JP7068821B2 - 化学修飾を有するガイドｒｎａ - Google Patents

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本発明は、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）技術に関する。
天然原核生物のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、一定の長さの可変配列が介在する短いリピートのアレイ（すなわち、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）、または「ＣＲＩＳＰＲ」）およびＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質を含む。転写されたＣＲＩＳＰＲアレイのＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質のサブセットによって小さいガイドＲＮＡへプロセシングされ、これは、一般に、以下に論じられるような２つの成分を有する。少なくとも３つの異なるシステム、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型がある。ＲＮＡの成熟したｃｒＲＮＡへのプロセシングに関与する酵素は、３つのシステムで異なっている。天然原核生物のシステムでは、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）およびトランス作動性ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）と呼ばれる２つの短い非コーディングＲＮＡ種を含む。例示的なシステムでは、ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼと複合体を形成する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）およびｇＲＮＡの部分と相補的である配列であるプロトスペーサーを有する標的ポリヌクレオチド配列と結合する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体による標的ポリヌクレオチドの認識および結合は、標的ポリヌクレオチドの切断を誘導する。天然ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、原核生物において、ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体が、真核生物におけるＲＮＡｉと類似の方法で外因性遺伝要素を認識し、サイレンシングし、それによって、プラスミドおよびファージなどの外因性遺伝要素に対する耐性を付与する免疫システムとして機能する。
単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）は、天然に存在するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ間で形成された複合体と置き換わり得ることが実証されている。
ｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡの開発に関連する考慮として、特異性、安定性および機能性が挙げられる。特異性とは、特定のｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体の、所望の標的配列と結合し、および／またはそれを切断する能力を指し、所望の標的とは配列および／または位置が異なるポリヌクレオチドの結合および／または切断は、ほとんどまたは全く生じない。したがって、特異性とは、ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体のオフターゲット効果を最小化することを指す。安定性とは、ｇＲＮＡの、ヌクレアーゼなどの酵素ならびに細胞内および細胞外環境中に存在するその他の物質による分解に抵抗する能力を指す。したがって、核酸分解に対する抵抗性が増大し、標的ポリヌクレオチドに対する結合親和性が増大し、および／またはオフターゲット効果が低減し、それにもかかわらず、ｇＲＮＡ機能性を有するｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを提供する必要がある。ｇＲＮＡの開発に関連するさらなる考慮として、トランスフェクト能力および免疫賦活特性が挙げられる。したがって、細胞への、特に、真核細胞の核への効率的な滴定可能なトランスフェクト能力を有し、トランスフェクトされた細胞において最小の免疫賦活特性しか有さないか、または全く有さないｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを提供する必要性がある。ｇＲＮＡについての別の重要な考慮は、意図される細胞、組織、体液または生物中にそれを送達し、所望のｇＲＮＡ機能性を可能にするのに十分な期間、維持するための有効な手段を提供することである。
例示的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの模式的モデルを示す図のセットである。ここで示される例示的なシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼを有するＩＩ型システムである。この特定の例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列を認識する（ここで、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧの３ｎｔ配列であり、ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであるが、その他のＰＡＭ配列も存在するとわかっている）。ｓｇＲＮＡは、ガイド配列、ｃｒＲＮＡ配列またはセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはセグメントを含む。ｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流のＤＮＡ標的とハイブリダイズする。ここで示される例では、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列の上流の二本鎖切断を媒介する（矢印）。 図２Ａは、例示的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性切断アッセイを示す図である。図２Ｂは、図４におけるデータを作成するために使用される生化学的切断アッセイの成分およびその濃度を示す表である。 図２Ｃは、生化学的切断アッセイの化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９ヌクレアーゼの滴定を示す図である。図２Ｄは、生化学的切断アッセイの例示的ｓｇＲＮＡの滴定を示す図である。この実施例では、ｋａｎＣ１と名付けられたｓｇＲＮＡが、カナマイシンン耐性遺伝子中の相補的配列に標的化される。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで精製された成分を使用する生化学的切断アッセイの例示的条件および手順を示す図である。 切断アッセイにおいて例示的な修飾されたガイドＲＮＡを使用して得られたデータを示す表である。 切断アッセイにおいて例示的な修飾されたガイドＲＮＡを使用して得られたデータを示す表である。 図５Ａは、本願において開示された例示的ガイドＲＮＡを示す図である。図５Ｂは、本願において開示された例示的単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を示す図である。 少なくとも２つの化学修飾（例えば、第１の修飾および第２の修飾）を有する例示的ガイドＲＮＡを示す表である。各数字は、示されるような修飾を表し、各「ｘ」は、ガイドＲＮＡにおける修飾の組合せを示す。特定の実施形態では、単一ヌクレオチド上に、第１および第２の修飾が存在する。特定の実施形態では、別個のヌクレオチド上に、第１および第２の修飾が存在する。 少なくとも３つの化学修飾を有するガイドＲＮＡの例示的種類を示す図である。図７の下部は、いくつかの種類の修飾を列挙する。図７の上部の表は、二重修飾（「二重修飾（ｄｏｕｂｌｅ ｍｏｄ）」、２種の修飾の組合せ）を、単一修飾（「単一修飾（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｄ）」、１種の修飾）と組み合わせることができる方法を示す。「ｘ」は、ガイドＲＮＡ中の対応する二重修飾および単一修飾の存在を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のためのフルオロフォア修飾されたＣＬＴＡ１ ｓｇＲＮＡを示す図である。図８Ａでは、ＣＬＴＡ１のｓｇＲＮＡ ＲＮＡ配列が示されており、蛍光色素または標識が、ｓｇＲＮＡに結合され得る位置を示す。図８Ｂは、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）１５６，１－１５において報告されるようにＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体のＸ線結晶学（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｙ）によって決定される構造を示す。 ＣＴＬＡ１標的の特異性を改善する試みにおける、特定の位置（位置３、９および１１）での２－チオウリジンを用いて修飾されたＣＴＬＡ１ ｓｇＲＮＡｓを示す図である。 オフターゲット部位が、Ｕ－Ｇゆらぎ対形成を含む場合に、２－チオＵを用いて修飾されたｇＲＮＡが、ｇＲＮＡの標的特異性を増大し得ることを示す。特に、５’鎖中、１１番目の位置にＴからＣへの突然変異を有するＣＴＬＡ１＿２－チオＵ＋１１は、オフターゲット配列ＣＬＴＡ１ ＯＦＦ３のかなり少ない切断を有していた。 Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３４８：６２４２，１４７７－８１において報告されるような、Ｃａｓ９のアミノ酸との非共有結合相互作用を示す、ガイドＲＮＡスキャフォールド二次構造を示す図である。 Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９，９８５－９において報告されるように、高頻度のインデルおよび相同組換え(HR)でのヒト細胞株における遺伝子破壊が、本明細書において開示される合成された、および化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用して達成され得ることを示す実験結果を示す図である。 Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９，９８５－９において報告されるように、高頻度のインデルおよび相同組換え(HR)でのヒト細胞株における遺伝子破壊が、本明細書において開示される合成された、および化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用して達成され得ることを示す実験結果を示す図である。 Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９，９８５－９において報告されるように、本明細書において記載される化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用して、刺激された一次ヒトＴ細胞において、ならびにＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）において、高頻度の遺伝子破壊または標的化されたゲノム編集を達成できることを示す実験結果を示す図である。 Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９，９８５－９において報告されるように、本明細書において記載される化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用して、刺激された一次ヒトＴ細胞において、ならびにＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）において、高頻度の遺伝子破壊または標的化されたゲノム編集を達成できることを示す実験結果を示す図である。
本発明は、少なくとも幾分かは、ｇＲＮＡへの特定の化学修飾が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって許容されるという予期しない発見に基づいている。特に、ｇＲＮＡの安定性を増大する、ｇＲＮＡハイブリダイゼーション相互作用の熱安定性を変更する、および／またはＣａｓ：ｇＲＮＡ複合体形成のオフターゲット効果を低減すると考えられる特定の化学修飾は、標的ポリヌクレオチドのニッキングおよび／または切断に対するＣａｓ：ｇＲＮＡ結合の有効性を実質的に損なわない。さらに、特定の化学修飾は、細胞への、特に、真核細胞の核への効率的な滴定可能なトランスフェクト能力を有し、および／またはトランスフェクトされた細胞において最小の免疫賦活特性しか有さないか、または全く有さない、ｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを提供すると考えられる。特定の化学修飾は、意図される細胞、組織、体液または生物中に効率的に送達され、所望のｇＲＮＡ機能性を可能にするのに十分な期間、維持され得る、ｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを提供すると考えられる。
Ｉ．定義
本明細書において、用語「ガイドＲＮＡ」とは、一般に、Ｃａｓタンパク質と結合し、Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）内の特定の位置に標的化するのに役立ち得るＲＮＡ分子（または集合的にＲＮＡ分子の群）を指す。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含み得る。本明細書において、用語「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡセグメント」とは、ポリヌクレオチドを標的化するガイド配列、ステム配列、任意選択的に、５’－オーバーハング配列を含むＲＮＡ分子またはその一部を指す。本明細書において、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」とは、タンパク質結合セグメント（例えば、タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用可能である）を含むＲＮＡ分子またはその一部を指す。用語「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、同一ＲＮＡ分子中に位置する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を包含する。用語「ガイドＲＮＡ」とはまた、集合的に、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、別個のＲＮＡ分子中に位置する２種以上のＲＮＡ分子の群を包含する。
用語「スキャフォールド」とは、実質的に同一であるか、または天然の生物学的種にわたって高度に保存されている配列を含むガイドＲＮＡ分子の一部を指す。スキャフォールドは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント、およびｃｒＲＮＡセグメントの５’末端にまたはその付近にポリヌクレオチドを標的化するガイド配列以外のｃｒＲＮＡセグメントの一部を含み、天然ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡにおいて保存されない配列を含む任意の非天然部分を含まない。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはその類似体を指す。本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子およびガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは合成ＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含む。さらに、本明細書において、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖形態を含む。
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの関連において、用語「修飾」とは、これらに限定されないが、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾または３’末端修飾、（ｂ）塩基の置換または除去を含む、核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’および／または４’位での修飾を含む糖修飾ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または置換を含む骨格修飾を含む。用語「修飾されたヌクレオチド」とは、一般に、塩基、糖およびホスホジエステル連結またはヌクレオチドホスフェートを含む骨格部分のうち１種以上の化学構造への修飾を有するヌクレオチドを指す。
用語「Ｚ」および「Ｐ」とは、例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｎｅｗ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ”Ｙａｎｇ，Ｚ．，Ｈｕｔｔｅｒ，Ｄ．，Ｓｈｅｎｇ，Ｐ．，Ｓｉｓｍｏｕｒ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４，６０９５－１０１に記載されるような、Ｓｔｅｖｅｎ Ｂｅｎｎｅｒおよび共同研究者によって開発された、ヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体を指す。
Figure 0007068821000001
用語「ｘＡ」、「ｘＧ」、「ｘＣ」、「ｘＴ」または「ｘ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｔ）」および「ｙＡ」、「ｙＧ」、「ｙＣ」、「ｙＴ」または「ｙ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｔ）」とは、その内容が参照によって全文で本明細書に組み込まれる、Ｋｒｕｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡｓ：Ｔｏｗａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ”；Ａｎｄｒｅｗ Ｔ．Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｈａｉｇｅ Ｌｕ，Ａｌｅｘ Ｈ．Ｆ．Ｌｅｅ，ａｎｄ Ｅｒｉｃ Ｔ．Ｋｏｏｌ（２００７）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，４０，１４１－５０によって記載されるようなヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体を指す。
用語「構造不定の核酸」または「ＵＮＡ」とは、その内容が参照により全文で本明細書に組み込まれるＵＳ７３７１５８０に記載されるような、ヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体を指す。構造不定の核酸またはＵＮＡ、修飾はまた、「偽相補性」ヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体とも呼ばれる（例えば、Ｌａｈｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：１０，３４０９－１９を参照のこと）。
用語「ＰＡＣＥ」および「チオＰＡＣＥ」とは、それぞれ、ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸基を含有するヌクレオチド間ホスホジエステル連結類似体を指す。これらの修飾は、ホスホノカルボン酸部分、ホスホノカルボン酸エステル部分、チオホスホノカルボン酸部分およびチオホスホノカルボン酸エステル部分を含む広いクラスの化合物に属する。これらの連結は、それぞれ一般式Ｐ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＯＯＲおよび（Ｓ）－Ｐ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＯＯＲによって記載することができ、式中、ｎは、０～６の整数であり、Ｒ１およびＲ２の各々は独立に、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルからなる群から選択される。これらの修飾の一部は、その内容が参照により全文で本明細書に組み込まれるＹａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ｍ．Ｙａｍａｄａ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｊ．Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｖｉｎ Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：１５，５２５１－６１によって記載されている。
本明細書において、「修飾」とは、非修飾リボヌクレオチド、すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンリボヌクレオチドにおいて見られるものとは異なる化学部分または化学構造の一部を指す。用語「修飾」とは、修飾の種類を指し得る。例えば、「同一修飾」とは、同一種類の修飾を意味し、「修飾されたヌクレオチドが同一である」は、修飾されたヌクレオチドが、塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕなど）は異なり得るが、同一種類の修飾を有することを意味する。同様に、「２つの修飾」を有するガイドＲＮＡは、同一ヌクレオチド中にある場合もない場合もある２つの種類の修飾を有するガイドＲＮＡであり、各種類は、ガイドＲＮＡ中の複数のヌクレオチドに現れ得る。同様に、「３つの修飾」を有するガイドＲＮＡは、同一ヌクレオチド中にある場合もない場合もある３種の修飾を有するガイドＲＮＡであり、各種類は、複数のヌクレオチドに現れ得る。
本明細書において、用語「標的ポリヌクレオチド」または「標的」とは、標的核酸配列を含有するポリヌクレオチドを指す。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖である場合も二本鎖である場合もあり、特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡである。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである。本明細書において、「標的核酸配列」または「標的配列」とは、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して結合し、ニックを入れ、または切断するよう望む特定の配列またはその相補体を意味する。
用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、完全にまたは部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖が、適したハイブリダイゼーション条件下で一緒になって、２つの成分鎖が水素結合によって接合される二本鎖構造または領域を形成するプロセスを指す。本明細書において、用語「部分ハイブリダイゼーション」は、二本鎖構造または領域が、１つまたは複数のバルジまたはミスマッチを含有する場合を含む。水素結合は、通常、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシル（ＡとＴまたはＡとＵ）またはシトシンとグアニン（ＣとＧ）の間に形成するが、その他の非標準塩基対が形成し得る（例えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照のこと）。修飾されたヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを可能にする、または促進する水素結合を形成し得ることが考慮される。
用語「切断」または「切断すること」とは、ポリヌクレオチドのリボシルホスホジエステル骨格における共有ホスホジエステル連結の分断を指す。用語「切断」または「切断すること」は、一本鎖分断および二本鎖分断の両方を包含する。二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。
用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」とは、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片またはその突然変異体または変異体を指す。用語「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」とは、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質またはポリペプチド誘導体、例えば、１つまたは複数の点突然変異、挿入、欠失、末端切断、融合タンパク質またはそれらの組合せを有するタンパク質を指す。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に保持する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ヌクレアーゼドメインの一方または両方が不活性であるように突然変異されている。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ヌクレアーゼ活性を有する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、その野生型対応物のヌクレアーゼ活性の一部またはすべてを欠く。
Ｃａｓタンパク質の用語「ヌクレアーゼドメイン」とは、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有するタンパク質内のポリペプチド配列またはドメインを指す。ヌクレアーゼドメインは、単一ポリペプチド鎖中に含有され得、または切断活性は、２種（またはそれを超える）ポリペプチドの会合に起因し得る。単一ヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の２つ以上の単離されたアミノ酸のストレッチからなり得る。これらのドメインの例として、ＲｕｖＣ様モチーフ（配列番号１中のアミノ酸７－２２、７５９－７６６および９８２－９８９）およびＨＮＨモチーフ（ａａ８３７－８６３）が挙げられる。Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：３９，Ｅ２５７９－Ｅ２５８６およびＷＯ２０１３１７６７７２を参照のこと。
「ｇＲＮＡ機能性」を有する合成ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と会合するなどの天然に存在するガイドＲＮＡの機能またはＣａｓタンパク質と関連してガイドＲＮＡによって実施される機能のうち１つまたは複数を有するものである。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを結合することを含む。特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、標的ポリヌクレオチドに標的化することを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質と会合することまたはそれと結合することを含む。特定の実施形態では、機能性は、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質を有する人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、Ｃａｓタンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡの任意のその他の公知の機能である。特定の実施形態では、機能性は、天然ガイドＲＮＡの任意のその他の機能である。合成ガイドＲＮＡは、天然に存在するガイドＲＮＡより大きなまたは小さな程度にｇＲＮＡ機能性を有し得る。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、同様の天然に存在するガイドＲＮＡとの比較において、ある特性についてより大きな機能性を、別の特性についてより小さな機能性を有し得る。
「一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質」とは、野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、ｄｓＤＮＡの２つの鎖のうち一方を切断する能力が低減した、Ｃａｓ突然変異体またはＣａｓ変異体を含むＣａｓタンパク質を指す。例えば、特定の実施形態では、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（またはＨＮＨドメイン）の機能を低減し、結果として、標的ＤＮＡの一方の鎖を切断する能力を低減する突然変異（例えば、アミノ酸置換）を有する。このような変異体の例は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｈ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａおよび／またはＮ８６３Ａ置換を含み、また、その他の種のＣａｓ９酵素中の同等の部位での同一または同様の置換を含む。
本明細書において、用語、配列の「一部」または「断片」とは、完全配列よりも小さい配列の任意の一部（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を指す。ポリヌクレオチドの一部は、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００または５００またはそれを超えるヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列の一部は、ガイド配列の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、例えば、ガイド配列の３分の１またはそれより短い、例えば、７、６、５、４、３または２ヌクレオチドの長さであり得る。
分子との関連において、用語「に由来する」とは、親分子または親分子に由来する情報を使用して単離された、または作製された分子を指す。例えば、Ｃａｓ９単一突然変異体ニッカーゼおよびＣａｓ９二重突然変異体ヌル－ヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質に由来する。
２種以上のポリヌクレオチド（または２種以上のポリペプチド）との関連において、用語「実質的に同一の」とは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって最大対応を求めて比較されアラインされた場合に、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約９０～９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超えるヌクレオチド（またはアミノ酸）配列同一性を有する配列または部分配列を指す。好ましくは、ポリヌクレオチド間の「実質的な同一性」は、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さの、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約２００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約３００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約５００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドの領域にわたって、またはポリヌクレオチドの全長にわたって存在する。好ましくは、ポリペプチド間の「実質的な同一性」は、少なくとも約５０個のアミノ酸残基の長さの、少なくとも約１００個のアミノ酸残基の長さのポリペプチドの領域にわたって、またはポリペプチドの全長にわたって存在する。
本明細書において開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。また、その範囲の上限と下限の間に介在する値は各々、下限の単位の少数第１位まで、具体的に考慮されることが理解される。述べられた範囲によって包含される、より小さい範囲または介在する値も各々、具体的に考慮される。用語「約」とは、一般に、示された数のプラスまたはマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示し得、「約２０」は、１８～２２を意味し得る。四捨五入することなど、「約」のその他の意味は、文脈から明らかとなり得、そのため、例えば、「約１」は、０．５～１．４を意味することもある。
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ媒介性配列特異的結合および／または切断
図１に示されるものは、ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性配列特異的切断の図である。ガイドＲＮＡは、５’ドメイン内の例示的な２０ヌクレオチド（２０ｎｔ）ガイド配列を有するｓｇＲＮＡ（その他のガイド配列は、例えば、約１５～約３０ｎｔの長さであり得る）、内部に位置する塩基対形成しているステムおよび３’ドメインとして表されている。ガイド配列は、ＤＮＡ標的中の例示的な２０ｎｔ標的配列に対して相補的である。ステムは、ｃｒＲＮＡ中のリピート配列に対応し、ｔｒａｃｒＲＮＡ中の配列に対して相補的である。ガイドＲＮＡの３’ドメインは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと結合するｔｒａｃｒＲＮＡの３’ドメインに対応する。Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡ配列またはＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列のすぐ上流のプロトスペーサーと結合し、切断する。図１では、３ｎｔのＰＡＭ配列が例示されているが、４ｎｔおよび５ｎｔのＰＡＭ配列を含むその他のＰＡＭ配列が公知である。図１に例示されるシステムでは、ＤＮＡ中の標的配列の両鎖が、矢印によって示される部位でＣａｓ９によって切断される。
ＩＩＩ．ガイドＲＮＡ
少なくとも１つの態様では、本発明は、ガイドＲＮＡ機能性を有する化学修飾されたガイドＲＮＡを含む。非天然であるか天然であるかに関わらず４種の標準リボヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ以外の任意のヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、イノシンまたはデオキシヌクレオチド）を含むガイドＲＮＡは、化学修飾されたガイドＲＮＡである。同様に、天然ホスホジエステルヌクレオチド間連結以外の任意の骨格またはヌクレオチド間連結を含むガイドＲＮＡは、化学修飾を有し、従って、化学修飾されたガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、保持される機能性として、Ｃａｓタンパク質と結合することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、標的ポリヌクレオチドと結合することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を、標的ポリヌクレオチドに標的化することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって標的ポリヌクレオチドにニックを入れることが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって標的ポリヌクレオチドを切断することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性は、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質を有する人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、Ｃａｓタンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡの任意のその他の公知の機能である。特定の実施形態では、保持される機能性は、天然ガイドＲＮＡの任意のその他の機能である。
Ａ．例示的修飾
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれるヌクレオチド糖修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）などの２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）などの２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－フルオロ（「２’－Ｆ」）、２’－アミノ（「２’－ＮＨ２」）、２’－アラビノシル（「２’－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（「２’－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２’－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）および４’－チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれるヌクレオチド間連結修飾は、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ））、ホスホノ酢酸「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））などのホスホノカルボン酸（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、チオホスホノ酢酸「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））などのチオホスホノカルボン酸（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）などのアルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））およびジチオリン酸（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる核酸塩基（「塩基」）修飾は、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、構造不定の核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「イソＧ」）、イソシトシン（「イソＣ」）［“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｉｎｔｏ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｐｈａｂｅｔ．”Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，Ｊ．Ａ．；Ｋｒａｕｃｈ，Ｔ．；Ｍｏｒｏｎｅｙ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３，３３に記載されるような］、５－メチル－２－ピリミジン［Ｒａｐｐａｐｏｒｔ，Ｈ．Ｐ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，３０４７に記載されるような］、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）およびｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、１種または複数の同位体的修飾が、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル連結および／またはヌクレオチドホスフェート上に導入される。このような修飾として、トレーサーとして使用される１種または複数の１５Ｎ，１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子またはその他の原子または元素を含むヌクレオチドが挙げられる。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる「末端」修飾は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ，Ｓ，Ｎ）置換炭化水素スペーサー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト－、カルボキシル－、アミド－、チオニル－、カルバモイル－、チオノカルバマオイル含有炭化水素スペーサーを含む）、スペルミンリンカー、例えば、６－フルオレセイン－ヘキシルなどのリンカーと結合している蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）を含む色素、クエンチャー（例えば、ダブシル、ＢＨＱ）およびその他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチドおよび／またはタンパク質）からなる群から選択される。特定の実施形態では、「末端」修飾は、ガイドＲＮＡの、オリゴヌクレオチド（デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンおよび／またはその他の分子を含む別の分子とのコンジュゲーション（または連結）を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる「末端」修飾は、例えば、ホスホジエステル連結として組み込まれており、ガイドＲＮＡ中の２つのヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカー（以下に表される）などのリンカーを介してガイドＲＮＡ配列中の内部に位置する。
Figure 0007068821000002
その他のリンカーとして、例えば、例として、これに限定されないが
Figure 0007068821000003
 を含む。
特定の実施形態では、末端修飾は、アミン、チオール（またはスルフヒドリル）、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲンまたは官能基で終端したリンカーなどの末端官能基を含み、そのいずれかは続いて、所望の部分、例えば、蛍光色素または非蛍光標識またはタグまたは例えば、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンなどの任意のその他の分子とコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、これらに限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、ＤＣＣ（またはＤＣＩ）を介したカップリングを含む当技術分野で周知の標準化学および／または内容が参照により全文で本明細書に組み込まれる“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｓｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３ｒｄ ｅｄ．（２０１３）に記載されるような任意のその他の標準方法を使用する。
特定の実施形態では、標識または色素は、ｇＲＮＡ中の修飾されたヌクレオチドに結合またはコンジュゲートされる。蛍光色素または非蛍光標識もしくはタグ（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１５Ｎ，１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉなどといった同位体標識を含有する部分）などのその他の部分または例えば、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンもしくはその他の分子などの任意のその他の分子のコンジュゲーションは、いわゆる「クリック」ケミストリーまたはいわゆる「スクレート」コンジュゲーションケミストリーを使用して実現され得る。「クリック」ケミストリーとは、例えば、その内容が参照により全文で本明細書に組み込まれる、Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒ，Ａ．Ｈ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．“Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ”，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１０，３９，１３８８－１４０５ ａｎｄ Ｍｏｊｉｂｕｌ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ ＸｉａｏＨｕａ，Ｐ．，ＤＮＡ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｃｉ．Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍ．，２０１４，５７：２，２１５－３１に記載されるような以下のスキーム
Figure 0007068821000004
 によって示されるような２つの部分間のトリアゾロ連結につながる、アジド部分を用いるアルキン部分の［３＋２］環化付加を指す。
特定の実施形態では、コンジュゲーションは、π－コンジュゲートジエン部分の、アルケン部分を用いるディールズ－アルダー［４＋２］環化付加などの代替環化付加によって実現され得る。
「スクアレート」コンジュゲーションケミストリーは、スクアレート誘導体を介して、各々アミンを有する２つの部分を連結して、スクアレート部分を含有するスクアレートコンジュゲートをもたらす（例えば、その内容が、参照により全文で本明細書に組み込まれる、Ｔｉｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１２４，１２１５－２１を参照のこと）。例えば、以下のスキームに記載されるように、リンカーアミンを含有するフルオレセインが、スクアレートリンカーを介してアミンを含有するオリゴリボヌクレオチドにコンジュゲートされる。スクアレートリンカーの一例は、以下のスキーム中に表されている。
Figure 0007068821000005
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる化学修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシン、脱塩基ヌクレオチド（「ａｂＮ」）、Ｚ、Ｐ、ＵＮＡ、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）およびｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結、４’－チオリボシルヌクレオチド、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、アルキルスペーサー、ヘテロアルキル（Ｎ、Ｏ、Ｓ）スペーサー、５’－および／または３’－アルキルで終端したヌクレオチド、Ｕｎｉｃａｐ、自然に由来する公知の５’末端キャップ、ｘＲＮＡ塩基（「ｘＤＮＡ」塩基と類似の）、ｙＲＮＡ塩基（「ｙＤＮＡ」塩基と類似の）、ＰＥＧ置換基または上記のような色素もしくは非蛍光標識（またはタグ）もしくはその他の部分にコンジュゲートされたリンカーからなる群から選択される。例示的な修飾されたヌクレオチドはまた、表２に表わされる。
Figure 0007068821000006
Figure 0007068821000007
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Figure 0007068821000022
Figure 0007068821000023
本明細書において記載されるように、特定の非天然塩基対（例えば、イソＧおよびイソＣ、Ｚ塩基およびＰ塩基Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．を参照のこと）は、ガイドＲＮＡ二次構造の熱安定性に影響を及ぼすために有利であり得る。これらの修飾を使用して、ガイドＲＮＡ配列のその他のドメインを有するガイドＲＮＡスキャフォールドのミスフォールディングを防ぐことができる。
最近のガイドＲＮＡ：Ｃａｓ９タンパク質構造情報（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて報告されるような図１０）およびｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的突然変異研究（例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５６，３３３－９を参照のこと）は、ガイドＲＮＡスキャフォールドが主に構造的に保存されていることを示す。これは、Ｃａｓ９を備えた機能性のための、ガイドＲＮＡの保存されたドメインの正しいフォールディングの重要性を補強する。図１０は、Ｃａｓ９のアミノ酸との相互作用を示すガイドＲＮＡスキャフォールド二次構造を示す。ガイドＲＮＡ窒素性塩基のほとんどは、Ｃａｓ９タンパク質との結合相互作用に関与しない。
ｓｇＲＮＡスキャフォールドのそれぞれの両端に位置する配列は、ミスフォールディング、ひいては、誤機能の可能性を増大する。２０ｎｔのガイドを標的化する配列、スキャフォールド領域の５’は、各標的に対してユーザー指定され、したがって、ミスフォールディングの可能性は、可変であるか、または標的特異的である。また、多数の新興ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ適用は、適切に機能するように、正しく独立してフォールディングする必要があるリボスイッチまたはアプタマーであるＣＲＩＳＰＲｄｉｓｐｌａｙ（Ｓｃｈｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５）およびＣＲＩＳＰＲ－ｉ／－ａ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１３）などの機能的配列をスキャフォールドの３’に付加する。所与のｓｇＲＮＡの機能的ドメインの各々（すなわち、標的化ガイド、スキャフォールド、アプタマー）が、モジュール式に、独立した方法でフォールディングすることを確実にするために、構造的に保存されたスキャフォールド塩基対が、非天然直交性塩基対（例えば、イソＧおよびイソＣ、Ｚ塩基およびＰ塩基）で置換され得、いくつかの実施形態では、もっぱら非天然直交性塩基対で置換され得る。これは、ｓｇＲＮＡスキャフォールド配列は、標的対形成ガイド配列または任意のアプタマー配列などのガイドＲＮＡ中に組み込まれたその他の非天然ドメインまたはガイドＲＮＡ上の任意の非天然５’もしくは３’オーバーハングの元素と、二次構造では安定に相互作用しないことを確実にする。あるいは、上記の非天然直交性塩基対は、存在し得る任意の非天然オーバーハングまたはアプタマー中に組み込まれ得、したがって、スキャフォールド配列（複数可）のミスフォールディングが絡む二次構造を防ぐ。
Ｂ． 少なくとも１つの修飾を有するガイドＲＮＡ
一態様では、本技術は、修飾されたｇＲＮＡを構成する、少なくとも１つの修飾を有するガイドＲＮＡを提供する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチドを含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、すべてのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、すべての修飾は同一である。特定の実施形態では、すべての修飾されたヌクレオチドは、同一種類の修飾を有する。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、異なって修飾されたヌクレオチドの組合せを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、２つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、３つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは連続して配置される。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。修飾されたヌクレオチドは各々、１種または複数の種類の修飾を独立に含み得る。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは連続ではなく、修飾されたｇＲＮＡの配列中の一部であるがすべてはないものが連続している。
特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの内部領域内（すなわち、５’末端と３’末端の間）である。
特定の実施形態では、修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの５’部分または３’部分中に、特に、５’部分の最初の５もしくは１０のヌクレオチド内に、または３’部分の最後の５もしくは１０のヌクレオチド内に組み込まれる。いくつかのその他の実施形態では、修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの５’部分および３’部分の両方中に、特に、５’部分の最初の５または１０のヌクレオチド内および３’部分の最後の５または１０ヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、２以上の種類の修飾が、ガイドＲＮＡの５’部分および３’部分の両方中に存在する。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端に、３’末端におよび内部配列内に位置する。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’部分中に４０個以下の、あるいは２０個以下の、あるいは１５個以下の、あるいは１０個以下の、あるいは５個以下の、あるいは３個以下のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。
特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメント内である。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡのガイド配列内である。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡセグメント上の５’オーバーハング内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメント内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである場合には、修飾は、ガイドＲＮＡのループ内に位置する。特定の実施形態では、１つまたは複数の修飾は、ループＬ領域内にある。特定の実施形態では、修飾は、例えば、２－（３－（色素／標識／タグ－アミド）プロパンアミド）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーとの、またはループまたはＬ領域中のヌクレオチドの修飾された塩基とのコンジュゲーションによって、上記のような２つのヌクレオチド間に組み込まれたリンカーとコンジュゲートしている色素、非蛍光標識またはタグを含む。
特定の実施形態では、修飾は、５’末端修飾または３’末端修飾などの末端修飾を含む。末端修飾の例として、これらに限定されないが、リン酸化（例えば、アルキルホスホネート、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ボラノホスホネート、ホスホロチオエート、ジチオリン酸などといった、天然リン酸基またはポリリン酸基としてまたは修飾されたリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｈａｔｅ）基として）、ビオチン化、コンジュゲート化またはコンジュゲートされた分子、リンカー、色素、標識、タグ、官能基（例えば、これらに限定されないが、５’－アミノ、５’－チオ、５’－アミド、５’カルボキシなど）、逆連結、またはエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エステル、ヒドロキシル、アリール、ハロ、ホスホジエステル、二環式、複素環式もしくはその他の有機官能基を含み得る炭化水素部分を含む。特定の実施形態では、末端修飾は、ジメトキシトリチルを含む。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された塩基を含む。本明細書において、「非修飾」塩基として、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された塩基の例は、これらに限定されないが、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノＰ、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシルおよび５－アミノアリル－シトシンなどの合成および天然塩基を含む。特定の実施形態では、修飾は、脱塩基ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾は、ＺまたはＰ、イソＣまたはイソＧ、ＵＮＡ、５－メチルピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）またはｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）などの非標準プリンまたはピリミジン構造を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の修飾された塩基を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての塩基が、修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された糖を含む。修飾された糖の例は、これらに限定されないが、２’位に修飾または４’位に修飾を有する糖を含む。例えば、特定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）などの２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知である２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）などの２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌまたは２’－Ｉなどの２’－ハロを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｈ（例えば、デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＬＮＡまたは２’－ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾された糖を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された骨格（すなわち、天然ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。修飾されたヌクレオチド間連結の例は、これらに限定されないが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、キラルホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結などのＣ１－４アルキルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結などのホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結などのホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、例えば、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結などのチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結などのチオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべてのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノＰ、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ＭｅＣ、５－ＭｅＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシン、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ、Ｐ、ＵＮＡ、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、３’－ホスホロチオエート基、３’－ホスホノ酢酸基、３’－ホスホノ酢酸エステル基、３’－チオホスホノ酢酸基、３’－チオホスホノ酢酸エステル基、３’－メチルホスホネート基、３’－ボラノホスホネート基、３’－ジチオリン酸基またはそれらの組合せである。
特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、Ｚ塩基を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（Ｉ）
Ｗ－ＹまたはＹ－Ｗ（Ｉ）
［式中、Ｗは、少なくとも１つの修飾を含むオリゴヌクレオチドのヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチを表し、Ｙは、オリゴヌクレオチドの非修飾部分を表す］によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの５’部分内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの３’部分内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの内部領域内（すなわち、５’末端と３’末端の間）にある。
特定の実施形態では、Ｗは、上記のような５’末端修飾または３’末端修飾などの末端修飾を含む。特定の実施形態では、末端修飾は、ジメトキシトリチルを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、上記のような修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の修飾された塩基を含む。その他の実施形態では、Ｗは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての塩基が修飾されている。
特定の実施形態では、Ｗは、上記のような修飾された糖を含む。特定の実施形態では、Ｗは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の修飾された糖を含む。その他の実施形態では、Ｗは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されている。
特定の実施形態では、Ｗは、上記のような修飾された骨格（すなわち、ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。特定の実施形態では、Ｗは、２個以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。その他の実施形態では、Ｗは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべてのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、Ｗは、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノＰ、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ＭｅＣ、５－ＭｅＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシン、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ、Ｐ、ＵＮＡ、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。
特定の実施形態では、Ｗは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは各々、同一修飾を含む。特定の実施形態では、Ｗは、多様に修飾されたヌクレオチドの組合せを含む。特定の実施形態では、Ｗは、２以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ｗは、３以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して配置されない、または少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、連続して配置される。特定の実施形態では、Ｗは、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも３つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも４つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも５つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（ＩＩ）
ＭｍＮｎ（ＩＩ）
［式中、各Ｎは独立に、非修飾リボヌクレオチドを表し、
各Ｍは修飾されたヌクレオチドを表し、独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）－リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチド、Ｚヌクレオチドおよび２’－デオキシヌクレオチドからなる群から選択され、
各Ｍは、ガイドＲＮＡの配列の任意の位置にあり、
任意の所与のＭは、任意のその他のＭと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮは、任意のその他のＮと同一であるかまたは異なっており、
ｍおよびｎの各々は独立に、０から２１９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦２２０であり、ｍは０ではない］
によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｍ＋ｎ＜１５０である。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｆ、２－チオウラシル、４－チオウラシル、２－アミノアデニン、ヒポキサンチン、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－アリルアミノウラシル、スクアレート連結、トリアゾロ連結および２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）連結からなる群から独立に選択される１つまたは複数の部分を用いて修飾される。いくつかの実施形態では、Ｍは、リンカーを介して結合している色素を含む。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から独立に選択される。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から独立に選択される。
特定の実施形態では、ｍ＞１である場合には、任意の所与のＭは、任意のその他のＭと同一であるかまたは異なっている。特定の実施形態では、ｍ＞１である場合には、各Ｍは同一修飾を有する。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、１から５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、２から５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４８の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、ｍは１である。特定の実施形態では、ｍは２である。特定の実施形態では、ｍは３である。特定の実施形態では、ｍは４である。特定の実施形態では、ｍは５である。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、１から５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、２から５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４８の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、ｍは１である。特定の実施形態では、ｍは２である。特定の実施形態では、ｍは３である。特定の実施形態では、ｍは４である。特定の実施形態では、ｍは５である。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、ｍは、１から４０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、ｍは、１から２５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、ｍは、１から２０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、ｍは１である。特定の実施形態では、ｍは２である。特定の実施形態では、ｍは３である。特定の実施形態では、ｍは４である。特定の実施形態では、ｍは５である。特定の実施形態では、ｍは１０である。特定の実施形態では、ｍは１５である。特定の実施形態では、ｍは２０である。特定の実施形態では、ｍは３０である。特定の実施形態では、ｍは４０である。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－デオキシヌクレオチドであり、ｍは、１から３０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－デオキシヌクレオチドであり、ｍは、１から２０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、ｍは５である。特定の実施形態では、ｍは１０である。特定の実施形態では、ｍは１５である。特定の実施形態では、ｍは２０である。特定の実施形態では、ｍは３０である。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドであり、ｍは、１から５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、ｍは１である。特定の実施形態では、ｍは２である。特定の実施形態では、ｍは３である。特定の実施形態では、ｍは４である。特定の実施形態では、ｍは５である。
特定の実施形態では、各Ｍは、Ｚヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、各Ｍは、Ｚヌクレオチドであり、ｍは、１から５の間の整数から選択され、各Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から独立に選択され、ｎは、１から１４９の間の整数から選択され、ただし、５０＜ｍ＋ｎ≦１５０である。特定の実施形態では、ｍは１である。特定の実施形態では、ｍは２である。特定の実施形態では、ｍは３である。特定の実施形態では、ｍは４である。特定の実施形態では、ｍは５である。
特定の実施形態では、修飾は、安定性変更性修飾である。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増大し、したがって、ガイドＲＮＡ安定性を増強する。特定の実施形態では、安定性変更性修飾は、安定性増強性修飾である。例えば、特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌまたは２’－Ｉなどの２’－ハロヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、２’ＭＯＥまたは２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、２’－ＮＨ２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、２’－Ｈ（または２’－デオキシ）ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、４’－チオリボシル糖部分を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、３’－チオホスホノ酢酸基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、３’－メチルホスホネート基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、３’－ボラノホスフェート基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、３’－ジチオリン酸基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強性修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。
特定の実施形態では、修飾は、特異性変更性修飾である。いくつかの実施形態では、特異性増強は、オンターゲット結合および／もしくは切断を増強すること、またはオフターゲットの結合および／もしくは切断を低減すること、または両方の組合せによって達成され得る。いくつかのその他の実施形態では、特異性低減は、例えば、オンターゲット結合および／もしくは切断を低減すること、またはオフターゲットの結合および／もしくは切断を増大すること、または両方の組合せによって達成され得る。
特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、２’－Ｏ－メチルを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、２’－フルオロなどの２’－ハロを含む。
特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、２－チオウラシル塩基（２－チオＵ）を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、２－チオＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、４－チオＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、６－チオＧを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、２－アミノＡを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、２－アミノプリンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、シュードウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ヒポキサンチンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、７－デアザグアニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、７－デアザ－８－アザグアニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、７－デアザアデニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、７－デアザ－８－アザアデニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－メチルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－メチルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－ヒドロキシメチルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－ヒドロキシメチルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５，６－デヒドロウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－プロピニルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－プロピニルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－エチニルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－エチニルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－アリルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－アリルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－アミノアリルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－アミノアリルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、脱塩基ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、Ｚ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、Ｐ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ＵＮＡ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、イソＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、イソＧを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、５－メチル－ピリミジンを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を含む。
特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、メチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ボラノホスフェートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、ＬＮＡを含む。
特定の実施形態では、修飾は、例えば、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）を変更することによって、ＲＮＡ塩基対形成を変更する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのＴｍを低下させる。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのＴｍを上昇させる。
特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる。特定の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡ塩基対がＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖でのそれらのそれぞれの対応物よりも低いＴｍを有することは、当技術分野で周知であるので、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は、２’－デオキシである。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は２－チオウラシルであり、これは、Ｇ－Ｕゆらぎ対のＴｍをわずかに低下させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはジチオリン酸ヌクレオチド間連結であり、これらは、修飾あたり約０．５℃、Ｔｍを低下させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結であり、これは、修飾あたり約０．５～０．８℃、Ｔｍを低下させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結であり、これは、修飾あたり約１．３℃、Ｔｍを低下させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は、アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）であり、これは、修飾あたり約５～８℃、Ｔｍを低下させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－メチルホスホネートである。
特定の実施形態では、特異性変更性修飾は、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、２’－Ｏ－メチルであり、これは、修飾あたり約０．５～０．７℃、Ｔｍを上昇させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、２’－Ｆであり、これは、修飾あたり約１℃、Ｔｍを上昇させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、２－チオウラシルであり、これは、Ａ－Ｕ対のＴｍを上昇させる（上記に記載されるように、Ｇ－Ｕゆらぎ対のＴｍをわずかに低下させる）。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、４－チオウラシルであり、これは、Ｇ－Ｕゆらぎ対のＴｍを上昇させ、Ａ－Ｕ対のＴｍをわずかに上昇させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、２－アミノ－アデニンであり、これは、修飾あたり約１℃、Ｕを用いるその塩基対形成のＴｍを上昇させる。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、５－メチル－ウラシル（５－メチルＵ）（例えば、Ｗａｎｇ ＆ Ｋｏｏｌ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，４１２５－３２を参照のこと）。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、５－メチル－シトシン（５－メチルＣ）である。特定の実施形態では、塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる修飾は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）であり、これは、修飾あたり約２～１０℃、Ｔｍを上昇させる。
特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を変更する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を増大させる。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を減少させる。特定の実施形態では、修飾は、リン酸上の陰イオン電荷を中和し、細胞への受動拡散を可能にする。特定の実施形態では、電荷中和性修飾は、ホスホノ酢酸メチルエステルヌクレオチド間連結などのホスホノ酢酸アルキルエステルヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの免疫賦活性効果を変更する。最初に、非メチル化細菌ＤＮＡおよびその合成類似体が、ＴＬＲ９のリガンドであることが発見された（Ｈｅｍｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０８，７４０－５を参照のこと）。ＴＬＲ９の刺激は、例えば、ＣおよびＧ残基を修飾することによって、ジヌクレオチオモチーフにおいて軽減され得る。５－メチルシトシン、２－アミノシトシン、２－チオシトシン、５－メチルイソシトシン、Ｐ核酸塩基（６－（β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル）－３，４－ジヒドロ－８Ｈ－ピリミド［４，５－ｃ］［１，２］オキサジン－７－オン）および２’－Ｏ－メチルシトシンの使用はすべて、ＴＬＲ９刺激の喪失または減少をもたらす。特定の実施形態では、６－チオグアニン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、キサントシン、イノシン、７－デアザキサントシン、イソグアニン、８－オキソグアニン、ネブラリン、８－ブロモグアニン、Ｋ－核酸塩基（２－アミノ－Ｎ－メトキシアデノシン）および／または２’－Ｏ－メチルグアニンの使用は、ＴＬＲ９刺激の喪失または減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ホスホジエステル修飾の使用は、ＴＬＲ９応答を低下または排除させ得る。通常、合成的に組み込まれたホスホロチオエートは、合成ＲＮＡ中の各ホスホロチオエートの２種の立体異性体の存在に起因すると考えられるように、ＴＬＲ９応答を制限された程度に減少させ得る。しかし、ＣｐＧモチーフを欠く、ホスホロチオエート修飾されたＤＮＡは、ＴＬＲ９をかなり小さい程度に刺激することがわかっている。リン上の負の電荷は、ＴＬＲ９による認識のために重要な要素であり、したがって、アルキルホスホネートを使用して負の電荷を除去することは、ＴＬＲ９刺激の喪失または減少をもたらし得る。５’および３’末端配列中のデオキシヌクレオシド間のホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結の使用は、ＴＬＲ９応答を大幅に増大し得るが、５’および３’末端配列中のデオキシヌクレオシド間のチオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結の使用は、ＴＬＲ９刺激の喪失または減少をもたらし得る。特定の実施形態では、２’－Ｏ－メチル修飾などのＣ３’－ｅｎｄｏコンホメーションを好む糖修飾の使用は、５’および３’末端に組み込まれ、ＴＬＲ９応答を減少させ得る。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、７－デアザグアニンを含有する分子によって、および一本鎖ＲＮＡによって刺激され得る（例えば、Ｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，１５２６－９を参照のこと)。ＴＬＲ３は、ウイルス由来二本鎖ＲＮＡに対する細胞性免疫応答に関与している。特定の実施形態では、これらのＴＬＲ応答は、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾、硫黄を含有する修飾されたホスホジエステル連結またはメチルホスホネートおよび／もしくはホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結などのヌクレオチド間の負の電荷を減少させる修飾を使用することによって軽減され得る。
特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性および特異性を増強する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性およびトランスフェクション効率を増強する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの特異性およびトランスフェクション効率を増強する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの全体的な有効性を増強する。
Ｃ．修飾の組合せを有するガイドＲＮＡ
一態様では、本技術は、２以上の修飾の組合せを有するガイドＲＮＡを提供する。
特定の実施形態では、２つの修飾は、同一ヌクレオチド上にある（例えば、１つのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸部分を含む）。その他の実施形態では、２つの修飾は、２つの異なるヌクレオチド上にある（例えば、１つのヌクレオチドが、２－チオＵ塩基を有し、別のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル基を有する）。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中の各修飾は、同一である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中の少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡ中の少なくとも１つのその他の修飾とは異なっている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ内の単一ヌクレオチドが、２つ以上の修飾を有する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、異なる種類の修飾の組合せを含み、組合せ中の少なくとも１つの種類が、ガイドＲＮＡ中の複数の場所に存在する。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類が、ガイドＲＮＡ中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回現れる。
特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、２つ以上の修飾されたヌクレオチド中に現れる。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾が、３つ以上の修飾されたヌクレオチドに現れる。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して配置されない、または少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、連続して配置される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、同一種類の連続する修飾されたヌクレオチドのストレッチを含む。特定の実施形態では、ストレッチは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の修飾されたヌクレオチドを有する。
特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡの内部領域内（すなわち、５’末端および３’末端の間）にある。
特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの５’部分または３’部分中に、特に、５’部分の最初の５もしくは１０ヌクレオチド内に、または３’部分の最後の５もしくは１０ヌクレオチド内に組み込まれる。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、５’部分中にあり、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの３’部分中、特に、５’部分の最初の５もしくは１０ヌクレオチド内に、および３’部分の最後の５もしくは１０ヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’部分中に２０個以下の、あるいは１５個以下の、あるいは１５個以下の、あるいは１０個以下の、あるいは５個以下の、あるいは３個以下のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。
特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメント内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ｃｒＲＮＡのガイド配列内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメント内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、組合せ中の少なくとも１つの種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内にあり、組合せ中の第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの内部領域内（すなわち、５’末端と３’末端の間）にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの内部領域（すなわち、５’末端と３’末端の間）内にあり、組合せ中の第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内にある。特定の実施形態では、第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡ３’部分の最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内にあり、組合せ中の第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内にあり、組合せ中の第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの内部領域（すなわち、５’末端と３’末端の間）内にあり、組合せ中の第３の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第３の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第３の種類の修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメント内にあり、組合せ中の第２の種類の修飾は、ｔｒａｃｒセグメント内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡのガイド配列内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類および第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメント内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡのガイド配列内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の第１の種類および第２の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメント内にあり、組合せ中の第３の種類の修飾は、ｔｒａｃｒセグメント内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡのガイド配列内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第１の種類の修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第３の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、第３の種類の修飾は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最後の３つのヌクレオチド内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、上記のような、５’末端修飾または３’末端修飾などの末端修飾を含む。特定の実施形態では、末端修飾は、ジメトキシトリチルを含む。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の修飾された塩基を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての塩基が修飾されている。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された糖を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の修飾された糖を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されている。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された骨格（すなわち、天然ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべてのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アミノ、２’－デオキシ、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ、２－チオウラシル、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、５－アミノアリルウラシル、Ｚ塩基、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノ酢酸、３’－ホスホノ酢酸エステル、３’－チオホスホノ酢酸、３’－チオホスホノ酢酸エステル、３’－メチルホスホネート、３’－ボラノホスホネート、３’－ジチオリン酸またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ、Ｚ塩基、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｆ、２－チオＵ、４－チオＵ、２－アミノＡ、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－アミノアリルＵまたはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、末端ホスフェート、ＰＥＧ、末端アミン、炭化水素リンカーなどの末端リンカー、置換炭化水素リンカー、スクアレートリンカー、トリアゾロリンカー、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーなどの内部リンカー、色素とコンジュゲートしているリンカー、非蛍光標識とコンジュゲートしているリンカー、タグとコンジュゲートしているリンカーまたは例えば、ビーズもしくはマイクロアレイなどの固相支持体とコンジュゲートしているリンカーなどの「末端」修飾である。特定の実施形態では、組合せ中の修飾の少なくとも２つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結または２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾の少なくとも２つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。その他の実施形態では、組合せ中の修飾は、２－チオウラシル、２－チオシトシン、４－チオウラシル、６－チオグアニン、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、シュードウラシル、イノシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル、５－アリルシトシン、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシンまたは脱塩基ヌクレオチドをさらに含む。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。少なくとも２つまたは３つの修飾の可能性ある組み合わせは、それぞれ、図６および図７に表されており、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）
Ｗ－Ｙ－Ｑ（ＩＩＩ）、または
Ｙ－Ｗ－Ｘ－Ｑ（ＩＶ）
［式中、ＱおよびＷは各々独立に、少なくとも１つの修飾を含むオリゴヌクレオチドのヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチを表し、ＹおよびＸは各々独立に、オリゴヌクレオチドの非修飾部分を表す］
によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡ５’部分内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの内部領域（すなわち、５’末端と３’末端の間）内にある。
特定の実施形態では、Ｑは、ガイドＲＮＡの３’部分内にある。特定の実施形態では、Ｑは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｑは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｑは、ガイドＲＮＡの内部領域（すなわち、５’末端と３’末端の間）内にある。
特定の実施形態では、Ｗは、５‘末端または３’末端修飾などの上記のような末端修飾を含む。特定の実施形態では、末端修飾は、ジメトキシトリチルを含む。
特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、上記のような修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、２個以上の修飾された塩基、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の修飾された塩基を含む。
特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、上記のような修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、２以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾された糖を含む。
特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、上記のような修飾された骨格（すなわち、ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、２以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｆヌクレオチド、２’－アミノヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２－チオウリジンヌクレオチド、２－アミノアデノシン（ａｄｅｏｓｉｎｅ）ヌクレオチド、６－チオグアノシンヌクレオチド、５－メチルシチジンヌクレオチド、５－アミノアリルウリジンヌクレオチド、Ｚヌクレオチド、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、３’－ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、３’－ホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結、３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、３’－チオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結、３’－メチルホスホネートヌクレオチド間連結、３’－ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、３’－ジチオリン酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。
特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸基連結を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホノ酢酸基連結を含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。
特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方内の修飾されたヌクレオチドの各々は、同一修飾（複数可）を含む。特定の実施形態では、Ｗは、Ｑ中の修飾されたヌクレオチドとは異なる修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、２以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、３以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して配置されない、または少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、連続して配置されない。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、少なくとも３つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、少なくとも４つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、ＷまたはＱのうちの少なくとも一方は、少なくとも５つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（Ｖ）または式（ＶＩ）のヌクレオチド配列
ＭｍＮｎＭ’ｍ’Ｎ’ｎ’（式Ｖ）、または
ＭｍＮｎＭ’ｍ’Ｎ’ｎ’Ｍ”ｍ”（式ＶＩ）
［式中、各Ｍは独立に、修飾されたリボヌクレオチドを表し、
各Ｎは独立に、非修飾リボヌクレオチドを表し、
各Ｍ’は独立に、修飾されたリボヌクレオチドを表し、
各Ｎ’は独立に、非修飾リボヌクレオチドを表し、
各Ｍ”は独立に、修飾されたリボヌクレオチドを表し、
ｍは、０から４０の間の整数であり、ｎは、０から１３０の間の整数であり、ｍ’は、０から１０の間の整数であり、ｎ’は、０から１３０の間の整数であり、ｍ”は、０から１０の間の整数であり、ただし、ｍ＋ｍ’＋ｍ”は１以上であり、５０＜ｍ＋ｎ＋ｍ’＋ｎ’＋ｍ”≦１５０である］
を含む。
特定の実施形態では、各Ｍは独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－デオキシヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、各Ｍは独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、各Ｍは独立に、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｍ＞１である場合には、任意の所与のＭは、任意のその他のＭと同一であるか、または異なっている。特定の実施形態では、ｍ＞１である場合には、各Ｍは、同一修飾（複数可）を含む。
特定の実施形態では、各Ｍ’は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－デオキシヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ’は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ’は独立に、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｍ’＞１である場合には、任意の所与のＭ’は、任意のその他のＭ’と同一であるか、または異なっている。特定の実施形態では、ｍ’＞１である場合には、各Ｍ’は、同一修飾（複数可）を含む。
特定の実施形態では、各Ｍ”は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－デオキシヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ”は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ”は独立に、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、ｍ”＞１である場合には、任意の所与のＭ”は、任意のその他のＭ”と同一であるか、または異なっている。特定の実施形態では、ｍ’＞１である場合には、各Ｍ”は、同一修飾（単一または複数）を含む。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎは、１０から１３０の間の整数から選択され、各Ｍ’は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドおよびＺヌクレオチドからなる群から選択され、ｍ’は、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎ’は、０から１３０の間の整数から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、Ｚヌクレオチドである。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎは、１０から１３０の間の整数から選択され、各Ｍ’は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドおよびＺヌクレオチドからなる群から選択され、ｍ’は、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎ’は、０から１３０の間の整数から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、Ｚヌクレオチドである。
特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドであり、ｍは、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎは、１０から１３０の間の整数から選択され、各Ｍ’は独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドおよびＺヌクレオチドからなる群から選択され、ｍ’は、１から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎ’は、０から１３０の間の整数から選択される。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍ’は、Ｚヌクレオチドである。
特定の実施形態では、各Ｍは独立に、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドおよびＺヌクレオチドからなる群から選択され、ｍは、０から１０の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎは、０から１５の間の整数から選択され、各Ｍ’は、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、ｍ’は、１から５の間の整数から選択され、各Ｎは独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群から選択され、ｎ’は、０から１３０の間の整数から選択される。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドである。特定の実施形態では、各Ｍは、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍは０であり、ｎは、１０から１５の間の整数から選択され、ｍ’は、１から５の間の整数から選択され、ｎ’は、０から１３０の間の整数から選択される。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、安定性変更性修飾である。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増大し、したがって、ガイドＲＮＡの安定性を増強する。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、上記のような安定性増強性修飾である。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、上記のような特異性変更性修飾である。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、ＲＮＡ塩基対形成を変更する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、上記のような塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、上記のような塩基対形成相互作用のＴｍを上昇させる。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を変更する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を増大する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を減少させる。特定の実施形態では、組合せ中のトランスフェクション増大性修飾のうちの少なくとも１つは、ホスホノ酢酸メチルエステルヌクレオチド間連結などのホスホノ酢酸アルキルエステルヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性および特異性を増強する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性およびトランスフェクション効率を増強する。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有さないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの特異性およびトランスフェクション効率を増強する。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡの二次構造を変更する。この修飾は、ガイドＲＮＡ中のＲＮＡ／ＲＮＡ内部二本鎖のいずれかの塩基対形成を変更する。これらの修飾のうちいくつかは、ＲＮＡ／ＲＮＡ構造の塩基対形成を増大するか、あるいは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを増大するのに対し、その他の修飾は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖（複数可）の塩基対形成（またはＴｍ）を減少させる。このような修飾は、塩基修飾されたヌクレオチド、特に、２－チオウリジンおよび２－アミノアデノシン対などのＵＮＡヌクレオチド、Ｚ／Ｐヌクレオチド対、イソＣ／イソＧ対、６－チオＧ／５－メチルピリミジン対および糖上に修飾を有するヌクレオチドまたは上記で開示されるようなヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、組合せは、特異性を増大する（すなわち、オフターゲット効果を低減する）少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを上昇させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する、少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを低下させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセット、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡ中のいずれかの場所でのいくつかの塩基対形成のＴｍを減少させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡのＣａｓタンパク質との結合を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡのＣａｓタンパク質との結合を減少させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、異なる種類の修飾の組合せを含む。
Ｄ．ガイドＲＮＡ構造
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と複合体を形成できる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるポリヌクレオチド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型のシステムによって提供されるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９突然変異体またはＣａｓ９変異体である。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡまたは合成ガイドＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質複合体は、修飾されたヌクレオチドを有さない天然ガイドＲＮＡまたは複合体の機能性を維持する。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドと結合することを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸内にある。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞のゲノム内にある（生物から単離された培養された細胞（複数可）中など）。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ中のプロトスペーサーである。
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、２５から８０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、標的配列とハイブリダイズ可能であるガイド配列を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、標的配列またはその一部と相補的である。特定の実施形態では、ガイド配列は、１５から３０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、ステム配列を含む。特定の実施形態では、ステム配列は、１０から５０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、５’－オーバーハング配列を含む。特定の実施形態では、５’－オーバーハング配列は、１から１０ヌクレオチド、あるいは、１～５ヌクレオチド、あるいは、１、２または３ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリダイズ可能であるガイド配列および（ｉｉ）ステム配列の両方を含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）５’－オーバーハング配列、（ｉｉ）標的配列とハイブリダイズ可能であるガイド配列および（ｉｉｉ）ステム配列を含む。ｃｒＲＮＡセグメントがステム配列を含む特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡセグメントのステム配列と部分的にまたは完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、少なくとももう１つの二本鎖構造を含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがループＬを介して連結している単一ガイドＲＮＡである。特定の実施形態では、ループＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ループＬは、ＧＮＲＡのヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒは、ＡまたはＧを表す。特定の実施形態では、ループＬは、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２以上のループを含む。
ガイドＲＮＡは、５’部分（すなわち、５’の半分）および３’部分（すなわち、３’の半分）を含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの５’（すなわち、上流）である。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡセグメントに対して５’である。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つの別個のＲＮＡ鎖、例えば、ｃｒＲＮＡ鎖および別個のｔｒａｃｒＲＮＡ鎖を含む。例えば、図５Ａを参照のこと。特定の実施形態では、鎖の各々は、１つまたは複数の修飾を含む合成鎖である。特定の実施形態では、鎖の少なくとも一方は、１つまたは複数の修飾を含む合成鎖である。特定の実施形態では、鎖は一緒に機能して、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質による標的ポリヌクレオチドの結合、ニッキングまたは切断をガイドする。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、別個の鎖上にあり、２つの相補的配列によって互いにハイブリダイズし、ステムまたは二本鎖を形成する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一ガイドＲＮＡである。例えば、図５Ｂを参照のこと。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ループ配列または「ループ」によって接続される。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、５’部分および３’部分を含み、ここで、ｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の上流である。
特定の実施形態では、２つのＲＮＡ片の総長は、約５０～２２０（例えば、約５５～２００、６０～１９０、６０～１８０、６０～１７０、６０～１６０、６０～１５０、６０～１４０、６０～１３０および６０～１２０）ヌクレオチドの長さ、例えば、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００または２２０ヌクレオチドの長さであり得る。同様に、単一ガイドＲＮＡ（例えば、図５Ｂ）は、約５０～２２０（例えば、約５５～２００、６０～１９０、６０～１８０、６０～１７０、６０～１６０、６０～１５０、６０～１４０、６０～１３０および６０～１２０）ヌクレオチドの長さ、例えば、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００または２２０ヌクレオチドの長さであり得る。
図５Ａおよび５Ｂに示されるように、合成ガイドＲＮＡは、（ｉ）（ａ）核酸中の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列（例えば、セグメントＧ１～Ｇｎ、式中、各Ｇは、ガイド配列中のヌクレオチドを表す）、（ｂ）第２のステム配列と部分的または完全にハイブリダイズ可能な第１のステム配列（例えば、セグメントＸ１～Ｘｎ、式中、各Ｘは、第１のステム配列中のヌクレオチドを表す）および任意選択で、（ｃ）５’－オーバーハング配列（例えば、セグメントＯ１～Ｏｎ、式中、各Ｏは、オーバーハング配列中のヌクレオチドを表す）を含むｃｒＲＮＡ配列と、（ｉｉ）第２のステム配列（例えば、セグメントＹ１～Ｙｎ、式中、各Ｙは、第２のステム配列中のヌクレオチドを表す）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、セグメントＴ１～Ｔｎ（式中、各Ｔは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のヌクレオチドを表す）をさらに含む。図５Ａ中に示される合成ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含む。同様に、図５Ｂ中に示される合成ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡセグメント、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントおよび任意選択的に、ループを含む単一ガイドＲＮＡの長さに沿って任意の点に位置する。特定の実施形態では、図５Ａおよび５Ｂに示される合成ガイドＲＮＡ中のＯ、Ｇ、Ｘ、ＹまたはＴによって表される任意のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであり得る。図５Ｂ中に示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、配列ＧＮＲＡを有するループによって接続しており、Ｎが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒが、ＡまたはＧを表す単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を表す。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメントは、２５～７０（例えば、３０～６０、３５～５０または４０～４５）ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ガイド配列は、１２～３０（例えば、１６～２５、１７～２０または１５～１８）ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの５’部分は、標的配列とハイブリダイズしないか、または部分的にしかハイブリダイズしない。例えば、ｃｒＲＮＡセグメント上に５’－オーバーハングがあり得る。
特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントのステム配列、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントのステム配列および任意選択的に、ｃｒＲＮＡセグメントをｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと共有結合によって接続するループを含む中央部分を含む。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡの中央セグメントは、８～６０（例えば、１０～５５、１０～５０または２０～４０）ヌクレオチドの長さである。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、１０～１３０（例えば、１０～１２５、１０～１００、１０～７５、１０～５０または１０～２５）ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、中央セグメント中の任意のヘアピンまたは二本鎖構造に加えて、１つまたは複数のヘアピンまたは二本鎖構造を含む。
特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然に存在する成熟ｔｒａｃｒＲＮＡなどの参照ｔｒａｃｒＲＮＡと比較して、末端切断型である。別個の型（図５Ａ）およびキメラｓｇＲＮＡ型（図５Ｂ）の両方において、さまざまな長さが機能することがわかっている。例えば、特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ｎｔだけ末端切断型であり得る。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その５’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０ｎｔだけ末端切断型であり得る。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、５’および３’末端の両方から、例えば、５’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０ｎｔだけおよび３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ｎｔだけ末端切断型であり得る。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－２１；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：６１２１，８２３－６；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：６１２１，８１９－２３；およびＨｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：３，２２７－９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ｅＬｉｆｅ，２，ｅ００４７１を参照のこと。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、末端切断されていない。
特定の実施形態では、開示される修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントまたはｔｒａｃｒＲＮＡセグメントまたは両方中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントのガイド配列中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントのステム配列中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ｃｒＲＮＡセグメントの５’－オーバーハング配列中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントのステム配列中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ガイドＲＮＡのループ配列中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分中にある。特定の実施形態では、開示される修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分およびガイドＲＮＡの３’部分中にある。
Ｅ．ガイドＲＮＡの合成
特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、図１および５Ｂを参照のこと）を含むガイドＲＮＡが、合成有機化学の技術分野を使用する化学合成によって製造される。非天然であるか天然であるかに関わらず、プソイドウリジン、イノシンまたはデオキシヌクレオチドなどの、４種の主なリボヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ以外の任意のヌクレオチドを含むガイドＲＮＡは、ＲＮＡ中の４種の主なヌクレオチドのいずれかと、化学的に／構造的に異なるヌクレオチドに化学修飾または置換を有する。
本明細書において記載される合成ガイドＲＮＡは、化学合成され得る。例えば、合成ガイドＲＮＡは、その内容が参照により全文で本明細書に組み込まれるＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３３，１１５４０、米国特許第８，２０２，９８３号および米国特許出願第２０１０／００７６１８３Ａ１号に記載された方法によってＴＣケミストリーを使用して合成され得る。「ＴＣケミストリー」とは、チオノカルバメート保護基によって２’－ヒドロキシル部分で保護されたＲＮＡ単量体ヌクレオチド前駆体を使用して、非修飾ＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡを合成する組成物および方法を指す。ＴＣ－ＲＮＡケミストリーを使用して比較的長いＲＮＡ（２００マー以上にも及ぶ）を化学的に合成する能力によって、４種の主なリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）によって可能となるものをしのぐことが可能な、特別な特徴を有するガイドＲＮＡを製造することが可能となる。本明細書に記載されたいくつかの合成ガイドＲＮＡはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および細胞ベースの発現を含む当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。例えば、細胞ベースの発現によって製造された合成ガイドＲＮＡ中に、２’－フルオロＮＴＰを組み込むことができる。
ガイドＲＮＡの合成はまた、ＲＮＡ配列の化学的または酵素的合成によって達成され得、その後、これが酵素によって一緒にライゲートされるか、またはこれらに限定されないが、臭化シアンケミストリー、Ｒ．Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，６８５９－６４によって公開されたような「クリック」ケミストリーまたは「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題されたＷＯ２０１３１７６８４４においてＫ．Ｈｉｌｌによって記載されたようなスクアレートコンジュゲーションケミストリーを含む化学ライゲーションによってライゲートされる。
以下にさらに記載されるように、修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間連結を含むものを含む、本明細書において開示されるガイドＲＮＡを使用して、細胞不含アッセイにおいて、無傷の細胞において、または全生物においてなど、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで種々のＣＲＩＳＰＲ媒介性機能（これらに限定されないが、遺伝子を編集すること、遺伝子発現を調節すること、標的配列を切断することおよび標的配列と結合することを含む）を実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ適用のために、ＲＮＡを、当技術分野で公知の任意の方法で細胞または全生物中に送達することができる。
ライブラリーおよびアレイ
一態様では、本発明は、複数のガイドＲＮＡのセットまたはライブラリーを提供する。特定の実施形態では、ライブラリーは、本明細書において開示される２つ以上のガイドＲＮＡを含有する。ライブラリーは、約１０～約１０７の個々のメンバー、例えば、約１０～約１０２、約１０２～約１０３、約１０３～約１０５、約１０５～約１０７のメンバーを含有し得る。ライブラリーの個々のメンバーは、ライブラリーのその他のメンバーとは、少なくとも、ガイド配列、すなわち、ｇＲＮＡのＤＮＡを標的化するセグメントにおいて異なる。他方、特定の実施形態では、ライブラリーの各個々のメンバーは、ライブラリーのすべてのその他のメンバーとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントについて同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を含有し得る。このような方法で、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド中の異なるポリヌクレオチドまたは異なる配列を標的化するメンバーを含み得る。
特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０３種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０６種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０７種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０３種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０６種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０７種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。
特定の実施形態では、ライブラリーは、ライブラリー中のメンバーの配列を横断する連続的にシフトしたウィンドウ中に同一配列および同一修飾を有するガイドＲＮＡの収集物を含む。特定の実施形態では、ウィンドウは、ＲＮＡの全長を集合的に対象とする。
特定の実施形態では、ライブラリーによって、ハイスループット、多重標的ゲノム操作および分析を実施することが可能となる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡを標的化するセグメントのみが変わり、Ｃａｓタンパク質結合セグメントは同一である。特定の実施形態では、ライブラリーの第１の部分は、特定のＣａｓタンパク質を認識し、それと結合し、それを指向するＣａｓ結合セグメントを有するガイドＲＮＡを含み、ライブラリーの第２の部分は、異なるＣａｓタンパク質（例えば、異なる種に由来するＣａｓタンパク質）を認識し、それと結合し、それを指向する異なるＣａｓ結合性セグメントを含み、それによって、ライブラリーが、２種以上の直交性Ｃａｓタンパク質とともに機能することが可能となる。特定の実施形態では、第１の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現は、第１の直交性Ｃａｓタンパク質と相互作用するライブラリーの一部を利用する。特定の実施形態では、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現は、それぞれ、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質と相互作用するライブラリーの一部を利用する。特定の実施形態では、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現は、異なる時点で起こる。したがって、具体的には、ライブラリーにおいて特定されるような複数の標的を遺伝子操作することまたは修飾することによって、大規模遺伝子編集または遺伝子調節を実施することができる。
特定の実施形態では、ライブラリーは、「アレイド（arrayed）」ライブラリー、すなわち、アドレス可能な配置中の異なる特徴または特徴のプールの収集物である。例えば、アレイの特徴を、選択的に切断し、プレート中の各ウェルが、公知の特徴または公知の特徴のプールを含有するようにマイクロタイタープレートに移すことができる。いくつかのその他の実施形態では、ライブラリーは、４８カラムまたは９６カラムマイクロタイタープレート形式で、または３８４カラムプレート中で合成される。
特定の実施形態では、本発明のガイドＲＮＡの合成は、化学実体が結合し得る表面を有する固相支持体上で実施され得る。いくつかの実施形態では、合成されているガイドＲＮＡが、同一固相支持体に直接的または間接的に結合され、アレイの部分を形成し得る。「アレイ」は、各配列の位置が公知であるように、空間的に規定され、物理的にアドレス可能な方法で各々配置された公知の単量体配列の別個の分子の収集物である。本明細書において同義的に使用される「アレイ」または「マイクロアレイ」は、その領域と会合している特定の化学部分（複数可）（リガンド、例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列（核酸）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水化物、脂質などといったバイオポリマーなど）を有する、アドレス可能な領域の任意の１次元の、２次元のまたは実質的に２次元の（ならびに３次元の）配置を含む。アレイは、アレイ上の特定の所定の位置（すなわち「アドレス」）で、領域（すなわち、アレイの「特徴」）が、特定の標的または標的のクラスを検出するように（特徴は、その特徴の非標的を偶発的に検出し得るが）、異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）の複数の領域を有する場合に「アドレス可能」である。アレイ特徴は、通常、介在する空間によって分かれているが、必要ではない。アレイ上に含有され得る特徴の数は、大きくは、基板の表面積、特徴のサイズおよび特徴間の間隔によって決定される。アレイは、２，５００～２００，０００特徴／ｃｍ２など、１ｃｍ２あたり最大数十万以上の特徴の密度を有し得る。特徴は、共有結合によって基板と結合される場合もされない場合もある。
適した固相支持体は、種々の形態および組成を有し、天然に存在する材料、相性的に修飾されている天然に存在する材料または合成材料に由来し得る。適した支持材料の例は、これらに限定されないが、シリカ、ケイ素および酸化ケイ素、テフロン（登録商標）、ガラス、アガロース（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のセファロース（登録商標））およびデキストラン（例えば、同様にＰｈａｒｍａｃｉａ製のセファデックス（登録商標）およびセファシル（登録商標））などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、メタクリル酸ヒドロキシエチルおよびメタクリル酸メチルのコポリマーなどを含む。いくつかの実施形態では、固相支持体は、複数のビーズである。
基板表面上で合成されるべきガイドＲＮＡの最初の単量体をリンカーと結合することができ、これは、順に、シリカ基板上に存在する表面親水基、例えば、表面ヒドロキシル部分と結合する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルリンカーを使用する。いくつかのその他の実施形態では、最初の単量体を、例えば、表面ヒドロキシル部分と直接反応させる。あるいは、ガイドＲＮＡを、本発明に従ってまず合成することができ、合成後、当技術分野で公知の任意の方法によって固体基板と結合させる。したがって、本発明を使用して、オリゴヌクレオチドがアレイ上で合成されるか、または合成後にアレイ基板に結合される、ガイドＲＮＡのアレイを調製できる。その後、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのプールもしくは複数のプールを、アレイ基板から任意選択的に選択的に切断し、ライブラリー（複数可）として使用できる。
ＩＶ．Ｃａｓタンパク質
上記のように、機能的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはまた、標的結合または標的ニッキング／切断などの所望の活性を提供するタンパク質成分（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼであり得るＣａｓタンパク質）を必要とする。特定の実施形態では、所望の活性は、標的結合である。特定の実施形態では、所望の活性は、標的ニッキングまたは標的切断である。特定の実施形態では、所望の活性はまた、本明細書において開示されるようなＣａｓタンパク質と共有結合によって融合しているポリペプチドによって提供される機能を含む。特定の実施形態では、所望の活性はまた、本明細書において開示されるようなヌクレアーゼ欠損Ｃａｓタンパク質と共有結合によって融合しているポリペプチドによって提供される機能を含む。このような所望の活性の例として、以下に記載されるような転写調節活性（活性化または抑制のいずれか）、エピジェニック修飾活性または標的可視化／同定活性が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、精製もしくは非精製（ｉ）Ｃａｓタンパク質または（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質の発現のためにコードされるｍＲＮＡまたは（ｉｉｉ）タンパク質の発現のためにコードされる直鎖もしくは環状ＤＮＡとしてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏシステム中に導入され得る。Ｃａｓタンパク質を提供するこれらの３種の方法のいずれも当技術分野で周知であり、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質の使用の言及が本明細書においてなされる場合には、同義的に暗示される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡから構成的に発現される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＤＮＡからのＣａｓタンパク質の発現が誘導可能であるか、または誘導される。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は化学合成される（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３を参照のこと）か、または本明細書において記載されるように組換えＤＮＡ技術によって製造される。さらなる指針については、当業者は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００３；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参考にしてもよい。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製された、または単離された形態で提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の純度で提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、組成物の一部として提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ反応のための組成物として使用するのに、または組成物中に含めるのに適した水性組成物中で提供される。当業者は、このようなヌクレアーゼ反応組成物中に含まれ得る種々の物質を十分に承知している。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、組換えポリペプチドとして提供される。特定の実施例では、組換えポリペプチドは、融合タンパク質として調製される。例えば、特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、融合パートナー、例えば、グルタチオン－ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ－ＨｉｓエピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質をコードする別の核酸と連結される。適した宿主細胞は、融合タンパク質を発現するために使用され得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法によって単離される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合パートナーを除去してＣａｓタンパク質を得るために、例えば、酵素消化によってさらに処理され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質：ガイドＲＮＡ複合体は、当技術分野で公知の宿主細胞システムまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳－転写システムを使用して組換え技術を用いて作成され得る。このようなシステムおよび技術の詳細は、例えば、その内容が参照により全文で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４１４４７６１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およびＵＳ２０１４０２７３２３３に見出すことができる。
野生型Ｃａｓタンパク質
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるポリヌクレオチド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有する、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のシステムに由来するタンパク質を含む。適したＣａｓタンパク質の限定されない例として、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕ１９６６が挙げられる。例えば、その内容が参照により全文で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４１４４７６１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およびＵＳ２０１４０２７３２３３を参照のこと。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＷＯ２０１４１４４７６１において同定されるものを含む、細菌Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種またはブドウ状球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種のＣａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。
特定の実施形態では、野生型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（配列番号１）である。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１の断片を含み得る、それからなり得るまたは本質的にそれからなり得る。
一般に、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用する、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の核酸結合親和性および／または特異性を増大し、酵素活性を変更し、および／または別の特性を変化させるように修飾される。例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾、突然変異、欠失または不活性化され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の機能にとって必須ではないドメインを除去するように末端切断型であり得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、エフェクタードメインの活性を最適化するように、末端切断型であるか、または修飾され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮＬＳタグが付けられたＣａｓタンパク質の生存細胞の核への移入を達成する核局在性配列（ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つ以上の修飾を含む。
突然変異体Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９など）またはその断片の突然変異体であり得る。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、突然変異体Ｃａｓタンパク質に由来し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の１つまたは複数の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、結合親和性、プロテアーゼに対する安定性など）を変更するように修飾され得る。あるいは、ＲＮＡによってガイドされる切断に関与していないＣａｓ９タンパク質のドメインは、修飾されたＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ9タンパク質より小さいように、タンパク質から排除され得る。例えば、Ｃａｓ９コード配列のサイズの低減によって、そうでなければ、中でもＡＡＶベクターなどの野生型配列に適応させることができないトランスフェクションベクター内に適合することが可能となる。いくつかの実施形態では、本システムは、細菌中にコードされるような、または真核細胞における発現のためにコドン最適化された、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。野生型化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質配列のアミノ酸配列（配列番号１、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９ＺＷ２で入手可能）が、以下に示される。
Figure 0007068821000024
Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、少なくとも２種のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ）ドメインを有する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを有し得る。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは一緒に働いて、標的部位中の両鎖を切断し、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を作製する（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６－８２１）。特定の実施形態では、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、１つのみの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）を含有するように修飾される。例えば、特定の実施形態では、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうち１つが、欠失または突然変異され、その結果、もはや機能的ではない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように修飾される。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性であるいくつかの実施形態では、突然変異体は、二本鎖ポリヌクレオチド中にニックを導入可能である（このようなタンパク質は、「ニッカーゼ」と呼ばれる）が、二本鎖ポリヌクレオチドを切断できない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの（Ｈ８４０Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるアスパラギン（ａｒｓｐａｒａｇｉｎｅ）からアラニンへの（Ｎ８６３Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインの両方が、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質が、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることができない、または切断できないように修飾されるか、または排除される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９由来タンパク質のすべてのヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ９由来タンパク質が、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾されるか、または排除される。特定の実施形態では、それにもかかわらず、一部のまたはすべてのヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ９タンパク質は、野生型対応物と比較して、標的認識活性をより高いまたはより低い程度に維持する。
上記の実施形態のいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインのいずれかまたはすべてが、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発および全遺伝子合成並びに当技術分野で公知のその他の方法などの周知の方法を使用する１つまたは複数の欠失突然変異、挿入突然変異および／または置換突然変異によって不活性化され得る。
特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、配列番号１に対して少なくとも５０％（例えば、５０％から１００％の間（両端を含む）の任意の数字、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％）同一である。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）と結合する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ＲＮＡ分子を介して特定のポリヌクレオチド配列に標的化される。
融合タンパク質
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質と異種の別のタンパク質またはポリペプチドと融合されて、融合タンパク質が作製される。特定の実施形態では、異種配列は、切断ドメイン、転写活性化ドメイン、転写レプレッサードメインまたはエピジェニック修飾ドメインなどの１つまたは複数のエフェクタードメインを含む。エフェクタードメインのさらなる例は、核局在性シグナル、細胞透過性または転位置ドメインまたはマーカードメインを含む。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端にまたは内部位置中に位置する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、すべてのヌクレアーゼドメインが不活性化または欠失されている、修飾された、または突然変異されたＣａｓタンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠く、修飾された、または突然変異されたＣａｓタンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のＲｕｖＣおよび／またはＨＮＨドメインは、もはやヌクレアーゼ活性を有さないように修飾される、または突然変異される。
切断ドメイン
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、切断ドメインである。本明細書において、「切断ドメイン」とは、ＤＮＡを切断するドメインを指す。切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの限定されない例として、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｒ Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３７９－８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、ヤエナリ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１種または複数を、切断ドメインの供給源として使用できる。
特定の実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを、通常、エンドヌクレアーゼのＤＮＡ認識部位から数塩基対離れた部位で特異的に切断し、そのようなものとして、分離可能な認識および切断ドメインを有する。これらの酵素は、一般に、一時的に会合して二量体を形成し、捻じれた位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。適したＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼの限定されない例として、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏｌＩおよびＳａｐＩが挙げられる。特定の実施形態では、融合タンパク質の切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたはその断片または誘導体であるＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，７７８－８５；Ｓｚｃｚｐｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，７８６－９３；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８，７４－８１を参照のこと。
転写活性化ドメイン
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメインである。一般に、転写活性化ドメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写を増大および／または活性化する。特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメインまたはＮＦＡＴ（活性化されたＴ細胞の核因子）活性化ドメインである。特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４またはＬｅｕ３である。転写活性化ドメインは、野生型であり得る、または元の転写活性化ドメインの修飾された型もしくは末端切断型であり得る。
転写レプレッサードメイン
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写レプレッサードメインである。一般に、転写レプレッサードメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用して、遺伝子の転写を減少させるおよび／または妨げる。特定の実施形態では、転写レプレッサードメインは、誘導性ｃＡＭＰ初期レプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）レプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチレプレッサードメイン、Ｓｐ１様レプレッサー、Ｅ（ｓｐＩ）レプレッサー、ＩκＢレプレッサーまたはＭｅＣＰ２である。
エピジェニック修飾ドメイン
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、エピジェニック修飾ドメインである。一般に、エピジェニック修飾ドメインは、ヒストン構造および／または染色体構造を修飾することによって遺伝子発現を変更する。特定の実施形態では、エピジェニック修飾ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインまたはＤＮＡデメチラーゼドメインである。
さらなるドメイン
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなるドメインをさらに含む。適したさらなるドメインの限定されない例として、核局在性シグナル（ＮＬＳ）、細胞透過性または転位置ドメインおよびマーカードメインが挙げられる。ＮＬＳは、一般に、塩基性アミノ酸のストレッチを含む。例えば、Lange et al. (2007) J. Biol. Chem., 282、5101-5を参照のこと。例えば、特定の実施形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号３）などのモノパータイト（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列である。特定の実施形態では、ＮＬＳは、ビパータイト（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列である。特定の実施形態では、ＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号４）である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含む。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質に由来する細胞透過性ペプチド配列である。例として、ＴＡＴ細胞透過性配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）であり得る。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号６）、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞透過性ペプチド配列である。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号７またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号８）である。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号 ９）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチドまたはポリアルギニンペプチド配列である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのマーカードメインを含む。マーカードメインの限定されない例は、蛍光タンパク質、精製タグおよびエピトープタグを含む。特定の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質である。適した蛍光タンパク質の限定されない例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）および任意のその他の適した蛍光タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグである。例示的タグとして、これらに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｖ．使用および方法
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質を用いて切断する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させることを含む。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に一本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質を含む複合体は、配列によって標的化される一本鎖ＤＮＡ切断、すなわち、ニッキングのために使用される。
一態様では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドを、Ｃａｓタンパク質を用いて切断する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を接触させることを含む。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に一本鎖切断をもたらす。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質を含む複合体は、配列によって標的化される一本鎖ＤＮＡ切断、すなわち、ニッキングのために使用される。
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質と結合するための方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させて、標的ポリヌクレオチドのＣａｓタンパク質との結合をもたらすことを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓ変異体は、対応物野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、一部またはすべてのヌクレアーゼ活性を欠く。
一態様では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質と結合させる方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させて、標的ポリヌクレオチドのＣａｓタンパク質との結合をもたらすことを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓ変異体は、対応物野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、一部またはすべてのヌクレアーゼ活性を欠く。
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチドに標的化するための方法を提供する。方法は、Ｃａｓタンパク質を、本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットと接触させることを含む。特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の形成をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の突然変異体または変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ欠損突然変異体）である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質（例えば、（ｉ）Ｃａｓタンパク質および（ｉｉ）異種ポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部である。
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質を、２種以上の標的ポリヌクレオチドに標的化するための方法を提供する。方法は、Ｃａｓタンパク質を、本明細書において記載されるガイドＲＮＡ分子のセットと接触させることを含む。特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の形成をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の突然変異体または変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ欠損突然変異体）である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質（例えば、（ｉ）Ｃａｓタンパク質またはおよび（ｉｉ）異種ポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部である。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、トランスフェクションによって細胞中に導入される。ＲＮＡトランスフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを含む。ＲＮＡトランスフェクションのための有効な技術は、主に、細胞型に応じて変わる。例えば、ＨＴＣ－１１６結腸癌細胞のトランスフェクションを記載し、商業的に得られた修飾されたｍｉＲＮＡまたは前駆体ｍｉＲＮＡのトランスフェクションのためにオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する、Ｌｕｊａｍｂｉｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｆｅｂ．２００７を参照のこと。また、Ｋ５６２細胞のトランスフェクションを記載し、転写されたｓｇＲＮＡ（約６０ｎｔ長）のトランスフェクションのために４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）（Ｌｏｎｚａ）エレクトロポレーションを使用するＣｈｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ．）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒ．２０１３も参照のこと。ＲＮＡのトランスフェクションの技術もまた、当技術分野で公知である。例えば、治療用ＲＮＡは、インベイシンタンパク質を用いてコーティングされた非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に送達されており（β－１インテグリンタンパク質を発現する細胞中への取り込みを容易にするために）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｓｈＲＮＡが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から細胞質へ通過することを可能にするリステリオリシンＯ孔形成性タンパク質を発現するようにコードされる。Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ．）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒ．２０１３も参照のこと。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞中に導入され、送達される。ガイドＲＮＡの送達のために使用され得る技術として、生分解性ポリマー、リポソームまたはナノ粒子によるカプセル封入を利用するものが挙げられる。このようなポリマー、リポソームおよびナノ粒子は、静脈内に送達され得る。特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、ガイドＲＮＡは、組織部位中に注射される場合も、または全身に投与される場合もある。ｉｎ ｖｉｖｏ送達はまた、その全文が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第５，０３２，４０１号および同５，６０７，６７７号および米国特許出願第２００５／０２８１７８１号に記載されるものなどのβグルカン送達システムによって達成され得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含有する送達ビヒクルは、特定の組織または身体コンパートメントに標的化される。例えば、特定の実施形態では、外因性ＲＮＡをその他の組織に標的化するために、合成担体は、受容体取り込みのために細胞特異的リガンドまたはアプタマーを用いて修飾される（例えば、ＰＥＧを用いてコーティングされ、腫瘍細胞において高度に発現されるトランスフェリン受容体を介した取り込みのためにヒトトランスフェリンタンパク質を用いて官能基付与されたシクロデキストリンナノ粒子中に包まれたＲＮＡ）。さらなるアプローチが、本明細書において以下に記載されているか、または当技術分野で公知である。
本発明は、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５） ３３：９，９８５－９（その全文が本願に組み込まれる）に記載されるようにヒト細胞において試験されている。引用された文献では、修飾されたガイドＲＮＡは、Ｋ５６２細胞、ヒト一次Ｔ細胞およびＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）中に導入される。修飾されたガイドＲＮＡは、非修飾ガイドＲＮＡと比較して、ヒト一次Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含むヒト細胞におけるゲノム編集効率を大幅に増強した。
図１１Ａおよび１１Ｂは、ヒト細胞株における遺伝子破壊が、高頻度のインデルによって、または本明細書において開示され合成された、化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用する切断によって刺激された相同組換えによって達成され得ることを示す実験結果を示す。変異原性ＮＨＥＪによる遺伝子破壊を、ＰＣＲアンプリコンのディープシークエンシング（図１２Ａ）または合成ｓｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９によって誘導されるＫ５６２細胞中の３つの遺伝子座ＩＬ２ＲＧ、ＨＢＢおよびＣＣＲ５でのＨＲによる遺伝子付加（図１２Ｂ）によって測定した。合成ｓｇＲＮＡは、１００万個細胞あたり１μｇ（明るい影）または２０μｇ（暗い影）で送達された。Ｃａｓ９は、プラスミドから（２μｇ）発現され、ＨＲ実験のために、５μｇのＧＦＰをコードするドナープラスミドが含まれた。陽性対照として、２μｇの、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の両方をコードするｓｇＲＮＡプラスミドを使用した（灰色バー）。バーは、平均値＋ｓ．ｅ．ｍ．を表す、ｎ＝３。
図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、本明細書において記載されるような化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用して、刺激された一次ヒトＴ細胞およびＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）において、高頻度の遺伝子破壊または標的化されたゲノム編集を達成できることを示す実験結果を示す。
図１２Ａは、１０μｇの合成ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡおよび１５μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡまたは１μｇのＣａｓ９をコードするプラスミドのいずれかを用いてヌクレオフェクトされた一次ヒトＴ細胞から得られた結果を示す。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の両方をコードする１μｇのｓｇＲＮＡプラスミドを、比較のために含めた。バーは、ｓｇＲＮＡ標的部位にわたるＰＣＲアンプリコンのＴＩＤＥ（分解によるインデルの追跡）分析によって、および対照参照としてｍｏｃｋ処理サンプルを使用して測定されるような、３種の異なるドナーの平均インデル頻度＋ｓ．ｅ．ｍ．を表す、ｎ＝６。非修飾またはＭ修飾されたｓｇＲＮＡを用いるＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達ならびにｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方をコードするプラスミドのヌクレオフェクションは、バックグラウンドを超える対立遺伝子修飾頻度をもたらさない。ＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡの、Ｃａｓ９のためのＤＮＡ発現プラスミドとの同時トランスフェクションは、９．３％のインデル頻度を生じた。ＭＳ修飾されたまたはＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡのいずれかととものＣａｓ９ ｍＲＮＡは、それぞれ４８．７％および４７．９％のインデル頻度を生じた。
図１２Ｂは、刺激されたＴ細胞から得られた結果を示す。細胞を上記のようにではあるが、１５μｇの、２．５モル過剰の示された合成ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡと複合体形成しているＣａｓ９タンパク質を用いてヌクレオフェクトした。ＴＩＤＥ分析によってインデル頻度を測定した。バーは、３種の異なるドナーの平均インデル頻度＋ｓ．ｅ．ｍ．を表す、ｎ＝６。Ｃａｓ９タンパク質と複合体形成されて送達された場合に化学修飾されたｓｇＲＮＡについて、非修飾ｓｇＲＮＡ（３０．７％対１２．８％）を上回る、ＭＳ修飾されたｓｇＲＮＡのインデル頻度における２．４倍の改善が観察された。これらの結果は、Ｃａｓ９タンパク質と複合体形成されて送達された場合に、化学修飾されたｓｇＲＮＡを、刺激されたＴ細胞のゲノム編集のために使用することができることを確立する。
図１２Ｃは、ヒト末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣから得た結果を示す。ＩＬ２ＲＧまたはＨＢＢを標的化する示された１０μｇの合成ｓｇＲＮＡ、および１５μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡまたは１μｇのＣａｓ９プラスミドのいずれかを用いて、５００，０００個の可動化された細胞をヌクレオフェクトした。ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の両方をコードする１μｇのｓｇＲＮＡプラスミドを、比較のために含めた。バーは、Ｔ７エンドヌクレアーゼ切断アッセイによって測定されるような、平均インデル頻度＋ｓ．ｅ．ｍ．を表す、ｎ＝３。インデルは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと同時トランスフェクトされた場合に、非修飾またはＭ修飾されたｓｇＲＮＡを使用するいずれの遺伝子座でも検出されなかった。しかし、ＩＬ２ＲＧ ＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡは、それぞれ、１７．５％および１７．７％インデル頻度を示し、ＨＢＢ ＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡについて、それぞれ、２３．４％および２２．０％を示した。
図１２Ｄは、刺激されたＴ細胞または可動化されたヒト末梢血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣから得た結果を示す。１５μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび１０μｇの示された合成ＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡを用いて、１００万個の細胞をヌクレオフェクトした。最近の研究によって、２種のｓｇＲＮＡの同時使用が、ヒト一次Ｔ細胞における、およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける遺伝子破壊を改善しることが示された。例えば、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１５，６４３－５２を参照のこと。ＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたＣＣＲ５ ｓｇＲＮＡを、２０５塩基対離れて切断する、Ｍａｎｄａｌ研究（「Ｄ」および「Ｑ」と呼ばれる）において報告された配列を用いて化学的に合成した。組み合わせて使用される場合に、各ｓｇＲＮＡの量は、５μｇであった。単一ｓｇＲＮＡを用いるサンプルのインデル頻度を、上記のようにＴＩＤＥ分析によって測定し、２種のｓｇＲＮＡを用いるサンプルの対立遺伝子破壊頻度を、クローニングされたＰＣＲ産物の配列決定によって測定した。バーは、平均インデル頻度＋ｓ．ｅ．ｍ．を表す、ｎ＝３。Ｔ細胞では、「Ｄ」ｓｇＲＮＡ単独は、それぞれＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡについて、５６．０％および５６．３％のインデルを生じ、「Ｑ」ｓｇＲＮＡは、それぞれ、６２．６％および６９．６％のインデルを生じた。組み合わせて使用される場合には、本発明者らが、それぞれ、２つのｓｇＲＮＡ標的部位間の修飾事象の大部分が欠失であった、ＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡについて７３．９％および９３．１％のインデルを観察したように、対立遺伝子修飾の頻度は増大した。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣでは、全体的な頻度は低かったが、観察結果は同様であった。「Ｄ」ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、ＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡについて、９．８％および１１．２％の対立遺伝子修飾頻度が観察され、「Ｑ」ｓｇＲＮＡについて１７．８％および１９．２％が観察された。組み合わせて使用された場合には、頻度は、それぞれ、ＭＳ修飾されたおよびＭＳＰ修飾されたｓｇＲＮＡについて３７．８％および４３．０％に増大した。これは、２種の化学修飾されたｓｇＲＮＡの使用が、一次ヒトＴ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて遺伝子破壊を容易にするための高度に有効な方法であることを示す。
その他の使用の例として、以下に記載されるようなゲノム編集および遺伝子発現調節が挙げられる。
ゲノム編集
一態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで（「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、限定されるものではないが、無細胞システム、細胞溶解物、細胞の単離された成分および生存している生物の外側の細胞を含む）ＤＮＡ配列を修飾するためにゲノム編集するための方法を提供する。ＤＮＡ配列は、染色体配列、エピソーム配列、プラスミド、ミトコンドリアＤＮＡ配列またはエンハンサー配列または非コーディングＲＮＡのＤＮＡ配列などの機能的遺伝子間配列を含み得る。方法は、ＤＮＡ配列を、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させることを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞の外側で接触する。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞内のゲノム中に位置し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで接触する。特定の実施形態では、細胞は、生物または組織内にある。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、単細胞生物または胚である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、ＤＮＡ配列中の標的化される部位に標的化するのに役立つ。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的化される部位でＤＮＡ配列の少なくとも１つの鎖を切断する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的化される部位でＤＮＡ配列の両鎖を切断する。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質を細胞または別のシステム中に導入することをさらに含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製された、または精製されていないタンパク質として導入される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡによって導入される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする直鎖または環状ＤＮＡによって導入される。特定の実施形態では、細胞またはシステムは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含む。
特定の実施形態では、二本鎖切断は、エラー－プローン、非相同末端結合（「ＮＨＥＪ」）修復プロセスによって修復され得る。特定の実施形態では、二本鎖切断は、相同性指向性修復（ＨＤＲ）プロセスによって修復され得、その結果、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれるか、それと交換され得る。
特定の実施形態では、方法は、少なくとも１種のドナーポリヌクレオチドを細胞またはシステム中に導入することをさらに含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列中の標的化される部位のいずれかの側上の配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１種の相同配列を含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは相同組換えなどの相同性指向性修復によって、ＤＮＡ配列中に組み込まれる、またはそれと交換されるドナー配列を含む。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、上流相同配列および下流相同配列を含み、その各々は、それぞれ、ＤＮＡ配列中の標的化される部位の上流および下流に位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する。これらの配列類似性によって、例えば、ドナーポリヌクレオチドと標的化されるＤＮＡ配列間の相同組換えが可能となり、その結果、ドナー配列が、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ得る（またはそれと交換され得る）。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列中の標的部位（複数可）は、障害を引き起こすか、またはそれと関連し得る、突然変異、例えば、点突然変異、転位置または逆位に広がるか、または隣接する。特定の実施形態では、方法は、細胞またはシステム中に、（ｉ）突然変異の野生型対応物および（ｉｉ）ＤＮＡ配列中の標的化される部位の片側上の配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの相同配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することによって、突然変異を補正することを含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列中の標的化される部位の両鎖上の配列と実質的な配列同一性を有する相同配列を含む。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えなどの相同性指向性修復プロセスによって、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ得るまたはそれと交換され得る外因性配列を含む。特定の実施形態では、外因性配列は、任意選択的に、外因性プロモーター制御配列と作動可能に連結されるタンパク質コーディング遺伝子を含む。したがって、特定の実施形態では、外因性配列の組込みの際に、細胞は、組み込まれた遺伝子によってコードされるタンパク質を発現し得る。特定の実施形態では、外因性配列は、レシピエント細胞またはシステムにおけるその発現が外因性プロモーター制御配列によって調節されるように、標的化されたＤＮＡ配列中に組み込まれる。標的化されたＤＮＡ配列中への外因性遺伝子の組込みは、「ノックイン」と呼ばれる。その他の実施形態では、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコード配列などであり得る。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、標的化される部位の、またはその付近のＤＮＡ配列の一部と本質的に同一であるが、少なくとも１つのヌクレオチド変更を含む配列を含む。例えば、特定の実施形態では、ドナー配列は、標的化される部位の、またはその付近のＤＮＡ配列の修飾された、または突然変異された型を含み、その結果、標的化される部位の組込みまたはそれとの交換の際に、得られた標的化される部位の配列は、少なくとも１つのヌクレオチド変更を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド変更は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、１つまたは複数のヌクレオチドの置換またはそれらの組合せである。修飾された配列の組込みの結果として、細胞は、標的化されたＤＮＡ配列から修飾された遺伝子産物を生成し得る。
特定の実施形態では、方法は、マルチプレックス適用のためのものである。特定の実施形態では、方法は、細胞またはシステム中にガイドＲＮＡライブラリーを導入することを含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１，０００種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０，０００種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００，０００種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１，０００，０００種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００，０００種の異なる配列を標的化する。
ヒトおよび哺乳動物細胞におけるゲノム編集
本発明の実施形態は、哺乳動物細胞において、標的ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ配列を修飾するためのゲノム編集するための方法において有用である。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、染色体配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、タンパク質コード配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、エンハンサー配列または非コード配列などの機能的遺伝子間配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡは、ヒト遺伝子の一部である。いくつかのこのような実施形態では、ヒト遺伝子は、クラスリン軽鎖（ＣＬＴＡ１）遺伝子、ヒトインターロイキン２受容体γ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＬＴＡ４）遺伝子、ヒトプロトカドヘリンα４（ＰＣＤＨＡ４）遺伝子、ヒトｅｎｇｒａｉｌｅｄホメオボックス１（ＥＮ１）遺伝子、鎌形赤血球貧血およびサラセミアに関与する突然変異を有し得るヒトヘモグロビンβ（ＨＢＢ）遺伝子またはＨＩＶの共受容体をコードするヒトケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子である。
特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかのこのような実施形態では、ヒト細胞は、一次ヒト細胞である。さらなる実施形態では、一次ヒト細胞は、ヒト一次Ｔ細胞である。ヒト一次Ｔ細胞は、刺激されている場合も、刺激されていない場合もある。特定の実施形態では、ヒト細胞は、ＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）などの幹／前駆体細胞である。特定の実施形態では、ヒト細胞は、培養細胞株、例えば、商業的に得ることができるものなどに由来する。例示的細胞株として、Ｋ５６２細胞、ヒト骨髄性白血病株が挙げられる。
特定の実施形態では、細胞は、生存生物内にある。特定のその他の実施形態では、細胞は、生存生物の外側にある。
方法は、ＤＮＡ配列を、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させることを含む。
特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡを細胞中に導入または送達することをさらに含む。いくつかのこのような実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞中にトランスフェクションによって導入される。ＲＮＡトランスフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが挙げられる。その他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞（より詳しくは、細胞核）中にヌクレオフェクションによって導入される。ヌクレオフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂまたはＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒなどのヌクレオフェクション装置および関連試薬を利用し得る。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質を細胞中に導入または送達することをさらに含む。いくつかのこのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製または非精製タンパク質として導入される。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡによって導入される。いくつかのこのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中にトランスフェクションによって導入される。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞（より詳しくは、細胞核）中にヌクレオフェクションによって導入される。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質が、ガイドＲＮＡとの複合体で細胞中に導入されるようなリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達を使用する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体でガイドＲＮＡと複合体形成され得、これは、ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の同時送達を可能にする。例えば、Ｃａｓ：ｇＲＮＡ複合体は、細胞中にヌクレオフェクトされ得る。
特定の実施形態では、方法は、すべてのＲＮＡ送達プラットフォームを使用する。例えば、いくつかのこのような実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、同時にまたは実質的に同時に細胞中に導入される（例えば、同時トランスフェクションまたは同時ヌクレオフェクションによって）。特定の実施形態では、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよび修飾されたｇＲＮＡの同時送達は、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよび非修飾ｇＲＮＡの同時送達と比較して、より高い編集頻度をもたらす。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してより高い編集頻度を提供する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中に逐次導入される、すなわち、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中に異なる時点で導入される。各薬剤の導入間の期間は、数分（またはそれ未満）から数時間または数日で変わり得る。例えば、いくつかのこのような実施形態では、ｇＲＮＡは最初に送達され、続いて、Ｃａｓ ｍＲＮＡが４、８、１２または２４時間後に送達される。その他のこのような実施形態では、Ｃａｓ ｍＲＮＡが最初に送達され、続いて、ｇＲＮＡが４、８、１２または２４時間後に送達される。いくつかの特定の実施形態では、最初の修飾されたｇＲＮＡの送達、続いてＣａｓ ｍＲＮＡの送達が、非修飾ｇＲＮＡとそれに続くＣａｓ ｍＲＮＡの送達と比較して、より高い編集頻度をもたらす。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞中に、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドと一緒に導入される。いくつかのこのような実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドは、細胞中にヌクレオフェクションによって導入される。いくつかの特定の実施形態では、ＲＮＰベースの送達プラットフォームまたは全ＲＮＡ送達プラットフォームは、ＤＮＡプラスミドベースの送達システムよりも、一次細胞において低い細胞毒性を提供する。
特定の実施形態では、方法は、ヒト一次Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含むヒト細胞において大幅に増強されたゲノム編集効率を提供する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、変異原性ＮＨＥＪおよび遺伝子破壊を示し得る、挿入または欠失（インデル）の頻度を増大する。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を有する修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してインデルの頻度を増大する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡおよびＣａｓ ｍＲＮＡの、ヒト一次Ｔ細胞への同時送達は、非修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓ ｍＲＮＡの同時送達と比較されるように、インデルの頻度を増大する。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を有する修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、ヒト一次Ｔ細胞においてインデルの頻度を増大する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してｇＲＮＡ安定性を改善する。１つの例として、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル（Ｍ）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡを上回って、ヌクレアーゼに対する安定性を中程度に改善し、また塩基対形成熱安定性を改善する。別の例として、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、ヌクレアーゼに対する安全性を劇的に改善する。ｇＲＮＡ末端修飾は、エキソヌクレアーゼに対する細胞内安定性を増強し、従って、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、ヒト細胞中に同時送達されるか、逐次送達される場合にゲノム編集の有効性の増大を可能にすることが考慮される。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、標的遺伝子組換えを刺激し、これは、順に、例えば、相同組換えまたはＮＨＥＪによる遺伝子編集を可能にする。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡよりも高いレベルの相同組換えを刺激する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、高い特異性を保持する。特定の実施形態では、非修飾ｇＲＮＡと比較されるように、修飾されたｇＲＮＡを用いた場合に、オンターゲット対オフターゲットのインデル頻度の比は改善される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質とのＲＮＰ複合体で送達された修飾されたｇＲＮＡは、ＤＮＡプラスミドベースの送達システムと比較して大幅に良好なオンターゲット：オフターゲット比を提供する。
遺伝子発現調節
特定の実施形態では、本明細書において記載されるガイドＲＮＡは、対象の遺伝子の転写または発現を調節するために使用される。例えば、特定の実施形態では、遺伝子の転写を増大するために、Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）および転写アクチベーターポリペプチドを含む融合タンパク質が使用される。同様に、特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）およびレプレッサーポリペプチドを含む融合タンパク質は、遺伝子の転写を干渉することによって遺伝子発現をノックダウンするために使用される。
少なくとも１つの態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで対象の遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。方法は、細胞または別のシステム中に、（ｉ）本明細書において記載される合成ガイドＲＮＡおよび（ｉｉ）融合タンパク質を導入することを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および転写活性化ドメイン、転写レプレッサードメインまたはエピジェニック修飾ドメインなどのエフェクタードメインを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヌルヌクレアーゼであるＣａｓ９タンパク質などの突然変異したＣａｓタンパク質を含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａおよび／またはＮ８６３Ａなどの１つまたは複数の突然変異を含有する。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、精製または非精製タンパク質として細胞またはシステム中に導入される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡによって細胞またはシステム中に導入される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする直鎖または環状ＤＮＡによって細胞またはシステム中に導入される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、融合タンパク質を、染色体配列、エピソーム配列、プラスミド、ミトコンドリアＤＮＡ配列またはエンハンサーなどの機能的遺伝子間配列または非コーディングＲＮＡのＤＮＡ配列を含む特定の標的ポリヌクレオチドに向けるのに役立つ。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、標的ポリヌクレオチドにおいて配列の発現を調節する。遺伝子発現を調節するためのガイドＲＮＡは、機能的ＲＮＡをコードする任意の所望の内因性遺伝子または配列を標的化するように設計され得る。ゲノム標的配列は、内因性遺伝子の転写開始部位の付近で、あるいは、内因性遺伝子の翻訳開始部位の付近で選択され得る。特定の実施形態では、標的配列は、遺伝子の「プロモーター近位」領域と伝統的に呼ばれるＤＮＡの領域中にある。特定の実施形態では、標的配列は、転写開始部位の約１，０００塩基対上流から転写開始部位の約１，０００塩基対下流の領域中にある。特定の実施形態では、標的配列は、遺伝子（例えば、別の染色体上の）の転写のための開始部位から離れている。
特定の実施形態では、方法は、マルチプレックス適用のためのものである。特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡのライブラリーを細胞またはシステム中に導入することを含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも１，０００，０００種の独特なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００，０００種の異なる配列を標的化する。
キット
一態様では、本発明は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を製造することおよび／または標的ポリヌクレオチドを結合、ニッキングもしくは切断するためのその活性を支持することを含む、上記の方法を実施するための試薬を含有するキットを提供する。特定の実施形態では、本明細書において開示される方法の１種または複数の反応成分、例えば、１種または複数のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、使用のためのキットの形態で供給され得る。特定の実施形態では、キットは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸および本明細書において記載される１種または複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのライブラリーのセットを含む。特定の実施形態では、キットは、１種または複数のその他の反応成分を含む。特定の実施形態では、１種または複数の反応成分の適当な量が、１つまたは複数の容器中で提供されるか、または基板上に保持される。
キットのさらなる成分の例は、これらに限定されないが、１種または複数の異なるポリメラーゼ、１種または複数の宿主細胞、外来核酸を宿主細胞中に導入するための１種または複数の試薬、ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出するための、または標的核酸の状態を確認するための１種または複数の試薬（例えば、プローブまたはＰＣＲプライマー）およびバッファー、トランスフェクション試薬または反応のための培養培地（１Ｘまたはより濃縮された形態の）を含む。特定の実施形態では、キットは、生化学的および物理的支持体、終結、修飾および／または消化試薬、浸透圧調節物質ならびに反応、トランスフェクションおよび／または検出のための装置の成分のうち、１種または複数を含む。
使用される反応成分は、種々の形態で提供され得る。例えば、成分（例えば、酵素、ＲＮＡ、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に懸濁されるか、またはビーズに結合されるか、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥された粉末もしくはペレットとしてであり得る。後者の場合には、成分は、再構成されると、アッセイにおいて使用するための成分の完全混合物を形成する。本発明のキットは、任意の適した温度で提供され得る。例えば、液体中にタンパク質成分またはその複合体を含有するキットの貯蔵のためには、それらが０℃未満で、好ましくは、約－２０℃で、おそらくは、グリセロールまたはその他の適した凍結防止剤を含有する凍結耐性溶液中で提供され、維持されることが好ましい。
キットまたはシステムは、少なくとも１種のアッセイにとって十分な量で、本明細書において記載される成分の任意の組合せを含有し得る。いくつかの適用では、１種または複数の反応成分は、個々の、通常、ディスポーザブルのチューブまたは同等の容器中に予め測定された単回使用量で提供され得る。このような配置を用いて、標的核酸または標的核酸を含有するサンプルもしくは細胞を、個々のチューブに直接添加することによってＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ反応が実施され得る。キット中に供給される成分の量は任意の適当な量であり得、製品が向けられる市場に応じて変わり得る。成分が供給される容器（複数可）は、供給された形態を保持可能である任意の従来の容器、例えば、マイクロチューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、ボトルまたは流体装置、カートリッジ、ラテラルフローまたはその他の同様の装置などの複合的試験装置であり得る。
キットはまた、容器または容器の組合せを保持するためのパッケージング材料を含み得る。このようなキットおよびシステムの通常のパッケージング材料は、種々の立体配置のいずれかの中に（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイ中など）反応成分または検出プローブを保持する固体マトリクス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子など）を含む。キットは、成分の使用のための有形の形態で記録された使用説明書をさらに含み得る。
［実施例１］
化学的に合成されたガイドＲＮＡの、ＤＮＡ標的配列を標的化し、切断する能力を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを開発した。手短には、図３に示されるように、約４ｋｂのＰＡＭ－アドレス可能なＤＮＡ標的を、プラスミドによって保持されるヒト配列（ここでは、ヒトクラスリン軽鎖ＣＬＴＡ遺伝子に由来する配列）の分取ＰＣＲ増幅によって調製した。２０μＬの反応容量中で、５０フェントモルの線形化ＤＮＡ標的を、５０ｎＭ ｓｇＲＮＡ、３９ｎＭ組換え精製Ｃａｓ９タンパク質（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ａｇｉｌｅｎｔ）および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ７．６で、３７℃で３０分間インキュベートした。完了するとすぐに、０．５μＬのＲＮａｃｅ Ｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を添加し、インキュベーションを３７℃で５分間、次いで、７０℃で１５分間継続した。続いて、０．５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ｇｒａｄｅ、ＮＥＢ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。アリコートをＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐ中にロードし、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２２００で分析した。精密検査ステップは、標的ＤＮＡとの結合からＣａｓ９を放出するように働き、これを切断についてアッセイした。
図４に列挙されるような一連のガイドＲＮＡを化学的に合成した。手短には、個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による化学純度および質量分析による全長鎖純度に基づいて品質管理承認した。これらのガイドＲＮＡの各々を、ヒトＣＬＴＡ遺伝子を標的化するように設計した。
結果は、図４に示されている。図４の表１に示されるように、１種を除くすべての化学的に合成されたガイドＲＮＡが、ＣＬＴＡによってコードされるＤＮＡ標的配列を標的化し、相当な切断率で切断した。１つの例外は、その５’末端に３７デオキシリボヌクレオチドの連続配列を有する「ＣＬＴＡ＿３７＿デオキシ」ガイドＲＮＡであった。
本明細書において開示されるように、種々の化学修飾をガイドＲＮＡの配列中の特定の位置で試験した。驚くべきことに、ガイドＲＮＡのガイド配列（ガイドＲＮＡ中のスペーサー配列としても公知である）中の試験された位置は、ガイドＲＮＡ中の単一ヌクレオチド内の複数の修飾の組合せを含む試験された修飾のほとんどを、修飾が標的結合配列中に例示される場合であっても許容した。
結果は、修飾が標的ポリヌクレオチドの標的特異的切断を妨げなかったので、特定の位置に修飾を含有するガイドＲＮＡは、活性Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって許容されることを示した。図４の表１に列挙されたすべてのガイドＲＮＡ配列では、５’末端の最初の２０ヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中の標的配列と相補的である。試験され、特定の位置で許容されることがわかった修飾として、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（＝２’ＯＭｅ）、２’－デオキシリボヌクレオチド、ラセミホスホロチオエートヌクレオチド間連結（複数可）（＝Ｐ（Ｓ））、３’－ホスホノ酢酸（＝ＰＡＣＥ）、３’－チオホスホノ酢酸（＝チオＰＡＣＥ）、Ｚヌクレオチドおよびこれらの組合せが挙げられる。
特に、試験された位置の、本明細書において開示され試験される化学修飾（図４の表１に列挙されるような）は、種々のガイドＲＮＡ中の同等の位置で許容されるということが考慮される。特定の実施形態では、本明細書において開示され試験される化学修飾は、ガイドＲＮＡ中の任意の位置で許容される。
本明細書において開示されるように、特定の特性を改善しようとして、化学修飾されたヌクレオチドをガイドＲＮＡ中に組み込んだ。このような特性として、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ耐性の改善、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体のオフターゲット効果の低減（特異性の改善としても公知である）、標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合する場合の、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の有効性の改善、トランスフェクション効率の改善および／または核局在性などのオルガネラ局在性の改善が挙げられる。
修飾されたＲＮＡの使用（例えば、特定の適用における、核酸分解（nucleotlytic degradation）を遮断するための）が公知であるが、特に、ＲＮＡ配列が、特定の機能を発揮するためにタンパク質または酵素と複合体を形成することを必要とする場合には、ＲＮＡ配列中の任意のまたはすべての位置に修飾を簡単に組み込み、それが機能すると期待することはできないということは広く知られている。したがって、これらのガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて十分なまたは改善された機能を発揮しながら、種々のヌクレオチド位置に化学修飾を許容し得るか否かは予測可能ではなかった。実際、ガイドＲＮＡが、特に、試験された位置のうちいくつかで例示された、また試験された程度に特定の修飾を許容し得ることは予期されなかった。
［実施例２］
化学合成されたガイドＲＮＡの、ＤＮＡ標的配列を標的化し、切断する能力を評価するために、実施例１において記載されたものと同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用した。標的ＤＮＡ構築物は、ヒトＤＮＡ標的（ヒトクラスリン軽鎖（ＣＬＴＡ１）遺伝子、ヒトインターロイキン２受容体γ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、ヒト細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４（ＣＬＴＡ４）遺伝子、ヒトプロトカドヘリンα４（ＰＣＤＨＡ４）遺伝子およびヒトｅｎｇｒａｉｌｅｄホメオボックス１（ＥＮ１）遺伝子に由来する配列）のものであり、標的ＤＮＡとは、１つまたは複数のヌクレオチドだけ異なるオフターゲットのＤＮＡ構築物を伴った。
表３は、ガイドＲＮＡ構築物およびその配列を示し、それらのガイドＲＮＡ構築物が標的化し、切断する能力を評価するために使用されるＤＮＡ構築物を伴う。表３中に列挙されたすべてのガイドＲＮＡ配列において、５’末端の最初の２０ヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中の標的配列と相補的である。オンターゲット構築物は、２０ｎｔの標的配列を含む。オフターゲット構築物は、標的ＤＮＡと同一の２０ヌクレオチドのほとんどを含み、１、２または３つのヌクレオチド相違を有する。したがって、ガイドＲＮＡは、完全にではないが大部分は、オフターゲット構築物の配列と相補的である。オフターゲット構築物は、ヒトゲノム中に生じることが公知である遺伝子配列に基づいている。
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表３中のＤＮＡ標的構築物は、以下の配列を有していた。
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２０μＬの反応容量中で、５０フェントモルの線形化ＤＮＡ標的を、５０ｎＭ ｓｇＲＮＡ、３９ｎＭ組換え精製Ｃａｓ９タンパク質（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ａｇｉｌｅｎｔ）および１０ｍＭまたは０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ７．６で、３７℃で３０分間インキュベートした。完了するとすぐに、０．５μＬのＲＮａｃｅ Ｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を添加し、インキュベーションを３７℃で５分間、次いで、７０℃で１５分間継続した。続いて、０．５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．ｇｒａｄｅ、ＮＥＢ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。アリコートをＤＮＡ １０００またはＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐ中にロードし、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２２００で分析するか、あるいは、ゲノムＤＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ中にロードし、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで分析した。精密検査ステップは、標的ＤＮＡとの結合からＣａｓ９を放出するように働き、これを切断についてアッセイした。切断収率は、式ａ／（ａ＋ｂ）×１００（式中、ａは、２種の切断生成物のバンド強度の合計であり、ｂは、存在すれば残存する未切断ＤＮＡである）によって算出した。１００％の切断パーセンテージは、標的ＤＮＡ構築物のすべてが切断されたことを意味する。
一連のガイドＲＮＡを化学合成した。ガイドＲＮＡオリゴマーを、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３３，１１５４０－５６に記載される手順に従って２’－Ｏ－チオノカルバメート保護されたヌクレオシドホスホラミダイトを使用してＡＢＩ ３９４ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で合成した。２’－Ｏ－メチルホスホラミダイトを、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護されたホスホラミダイトと同一の条件下でＲＮＡオリゴマー中に組み込んだ。チオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）修飾されたＲＮＡの合成のために使用された２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ酢酸－１，１－ジメチルシアノエチルエステル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルヌクレオシドは、公開された方法に本質的にしたがって合成した。Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，９４０－５０およびＴｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０，７４－５４を参照のこと。ホスホロチオエート含有オリゴマーについては、カップリング反応後のヨウ素酸化ステップを、ピリジン－アセトニトリル（３：２）混合物中の３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンの０．０５Ｍ溶液を使用する、６分間の硫化ステップによって置き換えた。
すべてのオリゴヌクレオチドを、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ｑ－ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｅｒｉｅｓ ＬＣシステムを使用する液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。ｓｇＲＮＡの合成および精製の収率は、ＬＣ－ＭＳ由来の総イオンクロマトグラムから得られた質量分析スペクトルの逆重畳積分を使用して推定した。１００マーのｓｇＲＮＡの化学合成は、通常、名目上１マイクロモル規模の合成から２５～３５％全長生成物をもたらした。イオン対形成バッファー条件を使用する逆相ＨＰＬＣ精製は、通常、粗生成物からの２０％の収率を与え、最終ｓｇＲＮＡの推定される純度は、９０％～９５％の範囲にある。
結果は、表４に示されている。「切断された標的％」は、切断された標的ＤＮＡ構築物のパーセンテージを示す。実験は、標的ＤＮＡと競合する可能性があり、そのため、アッセイの際に添加された非特異的ＤＮＡの可能性ある衝撃が見られ得る、モル過剰の標的のない競合物ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）を添加して、および添加せずに行った。
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結果は、修飾が、オンターゲットポリヌクレオチドの標的特異的切断を妨げなかったので、特定の位置に修飾を含有するガイドＲＮＡが、活性Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって許容されることを示した。試験され、特定の位置で許容されることがわかった修飾として、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（＝２’ＯＭｅ）、２’－デオキシリボヌクレオチド、ラセミホスホロチオエートヌクレオチド間連結、３’－ホスホノ酢酸（＝ＰＡＣＥ）、３’－チオホスホノ酢酸（＝チオＰＡＣＥ）、Ｚヌクレオチド、２－チオウラシル、２－アミノアデニン、５－メチルウラシル、Ｃｙ５フルオロフォアとカップリングしている５－アミノアリルウラシル、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーおよびこれらの組合せが挙げられる。
特に、試験された位置の、本明細書において開示され、記載される化学修飾（表３および４に列挙されるような）は、種々のガイドＲＮＡ中の同等の位置で許容されるということが考慮される。
本明細書において開示されるように、特定の特性を改善しようとして、化学修飾されたヌクレオチドをガイドＲＮＡ中に組み込んだ。このような特性として、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ耐性の改善（安定性の改善としても公知である）、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体のオフターゲット効果の低減（特異性の改善としても公知である）、標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合する場合のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の有効性の改善、トランスフェクション効率の改善および／またはオルガネラ局在性の改善が挙げられる。
表３および４におけるアッセイ結果は、以下を示す。（１）ガイドＲＮＡでは、多数の位置が、種々の化学修飾を許容し得る、（２）ガイドＲＮＡの５’および３’末端は、さまざまな末端保護性修飾を許容し、このような修飾は、エキソヌクレアーゼのＲＮＡ分解を阻害するのに有用である、（３）２－チオＵを使用して、Ｇ－Ｕゆらぎ対形成を含むオフターゲットの相互作用を阻止し、それによって、オフターゲットのハイブリダイゼーション相互作用を阻害することによってガイド対形成の特異性を増大することができる、（４）５’伸長は、一般に、十分に許容される、（５）ガイドＲＮＡの表面に露出された領域（公開された結晶構造から推測されるような）は、Ｕ’を５－メチルＵ’に大規模に修飾することに許容性があり、これは、修飾されたＲＮＡを、非修飾ＲＮＡによって刺激されるものなどの免疫応答を回避する可能性をより高くする可能性がある、（６）ＲＮＡフォールディングについては、Ｇ－Ｃ対は、Ａ－Ｕ対よりも強く、より安定である。少なくとも１つのガイドＲＮＡは、いくつかのＧ－Ｃ対を、非修飾Ａ－Ｕ対よりも熱力学的に安定である２’－Ｏ－メチルＡ─２’－Ｏ－メチルＵ対と置換することに許容性がある。
より詳しくは、本実施例は、２’－Ｏ－メチル修飾が、デュアルガイドＲＮＡ（表３および４においてエントリー１２によって示されるように）および単一ガイドＲＮＡ（エントリー１４３～１４６、１６９～１７０）の５’および３’末端で許容され、したがって、末端保護して、エキソヌクレアーゼに対してｇＲＮＡを安定化することを可能にすることを示す。２’－Ｏ－メチル修飾は、すべてではないがほとんどの内部位置で許容され、したがって、エンドヌクレアーゼを含む種々のヌクレアーゼに対する安定化を可能にする（エントリー１４６、１５３～１６８、１７４～１７９）。しかし、本実施例はまた、ガイドＲＮＡ中のすべての位置が、２’－Ｏ－メチル許容するわけではないことを実証し（エントリー１５１～１５２および１７１～１７３によって示されるように）、これは、５’末端での多すぎる連続した２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、２６以上の連続する２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド）または５’末端の２０マーのガイド配列の下流（３’）のＣおよびＵヌクレオチドの多すぎる２’－Ｏ－メチル修飾は、十分に許容されない（例えば、エントリー１５４～１５６において試験された位置によって示されるような、エントリー１７１～１７３における、配列位置＋５６および＋６９の２’－Ｏ－メチルウラシルの一方または両方の阻害効果）ことを示唆する。
本実施例は、２０マーのガイド配列中全体の２’－Ｏ－メチル修飾は、１０ｍＭ Ｍｇ２＋（エントリー１４６）を含有するバッファー中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ使用の際に許容されるが、このような広範な修飾は、細胞中に存在するような生理学的条件下では十分に許容されない（エントリー１４７～１５０）ことを示す。したがって、いくつかの実施形態では、２０マーのガイド配列中全体に１５以上の、あるいは１７以上の、あるいは１８以上の、あるいは２０の２’－Ｏ－メチル修飾を含むｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ配列を修飾するためにゲノム編集すること、ｉｎ ｖｉｔｒｏで対象の遺伝子の発現を調節すること、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ標的配列を切断することおよびその他の使用などの、本明細書において記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ法のために使用される。
本実施例は、２’－デオキシ修飾の広範な組込みは、十分には許容されず、実質的に完全に阻害され得る（エントリー１８０～１８２）ことを示す。しかし、２’－デオキシ修飾は、いくつかの位置では十分に許容され得（エントリー１８３）、したがって、このような修飾は、ヌクレアーゼを阻害するために有用であり得る。
本実施例はまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ中の３種の既知ステムループのどのループにおいても、フルオロフォアまたは色素標識が許容されることも示す（エントリー１１６）。このような標識はまた、ガイド配列上の５’オーバーハングにおいて許容され（エントリー１１４）、ｓｇＲＮＡ中のさらなる位置で許容され（エントリー１１４）、デュアル－ガイド適用において使用されるｔｒａｃｒＲＮＡ中のループにおいて許容される（エントリー１１）。この実施例では、２種の異なる種類のフルオロフォアを試験した（本質的にヌクレオチドに取って代わるホスホジエステルによって連結されたフルオロフォア（リボース環がない）（エントリー１１４＆１１６）、およびガイドＲＮＡ中に組み込まれた５－アミノアリルＵと共有結合によってカップリングされた色素標識（Ｃｙ５）（エントリー１１））。
本実施例はまた、Ｚ塩基は、特に、いくつかのＣ’がＺ塩基で置換される合成ガイドＲＮＡの修飾として合成ガイドＲＮＡにおいて許容されることを示す（エントリー２９０～２９１）。本実施例はまた、表３および４で示されるように、いくつかのその他の塩基が、種々の位置で許容されることを示す。
本実施例は、ガイドＲＮＡの５’および３’末端がさまざまな末端保護性修飾を許容し得ることをさらに示す。このような修飾を使用して、エキソヌクレアーゼのＲＮＡ分解を阻害できる。このような修飾の耐性についての支持は、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９，９８５－９に見出すことができる。ガイドＲＮＡの５’および３’末端の修飾のさらなる支持は、表３および４においてエントリー１４３～１４４、１８５～２２３、２４１～２５７、２５８～２６６および２７２～２７９によって提供される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、５’末端または３’末端に、または５’末端および３末端の各々に７つ以下の、あるいは６つ以下の、あるいは５つ以下の、あるいは４つ以下の、あるいは３つ以下の、あるいは２つ以下の、あるいは１つの修飾されたヌクレオチドを含む。デュアル－ガイドＲＮＡは、同様に保護され得る（エントリー１２～１５）。
本実施例は、２－チオＵを使用して、Ｇ－Ｕゆらぎ対形成を含むオフターゲットの相互作用を阻止し、それによって、オフターゲットのハイブリダイゼーション相互作用を阻害することによってガイド配列対形成の特異性を増大することができることをさらに示す（エントリー１６～３９）。ガイドＲＮＡおよびＣＬＴＡ１オフターゲット３（「ＣＬＴＡ１ ＯＦＦ３－ターゲット」または「ＣＬＴＡ１ ＯＦＦ３」とも呼ばれる）間のハイブリダイゼーションに関与する塩基対のうち１つは、Ｇ－Ｕゆらぎ対である。ガイドＲＮＡ中の対応するＵを、２－チオＵと置換することは、切断を１００％（エントリー８）から５９％（エントリー３９）に低減する。その他のＵ’を２－チオＵ’で置換すること（例えば、配列位置＋３または＋９で、エントリー２３および３１）は、おそらくは、それらのＵ’が試験されたオフターゲット部位の各々と十分にハイブリダイズされる場合に、Ｇ－Ｕゆらぎ対形成に関与しないために、同一効果を有さない。したがって、２－チオＵは、オフターゲット部位がＧ－Ｕゆらぎ対形成に関与する場合に、ガイドＲＮＡの標的特異性を増大し得る。
本実施例はまた、ガイド配列と結合している５’－オーバーハング配列が、一般に、十分に許容される（例えば、エントリー８３～９５、１１４および２０６～２２３）ことを示す。例えば、５’末端の嵩高いジメトキシトリチル（ｄｍｔ）基は十分に許容された（エントリー９５）。ｄｍｔのクロマトグラフィー特性を使用して、一般に、合成の際に製造される不完全に伸長した副生成物からの、全長合成ＲＮＡの精製をさらに容易にできる。したがって、いくつかの実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、例えば、ガイド配列と相補的であり、リンカーが５つ以上のあるいは６または７の連続するウリジンヌクレオチドであり得る、ポリヌクレオチドなどの重合体リンカーまたは同様のホスホジエステルベースのリンカーによって、その３’末端で、ガイド配列の５’末端と共有結合によって連結している、１５以下のヌクレオチドの短いポリヌクレオチド配列を含む５’－オーバーハング配列を含む。
本実施例はまた、ガイドＲＮＡの表面に露出した領域（他者によって公開された結晶構造から推測されるような）は、ウラシルヌクレオチドを５－メチルウラシル（５－メチルＵ’）に大規模に修飾することに耐容性があり（エントリー２８８）、これは、修飾されたＲＮＡを、非修飾ＲＮＡによって刺激されるなどの免疫応答を回避する可能性をより高くする可能性があることを示す。特に、合成ガイドＲＮＡの５’および３’末端は免疫賦活性である可能性があり、本実施例は、５’および３’末端が、５－メチルＵ修飾に耐容性があることを示す（エントリー２８８）。
本実施例はまた、合成ガイドＲＮＡは、いくつかのＧ－Ｃ対を、非修飾Ａ－Ｕ対よりも熱力学的に安定である２’－Ｏ－メチルＡ─２’－Ｏ－メチルＵと置換することに許容性があることを示す（エントリー２９２～２９３における非末端－２’－Ｏ－メチルＵおよび相補的－２’－Ｏ－メチルＡ修飾を参照のこと）。これは、フォールディングされたＲＮＡについて、Ｇ－Ｃ対はＡ－Ｕ対よりも強く、より安定であることが公知であるので有利である。合成ガイドＲＮＡにおけるＧ－Ｃ対の、このような熱安定化されたＡ－Ｕ対との置換によって、よく使われるＲＮＡフォールディングアルゴリズムによって予測され得るように、意図されないＧ－Ｃ対（複数可）を含むミスフォールディングされた構造を防ぐことによる、活性構造のフォールディングの改善が可能となる。
例示的実施形態
本明細書において開示される対象に従って提供される例示的実施形態として、これらに限定されないが、特許請求の範囲および以下の実施形態を含む。
Ａ１．（ｉ）標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
ステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡ機能性を有する合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２．２’－デオキシ部分を含む、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３．２’－フルオロ、２’－クロロ、２’－ブロモおよび２’－ヨードから選択される２’－ハロ部分を含む、実施形態Ａ１またはＡ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４．ホスホロチオエート基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ５．ＰＡＣＥ基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ６．チオＰＡＣＥ基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ７．２’－Ｏ－メチル部分を含む、実施形態Ａ２～Ａ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ８．２－チオウラシルを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ９．４－チオウラシルを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１０．２－アミノアデニンを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１１．ヒポキサンチンを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１２．５－メチルシトシンを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１３．５－メチルウラシルを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１４．５－アミノアリル－ウラシルを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１５．Ｚリボヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１６．Ｚデオキシリボヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１７．スクアレートコンジュゲーションを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１８．色素リンカーを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１９．色素リンカーが、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーである、実施形態Ａ１８の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２０．２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホロチオエートを有するヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２１．２’－Ｏ－メチルおよび３”－ＰＡＣＥを有するヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２２．２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオＰＡＣＥを有するヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２３．２’－デオキシおよび３’－ＰＡＣＥを有するヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２４．５－メチルシチジンを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２５．メチルホスホネートを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２６．ＰＡＣＥのエステルを含み、エステルが任意選択的にメチルエステルである、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２７．ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの両方を含む単一ＲＮＡ鎖を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２８．２つのＲＮＡ鎖を含み、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、異なるＲＮＡ鎖中にある、実施形態Ａ１～Ａ２６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２９．各ＲＮＡ鎖の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方に、修飾されたヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３０．ガイド配列中に修飾されたヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３１．ガイド配列の５’に修飾されたヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３２．ステム配列中に修飾されたヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３３．スキャフォールド領域中に修飾されたヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３４．スキャフォールド領域中に少なくとも１つの非天然直交性塩基対を含み、前記塩基対が、イソＧ－イソＣおよびＺ塩基－Ｐ塩基から独立に選択される、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３５．２’－アミノ基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３６．ジチオリン酸連結基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３７．ボラノホスホネート連結基を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３８．アンロックド核酸修飾（ＵＬＮＡ）を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３９．ロックド核酸修飾（ＬＮＡ）を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４０．構造不定の核酸修飾（ＵＮＡ）を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４１．シュードＵを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４２．２’－ＭＯＥを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４３．２’－アラビノを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４４．４’－チオリボースを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４５．スクアレート連結を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４６．トリアゾロ（ｔｒｉａｚａｏｌｏ）連結を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４７．標的ポリヌクレオチドを切断するまたはそれにニックを入れるための方法であって、標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡと接触させること、ならびに標的ポリヌクレオチドを切断するまたはそれにニックを入れることを含む、方法。
Ａ４８．切断するまたはニックを入れることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる、実施形態Ａ４７の方法。
Ａ４９．切断するまたはニックを入れることが、細胞で起こる、実施形態Ａ４７の方法。
Ａ５０．切断するまたはニックを入れることが、ｉｎ ｖｉｖｏで起こる、実施形態Ａ４７の方法。
Ａ５１．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態Ａ４７～Ａ５０のいずれか１つの方法。
Ａ５２．切断するまたはニックを入れることが、遺伝子編集をもたらす、実施形態Ａ４７～Ａ５１のいずれか１つの方法。
Ａ５３．切断するまたはニックを入れることが、遺伝子発現の変更をもたらす、実施形態Ａ４７～Ａ５２のいずれか１つの方法。
Ａ５４．標的ポリヌクレオチドを結合するための方法であって、標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡと接触させることを含む、方法。
Ａ５５．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、切断するまたはニックを入れる活性を有さない突然変異体を含む、実施形態Ａ５４の方法。
Ａ５６．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲシステムには天然に存在しないタンパク質成分を含む融合タンパク質である、実施形態Ａ５４またはＡ５５の方法。
Ａ５７．標的ポリヌクレオチドの発現の変化をもたらす、実施形態Ａ５４からＡ５６のいずれか１つの方法。
Ａ５８．標的ポリヌクレオチドにタグを付けるのに有用な、実施形態Ａ５４からＡ５７のいずれか１つの方法。
さらなる例示的実施形態
Ｂ１．（ａ）（ｉ）ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）ステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
１つまたは複数の修飾を含み、ｇＲＮＡ機能性を有する合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２．２’－Ｏ－メチル部分、２’－デオキシ部分、Ｚ塩基、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む、実施形態１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３．３’－ホスホロチオエート基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－ホスホノカルボン酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－チオホスホノカルボン酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－チオホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－デオキシヌクレオチド、３’－チオホスホノ酢酸基を有する２’－デオキシヌクレオチドおよびＺ塩基からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、実施形態１または２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４．２’－フルオロリボシル、２－チオウラシル塩基、４－チオウラシル塩基、２－アミノアデニン塩基、ヒポキサンチン塩基、５－メチルシトシン塩基、５－メチルウラシル塩基、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、５－アミノアリルウラシル塩基、スクアレート連結、トリアゾロ連結、ヌクレオチドとコンジュゲートしている色素およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、実施形態１、２または３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ５．２’－ＭＯＥ、２’－アミノ、２’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、３’－メチルホスホネート、３’－ボラノホスホネート、３’－ジチオリン酸、２’－ＯＭｅ－３’－Ｐ（Ｓ）２、２’－ＯＭｅ－３’－Ｐ（ＣＨ３）、２’－ＯＭｅ－３’－Ｐ（ＢＨ３）、４’－チオリボシル、Ｌ－糖、２－チオシトシン、６－チオグアニン、２－アミノプリン、シュードウラシル、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル、５－アリルシトシン、５－アリルアミノシトシン、Ｐ核酸塩基、イソシトシン（イソＣ）、イソグアニン（イソＧ），ＵＮＡ、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、脱塩基ヌクレオチド、ＰＥＧ、炭化水素リンカー、ハロ置換炭化水素リンカー、ヘテロ原子（Ｏ，Ｎ，Ｓ）－置換炭化水素リンカー、（ケト、カルボキシ、アミド、チオニル、カルバモイルまたはチオノカルバモイル）含有炭化水素リンカー、スペルミンリンカーおよびそれらの組合せからなる群から選択される修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ６．安定性増強性修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ７．少なくとも２つの修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡであって、第１の修飾が、安定性増強性修飾であり、第２の修飾が、特異性変更性修飾である、合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ８．安定性増強性修飾が、ガイド配列中に位置する、実施形態６または７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ９．安定性増強性修飾が、ガイド配列の上流に位置する、実施形態６または７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１０．安定性増強性修飾が、ｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのおよび／または最後の５つのヌクレオチド内に位置する、実施形態６または７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１１．安定性増強性修飾が、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント中に位置する、実施形態６または７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１２．安定性増強性修飾が、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの最初の５つのおよび／または最後の５つのヌクレオチド内に位置する、実施形態６または７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１３．安定性増強性修飾が、２’－Ｏ－メチル部分、２’－フルオロ部分または２’－デオキシ部分を含む、実施形態６～１２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１４．安定性増強性修飾が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスフェートヌクレオチド間連結またはジチオリン酸ヌクレオチド間連結を含む、実施形態６～１３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１５．安定性増強性修飾が、３’－ホスホノ酢酸または３’－チオホスホノ酢酸を含む、実施形態６～１４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１６．安定性増強性修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチドを含む、実施形態６～１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１７．安定性増強性修飾が、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチドまたは２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチドを含む、実施形態６～１６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１８．特異性変更性修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１９．特異性変更性修飾が、ガイド配列中に位置する、実施形態１８の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２０．特異性変更性修飾が、２－チオウラシル、４－チオウラシルまたは２－アミノアデニンを含む、実施形態１８または１９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２１．特異性変更性修飾が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスフェートヌクレオチド間連結またはジチオリン酸ヌクレオチド間連結を含む、実施形態１８～２０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２２．特異性変更性修飾が、３’－ホスホノ酢酸または３’－チオホスホノ酢酸を含む、実施形態１８～２１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２３．蛍光色素または標識を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２４．１種または複数の同位体的標識を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２５．ガイドＲＮＡが、オリゴヌクレオチド、アプタマー、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミン、糖またはオリゴ糖とコンジュゲートしている、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２６．合成ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、ループＬを介して連結している、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２７．ループＬが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含む、実施形態２６の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２８．ループＬが、ＧＮＲＡのヌクレオチド配列を含み、Ｎが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒが、ＡまたはＧを表す、実施形態２６または２７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ２９．ループＬが、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む、実施形態２６、２７または２８の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３０．ループＬが、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、実施形態２６～２９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３１．ループＬが、蛍光色素を含む、実施形態３０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３２．色素が、２－（４－ブチルアミド－色素）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーとコンジュゲートしている、実施形態３１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３３．ｃｒＲＮＡセグメントが、ガイドＲＮＡの５’末端にある、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３４．ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、ガイドＲＮＡの３’末端にある、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３５．ｃｒＲＮＡセグメントが、２５から７０ヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３６．ガイド配列が、１５から３０ヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３７．ステム配列が、１０から５０ヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３８．１つまたは複数のトリアゾロ連結を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ３９．１つまたは複数のスクアレート連結を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４０．ガイドＲＮＡが、
ＭｍＮｎ
のヌクレオチド組成を含み、
各Ｎが独立に、非修飾ヌクレオチドを表し、各Ｍが、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ（Ｓ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥリボヌクレオチドおよび２’－デオキシヌクレオチドから選択され、
各Ｍが、ガイドＲＮＡの配列中の任意の位置にあり、
ｍが、１から２２０の間の整数であり、ｎが、０から２１９の間の整数であり、５０＜ｍ＋ｎ≦２２０である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４１．ｍ＋ｎ＜１５０であり、ｍおよびｎの各々が、独立に、０から１５０の間の整数から選択され、ただし、ｍは０ではない、実施形態３８の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４２．ＭｍＮｎＭ’ｍ’Ｎ’ｎ’Ｍ”ｍ”のヌクレオチド配列を含み、
Ｍ、Ｍ’およびＭ”が各々独立に、修飾されたヌクレオチドを表し、ＮおよびＮ’が各々独立に、非修飾リボヌクレオチドを表し、
任意の所与のＭが、任意のその他のＭと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮが、任意のその他のＮと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＭ’が、任意のその他のＭ’と同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮ’が、任意のその他のＮ’と同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＭ”が、任意のその他のＭ”と同一であるかまたは異なっており、
ｍが０から４０の間の整数であり、ｎが２０から１３０の間の整数であり、ｍ’が０から１０の間の整数であり、ｎ’が０から５０の間の整数であり、ｍ”が０から１０の間の整数であり、ただし、ｍ＋ｍ’＋ｍ”が１以上である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４３．ｃｒＲＮＡセグメントが、ＭｍＮｎＭ’ｍ’Ｎ’ｎ’のヌクレオチド配列を含み、
ＭおよびＭ’が各々、修飾されたヌクレオチドを表し、ＮおよびＮ’が各々、非修飾リボヌクレオチドを表し
任意の所与のＭが、任意のその他のＭと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮが、任意のその他のＮと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＭ’が、任意のその他のＭ’と同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮ’が、任意のその他のＮ’と同一であるかまたは異なっており、
ｎおよびｎ’が各々独立に、０から５０の間の整数から選択され、
ｍおよびｍ’が、各々独立に、０から２５の間の整数から選択され、ただし、ｍ＋ｍ’が１以上である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４４．ガイド配列が、ＭｍＮｎＭ’ｍ’Ｎ’ｎ’のヌクレオチド配列を含み、
ＭおよびＭ’が各々、修飾されたヌクレオチドを表し、ＮおよびＮ’が各々、非修飾リボヌクレオチドを表し、
任意の所与のＭが、任意のその他のＭと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮが、任意のその他のＮと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＭ’が、任意のその他のＭ’と同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮ’が、任意のその他のＮ’と同一であるかまたは異なっており、
ｍ、ｎ、ｍ’およびｎ’が各々独立に、０から４０の間の整数から選択され、ただし、ｍ＋ｍ’が１以上である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４５．ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、ＮｎＭｍＮ’ｎ’Ｍ’ｍ’のヌクレオチド配列を含み、
ＭおよびＭ’が各々、修飾されたヌクレオチドを表し、ＮおよびＮ’が各々、非修飾リボヌクレオチドを表し、
任意の所与のＭが、任意のその他のＭと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮが、任意のその他のＮと同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＭ’が、任意のその他のＭ’と同一であるかまたは異なっており、任意の所与のＮ’が、任意のその他のＮ’と同一であるかまたは異なっており、
ｎが、０から１３０の間の整数であり、ｍが、０から４０の間の整数であり、ｎ’が、０から１３０の間の整数であり、ｍ’が、０から４０の間の整数であり、ただし、ｍ＋ｍ’が１以上である、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４６．ｍ、ｍ’、ｍ＋ｍ’またはｍ＋ｍ’＋ｍ”が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である、実施形態４０から４３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４７．ｍ、ｍ’、ｍ＋ｍ’またはｍ＋ｍ’＋ｍ”が、１、２、３、４、５または６である、実施形態４０から４３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４８．ｎが、１６、１７、１８または１９である、実施形態４０～４５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ４９．ｎ、ｎ’またはｎ＋ｎ’が、７５から１１５の間の整数である、実施形態４０から４５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ５０．Ｍが、各々独立に、２’修飾されたヌクレオチド、３’修飾されたヌクレオチドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４０から４７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ５１．２’修飾されたヌクレオチドが、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－フルオロヌクレオチドおよび２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態４８の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ５２．３’修飾されたヌクレオチドが、３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチドおよび ３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態４８の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ５３．２’修飾されたヌクレオチドおよび３’修飾されたヌクレオチドの組合せが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエートヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチドを含む、実施形態４８の合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ５４．標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡと接触させること、および標的ポリヌクレオチドを切断することを含む、標的ポリヌクレオチドを切断するための方法。
Ｂ５５．標的ポリヌクレオチドを外因性ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と接触させることをさらに含む、実施形態５２の方法。
Ｂ５６．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態５３の方法。
Ｂ５７．切断が、標的遺伝子の機能的ノックアウトをもたらす、実施形態５２～５４のいずれか１つの方法。
Ｂ５８．切断された標的ポリヌクレオチドを、外因性または内因性鋳型ポリヌクレオチドを用い相同性指向性修復によって修復することをさらに含む、実施形態５２～５５のいずれか１つの方法。
Ｂ５９．外因性または内因性鋳型ポリヌクレオチドが、切断部位のいずれかの側の配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含む、実施形態５６の方法。
Ｂ６０．切断された標的ポリヌクレオチドを非相同末端結合によって修復することをさらに含む、実施形態５２から５７のいずれか１つの方法。
Ｂ６１．修復ステップが、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換をもたらす、実施形態５６から５８のいずれか１つの方法。
Ｂ６２．挿入、欠失または置換が、標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子から発現されるタンパク質において１つまたは複数のアミノ酸変更をもたらす、実施形態５９の方法。
Ｂ６３．標的ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および合成ガイドＲＮＡと接触する、実施形態５２から６０のいずれか１つの方法。
Ｂ６４．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および合成ガイドＲＮＡと接触する標的ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞のゲノム内にある、実施形態５２から６１のいずれか１つの方法。
Ｂ６５．細胞が、多細胞供給源から単離され、その後、標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および合成ガイドＲＮＡと接触させる、実施形態６２の方法。
Ｂ６６．供給源が、植物、動物、多細胞原生生物または真菌である、実施形態６３の方法。
Ｂ６７．標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および合成ガイドＲＮＡと接触させた後に、細胞またはそれに由来する細胞が供給源に戻される、実施形態６２から６４のいずれか１つの方法。
Ｂ６８．細胞中に、実施形態１から５１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡを導入すること、および細胞中に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質または細胞においてＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を発現する核酸を導入することを含む、細胞中の標的ポリヌクレオチドを修飾する方法。
Ｂ６９．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態６６の方法。
Ｂ７０．細胞において少なくとも１種の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞中に実施形態１から５１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡを導入すること、および細胞中にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質または細胞においてＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を発現する核酸をさらに導入することを含み、細胞が、標的配列を有し遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し発現する、方法。
Ｂ７１．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態６８の方法。
Ｂ７２．ＣＲＩＳＰ関連タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断する、実施形態６９の方法。
Ｂ７３．実施形態１から５１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡを２種以上含むＲＮＡ分子のセットまたはライブラリー。
Ｂ７４．実施形態１から５１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたは実施形態７１のＲＮＡ分子のセットもしくはライブラリーを含むキット。
Ｂ７５．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸をさらに含む、実施形態７２のキット。
Ｂ７６．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態７３のキット。
Ｂ７７．合成ガイドＲＮＡが、末端修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｂ７８．単一ＲＮＡ鎖または２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖を有し、各ＲＮＡ鎖の両端に少なくとも１つの安定性増強性修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１．（ａ）（ｉ）ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと
（ｂ）ステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
１つまたは複数の修飾を含み、ｇＲＮＡ機能性を有する合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２．修飾のうちの１つまたは複数が、安定性増強性修飾を含む、実施形態Ｃ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ３．安定性増強性修飾のうちの１つまたは複数が、ガイド配列中に位置する、実施形態Ｃ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ４．安定性増強性修飾が、２’－Ｏ－メチル部分、Ｚ塩基、２’－デオキシヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結またはチオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む、実施形態Ｃ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ５．ガイドＲＮＡの５’末端に２６未満の連続する２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ６．合成ガイドＲＮＡ中のシトシンと置き換わるＺ塩基を含む前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ７．可能性あるオフターゲットの配列とのＵ－Ｇゆらぎ対形成に関与し得るウリジンに対応する位置に少なくとも１つの２－チオウラシルを含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ８．３’－ホスホロチオエート基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－チオホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－デオキシヌクレオチドからなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ９．少なくとも２つの修飾を含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１０．最大５０の修飾を含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１１．単一ＲＮＡ鎖または２つの別個のＲＮＡ鎖ならびに各ＲＮＡ鎖の５’末端に、各ＲＮＡ鎖の３’末端に、または各ＲＮＡ鎖の５’末端および３’末端の両方に１つまたは複数の修飾を含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１２．５’末端に、または３’末端に、または５’および３’末端の各々に７以下の連続する修飾されたヌクレオチドを含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１３．５’末端、３’末端のうち一方もしくは両方またはステム－ループに、１つまたは複数の５－メチルウリジンヌクレオチドを含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１４．修飾のうち１つまたは複数が、塩基対形成熱安定性を変更する、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１５．前記１つまたは複数の修飾が、塩基対形成熱安定性を増強する、実施形態Ｃ１４の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１６．前記１つまたは複数の修飾が、２－チオウラシル（２－チオＵ）、４－チオウラシル（４－チオＵ）、２－アミノアデニン、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、５－メチルウリジン、５－メチルシチジンおよびロックド核酸修飾（ＬＮＡ）から独立に選択される、実施形態Ｃ１５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１７．前記１つまたは複数の修飾が、塩基対形成熱安定性を減少させる、実施形態Ｃ１５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１８．前記１つまたは複数の修飾が、２－チオウラシル、２’－デオキシ、ホスホロチオエート連結、ジチオリン酸連結、ボラノホスホネート連結、ホスホノ酢酸連結、チオホスホノ酢酸連結およびアンロックド核酸修飾（ＵＬＮＡ）から独立に選択される、実施形態Ｃ１７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ１９．１つまたは複数の２’－Ｏ－メチルＡ─２’－Ｏ－メチルＵ塩基対を含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２０．修飾のうちの１つまたは複数が、特異性変更性修飾である、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２１．特異性変更性修飾が、ガイド配列中に位置する、実施形態Ｃ２０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２２．特異性変更性修飾が、２－チオウラシル、４－チオウラシル、２－アミノアデニン、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、ＬＮＡ、ホスホロチオエート連結、ジチオリン酸連結、ボラノホスホネート連結、ホスホノ酢酸連結、チオホスホノ酢酸連結、ＵＬＮＡ、２’－デオキシ、５－メチルウリジン、５－メチルシチジンまたはそれらの組合せを含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２３．蛍光色素または標識を含む、前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２４．蛍光色素または標識が、合成ガイドＲＮＡのステム－ループと結合している、実施形態Ｃ２３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｃ２５．ＤＮＡ配列を修飾するためにゲノム編集する、または対象の遺伝子の発現を調節する、標的ポリヌクレオチドを切断するための方法であって、ＤＮＡ配列、対象の遺伝子または標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および前述の実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡと接触させること、ならびにＤＮＡ配列、対象の遺伝子または標的ポリヌクレオチドを編集、調節または切断することを含む、方法。
Ｃ２６．ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され、合成ガイドＲＮＡが、ガイド配列中全体に１５以上の２’－Ｏ－メチル修飾を含む、実施形態Ｃ２５の方法。
Ｃ２７．前述の実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡを２種以上含むＲＮＡ分子のセットまたはライブラリー。
Ｃ２８．前述の実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡを含むキット。
Ｃ２９．前述の実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡを２種以上含むＲＮＡ分子のアレイ。
例示的または好ましい実施形態の前述の記載は、特許請求の範囲によって規定されるような本発明の制限としてではなく、例示ととられなければならない。容易に理解されるであろうが、特許請求の範囲において示されるような本発明から逸脱することなく、上記で示される特徴の多数の変更および組合せが利用され得る。このような変更は、本発明の範囲からの逸脱と見なされず、すべてのこのような変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照により全文で組み込まれる。

Claims (16)

  1. （ａ）（ｉ）ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
    （ｂ）前記ステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントと
    を含む合成ガイドＲＮＡであって、
    ５’末端から、３’末端から、または５’末端と３’末端の両者から５ヌクレオチド以内に存在する１つまたは複数の修飾を含み、前記１つまたは複数の修飾が、２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結またはチオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せからなる群から選択される、ｇＲＮＡ機能性を有する合成ガイドＲＮＡであり、
    前記ｇＲＮＡ機能性が、Ｃａｓタンパク質と会合することまたはＣａｓタンパク質と結合すること、標的ポリヌクレオチドに結合すること、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡを標的化すること、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成して標的ポリヌクレオチドにニックを入れること、及びＣａｓタンパク質と複合体を形成して標的ポリヌクレオチドを切断することから選択される１つまたは複数の機能性である、合成ガイドＲＮＡ。
  2. ５’末端と、３’末端と、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なガイド配列とを含む合成ｃｒＲＮＡであって、
    ５’末端から、３’末端から、または５’末端と３’末端の両者から５ヌクレオチド以内に存在する１つまたは複数の修飾を含み、前記１つまたは複数の修飾が、２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結またはチオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せからなる群から選択される、ｇＲＮＡ機能性を有する合成ｃｒＲＮＡであり、
    前記ｇＲＮＡ機能性が、Ｃａｓタンパク質と会合することまたはＣａｓタンパク質と結合すること、標的ポリヌクレオチドに結合すること、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡを標的化すること、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成して標的ポリヌクレオチドにニックを入れること、及びＣａｓタンパク質と複合体を形成して標的ポリヌクレオチドを切断することから選択される１つまたは複数の機能性である、合成ｃｒＲＮＡ。
  3. 前記１つまたは複数の修飾が、同一のヌクレオチドに対する２’－修飾、及び修飾されたホスホジエステルヌクレオチド間連結を含み、前記２’－修飾が、２’－Ｏ－メチル部分、２’－デオキシ、２’－ＭＯＥ、及び２’－フルオロからなる群から選択され、前記修飾されたホスホジエステルヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結およびチオホスホノ酢酸（チオＰＡＣＥ）ヌクレオチド間連結から選択される、請求項１に記載の合成ガイドＲＮＡまたは請求項２に記載の合成ｃｒＲＮＡ。
  4. ３’－ホスホロチオエート基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、３’－チオホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよび３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－デオキシヌクレオチドからなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡ。
  5. ２つの別個のＲＮＡ鎖を含む、請求項１、３または４のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡ。
  6. ５’末端に、または３’末端に、または５’および３’末端の各々に、７以下の連続する修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡ。
  7. 前記修飾のうち１つまたは複数が、３’－ホスホロチオエート基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡ。
  8. 前記修飾のうちの１つまたは複数が、３’－ホスホノ酢酸基を有する２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡ。
  9. 蛍光色素または標識をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡ。
  10. 前記蛍光色素または標識が、合成ガイドＲＮＡのステム－ループと結合している、請求項９に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡ。
  11. ＤＮＡ配列を修飾するためにゲノム編集する、または対象の遺伝子の発現を調節する、または標的ポリヌクレオチドを切断するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、ＤＮＡ配列、対象の遺伝子または標的ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質および請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡと接触させること、ならびにＤＮＡ配列、対象の遺伝子または標的ポリヌクレオチドを編集、調節または切断することを含む、方法。
  12. 細胞内で行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され、合成ガイドＲＮＡが、ガイド配列中全体に１５以上の２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡを２種以上含むＲＮＡ分子のセットまたはライブラリー。
  15. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）。
  16. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と、前記合成ガイドＲＮＡまたは合成ｃｒＲＮＡとがリボヌクレオタンパク質として送達される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
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