JP7010941B2 - Dna編集に用いられるシステムおよびその応用 - Google Patents
Dna編集に用いられるシステムおよびその応用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7010941B2 JP7010941B2 JP2019523070A JP2019523070A JP7010941B2 JP 7010941 B2 JP7010941 B2 JP 7010941B2 JP 2019523070 A JP2019523070 A JP 2019523070A JP 2019523070 A JP2019523070 A JP 2019523070A JP 7010941 B2 JP7010941 B2 JP 7010941B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- seq
- dna
- crrna
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
甲は、以下のN1)およびN2):
N1) 名称がRNA-2であるRNAまたはRNA-2に関連する生物材料;
N2) 名称がRNA-1であるRNAまたはRNA-1に関連する生物材料であり、
RNA-2は式Iに示されるRNAであり、
式I: Nx-ncrRNA
式中、NxはCRISPR-Casシステムにおけるスぺーサー配列であり、
ncrRNAは以下のa1)~a4)の中の何れか一つであり:
a1) 配列表におけるSEQ ID NO.1に示されるRNA;
a2) a1)の5′端および/または3′端に1個または複数個のヌクレオチドを添加して得られるRNA;
a3) a1)またはa2)において限定したRNAと85%以上の同一性を有するRNA;
a4) 配列表におけるSEQ ID NO.1に示されるRNAの修飾物であり、
RNA-2に関連する生物材料は以下のA1)~A5)の中の何れか一つであり:
A1) RNA-2をコードするDNA分子;
A2) A1)のDNA分子を含有する発現カセット;
A3) A1)のDNA分子を含有する組換えベクター、またはA2)の発現カセットを含有する組換えベクター;
A4) A1)のDNA分子を含有する組換え微生物、またはA2)の発現カセットを含有する組換え微生物、またはA3)の組換えベクターを含有する組換え微生物;
A5) A1)のDNA分子を含有する細胞株、またはA2)の発現カセットを含有する細胞株であり、
RNA-1は以下のb1)~b4)の中の何れか一つであり:
b1) 配列表におけるSEQ ID NO.5に示されるRNA;
b2) b1)の5′端および/または3′端に1個または複数個のヌクレオチドを添加して得られるRNA;
b3) b1)またはb2)において限定したRNAと85%以上の同一性を有するRNA;
b4) 配列表におけるSEQ ID NO.5に示されるRNAの修飾物であり、
RNA-1に関連する生物材料は以下のB1)~B5)の中の何れか一つであり:
B1) RNA-1をコードするDNA分子;
B2) B1)のDNA分子を含有する発現カセット;
B3) B1)のDNA分子を含有する組換えベクター、またはB2)の発現カセットを含有する組換えベクター;
B4) B1)のDNA分子を含有する組換え微生物、またはB2)の発現カセットを含有する組換え微生物、またはB3)の組換えベクターを含有する組換え微生物;
B5) B1)のDNA分子を含有する細胞株、またはB2)の発現カセットを含有する細胞株であり、
ncrRNAとRNA-1とは一部のフラグメントにて相補して茎領域と環領域を含む構造を構成しており、
乙は、RNA-2である。
ただし、xは非ゼロの自然数である。xは具体的に以下のe1)~e3)の中の何れか一つである:
e1) 15~22の何れか一つの整数;
e2) 19~21の何れか一つの整数;
e3) 20。
a2) RNAは以下のa21)~a23)の中の何れか一つであり得る:
a21) 長さが12-14ntのRNA;
a22) 長さが12-16ntのRNA;
a23) 長さが12-18ntのRNA。
b2) RNAは以下のb21)~b24)の中の何れか一つであり得る:
b21) 長さが64-66ntのRNA;
b22) 長さが64-68ntのRNA;
b23) 長さが64-70ntのRNA;
b24) 長さが64-86ntのRNA。
修飾物は、RNA中の少なくとも1個のヌクレオチドに対してリボース、リン酸骨格および/または塩基において修飾して得られる物質である。
M1) 真核生物のDNA;
M2) 動物のDNA;
M3) 哺乳類動物のDNA;
M4) ヒトのDNA;
M5) マウスのDNA。
a21) RNAは配列表におけるSEQ ID NO.2に示されるRNAであり得、
a22) RNAは配列表におけるSEQ ID NO.3に示されるRNAであり得、
a23) RNAは配列表におけるSEQ ID NO.4に示されるRNAであり得る。
b21) RNAは配列表におけるSEQ ID NO.6に示されるRNAであり得、
b22) RNAは配列表におけるSEQ ID NO.7に示されるRNAであり得、
b23) RNAは配列表におけるSEQ ID NO.8に示されるRNAであり得る。
DNAがOct4遺伝子である場合、RNA-2はSEQ ID NO.13-15の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAであり、
DNAがEMX1遺伝子である場合、RNA-2はSEQ ID NO.16-19の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAであり、
DNAがβサラセミア遺伝子である場合、RNA-2はSEQ ID NO.20-22に示されるRNAであり、
DNAがTP53遺伝子である場合、RNA-2はSEQ ID NO.23および/または24に示されるRNAであり、
DNAがTP53遺伝子のプロモーターである場合、RNA-2はSEQ ID NO.25-27の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAである。
Cas9ヌクレアーゼに関連する生物材料は以下のC1)~C7)の中の何れか一つである:
C1) Cas9ヌクレアーゼをコードする核酸分子;
C2) C1)の核酸分子を含有する発現カセット;
C3) C1)の核酸分子を含有する組換えベクター、またはC2)の発現カセットを含有する組換えベクター;
C4) C1)の核酸分子を含有する組換え微生物、またはC2)の発現カセットを含有する組換え微生物、またはC3)の組換えベクターを含有する組換え微生物;
C5) C1)の核酸分子を含有する細胞株、またはC2)の発現カセットを含有する細胞株。
R1) 細菌;
R2) レンサ球菌属、ブドウ球菌属、ロシア(Rothia)菌属、髄膜炎菌属、パービバキュラム(Parvibaculum)菌属、または乳酸桿菌。
O1) RNA-2またはRNA-2に関連する生物材料;
O2) RNA-1またはRNA-1に関連する生物材料。
X1 ncrRNAのcrRNAの製造への応用;
X2 ncrRNAのDNA編集への応用;
X3 ncrRNAのDNA編集製品の製造への応用;
X4 RNA-1のtracrRNAとしての応用;
X5 RNA-1またはRNA-1に関連する生物材料のDNA編集への応用;
X6 RNA-1またはRNA-1に関連する生物材料のDNA編集製品の製造への応用;
X7 RNA-2のcrRNAとしての応用;
X8 RNA-2またはRNA-2に関連する生物材料のDNA編集への応用;
X9 RNA-2またはRNA-2に関連する生物材料のDNA編集製品の製造への応用;
X10 システムのDNA編集への応用;
X11 システムの、生体内(in vivo)または生体外(in vitro)遺伝子発現の干渉への応用;
X12 システムの、DNA編集発生の動物、植物または細胞モデルの構築への応用。
M1) 真核生物のDNA;
M2) 動物のDNA;
M3) 哺乳類動物のDNA;
M4) ヒトのDNA;
M5) マウスのDNA。
以下の実施例におけるCas9-293T細胞、Cas9-HeLa細胞、Cas9-THP-1細胞およびCas9-HUVEC細胞は、広州易錦生物技術有限公司のGenome-TALER(商標)&Genome-CRISPR(商標)ヒトAAVS1 Safe Harbor遺伝子を試薬カセット(Catalog#SH-AVS-K100)にノックインして、293T細胞、HeLa細胞、THP-1細胞およびHUVEC細胞のそれぞれにCas9のコーディング遺伝子を導入して得られる細胞である。
DNA編集に用いられるCRISPR-Cas9システムエレメントの製造。
crRNAは式Iに示されるRNAである。
式I: Nx-ncrRNA
ただし、Nはリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド修飾物の中の何れか一つであり、リボヌクレオチドはA、U、CおよびGの中の何れか一つであり、リボヌクレオチド修飾物はA、U、CまたはGに対して2′-O-メチル修飾またはコレステロール修飾して得られる物質であり、
xはNの個数であって、20であり、
ncrRNAはncrRNA1、ncrRNA2、ncrRNA2y、ncrRNA3およびncrRNA4の中の何れか一つであり、
ncrRNA1は配列表におけるSEQ ID NO.1に示されるRNAであり、
ncrRNA2は配列表におけるSEQ ID NO.2に示されるRNAであり、
ncrRNA2yはそれぞれncrRNA2の5′の開始端の第10、第11および第13位のヌクレオチドに対して2′-O-メチル修飾して得られる物質であり、
ncrRNA3は配列表におけるSEQ ID NO.3に示されるRNAであり、
ncrRNA4は配列表におけるSEQ ID NO.4に示されるRNAである。
tracrRNAはtracrRNA1、tracrRNA2、tracrRNA3とtracrRNA4であり、
tracrRNA1は配列表におけるSEQ ID NO.5に示されるRNAであり、
tracrRNA2は配列表におけるSEQ ID NO.6に示されるRNAであり、
tracrRNA3は配列表におけるSEQ ID NO.7に示されるRNAであり、
tracrRNA4は配列表におけるSEQ ID NO.8に示されるRNAである。
配列表における各配列の1番目は共に同配列の5′末端である。
異なるncrRNAの長さのDNA編集効率への影響
一 生体外酵素消化の測定
1 DNAテンプレートの製造
293T細胞ゲノムDNAをテンプレートとして、Phusion酵素(即ちPhusion High-Fidelity DNA Polymerase)を用いて2回のPCRによる増幅してVEGFA(Vascular endothelial growth factor A)標的遺伝子断片、即ちDNAテンプレートを得た。1回目のPCRによる増幅に用いられるプライマーはVEGFA-F1・VEGFA-R1とし、2回目のPCRによる増幅は1回目のPCRによる増幅の生成物をテンプレートとしてプライマーVEGFA-F3・VEGFA-R3を使用して増幅した。2回目のPCRによる増幅生成物(即ちDNAテンプレート)の長さが485bpであった。
Cas9ヌクレアーゼ、10×Cas9Buffer、crRNA、tracrRNAとH2Oを均一に混ぜて、37℃で15minインキュベートして、それから、工程1におけるDNAテンプレートを入れて均一に混ぜて、そして37℃で70minインキュベートした。反応系は具体的に表3に示される。crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。ここでは、crRNAはVEGFA-crRNA1、VEGFA-crRNA2、VEGFA-crRNA3およびVEGFA-crRNA4とした。各反応系においてある1種類のcrRNAとした。VEGFA-crRNA1、VEGFA-crRNA2、VEGFA-crRNA3およびVEGFA-crRNA4の構造式は実施例1の式Iの通りに示されており、Nx部分は同様で、ncrRNAはそれぞれ実施例1のncrRNA1、ncrRNA2、ncrRNA3およびncrRNA4とする。Nxの配列は共に5′-CCACAGGGAAGCUGGGUGAA-3′であり、当該配列はVEGFA遺伝子の一部の配列に相補し、tracrRNAは実施例1のtracrRNA2とした。
1) 30μlの工程2における酵素消化生成物をEP管中に移した。
2) 2倍体積分の磁気ビーズをEP管中におけるサンプルとボルテックスシェイクして充分に均一に混ぜて、5-10min放置した。
3) EP管を磁力ラックに置いて、すべての磁気ビーズを側壁に吸着させたときに、上澄みを吸い上げた。
4) EP管中に200μlの80%(体積パーセント)のエタノール水溶液を入れて、磁気ビーズを洗浄して脱離させた。
5) 上澄み液を吸い取り、室温で3-5min放置し、壁に付けられる磁気ビーズに皹が発生したときに、20μlの水を入れて溶解させた。
6) 水を入れた後のEP管を磁力ラックから外して、3-5min放置した。
7) EP管を磁力ラックに置き戻して、上澄みはサイクルのサンプルとした。
1-2μlのサンプルおよびそれと等体積の染料を取って同システムにより測定した。
(1) 計算方法
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によってDNA断片の分布と濃度結果を得て、数式によって酵素消化効率が得られた。
f(cut)=(b+c)/(a+b+c);
ただし、aは切断されなかった断片のモル濃度(pmol/l)であり、b、cはそれぞれ切断された断片のモル濃度(pmol/l)である。
図1から、crRNAの長さが32nt(VEGFA-crRNA1)、34nt(VEGFA-crRNA2)、36nt(VEGFA-crRNA3)および38nt(VEGFA-crRNA4)とする場合、crRNA、tracrRNA、Cas9を含む生体外酵素消化系が485bpのDNAテンプレートを切断することができると分かった。crRNAの長さが34ntとする場合、Cas9酵素消化効果は最適(Indel%は89.2%)となり、即ちncrRNA部分の長さが14ntとする場合(即ちncrRNA2の場合)、Cas9酵素消化効率が最大となる。
1 細胞トランスフェクション
(1) Cas9-293T細胞は37℃で5%のCO2を培養条件とし、10%のウシ胎児血清を含有するDMEM培地を用いてインキュベーター内で培養された。ここで、Cas9-293T細胞は遺伝子編集によってCas9ヌクレアーゼをコーディングする遺伝子が安定的に導入され、Cas9ヌクレアーゼが発現できる(配列はNCBIにおけるGenbank ID:AQM52323.1に示す配列である)。
A 50μlのopti-MEM培地を1.5mlのEP管に置いて、1μlのLipo2000を入れて、静かに均一に混ぜて、室温で5min放置した。
B 50μlのopti-MEM培地を1.5mlのEP管において、200ngのcrRNAと300ngのtracrRNAを入れて、充分に均一に混ぜた。
C AおよびBで得られる溶液を混合して、室温で20min放置した。
D (1)の24ウェル培養プレートにおける培地を一部吸い出し、ウェル中における培地の残量が300μl程度になり、Cで得られる溶液を培養ウェルに添加して均一に混ぜた。
E 3-6h後に培養ウェルに10%のウシ胎児血清を含有するDMEM培地を1mlまで補充して、細胞をインキュベーターに置き戻して48h培養した後、細胞ゲノムDNAを抽出した。
(1)TIANGEN血液・組織・細胞ゲノムDNA抽出キットのプロトコールに基づいてDNAを抽出した。
(2) アガロースゲル電気泳動によってDNAの抽出効果を測定し、またDNA濃度および純度を測定した。
(1)ネステッドPCRによる増幅
Phusion酵素を用いてVEGFA標的遺伝子を増幅した。1回目のPCRによる増幅に用いられるプライマーはVEGFA-F1・VEGFA-R1とし、2回目のPCRによる増幅は1回目のPCRによる増幅生成物をテンプレートとしてプライマーVEGFA-F3・VEGFA-R3を用いて増幅した。
NEB T7のエンドヌクレアーゼI(T7EI)によって工程3のアニール生成物を酵素で消化し、37℃で40minインキュベートした後、1μlのプロテアーゼKを入れて、37℃で5minインキュベートした。
酵素消化サンプルはAgilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定に供した。
(1) 計算方法は工程一と同様である。
(2) 解析
結果が図2に示される。結果から、crRNA長さが32nt(VEGFA-crRNA1)、34nt(VEGFA-crRNA2)、36nt(VEGFA-crRNA3)および38nt(VEGFA-crRNA4)としたいずれの場合でも、Casが485bpの目的DNAの目的断片を切断できると分かった。crRNA長さが34ntとした場合、Cas9酵素消化効果が最適(Indel%は29.4%)となり、即ちncrRNA部分の長さが14ntとした場合(即ちncrRNA2の場合)、Cas9酵素消化効率が最大となった。
異なるtracrRNA長さのDNA編集効率への影響
一 生体外酵素消化の測定
1 方法
実施例2の工程一の方法に従い、crRNAがVEGFA-crRNA5とし、tracrRNAがそれぞれ実施例1のtracrRNA1、tracrRNA2、tracrRNA3およびtracrRNA4とする場合のcrRNA、tracrRNA、Cas9を含む生体外酵素消化系の酵素消化効率をそれぞれ測定した。各種類の反応系ごとに、ある1種類のtracrRNAとして、また、tracrRNAを代えて水を用いてネガティブコントロール(neg.)としている。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度の結果(図3)から、tracrRNA長さが64nt(tracrRNA1)、66nt(tracrRNA2)、68nt(tracrRNA3)および70nt(tracrRNA4)とした何れの場合でも、Cas9が485bpのDNAテンプレートを切断できるという結論が得られる。Indel%の結果から、tracrRNA長さが66ntとした場合(即ちtracrRNA2の場合)、Cas9の酵素消化効果が最適となり、Indel%が90.7%であったと分かった。
1 方法
実施例2の工程二の方法に従い、crRNAが工程一におけるVEGFA-crRNA5とし、tracrRNAがそれぞれ実施例1のtracrRNA1、tracrRNA2、tracrRNA3およびtracrRNA4とした場合のCas9の酵素消化効率をそれぞれ測定した。各種類の反応系ごとに、ある1種類のtracrRNAとして、また、tracrRNAを代えて水を用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度結果(図4)から、tracrRNA長さが64nt(tracrRNA1)、66nt(tracrRNA2)、68nt(tracrRNA3)および70nt(tracrRNA4)としたいずれの場合でも、Cas9が485bpの目的断片を切断できるという結論が得られる。Indel%の結果から、tracrRNA長さが66ntとした場合(即ちtracrRNA2の場合)、Cas9の酵素消化効果が最適となり、Indel%が29.8%であったと分かった。
異なる修飾の酵素消化測定
一 生体外酵素消化の測定
1 方法
293T細胞ゲノムをテンプレートとして、標的遺伝子VEGFA断片を増幅する。具体的な方法は実施例1と同様である。
UGmACUGCCGUCUGCACACCCGUUUUAGAGCmUmAUmG mは2′-O-メチル修飾を示す。
VEGFA-crRNA2-2はcrRNA2に対してコレステロールにより修飾して得られる物質であり、具体的に以下である:
Chol-UGACUGCCGUCUGCACACCCGUUUUAGAGCUAUGCholはコレステロールによる修飾を示す。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度結果である図5から、crRNAに対して化学修飾(メチル化修飾VEGFA-crRNA2-1、コレステロール修飾VEGFA-crRNA2-2)した後、いずれの場合もCas9ヌクレアーゼが485bpの目的断片を切断でき、VEGFA-crRNA2と比べて酵素消化効率は明らかな変化がないと分かった。
1 方法
実施例2の工程二の方法に従い、crRNAがそれぞれ工程一におけるVEGFA-crRNA2-1とVEGFA-crRNA2-2とし、tracrRNAが実施例1のtracrRNA2とした場合のCas9の酵素消化効率をそれぞれ測定した。各反応系ごとにある1種類のcrRNAとした。実施例2のVEGFA-crRNA2をコントロールとして、crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度結果である図6から、crRNAに対して化学修飾(メチル化修飾VEGFA-crRNA2-1、コレステロール修飾VEGFA-crRNA2-2)した後、いずれの場合も485bpの目的断片を切断でき、VEGFA-crRNA2と比べて酵素消化効率は明らかな変化がないと分かった。
異なる細胞株の酵素消化測定
1 方法
実施例2の工程二の方法に従い、Cas9-293T細胞をCas9-HeLa細胞、Cas9-THP-1細胞とCas9-HUVEC細胞にそれぞれ替えて、他の工程が変わらなく、異なる細胞株のCas9酵素消化効率への影響を測定した。各反応系ごとにある1種類の細胞とした。用いられるcrRNAは実施例2のVEGFA-crRNA2とし、tracrRNAは実施例1のtracrRNA2とする。tracrRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度の結果である図7から、異なるタイプの細胞株において、crRNAおよびtracrRNAをトランスフェクションした後、いずれの場合もCas9ヌクレアーゼが目的断片を切断できると分かられ、且つ各ネガティブコントロールの結果からも、いずれの場合もネガティブコントロールの酵素消化効率が0となると示される。
異なる遺伝子の酵素消化効率の測定
標的遺伝子はOct4(organiccation/carnitine transporter 4)遺伝子、EMX1(Empty spiracles homeobox 1)遺伝子、Beta-3遺伝子およびBeta-5遺伝子とした。ここで、Beta-3およびBeta-5共はβサラセミア遺伝子であり、Beta-3遺伝子はβサラセミア遺伝子変異誘発位点CD17(HBB:c.52A>T)を含有し、Beta-5遺伝子はβサラセミア遺伝子変異誘発位点CD17(HBB:c.52A>T)を含有する。
Oct4-E-T1-crRNA: GGUUAUUUCUAGAAGUUAGG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.13)
Oct4-E-T2-crRNA: CUUCUACAGACUAUUCCUUG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.14)
Oct4-E-T3-crRNA: GGAAAGGGGAGAUUGAUAAC GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.15)
E1R-crRNA: AAGGCCGUGCGGAUCCGCUU GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.16)
E7F-crRNA: AGGUCCGACGUGUUGGAGUG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.17)
Ee3F-crRNA: CGAUGUCACCUCCAAUGACU GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.18)
E2F-crRNA: UCUCGCCCUCGCAGCUGCUG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.19)
Beta-3-T1-crRNA: GUGUGGCAAAGGUGCCCUUG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.20)
Beta-3-T3-crRNA: ACCAAUAGAAACUGGGCAUG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.21)
Beta-5遺伝子に用いられるcrRNAはBeta-5-T3-crRNAとし、tracrRNAは実施例1のtracrRNA2とした。crRNAの構成は実施例1の式Iに示され、配列は以下である。
Beta-5-T3-crRNA: CGUAAAUACACUUGCAAAGG GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.22)
1 DNAテンプレートの製造
293T細胞ゲノムをテンプレートとして、標的遺伝子であるOct4遺伝子、EMX1遺伝子、Beta-3遺伝子およびBeta-5遺伝子の断片、即ちDNAテンプレートを増幅する。
EMX1-E2F: DNAテンプレートの1回目の増幅に用いられるプライマーはE1-1R/2F-WF/NFおよびE1-1R/2F-WRとし、2回目の増幅に用いられるプライマーはE1-1R/2F-WF/NFおよびE1-1R/2F-NRとした。
EMX1-E1R: DNAテンプレートの1回目の増幅に用いられるプライマーはE1-1R/2F-WF・NFおよびE1-1R・2F-WRとし、2回目の増幅に用いられるプライマーはE1-1R・2F-WF・NFおよびE1-1R・2F-NRとした。
EMX1-E7F: DNAテンプレートの1回目の増幅に用いられるプライマーはE1-7-F-WFおよびE1-7-F-WRとし、2回目の増幅に用いられるプライマーはE1-7-F-NFおよびE1-7-F-NRとした。
EMX1-Ee3F: DNAテンプレートの1回目の増幅に用いられるプライマーはE1-e3F-WFおよびE1-e3F-WRとし、2回目の増幅に用いられるプライマーはE1-e3F-NFおよびE1-e3F-NRとした。
Beta-3遺伝子のDNAテンプレートの1回目の増幅に用いられるプライマーはBeta-outer-F1およびBeta-outer-R1とし、2回目の増幅に用いられるプライマーはBeta3-inner-F1およびBeta3-inner-R1とした。
Beta-5遺伝子のDNAテンプレートの1回目の増幅に用いられるプライマーはBeta-outer-F1およびBeta-outer-R1とし、2回目の増幅に用いられるプライマーはBeta5-inner-F1およびBeta5-inner-R1とした。
実施例2の工程一における2~5の方法に従い、crRNA、tracrRNAおよびCas9を含有する生体外酵素消化系を用いて工程1の各DNAテンプレートを酵素で消化して、各反応系ごとにある1種類のcrRNAとした。tcrRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
Oct4-E-T1-crRNAが異なる濃度(200nM、400nMおよび800nM)とする場合のCas9の生体外酵素消化系の酵素消化効率を測定した。各系におけるtracrRNAの濃度はcrRNAの濃度によって違って、同一の反応系においてtracrRNAの濃度とcrRNA濃度とが同じであるように維持するが、他の物質の濃度はすべて表3に示される。
異なるcrRNA(E1R-crRNA、E7F-crRNA、Ee3F-crRNAおよびE2F-crRNA)のCas9によるEMX1遺伝子のDNAテンプレートの生体外酵素消化の酵素消化効率を測定する。EMX1遺伝子のDNAテンプレートであるEMX1-E2F、EMX1-E1R、EMX1-E7FおよびEMX1-Ee3Fに対応するcrRNAhはそれぞれE2F-crRNA、E1R-crRNA、E7F-crRNAおよびEe3F-crRNAであり、各系は何れも表3に示される。
Beta-3-T1-crRNAおよびBeta-3-T3-crRNAが存在した場合のCas9によるBeta-3遺伝子のDNAテンプレートの生体外酵素消化の酵素消化効率、以およびBeta-5-T3-crRNAが存在した場合のCas9によるBeta-5遺伝子のDNAテンプレートの生体外酵素消化の酵素消化効率を測定した。
実施例2の工程二の方法に従い、Cas9ヌクレアーゼのOct4遺伝子、EMX1遺伝子、Beta-3遺伝子およびBeta-5遺伝子に対する酵素消化効率を測定した。各反応系ごとにある1種類のcrRNAとした。crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
マウスゲノムVEGF遺伝子の酵素消化の測定
一 細胞内酵素消化の測定
実施例2の工程二の方法に従い、Cas9-293T細胞を、Cas9を含有するC2C12マウス筋芽細胞に替えて、他の工程が変わらなく、Cas9を含有するC2C12マウス筋芽細胞においてCas9のVEGFA遺伝子酵素消化効率への影響を測定した。用いられるcrRNAは修飾されたVEGFA-crRNA6、即ちVEGFA-crRNA6-1とし、tracrRNAは実施例1のtracrRNA2とした。crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
VEGFA-crRNA6-1はVEGFA-crRNA6の2番目、30番目、31番目および33番目の位置に対して2′-O-メチルで修飾して得られる物質であり、具体的に以下である。
AAmGAGGAGAGGGGGCCGCAG GUUUUAGAGCmUmAUmG
mは2′-O-メチル修飾を示す。
1 Lipo2000によるプラスミドPX260のトランスフェクション
(1) 50μlのopti-MEM培地を1.5mlのEP管に置いて、1μlのLipo2000を入れて、均一に混ぜた後、室温で5min放置した。
(2) 50μlのopti-MEM培地を1.5mlのEP管に置いて、1μμgのPX260プラスミドを入れて、均一に混ぜた。
(3) (1)および(2)で得られる溶液を混合して、室温で20min放置した。
(4) C2C12マウス筋芽細胞を培養した24ウェル培養プレートにおける培地を一部吸い出し、ウェル中における培地残量が300-500μl程度になり、(3)で得られたサンプルを培養ウェルに入れて、3-6h後に培養ウェルに10%のウシ胎児血清を含有するDMEM培地を1mlまで補充して、細胞をインキュベーターに置き戻して培養した。
1 C57bl/6マウス生体内のトランスフェクション
(1) C57BL/6マウス(北京維通利華実験動物有限公司)にペントバルビタールナトリウムを注射して麻酔させた。30mg/kg静脈または腹腔注射である。
5μgのCas9プラスミド(即ちPX260)、4μMのcrRNA(20μl)および4μMのtracrRNA(20μl)を200μlの生理食塩水に溶解させて、振動して均一に混ぜた。6μlのトランスフェクション試薬(即ちTurboFect in vivo Transfection Reagent)を入れて充分に混合させた。上記混合液を室温で15-20分間放置して、トランスフェクション製剤として筋肉に注射した。用いられるcrRNAは修飾されたVEGFA-crRNA6、即ちVEGFA-crRNA6-1とし、tracrRNAは実施例1のtracrRNA2とした。
マウス大腿二頭筋に対して200μlの工程2ー1のトランスフェクション製剤を注射した。
トランスフェクション後の7日目に、血液・組織・細胞ゲノム抽出キットによって大腿二頭筋ゲノムDNAを抽出した。
方法は実施例2の工程二における3と同様であった。用いられるプライマーはVEGFA-outer-F1(マウス)、VEGFA-outer-R1(マウス)、VEGFA-inner-F1(マウス)およびVEGFA-inner-R1(マウス)とした。
NEB T7エンドヌクレアーゼI(T7EI)を用いて消化した。具体的な方法は実施例2の工程二における4と同様であった。
酵素消化サンプルをAgilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定に供した。
計算方法は実施例2と同様であった。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度の結果から、マウスにおいて、crRNA、tracrRNAおよびCas9プラスミドをマウス細胞またはマウス体内に導入した場合では、526bpの目的DNAの目的断片を2個のDNA鎖に切断できる(図14)と分かった。
プロモーター、エキソンの酵素消化の測定
TP53(tumor protein p53)遺伝子およびエキソンの酵素消化効率を測定した。用いられるcrRNAはそれぞれTP53-P-T1、TP53-P-T2、TP53-E-T1、TP53-E-T2およびTP53-E-T3とした。各反応系においてある1種類のcrRNAとした。用いられるtracrRNAは実施例1のtracrRNA2とした。crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。用いられるcrRNAの配列は以下である。
TP53-P-T1: CAAUUCUGCCCUCACAGCUC GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.23)
TP53-P-T2: CCCCAAAAUGUUAGUAUCUA GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.24)
TP53-E-T1: CCCUCCCAUGUGCUCAAGAC GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.25)
TP53-E-T2: UGGGAGCGUGCUUUCCACGA GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.26)
TP53-E-T3: CCAGUCUUGAGCACAUGGGA GUUUUAGAGCUAUG (SEQ ID NO.27)
(Pはプロモーターを、Eはエキソンを示す)
1 DNAテンプレートの製造
293T細胞ゲノムをテンプレートとして、標的遺伝子TP53断片、即ちDNAテンプレートを増幅した。
実施例2の工程一における2-5の方法に従い、crRNA、tracrRNAおよびCas9を含有する生体外酵素消化系により工程1のDNAテンプレートを消化した。
実施例2の工程二の方法に従い、Cas9ヌクレアーゼのTP53断片に対する酵素消化効率を測定した。crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。
複数個のcrRNAの酵素消化の測定
一 生体外酵素消化の測定
1 Cas9の生体外酵素消化
Cas9ヌクレアーゼ、10×Cas9Buffer、crRNA、tracrRNAとH2Oを均一に混ぜて、37℃で15minインキュベートして、それからDNAテンプレートを入れて、均一に混ぜてから、37℃で70minインキュベートした。crRNAを代えてH2Oを用いてネガティブコントロール(neg.)とした。DNAテンプレートは実施例6のOct4遺伝子のDNAテンプレートとし、用いられるcrRNAはOct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNAおよびOct4-E-T3-crRNAとして、tracrRNAは実施例1のtracrRNA2とした。Cas9の生体外酵素消化系は以下の通りである。当該系では、3種類のcrRNA、即ちOct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNAおよびOct4-E-T3-crRNAが含まれている。
実施例2の工程一における3と同様である。
実施例2の工程一における4と同様である。
実施例2の工程二の方法に従い、Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNAおよびOct4-E-T3-crRNAならびに実施例1のtracrRNA2を用いて一緒にトランスフェクションした。crRNA6の用量は何れも66.7ngとし、tracrRNA2の用量は300ngとした。crRNAとしてOct4-E-T2-crRNAを単独的に用いて実験し、対照として、Oct4-E-T2-crRNAの用量は200ngとした。
異なるCas9ドナーの細胞酵素消化の測定
一 Cas9を安定に発現する細胞
Cas9ドナーはCas9を安定に発現する293T細胞、即ちCas9-293Tとした。具体的な方法は実施例2における工程一と同様である。用いられるcrRNAおよびTracRNAはそれぞれ実施例2のcrRNA2および実施例1のtracrRNA2とした。
Cas9ドナーはCas9プラスミド(即ちPX260)とした。
2ー1 Lipo2000によるプラスミドPX260のトランスフェクション
(1) 50μlのopti-MEM培地を1.5mlのEP管に置いて、1μlのLipo2000を入れて、均一に混ぜてから、室温で5min放置した。
(2) 50μlのopti-MEM培地を1.5mlのEP管に置いて、1μgのPX260のプラスミドを入れて、均一に混ぜた。
(3) (1)および(2)で得られる溶液を混合して、室温で20min放置した。
(4) 293T細胞を培養した24ウェル培養プレートにおける培地を一部吸い出し、ウェル中における培地残量が300-500μl程度になり、(3)で得られたサンプルを培養ウェル中に添加して、3-6h後に培養ウェル中にウシ胎児血清を10%含有するDMEM培地を1mlまで補充して、細胞をインキュベーターに置き戻して培養した。
異なるCas9濃度の生体外酵素消化の測定
1 方法
実施例2の工程一の方法に従い、crRNA、tracrRNA、および異なる濃度のCas9を含む生体外酵素消化系の酵素消化効率をそれぞれ測定した。Cas9の濃度はそれぞれ20nM、100nM、200nM、400nMとし、他の成分含有量は実施例2の工程一と同様である。
Agilent2200核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるDNA断片の分布と濃度結果(図20)から、タンパク質濃度が20-400nMとした場合は、酵素消化効率が50%以上となり、タンパク質濃度が100-400nMとした場合は、酵素消化効率が80%以上となり、タンパク質濃度が100-200nMとした場合は、酵素消化効率が85%以上となるという結論が得られる。
Claims (10)
- DNA編集に用いられるシステムであって、システムは甲または乙を含み、
甲は、以下のN1)およびN2):
N1)名称がRNA-2であるRNAまたはRNA-2に関連する生物材料;
N2)名称がRNA-1であるRNAまたはRNA-1に関連する生物材料;
を含み、
RNA-2は式Iに示されるRNAであり、
式I: Nx-ncrRNA
式中、NxはCRISPR-Casシステムにおけるスペーサー配列、
ncrRNAは以下の配列またはその修飾物の中の何れか一つ:
a1) SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4;
a2) 配列表におけるSEQ ID NO.1に示されるRNAの修飾物
であり、
RNA-2に関連する生物材料は以下のA1)~A5)の中の何れか一つ:
A1) RNA-2をコードするDNA分子;
A2) A1)のDNA分子を含有する発現カセット;
A3) A1)のDNA分子を含有する組換えベクター、またはA2)の発現カセットを含有する組換えベクター;
A4) A1)のDNA分子を含有する組換え微生物、またはA2)の発現カセットを含有する組換え微生物、またはA3)の組換えベクターを含有する組換え微生物;
A5) A1)のDNA分子を含有する細胞株、またはA2)の発現カセットを含有する細胞株
であり、
RNA-1は以下の配列又はその修飾物の中の何れか一つ:
b1) SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8;
b2) 配列表におけるSEQ ID NO.5に示されるRNAの修飾物
であり、
RNA-1に関連する生物材料は以下のB1)~B5)の中の何れか一つ:
B1) RNA-1をコードするDNA分子;
B2) B1)のDNA分子を含有する発現カセット;
B3) B1)のDNA分子を含有する組換えベクター、またはB2)の発現カセットを含有する組換えベクター;
B4) B1)のDNA分子を含有する組換え微生物、またはB2)の発現カセットを含有する組換え微生物、またはB3)の組換えベクターを含有する組換え微生物;
B5) B1)のDNA分子を含有する細胞株、またはB2)の発現カセットを含有する細胞株
であり、
ncrRNAとRNA-1とは一部の断片にて相補し、
乙は、RNA-2であり、
細胞または目的DNAの影響を受けることなくDNAの編集を実現できる、
ことを特徴とするシステム。 - 請求項1に記載のシステムであって、
修飾物は、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、もしくはSEQ ID NO.4、またはSEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、もしくはSEQ ID NO.8における少なくとも1個のヌクレオチドに対してリボース、リン酸骨格および/または塩基において修飾して得られる物質であり、
修飾は2′-O-メチル修飾、2′-脱酸素修飾、2′-フッ素修飾またはコレステロール修飾である、
ことを特徴とするシステム。 - 請求項1または2に記載のシステムであって、
NxがVEGFA遺伝子に由来する場合、RNA-2はSEQ ID NO.9-12、SEQ ID NO.28およびSEQ ID NO.29の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAであり、
NxがOct4遺伝子に由来する場合、RNA-2はSEQ ID NO.13-15の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAであり、
NxがEMX1遺伝子に由来する場合、RNA-2はSEQ ID NO.16-19の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAであり、
Nxがβサラセミア遺伝子に由来する場合、RNA-2はSEQ ID NO.20-22の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAであり、
NxがTP53遺伝子に由来する場合、RNA-2はSEQ ID NO.23および/または24に示されるRNAであり、
NxがTP53遺伝子のプロモーターに由来する場合、RNA-2はSEQ ID NO.25-27の中の少なくとも1個の配列に示されるRNAである、
ことを特徴とするシステム。 - 請求項1から3の何れか一項に記載のシステムであって、
システムはCas9ヌクレアーゼをさらに含む、
ことを特徴とするシステム。 - 請求項4に記載のシステムであって、Cas9ヌクレアーゼはR1)またはR2):
R1) 細菌;
R2) レンサ球菌属、ブドウ球菌属、ロシア(Rothia)菌属、髄膜炎菌属、パービバキュラム(Parvibaculum)菌属、または乳酸桿菌属
に由来する、
ことを特徴とするシステム。 - 以下の何れか一つのキット:
X3 請求項1から3の何れか一項に記載のシステムと、ncrRNAとを含む、DNA編集製品の製造のためのキット;
X6 請求項1または2に記載のシステムと、RNA-1またはRNA-1に関連する生物材料とを含む、DNA編集製品の製造のためのキット;
X9 請求項1から3の何れか一項に記載のシステムと、RNA-2またはRNA-2に関連する生物材料とを含む、DNA編集製品の製造のためのキット;
X10 請求項1から5の何れか一項に記載のシステムを含む、DNA編集のためのキット;
X11 請求項1から5の何れか一項に記載のシステムを含む、生体内または生体外遺伝子発現の干渉のためのキット;
X12 請求項1から5の何れか一項に記載のシステムを含む、DNA編集発生の動物、植物または細胞モデルの構築のためのキット。 - 生体外DNAを編集する方法であって、請求項1から5の何れか一項に記載のシステムを使用してDNAを処理してDNAの編集を実現することを含む方法。
- 請求項1から5の何れか一項に記載のシステムの製造方法であって、システム中の各物質のそれぞれを別々に包装することを含む製造方法。
- 請求項1から5の何れか一項に記載のシステムを用いることを含む、DNA編集製品の製造方法。
- 請求項1から5の何れか一項に記載のシステムを用いることを含む、DNA編集発生の非ヒト動物、植物または細胞モデルの製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710413147.7 | 2017-06-05 | ||
CN201710413147.7A CN108977442B (zh) | 2017-06-05 | 2017-06-05 | 用于dna编辑的系统及其应用 |
PCT/CN2018/088105 WO2018223843A1 (zh) | 2017-06-05 | 2018-05-24 | 用于dna编辑的系统及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020513732A JP2020513732A (ja) | 2020-05-21 |
JP7010941B2 true JP7010941B2 (ja) | 2022-02-10 |
Family
ID=64501997
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019523070A Active JP7010941B2 (ja) | 2017-06-05 | 2018-05-24 | Dna編集に用いられるシステムおよびその応用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210189435A1 (ja) |
EP (1) | EP3636760A4 (ja) |
JP (1) | JP7010941B2 (ja) |
CN (1) | CN108977442B (ja) |
AU (1) | AU2018279569B2 (ja) |
WO (1) | WO2018223843A1 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016100951A2 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Crispr-based compositions and methods of use |
WO2016123230A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use |
WO2017004261A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT2800811T (pt) * | 2012-05-25 | 2017-08-17 | Univ California | Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição |
CN110643600A (zh) * | 2012-10-23 | 2020-01-03 | 基因工具股份有限公司 | 用于切割靶dna的系统及其用途 |
EP2931892B1 (en) * | 2012-12-12 | 2018-09-12 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
CN110540991B (zh) * | 2013-03-15 | 2023-10-24 | 通用医疗公司 | 使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的特异性 |
AU2014346559B2 (en) * | 2013-11-07 | 2020-07-09 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAs |
EP3985124A1 (en) * | 2013-12-26 | 2022-04-20 | The General Hospital Corporation | Multiplex guide rnas |
EP3981876A1 (en) * | 2014-03-26 | 2022-04-13 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
EA038321B1 (ru) * | 2014-11-06 | 2021-08-09 | Е.И. Дюпон Де Немур Энд Компани | Опосредуемая пептидом доставка направляемой рнк эндонуклеазы в клетки |
EP3227447B1 (en) * | 2014-12-03 | 2024-04-24 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rna with chemical modifications |
WO2017004279A2 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same |
EP3344771A4 (en) * | 2015-08-31 | 2019-03-20 | Agilent Technologies, Inc. | COMPOUNDS AND METHODS FOR GENOME EDITING BASED ON CRISPR / CAS BY HOMOLOGOUS RECOMBINATION |
CA3002647A1 (en) * | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Allele selective gene editing and uses thereof |
CN106701810B (zh) * | 2016-12-12 | 2020-04-21 | 江南大学 | 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统及其应用 |
-
2017
- 2017-06-05 CN CN201710413147.7A patent/CN108977442B/zh active Active
-
2018
- 2018-05-24 WO PCT/CN2018/088105 patent/WO2018223843A1/zh unknown
- 2018-05-24 EP EP18814269.9A patent/EP3636760A4/en active Pending
- 2018-05-24 JP JP2019523070A patent/JP7010941B2/ja active Active
- 2018-05-24 AU AU2018279569A patent/AU2018279569B2/en active Active
- 2018-05-24 US US16/615,828 patent/US20210189435A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016100951A2 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Crispr-based compositions and methods of use |
WO2016123230A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use |
WO2017004261A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
IOVS,2016年,vol.57, no.13, p.5490-5497 |
PNAS,2015年,E7110-E7117 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108977442B (zh) | 2023-01-06 |
WO2018223843A1 (zh) | 2018-12-13 |
EP3636760A4 (en) | 2020-11-18 |
JP2020513732A (ja) | 2020-05-21 |
AU2018279569A1 (en) | 2020-01-16 |
AU2018279569B2 (en) | 2021-07-08 |
EP3636760A1 (en) | 2020-04-15 |
US20210189435A1 (en) | 2021-06-24 |
CN108977442A (zh) | 2018-12-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3320092B1 (en) | Engineered crispr-cas9 compositions and methods of use | |
EP3350327B1 (en) | Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids | |
JP7068821B2 (ja) | 化学修飾を有するガイドrna | |
JP2023100962A (ja) | Crisprcpf1の結晶構造 | |
US20230227857A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
WO2016049024A2 (en) | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo | |
JP2019528743A (ja) | 規定された配列および長さのdna1本鎖分子の拡大可能な生物工学的生成 | |
JP2024504981A (ja) | 新規の操作されたヌクレアーゼおよびキメラヌクレアーゼ | |
JP7010941B2 (ja) | Dna編集に用いられるシステムおよびその応用 | |
WO2019035485A1 (ja) | ゲノム編集酵素の活性を阻害する核酸アプタマー | |
KR20240017367A (ko) | 클래스 ii, v형 crispr 시스템 | |
Sauer | DHX36 function in RNA G-quadruplex-mediated posttranscriptional gene regulation | |
Chen et al. | All-RNA-mediated targeted gene integration in mammalian cells with rationally engineered R2 retrotransposons | |
WO2024138131A1 (en) | Expanding applications of zgtc alphabet in protein expression and gene editing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190724 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200901 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210601 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210930 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211004 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20211101 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20211109 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220104 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220113 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7010941 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |