주맙(CT-011; Cure Tech)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG1k 단클론 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 단클론 항체는 그들의 전문이 참조로 포함되는 국제 공개 제2009/101611호에 개시되어 있다. 펨브롤리주맙(이전에 람브롤리주맙(lambrolizumab)으로도 알려져 있으며, MK03475로도 지칭됨; Merck)은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 단클론 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 항체는 미국 특허 제8,354,509호 및 국제 공개 제2009/114335호에 개시되어 있다. MEDI4736(Medimmune)은 PDL1에 결합하며, 리간드와 PD1의 상호작용을 억제하는 인간 단클론 항체이다. MDPL3280A(Genentech / Roche)는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 단클론 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 단클론 항체는 미국 특허 제7,943,743호 및 미국 특허 공개 제20120039906호에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 결합 에이전트는 YW243.55.S70(중쇄 및 경쇄 가변 영역은 국제 공개 제2010/077634호에서 서열 번호 20 및 21로 예시됨) 및 MDX-1 105(BMS-936559로도 지칭됨, 예를 들어 국제 공개 제2007/005874호에 개시된 항-PD-L1 결합 에이전트)를 포함한다. AMP-224(B7-DCIg; Amplimmune; 예를 들어 국제 공개 제2010/027827호 및 국제 공개 제2011/066342호에 개시됨)는 PD-1과 B7-H1 간의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다. 다른 항-PD-1 항체는 AMP 514(Amplimmune), 다른 것들 중 특히, 예를 들어 미국 특허 제8,609,089호, 미국 특허 공개 제2010028330호 및/또는 미국 특허 공개 제20120114649호에 개시된 항-PD-1 항체를 포함한다.
TIM-3(T 세포 면역글로불린-3)은 또한, 특히 IFN-g-분비 CD4+ T 헬퍼 1 및 CD8+ T 세포독성 1 세포에서 T 세포 기능을 음성적으로 조절하고, T 세포 소진에서 중요한 역할을 한다. TIM3과 그의 리간드, 예를 들어 갈렉틴-9(Gal9), 포스포티딜세린(PS), 및 HMGB1 사이의 상호작용의 억제는 면역 반응을 증가시킬 수 있다. TIM3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제자는 본 기술 분야에서 이용가능하고, 본원에 기술된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어 TIM3을 표적화하는 항체, 항체 단편, 소분자, 또는 펩티드 억제자는 TIM3의 IgV 도메인에 결합하여, 그의 리간드와의 상호작용을 억제한다. TIM3을 억제하는 항체 및 펩티드는 국제 공개 제2013/006490호 및 미국 특허 공개 제20100247521호에 개시되어 있다. 다른 항-TIM3 항체는 인간화 버전의 RMT3-23(문헌[Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551]에 개시됨), 및 클론 8B.2C12(문헌[Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541]에 개시됨)를 포함한다. TIM3 및 PD-1을 억제하는 이중특이성 항체는 미국 특허 공개 제20130156774호에 개시되어 있다.
다른 실시 형태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트는 CEACAM 억제자(예를 들어 CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5 억제자)이다. 일 실시 형태에서, CEACAM의 억제자는 항-CEACAM 항체 분자이다. 예시적인 항-CEACAM-1 항체, 예를 들어 단클론 항체 34B1, 26H7, 및 5F4가 국제 공개 제2010/125571호, 국제 공개 제2013/082366호, 국제 공개 제2014/059251호 및 국제 공개 제2014/022332호에 기술되어 있거나; 또는 그의 제조합 형태는 예를 들어 미국 특허 공개 제2004/0047858호, 미국 특허 제7,132,255호 및 국제 공개 제99/052552호에 기술된 바와 같다. 다른 실시 형태에서, 항-CEACAM 항체는 예를 들어 문헌[Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)]에 기술된 바와 같이 CEACAM-5에 결합하거나, 또는 예를 들어 국제 공개 제2013/054331호 및 미국 특허 공개 제2014/0271618호에 기술된 바와 같이 CEACAM-1 및 CEACAM-5와 교차반응한다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 암배아성 항원 세포 유착 분자(CEACAM), 예컨대 CEACAM-1 및 CEACAM-5는, 적어도 부분적으로, 항종양 면역 반응의 억제를 매개하는 것으로 여겨진다(예를 들어 문헌[Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10]; 문헌[Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71]; 문헌[Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200]; 문헌[Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30]; 문헌[Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10]; 문헌[Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701]; 문헌[Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529] 참조). 예를 들어 CEACAM-1은 TIM-3에 대한 이종친화성 리간드로서 및 TIM-3-매개 T 세포 관용 및 소진에서 역할을 하는 것으로서 기술되어 있다(예를 들어 국제 공개 제2014/022332호; 문헌[Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848] 참조). 실시 형태들에서, CEACAM-1 및 TIM-3의 공동-차단은 이종이식편 결장직장암 모델에서 항종양 면역 반응을 증진시키는 것으로 밝혀진 바 있다(예를 들어 국제 공개 제2014/022332호; 상기 문헌 [Huang, et al. (2014)] 참조). 다른 실시 형태에서, CEACAM-1 및 PD-1의 공동-차단은 예를 들어 국제 공개 제2014/059251호에 기술된 바와 같이 T 세포 관용을 감소시킨다. 따라서, CEACAM 억제자는 본원에 기술된 다른 면역조절자(예를 들어 항-PD-1 및/또는 항-TIM-3 억제자)와 함께 사용되어 암, 예를 들어 흑색종, 폐암(예를 들어 NSCLC), 방광암, 결장암, 난소암 및 본원에 기술된 바와 같은 다른 암에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
LAG-3(림프구 활성화 유전자-3 또는 CD223)은 CD8+ T 세포 소진에서 소정의 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있는, 활성화된 T 세포 및 B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 분자이다. LAG-3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제자는 본 기술 분야에서 이용가능하고, 본원에 기술된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어 BMS-986016(Bristol-Myers Squib)은 LAG3을 표적화하는 단클론 항체이다. IMP701(Immutep)은 길항제 LAG-3 항체이고, IMP731(Immutep 및 GlaxoSmithKline)은 고갈 LAG-3 항체이다. 다른 LAG3 억제자는, MHC 클래스 II 분자에 결합하고 항원 제시 세포(APC)를 활성화시키는 LAG3의 가용성 부분 및 Ig의 재조합 융합 단백질인 IMP321(Immutep)을 포함한다. 다른 항체는 예를 들어 국제 공개 제2010/019570호에 개시되어 있다.
일부 실시 형태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트는 예를 들어 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 제1 도메인은 억제성 분자 또는 그의 단편이고, 제2 도메인은 양성 신호와 관련된 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시 형태에서, 양성 신호와 관련된 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS의 공동자극 도메인, 예를 들어 CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 예를 들어 본원에 기술된, 예를 들어 CD3 제타의 일차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 융합 단백질은 CAR을 발현하는 동일한 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 융합 단백질은 본 발명의 CAR을 발현하지 않는 세포, 예를 들어 T 세포에 의해 발현된다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트는 miR-17-92이다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR의 활성을 증진시키는 에이전트는 사이토카인이다. 사이토카인은 T 세포 확장, 분화, 생존, 및 항상성과 관련하여 중요한 기능을 갖는다. 본원에 개시된 CAR-발현 세포를 받는 대상체에게 투여될 수 있는 사이토카인은 다음을 포함한다: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, 및 IL-21, 또는 이들의 조합. 바람직한 실시 형태에서, 투여되는 사이토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21, 또는 이들의 조합이다. 사이토카인은 1일에 1회, 또는 1일에 1회 초과, 예를 들어 1일에 2회, 1일에 3회, 또는 1일에 4회 투여될 수 있다. 사이토카인은 1일 초과 동안 투여될 수 있고, 예를 들어 사이토카인은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 투여된다. 예를 들어 사이토카인은 7일 동안 1일에 1회 투여된다.
실시 형태들에서, 사이토카인은 CAR-발현 T 세포와 조합되어 투여된다. 사이토카인은 CAR-발현 T 세포와 동시에 또는 병행하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 동일한 날에 투여될 수 있다. 사이토카인은 CAR-발현 T 세포와 동일한 제약 조성물 내에 제조될 수 있거나, 또는 개별 제약 조성물로 제조될 수 있다. 대안적으로, 사이토카인은 CAR-발현 T 세포의 투여 직후, 예를 들어 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 투여될 수 있다. 사이토카인이 1일 초과에 걸쳐 이루어지는 투여 요법으로 투여되는 실시 형태에서, 사이토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포에 의한 투여와 동일한 날일 수 있거나, 또는 사이토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후일 수 있다. 일 실시 형태에서, 제1일에 CAR-발현 세포가 대상체에게 투여되고, 제2일에 사이토카인이 다음 7일 동안 1일에 1회 투여된다. 바람직한 실시 형태에서, CAR-발현 T 세포와 조합되어 투여되는 사이토카인은 IL-7, IL-15, 및/또는 IL-21이다.
다른 실시 형태에서, 사이토카인은 CAR-발현 세포의 투여의 충분한 기간 후, 예를 들어 CAR-발현 세포를 투여한지 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 이상 후에 투여된다. 일 실시 형태에서, 사이토카인은 CAR-발현 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 투여된다. 예를 들어 본원에 기술된 투여량 및 요법에 따라 대상체에게 CAR-발현 세포가 투여된다. CAR-발현 세포 요법에 대한 대상체의 반응은 종양 성장의 억제, 순환 종양 세포의 감소, 또는 종양 퇴행을 포함한 본원에 기술된 방법 중 임의의 것을 사용하여, CAR-발현 세포를 투여한지 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 이상 후에 평가된다. CAR-발현 세포 요법에 대해 충분한 반응을 나타내지 않는 대상체에게 사이토카인이 투여될 수 있다. CAR-발현 세포 요법에 대해 준-최적 반응을 갖는 대상체에게의 사이토카인의 투여는 CAR-발현 세포의 효능 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다. 바람직한 실시 형태에서, CAR-발현 세포의 투여 후에 투여되는 사이토카인은 IL-7이다.
낮은 용량의 mTOR 억제자와의 조합
일 실시 형태에서, CAR 분자, 예를 들어, 본원에 기술된 CAR 분자를 발현하는 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제자와 조합되어 투여된다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 90% 이하, 10% 이상 90% 이하, 15% 이상 90% 이하, 20% 이상 90% 이하, 30% 이상 90% 이하, 40% 이상 90% 이하, 50% 이상 90% 이하, 60% 이상 90% 이하 또는 70% 이상 90% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 80% 이하, 10% 이상 80% 이하, 15% 이상 80% 이하, 20% 이상 80% 이하, 30% 이상 80% 이하, 40% 이상 80% 이하, 50% 이상 80% 이하 또는 60% 이상 80% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 70% 이하, 10% 이상 70% 이하, 15% 이상 70% 이하, 20% 이상 70% 이하, 30% 이상 70% 이하, 40% 이상 70% 이하 또는 50% 이상 70% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 60% 이하, 10% 이상 60% 이하, 15% 이상 60% 이하, 20% 이상 60% 이하, 30% 이상 60% 이하 또는 40% 이상 60% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 50% 이하, 10% 이상 50% 이하, 15% 이상 50% 이하, 20% 이상 50% 이하, 30% 이상 50% 이하 또는 40% 이상 50% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 40% 이하, 10% 이상 40% 이하, 15% 이상 40% 이하, 20% 이상 40% 이하, 30% 이상 40% 이하 또는 35% 이상 40% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 5% 이상 30% 이하, 10% 이상 30% 이하, 15% 이상 30% 이하, 20% 이상 30% 이하 또는 25% 이상 30% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상 20% 이하, 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상 30% 이하, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상 35 이하, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상 40% 이하 또는 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상 45% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
일 실시 형태에서, mTOR 억제자의 용량은 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상 90% 이하의 mTOR 억제와 관련되거나 이를 제공한다.
본원에 논의된 바와 같이, mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나아제 억제의 정도로서 표현될 수 있고, 예를 들어 mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나아제 활성의 감소 수준에 의해, 예를 들어 P70 S6 키나아제 기질의 인산화의 감소에 의해 결정될 수 있다. mTOR 억제의 수준은 본원에 기술된 방법, 예를 들어 불레이(Boulay) 분석법 또는 웨스턴 블롯에 의한 인산화된 S6 수준의 측정에 의해 평가될 수 있다.
예시적인 mTOR 억제자
본원에 사용된 용어 "mTOR 억제자"는 세포에서 mTOR 키나아제를 억제하는 화합물 또는 리간드, 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 지칭한다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자는 알로스테릭 억제자이다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자는 촉매적 억제자이다.
알로스테릭 mTOR 억제자는 중성 삼환식 화합물 라파마이신(시롤리무스), 예를 들어 라파마이신 유도체, 라파마이신 유사체(라파로그로도 지칭됨) 및 mTOR 활성을 억제하는 다른 마크롤리드 화합물을 포함한 라파마이신과 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 화합물인 라파마이신-관련 화합물을 포함한다.
라파마이신은 다음 화학식 A에 나타낸 구조를 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생성되는 공지된 마크롤리드 항생제이다.
[화학식 A]
Figure pct00127
예를 들어 문헌[McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688]; 문헌[Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433]; 미국 특허 제3,929,992호를 참조한다. 라파마이신에 대해 제안되는 다양한 넘버링 체계가 존재한다. 혼동을 피하기 위해, 특정 라파마이신 유사체가 본원에서 명명되는 경우에, 명칭은 화학식 A의 넘버링 체계를 사용하는 라파마이신과 관련하여 주어진다.
본 발명에서 유용한 라파마이신 유사체는, 예를 들어 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기가 OR1(여기서 R1은 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 아실아미노알킬 또는 아미노알킬임)에 의해 대체된 O-치환된 유사체; 예를 들어 미국 특허 제5,665,772호 및 국제 공개 제94/09010호(이들의 내용은 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같은 에베롤리무스로도 공지된 RAD001이다. 다른 적합한 라파마이신 유사체는 26- 또는 28-위치에서 치환된 것을 포함한다. 라파마이신 유사체는 상기 언급된 유사체의 에피머, 특히 위치 40, 28 또는 26에서 치환된 유사체의 에피머일 수 있고, 예를 들어 그 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제6,015,815호, 국제 공개 제95/14023호 및 국제 공개 제99/15530호에 기술된 바와 같이 선택적으로 추가로 수소화될 수 있다(예를 들어 그 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 제7,091,213호, 국제 공개 제98/02441호 및 국제 공개 제01/14387호에 기술된 조타롤리무스로도 공지된 ABT578 또는 라파마이신 유사체, 예를 들어 리다포롤리무스(ridaforolimus)로도 공지된 AP23573).
미국 특허 제5,665,772호로부터의 본 발명에서 사용하기에 적합한 라파마이신 유사체의 예는 40-O-벤질-라파마이신, 40-O-(4'-히드록시메틸)벤질-라파마이신, 40-O-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파마이신, 40-O-알릴-라파마이신, 40-O-[3'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4(S)-일)-프로프-2'-엔-1'-일]-라파마이신, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-디히드록시펜트-2'-엔-1'-일)-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에톡시카르보닐메틸-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(3-히드록시)프로필-라파마이신, 40-O-(6-히드록시)헥실-라파마이신, 40-O-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파마이신, 40-O-[(3S)-2,2-디메틸디옥솔란-3-일]메틸-라파마이신, 40-O-[(2S)-2,3-디히드록시프로프-1-일]-라파마이신, 40-O-(2-아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-니코티노일옥시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파마이신, 40-O-(2-N-이미다졸릴아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-메틸-N'-피페라지닐)아세톡시]에틸-라파마이신, 39-O-데스메틸-39,40-O,O-에틸렌-라파마이신, (26R)-26-디히드로-40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-아세트아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-니코틴아미도에틸)-라파마이신, 40-O-(2-(N-메틸-이미다조-2'-일카르브에톡사미도)에틸)-라파마이신, 40-O-(2-에톡시카르보닐아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-톨릴술폰아미도에틸)-라파마이신 및 40-O-[2-(4',5'-디카르보에톡시-1',2',3'-트리아졸-1'-일)-에틸]-라파마이신을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기 및/또는 28 위치의 히드록실 기가 히드록시에스테르 기로 대체된 유사체이고, 예를 들어 US RE44,768호에서 발견되는 라파마이신 유사체, 예를 들어 템시롤리무스가 공지되어 있다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 16 위치의 메톡시 기가 또 다른 치환기, 바람직하게는 (선택적으로 히드록시-치환된) 알키닐옥시, 벤질, 오르토메톡시벤질 또는 클로로벤질에 의해 대체되고/되거나 39 위치의 메톡시기가 39 탄소와 함께 결실되어 라파마이신의 시클로헥실 고리가 39 위치 메톡시 기가 결여된 시클로펜틸 고리로 된 것; 예를 들어 그 내용이 본원에 참고로 포함되는 국제 공개 제95/16691호 및 국제 공개 제96/41807호에 기술된 바와 같은 것을 포함한다. 상기 유사체는 라파마이신의 40-위치의 히드록시가 알킬화되고/되거나 32-카르보닐이 환원되도록 추가로 변형될 수 있다.
국제 공개 제95/16691호로부터의 라파마이신 유사체는 16-데메톡시-16-(펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(프로파르길)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(4-히드록시-부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-오르토-메톡시벤질-라파마이신, 16-데메톡시-40-O-(2-메톡시에틸)-16-펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-포르밀-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-히드록시메틸-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-카르복시-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(4-메틸-피페라진-1-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(모르폴린-4-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-[N-메틸, N-(2-피리딘-2-일-에틸)]카르바모일-42-노르-라파마이신 및 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(p-톨루엔술포닐히드라조노메틸)-42-노르-라파마이신을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
국제 공개 제96/41807호로부터의 라파마이신 유사체는 32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-40-O-(2-히드록시-에틸)-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 32(S)-디히드로-40-O-(2-메톡시)에틸-라파마이신 및 32(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 적합한 라파마이신 유사체는 그 내용이 참고로 포함되는 미국 특허 공개 제2005/0101624호에 기술된 바와 같은 우미롤리무스이다.
달리 에베롤리무스(Afinitor®)로도 공지된 RAD001은 화학명 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸}-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자-트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜타온을 갖는다.
알로스테릭 mTOR 억제자의 추가의 예는 시롤리무스(라파마이신, AY-22989), 40-[3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신(템시롤리무스 또는 CCI-779로도 불림) 및 리다포롤리무스(AP-23573/MK-8669)를 포함한다. 알로스테릭 mTOR 억제자의 다른 예는 조타롤리무스(ABT578) 및 우미롤리무스를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 촉매적, ATP-경쟁적 mTOR 억제자는 mTOR 키나아제 도메인을 직접적으로 표적화하고, mTORC1 및 mTORC2 둘 다를 표적화하는 것으로 발견되었다. 이들은 또한, 라파마이신-저항성 mTORC1 결과물, 예컨대 4EBP1-T37/46 인산화 및 캡-의존성 번역을 조정하기 때문에, 라파마이신과 같은 이러한 알로스테릭 mTOR 억제자보다 mTORC1의 보다 유효한 억제자이다.
촉매적 억제자는 BEZ235 또는 2-메틸-2-[4-(3-메틸-2-옥소-8-퀴놀린-3-일-2,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-페닐]-프로피오니트릴 또는 모노토실레이트 염 형태(BEZ235의 합성은 국제 공개 제2006/122806호에 기술되어 있음); 화학명 {5-[2,4-비스-((S)-3-메틸-모르폴린-4-일)-피리도[2,3d]피리미딘-7-일]-2-메톡시-페닐}-메탄올을 갖는 CCG168(달리 AZD-8055로 공지됨, 문헌[Chresta, CM, et al, Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298]); 3-[2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N-메틸벤즈아미드(국제 공개 제09104019호); 3-(2-아미노벤조[d]옥사졸-5-일)-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민(국제 공개 제10051043호 및 국제 공개 제2013023184호); N-(3-(N-(3-((3,5-디메톡시페닐)아미노)퀴녹살린-2-일)술파모일)페닐)-3-메톡시-4-메틸벤즈아미드(국제 공개 제07044729호 및 국제 공개 제12006552호); 화학명 1-[4-[4-(디메틸아미노)피페리딘-1-카르보닐]페닐]-3-[4-(4,6-디모르폴리노-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아를 갖는 PKI-587(문헌[Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645]); 화학명 2,4-디플루오로-N-{2-메톡시-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드를 갖는 GSK-2126458(문헌[ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43]); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민(국제 공개 제10114484호); 및 (E)-N-(8-(6-아미노-5-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)-1-(6-(2-시아노프로판-2-일)피리딘-3-일)-3-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-일리덴)시안아미드(국제 공개 제12007926호)를 포함한다.
촉매적 mTOR 억제자의 추가의 예는 8-(6-메톡시-피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-피페라진-1-일-3-트리플루오로메틸-페닐)-1,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온(국제 공개 제2006/122806호) 및 Ku-0063794(문헌[Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42])를 포함한다. Ku-0063794는 라파마이신(mTOR)의 포유동물 표적의 특이적 억제제이다. WYE-354는 촉매적 mTor 억제자의 또 다른 예이다(문헌[Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240]).
본 발명에 따른 유용한 mTOR 억제자는 상기 중 임의의 것의 전구약물, 유도체, 제약상 허용가능한 염, 또는 그의 유사체를 또한 포함한다.
mTOR 억제자, 예컨대 RAD001은 본원에 기술된 특정한 투여량을 기초로 하여 본 기술 분야에 널리 확립되어 있는 방법을 기초로 전달을 위해 제형화될 수 있다. 특히, 미국 특허 제6,004,973호(본원에 참고로 포함됨)는 본원에 기술된 mTOR 억제자와 함께 사용가능한 제형의 예를 제공한다.
mTOR 억제의 평가
mTOR은 키나아제 P70 S6을 인산화시킴으로써, P70 S6 키나아제를 활성화시켜 그의 기질을 인산화시키도록 한다. mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나아제 억제의 정도로서 표현될 수 있으며, 예를 들어 mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나아제 활성의 감소의 수준에 의해, 예를 들어 P70 S6 키나아제 기질의 인산화의 감소에 의해 결정될 수 있다. mTOR 억제의 수준을 억제자의 부재 하에, 예를 들어 억제자의 투여 전에, 및 억제자의 존재 하에, 또는 억제자의 투여 후에 P70 S6 키나아제 활성(기질을 인산화하는 P70 S6 키나아제의 능력)을 측정함으로써 결정할 수 있다. P70 S6 키나아제의 억제의 수준은 mTOR 억제의 수준을 제공한다. 따라서, P70 S6 키나아제가 40%만큼 억제되는 경우, P70 S6 키나아제 활성에 의해 측정되는 바와 같이, mTOR 활성은 40%만큼 억제된다. 본원에 언급된 억제의 정도 또는 수준은 투여 간격에 걸친 평균 억제 수준이다. 예로서, 억제자가 1주에 1회 주어지는 경우, 억제의 수준은 그러한 간격, 즉 1주일에 걸친 평균 억제 수준에 의해 주어진다.
본원에 참고로 포함되는 문헌[Boulay et al, Cancer Res, 2004, 64:252-61]은 mTOR 억제의 수준을 평가하는데 사용될 수 있는 분석법(본원에서 불레이 분석법으로 지칭됨)을 교시한다. 일 실시 형태에서, 상기 분석법은 mTOR 억제자, 예를 들어 RAD001의 투여 전 및 후의 생물학적 샘플로부터의 P70 S6 키나아제 활성의 측정에 의존한다. 샘플은 mTOR 억제자를 이용한 처리 후의 미리 선택된 시점에, 예를 들어 처리 24시간 후, 48시간 후, 및 72시간 후에 채취될 수 있다. 예를 들어 피부 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터의 생물학적 샘플이 사용될 수 있다. 전체 단백질 추출물이 샘플로부터 제조된다. P70 S6 키나아제는 P70 S6 키나아제를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 면역 침전에 의해 단백질 추출물로부터 단리된다. 단리된 P70 S6 키나아제의 활성이 시험관 내 키나아제 분석법에서 측정될 수 있다. 단리된 키나아제는 기질의 인산화를 가능하게 하는 조건 하에 40S 리보솜 서브유닛 기질(이는 P70 S6 키나아제의 내인성 기질임) 및 감마-32P와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 반응 혼합물은 SDS-PAGE 겔 상에서 분해될 수 있고, 32P 신호는 포스포르이미저(PhosphorImager)를 사용하여 분석될 수 있다. 40S 리보솜 서브유닛의 크기에 상응하는 32P 신호는 인산화된 기질 및 P70 S6 키나아제의 활성을 나타낸다. 키나아제 활성의 증가 및 감소는 인산화된 기질의 32P 신호의 면적 및 강도를 정량화하고(예를 들어 Molecular Dynamics의 이미지콴트(ImageQuant)를 사용함), 정량화된 신호에 임의의 단위 값을 할당하고, 투여 후로부터의 값을 투여 전으로부터의 값 또는 기준 값과 비교함으로써 계산될 수 있다. 예를 들어 키나아제 활성의 억제 백분율은 하기 식으로 계산될 수 있다: 1-(투여 후에 수득된 값/투여 전에 수득된 값) X 100. 상기 기술된 바와 같이, 본원에 언급된 억제의 정도 또는 수준은 투여 간격에 걸친 평균 억제 수준이다.
키나아제 활성, 예를 들어 P70 S6 키나아제 활성의 평가 방법이 또한 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,727,950호에서 제공된다.
mTOR 억제의 수준은 또한 PD1 음성 대 PD1 양성 T 세포의 비의 변화에 의해 평가될 수 있다. 말초 혈액으로부터의 T 세포는 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 PD1 음성 또는 양성으로서 확인될 수 있다.
저용량 mTOR 억제자
본원에 기술된 방법은 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제자, 라파로그, 예컨대 RAD001을 포함한 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자의 용량을 사용한다. 대조적으로, mTOR 경로를 완전히 또는 거의 완전히 억제하는 수준의 억제자는 면역억제성이고, 예를 들어 기관 이식 거부를 방지하기 위해 사용된다. 게다가, mTOR을 완전히 억제하는 고용량의 라파로그는 또한 종양 세포 성장을 억제하며, 다양한 암을 치료하는 데 사용된다(예를 들어, 문헌[Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83]; 문헌[Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256]; 문헌[Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A,
Figure pct00128
Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93]; 문헌[Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.]; 문헌[Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2] 참조).
본 발명은, 적어도 부분적으로, 현행 임상 현장에서 사용되는 것들보다 꽤 낮은 용량의 mTOR 억제자가 대상체에서 면역 반응을 증가시키고 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 T 세포의 비를 증가시키는 데 뛰어난 효과를 갖는다는 놀라운 발견에 기초한다. mTOR 활성의 단지 부분적인 억제를 생성하는 저용량의 mTOR 억제자가 인간 대상체에서 면역 반응을 효과적으로 개선시키고 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 T 세포의 비를 증가시킬 수 있다는 것은 놀라운 것이었다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 어떠한 이론에 구애되고자 함이 없이, 그러한 낮은, 면역 증진, 용량의 mTOR 억제자는, 예를 들어 치료받지 않은 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로, 나이브 T 세포 수를 증가시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 또한 이론에 구애되고자 함이 없이, 충분한 양의 시간 또는 충분한 투약 후의 mTOR 억제자를 사용한 치료가 하기:
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2 중 하나 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 갖는 세포의 수의 증가 중 하나 이상을 초래하며,
여기서 임의의 상기 기술된 변화는, 예를 들어 치료받지 않은 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다(문헌[Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112]). 기억 T 세포 전구체는 분화 프로그램에서 초기의 기억 T 세포이다. 예를 들어 기억 T 세포는 하기 특징: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및/또는 증가된 BCL2 중 하나 이상을 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 선택된 투약 요법, 예를 들어 1일 1회 또는 매주 1회로 투여되는 경우에, 완전, 또는 유의한 면역 억제와는 관련되지 않지만 면역 반응의 증진과 관련되는, mTOR 억제의 수준과 관련된 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 라파마이신, 또는 RAD001, 또는 촉매적 mTOR 억제제의 조성물, 또는 투여 형태에 관한 것이다.
mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파로그, 라파마이신, 또는 RAD001, 또는 촉매적 mTOR 억제자는 지속 방출 제형으로 제공될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 조성물 또는 단위 투여 형태가 지속 방출 제형으로 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지속 방출 제형은 즉시 방출 제형보다 낮은 생체이용률을 가질 것이다. 예를 들어 실시 형태들에서, 즉시 방출 제형과 유사한 치료 효과를 달성하기 위해, 지속 방출 제형은 즉시 방출 제형에서 제공되는 억제자의 양의 약 2 내지 약 5, 약 2.5 내지 약 3.5, 또는 약 3배를 가질 것이다.
일 실시 형태에서, 단위 투여 형태당 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 2.5 내지 75, 3 내지 6, 또는 약 5 ㎎을 갖는, 전형적으로 1주에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1주에 1회 투여에 대해, 이들 즉시 방출 제형은 각각 0.3 내지 60, 1.5 내지 30, 7.5 내지 22.5, 9 내지 18, 또는 약 15 ㎎의 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다. 실시 형태들에서, 상기 형태 둘 다는 1회/주에 기초하여 투여된다.
일 실시 형태에서, 단위 투여 형태당 0.005 내지 1.5, 0.01 내지 1.5, 0.1 내지 1.5, 0.2 내지 1.5, 0.3 내지 1.5, 0.4 내지 1.5, 0.5 내지 1.5, 0.6 내지 1.5, 0.7 내지 1.5, 0.8 내지 1.5, 1.0 내지 1.5, 0.3 내지 0.6, 또는 약 0.5 ㎎을 갖는, 전형적으로 1일에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1일에 1회 투여에 대해, 이들 즉시 방출 형태는 각각 0.015 내지 4.5, 0.03 내지 4.5, 0.3 내지 4.5, 0.6 내지 4.5, 0.9 내지 4.5, 1.2 내지 4.5, 1.5 내지 4.5, 1.8 내지 4.5, 2.1 내지 4.5, 2.4 내지 4.5, 3.0 내지 4.5, 0.9 내지 1.8, 또는 약 1.5 ㎎의 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다. 1주에 1회 투여에 대해, 이들 즉시 방출 형태는 각각 0.1 내지 30, 0.2 내지 30, 2 내지 30, 4 내지 30, 6 내지 30, 8 내지 30, 10 내지 30, 1.2 내지 30, 14 내지 30, 16 내지 30, 20 내지 30, 6 내지 12, 또는 약 10 ㎎의 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다.
일 실시 형태에서, 단위 투여 형태당 0.01 내지 1.0 mg을 갖는, 전형적으로 1일에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1일에 1회 투여에 대해, 이들 즉시 방출 형태는 각각 0.03 내지 3 mg의 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다. 1주에 1회 투여에 대해, 이들 즉시 방출 형태는 각각 0.2 내지 20 mg의 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다.
일 실시 형태에서, 단위 투여 형태당 0.5 내지 5.0 mg을 갖는, 전형적으로 1주에 1회 투여를 위해 사용되는, 예를 들어 RAD001의 즉시 방출 형태가 제공된다. 1주에 1회 투여에 대해, 이들 즉시 방출 형태는 각각 1.5 내지 15 mg의 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 갖는 지속 방출 형태에 상응한다.
상기 기술된 바와 같이, mTOR 경로의 하나의 표적은 P70 S6 키나아제이다. 따라서, 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 유용한 mTOR 억제자의 용량은, 예를 들어 본원에 기술된 분석법, 예를 들어 불레이 분석법에 의해 측정된 바와 같이, mTOR 억제자의 부재 하의 P70 S6 키나아제의 활성에 비해 P70 S6 키나아제 활성의 80% 이하의 억제를 달성하기에 충분한 용량이다. 추가 양태에서, 본 발명은 mTOR 억제자의 부재 하의 P70 S6 키나아제 활성에 비해 P70 S6 키나아제 활성의 38% 이하의 억제를 달성하기에 충분한 양의 mTOR 억제자를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 mTOR 억제자의 용량은, 예를 들어 인간 대상체에게 투여된 경우에, 예를 들어 본원에 기술된 분석법, 예를 들어 불레이 분석법에 의해 측정되는 바와 같이, P70 S6 키나아제 활성의 90+/-5%(즉, 85 내지 95%), 89+/-5%, 88+/-5%, 87+/-5%, 86+/-5%, 85+/-5%, 84+/-5%, 83+/-5%, 82+/-5%, 81+/-5%, 80+/-5%, 79+/-5%, 78+/-5%, 77+/-5%, 76+/-5%, 75+/-5%, 74+/-5%, 73+/-5%, 72 +/-5%, 71 +/-5%, 70 +/-5%, 69 +/-5%, 68 +/-5%, 67 +/-5%, 66 +/-5%, 65 +/-5%, 64 +/-5%, 63 +/-5%, 62 +/-5%, 61 +/-5%, 60 +/-5%, 59 +/-5%, 58 +/-5%, 57 +/-5%, 56 +/-5%, 55 +/-5%, 54 +/-5%, 54 +/-5%, 53 +/-5%, 52 +/-5%, 51 +/-5%, 50 +/-5%, 49 +/-5%, 48 +/-5%, 47 +/-5%, 46 +/-5%, 45 +/-5%, 44 +/-5%, 43 +/-5%, 42 +/-5%, 41 +/-5%, 40 +/-5%, 39 +/-5%, 38 +/-5%, 37 +/-5%, 36 +/-5%, 35 +/-5%, 34 +/-5%, 33 +/-5%, 32 +/-5%, 31 +/-5%, 30 +/-5%, 29 +/-5%, 28 +/-5%, 27 +/-5%, 26 +/-5%, 25 +/-5%, 24 +/-5%, 23 +/-5%, 22 +/-5%, 21 +/-5%, 20 +/-5%, 19 +/-5%, 18 +/-5%, 17 +/-5%, 16 +/-5%, 15 +/-5%, 14 +/-5%, 13 +/-5%, 12 +/-5%, 11 +/-5% 또는 10 +/-5% 억제를 달성하기에 충분하다.
대상체에서의 P70 S6 키나아제 활성은 본 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 제7,727,950호에 기술된 방법에 따라, 포스포P70 S6K 수준 및/또는 포스포P70 S6 수준의 면역블롯 분석법에 의해 또는 시험관 내 키나아제 활성 분석법에 의해 측정될 수 있다.
mTOR 억제자의 용량과 관련하여 본원에 사용된 용어 "약"은 mTOR 억제자의 양의 최대 +/-10%의 가변성을 지칭하지만, 언급된 용량 주변의 어떠한 가변성도 포함하지 않을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 표적 최저 수준 내의 투여량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 최저 수준은 기관 이식 및 암 환자에서 사용되는 투여 요법과 관련된 최저 수준보다 유의하게 더 낮다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자, 예를 들어 RAD001, 또는 라파마이신은 면역억제 또는 항암 효과를 생성하는 최저 수준의 ½, 1/4, 1/10, 또는 1/20 미만인 최저 수준을 생성하도록 투여된다. 일 실시 형태에서, mTOR 억제자, 예를 들어 RAD001, 또는 라파마이신은 면역억제 또는 항암 적응증에 사용하기 위한 FDA 승인된 포장 삽입물에서 제공되는 최저 수준의 ½, 1/4, 1/10, 또는 1/20 미만인 최저 수준을 생성하도록 투여된다.
일 실시 형태에서 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.1 내지 10 ng/㎖, 0.1 내지 5 ng/㎖, 0.1 내지 3 ng/㎖, 0.1 내지 2 ng/㎖, 또는 0.1 내지 1 ng/㎖의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.2 내지 10 ng/㎖, 0.2 내지 5 ng/㎖, 0.2 내지 3 ng/㎖, 0.2 내지 2 ng/㎖, 또는 0.2 내지 1 ng/㎖의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.3 내지 10 ng/㎖, 0.3 내지 5 ng/㎖, 0.3 내지 3 ng/㎖, 0.3 내지 2 ng/㎖, 또는 0.3 내지 1 ng/㎖의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.4 내지 10 ng/㎖, 0.4 내지 5 ng/㎖, 0.4 내지 3 ng/㎖, 0.4 내지 2 ng/㎖, 또는 0.4 내지 1 ng/㎖의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 0.5 내지 10 ng/㎖, 0.5 내지 5 ng/㎖, 0.5 내지 3 ng/㎖, 0.5 내지 2 ng/㎖, 또는 0.5 내지 1 ng/㎖의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서 본원에 개시된 방법은 대상체에게 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001을 1 내지 10 ng/㎖, 1 내지 5 ng/㎖, 1 내지 3 ng/㎖, 또는 1 내지 2 ng/㎖의 표적 최저 수준을 제공하는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "최저 수준"은 다음 용량 직전의 혈장 중 약물의 농도, 또는 2개의 용량 사이의 최소 약물 농도를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, RAD001의 표적 최저 수준은 약 0.1 내지 4.9 ng/㎖의 범위 내이다. 일 실시 형태에서, 표적 최저 수준은 3 ng/㎖ 미만, 예를 들어 0.3 ng/㎖ 이하 내지 3 ng/㎖이다. 일 실시 형태에서, 표적 최저 수준은 3 ng/㎖ 미만, 예를 들어 0.3 ng/㎖ 이하 내지 1 ng/㎖이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 RAD001에 대해 명시된 표적 최저 수준과 생물학적으로 동등한 표적 최저 수준과 관련된 양의, RAD001 이외의 mTOR 억제자를 이용할 수 있다. 일 실시 형태에서, RAD001 이외의 mTOR 억제자에 대한 표적 최저 수준은 본원에 설명된 RAD001의 최저 수준과 동일한 수준의 mTOR 억제를 제공하는 수준이다(예를 들어 본원에 기술된 방법, 예를 들어 P70 S6의 억제에 의해 측정된 바와 같음).
제약 조성물: mTOR 억제자
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 CAR 세포와 조합하여 사용하기 위해 제형화된, mTOR 억제자, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 mTOR 억제자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일부 실시 형태에서, mTOR 억제자는, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 첨가제와 조합하여 투여하기 위한 것으로 제형화된다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합되어 본 기술 분야에 공지된 임의의 통상적이고 허용되는 방식을 통해 상기 기술된 바와 같이 치료적 유효량으로 투여될 것이다.
제약 제형은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 벌크 원료 의약품(예를 들어 mTOR 억제자 또는 화합물의 안정화된 형태(예를 들어 시클로덱스트린 유도체 또는 다른 공지된 복합체화제와의 복합체))이 본원에 기술된 하나 이상의 부형제의 존재 하에 적합한 용매 중에 용해된다. mTOR 억제자는 전형적으로 용이하게 제어가능한 투여량의 약물을 제공하도록, 그리고 환자에게 우아하고 용이하게 취급가능한 제품을 제공하도록 제약 투여 형태로 제형화된다.
본 발명의 화합물은 제약 조성물로서 임의의 통상적인 경로에 의해, 특히 장관 투여에 의해, 예를 들어 경구로, 예를 들어 정제 또는 캡슐의 형태로, 또는 비경구로, 예를 들어 주사액 또는 현탁액의 형태로, 국소로, 예를 들어 로션, 겔, 연고 또는 크림의 형태로, 또는 비강 또는 좌제 형태로 투여될 수 있다. mTOR 억제자가 본원에 기술된 바와 같은 또 다른 에이전트와 조합되어(이와 동시에 또는 개별적으로) 투여되는 경우에, 일 양태에서, 상기 성분 둘 다는 동일한 경로에 의해(예를 들어 비경구로) 투여될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 에이전트가 mTOR 억제자와 관련하여 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어 mTOR 억제자는 경구로 투여될 수 있고 다른 에이전트는 비경구로 투여될 수 있다.
지속 방출
본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제자 또는 촉매적 mTOR 억제자는 제품 안정성 요건을 만족시키고/거나 즉시 방출(IR) 정제에 비해 유리한 약동학적 특성, 예컨대 감소된 평균 혈장중 피크 농도, 약물 흡수 정도 및 혈장중 피크 농도에서의 감소된 환자간 및 환자내 변동성, 감소된 Cmax / Cmin 비 및/또는 감소된 음식물 영향을 갖는, 본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001을 포함하는 경구 고체 투여 형태의 형태의 제약 제형으로서 제공될 수 있다. 제공된 제약 제형은 보다 정확한 용량 조정이 가능하고/거나 유해 사건의 빈도를 감소시킴으로써 본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001에 의한 환자를 위해 보다 안전한 치료를 제공할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 다중-미립자 시스템이고 기능성 층 및 코팅을 가질 수 있는, 본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 서방성 제형을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "서방성, 다중-미립자 제형"은 본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 연장된 기간에 걸친, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간에 걸친 방출을 가능하게 하는 제형을 지칭한다. 서방성 제형은 섭취 후에 연장된 기간에 걸쳐 활성 성분이 이용가능하게 하는 방식으로 제형화된, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 특수 부형제로 제조된 매트릭스 및 코팅을 함유할 수 있다.
용어 "서방성"은 용어 "지속 방출"(SR) 또는 "장기간 방출"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "서방성"은 경구 투약 직후에 활성 원료 의약품을 방출하는 것이 아니라, 연장된 기간에 걸쳐 방출하는 제약 제형과 관련된 것으로서, 이는 약전인, 정제 및 캡슐에 대한 유럽 약전(제7판)의 논문 및 제약 투여 형태에 대한 USP 일반 챕터 <1151>에서의 정의에 따른 것이다. 본원에 사용된 용어 "즉시 방출"(IR)은 문헌["Guidance for Industry: "Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms" (FDA CDER, 1997)]의 정의에 따라 활성 원료 의약품의 85%를 60분 미만 이내에 방출하는 제약 제형을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "즉시 방출"은, 예를 들어 본원에 기술된 용해 분석법에서 측정된 바와 같이, 에베롤리무스가 정제로부터 30분의 시간 이내에 방출되는 것을 의미한다.
본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 서방성 제형은 본 기술 분야에 공지된 분석법, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 용해 분석법(용해 용기를 소듐 도데실 설페이트 0.2%를 함유하는 900 mL 인산염 완충제(pH 6.8)로 37℃에서 채우고 각각 문헌[USP testing monograph 711], 및 문헌[PhEur testing monograph 2.9.3]에 따른 USP에 따라 패들 방법을 사용하여 75 rpm에서 용해를 수행함)을 사용하여 시험관 내 방출 프로파일에 의해 특성화될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 서방성 제형은 시험관 내 방출 분석법에서 하기 방출 상세 사항에 따라 mTOR 억제자를 방출한다:
0.5h: 45% 미만, 또는 40% 미만, 예를 들어 30% 미만
1h: 20 내지 80%, 예를 들어 30 내지 60%
2h: 50% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어 75% 초과
3h: 60% 초과, 또는 65% 초과, 예를 들어 85% 초과, 예를 들어 90% 초과.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 mTOR 억제자, 예를 들어 라파마이신 또는 RAD001의 안정한 서방성 제형은 시험관 내 용해 분석법에서 45, 60, 75, 90, 105분 또는 120분 이후에 mTOR 억제자의 50%를 방출한다.
생체중합체 전달 방법
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 CAR-발현 세포는 생체중합체 스캐폴드, 예를 들어 생체중합체 임플란트를 통해 대상체에게 투여되거나 또는 전달될 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 전달, 확장, 및/또는 분산을 지지하거나 또는 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 자연 발생적 또는 합성적일 수 있는 생체적합성(예를 들어 염증 또는 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않음) 및/또는 생체분해성 중합체를 포함한다.
적합한 생체중합체의 예는 단독의, 또는 임의의 다른 중합체 조성물과 임의의 농도 및 임의의 비로 조합된 한천, 아가로스, 알기네이트, 알기네이트/칼슘 포스페이트 시멘트(CPC), 베타-갈락토시다아제(β-GAL), (1,2,3,4,6-펜타아세틸 a-D-갈락토스), 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 히알루론산 콜라겐, 히드록시아파타이트, 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시-헥사노에이트)(PHBHHx), 폴리(락티드), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리에틸렌 옥시드(PEO), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리프로필렌 옥시드(PPO), 폴리비닐 알콜(PVA), 실크, 대두 단백질, 및 대두 단백질 단리물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 생체중합체는 유착- 또는 이동-촉진 분자, 예를 들어 림프구의 콜라겐 수용체에 결합하는 콜라겐-모방체 펩티드, 및/또는 자극 분자에 의해 증대 또는 변형되어, 전달될 세포의 전달, 확장, 또는 기능, 예를 들어 항암 활성을 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 주사가능한, 예를 들어 겔 또는 반-고체, 또는 고체 조성물일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 대상체에게의 전달 전에 생체중합체 스캐폴드 상에 시딩된다. 실시 형태들에서, 생체중합체 스캐폴드는, 예를 들어 스캐폴드의 생체중합체에 혼입되거나 또는 콘쥬게이션된, 하나 이상의 본원에 기술된 추가 치료제(예를 들어 또 다른 CAR-발현 세포, 항체, 또는 소분자) 또는 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 에이전트를 추가로 포함한다. 실시 형태들에서, 생체중합체 스캐폴드는, 예를 들어 종양 내로 주사되거나, 또는 종양에 또는 항종양 효과를 매개하기에 충분할만큼 종양에 근접하여 외과적으로 이식된다. 생체중합체 조성물 및 그의 전달 방법의 추가의 예는 문헌[Stephan et al, Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101]; 및 국제 공개 제2014/110591호에 기술되어 있다.
제약 조성물 및 치료
본 발명의 제약 조성물은, 본원에 기술된 바와 같은 CAR-발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 세포를 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 인산염 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들어 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일 양태에서 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 제약 조성물은 치료할(또는 예방할) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다.
일 실시 형태에서, 제약 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없고, 예를 들어 검출가능한 수준의 상기 오염물이 없다. 일 실시 형태에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 군 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1가지이다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 표시되는 경우에, 투여할 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로 본원에 기술된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 포함하는 제약 조성물은, 예를 들어 104 내지 109개 세포/㎏(체중), 일부 경우에, 105 내지 106개 세포/㎏(체중)(상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있음이 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 통상적으로 알려져 있는 주입 기술을 사용함으로써 투여될 수 있다(예를 들어 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
특정 양태에서, 활성화된 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 대상체에게 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고 (또는 분리반출술을 수행하고), 본 발명에 따라 그로부터의 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 활성화하고, 환자에게 이들 활성화되고 확장된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 재주입하는 것이 요구될 수 있다. 이러한 과정은 수주마다 다회 실시될 수 있다. 특정 양태에서, 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 10cc 내지 400cc의 혈액 채취물로부터 활성화될 수 있다. 특정 양태에서, 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc 또는 100cc의 혈액 채취물로부터 활성화된다.
본 발명의 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 체내이식(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 실시될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일 양태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
특정한 예시적인 양태에서, 대상체는 백혈구분리반출술을 거칠 수 있고, 여기서 백혈구를 수집, 농축, 또는 생체 외 고갈시켜 관심 세포, 예를 들어 T 세포를 선발하고/거나 단리한다. 이들 T 세포 단리물은 본 기술 분야에 알려져 있는 방법에 의해 확장되고, 본 발명의 하나 이상의 CAR 구축물이 도입되어, 본 발명의 CAR T 세포를 생성할 수 있도록 처리될 수 있다. 그를 필요로 하는 대상체는 후속적으로 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식을 이용한 표준 치료를 거칠 수 있다. 특정 양태에서, 이식 이후에 또는 이식과 병행하여, 대상체는 본 발명의 확장된 CAR T 세포의 주입을 받는다. 추가의 양태에서, 확장된 세포는 수술 전에 또는 수술 이후에 투여된다.
환자에게 투여할 상기 치료제의 투여량은 치료되는 병태의 정확한 속성 및 치료제의 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 본 기술 분야에서 허용되는 실시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 CAMPATH에 대한 용량은 일반적으로, 성인 환자의 경우에 예를 들어 1 내지 약 100 ㎎ 범위 내이고, 보통 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여될 것이다. 바람직한 1일 용량은 1일에 1 내지 10 ㎎이지만, 일부 경우에 1일에 최대 40 ㎎의 보다 많은 용량이 사용될 수 있다 (미국 특허 제6,120,766호에 기술됨).
일 실시 형태에서, CAR은 예를 들어 시험관 내 전사를 이용해 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포) 내에 도입되고, 대상체(예를 들어, 인간)는 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 초기 투여를 받고, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)가 1회 이상 후속 투여되며, 여기서, 상기 1회 이상의 후속 투여는 이전의 투여를 한지 15일 미만의 시점 후에, 예를 들어, 이전 투여 후 15일 전(예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2일째)에 투여된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)의 1회 초과의 투여가 매주 대상체(예를 들어 인간)에게 투여되고, 예를 들어 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 2, 3 또는 4회 투여가 매주 투여된다. 일 실시 형태에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 매주 1회 초과 투여(예를 들어, 매주 2, 3 또는 4회 투여)한 후(본원에서 사이클이라고도 함), 1주 동안 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 투여하지 않고, 이어서 대상체에게 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 1회 이상 추가 투여(예를 들어, CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)를 매주 1회 초과 투여)한다. 또 다른 실시 형태에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)는 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 1회 초과 사이클로 받으며, 각각의 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 미만이다. 일 실시 형태에서, CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 주마다 3회 투여 동안 격일로 투여된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 이상 동안 투여된다.
일 양태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포는 렌티바이러스 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스를 사용하여 생성된다. 그러한 방식으로 생성된 세포, 예를 들어 CART는 안정한 CAR 발현을 가질 것이다.
일 양태에서, CAR-발현 세포, 예를 들어 CART는 감마레트로바이러스 벡터(예를 들어, 본원에 기술된 감마레트로바이러스 벡터)와 같은 바이러스 벡터를 사용해 생성된다. 이러한 벡터를 사용하여 생성된 CART는 안정한 CAR 발현을 가질 수 있다.
일 양태에서, CART는 형질도입 이후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일 동안 CAR 벡터를 일시적으로 발현한다. CAR의 일시적 발현은 RNA CAR 벡터 전달에 의해 실행될 수 있다. 일 양태에서, CAR RNA는 전기천공법에 의해 T 세포를 형질도입시킨다.
일시적으로 발현하는 CAR 면역 이펙터 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포)를 사용해(특히, 쥣과 scFv 보유 CART로) 치료받는 환자에서 일어날 수 있는 잠재적인 문제는 다회 치료 후의 아나필락시스이다.
이러한 이론에 구애됨이 없이, 이러한 아나필락시스 반응은 체액성 항-CAR 반응, 즉, 항-IgE 아이소타입을 갖는 항-CAR 항체를 발생시키는 환자에 의해 유발될 수 있는 것으로 여겨진다. 환자의 항체 생산 세포는 항원에의 노출에서 10 내지 14일 중단이 있을 때 IgG 아이소타입(아나필락시스를 유발하지 않음)으로부터 IgE 아이소타입으로 클래스 전환을 거치는 것으로 생각된다.
환자가 일시적 CAR 요법(예컨대, RNA 형질도입에 의해 생성된 것)의 과정 동안 항-CAR 항체 반응을 생성할 위험이 크면, CART 주입 중단은 10 내지 14일보다 오래 지속되어서는 안된다.
실시예
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로도 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 대신에 본원에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 메틸시토신 디옥시게나아제 TET2 의 파괴는 CD19-표적화된 T-세포의 치료 효능을 촉진한다
요약
환자 T-세포를 유전적으로 방향수정하는 것에 기반한 암 면역요법은 B-세포 백혈병 및 림프종을 치료하기 위하여 성공적으로 이용될 수 있다. 본 방법에서는, 종양 세포 인식과 사멸을 지시하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 트랜스포존의 통합에 의해 T-세포 게놈이 변형된다. 그러나, 이 방법의 성공은 때로는 조작된 세포의 확장과 지속의 정도에 의해 제한될 수 있어서, CAR T-세포 증식, 이펙터 기능 및 생존을 지시하는 기작에 주의를 기울인다. 본 실시예는 B-세포 상의 CD19 단백질을 표적화하는 CAR T-세포로 처리된 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자의 연구로부터의 기계론적 통찰력을 제공한다. CAR T-세포의 주입시, 항-종양 활성이 말초 혈액, 림프절 및 골수에서 명백하였으며, 완전 관해가 수반되었다. 예상치 못하게, 항-종양 반응의 피크에서, 94%의 CAR T-세포는 렌티바이러스 벡터-매개된 CAR 트랜스진 삽입이 메틸시토신 디옥시게나아제 TET2를 코딩하는 유전자를 파괴한 단일 클론으로부터 기원되었다. 추가의 분석은 이 환자의 제2 TET2 대립유전자에서의 새로운 기능저하 돌연변이를 밝혔다. 이중대립유전자 TET2 결손을 가진 세포는 변화된 T-세포 분화 및 기능과 일치하는 감소된 DNA 히드록시메틸화 및 후성유전학적 프로파일을 나타냈다. 피크 확장에서, 파괴된 TET2를 가진 CAR T-세포는 중심 기억 표현형을 나타냈으며, 이것은 대신에 후기 기억/이펙터 분화를 특징으로 하는 장기 영속성 반응을 가진 전형적인 환자와는 상이하다. TET2의 실험적 넉다운은 CAR T-림프구 운명 및 항-종양 역가에 대한 TET2 상실의 효과를 반복하였다. 그 결과는 이 환자에서 TET2 억제가 T-세포 증식을 촉진하고 이펙터 기능을 증진시켰으며, 단일 CAR T-세포의 후손이 관해를 유도하였음을 나타낸다. 이들 데이터는 인간 T-세포 운명 결정에서 TET2의 중요성을 강조하며 TET2 경로의 변형이 유전적-방향수정 T-세포를 이용한 치료를 증진시키기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.
서문
인간 면역계는 외래 항원을 발현하는 세포를 인식하고 제거하도록 발달하였다. 악성 세포는 항-종양 T-세포 면역을 끌어낼 수 있는 새로운 - "비-자가" 에피토프를 생성할 수 있음에도 불구하고, 이들 반응은 종양에 대한 T-세포의 관용에 의해 종종 제한된다. 관용을 극복하는 한 가지 방법은 암 세포를 공격하기 위하여 T-림프구를 유전적으로 재지시하는 것이다. T-세포는 CD3ζ 쇄의 세포내 도메인 및 선택적인 공동자극 엔도도메인에 연결된 항체-유래 결합 모이어티로 구성된 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 유전자로 형질도입될 수 있다(문헌[Gross, G., Waks, T. & Eshhar, Z. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 10024-10028 (1989)]; 문헌[Irving, B. A. & Weiss, A. Cell 64, 891-901 (1991)]). 한 가지 종양 항원은 B-세포 유래 암에서 발견되며 성공적인 면역요법에서 표적화된 CD19 단백질이다. 예를 들어, 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인(CTL019)이 통합된 자가유래 항-CD19 CAR T-세포는 CLL 및 급성 림프구성 백혈병(ALL)과 같은 B 세포 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, CAR T-세포 요법의 성공은 생체 내에서 입양되어 전달된 세포의 충분한 융합 및 생존을 이루는 것에 의존할 수 있다. CTL019 요법에 반응하는 CLL을 가진 개인은 주입 후 CAR-T 세포의 유의한 확장과 지속을 가질 수 있는 반면, 비-반응 환자에서는 이들 세포가 감소된 증식 능력을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이론에 구애됨이 없이, 반응하는 환자에서 CAR T-세포의 우수한 항-종양 역가 및 장기 생존에 관련되는 기작은 예를 들어, T-세포 내인성 및 외인성 인자 둘 다를 포함하는 것으로 생각된다. CLL 환자의 하위세트만이 치료 수준의 CAR T-세포 확장을 경험하므로(문헌[Porter, D. L. et al., Science translational medicine 7, 303ra139, doi:10.1126 (2015)]), 영속적인 관해의 경우에 성공적인 증식과 지속의 결정인자를 이해하는 것이 매우 중요하다.
본 실시예에서는, B-세포 상의 CD19 단백질을 표적화하는 CAR T-세포로 처리된 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 가진 환자를 평가하였다. CAR T-세포의 주입시, 항-종양 활성이 말초 혈액, 림프절 및 골수에서 명백하였으며, 완전 관해가 수반되었다. 항-종양 반응의 피크에서, 94%의 CAR T-세포는 렌티바이러스 벡터-매개된 CAR 트랜스진 삽입이 메틸시토신 디옥시게나아제 TET2를 코딩하는 유전자를 파괴한 단일 클론으로부터 기원되었다. 이 삽입을 보유한 세포는 변화된 T-세포 분화와 일치하게 DNA 히드록시메틸화 감소 및 후성유전학적 프로파일의 획득을 나타냈다. 피크 확장에서, TET2 삽입을 가진 CAR T-세포는 초기 기억 표현형을 나타냈으며, 이것은 대신에 후기 기억 분화를 특징으로 하는 장기 영속성 반응을 가진 전형적인 환자와는 상이하다. 건강한 공여자 T-세포에서 TET2의 실험적 넉다운은 CAR T-림프구 운명에 대한 통합-매개된 TET2 파괴의 효과를 반복하였다. TET2의 활성 감소, 예를 들어, 이중대립유전자 파괴는 삽입 돌연변이유발 촉진된 T-세포 증식과 관련되었으며, 이 환자, 즉, 여기서 환자 10으로 불리는 환자에서 단일 CAR T-세포의 후손이 관해를 유도한 것으로 결론내렸다. 이들 데이터는 T-세포 분화에서 TET2의 중요성을 강조하며 TET2 경로의 변형이 유전적-방향수정 T-세포를 이용한 치료를 향상시키기 위해 유용할 수 있음을 제안한다.
결과
여러번의 화학요법과 생물학적 치료 요법을 거친 진행된 CLL을 가진 78세 남성(환자 10; 표 6)을 CTL019 요법을 위한 임상 시험에 등록하였다(NCT01029366). 이 환자는 2개월 간격으로, 3.75 × 108 및 5.61 × 108개의 자가유래 CTL019 세포의 2회 입양 전달을 거쳤다. CAR T-세포의 제1 분할-용량 주입 후, 그는 지속적으로 열이 있었다. 어떤 감염원도 확인되지 않았다. 환자 10은 사이토카인 방출 증후군(CRS)으로 진단되어 인터류킨(IL)-6 수용체-차단 치료를 받았으며 그 후 CRS의 징후와 증상이 빨리 사라졌다. 환자 10은 그의 제1 용량의 CAR T-세포가 주어진 후 6주에 그의 큰 선병증에서의 진행 및 CLL의 방대한 골수 침윤을 계속 나타냈다. CTL019 치료에 반응하는 대부분의 환자는 CRS를 수반하는 빠른 T-세포 증식 및 주입후 제1 개월 내에 종양 부담의 지속적인 감소를 나타내며, 예를 들어, 문헌[Porter, D. L. et al.Science translational medicine 7, 303ra139, (2015)]을 참고하며, 이것은 환자 10에서는 발생하지 않았다(도 1a-1c).
[표 6]
Figure pct00129
IL-6-매개된 신호전달의 조기 차단이 CAR T-세포 요법에 대한 이 환자의 반응을 감소시켰을 수도 있다는 염려가 있었으므로, 제2 용량의 세포 산물을 투여하였다(5.61 × 108개의 CAR-T 세포, 제1 주입 후 70일). 주입은 고열, 저혈압 및 저산소증에 의해 나타난 CRS를 다시 수반하였으며, 이 증상들은 중재없이 며칠 후에 사라졌다. 1개월 뒤 그의 골수의 평가는 CLL의 지속적인 방대한 침윤을 나타냈으며 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔은 방대한 선병증에서 최소의 개선을 나타냈다. 제2 주입 후 약 2개월에, CTL019 세포의 확장이 말초 혈액에서 최대가 되었으며, 이어지는 날과 주 동안 축소되었다(도 1a). CTL019 세포의 성장은 CD8+ T-세포 구획에서 발생하였으며, 이것은 이 치료법에 반응하는 CLL 환자에서 전형적이다(도 2 및 도 13). 이 반응은 인터페론 (IFN)-γ, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), IL-6, IL-8 및 IL-10의 순환 수준 상승과 함께, 임상적 중재를 요구하는 고-등급 CRS를 수반하였다(도 1b). 이와 동시에, 그리고 고열의 개시와 일치하게, 환자는 CLL 세포의 신속한 제거를 나타냈다(도 1c). 백혈병 클론의 추적을 가능하게 하는 면역글로불린 중쇄(IGH) 유전자좌에서의 재배열 생성물의 차세대 서열분석은 1개월 후 혈액으로부터 이 클론의 완전한 박멸과 함께, 제2 주입 후 제51일에 종양 부담의 1-로그 감소를 나타냈다(표 7). CT 스캔은 종격 및 액와 선병증에서 극적인 개선을 나타냈다(69% 변화; 도 1d). CTL019 세포의 제2 주입 후 6개월에, 환자 10은 그의 골수에서 CLL의 증거없이 완전 반응(표 7) 및 모든 비정상 선병증의 해결(도 1d)을 이루었다. 그의 대부분의 최근의 장기 후속 평가(CTL019 세포 주입 후 4.2년 초과)는 말초 혈액내의 CAR T-세포의 존재, 진행성 B-세포 무형성(도 14a-14c) 및 순환 질병 또는 골수 침윤의 증거 부재를 밝혔다. 혈액 내의 추가적인 면역 세포 집단은 빈도에서 정상이었으며, 림프증식성 이상의 징후는 관찰되지 않았다(도 14a-14c). 완전 관해는 본 실시예의 시점에서 5년 초과 동안 지속되었다.
[표 7]
Figure pct00130
다음으로, CTL019 세포 내의 T-세포 레퍼토리의 클론 구조를 처리 전에 그리고 입양 전달 후에 검사하였다. T-세포 수용체 베타 레퍼토리의 심층 서열결정(Deep sequencing)은 예비-주입된 CD8+ CTL019 세포 및 주입 후 1개월에 CD8+ T-세포 구획은 다중클론성이었으며, 샘플간에 유사한 다수의 구별되는 TCRVβ 클로노타입을 가짐을 밝혔다(도 3; 도 4a). 제2 주입 후 약 2개월에, CTL019 세포 집단을 지배한 TCRVβ5.1+ 클론이 말초 혈액에서 전체 CD8+ T-림프구의 50%를 초과하여 존재하였다(도 4a-4b). 후속 분석은 CD8+ CAR T-세포 레퍼토리의 94%가 전달시에 또는 제2 주입 후 1개월에 검출되지 않은 이 단일 클론으로 이루어짐을 밝혔다(도 4c). 종양 박멸 후, TCRVβ5.1+ 세포의 확장은 CAR T-세포 감퇴 동력학과 일치하게 감소하였다(도 4d). 따라서, 백혈병은 주로 생체 내 대량 확장을 입증한 단일 CAR T-세포의 후손에 의해 이 환자에서 제거되었다.
이 클론 집단의 우수한 증식 능력 및 항-종양 효능의 기저의 기전을 결정하기 위하여, 입양 전달 후 말초 혈액 또는 CD8+ CAR+ T-세포 내의 또는 주입 전 CAR-형질도입된 세포 생성물 내의 렌티바이러스 통합 부위를 검사하였다. 렌티바이러스 DNA는 인간 게놈에서 다수의 부위에서 통합되므로, 통합 수용체 부위의 서열분석을 이용하여 세포 클론의 증식을 추적하고 잠재적인 삽입 돌연변이유발을 조사할 수 있다.
환자 10 혈액 샘플의 종적 샘플링은 TET2의 인트론 9에서의 통합 부위를 가진 세포 클론을 밝혔으며, 이것은 임상 활성의 피크에서 CAR T-세포에서 확장되었으나 더 이른 시점에는 확장되지 않았다(도 5a). 이렇게 큰 클론 지배력은 현재까지 CD19-지시된 T 세포로 치료된 어떤 환자에서도 관찰되지 않았다. CLL 및 ALL에서, 생체 내에서 CAR T-세포의 축적은 전형적으로 형질도입된 T-세포 집단 내에서 다양한 다중-클론성 또는 희소-클론성(pauci-clonal) 레퍼토리의 확장으로부터 야기된다. TET2 통합체를 보유한 세포는 장기 지속성을 나타냈으며(도 5a), 주입 후 4.2년에 14%의 상대적인 풍부함으로 말초 혈액에 존재하였다(도 11a). 클론 집단은 시간에 따라 축소되었으며 항상성 제어하에 있는 것으로 보였으며, 삽입성 종양형성이 발생한 징후는 없었다(도 14a-14c).
TET2는 혈액 세포 형성의 주요 조절자이며, 이 유전자의 반가불충분성 또는 결실은 정상적인 클론 혈액생성에서(문헌[Busque, L. et al.Nature genetics 44, 1179-1181, doi:10.1038/ng.2413 (2012)]) 및 자연-발생 및 인간 T-림프친화성 바이러스 타입 1(HTLV-1)-관련 종양을 비롯한 림프종 및 백혈병의 개시에서(문헌[Yeh, C. H. et al. Molecular cancer 15, 15, doi:10.1186/s12943-016-0500-z (2016)]) 역할을 한다. TET2 불활성화가 조혈 줄기 및 전구 세포의 증가된 자가-재생에 기여할 수 있음에도 불구하고, 이것은 가끔 명시적인 종양형성을 야기하여, 완전한 악성 형질전환을 위하여 추가적인 유전자 돌연변이가 요구됨을 제안한다(문헌[Zang, S. et al.The Journal of clinical investigation 127, 2998-3012, doi:10.1172/JCI92026 (2017)]). 폴리아데닐화된 TET2 RNA 집단의 분석은 TET2 엑손 9로부터 벡터내로 스플라이싱되고 종결되어 코딩된 단백질을 절단하는 새로운 키메라 RNA의 출현을 보여주었다(도 5b, 6a, 및 6b). 절단된 융합 TET2 mRNA 및 상응하는 단백질의 CAR T-세포 특이적 발현이 정상 TET2 활성에 대해 우성적 네거티브 효과를 가질 수 있는 것도 가능한 한편, TET2 돌연변이체는 야생형 단백질의 기능을 억제하지 않으며 따라서 우성적 네거티브 특징을 나타내지 않음이 입증되었다. 또한, 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 TET2 돌연변이의 평가는 일관되게 기능상실 표현형을 나타낸다.
렌티바이러스 통합에 의한 TET2의 단일 대립유전자 파괴가 이러한 전례없을 정도의 CAR T-세포 클론 증식에 대해 주로 책임이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 이 대상체로부터의 CAR+(TET2-렌티바이러스 통합에 의해 파괴됨) 및 CAR- CD8+ T 세포를 서열분석하고 혈액 종양 또는 전구체 병변에 관련된 유전자를 검사하였다. 두 샘플 모두에서, 아미노산 1879(엑손 11)에서의 미스센스 변이체가 TET2의 촉매 도메인에서 발견되어, 야생형 잔기 글루탐산을 글루타민으로 전환시켰다(도 11c). 주목할만하게, 글루탐산에서 리신, 아스파르트산 또는 알라닌으로의 위치 1879에서의 아미노산 서열의 변화에 관련된 TET2에서의 유전적 변이는 골수이형성-골수증식성 신생물과 관련되었다. 염색체가 야생형 기준 서열(c.5635G)을 함유하였으므로, c.5635C 돌연변이는 통합된 CAR 트랜스진없는 TET2의 대립유전자에 존재하였다. 67개의 추가 유전자의 패널에서는 다른 돌연변이는 발견되지 않았다.
TET2는 5-메틸시토신(5mC)의 5-히드록시메틸시토신(5hmC)으로의 전환을 촉매하여, DNA 탈메틸화를 매개하는 효소인 메틸시토신 디옥시게나아제를 코딩한다(문헌[Tahiliani, M. et al.Science 324, 930-935 (2009)]; 문헌[Iyer, L. M., et al.Cell 8, 1698-1710 (2009)]). 시토신의 C5 위치에서의 메틸화는 정상적으로는 전사를 억제하고, 따라서 탈메틸화는 유전자 발현을 활성화할 것으로 예상된다. HEK293T 세포를 일시적으로 트랜스펙션시킨, 야생형 TET2 또는 이 TET2 변이체를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 E1879Q 돌연변이의 기능적 유의성을 조사하였다. 닷 블로팅을 이용한 이들 세포로부터 단리된 게놈 DNA의 분석은 E1879Q가 5-hmC에서의 산화를 중단시키며, 5-fC 및 5-caC의 형성이 상당히 감소됨을 밝혔다(도 11d). 이것은 촉매적 불활성(HxD) TET2의 도입으로 인하여 5-mC의 산화가 발생하지 않았던 세포와 대조적이었다(도 11d). Tet2 단백질의 균일한 과발현은 세포 용해물의 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다(도 11d). 게놈 수준에서 이들 발견을 확인하기 위하여, 트랜스펙션된 세포로부터의 DNA를 성분 뉴클레오시드로 분해하고 이를 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법을 이용하여 분석하였다. 사실상, E1879Q를 과발현하는 세포는 그들의 야생형 대응물에 비하여 5-fC 및 5-caC의 생산에서 2배 감소를 나타냈다(도 11e). 이들 발견은 환자 10의 클론-확장된 CD8+ CAR T-세포에서 렌티바이러스 통합에 의해 파괴되지 않은 TET2 대립유전자에서 기능저하가 일어났다는 생각을 지지한다.
TET2 이중대립유전자 파괴된 CAR+ Vβ5.1+ CD8+ T-세포는 생체 외에서 그들의 CAR- Vβ5.1- CD8+ T-세포(TET2 반가불충분) 대응물에 비하여 더 낮은 총 수준의 5hmC를 나타냈다(도 7a). E1879Q 변이체가 5-hmc의 생성에 영향을 주지 않았으므로, 이것은 아마도 삽입 돌연변이유발 후 TET2 결손의 결과였다(도 11d-11e).
CAR T-세포 기능에 대한 TET2 삽입 돌연변이유발의 기전을 조사하기 위하여, DNA 접근성을 모니터하는 ATAC-seq를 수행하였다(그 전체가 참고로 본원에 포함되는 문헌[Buenrostro, J. D., et al.Nat Methods 10, 1213-1218 (2013)](표 10). 이 환자로부터의 TET2 반가불충분(CAR-) 및 이중대립유전자 결손(CAR+) CD8+ T-세포 사이의 후성유전학적 변화는 전체적으로 보통 정도였지만(도 7b), 크로마틴 접근성 프로파일에 기초한 유전자 온톨로지 분석은 세포 주기 및 T-세포 수용체 신호전달을 조절하는 경로에서의 유전자에 대한 접근성 획득(도 15 및 표 8), 및 분화, T-세포 활성화 및 이펙터 기능을 조절하는 경로에서의 유전자에 대한 접근성 감소를 나타냈다(도 7c; 도 8; 표 8; 부록의 표 9). TET2 이중대립유전자 기능장애, 예를 들어, 삽입 돌연변이유발 후에 실질적으로 감소되거나 상실된 ATAC-seq 판독값 근처의 유전자는 T-세포 이펙터 분화 및 기능의 여러 조절자, 예를 들어, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA 및 PRDM1을 포함하였다(도 7c; 표 8).
클론-확장된 CAR T-세포의 전체적인 크로마틴 지형에서의 이들 변화가 T-림프구 분화 및 기능의 중심 매개자인 특정 전사 회로에 영향을 미쳤을 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 CAR- CD8+ T-세포에 비교하여 CAR+ CD8+ T-세포에서 획득되거나 소실된 전사 인자(TF) 모티프를 확인하였다(도 12a). CAR+ T-세포에서 획득된 TF 모티프는 항원미접촉 및 초기 기억 인간 CD8+ T-세포44를 특징짓는 E26 형질전환-특이적(ETS)(GABPα, ELF1, Elk4) 및 징크 핑거(ZF) TF(Sp1) 결합 부위를 포함하였다(도 12a 및 표 11). 주목할만하게, ETS TF는 정상적인 T-세포 발달, 활성화 및 생존을 위해 요구되는 것으로 입증되었다(문헌[Muthusamy, N., Barton, K. & Leiden, J. M. Nature 377, 639-642, doi:10.1038/377639a0 (1995)]). 대조적으로, 환자 10 CAR+ T-세포에서 덜 접근성인 TF 모티프(도 12a 및 표 11)(NF-κB, IRF1, NFAT:AP1 및 CTCF)는 최종-분화된 이펙터 및 기능소실된 T-세포에서 농축되며 그들의 생물학을 프로그래밍하는 후성유전학적 지형의 형성에서 공지의 핵심 역할을 가진다. 이중대립유전자 TET2 상실의 배경에서 폐쇄된 피크는 또한 염기성 루이신 지퍼(bZIP) TF, BACH2에 의해 인식되는 모티프를 포함하였다(도 12a 및 표 11). BACH2는 쥐 CD8+ T 세포에서 항원미접촉 상태를 유지하기 위하여 이펙터-관련 유전자의 발현을 억제하는 것으로 보고된 한편(문헌[Tsukumo, S. et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 10735-10740, doi:10.1073/pnas.1306691110 (2013)], 렌티바이러스 통합에 의한 그의 파괴는 또한 여러 연구에서 클론 확장 및 HIV-감염된 T-세포의 지속성에 연관되었다(문헌[Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A. & Matsushita, S. The Journal of infectious diseases 195, 716-725, doi:10.1086/510915 (2007)]). 또한, BACH2는 쥐 백혈병 바이러스에 의해 유도된 B-세포 림프종에서 프로바이러스 통합의 표적이며 그의 상실은 면역 세포의 클론원성 활성과 지속성의 기저의 직접적인 기전이다. 전체적으로, T-세포 분화, 발달, 클론 확장 및 지속성의 잘-정의된 조절자의 크로마틴 접근성 및 관련된 TF 결합 모티프에서의 유의한 차이는 TET2 결손이 환자 10에서 발견된 매우 강력한 CAR T-세포에서의 활성 조절 프로그램을 변화시켰다는 우리의 추론을 지지한다.
이들 발견에 따르면, 이 환자로부터 배양된 TET2 이중대립유전자 결손된, 예를 들어, 파괴된, CAR+ T-세포의 기능적 분석은 덜 분화된 상태와 일치하게, 활성화될 경우, IFN-γ 및 CD107a(탈과립화를 위한 대리 마커)를 발현하는 능력의 감소를 나타냈다(도 7d). 따라서, 제2 대립유전자에서의 기능저하 돌연변이와 함께 TET2 내로의 렌티바이러스 통합은 변경된 T-림프구 운명과 일치하는 방식으로 CAR T-세포의 후성유전학적 지형을 재프로그래밍하였다.
[표 8]
Figure pct00131
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
[표 9]
표 9는 부록에 나타나며, 부록은 본 명세서의 일부이며 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
[표 10]
Figure pct00136
[표 11]
Figure pct00137
Figure pct00138
다음으로, 환자 10으로부터의 생체 내 CTL019 세포의 분화 상태를 분석하고, 장기 영속성 관해(>6년)를 가졌으며 TET2 통합을 가지지 않은 두 CLL 대상체(환자 1 및 2)를 비롯하여 이 치료법에 반응한 6명의 다른 환자로부터의 CAR T-세포와 비교하였다. 생체 내 융합 및 활성화 마커 발현의 피크에서(도 9), CAR T-세포의 65% 초과가 중심 기억 표현형이었으며, 이것은 그들의 레퍼토리가 반응의 높이에서 CD8+ 이펙터 기억 및 이펙터 CTL019 세포에 의해 지배된 이들 다른 완료 반응자들과 상이하였다(도 7e). TET2의 넉다운은 건강한 대상체로부터의 CD4 인간 T-세포뿐만 아니라 전체 및 CAR+ CD8 둘 다의 분화 상태에 대한 환자 10에서의 그의 상실, 예를 들어, 삽입 파괴의 효과를 반복하여(도 7f-g; 도 10a-10c), TET2를 T-림프구 운명의 후성유전학적 조절자로 나타냈다.
본 발명자들은 항원미접촉 및 기억 하위세트 간에 차등적인 TET2 mRNA 발현을 관찰하지 못하였으므로, CD8+ T-세포 분화의 TET2-매개 조절은 전사 수준에서 발생하지 않을 수 있다. 이들 발견은 Tet2 유전자 발현이 Ca2+-의존적 방식으로 T-세포 수용체 트리거링시에 신속하게 그리고 일시적으로 증가됨에도 불구하고, 5-hmC 유도의 타이밍은 mRNA 발현에서의 변화보다 빠르게 발생한다는 관찰에 의해 설명될 수 있다. T-세포 활성화/분화 동안 TET 효소 활성 뿐만 아니라 TET2 전사를 조절하는 항원 수용체 신호는 엄격하게 조절되는 것으로 보이며 다수의 독립적인 기전을 통해 작용할 수 있다.
TET2 결손으로부터 야기되는 이러한 T-세포 분화 상태 변경의 기능적 유의성을 조사하기 위하여, 임상 CAR T-세포 역가를 예측하는 시험관 내 연속 재-자극 분석을 수행하였다. CD19-발현 종양 세포를 이용한 반복적인 자극은 TET2-결손 CAR T-세포가 항원-의존적 방식으로 계속 확장하도록 한 반면, 비변경 TET2를 가진 CAR T-세포의 재-자극은 그들의 생존능에 영향을 미치지 않고서(도 17) 배양 성장 중지를 야기하였다(도 12c). 이들 결과는 TET2의 억제자인 2-히드록시글루타레이트가 생체 외에서 쥐 CD8+ T-세포의 생존을 유지하며, 이것은 다시 그렇지 않으면 이펙터 분화에 의해 감소될 이들 림프구의 생체 내 항-종양 활성을 매개할 수 있음을 입증한다. 쥐 CD8+ T-세포에서 TET2의 넉아웃이 유사한 중심 기억 표현형 편향을 보여줌에도 불구하고, 면역염증 및 항-바이러스 반응의 맥락에서 그들의 향상된 활성은 증식성 효과로 인한 것이 아니다(문헌[Carty, S. A. et al.J Immunol, doi:10.4049/jimmunol.1700559 (2017)]). 이것은 마우스 CD8+ T-세포에 비하여 인간의 기능에 대한 TET2 결손의 차등적 효과를 강조한다.
CAR T-세포 기능에 대한 TET2 억제의 효과를 추가로 조사하기 위하여, 급성 (도 18a) 및 만성(도 18b) 시험관 내 항원 자극 후 사이토카인의 생산을 조사하였다. 환자 10에서의 CD8+ CAR+ T-세포의 본 발명자들의 분석과 일치하게, CD3/CD28 활성화 후 IFNγ 생산은 감소된 TET2 수준을 가진 CD4+ T-세포 뿐만 아니라 CD8+에서 감소되었다(도 18a). 유사한 감소가 TNFα 생성에 대해 관찰되었다(도 18b). 대조적으로, CD4+ T-세포에 의한 TNFα 및 IL-2 둘 다의 급성 생산은 CAR-특이적 유도시에 증가되었다(도 18a). CD19-발현 종양 표적에의 벌크 CTL019 세포의 반복된 노출이 또한 IFNγ 합성의 감소를 유도한 반면(도 18b), TET2 억제는 여러번의 자극 후 다양한 다른 자극, 염증 및 조절 사이토카인의 지속적인 생산을 야기하였다(도 18b). 이들 관찰은 TET2가 항원-수용체 및/또는 공동-자극 신호-의존적 방식으로 인간 T-세포 하위세트-특이적 사이토카인 생산을 제어할 수 있음을 제안한다.
사이토카인 유전자 유전자좌의 조절에 더하여, DNA 메틸화는 이펙터 CD8+ T-세포 상태의 형성과 유지에 영향을 미치는 중요하고 동적인 후성유전학적 과정이다. 환자 10으로부터 확장된 TET2-결손 CAR+ T-세포의 본 발명자들의 기능적 평가 및 다른 연구로부터의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 TET2의 넉다운이 CTL019 림프구에서 이펙터 분자 발현을 감소시킬 것으로 예상하였다. CAR-특이적이지만, CD3/CD28 특이적이 아닌 자극은 CD107a의 발현을 증가시켰다(도 19a). 이것은 적어도 부분적으로, NKG2D 상향조절로 인한 CD28 공동-자극에 비하여 4-1BB에 의해 매개된 향상된 세포용해 능력에 기인할 수 있다. CD8+ T-세포 분화가 GZMB(그랜자임 B를 코딩) 및 IFNG를 비롯한 이펙터 유전자 유전자좌에서 감소된 메틸화 및 상향조절된 유전자 발현을 수반하므로, TET2 억제가 세포독성 기계의 중요한 성분에 영향을 주는지를 후속하여 조사하였다. IFNγ와 대조적으로, CD8+ CAR+ T-세포에서 TET2 감소는 그랜자임 B 및 퍼포린 발현 수준을 증가시켰다(도 19b). 이들 변화는 CD19-발현 백혈병 표적과의 공동-배양시에 TET2 넉다운 CAR T-세포의 높아진 세포독성 활성과 연관되었다(도 19c).
상기 발견은 TET2 결손이, 강한 이펙터 반응을 신속하게 확장시키고 유발할 수 있는 짧게 사는 기억 세포 및 영속적으로 지속되는 길게 사는 기억 세포의 특성을 가진 매우 강력한 CAR T-세포를 생산할 수 있음을 제안한다. 따라서 환자 10 및 다른 장기 반응 CLL 환자로부터의 소급적 주입후 샘플을 이용하여 CD8+ CAR+ 및 CAR- T-세포에서 추가의 이펙터/기억 마커를 조사하였다. 반응의 높이에서, 환자 10으로부터의 종양 반응성 CAR+ T-세포는 매칭된 CAR- T-세포와 비교할 때 더 높은 수준의 그랜자임 B(도 20의 A) 및 에오메소데르민(Eomesodermin)(EOMES; CD8+ 기억 T-세포 풀의 형성과 유지에 관련된 전사 인자; 도 20의 B, 좌측 패널)을 보유하였으며, 이것은 영속적인 관해를 경험한 다른 반응자들과 구별되었다. 환자 10의 CD8+ CAR+ T-세포를 비롯하여, 반응하는 환자에서의 모든 임상적으로 활성인 CD8+ CAR+ T-세포는 T-세포 기억의 생성에 관련된 공동-자극 수용체인 CD27을 발현하였다(도 20의 B, 중간 패널). DNA 메틸화에 의해 조절되는 것으로 알려진 T-림프구 노화의 마커인 KLRG1을 발현하는 CTL019 세포의 빈도는 다른 대상체의 CAR T-세포에 비하여 TET2-결손 환자 10 CAR T-세포에서 유의하게 더 낮았다(도 20의 B, 우측 패널). 본 발명자들의 이전의 관찰에 따르면 Ki-67 양성 CAR+ T-세포의 높은 빈도가 환자 10에서 생체 내 확장의 피크에서 관찰되어(도 20의 A, 우측 패널), TET2가 CAR-특이적 CD8+ T-세포 증식 및 확장을 위해 요구됨을 추가로 제안한다. 이들 관찰은 종합적으로, TET2 상실이 강한 항-종양 이펙터 반응을 이끌어낼 수 있는 인간 기억 CAR T-세포의 발달을 촉진한다는 아이디어를 지지한다.
요약하면, 예를 들어, 렌티바이러스 통합이 TET2를 파괴한, 이중대립유전자 TET2 결손을 가진 단일 CAR-형질도입된 T-세포의 극심한 클론 확장은 78세 CLL 환자에서 비-치유성 반응을 고심도 분자학적 관해(deep molecular remission)로 전환시켰다. 이 T-림프구 집단의 특성규명은 후성유전학적 환경에 대한 심지어 보통의 변화도 분화 운명 및 이펙터 기능을 변경할 수 있으며, 상당한 치료 효과로 번역될 수 있음을 밝혔다. 초기 연구는 한 대상체의 방대한 분석에 기초하였음에도 불구하고, 12명의 건강한 개인으로부터의 일차 인간 T-세포에 관련된 관련 배양 시스템에서 CAR T 세포 운명, T-림프구 분화 및 항-종양 활성에 대한 TET2 결손의 효과의 반복은 면역 반응을 형성할 수 있는 변형가능한 후성유전학적 경로의 발견을 지지한다. 따라서, 소분자를 이용한 후성유전학 표적화, 매우 효율적인 부위-지시된 트랜스진 통합 전략 또는 다른 유전적 조작 방법이 암 치료법에서 CAR T-세포의 효능과 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 이 조사는 후성유전학적 지형 맵핑을 CAR T-세포로 연장하기 위한 자극 및 TET2가 어떻게 그들의 분화 능력/이펙터 역가를 촉매 및/또는 비-촉매 경로를 통해 부분적으로(또는 완전히) 조절하는지를 결정하기 위한 기계적 골격을 제공한다. 마지막으로, 결과는 단일 CAR T-세포의 후손이 진행된 백혈병에서 강한 항-종양 효과를 매개하기에 충분함을 나타낸다.
방법
환자 샘플
환자는 TCR 제타 및 4-1BB 공동자극 도메인(CTL019)을 통합하는 CD19 키메라 항원 수용체를 발현하는 자가유래 T 세포의 입양 전달의 안전성과 효과를 평가하기 위하여 설계된, 임상연구 심의 위원회(institutional review board)(IRB)-승인 임상 프로토콜: "Genetically Engineered Lymphocyte Therapy in Treating Patients With B-Cell Leukemia or Lymphoma That is Resistant or Refractory to Chemotherapy"(ClinicalTrials.gov number:NCT01029366)에 등록하였다. 모든 참여자가 우수한 임상 실시를 위한 조화 가이드라인에 대한 헬싱키 및 국제 회의의 선언문(Declaration of Helsinki and the International Conference on Harmonization Guidelines for Good Clinical Practice)에 따른 동의서를 제공하였다. 본 연구는 기존의 임상 시험으로부터 수집된 환자 샘플을 이용한 이차 조사이다. 따라서, 본 실시예에서 샘플 크기는 원래의 임상 시험 설계 및 샘플 이용가능성에 의해 결정되었으며; 추가적인 포함/배제 기준이 적용되지 않았다.
세포주
NALM-6 세포주는 원래 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 수득하였다. OSU-CLL 세포는 오하이오 주립대학으로부터 수득하였다. 세포는 낮은 계대에서 10% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지에서 확장시키고 제조사(Lonza) 설명서에 따라 마이코알러트(MycoAlert) 검출 키트를 이용하여 마이코플라스마에 대해 시험하였다. 세포주의 입증은 국제 세포주 입증 위원회(International Cell Line Authentication Committee)에 의해 확립된 기준에 기초하여 아리조나 대학(USA) 유전학 코어에 의해 수행하였다. 짧은 반복 염기(Short tandem repeat)(STR) 프로파일링은 이들 세포주가 80% 매치 역치를 훨씬 초과하였음을 밝혔다. NALM-6 및 OSU-CLL 세포를 방아벌레 그린(CBG) 루시퍼라아제/향상된 GFP(eGFP)를 구성적으로 발현하도록 조작하고 FACSAria(BD)에서 분류하여 >99% 순수 집단을 수득하였다. 마이코플라스마 및 입증 시험은 분자 조작 전과 후에 일상적으로 수행된다.
CAR T-세포 제조 및 상관성 연구
CTL019 제조를 위한 말초 혈액 T 세포는 이전에 개시된 대로(문헌[Fraietta, J. A. et al.Blood 127, 1117-1127 (2016)]; 문헌[Kalos, M. et al.Science translational medicine 3, 95ra73, (2011)]; 문헌[Porter, D. L. et al.The New England journal of medicine 365, 725-733, (2011)], 문헌[Porter, D. L. et al.Science translational medicine 7, 303ra139, (2015)]) 백혈구분반술에 의해 수득하였다. CTL019 주입 전과 후의 샘플의 가공, 유세포분석 평가, 혈청 사이토카인의 정량 및 정량적 PCR 분석은 이전에 보고된 대로 수행하였다(문헌[Maude, S. L. et al.The New England journal of medicine 371, 1507-1517, (2014)]). 면역글로불린 중쇄(IGH) 재배열의 차세대 서열분석은 혈액과 골수 샘플로부터 단리된 DNA에서 수행하였다. 간단히 설명하면, IGH의 제3 상보성-결정 영역의 가변 및 연결 유전자 절편에 대해 특이적인 프라이머를, 기준선 샘플(Adaptive Biotechnologies)에 비하여 백혈병 클론을 확인하기 위한 증폭 및 심층 서열결정을 위해 이용하였다. 각 샘플에서 백혈병 클론의 빈도를 전체 및 독특한 산물 판독값의 수를 이용하여 계산하였다. 이들 상관성 분석은 질병 반응 평가와 병행하여 각 임상 프로토콜에 의해 정의된 시점에 수행하였다. 이 임상 시험은 단일-처리 연구였으며; 현재 연구에서 환자 간의 비교는 관찰된 임상 반응에 의해 정의되었다. 상관성 분석이 개인정보제거된 대상체 샘플을 이용하여 수행되었으므로 조사자는 임상 반응은 알 수 없었다.
유세포분석
혈액과 골수 내의 B-CLL 부담 및 CTL019 확장과 지속의 일상적 평가는 6-파라미터 Accuri C6 유세포분석기(BD)를 이용하여 이전에 개시된 방법에 따라 수행하였다(문헌[Kalos, M. et al.Science translational medicine 3, 95ra73, (2011)];문헌[Porter, D. L. et al.Science translational medicine 7, 303ra139, (2015)]). T 세포 면역표현형결정은, 아쿠아 블루(Aqua Blue) 사멸 세포 배제 염료(Invitrogen)와의 예비-인큐베이션 후 즉시 유세포분석 항체를 이용한 표면 염색에 의해 CTL019 주입 생성물 또는 주입후 PBMC 샘플에서 수행하였다. CAR 분자를 검출하기 위해 이용된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-콘쥬게이션 단클론 항체가 개시되었다(문헌[Jena, B. et al.PLoS One 8, e57838, (2013)]). 연구에서 사용된 시판 유세포분석 항체는 다음과 같다: CD3 알로피코시아닌(APC) H7, CCR7 PE/CF594(BD Biosciences); CD107a APC, (BD Biosciences); CD45RO 밝은 보라색 (BV)570, CD8 BV650, CD4 BV785(Biolegend); 퍼포린 BV421, Ki-67 알렉사 플루오르 (AF)700, TNFα BV605(Biolegend); IFNγ PE, IL-2 PerCP-eFluor 710, 에오메스(Eomes) FITC(eBioscience); 그랜자임 B PE/시아닌(Cyanine)5.5(Invitrogen) 및 TCRVβ5.1 APC(eBioscience). 모넨신을 함유하는 골지스탑(GolgiStop) 단백질 수송 억제자 및 브레펠딘 A를 함유한 골지플러그(GolgiPlug) 단백질 수송 억제자(BD Biosciences)를 세포내 사이토카인 생성을 위해 염색할 때 이용하였다. 모든 유세포분석 시약은 사용 전에 적정하였다. 샘플은 LSRFortessa(BD)에서 획득하였으며 데이터는 FlowJo 소프트웨어(TreeStar)를 이용하여 분석하였다.
TCRVβ 심층 서열결정
주입-전 T 세포, 말초 혈액 샘플 또는 분류된 주입-후 T 세포로부터의 게놈 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 단리하였다. TCRVβ 심층 서열결정을 immunoSEQ(Adaptive Biotechnologies)에 의해 실시하였다. 단지 생산적 TCR 재배열이 TCR 클로노타입 빈도의 평가에 사용되었다.
통합 부위 분석
벡터 통합 부위를 이전에 기술된 바와 같이 게놈 DNA로부터 탐지하였다(문헌[Brady, T. et al., Nucleic Acids Res 39, e72 (2011)]; 문헌[Berry, C. et al., PLoS Comput Biol 2, e157 (2006)]; 문헌[Berry, C. C. et al., Bioinformatics 28, 755-762 (2012)]; 문헌[Berry, C. C. et al., Bioinformatics 30, 1493-1500 (2014)]). 게놈 서열들을 BLAT(hg18, 버전 36.1, 95% 초과의 동일성)에 의해 인간 게놈에 대해 정렬하고, 통합 부위 분포를 분석하기 위한 통계적 방법을 이전에 기술된 바와 같이 실시하였다(문헌[Scholler, J. et al., Science translational medicine 4, 132ra153 (2012)]). SonicAbundance 방법을 이용하여, 통합 부위 데이터로부터의 세포 클론의 풍부성을 추론하였다(문헌[Berry, C. C. et al., Bioinformatics 28, 755-762 (2012)]). 모든 샘플을 사중으로 독립적으로 분석하여, 샘플링의 추측 통계학 및 PCR에서의 창시자 효과를 억제하였다.
TET2 키메라 전사체의 검출
샘플 RNA를 단리하고, Qiagen One-Step RT-PCR Kit에서 주형으로 사용하였다. 프라이머는, 항-CD19BBζ CAR 렌티바이러스 벡터의 내부의 서열 및 벡터 통합 부위의 측면에 있는 TET2의 엑손 9 및 10의 경계를 표적화하도록 설계하였다. 이들은 벡터 서열의 다양한 영역을 포함하였다(도 6a). 반응을 제조업체의 설명서에 따라 실시하였다. 역전사 및 PCR 활성화를 위한 서모사이클링 온도 및 시간은 다음의 사이클링 조건을 이용하여, 제조업체에 따라, 수행하였다: 용융의 경우 94℃에서 30초, 프라이머 어닐링의 경우 57℃에서 30초, 및 프라이머 신장의 경우 72℃에서 1.5분(35 사이클). 72℃에서의 최종 신장은 각각의 샘플에 대하여 10분 동안 유지하였다. PCR 생성물을 전기영동 및 UV 영상화를 통하여 에티듐 브로마이드 아가로스 겔(1.5 중량%)에서 시각화하였다.
주입 후 CAR T 세포 샘플의 차세대 서열결정
CAR+ 및 CAR- CD8+ T- 세포는, 환자 10에서의 생체 내 확장의 피크에 상응하는 주입 후 PBMC 샘플로부터 정제하였다. T-세포를 FACSAria(BD)를 사용하여 분류하고, 게놈 DNA를 이러한 림프구로부터 단리하였으며, 이는 상기에 설명된 바와 같았다. 그 후 혈액 악성 종양과 관련된 68가지의 유전자의 주문제작 표적화 차세대 서열결정 패널을 이용하여(TruSeq Custom Amplicon, Illumina Inc.) Illumina MiSeq(Illumina, Inc.)에서 서열결정하였다. 2110개 판독치의 최소 평균 심도를 서열결정 표본에 대하여 달성하였으며, 이때, 분석 및 바이오인포매틱스(bioinformatics)는 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(예를 들어, 문헌[Daber, R., Sukhadia, S. & Morrissette, J. J. Cancer Genet 206, 441-448] 참조). 제시된 데이터는 인간 기준 서열 UCSC 빌드(build) hg 19 (NCBI 빌드 37.1)을 기반으로 한다.
TET2 대립유전자 호스팅(hosting) 벡터 통합의 결정
c.5635G>C 돌연변이의 유전자좌와 벡터 통합 사이의 DNA의 영역(대략 4 kB)을 증폭시키기 위한 PCR 분석법을 개발하였다. 프라이머는 벡터 서열(MKL-3: 5'-CTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAG-3') 및 돌연변이, chr4:105,276,145의 하류의 다수의 위치에 어닐링하도록 설계하였다(50 bp: 5' GCTGGTAAAAGACGAGGGAGATCCTG-3', 99 bp: 5'-GGCTTCCCAAAGAGCCAAGCCATG-3', 120 bp: 5'-CACGGGCTTTTTCAGCCATTTTGGC-3'). 환자 10에서의 클론 확장의 피크에 상응하는 분류된 CAR+ 및 CAR- CD8+ T 세포로부터의 게놈 DNA 샘플을 증폭용으로 선발하였다. 제조업체의 권고에 따라 Long Amp Taq 폴리머라아제(New England BioLabs) 및 샘플로부터의 DNA 100~400 ng을 이용하여 PCR 반응을 실시하였다. 증폭을 다음과 같이 수행하였다: 94℃, 30초; 30 사이클의 (94℃, 30초; 60℃, 30초; 및 65℃, 3분 20초); 및 65℃, 10분의 최종 신장. 증폭된 생성물을 1.0% 에티듐 브로마이드 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하고, 크기가 4 kb인 두드러진 밴드를 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 사용하여 단리하였다. 단리된 밴드를 pCR2.1 벡터 내로 라이게이션하고, TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)를 사용하여 TOP-10 화학적 적격성 세포 내로 클로닝하였다. 표준 Sanger 기술을 이용하여 M13 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 정제 플라스미드를 서열결정하였다. 서열결정 결과들을 벡터 서열 및 기준 게놈에 대하여 정렬하였다.
TET2 E1879Q 돌연변이의 특성화
이전에 특성화되고 결정화된 인간 TET2-CS 변이체(1129-1936 Δ1481-1843)를 pLEXm 발현 벡터를 사용하여 발현시켰다. E1879Q 돌연변이 또는 촉매적 H1382Y 및 D1384A의 돌연변이(HxD 돌연변이체)를 표준 수단에 의해 생성하였다. GlutaMAX(ThermoFisher Scientific) 및 10% FBS(Sigma)를 포함하는 DMEM에서 HEK293T 세포를 배양하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 세포를 야생형(WT), 돌연변이 hTET2-CS 또는 pLEXm 공벡터 대조군으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한지 24시간 후에 배지를 교환하고, 트랜스펙션한지 48시간 후에 트립신 처리에 의해 세포를 수확하고, 이를 인산염 완충 염수에 재현탁시켰다. DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 상기 세포의 4/5로부터 게놈 DNA를 단리하고, 웨스턴 블롯 분석을 위하여 CytoBuster Protein Extraction Reagent(EMD Millipore)를 사용하여 나머지 1/5의 세포를 용해시켰다.
시토신 변형에 대한 DNA 블롯을 확립된 프로토콜에 따라 실시하였다. HEK293T 세포로부터의 정제 DNA는, 각각의 샘플의 2배 희석을 위하여 트리스-EDTA(TE) 완충제(pH 8.0)에서 15, 7.5, 및 3.5 ng/μL까지 희석시켰다. 2 M NaOH-50 mM EDTA의 1/4 부피를 각각의 샘플에 첨가하였다. DNA를 95℃에서 10분 동안 변성시키고, 빠르게 얼음에 옮기고, 이어서 1:1의 빙냉 2 M 아세트산암모늄을 첨가하였다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막을 크기에 맞게 절단하고, MeOH로 습윤시키고, TE 완충제에서 평형화하고, 그 후 PR 648 Slot Blot Manifold(GE Healthcare Life Sciences) 내에 어셈블링하였다. 각각의 웰을 온화한 진공을 이용하여 흡인하면서 400 μL의 Te로 세척하고, 600, 300, 또는 150 ng의 게놈 DNA를 로딩하고, 이어서 Te로 추가 세척하였다. 막을 5% 밀크(milk)-TBST에서 2시간 동안 차단하고, TBST로 3회 세척하고, 각각의 변형 시토신에 대한 일차 항체(1:5,000의 마우스 항-5-mC(Abcam); 1:10,000의 토끼 항-5-hmC(Active Motif); 1:5,000의 토끼 항-5-fC(Active Motif); 1:10,000의 토끼 항-5-caC(Active Motif))를 이용하여 4℃에서 하룻밤 블롯팅하였다. 그 후 블롯을 세척하고, 1:2,000으로 희석된 이차 말 항-마우스-서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP; Cell Signaling Technology) 또는 1:5,000의 염소 항-토끼-HRP(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore) 및 Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 영상화하였다.
단백질 검출을 위하여, 청징화 세포 용해물을 8% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드(SDS-PAGE) 겔에서 진행시켰다. 겔들을 iBlot 2 Gel Transfer Device(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 PVDF 막 상으로 함께 옮겼다. 막들을 0.1%(v/v) 트윈(Tween)-20(TBST)을 포함하는 트리스-완충 염수 중 5%(w/v) 밀크를 이용하여 실온에서 2시간 동안 차단하고, TBST로 3회 세척하고, 일차 1:10,000 항-FLAG M2(Sigma) 또는 1:1,000 항-Hsp90α/β(Santa Cruz Biotechnology) 항체를 이용하여 4℃에서 하룻밤 블롯팅하였다. 인큐베이션 후, 막들을 세척하고, 1:5,000으로 희석된 이차 염소 항-마우스-HRP(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 2시간 동안 블롯팅하고, 세척하고, Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 이용하여 Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences)에서 영상화하였다.
액체 크로마토그래피 탠덤-질량 분광법(LC-MS/MS)을 위하여, 각각의 샘플로부터의 게놈 DNA 1~2 μg을 1 U의 DNA Degradase Plus(Zymo Research Corporation)를 이용하여 37℃에서 하룻밤, 성분 뉴클레오시드로 분해하였다. 상기 뉴클레오시드 혼합물을 0.1% 포름산에서 10배 희석시키고, 완충제 A(5 mM의 포름산암모늄, pH 4.0)에서 45℃까지 평형화한 5 μm, 2.1 × 250 mm Supelcosil LC-18-S 분석용 컬럼(Sigma)을 갖춘 Agilent 1200 Series HPLC에 주입하였다. 뉴클레오시드들을 0.5 mL/분의 유량에서 8분에 걸친 0~15%의 완충제 B (4 mM의 포름산암모늄, pH 4.0, 20% (v/v)의 메탄올)의 구배에서 분리하였다. 탠덤 MS/MS는, 250℃의 가스 온도, 12 L/분의 가스 유량, 35 psi의 분무기 압력, 300℃의 시스 가스 온도, 11 L/분의 시스 가스 유량, 3,500 V의 모세관 전압, 70 V의 단편화 전압 및 +1,000 V의 델타 EMV를 이용하여 6460 삼중사중극자 질량분석기(Agilent)에서 포지티브 이온 모드 ESI에 의해 수행하였다. 충돌 에너지를 5-mC 및 5-fC의 경우 10 V; 5-caC의 경우 15 V; 및 5-hmC의 경우 25 V로 최적화하였다. 다중 반응 모니터링(MRM) 질량 변화(mass transition)는 5-mC 242.11 126.066 m/z; 5-hmC 258.11 124.051; 5-fC 256.09 140.046; 5-caC 272.09 156.041; 및 T 243.10 127.050이었다. 2.5 μM 내지 610 pM(총 12.5 pmol 내지 3 fmol)의 범위의 표준 뉴클레오시드(Berry & Associates, Inc.)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 등몰량의 각각의 변형 시토신을 포함하는 절단된 올리고뉴클레오티드를 정도 관리 샘플로서 사용하였다. 게놈 DNA 샘플 중 각각의 변형 시토신의 양을 결정하기 위하여 정도 관리 샘플에 의해 조정되는 바와 같이, 샘플 피크 면적을 표준 곡선에 피팅시켰다. 양을 전체 시토신 변형의 백분율로서 표현한다.
총 5-히드록시메틸시토신 수준의 측정
CD8+ T-세포는 EasySep Human CD8+ T Cell Immunomagnetic Negative Selection Kit(StemCell Technologies)를 사용하여 주입-전 PBMC 샘플로부터 정제하고, 이전에 보고된 급속 확장 프로토콜을 사용하여 생체 외에서 확장시켰다(문헌[Jin, J. et al. J Immunother 35, 283-292, (2012)]). 배양 후, CD8+ CAR+ TCRVβ5.1+ 및 CD8+ CAR- TCRVβ5.1- T-세포를 FACSAria(BD)에서 분류하였다. 세포를 투과화하고, 300 μg/ml의 DNase I을 이용하여 37℃에서 60분 동안 처리하였다. 세척 후, 샘플을 항-5hmc 단클론 항체 또는 아이소타입 대조군과 함께 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 Alexa Fluor 647-콘쥬게이션된 이차 항체로 염색하였다. 세포를 LSRFortessa(BD)에서 즉시 획득하였다.
ATAC-seq에 의한 전반적인 염색질의 프로파일링
배양 후, CD8+ CAR+ TCRVβ5.1+ 및 CD8+ CAR- TCRVβ5.1- T-세포를 FACSAria(BD)에서 분류하였다. ATAC-seq를 이전에 기술된 바와 같이 실시하였다(문헌[Buenrostro, J. D. et al. Nat Methods 10, 1213-1218, (2013)]; 문헌[Pauken, K. E. et al. Science 354, 1160-1165, (2016)]). 2회 반복을 각각의 생체 내 확장 CD8+ CAR+ TCRVβ5.1+ 및 CD8+ CAR- TCRVβ5.1- T-세포 배양물에 대하여 수행하였다. 간략하게, 핵을 각각의 반복에 있어서 200,000개의 분류된 CD8+ T-세포로부터 단리하고, 이어서 Tn5 트랜스포사아제(Illumina)의 존재 하에 37℃에서 45분 동안 전위 반응시켰다. 후속적으로, 전위된 DNA의 정제를 MinElute Kit(Qiagen)로 완료하고, 단편을 이중 인덱스(Illumina Nextra)로 바코드화하였다. Illumina NextSeq 500을 사용하여 쌍 형성 말단 서열 결정(2 × 75 bp의 판독)을 실시하였다 .서열결정 미가공 데이터를 프로세싱하고, Bowtie2를 이용하여 GRC37h/hg19 기준 게놈에 대하여 정렬시키고, 유의한 농축의 영역을 MACS v1.4.2를 이용하여 확인하였다. 합쳐진 피크의 목록을 BedTools를 사용하여 생성하고, 서열결정 태그 농축을 HOMER를 사용하여 실시하고, GO/경로 분석을 Metascape를 이용하여 수행하였다. 단지 고신뢰도 피크를 유전자 온톨로지 및 DNA 모티프 분석에 사용하였다. 이러한 평가를 위하여, 5 미만의 농축 점수를 갖는 피크를 이전에 확립된 바와 같이 걸러 냈다.
세포내 사이토카인 분석
생체 외 확장 CD8+ T-세포는, CD107a 단클론 항체 및 골지 억제자인 브레펠딘 A 및 모넨신의 존재 하에 6시간 동안, 항-CD3 및 항-CD28 단클론 항체로 코팅된 상자성 폴리스티렌 비드를 이용하여 3:1 자극하였다. 세포를 세척하고, 생세포/사세포 생존성에 대한 염료로 염색하고, 이어서 CD3, CD8 및 TCRVβ5.1+에 대하여 표면 염색하였다. 이러한 림프구를 후속적으로 고정하고/투과화하고, IFN-γ에 대하여 세포내 염색하였다. 세포를 LSRFortessa(BD)에서 분석하였다.
CAR T-세포의 분화 및 확장 능력의 분석
벌크 일차 인간 T-세포는, 이전에 기술된 바와 같이 항-CD3 및 항-CD28 단클론 항체로 코팅된 상자성 폴리스티렌 비드로 활성화시키고(문헌[Laport, G. G. et al. Blood 102, 2004-2013 (2003)]), GFP 공동발현을 갖는 스크램블드 대조군(Cellecta) 또는 TET2를 표적화하는 shRNA 헤어핀 서열 및 항-CD19BBζ CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. shRNA 형질도입 후 T-세포에서의 넉다운 효율은 TET2(어세이 Hs00325999_m1) 및 GAPDH(어세이 Hs03929097_g1)와, GUSB(Hs99999908_m1)(이는 로딩 및 정규화 대조군으로서의 역할을 함)에 대하여 Taqman gene expression assay(Applied Biosystems)를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 결정하였다. 14일의 배양 후, 이 세포의 분화 표현형을 유세포 분석법으로 결정하였다. GFP+ CAR+ T-세포를 FACSAria(BD)에서 분류하고, 음성 대조군으로서 메소텔린, 또는 CD196을 발현하도록 조작된 방사선 조사 K562 세포와 1:1로 조합하였다. CTL019 세포를 방사선 조사 K562 표적을 이용하여 총 3회 연속으로 재자극하였으며, 이때 절대 계수치 및 생존성 평가는 17일에 걸쳐 규칙적인 간격으로 취하였다. 세포의 계수치 및 생존성 측정치는 LUNA Automated Cell CounterLogos Biosystems)를 사용하여 얻었다. 집단 배가를 등식 At = A02 n 을 사용하여 계산하였으며, 여기서, n은 집단 배가의 수이며, A0은 입력 세포수이며, At는 총 세포수이다. 배양물 중 사이토카인 수준의 경시적 측정을 위하여 각각의 재자극 후 24시간에 상청액을 수집하였다.
세포내 사이토카인, 퍼포린 및 그랜자임 B의 분석.
환자 10으로부터의 CD8+ T-세포는, CD107a 단클론 항체 및 골지(Golgi) 억제자인 브레펠딘 A 및 모넨신의 존재 하에 6시간 동안, 항-CD3 및 항-CD28 단클론 항체로 코팅된 상자성 폴리스티렌 비드를 이용하여 3:1 자극하였다. 세포를 세척하고, 생세포/사세포 생존성에 대한 염료로 염색하고, 이어서 CD3, CD8 및 TCRVβ5.1+에 대하여 표면 염색하였다. 이러한 림프구를 후속적으로 고정하고/투과성으로 되게 하고, IFNγ에 대하여 세포내 염색하였다. 건강한 공여자로부터 생성한 CAR T-세포(TET2 넉다운 또는 대조군)는, CAR19에 대한 항-이디오타입 항체로 코팅된 비드 또는 CD3/CD28 비드를 이용하여 동일한 방식으로 자극하였다. 그 후 세포를 표면 마커(CD3, CD4, CD8 및 CAR19)에 대하여 염색하였다. 고정 및 투과화 후, IFNγ, TNFα 및 Il-2에 대한 세포내 염색을 수행하였다.
퍼포린 및 그랜자임 B 분석에 있어서, TET2 또는 스크램블드 대조 shRNA로 형질도입된 CTL019 세포를 14일 동안 확장시키고, 동결보존하였다. 그 후 이러한 CAR T-세포를 해동시키고, 4시간 동안 휴지시키고, 이어서 CD3, CD8과, CAR19에 대하여 생세포/사세포 및 표면 염색하였다. 퍼포린 및 그랜자임에 대한 세포내 염색은 고정 및 투과화 후에 실시하였다. 세포를 LSRFortessa(BD)에서 분석하였다.
세포독성 분석.
스크램블드 대조군 또는 TET2에 대하여 유도된 shRNA로 형질도입된 건강한 공여자 CTL019 세포를 CBG 루시퍼라아제-발현 NALM-6 및 OSU-CLL 세포주와 함께, 표시된 비로 16시간 동안 공동배양하였다. Bright-Glo Luciferase Assay System(Promega Corporation)을 사용하여 세포 추출물을 생성하고, 기질을 첨가하였다(제조업체의 지시에 따라). 루시퍼라아제 측정치를 SpectraMax luminescence microplate reader(Molecular Devices)에서 취하고, 비용해율(specific lysis)을 계산하였다.
T-세포 하위세트 중 Tet2 유전자 발현 수준의 분석.
Tet2 유전자 발현 수준은 3명의 상이한 건강한 인간 대상체로부터 단리한 CD8+ T-세포 하위세트(나이브, TN; 줄기 세포 기억, TSCM; 중심 기억, TCM; 및 이펙터 기억, TEM)에 대한 공개된 유전자 발현 데이터세트를 분석함으로써 결정하였다. RMA 방법을 이용하여 Bioconductor Oligo 소프트웨어 패키지(릴리스(release) 3.6, Bioconductor)를 이용하여 Genechip(Affymetrix) 데이터를 프로세싱하였다.
통계학적 분석
D'Agostino-Pearson 옴니버스 검정을 이용하여 모든 데이터에 대하여 정규성을 평가하였다. 샘플 크기가 너무 작아서 정규성을 적절하게 조사할 수 없을 경우, 비모수 통계를 이용하였다. 통합 부위 데이터 분석을 위하여, X2, Fisher의 정확 검정, 또는 베이지안(Bayesian) 모델 평균, 조건부 로짓 및 회귀의 조합을 이용하여 이전에 기술된 바와 같이 게놈 특징부 데이터 비교를 실시하였다(문헌[Berry, C. et al. PLoS Comput Biol 2, e157 (2006)]; 문헌[Brady, T. et al. Genes Dev 23, 633-642, (2009)]; 문헌[Berry, C. et al. PLoS Comput Biol 2, e157, (2006)]; 문헌[Ocwieja, K. E. et al. PLoS Pathog 7, e1001313, (2011)]). 양측 대응 스튜던트 t-검정을 이용하여 shRNA-매개 TET2 넉다운 실험에서의 T-세포 분화 표현형의 평가를 수행하였다. 12명의 정상 공여자에서, 양측 대응 스튜던트 t-검정을 이용하여 1.0(표준 편차의 단위)의 최소 효과 크기를 탐지함에 있어서 88%의 검정력이 달성된다. 각각의 데이터 군 내에서의 변동의 추정치는 도면에서 에러 바로 제시된다. SAS(SAS Institute Inc.), Stata 13.0(StataCorp) 또는 GraphPad Prism 6(GraphPad Software)을 이용하여 분석을 수행하였다. 모든 검정은 양측 검정이었다. 0.05 미만의 P 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
추가의 설명 없이, 당업자는 선행하는 상세한 설명 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 구체적으로 나타내며, 실시예는 나머지 개시 내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
등가물
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 발명은 특정한 양태와 관련하여 개시되지만, 본 기술 분야의 다른 통상의 기술자가 본 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 양태 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 이러한 양태 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
부록
[표 9]
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SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA <120> BIOMARKERS AND CAR T CELL THERAPIES WITH ENHANCED EFFICACY <130> N2067-7125WO <140> <141> <150> 62/621,356 <151> 2018-01-24 <150> 62/474,991 <151> 2017-03-22 <160> 1367 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960 tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020 cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080 tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140 agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60 ccc 63 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 5 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 6 <211> 230 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Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Met 225 230 <210> 7 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 7 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120 gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 8 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 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gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180 cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240 gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300 gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360 ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420 tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480 cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540 ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600 tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660 ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720 gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780 catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840 gaccatt 847 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 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gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 18 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 19 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 19 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 21 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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polypeptide" <400> 24 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val 145 150 <210> 25 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 25 cccggatggt ttctggactc tccggatcgc ccgtggaatc ccccaacctt ctcaccggca 60 ctcttggttg tgactgaggg cgataatgcg accttcacgt gctcgttctc caacacctcc 120 gaatcattcg tgctgaactg gtaccgcatg agcccgtcaa accagaccga caagctcgcc 180 gcgtttccgg aagatcggtc gcaaccggga caggattgtc ggttccgcgt gactcaactg 240 ccgaatggca gagacttcca catgagcgtg gtccgcgcta ggcgaaacga ctccgggacc 300 tacctgtgcg gagccatctc gctggcgcct aaggcccaaa tcaaagagag cttgagggcc 360 gaactgagag tgaccgagcg cagagctgag gtgccaactg cacatccatc cccatcgcct 420 cggcctgcgg ggcagtttca gaccctggtc 450 <210> 26 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 26 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro 20 25 30 Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly 35 40 45 Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu 65 70 75 80 Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe 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cgactccggg 360 acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg 420 gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg 480 cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg 540 actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct 600 gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg 660 gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc 720 aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa 780 accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc 840 gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac 900 cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg 960 cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg 1020 tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga 1080 gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag 1140 gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc 1182 <210> 28 <211> 40 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 32 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> /note="This sequence may encompass 50-2000 nucleotides" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 32 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 tgaaggagcc cagagagaga 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 66 gtaagccaag aaagaaatcc 20 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 67 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 68 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 68 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 69 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 71 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 72 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> /note="This sequence may encompass 1-6 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units" <400> 72 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 73 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 73 ugucgggucu uuaaaaauac 20 <210> 74 <211> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 79 gcaugcccuc ggugaaacag 20 <210> 80 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 80 ugagauuaaa gcgacagaaa 20 <210> 81 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 81 gagauuaaag cgacagaaaa 20 <210> 82 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 82 uaaagcgaca gaaaagggaa 20 <210> 83 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 83 agaaaaggga aaggagagcg 20 <210> 84 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 84 gaaaagggaa aggagagcgc 20 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Synthetic oligonucleotide" <400> 106 aguggcagcg gcgagagcuu 20 <210> 107 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 107 ggcagcggcg agagcuuggg 20 <210> 108 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 108 ccucgcgagc gccgcgcgcc 20 <210> 109 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 109 cucgcgagcg ccgcgcgccc 20 <210> 110 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 110 gcaagucacg uccgcccccu 20 <210> 111 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 111 ucacguccgc ccccucggcg 20 <210> 112 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 128 gcgcggcgcu cgcgaggagg 20 <210> 129 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 129 ggcgcgcggc gcucgcgagg 20 <210> 130 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 130 ccgggcgcgc ggcgcucgcg 20 <210> 131 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 gcgagcggga cccgggcgcg 20 <210> 132 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 cuugcaugcg agcgggaccc 20 <210> 133 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 133 acuugcaugc gagcgggacc 20 <210> 134 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 134 gacgugacuu gcaugcgagc 20 <210> 135 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 135 ggacgugacu ugcaugcgag 20 <210> 136 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 136 gggcggccgc gccgaggggg 20 <210> 137 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 137 ucggggcggc cgcgccgagg 20 <210> 138 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 138 cucggggcgg ccgcgccgag 20 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<400> 149 ccuccgcauc aauauucaua 20 <210> 150 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 150 ccuuucuaac aaauccuaaa 20 <210> 151 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 151 uccuuucuaa caaauccuaa 20 <210> 152 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 152 gcaauccagc aguugcaguc 20 <210> 153 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 153 agcaauccag caguugcagu 20 <210> 154 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 154 aaacucuguc uucucuaggc 20 <210> 155 <211> 20 <212> RNA <213> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 160 cagccaauag gacaugaucc 20 <210> 161 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 161 augauccagg aagagcagua 20 <210> 162 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 162 ugauccagga agagcaguaa 20 <210> 163 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 163 gcaguaaggg acugagcugc 20 <210> 164 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 164 cugagcugcu gguaagacag 20 <210> 165 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 165 gcaaguaaac 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oligonucleotide" <400> 176 cgaagcaagc cugauggaac 20 <210> 177 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 177 ggauagaacc aaccauguug 20 <210> 178 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 178 gauagaacca accauguuga 20 <210> 179 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 179 cauuugccag acagaaccuc 20 <210> 180 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 180 cuggcuacaa agcuccagaa 20 <210> 181 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 181 agagcucauc cagaaguaaa 20 <210> 182 <211> 20 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 203 agauucugaa ugagcaggag 20 <210> 204 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 204 cauuguauua cuuaaaaaca 20 <210> 205 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 205 aaggcagugc uaaugccuaa 20 <210> 206 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 206 uacaguuucu gccucuuccg 20 <210> 207 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 207 ucuuccgugg aacacacaca 20 <210> 208 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 208 acacacacau ggugaacucc 20 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Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 343 aauaaaccaa gcaauauucu 20 <210> 344 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 344 auaaaccaag caauauucug 20 <210> 345 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 345 uaaaccaagc aauauucugg 20 <210> 346 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 346 accaagcaau auucuggggg 20 <210> 347 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 347 ccaagcaaua uucugggggu 20 <210> 348 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 348 uucugggggu gggauagagc 20 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1224 cuguuuaagg gaaguccaca 20 <210> 1225 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1225 guagguguuu gccuguuuaa 20 <210> 1226 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1226 uguagguguu ugccuguuua 20 <210> 1227 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1227 cuguugcaca ccauaccugu 20 <210> 1228 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1228 uaguaagcaa aaauguauuu 20 <210> 1229 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1229 auuugaccaa uaaaacccaa 20 <210> 1230 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1230 uuuuggaaau guuugcaaau 20 <210> 1231 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1231 guaagcaaag caaacauuuu 20 <210> 1232 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1232 caaaaaacau uaaaaucaug 20 <210> 1233 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1233 auguuugggg cuagauauua 20 <210> 1234 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1234 auguaguaau caaauguuug 20 <210> 1235 <211> 20 <212> RNA <213> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1258 gccaagtcat tatttgacca tctcgagatg gtcaaataat gacttggctt ttttga 56 <210> 1259 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1259 cctcagagat attgtgggtt tctcgagaaa cccacaatat ctctgaggtt ttttga 56 <210> 1260 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1260 gggtaagcca agaaagaaac tcgagtttct ttcttggctt accctttttt ga 52 <210> 1261 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1261 gaagacgcac cgggggtaag ccaagaaaga aagttaatat tcatagcttt ctttcttggc 60 ttaccctttt ttgaattcgc accagcacgc tacgcaacac gtcaaccagt gtcagtgttt 120 cgccgt 126 <210> 1262 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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Synthetic oligonucleotide" <400> 1299 tgtgcagcaa gtagggaggc gacaccgaca agctcatctt t 41 <210> 1300 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1300 tgcctcgtgg gtgcgaacag agatgacaag atcatcttt 39 <210> 1301 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1301 gcgccagcag cttggacggt tcgggacagg gatcggacta tggcta 46 <210> 1302 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1302 aagcaagcct gatggaacag actaagtcca ttcctgatac catcacctcc c 51 <210> 1303 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1303 aagcaagcct gatggaacag gatagaacca acagactaag tccattcctg ataccatcac 60 ctccc 65 <210> 1304 <211> 78 <212> 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tgccctgcat ctccaaaaca aggagaatga catgctttcc cacacagcta atgggttatc 5880 aaagatgctt ccagctctta accatgatag aactgcttgt gtccaaggag gcttacacaa 5940 attaagtgat gctaatggtc aggaaaagca gccattggca ctagtccagg gtgtggcttc 6000 tggtgcagag gacaacgatg aggtctggtc agacagcgag cagagctttc tggatcctga 6060 cattggggga gtggccgtgg ctccaactca tgggtcaatt ctcattgagt gtgcaaagcg 6120 tgagctgcat gccacaaccc ctttaaagaa tcccaatagg aatcacccca ccaggatctc 6180 cctcgtcttt taccagcata agagcatgaa tgagccaaaa catggcttgg ctctttggga 6240 agccaaaatg gctgaaaaag cccgtgagaa agaggaagag tgtgaaaagt atggcccaga 6300 ctatgtgcct cagaaatccc atggcaaaaa agtgaaacgg gagcctgctg agccacatga 6360 aacttcagag cccacttacc tgcgtttcat caagtctctt gccgaaagga ccatgtccgt 6420 gaccacagac tccacagtaa ctacatctcc atatgccttc actcgggtca cagggcctta 6480 caacagatat atatgatatc accccctttt gttggttacc tcacttgaaa agaccacaac 6540 caacctgtca gtagtatagt tctcatgacg tgggcagtgg ggaaaggtca cagtattcat 6600 gacaaatgtg gtgggaaaaa cctcagctca ccagcaacaa aagaggttat cttaccatag 6660 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gaaaagaacc 8280 actgaattaa attcacctag tgttgcaaat gagtacttat ctctaagttt tcttttacca 8340 taaaaagaga gcaagtgtga tatgttgaat agaaagagaa acatactatt tacagctgcc 8400 tttttttttt tttttcgcta tcaatcacag gtatacaagt acttgccttt actcctgcat 8460 gtagaagact cttatgagcg agataatgca gagaaggcct ttcatataaa tttatacagc 8520 tctgagctgt tcttcttcta gggtgccttt tcattaagag gtaggcagta ttattattaa 8580 agtacttagg atacattggg gcagctagga catattcagt atcattcttg ctccatttcc 8640 aaattattca tttctaaatt agcatgtaga agttcactaa ataatcatct agtggcctgg 8700 cagaaatagt gaatttccct aagtgccttt tttttgttgt ttttttgttt tgttttttaa 8760 acaagcagta ggtggtgctt tggtcataag ggaagatata gtctatttct aggactattc 8820 catattttcc atgtggctgg atactaacta tttgccagcc tccttttcta aattgtgaga 8880 cattcttgga ggaacagttc taactaaaat ctattatgac tccccaagtt ttaaaatagc 8940 taaatttagt aagggaaaaa atagtttatg ttttagaaga ctgaacttag caaactaacc 9000 tgaattttgt gctttgtgaa attttatatc gaaatgagct ttcccatttt cacccacatg 9060 taatttacaa aatagttcat tacaattatc tgtacatttt gatattgagg aaaaacaagg 9120 cttaaaaacc attatccagt ttgcttggcg tagacctgtt taaaaaataa taaaccgttc 9180 atttctcagg atgtggtcat agaataaagt tatgctcaaa tgttcaaata tttaaa 9236 <210> 1362 <211> 5969 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1362 tcaggctcta cttctaattc tggttctctt gctacatctc cctcatctgc agtgacctct 60 ccacggaagt cttgaactcc tcaaaagcaa attattgaaa aagatgaagg tcctttttat 120 acccatctag gagcaggtcc taatgtggca gctattagag aaatcatgga agaaaggttt 180 ggacagaagg gtaaagctat taggattgaa agagtcatct atactggtaa agaaggcaaa 240 agttctcagg gatgtcctat tgctaagtgg gtggttcgca gaagcagcag tgaagagaag 300 ctactgtgtt tggtgcggga gcgagctggc cacacctgtg aggctgcagt gattgtgatt 360 ctcatcctgg tgtgggaagg aatcccgctg tctctggctg acaaactcta ctcggagctt 420 accgagacgc tgaggaaata cggcacgctc accaatcgcc ggtgtgcctt gaatgaagag 480 agaacttgcg cctgtcaggg gctggatcca gaaacctgtg gtgcctcctt ctcttttggt 540 tgttcatgga gcatgtacta caatggatgt aagtttgcca gaagcaagat cccaaggaag 600 tttaagctgc ttggggatga cccaaaagag gaagagaaac tggagtctca tttgcaaaac 660 ctgtccactc 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gaacccttac cctgggcttt tgaatcagaa tacccaatat 1560 ccatcatatc aatgcaatgg aaacctatca gtggacaact gctccccata tctgggttcc 1620 tattctcccc agtctcagcc gatggatctg tataggtatc caagccaaga ccctctgtct 1680 aagctcagtc taccacccat ccatacactt taccagccaa ggtttggaaa tagccagagt 1740 tttacatcta aatacttagg ttatggaaac caaaatatgc agggagatgg tttcagcagt 1800 tgtaccatta gaccaaatgt acatcatgta gggaaattgc ctccttatcc cactcatgag 1860 atggatggcc acttcatggg agccacctct agattaccac ccaatctgag caatccaaac 1920 atggactata aaaatggtga acatcattca ccttctcaca taatccataa ctacagtgca 1980 gctccgggca tgttcaacag ctctcttcat gccctgcatc tccaaaacaa ggagaatgac 2040 atgctttccc acacagctaa tgggttatca aagatgcttc cagctcttaa ccatgataga 2100 actgcttgtg tccaaggagg cttacacaaa ttaagtgatg ctaatggtca ggaaaagcag 2160 ccattggcac tagtccaggg tgtggcttct ggtgcagagg acaacgatga ggtctggtca 2220 gacagcgagc agagctttct ggatcctgac attgggggag tggccgtggc tccaactcat 2280 gggtcaattc tcattgagtg tgcaaagcgt gagctgcatg ccacaacccc tttaaagaat 2340 cccaatagga atcaccccac caggatctcc ctcgtctttt accagcataa gagcatgaat 2400 gagccaaaac atggcttggc tctttgggaa gccaaaatgg ctgaaaaagc ccgtgagaaa 2460 gaggaagagt gtgaaaagta tggcccagac tatgtgcctc agaaatccca tggcaaaaaa 2520 gtgaaacggg agcctgctga gccacatgaa acttcagagc ccacttacct gcgtttcatc 2580 aagtctcttg ccgaaaggac catgtccgtg accacagact ccacagtaac tacatctcca 2640 tatgccttca ctcgggtcac agggccttac aacagatata tatgatatca cccccttttg 2700 ttggttacct cacttgaaaa gaccacaacc aacctgtcag tagtatagtt ctcatgacgt 2760 gggcagtggg gaaaggtcac agtattcatg acaaatgtgg tgggaaaaac ctcagctcac 2820 cagcaacaaa agaggttatc ttaccatagc acttaatttt cactggctcc caagtggtca 2880 cagatggcat ctaggaaaag accaaagcat tctatgcaaa aagaaggtgg ggaagaaagt 2940 gttccgcaat ttacattttt aaacactggt tctattattg gacgagatga tatgtaaatg 3000 tgatcccccc cccccgctta caactctaca catctgtgac cacttttaat aatatcaagt 3060 ttgcatagtc atggaacaca aatcaaacaa gtactgtagt attacagtga caggaatctt 3120 aaaataccat ctggtgctga atatatgatg tactgaaata ctggaattat ggctttttga 3180 aatgcagttt ttactgtaat cttaactttt atttatcaaa atagctacag gaaacatgaa 3240 tagcaggaaa acactgaatt tgtttggatg ttctaagaaa tggtgctaag aaaatggtgt 3300 ctttaatagc taaaaattta atgcctttat atcatcaaga tgctatcagt gtactccagt 3360 gcccttgaat aataggggta ccttttcatt caagttttta tcataattac ctattcttac 3420 acaagcttag tttttaaaat gtggacattt taaaggcctc tggattttgc tcatccagtg 3480 aagtccttgt aggacaataa acgtatatat gtacatatat acacaaacat gtatatgtgc 3540 acacacatgt atatgtataa atattttaaa tggtgtttta gaagcacttt gtctacctaa 3600 gctttgacaa cttgaacaat gctaaggtac tgagatgttt aaaaaacaag tttactttca 3660 ttttagaatg caaagttgat ttttttaagg aaacaaagaa agcttttaaa atatttttgc 3720 ttttagccat gcatctgctg atgagcaatt gtgtccattt ttaacacagc cagttaaatc 3780 caccatgggg cttactggat tcaagggaat acgttagtcc acaaaacatg ttttctggtg 3840 ctcatctcac atgctatact gtaaaacagt tttatacaaa attgtatgac aagttcattg 3900 ctcaaaaatg tacagtttta agaattttct attaactgca ggtaataatt agctgcatgc 3960 tgcagactca acaaagctag ttcactgaag cctatgctat tttatggatc ataggctctt 4020 cagagaactg aatggcagtc tgcctttgtg ttgataatta tgtacattgt gacgttgtca 4080 tttcttagct taagtgtcct ctttaacaag aggattgagc agactgatgc ctgcataaga 4140 tgaataaaca gggttagttc catgtgaatc tgtcagttaa aaagaaacaa aaacaggcag 4200 ctggtttgct gtggtggttt taaatcatta atttgtataa agaagtgaaa gagttgtata 4260 gtaaattaaa ttgtaaacaa aactttttta atgcaatgct ttagtatttt agtactgtaa 4320 aaaaattaaa tatatacata tatatatata tatatatata tatatatatg agtttgaagc 4380 agaattcaca tcatgatggt gctactcagc ctgctacaaa tatatcataa tgtgagctaa 4440 gaattcatta aatgtttgag tgatgttcct acttgtcata tacctcaaca ctagtttggc 4500 aataggatat tgaactgaga gtgaaagcat tgtgtaccat catttttttc caagtccttt 4560 tttttattgt taaaaaaaaa agcatacctt ttttcaatac ttgatttctt agcaagtata 4620 acttgaactt caaccttttt gttctaaaaa ttcagggata tttcagctca tgctctccct 4680 atgccaacat gtcacctgtg tttatgtaaa attgttgtag gttaataaat atattctttg 4740 tcagggattt aaccctttta ttttgaatcc cttctatttt acttgtacat gtgctgatgt 4800 aactaaaact aattttgtaa atctgttggc tctttttatt gtaaagaaaa gcattttaaa 4860 agtttgagga atcttttgac 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gtgtaggaaa cttttgcagt ttgacactaa gataacttct 5760 gtgtgcattt ttctatgctt ttttaaaaac tagtttcatt tcattttcat gagatgtttg 5820 gtttataaga tctgaggatg gttataaata ctgtaagtat tgtaatgtta tgaatgcagg 5880 ttatttgaaa gctgtttatt attatatcat tcctgataat gctatgtgag tgtttttaat 5940 aaaatttata tttatttaat gcactctaa 5969 <210> 1363 <211> 4594 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1363 gtagagaagc agaaggaagc aagatggctg ccctttagga tttgttagaa aggagacccg 60 actgcaactg ctggattgct gcaaggctga gggacgagaa cgaggctggc aaacattcag 120 cagcacaccc tctcaagatt gtttacttgc ctttgctcct gttgagttac aacgcttgga 180 agcaggagat gggctcagca gcagccaata ggacatgatc caggaagagc agtaagggac 240 tgagctgctg aattcaacta gagggcagcc ttgtggatgg ccccgaagca agcctgatgg 300 aacaggatag aaccaaccat gttgagggca acagactaag tccattcctg ataccatcac 360 ctcccatttg ccagacagaa cctctggcta caaagctcca gaatggaagc ccactgcctg 420 agagagctca tccagaagta aatggagaca ccaagtggca ctctttcaaa agttattatg 480 gaataccctg tatgaaggga agccagaata gtcgtgtgag tcctgacttt acacaagaaa 540 gtagagggta ttccaagtgt ttgcaaaatg gaggaataaa acgcacagtt agtgaacctt 600 ctctctctgg gctccttcag atcaagaaat tgaaacaaga ccaaaaggct aatggagaaa 660 gacgtaactt cggggtaagc caagaaagaa atccaggtga aagcagtcaa ccaaatgtct 720 ccgatttgag tgataagaaa gaatctgtga gttctgtagc ccaagaaaat gcagttaaag 780 atttcaccag tttttcaaca cataactgca gtgggcctga aaatccagag cttcagattc 840 tgaatgagca ggaggggaaa agtgctaatt accatgacaa gaacattgta ttacttaaaa 900 acaaggcagt gctaatgcct aatggtgcta cagtttctgc ctcttccgtg gaacacacac 960 atggtgaact cctggaaaaa acactgtctc aatattatcc agattgtgtt tccattgcgg 1020 tgcagaaaac cacatctcac ataaatgcca ttaacagtca ggctactaat gagttgtcct 1080 gtgagatcac tcacccatcg catacctcag ggcagatcaa ttccgcacag acctctaact 1140 ctgagctgcc tccaaagcca gctgcagtgg tgagtgaggc ctgtgatgct gatgatgctg 1200 ataatgccag taaactagct gcaatgctaa atacctgttc ctttcagaaa ccagaacaac 1260 tacaacaaca aaaatcagtt tttgagatat gcccatctcc tgcagaaaat aacatccagg 1320 gaaccacaaa gctagcgtct ggtgaagaat tctgttcagg ttccagcagc aatttgcaag 1380 ctcctggtgg cagctctgaa cggtatttaa aacaaaatga aatgaatggt gcttacttca 1440 agcaaagctc agtgttcact aaggattcct tttctgccac taccacacca ccaccaccat 1500 cacaattgct tctttctccc cctcctcctc ttccacaggt tcctcagctt ccttcagaag 1560 gaaaaagcac tctgaatggt ggagttttag aagaacacca ccactacccc aaccaaagta 1620 acacaacact tttaagggaa gtgaaaatag agggtaaacc tgaggcacca ccttcccaga 1680 gtcctaatcc atctacacat gtatgcagcc cttctccgat gctttctgaa aggcctcaga 1740 ataattgtgt gaacaggaat gacatacaga ctgcagggac aatgactgtt ccattgtgtt 1800 ctgagaaaac aagaccaatg tcagaacacc tcaagcataa cccaccaatt tttggtagca 1860 gtggagagct acaggacaac tgccagcagt tgatgagaaa caaagagcaa gagattctga 1920 agggtcgaga caaggagcaa acacgagatc ttgtgccccc aacacagcac tatctgaaac 1980 caggatggat tgaattgaag gcccctcgtt ttcaccaagc ggaatcccat ctaaaacgta 2040 atgaggcatc actgccatca attcttcagt atcaacccaa tctctccaat caaatgacct 2100 ccaaacaata cactggaaat tccaacatgc ctggggggct cccaaggcaa gcttacaccc 2160 agaaaacaac acagctggag cacaagtcac aaatgtacca agttgaaatg aatcaagggc 2220 agtcccaagg tacagtggac 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cctgtgcctg accagggagg aagtcacact cagacccctc 3120 cccagaagga cactcaaaag catgctgctc taaggtggca tctcttacag aagcaagaac 3180 agcagcaaac acagcaaccc caaactgagt cttgccatag tcagatgcac aggccaatta 3240 aggtggaacc tggatgcaag ccacatgcct gtatgcacac agcaccacca gaaaacaaaa 3300 catggaaaaa ggtaactaag caagagaatc cacctgcaag ctgtgataat gtgcagcaaa 3360 agagcatcat tgagaccatg gagcagcatc tgaagcagtt tcacgccaag tcgttatttg 3420 accataaggc tcttactctc aaatcacaga agcaagtaaa agttgaaatg tcagggccag 3480 tcacagtttt gactagacaa accactgctg cagaacttga tagccacacc ccagctttag 3540 agcagcaaac aacttcttca gaaaagacac caaccaaaag aacagctgct tctgttctca 3600 ataattttat agagtcacct tccaaattac tagatactcc tataaaaaat ttattggata 3660 cacctgtcaa gactcaatat gatttcccat cttgcagatg tgtagagcaa attattgaaa 3720 aagatgaagg tcctttttat acccatctag gagcaggtcc taatgtggca gctattagag 3780 aaatcatgga agaaaggtat acaagtactt gcctttactc ctgcatgtag aagactctta 3840 tgagcgagat aatgcagaga aggcctttca tataaattta tacagctctg agctgttctt 3900 cttctagggt gccttttcat 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Claims (147)

  1. 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, 세포 집단), 예를 들어, 면역 이펙터 세포로서,
    CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하며,
    세포는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 변경된 발현 및/또는 기능을 갖는, 세포.
  2. 제1항에 있어서, Tet2-관련 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Tet2-관련 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Tet2-관련 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능, 및 제2 Tet2-관련 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 추가로 갖는 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개의, 또는 전부의) 유전자를 포함하는, 세포.
  7. 제6항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개의, 또는 전부의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 표 8로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함하는, 세포.
  9. 제8항에 있어서, 표 8, 컬럼 B로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 표 8, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함하는, 세포.
  12. 제11항에 있어서, 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 표 9, 컬럼 D로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 경로(예를 들어, 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 경로)에서의 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자를 포함하는, 세포.
  15. 제14항에 있어서, 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 감소되거나 제거된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 표 9, 컬럼 A로부터 선택되는 하나 이상의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의) 유전자의 증가되거나 활성화된 발현 및/또는 기능을 갖는 세포.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 경로는 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 전부)으로부터 선택되는, 세포:
    (1) 백혈구 분화 경로;
    (2) 면역계 과정의 양성 조절 경로;
    (3) 막관통 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호전달 경로;
    (4) 해부 구조 형태 형성의 조절 경로;
    (5) NFKB를 통한 TNFA 신호전달 경로;
    (6) 히드롤라아제 활성의 양성 조절 경로;
    (7) 창상 치유 경로;
    (8) 알파-베타 T 세포 활성화 경로;
    (9) 세포 구성요소 이동 조절 경로;
    (10) 염증 반응 경로;
    (11) 골수성 세포 분화 경로;
    (12) 사이토카인 생성 경로;
    (13) UV 반응 하향조절 경로;
    (14) 다세포 유기체 과정의 음성 조절의 경로;
    (15) 혈관 형태 형성 경로;
    (16) NFAT-의존성 전사 경로;
    (17) 아폽토시스 과정의 양성 조절의 경로;
    (18) 저산소증 경로;
    (19) KRAS 신호전달에 의한 상향조절의 경로; 또는
    (20) 스트레스-활성화 단백질 키나아제 신호전달 캐스케이드 경로.
  18. 제17항에 있어서, 백혈구 분화 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제1열로부터 선택되는, 세포.
  19. 제17항에 있어서, 면역계 과정의 양성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제56열로부터 선택되는, 세포.
  20. 제17항에 있어서, 막관통 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호전달 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제85열로부터 선택되는, 세포.
  21. 제17항에 있어서, 해부 구조 형태 형성의 조절 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제128열로부터 선택되는, 세포.
  22. 제17항에 있어서, NFKB를 통한 TNFA 신호전달 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제134열로부터 선택되는, 세포.
  23. 제17항에 있어서, 히드롤라아제 활성의 양성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제137열로부터 선택되는, 세포.
  24. 제17항에 있어서, 창상 치유 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제141열로부터 선택되는, 세포.
  25. 제17항에 있어서, 알파-베타 T 세포 활성화 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제149열로부터 선택되는, 세포.
  26. 제17항에 있어서, 세포 구성요소 이동 조절 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제180열로부터 선택되는, 세포.
  27. 제17항에 있어서, 염증 반응 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제197열로부터 선택되는, 세포.
  28. 제17항에 있어서, 골수성 세포 분화 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제206열로부터 선택되는, 세포.
  29. 제17항에 있어서, 사이토카인 생성 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제221열로부터 선택되는, 세포.
  30. 제17항에 있어서, UV 반응 하향조절 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제233열로부터 선택되는, 세포.
  31. 제17항에 있어서, 다세포 유기체 과정의 음성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제235열로부터 선택되는, 세포.
  32. 제17항에 있어서, 혈관 형태 형성 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제237열로부터 선택되는, 세포.
  33. 제17항에 있어서, NFAT-의존성 전사 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제243열로부터 선택되는, 세포.
  34. 제17항에 있어서, 아폽토시스 과정의 양성 조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제250열로부터 선택되는, 세포.
  35. 제17항에 있어서, 저산소증 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제256열로부터 선택되는, 세포.
  36. 제17항에 있어서, KRAS 신호전달에 의한 상향조절의 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제258열로부터 선택되는, 세포.
  37. 제17항에 있어서, 스트레스-활성화 단백질 키나아제 신호전달 캐스케이드 경로와 관련된 상기 하나 이상의 유전자는 표 9, 제260열로부터 선택되는, 세포.
  38. 제1항 또는 제2항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 중심 기억 표현형과 관련된 유전자(예를 들어, 하나 이상의 유전자)를 포함하는, 세포.
  39. 제38항에 있어서, 중심 기억 표현형은 중심 기억 T 세포 표현형인, 세포.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 중심 기억 표현형은 나이브(
    Figure pct00208
    ) 세포(예를 들어, 나이브 T 세포)에서의 CCR7 및/또는 CD45RO의 발현 수준과 비교하여 CCR7 및/또는 CD45RO의 더 높은 발현 수준을 포함하는, 세포.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 기억 표현형은 나이브 세포(예를 들어, 나이브 T 세포)에서의 CD45RA의 발현 수준과 비교하여 CD45RA의 더 낮은 발현 수준을 포함하는, 세포.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 기억 표현형은 세포의 증진된 항원-의존성 증식을 포함하는, 세포.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 중심 기억 표현형은, 예를 들어, 세포가 항-CD3 또는 항-CD28 항체로 활성화될 때, IFN-γ 및/또는 CD107a의 감소된 발현 수준을 포함하는, 세포.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2-관련 유전자의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 포함하는 세포.
  45. 제41항에 있어서, 상기 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)는 (1) Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) 상기 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 핵산; 또는 (3) 이들의 조합인, 세포.
  46. 제45항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템, 및 메가뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 초기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합하는, 세포.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 엑손 4의 상류에, 예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 또는 엑손 3 내에 있는, 세포.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 후기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합하는, 세포.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 끝에서 네 번째의 엑손의 하류에 있는, 예를 들어, 끝에서 세 번째의 엑손, 끝에서 두 번째의 엑손, 또는 마지막 엑손 내에 있는, 세포.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 Tet2-관련 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템인, 세포.
  52. 제44항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 Tet2-관련 유전자에 특이적인 siRNA 또는 shRNA, 또는 상기 siRNA 또는 shRNA를 코딩하는 핵산인, 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 Tet2-관련 유전자의 mRNA의 서열에 대하여 상보성인 서열을 포함하는, 세포.
  54. 제44항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)는 소분자인, 세포.
  55. 제44항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)는 단백질인, 세포.
  56. 제55항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브 결합 파트너, 또는 상기 우성적 네거티브 결합 파트너를 코딩하는 핵산인, 세포.
  57. 제55항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브(예를 들어, 촉매적 불활성) 변이체, 또는 상기 우성적 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산인, 세포.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Tet2-관련 유전자의 억제자 및 제2 Tet2-관련 유전자의 활성자를 포함하는 세포.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2의 억제자를 추가로 포함하는 세포.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원에 결합하는, 세포: TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린(Mesothelin), IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스Y(LewisY), CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타아제(Prostase), PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H(GloboH), NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, MAGE-A1, 레구마인(legumain), HPV E6,E7, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인(prostein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라아제, PCTA-1/갈렉틴(Galectin) 8, 멜란A(MelanA)/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린(Cyclin) B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2, 장 카르복실 에스테라아제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, 및 IGLL1.
  61. 제60항에 있어서, 종양 항원은 CD19인, 세포.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 예를 들어 국제 공개 제2012/079000호 또는 국제 공개 제2014/153270호에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 단편인, 세포.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은
    서열 번호 12의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개 이상이자 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열에 대하여 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는 서열 번호 12의 서열을 포함하는, 세포.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결되며, 여기서, 상기 힌지 영역은 서열 번호 2 또는 서열 번호 6, 또는 이와의 동일성이 95 내지 99%인 서열을 포함하는, 세포.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인 및/또는 공동자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, 공통 FcR 감마(FCER1G), FcR 베타(Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, 또는 DAP12로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, 세포.
  66. 제65항에 있어서, 일차 신호전달 도메인은 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개 이상이자 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열에 대하여 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열; 또는 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 세포.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인, 또는 일차 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서, 공동자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일(Tactile)), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, 세포.
  68. 제67항에 있어서, 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개 이상이자 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열에 대하여 95 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 세포.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 서열을 포함하는, 세포.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 도메인은 서열 번호 14 또는 서열 번호 16의 서열, 및 서열 번호 18 또는 서열 번호 20의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 구성하는 서열은 동일한 프레임 내에서 그리고 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는, 세포.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2의 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함하는 세포.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 이펙터 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포 집단)인 세포.
  73. 제72항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 세포.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 T 세포인, 세포.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합인, 세포.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자를 포함하는 세포.
  78. 제77항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 (1) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) 상기 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 핵산; 또는 (3) 이들의 조합인, 세포.
  79. 제78항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템, 및 메가뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 초기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합하는, 세포.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 엑손 4의 상류에, 예를 들어, 엑손1, 엑손2, 또는 엑손3 내에, 예를 들어 엑손 3 내에 있는, 세포.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 후기 엑손 또는 인트론 내의 표적 서열에 결합하는, 세포.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 표적 서열에 결합하며, 표적 서열은 끝에서 네 번째의 엑손의 하류에 있는, 예를 들어, 끝에서 세 번째의 엑손, 끝에서 두 번째의 엑손, 또는 마지막 엑손 내에 있는, 세포.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템은 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 표적 서열에 혼성화되는 표적화 서열을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템인, 세포.
  85. 제84항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1에 특이적인 siRNA 또는 shRNA, 또는 상기 siRNA 또는 shRNA를 코딩하는 핵산인, 세포.
  86. 제85항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 mRNA의 서열에 대하여 상보성인 서열을 포함하는, 서열.
  87. 제77항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 소분자인, 세포.
  88. 제77항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 단백질이며, 예를 들어, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브 결합 파트너, 또는 상기 우성적 네거티브 결합 파트너를 코딩하는 핵산인, 세포.
  89. 제77항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자는 단백질이며, 예를 들어, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 우성적 네거티브(예를 들어, 촉매적 불활성) 변이체, 또는 상기 우성적 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산인, 세포.
  90. CAR-발현 세포, 예를 들어, 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019 또는 CTL119)의 치료 효능을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포에서 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키거나 증가시키는) 단계를 포함하고, 여기서, Tet2-관련 유전자는 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부)으로부터 선택되는, 방법:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  91. 제90항 또는 제91항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키는) 단계를 포함하는 방법.
  92. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, Tet2의 발현 및/또는 기능을 변경시키는(예를 들어, 감소시키는) 단계를 추가로 포함하는 방법.
  93. CAR-발현 세포, 예를 들어, 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항의 세포, 예를 들어, CAR19-발현 세포(예를 들어, CTL019 또는 CTL119)의 치료 효능을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포를 다음 중에서(예를 들어 2가지, 3가지, 4가지 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  94. 제93항에 있어서, 상기 단계는 상기 세포를 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 억제자는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: (1) Tet2-관련 유전자, 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) Tet2-관련 유전자의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어, 우성적 네거티브, 예를 들어, 촉매적 불활성), 또는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 결합 파트너; (4) Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능을 억제하는 소분자; (5) (1)~(3) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산; 및 (6) (1)~(5)의 임의의 조합.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 Tet2의 억제자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 생체 외에서 일어나는, 방법.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 생체 내에서 일어나는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 접촉은 CAR 코딩 핵산의 세포 내로의 전달 전에 생체 내에서 일어나는, 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 접촉은 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 후 생체 내에서 일어나는, 방법.
  101. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 대상체에게 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부)으로부터 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 대상체에게 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  105. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 세포로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 세포.
  106. 제105항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에게 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 세포:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에게 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 세포.
  108. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 세포.
  109. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 CAR-발현 세포 요법제로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 CAR-발현 세포 요법제 및 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 포함하는, CAR-발현 세포 요법제:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  110. 제109항에 있어서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자인, CAR-발현 세포 요법제.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, CAR-발현 세포 요법제.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법제의 시작 전에 조정자(예를 들어, 억제자)의 전처치를 받는, CAR-발현 세포 요법제.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 조정자(예를 들어, 억제자) 및 CAR 발현 세포 요법제를 이용한 병행 치료를 받는, CAR-발현 세포 요법제.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법제 후에 조정자(예를 들어, 억제자)를 이용한 치료를 받는, CAR-발현 세포 요법제.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 종양 항원의 발현과 관련된 질환, 예를 들어, 증식성 질환, 전암성 병태, 암, 및 종양 항원의 발현과 관련된 비-암 관련 징후를 갖는, CAR-발현 세포 요법제.
  116. 제115항에 있어서, 암은 혈액암 또는 고형 종양인, CAR-발현 세포 요법제.
  117. 제115항 또는 제116항에 있어서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병(ALL), B-세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 또는 전백혈병 중 하나 이상으로부터 선택되는 혈액암인, CAR-발현 세포 요법제.
  118. 제115항 또는 제116항에 있어서, 암은 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 비소세포 폐암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유발된 암, 상기 암들의 조합, 및 상기 암들의 전이성 병변으로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR-발현 세포 요법제.
  119. 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자
    (여기서, 상기 대상체는 CAR-발현 세포를 포함하는 요법제를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 함).
  120. 제119항에 있어서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자인, 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 대상체에게 Tet2의 억제자를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  122. 대상체의 치료에 사용하기 위한 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)로서,
    Tet2-관련 유전자는 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는, 조정자:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자
    (여기서, 상기 대상체는 CAR-발현 세포를 포함하는 요법제를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 함).
  123. 제122항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자인 조정자.
  124. 제122항 또는 제123항에 있어서, 대상체는 Tet2의 억제자를 받았거나, 받고 있거나, 곧 받으려고 하는, 조정자.
  125. CAR-발현 세포를 제조하는 방법으로서, CAR 코딩 핵산(또는 이의 CAR-코딩 부분)이 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자) 내의(예를 들어, Tet2-관련 유전자의 인트론 또는 엑손 내의) 세포 게놈 내로 통합되도록 CAR 코딩 핵산을 세포 내로 도입하여서, Tet2-관련 유전자의 발현 및/또는 기능이 변경되도록(예를 들어, 감소되거나 제거되도록) 하는 단계를 포함하고,
    Tet2-관련 유전자는 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는, 방법:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  126. 제125항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1으로부터 선택되는, 방법.
  127. CAR-발현 세포를 제조하는 방법으로서, 생체 외에서 상기 CAR-발현 세포를 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  128. 제127항에 있어서, Tet2-관련 유전자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1으로부터 선택되는, 방법.
  129. CAR을 코딩하는 서열, 및 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  130. 제129항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 (1) 유전자, 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) Tet2-관련 유전자의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어, 우성적 네거티브, 예를 들어, 촉매적 불활성), 또는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 결합 파트너; 및 (4) (1)~(3) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합인, 벡터.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자인, 벡터.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, CAR을 코딩하는 서열과 상기 억제자를 코딩하는 서열은 2A 부위에 의해 분리된, 벡터.
  133. Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자) 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 유전자 편집 시스템으로서, Tet2-관련 유전자는 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는, 유전자 편집 시스템:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  134. 제133항에 있어서, IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 유전자의 서열에 특이적인 유전자 편집 시스템.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템, 또는 메가뉴클레아제 시스템인 유전자 편집 시스템.
  136. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템인 유전자 편집 시스템.
  137. 제136항에 있어서,
    Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질을 포함하는 gRNA 분자;
    Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 gRNA 분자;
    Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질을 포함하는 gRNA 분자를 코딩하는 핵산; 또는
    Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소의 서열에 특이적인 표적화 서열, 및 Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 gRNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 편집 시스템.
  138. 제133항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 DNA를 추가로 포함하는 유전자 편집 시스템.
  139. 제138항에 있어서, 주형 DNA는 CAR, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 편집 시스템.
  140. CAR-발현 세포의 생체 외 제조를 위한 조성물로서, 다음 중에서(예를 들어, 2가지, 3가지, 4가지, 또는 전부 중에서) 선택되는 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 조정자(예를 들어, 억제자 또는 활성자)를 포함하는, 조성물:
    (i) IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1 중 하나 이상;
    (ii) 표 8에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iii) 표 9, 컬럼 D에 열거된 하나 이상의 유전자;
    (iv) 표 9, 컬럼 A에 열거된 하나 이상의 경로와 관련된 하나 이상의 유전자; 또는
    (v) 중심 기억 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자.
  141. 제140항에 있어서, 조정자는 IFNG, NOTCH2, CD28, ICOS, IL2RA, 또는 PRDM1의 억제자인, 조성물.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 조정자(예를 들어, 억제자)는 (1) Tet2-관련 유전자 또는 이의 조절 요소 내의 하나 이상의 부위에 표적화된 유전자 편집 시스템; (2) Tet2-관련 유전자의 발현을 억제하는 핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA); (3) 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어, 우성적 네거티브, 예를 들어, 촉매적 불활성), 또는 Tet2-관련 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 결합 파트너; 또는 (4) (1)~(3) 중 임의의 것을 코딩하는 핵산, 또는 이들의 조합인, 조성물.
  143. 142항에 있어서, Tet2의 억제자를 추가로 포함하는 조성물.
  144. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 세포를 하나 이상 포함하는 세포 집단으로서, 세포에서 Tet2-관련 유전자(예를 들어, 하나 이상의 Tet2-관련 유전자)의 발현 및/또는 기능이 감소되거나 제거된 하나 이상의 상기 세포를 포함하지 않는 세포 집단보다 더 큰(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 큰) 백분율의 Tscm 세포(예를 들어, CD45RA+CD62L+CCR7+ (선택적으로 CD27+CD95+) T 세포)를 포함하는, 세포 집단.
  145. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 세포를 하나 이상 포함하는 세포 집단으로서, 세포 집단의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%)는 중심 기억 T 세포 표현형을 갖는, 세포 집단.
  146. 제145항에 있어서, 중심 기억 세포 표현형은 중심 기억 T 세포 표현형인, 세포 집단.
  147. 제145항 또는 제146항에 있어서, 세포 집단의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%)는 CD45RO 및/또는 CCR7을 발현하는, 세포 집단.
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