CN115927400A - 一种含口蹄疫病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：1)制备含口蹄疫5'‑UTR和3D基因的克隆质粒pLJM1‑UTR‑3D；2)四质粒共转染，包装假病毒颗粒。本发明采用HIV包装系统包装口蹄疫病毒5'‑UTR和3D基因，得到含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒，为首次获得口蹄疫病毒假病毒颗粒。该假病毒安全、稳定，适合大规模的生产和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
口蹄疫是全球性最重要的动物健康问题之一，世界大部分地区时有发生，是我国规定的一类动物疫病，是世界动物卫生组织规定的通报疫病。口蹄疫由口蹄疫病毒(footand mouth disease virus，FMDV)所致，该病毒属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属，单链RNA病毒，可感染牛、羊、猪等多种偶蹄动物。病畜口、鼻、蹄等部位出现水疱为主要症状，且可能跛行，也可导致病畜流产，繁殖力下降，具有发病急、传播迅速、发病率高的特点。对口蹄疫的快速准确诊断是防控该病的重要手段，尤其是核酸诊断，这就需要用到对照参考品。虽然目前多数诊断试剂以真实病毒作为参考品，但由于口蹄疫病毒具有高度传染性，必须在生物安全3级以上实验室进行病毒操作，易引起生物安全问题。而且裸露的RNA做参考品存在RNA降解的风险。
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法和应用。
技术方案：本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)制备含口蹄疫5'-UTR和3D基因的克隆质粒pLJM1-UTR-3D；
2)四质粒共转染，包装假病毒颗粒。
作为优选或者具体实施方案：
步骤1)中，所述5'-UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
步骤1)中，所述克隆质粒pLJM1-UTR-3D的制备方法，包括如下步骤：
合成一段带有Nde I和EcoR I酶切位点的5'-UTR和3D基因串联序列，将合成的目的基因与经Nde I和EcoR I酶切的pLJM1-EGFP载体进行链接，所得产物加入到E.coliDH5α感受态细胞中培养，结束后挑取单菌落，即得重组质粒pLJM1-UTR-3D/DH5α。
步骤2)中，所述四质粒共转染，包装假病毒颗粒的方法，包括如下步骤：
挑取pLJM1-UTR-3D/DH5α，pMDLg-pRRE/DH5α，pRSV-Rev/DH5α，pMD2G/DH5α单菌落，进行培养，提取质粒，得到上述各质粒，转染到293T细胞中培养，取细胞培养上清，离心，过滤，即得。
优选的，所述pLJM1-UTR-3D/DH5α，pMDLg-pRRE/DH5α，pRSV-Rev/DH5α，pMD2G/DH5α的质量比为(9-11)：(1-3)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)。
本发明还提供了一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒，由上述制备方法所制得。
本发明最提供了所述的含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒作为口蹄疫病毒标准品的应用。将所述含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒作为口蹄疫病毒标准品，操作安全，且RNA稳定，无降解。
本发明制备的假病毒可将口蹄疫基因包裹在慢病毒包膜蛋白中，由于包裹的核酸不具有形成全病毒的完整序列，因此操作更加安全。假病毒制备也较容易，通过质粒共转染细胞等方式，即可获得高滴度的假病毒，同时可以用来模拟真实样本的提取过程。
本发明选用3代包装系统，即四质粒系统，该系统包括2个包装质粒，为pMDLg-pRRE和pRSV-Rev，分别编码HIV主要结构蛋白gag基因、病毒特异性酶pol基因以及调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因；1个包膜质粒，为pMD2G,提供病毒包装所需要的包膜蛋白VSV-G；1个目的基因质粒，为pLJM1，该载体中含有病毒的基本元件5’LTR和3’LTR、其他辅助元件及目的外源基因。通过转染试剂将上述四种质粒共转染到包装细胞293T中，转录出的目的基因RNA与包装质粒和包膜质粒翻译出的蛋白可组装成为慢病毒。
有益效果：与现有技术相比，本发明采用HIV包装系统包装口蹄疫病毒5'-UTR和3D基因，得到含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒，为首次获得口蹄疫病毒假病毒颗粒。该假病毒安全、稳定，适合大规模的生产和应用。
附图说明
图1为质粒pLJM1-EGFP的结构图谱。
图2为重组质粒pLJM1-UTR-3D双酶切鉴定图。
图3为含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒电镜观察结果。
图4为含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的5'UTR基因实时荧光RT-PCR。
图5为含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的3D基因实时荧光RT-PCR。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用的材料来源：
质粒pMDLg-pRRE，pRSV-Rev，pLJM1-EGFP及pMD2G购自湖南丰晖生物科技有限公司。
菌株E.coliDH5α购自北京擎科生物科技有限公司。
限制性内切酶，T4 DNA ligase，One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(PerfectReal Time)均购自TAKARA公司。
质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒及胶回收试剂盒均购自QIAGEN公司。
DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基，胎牛血清购于GIBCO公司；
X-tremeGENETM转染试剂购自MERCK公司。
293T细胞购自北纳生物。
病毒核酸提取试剂盒购自苏州天隆生物科技有限公司
实施例
(1)重组质粒pLJM1-UTR-3D的构建
根据GeneBank中口蹄疫病毒5'-UTR和3D基因序列(序列分别如SEQ ID NO：1和SEQID NO：1所示)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成一段带有Nde I和EcoR I酶切位点的5'-UTR和3D基因串联序列，预期目的片段长度为5'-UTR基因与3D基因片段长度之和，为2491bp，将合成的目的基因与经Nde I和EcoR I酶切的pLJM1-EGFP载体进行连接(酶切后载体大小为6957bp)，其结构图谱如图1所示。次日，从-80℃冰箱取出1管E.coliDH5α感受态细胞，迅速放入冰上，待其融化后向其中加入全部连接产物，轻轻混匀，冰水浴中放置30min，42℃热击45s，冰水浴中放置1min，随后加入960μL LB液体培养基中，37℃，150rpm活化1h，转化液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体板，37℃培养过夜，次日挑取单菌落，提取经菌落PCR鉴定为阳性的重组质粒pLJM1-UTR-3D/DH5α进行双酶切鉴定和测序鉴定。
(2)包装含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒
将质粒pMDLg-pRRE，pRSV-Rev，pMD2G化学转化E.coliDH5α感受态细胞，如(1)重组质粒pLJM1-UTR-3D的构建中所述。挑取转化后LB固体板上的pLJM1-UTR-3D/DH5α，pMDLg-pRRE/DH5α，pRSV-Rev/DH5α，pMD2G/DH5α单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。按QIAGEN公司的质粒大提试剂盒进行质粒提取，得到上述各质粒并保存于-20℃，菌种保存于-80℃。复苏293T细胞并在10cm培养皿中培养至70-80％密度，转染前为293T细胞换新鲜培养基。分别加入6μg pLJM1-UTR-3D，1.2μg pMD2G，0.6μg pMDLg-pRRE，0.6μg pRSV-Rev及27μL转染试剂至1mL Opti-MEM培养基中，按照X-tremeGENETM转染试剂说明书操作，转染后24h更换新鲜培养液体，转染后48h，取细胞培养上清400g离心4min，并用0.45μm滤膜过滤分装，保存于-80℃。
(3)假病毒颗粒的验证
取上述(2)制备的假病毒颗粒进行电镜观察，结果如图3所示。同时将假病毒颗粒按照天隆生物核酸提取试剂盒进行提取，得到RNA。以RNA为模板，用如下引物进行实时荧光RT-CR验证。
5'UTR基因引物为：
Forward primer：CACYTYAAGRTGACAYTGRTACTGGTAC，
Reverse primer：CAGATYCCRAGTGWCICITGTTA，
labelled probe：CCTCGGGGTACCTGAAGGGCATCC。
3D基因引物为：
Forward primer：ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA，
Reverse primer：GCGAGTCCTGCCACGGA，
labelled probe：TCCTTTGCACGCCGTGGGAC。
实时荧光RT-PCR扩增体系为：2X One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa ExTaq HS(5U/μl)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，PCR Forward Primer(10μM)0.4μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL，Probe 0.8μL ，Total RNA 2μL，RNase FreedH2O 5.4μL，Total 20μL。实时荧光RT-PCR扩增程序为：42℃5min，95℃10sec；95℃5s，60℃20s并收集荧光信号，重复40个循环。扩增结果如图4所示，均为阳性，证明得到的假病毒颗粒为含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒。
Claims (7)
1.一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备含口蹄疫5'-UTR和3D基因的克隆质粒pLJM1-UTR-3D；
2)四质粒共转染，包装假病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述5'-UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述3D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述克隆质粒pLJM1-UTR-3D的制备方法，包括如下步骤：
合成一段带有Nde I和EcoR I酶切位点的5'-UTR和3D基因串联序列，将合成的目的基因与经Nde I和EcoR I酶切的pLJM1-EGFP载体进行连接，所得产物加入到E.coliDH5α感受态细胞中培养，结束后挑取单菌落，即得重组质粒pLJM1-UTR-3D/DH5α。
4.根据权利要求1所述的含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述四质粒共转染，包装假病毒颗粒的方法，包括如下步骤：
挑取pLJM1-UTR-3D/DH5α，pMDLg-pRRE/DH5α，pRSV-Rev/DH5α，pMD2G/DH5α单菌落，进行培养，提取质粒，得到上述各质粒，转染到293T细胞中培养，取细胞培养上清，离心，过滤，即得。
5.根据权利要求4所述的含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，所述pLJM1-UTR-3D/DH5α，pMDLg-pRRE/DH5α，pRSV-Rev/DH5α，pMD2G/DH5α的质量比为(9-11)：(1-3)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)。
6.一种含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒，由权利要求1-5任一项所述制备方法制得。
7.权利要求6所述的含口蹄疫病毒RNA片段的假病毒颗粒作为口蹄疫病毒标准品的应用。
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