CN108977442B - 用于dna编辑的系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于DNA编辑的系统及其应用。本发明公开的用于DNA编辑的系统包括crRNA与tracrRNA，crRNA为式Ⅰ所示RNA：Nx‑ncrRNA(式Ⅰ)，Nx为间隔序列，ncrRNA为序列表中SEQ ID NO.1‑4所示的RNA，tracrRNA为序列表中SEQ ID NO.5‑8所示的RNA。本发明的用于DNA编辑的系统中的元件——crRNA与tracrRNA序列短，易于通过化学合成获得，有利于提升RNA的纯度和规模生产，并简化系统的制备与应用，可以用于编辑目的DNA。

Description

用于DNA编辑的系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，用于DNA编辑的系统及其应用。
背景技术
CRISPR–Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。根据功能元件的不同，CRISPR–Cas系统可以分为Ⅰ类系统、Ⅱ类系统和Ⅲ类系统。这三类系统又可以根据其编码Cas蛋白的基因不同而分为更多的亚类。Ⅰ类系统和Ⅲ类CRISPR–Cas系统只需要crRNA和Cas蛋白两种元件的参与，而Ⅱ类CRISPR–Cas系统包括crRNA、tracrRNA和Cas蛋白三种元件。
CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的靶位点剪切双链DNA。
Cas9有两个关键的结构域：HNH和RuvC，它们分别切开DNA双链中的一条单链。产生DNA双链断裂(DSB)，细胞启动修复机制，细胞可通过非同源末端连接(NHEJ)这种不精确的修复方式产生基因定点突变，也可以通过同源重组(HR)方式修复实现精确的基因定点插入或基因替换。Cas9已经在细菌、人类细胞、斑马鱼和小鼠中成功进行基因组工程研究。
发明内容
本发明的目的是提供用于DNA编辑的CRISPR/Cas系统。
本发明首先提供了一种用于DNA编辑的系统，所述系统为CRISPR-Cas系统，包括甲或乙：
甲、下述N1)和N2)：
N1)名称为RNA-2的RNA或与所述RNA-2相关的生物材料；
N2)名称为RNA-1的RNA或与所述RNA-1相关的生物材料；
所述RNA-2为式Ⅰ所示RNA；
Nx-ncrRNA
式Ⅰ；
其中，Nx为CRISPR/Cas系统中的间隔序列(Spacer)；
所述ncrRNA为如下a1)至a4)中的任一种：
a1)序列表中SEQ ID NO.1所示的RNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
a3)与a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
a4)序列表中SEQ ID NO.1所示的RNA的修饰物；
与所述RNA-2相关的生物材料为下述A1)至A5)中的任一种：
A1)编码所述RNA-2的DNA分子；
A2)含有A1)所述DNA分子的表达盒；
A3)含有A1)所述DNA分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；
A4)含有A1)所述DNA分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A5)含有A1)所述DNA分子的细胞系、或含有A2)所述表达盒的细胞系；
所述RNA-1为如下b1)至b4)中的任一种：
b1)序列表中SEQ ID NO.5所示的RNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
b3)与b1)或b2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
b4)序列表中SEQ ID NO.5所示的RNA的修饰物；
与所述RNA-1相关的生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述RNA-1的DNA分子；
B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；
B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有1)所述DNA分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系；
所述ncrRNA与所述RNA-1部分片段互补形成包括茎区和环区的结构；
乙、所述RNA-2。
所述RNA-2的Nx部分位于5′端，所述RNA-2的ncrRNA部分位于3′端，二部分通过核苷间键连接。Nx为RNA序列，与进行编辑的目的DNA的片段互补，满足为CRISPR/Cas系统中的间隔序列的要求。
N可为核糖核苷酸或核糖核苷酸修饰物；x为N的个数。
其中，x为非零自然数。x具体可为下述e1)-e3)中的任一种：
e1)15～22间的任一整数；
e2)19～21间的任一整数；
e3)20。
所述RNA-2可通过ncrRNA与所述RNA-1的部分片段形成复合物，CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白(即Cas核酸酶)可与该复合物结合实现对DNA的编辑。
所述添加一个或几个核苷酸具体可为添加一至十个核苷酸。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述细胞系不包括繁殖材料。
上述系统中，a2)所述RNA可为如下a21)至a23)中的任一种：
a21)长度为12-14nt的RNA；
a22)长度为12-16nt的RNA；
a23)长度为12-18nt的RNA。
b2)所述RNA可为如下b21)至b24)中的任一种：
b21)长度为64-66nt的RNA；
b22)长度为64-68nt的RNA；
b23)长度为64-70nt的RNA；
b24)长度为64-86nt的RNA。
所述核糖核苷酸可为A、U、C或G。所述核糖核苷酸修饰物可为对A、U、C或G在核糖、磷酸骨架和/或碱基进行修饰得到的物质；
所述修饰物为对所述RNA中的至少一个核苷酸在核糖、磷酸骨架和/或碱基进行修饰得到的物质。
所述修饰可为2′-O-甲基修饰、2′-脱氧修饰、2′-氟代修饰或胆固醇修饰。
所述DNA可为下述M1)-M5)中的任一种：
M1)真核生物的DNA；
M2)动物的DNA；
M3)哺乳动物的DNA；
M4)人的DNA；
M5)小鼠的DNA。
上述系统中，a21)所述RNA可为序列表中SEQ ID NO.2所示的RNA；
a22)所述RNA可为序列表中SEQ ID NO.3所示的RNA；
a23)所述RNA可为序列表中SEQ ID NO.4所示的RNA。
b21)所述RNA可为序列表中SEQ ID NO.6所示的RNA；
b22)所述RNA可为序列表中SEQ ID NO.7所示的RNA；
b23)所述RNA可为序列表中SEQ ID NO.8所示的RNA。
所述修饰可为2′-O-甲基修饰、2′-脱氧修饰、2′-氟代修饰或胆固醇修饰。
所述DNA可为VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)基因、EMX1(Emptyspiracles homeobox 1)基因、Oct4(organic cation/carnitine transporter4)基因、β地中海贫血基因、TP53(tumor protein p53)基因或TP53基因的启动子。
上述系统中，所述RNA-2可为SEQ ID NO.9-29中任一序列所示的RNA。
在所述DNA为VEGFA基因时，所述RNA-2为SEQ ID NO.9-12、SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.29中至少一条序列所示的RNA；
在所述DNA为Oct4基因时，所述RNA-2为SEQ ID NO.13-15中至少一条序列所示的RNA；
在所述DNA为EMX1基因时，所述RNA-2为SEQ ID NO.16-19中至少一条序列所示的RNA；
在所述DNA为β地中海贫血基因时，所述RNA-2为SEQ ID NO.20-22所示的RNA；
在所述DNA为TP53基因时，所述RNA-2为SEQ ID NO.23和/或24所示的RNA；
在所述DNA为TP53基因的启动子时，所述RNA-2为SEQ ID NO.25-27中至少一条序列所示的RNA。
所述系统可为CRISPR-Cas系统，具体可为Ⅱ类CRISPR-Cas系统，如CRISPR/Cas9系统。
上述系统还可包括N3)，N3)为Cas9核酸酶或与Cas9核酸酶相关的生物材料；
所述与Cas9核酸酶相关的生物材料为下述C1)至C7)中的任一种：
C1)编码Cas9核酸酶的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的细胞系、或含有C2)所述表达盒的细胞系。
上述系统中，所述Cas9核酸酶可来源于R1)或R2)：
R1)细菌；
R2)链球菌属、葡萄球菌属、罗氏菌属、奈瑟菌属、细小棒菌属或乳杆菌属。
所述链球菌属细菌具体可为脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。所述葡萄球菌属细菌具体可为金黄色葡萄球菌。所述Cas9核酸酶具体可为Genbank ID：AQM52323.1所示的蛋白质。
所述系统还可包括利用CRISPR/Cas9DNA编辑方法进行DNA编辑中除crRNA、tracrRNA和Cas9核酸酶外所需要的其他试剂和/或仪器。
当所述系统含有RNA-2和RNA-1时，RNA-1和RNA-2的摩尔比可为1:(1-1.5)。
当所述系统含有Cas9和tracrRNA和crRNA时，Cas9和tracrRNA和crRNA的摩尔比可为1：(1-20):(1:20),具体可为1：(1-8):(1:8)，进一步可为1：(1-4):(1:4)，更进一步可为1：(2-4):(2-4)。
当RNA-2为至少两条RNA时，上述摩尔比中的RNA-2以多条RNA的总浓度计。
具体来说，所述系统可仅为所述RNA-2，也由上述N1)和N2)组成，也可由上述N1)、N2)和N3)组成。
本发明还提供了下述O1)或O2)：
O1)所述RNA-2或与所述RNA-2相关的生物材料；
O2)所述RNA-1或与所述RNA-1相关的生物材料。
本发明还提供了下述任一应用：
X1、所述ncrRNA在制备crRNA中的应用；
X2、所述ncrRNA在DNA编辑中的应用；
X3、所述ncrRNA在制备DNA编辑产品中的应用；
X4、所述RNA-1在作为tracrRNA中的应用；
X5、所述RNA-1或与所述RNA-1相关的生物材料在DNA编辑中的应用；
X6、所述RNA-1或与所述RNA-1相关的生物材料在制备DNA编辑产品中的应用；
X7、所述RNA-2在作为crRNA中的应用；
X8、所述RNA-2或与所述RNA-2相关的生物材料在DNA编辑中的应用；
X9、所述RNA-2或与所述RNA-2相关的生物材料在制备DNA编辑产品中的应用；
X10、所述系统在DNA编辑中的应用；
X11、所述系统在干扰体内或体外基因的表达中的应用；
X12、所述系统在建立DNA发生编辑的动物、植物或细胞模型中的应用。
所述产品可为可为CRISPR-Cas系统，具体可为Ⅱ类CRISPR-Cas系统，如CRISPR/Cas9系统。
本发明还提供了编辑DNA的方法，所述方法包括：利用所述系统处理DNA实现所述DNA的编辑。
利用所述系统进行DNA进行编辑的体系中，在所述系统含有RNA-2时，RNA-2的浓度可为100-800nM，具体可为200-400nM。在所述系统含有RNA-1时，RNA-1的浓度可为100-800nM，具体可为200-400nM。所述CRISPR/Cas9系统还可含有Cas9核酸酶或与Cas9核酸酶相关的生物材料。
在所述体系含有Cas9核酸酶时，Cas9核酸酶的浓度可为20-400nM，具体可为100-400nM，进一步可为100-200nM。在所述体系含有含有Cas9核酸酶编码基因的载体时，所述载体的用量可为1-200μg，进一步可为20-100μg，更进一步可为30-50μg或1-5μg。所述载体的用量优选为3μg。
在利用所述CRISPR/Cas9系统对细胞中的基因进行编辑时，所述体系中所述细胞与RNA-2的配比可为0.5万-6万个细胞/100nM RNA-2，进一步可为0.75万-4万个细胞/100nMRNA-2，更进一步可为为1-1.25万个细胞/100nM RNA-2。
所述细胞可为真核细胞。所述细胞进一步可为哺乳动物细胞，如293T细胞、HeLa细胞、THP1细胞、HUVEC细胞或C2C12小鼠成肌细胞。
本发明还提供了所述系统的制备方法，所述方法包括将所述系统中的各物质分别独立包装。
所述系统的制备方法还可包括合成所述系统的各RNA。所述合成可利用化学方法合成。
本发明中，所述DNA均可为下述M1)-M5)中的任一种：
M1)真核生物的DNA；
M2)动物的DNA；
M3)哺乳动物的DNA；
M4)人的DNA；
M5)小鼠的DNA。
所述编辑的效率为至少1％或1％以上，如2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或90％。
本发明中，每条序列的第1位均为该条序列的5′末端。
所述DNA编辑可为对DNA的切割。
实验证明，本发明的用于DNA编辑的系统可作为CRISPR/Cas9系统编辑DNA，其中作为crRNA的RNA-2中ncrRNA部分的长度为14nt时(即为ncrRNA2时)Cas9酶切效率最高，体外酶切效果达89.2％，细胞内酶切效果达29.4％；作为tracrRNA的RNA-1的长度为66nt时Cas9酶切效果为最优，体外酶切效果达90.7％，细胞内酶切效果达29.8％。另外，RNA-2经过修饰后，CRISPR/Cas9系统中的Cas9的酶切效果无明显变化。在RNA-2和RNA-1均可用于CRISPR/Cas9系统元件利用CRISPR/Cas9系统编辑目的DNA时，DNA的编辑不受细胞和目的DNA的影响，均可实现DNA的编辑，利用该系统还可以直接对动物体内DNA进行编辑，在利用该CRISPR/Cas9系统编辑DNA时，还可以通过利用多条序列不同的RNA-2提高编辑效率，利用稳定表达Cas9的细胞可以提高DNA编辑效率。本发明的RNA-2和RNA-1序列短，易于通过化学合成获得，有利于提升RNA的纯度和规模生产，并简化CRISPR/Cas9系统的制备与应用。另外化学合成的RNA元件无需质粒表达，规避了质粒构建的问题(如质粒间相容性、质粒载体承载能力、多个质粒体系构建困难等)，且更易于化学修饰，适宜体内应用)。表明，可以利用本发明的RNA-2和RNA-1作为CRISPR/Cas9系统中的crRNA和tracrRNA元件用于编辑目的DNA。
附图说明
图1为不同crRNA下Cas9的体外酶切效果。
图2为不同crRNA下Cas9的细胞内酶切效果。
图3为不同tracrRNA下Cas9的体外酶切效果。
图4为不同tracrRNA下Cas9的细胞内酶切效果。
图5为crRNA的修饰对Cas9的体外酶切效果的影响。
图6为crRNA的修饰对Cas9的细胞内酶切效果的影响。
图7为针对VEGFA基因的不同细胞系中的Cas9核酸酶切割效果。
图8为不同Oct4-E-T1-crRNA浓度的Cas9核酸酶切割效果。其中，800、400和200均为Oct4-E-T1-crRNA的浓度，单位均为nM。
图9为不同crRNA下Cas9核酸酶对EMX1基因DNA模板的体外切割效果。其中，E1R、E7F、Ee3F和E2F分别表示E1R-crRNA、E7F-crRNA、Ee3F-crRNA和E2F-crRNA。
图10为不同crRNA的Cas9核酸酶体外切割效果。其中，Beta-3-T1、Beta-3-T3和Beta-5-T3分别表示Beta-3-T1-crRNA、Beta-3-T3-crRNA和Beta-5-T3-crRNA。
图11不同crRNA下Oct4基因的细胞内切割效果。其中，E-T1、E-T2和E-T3分别表示Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA。
图12为不同Ee3F-crRNA用量下Cas9核酸酶对EMX1基因的细胞内切割效果。其中，400、200、100和50均为Ee3F-crRNA的用量，单位均为ng。
图13为不同crRNA下Cas9核酸酶对基因的细胞内切割效果。其中，Beta-3-T1、Beta-3-T3和Beta-5-T3分别表示Beta-3-T1-crRNA、Beta-3-T3-crRNA和Beta-5-T3-crRNA。
图14为小鼠细胞(C2C12)和小鼠体内(in vivo)VEGFA基因切割效果。
图15为TP53片段的启动子和外显子区域细胞内切割效果。
图16为TP53片段的启动子和外显子区域体外切割效果。
图17为多条crRNA下Cas9核酸酶对Oct4基因的体外切割效果。其中，Mix表示Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA共同的实验结果，ET2表示Oct4-E-T2-crRNA。
图18为多条crRNA下Cas9核酸酶对Oct4基因的细胞内切割效果。其中，Mix表示Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA共同的实验结果，ET2表示Oct4-E-T2-crRNA。
图19为不同Cas9供体的酶切效果。
图20为不同Cas9浓度的酶切效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
表1、试剂来源
Figure BDA0001312756370000071
其中Cas9核酸酶的序列为NCBI上Genbank ID：AQM52323.1所示的序列。该蛋白质来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。
下述实施例中的Cas9-293T细胞、Cas9-HeLa细胞、Cas9-THP-1细胞和Cas9-HUVEC细胞为利用广州易锦生物技术有限公司的Genome-TALERTM&Genome-CRISPRTM人类AAVS1Safe Harbor基因敲入试剂盒(Catalog#SH-AVS-K100)分别向293T细胞、HeLa细胞、THP-1细胞和HUVEC细胞中导入Cas9的编码基因得到的细胞。
表2、引物序列表
Figure BDA0001312756370000072
Figure BDA0001312756370000081
实施例1、用于DNA编辑的CRISPR/Cas9系统元件的制备
本实施例提供了用于DNA编辑的CRISPR/Cas9系统元件为crRNA和tracrRNA。
crRNA为式Ⅰ所示RNA；
Nx-ncrRNA
式Ⅰ；
其中，N为核糖核苷酸和核糖核苷酸修饰物中的任一种，核糖核苷酸为A、U、C和G中的任一种，核糖核苷酸修饰物为对A、U、C或G进行2′-O-甲基修饰或胆固醇修饰得到的物质；
x为N的个数，x为20；
ncrRNA为ncrRNA1、ncrRNA2、ncrRNA2y、ncrRNA3和ncrRNA4中的任一种；
ncrRNA1为序列表中SEQ ID NO.1所示的RNA；
ncrRNA2为序列表中SEQ ID NO.2所示的RNA；
ncrRNA2y为分别对ncrRNA2的5′端始的第10、11和13位核苷酸进行2′-O-甲基修饰得到的物质；
ncrRNA3为序列表中SEQ ID NO.3所示的RNA；
ncrRNA4为序列表中SEQ ID NO.4所示的RNA。
tracrRNA为tracrRNA1、tracrRNA2、tracrRNA3和tracrRNA4；
tracrRNA1为序列表中SEQ ID NO.5所示的RNA；
tracrRNA2为序列表中SEQ ID NO.6所示的RNA；
tracrRNA3为序列表中SEQ ID NO.7所示的RNA；
tracrRNA4为序列表中SEQ ID NO.8所示的RNA。
序列表中各序列的第1位均为该条序列的5′末端。
实施例2、不同ncrRNA长度对DNA编辑效率的影响
一、体外酶切检测
1、DNA模板制备
以293T细胞基因组DNA为模板,使用Phusion酶(即Phusion High-Fidelity DNAPolymerase)进行二次PCR扩增得到VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)靶基因片段，即DNA模板。第一次PCR扩增所用引物为VEGFA-F1/VEGFA-R1，第二次PCR扩增以第一次PCR扩增产物为模板利用引物VEGFA-F3/VEGFA-R3进行扩增，第二次PCR扩增产物(即DNA模板)长度为485bp。
2、Cas9体外酶切
将Cas9核酸酶，10×Cas9buffer，crRNA，tracrRNA和H2O混匀，37℃孵育15min，之后加入步骤1的DNA模板，混匀后37℃孵育70min，反应体系具体如表3所示。以用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。其中，crRNA为VEGFA-crRNA1、VEGFA-crRNA2、VEGFA-crRNA3和VEGFA-crRNA4，每个反应体系一种crRNA，VEGFA-crRNA1、VEGFA-crRNA2、VEGFA-crRNA3和VEGFA-crRNA4的结构式如实施例1式Ⅰ所示，Nx部分相同，ncrRNA分别为实施例1的ncrRNA1、ncrRNA2、ncrRNA3和ncrRNA4，Nx的序列均为：5′-CCACAGGGAAGCUGGGUGAA-3′，该序列与VEGFA基因的部分序列互补；tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。
表3、Cas9的体外酶切反应体系
试剂 体积 终浓度
Cas9核酸酶(1.2μM) 2.5μl 100nM
10×Cas9Buffer 3μl 1×
crRNA(4μM) 3μl 400nM
tracrRNA(4μM) 3μl 400nM
DNA模板 2μl(192ng) 20nM
H<sub>2</sub>O 16.5μl ——
总计 30μl ——
3、磁珠纯化
1)将步骤2的酶切产物30μl转至EP管中；
2)将两倍体积的磁珠与EP管中的样品涡旋震荡充分混匀，静置5-10min；
3)将EP管放置磁力架上，待磁珠全都吸附到侧壁时，吸走上清；
4)向EP管中加入200μl 80％(体积百分比)的乙醇水溶液，洗脱磁珠；
5)吸走上清液，室温下静置3-5min，待贴壁的磁珠干燥到出现裂痕时，加入20μl水溶解；
6)将加水后的EP管从磁力架拿出，静置3-5min；
7)EP管放回磁力架，上清即回收样品。
4、Agilent2200核酸自动化电泳系统检测
取1-2μl样品和等体积染料上机检测。
5、酶切结果
(1)计算方法
Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到DNA片段分布和浓度结果，利用计算公式得出酶切效率。
计算公式：
Figure BDA0001312756370000101
f(cut)＝(b+c)/(a+b+c)；a为未切开的片段的摩尔浓度(pmol/l)，b、c分别为切开的片段的摩尔浓度(pmol/l)。
(2)结果分析
图1表明crRNA长度为32nt(VEGFA-crRNA1)、34nt(VEGFA-crRNA2)、36nt(VEGFA-crRNA3)和38nt(VEGFA-crRNA4)时，包括crRNA、tracrRNA、Cas9的体外酶切体系可将485bp的DNA模板切开。crRNA长度为34nt时，Cas9酶切效果为最优(Indel％为89.2％)，即当ncrRNA部分的长度为14nt时(即为ncrRNA2时)Cas9酶切效率最高。
二、Cas9细胞内酶切检测
1、细胞转染
(1)Cas9-293T细胞以37℃，5％CO2为培养条件，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在培养箱内培养。其中，Cas9-293T细胞通过基因编辑，稳定导入了Cas9核酸酶的编码基因，能表达Cas9核酸酶(序列为NCBI上Genbank ID：AQM52323.1所示的序列)。
(2)转染前一天将稳定表达Cas9核酸酶的Cas9-293T细胞细胞铺板于24孔板中。
(3)调整细胞密度为4×104-5×104个/mL左右，利用lipo2000(Lipofectamine2000)转染crRNA和tracrRNA。其中crRNA为步骤一的VEGFA-crRNA1、VEGFA-crRNA2、VEGFA-crRNA3和VEGFA-crRNA4，每个反应体系一种crRNA，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。以用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。具体方法如下：
A.取50μl opti-MEM培养基于1.5ml EP管中，加入1μl lipo2000，轻轻混匀，室温静置5min；
B.取50μl opti-MEM培养基于1.5ml EP管中，加入200ng crRNA和300ngtracrRNA，充分混匀；
C.将A和B中得到的溶液混合，室温静置20min；
D.将(1)中24孔培养板中培养基吸出一部分，孔中剩余培养基在300μl左右，将C得到的溶液加入培养孔中混匀；
E.3-6h后向培养孔中补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基至1ml，细胞放回培养箱培养48h后提取细胞基因组DNA。
2、细胞基因组DNA提取
(1)按照TIANGEN血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果和测定DNA浓度及纯度。
3、巢式PCR扩增目的DNA片段
(1)巢式PCR扩增
使用Phusion酶扩增VEGFA靶基因。第一次PCR扩增所用引物为VEGFA-F1/VEGFA-R1，第二次PCR扩增以第一次PCR扩增产物为模板利用引物VEGFA-F3/VEGFA-R3进行扩增。
(2)步骤(1)得到的第二次的PCR产物退火，退火产物直接用于下一步酶切。
退火体系如下，其中buffer2为T7Endonuclease I(NEB，货号：M0302L)：
Figure BDA0001312756370000102
PCR仪上进行退火反应，退火条件如下：
Figure BDA0001312756370000111
4、T7EI酶切效率检测
使用NEB T7核酸内切酶I(T7EI)进行酶切步骤3的退火产物，37℃孵育40min后，加1μl蛋白酶K，37℃孵育5min。
酶切体系(20μl)：
Figure BDA0001312756370000112
5、电泳检测
酶切样品用于Agilent2200核酸自动化电泳系统检测。
6、酶切结果
(1)计算方法同步骤一。
(2)分析
结果如图2，结果表明，crRNA长度为32nt(VEGFA-crRNA1)、34nt(VEGFA-crRNA2)、36nt(VEGFA-crRNA3)和38nt(VEGFA-crRNA4)时，Cas9均可将485bp的目的DNA的目的片段切开。crRNA长度为34nt时，Cas9酶切效果为最优(Indel％为29.4％)，即当ncrRNA部分的长度为14nt时(即为ncrRNA2时)Cas9酶切效率最高。
实施例3、不同tracrRNA长度对DNA编辑效率的影响
一、体外酶切检测
1、方法
按照实施例2步骤一的方法分别检测crRNA为VEGFA-crRNA5，tracrRNA分别为实施例1的tracrRNA1、tracrRNA2、tracrRNA3和tracrRNA4时，包括crRNA、tracrRNA、Cas9的体外酶切体系的酶切效率，每种反应体系一种tracrRNA，并利用水替换tracrRNA作为阴性对照(neg.)。
其中，VEGFA-crRNA5的序列为UGACUGCCGUCUGCACACCC GUUUUAGAGCUAUG(SEQ IDNO.28)。
2、结果
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果(图3)，可得出结论：tracrRNA长度为64nt(tracrRNA1)、66nt(tracrRNA2)、68nt(tracrRNA3)和70nt(tracrRNA4)时，Cas9均可将485bp的DNA模板切开。从Indel％结果中可知，tracrRNA长度为66nt时(即为tracrRNA2时)，Cas9酶切效果为最优，Indel％为90.7％。
二、细胞内酶切检测
1、方法
按照实施例2步骤二的方法分别检测crRNA为步骤一的VEGFA-crRNA5，tracrRNA分别为实施例1的tracrRNA1、tracrRNA2、tracrRNA3和tracrRNA4时，Cas9的酶切效率，每种反应体系一种tracrRNA，并利用水替换tracrRNA作为阴性对照(neg.)。
2、结果
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果(图4)，可得出结论：tracrRNA长度为64nt(tracrRNA1)、66nt(tracrRNA2)、68nt(tracrRNA3)和70nt(tracrRNA4)时，Cas9均可将485bp的目的片段切开。从Indel％结果中可看出，tracrRNA长度为66nt时(即为tracrRNA2时)，Cas9酶切效果为最优，Indel％为29.8％。
实施例4、不同修饰的酶切检测
一、体外酶切检测
1、方法
以293T细胞基因组为模板,扩增靶基因VEGFA片段，具体方法同实施例一。
按照实施例2步骤一的方法分别检测crRNA分别为VEGFA-crRNA2-1和VEGFA-crRNA2-2，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2时，包括crRNA、tracrRNA、Cas9的体外酶切体系的酶切效率，每个反应体系一种crRNA。利用实施例2的VEGFA-crRNA2作为对照，利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。
其中，VEGFA-crRNA2-1为对实施例3的crRNA5的第2位、第30位、第31位和第33位进行2′-O-甲基修饰得到的物质，具体如下：
UGmACUGCCGUCUGCACACCCGUUUUAGAGCmUmAUmG，m表示2′-O-甲基修饰；
VEGFA-crRNA2-2为对crRNA2进行胆固醇修饰得到的物质，具体如下：
Chol-UGACUGCCGUCUGCACACCCGUUUUAGAGCUAUG，Chol表示胆固醇修饰。
2、结果
Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，从图5可知当对crRNA进行化学修饰(甲基化修饰VEGFA-crRNA2-1,胆固醇修饰VEGFA-crRNA2-2)后，Cas9核酸酶均可将485bp的目的片段切开，与VEGFA-crRNA2相比酶切效率无明显变化。
二、细胞内酶切检测
1、方法
按照实施例2步骤二的方法分别检测crRNA分别为步骤一的VEGFA-crRNA2-1和VEGFA-crRNA2-2，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2时，Cas9的酶切效率，每个反应体系一种crRNA。利用实施例2的VEGFA-crRNA2作为对照，利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。
2、结果
Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，从图6可知当对crRNA进行化学修饰(甲基化修饰VEGFA-crRNA2-1,胆固醇修饰VEGFA-crRNA2-2)后，均可将485bp的DNA模板切开，与VEGFA-crRNA2相比酶切效率无明显变化。
实施例5、不同细胞系酶切检测
1、方法
按照实施例2步骤二的方法，将Cas9-293T细胞分别替换为Cas9-HeLa细胞、Cas9-THP-1细胞和Cas9-HUVEC细胞，其他步骤均不变，检测不同细胞系对Cas9酶切效率的影响，每个反应体系一种细胞。所用crRNA为实施例2的VEGFA-crRNA2，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2，利用H2O替换tracrRNA作为阴性对照(neg.)。
2、结果
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，从图7可知在不同类型的细胞系中，crRNA与tracrRNA转染后Cas9核酸酶均可将目的片段切开，并且各阴性对照的结果也显示阴性对照的酶切效率均为0。
实施例6、不同基因的酶切效率检测
靶基因：Oct4(organic cation/carnitine transporter4)基因、EMX1(Emptyspiracles homeobox 1)基因、Beta-3基因和Beta-5基因，其中Beta-3和Beta-5均为β地中海贫血基因，Beta-3基因含有β地中海贫血基因突变位点CD17(HBB:c.52A>T)，Beta-5基因含有β地中海贫血基因突变位点CD17(HBB:c.52A>T)。
Oct4基因所用crRNA为Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。crRNA的结构如实施例1式Ⅰ所示，各crRNA的ncrRNA部分相同，均为实施例1的ncrRNA2，Nx部分不同，各crRNA的序列如下：
Oct4-E-T1-crRNA：GGUUAUUUCUAGAAGUUAGG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.13)
Oct4-E-T2-crRNA：CUUCUACAGACUAUUCCUUG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.14)
Oct4-E-T3-crRNA：GGAAAGGGGAGAUUGAUAAC GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.15)。
EMX1基因所用crRNA为E1R-crRNA、E7F-crRNA、Ee3F-crRNA和E2F-crRNA，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。crRNA的结构如实施例1式Ⅰ所示，各crRNA的ncrRNA部分相同，均为实施例1的ncrRNA2，Nx部分不同，各crRNA的序列如下：
E1R-crRNA：AAGGCCGUGCGGAUCCGCUU GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.16)
E7F-crRNA：AGGUCCGACGUGUUGGAGUG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.17)
Ee3F-crRNA：CGAUGUCACCUCCAAUGACU GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.18)
E2F-crRNA：UCUCGCCCUCGCAGCUGCUG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.19)
Beta-3基因所用crRNA为Beta-3-T1-crRNA和Beta-3-T3-crRNA，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。crRNA的结构如实施例1式Ⅰ所示，各crRNA的ncrRNA部分相同，均为实施例1的ncrRNA2，Nx部分不同，各crRNA的序列如下：
Beta-3-T1-crRNA：GUGUGGCAAAGGUGCCCUUG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.20)
Beta-3-T3-crRNA：ACCAAUAGAAACUGGGCAUG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.21)
Beta-5基因所用crRNA为Beta-5-T3-crRNA，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。crRNA的结构如实施例1式Ⅰ所示，序列如下：
Beta-5-T3-crRNA：CGUAAAUACACUUGCAAAGG GUUUUAGAGCUAUG。(SEQ ID NO.22)
一、体外酶切检测
1、DNA模板制备
以293T细胞基因组为模板，扩增靶基因Oct4基因、EMX1基因、Beta-3基因和Beta-5基因的片段，即DNA模板。
Oct4基因DNA模板第一次扩增所用引物为Oct4-outer-F1和Oct4-outer-R1，第二次扩增所用引物为Oct4-inner-F1和Oct4-inner-R1。
EMX1基因DNA模板为EMX1-E2F、EMX1-E1R、EMX1-E7F和EMX1-Ee3F，各模板所用引物如下：
EMX1-E2F：DNA模板第一次扩增所用引物为E1-1R/2F-WF/NF和E1-1R/2F-WR，第二次扩增所用引物为E1-1R/2F-WF/NF和E1-1R/2F-NR。
EMX1-E1R：DNA模板第一次扩增所用引物为E1-1R/2F-WF/NF和E1-1R/2F-WR，第二次扩增所用引物为E1-1R/2F-WF/NF和E1-1R/2F-NR。
EMX1-E7F：DNA模板第一次扩增所用引物为E1-7-F-WF和E1-7-F-WR，第二次扩增所用引物为E1-7-F-NF和E1-7-F-NR。
EMX1-Ee3F:DNA模板第一次扩增所用引物为E1-e3F-WF和E1-e3F-WR，第二次扩增所用引物为E1-e3F-NF和E1-e3F-NR。
Beta-3基因DNA模板第一次扩增所用引物为Beta-outer-F1和Beta-outer-R1，第二次扩增所用引物为Beta3-inner-F1和Beta3-inner-R1。
Beta-5基因DNA模板第一次扩增所用引物为Beta-outer-F1和Beta-outer-R1，第二次扩增所用引物为Beta5-inner-F1和Beta5-inner-R1。
2、Cas9体外酶切
按照实施例2步骤一中2-5的方法，利用含有crRNA、tracrRNA和Cas9的体外酶切体系对步骤1的各DNA模板进行酶切，每个反应体系一种crRNA。利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。
2.1Oct4基因
检测Oct4-E-T1-crRNA在不同浓度(200nM、400nM和800nM)下的Cas9的体外酶切体系的酶切效率，各体系中tracrRNA的浓度随crRNA浓度的不同而不同，保持同一反应体系中tracrRNA的浓度与crRNA浓度相同，其他物质的浓度均同表3。
结果显示，Oct4-E-T1-crRNA在浓度为200nM、400nM和800nM时Cas9均可将Oct4基因DNA模板切开(图8)。
2.2EMX1基因
检测不同crRNA(E1R-crRNA、E7F-crRNA、Ee3F-crRNA和E2F-crRNA)的Cas9的体外酶切EMX1基因DNA模板的酶切效率，EMX1基因DNA模板EMX1-E2F、EMX1-E1R、EMX1-E7F和EMX1-Ee3F对应的crRNA分别为E2F-crRNA、E1R-crRNA、E7F-crRNA和Ee3F-crRNA，各体系均同表3。
结果显示，不同的crRNA均可将EMX1基因DNA模板切开(图9)。
2.3Beta-3基因和Beta-5基因
检测Beta-3-T1-crRNA和Beta-3-T3-crRNA存在下Cas9的体外酶切Beta-3基因DNA模板的酶切效率，以及Beta-5-T3-crRNA存在下Cas9的体外酶切Beta-5基因DNA模板的酶切效率。
结果显示，Beta-3-T1-crRNA和Beta-3-T3-crRNA存在下Cas9均可将Beta-3基因DNA模板切开，Beta-5-T3-crRNA存在下Cas9可将Beta-5基因DNA模板切开(图10)。
二、细胞内酶切检测
按照实施例2步骤二的方法，检测Cas9核酸酶对Oct4基因、EMX1基因、Beta-3基因和Beta-5基因的酶切效率，每个反应体系一种crRNA。利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。
Oct4基因所用crRNA为Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA，方法均同实施例2步骤二。在巢式PCR扩增目的DNA片段中，Oct4基因所用引物为：第一次扩增所用引物为Oct4-outer-F1和Oct4-outer-R1，第二次扩增所用引物为Oct4-inner-F1和Oct4-inner-R1。结果显示，不同的crRNA存在下Cas9核酸酶均可将Oct4基因切开(图11)。
EMX1基因所用crRNA为Ee3F-crRNA，Ee3F-crRNA的用量分别为50ng、100ng、200ng、400ng，保持同一反应体系中tracrRNA的浓度与crRNA浓度相同，其余物质用量及方法均同实施例2步骤二。在巢式PCR扩增目的DNA片段中，EMX1基因所用引物为：第一次扩增所用引物为E1-e3F-WF和E1-e3F-WR，第二次扩增所用引物为E1-e3F-NF和E1-e3F-NR。结果显示，不同crRNA的用量下Cas9核酸酶均可将EMX1基因切开(图12)。
Beta-3基因所用crRNA为Beta-3-T1-crRNA和Beta-3-T3-crRNA，Beta-5基因所用crRNA为Beta-5-T3-crRNA，方法均同实施例2步骤二。在巢式PCR扩增目的DNA片段中，Beta-3基因所用引物为：第一次扩增所用引物为Beta-outer-F1和Beta-outer-R1，第二次扩增所用引物为Beta3-inner-F1和Beta3-inner-R1；Beta-5基因所用引物为：第一次扩增所用引物为Beta-outer-F1和Beta-outer-R1，第二次扩增所用引物为Beta5-inner-F1和Beta5-inner-R1。结果显示，Beta-3-T1-crRNA和Beta-3-T3-crRNA存在下Cas9核酸酶均可将Beta-3基因切开，Beta-5-T3-crRNA存在下Cas9核酸酶可将Beta-5基因切开(图13)。
实施例7、小鼠基因组VEGFA基因酶切检测
一、细胞内酶切检测
按照实施例2步骤二的方法，将Cas9-293T细胞替换为含有Cas9的C2C12小鼠成肌细胞，其他步骤均不变，检测含有Cas9的C2C12小鼠成肌细胞中Cas9对VEGFA基因酶切效率的影响，所用crRNA为经过修饰的的VEGFA-crRNA6，即VEGFA-crRNA6-1，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。
VEGFA-crRNA6：AAGAGGAGAGGGGGCCGCAG GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.29)，
VEGFA-crRNA6-1为对VEGFA-crRNA6的第2位、第30位、第31位和第33位进行2′-O-甲基修饰得到的物质，具体如下：
AAmGAGGAGAGGGGGCCGCAG GUUUUAGAGCmUmAUmG，m表示2′-O-甲基修饰。
含有Cas9的C2C12小鼠成肌细胞的制备方法如下：
1、Lipo2000转染质粒PX260
(1)取50μl opti-MEM培养基于1.5ml EP管中，加入1μl lipo2000，混匀后室温静置5min；
(2)取50μl opti-MEM培养基于1.5ml EP管中，加入1μg PX260质粒，混匀；
(3)混合(1)和(2)中得到的溶液，室温静置20min；
(4)将培养C2C12小鼠成肌细胞的24孔培养板中培养基吸出一部分，孔中剩余培养基在300-500μl左右，将(3)的样品加入培养孔中，3-6h后向培养孔中补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基至1ml，细胞放回培养箱培养。
2、质粒转染24h后Lipo2000转染crRNA和tracrRNA，转染方法同实施例2步骤一中1的(3)。
二、C57bl/6小鼠体内(in vivo)酶切检测
1、C57bl/6小鼠体内转染：
(1)C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)注射戊巴比妥钠麻醉：30mg/kg静脉或腹腔注射。
(2)制剂混合
将5μg Cas9质粒(即PX260)、4μM crRNA(20μl)和4μM tracrRNA(20μl)溶解在200μl的生理盐水中，震荡混匀。加入6μl转染试剂(即TurboFect in vivo TransfectionReagent)后充分混合。将上述混合液在室温放置15-20分钟，作为转染制剂注射肌肉。所用crRNA为经过修饰的的VEGFA-crRNA6，即VEGFA-crRNA6-1，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。
2.2小鼠肌肉注射
向小鼠股二头肌注射步骤2.1的转染制剂200μl。
2.3小鼠肌肉组织基因组DNA提取
转染后7天用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒提取股二头肌基因组DNA。
2.4巢式PCR扩增目的DNA片段
方法同实施例2步骤二中3。所用引物为VEGFA-outer-F1(小鼠)、VEGFA-outer-R1(小鼠)、VEGFA-inner-F1(小鼠)和VEGFA-inner-R1(小鼠)。
2.5T7EI酶切效率检测
使用NEB T7核酸内切酶I(T7EI)进行酶切，具体方法同实施例2步骤二中4。
2.6电泳检测
酶切样品用于Agilent2200核酸自动化电泳系统检测。
3、结果分析
计算方法同实施例2。
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，可知在小鼠中，crRNA、tracrRNA、和Cas9质粒导入小鼠细胞或小鼠体内，均可将526bp目的DNA目的片段切开为2条DNA链(图14)。
实施例8、启动子、外显子酶切检测
检测TP53(tumor protein p53)基因和外显子的酶切效率，所用crRNA分别为TP53-P-T1、TP53-P-T2、TP53-E-T1、TP53-E-T2和TP53-E-T3，每个反应体系一种crRNA，所用tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。所用crRNA的序列如下：
TP53-P-T1：CAAUUCUGCCCUCACAGCUC GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.23)
TP53-P-T2：CCCCAAAAUGUUAGUAUCUA GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.24)
TP53-E-T1：CCCUCCCAUGUGCUCAAGAC GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.25)
TP53-E-T2：UGGGAGCGUGCUUUCCACGA GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.26)
TP53-E-T3：CCAGUCUUGAGCACAUGGGA GUUUUAGAGCUAUG(SEQ ID NO.27)
(P表示启动子，E表示外显子)
一、体外酶切检测
1、DNA模板制备
以293T细胞基因组为模板，扩增靶基因TP53片段，即DNA模板。
第一次扩增所用引物为TP53-outer-FP和TP53-outer-RP，第二次扩增所用引物为TP53-inner-FP和TP53-inner-RP。
2、Cas9体外酶切
按照实施例2步骤一中2-5的方法，利用含有crRNA、tracrRNA和Cas9的体外酶切体系对步骤1的DNA模板进行酶切。
二、细胞内酶切检测
按照实施例2步骤二的方法，检测Cas9核酸酶对TP53片段的酶切效率。利用H2O替换crRNA作为阴性对照(neg.)。
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，从图15-图16可知，crRNA、tracrRNA、Cas9核酸酶系统可将TP53片段的启动子和外显子区域切开。
实施例9、多条crRNA酶切检测
一、体外酶切检测
1、Cas9体外酶切
将Cas9核酸酶，10×Cas9buffer，crRNA，tracrRNA和H2O混匀，37℃孵育15min，之后加入DNA模板，混匀后37℃孵育70min。以用H2O替换为crRNA作为阴性对照(neg.)。DNA模板为实施例6的Oct4基因DNA模板，所用crRNA为Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA，tracrRNA为实施例1的tracrRNA2。Cas9体外酶切体系如下，该体系中含有三种crRNA，即含有Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA：
Figure BDA0001312756370000171
利用Oct4-E-T2-crRNA单独作为crRNA进行实验，作为对照，Oct4-E-T2-crRNA的浓度为400nM。
2、磁珠纯化
同实施例2步骤一中3。
3、Agilent2200核酸自动化电泳系统检测
同实施例2步骤一中4。
二、细胞内酶切检测
按照实施例2步骤二的方法，利用Oct4-E-T1-crRNA、Oct4-E-T2-crRNA和Oct4-E-T3-crRNA以及实施例1的tracrRNA2一起进行转染，crRNA6的用量均为66.7ng，tracrRNA2的用量为300ng。利用Oct4-E-T2-crRNA单独作为crRNA进行实验，作为对照，Oct4-E-T2-crRNA的用量为200ng。
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，从图17-18可知在crRNA用量一致的情况下，针对Oct 4基因的多条crRNA的酶切效率高于单条crRNA，体外和细胞分别提升了1倍和2倍以上。
实施例10、不同的Cas9供体的细胞酶切检测
一、稳定表达Cas9的细胞
Cas9供体为稳定表达Cas9的293T细胞，即Cas9-293T，具体方法同实施例2中一。所用crRNA和tracRNA分别为实施例2的crRNA2和实施例1的tracrRNA2。
2、Cas9质粒
Cas9供体为Cas9质粒(即PX260)。
2.1Lipo2000转染质粒PX260
(1)取50μl opti-MEM培养基于1.5ml EP管中，加入1μl lipo2000，混匀后室温静置5min；
(2)取50μl opti-MEM培养基于1.5ml EP管中，加入1μg PX260质粒，混匀；
(3)混合(1)和(2)中得到的溶液，室温静置20min；
(4)将培养293T细胞的24孔培养板中培养基吸出一部分，孔中剩余培养基在300-500μl左右，将(3)的样品加入培养孔中，3-6h后向培养孔中补加含有10％胎牛血清的DMEM培养基至1ml，细胞放回培养箱培养。
2.2质粒转染24h后Lipo2000转染crRNA和tracrRNA，转染方法同实施例2步骤一中1的(3)。所用crRNA和tracRNA分别为实施例2的crRNA2和实施例1的tracrRNA2。
按照实施例步骤二中2-6的方法，通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果，从图19可知正常的293T细胞中转染质粒表达Cas9，再转染crRNA和tracrRNA后同样可以酶切目的DNA片段，效率低于Cas9稳转细胞(Cas9-293T)。
实施例11、不同的Cas9浓度的体外酶切检测
1、方法
按照实施例2步骤一的方法分别检测包括crRNA、tracrRNA、不同浓度的Cas9的体外酶切体系的酶切效率。Cas9的浓度分别为20nM、100nM、200nM、400nM，其他组分含量同实施例2步骤一。
所用crRNA和tracRNA分别为实施例2的VEGFA-crRNA2和实施例1的tracrRNA2。
2、结果
通过Agilent2200核酸自动化电泳系统检测得到的DNA片段分布和浓度结果(图20)，可得出结论：蛋白浓度为20-400nM时，酶切效率均在50％以上；蛋白浓度为100-400nM时，酶切效率均在80％以上；蛋白浓度为100-200nM时，酶切效率在85％以上。
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
<120> 用于DNA编辑的系统及其应用
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
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guuuuagagc ua 12
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guuuuagagc uaug 14
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guuuuagagc uaugcu 16
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guuuuagagc uaugcugu 18
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uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60
uuuu 64
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gugcuuuu 68
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uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu 60
cggugcuuuu 70
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ccacagggaa gcugggugaa guuuuagagc ua 32
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ccacagggaa gcugggugaa guuuuagagc uaugcu 36
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gguuauuucu agaaguuagg guuuuagagc uaug 34
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cuucuacaga cuauuccuug guuuuagagc uaug 34
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ggaaagggga gauugauaac guuuuagagc uaug 34
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cgaugucacc uccaaugacu guuuuagagc uaug 34
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ucucgcccuc gcagcugcug guuuuagagc uaug 34
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guguggcaaa ggugcccuug guuuuagagc uaug 34
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accaauagaa acugggcaug guuuuagagc uaug 34
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cguaaauaca cuugcaaagg guuuuagagc uaug 34
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caauucugcc cucacagcuc guuuuagagc uaug 34
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ccccaaaaug uuaguaucua guuuuagagc uaug 34
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cccucccaug ugcucaagac guuuuagagc uaug 34
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ugggagcgug cuuuccacga guuuuagagc uaug 34
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ccagucuuga gcacauggga guuuuagagc uaug 34
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ugacugccgu cugcacaccc guuuuagagc uaug 34
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aagaggagag ggggccgcag guuuuagagc uaug 34

Claims (5)

1.用于VEGFA基因编辑的系统，包括下述N1）和N2）：
N1）名称为RNA-2的RNA；所述RNA-2为SEQ ID NO.9-12、SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29中至少一条序列所示的RNA；
N2）名称为RNA-1的RNA；所述RNA-1为SEQ ID NO.6所示的RNA。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述系统还包括Cas9核酸酶或与Cas9核酸酶相关的生物材料；
所述与Cas9核酸酶相关的生物材料为下述C1）至C7）中的任一种：
C1）编码Cas9核酸酶的核酸分子；
C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；
C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；
C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；
C5）含有C1）所述核酸分子的细胞系、或含有C2）所述表达盒的细胞系。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于：所述Cas9核酸酶来源于细菌。
4.根据权利要求2所述的系统，其特征在于：所述Cas9核酸酶来源于链球菌属、葡萄球菌属、罗氏菌属、奈瑟菌属、细小棒菌属或乳杆菌属。
5.编辑VEGFA基因的方法，包括：利用权利要求1-4中任一所述系统处理VEGFA基因实现所述VEGFA基因的编辑。
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