KR20220005050A - Tet2 조작된 t 세포 요법을 사용한 암의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Tet2 조작된 t 세포 요법을 사용한 암의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TET2 유전자의 발현의 넉아웃을 갖는 네오TCR 기반 세포 요법을 포함하는 조성물 및 이를 사용한 암의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

TET2 조작된 T 세포 요법을 사용한 암의 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/841,748, 및 2019년 5월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/841,753에 대해 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 그 전문이 포함되고, 그에 대한 우선권이 주장된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2020년 4월 30일에 생성된 상기 ASCII 사본은 087520_0146_SL.txt로 명명되고, 13,867 바이트의 크기이다.
Tet 메틸시토신 디옥시게나제 2 (TET2)는 메틸시토신의 5-히드록시메틸시토신으로의 전환을 촉매하는 단백질 메틸시토신 디옥시게나제를 코딩하는 유전자이다. 코딩된 단백질은 골수혈구형성에 수반되는 것으로 보이며, 이 유전자의 결함은 몇몇 골수증식성 장애와 연관되었다. 그러나, 단백질의 정확한 기능은 미공지되어 있다.
TET2 유전자는 세포유전학적 위치 4q24 (위치 24에서의 염색체 4의 긴 (q) 아암) 상에서 발견된다. TET2 유전자에 대한 다른 명칭은 FLJ20032, KIAA1546, MGC125715, 가능하게는 메틸시토신 디옥시게나제 TET2, 가능하게는 메틸시토신 디옥시게나제 TET2 이소형 a, 가능하게는 메틸시토신 디옥시게나제 TET2 이소형 b, tet 종양유전자 패밀리 구성원 2, 및 TET2_인간을 포함한다.
유사한 단백질의 기능에 기반하여, 연구자들은 TET2 단백질이 단백질 생산에서 첫번째 단계인 전사의 프로세스를 조절하는 것에 수반된다고 믿고 있다. 이 단백질은 신체 전반에 걸쳐 발견되지만, 이는 조혈 줄기 세포로부터의 혈구의 생산에 있어서 특히 중요한 역할을 할 수 있다. 이들 줄기 세포는 골수 내에 위치하며, 적혈구, 백혈구, 및 혈소판으로 발달할 잠재성을 갖는다. TET2 단백질은 세포가 비제어된 방식으로 성장 및 분열하는 것을 방지하는 종양 서프레서로서 작용하는 것으로 보인다. 예를 들어, 체세포 TET2 돌연변이는 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 속발성 AML (sAML)을 포함한 골수형성이상 증후군 (MDS), 골수증식성 신생물 (MPN), MDS/MPN 중첩 증후군에서 빈번히 관찰된다.
TET2 돌연변이는 세포유전학적적으로 정상적인 급성 골수성 백혈병 (CN-AML)에서 예후적 가치를 갖는 것으로 또한 제안되었다. 이 유전자에서의 "넌센스" 및 "프레임시프트" 돌연변이는 이 그렇지 않다면 최소-위험 환자 하위세트에서의 표준 요법에 대한 불량한 결과와 연관된다. 기능 TET2 돌연변이의 소실은 또한 죽종형성에서 가능한 원인적 역할을 가질 수 있다.
TET2는 또한 시토신 염기 상의 제5 탄소에 첨가된 메틸 기의 촉매적 제거인 활성 DNA 탈메틸화를 위한 후보일 수 있다.
일부 유전자 돌연변이는 사람의 일생 동안 획득되며, 단지 특정 세포에만 존재한다. 체세포 돌연변이로 지칭되는 이들 변화는 유전되지 않는다. TET2 유전자에서의 체세포 돌연변이는 혈액 중의 혈소판의 높은 수를 특징으로 하는 상태인 본태성 혈소판증가증을 갖는 소수의 사람에서 확인되었다. 혈소판은 혈액 응고에 수반되는 혈구이다. TET2 유전자 돌연변이는 TET2 단백질을 상이한 방식으로 변경시키지만; 이들 모두는 비기능적 단백질을 발생시키는 것으로 보인다. 이들 돌연변이가 본태성 혈소판증가증의 발달에서 하는 역할은 미공지되어 있다.
TET2 유전자에서의 체세포 돌연변이는 비제어된 혈구 생산을 특징으로 하는 장애인 진성 적혈구증가증과 연관된다. 이들 돌연변이는 비기능적 단백질을 발생시키는 것으로 생각된다. 이 유전자에서의 돌연변이는 진성 적혈구증가증을 갖는 사람의 대략 16 퍼센트에서 발견되었다. 이들 돌연변이가 진성 적혈구증가증에서 하는 역할은 불명확하다.
TET2 유전자에서의 체세포 돌연변이는 원발성 골수섬유증과 연관된다. 이 상태는 혈구를 생산하는 조직인 골수에서의 흉터 조직 (섬유증)을 특징으로 한다. TET2 유전자 돌연변이가 원발성 골수섬유증의 발달에서 무슨 역할을 하는지는 불명확하다.
체세포 TET2 유전자 돌연변이는 또한 혈액-형성 세포의 암의 특정 유형 (백혈병) 및 골수형성이상 증후군으로 지칭되는 혈액 및 골수의 질환과 연관된다. 이들 돌연변이는 비기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것으로 생각된다. 조혈 줄기 세포에서의 TET2 단백질의 소실은 이들 세포의 비제어된 성장 및 분열을 초래할 수 있다. 연구자들은 TET2 유전자 돌연변이가 골수 장애의 발달에서 무슨 역할을 하는지를 정확하게 결정하기 위해 연구하고 있다.
TET2 돌연변이는 또한 골수성 신생물과 연관되는 것으로 나타났다.
CAR T 세포에서의 TET2-파괴는 또한 대상체에서의 암 완화 및 주입 후 장기 CAR T 세포 생존과 연관되는 것으로 나타났다 (Fraietta et al., 2018, Nature, 558(7709), 307-312). 구체적으로, 바이러스 편집 방법에 의해 변형된 TET2-파괴된 CAR T 세포는 완화를 갖는 환자에서 확인되었으며, 프로퓨전 후 2 (2) 개월에 거의 모든 편집된 세포를 차지하였다.
TET2 유전자의 공동 넉아웃 및 넉다운을 갖는 네오TCR(NeoTCR)을 발현하도록 디자인된 세포 요법은 이전에는 추구되지 않았다. 더욱이, 단일 또는 빈번하게 투여되는 요법인 세포 요법을 허용하기 위해, 긴 존속 시간 및/또는 기억 줄기 세포로서의 이상적으로 완전한 그라프팅을 갖는 세포 요법을 개발해야 할 충족되지 않은 필요가 있다.
그러나, TET2의 내인성 억제 및 그의 내재적 항-종양 활성을 고려하여, T 세포 상의 TET2의 발현을 조정하는 요법은 이러한 요법의 종양형성 표현형을 방지하기 위해 정확하게 조작될 필요가 있다.
따라서, 네오TCR 결속을 통해 종양을 특이적으로 표적화할 수 있으며 주입 후 환자 내에서 연장된 기간 동안 존속하는 세포 요법에 대한 충족되지 않은 필요가 있다. T 세포에 특이적인 넉아웃 또는 넉다운 TET2를 포함하는 이러한 요법이 본원에 기재된다.
본원에 기재된 본 발명은 TET2 유전자의 내인성 발현을 조정하도록 조작된 세포를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 외인성 T 세포 수용체 (TCR), 및 TET2 로커스의 유전자 파괴를 포함하는 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 유전자 파괴는 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 파괴는 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 로커스의 유전자 파괴는 비-기능적 TET2 단백질을 발생시킨다. 특정 실시양태에서, TET2 로커스의 유전자 파괴는 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시킨다.
특정 실시양태에서, 세포는 gRNA 및 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, TET2 로커스의 유전자 파괴는 세포 존속을 증진시킨다. 특정 실시양태에서, TET2 로커스의 유전자 파괴는 기억 세포 분화를 증진시킨다.
특정 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 환자-유래 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 림프구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+이다.
특정 실시양태에서, 외인성 TCR은 환자 유래 TCR이다. 특정 실시양태에서, 외인성 TCR은 신호 서열, 제1 및 제2 2A 서열, 및 TCR 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 외인성 TCR은 암 항원을 인식한다. 특정 실시양태에서, 암 항원은 신생항원이다. 특정 실시양태에서, 암 항원은 환자 특이적 항원이다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 세포 내로 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 도입하고, HR 주형 핵산을 세포의 내인성 로커스 내로 재조합하고, 세포의 TET2 로커스를 파괴하는 것을 포함하는 프로세스에 의해 변형된 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제1 및 제2 표적 핵산 서열에 대해 상동성인 제1 및 제2 상동성 아암, 및 제1 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 TCR 유전자 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 TCR 유전자 서열의 상류에 위치한 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열의 하류에 위치한 제2 2A-코딩 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 2A-코딩 서열은 서로에 대해 코돈-분기된 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 2A-코딩 서열은 P2A-코딩 서열이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 Gly Ser Gly를 코딩하는 서열은 2A-코딩 서열의 바로 상류에 위치한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제2 2A-코딩 서열의 상류에 위치한 푸린 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 상동성 아암은 각각 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이이다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 상동성 아암은 각각 약 600개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 신호 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제2 2A-코딩 서열 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 제2 TCR 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, HR 주형은 제1 2A-코딩 서열 및 제1 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제1 신호 서열, 및 제2 2A-코딩 서열 및 제2 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제2 신호 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 신호 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 서로에 대해 코돈 분기된다. 특정 실시양태에서, 신호 서열은 인간 성장 호르몬 신호 서열이다.
특정 실시양태에서, HR 주형은 비-바이러스성이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 원형 DNA이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 선형 DNA이다. 특정 실시양태에서, 도입은 전기천공을 통해 일어난다.
특정 실시양태에서, 재조합은 뉴클레아제에 의한 내인성 로커스의 절단, 및 상동성 지정 복구에 의한 내인성 로커스 내로의 HR 주형 핵산 서열의 재조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 gRNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, 파괴는 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 파괴는 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 파괴는 비-기능적 TET2 단백질을 발생시킨다. 특정 실시양태에서, 파괴는 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시킨다.
특정 실시양태에서, 파괴는 뉴클레아제에 의한 TET2 로커스의 절단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 gRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 벡터에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, gRNA는 벡터에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다.
특정 실시양태에서, TET2 로커스의 파괴는 세포 존속을 증진시킨다. 특정 실시양태에서, TET2 로커스의 파괴는 기억 세포 분화를 증진시킨다.
특정 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 환자-유래 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 림프구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 환자-유래 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 어린 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+이다.
특정 실시양태에서, 내인성 로커스는 내인성 TCR 유전자 내에 있다. 특정 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 종양 항원을 인식하는 TCR을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 신생항원이다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 환자 특이적 신생항원이다. 특정 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 환자 특이적 TCR 유전자 서열이다.
특정 실시양태에서, 프로세스는 세포를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 배양은 적어도 1종의 시토카인의 존재 하에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 배양은 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 배양은 IL7 및 IL15의 존재 하에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 세포 내로 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 도입하고, HR 주형 핵산을 세포의 내인성 로커스 내로 재조합하고, 세포의 TET2 로커스를 파괴하는 것을 포함하는, 세포를 변형시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제1 및 제2 표적 핵산 서열에 대해 상동성인 제1 및 제2 상동성 아암, 및 제1 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 TCR 유전자 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 TCR 유전자 서열의 상류에 위치한 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열의 하류에 위치한 제2 2A-코딩 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 2A-코딩 서열은 서로에 대해 코돈-분기된 동일한 아미노산 서열을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 2A-코딩 서열은 P2A-코딩 서열이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 Gly Ser Gly를 코딩하는 서열은 2A-코딩 서열의 바로 상류에 위치한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제2 2A-코딩 서열의 상류에 위치한 푸린 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 상동성 아암은 각각 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이이다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 상동성 아암은 각각 약 600개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 신호 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 제2 2A-코딩 서열 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 제2 TCR 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, HR 주형은 제1 2A-코딩 서열 및 제1 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제1 신호 서열, 및 제2 2A-코딩 서열 및 제2 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제2 신호 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 신호 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 서로에 대해 코돈 분기된다. 특정 실시양태에서, 신호 서열은 인간 성장 호르몬 신호 서열이다.
특정 실시양태에서, HR 주형은 비-바이러스성이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 원형 DNA이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 선형 DNA이다. 특정 실시양태에서, 도입은 전기천공을 통해 일어난다.
특정 실시양태에서, 재조합은 뉴클레아제에 의한 내인성 로커스의 절단, 및 상동성 지정 복구에 의한 내인성 로커스 내로의 HR 주형 핵산 서열의 재조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 gRNA를 포함한다.
특정 실시양태에서, 파괴는 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 파괴는 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 파괴는 비-기능적 TET2 단백질을 발생시킨다. 특정 실시양태에서, 파괴는 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시킨다.
특정 실시양태에서, 파괴는 뉴클레아제에 의한 TET2 로커스의 절단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 gRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 벡터에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, gRNA는 벡터에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다.
특정 실시양태에서, TET2 로커스의 파괴는 세포 존속을 증진시킨다. 특정 실시양태에서, TET2 로커스의 파괴는 기억 세포 분화를 증진시킨다.
특정 실시양태에서, 세포는 1차 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 환자-유래 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 림프구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 환자-유래 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 어린 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+이다. 특정 실시양태에서, 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+이다.
특정 실시양태에서, 내인성 로커스는 내인성 TCR 유전자 내에 있다. 특정 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 종양 항원을 인식하는 TCR을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 신생항원이다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 환자 특이적 신생항원이다. 특정 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 환자 특이적 TCR 유전자 서열이다.
특정 실시양태에서, 방법은 세포를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 배양은 적어도 1종의 시토카인의 존재 하에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 배양은 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 배양은 IL7 및 IL15의 존재 하에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 본원에 개시된 세포의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 세포의 치료 유효량을 투여하기 전에, 비-골수소멸성 림프구고갈 레지멘이 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 암은 액상 종양이다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 흑색종, 흉부암, 폐암, 난소암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 전립선암, 부인과암, 중추 신경계암, 피부암, HPV+ 암, 식도암, 갑상선암, 위암, 간세포암, 담관암종, 신세포암, 고환암, 육종, 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 액상 종양은 소포성 림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 본원에 개시된 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 암의 치료를 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 동결보존제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 혈청 알부민을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 플라스마-라이트(Plasma-Lyte) A, HSA, 및 크리오스토르(CryoStor) CS10을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 본원에 개시된 세포, 방법을 수행하기 위한 시약, 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 암을 치료하는 것에 대한 서면 지시서를 추가로 포함한다.
도 1. 도 1은 본원에 기재된 유전자 편집 기술에 의해 달성된 내인성 TCR 로커스에서의 넉-아웃 및 넉-인 및 TET2 유전자의 넉-아웃의 고-수준 도해를 제공한다.
도 2a-2c. 도 2a-2c는 네오TCR 산물을 제조하는데 사용될 수 있는 네오E(NeoE) TCR 카세트 및 유전자 편집 방법의 예를 나타낸다. 도 2a는 신생항원-특이적 TCR 구축물 (네오TCR)을 TCRα 로커스 내로 통합하는데 사용된 일반적인 표적화 전략을 나타내는 개략도를 나타낸다. 도 2b 및 2c는 네오TCR을 TCRα 로커스 내로 통합하는데 사용된 신생항원-특이적 TCR 구축물 디자인을 나타내며, 여기서 카세트는 신호 서열 ("SS"), 프로테아제 절단 부위 ("P"), 및 2A 펩티드 ("2A")를 갖는 것으로 나타내어진다. 도 2b는 표적 TCRα 로커스 (내인성 TRAC, 상부 패널) 및 그의 CRISPR Cas9 표적 부위 (수평 줄무늬, 절단 부위는 화살표에 의해 표시됨), 및 통합 전에 좌측 및 우측 상동성 아암 (각각 "LHA" 및 "RHA") 사이에 위치한 네오TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 원형 플라스미드 HR 주형 (하부 패널)을 나타낸다. 도 2c는 TCRα 로커스에서의 통합된 네오TCR (상부 패널), 전사되고 스플라이싱된 네오TCR mRNA (중간 패널), 및 발현된 네오TCR의 번역 및 프로세싱 (하부 패널)을 나타낸다.
도 3. 도 3은 네오E TCR 카세트의 정확한 표적 통합을 확인하는 인-아웃 PCR의 결과를 나타낸다. 아가로스 겔은 네오E TCR 카세트 및 상대 부위에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR의 결과가 단지 뉴클레아제 및 DNA 주형 둘 다로 처리된 세포 (넉-아웃-넉-인 (KOKI) 및 넉-아웃-넉-인-넉-아웃 (KOKIKO))에 대해서만 예상된 크기의 산물을 생성함을 나타내며, 이는 부위-특이적 및 정확한 통합을 입증한다.
도 4a 및 4b. 도 4a는 내인성 TCR이 감소된 신호를 갖고, 네오E TCR 카세트로 전기천공된 세포에서 강한 네오E TCR 신호가 있음을 나타내는 FACS 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 도 4b는 실험 사이의 높은 정도의 재현성을 나타내는 네오E TCR 카세트로의 일련의 다중 형질감염 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
도 5a-5e. 도 5a-5e는 TET2 유전자를 넉아웃시키기 위한 다섯 (5)가지 예시적인 RNP 넉아웃 전략을 나타낸다. 도 5a 및 5e는 음성 가닥을 표적화하는 sgRNA를 나타낸다. 도 5b, 5c, 및 5d는 양성 가닥을 표적화하는 sgRNA를 나타낸다.
도 6a 및 6b. 도 6a 및 6b는 용해된 TET2 gRNA-Cas9 RNP 편집된 CD4 및 CD8 T 세포로부터 추출된 증폭된 DNA의 아가로스 겔을 나타낸다. 증폭에 사용된 프라이머는 표 3에 제공된다. 도 6a는 비커팅된 PCR 앰플리콘을 나타낸다. 도 6b는 T7 엔도뉴클레아제 I (NEB)과의 인큐베이션에 의해 커팅된 PCR 앰플리콘을 나타낸다. 도 6a 및 도 6b 둘 다의 레인은 1. 마커, 2. WT (TET2_Fwd1, TET2_Rev1), 3. WT (TET2_Fwd2, TET2_Rev2), 4. gRNA1 (TET2_Fwd1, TET2_Rev1), 5. gRNA2 (TET2_Fwd2, TET2_Rev2), 6. gRNA3 (TET2_Fwd2, TET2_Rev2), 7. gRNA4 (TET2_Fwd1, TET2_Rev1), 8. gRNA5 (TET2_Fwd1, TET2_Rev1)이다.
도 7a-7e. 도 7a-7e는 PCR 앰플리콘의 커버리지가 가이드 부위 주위의 모든 앰플리콘에 대해 왕성하였음을 나타낸다. 도 7a는 gRNA 1 (서열식별번호: 1)의 결과를 나타낸다. 도 7b는 gRNA 4 (서열식별번호: 4)의 결과를 나타낸다. 도 7c는 gRNA 5 (서열식별번호: 5)의 결과를 나타낸다. 도 7d는 gRNA 3 (서열식별번호: 3)의 결과를 나타낸다. 도 7e는 gRNA 2 (서열식별번호: 2)의 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b. 도 8a 및 8b는 sgRNA 3 (서열식별번호: 3)이 TET2의 가장 양호한 파괴를 제공하고, 네오TCR 유전자 편집 및 네오TCR의 삽입을 간섭하지 않음을 나타낸다. 도 8a는 indel 특징규명을 나타내고, 도 8b는 유전자 편집 (네오TCR의 삽입) 비율을 나타낸다. 도 8b에 제공된 바와 같은 네오TCR의 유전자 편집 삽입은 유전자 편집된 세포에의 덱스트라머 결합에 의해 측정된다. 덱스트라머는 네오TCR에 특이적으로 결합하기 때문에, 결합은 네오TCR 발현에 대해 직접적 상관관계이다.
도 9. 도 9는 동족 comPACT 플레이트 코팅으로의 1.5시간 자극을 갖는 또는 갖지 않는 TET2의 부재 하에서 (즉, TET2 산물에서) 5-hmC에서 주목할 만한 감소가 없음을 나타낸다. 휴지 또는 동족 comPACT (EXP19001222)로 1.5시간 동안 자극된 샘플의 항-5-hmC 항체 염색을 유동 세포계측법을 사용하여 검출하였다.
도 10. 도 10은 TET2 산물이 네오TCR 산물과 등가의 TCF7 및 TBET 전사 인자의 발현을 가졌음을 나타낸다 (즉, TET2 결실을 갖지 않은 세포). 이 유동 세포계측법 실험에 사용된 세포는 휴지 편집된 세포였다.
도 11a 및 11b. 도 11a 및 11b는 gRNA3에 의한 TET2 파괴가 퍼센트 IFNγ+ 세포 (도 11a) 및 퍼센트 CD107a+ 세포 (도 11b)에 의해 입증된 바와 같은 감소된 말단 이펙터 분화를 발생시킴을 나타낸다.
도 12a 및 12b. 도 12a 및 12b에 나타내어진 바와 같이, 14-15일 동안 배양에서 유지된 TET2 산물 및 네오TCR 산물의 종양 세포 살해 능력 사이에 차이가 없다. TET2 gRNA3을 갖는 및 갖지 않는 PACT035-TCR089 네오TCR 편집된 T 세포로의 인큐사이트(IncuCyte) 검정물을 SW620 COX6C-R20Q 종양 세포 (도 12a) 또는 COX6C-R20Q 돌연변이를 결여한 SW620 종양 세포 (도 12b)와 공동-배양하였다. R20Q 돌연변이는 TCR089가 R20Q 돌연변이를 발현하는 세포를 살해하도록 디자인되도록 TCR089와 직접적으로 상관된다.
도 13a 및 13b. 도 13a 및 13b는 TET2 산물이 네오TCR 산물 (TET2 유전자의 넉아웃을 갖지 않는 세포)보다 더 긴 살해 활성을 유지함을 나타낸다. 네오TCR 산물 (도면에 나타내어진 바와 같은 PACT035-TCR089) 및 TET2 산물 (도면에 나타내어진 바와 같은 PACT035-TCR089 TET2 gRNA 3)을 30일 동안 배양에서 유지한 후, 시험하였다. 네오TCR 산물 (PACT035-TCR089) 및 TET2 산물 (PACT035-TCR089 TET2 gRNA 3)로의 인큐사이트 검정물을 SW620 COX6C-R20Q 종양 세포 (도 13a) 또는 COX6C-R20Q 돌연변이를 결여한 SW620 종양 세포 (도 13b)와 공동-배양하였다.
도 14a 및 14b. 도 14a 및 14b는 TET2 파괴가 CD8 기억 세포 분화를 증진시킴을 나타낸다. 기억과 연관된 표면 마커의 기하 평균 형광 강도 및 7일 동안 동족 comPACT로 자극된 TET2 gRNA3을 갖는 또는 갖지 않는 CD8+ 덱스트라머+ 네오TCR 편집된 T 세포 중에서의 소진이 네오TCR 산물 (도면에 나타내어진 바와 같은 PACT035-TCR089) 및 TET2 산물 (도면에 나타내어진 바와 같은 PACT035-TCR089 TET2 gRNA 3)에 대해 나타내어진다. 도 14a 및 14b에 나타내어진 CCR7 및 CD27 플롯은 TET2 파괴가 CD8 기억 세포 분화를 증진시킴을 나타낸다. 구체적으로, CCR7 및 CD27은 중심 기억 CD8 T 세포 상에 고도로 발현된다. TET2 세포가 네오TCR 세포에 비해 발현을 증가시킨다는 (보다 높은 MFI) 사실은 이 효과를 나타낸다.
도 15a-15d. 도 15a-15d는 TOX (도 15b 및 15d) 및 TCF7 (도 15a 및 15c)의 발현이 네오TCR 산물 (도면에 나타내어진 바와 같은 PACT035-TCR089) 및 TET2 산물 (도면에 나타내어진 바와 같은 PACT035-TCR089 TET2 gRNA 3) 사이에 변화되지 않았음을 나타낸다. 7일 동안 comPACT 자극 (도 15a 및 15b) 또는 7일 동안 자극, 이어서 추가의 2일 동안 신선한 comPACT 코팅된 플레이트 상에서의 재-자극 (도 15c 및 15d)에 반응하여 TCF7+ (도 15a 및 15c) 및 TOX+ (도 15b 및 15d) CD8+ 덱스트라머+ T 세포의 빈도.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 개시된 대상에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; [The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; [The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 하기 용어는 달리 특정되지 않는 한, 하기 그들에 주어진 의미를 갖는다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 "포함하는", "이루어진", 및 "본질적으로 이루어진" 측면 및 실시양태를 포함함이 이해된다. 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 미국 특허법에서 그들에 주어진 넓은 의미를 갖는 것으로 의도되며, "포괄한다", "포괄하는" 등을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 관행에 따라, 3 또는 3 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 예를 들어, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스에 관하여, 상기 용어는 값의 한 자릿수 내, 예를 들어, 5배 내 또는 2배 내를 의미할 수 있다.
용어 "암" 및 "종양"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 상기 용어는 또한 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재하기 위해 사용된다. 암은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 신경아교, 식도, 나팔관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 비뇨생식관, 요관, 요도, 자궁, 및 질로 이루어진 군으로부터 선택되는 기관, 또는 그의 조직 또는 세포 유형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 세포 유형, 조직, 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 암은 육종, 암종, 또는 형질세포종 (형질 세포의 악성 종양)과 같은 암을 포함한다. 암의 예는 본원에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "암" 또는 "종양" 및 "증식성 장애"는 본원에 사용된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
본원에 사용된 "덱스트라머"는 그의 동족 네오TCR에 특이적으로 결합하는 다량체화된 네오에피토프-HLA 복합체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "신생항원", "네오에피토프" 또는 "네오E"는 예를 들어, 체세포 돌연변이(들)로부터 발생하고, "비-자기"로서 인식되는 새롭게 형성된 항원 결정자를 지칭한다. "신생항원", "네오에피토프" 또는 "네오E"를 발생시키는 돌연변이는 프레임시프트 또는 비-프레임시프트 인델, 미스센스 또는 넌센스 치환, 스플라이스 부위 변경 (예를 들어, 대체 스플라이싱된 전사체), 게놈 재배열 또는 유전자 융합, 임의의 게놈 또는 발현 변경, 또는 임의의 번역후 변형을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "네오TCR" 및 "네오E TCR"은 예를 들어, 유전자 편집 방법에 의해 T 세포 내로 도입된 네오에피토프-특이적 T 세포 수용체를 의미한다.
본원에 사용된 "네오TCR 세포"는 1종 이상의 네오TCR을 발현하도록 정확성 조작된 1종 이상의 세포를 의미한다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포이다. 특정 실시양태에서, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포는 네오TCR 산물이 투여될 환자로부터의 자가 세포이다. 용어 "네오TCR 세포" 및 "네오TCR-P1 T 세포" 및 "네오TCR-P1 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 네오TCR 세포는 TET2 유전자의 발현을 넉아웃시키도록 조작되지 않는다.
본원에 사용된 "네오TCR 산물"은 1종 이상의 네오TCR 세포를 포함하는 제약 제제를 의미한다. 네오TCR 산물은 자가 정확성 게놈-조작된 CD8+ 및 CD4+ T 세포로 이루어진다. 표적화된 DNA-매개 비-바이러스 정확성 게놈 조작 접근법을 사용하여, 내인성 TCR의 발현은 제거되고, 종양-배타적 네오에피토프를 표적화하는 말초 CD8+ T 세포로부터 단리된 환자-특이적 네오TCR에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, 생성된 조작된 CD8+ 또는 CD4+ T 세포는 천연 서열, 천연 발현 수준, 및 천연 TCR 기능의 그들의 표면 상에 네오TCR을 발현한다. 네오TCR 외부 결합 도메인 및 세포질 신호전달 도메인의 서열은 천연 CD8+ T 세포로부터 단리된 TCR로부터 비변형된다. 네오TCR 유전자 발현의 조절은 네오TCR 유전자 카세트가 게놈 내로 통합된 상류에 위치한 천연 내인성 TCR 프로모터에 의해 유도된다. 이 접근법을 통해, 네오TCR 발현의 천연 수준은 비자극된 및 항원-활성화된 T 세포 상태에서 관찰된다.
각각의 환자에 대해 제조된 네오TCR 산물은 그 동일한 환자의 말초 혈액으로부터 개별적으로 단리된 네오E-특이적 CD8+ T 세포로부터 클로닝된 단일 네오E-특이적 TCR을 발현하도록 정확성 게놈 조작된 한정된 용량의 자가 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포를 나타낸다.
본원에 사용된 네오TCR 산물은 TET2 유전자의 발현을 넉아웃시키도록 조작되지 않는다.
본원에 사용된 "네오TCR 바이러스 산물"은 게놈 조작이 바이러스 매개 방법을 사용하여 수행되는 것을 제외하고는 네오TCR 산물의 동일한 정의를 갖는다.
"제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 되는 것을 허용하도록 하는 형태이고, 제제가 투여될 대상체에게 비허용가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 명확성을 위해, 네오TCR 산물에 사용된 대량의 DMSO는 비허용가능하게 독성인 것으로 간주되지 않는다.
치료의 목적을 위한 "대상체", "환자", 또는 "개체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 경기, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본원에 사용된 "TCR"은 T 세포 수용체를 의미한다.
"TET2"는 메틸시토신의 5-히드록시메틸시토신으로의 전환을 촉매하는 단백질 메틸시토신 디옥시게나제를 코딩하는 유전자이다. TET2는 또한 Tet 메틸시토신 디옥시게나제 2, FLJ20032, KIAA1546, MGC125715, 가능하게는 메틸시토신 디옥시게나제 TET2, 가능하게는 메틸시토신 디옥시게나제 TET2 이소형 a, 가능하게는 메틸시토신 디옥시게나제 TET2 이소형 b, tet 종양유전자 패밀리 구성원 2, 및 TET2_인간으로 지칭된다.
본원에 사용된 "TET2 세포"는 1종 이상의 네오TCR 및 TET2 유전자의 넉아웃을 발현하도록 정확성 조작된 1종 이상의 세포를 의미한다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포이다. 특정 실시양태에서, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포는 TET2 산물이 투여될 환자로부터의 자가 세포이다.
본원에 사용된 "TET2 네오TCR 산물"은 TET2 세포를 포함하는 산물을 의미한다.
"치료하다", "치료", 및 "치료하는"은 상호교환가능하게 사용되며, 본원에 사용된 바와 같이 임상적 결과를 포함한 유익하거나 목적하는 결과를 얻는 것을 의미한다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이를 방지하는 것, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 TET2 산물은 증식성 장애 (예를 들어, 암)의 발달을 지연시키거나 이러한 질환의 진행을 감속시키는데 사용된다.
"치료하다", "치료", 및 "치료하는"은 상호교환가능하게 사용되며, 본원에 사용된 바와 같이 임상적 결과를 포함한 유익하거나 목적하는 결과를 얻는 것을 의미한다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이를 방지하는 것, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 TET2 산물은 증식성 장애 (예를 들어, 암)의 발달을 지연시키거나 이러한 질환의 진행을 감속시키는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "종양 항원"은 정상 또는 비-신생물성 세포에 비해 종양 세포 상에 고유하게 또는 차등적으로 발현된 항원 (예를 들어, 폴리펩티드)을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 종양 항원은 항원-인식 수용체를 통해 면역 반응을 활성화시키거나 유도할 수 있는 또는 수용체-리간드 결합을 통해 면역 반응을 억제할 수 있는 종양에 의해 발현된 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
"2A" 및 "2A 펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 진핵생물 세포에서 번역 동안 펩티드의 절단을 매개할 수 있는 18-22 아미노산 길이의 바이러스성 자기-절단 펩티드의 부류를 의미한다.
2A 펩티드 부류의 4가지 널리 공지된 구성원은 T2A, P2A, E2A, 및 F2A이다. T2A 펩티드는 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A에서 최초로 확인되었다. P2A 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 2A에서 최초로 확인되었다. E2A 펩티드는 말 A형 비염 바이러스에서 최초로 확인되었다. F2A 펩티드는 구제역 바이러스에서 최초로 확인되었다.
2A 펩티드의 자기-절단 메커니즘은 2A의 C-말단에서 글리실-프롤릴 펩티드 결합의 형성을 스키핑하는 리보솜의 결과이다. 구체적으로, 2A 펩티드는 입체 장해 및 리보솜 스키핑의 생성에 필요한 C-말단 보존된 서열을 갖는다. 리보솜 스키핑은 3가지 옵션 중 하나를 발생시킬 수 있다: 1) 2개의 절단된 단백질을 발생시키는 번역의 성공적인 스키핑 및 재개 (C-말단 프롤린을 제외하고 완전한 2A 펩티드에 부착된 2A 단백질의 상류 및 N-말단에서 하나의 프롤린에 부착된 2A 단백질의 하류; 2) 중단된 번역 및 단지 2A의 상류의 단백질을 발생시키는 성공적인 스키핑, 그러나 리보솜 떨어짐; 또는 3) 비성공적인 스키핑 및 계속된 번역 (즉, 융합 단백질).
본원에 사용된 용어 "내인성"은 세포 또는 조직에서 정상적으로 발현되는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 세포에 내인적으로 존재하지 않는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 용어 "외인성"은 세포에서 발현된 임의의 재조합 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 예컨대 외래, 이종, 및 과-발현된 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포괄한다. "외인성" 핵산이란 천연 야생형 세포에 존재하지 않는 핵산을 의미하며; 예를 들어, 외인성 핵산은 서열에 의해, 위치/장소에 의해, 또는 둘 다에 의해 내인성 대응물과는 다를 수 있다. 명확성을 위해, 외인성 핵산은 그의 천연 내인성 대응물에 비해 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있으며; 이는 세포 자체 또는 그의 전구체 내로의 유전자 조작에 의해 도입될 수 있고, 임의로 대안적 제어 서열, 예컨대 비-천연 프로모터 또는 분비 서열에 연결될 수 있다.
그것이 T 세포에 관한 것일 때 "어린" 또는 "보다 어린" 또는 "어린 T 세포"는 기억 줄기 세포 (TMSC) 및 중심 기억 세포 (TCM)를 의미한다. 이들 세포는 특이적 활성화 시 T 세포 증식을 가지며, 다중 세포 분열에 적격이다. 이들은 또한 재-주입 후 그라프팅되어, 그들의 동족 항원에의 노출 시 이펙터 T 세포로 급속하게 분화되고, 종양 세포를 표적화하고 살해할 뿐만 아니라, 진행중인 암 감시 및 제어를 위해 존속하는 능력을 갖는다.
네오TCR 산물
일부 실시양태에서, 그 전문이 본원에 포함되는 PCT/US2020/017887 및 PCT/US2019/025415에 기재된 유전자 편집 기술 및 네오TCR 단리 기술을 사용하여, 네오TCR은 네오TCR을 발현하도록 조작된 정확성 게놈에 의해 (도 2a-2c에 기재된 바와 같은 DNA-매개 (비-바이러스) 방법을 사용하여) 암을 갖는 동일한 환자로부터의 자가 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 클로닝된다. 다시 말해서, 네오TCR은 종양 특이적이고, 암 환자에서 확인된다. 이어서 이들 네오TCR을 클로닝하고, 클로닝된 네오TCR을 암 환자의 T 세포 내로 삽입한다. 이어서 네오TCR 발현 T 세포를 "어린" T 세포 표현형을 보존하는 방식으로 확장시켜, T 세포의 대다수가 T 기억 줄기 세포 및 T 중심 기억 표현형을 나타내는 네오TCR-P1 산물 (즉, 네오TCR 산물)을 생성한다.
이들 '어린' 또는 '보다 어린' 또는 덜-분화된 T 세포 표현형은 개선된 그라프팅 잠재성 및 주입 후 연장된 존속을 부여하는 것으로 기재된다. 따라서, 유의하게 '어린' T 세포 표현형으로 이루어진 네오TCR 산물의 투여는 개선된 그라프팅 잠재성, 주입 후 연장된 존속, 및 신체 전반에 걸쳐 종양 세포를 근절시키는 이펙터 T 세포로의 급속한 분화를 통해, 암을 갖는 환자를 유익하게 할 잠재성을 갖는다.
생체외 작용 메커니즘 연구를 또한 암을 갖는 환자로부터의 T 세포로 제조된 네오TCR 산물로 수행하였다. T 세포 살해 활성, 증식, 및 시토카인 생산의 항원-특이성에 의해 측정된 바와 같은 필적하는 유전자 편집 효율 및 기능적 활성이 관찰되었으며, 이는 본원에 기재된 제조 프로세스가 출발 물질로서 암을 갖는 환자로부터의 T 세포를 갖는 산물을 생성하는데 있어서 성공적임을 입증한다.
특정 실시양태에서, 네오TCR 산물 제조 프로세스는 가이드 RNA 서열에 결합된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제의 이중 리보핵단백질 종의 전기천공을 수반하며, 각각의 종은 게놈 TCRα 및 게놈 TCRβ 로커스를 표적화한다. Cas9 뉴클레아제를 각각의 게놈 로커스에 표적화하는 특이성은 고도로 특이적인 것으로 문헌에 이전에 기재되었다. 각각 COSMID 및 GUIDE-seq를 사용하여, 네오TCR 산물의 포괄적인 시험을 시험관내에서 및 인 실리코 분석에서 수행하여 가능한 오프-타겟 게놈 절단 부위를 조사하였다. 건강한 공여자로부터의 다중 네오TCR 산물 또는 필적하는 세포 산물을 딥 시퀀싱에 의해 후보 오프-타겟 부위의 절단에 대해 평가하였으며, 이는 선택된 뉴클레아제가 고도로 특이적이라는 공개된 증거를 뒷받침한다.
정확성 게놈 조작 프로세스의 추가의 측면은 안전성에 대해 평가되었다. 표적화된 로커스 증폭 (TLA) 또는 표준 FISH 세포유전학에 의해 다중 네오TCR 산물을 평가하는데 있어서 정확성 게놈 조작 후의 게놈 불안정성의 증거는 발견되지 않았다. 네오TCR 서열의 게놈 내로 어디에서도 오프-타겟 통합은 검출되지 않았다. 잔여 Cas9의 증거는 세포 산물에서 발견되지 않았다.
네오TCR 산물 및 정확성 게놈 조작 프로세스의 포괄적인 평가는 네오TCR 산물이 환자로의 재주입 후 잘 내성화될 것임을 지시한다.
본원에 기재된 게놈 조작 접근법은 고형 및 액상 종양을 갖는 환자에 대한 개인화된 입양 세포 요법을 위한 맞춤 네오TCR T 세포 (즉, 네오TCR 산물)의 고도로 효율적인 생성을 가능하게 한다. 더욱이, 조작 방법은 T 세포에서의 사용에 제한되지 않으며, 또한 자연 킬러 및 조혈 줄기 세포를 포함한 다른 1차 세포 유형에 성공적으로 적용되었다.
TET2 산물
일부 실시양태에서, 상기 기재된 네오TCR 산물은 산물의 세포로부터 TET2 발현을 넉아웃시키도록 추가로 변형된다 (즉, TET2 산물). 구체적으로, 그 전문이 본원에 포함되는 PCT/US2020/017887 및 PCT/US2019/025415에 기재된 유전자 편집 기술 및 네오TCR 단리 기술을 사용하여, 네오TCR은 네오TCR을 발현하도록 조작된 정확성 게놈에 의해 (도 2a-2c에 기재된 바와 같은 DNA-매개 (비-바이러스) 방법을 사용하여) 암을 갖는 동일한 환자로부터의 자가 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 클로닝된다.
특정 실시양태에서, TET2 유전자는 TCRβ를 넉아웃시키는데 사용된 반응과 동일한 반응에서 TET2의 발현을 넉아웃시키는 gRNA 및 네오TCRα 및 네오TCRβ의 삽입을 사용하여 파괴된다 (도 1 참조). 특정 실시양태에서, TCRβ의 넉아웃, 네오TCRα 및 네오TCRβ의 삽입, 및 TET2의 넉아웃은 동일한 반응에서 공동으로 수행된다.
특정 실시양태에서, TET2 유전자는 TCRβ를 넉아웃시키는데 사용된 반응과 상이한 반응에서 TET2의 발현을 넉아웃시키는 gRNA 및 네오TCRα 및 네오TCRβ의 삽입을 사용하여 파괴된다 (도 1 참조). 특정 실시양태에서, TCRβ의 넉아웃 및 네오TCRα 및 네오TCRβ의 삽입은 TET2의 넉아웃으로부터 별개의 및 연속적 반응에서 수행된다. 특정 실시양태에서, TCRβ의 넉아웃 및 네오TCRα 및 네오TCRβ의 삽입은 제1 반응에서 수행되고, TET2의 넉아웃은 제2 반응에서 수행된다. 특정 실시양태에서, TET2의 넉아웃은 제1 반응에서 수행되고, TCRβ의 넉아웃 및 네오TCRα 및 네오TCRβ의 삽입은 제2 반응에서 수행된다.
일부 실시양태에서, TET2 산물은 바이러스 방법을 사용하여 1종 이상의 네오TCR (즉, 네오TCR 바이러스 산물) 및 TET2 유전자의 넉아웃을 발현하도록 조작된 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 네오TCR 바이러스 산물의 세포는 비-바이러스 방법을 사용하여 TET2 유전자를 넉아웃시키도록 추가로 조작된다. 특정 실시양태에서, 네오TCR 바이러스 산물의 세포는 바이러스 방법을 사용하여 TET2 유전자를 넉아웃시키도록 추가로 조작된다.
TET2 산물 제조 프로세스는 1) 가이드 RNA 서열에 결합된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제의 이중 리보핵단백질 종 (각각의 종은 게놈 TCRα 및 게놈 TCRβ 로커스를 표적화함), 및 2) TET2 유전자를 표적화하는 가이드 RNA 서열에 결합된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제의 리보핵단백질 종의 전기천공을 수반한다. Cas9 뉴클레아제를 각각의 게놈 로커스에 표적화하는 특이성은 고도로 특이적인 것으로 문헌에 이전에 기재되었다. 각각 COSMID 및 GUIDE-seq를 사용하여, TET2 산물의 포괄적인 시험은 시험관내에서 및 인 실리코 분석에서 수행되어 가능한 오프-타겟 게놈 절단 부위를 조사할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시험은 오프-타겟의 COSMID-기반 인 실리코 예측 및 오프-타겟의 GUIDE-seq-기반 시험관내 예측, 이어서 표적화된 딥 시퀀싱에 의한 그들 추정 오프-타겟의 시험을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, TET2 세포는 "어린" T 세포 표현형을 보존하는 방식으로 확장되어, T 세포의 대다수가 T 기억 줄기 세포 및 T 중심 기억 표현형을 나타내는 TET2 산물을 생성한다.
이들 '어린' 또는 '보다 어린' 또는 덜-분화된 T 세포 표현형은 개선된 그라프팅 잠재성 및 주입 후 연장된 존속을 부여하는 것으로 기재된다. 따라서, 유의하게 '어린' T 세포 표현형으로 이루어진 TET2 산물의 투여는 개선된 그라프팅 잠재성, 주입 후 연장된 존속, 및 신체 전반에 걸쳐 종양 세포를 근절시키는 이펙터 T 세포로의 급속한 분화를 통해, 암을 갖는 환자를 유익하게 할 잠재성을 갖는다.
특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 우세하게 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 25%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 30%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 35%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 40%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 45%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 50%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 55%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 60%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 65%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 70%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 적어도 75%는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 TET2 세포의 75% 초과는 기억 줄기 세포 (Tmsc) 및/또는 중심 기억 세포 (Tcm)를 포함한다. Tmsc는 CD45RA+CD62L+, CD28+CD95+, 및 CCR7+CD27+인 세포로서 특징규명된다. Tcm은 CD45RO+CD62L+, CD28+CD95+, 및 CCR7+CD27+CD127+인 세포로서 특징규명된다. Tmsc 및 Tcm 둘 다는 약한 이펙터 T 세포 기능, 왕성한 증식, 왕성한 그라프팅, 및 긴 텔로미어를 갖는 것으로서 특징규명된다.
어린 표현형을 갖는 TET2 산물을 제조하는 방법
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 부분적으로 조작된 "어린" T 세포의 제조에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 원래 대상체로부터 수득되거나 이러한 샘플로부터 단리된 항원-특이적 세포를 활성화시키고, 조작하고, 확장시키는 것을 포함하는, 생체외에서 항원-특이적 세포, 예를 들어, T 세포를 제조하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포를 활성화시키는 방법은 TCR/CD3 복합체를 활성화시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제한 없이, T 세포는 CD3 효능제, CD28 효능제, 또는 이들의 조합과 함께 인큐베이션되고/거나 배양될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조작된 활성화된 항원-특이적 세포, 예를 들어, 조작된 활성화된 T 세포는 조작된 활성화된 항원-특이적 세포, 예를 들어, T 세포를 시토카인, 케모카인, 가용성 펩티드, 또는 이들의 조합과 함께 배양함으로써 확장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 활성화된 항원-특이적 세포, 예를 들어, 조작된 활성화된 T 세포는 1종 이상의 시토카인과 함께 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시토카인은 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 조작된 활성화된 항원-특이적 세포, 예를 들어, 조작된 활성화된 T 세포는 IL7 및 IL15와 함께 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작된 활성화된 항원-특이적 세포, 예를 들어, 조작된 활성화된 T 세포 배양과 관련하여 사용된 시토카인은 약 1 pg/ml 내지 약 1 g/ml, 약 1 ng/ml 내지 약 1 g/ml, 약 1 μg/ml 내지 약 1 g/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 1g/ml, 및 그 사이에 있는 임의의 값의 농도로 존재할 수 있다.
제약 제제.
TET2 산물의 제약 제제는 세포의 '어린' 표현형을 동결보존된 상태로 보존할 수 있는 용액에서 TET2 세포를 배합함으로써 제조된다. 표 1은 한 이러한 제약 제제의 예를 제공한다. 대안적으로, TET2 산물의 제약 제제는 세포의 '어린' 표현형을 산물을 동결하거나 동결보존할 필요 없이 보존할 수 있는 용액에서 TET2 세포를 배합함으로써 제조될 수 있다 (즉, TET2 산물은 수용액에서 또는 비-동결된/동결보존된 세포 펠릿으로서 유지된다).
추가의 제약상 허용되는 담체, 완충제, 안정화제, 및/또는 보존제는 또한 동결보존 용액 또는 수성 저장 용액 (TET2 산물이 동결보존되지 않는 경우)에 첨가될 수 있다. 크리오스토르, 크리오스토르 CS5, 셀뱅커(CELLBANKER), 및 DMSO를 임의로 포함하는 주문제작 동결보존 배지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동결보존제 및/또는 배지는 TET2 산물을 동결보존하는데 사용될 수 있다.
유전자-편집 방법
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 부분적으로 인간 세포, 예를 들어, 조작된 T 세포 또는 조작된 인간 줄기 세포를 조작하는 방법을 수반한다. 특정 실시양태에서, 이러한 조작은 게놈 편집을 수반한다. 예를 들어 (그러나 제한은 아님), 이러한 게놈 편집은 TET2 로커스와 함께, 1개 이상의 내인성 로커스, 예를 들어, TCR 알파 (TCRα) 로커스 및 TCR 베타 (TCRβ) 로커스를 표적화하는 뉴클레아제로 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 내인성 표적 서열에서 단일-가닥 DNA 닉 또는 이중-가닥 DNA 파단을 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 게놈의 코딩 또는 비-코딩 부분, 예를 들어, 엑손, 인트론을 표적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 고려되는 뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 메가TAL 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 및 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/Cas 뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 자체가 예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 결실의 도입을 통해, 커팅 활성의 효율을 증가시키도록 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 인간 세포를 조작하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 Cas 뉴클레아제, 및 Cas 뉴클레아제를 내인성 표적 서열에 동원하는 1개 이상의 RNA, 예를 들어, 단일 가이드 RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas 뉴클레아제 및 RNA는 세포에서 예를 들어 상이한 벡터 또는 조성물을 사용하여 별개로, 또는 예를 들어, 폴리시스트론성 구축물 또는 단일 단백질-RNA 복합체에서 함께 도입된다. 특정 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cas12a이다. 특정 실시양태에서, Cas9 폴리펩티드는 제한 없이, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 네이세리아 메넨기티디스(Neisseria menengitidis)를 포함하는 박테리아 종으로부터 수득된다. CRISPR/Cas 시스템의 추가의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그것이 교시하는 전부에 대해 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Adli, Mazhar. "The CRISPR tool kit for genome editing and beyond." Nature communications vol. 9,1 1911 (2018)]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 게놈 편집은 면역학적 반응을 조절하는 1개 이상의 게놈 로커스에서 일어난다. 특정 실시양태에서, 로커스는 제한 없이, TCR 알파 (TCRα) 로커스, TCR 베타 (TCRβ) 로커스, TCR 감마 (TCRγ), TCR 델타(TCRδ), 및 TET2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 로커스 중 하나는 TET2 로커스이다.
특정 실시양태에서, 게놈 편집은 비-바이러스 전달 시스템을 사용함으로써 수행된다. 예를 들어, 핵산 분자는 핵산을 리포펙션 (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리리신 접합 (Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)의 존재 하에서, 또는 외과적 조건 하에서의 미세-주사에 의해 (Wolff et al., Science 247:1465, 1990) 투여함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공, 및 원형질체 융합을 사용한 시험관내에서의 형질감염을 포함한다. 리포솜은 또한 세포 내로의 DNA의 전달을 위해 잠재적으로 유익할 수 있다. 대상체의 질환에 걸린 조직 내로의 정상 유전자의 이식은 또한 정상 핵산을 생체외에서 배양가능한 세포 유형 (예를 들어, 자가 또는 이종 1차 세포 또는 그의 자손) 내로 전달하고, 그 후 세포 (또는 그의 후손)를 표적화된 조직 내로 주사하거나, 전신적으로 주사함으로써 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 게놈 편집은 바이러스 전달 시스템을 사용함으로써 수행된다. 특정 실시양태에서, 바이러스 방법은 표적화된 통합 (AAV를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 및 무작위 통합 (렌티바이러스 접근법을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 전달은 뉴클레아제의 통합 없이 달성될 것이다. 이러한 실시양태에서, 바이러스 전달 시스템은 렌티플래쉬(Lentiflash) 또는 또 다른 유사한 전달 시스템일 수 있다.
상동성 재조합 주형
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 세포의 내인성 로커스 내로 도입하고 재조합하는 것에 의한 세포의 게놈 편집을 제공한다. 특정 실시양태에서, HR 주형 핵산 서열은 선형이다. 특정 실시양태에서, HR 주형 핵산 서열은 원형이다. 특정 실시양태에서, 원형 HR 주형은 플라스미드, 미니서클, 또는 나노플라스미드일 수 있다. 특정 실시양태에서, HR 주형 핵산 서열은 제1 및 제2 상동성 아암을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상동성 아암은 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 것일 수 있다. 예를 들어, 각각의 상동성 아암은 1,000개 염기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상동성 아암은 세포의 제1 및 제2 내인성 서열에 대해 상동성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 내인성 로커스는 TCR 로커스이다. 예를 들어, 제1 및 제2 내인성 서열은 TCR 알파 로커스 또는 TCR 베타 로커스 내에 있다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 TCR 유전자 서열을 포함한다. 비-제한적 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 환자 특이적 TCR 유전자 서열이다. 비-제한적 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 종양-특이적이다. 비-제한적 실시양태에서, TCR 유전자 서열은 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2020/017887에 기재된 방법을 사용하여 확인되고 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 TCR 알파 유전자 서열 및 TCR 베타 유전자 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, HR 주형은 폴리시스트론성 폴리뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 유연성 폴리펩티드 서열 (예를 들어, Gly-Ser-Gly 서열)을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, HR 주형은 2A 펩티드 (예를 들어, P2A, T2A, E2A, 및 F2A)를 포함한다. HR 주형 핵산 및 그의 세포를 변형시키는 방법에 대한 추가의 정보는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2018/058230에서 발견될 수 있다.
치료 방법
본 개시된 대상은 면역 반응의 유도 및/또는 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하고/거나 증가시키는 방법을 제공한다. TET2 산물은 대상체에서 암을 치료하고/거나 예방하는데 사용될 수 있다. TET2 산물은 암을 앓고 있는 대상체의 생존을 연장시키는데 사용될 수 있다. TET2 산물은 또한 대상체에서 암을 치료하고/거나 예방하는데 사용될 수 있다. TET2 산물은 또한 대상체에서 종양 부담을 감소시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 유효량으로 TET2 산물 또는 이를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 투여하여, 기존의 상태의 경감 또는 재발의 방지인 목적하는 효과를 달성하는 것을 포함한다. 치료를 위해, 투여되는 양은 목적하는 효과를 생성하는데 있어서 유효한 양이다. 유효량은 하나 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스로 또는 연속적 관류에 의해 제공될 수 있다.
특정 실시양태에서, TET2 산물의 유효량은 정맥내 (IV) 투여를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, TET2 산물은 단일 투여로 IV 투여를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, TET2 산물은 다중 투여로 IV 투여를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, TET2 산물은 2회 이상의 투여로 IV 투여를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, TET2 산물은 2회의 투여로 IV 투여를 통해 전달된다. 특정 실시양태에서, TET2 산물은 3회의 투여로 IV 투여를 통해 전달된다.
본 개시된 대상은 대상체에서 암을 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 유효량의 TET2 산물을 암을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
암의 비-제한적 예는 혈액암 (예를 들어 백혈병, 림프종, 및 골수종), 난소암, 유방암, 방광암, 뇌암, 결장암, 장암, 간암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부 암, 위암, 교모세포종, 인후암, 흑색종, 신경모세포종, 선암종, 신경아교종, 연조직 육종, 및 다양한 암종 (전립선 및 소세포 폐암을 포함함)을 포함한다. 적합한 암종은 성상세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 희소돌기아교세포종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 원시 신경 외배엽 종양 (PNET), 연골육종, 골원성 육종, 췌장 관 선암종, 소 및 대 세포 폐 선암종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 편평 세포 암종, 기관지폐포암종, 상피 선암종, 및 그의 간 전이, 림프관육종, 림프관내피육종, 간암, 담관암종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 횡문근육종, 결장 암종, 기저 세포 암종, 한선 암종, 유두상 암종, 피지선 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 담관 암종, 융모막암종, 고환종, 배아 암종, 윌름스 종양, 고환 종양, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경 집종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 중쇄 질환, 유방 종양, 예컨대 도관 및 소엽 선암종, 자궁 경부의 편평 및 선암종, 자궁 및 난소 상피 암종, 전립선 선암종, 방광의 이행 편평 세포 암종, B 및 T 세포 림프종 (결절성 및 미만성) 형질세포종, 급성 및 만성 백혈병, 악성 흑색종, 연조직 육종 및 평활근육종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양학의 분야에 공지된 임의의 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 혈액암 (예를 들어 백혈병, 림프종, 및 골수종), 난소암, 전립선암, 유방암, 방광암, 뇌암, 결장암, 장암, 간암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 교모세포종, 및 인후암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 본 개시된 어린 T 세포 및 이를 포함하는 조성물은 통상적인 치료 개입으로 처리할 수 없는 혈액암 (예를 들어, 백혈병, 림프종, 및 골수종) 또는 난소암을 치료하고/거나 예방하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 암은 고형 암 또는 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 고형 종양 또는 고형 암은 교모세포종, 전립선 선암종, 신장 유두상 세포 암종, 육종, 난소암, 췌장 선암종, 직장 선암종, 결장 선암종, 식도 암종, 자궁 체부 자궁내막모양 암종, 유방암, 피부 피부 흑색종, 폐 선암종, 위 선암종, 자궁경부 및 자궁경관내 암, 신장 투명 세포 암종, 고환 배 세포 종양, 및 공격성 B-세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대상체는 질환의 진행된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 질환 진행의 완화 또는 반전, 및/또는 부작용의 개선을 포함할 수 있다. 대상체는 그들이 이미 치료된 상태의 병력을 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 전형적으로 재발의 위험을 감소시키거나 지연시키는 것을 포함할 것이다.
요법을 위한 적합한 인간 대상체는 전형적으로 임상적 기준에 의해 구별될 수 있는 2개의 치료 군을 포함한다. "진행된 질환" 또는 "높은 종양 부담"을 갖는 대상체는 임상적으로 측정가느안 종양을 갖는 것들이다. 임상적으로 측정가능한 종양은 종양 질량에 기반하여 검출될 수 있는 것이다 (예를 들어, 촉진, CAT 스캔, 초음파도, 유방촬영상 또는 X-선에 의해; 그들 자신 상의 양성 생화학적 또는 조직병리학적 마커는 이 집단을 확인하는데 불충분함). 제약 조성물은 그들의 상태를 경감시킬 목적으로 항-종양 반응을 유발하기 위해 이들 대상체에게 투여된다. 이상적으로, 종양 질량의 감소는 결과로서 일어나지만, 임의의 임상적 개선은 유익을 구성한다. 임상적 개선은 진행의 감소된 위험 또는 속도 또는 종양의 병리학적 결과의 감소를 포함한다.
제조품
TET2 산물은 제조품과 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 제조품은 증식성 장애 (예를 들어, 암)의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다. 제조품의 예는 용기 (예를 들어, 주입 백, 보틀, 저장 용기, 플라스크, 바이알, 시린지, 튜브, 및 IV 용액 백) 및 용기 상의 또는 그와 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용기는 TET2 산물 내의 TET2 세포의 저장 및 보존을 위해 허용되는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 예를 들어, 용기는 크리오맥스(CryoMACS) 동결 백일 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 TET2 산물이 선택의 상태 및 기원의 환자를 치료하는데 사용됨을 지시한다. 환자는 TET2 산물의 용기 상에서 확인되는데, 이는 TET2 산물이 자가 세포로부터 제조되고, 환자-특이적 및 개별화된 치료로서 조작되기 때문이다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기를 포함할 수 있다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 및 2) 그 안에 함유된 제1 용기와 동일한 TET2 산물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 임의로, 제1 및 제2 용기와 동일한 TET2 산물을 갖는 추가의 용기가 제조되고 만들어질 수 있다. 임의로, 상이한 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 추가의 용기는 또한 상기 기재된 용기와 조합될 수 있다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 및 2) 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 2종의 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 및 2) 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 및 3) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제3 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 TET2 산물은 상이한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 TET2 산물은 동일한 TET2 산물이다.
제조품 1) 그 안에 함유된 3종의 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 및 2) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 3) 그 안에 함유된 제3 TET2 산물을 갖는 제3 용기; 및 4) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제4 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 및 제3 TET2 산물은 상이한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 및 제3 TET2 산물은 동일한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 및 제3 TET2 산물 중 2개는 동일한 TET2 산물이다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 4종의 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 및 2) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 3) 그 안에 함유된 제3 TET2 산물을 갖는 제3 용기; 4) 그 안에 함유된 제4 TET2 산물을 갖는 제4 용기; 및 5) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제5 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 TET2 산물은 상이한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 TET2 산물은 동일한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 TET2 산물 중 2개는 동일한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 TET2 산물 중 3개는 동일한 TET2 산물이다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 5종 이상의 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 및 2) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 3) 그 안에 함유된 제3 TET2 산물을 갖는 제3 용기; 4) 그 안에 함유된 제4 TET2 산물을 갖는 제4 용기; 5) 그 안에 함유된 제5 TET2 산물을 갖는 제5 용기; 6) 임의로 그 안에 함유된 제6 이상의 TET2 산물을 갖는 제6 이상의 추가의 용기; 및 7) 임의로 그 안에 함유된 조성물을 갖는 추가의 용기를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다르게는 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 모든 용기는 상이한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, TET2 산물의 모든 용기는 동일한 TET2 산물이다. 특정 실시양태에서, 환자의 종양 샘플(들)에서 검출가능한 TET2의 이용가능성, 환자에 대한 다중 TET2 산물을 가질 필요성 및/또는 목적, 및 1개 이상의 용기를 요구하거나 그로부터 이익을 얻을 수 있는 어느 하나의 TET2 산물의 이용가능성에 기반하여 5개 이상의 용기에 동일하거나 상이한 TET2 산물의 임의의 조합이 있을 수 있다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 및 3) 그 안에 함유된 제3 TET2 산물을 갖는 제3 용기를 포함할 수 있다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 3) 그 안에 함유된 제3 TET2 산물을 갖는 제3 용기; 및 4) 임의로 그 안에 함유된 제4 TET2 산물을 갖는 제4 용기를 포함할 수 있다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 TET2 산물을 갖는 제1 용기; 2) 그 안에 함유된 제2 TET2 산물을 갖는 제2 용기; 3) 그 안에 함유된 제3 TET2 산물을 갖는 제3 용기; 4) 그 안에 함유된 제4 TET2 산물을 갖는 제4 용기; 및 5) 임의로 그 안에 함유된 제4 TET2 산물을 갖는 제5 용기를 포함할 수 있다.
제조품은 그 안에 함유된 1종의 TET2 산물을 갖는 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 그 안에 함유된 2종의 TET2 산물을 갖는 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 그 안에 함유된 3종의 TET2 산물을 갖는 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 그 안에 함유된 4종의 TET2 산물을 갖는 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 그 안에 함유된 5종의 TET2 산물을 갖는 용기를 포함할 수 있다.
제조품은 1) 그 안에 함유된 1종의 TET2 산물을 갖는 제1 용기, 및 2) 그 안에 함유된 2종의 TET2 산물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 1) 그 안에 함유된 2종의 TET2 산물을 갖는 제1 용기, 및 2) 그 안에 함유된 1종의 TET2 산물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 상기 예에서, 1종 이상의 추가의 TET2 산물을 포함하는 제3 및/또는 제4 용기는 제조품에 포함될 수 있다. 추가적으로, 1종 이상의 추가의 TET2 산물을 포함하는 제5 용기는 제조품에 포함될 수 있다.
더욱이, 본원에 기재된 TET2 산물의 임의의 용기는 다중 시점의 투여를 위해 및/또는 환자에 대한 적절한 용량에 기반하여 2, 3, 또는 4개의 별개의 용기로 분할될 수 있다.
특정 실시양태에서, TET2 산물은 키트에 제공된다. 키트는 비-제한적 예로서, 패키지 삽입물(들), 표지, TET2 산물(들)을 사용하는 것에 대한 지시서, 시린지, 처리 지시서, 투여 지시서, 튜빙, 바늘, 및 임상의가 TET2 산물(들)을 적절하게 투여하기 위해 필요로 할 다른 것을 함유할 수 있다.
치료 조성물 및 제조 방법
본원에 기재된 바와 같이, TET2 산물의 우수 제조 관행 (GMP) 제조를 위한 플라스미드 DNA-매개 정확성 게놈 조작 프로세스가 개발되었다. 환자-특이적 네오TCR의 표적화된 통합은 CRISPR 엔도뉴클레아제 리보핵단백질 (RNP)을 플라스미드 DNA에 의해 코딩된 개인화된 네오TCR 유전자 카세트와 함께 전기천공함으로써 달성되었다. 네오TCR에 추가로, TET2 넉아웃은 TET2 로커스를 표적화하는 CRISPR 엔도뉴클레아제 리보핵단백질 (RNP)을 전기천공함으로써 달성되었다.
TET2 산물은 임상적 제조 프로세스를 사용하여 약물 산물로 제제화될 수 있다. 이 프로세스 하에서, TET2 산물은 크리오맥스 동결 백에서 동결보존된다. 1개 이상의 백은 환자 필요에 따라 각각의 환자에 대한 부위에 선적될 수 있다. 산물은 그 환자의 종양 세포의 표면 상에 배타적으로 존재하는 내인성 HLA 수용체 중 하나에 복합체화된 네오에피토프를 표적화하는 1종 이상의 자가 네오TCR을 발현하도록 정확성 게놈 조작된 분리반출술-유래, 환자-자가, CD8 및 CD4 T 세포로 구성된다.
최종 산물은 5% 디메틸 술폭시드 (DMSO), 인간 혈청 알부민, 및 플라스마-라이트를 함유할 것이다. 최종 세포 산물은 표 1에 제공된 성분의 목록을 함유할 것이다.
표 1: TET2 산물의 조성
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조성물 및 벡터
본 개시된 대상은 본원에 개시된 세포 (예를 들어, 면역반응성 세포)를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시된 대상은 본원에 개시된 네오TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 핵산 조성물은 TET2 로커스의 유전자 파괴를 위한 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 핵산 조성물은 TET2 로커스의 유전자 파괴를 위한 Cas 뉴클레아제 및 gRNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 1-5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 또한, 이러한 핵산 조성물을 포함하는 세포가 제공된다.
특정 실시양태에서, 핵산 조성물은 TET2 로커스의 유전자 파괴를 위한 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 프로모터는 내인성 또는 외인성이다. 특정 실시양태에서, 외인성 프로모터는 신장 인자 (EF)-1 프로모터, CMV 프로모터, SV40 프로모터, PGK 프로모터, 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 유도성 프로모터는 NFAT 전사 반응 요소 (TRE) 프로모터, CD69 프로모터, CD25 프로모터, IL-2 프로모터, IL-12 프로모터, p40 프로모터, 및 Bcl-xL 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조성물 및 핵산 조성물은 관련 기술분야에 공지된 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 대상체에게 투여되고/거나 세포 내로 전달될 수 있다. 세포 (예를 들어, T 세포)의 유전자 변형은 실질적으로 균질한 세포 조성물을 재조합 DNA 구축물로 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터 (감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터 중 어느 하나)는 세포 내로의 DNA 구축물의 도입을 위해 사용된다. 예를 들어, TET2 로커스의 유전자 파괴를 위한 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 발현은 그의 내인성 프로모터로부터, 또는 관심의 표적 세포 유형에 대해 특이적인 프로모터로부터 유도될 수 있다. 비-바이러스 벡터는 또한 사용될 수 있다.
가능한 형질도입 방법은 또한 예를 들어, 문헌 [Bregni, et al. (1992) Blood 80:1418-1422]의 방법에 의한 생산자 세포와의 세포의 직접적 공동-배양, 또는 예를 들어, 문헌 [Xu, et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230]; 및 [Hughes, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817]의 방법에 의해 적절한 성장 인자 및 다가양이온과 함께 또는 없이 바이러스 상청액 단독으로 또는 농축된 벡터 스톡과 함께 배양하는 것을 포함한다.
다른 형질도입 바이러스 벡터는 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 선택된 벡터는 높은 효율의 감염 및 안정한 통합 및 발현을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997]; [Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996]; [Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997]; [Naldini et al., Science 272:263-267, 1996]; 및 [Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997] 참조). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 우두 바이러스, 소 유두종 바이러스, 또는 포진 바이러스, 예컨대 엡스타인-바르 바이러스를 포함한다 (또한, 예를 들어, 문헌 [Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990]; [Friedman, Science 244:1275-1281, 1989]; [Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988]; [Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990]; [Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991]; [Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987]; [Anderson, Science 226:401-409, 1984]; [Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991]; [Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989]; [LeGal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993]; 및 [Johnson, Chest 107:77S- 83S, 1995]의 벡터 참조). 레트로바이러스 벡터는 특히 잘 개발되어 있으며, 임상적 환경에서 사용되었다 (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., 미국 특허 번호 5,399,346).
비-바이러스 접근법은 또한 세포의 유전자 변형에 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 핵산을 리포펙션 (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리리신 접합 (Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)의 존재 하에서, 또는 외과적 조건 하에서의 미세-주사에 의해 (Wolff et al., Science 247:1465, 1990) 투여함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공, 및 원형질체 융합을 사용한 시험관내에서의 형질감염을 포함한다. 리포솜은 또한 세포 내로의 DNA의 전달을 위해 잠재적으로 유익할 수 있다. 대상체의 질환에 걸린 조직 내로의 정상 유전자의 이식은 또한 정상 핵산을 생체외에서 배양가능한 세포 유형 (예를 들어, 자가 또는 이종 1차 세포 또는 그의 자손) 내로 전달하고, 그 후 세포 (또는 그의 후손)를 표적화된 조직 내로 주사하거나, 전신적으로 주사함으로써 달성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 요법 방법은 임의의 적합한 프로모터 (예를 들어, 인간 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 또는 메탈로티오네인 프로모터)로부터 지정되고, 임의의 적절한 포유동물 조절 요소 또는 인트론 (예를 들어 신장 인자 1a 인핸서/프로모터/인트론 구조)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 경우, 특이적 세포 유형에서 유전자 발현을 우선적으로 지정하는 것으로 공지된 인핸서는 핵산의 발현을 지정하는데 사용될 수 있다. 사용되는 인핸서는 제한 없이, 조직- 또는 세포-특이적 인핸서로서 특징규명된 것들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 게놈 클론이 치료 구축물로서 사용되는 경우, 조절은 동족 조절 서열에 의해, 또는 목적하는 경우, 상기 기재된 임의의 프로모터 또는 조절 요소를 포함한 이종 공급원으로부터 유래된 조절 서열에 의해 매개될 수 있다.
생성된 세포는 비변형된 세포에 대한 것들과 유사한 조건 하에서 성장될 수 있으며, 그에 의해 변형된 세포는 확장되고 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다.
키트
본 개시된 대상은 면역 반응을 유도하고/거나 증진시키고/거나, 대상체에서 암 또는 병원체 감염을 치료하고/거나 예방하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본 개시된 세포 또는 이를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 멸균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 융리, 적층 종이, 금속 호일, 또는 의약을 보유하는데 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.
목적하는 경우, 세포 및/또는 핵산 분자는 세포 또는 핵산 분자를 암 또는 병원체 또는 면역 장애를 갖거나 이를 발달시킬 위험이 있는 대상체에게 투여하는 것에 대한 지시서와 함께 제공된다. 지시서는 일반적으로 신생물 또는 병원체 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물의 사용에 관한 정보를 포함한다. 특정 실시양태에서, 지시서는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 설명; 암, 병원체 감염, 또는 면역 장애 또는 그의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 스케줄 및 투여; 예방책; 경고; 적응증; 금기증; 과다-투여량 정보; 유해 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 지시서는 용기 상에 직접적으로 인쇄될 수 있거나 (존재하는 경우), 용기에 적용된 표지로서, 또는 별개의 쉬트, 팸플릿, 카드, 또는 용기에 또는 그와 함께 공급된 폴더로서일 수 있다. 생성된 세포는 비변형된 세포에 대한 것들과 유사한 조건 하에서 성장될 수 있으며, 그에 의해 변형된 세포는 확장되고 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다.
예시적인 실시양태
A. 특정 비-제한적 실시양태에서, 본 개시된 대상은 외인성 T 세포 수용체 (TCR), 및 TET2 로커스의 유전자 파괴를 포함하는 세포를 제공한다.
A1. 유전자 파괴가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 A의 상기 세포.
A2. 유전자 파괴가 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 A 또는 A1의 상기 세포.
A3. TET2 로커스의 유전자 파괴가 비-기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것인 A-A2의 상기 세포.
A4. TET2 로커스의 유전자 파괴가 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시키는 것인 A-A3의 상기 세포.
A5. gRNA 및 Cas9 뉴클레아제를 포함하는 A-A4의 상기 세포.
A6. gRNA가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 A5의 상기 세포.
A7. TET2 로커스의 유전자 파괴가 세포 존속을 증진시키는 것인 A-A6의 상기 세포.
A8. TET2 로커스의 유전자 파괴가 기억 세포 분화를 증진시키는 것인 A-A7의 상기 세포.
A9. 세포가 1차 세포인 A-A8의 상기 세포.
A10. 세포가 환자-유래 세포인 A-A9의 상기 세포.
A11. 세포가 림프구인 A-A10의 상기 세포.
A12. 세포가 T 세포인 A-A11의 상기 세포.
A13. 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+인 A12의 상기 세포.
A14. 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+인 A12의 상기 세포.
A15. 세포가 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+인 A12의 상기 세포.
A16. 외인성 TCR이 환자-유래 TCR인 A-A15의 상기 세포.
A17. 외인성 TCR이 신호 서열, 제1 및 제2 2A 서열, 및 TCR 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 A-A16의 상기 세포.
A18. 외인성 TCR이 암 항원을 인식하는 것인 A-A17의 상기 세포.
A19. 암 항원이 신생항원인 A18의 상기 세포.
A20. 암 항원이 환자 특이적 항원인 A18의 상기 세포.
B. 특정 비-제한적 실시양태에서, 본 개시된 대상은 세포 내로 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 도입하고; HR 주형 핵산을 세포의 내인성 로커스 내로 재조합하고; 세포의 TET2 로커스를 파괴하는 것을 포함하는 프로세스에 의해 변형된 세포를 제공한다.
B1. HR 주형이 제1 및 제2 표적 핵산 서열에 대해 상동성인 제1 및 제2 상동성 아암; 및 제1 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 TCR 유전자 서열을 포함하는 것인 B의 상기 세포.
B2. HR 주형이 TCR 유전자 서열의 상류에 위치한 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열의 하류에 위치한 제2 2A-코딩 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 2A-코딩 서열은 서로에 대해 코돈-분기된 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 것인 B 또는 B1의 상기 세포.
B3. 2A-코딩 서열이 P2A-코딩 서열인 B2의 상기 세포.
B4. 아미노산 서열 Gly Ser Gly를 코딩하는 서열이 2A-코딩 서열의 바로 상류에 위치하는 것인 B2 또는 B3의 상기 세포.
B5. HR 주형이 제2 2A-코딩 서열의 상류에 위치한 푸린 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 B-B4의 상기 세포.
B6. 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 B1-B5의 상기 세포.
B7. 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 600개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 B1-B5의 상기 세포.
B8. HR 주형이 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 B2-B7의 상기 세포.
B9. HR 주형이 제2 2A-코딩 서열 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 제2 TCR 서열을 포함하는 것인 B2-B8의 상기 세포.
B10. HR 주형이 제1 2A-코딩 서열 및 제1 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제1 신호 서열; 및 제2 2A-코딩 서열 및 제2 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제2 신호 서열을 포함하며; 여기서 제1 및 제2 신호 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 서로에 대해 코돈 분기된 것인 B9의 상기 세포.
B11. 신호 서열이 인간 성장 호르몬 신호 서열인 B8 또는 B10의 상기 세포.
B12. HR 주형이 비-바이러스성인 B-B11의 상기 세포.
B13. HR 주형이 원형 DNA인 B-B12의 상기 세포.
B14. HR 주형이 선형 DNA인 B-B12의 상기 세포.
B15. 도입이 전기천공을 통해 일어나는 것인 B-B14의 상기 세포.
B16. 재조합이 뉴클레아제에 의한 내인성 로커스의 절단; 및 상동성 지정 복구에 의한 내인성 로커스 내로의 HR 주형 핵산 서열의 재조합을 포함하는 것인 B-B15의 상기 세포.
B17. 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 B16의 상기 세포.
B18. gRNA를 추가로 포함하는 B17의 상기 세포.
B19. 파괴가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 B-B18의 상기 세포.
B20. 파괴가 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 B-B19의 상기 세포.
B21. 파괴가 비-기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것인 B-B20의 상기 세포.
B22. 파괴가 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시키는 것인 B-B21의 상기 세포.
B23. 파괴가 뉴클레아제에 의한 TET2 로커스의 절단을 포함하는 것인 B-B22의 상기 세포.
B24. 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 B23의 상기 세포.
B25. gRNA를 추가로 포함하는 B24의 상기 세포.
B26. gRNA가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 포함하는 것인 B25의 상기 세포.
B27. 뉴클레아제가 벡터에 의해 발현되는 것인 B23-B26의 상기 세포.
B28. gRNA가 벡터에 의해 발현되는 것인 B25-B27의 상기 세포.
B29. 벡터가 바이러스 벡터인 B27 또는 B28의 상기 세포.
B30. 벡터가 비-바이러스 벡터인 B27 또는 B28의 상기 세포.
B31. TET2 로커스의 파괴가 세포 존속을 증진시키는 것인 B-B30의 상기 세포.
B32. TET2 로커스의 파괴가 기억 세포 분화를 증진시키는 것인 B-B31의 상기 세포.
B33. 세포가 1차 세포인 B-B32의 상기 세포.
B34. 세포가 환자-유래 세포인 B-B33의 상기 세포.
B35. 세포가 림프구인 B-B34의 상기 세포.
B36. 세포가 T 세포인 B-B35의 상기 세포.
B37. T 세포가 환자-유래 세포인 B36의 상기 세포.
B38. 세포가 어린 T 세포인 B-B37의 상기 세포.
B39. 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+인 B38의 상기 세포.
B40. 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+인 B38의 상기 세포.
B41. 세포가 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+인 B38의 상기 세포.
B42. 내인성 로커스가 내인성 TCR 유전자 내에 있는 것인 B-B41의 상기 세포.
B43. TCR 유전자 서열이 종양 항원을 인식하는 TCR을 코딩하는 것인 B1-B42의 상기 세포.
B44. 종양 항원이 신생항원인 B43의 상기 세포.
B45. 종양 항원이 환자 특이적 신생항원인 B43의 상기 세포.
B46. TCR 유전자 서열이 환자 특이적 TCR 유전자 서열인 B1-B45의 상기 세포.
B47. 프로세스가 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 B-B46의 상기 세포.
B48. 배양이 적어도 1종의 시토카인의 존재 하에서 수행되는 것인 B47의 상기 세포.
B49. 배양이 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서 수행되는 것인 B47 또는 B48의 상기 세포.
B50. 배양이 IL7 및 IL15의 존재 하에서 수행되는 것인 B47 또는 B48의 상기 세포.
C. 특정 비-제한적 실시양태에서, 본 개시된 대상은 세포 내로 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 도입하고; HR 주형 핵산을 세포의 내인성 로커스 내로 재조합하고; 세포의 TET2 로커스를 파괴하는 것을 포함하는, 세포를 변형시키는 방법을 제공한다.
C1. HR 주형이 제1 및 제2 표적 핵산 서열에 대해 상동성인 제1 및 제2 상동성 아암; 및 제1 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 TCR 유전자 서열을 포함하는 것인 C의 상기 방법.
C2. HR 주형이 TCR 유전자 서열의 상류에 위치한 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열의 하류에 위치한 제2 2A-코딩 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 2A-코딩 서열은 서로에 대해 코돈-분기된 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 것인 C 또는 C1의 상기 방법.
C3. 2A-코딩 서열이 P2A-코딩 서열인 C1 또는 C2의 상기 방법.
C4. 아미노산 서열 Gly Ser Gly를 코딩하는 서열이 2A-코딩 서열의 바로 상류에 위치하는 것인 C2 또는 C3의 상기 방법.
C5. HR 주형이 제2 2A-코딩 서열의 상류에 위치한 푸린 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 C2-C4의 상기 방법.
C6. 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 C1-C5의 상기 방법.
C7. 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 600개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 C1-C6의 상기 방법.
C8. HR 주형이 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 C2-C7의 상기 방법.
C9. HR 주형이 제2 2A-코딩 서열 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 제2 TCR 서열을 포함하는 것인 C2-C8의 상기 방법.
C10. HR 주형이 제1 2A-코딩 서열 및 제1 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제1 신호 서열; 및 제2 2A-코딩 서열 및 제2 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제2 신호 서열을 포함하며; 여기서 제1 및 제2 신호 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 서로에 대해 코돈 분기된 것인 C9의 상기 방법.
C11. 신호 서열이 인간 성장 호르몬 신호 서열인 C8 또는 C10의 상기 방법.
C12. HR 주형이 비-바이러스성인 C1-C11의 상기 방법.
C13. HR 주형이 원형 DNA인 C-C12의 상기 방법.
C14. HR 주형이 선형 DNA인 C-C13의 상기 방법.
C15. 도입이 전기천공을 통해 일어나는 것인 C-C14의 상기 방법.
C16. 재조합이 뉴클레아제에 의한 내인성 로커스의 절단; 및 상동성 지정 복구에 의한 내인성 로커스 내로의 HR 주형 핵산 서열의 재조합을 포함하는 것인 C-C15의 상기 방법.
C17. 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 C16의 상기 방법.
C18. gRNA를 추가로 포함하는 C17의 상기 방법.
C19. 파괴가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 C-C18의 상기 방법.
C20. 파괴가 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 C-C19의 상기 방법.
C21. 파괴가 비-기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것인 C-C20의 상기 방법.
C22. 파괴가 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시키는 것인 C-C21의 상기 방법.
C23. 파괴가 뉴클레아제에 의한 TET2 로커스의 절단을 포함하는 것인 C-C22의 상기 방법.
C24. 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 C23의 상기 방법.
C25. gRNA를 추가로 포함하는 C24의 상기 방법.
C26. gRNA가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 포함하는 것인 C25의 상기 방법.
C27. 뉴클레아제가 벡터에 의해 발현되는 것인 C23-C26의 상기 방법.
C28. gRNA가 벡터에 의해 발현되는 것인 C25-C27의 상기 방법.
C29. 벡터가 바이러스 벡터인 C27 또는 C28의 상기 방법.
C30. 벡터가 비-바이러스 벡터인 C27-C29의 상기 방법.
C31. TET2 로커스의 파괴가 세포 존속을 증진시키는 것인 C-C30의 상기 방법.
C32. TET2 로커스의 파괴가 기억 세포 분화를 증진시키는 것인 C-C31의 상기 방법.
C33. 세포가 1차 세포인 C-C32의 상기 방법.
C34. 세포가 환자-유래 세포인 C-C32의 상기 방법.
C35. 세포가 림프구인 C-C32의 상기 방법.
C36. 세포가 T 세포인 C-C32의 상기 방법.
C37. T 세포가 환자-유래 세포인 C36의 상기 방법.
C38. 세포가 어린 T 세포인 C-C32의 상기 방법.
C39. 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+인 C38의 상기 방법.
C40. 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+인 C38의 상기 방법.
C41. 세포가 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+인 C38의 상기 방법.
C42. 내인성 로커스가 내인성 TCR 유전자 내에 있는 것인 C-C41의 상기 방법.
C43. TCR 유전자 서열이 종양 항원을 인식하는 TCR을 코딩하는 것인 C1-C42의 상기 방법.
C44. 종양 항원이 신생항원인 C43의 상기 방법.
C45. 종양 항원이 환자 특이적 신생항원인 C43의 상기 방법.
C46. TCR 유전자 서열이 환자 특이적 TCR 유전자 서열인 C1-C45의 상기 방법.
C47. 방법이 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 C-C46의 상기 방법.
C48. 배양이 적어도 1종의 시토카인의 존재 하에서 수행되는 것인 C47의 상기 방법.
C49. 배양이 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서 수행되는 것인 C47 또는 C48의 상기 방법.
C50. 배양이 IL7 및 IL15의 존재 하에서 수행되는 것인 C47 또는 C48의 상기 방법.
D. 특정 비-제한적 실시양태에서, 본 개시된 대상은 A-A20 또는 B-B50 중 어느 하나의 세포의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
D1. 세포의 치료 유효량을 투여하기 전에, 비-골수소멸성 림프구고갈 레지멘이 대상체에게 투여되는 것인 D의 상기 방법.
D2. 암이 고형 종양인 D 또는 D1의 상기 방법.
D3. 암이 액상 종양인 D 또는 D1의 상기 방법.
D4. 고형 종양이 흑색종, 흉부암, 폐암, 난소암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 전립선암, 부인과암, 중추 신경계암, 피부암, HPV+ 암, 식도암, 갑상선암, 위암, 간세포암, 담관암종, 신세포암, 고환암, 육종, 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 D2의 상기 방법.
D5. 액상 종양이 소포성 림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 D3의 상기 방법.
E. 특정 비-제한적 실시양태에서, 본 개시된 대상은 A-A20 또는 B-B50 중 어느 하나의 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다.
E1. 조성물이 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물인 E의 상기 조성물.
E2. 조성물이 암의 치료를 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여되는 것인 E 또는 E1의 상기 조성물.
E3. 조성물이 동결보존제를 포함하는 것인 E-E2의 상기 조성물.
E4. 조성물이 혈청 알부민을 포함하는 것인 E-E3의 상기 조성물.
E5. 조성물이 플라스마-라이트 A, HSA, 및 크리오스토르 CS10을 포함하는 것인 E-E4의 상기 조성물.
F. 특정 비-제한적 실시양태에서, 본 개시된 대상은 A-A20 또는 B-B50 중 어느 하나의 세포, C-C50 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 시약, 또는 E-E5 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
F1. 키트가 암을 치료하는 것에 대한 서면 지시서를 추가로 포함하는 것인 F의 상기 키트.
실시예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 구체적인 실시양태의 실시예이다. 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 기울여졌으나, 일부 실험적 오차 및 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)]; [A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]; [Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)]을 참조한다.
환자의 종양 세포의 표면 상에 배타적으로 제시된 네오에피토프 (네오TCR)를 표적화하는 자가 T 세포 수용체를 발현하도록 정확성 게놈 조작된 분리반출술-유래, 환자-자가, CD8 및 CD4 T 세포로 구성되된 개인화된 입양 T 세포 요법을 생성하기 위한 네오TCR을 발현하고 TET2의 발현을 넉아웃시키도록 T 세포를 조작하는 (즉, TET2 산물) 실시예가 본원에서 제공되며, 여기서 TET2 산물은 어린 표현형을 갖는 T 세포를 포함한다.
실시예 1. 네오TCR의 표적 통합
PCT/US2020/17887 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 imPACT 단리 기술에 의해 확인된 네오에피토프-특이적 TCR을 사용하여 상동성 재조합 (HR) DNA 주형을 생성하였다. 이들 HR 주형을 부위-특이적 뉴클레아제와 나란히 1차 인간 T 세포 내로 형질감염시켰다 (도 2a-2c, 및 도 3 참조). 단일-단계 비-바이러스 정확성 게놈 조작은 내인성 프로모터에 의해 발현된 환자의 네오에피토프-특이적 TCR로의 내인성 TCR의 심리스 대체를 발생시켰다. 표면 상에 발현된 TCR은 서열에 있어서 전체적으로 천연이다.
네오TCR-T 세포 게놈 조작의 정확성을 오프-타겟 통합 핫 스팟 또는 전위에 대한 표적화된 로커스 증폭 (TLA)에 의해, 및 차세대 시퀀싱 기반 오프-타겟 절단 검정에 의해 평가하고, 비의도된 결과의 증거를 결여함을 발견하였다.
도 2a-2c에 나타내어진 바와 같이, 관심의 유전자를 함유하는 구축물을 내인성 로커스 내로 삽입하였다. 이는 좌측 및 우측 HR 아암에 의해 플랭킹된 관심의 유전자의 코딩 서열을 함유하는 상동성 복구 주형의 사용으로 달성되었다. HR 아암에 추가로, 관심의 유전자를 2A 펩티드, 관심의 상류 번역된 유전자로부터 2A 펩티드를 제거하는 2A 펩티드의 상류인 프로테아제 절단 부위, 및 신호 서열 사이에 끼워 넣었다 (도 2b). 게놈 내로 통합되면, 관심의 발현 유전자 카세트의 유전자를 단일 메신저 RNA로서 전사하였다. 메신저 RNA에서의 관심의 이 유전자의 번역 동안, 플랭킹 영역을 자기-절단 2A 펩티드에 의해 관심의 유전자로부터 풀고, 프로테아제 절단 부위를 관심의 번역된 유전자로부터 상류의 2A 펩티드의 제거를 위해 절단하였다 (도 2c). 2A 펩티드 및 프로테아제 절단 부위에 추가로, gly-ser-gly (GSG) 링커를 각각의 2A 펩티드 앞에 삽입하여 발현 카세트에서 다른 요소로부터 관심의 유전자의 분리를 추가로 증진시켰다.
P2A 펩티드는 그의 효율적인 절단 때문에 네오TCR 및 TET2 산물에 대해 다른 2A 펩티드보다 우수한 것으로 결정되었다. 따라서, 두 (2)가지 P2A 펩티드 및 코돈 분기성을 사용하여, P2A 펩티드로부터 관심의 유전자의 어느 하나의 말단 상에 나머지 아미노산으로부터 임의의 외인성 에피토프를 도입하지 않고 관심의 유전자를 발현시켰다. 외인성 에피토프를 갖지 않는 (즉, 관심의 유전자의 어느 하나의 측 상에 플랭킹 P2A 펩티드 아미노산을 갖지 않는) 유전자 편집된 세포의 유익은 면역원성이 대폭 감소되고, 유전자 편집된 세포를 함유하는 네오TCR 및 TET2 산물로 주입된 환자가 유전자 편집된 세포에 대한 면역 반응을 가질 가능성이 적다는 것이다.
PCT/US/2018/058230에 기재된 바와 같이, 네오TCR은 T 세포의 TCRα 로커스 내로 통합되었다. 구체적으로, 좌측 및 우측 HR 아암에 의해 플랭킹된 네오TCR 코딩 서열을 함유하는 상동성 복구 주형을 사용하였다. 또한, 내인성 TCRβ 로커스는 파괴되어 단지 네오TCR 구축물에 의해 코딩된 TCR 서열의 발현을 초래하였다. 일반적 전략을 원형 HR 주형을 사용하여 뿐만 아니라 선형 주형으로 적용하였다.
신생항원-특이적 TCR 구축물 디자인은 도 3a 및 3b에 도해된다. 표적 TCRα 로커스 (Cα)는 플라스미드 HR 주형과 함께 나타내어지고, 생성된 편집된 서열 및 하류 mRNA/단백질 산물이 나타내어진다. 표적 TCRα 로커스 (내인성 TRAC) 및 그의 CRISPR Cas9 표적 부위 (수평 줄무늬, 절단 부위는 화살표에 의해 표시됨)가 나타내어진다 (도 3a). 좌측 및 우측 상동성 아암 (각각 "LHA" 및 "RHA") 사이에 위치한 네오TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 원형 플라스미드 HR 주형이 나타내어진다 (도 3a). 코돈 최적화된 HR 주형에 의해 도입된 TRAC의 영역이 나타내어진다 (수직 줄무늬). TCRβ 불변 도메인은 TRBC2로부터 유래되었으며, 이는 TRBC1에 대해 기능적으로 등가인 것으로 지시된다. 네오TCR 카세트 중의 다른 요소는 2A = 2A 리보솜 스키핑 요소 (비-제한적 예로서, 카세트에 사용된 2A 펩티드는 번역된 산물에서 임의의 그러지 않다면 발생하는 비-내인성 에피토프를 제거하는 코돈 분기성과 조합으로 사용된 둘 다의 P2A 서열임); P = 상류 TCRβ 단백질로부터 2A 태그를 제거하는 2A의 상류의 프로테아제 절단 부위 (비-제한적 예로서, 프로테아제 절단 부위는 푸린 프로테아제 절단 부위일 수 있음); SS = 신호 서열 (비-제한된 예로서, 신호 서열은 인간 성장 호르몬 신호 서열일 수 있음)을 포함한다. 네오TCR 발현 유전자 카세트의 HR 주형은 TCRα 가이드 RNA를 갖는 CRISPR Cas9 뉴클레아제 RNP에 의해 표적화된 TCRα 게놈 로커스 내로의 삽입을 지정하는 2개의 플랭킹 상동성 아암을 포함한다. 이들 상동성 아암 (LHA 및 RHA)은 네오TCR 발현 유전자 카세트의 네오E-특이적 TCR 서열을 플랭킹한다. 이 실시예에 사용된 프로테아제 절단 부위는 푸린 프로테아제 절단 부위였지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적절한 프로테아제 절단 부위가 사용될 수 있다. 유사하게, HGH는 이 실시예를 위해 선택된 신호 서열이었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 신호 서열은 목적하는 트래피킹에 기반하여 선택되고 사용될 수 있다.
게놈 내로 통합되면 (도 2c), 네오TCR 발현 유전자 카세트는 그 개별적인 T 세포로부터의 내인성 TCRα 폴리펩티드의 부분을 여전히 포함하는 내인성 TCRα 프로모터로부터 단일 메신저 RNA로서 전사된다 (도 2c). 이 단일 네오TCR 메신저 RNA의 리보솜 폴리펩티드 번역 동안, 네오TCR 서열은 P2A 펩티드에서의 자기-절단에 의해 내인성, CRISPR-파괴된 TCRα 폴리펩티드로부터 풀린다 (도 2c). 코딩된 네오TCRα 및 네오TCRβ 폴리펩티드는 또한 네오TCR 발현 유전자 카세트에 포함된 내인성 세포성 인간 푸린 프로테아제 및 제2 자기-절단 P2A 서열 모티프에 의한 절단을 통해 서로로부터 풀린다 (도 2c). 네오TCRα 및 네오TCRβ 폴리펩티드는 T 세포 표면에 대한 네오TCR 단백질 복합체의 다량체 어셈블리 및 트래피킹을 위해 신호 리더 서열 (인간 성장 호르몬, HGH로부터 유래됨)에 의해 세포질 세망에 별개로 표적화된다. 푸린 프로테아제 절단 부위의 포함은 상류 TCRβ 쇄로부터 2A 서열의 제거를 용이하게 하여 TCRβ 기능의 잠재적 간섭을 감소시킨다. 각각의 2A 앞에 gly-ser-gly 링커의 포함 (나타내지 않음)은 3개의 폴리펩티드의 분리를 추가로 증진시킨다.
추가적으로, 3개의 반복된 단백질 서열은 HR 주형 내에서 코돈 분기되어 게놈 안정성을 촉진시킨다. TCR 유전자 카세트 내에서, 2개의 P2A는 서로에 대해 코돈 분기될 뿐만 아니라 2개의 HGH 신호 서열은 서로에 대해 코돈 분기되어 생체외 조작된 T 세포의 게놈 내의 도입된 네오TCR 카세트 서열의 안정성을 촉진시킨다. 유사하게, TRAC 엑손 1 (수직 줄무늬)의 재-도입된 5' 말단은 전체 카세트가 2개의 직접적 반복부의 개재 서열의 제거를 통해 시간 경과에 따라 소실될 가능성을 감소시킨다.
네오TCR 산물에 추가로, 이 방법은 임의의 TET2 산물에 사용될 수 있다.
도 3은 네오E TCR 카세트의 정확한 표적 통합을 확인하는 인-아웃 PCR의 결과를 나타낸다. 아가로스 겔은 통합 카세트 및 부위에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR의 결과가 단지 뉴클레아제 및 DNA 주형 둘 다로 처리된 세포 (KOKI 및 KOKIKO)에 대해서만 예상된 크기의 산물을 생성함을 나타내며, 이는 부위-특이적 및 정확한 통합을 입증한다.
더욱이, 표적화된 로커스 증폭 (TLA)을 사용하여 표적화된 통합의 특이성을 확인하였다. 가교, 라이게이션, 및 네오TCR 삽입물에 특이적인 프라이머의 사용을 사용하여 통합의 부위(들) 주위의 서열을 얻었다. 게놈에 대해 맵핑된 판독물은 10 kb 간격으로 비닝된다. 유의한 판독물 깊이를 단지 염색체 14 상의 의도된 부위 통합 부위 주위에서 얻었으며, 이는 공통 오프-타겟 삽입 부위의 증거가 없음을 나타낸다.
내인성 TCR에 대한 항체 염색 및 및 네오TCR에 대한 펩티드-HLA 염색은 조작이 네오TCR의 고 빈도 넉-인을 발생시킴을 밝혀내었으며, 일부 TCR- 세포 및 소수의 WT T 세포가 남는다 (도 4a). 넉-인은 외인성 프로모터의 부재 하에서 네오TCR 발현에 의해 입증된다. 조작을 유사한 결과를 갖는 동일한 네오TCR을 사용하여 다수회 수행하였다 (도 4b). 따라서, 조작된 T 세포에서 네오TCR의 효율적이고 일관된 발현 및 내인성 TCR의 넉아웃이 달성되었다.
실시예 2. TET2 넉아웃 네오TCR-P1 T 세포의 생성
물질 및 방법. T 세포를 실시예 1 및 PCT/US2020/17887 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 TRA 및 TRB gRNA-Cas9 RNP와 함께 Cas9 RNP로서 TET2의 제1 엑손을 표적화하는 gRNA로 형질감염시켜, 내인성 TET2 코딩 서열의 파괴 및 감소된 TET2 단백질 발현 (즉, TET2 산물)을 발생시켰다.
T 세포 단리 및 편집. 먼저 공여자의 류코팩으로부터 CD4 및 CD8 T 세포를 단리하고, 이어서 TET2 유전자를 넉아웃시키는 TET2 gRNA와 함께 TCRα 및 TCRβ gRNA로 세포를 형질감염시킴으로써 (실시예 1에 개시된 네오TCR 통합 방법을 사용하여) TET2 산물을 제조하였다. TET2에 특이적으로 결합하고, TET2 유전자를 파괴하고, TET2 유전자 발현을 넉아웃시키는 임의의 gRNA가 사용될 수 있지만, 표 2에 제공된 예시적인 gRNA가 본원에 사용되었다. sgRNA 1 및 5는 음성 가닥 sgRNA이고, sgRNA 2-4는 양성 가닥 sgRNA이다.
표 2. gRNA를 플랭킹하는 영역을 위한 예시적인 프라이머
Figure pct00002
gRNA 선택 및 반응. 상기 기재된 TET2 gRNA-Cas9 RNP 편집된 CD4 및 CD8 T 세포 (즉, TET2 산물)를 용해시키고, DNA를 추출하였다. gRNA 표적 부위를 플랭킹하는 영역을 표 3에 제공된 예시적인 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다. 대안적으로, 보다 많은 특이성을 갖는 재디자인된 프라이머 또는 증폭을 달성하도록 디자인된 교대 프라이머가 또한 사용될 수 있다. 이어서, PCR 앰플리콘을 T7 엔도뉴클레아제 I (NEB)과 함께 인큐베이션하고, 생성된 산물을 아가로스 겔 상에서 구동하였다 (도 6a 및 6b).
표 3. gRNA를 플랭킹하는 영역을 위한 예시적인 프라이머
Figure pct00003
TET2_1 Fwd 프라이머 (서열식별번호: 6)를 sgRNA 1 (서열식별번호: 1), 4 (서열식별번호: 4), 및 5 (서열식별번호: 5)에 대한 sgRNA 인델을 분석하는데 사용하였다. 이 반응에 대한 예상된 산물 크기는 849 bp이다.
TET2_1 Rev 프라이머 (서열식별번호: 7)를 sgRNA 1 (서열식별번호: 1), 4 (서열식별번호: 4), 및 5 (서열식별번호: 5)에 대한 sgRNA 인델을 분석하는데 사용하였다. 이 반응에 대한 예상된 산물 크기는 849 bp이다.
TET2_2 Fwd 프라이머 (서열식별번호: 8)를 sgRNA 2 (서열식별번호: 2) 및 3 (서열식별번호: 3)에 대한 sgRNA 인델을 분석하는데 사용하였다. 이 반응에 대한 예상된 산물 크기는 1032 bp이다.
TET2_2 Rev 프라이머 (서열식별번호: 9)를 sgRNA (서열식별번호: 2) 및 3 (서열식별번호: 3)에 대한 sgRNA 인델을 분석하는데 사용하였다. 이 반응에 대한 예상된 산물 크기는 1032 bp이다.
최적 gRNA를 T7 엔도뉴클레아제 I (T7EI) 검정을 통해 TET2 넉아웃 (KO)을 평가함으로써 결정하여 비-완벽하게 어닐링된 PCR 산물을 검출하였다. 유전자 발현의 소실의 추가의 특징규명을 TET2 mRNA의 qPCR 정량화 및 TET2 gRNA로 뉴클레오펙션된 네오TCR T 세포에서의 TET2 단백질에 대한 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. TET2 gRNA로 처리되지 않은 T 세포를 TET2 유전자 및 단백질 발현에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. T7EI 검정은 T7EI 효소에 의해 절단된 PCR 산물의 분율을 측정함으로써 gRNA 표적화 효율을 정량화하였다. TET2 mRNA 전사체 풍부도를 qPCR에 의해 결정하였다. TET2 단백질 풍부도를 항-TET2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 통해 결정하였다. TET2 유전자의 성공적인 넉아웃은 네오TCR 산물의 그것에 비해 TET2 산물에서의 감소된 mRNA 및 단백질 수준을 발생시켰다.
crispr-dav (https://github.com/pinetree1/crispr-dav/blob/master/Install-and-Run.md#description-of-files-created-by-prepare_runpl-script) 분석을 수행하여 아웃프레임 인델을 생성하기 위한 가장 효율적인 gRNA를 확인하였다. PCR 앰플리콘의 커버리지는 가이드 부위 주위의 모든 앰플리콘에 대해 왕성하였다. 도 7a-7e를 참조한다.
5가지 별개의 가이드 RNA를 TET2의 제1 코딩 엑손을 표적화하고, T7E1 커팅 효율 검정 뿐만 아니라 PCR 앰플리콘 DNA 트랜스포존-기반 시퀀싱에 의해 평가된 바와 같이 프레임 인델을 왕성하게 편집하고 그 중 >70%를 초래하도록 디자인하였다 (도 8a 및 8b).
TET2 활성의 소실을 확인하기 위해, 폴리클로날 항-5hmC 항체 (액티브 모티프(Active Motif); 1 ug/mL; 카탈로그 번호 39791)를 사용한 5-hmC의 세포내 염색을 수행하였다. 구체적으로, 5-hmC 유동 세포계측법 실험을 하기와 같이 수행하였다: 1) WT 및 각각의 gRNA 뉴클레오펙션된 샘플로부터의 200K T 세포를 플레이트 코팅된 PACT035 comPACT 상에서 1.5시간 동안 자극시키고, 2) 이어서 샘플을 수거하고, 라이브/데드에 대해 염색하고, 이어서 BD ICS 픽스(Fix)/펌(Perm)으로 고정시키고, 이어서 2회 세척하고, 염색 완충제에 재현탁시키고, 3) 세포를 펌 완충제에서 15분 동안 투과화하고, 4) 세포를 펌 완충제 중 DNaseI (300ug/mL)로 37C에서 3시간 동안 처리하고 (1시간 동안 처리되기를 원함), 5) 세포를 펌 완충제로 2X 세척하고, 6) 세포를 펌 완충제 중 항-5-hmC (1ug/mL)로 4C에서 30분 동안 염색하고, 7) 세포를 펌 완충제로 2X 세척하고, 8) 세포를 항-토끼 IgG-AF647 (5uL/50uL)로 4C에서 30분 동안 염색하고, 9) 세포를 펌 완충제로 2X 세척하고, 10) 세포를 유동 세포계측기로의 프로세싱을 위해 200uL에 재현탁시켰다.
5-hmC 염색은 휴지 TET2 산물 v. 자극된 TET2 산물의 5-hmC 상태의 주목할 만한 차이가 없었음을 나타내었다. 동족 comPACT 플레이트 코팅을 갖는 1.5시간 자극이 있는 또는 없는 TET2의 부재 하에서 5-hmC의 주목할 만한 감소는 관찰되지 않았다. 도 9를 참조한다.
TET2 파괴의 효과를 추가로 특징규명하기 위해, ATAC-seq (문헌 [Buenrostro et al., 2013, N. Methods, 10(12) 1213-1218]에 기재된 바와 같음)를 TET2 산물에 대해 수행하여 세포의 게놈-범위 염색질 상태를 결정하였다.
휴지 TET2 산물의 TCF7 및 TBET 염색을 또한 수행하였다 (도 10). TET2를 넉아웃시키는 것은 TCF7 및 TBET 전사 인자의 발현에 대한 효과를 갖지 않았음이 나타났다.
IFNγ를 생산하는 TET2 산물의 능력을 시험하였다 (도 11a). TET2를 넉아웃시키는 것은 네오TCR 산물에 비해 IFNγ 생산 T 세포의 빈도를 감소시킨 것으로 결정되었다.
TET2 산물을 시험하여 CD107a+ 세포의 수가 넉아웃에 의해 영향을 받을 것인지를 결정하였다 (도 11b). TET2를 넉아웃시키는 것은 네오TCR 산물에 비해 CD107a+ T 세포의 빈도를 감소시킨 것으로 결정되었다.
인큐사이트 실험의 다중 라운드를 TET2 산물 ("PACT-035-TCR089" 세포) 및 네오TCR 산물 ("PACT035-TCR089 TET2 gRNA3" 세포)을 사용하여 수행하였다 (도 12a 및 12b). 이들 실험에서, TET2 산물 및 네오TCR 산물로부터의 유전자 편집 후 14일 세포 및 유전자 편집 후 > 30일 세포를 사용하였다. >30일 TET2 산물 세포는 >30일 네오TCR 산물 세포보다 더 효과적인 살해자였음이 관찰되었지만 (데이터는 나타내지 않음), 둘 다의 산물의 14일 세포 사이에는 차이가 없었다 (도 12a 및 12b). 둘 다의 경우, 대조군을 수행하였으며, TET2 산물 세포 및 네오TCR 산물 세포는 COX6C R20Q 돌연변이를 결여한 SW620 세포를 살해하지 않았다. 이들 인큐사이트 실험은 TET2 결함성을 조작하는 세포의 유전자 편집 후 일수가 세포의 표현형에 영향을 미침을 입증한다.
TET2 파괴는 CD8 기억 세포 분화를 증진시킨다 (Carty et al., 2018; Fraietta et al., 2018, Nature, 558(7709), 307-312). 편집된 세포의 표현형적 상태를 CCR7 및 CD27에 대한 항체로의 염색 후에 유동 세포계측법을 통해 평가하였다. 이들 실험에 기반하여, TET2 산물은 대조군 T 세포 및 네오TCR 산물과 비교하여 CCR7 및 CD27의 발현에 대해 풍부화됨이 나타났으며, 이는 TET2 산물이 Tcm T 세포를 포함함을 지시한다.
CD27은 TNF 수용체 패밀리의 구성원이다. 이는 또한 중심 기억 T (Tcm) 및 나이브 T 세포 (Tn) 상에 구성적으로 발현된다. TET2 산물 세포가 기억-유사 표현형을 가졌는지를 결정하기 위해, TET2 산물 세포를 동족 comPACT 코팅을 통해 7일 동안 자극시켰다. 이 자극은 TET2 산물 세포 중에서 CD27 (도 14b) 및 CCR7 (도 14a)을 발현하는 세포의 증가된 빈도를 밝혀내었다. 다시 말해서, TET2 산물 세포는 기억-유사 표현형을 갖는 것으로 나타났다.
시토카인 및 그란자임 검정을 TET2 산물에 대해 수행하였다. 구체적으로, 세포내 염색 및 유동 세포계측법을 통한 검출 및 신생항원-특이적 살해 검정을 수행하였다. 이들 실험의 결과는 TET2 산물이 TET2를 발현하는 세포 (예를 들어, 네오TCR 산물)보다 더 높은 수준의 이펙터 시토카인을 생산하고, 더 많은 세포독성 과립을 방출함을 나타내었다.
마지막으로, TOX 및 TCF7의 발현을 네오TCR 산물 세포 및 TET2 산물 세포에서 특징규명하였다. TOX 및 TCF7 발현 둘 다는 1) 휴지 상태, 2) 자극 후 7일, 및 3) 자극 후 9일에서 네오TCR 산물 세포 및 TET2 산물 세포 사이에서 변화되지 않은 것으로 나타났다. 도 15a-15d를 참조한다.
실시예 3. TET2 산물의 생성에 사용된 방법 및 물질
물질 및 방법. T 세포를 실시예 1 및 PCT/US2020/17887 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 TRA 및 TRB gRNA-Cas9 RNP와 함께 Cas9 RNP로서 TET2의 제1 엑손을 표적화하는 gRNA로 형질감염시켜, 내인성 TET2 코딩 서열의 파괴 및 감소된 TET2 단백질 발현을 발생시켰다.
T 세포 단리 및 편집. CD4 및 CD8 T 세포를 건강한 공여자 PBMC로부터 단리하였다. 예로서, 이러한 세포의 단리는 밀테니(Miltenyi) 프로디지(Prodigy) 또는 밀테니 MACS 분리 칼럼을 제조업체의 지시서에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 양성-선택된 CD4 및 CD8 T 세포 (예를 들어, 밀테니 항체 및 단리 칼럼을 사용하여)를 신선하게 사용하거나 1% 인간 혈청 알부민, 49% 플라스마라이트 (백스터(Baxter)), 및 50% CS10 (시그마(Sigma))에서 동결보존하였다. 동결보존된 세포를 해동시키고, TexMACS (밀테니) + 10% 인간 AB 혈청 (밸리 바이오메디칼(Valley Biomedical))에서 세척하고, TexMACS + 3% 인간 AB 혈청 (배양 배지)에서 mL 당 2 x 106개 세포의 밀도로 시딩하였다. 해동 후 1일에, 또는 신선하게 사용되는 경우 즉시, 세포를 세척하고, 부피로 배양 배지 + 12.5 ng/mL IL7 + 12.5 ng/mL IL15 + 1:17.5 비의 트랜스ACT(TransACT) T 세포 활성화 시약 (모든 시약은 밀테니로부터)에서 mL 당 1.46 x 106개 세포의 밀도로 재-시딩하였다. 활성화 후 2일에, T 세포를 관심의 네오TCR을 포함하는 플라스미드로 전기천공하였다.
comPACT 및 comPACT-덱스트라머 제조. 신생항원-특이적 펩티드-HLA 복합체 폴리펩티드 (즉, 각각의 "comPACT")를 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2019/025415에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조하였다. comPACT-덱스트라머 복합체를 네오TCR 발현 T 세포의 표지화를 위해 제조하였다. 비오티닐화 comPACT 단백질을 스트렙타비딘-접합된 형광단과 함께 실온 (RT)에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 비오틴-40-덱스트란 (NANOCS)을 혼합물에 첨가하고 RT에서 추가의 10분 동안 인큐베이션하였다. comPACT-덱스트라머를 4℃에서 저장하였다.
네오TCR 편집된 T 세포에의 comPACT 결합의 확인. T 세포를 지시된 날에 유동 세포계측법을 위해 염색하였다. 세포를 먼저 생존력 염료로 4℃에서 20분 동안 염색하고, 이어서 세척하고, comPACT-덱스트라머로 4℃에서 10분 동안 염색하였다. 표면 항체 (항-CD8α, 항-CD8β, 항-CD4)를 세포 및 comPACT-덱스트라머의 현탁액에 첨가하고, 세포를 4℃에서 추가의 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고, 세포내 고정 완충제 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))에서 고정시켰다. 모든 세포를 애튠(Attune) NxT 유동 세포계측기 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 상에서 획득하고, 데이터를 FCS 익스프레스(FCS Express) 또는 플로우조(FlowJo) 중 어느 하나로 분석하였다.
세포계측 비드 어레이 (CBA). 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 (이글 바이오사이언시스(Eagle Biosciences))를 세척 완충제 (1% BSA 및 0.05% 트윈20으로 보충된 PBS)로 3회 세척하고, 이어서 100-0.01 ng/웰의 범위의 상이한 농도로 comPACT로 코팅하였다. comPACT를 갖지 않는 웰 및 미스매칭된 comPACT로 코팅된 웰을 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충제로 3회 세척하고, 이어서 3% 인간 AB 혈청으로 보충된 TexMACS로 3회 세척하여 트윈20을 제거하였다. T 세포를 3% 인간 AB 혈청으로 보충된 TexMACS로 2회 세척하고, 3% 인간 AB 혈청으로 보충된 TexMACS 및 1X 페니실린-스트렙토마이신 용액에서 100만개 세포/mL로 재현탁시켰다. T 세포를 comPACT 코팅된 플레이트 상으로 100 μL/웰로 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고, 시토카인 농도를 BD 세포계측 비드 어레이 (CBA) 인간 Th1/Th2 시토카인 키트 II (카탈로그 번호 551809)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 분석하였다. 포획 비드를 배양 상청액과 혼합하고, 광으로부터 보호된 RT에서 3시간 동안 검출 시약과 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 세척 완충제에 재현탁시켰다. 샘플을 애튠 NxT 유동 세포계측기 상에서 검정하고, 데이터를 플로우조로 분석하였다. EC50은 최대 반응의 50%를 유발하는 동족 comPACT의 농도를 나타내며, 다양한 comPACT 농도에 걸친 IFNγ 분비의 최소-제곱 적합을 이용하여 계산되었다.
세포내 염색. T 세포를 지시된 날에 유동 세포계측법을 위해 염색하였다. T 세포를 먼저 생존력 염료로 4℃에서 20분 동안 염색하고, 이어서 세척하고, 표면 항체 (항-CD8α, 항-CD8β, 항-CD4)와 함께 4℃에서 추가의 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 T 세포를 세척하고, 세포내 염색을 위해 투과화하였다. T 세포를 항-2A 펩티드로 또는 항-IFNγ, 항-TNF, 또는 항-IL2로 투과화 완충제에서 4℃에서 20분 동안 염색하였다. T 세포를 세포내 고정 완충제 (비디 바이오사이언시스)에서 고정시켰다. 샘플을 애튠 NxT 유동 세포계측기 (써모피셔 사이언티픽) 상에서 검정하고, FCS 익스프레스 또는 플로우조 중 어느 하나로 분석하였다.
T 세포 증식 검정. 편집된 CD4 및 CD8 T 세포를 e450 증식 염료 (이바이오사이언스(eBioscience))로 제조업체의 지시서에 따라 표지하였다. 표지된 세포를 상기 기재된 바와 같이 다양한 농도로 comPACT 코팅된 플레이트 상에서 자극시켰다. T 세포를 48-96시간에 걸쳐 수거하고, e450 염료의 희석에 의해 측정된 바와 같은 증식에 대해 분석하였다.
T 세포 살해 검정. HLA-매칭된 세포주를 동족 신생항원 펩티드 또는 미스매칭된 펩티드로 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 펄싱하였다. 세포를 배지로 3회 세척하여 임의의 비결합된 펩티드를 제거하고, 이어서 상기 기재된 e450 증식 염료로 표지된 편집된 CD4 및 CD8 T 세포와 공동-배양하였다. 공동-배양물을 37℃에서 48시간 동안 5% CO2와 함께 인큐베이션한 후, 수거하였다. 세포를 세척하고, 고정가능한 생존력 염료로 염색하여 살해 효율을 결정하였다. e450 증식 염료를 사용하여 편집된 T 세포를 표적 세포로부터 구별하였다.
본 발명을 자세하게 및 일부는 특히 몇몇 기재된 실시양태에 관하여 기재하였지만, 이는 임의의 이러한 상세사항 또는 실시양태 또는 임의의 특정 실시양태에 제한되어야 하는 것으로 의도되지 않으며, 이는 첨부된 청구범위에 관하여, 종래 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가장 넓은 가능한 해석을 제공하도록, 및 따라서, 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포괄하도록 해석되어야 한다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 섹션 표제, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> PACT PHARMA, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER USING A TET2 ENGINEERED T CELL THEARPY <130> 087520.0146 <150> 62/841,748 <151> 2019-05-01 <150> 62/841,753 <151> 2019-05-01 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TET sgRNA <400> 1 cctcccattt gccagacaga acc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 2 ttaagggaag tgaaaataga ggg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 3 ggaatgacat acagactgca ggg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 4 gatagaacca accatgttga ggg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 5 ccaaccatgt tgagggcaac aga 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 gatcaggagg aggcacagtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 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Claims (137)

  1. 하기를 포함하는 세포:
    a. 외인성 T 세포 수용체 (TCR); 및
    b. TET2 로커스의 유전자 파괴.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 파괴가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 파괴가 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 유전자 파괴가 비-기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것인 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 유전자 파괴가 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시키는 것인 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, gRNA 및 Cas9 뉴클레아제를 포함하는 세포.
  7. 제6항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 유전자 파괴가 세포 존속을 증진시키는 것인 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 유전자 파괴가 기억 세포 분화를 증진시키는 것인 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 환자-유래 세포인 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 림프구인 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+인 세포.
  15. 제13항에 있어서, 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+인 세포.
  16. 제13항에 있어서, 세포가 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+인 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 TCR이 환자-유래 TCR인 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 TCR이 신호 서열, 제1 및 제2 2A 서열, 및 TCR 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 TCR이 암 항원을 인식하는 것인 세포.
  20. 제19항에 있어서, 암 항원이 신생항원인 세포.
  21. 제19항에 있어서, 암 항원이 환자 특이적 항원인 세포.
  22. a. 세포 내로 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 도입하고;
    b. HR 주형 핵산을 세포의 내인성 로커스 내로 재조합하고;
    c. 세포의 TET2 로커스를 파괴하는 것
    을 포함하는 프로세스에 의해 변형된 세포.
  23. 제22항에 있어서, HR 주형이 하기를 포함하는 것인 세포:
    a. 제1 및 제2 표적 핵산 서열에 대해 상동성인 제1 및 제2 상동성 아암; 및
    b. 제1 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 TCR 유전자 서열.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, HR 주형이 TCR 유전자 서열의 상류에 위치한 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열의 하류에 위치한 제2 2A-코딩 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 2A-코딩 서열은 서로에 대해 코돈-분기된 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 것인 세포.
  25. 제24항에 있어서, 2A-코딩 서열이 P2A-코딩 서열인 세포.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 아미노산 서열 Gly Ser Gly를 코딩하는 서열이 2A-코딩 서열의 바로 상류에 위치하는 것인 세포.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 제2 2A-코딩 서열의 상류에 위치한 푸린 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 세포.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 세포.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 600개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 세포.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 세포.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 제2 2A-코딩 서열 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 제2 TCR 서열을 포함하는 것인 세포.
  32. 제31항에 있어서, HR 주형이 하기를 포함하며:
    a. 제1 2A-코딩 서열 및 제1 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제1 신호 서열; 및
    b. 제2 2A-코딩 서열 및 제2 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제2 신호 서열;
    c. 여기서 제1 및 제2 신호 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 서로에 대해 코돈 분기된 것인
    세포.
  33. 제30항 또는 제32항에 있어서, 신호 서열이 인간 성장 호르몬 신호 서열인 세포.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 비-바이러스성인 세포.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 원형 DNA인 세포.
  36. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 선형 DNA인 세포.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 도입이 전기천공을 통해 일어나는 것인 세포.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합이 하기를 포함하는 것인 세포:
    a. 뉴클레아제에 의한 내인성 로커스의 절단; 및
    b. 상동성 지정 복구에 의한 내인성 로커스 내로의 HR 주형 핵산 서열의 재조합.
  39. 제38항에 있어서, 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 세포.
  40. 제39항에 있어서, gRNA를 추가로 포함하는 세포.
  41. 제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 세포.
  42. 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 세포.
  43. 제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 비-기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것인 세포.
  44. 제22항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시키는 것인 세포.
  45. 제22항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 뉴클레아제에 의한 TET2 로커스의 절단을 포함하는 것인 세포.
  46. 제45항에 있어서, 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 세포.
  47. 제46항에 있어서, gRNA를 추가로 포함하는 세포.
  48. 제47항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 포함하는 것인 세포.
  49. 제45항 또는 제46항에 있어서, 뉴클레아제가 벡터에 의해 발현되는 것인 세포.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, gRNA가 벡터에 의해 발현되는 것인 세포.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 세포.
  52. 제49항 또는 제50항에 있어서, 벡터가 비-바이러스 벡터인 세포.
  53. 제22항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 파괴가 세포 존속을 증진시키는 것인 세포.
  54. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 파괴가 기억 세포 분화를 증진시키는 것인 세포.
  55. 제22항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 세포.
  56. 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 환자-유래 세포인 세포.
  57. 제22항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 림프구인 세포.
  58. 제22항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.
  59. 제58항에 있어서, T 세포가 환자-유래 세포인 세포.
  60. 제22항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 어린 T 세포인 세포.
  61. 제60항에 있어서, 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+인 세포.
  62. 제60항에 있어서, 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+인 세포.
  63. 제60항에 있어서, 세포가 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+인 세포.
  64. 제22항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 로커스가 내인성 TCR 유전자 내에 있는 것인 세포.
  65. 제23항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 유전자 서열이 종양 항원을 인식하는 TCR을 코딩하는 것인 세포.
  66. 제65항에 있어서, 종양 항원이 신생항원인 세포.
  67. 제65항에 있어서, 종양 항원이 환자 특이적 신생항원인 세포.
  68. 제23항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 유전자 서열이 환자 특이적 TCR 유전자 서열인 세포.
  69. 제22항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세스가 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 세포.
  70. 제69항에 있어서, 배양이 적어도 1종의 시토카인의 존재 하에서 수행되는 것인 세포.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 배양이 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서 수행되는 것인 세포.
  72. 제69항 또는 제70항에 있어서, 배양이 IL7 및 IL15의 존재 하에서 수행되는 것인 세포.
  73. a. 세포 내로 상동성 재조합 (HR) 주형 핵산 서열을 도입하고;
    b. HR 주형 핵산을 세포의 내인성 로커스 내로 재조합하고;
    c. 세포의 TET2 로커스를 파괴하는 것
    을 포함하는, 세포를 변형시키는 방법.
  74. 제73항에 있어서, HR 주형이 하기를 포함하는 것인 방법:
    a. 제1 및 제2 표적 핵산 서열에 대해 상동성인 제1 및 제2 상동성 아암; 및
    b. 제1 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 TCR 유전자 서열.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, HR 주형이 TCR 유전자 서열의 상류에 위치한 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열의 하류에 위치한 제2 2A-코딩 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 2A-코딩 서열은 서로에 대해 코돈-분기된 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 것인 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 2A-코딩 서열이 P2A-코딩 서열인 방법.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 Gly Ser Gly를 코딩하는 서열이 2A-코딩 서열의 바로 상류에 위치하는 것인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 제2 2A-코딩 서열의 상류에 위치한 푸린 절단 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  79. 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 300개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상동성 아암이 각각 약 600개 염기 내지 약 2,000개 염기의 길이인 방법.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 제1 2A-코딩 서열 및 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  82. 제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 제2 2A-코딩 서열 및 제2 상동성 아암 사이에 위치한 제2 TCR 서열을 포함하는 것인 방법.
  83. 제82항에 있어서, HR 주형이 하기를 포함하며:
    a. 제1 2A-코딩 서열 및 제1 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제1 신호 서열; 및
    b. 제2 2A-코딩 서열 및 제2 TCR 유전자 서열 사이에 위치한 제2 신호 서열;
    여기서 제1 및 제2 신호 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하고, 서로에 대해 코돈 분기된 것인
    방법.
  84. 제81항 또는 제83항에 있어서, 신호 서열이 인간 성장 호르몬 신호 서열인 방법.
  85. 제73항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 비-바이러스성인 방법.
  86. 제73항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 원형 DNA인 방법.
  87. 제73항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, HR 주형이 선형 DNA인 방법.
  88. 제73항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 도입이 전기천공을 통해 일어나는 것인 방법.
  89. 제73항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합이 하기를 포함하는 것인 방법:
    a. 뉴클레아제에 의한 내인성 로커스의 절단; 및
    b. 상동성 지정 복구에 의한 내인성 로커스 내로의 HR 주형 핵산 서열의 재조합.
  90. 제89항에 있어서, 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 방법.
  91. 제90항에 있어서, gRNA를 추가로 포함하는 방법.
  92. 제73항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  93. 제73항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 비-프레임시프트 결실, 프레임시프트 결실, 비-프레임시프트 삽입, 프레임시프트 삽입, 또는 이들의 임의의 조합을 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  94. 제73항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 비-기능적 TET2 단백질을 발생시키는 것인 방법.
  95. 제73항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 TET2 유전자 발현의 넉아웃을 발생시키는 것인 방법.
  96. 제73항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴가 뉴클레아제에 의한 TET2 로커스의 절단을 포함하는 것인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 뉴클레아제가 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR) 패밀리 뉴클레아제, 또는 그의 유도체인 방법.
  98. 제97항에 있어서, gRNA를 추가로 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 포함하는 것인 방법.
  100. 제96항 또는 제97항에 있어서, 뉴클레아제가 벡터에 의해 발현되는 것인 방법.
  101. 제98항 또는 제99항에 있어서, gRNA가 벡터에 의해 발현되는 것인 방법.
  102. 제96항 또는 제97항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  103. 제96항 또는 제97항에 있어서, 벡터가 비-바이러스 벡터인 방법.
  104. 제73항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 파괴가 세포 존속을 증진시키는 것인 방법.
  105. 제73항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, TET2 로커스의 파괴가 기억 세포 분화를 증진시키는 것인 방법.
  106. 제73항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1차 세포인 방법.
  107. 제73항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 환자-유래 세포인 방법.
  108. 제73항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 림프구인 방법.
  109. 제73항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
  110. 제109항에 있어서, T 세포가 환자-유래 세포인 방법.
  111. 제73항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 어린 T 세포인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95-, CCR7+, 및 CD27+인 방법.
  113. 제111항에 있어서, 세포가 CD45RA+, CD62L+, CD28+, CD95+, CD27+, CCR7+인 방법.
  114. 제111항에 있어서, 세포가 CD45RO+, CD62L+, CD28+, CD95+, CCR7+, CD27+, CD127+인 방법.
  115. 제73항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 로커스가 내인성 TCR 유전자 내에 있는 것인 방법.
  116. 제73항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 유전자 서열이 종양 항원을 인식하는 TCR을 코딩하는 것인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 종양 항원이 신생항원인 방법.
  118. 제116항에 있어서, 종양 항원이 환자 특이적 신생항원인 방법.
  119. 제73항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 유전자 서열이 환자 특이적 TCR 유전자 서열인 방법.
  120. 제73항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 배양이 적어도 1종의 시토카인의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 배양이 IL2, IL7, IL15, 또는 이들의 임의의 조합의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
  123. 제120항 또는 제121항에 있어서, 배양이 IL7 및 IL15의 존재 하에서 수행되는 것인 방법.
  124. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 세포의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 세포의 치료 유효량을 투여하기 전에, 비-골수소멸성 림프구고갈 레지멘이 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  126. 제124항 또는 제125항에 있어서, 암이 고형 종양인 방법.
  127. 제124항 또는 제125항에 있어서, 암이 액상 종양인 방법.
  128. 제126항에 있어서, 고형 종양이 흑색종, 흉부암, 폐암, 난소암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 전립선암, 부인과암, 중추 신경계암, 피부암, HPV+ 암, 식도암, 갑상선암, 위암, 간세포암, 담관암종, 신세포암, 고환암, 육종, 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  129. 제127항에 있어서, 액상 종양이 소포성 림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  130. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포함하는 조성물.
  131. 제130항에 있어서, 조성물이 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물인 조성물.
  132. 제130항 또는 제131항에 있어서, 조성물이 암의 치료를 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여되는 것인 제약 조성물.
  133. 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동결보존제를 포함하는 것인 조성물.
  134. 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 혈청 알부민을 포함하는 것인 조성물.
  135. 제130항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 플라스마-라이트(Plasma-Lyte) A, HSA, 및 크리오스토르(CryoStor) CS10을 포함하는 것인 조성물.
  136. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 세포, 제73항 내지 제124항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 시약, 또는 제130항 내지 제135항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  137. 제136항에 있어서, 키트가 암을 치료하는 것에 대한 서면 지시서를 추가로 포함하는 것인 키트.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3856769A4 (en) * 2018-09-28 2022-08-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center IMMUNOREACTIVE CELLS EXPRESSING DOMINANT NEGATIVE FAS AND USES THEREOF
JP2022547865A (ja) * 2019-09-06 2022-11-16 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 培養液中における改善された残存率を有する遺伝子操作されたｔ細胞
IL297539A (en) * 2020-04-24 2022-12-01 Pact Pharma Inc Methods for determining the efficiency of gene editing in cells
WO2022109277A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Pact Pharma, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER USING A TGFβRII ENGINEERED T CELL THERAPY
WO2022132836A2 (en) * 2020-12-14 2022-06-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2022140361A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Genetically engineered lymphocytes for adoptive cell therapy
EP4294822A1 (en) * 2021-02-18 2023-12-27 University of Florida Research Foundation, Incorporated Enhancing metabolic fitness of t cells to treat cancer
WO2022182891A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Lyell Immunopharma, Inc. Ror1 targeting chimeric antigen receptor
KR20230150834A (ko) 2021-02-25 2023-10-31 라이엘 이뮤노파마, 인크. Ap-1 전사 인자를 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열
EP4352508A1 (en) * 2021-06-11 2024-04-17 Adoc Ssf, Llc Method of assessing cell products
WO2023077026A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells expressing ror1-binding protein
CA3234826A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells expressing c-jun
CN114373511B (zh) * 2022-03-15 2022-08-30 南方医科大学南方医院 基于5hmC分子标志物检测的肠癌模型及肠癌模型构建方法
WO2023212507A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-02 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024026490A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Sqz Biotechnologies Company Polynucleotides encoding linked antigens and uses thereof
WO2024064606A2 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Emendobio Inc. Biallelic knockout of ctla4
WO2024064607A2 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Emendobio Inc. Biallelic knockout of tet2
WO2024064637A2 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Emendobio Inc. Biallelic knockout of faslg
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
CN116179495A (zh) * 2022-11-28 2023-05-30 上海恩凯细胞技术有限公司 转基因免疫细胞及其应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US20020127594A1 (en) * 2000-06-22 2002-09-12 Gearing David P. Don-1 gene and polypeptides and uses therefor
US6355412B1 (en) * 1999-07-09 2002-03-12 The European Molecular Biology Laboratory Methods and compositions for directed cloning and subcloning using homologous recombination
US7485291B2 (en) * 2003-06-03 2009-02-03 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for generating multiple polypeptides from a single vector using a virus derived peptide cleavage site, and uses thereof
WO2008042814A2 (en) * 2006-09-29 2008-04-10 California Institute Of Technology Mart-1 t cell receptors
WO2013033626A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
WO2014039044A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t memory stem cell populations
CA2930215C (en) * 2013-11-21 2021-04-27 Ucl Business Plc A cell comprising more than one chimeric antigen receptor
MX2018003353A (es) * 2015-09-17 2018-09-17 Novartis Ag Terapias con celulas cart con una eficacia mejorada.
EA201891212A1 (ru) * 2015-12-18 2019-01-31 Сангамо Терапьютикс, Инк. Адресная дезорганизация клеточного рецептора гкгс
CN115109120A (zh) * 2016-04-04 2022-09-27 英蒂分子公司 Cd8-特异性捕获剂、组合物及使用和制备方法
EP3516044A4 (en) * 2016-09-23 2020-03-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center SPECIFIC TCRs OF THE MINOR HISTOCOMPATIBILITY (H) ANTIGEN HA-1 AND USES THEREOF
JP2020502262A (ja) * 2016-11-22 2020-01-23 アロプレックス バイオセラピューティクス 同種異系腫瘍細胞ワクチン
EA201992131A1 (ru) * 2017-03-15 2020-02-06 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Высокоаффинные специфичные к mage-a1 tcr и их применение
US11851659B2 (en) * 2017-03-22 2023-12-26 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
US11512287B2 (en) * 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
ES2972783T3 (es) * 2017-06-30 2024-06-17 Academisch Ziekenhuis Leiden H O D N Leids Univ Medisch Centrum Tratamiento de las neoplasias malignas hematológicas
CA3072777A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for chimeric ligand receptor (clr)-mediated conditional gene expression
RU2020116585A (ru) * 2017-10-30 2021-12-01 Пэкт Фарма, Инк. Редактирование гена первичных клеток
WO2019136335A1 (en) * 2018-01-05 2019-07-11 Gencyte Therapeutics, Inc. Precision molecular adaptor system for car-t immunotherapy
RU2020135720A (ru) 2018-04-02 2022-05-04 Пэкт Фарма, Инк. Пептид-мнс compact
JP2022500022A (ja) * 2018-09-05 2022-01-04 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドGlaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Ｔ細胞改変
GB201819540D0 (en) * 2018-11-30 2019-01-16 Adaptimmune Ltd T cell modification
KR20210126073A (ko) 2019-02-12 2021-10-19 팩트 파마, 인크. 항원 특이적 t 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법
EP3976805A1 (en) * 2019-05-27 2022-04-06 Immatics US, Inc. Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy

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