JP2022519595A - 免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ - Google Patents

免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ Download PDF

Info

Publication number
JP2022519595A
JP2022519595A JP2021545400A JP2021545400A JP2022519595A JP 2022519595 A JP2022519595 A JP 2022519595A JP 2021545400 A JP2021545400 A JP 2021545400A JP 2021545400 A JP2021545400 A JP 2021545400A JP 2022519595 A JP2022519595 A JP 2022519595A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
targeting
nos
molecule
ptpn2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021545400A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020163365A5 (ja
Inventor
マイカ ベンソン，
マイケル シュラバック，
グレゴリー クリュコフ，
アン ルイーズ カッゾー，
ル メルシエ， イザベル フルール
フランク ステグマイヤー，
Original Assignee
ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド filed Critical ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド
Publication of JP2022519595A publication Critical patent/JP2022519595A/ja
Publication of JPWO2020163365A5 publication Critical patent/JPWO2020163365A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464454—Enzymes
    • A61K39/464463—Phosphatases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させるか、または内在性タンパク質の１つ以上の機能を低下させて、免疫細胞のエフェクター機能が増強されるように改変した免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子を導入することによってさらに改変した免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を用いて、がんのような細胞増殖性障害を治療する方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年２月４日に出願された米国特許仮出願第６２／８００，９９９号及び２０１９年３月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／８１８，６７７号に基づく優先権を主張するものであり、この両方の仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
電子的に提出したテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出したテキストファイル、すなわち、配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：７０００６１＿ＫＳＱＷ－０１４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年２月４日、ファイルサイズ９４５キロバイト）の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
分野
本開示は、標的核酸配列を編集するか、または標的核酸配列の発現を調節するための方法、組成物及び構成成分、ならびに、細胞増殖性疾患、炎症性疾患及び／または感染症の治療において、受容体導入免疫エフェクター細胞とともに使用する用途を含め、それらの免疫療法関連用途に関するものである。
遺伝子改変Ｔ細胞、特にＣＡＲ－Ｔ細胞を利用する養子細胞移入は、固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍に対する療法として、臨床試験段階に入っている。これまでの成果は、まちまちである。血液悪性腫瘍（特に、リンパ腫、ＣＬＬ及びＡＬＬ）では、いくつかの第１相試験及び第２相試験の患者の大半で、少なくとも部分奏効が見られ、一部では、完全奏効が見られた（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｂｌｏｏｄ １ １９，２７０９－２７２０）。２０１７年には、ＦＤＡは、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）及びＹｅｓｃａｒｔａ（商標）という２つのＣＡＲ－Ｔ療法剤を認可し、両方とも、血液癌の治療用であった。しかしながら、大半の種類の腫瘍（メラノーマ、腎細胞癌及び大腸癌を含む）では、血液悪性腫瘍よりも低い奏効が観察された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｌｏｏｄ １ １４，５３５－５４６、Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４－９１２、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５，Ｓ１－Ｓ２）。したがって、成果は大方、Ｂ細胞系の血液悪性腫瘍を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞のアプローチに限定されているので、養子Ｔ細胞療法には、改良の余地がかなりある。
Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｂｌｏｏｄ １ １９，２７０９－２７２０ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｌｏｏｄ １ １４，５３５－５４６ Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４－９１２ Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５，Ｓ１－Ｓ２
上記の種類の腫瘍（メラノーマ、腎細胞癌及び大腸癌、Ｙｏｎｇ，２０１７，Ｉｍｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９５：３５６－３６３）では、奏効の低下が観察されたことから、がん治療での改変免疫細胞の養子移入の有効性を向上させるニーズ、特に、固形悪性腫瘍に対する養子細胞療法の有効性を向上させるニーズが存在する。加えて、養子移入の有益性が観察された血液悪性腫瘍でも、すべての患者が奏効を示すわけではなく、おそらくは、養子移入Ｔ細胞の機能の低下により、望ましい頻度を上回る頻度で再発が見られる。
がん治療剤としての遺伝子改変免疫細胞の有効性を制限する要因としては、（１）細胞の増殖性、例えば、養子移入後のＴ細胞の限られた増殖、（２）細胞の生存性、例えば、腫瘍環境における因子による、Ｔ細胞のアポトーシスの誘発、ならびに（３）細胞の機能、例えば、宿主免疫細胞及びがん細胞によって分泌される抑制因子による、細胞傷害性Ｔ細胞の機能の阻害と、製造プロセス中及び／または移入後における免疫細胞の疲弊が挙げられる。
免疫細胞の抗腫瘍作用を向上させると考えられる具体的な特徴としては、細胞が、１）養子移入後に、宿主内で増殖する能力、２）腫瘍に浸潤する能力、３）宿主内に存続し、及び／または免疫細胞の疲弊に対する耐性を示す能力、ならびに４）腫瘍細胞を殺傷できる形で機能する能力が挙げられる。本開示は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された免疫細胞を提供し、その改変免疫細胞では、増殖性の向上、腫瘍への浸潤性の向上、対象における免疫細胞の存続、及び／または免疫細胞の疲弊に対する耐性の向上を含め、１つ以上のエフェクター機能の増強が見られる。本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、腫瘍細胞に対する免疫細胞活性の増強を誘導するための方法及び組成物、ならびに養子免疫細胞移入療法との関連で使用するのに適する方法及び組成物も提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムはさらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質、または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、酵素タンパク質を含み、その酵素タンパク質は、その内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている。いくつかの実施形態では、そのタンパク質は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その核酸分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、その酵素タンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを２つ含む野生型Ｃａｓタンパク質であり、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを１つ含むＣａｓニッカーゼ変異体であり、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している。いくつかの実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡと、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号７～１５１からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号７～１５１からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、その遺伝子調節システムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列に結合するＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、またはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって、免疫エフェクター細胞に導入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、その少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能の低下によって、その免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む。いくつかの実施形態では、その欠失は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの核酸阻害剤は、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する。いくつかの実施形態では、その２つ以上の内在性標的遺伝子の機能は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下する。いくつかの実施形態では、その不活性化変異または核酸阻害剤によって、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現が実質的に阻害される。いくつかの実施形態では、その不活性化変異または核酸阻害剤によって、その２つ以上の内在性標的遺伝子の機能が実質的に阻害される。いくつかの実施形態では、その不活性化変異または核酸阻害剤によって、その改変免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が１つ以上増強される。いくつかの実施形態では、その１つ以上のエフェクター機能は、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて増強される。
いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、その免疫活性化分子は、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、そのエフェクター機能は、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている。
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その細胞表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、その操作免疫受容体は、標的細胞の表面に発現した抗原に特異的に結合でき、その抗原は、腫瘍関連抗原である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その組成物は、改変免疫エフェクター細胞を少なくとも１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個またはそれを上回る数含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、自己免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、その組成物は、同種異系免疫エフェクター細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した、細胞内の少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質、または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである。
いくつかの実施形態では、そのシステムは、少なくとも２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、そのシステムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのシステムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの内在性遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのシステムは、ＰＴＮＰ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを２つ含む野生型Ｃａｓタンパク質であり、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、酵素活性ドメインを１つ含むＣａｓニッカーゼ変異体であり、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、その１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している。いくつかの実施形態では、その異種タンパク質は、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、少なくとも２つの核酸分子を含み、その少なくとも２つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、そのシステムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及びＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのシステムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、約１９～３０個のヌクレオチドを含み、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのシステムは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、酵素タンパク質を含み、その酵素タンパク質は、その内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている。いくつかの実施形態では、そのシステムは、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、そのタンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている。いくつかの実施形態では、そのシステムは、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とをコードするベクターを１つ以上含み、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その第２の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とをコードするベクターを１つ以上含み、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とをコードするベクターを１つ以上含み、その第１の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、そのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、その第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びそのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、１つのベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びその第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、第１のベクターによってコードされ、そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、第２のベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、第１のベクターによってコードされ、その第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、第２のベクターによってコードされ、そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質は、第３のベクターによってコードされる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡと、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを１つ以上と、（ｉｉ）そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ、及びＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを１つ以上と、（ｉｉ）そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ、及びＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを１つ以上と、（ｉｉ）そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びその第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、１つのベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、第１のベクターによってコードされ、その第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、第２のベクターによってコードされる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するｇＲＮＡと、（ｉｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡと、（ｉｉ）ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡと、（ｉｉ）ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡ分子を含む組成物であって、その複数のｇＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含み、その第１の標的遺伝子及び第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている組成物を提供する。いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡと、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、モジュラーｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、デュアルｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡターゲティングドメインは、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、その５’末端またはその５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含み、及び／またはその３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含む。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡは、免疫エフェクター細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する耐性が向上する。いくつかの実施形態では、その改変ｇＲＮＡは、免疫エフェクター細胞に導入すると、自然免疫応答が誘導されないか、または免疫エフェクター細胞に導入すると、非改変ｇＲＮＡと比べて、自然免疫応答の軽減が誘導される。
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子であって、その複数のｇＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含み、その第１の標的遺伝子及び第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されているポリヌクレオチド分子を提供する。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子であって、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、その第１の標的遺伝子及び第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されているポリヌクレオチド分子を提供する。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、その複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子であって、その第１の標的遺伝子及び第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されているポリヌクレオチド分子を提供する。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２である。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をと、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、その第１の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたは組成物を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、その方法が、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入することを含み、その遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することであって、その遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができること、ならびにその免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムから選択した遺伝子調節システムである。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システム及び／またはその操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチドは、免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、その方法が、免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、ならびに遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞集団を得ること、その免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞集団に導入することであって、その遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができること、ならびにその免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖の後、かつ第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムから選択した遺伝子調節システムである。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変免疫エフェクターまたはその組成物を有効量、その対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である。いくつかの実施形態では、その疾患または障害は、がんまたはウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、そのがんは、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、その固形腫瘍は、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、または肺腫瘍もしくは肺転移である。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである。いくつかの実施形態では、その対象は以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して自家である。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、その対象に対して同種異系である。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片をその対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与とともに、高用量ＩＬ－２治療を行わない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物とともに、いずれのＩＬ－２治療も行わない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、いずれのＩＬ－２治療も行ったことがない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、いずれの高用量ＩＬ－２治療も行ったことがない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがなく、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物とともに、高用量ＩＬ－２治療を行わない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがなく、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物とともに、いずれのＩＬ－２治療も行わない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去または高用量ＩＬ－２治療を行ったことがない。いくつかの実施形態では、その対象には、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去またはいずれのＩＬ－２治療も行ったことがない。
いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷方法であって、その方法が、そのがん細胞を、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物に暴露することを含み、その改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、そのがん細胞の殺傷性が増大する方法を提供する。いくつかの実施形態では、その暴露は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの暴露である。
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、その方法が、遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することを含み、その遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、その方法が、遺伝子調節システムをその免疫エフェクター細胞に導入することであって、その遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができること、その免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすることを含み、その改変免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変していないその免疫エフェクター細胞と比べて増強される方法を提供する。いくつかの実施形態では、その１つ以上のエフェクター機能は、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムである。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、その方法が、免疫エフェクター細胞における少なくとも２つの内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入することを含み、その少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、その方法が、免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、その免疫エフェクター細胞集団における少なくとも２つの内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入することを含み、その少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、その方法が、免疫エフェクター細胞における少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することを含み、その少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、その方法が、免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、その免疫エフェクター細胞集団における少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することを含み、その少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される方法を提供する。
いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、その不活性化変異は、先行請求項のいずれか１項に記載の核酸遺伝子調節システムによって導入する。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの核酸阻害剤は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムに含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷が必要な対象のがん細胞の殺傷方法であって、その対象に、請求項１～５７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞または請求項７９～８３のいずれか１項に記載の組成物を治療有効量投与することを含み、その改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、そのがん細胞の殺傷性が増大し、治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数が、治療有効量を構成するのに必要な非改変免疫エフェクター細胞の数の少なくとも１０分の１または少なくとも１００分の１である方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数は、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも５×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも５×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも２×１０６個の細胞、少なくとも３×１０６個の細胞、少なくとも４×１０６個の細胞、少なくとも５×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも５×１０８個の細胞または少なくとも１×１０９個の細胞である。
Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＰｐｔｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の抗腫瘍有効性を示している。 Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＺｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の抗腫瘍有効性を示している。 Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＺｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型ＴＩＬの抗腫瘍有効性を示している。 Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＰｄ１／Ｌａｇ３デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の抗腫瘍有効性を示している。 ＳＯＣＳ１の欠損後、ＩＬ－２シグナル伝達に応答して、初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５レベルが上昇したことを示している。 ＰＴＰＮ２の遺伝子ノックダウン後、ＩＦＮγによる刺激に応答して、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ１レベルが上昇したことを示している。 Ａは、ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ヒトＴＩＬによるＩＦＮγの産生量を示している。Ｂは、ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ヒトＴＩＬによるＴＮＦαの産生量を示している。Ｃは、ホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激した場合のＣＤ１０７ａ染色の陽性率によって測定した場合に、ＴＩＬ集団内のＣＤ８ Ｔ細胞が、脱顆粒を起こす能力を示している。Ｄは、ホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで刺激した場合のＣＤ１０７ａ染色の強度によって測定した場合に、ＴＩＬ集団内のＣＤ８ Ｔ細胞が、脱顆粒を起こす能力を示している。 １８頭のマウスのうちの１７頭で、Ｐｔｐｎ２－／－／Ｓｏｃｓ１－／－ ＯＴ１が、１００ｍｍ３のＢ１６Ｏｖａ腫瘍を完全に退縮させた能力を示している。 Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍が以前に退縮したマウスが、Ｂ１６Ｏｖａの追加接種に完全に耐えたとともに、元のＢ１６Ｆ１０腫瘍の追加接種に部分的に耐えた能力を示している。 リチャレンジ試験中にわたって、末梢血中のＯＴ１集団を追跡した結果である。 リチャレンジ試験中にわたって、末梢血中のＯＴ１集団のメモリー表現型を追跡した結果である。 Ｐｔｐｎ２－／－／Ｓｏｃｓ１－／－ ＯＴ１が、８頭のマウスのうち８頭で、３４３ｍｍ３のさらに大型のＢ１６Ｏｖａ腫瘍を完全に退縮させた能力を示している。 別のマウスコホートで、腫瘍に浸潤したＰｔｐｎ２－／－／Ｓｏｃｓ１－／－ ＯＴ１の総数を示している。 Ｐｔｐｎ２－／－／Ｓｏｃｓ１－／－ ＯＴ１が、グランザイムＢを産生する能力を示している。 Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍が以前に退縮したマウスが、Ｂ１６Ｏｖａの追加接種に完全に耐えたとともに、元のＢ１６Ｆ１０腫瘍の追加接種に部分的に耐えた能力を示している。 リチャレンジ試験中にわたって、末梢血中のＯＴ１集団を、そのメモリー表現型とともに追跡した結果である。 コントロールの編集マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。コントロール細胞を４．１×１０４個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 コントロールの編集マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。コントロール細胞を４．１×１０５個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 コントロールの編集マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。コントロール細胞を４．１×１０６個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 コントロールの編集マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。コントロール細胞を４．１×１０７個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 漸増用量のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型細胞を４．１×１０４個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 漸増用量のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型細胞を４．１×１０５個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 漸増用量のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型細胞を４．１×１０６個投与した場合の値を示している。それぞれの線は、別個のマウスの結果を表している。 漸増用量のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルに養子移入した後の腫瘍体積測定値を示している。Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型細胞を４．１×１０７個投与した場合の値を示している。
本開示は、免疫エフェクター細胞を改変して、免疫療法との関連において、その細胞の治療有効性を向上させることに関する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞を本開示の方法によって改変して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させて、その免疫細胞の、１つ以上のエフェクター機能が増強されるようにする。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現コンストラクトの導入のように、抗原特異性を付与する導入遺伝子の導入によって、さらに改変する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムの組成物のように、その免疫エフェクター細胞を改変するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、がんのような細胞増殖性障害の治療方法であって、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を、治療の必要な対象に投与することを含む方法を提供する。
Ｉ．定義
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。
本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語は、本開示では、別段に示されていない限り、「及び」または「または」のいずれかを意味する目的で使用する。
本明細書の全体を通じて、文脈上別段に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形表現は、示されている要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群が含まれるが、いずれの他の要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群も排除されないことを示唆していると理解するものとする。
本願で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、同義語として使用する。本願で用いられている数字であって、約／およそが付されているかまたは付されていないいずれの数字も、当業者によって認識されるあらゆる通常の変動を網羅するように意図されている。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載のない限り、または文脈から別段に明らかでない限り、いずれかの方向（示されている言及値を上回るかまたは下回る方向）で、示されている言及値から２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれらを下回る割合以内に入る値の範囲を指す（ただし、その数が、考え得る値の１００％を上回る場合を除く）。
「減少する」または「低下する」とは、特定の値が少なくとも５％減少または低下すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少することを指す。特定の値の減少または低下は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値と比べて、少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１０００分の１またはそれを上回る割合に減少するとして表されることもある。
「増加する」とは、特定の値が少なくとも５％増加すること、例えば、参照値と比べて、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれを上回る割合増加することを指す。特定の値の増加は、その値を参照値と比較した場合の変化倍率として、例えば、参照値のレベルと比べて、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれを上回る割合で増加するとして表されることもある。
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、その形態としては、コードアミノ酸、非コードアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、及び改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基、その他の天然の塩基、化学的に改変された塩基、生化学的に改変された塩基、非天然塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限らない。「オリゴヌクレオチド」とは概して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの、約５～約１００ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的では、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離しても、当該技術分野において知られている方法によって化学的に合成してもよい。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語には、記載されている実施形態に適用可能なように、一本鎖ポリヌクレオチド（センス鎖またはアンチセンス鎖など）及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。
「断片」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の全体よりも少ない配列を含む、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子の部分を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの断片は、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片またはポリヌクレオチド断片は、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個またはこれを上回る数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間で、同じであるとともに、同じ相対的位置にある塩基またはアミノ酸の割合（％）を指す。したがって、一方のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対する配列同一性が、ある特定の割合（％）である。配列比較の際には、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割を果たす。「参照配列」という用語は、試験配列と比較する分子を指す。
「相補的」とは、天然の塩基もしくは非天然の塩基、またはそのアナログを含む２つの配列間で、塩基スタッキング及び特異的水素結合を通じて対合する能力を指す。例えば、核酸のある１つの位置の塩基が、標的の対応する位置の塩基と水素結合できる場合には、それらの塩基は、その位置において、互いに相補的であるとみなす。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合に対してプラスまたはマイナスに寄与しない不活性な無塩基スペーサーを含むことができる。塩基対形成には、カノニカルなワトソン－クリック塩基対形成及び非ワトソン－クリック塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成及びフーグスティーン塩基対形成）の両方を含めてよい。相補的塩基対合では、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、３－ニトロピロールまたは５－ニトロインドールのようなユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれともハイブリダイズでき、これらと相補的であるとみなすことができることが分かる。Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２－４９３及びＬｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９－４０４３。イノシン（Ｉ）も、当該技術分野において、ユニバーサル塩基であるとみなされてきており、Ａ、Ｃ、ＵまたはＴのいずれとも相補的であるとみなされている。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。
本明細書で言及されている場合、「相補的核酸配列」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏでの適切な温度条件及び溶液イオン強度条件下で、配列特異的かつ逆平行な形で、その配列が別の核酸に非共有結合する（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ようにできるヌクレオチド配列を含む核酸配列である。
比較するとともに、配列同一性パーセント及び相補性パーセントを求めるための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のために、配列を最適にアラインメントするのは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法によって、コンピューターによる、これらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、マニュアルアラインメント及び目視確認（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されているＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含め、当該技術分野において知られているアルゴリズムを用いることによって行うことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて、公的に入手可能である。
本明細書では、「ハイブリダイズする」という用語は、相補的ヌクレオチド塩基間が対合して（例えば、アデニン（Ａ）は、ＤＮＡ分子ではチミン（Ｔ）と、ＲＮＡ分子ではウラシル（Ｕ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方で、シトシン（Ｃ）と塩基対を形成する）、二本鎖核酸分子を形成することを指す（例えば、Ｗａｈｌ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。加えて、当該技術分野においては、２つのＲＮＡ分子のハイブリダイゼーション（例えばｄｓＲＮＡ）では、グアニン（Ｇ）が、ウラシル（Ｕ）と塩基対を形成することも知られている。例えば、Ｇ／Ｕという塩基対の形成は、ｍＲＮＡ内のコドンとのｔＲＮＡのアンチコドンの塩基対の形成に関しては、遺伝暗号の縮退（すなわち冗長性）の部分的な要因となっている。本開示との関連においては、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的であるとみなされ、Ｕは、そのＧと相補的であるとみなされる。したがって、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（二本鎖ｄｓＲＮＡ）の所定のヌクレオチド位置で、Ｇ／Ｕ塩基対を形成できるときには、その位置は、非相補的であるとはみなされず、むしろ相補的であるとみなされる。当該技術分野では、ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるには、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないと理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズして、介在セグメントまたは隣接セグメントが、ハイブリダイゼーション事象に関与しないようにし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチドは、その標的となる標的核酸配列内の標的領域との配列相補性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であることができる。
「改変」という用語は、対応する非改変物質または非改変化合物と比べて、変質または変更された物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列及び／またはポリペプチド配列）を指す。
「天然の」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸、ポリペプチド、細胞または生物に適用されている際には、自然界で見られる核酸、ポリペプチド、細胞または生物を指す。例えば、天然の供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列であって、実験室において人間が意図的に改変していないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然のものである。
「単離」とは、天然の状態で見られる場合には通常、その物質に付随している構成成分から、様々な程度で遊離されている物質を指す。
「発現カセット」または「発現コンストラクト」とは、プロモーターに機能可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「機能可能に連結された」とは、機能可能に連結されていると記載されている構成成分が、意図した形で機能できる関係にある並置状態を指す。例えば、プロモーターが、ポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターは、そのポリヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。
「組み換えベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、そのベクターに挿入された別のポリヌクレオチドを移入または輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。その挿入されたポリヌクレオチドは、発現カセットであってよい。いくつかの実施形態では、組み換えベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であってよい。
「試料」という用語は、解析及び／または遺伝子改変を行う生物学的組成物（例えば、細胞、または組織の一部）を指す。いくつかの実施形態では、試料は、対象から直接採取するという点で、「一次試料」であり、いくつかの実施形態では、「試料」は、例えば、ある特定の構成成分を除去し、及び／または対象とする、ある特定の構成成分を単離もしくは精製する目的で、一次試料を処理して得られたものである。
「対象」という用語には、例えば哺乳動物のような動物が含まれる。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、霊長類動物である。いくつかの実施形態では、その哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、ブタなどのような家畜、またはイヌ及びネコのような飼育動物である。いくつかの実施形態では（例えば、特に研究環境では）、対象は、齧歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類動物、または近交系ブタのようなブタなどである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義的に用いられている。
「投与」とは、本明細書では、薬剤または組成物を対象に導入することを指す。
「治療」とは、本明細書で使用する場合、生理学的転帰に影響を及ぼすために、薬剤または組成物を対象に送達することを指す。
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、特定の生理作用をもたらすのに必要な薬剤または組成物の最小量を指す。特定の薬剤の有効量は、その薬剤の性質に基づき、質量／体積、細胞数／体積、粒子／体積、（薬剤の質量）／（対象の質量）、細胞数／（対象の質量）、または粒子／（対象の質量）といった様々な方法で表してよい。特定の薬剤の有効量は、半最大効果濃度（ＥＣ５０）として表してもよく、この値は、基準レベルと最大応答レベルの中間の、特定の生理応答をもたらす薬剤濃度を指す。
細胞の「集団」は、２個以上のいずれの数の細胞も指すが、好ましくは、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞以上の細胞である。細胞集団とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ集団（例えば、培養液中の細胞集団）またはｉｎ ｖｉｖｏ集団（例えば、特定の組織に存在する細胞集団）を指してよい。
分子細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）のような標準的な教科書に見ることができ、その開示内容は、参照により、本明細書に援用される。
ＩＩ．改変免疫エフェクター細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書では、「改変免疫エフェクター細胞」という用語には、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上のゲノム改変を含む免疫エフェクター細胞、ならびに２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む免疫エフェクター細胞が含まれる。本明細書では、「非改変免疫エフェクター細胞」または「コントロールの免疫エフェクター細胞」は、ゲノムが改変されておらず、遺伝子調節システムを含まないか、またはコントロール遺伝子調節システム（例えば、空ベクターコントロール、非ターゲティングｇＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡなど）を含む細胞または細胞集団を指す。
「免疫エフェクター細胞」という用語は、自然免疫応答及び適応免疫応答の惹起に関与する細胞を指し、リンパ球（Ｔ細胞（胸腺細胞を含む）及びＢ細胞など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好塩基球、好中球、樹状細胞、ならびにマスト細胞が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞もしくはＣＴＬともいう）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞またはＴｈ１７細胞のようなＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍試料から単離したＴ細胞（本明細書では、「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という）である。理論に束縛されることを望まないが、ＴＩＬは、腫瘍抗原に対する特異性が向上しており（Ｒａｄｖａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １８：６７５８－６７７０）、したがって、外因性の操作受容体の導入なしに、腫瘍抗原特異的免疫応答（例えば、活性化、増殖及びがん細胞に対する細胞傷害活性）を媒介して、がん細胞を破壊させることができる（Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ １５：３１－４６）と考えられる。すなわち、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、対象の腫瘍から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、対象に再注入する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自己腫瘍抗原に対して特異的な１つ以上の外因性受容体を発現するように改変し、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、対象に再注入する。このような実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルを用いてモデル化でき、そのマウスには、がん抗原（例えばＣＤ１９）を発現するがん細胞株が移植されており、そのがん抗原に特異的である外因性受容体を発現する改変Ｔ細胞でそのマウスを処置する（例えば、実施例６～９を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、動物細胞であるか、または、無脊椎動物及び脊椎動物を含む動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥または哺乳動物）の細胞に由来するものである。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、哺乳動物細胞であるか、または哺乳動物細胞に由来するものである（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類動物、ヒト以外の霊長類動物、ヒトなど）。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、齧歯類動物細胞であるか、または齧歯類動物細胞に由来するものである（例えば、ラットまたはマウス）。いくつかの実施形態では、修飾免疫エフェクター細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来するものである。
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に、その内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上の改変（例えば、１つ以上の核酸の挿入、欠失または変異）を含む。このような実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、「改変内在性標的遺伝子」を含む。いくつかの実施形態では、そのゲノムＤＮＡ配列内の改変は、ｍＲＮＡの転写を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるｍＲＮＡ転写物及びタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、そのゲノムＤＮＡ配列内の改変は、ｍＲＮＡの翻訳を減少させるかまたは阻害することによって、コードされるタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、そのゲノムＤＮＡ配列内の改変は、非改変型（すなわち野生型）の内在性タンパク質と比べて、機能が低下または変更された改変内在性タンパク質（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）をコードする。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの改変内在性標的遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、内在性標的遺伝子以外のゲノム位置に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させるか、あるいは改変型の内在性タンパク質を発現させる１つ以上のゲノム改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチド配列をゲノム内の１つ以上の位置に挿入することによって、その遺伝子調節システムの発現の際に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変型の内在性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、ゲノム内の１つ以上の位置に挿入されており、その改変型のタンパク質の機能が、非改変型または野生型のタンパク質と比べて低下する（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、改変された内在性標的遺伝子を２つ以上含み、その１つ以上の改変によって、その内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質）の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、ｍＲＮＡ転写物の発現が低下し、及び／またはタンパク質の発現が低下する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現は、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも５％低下する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現は、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを上回る程度低下する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子に由来する遺伝子産物の発現及び／または機能が、非改変免疫エフェクター細胞におけるその遺伝子産物の発現と比べて低下する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞であって、２つ以上の内在性標的遺伝子またはその一部が欠失（すなわち「ノックアウト」）されており、そのｍＲＮＡ転写物またはタンパク質を発現しないようになっている改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、複数の内在性標的遺伝子またはその一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の内在性標的遺伝子の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、１つ以上の改変内在性標的遺伝子を含み、その標的ＤＮＡ配列に対する１つ以上の改変によって、非改変免疫エフェクター細胞で発現する対応するタンパク質（例えば「非改変内在性タンパク質」）の機能と比べて、機能が低下または変更されたタンパク質（例えば「改変内在性タンパク質」）が発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性タンパク質をコードする２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の改変内在性標的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、その改変内在性タンパク質では、その改変免疫エフェクター細胞によって発現されるかもしくは別の細胞によって発現される別のタンパク質に対する結合親和性が低下もしくは変化するか、シグナル伝達能が低下もしくは変化するか、酵素活性が低下もしくは変化するか、ＤＮＡ結合活性が低下もしくは変化するか、または足場タンパク質として機能する能力が低下もしくは変化する。
いくつかの実施形態では、その改変内在性標的遺伝子は、１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む。本明細書で使用する場合、「ドミナントネガティブ変異」とは、標的遺伝子の、１つ以上のヌクレオチドが置換、欠失または挿入されていて、そのコードされたタンパク質が、非改変標的遺伝子によってコードされるタンパク質に対して拮抗的に作用するようになっていることを指す。このネガティブな表現型は、対応する非改変遺伝子のポジティブな表現型に対して、遺伝的に優位となるので、その変異は、ドミナントネガティブである。１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む遺伝子、及びその遺伝子によってコードされるタンパク質は、「ドミナントネガティブ変異体」、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子及びドミナントネガティブタンパク質という。いくつかの実施形態では、そのドミナントネガティブ変異体タンパク質は、その免疫エフェクター細胞のゲノム内の１つ以上の位置に挿入した外来性導入遺伝子によってコードされる。
ドミナントネガティブの機序は、様々なものが知られている。典型的には、ドミナントネガティブ変異体の遺伝子産物は、非改変遺伝子産物の機能をいくつか保持しているが、非改変遺伝子産物の他の重要な機能を１つ以上欠損している。これにより、ドミナントネガティブ変異体は、非改変遺伝子産物を拮抗阻害する。例えば、例示的な実施形態として、転写因子のドミナントネガティブ変異体は、機能活性化ドメインを欠損しているが、機能性ＤＮＡ結合ドメインを保持し得る。この例では、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子のようにＤＮＡの転写を活性化することはできず、ドミナントネガティブ転写因子は、非改変転写因子の転写因子結合部位への結合を阻止することによって、遺伝子の発現を間接的に阻害できる。別の例示的な実施形態として、二量体として機能するタンパク質のドミナントネガティブ変異が知られている。このような二量体タンパク質のドミナントネガティブ変異体は、非改変タンパク質と二量体を形成する能力を保持し得るが、それ以外は機能できないことがある。ドミナントネガティブ単量体は、非改変単量体と二量体を形成することによって、ヘテロ二量体を形成し、非改変単量体の機能的なホモ二量体の形成を阻止する。ＳＯＣＳ１遺伝子のドミナントネガティブ変異は、当該技術分野において知られており、その変異としては、マウスＦ５９Ｄ変異体（例えば、Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：４４：２（２００１），４０７４６－４０７５４及びＳｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９３：４（２００１），４７１－４８２を参照されたい）、ならびにヒトＦ５８Ｄ変異体が挙げられ、これらは、ヒトＳＯＣＳ１及びマウスＳＯＣＳ１のアミノ酸配列の配列アラインメントによって特定されたものである。
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。その遺伝子調節システムは、（例えば、ゲノムＤＮＡ配列内の１つ以上の核酸の挿入、欠失もしくは変異によって）内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を改変すること、内在性標的遺伝子の転写を調節すること（例えば、ｍＲＮＡの転写の阻害もしくは抑制）、及び／または（例えば、ｍＲＮＡの分解によって）内在性標的遺伝子の翻訳を調節することによる機序を含む様々な機序によって、内在性標的遺伝子改変部の発現及び／または機能を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、
（ａ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、及び／またはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子、
（ｂ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、及び／またはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、及び／またはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質、
（ｄ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、及び／またはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
（ｆ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、あるいは
（ｑ）上記をいずれかに組み合わせたもの、
を含む遺伝子調節システムを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、その免疫エフェクター細胞のゲノムに挿入されている。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソーマルに発現され、その免疫エフェクター細胞のゲノムに挿入されていない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されており、１つ以上のゲノム遺伝子座に挿入された１つ以上の外因性導入遺伝子をさらに含む（例えば遺伝子「ノックイン」）。いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性導入遺伝子は、検出可能なタグ、安全スイッチシステム、キメラスイッチ受容体及び／または操作型抗原特異的受容体をコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、検出可能なタグをコードする外来性導入遺伝子さらに含む。検出可能なタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（例えば６×Ｈｉｓ）、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ｃＭｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、アビジン、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質及びリン光タンパク質が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、その蛍光タンパク質は、青色／ＵＶタンパク質（ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅなど）、シアンタンパク質（ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ及びｍＴＦＰ１など）、緑色タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍｅＧＦＰ（Ａ２０８Ｋ変異）、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎなど）、黄色タンパク質（ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２及びＴａｇＹＦＰなど）、オレンジ色タンパク質（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ及びｍＯｒａｎｇｅ２など）、赤色タンパク質（ＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ及びｍＲｕｂｙ２など）、遠赤色タンパク質（ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ及びＮｉｒＦＰなど）、近赤外蛍光タンパク質（ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４及びｉＲＦＰなど）、ストークスシフトの長いタンパク質（ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２及びｍＢｅＲＦＰなど）、光活性化可能なタンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１及びＰＡＴａｇＲＦＰなど）、光変換可能なタンパク質（Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ｍＥｏｓ３．２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ３．２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ及びＰＳｍＯｒａｎｇｅなど）、ならびに光で切り替え可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａなど）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その検出可能なタグは、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ Ｍｏｎｏｍｅｒ及び／またはＡｃＧＦＰから選択でき、これらはいずれも、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、安全スイッチシステムをコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。安全スイッチシステム（当該技術分野においては、自殺遺伝子システムともいう）は、改変免疫エフェクター細胞を対象に投与した後に、その細胞を除去可能にする１つ以上のタンパク質をコードする外因性導入遺伝子を含む。安全スイッチシステムの例は、当該技術分野において知られている。例えば、安全スイッチシステムは、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｈｓｖ－ｔｋ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）システム（Ｈｓｖ－ｔｋ／ＧＣＶ）のような、非傷害性のプロドラッグを傷害性化合物に変換するタンパク質をコードする遺伝子を含む。Ｈｓｖ－ｔｋは、非傷害性のＧＣＶを、細胞アポトーシスに導く傷害性化合物に変換する。したがって、Ｈｓｖ－ｔｋタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変免疫エフェクター細胞で治療した対象にＧＣＶを投与すると、その改変免疫エフェクター細胞を選択的に除去できる一方で、内在性免疫エフェクター細胞は影響を受けない。（例えば、Ｂｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６（５３１９）：１７１９－１７２４、Ｃｉｃｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９（１１）：１８２８－１８３６、Ｂｏｎｄａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７（５）：１８２８－１８３６を参照されたい）。
追加の安全スイッチシステムは、細胞表面マーカーをコードする遺伝子を含み、その細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体の投与によって、ＡＤＣＣを介して、改変免疫エフェクター細胞を除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、その細胞表面マーカーは、ＣＤ２０であり、その改変免疫エフェクター細胞は、リツキシマブのような抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の投与によって除去できる（例えば、Ｉｎｔｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０００，１１（４）：６１１－６２０、Ｓｅｒａｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１４，６３－７６、ｖａｎ Ｍｅｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００６，１３，７８９－７９７を参照されたい）。ＥＧＦ－Ｒ及びセツキシマブまたはパニツムマブを用いる同様のシステムが、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号に記載されている。追加の安全スイッチシステムは、二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）に対する結合部位を１つ以上含むプロアポトーシス分子をコードする導入遺伝子を含み、そのプロアポトーシス分子のオリゴマー化及びアポトーシス経路の活性化を誘導するＣＩＤの投与によって、改変免疫エフェクター細胞を除去できるようになっている。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、Ｆａｓ（ＣＤ９５としても知られている）である（Ｔｈｏｍｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７（５），１２４９－１２５７）。いくつかの実施形態では、そのプロアポトーシス分子は、カスパーゼ－９である（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（１１），４２４７－４２５４）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、キメラスイッチ受容体をコードする外来性導入遺伝子をさらに含む。キメラスイッチ受容体は、内在性細胞表面受容体に由来する細胞外ドメイン、及び異種の細胞内シグナル伝達ドメインを含む操作型細胞表面受容体であり、その細胞外ドメインによってリガンドが認識されると、野生型の細胞表面受容体によって活性化されるシグナル伝達カスケードとは異なるシグナル伝達カスケードが活性化されるようになっている。いくつかの実施形態では、そのキメラスイッチ受容体は、細胞内ドメインに融合された抑制性の細胞表面受容体の細胞外ドメインを含み、その細胞内ドメインは、その抑制性の細胞表面受容体によって通常伝達される阻害シグナルではなく、活性化シグナルを伝達させるものである。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞の活性化を阻害することが知られている細胞表面受容体に由来する細胞外ドメインは、細胞内の活性化ドメインに融合できる。そして、対応するリガンドが結合すると、その免疫エフェクター細胞の活性化を阻害するのではなく、その活性化を増大させるシグナル伝達カスケードが活性化することになる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＰＤ１－ＣＤ２８スイッチ受容体をコードする導入遺伝子を含み、ＰＤ１の細胞外ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７６：６（２０１６），１５７８－１５９０及びＭｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（２０１４），Ｓ２０１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする導入遺伝子を含む（Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １３０：２２（２０１７），２４１０－２４１９を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）のような標的細胞によって発現されるタンパク質標的を認識する操作型抗原特異的受容体をさらに含む（本明細書では「改変受容体導入細胞」または「改変ＲＥ細胞」という）。「操作抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような非天然の抗原特異的受容体を指す。いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを介して、シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、標的細胞によって発現される抗原に、ＭＨＣに依存しない形で結合し、ＲＥ細胞を活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片に融合されたタグを認識する。このような実施形態では、ＣＡＲの抗原特異性は、標識抗体の抗原特異性に依存しており、その結果、ある１つの抗体を別の抗体に置き換えることによって、単一のＣＡＲコンストラクトを用いて、複数の異なる抗原を標的とすることができる（例えば、米国特許第９，２３３，１２５号及び同第９，６２４，２７９号、米国特許出願公開第２０１５０２３８６３１号及び同第２０１８０１０４３５４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体に由来する抗原結合断片を含んでよい。本開示において有用である抗原結合ドメインとしては、例えば、ｓｃＦｖ、抗体、抗体の抗原結合領域、重鎖／軽鎖の可変領域、及び一本鎖抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ζ鎖ドメイン（ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインなど）、ＦｃγＲＩＩＩドメイン、ＦｃεＲＩドメインまたはＴリンパ球活性化ドメインに由来してよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメインまたはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つを含む。例示的なＣＡＲの構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは、当該技術分野において知られている（例えば、ＷＯ２００９／０９１８２６、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１４／０５５６５７及びＷＯ２０１５／０９０２２９（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）。
様々な腫瘍抗原に特異的なＣＡＲが、当該技術分野において知られており、例えば、ＣＤ１７１特異的ＣＡＲ（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００７）１５（４）：８２５－８３３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２０１２）２３（１０）：１０４３－１０５３）、ＥＧＦ－Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｋｏｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０１４）１０７（１）：３６４）、炭酸脱水酵素Ｋ特異的ＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ（２０１６）４４（３）：９５１－９５９）、ＦＲ－α特異的ＣＡＲ（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００６）１２（２０）：６１０６－６０１５）、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１５）３３（１５）１６８８－１６９６、Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１１）１９（１２）：２１３３－２１４３、Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００９）１７（１０）：１７７９－１７８７、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２０１６）２６（７）：８５０－８５３、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１０）１８（４）：８４３－８５１、Ｇｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）９（２）：３２）、ＣＥＡ特異的ＣＡＲ（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１５）２１（１４）：３１４９－３１５９）、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｃｎｅｒ Ｒｅｓ（２０１５）２１（１８）：４０６２－４０７２）、ＧＤ２特異的ＣＡＲ（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（２３）：６０５０－６０５６、Ｃａｒｕａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１５）２１（５）：５２４－５２９）、ＥｒｂＢ２特異的ＣＡＲ（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２（５）：１０５９－１０７０）、ＶＥＧＦ－Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１６）２２（２）：４３６－４４７）、ＦＡＰ特異的ＣＡＲ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ（２０１４）２（２）：１５４－１６６）、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１１）１７（１４）：４７１９－３０）、ＮＫＧ２Ｄ特異的ＣＡＲ（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１５）２３（１０）：１６００－１６１０）、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（アキシカブタジンシロルーセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））及びチサゲンレクルユーセル（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））である。腫瘍特異的ＣＡＲの臨床試験について論評しているＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌ（２０１８）１１（２２）も参照されたい。本開示による使用に適する例示的なＣＡＲは、下記の表１に記載されている。
Figure 2022519595000002
いくつかの実施形態では、操作抗原受容体は、組み換えＴＣＲである。組み換えＴＣＲは、特定の標的抗原を認識するＴ細胞集団から単離及びクローニングしたＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含む。例えば、ＴＣＲα遺伝子及び／またはＴＣＲβ遺伝子（すなわち、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ）は、特定の悪性腫瘍を有する個体から単離したＴ細胞集団、または所定の腫瘍抗原もしくは腫瘍細胞で免疫したヒト化マウスから単離したＴ細胞集団からクローニングできる。組み換えＴＣＲは、その内在性対応物と同じ機序を通じて（例えば、標的細胞の表面に発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質との関連において提示されたその同種抗原を認識することによって）、抗原を認識する。この抗原と結合すると、内在性シグナル伝達経路が刺激され、それにより、ＴＣＲ操作細胞が活性化及び増殖する。
腫瘍抗原に特異的な組み換えＴＣＲは、当該技術分野において知られており、例えば、ＷＴ１特異的ＴＣＲ（ＪＴＣＲ０１６（Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、米国特許出願公開第２０１６００８３４４９号に記載されているＷＴ１－ＴＣＲｃ４）、ＭＡＲＴ－１特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４（２００６）１２６－１２９に記載されているＤＭＦ４Ｔクローン、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１４（２００９）５３５－５４６に記載されているＤＭＦ５Ｔクローン、及びｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（２０１５）１５４１－１５５０に記載されているＩＤ３Ｔクローンを含む）、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１４（２００９）５３５－５４６）、ＣＥＡ特異的ＴＣＲ（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（２０１１）６２０－６２６）、ＮＹ－ＥＳＯ及びＬＡＧＥ－１特異的ＴＣＲ（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（２０１１）９１７－９２４、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１（２０１５）１０１９－１０２７及びＲａｐｏｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１（２０１５）９１４－９２１に記載されている１Ｇ４Ｔクローン）、ならびにＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３６（２０１３）１３３－１５１及びＬｉｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（２０１３）２２７－２４２）である。（Ｄｅｂｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３（２０１６）１０－２１も参照されたい。）
組み換えＴＣＲを作製するために、天然型のＴＲＡＣタンパク質配列（配列番号２６０）及びＴＲＢＣタンパク質配列（配列番号２６２）を、対象とするタンパク質またはペプチドに特異的なＴＣＲ－α鎖可変領域及びＴＣＲ－β 鎖可変領域のＣ末端に融合する。例えば、その操作ＴＣＲは、１Ｇ４ ＴＣＲまたは９５：ＬＹ ＴＣＲのように、ＮＹ－ＥＳＯペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号２３９）を含むアミノ酸配列を認識できる（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）。このような例示的な実施形態では、１Ｇ４－ＴＣＲのα鎖とβ鎖の対では、α鎖が配列番号２４９を含み、β鎖が配列番号２４８を含み、９５：ＬＹ－ＴＣＲのα鎖とβ鎖の対では、α鎖が配列番号２５２を含み、β鎖が配列番号２５１を含む。その組み換えＴＣＲは、ＤＭＦ４ ＴＣＲ及びＤＭＦ５ ＴＣＲのように、ＭＡＲＴ－１ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号２４０）を認識できる（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）。このような例示的な実施形態では、ＤＭＦ４－ＴＣＲのα鎖とβ鎖の対では、α鎖が配列番号２５５を含み、β鎖が配列番号２５４を含み、ＤＭＦ５－ＴＣＲのα鎖とβ鎖の対では、α鎖が配列番号２５８を含み、β鎖が配列番号２５７を含む。その組み換えＴＣＲは、ＤＬＴ ＴＣＲのように、ＷＴ－１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号２４１）を認識できる（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）。このような例示的な実施形態では、高親和性ＤＬＴ－ＴＣＲのα鎖とβ鎖の対では、α鎖が配列番号配列番号２４６を含み、β鎖が配列番号２４５を含む。
その組み換えＴＣＲα鎖タンパク質及びＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、両方のＴＣＲ鎖の発現を化学量論的に単一のプロモーターから駆動させるようにして作製できる。このような実施形態では、ＴＣＲβ鎖及びＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列の間に、Ｐ２Ａ配列（配列番号２３８）を挿入して、これらの組み換えＴＣＲ鎖をコードする発現カセットが、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαという形態を含むようにできる。例示的な実施形態として、このようなカセットから発現される、ＮＹ－ＥＳＯに特異的な１Ｇ４ ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号２５０を含むことになり、このようなカセットから発現される、ＮＹ－ＥＳＯに特異的な９５：ＬＹ ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号２３を含むことになり、このようなカセットから発現される、ＭＡＲＴ１に特異的なＤＭＦ４ ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号２５６を含むことになり、このようなカセットから発現される、ＭＡＲＴ１に特異的なＤＭＦ５ ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号２５９を含むことになり、このようなカセットから発現される、ＷＴ１に特異的なＤＬＴ ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号２４７を含むことになる。
いくつかの実施形態では、その操作抗原受容体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７８、ＣＤ８０（Ｂ７－１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７－２としても知られている）、ＣＤ９６、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７１（ＣＬＬ１としても知られている）のような分化クラスター分子、５Ｔ４、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９及びＴＮＦＲＳＦ１７としても知られている。ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ０２２２３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸまたはＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２など）、ＥＬＦ２Ｍ、導管上皮ムチン、エフリンＢ２、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＦＣＲＬ５（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ６８ＳＮ８）、ＦＫＢＰ１１（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＹＬ４）、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＤ１）、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、腸カルボキシルエステラーゼ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＩＴＧＡ８（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ５３７０８）、ＫＡＭＰ３、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ、メソセリン、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、プロステイン、ＲＡＧＥ－１、ＲＯＲ１、ＲＵ１（ＳＦＭＢＴ１）、ＲＵ２（ＤＣＤＣ２）、ＳＬＡＭＦ７（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＱ２５）、サバイビン、タグ－７２及びテロメラーゼのような腫瘍関連表面抗原、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）のような腫瘍間質抗原、テネイシン－ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）及び線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＴＦＧβ－Ｒまたはその構成成分（エンドグリンなど）のようなサイトカイン受容体、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶ ｇｐ１２０など）、ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、ＨＰＶ特異的抗原、ラッサウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原のようなウイルス特異的表面抗原、及びこれらの表面抗原のいずれかの誘導体またはバリアントから選択した標的抗原に対するものである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞、あるいは、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その細胞表面上に発現したＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをさらに含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能が低下されているか、あるいはＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含み、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞、あるいはＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その細胞表面上に発現したＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをさらに含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下されているか、あるいは、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含み、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞、あるいは、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その細胞表面上に発現したＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをさらに含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下されているか、あるいは、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含み、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞、あるいは、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その免疫エフェクター細胞がＴＩＬである改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞、あるいはＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その免疫エフェクター細胞がＴＩＬである改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞、あるいはＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、その免疫エフェクター細胞がＴＩＬである改変免疫エフェクター細胞を提供する。
Ａ．エフェクター機能
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されており（あるいは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含み）、１つ以上の免疫細胞エフェクター機能が上昇する。本明細書では、「エフェクター機能」という用語は、免疫細胞の機能のうち、標的細胞または標的抗原に対する免疫応答の発生、維持及び／または増強に関連する機能を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞では、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性もしくは遊走性が向上する特徴、増殖性が向上する特徴、細胞生存能が向上もしくは延長する特徴、周囲の微小環境における抑制因子耐性が向上して、その細胞の活性化状態が延長または増大するようになる特徴、炎症誘発性免疫因子（例えば、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン及び／または酵素）の産生が増加する特徴、細胞傷害性が向上する特徴、及び／または疲弊耐性が向上する特徴のうちの１つ以上が見られる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性が向上する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞による腫瘍への浸潤性の向上とは、所定の期間において腫瘍に浸潤する改変免疫エフェクター細胞の数が、同じ期間において腫瘍に浸潤する非改変免疫エフェクター細胞の数と比べて増加することを指す。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、腫瘍への浸潤性が、非改変免疫細胞と比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上する。腫瘍への浸潤性は、対象から１つ以上の腫瘍を単離し、フローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって、その試料中の改変免疫細胞の数を評価することによって測定できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、細胞増殖性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上する。これらの実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変免疫エフェクター細胞の数が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、増殖速度が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて上昇し、この場合、改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫エフェクター細胞よりも速い速度で分裂する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、増殖速度が、非改変免疫細胞と比べて１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞は、増殖期間が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて長く、この場合、その改変免疫エフェクター細胞及び非改変免疫エフェクター細胞は、同じ速度で分裂するが、改変免疫エフェクター細胞の方が、長い期間にわたって増殖状態を維持する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、増殖状態を維持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、細胞生存能が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上するかまたは延長される。このような実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変免疫エフェクター細胞の数が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、非改変免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度長い時間、生存状態を維持して存続する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、抑制因子耐性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて向上する。例示的な抑制因子としては、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＩＤＯ）及び／または抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ）によるシグナル伝達が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性が、非改変Ｔ細胞と比べて向上する。Ｔ細胞疲弊は、エフェクター機能が低下し、その後、抗原特異的Ｔ細胞が枯渇することによって特徴付けられる抗原特異的Ｔ細胞機能障害の状態である。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、抗原に応答して増殖する能力が欠損し、サイトカインの産生が減少し、及び／または腫瘍細胞のような標的細胞に対する細胞傷害性が低下する。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、ＣＤ１２２及びＣＤ１２７の細胞表面での発現の減少、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３及び／またはＣＴＬＡ４のような抑制性細胞表面マーカーの発現の増加、及び／またはＢｌｉｍｐ１、ＮＦＡＴ及び／またはＢＡＴＦのような転写因子の発現の増加のような、細胞表面マーカー及び転写因子の発現の変化によって特定する。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、ＴＧＦβのシグナル伝達に対する感受性の上昇及び／またはＩＬ－７及びＩＬ－１５のシグナル伝達に対する感受性の低下のような、サイトカインのシグナル伝達に対する感受性の変化が見られる。Ｔ細胞疲弊は、例えば、そのＴ細胞を標的細胞集団と共培養し、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定することによって判断することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を標的細胞（例えば、標的腫瘍抗原を発現するように操作した自己腫瘍細胞または自己腫瘍細胞株）の集団と共培養し、エフェクター細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定する。続いて、これらの結果と、標的細胞をコントロールの免疫細胞（非改変免疫エフェクター細胞、またはコントロールの改変が施された免疫エフェクター細胞など）の集団と共培養することによって得られた結果を比較する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞による１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはＩＬ－２）の産生が、コントロールの免疫細胞集団で観察されるサイトカインの産生と比べて増加することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞によるサイトカインの産生が、コントロールの免疫細胞集団によるサイトカインの産生と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度増加することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団で観察される増殖性と比べて向上することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の増殖性が、コントロールの免疫細胞集団の増殖性と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度向上したことによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、改変免疫エフェクター細胞による標的細胞の溶解が、コントロールの免疫細胞集団で観察される標的細胞の溶解と比べて増大することによって示される。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞による標的細胞の溶解が、コントロールの免疫細胞集団による標的細胞の溶解と比べて、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを超える程度増大することによって、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の向上が示される。
いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比較した場合の改変免疫エフェクター細胞の疲弊は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの製造プロセス中に測定する。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍断片から単離したＴＩＬを、本明細書に記載されている方法に従って改変してから、１ラウンド以上増殖させて、改変ＴＩＬ集団を作製する。このような実施形態では、その改変ＴＩＬの疲弊は、回収直後及び第１ラウンドの増殖の前、第１ラウンドの増殖後かつ第２ラウンドの増殖の前、及び／または第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に判断することができる。いくつかの実施形態では、コントロールの免疫細胞集団と比べた場合の改変免疫エフェクター細胞の疲弊は、改変免疫エフェクター細胞を対象に移入した後、１つ以上の時点に測定する。例えば、いくつかの実施形態では、その改変細胞を、本明細書に記載されている方法に従って作製し、対象に投与する。続いて、移入後、様々な時点に、試料を対象から採取して、ｉｎ ｖｉｖｏでの改変免疫エフェクター細胞の経時的な疲弊を判断することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、炎症誘発性免疫因子の発現または産生が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて増加する。炎症誘発性免疫因子の例としては、グランザイムＢ、パーフォリン及びグラニュライシンのような細胞溶解因子、ならびにインターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＣＸＣＬ８及び／またはＩＬ－６のような炎症誘発性サイトカインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害性が、非改変免疫エフェクター細胞と比べて上昇する。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害性が、非改変免疫細胞と比べて、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る程度上昇する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞では、セントラルメモリー表現型（Ｔｃｍ細胞）及びエフェクターメモリー表現型（Ｔｅｍ細胞）の両方を有した状態で存続するＴＩＬ集団が作られる。これらの表現型により、持続性のある抗腫瘍メモリーが得られ、エピトープ拡大が生じる。
免疫エフェクター機能を測定するためのアッセイは、当該技術分野において知られている。例えば、腫瘍への浸潤性は、対象から腫瘍を単離し、その腫瘍に存在するリンパ球の総数及び／または表現型をフローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって求めることによって測定できる。細胞表面受容体の発現は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット及び／またはｑＰＣＲによって求めることができる。サイトカイン及びケモカインの発現及び産生は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及び／またはｑＰＣＲによって測定できる。細胞外の刺激（例えば、サイトカイン、抑制性リガンドまたは抗原）に対する応答性または感受性は、その刺激に応答する細胞増殖及び／または下流のシグナル伝達経路の活性化（例えば、下流のシグナル伝達中間体のリン酸化）をアッセイすることによって測定できる。細胞傷害性は、実施例全体を通じて説明されているような改変免疫エフェクター細胞と標的細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの共培養及びｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルを含め、当該技術分野において知られている標的細胞溶解アッセイによって測定できる。
Ｂ．内在性の経路及び遺伝子の調節
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現もしくは機能が低下されている。その内在性標的遺伝子のさらなる詳細は、下記の表２に記載されている。このような実施形態では、その２つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、その免疫細胞の、１つ以上のエフェクター機能が増強される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、サイトカインシグナル伝達抑制因子ＳＯＣＳ１（ＳＯＣＳ１）遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。そのＳＯＣＳ１タンパク質は、Ｃ末端ＳＯＣＳボックスモチーフ、ＳＨ２ドメイン、ＥＳＳドメイン及びＮ末端ＫＩＲドメインを含む。キナーゼ阻害領域（ＫＩＲ）と呼ばれる１２個のアミノ酸残基は、ＳＯＣＳ１が、ＪＡＫ１、ＴＹＫ２及びＪＡＫ２のチロシンキナーゼ機能を負に調節する能力に不可欠であることが明らかになっている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＰＴＰＮ２遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。チロシンホスファターゼファミリー（ＰＴＰ）タンパク質は、そのホスファターゼ触媒ドメインによって、ホスホチロシン残基を脱リン酸化する。ＰＴＰＮ２は、ＴＣＲ及びサイトカイン（ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達複合体を通じてシグナル伝達を行う）の両方に対するブレーキとして機能し、すなわち、シグナル１及びシグナル３の両方に対するチェックポイントとしての役割を果たす。Ｔ細胞が抗原と結合し、ＴＣＲが活性化した後、チロシン残基のリン酸化によって、キナーゼＬｃｋ及びＦｙｎにより、ポジティブシグナルが下流で増幅される。ＰＴＰＮ２は、Ｌｃｋ及びＦｙｎの両方を脱リン酸化する働きをし、その結果、ＴＣＲシグナル伝達を減弱させる。加えて、Ｔ細胞が、サイトカインと遭遇し、共通γ鎖受容体複合体を通じてシグナル伝達を行い、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を通じて、ポジティブシグナルを伝達した後、ＰＴＰＮ２は、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の脱リン酸化によっても減弱化を行う。ＰＴＰＮ２の欠失が、Ｔ細胞の機能に及ぼす全体的な機能上の影響は、ＴＣＲを通じてＴ細胞を急激に活性化させるのに必要な活性化閾値の低下、ならびに成長促進及び分化促進サイトカインに対する超感受性である。チロシンホスファターゼファミリー（ＰＴＰ）タンパク質は、そのホスファターゼ触媒ドメインによって、ホスホチロシン残基を脱リン酸化する。ＰＴＰＮ２は、ＴＣＲ及びサイトカイン（ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達複合体を通じてシグナル伝達を行う）の両方に対するブレーキとして機能し、すなわち、シグナル１及びシグナル３の両方に対するチェックポイントとしての役割を果たす。Ｔ細胞が抗原と結合し、ＴＣＲが活性化した後、チロシン残基のリン酸化によって、キナーゼＬｃｋ及びＦｙｎにより、ポジティブシグナルが下流で増幅される。ＰＴＰＮ２は、Ｌｃｋ及びＦｙｎの両方を脱リン酸化する働きをし、その結果、ＴＣＲシグナル伝達を減弱させる。加えて、Ｔ細胞が、サイトカインと遭遇し、共通γｃ鎖受容体複合体を通じてシグナル伝達を行い、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を通じて、ポジティブシグナルを伝達した後、ＰＴＰＮ２は、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の脱リン酸化によっても減弱化を行う。ＰＴＰＮ２の欠失が、Ｔ細胞の機能に及ぼす全体的な機能上の影響は、ＴＣＲを通じてＴ細胞を急激に活性化させるのに必要な活性化閾値の低下、ならびに成長促進及び分化促進サイトカインに対する超感受性である。
加えて、遺伝子操作マウス（ＧＥＭ）モデルでは、マウス全身のＰＴＰＮ２が欠失すると、サイトカインレベル、非リンパ組織でのリンパ球浸潤、及び関節リウマチ様症状の初期徴候が増大し、これらのマウスは、５週齢までしか生きられない。したがって、ＰＴＰＮ２は、マウスの生後発育に欠かせないものとして認識されている。この自己免疫表現型と一致して、出生時から、Ｔ細胞系列のＰｔｐｎ２が欠失していても、非リンパ組織でのリンパ球浸潤が増大する。重要なことに、成体マウスＴ細胞でＰｔｐｎ２の誘導型ノックアウトを行っても、自己免疫におけるＰｔｐｎ２の役割による自己免疫症状発現はいずれも見られない。Ｐｔｐｎ２の欠失は、ヒトにおいて、わずかな割合のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）と関連するとともに、２段階化学発がんマウスモデルにおいて、皮膚腫瘍の発現を増大させることが特定された。これらのデータから、ＰＴＰＮ２が腫瘍抑制因子タンパク質であり得ると仮定する者もいる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変エフェクター細胞は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の発現及び／または機能が低下されている。ＺＣ３Ｈ１２Ａ（ＭＣＰＩＰ１及びＲＥＧＮＡＳＥ－１とも称する）は、ＣＣＣＨ型ジンクフィンガーモチーフのすぐ上流にＲＮａｓｅドメインを有するＲＮａｓｅである。ＺＣ３Ｈ１２Ａは、ＩＬ－６のような転写産物の遺伝子の３’ＵＴＲ内の保存されたステムループ構造と結合することによって、そのヌクレアーゼ活性を通じて、ＩＬ－６のような転写産物のｍＲＮＡを標的として、不安定化する。Ｔ細胞では、ＺＣ３Ｈ１２Ａは、ｃ－Ｒｅｌ、ＯＸ４０及びＩＬ－２ を含むいくつかの炎症誘発性遺伝子の転写レベルを制御する。ＲＥＧＮＡＳＥ－１の活性化は一過性のものであり、プロテアソーム媒介性分解または粘膜関連リンパ組織１（ＭＡＬＴ１）媒介性切断を含むネガティブフィードバック機構の作用を受ける。ＲＥＧＮＡＳＥ－１の主な機能は、異なる種類の細胞における遺伝子サブセットを特異的に標的とすることによって、そのリボヌクレアーゼ活性を介して、ｍＲＮＡ分解を促すことである。単球では、ＲＥＧＮＡＳＥ－１は、ＩＬ－６及びＩＬ－１２ＢのｍＲＮＡをダウンレギュレートし、それによって炎症を緩和し、Ｔ細胞では、ＲＥＧＮＡＳＥ－１は、ｃ－Ｒｅｌ、Ｏｘ４０及びＩＬ－２の転写産物を標的とすることによって、Ｔ細胞の活性化を制限する。がん細胞では、ＲＥＧＮＡＳＥ－１は、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ａ１、ＲＥＬＢ及びＢＣＬ３を含む抗アポトーシス遺伝子を阻害することによって、アポトーシスを促進する。
Figure 2022519595000003
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１の発現及び／または機能が低下されており、ＰＴＰＮ２の発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１の発現及び／または機能が低下されており、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＰＴＰＮ２の発現及び／または機能が低下されており、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能が低下されている。いくつかの実施形態では、その改変免疫エフェクター細胞は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下されており、さらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下されている。
ＩＩＩ．遺伝子調節システム
本明細書では、「遺伝子調節システム」という用語は、細胞に導入したときに、内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸またはそれらを組み合わせたものを指す。本開示の方法で使用するのに適する多くの遺伝子編集システムが、当該技術分野において知られており、そのシステムとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、遺伝子調節システムが内在性標的遺伝子に及ぼす作用に関連して「調節する」を使用するときには、「調節する」には、その内在性標的遺伝子の配列のいずれの変化、その内在性標的遺伝子のエピジェネティックな状態のいずれの変化、及び／またはその内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは機能のいずれの変化も含まれる。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、例えば、内在性標的配列において１つ以上の核酸を挿入するかまたは欠失させることによるなど、１つ以上の変異をその内在性標的配列に導入することによって、その内在性標的遺伝子の配列の変化を媒介し得る。その内在性標的配列の変化を媒介できる例示的な機序としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば古典的または代替的）、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）、相同配向型修復（例えば内在性ドナーテンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存的一本鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖侵入が挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的配列のエピジェネティックな状態の変化を媒介し得る。例えば、いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子のＤＮＡの共有結合の改変（例えば、シトシンのメチル化及びヒドロキシメチル化）、または関連ヒストンタンパク質の改変（例えば、リシンのアセチル化、リシン及びアルギニンのメチル化、セリン及びトレオニンのリン酸化、ならびにリシンのユビキチン化及びＳＵＭＯ化）を媒介し得る。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化を媒介し得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムは、その内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、またはそのＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡ産物に作用することによって、そのコードタンパク質の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムによって、改変内在性タンパク質を発現させ得る。このような実施形態では、その遺伝子調節システムの媒介により、内在性ＤＮＡ配列が改変されると、非改変免疫エフェクター細胞における対応する内在性タンパク質と比べて機能が低下した内在性タンパク質が発現される。このような実施形態では、その改変内在性タンパク質の発現レベルは、非改変免疫細胞における対応する内在性タンパク質の発現レベルよりも上昇しても低下してもよく、あるいは、その対応する内在性タンパク質の発現レベルと同じであっても実質的に同程度であってもよい。
Ａ．核酸ベースの遺伝子調節システム
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる２つ以上の核酸を含む核酸遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このような遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書で使用する場合、核酸ベースの遺伝子調節システムは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節できる１つ以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、標的核酸配列と相補的であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
「アンチセンスＲＮＡ分子」とは、長さを問わず、ｍＲＮＡ転写物と相補的であるＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子とは、細胞、組織または対象に導入でき、内在性遺伝子のサイレンシング経路に依存するのではなく、ＲＮａｓｅＨの媒介による、標的ｍＲＮＡ転写物の分解に依存する機序を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現を低下させる一本鎖ＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、改変された主鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは当該技術分野において知られているその他の主鎖を含み、あるいは、非天然のヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。
「ＲＮＡ干渉分子」とは、本明細書で使用する場合、内在性遺伝子のサイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を通じて、標的ｍＲＮＡを分解することによって、内在性標的遺伝子産物の発現の低下を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー及びモルホリノが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡは、約２１～２５ヌクレオチド長で天然の、小分子の非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、１つ以上の標的ｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの切断及び／または脱アデニル化を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現をダウンレギュレートする（例えば低下させる）ことができる。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成するとともに、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させる約５０～７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるプラスミドまたは非複製型の組み換えウイルスベクターにクローニングして、ｓｈＲＮＡコード配列がゲノムに組み込まれるようにできる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内在性標的遺伝子の翻訳及び発現を安定的かつ着実に抑制させることができる。
いくつかの実施形態では、核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡとは、典型的には約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複数タンパク質複合体と会合し、その会合の際に、「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。そして、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相同性によって、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣを導き、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、その結果、特異的な遺伝子サイレンシングが行われる。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に、２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入して、標的ｍＲＮＡ配列を分解させることができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについては、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：１９，１９９８、ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のモルホリノを含む。「モルホリノ」は、本明細書で使用する場合、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合しているとともに、ホスホロジアミデート結合を通じて連結されている改変核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列を分解させるために標的とするのではなく、ｍＲＮＡの翻訳を立体的に阻害し、ｍＲＮＡスプライシングを変化させることを通じて機能する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、表３～８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を含む。本願の全体を通じて、参照ゲノム座標は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得たヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８ともいう）アセンブリーのゲノムアノテーションに基づくものであり、このアセンブリーは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで入手可能である。ある１つのアセンブリーと別のアセンブリーとの間でゲノム座標を変換するツール及び方法は、当該技術分野において知られており、そのツール及び方法を用いて、本明細書に示されているゲノム座標を、ヒトゲノムの別のアセンブリーにおける対応する座標に変換できる（同じ機関によってまたは同じアルゴリズムを用いて作製された以前のアセンブリーに変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７に変換すること）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって作製されたアセンブリーを変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８から、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって作製されたＮＣＢＩ３３に変換すること）を含む）。当該技術分野において知られている利用可能な方法及びツールとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで利用可能なＮＣＢＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｍａｐｐｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒのウェブサイトで利用可能なＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ、及びＥｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで利用可能なＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を少なくとも２つを含み、その核酸分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、当該技術分野において知られているものから選択したｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子であって、表Ａに示されている配列番号１５２～１７１から選択した標的配列に結合するｓｈＲＮＡ分子である（米国特許第９，９４４，９３１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子は、表Ａに示されている配列番号１７２～１７４から選択した核酸配列によってコードされる（米国特許第８，３２４，３６９号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡであって、表Ｂに示されている配列番号１７５～１８４から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡである（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、同第ＷＯ２０１８１３７２９５号、同第ＷＯ２０１７１２０９９８号及び同第ＷＯ２０１８１３７２９３号を参照されたい）。
Figure 2022519595000004
Figure 2022519595000005
Figure 2022519595000006
Figure 2022519595000007
Figure 2022519595000008
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を少なくとも２つを含み、その核酸分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
Figure 2022519595000009
Figure 2022519595000010
Figure 2022519595000011
Figure 2022519595000012
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を少なくとも２つ含み、その核酸分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号２３４～２３７から選択した核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ分子である（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２０１５）２９０（３４），２０７８２－２０７９２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡであって、配列番号２３１～２３３から選択した核酸配列を含むｓｉＲＮＡである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１６），６，Ａｒｔｉｃｌｅ ＃ ２４０７３及びＭｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６１（５），１０５８－１０７３を参照されたい）。
Figure 2022519595000013
Figure 2022519595000014
Figure 2022519595000015
Figure 2022519595000016
Figure 2022519595000017
Figure 2022519595000018
Figure 2022519595000019
Figure 2022519595000020
Figure 2022519595000021
Figure 2022519595000022
Figure 2022519595000023
Figure 2022519595000024
Figure 2022519595000025
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）などのような市販業者から入手したものである。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子は、表９に示されているｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子は、表１０に示されているｓｈＲＮＡ分子である。
Figure 2022519595000026
Figure 2022519595000027
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を少なくとも２つ含み、その核酸分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、その核酸分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を少なくとも２つ含み、その核酸分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、その核酸分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、その ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７～１５１のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーまたはモルホリノ）を少なくとも２つ含み、その核酸分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子であり、その核酸分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つの核酸分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸ベースの遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、そのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１８５～２０７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０８～２３０のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
Ｂ．タンパク質ベースの遺伝子調節システム
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができるタンパク質を２つ以上含むタンパク質遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このような遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる１つ以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このような実施形態は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ」という。
１．ジンクフィンガーシステム
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができるジンクフィンガー融合タンパク質を２つ以上含むジンクフィンガー遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このような遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。本発明では、ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを有する融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、その配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作できる。したがって、切断または組み換えを行いたい標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表２または３で言及されている標的遺伝子内の標的座位）を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、その標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０個のアミノ酸の長さである。個々のジンクフィンガーは、３つのヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの、４ヌクレオチドの結合部位と、１つのヌクレオチドが重複し得る４つのヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインを操作して、結合するようにする配列（例えば標的配列）の長さによって、操作ジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数が決まることになる。例えば、フィンガーモチーフが、重複するサブ部位には結合しないＺＦＰの場合には、６個のヌクレオチド標的配列には、２つのフィンガー結合ドメインが結合し、９個のヌクレオチド標的配列には、３つの結合ドメインが結合するなどである。標的部位における、個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわちサブ部位）は、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間（すなわち、フィンガー間のリンカー）のアミノ酸配列の長さ及び性質に応じて、連続している必要はなく、１つまたは数個のヌクレオチドによって隔てられていることができる。いくつかの実施形態では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、個別のジンクフィンガーリピートを３～６個含み、それぞれ、９～１８塩基対を認識できる。
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定の配列に結合するように操作できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べて、新規な結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限らない。
ジンクフィンガードメインによる結合について標的ＤＮＡ配列を選択することは、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。標的ＤＮＡ配列の選択を行うために、ヌクレオチド配列を単に目視確認することも利用できることは、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に記載されている方法では、標的ＤＮＡ配列を選択するためのいずれの手段も用いることができる。標的部位は概して、少なくとも９ヌクレオチドの長さであるので、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインと結合する。しかしながら、例えば、４つのフィンガーの結合ドメインと１２ヌクレオチドの標的部位との結合、５つのフィンガーの結合ドメインと１５ヌクレオチドの標的部位との結合、または６つのフィンガーの結合ドメインと１８ヌクレオチドの標的部位との結合も可能である。明らかなように、上記よりも大きい結合ドメイン（例えば、７個、８個、９個以上のフィンガー）と、上記よりも長い標的部位との結合も可能である。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー融合タンパク質（ＺＦＰ）を少なくとも２つ含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＳＯＣＳ１標的ＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されている。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー融合タンパク質（ＺＦＰ）を少なくとも２つ含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＰＴＰＮ２標的ＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されている。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ジンクフィンガー融合タンパク質（ＺＦＰ）を少なくとも２つ含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＺＣ３Ｈ１２Ａ標的ＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＺＦＰは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような市販業者から入手したものである。例えば、いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＺＦＰは、表１１に示されているＺＦＰである。
Figure 2022519595000028
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＺＦＰを少なくとも２つ含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＺＦＰを少なくとも２つ含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＺＦＰを少なくとも２つ含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、そのＺＦＰの少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
そのジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、いずれのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼからも得ることができる。酵素ドメインの由来元とし得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限らない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインの供給源として用いることができる。
本明細書に記載されているＺＦＰの酵素ドメインとして用いるのに適する例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合して、結合部位でまたは結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えばタイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、離れていることのできる結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖では、その認識部位から９ヌクレオチドの位置で、もう一方の鎖では、その認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する酵素ドメイン、及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
切断ドメインが結合ドメインから離れていることのできる例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特有の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を用いて、二本鎖ＤＮＡの標的切断を行うには、ＦｏｋＩ酵素ドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性を持つ切断ドメインを再構成できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。
２．ＴＡＬＥＮシステム
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができるＴＡＬＥＮ融合タンパク質を２つ以上含むＴＡＬＥＮ遺伝子調節システムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このような遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞を提供する。ＴＡＬＥＮベースのシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。このシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製する。上記のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子調節システムで用いるのに適する例示的な酵素ドメインである。
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌が植物に感染する時に、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌によって、そのタイプＩＩＩ分泌システムを介して分泌されるタンパク質である。上記のＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３～３４個のアミノ酸の反復配列を含むが、１２番目と１３番目のアミノ酸は異なる。これらの２つの位置は、反復可変二残基（ＲＶＤ）といい、可変性が高く、特異的なヌクレオチドの認識と密接に相関する。したがって、適切なＲＶＤを含む反復セグメントの組み合わせを選択することによって、ＴＡＬエフェクタードメインを操作して、特定の標的ＤＮＡ配列と結合するようにできる。ＲＶＤの組み合わせの核酸特異性は、以下のとおりである。すなわち、ＨＤは、シトシンを標的とし、ＮＩは、アデニンを標的とし、ＮＧは、チミンを標的とし、ＮＮは、グアニンを標的とする（ただし、いくつかの実施形態では、ＮＮは、グアニンよりも低い特異性で、アデニンとも結合し得る）。
ＴＡＬエフェクターリピートをアセンブルするための方法及び組成物は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照されたい。ＴＡＬエフェクターリピートを構築するためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＴＡＬＥＮ融合タンパク質を少なくとも２つ含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号１）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＳＯＣＳ１標的ＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されている。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＴＡＬＥＮ融合タンパク質を少なくとも２つ含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＰＴＰＮ２標的ＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されている。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＴＡＬＥＮ融合タンパク質を少なくとも２つ含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＺＣ３Ｈ１２Ａ標的ＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＴＡＬ融合タンパク質を少なくとも２つ含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＴＡＬＥＮ融合タンパク質を少なくとも２つ含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、本発明の、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、ＴＡＬＥＮ融合タンパク質を少なくとも２つ含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、そのＴＡＬＥＮ融合タンパク質の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
Ｃ．核酸／タンパク質複合体ベースの遺伝子調節システム
複合型遺伝子調節システムは、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列（例えば、内在性標的ＤＮＡ配列または内在性標的ＲＮＡ配列）に結合するその核酸ガイド分子によってその標的核酸配列に導かれ、その標的核酸配列の改変（例えば、標的核酸配列の切断、変異またはメチル化）を行うポリペプチドを指す。
部位特異的改変ポリペプチドは、核酸ガイドと結合する部分及び活性部分という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的な酵素活性（例えば、ＤＮＡのメチル化、ＤＮＡまたはＲＮＡの切断、ヒストンのアセチル化、ヒストンのメチル化など）を呈する活性部分を含み、その酵素活性の部位は、ガイド核酸によって決定される。いくつかの場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する活性部分を含む。別の場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列と関連するポリペプチド（例えばヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボース化活性、脱リボース化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の転写を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＲＮＡ配列の発現または翻訳を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。
その核酸ガイドは、内在性標的核酸配列と相補的であり、内在性標的核酸配列と結合できる第１の部分（本明細書では「核酸結合セグメント」という）、及び部位特異的改変ポリペプチドと相互作用できる第２の部分（本明細書では「タンパク質結合セグメント」という）という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれている。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントはそれぞれ、別々のポリヌクレオチド分子内に含まれており、その核酸ガイドは、会合し合って機能的ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含むようになっている。
その核酸ガイドは、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズすることによって、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムの標的特異性を媒介する。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物内に含まれるＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列である。本明細書で標的遺伝子に言及する場合には、複数の標的遺伝子座（すなわち、特定の標的遺伝子配列の一部（例えば、エキソンまたはイントロン））を含むその特定の遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が含まれる。各標的遺伝子座内にあるのは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって改変できる、より短い領域のＤＮＡ配列（本明細書では「標的ＤＮＡ配列」という）である。さらに、各標的遺伝子座は、「標的改変部位」を含み、その標的改変部位とは、遺伝子調節システムによって誘導される改変の正確な位置（例えば、挿入、欠失もしくは変異の位置、ＤＮＡ切断の位置、またはエピジェネティックな改変の位置）を指す。本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、２つ以上の核酸ガイド（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数の核酸ガイド）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節システムは、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ａｇｏ、すなわちＴｔＡｇｏ）に由来する部位特異的改変ポリペプチドを含む。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ａｇｏ ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、その核酸ガイドは、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７（２０１４），２５８－２６１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス２システムである。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型システム、Ｖ型システム及びＶＩ型システムという３つの型に分類される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９タンパク質を用いるクラス２ ＩＩ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても知られている）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても知られている）及びＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても知られている））を用いるクラス２ Ｖ型システムである。このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１２（またはそのバリアント）であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られている）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ）を用いるクラス２のＶＩ型システムである。（Ｐｙｚｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（２），３４７－３５６を参照されたい。）このような実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、ＲＮＡリボエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１３であり、その核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。
Ｃａｓポリペプチドとは、ｇＲＮＡ分子と相互作用するとともに、ｇＲＮＡ分子に呼応して、標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列に誘導または局在化されることができるポリペプチドを指す。Ｃａｓポリペプチドには、天然のＣａｓタンパク質、及び操作、変更または別段に改変されたＣａｓタンパク質であって、天然のＣａｓ配列とは１つ以上のアミノ酸残基が異なるＣａｓタンパク質が含まれる。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ結合セグメント及びタンパク質結合セグメントという２つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、そのＤＮＡ結合セグメントは、別の異なるＲＮＡ分子に含まれる。このような実施形態は、本明細書では、「二重分子ｇＲＮＡ」、「二分子ｇＲＮＡ」または「デュアルｇＲＮＡ」という。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、包括的な用語であり、二分子ガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方を指す。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、ハイブリダイズし合って二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する２つの相補的ヌクレオチド領域を含み、そのｄｓＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質への結合を促す。ｇＲＮＡの核酸結合セグメント（または「核酸結合配列」）は、特異的な標的核酸配列と相補的であり、その配列に結合できるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的改変ポリペプチドとの相互作用によって、Ｃａｓが内在性核酸配列に結合し、標的核酸配列内または標的核酸配列内周辺で、１つ以上の改変が行われる。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的核酸配列との塩基対形成の相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）という短いモチーフの位置（標的ＲＮＡ配列内では、プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）という）の両方によって決定される。Ｃａｓが標的核酸配列に結合するには、ＰＡＭ／ＰＦＳ配列が必要となる。様々なＰＡＭ／ＰＦＳ配列が当該技術分野において知られており、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）とともに使用するのに適する（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１及びＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から５０塩基対以内に位置する。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から１０塩基対以内に位置する。本発明の方法によって標的にすることができるＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列と標的改変部位との相対的な距離、及び配列特異的かつｇＲＮＡ媒介性のＣａｓ結合を媒介するための特有の２０塩基対の配列の存在によってのみ制限される。いくつかの実施形態では、そのＰＦＳ配列は、標的ＲＮＡ配列の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、その標的改変部位は、標的座位のイントロンまたはエキソン内に位置する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれている。
１．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。本明細書に記載されている方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ分子を使用でき、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、天然のＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、そのＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａともいう）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３及びＣｓｆ４からなる群から選択する。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質のようなエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａタンパク質（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０ （２０１７），２８０－２８４）、Ｃａｓ１３ｂタンパク質（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、Ｃａｓ１３ｃタンパク質（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）またはＣａｓ１３ｄタンパク質（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７５（２０１８），２１２－２２３）である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型または天然のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び非標的鎖を切断するためのＲｕｖＣ様ドメインを用いるマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡの特異性に基づき、野生型Ｃａｓ９がＤＮＡに結合すると、二本鎖ＤＮＡが切断され、この切断部は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）によって修復できる。例示的な天然のＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されており、追加のＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載されている。このようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリーまたはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、天然のＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９及びＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１－６に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、
（ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
（ｂ）二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を起こす能力（一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ活性、
（ｄ）エキソヌクレアーゼ活性及び／または
（ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力、
という活性のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、様々な修復機序による、標的配列の修復の可能性または修復率をさらに向上させるために、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼを動員する異種タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、野生型Ｃａｓポリペプチドを核酸修復鋳型と共発現させる。
いくつかの実施形態では、（例えば、それぞれに異なるＰＡＭ配列選択性、酵素活性の向上または低下、細胞傷害性レベルの上昇または低下、ＮＨＥＪ、相同配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断などのバランスの変更のために）それぞれに異なるＣａｓタンパク質の様々な酵素特性を活用するためには、それぞれに異なるＣａｓタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓ９タンパク質）が、提供する各種方法で用いるものとして有益である場合がある。
いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡというＰＡＭ配列モチーフを認識する（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧＮＧ及び／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０及びＤｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ及び／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＡＴＴまたはＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｈ，ＰＮＡＳ ２０１３，１－６を参照されたい）。上記の実施形態では、Ｎは、いずれのヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれであることもできる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉに由来するＣａｓ１３タンパク質であり、３’の単一のＡ、ＵまたはＣというＰＦＳ配列モチーフを認識する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
２．Ｃａｓ変異体
いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドの、１つ以上の特性を改変させるために操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、酵素特性が改変されており、例えば、（天然のＣａｓ分子もしくは他の参照Ｃａｓ分子と比べて）ヌクレアーゼ活性が改変されているか、またはヘリカーゼ活性が改変されている。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、その大きさを改変させる改変、例えば、そのＣａｓポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、その大きさを縮小させる、アミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作Ｃａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす改変を含む。例えば、操作Ｃａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように改変させることができる。
所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、いくつかの方法で作製することができ、その方法としては、所望の特性を有する変異体または改変型のＣａｓポリペプチドを得られるように、天然のＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドを改変することが挙げられる。例えば、１つ以上の変異を親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然のＣａｓポリペプチドまたは操作Ｃａｓポリペプチド）の配列に導入できる。このような変異及び相違は、置換（例えば、保存的置換もしくは重要ではないアミノ酸の置換）、挿入または欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドに対して１個以上の変異（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個の変異）を含む。
一実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、天然のＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓは、不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）変異体である。このような実施形態では、そのＣａｓポリペプチドは、いずれの内在性酵素活性も含まず、標的核酸切断を媒介できない。このような実施形態では、そのｄＣａｓは、非切断ベースの形式で標的核酸を改変できる異種タンパク質と融合してよい。例えば、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子のドメイン（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）、ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）など）に融合されている。いくつかのこのような場合では、そのｄＣａｓ融合タンパク質は、ｇＲＮＡによって、標的核酸における所定の位置（すなわち配列）に導かれて、座位特異的な調節（ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合のブロック（それにより、転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）及び／または局在的なクロマチンの状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するか、もしくは標的ＤＮＡと関連するポリペプチドを改変する融合配列を用いる場合）など）を行う。いくつかのケースでは、その変化は、一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。いくつかのケースでは、その変化は、遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと関連するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンに、エピジェネティックな改変を加える場合）。
いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ１３変異体である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３（２０１８），６６５－６７６）。そして、これらのｄＣａｓ１３変異体は、ＲＮＡを改変する酵素に融合でき、その酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２）が挙げられる。アデノシンデアミナーゼは、アデニンをイノシンに変換し、そのイノシンを翻訳機構がグアニンのように扱うことにより、ＲＮＡ配列において、機能上はＡ→Ｇという変更が行われる。いくつかの実施形態では、そのｄＣａｓは、ｄＣａｓ９変異体である。
いくつかの実施形態では、その変異体のＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体である。Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体は、触媒活性を持つドメインを１つだけ含む（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）。このＣａｓ９ニッカーゼ変異体は、ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡ結合性を保持するが、切断できるのは、ＤＮＡの一方の鎖のみであることから、一本鎖切断（例えば「ニック」）が生じる。いくつかの実施形態では、同じ細胞内で、２つの相補的Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（例えば、ＲｕｖＣドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体、及びＨＮＨドメインが不活化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体）が、２つのそれぞれの標的配列（ＤＮＡセンス鎖上の１つの標的配列、及びＤＮＡアンチセンス鎖上の１つの標的配列）に対応する２つのｇＲＮＡとともに発現する。このデュアルニッカーゼシステムにより、ずれた位置で二本鎖切断が行われ、二本鎖切断を起こすのに充分なほど近くで２つのオフターゲットニックが生じる可能性が低くなるので、標的特異性を向上させることができる。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体を核酸修復鋳型と共発現させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣａｓポリペプチドを操作して、そのＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を改変できる。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ／ＰＦＳ特異性が、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なる。例えば、オフターゲット部位を減少させるか、特異性を向上させるか、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を排除するために、天然のＣａｓタンパク質を改変して、その変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を改変できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を改変して、ＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを長くできる。いくつかの実施形態では、そのＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１５個のアミノ酸の長さである。指向性進化法を用いて、異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識し、及び／またはオフターゲット活性が低減されたＣａｓポリペプチドを作製できる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化法で使用できる例示的な方法及びシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１１，４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。
例示的なＣａｓ変異体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３（２０１８），６６５－６７６に記載されており、これらは、参照により、その全体が本明細書に援用される。
３．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、核酸ターゲティングセグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの核酸ターゲティングセグメントは、その標的核酸内の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの核酸ターゲティングセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）によって標的核酸と相互作用し、ｇＲＮＡが結合する、標的核酸内の位置を、その核酸ターゲティングセグメントのヌクレオチド配列が決定する。ｇＲＮＡの核酸ターゲティングドメインセグメントを（例えば遺伝子操作によって）改変して、標的核酸配列内のいずれかの所望の配列にハイブリダイズさせることができる。
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチド（例えばＣａｓタンパク質）と相互作用して、複合体を形成する。そのガイドＲＮＡは、結合したポリペプチドを、上記の核酸ターゲティングセグメントによって、標的核酸内の所定のヌクレオチド配列に導く。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるとともに、二本鎖ＲＮＡを形成する２つのヌクレオチド領域を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。このような実施形態では、その２つのＲＮＡ分子はそれぞれ、互いに相補的であるヌクレオチド領域であって、その２つのＲＮＡ分子のその相補的なヌクレオチドがハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡのタンパク質結合セグメントを形成するようになっているヌクレオチド領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含む。
標的座位に対する、ｇＲＮＡの特異性は、その核酸結合セグメントの配列によって媒介され、その核酸結合セグメントは、その標的座位内の標的核酸配列と相補的である約２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その対応する標的核酸配列は、およそ２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と１００％相補的である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、その標的核酸配列は、ＤＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、その標的座位内の標的核酸配列を変更しなければならない。例えば、標的核酸配列の変更を行うことができるのは、使用するＣａｓタンパク質が変更され、その新たなＣａｓタンパク質が、異なるＰＡＭを有するからである。本明細書には、明細部分及び本明細書に示されている表に、ｇＲＮＡの標的核酸配列の例が数多く示されている。これらの標的核酸配列のいずれも、所定の遺伝子の標的座位内において、その標的核酸配列を５’または３’側に移動させることによって変更できる。いくつかの実施形態では、所定の遺伝子の標的座位内において、標的核酸配列を最大で１００ｂｐ分、５’または３’側に移動させる。別の実施形態では、所定の遺伝子の標的座位内において、標的核酸配列を最大で１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐ、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐまたは９５ｂｐ分、５’または３’側に移動させる。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸結合セグメントを含む（すなわち、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡである）。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＳＯＣＳ１標的ＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されている。
Figure 2022519595000029
Figure 2022519595000030
Figure 2022519595000031
Figure 2022519595000032
Figure 2022519595000033
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸結合セグメントを含む（すなわち、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡである）。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＰＴＰＮ２標的ＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２７２～３７５のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２７２～３７５のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２７２～３０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２７２～３０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されている。
Figure 2022519595000034
Figure 2022519595000035
Figure 2022519595000036
Figure 2022519595000037
Figure 2022519595000038
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸結合セグメントを含む（すなわち、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡである）。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＺＣ３Ｈ１２Ａ標的ＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～８１２のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～８１２のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～５７５のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～５７５のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
Figure 2022519595000039
Figure 2022519595000040
Figure 2022519595000041
Figure 2022519595000042
Figure 2022519595000043
Figure 2022519595000044
Figure 2022519595000045
Figure 2022519595000046
Figure 2022519595000047
Figure 2022519595000048
Figure 2022519595000049
Figure 2022519595000050
Figure 2022519595000051
Figure 2022519595000052
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸結合セグメントを含み（すなわち、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡである）、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸結合セグメントを含む（すなわち、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡである）。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＳＯＣＳ１標的ＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されており、例示的なＰＴＰＮ２標的ＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されており、そのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されている。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸結合セグメントを含み（すなわち、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡである）、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸結合セグメントを含む（すなわち、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡである）。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表３または表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＳＯＣＳ１標的ＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されており、例示的なＺＣ３Ｈ１２Ａ標的ＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号７～１５１のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１２及び表１３に示されており、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、ｇＲＮＡ分子を少なくとも２つ含み、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸結合セグメントを含み（すなわち、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡである）、そのｇＲＮＡ分子の少なくとも１つは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸結合セグメントを含む（すなわち、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡである）。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表５または表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、表７または表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＰＴＰＮ２標的ＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されており、例示的なＺＣ３Ｈ１２Ａ標的ＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号１８５～２０７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡの核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１４及び表１５に示されており、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、特定の標的座位または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するための、当該技術分野において知られているアルゴリズム（例えばＣａｓ－ＯＦＦ ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、オフターゲット結合を最小限にするように設計されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を付与する１つ以上の改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドを含むことができる。このような実施形態では、これらの改変ｇＲＮＡは、非改変ｇＲＮＡと比べて、自然免疫の低下を誘発し得る。「自然免疫応答」という用語には、概ねウイルスまたは細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答が含まれ、その応答には、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導が伴う。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、５’末端または５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核ｍＲＮＡのキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログまたは３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））を含めることによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させたｇＲＮＡが、ホスファターゼ（例えば仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つ以上（例えば、２５～２００個）のアデニン（Ａ）残基を付加することによって改変されている。
いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、ｇＲＮＡに存在できるが、他の遺伝子調節システム、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡベースのシステムにも存在し得る。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、
（ａ）結合していないリン酸酸素及び／またはホスホジエステル骨格結合において結合しているリン酸酸素のうちの１つ以上のうちの一方または両方の改変、例えば置換、
（ｂ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換、
（ｃ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大幅な置換、
（ｄ）天然の核酸塩基の改変または置換、
（ｅ）リボース－リン酸骨格の置換または改変、
（ｆ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の除去、改変もしくは置換、またはある部分のコンジュゲーション、ならびに
（ｇ）糖の改変、
のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施形態では、上に列挙した改変を組み合わせて、改変を２個、３個、４個または５個以上有し得る改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドは、改変糖及び改変核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのすべての塩基が改変されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のすべてが、それぞれホスホロチオエート基に置き換わっている。
いくつかの実施形態では、例えば、ゲノム全体における総オフターゲット活性を最小限にするために、ソフトウェアツールを用いて、ユーザーの標的配列内におけるｇＲＮＡの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を用いる場合の考え得る各ｇＲＮＡの選択を行う際には、ソフトウェアツールによって、ゲノム全体において、ある特定の数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）以下のミスマッチ塩基対を含むすべての潜在的オフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧのいずれかのＰＡＭの直前に位置する）を特定できる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験によって導出した重み付けスキームを用いて予測することができる。そして、考え得る各ｇＲＮＡをオフターゲット切断の総予測数によってランク付けし、上位のｇＲＮＡは、オンターゲット切断の可能性が最も高く、オフターゲット切断の可能性が最も低いｇＲＮＡとなる。そのツールには、他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクターの構築用試薬の自動設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用プライマーの設計、次世代シーケンシングによってオフターゲット切断のハイスループットの検出及び定量を行うためのプライマーの設計の機能も含まれていることがある。
ＩＶ．改変免疫エフェクター細胞の作製方法
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
本明細書に記載されている遺伝子調節システム、例えば、核酸ベース、タンパク質ベースまたは核酸／タンパク質ベースのシステムの構成成分は、様々な送達方法及び製剤を用いて、様々な形態で標的細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを組み換えベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）によって送達する。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、ベクターは、そのシステムの構成成分をそれぞれコードする複数のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、そのシステムが、２つ以上の構成成分を含む場合には、複数のベクターを用いてもよく、その各ベクターは、そのシステムの特定の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のためのシグナルペプチド）をコードする配列が、そのシステムの１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合されたものも含んでよい。例えば、ベクターは、そのシステムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合された核局在化配列（例えば、ＳＶ４０に由来する核局在化配列）を含んでよい。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｖｏで行う。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムの細胞への導入は、ｅｘ ｖｉｖｏで行う。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、ＳｒｉｖａｓｔａｖａによるＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照されたい）をベースとするウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳癌ウイルスのようなレトロウイルスに由来するベクター）などが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、プラスミドである。数多くの好適なプラスミド発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。例えば、真核宿主細胞用では、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）というベクターが供給されている。しかしながら、宿主細胞と適合するものであれば、いずれの他のプラスミドベクターも使用し得る。使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、調節エレメント、例えば、プロモーターのような転写調節エレメントに機能可能に連結されている。この転写調節エレメントは、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能するものであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方でポリヌクレオチドの発現を可能にする複数の調節エレメントに機能可能に連結されている。使用する細胞の種類及び遺伝子調節システムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。
好適な真核生物プロモーター（真核細胞で機能するプロモーターを含む）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスに由来する長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は充分に、当業者のレベルの範囲内である。その発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含んでよい。その発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含んでよい。その発現ベクターは、部位特異的改変ポリペプチドに融合されるタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列も含み、それにより、キメラポリペプチドが得られるようになっていてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能可能に連結されている。
ポリヌクレオチド及び組み換えベクターを宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において知られており、いずれかの既知の方法を用いて、遺伝子調節システムの構成成分を細胞に導入できる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、バクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子仲介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９を参照されたい）、マイクロフルイディクス送達方法（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３号を参照されたい）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションによる送達は、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で混合すること、ならびに電気的刺激を所定の期間及び振幅で１回以上加えることを含む。いくつかの実施形態では、細胞と、遺伝子調節システムの構成成分との混合物をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットに送る装置（例えばポンプ）に連結した反応容器で、細胞を遺伝子調節システムの構成成分と混合し、電気的刺激を１回以上、所定の期間及び振幅で加えた後、その細胞を第２の反応容器に送る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分、または遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、トランスポゾン、ナノ粒子（例えば脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、弱毒化細菌またはウイルス様粒子のような、ウイルス以外の送達ビヒクルで、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、弱毒化細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ある特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ及び改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含め、天然の細菌または人工的に操作されて、侵襲性であるが、発病を防ぐように弱毒化されている細菌）、標的特異的な細胞に対して栄養特異的及び組織特異的なトロピズムを有する細菌、標的細胞特異性を変化させるために、表面タンパク質が改変された細菌である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、パッケージング能が大きく、免疫原性が小さめであり、哺乳動物のプラスミド保持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた操作ファージ）である。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、哺乳動物のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空の」粒子を精製してから、ｅｘ ｖｉｖｏでウイルスを所望のカーゴとともにアセンブルすることによって）改変ウイルス粒子を作製できる。そのビヒクルを操作して、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を改変することもできる。いくつかの実施形態では、そのビヒクルは、生体リポソームである。例えば、その生体リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、赤血球ゴースト（対象に由来する赤血球を溶血させ、球体構造にしたものであり、組織ターゲティングは、様々な組織特異的または細胞特異的リガンドの結合によって実現できる））、分泌エクソソーム、すなわち、対象から得られる、エンドサイトーシス由来の膜結合型ナノベシクル（３０～１００ｎｍ）（例えば、様々な種類の細胞から産生され得るので、ターゲティングリガンドを必要とすることなく、細胞に取り込ませることができる）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、免疫エフェクター細胞集団を試料から得ることを含む。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料、流体試料、細胞試料、タンパク質試料、ＤＮＡ試料またはＲＮＡ試料を含む。いくつかの実施形態では、組織試料は、いずれの種類の組織に由来してもよく、その組織としては、皮膚、毛髪（毛根を含む）、骨髄、骨、筋肉、唾液腺、食道、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸もしくは回腸の組織）、大腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、膣、胎盤、精巣、甲状腺、副腎、心臓組織、胸腺、脾臓、リンパ節、脊髄、脳、眼、耳、舌、軟骨、白色脂肪組織または褐色脂肪組織が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、組織試料は、がん性腫瘍、前がん性腫瘍または非がん性腫瘍に由来してもよい。いくつかの実施形態では、流体試料は、口腔スワブ、血液、血漿、口腔粘膜、膣粘膜、末梢血、臍帯血、唾液、精液（ｓｅｍｅｎ）、尿、腹水、胸膜液、髄液、肺洗浄液、涙、汗、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、射精前液（クーパー液）、排泄物、脳脊髄液、リンパ、１つ以上の細胞集団を含む細胞培養培地、１つ以上の細胞集団を含む緩衝化液などを含む。
いくつかの実施形態では、その試料を処理して、免疫エフェクター細胞のような特定の種類の細胞をその試料の残部から濃縮または単離する。ある特定の実施形態では、その試料は末梢血試料であり、その末梢血試料に対しては、後で白血球アフェレーシスを行って、赤血球及び血小板を分離するとともに、リンパ球を単離する。いくつかの実施形態では、その試料は、免疫エフェクター細胞を単離または濃縮できるロイコパックである。いくつかの実施形態では、その試料は、腫瘍試料であって、さらに処理して、その腫瘍に存在するリンパ球を単離する（すなわち、腫瘍浸潤リンパ球を単離する）腫瘍試料である。
いくつかの実施形態では、単離したその免疫エフェクター細胞を培養増殖させて、増殖させた免疫エフェクター細胞集団を作製する。その増殖プロセスの最中には、培養系に、１つ以上の活性化因子または成長因子を加えてよい。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－７など）を培養系に加えて、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を増強及び促進することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体のような１つ以上の活性化抗体を培養系に加えて、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を増強または促進してよい。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、増殖プロセスの際に、フィーダー細胞と共培養してよい。いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法は、１回以上の増殖フェーズを含む。例えば、いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、試料から単離した後に増殖させ、増殖を休止させてから、再び増殖させることができる。いくつかの実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、ある一連の増殖条件で増殖させた後に、第２の異なる一連の増殖条件で、第２ラウンドの増殖を行うことができる。免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖法は、例えば、米国特許出願公開第２０１８０２８２６９４号及び同第２０１７０１５２４７８号、ならびに米国特許第８，３８３，０９９号及び同第８，０３４，３３４号に記載されているように、当該技術分野において知られている。
培養プロセス及び増殖プロセスのいずれかの時点に、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入して、改変免疫エフェクター細胞集団を作製できる。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、試料から免疫エフェクター細胞を濃縮した直後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、１つ以上の増殖プロセスの前、そのプロセスの最中またはそのプロセスの後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞を試料から濃縮するかまたは対象から採取するかした直後、かつあらゆる増殖ラウンドの前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンドの増殖の後、かつ第２ラウンドの増殖の前に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１ラウンド及び第２ラウンドの増殖の後に、免疫エフェクター細胞集団に導入する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法によって作製した改変免疫エフェクター細胞は、直ちに使用してよい。あるいは、その細胞は、液体窒素温度で凍結して、長期間保存し、解凍して、再生できるようにしてよい。このような場合には、その細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝化媒体、または細胞を同様の凍結温度で保存する目的で当該技術分野において一般的に用いられているような何らかの他の同様の溶液で凍結させ、凍結した培養細胞を解凍するためのものとして当該技術分野において一般的に知られている方式で解凍することになる。
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、様々な培養条件下で培養してよい。その細胞は、培養増殖、すなわち、その細胞の増殖を促す条件下で成長させてよい。培養培地は、液体または半固体、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含むものであってよい。その細胞集団は、ウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンが通常添加されたイスコブ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０のような適切な栄養培地に懸濁させてよい。その培養液は、制御性Ｔ細胞が応答する成長因子を含んでよい。成長因子とは、本明細書で定義する場合、膜貫通受容体に対する特異的作用を通じて、培養細胞または無傷の組織内の細胞のいずれの生存、成長及び／または分化も促すことができる分子である。成長因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチドの因子が含まれる。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的ＤＮＡ配列と、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体とを接触させることを伴う。上で論じたように、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドが複合体を形成し、そのｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメインが、その複合体を標的ＤＮＡ配列に導き、そのＣａｓタンパク質（または酵素活性が不活性なＣａｓタンパク質に融合された異種タンパク質）が、標的ＤＮＡ配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（またはｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ核酸であり、細胞にトランスダクションによって導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡの構成成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルストランスダクションによって細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムのＣａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第１のウイルスベクターに含まれ、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、第２のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、第２のウイルスベクターよりも前に、第１のウイルスベクターを細胞に導入する。この実施形態のいくつかの態様では、第１のウイルスベクターよりも前に、第２のウイルスベクターを細胞に導入する。このような実施形態では、それらのベクターが組み込まれることにより、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡの構成成分の発現が持続する。しかしながら、一部の種類の細胞では、Ｃａｓ９の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスフェクションによって、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ核酸配列を細胞集団に導入してもよい。このような実施形態では、Ｃａｓ９の発現は、時間とともに減少することになり、オフターゲット変異部位またはオフターゲット切断部位の数を減少し得る。
いくつかの実施形態では、この複合体は、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓタンパク質を一緒に混合し、複合体を形成させるのに充分な期間にわたってインキュベートすることによって、無細胞システムで形成させる。続いて、標的ＤＮＡ配列を改変する目的で、予め形成したこの複合体であって、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む複合体（本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ－リボ核タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ）という）を細胞に導入できる。
Ｂ．ｓｈＲＮＡシステムを用いた、改変免疫エフェクター細胞の作製
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物と相補的である配列を有する１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。小さな遺伝子カセットを介して、所定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、免疫エフェクター細胞を改変して、ｓｈＲＮＡを作製することができる。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方を用いて、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入することができる。導入されたＤＮＡは、細胞自体のＤＮＡの一部となることも、または核内に存続することもでき、その細胞機構に対して、ｓｈＲＮＡを産生するように命令する。ｓｈＲＮＡは、その細胞内のダイサーまたはＡｇｏ２の媒介によるスライサー活性によって処理して、ＲＮＡｉの媒介による遺伝子ノックダウンを誘導し得る。
Ｖ．組成物及びキット
「組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の製剤であって、対象または細胞に投与または送達できる製剤を指す。典型的には、製剤は、あらゆる生理学的に許容可能な組成物（その誘導体及び／またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体もしくは互変異性体を含む）を、いずれかの生理学的に許容可能な担体、希釈剤及び／または賦形剤とともに含む。「治療用組成物」または「医薬組成物」（本明細書では同義的に用いられている）は、特定の疾患もしくは障害を治療するために、対象に投与するか、または１つ以上の内在性標的遺伝子を改変するために、細胞と接触させることができる、遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の組成物である。
「薬学的に許容可能な」という表現は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を引き起こさずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適するとともに、合理的な効果／リスク比に釣り合う化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す目的で使用する。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」には、ヒト及び／または飼育動物での使用が認められるものとして、米国食品医薬品局から認可されているいずれのアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張化剤、溶媒、界面活性剤及び／または乳化剤も含まれるが、これらに限らない。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖、コーンスターチ及びバレイショデンプンのようなデンプン、セルロース、及びナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースのようなその誘導体、トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオ脂、ワックス、動物性油脂及び植物性油脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油のような油、プロピレングリコールのようなグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で用いられるいずれかの他の適合物質が挙げられるが、これらに限らない。いずれの従来の媒体及び／または作用剤も、本開示の薬剤と適合性がない場合を除き、治療用組成物で用いることが企図されている。補助的な有効成分も、その組成物に組み込むことができる。
「薬学的に許容可能な塩」には、酸付加塩と塩基付加塩の両方が含まれる。薬学的に許容可能な塩には酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成されるもの）が含まれ、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、及び酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、カンファー－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸など（これらに限らない）のような有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などのような無機塩基から誘導することもできる。有機塩基から誘導される塩としては、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などのような一級、二級及び三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂の塩が挙げられるが、これらに限らない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
湿潤剤、乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような潤沢剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、矯臭剤、保存剤、ならびに抗酸化剤も、その組成物に存在し得る。
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなどのような油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤が挙げられる。
様々な種類の投与に適する製剤に関するさらなる手引きは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見ることができる。薬物送達法の簡潔な論評については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法を行うためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、
（ａ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子、
（ｂ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｃ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質、
（ｄ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる２つ以上の改変タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｅ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡ、
（ｆ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｇ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｈ）ｇＲＮＡと相互作用して、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｉ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
（ｊ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｋ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｌ）ｇＤＮＡと相互作用して、内在性遺伝子内の標的ＤＮＡ配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｍ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡ、
（ｎ）ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合できる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｏ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
（ｐ）ｇＲＮＡと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
（ｑ）本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、または
（ｒ）上記をいずれかに組み合わせたもの
を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む。いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が当該技術分野において知られており、１つ以上のがんの治療用として、ＦＤＡから認可を受けている。例えば、ＦＤＡから認可されたＰＤ－Ｌ１阻害剤としては、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）及びデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられ、ＦＤＡから認可されたＰＤ－１阻害剤としては、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられ、ＦＤＡから認可されたＣＴＬＡ４阻害剤としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。今後、治療標的となり得る追加の抑制性免疫チェックポイント分子としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＬＡＧ３（例えば、ＢＳＭによって開発中であるＢＭＳ－９８６０１６）、ＫＩＲ（例えば、ＢＳＭによって開発中であるリリルマブ）、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ及びＶＩＳＴＡが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、及び当該技術分野において知られている１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、及び抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（またはその集団）、及び当該技術分野において知られている１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているキットは、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（またはその集団）、及び抗ＰＤ１抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む。
いくつかの実施形態では、そのキットは、遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）、ならびにその構成成分を再構成及び／または希釈するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分（またはその１つ以上の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド）を含むキットは、１つ以上の追加の試薬をさらに含み、その追加の試薬は、その遺伝子調節システムを細胞に導入するための緩衝剤、洗浄緩衝液、コントロール試薬、コントロールの発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、その遺伝子調節システムをＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで作製するための試薬などから選択できる。キットの構成成分は、別々の容器に入れることも、単一の容器内で組み合わせることもできる。
上記の構成成分に加えて、いくつかの実施形態では、キットは、そのキットの構成成分を用いて、本開示の方法を実施するための説明書をさらに含む。本開示の方法を実施するための説明書は概して、好適な記録媒体に記録されている。例えば、その説明書は、紙またはプラスチックなどのような基材に印刷されていてもよい。したがって、その説明書は、添付文書としてキット内に存在しても、キットまたはその構成成分の容器のラベルに存在してもよい（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随していてもよい）。別の実施形態では、その説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに別の実施形態では、実際の説明書は、キット内には存在しないが、その説明書をリモートソース、例えばインターネットから得る手段が供給されている。この実施形態の例は、その説明書を閲覧でき及び／またはその説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書に関しては、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材に記録されている。
ＶＩ．治療方法及び用途
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、様々な治療用途で用いてよい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び／または遺伝子調節システムは、例えば疾患を治療するための遺伝子療法を目的として、抗ウイルス剤として使用するため、抗病原体剤として使用するため、抗がん剤として使用するため、または生物学的研究のために、対象に投与してよい。
いくつかの実施形態では、その対象は、新生体、幼若体または成体であってよい。特に対象となるのは、哺乳動物の対象である。本発明の方法で治療し得る哺乳動物種としては、イヌ科及びネコ科の動物、ウマ科の動物、ウシ亜科の動物、ヒツジなど、ならびに霊長類動物、特にヒトが挙げられる。動物モデル、特に、小型の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなど）を実験的研究に用いてよい。
本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、その集団及びその組成物の投与は、注射、灌注、吸入、摂食、電気浸透、血液透析、イオントフォレシス、及び当該技術分野において知られているその他の方法によって行うことができる。いくつかの実施形態では、投与経路は、局所経路または全身経路である。いくつかの実施形態では、投与経路は、動脈内経路、頭蓋内経路、皮内経路、十二指腸内経路、乳房内経路、髄膜内経路、腹腔内経路、髄腔内経路、腫瘍内経路、静脈内経路、硝子体内経路、眼内経路、非経口経路、脊髄経路、皮下経路、尿管経路、尿道経路、膣経路または子宮内経路である。
いくつかの実施形態では、投与経路は、注入（例えば、持続注入またはボーラス）による経路である。局所投与の方法、すなわち、損傷部位または疾患部位への送達方法の例としては、例えば髄腔内送達用のオンマイヤーリザーバーによる方法（例えば、米国特許第５，２２２，９８２号、同第５，３８５，５８２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、例えばシリンジによって、例えば関節にボーラス注射する方法、持続注入、例えば、対流を伴うような挿管による方法（例えば、米国特許出願公開第２００７－０２５４８４２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、またはその細胞が可逆的に添加されたデバイスを埋め込むことによる方法（例えば米国特許出願公開第２００８－００８１０６４号及び同第２００９－０１９６９０３号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その投与経路は、局所投与または直接注射による経路である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、単独で、あるいは例えば、それらの細胞が移植される組織内でのその細胞の成長及び／または組織化を補助するための好適な基材またはマトリックスとともに、対象に供給してよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１×１０３個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、少なくとも５×１０３個の細胞、１×１０４個の細胞、５×１０４個の細胞、１×１０５個の細胞、５×１０５個の細胞、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個、またはこれを超える数の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０８～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０９～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０１０～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０１１～約１×１０１２個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０１１個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０１０個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０９個の細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、約１×１０７～約１×１０８個の細胞を対象に投与する。対象に対する、治療のための投与数は、変動し得る。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の対象への導入は、１回限りであってよい。いくつかの実施形態では、このような治療には、継続的な一連の反復処置が必要となり得る。いくつかの実施形態では、効果が観察されるまでには、改変免疫エフェクター細胞の投与が複数回必要となり得る。厳密なプロトコールは、治療を受ける個々の対象の疾患または状態、病期、及びパラメーターに左右される。
いくつかの実施形態では、遺伝子療法または生物学的研究などのために、本明細書に記載されている遺伝子調節システムを用いて、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで改変する。このような実施形態では、遺伝子調節システムは、上記の方法によるなどして、対象に直接投与してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞集団のｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの改変に用いる。このような実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、免疫エフェクター細胞を含む試料に投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞を対象に投与する。いくつかの実施形態では、対象に投与する、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、自己免疫エフェクター細胞である。この関連における「自己」という用語は、投与される同じ対象から得た細胞を指す。例えば、免疫エフェクター細胞は、対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘ ｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で同じ対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、自己免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、対象に投与する改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、同種異系免疫エフェクター細胞である。この関連における「同種異系」という用語は、ある対象から採取して、別の対象に投与する細胞を指す。例えば、免疫エフェクター細胞は、第１の対象から採取して、本明細書に記載されている方法に従って、ｅｘ ｖｉｖｏで改変してから、疾患を治療する目的で第２の対象に投与し得る。このような実施形態では、その対象に投与する細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、疾患を治療する目的で、対象に投与する。いくつかの実施形態では、治療は、細胞集団（例えば、改変免疫エフェクター細胞集団）またはその組成物を有効量、治療の必要な対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、治療とは、哺乳動物、例えばヒトの疾患の治療を指し、その治療には、（ａ）疾患を抑制すること、すなわち、疾患の発症を抑止するか、または疾患の進行を防止すること、（ｂ）疾患を軽減させること、すなわち、病態を好転させるか、または疾患の１つ以上の症状を軽減させること、及び（ｃ）疾患を治癒させること、すなわち、１つ以上の疾患症状を寛解させることが含まれる。いくつかの実施形態では、治療とは、１つ以上の疾患症状を短期的に（例えば、一時的に及び／または短時間）、及び／または長期的に（例えば持続的に）軽減することを指してよい。いくつかの実施形態では、治療によって、疾患の症状が改善または軽快する。この改善は、観察可能もしくは測定可能な改善であり、または対象の体調的な感覚の改善であってもよい。
特定の対象に投与する改変免疫エフェクター細胞の有効量は、様々な要因によって決定されることになり、その要因のうちのいくつかは、患者によって異なり、その要因としては、治療する障害及びその障害の重症度、用いる具体的な薬剤（複数可）の活性、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活、投与のタイミング、投与経路、治療期間、併用する薬物、処方医の判断、ならびに医療技術分野において知られている類似の要因が挙げられる。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、腫瘍の質量もしくは体積、腫瘍細胞数、または転移数を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはこれを上回る割合減少させるのに必要な細胞数であってよい。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、平均余命の延長、無増悪生存期間もしくは無病生存期間の延長、または治療する疾患と関連する様々な生理学的な症状の改善をもたらすのに必要な細胞数であってよい。いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の有効量は、少なくとも１×１０３個の細胞、例えば、５×１０３個、１×１０４個、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、１×１０１０個、５×１０１０個、１×１０１１個、５×１０１１個、１×１０１２個、５×１０１２個またはこれを上回る数の細胞となる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、がんのような細胞増殖性障害の治療で用いてよい。本発明で開示する組成物及び方法を用いて治療し得るがんとしては、血液のがん及び固形腫瘍が挙げられる。例えば、本発明で開示する組成物及び方法を用いて治療し得るがんとしては、腺腫、癌腫、肉腫、白血病またはリンパ腫が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、そのがんは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、神経芽腫、大腸癌、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、肺癌（ＮＳＣＬＣが挙げられるが、これに限らない）、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、星状細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫、膀胱癌及び肝臓癌である。
上記のように、様々な腫瘍の適応症で使用するものとして、現在、いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が認可されている（例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ１阻害剤、ＰＤＬ１阻害剤など）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞を投与すると、治療効果が、免疫チェックポイント阻害剤による治療後に観察される効果よりも増強される（例えば、腫瘍の成長がさらに有意に低下する、リンパ球の腫瘍への浸潤性が向上する、無増悪生存期間が長くなるなど）。
さらに、一部の腫瘍適応症は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して不応性（すなわち非感受性）のものである。さらに、最初は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に応答する（すなわち、感受性を示す）腫瘍適応症の一部は、治療の過程で阻害剤耐性表現型を発現する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）であるがんを治療する目的で投与する。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）であるがんを罹患している対象に、その改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を投与することによって、そのがんを治療する（例えば、腫瘍の成長を低下させる、無増悪生存期間を延長するなど）。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）または非感受性（もしくは部分的に非感受性）のがんである。
いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞またはその組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性、抵抗性または非感受性であるがんでの治療効果が、その改変免疫エフェクター細胞または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかのみによる治療によって観察される効果よりも増強される。いくつかの実施形態では、本発明の改変免疫エフェクター細胞を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与すると、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して部分的に耐性、部分的に抵抗性または部分的に非感受性であるがんでの治療効果が、その改変免疫エフェクター細胞または免疫チェックポイント阻害剤のいずれかのみによる治療によって観察される効果よりも増強される。いくつかの実施形態では、そのがんは、ＰＤ１阻害剤による治療に対して耐性（もしくは部分的に耐性）、抵抗性（もしくは部分的に抵抗性）、または非感受性（もしくは部分的に非感受性）のがんである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与すると、抗ＰＤ１抗体のみによる治療に対して耐性または非感受性であるがんでの治療効果が増強される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞またはその組成物を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与すると、抗ＰＤ１抗体のみによる治療に対して部分的に耐性または部分的に非感受性であるがんでの治療効果が増強される。
免疫チェックポイント阻害剤に対して耐性または感受性を示すがんは、当該技術分野において知られており、様々なｉｎ ｖｉｖｏモデル及びｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで試験できる。例えば、いくつかのメラノーマは、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して感受性があり、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｂ１６－Ｏｖａ腫瘍モデルでモデル化できる（実施例５を参照されたい）。さらに、いくつかの大腸癌は、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して耐性があることが知られており、ＰＭＥＬ／ＭＣ３８－ｇｐ１００モデルでモデル化できる（実施例５を参照されたい）。さらにまた、いくつかのリンパ腫は、抗ＰＤ１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤による治療に対して非感受性があることが知られており、Ｒａｊｉ細胞のようなリンパ腫細胞株の養子移入または皮下投与によって、様々なモデルでモデル化できる（実施例６～９を参照されたい）。
ＴＩＬ療法を含め、現在の養子細胞療法には、ＴＩＬを注入する７日前に、Ｃｙ／Ｆｌｕベースの治療を用いてリンパ球除去を行うことが含まれる。そのリンパ球除去は、内在性Ｔｒｅｇ集団を除去し、内在性のＩＬ－７及びＩＬ－１５の産生を高め、ＴＩＬ注入のための物理的スペースを作るために必要であると考えられる。このリンパ球除去は、重篤なグレード３、グレード４、及び場合によってはグレード５の有害事象を伴い、患者の転帰に多大な影響を及ぼすことがある。加えて、現在の療法には、移入されたＴＩＬの機能及び生存性を高める目的で、ＴＩＬ注入の５日前に、ＩＬ－２を高用量注入することが含まれる。しかしながら、高用量のＩＬ－２の注入には、毛細血管漏出症候群を含む重篤なグレード３及び４の有害事象が伴う。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、リンパ球除去治療を受けたことがないレシピエント宿主に移入し、及び／または高用量ＩＬ－２治療を行わずに、レシピエント宿主に移入する。理論に束縛されることを望まないが、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞（例えば、改変ＴＩＬ）は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２に対する感受性が増大し、すなわち、その改変細胞の競合的適応性、生存性及び／または存続性が増大し、リンパ球除去及び／または高用量のＩＬ－２が不要となる可能性がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、ウイルス感染症の治療で用いてよい。いくつかの実施形態では、そのウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス及び帯状疱疹ウイルスを含む）、ポックスウイルス、パポバウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む）、パピローマウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ及びＣ型インフルエンザを含む）、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスまたはレトロウイルスのうちの１つから選択する。
実施例１：材料及び方法
本明細書に記載されている実験では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、それぞれ異なるＴ細胞集団において、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａのうちの２つ以上の発現を低下させる。
ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ：別段に示されていない限り、下記の実験では、２００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）と２００μＭの標的特異的ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）をＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１１－０１－０３－０１）中で５分、９５℃で複合化して、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体（ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡが１：１の比率で存在する）を形成することによって形成したデュアルｇＲＮＡを使用する。あるいは、単分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ＩＤＴ）を１００μＭで、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴ）に再懸濁させた。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質のいずれかを導入することによって、Ｃａｓ９を標的細胞内で発現させた。別段に示されていない限り、下記の実験では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴカタログ番号１０７４１８２）を使用した。ヒトＲＮＰでは、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体またはｇＲＮＡ１．２μＬと、２０μＭのＣａｓ９タンパク質１μＬ及びＰＢＳ０．８μＬとを混ぜ合わせることによって、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。マウスＲＮＰでは、４４μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体またはｇＲＮＡ１容量と、３６μＭのＣａｓ９ １容量とをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔにおいて混ぜ合わせることによって、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。いずれのＲＮＰでも、混合物を室温で２０分インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。下記の実験で使用したｇＲＮＡは、下記の表１８に示されている。
Figure 2022519595000053
ＣＡＲ発現コンストラクト：ヒトＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製した。簡潔に述べると、ＣＤ１９（クローンＦＭＣ６３）に特異的に結合する抗原特異的ｓｃＦｖドメインに、ヒト顆粒球－マイクロファージコロニー刺激因子受容体サブユニットα（ＧＭＳＣＦ－Ｒα）の２２個のアミノ酸シグナルペプチドを融合した。ヒトＣＤ８αストークを膜貫通ドメインとして使用した。ＣＤ３ξ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインをそのＣＤ８αストークの細胞質末端に融合した。その完全長ＣＡＲコンストラクトは、配列番号８１３に示されており、その完全長ＣＡＲコンストラクトの核酸配列は、配列番号８１４に示されている。
操作ＴＣＲ発現コンストラクト：（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１との関連における）ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに特異的な組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を作製した。ＴＣＲ－α：ＴＣＲ－βが対になった可変領域タンパク質の配列であって、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号８１５）という配列を含むＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドに特異的な１Ｇ４ ＴＣＲ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって提示される）をコードする可変領域タンパク質配列を文献（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）から特定した。そのＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドは、追加のシステインまたはバリンをそのＣ末端に有し得る。ＴＣＲα鎖は、Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＣＤＲ３α配列で構成させ、ＴＣＲβ鎖は、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＣＤＲ３－β配列で構成させた。天然型のＴＲＡＣタンパク質配列（配列番号８１６）をα鎖可変領域のＣ末端に、ＴＲＢＣタンパク質配列（配列番号８１７）をβ鎖可変領域のＣ末端に融合して、９５：ＬＹ １Ｇ４－ＴＣＲα鎖（配列番号８１８）／９５：ＬＹ １Ｇ４－ＴＣＲβ鎖（配列番号８１９）を作製した。
これらの操作ＴＣＲα鎖タンパク質及びＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を作製し、その際には、ＴＣＲβ鎖及びＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列の間に、Ｐ２Ａ配列（配列番号８２０）を挿入して、両方のＴＣＲ鎖の発現を化学量論的に単一のプロモーターから駆動させるようにした。したがって、これらの操作ＴＣＲ鎖をコードする発現カセットは、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαという形態を含んでいた。各ＴＣＲコンストラクトの最終的なタンパク質配列は、配列番号８２１（９５：ＬＹ １Ｇ４）に示されている。このＴＣＲコンストラクトは、以下では、「ＴＣＲ２」と称する。
コンストラクトのレンチウイルスによる発現：続いて、上記の操作受容体の発現を駆動するＳＦＦＶプロモーター、Ｔ２Ａ配列及びピューロマイシン耐性カセットを含むプラスミドに、上記のＣＡＲ発現コンストラクト及び操作ＴＣＲ発現コンストラクトを挿入した。操作ＣＡＲ発現コンストラクトを含むレンチウイルスコンストラクトは、上記のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域をコードする内在性ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをさらに含んでよい。
上記の操作受容体をコードするレンチウイルスは、以下のようにして作製した。簡潔に述べると、トランスフェクションの２４時間前に、２８９×１０６個のＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞を５段ＣｅｌｌＳＴＡＣＫに播種した。無血清ＯｐｔｉＭＥＭ及びＴｒａｎｓＩＴ－２９３を合わせ、５分インキュベートしてから、ヘルパープラスミド（ＶＳＶＧを５８μｇ及びＰＡＸ２－Ｇａｇ－Ｐｏｌを１１５μｇ）と、上記の操作受容体及びｓｇＲＮＡ発現プラスミド２３１μｇを合わせた。２０分後、この混合物を上記のＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞に、新鮮な培地とともに加えた。トランスフェクションの１８時間後に、培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に、ウイルス上清を回収した。上清をヌクレアーゼＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理し、０．４５μｍのフィルターにかけて、ウイルス粒子を単離した。続いて、ウイルス粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮し、小分けし、力価の測定を行い、－８０℃で保存した。
ヒトＴ細胞の単離及び活性化：ヒト全ＰＢＭＣを新鮮な白血球アフェレーシス産物から、フィコール勾配遠心分離によって単離した。続いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１７９５３）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を全ＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞の活性化のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０６細胞／ｍＬで、Ｔ１７５フラスコ内のＸ－ＶＩＶＯ１５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ）に、６．２５μＬ／ｍＬのＴ細胞活性化因子ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ２とともに播種した。レンチウイルスコンストラクトによるトランスダクションの前に、Ｔ細胞を１８時間活性化させた。
Ｔ細胞へのレンチウイルスによるトランスダクション：事前に１８時間活性化させたＴ細胞を６ウェルプレートに、１ウェル当たり５×１０６細胞で、体積１．５ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ１５培地、ならびに１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２及び１２．５μＬのヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ中に播種した。上記の操作受容体を発現するレンチウイルスを、全細胞の８０％に感染できるＭＯＩで加えた。２５μＬのレトロネクチン（１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。ＸＶＩＶＯ－１５培地を、１ウェル当たりの最終体積が２．０ｍＬになるまで加えた。プレートを６００×ｇで１．５時間、室温で回転させた。１日後、細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬで、Ｘ－ＶＩＶＯ１５、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２＋Ｔ細胞活性化因子中に播種した。
ヒトＰＢＭＣ由来のＴ細胞へのエレクトロポレーション：Ｔ細胞の活性化から３日後に、Ｔ細胞を回収し、ヌクレオフェクション緩衝液（Ａｍａｘａ Ｐ３初代細胞４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＸキットＳの助剤１を１８％、Ｐ３緩衝液を８２％）に、１００×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。細胞溶液２０μＬ当たりに、１．５μＬのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体（１２０ピコモルのｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体及び２０ピコモルのＣａｓ９ヌクレアーゼを含む）、ならびに２．１μＬ（１００ピコモル）のエレクトロポレーション促進剤を加えた。続いて、細胞／ＲＮＰ／促進剤の混合物２５μＬを各エレクトロポレーションウェルに加えた。「ＥＯ－１１５」というプログラムによって、Ｌｏｎｚａのエレクトロポレーターを用いて、細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、温めたＸ－ＶＩＶＯ１５培地８０μＬを各ウェルに加え、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地中で、細胞を培養フラスコに、２×１０６細胞／ｍＬの密度でプールした。４日目に、細胞を洗浄、計数し、利用可能な細胞数に応じて、Ｇ－Ｒｅｘ６ＭウェルプレートまたはＧ－Ｒｅｘ１００Ｍ内のＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地に、５０～１００×１０６細胞／Ｌの密度で播種した。６日目及び８日目に、その培養液に、１０ｎｇ／ｍＬの新鮮な組み換えヒトＩＬ－２を加えた。
ヒトＴＩＬの単離及び活性化：本明細書に記載されている方法によって、腫瘍浸潤リンパ球も改変することができる。このような場合では、腫瘍をヒト患者から手術により切除し、外科用メスで１ｍｍ３の切片に裁断し、一片の腫瘍を２４プレートの各ウェルに入れる。６０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した２ｍＬの完全ＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化男性ヒトＡＢ血清、１ｍＭのピルビン酸塩、２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１×グルタマックス）を単離ＴＩＬの各ウェルに加える。１ｍＬの培地をウェルから除去し、必要に応じて、最大で週に３回、新鮮な培地及びＩＬ－２と交換する。ウェルがコンフルエントになったら、１：１で、新たな培地＋ＩＬ－２に分ける。４～５週間の培養後、急速増殖のために、それらの細胞を回収する。
ＴＩＬの急速増殖：２０ｍＬのＴＩＬ培地＋２０ｍＬのＡｉｍ－Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３ ｍＡｂにおいて、５００，０００個のＴＩＬを２６×１０６個の同種異系の照射（５０００ｃＧｙ）ＰＢＭＣフィーダー細胞で活性化させることによって、ＴＩＬを急速に増殖させる。４８時間後（２日目）、その培養液に６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を加える。５日目に、２０ｍＬの培地を除去し、２０ｍＬの新鮮な培地（＋３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３）を加える。７日目に、細胞を計数し、利用可能な細胞数に応じて、６０×１０６細胞／Ｌで、Ｇ－Ｒｅｘ６Ｍウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０６６０Ｍ）またはＧ－Ｒｅｘ１００Ｍ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）に播き直す。９日目に、６０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ－２を加え、１２日目に、３０００Ｕ／ｍＬの新鮮なＩＬ－２を加える。１４日目に、ＴＩＬを回収する。続いて、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ凍結容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、増殖細胞をＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ－１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号０７９３０）で低速凍結し、液体窒素中で長期保存する。
マウス：野生型ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）から採取した。オボアルブミン（Ｏｖａ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から採取した。ＯＴ１マウスは、オボアルブミン（Ｏｖａ）タンパク質の２５７～２６４位の残基を認識するトランスジェニックＴＣＲを有する。ｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＭＥＬマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｈｙ１＜ａ＞／ＣｙＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥカタログ番号００５０２３）から採取した。Ｃａｓ９タンパク質を構成的に発現するマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから入手し（Ｂ６Ｊ．１２９（Ｃｇ）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＣＡＧ－ｃａｓ９＊，－ＥＧＦＰ）Ｆｅｚｈ／Ｊ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ系統番号０２６１７９）、Ｃａｓ９を構成的に発現するＴＣＲトランスジェニックマウスは、ＯＴ１マウスをＣａｓ９マウスと交配させることによって得た。
マウスＴ細胞の単離及び活性化：トランスジェニックマウスの脾臓を摘出し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステムをメーカーの推奨に従って用いて、単細胞懸濁液まで解離させた。ＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号１９８５３）を用いて、精製ＣＤ８＋ Ｔ細胞を得た。２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号５７５４０６）を添加した完全Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ－メルカプトエタノール）で、ＣＤ８ Ｔ細胞を１×１０６細胞／ｍＬで培養し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍｏｕｓｅ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ ｆｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、カタログ番号１１４５６Ｄ）で活性化させた。
マウスＴ細胞へのエレクトロポレーション：事前に４８時間活性化させたマウスＴ細胞を回収し、活性化ビーズを除去し、細胞を洗浄し、Ｎｅｏｎのヌクレオフェクション緩衝液Ｔに再懸濁させた。Ｎｅｏｎ（商標）の１００μＬ用チップ１つを用いて、９０μＬ（単一編集の場合）または８０μＬ（組み合わせて編集する場合）の緩衝液Ｔに再懸濁させた最大２×１０６個の細胞をエレクトロポレーションできる。チップ１つ当たりに、各ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体を１０μＬ、１０．８μＭのエレクトロポレーション促進剤を２０μＬ加えた。Ｔ細胞／ＲＮＰ／促進剤の混合物をＮｅｏｎ（商標）のチップに加え、１７００Ｖで、２０ｍｓの単一パルスを用いて、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション直後に、培養フラスコにおいて、２ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ－２を添加した温めた完全Ｔ細胞培地に、細胞を１．６×１０６細胞／ｍＬの密度で移した。ＩＬ－２を添加した完全Ｔ細胞培地中で、編集されたマウスＣＤ８ Ｔ細胞をさらに、１×１０６細胞／ｍＬで、さらに２日間培養した。４日目に、細胞を回収、計数し、ｉｎ ｖｉｖｏ注射のために、ＰＢＳに再懸濁させた。
マウスＴＩＬの作製及び編集：ＴＩＬを作製するために、ドナーであるＣＤ４５．１Ｐｅｐ Ｂｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）に、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ細胞を皮下注射した。腫瘍細胞の接種から１４日目に、腫瘍を摘出して、第２のコホートのマウスに注入するための編集型ＣＤ４５．１腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製した。Ｂ１６－Ｏｖａ腫瘍（２００～６００ｍｍ３）を摘出し、裁断し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳシステム及びｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０－０９６－７３０）をメーカーの推奨に従って用いて、単細胞懸濁液まで解離させた。腫瘍懸濁液を７０μＭの細胞ストレーナーで濾過し、ＣＤ４／ＣＤ８（ＴＩＬ）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０－１１６－４８０）を用いて、ＴＩＬを濃縮した。３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０２）を添加した完全ｍＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭのβ－メルカプトエタノール）で、単離ＴＩＬを６ウェルプレートにおいて、１．５×１０６細胞／ｍＬで培養した。３日目に、細胞を回収し、洗浄し、ヌクレオフェクション緩衝液Ｔに再懸濁させ、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＲＮＰをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した完全ｍＴＩＬ培地で、ＴＩＬを６ウェルプレートにおいて、１．５×１０６細胞／ｍＬで培養した。５日目及び７日目に、３０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２を添加した新鮮な完全ｍＴＩＬ培地に細胞を再懸濁させ、１×１０６細胞／ｍＬの密度でフラスコに播種した。８日目に、細胞を回収し、計数し、ｉｎ ｖｉｖｏ注射のために、ＰＢＳに再懸濁させた。
実施例２：デュアル編集の組み合わせに関するスクリーニング
ダブルｓｇＲＮＡライブラリーをレトロウイルス骨格で構築した。そのライブラリーは、単一のガイドＲＮＡ（ガイド＋ｔｒａｃｒ、ｓｇＲＮＡ）の発現をそれぞれ駆動する２つのＵ６プロモーター（１つのヒトＵ６プロモーター及び１つのマウスＵ６プロモーター）で構成させた。それらのガイドをプールとしてクローニングして、すべてのｓｇＲＮＡそれぞれが、他のすべてのｓｇＲＮＡそれぞれと対になるように、ガイドをランダムに組み合わせた。最終的なダブルガイドライブラリーをＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、マウスエコトロピックレトロウイルスを作製した。Ｃａｓ９を発現するＴＣＲトランスジェニックＯＴ１細胞を、ｓｇＲＮＡ発現ウイルスに感染させて、各ｓｇＲＮＡの標的となる２つの遺伝子座を編集した。続いて、４００ｍｍ３超のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍同種移植片を担持するマウスに、編集されたトランスジェニックＴ細胞を移入した。２週間後、その腫瘍を切り出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて消化して、単細胞懸濁液にした。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｋｉｔを用いて、ｇＤＮＡをその細胞ペレットから抽出し、レトロウイルス骨格配列に対応するプライマーを用いたＰＣＲによって、レトロウイルスインサートを回収した。続いて、得られたＰＣＲ産物をシーケンシングして、移入の２週間後に腫瘍に存在するｓｇＲＮＡを特定した。最終単離細胞集団内のガイドペアの内容を、最初のプラスミド集団、及びマウスに注射する前の感染トランスジェニックＴ細胞集団と比較した。Ｔ細胞の適応性及び／または腫瘍浸潤性を向上させるｓｇＲＮＡペアの頻度は、時間とともに上昇すると予測され、一方、適応性を損なう組み合わせは、時間とともに減少すると予測された。下記の表１９には、最終細胞集団におけるｓｇＲＮＡ頻度を、ｉｎ ｖｉｖｏ移入した最初の細胞集団におけるｓｇＲＮＡ頻度と比較した変化倍率の中央値が示されている。
Figure 2022519595000054
Figure 2022519595000055
実施例３：マウス同系腫瘍モデルにおけるＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
ＯＴ１ Ｔ細胞及びＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞モデル：Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部に、０．５×１０６個のＢ１６Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。接種から１５日後に、全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ４８５ｍｍ３に達したら、マウスを１群当たり１０頭からなる５つの群に無作為に分け、尾静脈注射によって、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子（配列番号２７０）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｐｔｐｎ２遺伝子（配列番号２０２）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｓｏｃｓ１遺伝子（配列番号９）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ｐｔｐｎ２遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を次世代シーケンシングによって評価したところ、Ｐｔｐｎ２遺伝子では７０％、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８２％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ最終－Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、７日目であり、初期は、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である。
図１のデータには、皮下Ｂ１６Ｏｖａマウスモデルにおいて、コントロールのガイドと比較したところ、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入によって、抗腫瘍応答が得られたことが示されている。さらに、Ｔ細胞移入から７日後に観察された％ＴＧＩは、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集群（ＴＧＩ＝９０％）において、Ｐｔｐｎ２単一編集群（ＴＧＩ＝１％）またはＳｏｃｓ１単一編集群（ＴＧＩ＝４４％）のいずれよりも上昇した。加えて、ＰＤ１編集型Ｔ細胞の場合に観察された％ＴＧＩ（ＴＧＩ＝３０％）と比較しても、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集群の％ＴＧＩは上昇した。Ｂ１６－Ｏｖａモデルにおけるデュアル編集型Ｔ細胞及び単一編集型Ｔ細胞の有効性の概要は、下記の表２０に示されている。
Figure 2022519595000056
 ＊１００ｍｍ３
＊＊５００ｍｍ３超
ＮＴ＝未試験、（－）＝有効性は観察されず、（＋）＝大半のマウスにおいて、応答が中度、（＋＋）＝大半のマウスにおいて、応答が強度、（＋＋＋）＝処置したすべてのマウスにおいて、応答が最高強度（一部、完全奏効を含む）
続いて、ＰＤ－１耐性の大型腫瘍Ｂ１６Ｏｖａモデルにおける試験を上記のようにして行い、接種から１５日後における初期の開始腫瘍体積は、およそ３４３ｍｍ３であった。その元々の大型Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍が完全に拒絶されたマウスには、Ｔ細胞移入から１０６日後、左側腹部皮下に、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞（ｎ＝６）または０．３×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（ｎ＝６）のいずれかでリチャレンジを行った。Ｐｔｐｎ２遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を次世代シーケンシングによって評価したところ、Ｐｔｐｎ２遺伝子では７５．４％、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８６．５％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を上記のようにして算出した。リチャレンジの前後の様々な時点に、マウスに尾採血を行い、試料をフローサイトメトリーによって解析して、末梢血中のＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞及びその表現型を追跡した。
別のコホートのマウスに接種を行い、６日目に安楽死させた。腫瘍、脾臓及び血液において、フローサイトメトリーによって、全ＯＴ１集団、サイトカイン産生及び標的関連のその他の読み出しデータについて解析した。
図９Ａのデータには、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入を行ったところ、８頭のマウスのうちの８頭が、大型Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍に対して完全奏効を達成したことが示されている。Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞で処置したマウスでは、６日目に、単一編集型ＯＴ１ ＣＤ８ Ｔ細胞の場合と比べて、Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍内のＯＴ１細胞数が増加し（図９Ｂ）、グランザイムＢも増加した（図９Ｃ）。図９Ｄには、大型Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍を以前に拒絶したすべてのマウスが、その後、ナイーブマウスよりも、２回目に接種したＢ１６Ｏｖａを拒絶できたことが示されている。大型Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍を以前に拒絶した６頭のマウスのうち２頭は、ネオアンチゲンを発現しない元のＢ１６Ｆ１０を２回目として接種した腫瘍も完全に拒絶できた。Ｂ１６Ｏｖａによるリチャレンジの際のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けにより、Ｂ１６Ｏｖａによるリチャレンジから８日後に、これらの細胞が、セントラルメモリー表現型からエフェクター表現型に発展したことが示された。この発展後、セントラルメモリー表現型に戻った（図９Ｅ）。
ＰＭＥＬ Ｔ細胞及びＭＣ３８－ｇｐ１００腫瘍細胞モデル：追加の実験を行って、大腸癌の皮下ＭＣ３８同系腫瘍モデル（抗ＰＤ１抗体による処置に対して非感受性である）におけるＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の作用を評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ｇｐ１００を発現するＭＣ３８腫瘍細胞を１×１０６個皮下注射する。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集マウスＰＭＥＬ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。注射の前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｐｔｐｎ２遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。ＰＭＥＬ ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、実施例４に記載されている方法に従って編集した。ＮＧＳを用いることによって、Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＰｔｐｎ２遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｓｏｃｓ１遺伝子では６５％、Ｐｔｐｎ２遺伝子では４７％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、各処置群における％ＴＧＩは、上記のようにして算出する。これらの実験により、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、コントロールまたは単一編集型のＴ細胞で治療する場合と比べて向上することが示される。
実施例４：転移性肺癌のマウス同系モデルにおけるＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性Ｂ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルを用いて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内注射した。接種の前に、マウスの体重を測定し、マウスを無作為に治療群に割り当てた。腫瘍細胞の接種から３日後に、マウスに編集マウスＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。Ｔ細胞の注射前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｐｔｐｎ２遺伝子（配列番号２０２）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｓｏｃｓ１遺伝子（配列番号９）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。ＮＧＳを用いることによって、Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＰｔｐｎ２遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｓｏｃｓ１遺伝子では６５％、Ｐｔｐｎ２遺伝子では４７％であることが判明した。体重を少なくとも週に２回モニタリングした。腫瘍細胞の接種から１５日目（Ｔ細胞移入から１２日目）に、各マウスの肺を１０％パラホルムアルデヒドで灌流及び固定した。一晩固定後、肺をさらに保存するために、７０％ＥｔＯＨに移した。
肺においてがん細胞の黒色コロニーとして見ることができるＢ１６－Ｆ１０腫瘍量を目視で評価することによって、腫瘍有効性を評価した。非処置群、及びコントロールの編集型ＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞で処置したマウスから得たすべての肺で、多数の転移性コロニーが観察され、これらの群では、疾患の顕著な進行が示された。Ｓｏｃｓ１単一編集型細胞で処置したマウスでは、部分的な有効性が見られ、転移性腫瘍量が部分的に減少した形跡が示されたのに対して、Ｐｔｐｎ２単一編集型細胞では、有効性は最小限であった。しかしながら、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型細胞で処置したところ、強力な抗腫瘍有効性が得られ、腫瘍の形成がほぼ完全に阻害された。Ｂ１６－Ｆ１０モデルにおけるデュアル編集型Ｔ細胞及び単一編集型Ｔ細胞の有効性の概要は、下記の表２１に示されている。
Figure 2022519595000057
 （－）＝有効性は観察されず、（＋）＝大半のマウスにおいて、応答が中度、（＋＋）＝大半のマウスにおいて、応答が強度、（＋＋＋）＝処置したすべてのマウスにおいて、応答が最高強度（一部、完全奏効を含む）
実施例５：メラノーマの異種移植モデルにおけるＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
Ａ３７５異種移植腫瘍モデルを用いて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢のＮＳＧマウスに、５×１０６個のＡ３７５細胞（ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を発現する）を皮下注射する。腫瘍が、およそ２００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを８頭からなる群に無作為に分け、最大３０×１０６個の編集細胞（さらに、ＴＣＲ２を発現するように、レンチウイルスを用いてトランスダクションした）を尾静脈から静脈内注射する。Ｔ細胞の注射前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｐｔｐｎ２遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、％ＴＧＩは、上記のようにして算出する。これらのデータにより、ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍モデルにおいて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞で処置すると、抗腫瘍有効性が、Ｐｔｐｎ２単一編集型細胞またはＳｏｃｓ１単一編集細胞のいずれかで処置した後に観察される抗腫瘍有効性よりも向上することが示される。
実施例６：Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球の有効性
探索的マウスモデルにおいて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗腫瘍有効性を評価した。この実験では、ドナーコホートのＣＤ４５．１ Ｐｅｐ Ｂｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）及びレシピエントコホートのＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）という２つのマウスコホートを使用し、それぞれ、６～８週齢の雌のマウスから構成させた。
ＴＩＬを作製するために、ドナーであるＣＤ４５．１ Ｐｅｐ Ｂｏｙマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ細胞を皮下注射した。腫瘍細胞の接種から１４日目に、腫瘍を摘出して、実施例１に記載されているように、第２のコホートのマウスに注入するための編集型ＣＤ４５．１腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製した。これらのＴＩＬ細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｐｔｐｎ２遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（４）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。ＮＧＳを用いることによって、Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＰｔｐｎ２遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｓｏｃｓ１遺伝子では７７．８％、Ｐｔｐｎ２遺伝子では８７．６％であることが判明した。Ｐｔｐｎ２＋Ｓｏｃｓ１編集型の詳細については、実施例１０及び実施例１５を参照されたい。
レシピエントであるＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集ＣＤ４５．１ ＴＩＬを尾静脈から静脈内注射した。追加実験で、ヒトＩＬ－２を同時送達できる。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、下記の式に従って、％ＴＧＩを算出した。
％ＴＧＩ＝（Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ最終）－Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１７日目であり、初期は、編集ＴＩＬの移入日である。
この探索的モデルを用いたこの予備実験では、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型ＴＩＬで処置すると、抗腫瘍有効性が向上する。
Figure 2022519595000058
 （－）＝有効性は観察されず、（＋）＝大半のマウスにおいて、応答が中度、（＋＋）＝大半のマウスにおいて、応答が強度、（＋＋＋）＝処置したすべてのマウスにおいて、応答が最高強度（一部、完全奏効を含む）
実施例７：マウス同系腫瘍モデルにおけるＺｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
ＯＴ１ Ｔ細胞及びＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞モデル：Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ４８５ｍｍ３に達したら、マウスを１群あたり１０頭からなる５つの群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。注射の前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号２１１）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｓｏｃｓ１遺伝子（配列番号９）を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（４）一方はＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とし、もう一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率をＮＧＳによって評価したところ、Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子では８６％、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８４％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ最終）－Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１０日目であり、初期は、編集Ｔ細胞の移入日である。
図２のデータには、皮下Ｂ１６Ｏｖａマウスモデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入すると、コントロールのガイドと比べて、抗腫瘍応答が増強されたことが示されている。この作用は、試験終了前、１４０日目まで維持された。
ＰＭＥＬ Ｔ細胞及びＭＣ３８－ｇｐ１００腫瘍細胞モデル：追加の実験を行って、大腸癌のＭＣ３８皮下同系腫瘍モデル（抗ＰＤ１抗体による処置に対して非感受性である）におけるＺｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の作用を評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ｇｐ１００を発現するＭＣ３８腫瘍細胞を１×１０６個皮下注射する。腫瘍が、およそ１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集マウスＰＭＥＬ ＣＤ８＋ Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。注射の前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、各群における％ＴＧＩを上記のようにして算出する。これらの実験では、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、コントロールまたは単一編集型のＴ細胞で処置した場合と比べて向上することが予測される。
実施例８：転移性がんのマウス同系モデルにおけるＺｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性Ｂ１６－Ｆ１０同系腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内注射する。接種の前に、マウスの体重を測定し、マウスを無作為に治療群に割り当てた。腫瘍の接種から３日後に、マウスに、編集マウスＰＭＥＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射する。Ｔ細胞の注射前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）一方はＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とし、もう一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。ＮＧＳを用いることによって、Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価する。体重を少なくとも週に２回モニタリングする。腫瘍の接種から１５日目（Ｔ細胞移入から１２日目）に、各マウスの肺を１０％パラホルムアルデヒドで灌流及び固定する。一晩固定後、肺をさらに保存するために７０％ＥｔＯＨに移す。肺においてがん細胞の黒色コロニーとして見ることができるＢ１６－Ｆ１０腫瘍量を目視で評価することによって、腫瘍有効性を評価する。これらのデータにより、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、コントロールまたは単一編集型のＴ細胞で治療する場合と比べて向上することが予測である。
Figure 2022519595000059
 （－）＝有効性は観察されず、（＋）＝大半のマウスにおいて、応答が中度、（＋＋）＝大半のマウスにおいて、応答が強度、（＋＋＋）＝処置したすべてのマウスにおいて、応答が最高強度（一部、完全奏効を含む）
実施例９：メラノーマの異種移植モデルにおけるＺｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
Ａ３７５異種移植腫瘍モデルを用いて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢のＮＳＧマウスに、５×１０６個のＡ３７５細胞（抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する）を皮下注射する。腫瘍の体積がおよそ４００ｍｍ３に達したら、マウスを８頭からなる群に無作為に分け、３０×１０６個の編集ＴＣＲ２細胞を尾静脈から静脈内注射する。Ｔ細胞の注射前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｓｏｃｓ１遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定する。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、％ＴＧＩは、上記のようにして算出する。これらのデータによって、ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍モデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型Ｔ細胞で処置すると、抗腫瘍有効性が、Ｚｃ３ｈ１２ａ単一編集型細胞またはＳｏｃｓ１単一編集型細胞のいずれかで処置した後に観察される抗腫瘍有効性よりも向上すると予測されることが示される。
実施例１０：Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球の有効性
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、リンパ球除去を行っていないマウスにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗腫瘍有効性を評価した。この実験では、ドナーコホートのＣＤ４５．１ Ｐｅｐ Ｂｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）及びレシピエントコホートのＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）という２つのマウスコホートを使用し、それぞれ、６～８週齢の雌のマウスから構成させた。
ＴＩＬを作製するために、ドナーであるＣＤ４５．１ Ｐｅｐ Ｂｏｙマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ 細胞を皮下注射する。腫瘍細胞の接種から１４日目に、腫瘍を摘出して、実施例１に記載されているように、第２のコホートのマウスに注入するための編集型ＣＤ４５．１腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製した。これらのＴＩＬ細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号２１１）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｓｏｃｓ１遺伝子（配列番号９）を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（４）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。ＮＧＳを用いることによって、Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子では８２％、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８４％であることが判明した。
レシピエントであるＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の体積がおよそ１００ｍｍ３に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集ＣＤ４５．１ＴＩＬを尾静脈から静脈内注射した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、下記の式に従って、％ＴＧＩを算出する。
％ＴＧＩ＝（Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ最終）－Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１７日目であり、初期は、編集ＴＩＬの移入日である。
図３のデータには、皮下Ｂ１６Ｏｖａマウスモデルにおいて、Ｚｃ３ｈ１２ａ／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＴＩＬを養子移入すると、コントロールのガイドとの比較において、Ｚｃ３ｈ１２ａ単一編集型ＴＩＬ（ＴＧＩ＝４７％）またはＳｏｃｓ１単一編集型ＴＩＬ（ＴＧＩ＝３２％）のいずれかで処置した場合と比べて、抗腫瘍応答が増強された（ＴＧＩ＝９７％）ことが示されている。
実施例１１：Ｂ１６－Ｏｖａマウス腫瘍モデルにおけるＰＤ１／Ｌａｇ３デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性
Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、ＰＤ－１／Ｌａｇ３デュアル編集型Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ４８５ｍｍ３に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子（配列番号２７０）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｌａｇ３遺伝子を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）一方はＰＤ１遺伝子を標的とし、もう一方はＬａｇ３遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。ＮＧＳを用いることによって、Ｐｄｃｄ１遺伝子及びＬａｇ３遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｐｄｃｄ１遺伝子では５８．８％、Ｌａｇ３遺伝子では８９．４％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式を用いて、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）を算出した。
％ＴＧＩ＝（ＰＤ１／Ｌａｇ３ ＴＶ最終）－ＰＤ１／Ｌａｇ３ ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１０日目であり、初期は、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である。
図４のデータには、ＰＤ１単一編集型Ｔ細胞の養子移入によって、ＴＧＩが７０％となり、Ｌａｇ３単一編集型Ｔ細胞の養子移入により、ＴＧＩが３６％となったことが示されている。驚くべきことに、ＰＤ１とＬａｇ３を組み合わせて編集したところ、腫瘍成長抑制率が上昇せず、ＴＧＩは３８％となった。
実施例１２：デュアル編集型のＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の有効性及び機能の検証
実験を行って、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及び／またはＳＯＣＳ１のうちの２つの編集が、ＣＡＲ Ｔ細胞及び人工ＴＣＲを発現するように操作した及びＴ細胞の抗腫瘍有効性に及ぼす作用を検証した。表２４に記載されている操作Ｔ細胞を、実施例１に記載されているようにして編集して、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及び／またはＳＯＣＳ１の発現を低下させた。続いて、示されている種類の細胞を用いて、皮下マウス異種移植モデルにおいて、これらの編集Ｔ細胞を評価した。
Figure 2022519595000060
簡潔に述べると、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＮＳＧマウスに、１×１０６個のＲａｊｉ細胞を皮下注射した。腫瘍の体積がおよそ２００ｍｍ３に達したら、マウスを８頭からなる群に無作為に分け、編集した操作ＣＡＲ Ｔ細胞であって、ＣＤ１９を標的とする操作ＣＡＲ Ｔ細胞３×１０６～１０×１０６個を尾静脈から静脈内注射した。その養子移入細胞は、注射の前に、コントロールのｇＲＮＡ、あるいはＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及び／またはＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群において平均及び平均の標準誤差として算出した。これらの実験の結果（表２５）によって、１０×１０６個のＰＴＰＮ２－／－及びＳＯＣＳ１－／－デュアル編集型の操作Ｔ細胞の抗腫瘍有効性が、試験終了時の腫瘍体積及び完全奏効（ＰＴＰＮ２－／－／ＳＯＣＳ１－／－ ＣＡＲ Ｔ細胞では、８頭中８頭であったのに対して、コントロールの編集ＣＡＲ Ｔ細胞では、８頭中１頭であった）によって測定した場合に、ガイドコントロールの場合と比べて向上したことが示された。
Figure 2022519595000061
 （－）＝有効性は観察されず、（＋）＝大半のマウスにおいて、応答が中度、（＋＋）＝大半のマウスにおいて、応答が強度、（＋＋＋）＝処置したすべてのマウスにおいて、応答が最高強度（一部、完全奏効を含む）
追加実験を行って、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及び／またはＳＯＣＳ１の編集が、操作Ｔ細胞によるサイトカインの産生に及ぼす作用を検証する。簡潔に述べると、上記の表２５に記載されている操作Ｔ細胞をヒトＴ細胞から作製し、ＲＮＰの形態でＣａｓ９と複合化したガイドＲＮＡを用いて、エレクトロポレーションによって、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及び／またはＳＯＣＳ１のうちの２つ以上を編集する。ＣＡＲ－Ｔを、表２２に示されている対応する細胞株とｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、１：０、０．３：１、１：１、３：１及び１０：１の比率で共培養する。２４時間後、操作Ｔ細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために上清を保存する。これらの実験の結果によって、コントロールの編集細胞と比べて、集積が増大し、デュアル編集ＣＡＲ Ｔ細胞からのサイトカインの産生のレベルが上昇することが示されることが予測される。
実施例１３：デュアル編集型免疫細胞の機能のインビトロ評価
ＳＯＣＳ１依存性、ＰＴＰＮ２依存性及びＺＣ３Ｈ１２Ａ依存性の薬理について評価するために、各標的の依存性の生物学的プロセスを定量するアッセイを開発する。これらのアッセイは、二重編集型のＴＩＬにおいて標的依存性の薬理を評価する目的で用いるようにも意図されている。これらのアッセイでは、ＴＩＬにおける、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｇＲＮＡの活性を評価する。例えば、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の両方が不活性化される細胞は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の両方の薬理を測定するアッセイにおいて、活性を調べなければならない。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に対する、ＰＴＰＮ２の負の役割に加えて、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２のいずれも、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の負の制御因子である。したがって、ＳＯＣＳ１依存性及びＰＴＰＮ２依存性の薬理は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の増大によって測定できる。
ＳＯＣＳ１は、部分的には、ＪＡＫ１（ＳＴＡＴ５のリン酸化及びサイトカインのシグナル伝達に関与するキナーゼ）を阻害することによって、Ｔ細胞におけるサイトカインのシグナル伝達を負に調節する。ＩＬ－２受容体複合体を通じたＩＬ－２シグナル伝達では、ＳＴＡＴ５は、ＪＡＫ１に依存した形でリン酸化される。したがって、ＩＬ－２で刺激された場合のｐＳＴＡＴ５レベル及び下流シグナル伝達経路の活性化は、ＴＩＬにおけるＳＯＣＳ１依存性の薬理を測定するアッセイとして機能し得る。実際、ＳＯＣＳ１を欠失させると、初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルは、ＩＬ－２シグナル伝達に応答して上昇する（図５）。
ＰＴＰＮ２も、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ３のようなＳＴＡＴタンパク質を直接脱リン酸化することによって、ＩＬ－２及びＩＦＮγを含むサイトカインのシグナル伝達の負の制御因子として作用する。したがって、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＡＴ３のレベル、ならびに下流シグナル達経路の活性化は、ＴＩＬにおけるＰＴＰＮ２依存性の薬理を測定するアッセイとして機能し得る。実際、Ｃａｓ９によってＰＴＰＮ２の遺伝子ノックダウンを行うと、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ１レベルは、ＩＦＮγによる刺激に応答して上昇する（図６）。ＰＴＰＮ２は、ＴＣＲシグナル伝達の負の制御因子でもある。ＬＣＫ及びＦＹＮのいずれも、そのＴＣＲの下流でポジティブシグナルを伝達するものであり、ＴＣＲの活性化後は、ＰＴＰＮ２ホスファターゼ活性の直接的な標的となる。したがって、ＰＴＰＮ２の遺伝的な不活性化が、近位のＴ細胞受容体のシグナル伝達に及ぼす影響は、ＴＣＲ刺激後のｐＬＣＫ及びｐＦＹＮを定量することによって評価し得る。
すなわち、デュアル編集型細胞におけるＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の薬理の直接的評価は、１）サイトカインによる刺激及びｐＳＴＡＴのアッセイ、ならびに２）ＴＣＲの活性化及び下流シグナル伝達のアッセイを用いて行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の遺伝的な不活性化が、細胞の機能に及ぼす影響を求めるには、Ｔ細胞の機能と相関する複数のパラメーターを評価してよい。これらのパラメーターとしては、サイトカイン（例えばＩＬ－６及びＩＬ－１２）の産生、ベースラインの細胞表面の表現型及び活性化細胞表面の表現型、Ｔ細胞の分化状態、ならびに腫瘍殺傷能力が挙げられる。
実施例１４：デュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球の作製
ＴＩＬの単離及び増殖を行うためのものとしてＦＤＡから認可された臨床試験で以前に用いられた確立済みのプロトコールに従って、デュアル編集型ＴＩＬを作製する。
腫瘍組織を取り出した後、腫瘍を断片化して２ｍｍ３の切片にし、機械的／酵素的にホモジナイズし、最長で６週間、または細胞数が１×１０８個以上になるまで、６，０００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２で培養する（これをＴＩＬ作製の急速増殖前フェーズ（ｐｒｅ－ＲＥＰ）とする）。ｐｒｅ－ＲＥＰの段階が完了したら、ＴＩＬに、ｃＧＭＰの条件下で、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、及び／またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションする。細胞には、ｐｒｅ－ＲＥＰプロセスの前またはその最中にエレクトロポレーションしてもよい。エレクトロポレーション後、１：１００の比率のＴＩＬ及び照射フィーダー細胞で、５０×１０６個の細胞を１ＬのＧ－Ｒｅｘ（商標）培養フラスコに、およそ２週間かけて移す。この作製部分は、急速増殖フェーズ（ＲＥＰ）とする。ＲＥＰフェーズの後、ＴＩＬを回収し、洗浄し、患者に即時注入するために溶液に懸濁させる。
上記と同様の方法を用いて、３つの独立したドナーにおいて、編集腫瘍浸潤リンパ球を最小限の研究規模で作製した。ＳＯＣＳ１単一編集型、ＰＴＰＮ２単一編集型、ＺＣ３Ｈ１２Ａ単一編集型、ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型及びＳＯＣＳ１／ＺＣ３Ｈ１２Ａデュアル編集型の細胞を作製した。簡潔に述べると、ＴＩＬをＩＬ－２でｐｒｅ－ＲＥＰ増殖後、ＴＩＬを取り出し、Ｍａｘｃｙｔｅエレクトロポレーション緩衝液（Ｍａｘｃｙｔｅ）に、３０Ｍ細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。エレクトロポーレーション緩衝液中の細胞２０μｌ当たり、５μｌのＲＮＰ溶液を加えた。５μｌの反応液あたり、ＲＮＰ溶液は、６１μＭのｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）０．８５μｌ、ＰＢＳ１．７５μｌ、及び１００μＭの全ｓｇＲＮＡ溶液２．４μｌで構成させた。ｓｇＲＮＡ溶液は、単一のｓｇＲＮＡ２．４μｌ、または２つの異なるｓｇＲＮＡをそれぞれ１．２μｌのいずれかで構成させた。用いたガイドにおいては、ＳＯＣＳ１はＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧ（配列番号２５）、ＰＴＰＮ２はＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧ（配列番号１９０）及びＺＣ３Ｈ１２ＡはＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧ（配列番号２１９）であった。
細胞／ＲＮＰ溶液をＭａｘｃｙｔｅの処理アセンブリー（カタログ番号ＯＣ－２５Ｘ３またはＯＣ－１００Ｘ２）に充填した後、Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴＸを用いて、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ＃９」というプログラムを使用してエレクトロポレーションした。細胞をその処理アセンブリーから回収し、２倍体積の完全ＲＥＰ培地（ＡＩＭＶ培地（Ｇｉｂｃｏ＃１２０５５）及びＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ＃１１８７５）の５０：５０ミックスに、５％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を添加したもの）に加えた。細胞を３７Ｃで２０分回復させた。
続いて、ＴＩＬを６ウェル（１ウェル当たり表面積１０ｃｍ２）または２４ウェル（１ウェル当たり表面積２ｃｍ２）のＧｒｅｘフラスコのいずれかに、ｃｍ２当たり５０，０００個のＴＩＬという密度で移すことによって、ＴＩＬをＲＥＰに播種した。加えて、フラスコには、１ｃｍ２当たり５Ｍという密度の照射ＰＢＭＣフィーダー細胞、６０００Ｕ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３を入れた。ＲＥＰを１４日間行い、その際には、細胞に、ＩＬ－２、ＩＬ－２を含む新鮮な培地を供給し、及び／または細胞を分割した。ＲＥＰの１４日目に、細胞を回収し、その切断部位のゲノムＤＮＡのアンプリコンシーケンシングによって、編集効率を求めた。編集効率は、表２６に示されているとおりであった（数字には、予測される野生型配列からの変異を示したＤＮＡリードの割合（％）が反映されている）。










Figure 2022519595000062
実施例１５：リンパ除去を行ったシステムにおけるデュアル編集型腫瘍浸潤リンパ球の有効性
実施例６及び１０とは対照的に、リンパ球除去を行ったＢ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型、Ｐｔｐｎ２／Ｚｃ３ｈ１２ａデュアル編集型またはＳｏｃｓ１／Ｚｃ３ｈ１２Ａデュアル編集型の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。この実験では、ドナーコホートのＣＤ４５．１ Ｐｅｐ Ｂｏｙマウス（Ｂ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）及びレシピエントコホートのＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）という２つのマウスコホートを使用し、それぞれ、６～８週齢の雌のマウスから構成させた。
ＴＩＬを作製するために、ドナーであるＣＤ４５．１ Ｐｅｐ Ｂｏｙマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ 細胞を皮下注射した。腫瘍細胞の接種から１４日目に、腫瘍を摘出して、上記の実施例１に記載されているように、第２のコホートのマウスに注入するための編集型ＣＤ４５．１腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を作製した。これらのＴＩＬ細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）Ｐｔｐｎ２、Ｓｏｃｓ１を標的とする単一のｇＲＮＡ、または（３）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とするか、もしくは一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。ＮＧＳを用いることによって、Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＰｔｐｎ２遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８５％、Ｐｔｐｎ２遺伝子では７１％であることが判明した。ＮＧＳを用いて、Ｓｏｃｓ１遺伝子及びＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子を標的とするデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を評価したところ、Ｓｏｃｓ１遺伝子では９４％、Ｚｃ３ｈ１２ａ遺伝子では９０％であることが判明した。追加実験で、Ｐｔｐｎ２遺伝子及びＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子のそれぞれを標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をエレクトロポレーションすることによって、ＴＩＬを編集できる。
レシピエントであるＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の体積がおよそ１００ｍｍ３に達したら、マウスを１０頭からなる群に無作為に分け、シクロホスファミド（２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、リンパ球除去を誘導した。翌日、マウスに編集ＣＤ４５．１ ＴＩＬを尾静脈から静脈内注射した。追加実験では、マウスに、組み換えヒトＩＬ－２（７２０，０００ＩＵ／Ｋｇ）を最長で４日間、１日に２回腹腔内注射できる。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出し、下記の式に従って、％ＴＧＩを１７日目に算出する。
％ＴＧＩ＝（デュアル型ＴＶ最終）－デュアル型ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、１７日目であり、初期は、編集ＴＩＬの移入日である。
これらのデータにより、リンパ除去を行ったシステムでは、デュアル編集型ＴＩＬで処置すると、単一編集型ＴＩＬで処置した後に観察される抗腫瘍有効性よりも、抗腫瘍有効性が向上することが示される。
Figure 2022519595000063
 （－）＝有効性は観察されず、（＋）＝大半のマウスにおいて、応答が中度、（＋＋）＝大半のマウスにおいて、応答が強度、（＋＋＋）＝処置したすべてのマウスにおいて、応答が最高強度（一部、完全奏効を含む）
実施例１６：ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ＴＩＬの機能の特徴付け
実施例１４に記載されているような方法を用いて、ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ＴＩＬ及びコントロールのＴＩＬ（Ｔ細胞では発現されないＯＲ１Ａ１座位を編集）を作製した。ＴＩＬが炎症性サイトカインを産生する能力を評価した。簡潔に述べると、５頭の特有のドナーから得た生存ＴＩＬ２００，０００個を９６ウェルプレートのウェルに播種した。そのウェル内の培地の体積は、２００μｌであり、その培地は、ＲＥＰ培地（ＡＩＭ Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）及びＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）の５０：５０ミックスに、５％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を添加したもの）１８０μｌ、ならびに抗ＣＤ３活性化四量体（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カスタム試薬）２０μｌで構成させた。そのＴＩＬを摂氏３７度で１８時間、５％ ＣＯ２の加湿チャンバーでインキュベートした。インキュベート後、培養上清を回収し、Ｖ－ｐｌｅｘというサイトカインプレート及びＱｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０という装置（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、その上清中のＩＦＮγ及びＴＮＦαのレベルを測定した。ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ＴＩＬでは、コントロールの編集型ＴＩＬと同程度のＩＦＮγ産生能力（図７Ａ）及びコントロールの編集型ＴＩＬを上回るＴＮＦα産生能力が示された（図７Ｂ）。
ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ＴＩＬが、刺激されると脱顆粒を起こす能力も評価した。Ｃｅｌｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１／５００希釈液を含む９６ウェルプレートにおいて、ゴルジプラグ（ＢＤ）及び蛍光抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ）の存在下で、５００，０００個のＴＩＬを４時間刺激した。その後、細胞をＴ細胞マーカーに対して染色し、Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ陽性率及び蛍光強度をフローサイトメトリーによって評価した。ＳＯＣＳ１／ＰＴＰＮ２デュアル編集型ＴＩＬでは、コントロールの編集ＴＩＬと比べて、脱顆粒が増大し（図７Ｃ）、ＣＤ１０７ａ強度が上昇した（図７Ｄ）。
実施例１７－マウス同系腫瘍モデルにおけるＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型トランスジェニックＴ細胞の有効性、作用機序及びリチャレンジ
ＯＴ１ Ｔ細胞及びＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞モデル：Ｂ１６Ｏｖａ皮下同系腫瘍モデルを用いて、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから得た６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部に、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ１００ｍｍ３に達したら、マウスを１群当たり１０～２０頭からなる５つの群に無作為に分け、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を尾静脈注射によって静脈内注射した。注射の前に、これらの細胞は、（１）非標的化型コントロールのｇＲＮＡ、（２）ＰＤ１遺伝子（配列番号２７０）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（３）Ｐｔｐｎ２遺伝子（配列番号２０２）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（４）Ｓｏｃｓ１遺伝子（配列番号９）を標的とする単一のｇＲＮＡ、（５）一方はＳｏｃｓ１遺伝子を標的とし、もう一方はＰｔｐｎ２遺伝子を標的とする２つのｇＲＮＡを含むｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。Ｐｔｐｎ２遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を次世代シーケンシングによって評価したところ、Ｐｔｐｎ２遺伝子では８０．３％、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８７．６％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ）は、下記の式に従って算出した。
％ＴＧＩ＝（Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ最終－Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１ ＴＶ初期）／（コントロールＴＶ最終－コントロールＴＶ初期）
式中、ＴＶは、平均腫瘍体積であり、最終は、７日目であり、初期は、編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の移入日である。
続いて、７６日目に、元の大型Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍が完全に拒絶されたマウスの左側腹部皮下に、０．５×１０６個のＢ１６－Ｏｖａ腫瘍細胞（ｎ＝６）または０．３×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（ｎ＝５）のいずれかで、リチャレンジを行った。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を上記のようにして算出した。リチャレンジの前後の様々な時点に、マウスに尾採血を行い、試料をフローサイトメトリーによって解析して、末梢血中のＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞及びその表現型を追跡した。
図８Ａのデータには、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入すると、１８頭のマウスのうち１７頭がＢ１６Ｏｖａ腫瘍に対して完全奏効を達成したことが示されている。図８Ｂには、Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍を以前に拒絶したすべてのマウスが、その後、ナイーブマウスと比べて、２回目に接種したＢ１６Ｏｖａを拒絶できたことが示されている。Ｂ１６Ｏｖａ腫瘍を以前に拒絶した５頭のマウスのうちの２頭は、ネオアンチゲンを発現しない元のＢ１６Ｆ１０を２回目として接種した腫瘍も完全に拒絶できた。図８Ｃには、リチャレンジから８日後に、末梢血において、ＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞が急激に増加したことが示されている。図８Ｄには、Ｂ１６Ｏｖａの２回目の接種から８日後に、これらの同じＯＴ１が、リチャレンジ前のセントラルメモリー表現型からエフェクター表現型に変化した特徴が示されている。この後、リチャレンジから８４日目に、セントラルメモリー表現型に戻った。
実施例１８．Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウス Ｔ細胞の効能の上昇
ＰＤ－１耐性を有する大型腫瘍Ｂ１６ＯｖａモデルにおけるＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的な効能を評価するために、４つの異なる用量を、コントロールである同様の編集型細胞と比較して試験した。これらの試験は、上記の実施例３に記載されているようにして開始し、初期の開始腫瘍体積は約３５５ｍｍ３であり、その時点に、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型またはコントロールの編集型のマウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞をマウス１頭当たり４．１×１０４個、４．１×１０５個、４．１×１０６個または４．１×１０７個の細胞という用量で、静脈内で養子移入した。Ｐｔｐｎ２遺伝子及びＳｏｃｓ１遺伝子を標的とするｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の編集効率を次世代シーケンシングによって評価したところ、Ｐｔｐｎ２遺伝子では６６．４％、Ｓｏｃｓ１遺伝子では８６．５％であることが判明した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に２回測定した。腫瘍体積を上記のようにして算出した。図１０に示されているように、コントロールの編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入したところ、マウス１頭当たり４．１×１０７個のＴ細胞という最高用量の場合のみに、腫瘍の成長が遅延され、完全奏効は観察されなかった。同様の数のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与したマウスでは、１０頭のうちの７頭で、腫瘍の完全退縮が観察された。加えて、低用量のＰｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合にも、有意な抗腫瘍活性が観察され、４．１×１０５個の群において、１０頭のマウスのうち１頭で腫瘍の完全奏効が見られた。勘案すると、これらのデータにより、Ｐｔｐｎ２／Ｓｏｃｓ１デュアル編集型マウスＴ細胞が、コントロール編集型マウスＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもおよそ１０～１００倍強力であったことが示されている。
参照による援用
本明細書に引用されている参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。しかしながら、本明細書に引用されているいずれの参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に言及する際も、それらが、世界のいずれの国においても、正当な先行技術を構成したり、または技術常識の一部を形成すると解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりするものでないとともに、そのように解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりすべきでもない。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質とをコードするベクターを１つ以上含み、その第１の標的遺伝子は、ＰＴＰＮ２であり、そのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、その第２の標的遺伝子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを１つ以上と、（ｉｉ）そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを１つ以上と、（ｉｉ）そのＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡと、（ｉｉ）ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、その遺伝子調節システムは、（ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡと、（ｉｉ）ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成するｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、がん細胞の殺傷が必要な対象のがん細胞の殺傷方法であって、その対象に、請求項１～５７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞または請求項７９～８３のいずれか１項に記載の組成物を治療有効量投与することを含み、その改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、そのがん細胞の殺傷性が増大し、治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数が、治療有効量を構成するのに必要な非改変免疫エフェクター細胞の数の少なくとも１０分の１または少なくとも１００分の１である方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数は、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも５×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも５×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも２×１０６個の細胞、少なくとも３×１０６個の細胞、少なくとも４×１０６個の細胞、少なくとも５×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも５×１０８個の細胞または少なくとも１×１０９個の細胞である。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
前記少なくとも２つの内在性遺伝子の前記発現及び／または前記機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
（項目２）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、項目１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５）
前記遺伝子調節システムがさらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、項目１～４のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６）
前記遺伝子調節システムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、項目１～５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７）
前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む、項目６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目８）
前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、項目６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目９）
前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、項目８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１０）
前記遺伝子調節システムが、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、項目６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１１）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１２）
前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、項目１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１３）
前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、項目１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１４）
前記Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している、項目１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１５）
前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、項目１４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１６）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１７）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１８）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目１９）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２０）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２１）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡを含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２２）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２３）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２４）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２５）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２６）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２７）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２８）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目２９）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３０）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号７～１５１からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡと、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡを含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３１）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３２）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３３）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号７～１５１からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡと、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡを含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３４）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３５）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３６）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡと、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡを含む、項目７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３７）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、項目９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３８）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、項目９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目３９）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、項目９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４０）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、項目９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４１）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、項目９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４２）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、項目９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４３）
前記遺伝子調節システムが、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている、項目１～４２のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４４）
前記遺伝子調節システムが、前記システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている、項目４３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４５）
ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、前記少なくとも２つの内在性遺伝子の前記発現及び／または前記機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
（項目４６）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、項目４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４７）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４８）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目４９）
ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子に不活性化変異を含む、改変免疫エフェクター細胞。
（項目５０）
前記免疫エフェクター細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＡＲ－Ｔ細胞である、項目４９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５１）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、項目４９または項目５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５２）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目４９または項目５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５３）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目４９または項目５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５４）
前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、項目４９～５３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５５）
前記欠失が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、項目５４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５６）
前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、項目５４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５７）
前記不活性化変異によって、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下する、項目４９～５６のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５８）
さらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下される、項目４５～５７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目５９）
ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む改変免疫エフェクター細胞。
（項目６０）
前記免疫エフェクター細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＡＲ－Ｔ細胞である、項目５９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６１）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、項目５９または項目６０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６２）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目５９または項目６０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６３）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目５９または項目６０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６４）
前記少なくとも２つの核酸阻害剤が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる、項目５９～６３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６５）
前記２つ以上の内在性標的遺伝子の前記発現を、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下させる、項目５８または項目６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６６）
前記２つ以上の内在性標的遺伝子の機能を、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下させる、項目６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６７）
前記不活性化変異または前記核酸阻害剤が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の前記発現を実質的に阻害する、項目６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６８）
前記不活性化変異または前記核酸阻害剤が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の機能を実質的に阻害する、項目６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目６９）
前記不活性化変異または前記核酸阻害剤が、前記改変免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能を増強する、項目５０～６８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７０）
前記１つ以上のエフェクター機能を、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて増強する、項目６９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７１）
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、項目１～７０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７２）
免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む、項目１～７１のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７３）
免疫活性化分子が、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている、項目１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７４）
前記エフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている、項目１～７３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７５）
前記細胞の表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む、項目１～７４のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７６）
前記操作免疫受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目７５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７７）
前記操作免疫受容体が、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、項目７６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７８）
前記操作免疫受容体が、標的細胞の表面に発現した抗原に特異的に結合でき、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、項目７５～７７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
（項目７９）
項目１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞を含む組成物。
（項目８０）
少なくとも１×１０ ４ 個、１×１０ ５ 個、１×１０ ６ 個、１×１０ ７ 個、１×１０ ８ 個、１×１０ ９ 個、１×１０ １０ 個、１×１０ １１ 個またはこれを上回る数の改変免疫エフェクター細胞を含む、項目７９に記載の組成物。
（項目８１）
薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、項目７９または８０に記載の組成物。
（項目８２）
自己免疫エフェクター細胞を含む、項目７９～８１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８３）
同種異系免疫エフェクター細胞を含む、項目７９～８１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８４）
ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した、細胞内の少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質、または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記遺伝子調節システム。
（項目８５）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、項目８４に記載の遺伝子調節システム。
（項目８６）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目８４に記載の遺伝子調節システム。
（項目８７）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目８４に記載の遺伝子調節システム。
（項目８８）
少なくとも２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、項目８４～８７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目８９）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、項目８８に記載の遺伝子調節システム。
（項目９０）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目８９に記載の遺伝子調節システム。
（項目９１）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目８９に記載の遺伝子調節システム。
（項目９２）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目８９に記載の遺伝子調節システム。
（項目９３）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目８９に記載の遺伝子調節システム。
（項目９４）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、項目８９に記載の遺伝子調節システム。
（項目９５）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目９４に記載の遺伝子調節システム。
（項目９６）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目９４に記載の遺伝子調節システム。
（項目９７）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目９４に記載の遺伝子調節システム。
（項目９８）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目９４に記載の遺伝子調節システム。
（項目９９）
前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、前記ＰＴＮＰ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、項目８８に記載の遺伝子調節システム。
（項目１００）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目９９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０１）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目９９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０２）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目９９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０３）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目９９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０４）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０５）
前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含むとともに、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、項目８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０６）
前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含むとともに、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、項目８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０７）
前記Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している、項目８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０８）
前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、項目１０７に記載の遺伝子調節システム。
（項目１０９）
前記システムが、少なくとも２つの核酸分子を含み、前記少なくとも２つの核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている、項目８４～８７に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１０）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及び前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む、項目１０９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１１）
前記ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１０に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１２）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１０に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１３）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１０に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１４）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む、項目１０９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１５）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１４に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１６）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、約１９～３０個のヌクレオチドを含み、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する、項目１１４に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１７）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１４に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１８）
前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む、項目１０９に記載の遺伝子調節システム。
（項目１１９）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１８に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２０）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１８に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２１）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、項目１１８に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２２）
前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、項目８４～８７に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２３）
前記システムが、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている、項目１２２に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２４）
前記遺伝子調節システムが、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上のベクターを含み、
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、
項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２５）
前記遺伝子調節システムが、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上のベクターを含み、
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、
項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２６）
前記遺伝子調節システムが、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上のベクターを含み、
前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、
項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２７）
前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が、１つのベクターによってコードされる、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２８）
前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第１のベクターによってコードされ、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が、第２のベクターによってコードされる、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１２９）
前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第１のベクターによってコードされ、前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第２のベクターによってコードされ、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が、第３のベクターによってコードされる、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３０）
（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡをコードする１つ以上のベクターと、
（ｉｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と、
を含む、項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３１）
（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡをコードする１つ以上のベクターと、
（ｉｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と、
を含む、項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３２）
（ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡをコードする１つ以上のベクターと、
（ｉｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と、
を含む、項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３３）
前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、１つのベクターによってコードされる、項目１３０～１３２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３４）
前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第１のベクターによってコードされ、前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第２のベクターによってコードされる、項目１３０～１３２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３５）
（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
（ｉｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
を含む、項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３６）
（ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
（ｉｉ）ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
含む、項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３７）
（ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
（ｉｉ）ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
を含む、項目８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
（項目１３８）
項目８４～１３７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを含むキット。
（項目１３９）
複数のｇＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記複数のｇＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記組成物。
（項目１４０）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、項目１３９に記載の組成物。
（項目１４１）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１４０に記載の組成物。
（項目１４２）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１４０に記載の組成物。
（項目１４３）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１４０に記載の組成物。
（項目１４４）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１４０に記載の組成物。
（項目１４５）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１３９に記載の組成物。
（項目１４６）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目１４５に記載の組成物。
（項目１４７）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１４５に記載の組成物。
（項目１４８）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１４５に記載の組成物。
（項目１４９）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１４５に記載の組成物。
（項目１５０）
前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１３９に記載の組成物。
（項目１５１）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目１５０に記載の組成物。
（項目１５２）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１５０に記載の組成物。
（項目１５３）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１５０に記載の組成物。
（項目１５４）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１５０に記載の組成物。
（項目１５５）
前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、項目１３９～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５６）
前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ分子である、項目１３９～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５７）
ｇＲＮＡターゲティングドメインが、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である、項目１３９～１５６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５８）
前記ｇＲＮＡが、５’末端もしくは前記５’末端近傍（例えば、前記５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変、及び／または３’末端もしくは前記３’末端近傍（例えば、前記３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変を含む、項目１３９～１５７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１５９）
前記改変ｇＲＮＡを免疫エフェクター細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する耐性が向上する、項目１５８に記載の組成物。
（項目１６０）
前記改変ｇＲＮＡを免疫エフェクター細胞に導入すると、自然免疫応答が誘導されないか、または前記改変ｇＲＮＡを免疫エフェクター細胞に導入すると、非改変ｇＲＮＡの場合と比べて、自然免疫応答の軽減が誘導される、項目１５８または１５９に記載の組成物。
（項目１６１）
複数のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記複数のｇＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記ポリヌクレオチド分子。
（項目１６２）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、項目１６１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６３）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１６２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６４）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１６２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６５）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１６２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６６）
前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、項目１６２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６７）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１６１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６８）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目１６７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６９）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１６７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７０）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１６７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７１）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１６７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７２）
前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１６１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７３）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、項目１７２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７４）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１７２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７５）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１７２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７６）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、項目１７２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７７）
複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記ポリヌクレオチド分子。
（項目１７８）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、項目１７７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７９）
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目１７８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８０）
前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、項目１７８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８１）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１７７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８２）
前記ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８３）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８４）
前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１７７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８５）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１８４に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８６）
前記ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、項目１８４に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８７）
第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記ポリヌクレオチド分子。
（項目１８８）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、項目１８７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８９）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、項目１８８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９０）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、項目１８８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９１）
前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１８７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９２）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、項目１９１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９３）
前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、項目１９１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９４）
前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、項目１８７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９５）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、項目１９４に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９６）
前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、項目１９４に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９７）
項目１６１～１９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
（項目１９８）
項目１６１～１９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または項目１７６に記載の組成物を含むキット。
（項目１９９）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること
を含む前記方法。
（項目２００）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、
遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、ならびに
前記免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすること、
を含む前記方法。
（項目２０１）
前記遺伝子調節システムが、項目８４～１３７から選択した遺伝子調節システムである、項目１９９または２００に記載の方法。
（項目２０２）
ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、項目１９９～２０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０３）
前記遺伝子調節システム及び／または前記操作免疫受容体をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する、項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
前記遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として、前記システムを導入する、項目１９９～２０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０５）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、ならびに
遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、
を含む前記方法。
（項目２０６）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
免疫エフェクター細胞集団を得ること、
前記免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、
遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、ならびに
前記免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすること、
を含む前記方法。
（項目２０７）
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２０５または２０６に記載の方法。
（項目２０８）
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンドの増殖の後、かつ前記第２ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２０５または２０６に記載の方法。
（項目２０９）
前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、項目２０５または２０６に記載の方法。
（項目２１０）
前記遺伝子調節システムが、項目８４～１３７から選択した遺伝子調節システムである、項目２０４～２０９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１１）
治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、項目１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または項目７９～８３のいずれか１項に記載の組成物を有効量、前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目２１２）
前記疾患または障害が、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である、項目２１１に記載の方法。
（項目２１３）
前記疾患または障害が、がんまたはウイルス感染症である、項目２１１に記載の方法。
（項目２１４）
前記がんが、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される、項目２１３に記載の方法。
（項目２１５）
前記固形腫瘍が、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、または肺腫瘍もしくは肺転移である、項目２１４に記載の方法。
（項目２１６）
前記がんが、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである、項目２１３～２１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１７）
前記対象が以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある、項目２１１～２１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１８）
前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して自家である、項目２１１～２１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１９）
前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して同種異系である、項目２１１～２１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２０）
ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、前記タンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片を前記対象に投与することをさらに含む、項目２１１～２１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２１）
前記対象が、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがない、項目２１１～２２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２２）
前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与とともに、高用量ＩＬ－２治療を行わない、項目２１１～２２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２３）
前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与とともに、いずれのＩＬ－２治療も行わない、項目２２１～２２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２４）
前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがないとともに、前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物とともに、高用量ＩＬ－２治療を行わない、項目２２１または２２２に記載の方法。
（項目２２５）
がん細胞の殺傷方法であって、
項目１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または項目７９～８３のいずれか１項に記載の組成物に、前記がん細胞を暴露することを含み、
前記改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、前記がん細胞の殺傷性が増大する、前記方法。
（項目２２６）
前記暴露が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの暴露である、項目２２５に記載の方法。
（項目２２７）
免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、前記方法が、遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、前記方法。
（項目２２８）
免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、前記方法が、
遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、ならびに
前記免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすること、
を含み、
前記改変免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変していない前記免疫エフェクター細胞と比べて増強される、前記方法。
（項目２２９）
前記１つ以上のエフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される、項目２２７または２２８に記載の方法。
（項目２３０）
前記遺伝子調節システムが、項目８５～１３７から選択した遺伝子調節システムである、項目２２７～２２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３１）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞における少なくとも２つの内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される前記導入することを含む、前記方法。
（項目２３２）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
免疫エフェクター細胞集団を増殖させること、ならびに
前記免疫エフェクター細胞集団における少なくとも２つの内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される前記導入すること、
を含む、前記方法。
（項目２３３）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞における少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されることを含む前記導入する、前記方法。
（項目２３４）
改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
免疫エフェクター細胞集団を増殖させること、ならびに
前記免疫エフェクター細胞集団における少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される前記導入すること、
を含む、前記方法。
（項目２３５）
前記免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンド及び／または第２ラウンドの増殖で増殖させる、項目２３１または２３４に記載の方法。
（項目２３６）
ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、項目２３１～２３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３７）
項目８５～１３７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムによって、不活性化変異を導入する、項目２３１または項目２３２に記載の方法。
（項目２３８）
前記少なくとも２つの核酸阻害剤が、項目８５～１３７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムに含まれる、項目２３３または項目２３４に記載の方法。
（項目２３９）
がん細胞の殺傷が必要な対象のがん細胞の殺傷方法であって、前記方法が、項目１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または項目７９～８３のいずれか１項に記載の組成物を治療有効量、前記対象に投与することを含み、前記改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、前記がん細胞の殺傷性が増大し、治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数が、治療有効量を構成するのに必要な非改変免疫エフェクター細胞の数の少なくとも１０分の１である、前記方法。
（項目２４０）
前記治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数が、少なくとも１×１０ ３ 個、５×１０ ３ 個、１×１０ ４ 個、５×１０ ４ 個、１×１０ ５ 個、５×１０ ５ 個、１×１０ ６ 個、２×１０ ６ 個、３×１０ ６ 個、４×１０ ６ 個、５×１０ ６ 個、１×１０ ７ 個、５×１０ ７ 個、１×１０ ８ 個、５×１０ ８ 個、１×１０ ９ 個の細胞である、項目２３９に記載の方法。
いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０８～２３０のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～８１２のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～８１２のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～５７５のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３７６～５７５のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。そのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表１６及び表１７に示されている。
Figure 2022519595000088
Figure 2022519595000089
Figure 2022519595000090
Figure 2022519595000091
Figure 2022519595000092
Figure 2022519595000093
Figure 2022519595000094
Figure 2022519595000095
Figure 2022519595000096
Figure 2022519595000097
Figure 2022519595000098
Figure 2022519595000099
Figure 2022519595000100

Claims (240)

  1. ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
    前記少なくとも２つの内在性遺伝子の前記発現及び／または前記機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
  2. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、請求項１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  3. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  4. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  5. 前記遺伝子調節システムがさらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる、請求項１～４のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  6. 前記遺伝子調節システムが、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  7. 前記遺伝子調節システムが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択した核酸分子を含む、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  8. 前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  9. 前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、請求項８に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  10. 前記遺伝子調節システムが、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである、請求項６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  11. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  12. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含み、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、請求項１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  13. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含み、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、請求項１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  14. 前記Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している、請求項１０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  15. 前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項１４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  16. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  17. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  18. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  19. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  20. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  21. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡを含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  22. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  23. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  24. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  25. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標のうちのいずれか１つによって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  26. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  27. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  28. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  29. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  30. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号７～１５１からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡと、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡを含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  31. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  32. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  33. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号７～１５１からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡと、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡを含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  34. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  35. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  36. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡと、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５からなる群から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む前記ｓｉＲＮＡまたは前記ｓｈＲＮＡを含む、請求項７に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  37. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  38. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  39. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  40. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  41. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される標的ＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  42. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記遺伝子調節システムが、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合する前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  43. 前記遺伝子調節システムが、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている、請求項１～４２のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  44. 前記遺伝子調節システムが、前記システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入されている、請求項４３に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  45. ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択した少なくとも２つの内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、前記少なくとも２つの内在性遺伝子の前記発現及び／または前記機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
  46. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、請求項４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  47. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  48. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項４５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  49. ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性遺伝子に不活性化変異を含む、改変免疫エフェクター細胞。
  50. 前記免疫エフェクター細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項４９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  51. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、請求項４９または請求項５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  52. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項４９または請求項５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  53. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項４９または請求項５０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  54. 前記不活性化変異が、前記２つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、請求項４９～５３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  55. 前記欠失が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、請求項５４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  56. 前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、請求項５４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  57. 前記不活性化変異によって、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下する、請求項４９～５６のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  58. さらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能が低下される、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  59. ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む改変免疫エフェクター細胞。
  60. 前記免疫エフェクター細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項５９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  61. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、請求項５９または請求項６０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  62. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項５９または請求項６０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  63. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項５９または請求項６０に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  64. 前記少なくとも２つの核酸阻害剤が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる、請求項５９～６３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  65. 前記２つ以上の内在性標的遺伝子の前記発現を、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下させる、請求項５８または請求項６４に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  66. 前記２つ以上の内在性標的遺伝子の機能を、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下させる、請求項６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  67. 前記不活性化変異または前記核酸阻害剤が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の前記発現を実質的に阻害する、請求項６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  68. 前記不活性化変異または前記核酸阻害剤が、前記２つ以上の内在性標的遺伝子の機能を実質的に阻害する、請求項６５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  69. 前記不活性化変異または前記核酸阻害剤が、前記改変免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能を増強する、請求項５０～６８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  70. 前記１つ以上のエフェクター機能を、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて増強する、請求項６９に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  71. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１～７０のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  72. 免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  73. 免疫活性化分子が、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている、請求項１に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  74. 前記エフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択されている、請求項１～７３のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  75. 前記細胞の表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  76. 前記操作免疫受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項７５に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  77. 前記操作免疫受容体が、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項７６に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  78. 前記操作免疫受容体が、標的細胞の表面に発現した抗原に特異的に結合でき、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項７５～７７のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
  79. 請求項１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞を含む組成物。
  80. 少なくとも１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個またはこれを上回る数の改変免疫エフェクター細胞を含む、請求項７９に記載の組成物。
  81. 薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、請求項７９または８０に記載の組成物。
  82. 自己免疫エフェクター細胞を含む、請求項７９～８１のいずれか１項に記載の組成物。
  83. 同種異系免疫エフェクター細胞を含む、請求項７９～８１のいずれか１項に記載の組成物。
  84. ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した、細胞内の少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、（ｉ）核酸分子、（ｉｉ）酵素タンパク質、または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記遺伝子調節システム。
  85. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２である、請求項８４に記載の遺伝子調節システム。
  86. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項８４に記載の遺伝子調節システム。
  87. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項８４に記載の遺伝子調節システム。
  88. 少なくとも２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸分子及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項８４～８７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  89. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項８８に記載の遺伝子調節システム。
  90. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項８９に記載の遺伝子調節システム。
  91. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項８９に記載の遺伝子調節システム。
  92. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項８９に記載の遺伝子調節システム。
  93. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項８９に記載の遺伝子調節システム。
  94. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項８９に記載の遺伝子調節システム。
  95. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項９４に記載の遺伝子調節システム。
  96. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項９４に記載の遺伝子調節システム。
  97. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項９４に記載の遺伝子調節システム。
  98. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項９４に記載の遺伝子調節システム。
  99. 前記少なくとも２つの内在性遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、前記ＰＴＮＰ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項８８に記載の遺伝子調節システム。
  100. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項９９に記載の遺伝子調節システム。
  101. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項９９に記載の遺伝子調節システム。
  102. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項９９に記載の遺伝子調節システム。
  103. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項９９に記載の遺伝子調節システム。
  104. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  105. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを２つ含むとともに、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができる野生型Ｃａｓタンパク質である、請求項８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  106. 前記Ｃａｓタンパク質が、酵素活性ドメインを１つ含むとともに、一本鎖ＤＮＡ切断を誘導することができるＣａｓニッカーゼ変異体である、請求項８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  107. 前記Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）であり、前記１つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節できる異種タンパク質と結合している、請求項８８～１０３のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  108. 前記異種タンパク質が、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン及びｍＳｉｎ３ ４連結ドメイン（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択されている、請求項１０７に記載の遺伝子調節システム。
  109. 前記システムが、少なくとも２つの核酸分子を含み、前記少なくとも２つの核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲまたはアンチセンスＲＮＡから選択されている、請求項８４～８７に記載の遺伝子調節システム。
  110. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２であり、前記システムが、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及び前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項１０９に記載の遺伝子調節システム。
  111. 前記ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１０に記載の遺伝子調節システム。
  112. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１０に記載の遺伝子調節システム。
  113. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１０に記載の遺伝子調節システム。
  114. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項１０９に記載の遺伝子調節システム。
  115. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１４に記載の遺伝子調節システム。
  116. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、約１９～３０個のヌクレオチドを含み、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する、請求項１１４に記載の遺伝子調節システム。
  117. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１４に記載の遺伝子調節システム。
  118. 前記少なくとも２つの標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記システムが、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのガイドｓｉＲＮＡ分子またはガイドｓｈＲＮＡ分子、及びＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項１０９に記載の遺伝子調節システム。
  119. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的である約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１８に記載の遺伝子調節システム。
  120. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１８に記載の遺伝子調節システム。
  121. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合する約１９～３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１８に記載の遺伝子調節システム。
  122. 前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの１つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項８４～８７に記載の遺伝子調節システム。
  123. 前記システムが、ＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択されている、請求項１２２に記載の遺伝子調節システム。
  124. 前記遺伝子調節システムが、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上のベクターを含み、
    前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
    前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、
    請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  125. 前記遺伝子調節システムが、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上のベクターを含み、
    前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
    前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、
    請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  126. 前記遺伝子調節システムが、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、及びＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする１つ以上のベクターを含み、
    前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡが、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
    前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａであり、前記ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、
    請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  127. 前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が、１つのベクターによってコードされる、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  128. 前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第１のベクターによってコードされ、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が、第２のベクターによってコードされる、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  129. 前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第１のベクターによってコードされ、前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第２のベクターによってコードされ、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質が、第３のベクターによってコードされる、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  130. （ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡをコードする１つ以上のベクターと、
    （ｉｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と、
    を含む、請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  131. （ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡをコードする１つ以上のベクターと、
    （ｉｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と、
    を含む、請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  132. （ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡと、ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡをコードする１つ以上のベクターと、
    （ｉｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と、
    を含む、請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  133. 前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、１つのベクターによってコードされる、請求項１３０～１３２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  134. 前記第１の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第１のベクターによってコードされ、前記第２の標的遺伝子を標的とする前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、第２のベクターによってコードされる、請求項１３０～１３２のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  135. （ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
    （ｉｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
    を含む、請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  136. （ｉ）ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
    （ｉｉ）ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
    含む、請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  137. （ｉ）ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第１のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
    （ｉｉ）ＺＣ２Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡであって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼタンパク質と複合化して、第２のＲＮＰ複合体を形成する前記ｇＲＮＡと、
    を含む、請求項８４～１０８のいずれか１項に記載の遺伝子調節システム。
  138. 請求項８４～１３７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムを含むキット。
  139. 複数のｇＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記複数のｇＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記組成物。
  140. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、請求項１３９に記載の組成物。
  141. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１４０に記載の組成物。
  142. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１４０に記載の組成物。
  143. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１４０に記載の組成物。
  144. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１４０に記載の組成物。
  145. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１３９に記載の組成物。
  146. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項１４５に記載の組成物。
  147. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１４５に記載の組成物。
  148. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１４５に記載の組成物。
  149. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１４５に記載の組成物。
  150. 前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１３９に記載の組成物。
  151. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５０に記載の組成物。
  152. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５０に記載の組成物。
  153. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５０に記載の組成物。
  154. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１５０に記載の組成物。
  155. 前記ｇＲＮＡが、モジュラーｇＲＮＡ分子である、請求項１３９～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
  156. 前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ分子である、請求項１３９～１５４のいずれか１項に記載の組成物。
  157. ｇＲＮＡターゲティングドメインが、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である、請求項１３９～１５６のいずれか１項に記載の組成物。
  158. 前記ｇＲＮＡが、５’末端もしくは前記５’末端近傍（例えば、前記５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変、及び／または３’末端もしくは前記３’末端近傍（例えば、前記３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドもしくは１～２ヌクレオチド以内）の改変を含む、請求項１３９～１５７のいずれか１項に記載の組成物。
  159. 前記改変ｇＲＮＡを免疫エフェクター細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する耐性が向上する、請求項１５８に記載の組成物。
  160. 前記改変ｇＲＮＡを免疫エフェクター細胞に導入すると、自然免疫応答が誘導されないか、または前記改変ｇＲＮＡを免疫エフェクター細胞に導入すると、非改変ｇＲＮＡの場合と比べて、自然免疫応答の軽減が誘導される、請求項１５８または１５９に記載の組成物。
  161. 複数のｇＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記複数のｇＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記ポリヌクレオチド分子。
  162. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、請求項１６１に記載のポリヌクレオチド。
  163. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１６２に記載のポリヌクレオチド。
  164. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１６２に記載のポリヌクレオチド。
  165. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１６２に記載のポリヌクレオチド。
  166. 前記複数のｇＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む前記ｇＲＮＡ分子を含む、請求項１６２に記載のポリヌクレオチド。
  167. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１６１に記載のポリヌクレオチド。
  168. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
  169. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
  170. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
  171. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
  172. 前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１６１に記載のポリヌクレオチド。
  173. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７２に記載のポリヌクレオチド。
  174. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７２に記載のポリヌクレオチド。
  175. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した標的ＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７２に記載のポリヌクレオチド。
  176. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項１７２に記載のポリヌクレオチド。
  177. 複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記ポリヌクレオチド分子。
  178. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、請求項１７７に記載のポリヌクレオチド。
  179. 前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項１７８に記載のポリヌクレオチド。
  180. 前記複数のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ｓｈＲＮＡ分子を含む、請求項１７８に記載のポリヌクレオチド。
  181. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１７７に記載のポリヌクレオチド。
  182. 前記ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
  183. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
  184. 前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１７７に記載のポリヌクレオチド。
  185. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１８４に記載のポリヌクレオチド。
  186. 前記ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子が、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項１８４に記載のポリヌクレオチド。
  187. 第１の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質と、第２の標的遺伝子を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子であって、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されている、前記ポリヌクレオチド分子。
  188. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２である、請求項１８７に記載のポリヌクレオチド。
  189. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、請求項１８８に記載のポリヌクレオチド。
  190. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、請求項１８８に記載のポリヌクレオチド。
  191. 前記第１の標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１８７に記載のポリヌクレオチド。
  192. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表３及び表４に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、請求項１９１に記載のポリヌクレオチド。
  193. 前記ＳＯＣＳ１を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号７～１５１から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、請求項１９１に記載のポリヌクレオチド。
  194. 前記第１の標的遺伝子が、ＰＴＰＮ２であり、前記第２の標的遺伝子が、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項１８７に記載のポリヌクレオチド。
  195. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表５及び表６に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、表７及び表８に示されている一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、請求項１９４に記載のポリヌクレオチド。
  196. 前記ＰＴＰＮ２を標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号１８５～２０７、配列番号２７２～３７５または配列番号２７２～３０８から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質と、前記ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする少なくとも１つのＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーまたはメガヌクレアーゼタンパク質であって、配列番号２０８～２３０、配列番号３７６～８１２または配列番号３７６～５７５から選択したＤＮＡ配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む前記ＴＡＬＥＮ、前記ジンクフィンガーまたは前記メガヌクレアーゼタンパク質をコードする、請求項１９４に記載のポリヌクレオチド。
  197. 請求項１６１～１９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
  198. 請求項１６１～１９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１７６に記載の組成物を含むキット。
  199. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
    遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること
    を含む前記方法。
  200. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
    免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、
    遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、ならびに
    前記免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすること、
    を含む前記方法。
  201. 前記遺伝子調節システムが、請求項８４～１３７から選択した遺伝子調節システムである、請求項１９９または２００に記載の方法。
  202. ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項１９９～２０１のいずれか１項に記載の方法。
  203. 前記遺伝子調節システム及び／または前記操作免疫受容体をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する、請求項２０２に記載の方法。
  204. 前記遺伝子調節システムの、１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として、前記システムを導入する、請求項１９９～２０３のいずれか１項に記載の方法。
  205. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
    免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、ならびに
    遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、
    を含む前記方法。
  206. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
    免疫エフェクター細胞集団を得ること、
    前記免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンドの増殖及び第２ラウンドの増殖で増殖させること、
    遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、ならびに
    前記免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすること、
    を含む前記方法。
  207. 前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２０５または２０６に記載の方法。
  208. 前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンドの増殖の後、かつ前記第２ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２０５または２０６に記載の方法。
  209. 前記遺伝子調節システムを、前記第１ラウンド及び前記第２ラウンドの増殖の後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項２０５または２０６に記載の方法。
  210. 前記遺伝子調節システムが、請求項８４～１３７から選択した遺伝子調節システムである、請求項２０４～２０９のいずれか１項に記載の方法。
  211. 治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、請求項１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項７９～８３のいずれか１項に記載の組成物を有効量、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  212. 前記疾患または障害が、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である、請求項２１１に記載の方法。
  213. 前記疾患または障害が、がんまたはウイルス感染症である、請求項２１１に記載の方法。
  214. 前記がんが、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される、請求項２１３に記載の方法。
  215. 前記固形腫瘍が、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、または肺腫瘍もしくは肺転移である、請求項２１４に記載の方法。
  216. 前記がんが、ＰＤ１耐性またはＰＤ１非感受性のがんである、請求項２１３～２１５のいずれか１項に記載の方法。
  217. 前記対象が以前に、ＰＤ１阻害剤またはＰＤＬ１阻害剤による治療を受けたことがある、請求項２１１～２１６のいずれか１項に記載の方法。
  218. 前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して自家である、請求項２１１～２１７のいずれか１項に記載の方法。
  219. 前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して同種異系である、請求項２１１～２１７のいずれか１項に記載の方法。
  220. ＮＲＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４またはＰＤＣＤ１によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、前記タンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２１１～２１９のいずれか１項に記載の方法。
  221. 前記対象が、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがない、請求項２１１～２２０のいずれか１項に記載の方法。
  222. 前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与とともに、高用量ＩＬ－２治療を行わない、請求項２１１～２２０のいずれか１項に記載の方法。
  223. 前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与とともに、いずれのＩＬ－２治療も行わない、請求項２２１～２２２のいずれか１項に記載の方法。
  224. 前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物の投与前に、リンパ球除去を行ったことがないとともに、前記対象に、前記改変免疫エフェクター細胞またはその組成物とともに、高用量ＩＬ－２治療を行わない、請求項２２１または２２２に記載の方法。
  225. がん細胞の殺傷方法であって、
    請求項１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項７９～８３のいずれか１項に記載の組成物に、前記がん細胞を暴露することを含み、
    前記改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、前記がん細胞の殺傷性が増大する、前記方法。
  226. 前記暴露が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの暴露である、請求項２２５に記載の方法。
  227. 免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、前記方法が、遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる、前記方法。
  228. 免疫エフェクター細胞の、１つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、前記方法が、
    遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することであって、前記遺伝子調節システムが、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択した少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる前記導入すること、ならびに
    前記免疫エフェクター細胞を培養して、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能が低下するようにすること、
    を含み、
    前記改変免疫エフェクター細胞において、１つ以上のエフェクター機能が、改変していない前記免疫エフェクター細胞と比べて増強される、前記方法。
  229. 前記１つ以上のエフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び／または疲弊耐性から選択される、請求項２２７または２２８に記載の方法。
  230. 前記遺伝子調節システムが、請求項８５～１３７から選択した遺伝子調節システムである、請求項２２７～２２８のいずれか１項に記載の方法。
  231. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞における少なくとも２つの内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される前記導入することを含む、前記方法。
  232. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
    免疫エフェクター細胞集団を増殖させること、ならびに
    前記免疫エフェクター細胞集団における少なくとも２つの内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される前記導入すること、
    を含む、前記方法。
  233. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、免疫エフェクター細胞における少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択されることを含む前記導入する、前記方法。
  234. 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
    免疫エフェクター細胞集団を増殖させること、ならびに
    前記免疫エフェクター細胞集団における少なくとも２つの内在性標的遺伝子の核酸阻害剤を少なくとも２つコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することであって、前記少なくとも２つの内在性標的遺伝子が、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される前記導入すること、
    を含む、前記方法。
  235. 前記免疫エフェクター細胞集団を第１ラウンド及び／または第２ラウンドの増殖で増殖させる、請求項２３１または２３４に記載の方法。
  236. ＣＡＲ及びＴＣＲから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項２３１～２３５のいずれか１項に記載の方法。
  237. 請求項８５～１３７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムによって、不活性化変異を導入する、請求項２３１または請求項２３２に記載の方法。
  238. 前記少なくとも２つの核酸阻害剤が、請求項８５～１３７のいずれか１項に記載の遺伝子調節システムに含まれる、請求項２３３または請求項２３４に記載の方法。
  239. がん細胞の殺傷が必要な対象のがん細胞の殺傷方法であって、前記方法が、請求項１～７８のいずれか１項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項７９～８３のいずれか１項に記載の組成物を治療有効量、前記対象に投与することを含み、前記改変免疫エフェクター細胞に暴露すると、改変していない免疫エフェクター細胞に暴露する場合と比べて、前記がん細胞の殺傷性が増大し、治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数が、治療有効量を構成するのに必要な非改変免疫エフェクター細胞の数の少なくとも１０分の１である、前記方法。
  240. 前記治療有効量を構成するのに必要な改変免疫エフェクター細胞の数が、少なくとも１×１０３個、５×１０３個、１×１０４個、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個の細胞である、請求項２３９に記載の方法。
JP2021545400A 2019-02-04 2020-02-04 免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ Pending JP2022519595A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962800999P 2019-02-04 2019-02-04
US62/800,999 2019-02-04
US201962818677P 2019-03-14 2019-03-14
US62/818,677 2019-03-14
PCT/US2020/016623 WO2020163365A2 (en) 2019-02-04 2020-02-04 Combination gene targets for improved immunotherapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022519595A true JP2022519595A (ja) 2022-03-24
JPWO2020163365A5 JPWO2020163365A5 (ja) 2023-02-10

Family

ID=71947815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021545400A Pending JP2022519595A (ja) 2019-02-04 2020-02-04 免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20200347386A1 (ja)
EP (1) EP3920942A4 (ja)
JP (1) JP2022519595A (ja)
KR (1) KR20210138587A (ja)
CN (1) CN113396216A (ja)
AU (1) AU2020217715A1 (ja)
BR (1) BR112021015170A2 (ja)
CA (1) CA3128823A1 (ja)
IL (1) IL285307A (ja)
MX (1) MX2021009357A (ja)
SG (1) SG11202108452WA (ja)
WO (1) WO2020163365A2 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3765094A4 (en) 2018-03-15 2021-12-22 KSQ Therapeutics, Inc. GENE REGULATION COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING IMMUNOTHERAPY
KR20230056766A (ko) * 2020-08-28 2023-04-27 제넨테크, 인크. 숙주 세포 단백질의 CRISPR/Cas9 다중 녹아웃
WO2022133329A1 (en) * 2020-12-17 2022-06-23 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Method for programmable control of rna transcript levels with autoregulated crispr-cas13d
EP4305153A1 (en) * 2021-03-09 2024-01-17 CRISPR Therapeutics AG Genetically engineered t cells with ptpn2 knockout have improved functionality and anti-tumor activity
WO2023015213A1 (en) * 2021-08-03 2023-02-09 Spotlight Therapeutics Ptpn2 specific guide rnas and uses thereof
CN116103240A (zh) * 2021-11-10 2023-05-12 清华大学 增强免疫细胞持久性的方法
WO2023096928A1 (en) * 2021-11-23 2023-06-01 Kumquat Biosciences Inc. Hetero-atom containing compounds and uses thereof
WO2023131053A1 (zh) * 2022-01-05 2023-07-13 苏州系统医学研究所 一种t细胞受体及其制备方法和用途
WO2023143515A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7348139B1 (en) * 2001-04-13 2008-03-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine SOCS-1 gene methylation in cancer
US20130331294A1 (en) * 2007-11-09 2013-12-12 Fox Chase Cancer Center Egfr/nedd9/tgf-beta interactome and methods of use thereof for the identification of agents having efficacy in the treatment of hyperproliferative disorders
CN102378633A (zh) * 2009-02-27 2012-03-14 国立大学法人大阪大学 免疫佐剂组合物及其应用
US20150017136A1 (en) * 2013-07-15 2015-01-15 Cellectis Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy
WO2015070083A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
WO2018148378A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficiacy of cancer immunotherapy
CA3093968A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP3920942A2 (en) 2021-12-15
WO2020163365A3 (en) 2020-09-24
AU2020217715A1 (en) 2021-09-23
CN113396216A (zh) 2021-09-14
US20200347386A1 (en) 2020-11-05
KR20210138587A (ko) 2021-11-19
SG11202108452WA (en) 2021-09-29
CA3128823A1 (en) 2020-08-13
MX2021009357A (es) 2021-11-17
EP3920942A4 (en) 2023-01-18
WO2020163365A2 (en) 2020-08-13
BR112021015170A2 (pt) 2021-09-28
IL285307A (en) 2021-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230088186A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
US11608500B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
JP7101419B2 (ja) 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
JP2022519595A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ
US11459544B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
JP2021518161A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
JP2021518161A6 (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
US11332713B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
JP2022519070A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210827

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230202

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230202

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240319