KR102418185B1 - 단일 가닥 rna-편집 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진핵 세포 내의 표적 RNA 내에서 표적 뉴클레오타이드(아데노신)을 특이적으로 편집할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 그 자체 내에서 분자 내 헤어핀 또는 스템-루프 구조를 포함하지 않고 또한 상기 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA 영역 내에서 편집되는 표적 아데노신에 대향하는 위치에 시티딘(비상보적 뉴클레오타이드) 또는 우리딘을 포함하는 것이다.

Description

단일 가닥 RNA-편집 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는 RNA 서열의 변이를 특이적으로 편집하기 위해 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 RNA 서열을 표적화시키는 RNA 편집 분야에 관한 것이다.
RNA 편집은 진핵 세포가 RNA 분자의 서열을 변경시키는 자연적 과정으로 종종 위치 특이적인 정교한 방식으로 진행된다. 이에 따라 게놈 코드화된 RNA 레퍼토리를 10의 몇 승까지 증폭시킨다. RNA 편집 효소는 동물과 식물 전체에 걸쳐 진핵생물 내에서 존재해 왔으며 이러한 프로세스는 Caenorhabditis elegans와 같은 가장 간단한 생명체에서 인간에 이르기까지 후생동물(metazoans) 내에서 세포의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다.
RNA 편집의 예로는 아데노신(A)을 이노신(I)으로 전환하는 것과 시티딘(C)을 우리딘(U)으로 전환시키는 것이 있다. 이들은 아데노신 디아미나제 및 시티딘 디아미나제로 불리우는 효소를 통해 발생한다. 가장 광범위하게 연구된 RNA 편집 시스템은 아데노신 디아미나제 효소이다.
아데노신 디아미나제는 효소에 따라 2 내지 3개의 이중 가닥 RNA 인식 도메인 및 촉매 활성 도메인을 포함하는 다중 도메인 단백질이다. 인식 도메인은 특정한 이중 가닥 RNA(dsRNA) 서열 및/또는 형상을 인식하는 반면 촉매 활성 도메인은 뉴클레오베이스의 탈아민에 의해 표적 RNA의 인근 또는 미리 예정된 위치에서 아데노신(A)을 이노신(I)으로 전환시킬 수 있는 것이다. 이노신은 세포의 번역화 과정에 의해 구아닌으로 판독되고 이는 만약 편집된 아데노신이 mRNA 또는 프리-mRNA 의 코딩 영역에 존재한다면 이는 단백질 서열을 암호화시킬 수 있는 것이다.
A로부터 I로의 전환은 또한 표적 mRNA의 5' 비코딩 서열에서 발생할 수 있고, N 말단 상에 연장된 단백질 또는 3'UTR 또는 다른 전사체 내의 비코딩 부위 내에서 생성될 수 있도록 원래의 출발 위치의 업스트림에 새로운 번역 시작 부위를 생성시킬 수 있다. 이는 RNA의 프로세싱 및/또는 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 또한 A에서 I로의 전환은 pre-mRNA 내의 인트론 또는 엑손의 스플라이스 엘레먼트에서 일어날 수 있으며 이는 스플라이싱 패턴의 변화를 야기한다. 그 결과로서 엑손이 포함되거나 스킵핑될 수 있다. 아데노신 디아미나제는 인간 디아미나제 hADAR1, hADAR2 및 hADAR3을 포함하여 RNA(ADAR)에 작용하는 아데노신 디아미나제라고 불리는 효소 패밀리의 일부이다.
아데노신 디아미나제를 적용한 표적 RNA를 편집하기 위해 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법이 기술되어왔다(Montiel-Gonzalez 등, PNAS 2013, 110(45) : 18285-18290, Vogel 등, 2014. Angewandte Chemie Int Ed 53 : 267-271 Woolf 등, 1995. PNAS 92 : 8298-8302). Montiel-Gonzalez 등(2013)은 boxB RNA 헤어핀 서열을 인식하는 박테리오파지 람다 N 단백질에 융합된 hADAR2 단백질의 아데노신 디아미나제 도메인을 포함하는 유전공학적 융합 단백질을 사용하여 표적 RNA의 편집을 보고하였다.
천연 ADAR의 기질 인식 특성을 제거하기 위하여 hADAR2 내의 천연 dsRNA 결합 도메인을 제거하고 λ-N-단백질을 boxB 인식 도메인으로 대체하였다. 저자들은 편집을 위한 표적 서열에 상보적인 '가이드 RNA' 부위를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하고 N-도메인-디아미나제 융합 단백질에 의해 서열 특이적으로 인식되는 boxB 부위를 융합시켰다.
이에 따라 가이드 RNA 올리고뉴클레오타이드가 아데노신 디아미나제 융합 단백질을 충실히 표적 부위로 인도하여 가이드 RNA로 인한 표적 RNA의 A를 I로 편집시키는 부위 특이적 편집을 나타내었다. Montiel-Gonzalez 등(2013)에서 개시된 가이드 RNA는 50개 이상의 뉴클레오타이드로 구성되어 있어 일반적으로 치료 용도로는 제조 및 세포 진입이 어려워 문제가 있었다.
치료 방법으로서 이 방법의 단점은 박테리오파지 λ-N- 단백질의 boxB 인식 도메인과 트렁크화 절단된 천연 ADAR 단백질의 아데노신 디아미나제 도메인을 유전적으로 융합시킨 융합 단백질을 또한 요구하고 있는 점이다.
이는 표적 세포가 주요 장애물인 융합 단백질과 함께 형질 전환되거나 표적 세포가 발현을 위해 아데노신 디아미나제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 컨스트럭트로 형질 전환되도록 요구하는 것이다. 후자의 경우 유전적 장애를 치료하기 위한 인간 질병 치료의 경우에는 다세포 생물 내에서 편집이 이루어질 때 어느 사소한 장애물도 없어야 한다는 조건이 필요하다.
Vogel 등(2014)은 벤질구아닌 치환된 가이드 RNA 및 유전적으로 조작된 융합 단백질을 사용하여 eCFP 및 인자 V 라이덴을 위한 RNA 코딩의 편집을 개시하고 있다. 이때 융합 단백질은 dsRNA 결합 도메인이 결여된 ADAR1 또는 2의 아데노신 디아미나제 도메인은 O6-알킬구아닌-DNA-알킬 전이효소인 SNAP-태그 도메인에 유전적으로 융합시킨 단백질이다.
유전적으로 조작된 인공 디아미나제 융합 단백질은 5'-말단 O6-벤질구아닌 변형을 통해 가이드 RNA에 공유 결합되어 있는 SNAP- 태그 도메인을 통해 배양된 HeLa 세포 내의 표적 RNA 내에서 원하는 편집 사이트를 표적화시킬 수 있다. 이 시스템은 Montiel-Gonzalez 등(2013)에 의해 기술된 유전자 조작된 ADAR과 같은 유사한 결점을 지닌다. 우선 ADAR의 유전자 조작 없이 연이어 유전적으로 조작된 단백질을 세포에 제공하기 위해 표적 RNA를 지닌 세포를 형질 전환시키는 시스템을 어떻게 적용하는 지는 명확치 않다. 분명히 이 시스템은 치료 환경에서 인간에서 사용하기가 용이하지 않다.
Woolf 등(1995)은 25 내지 52 뉴클레오타이드 길이를 지닌 단일 가닥 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 사용한 간단한 접근 방법을 개시하였다. 특히 내인성 ADAR에 의한 표적 RNA의 편집을 증진시킬 수 있는 것으로 이는 표적 RNA 이중 가닥 특성과 여기에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 기인하는 것이다.
표적 RNA 서열에 100% 상보적인 Woolf 등(1995)의 올리고뉴클레오타이드는 마이크로인젝션에 의해 세포 추출물 또는 양서류(Xenopus) 난모세포에서 작용하는 것으로 나타났으며 특이성에 심각한 문제가 있어 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 표적RNA 가닥 내의 거의 모든 아데노신은 편집되었다.
각각의 뉴클레오타이드 내에 2'O-메틸 변형을 지니고 있는 34개의 뉴클레오타이드 길이를 지닌 올리고뉴클레오타이드를 시험하였으며 Woolf 등(1995)에는 불활성화됨을 나타내었다. 뉴클레아제에 대한 안정성을 확보하기 위해 2'O-메틸-변형된 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 지닌 34-머 RNA를 또한 시험하였다. 이 올리고뉴클레오타이드의 중심 비변형 영역은 내인성 ADAR에 의한 표적 RNA의 편집을 촉진하고 말단부 변형은 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하는 것으로 나타났다.
Woolf 등(1995)은 표적 RNA 서열에서 특이적 표적 아데노신의 탈아민화는 달성되지 않는다. 언급한 바와 같이 안티센스 올리고뉴클레오타이드 내의 비변형 뉴클레오타이드에 대향하는 거의 모든 아데노신은 편집되었다. 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5'- 및 3'-말단 5개 뉴클레오타이드가 변형된다면 중심부 비변형 영역 내의 뉴클레오타이드에 대향하는 거의 모든 아데노신은 편집되고 또한 아무런 뉴클레오타이드가 변형되지 않았다면 표적 RNA 가닥 내에 거의 모든 아데노신이 편집되는 것이다. 이는 ADAR이 어느 dsRNA와도 작용하는 것으로 인식된다.
'무차별(promiscuous) 편집'이라고 칭하는 과정을 통해 효소는 dsRNA에서 다수의 A를 편집할 수 있다. 따라서 이러한 무차별 편집을 회피하고 치료적 적용을 위해 표적 RNA 서열에서 특정 아데노신만을 표적화 하는 방법 및 수단이 요구된다. Vogel 등(2014)은 편집되지 않아야 하는 아데노신에 대향되는 위치에서 올리고뉴클레오타이드 내에 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 사용함으로써 오프-표적 편집이 억제될 수 있음을 보여 주었고 표적 RNA에서 특이적으로 표적화된 아데노신에 대향되는 위치에 비변형 뉴클레오타이드의 사용을 나타내었다. 그러나 표적 뉴클레오타이드에 특이적 편집 효과는 발생되지 않았으며 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 공유 결합을 지니는 재조합 ADAR 효소의 사용없이도 가능하였다.
CRISPR/Cas9 시스템으로 알려진 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 또 다른 편집 기술이 존재하나 이 편집 콤플렉스는 DNA만 작용한다. 또한 가이드 올리고뉴클레오타이드와 함께 CRISPR/Cas9 효소의 표적 세포 또는 이를 코딩하는 발현 컨스트럭트에 공동 전달이 필요하기 때문에 상기한 조작화된 ADAR 시스템과 동일한 결점이 존재한다.
상기한 바와 같이 내인성 세포 경로 및 자연적으로 이용 가능한 ADAR 효소를 이용하여 포유류 세포 내에서 내인성 핵산을 심지어 전체 유기체에서 선행 기술 방법에 관련된 아무런 문제없이 특이적으로 편집할 수 있는 새로운 기술 및 화합물에 대한 필요성이 요구된다.
본 발명은 하나의 실시형태에서 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)를 사용하여 상기 세포 내에 존재하는 포유류 ADAR 효소에 의한 표적 RNA 내의 특정 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 RNA 편집에 관한 표적화 접근법을 제공함으로써 선행 기술에 따른 방법의 결점을 해소한 것이다.
이때 상기 AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA에 상보적이며 상기 AON은 상기 표적 RNA와 하나 이상의 미스매치, 워블(wobble) 및/또는 벌지(bulge)를 선택적으로 포함하고; 또한 이때 상기 AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH 그룹을 갖는 리보스 또는 2'-H 그룹을 갖는 데옥시리보스를 포함하는 경우 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며; 이때 또한 AON은 포유류 ADAR 효소를 바인딩할 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 비-상보적인 부분 즉 그 자체 측면에서 비상보적이고 표적에 대해서도 비상보적인 부분을 포함하지 않는다. 또한 AON은 5'-말단 O6-벤질구아닌 또는 5'-말단 아미노 변형을 포함하지 않으며; AON은 SNAP-태그 도메인에 공유 결합되지 않는다.
본 발명의 AON은 기본 구조는 단일 가닥 RNA 편집 올리고뉴클레오타이드인 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드는 시티딘 또는 우리딘이며 보다 바람직하게는 시티딘이다. 또 다른 바람직한 측면에서 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드로부터 5' 및/또는 3' 위치의 인접 뉴클레오타이드는 2'-OH기를 갖는 리보스 또는 2'-H기를 갖는 데옥시리보스를 포함한다.
가능한 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 방지하기 위해서 바람직하게는 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드 및 대향하는 뉴클레오타이드에 직접 인접한 뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 AON 내의 모든 다른 뉴클레오타이드는 바람직하게는 2'-O-메틸기와 같은 2'-O-알킬기를 포함한다. 또다른 바람직한 측면에서 2'-OH 그룹을 지닌 리보스를 포함하는 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드를 제외하고는 표적 RNA 서열에서 아데노신에 대향하는 각각의 뉴클레오타이드는 2'-O-알킬기, 바람직하게는 2'-O-메틸기를 포함한다.
또한 바람직한 실시형태에서 AON은 단일 미스매치일 수 있는 표적 아데노신에 대향하는 시티딘 이외에도 표적 서열 내에 추가적 미스매치 또는 워블 염기쌍을 적어도 하나 이상 포함할 수 있다. 적어도 하나의 부가적인 미스매치 및/또는 워블 염기쌍의 존재는 RNA 편집 효율성을 증가시키며 그 이유는 표적 분자를 지닌 AON의 변화된 온/오프 비율을 증가시키거나 dsRNA로의 ADAR분자의 결합 및/또는 인식을 목표 서열에 의존하여 증가시키기 때문이다.
본 명세서의 개요는 AON과 표적 서열(표적 위치의 바람직한 C-A를 지닌) 사이의 추가 불일치 및/또는 워블 염기쌍에 대한 하나의 바람직한 위치는 표적 서열 내의 표적 아데노신의 5'방향 업스트림으로 4번째 뉴클레오타이드이다. 또한 본 명세서 내에는 표적 서열에 따른 추가의 불일치 및/또는 워블 염기쌍 및 부가적인 벌지(논-페어링 및 뉴클레오타이드의 작은 아웃 루프)가 RNA 편집 효율을 증가시킬 수 있음을 개시한다.
따라서 본 발명의 바람직한 측면은 AON과 표적 서열 사이에 추가적 벌지, 미스매치 및/또는 워블을 지니는 것이다. 표적 아데노신에 대향하는 시티딘(또는 표적 아데노신에 대향하는 우리딘을 제외한 것으로 이는 미스매치는 아니고 특정 표적 서열에 바람직한 것이다)이다.
바람직한 측면에서 AON이 도입된 세포는 인간 세포이다. 또 다른 바람직한 측면에서 본 발명의 AON은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하며 바람직하게는 AON의 5' 및 3' 말단의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 말단 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 결합으로 연결되어 있고 보다 더 바람직하게는 5' 및 3' 말단의 5개의 뉴클레오타이드가(이 경우에는 4개) 포스포로티오에이트 결합으로 연결되어 있다.
하나의 실시형태에서 본 발명의 AON은 5' 캡을 지니지 않는다. 본 발명의 다른 실시형태에서 AON은 17-머 또는 20-머는 아니다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서 표적 RNA 서열에 상보적인 AON 부분은 17개 뉴클레오타이드보다 길거나 14개 뉴클레오타이드 보다 짧다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바람직하게는 낭포성 섬유증, 허러(Hurler) 증후군, 알파-1-항트립신(A1AT) 결핍증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 백반증, 근위축성 경화증, 천식, 지중해 빈혈, 카다실 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 근위부 척수성 근위축증(DSMA), 뒤센/베커 근이영양증, 이영양성 수포성 표피 박리증, 표피 박리증, 파브리 병, Factor V Leiden 관련 질환, 가족성 선종, 용종증, 갈락토스 혈증, 고쉐 병, 포도당-6-인산 탈수소 효소, 혈우병, 유전성 혈색소증, 헌터 증후군, 헌팅턴병, 염증성 장질환(IBD), 유전성 다응집 증후군, 레버 선천적 흑내장, 레쉬-니한 증후군, 린치 증후군, 마르팡 증후군, 뮤코다당, 근이영양증, 근긴장성 이영양증 Ⅰ형과 Ⅱ형, 신경 섬유종증, 니만-피크 병 A형, B형과 C형, NY-eso1 관련 암, 포이츠-제거스 증후군, 페닐케톤요증, 폼페 병, 원발성 섬모질환, 프로트롬빈 G20210A 변이 프로트롬빈 변이 관련 질환, 폐 고혈압, 망막 색소 변성증, 샌드호프 병, 중증 결합 면역 결핍 증후군(SCID), 겸상 적혈구 빈혈, 척추성 근위축증, 스타가르트 병,테이-삭스 질병, 어셔 증후군, X- 연결된 면역 결핍 및 암과 같은 유전 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON에 관한 것이다.
본 발명은 세포에서 표적 RNA 서열 내에 존재하는 특정 표적 아데노신의 탈아민화 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 세포에 본 발명에 따른 AON을 제공하는 단계; 상기 AON의 세포에 의한 업테이크를 허용하는 단계; 상기 AON을 표적 RNA 서열에 어닐링을 허용하는 단계; 야생형 효소에서 발견되는 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함하는 포유류 ADAR 효소가 표적 RNA 서열에서 표적 아데노신을 이노신으로 탈아민화시키는 것을 허용하는 단계; 및 RNA 서열 내에서 이노신의 존재를 확인하는 단계로 이루어져 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서 표적 RNA 서열은 CFTR(예를 들면 1784G>A 변이 편집), CEP290(예를 들면 c.2991+1655A>G 변이 편집), α1- 항 트립신(A1AT; 9989G>A 변이 또는 1096G>A 변이 편집), LRRK2(예를 들면 G6055 변이 편집), BDNF(예를 들면 RNA 레벨에서 Val66Met 변이 복구) 이거나 표적 RNA는 예를 들면 c.1205G>A(W402X) 변이를 편집하는 IDUA 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
도 1은 GFP-stop 표적 서열(하부 스트랜드)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(상부 스트랜드)의 상보성을 나타낸다. 패널 A 내지 D에서, 표적 RNA의 서열의 일부는 표적 아데노신(A)을 굵게 표시하여 5' 내지 3'(각각의 패널에서 하부 스트랜드)으로 나타낸다.
상부 가닥의 올리고뉴클레오타이드의 서열은 3'에서 5' 까지이고, 미스매치, 워블 및 '벌지'는 밑줄이 그어져 있다. 화학적 변형은 나타나지 않았다. 모든 패널의 하부 스트랜드는 동일하고(서열번호: 5), GFP 표적 서열의 일부만을 반영한다. 표적 서열의 UAG는 A가 I(G로 판독)로 편집될 때 GFP 단백질을 허용하는 Trp 코돈을 나타내는 UGG로 전환되는 중지 코돈(5'에서 3' 까지)이다. 기능성 단백질로 완전히 번역되었다. A. 상부 스트랜드 AON ADAR56(서열번호: 1); B. 상부 스트랜드 AON ADAR57(서열번호: 2); C. 상부 스트랜드 AON ADAR58(서열번호: 3); D. 상부 스트랜드 AON ADAR59(서열번호: 4).
도 2는 서열 분석으로 분석한 편집 효율을 나타낸다. 크로마토그램(A ~ J)은 표적 부위(중심 A 위에 강조 표시됨) 및 인접한 뉴클레오타이드에서 뉴클레오타이드 빈도를 나타낸다. 피크 뉴클레오타이드 동일체는 크로마토그램 아래의 서열에서와 동일한 색상으로 표시되며, 여기서 G는 검정색으로 표시된다.
패널 (A)에서 처리되지 않은 세포(NT)의 결과가 표시되고, 패널 (B)에서는 트랜스펙션 시약(CTRL)만 사용되었다. 지시된 패널 (C) 내지 (J)처럼 50 nM 또는 100 nM 농도의 AON ADAR56 내지 ADAR59를 사용하였다. 중앙 A 위의 G 신호가 명백하게 증가한다(인접한 G 신호에서 '어깨'로 표시되는 반면, 어깨는 대조군에서 관찰되지 않음). 이는 4가지 경우 모두 4가지 AON 중 하나를 사용하여, RNA 편집이 그 위치에서 발생하였다.
도 3은 GFP 표적 서열상의 ADAR2a로 형질 감염된 세포로부터의 HeLa 세포 용해물에서의 ADAR59-2 및 ADAR72-1(ADAR59-2와 비교하여 추가 워블 염기쌍을 포함함)을 사용한 후의 서열 정보 결과를 나타낸다. 추가적 워블은 RNA 편집 효율을 증가시킨다. 편집된 타겟의 위치는 화살표로 표시됩니다.
도 4는 α-L-이듀로니다제 분석에서 측정된 효소 활성(총 단백 농도로 정규화된 상대 형광 단위)을 나타낸다. 표시된 대로 각각의 AON에 대해 두 번의 중복 측정의 평균 및 표준 편차를 나타내었다. NT는 비처리를 나타낸다.
도 5는 표적 서열의 업스트림 4번 위치에서 표적 서열과 미스매치를 지닌 서로 상이한 2쌍의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 후에 도 4에 나타난 바와 같은 동일한 효소 에세이를 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열간의 특이적 추가 벌지의 긍정적 효과를 나타낸다.
도 6은 내인성 ADAR 활성의 후속 분석을 위해 ADAR1 및 ADAR2의 발현을 평가하는 8개의 상이한 인간 암 세포주(하단 패널의 표에 따른 레인 번호 부여)의 웨스턴 블랏이다.
도 7은 4개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ADAR56-2, ADAR57-2, ADAR58-2 및 ADAR59-2, 약어로는 56-2, 57- 2, 58-2 및 59-2)를 SNU-475 간암 세포와 함께 인큐베이션시켜 GFPstop57 표적 플라스미드로부터의 PCR 생성물 결과를 분석한 서열을 나타낸다. ADAR59-2 = ADAR59. RNA 편집은 ADAR 효소를 과다 발현할 필요없이 발생하였다. 'Fwd'= 정방 서열; 'Rev'= 역방 서열. 표적 아데노신(정방 서열에서 구아노신으로 쉬프트하고 역방 서열에서 시티딘으로 쉬프트하는)의 스폿은 화살표로 나타내었다.
도 8은 4개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ADAR56-2, ADAR57-2, ADAR58-2 및 ADAR59-2, 약어로는 56-2, 57- 2, 58-2 및 59-2)의 세포 독성을 관찰하였다. RNA 편집은 ADAR 효소를 과다 발현할 필요 없이 발생하였다. 'Fwd'= 정방 서열. 표적 아데노신(구아노신으로 쉬프트)의 스폿은 화살표로 표시하였다. ADAR56-2, ADAR57-2 및 ADAR58-2에서는 유의한 쉬프트가 관찰되지 않았지만 ADAR59-2에서는 매우 중요한 RNA 편집 쉬프트가 관찰되었다.
도 9는 ADAR57-2 처리 후 표적 아데노신(화살표)을 둘러싼 영역의 서열 데이터를 나타내며(도 7의 좌측 하단 참조), AON의 표적 영역 및 표적 아데노신 인근의 다른 아데노신에서 탈아민이 발생하지 않음을 나타낸다.
도 10 (A)는 GFPstop57 삽입을 운반하는 발현 플라스미드의 맵을 나타낸다. GFP의 핵산 서열 및 이로 야기되는 아미노산 서열을 (B)에 나타내었다. 또한 트립랫 58에서 TAG 정지를 지녔기 때문에 57개의 아미노산 단백질을 암호화시킨 컨스트럭트를 나타낸다. 본 명세서에서 개시한 바와 같이 이러한 TAG 내의 아데노신은 이노신으로 편집되어 구아노신으로 판독되고 그 결과 TGG 정지 코돈으로 판독된다.
도 11 (A)는 SNRPA(Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide A) 유전자(서열번호:16)의 RNA 서열의 5' 말단 부분을 나타낸다. 상부 스트랜드에서 코딩 서열은 UAG 정지 코돈(굵은 글씨)까지 밑줄로 나타내었다. 정지 코돈 내의 A의 I(G로 읽음)로의 RNA 편집은 트립토판(W)을 코딩하는 UGG를 초래하고; 편집된 서열로 제공된다(서열번호: 17). 이 판독(read-through)은 이론적으로 후속 정지 코돈(굵은 체로)까지 번역될 때 25 아미노산 길이의 단백질을 생성한다.
(B)는 (A)에서 나타난 SNRPA의 5'말단 부분을 나타낸다. 코딩 서열 아래에 ADAR87-1, ADAR89-1, ADAR89-2 및 ADAR94-1의 AON 서열이 제시되어있다. 벌지, 워블 및 미스매치는 밑줄로 나타내었다. 표적으로 하는 아데노신에 대향하는 시티딘은 더 큰 글씨체로 표시하였다. ADAR89-2와 ADAR94-1에서 Central Triplet 5'-CCA-3'에 있는 3개의 뉴클레오사이드는 DNA이지만, 이 올리고뉴클레오타이드의 다른 모든 뉴클레오사이드는 RNA이다.
도 12는 AON을 사용하여 마우스 Hepa 1-6 세포에서 내인성 SNRPA RNA에 대한 RNA 편집의 결과를 나타낸다. 패널 (A)는 비 트랜스펙션(NT) 대조군을 나타낸다. 패널 (B)는 ADAR2의 짧은 이소-폼을 코딩하는 플라스미드만으로 형질 감염된 대조군을 나타낸다. 패널 (C)는 화살표로 표시된 G 피크의 상승을 나타내며, ADAR2가 과발현되지 않은 세포에서 ADAR89-1 AON으로 형질 감염시킨 후 원하는 위치에서(A를 I로) RNA 편집이 수행되었음을 나타낸다. 패널 (D)는 ADARsh 발현 플라스미드 및 AON 모두의 양성 대조군을 나타낸다.
도 13은 마우스 Hepa 1-6 세포에 ADAR89-2 및 ADAR94-1 AON을 도입한 후 서열 분석 결과를 나타내며 타겟 아데노신에 대향하는 중앙 삼중항에 DNA 뉴클레오시드가 있는 AON으로 RNA 편집이 가능하다는 것을 나타낸다. RNA 편집은 추가적인 미스매치가 도입될 때 더 증가될 수 있다.
WO 2016/097212호는 RNA의 표적화된 편집을 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)를 개시하고 있으며 여기서 AON은 표적 RNA 서열(그 명세서 내에서 '표적 부분'으로 언급됨)에 상보적인 서열임을 특징으로 하고 바람직하게는 표적 RNA와 상보적이지 않은 스템-루프(stem-loop) 구조(그 명세서 내에서 '모집 부분(recruitment portion)'으로 언급됨)를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드를 '자체 루프 AON'으로 칭한다.
모집 부분은 표적 부분과 표적 부위의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA에 세포에 존재하는 천연 ADAR 효소를 모집하는데 작용한다. 모집 부분으로 인한 컨쥬게이트 엔티티 또는 수정된 재조합 ADAR 효소를 요구하지는 않는다. WO 2016/097212호는 모집 부분을 천연 기질(예, GluB 수용체) 또는 ADAR 효소의 dsRNA 결합 영역에 의해 인식되는 것으로 알려진 Z-DNA 구조 중 어느 하나를 모방하는 스템-루프(stem-loop) 구조로 기술한다.
스템-루프 구조는 분자간 스템-루프 구조일 수 있으며 단일 핵산 가닥 내에서 형성된 두 개의 분리된 핵산 가닥 또는 분자 내 스템 루프 구조에 의해 형성될 수있다. WO 2016/097212호에 개시된 모집부의 스템-루프 구조는 AON 자체 내에서 형성되고 ADAR을 유도할 수 있는 분자 내 스템-루프 구조이다.
본 발명의 AON은 WO 2016/097212호에 개시된 바와 같이 모집 부분을 포함하지 않는다. 본 발명의 AON은 분자 내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않는다. 본 발명의 AON은 더 단축되어 생산 비용이 감소되고 사용하기도 쉽고 제조하기도 용이하다.
또한 ADAR 효소를 세포 내 정상 기능으로부터 격리시키는 단점도 없다. 예상외로 본 발명의 발명자들은 AON과 상보적인 표적 RNA 내에서 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 위한 표적 RNA에 AON이 상보적이나 중요하게는 전술한 바와 같이 모집 부분이 결여되어 있고 표적 아데노신을 편집하기 위한 세포 내에 존재하는 ADAR 효소를 여전히 사용 가능한 것으로 보인다.
바람직한 측면에서 본 발명의 AON은 표적 아데노신의 위치에서 미스매치를 포함하며, AON에 대향하는 뉴클레오타이드는 시티딘이다. 또한 우리딘이 표적 아데노신(사실상 불일치가 아님)에 대향하는 경우, AON은 표적 아데노신의 탈아민화를 일으킬 수있다. 본 발명자들은 왓슨 크릭(Watson-Crick) 염기쌍 짝짓기 규칙에 따라 표적 RNA와 완벽한 염기쌍을 형성하지 않는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드에 의해 야기되는 부가적인 미스매치, 워블 및/또는 아웃 루프 벌지)은 허용될 수 있지만 경우에 따라서는 표적 RNA 서열의 특정 표적 편집에 필수적이지 않은 경우 그 허용되는 갯수에는 한계가 있다.
본 발명의 AON에서의(RNA 표적 서열에 혼성화 될 때) 미스매치, 워블 또는 벌지의 수는 0일 수 있고(표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오시드가 우리딘이고 AON의 나머지가 표적 서열에 100% 상보적인 경우) 오직 하나일 수 있고(표적 아데노신 위치에서 형성된 하나의 불일치, 시토신이 대향하는 뉴클레오시드이거나 AON 내에서 일부 다른 위치일 수 있음) 그 이상일 수 있으며(표적 아데노신에 미스매치되거나 매치된) AON의 길이에 의존한다.
부가적인 미스매치, 워블 또는 벌지는 표적 아데노신의 업스트림 및 다운스트림에 있을 수있다. 특정의 바람직한 실시형태에서 표적 아데노신으로부터 4 염기 업스트림(5' 말단 방향으로) 위치에 미스매치 또는 워블이 존재하며, 이는 표적 아데노신과 우리딘이 쌍을 이루는 경우 유일한 미스매치 또는 워블일 수 있다. 또는 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오시드가 시티딘일 때 추가적인 미스매치 또는 워블일 수 있다.
벌지 또는 미스매치는 오직 하나의 미스매치, 워블 염기쌍 또는 벌지에 의한 단일 부분일 수 있고 충분히 상보적이지 않은 일련의 뉴클레오타이드일 수 있다. 이는 하나 이상의 연속적인 미스매치 또는 워블 염기쌍 또는 벌지에 의한 것으로 바람직하게는 2 내지 3개의 연속적인 미스매치 및/또는 워블 염기쌍 및/또는 벌지이다.
그 어느 경우에도 본 발명에 따른 AON은 WO 2016/097212호에 기술된 올리고뉴클레오타이드보다 확실한 장점을 지니며 헤어핀 또는 스템-루프 구조가 필요 없기 때문에 본 발명의 AON은(상당히) 더 단축된다. 더욱이 WO 2016/097212 호에 기술된 올리고뉴클레오타이드는 세포에 존재하는 ADAR 효소를 격리하는 잠재적인 위험성을 지닌다.
이러한 맥락에서 한정한다면 천연 ADAR 단백질이 올리고뉴클레오타이드의 표적 부위와 표적 RNA 사이에 dsRNA 복합체의 형성 없이도 WO 2016/097212호에 기술된 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있음을 의미한다. WO 2016/097212호에 기술된 올리고뉴클레오타이드에 대한 ADAR의 직접적인 결합은 분자 내 스템-루프 구조의 존재로 인해 표적 RNA 서열의 부재 하에 본 발명의 AON을 사용할 때 생성되지 않으며 이는 분자 내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지도 않는다. WO 2016/097212 호에 기술된 올리고뉴클레오타이드를 특정 적용을 위해 사용할 수 있지만 헤어핀 및/또는 (스템-) 루프 구조의 존재로 인해 회피되는 경우가 많이 있다.
따라서 본 발명은 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 위해 세포에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것으로, 상기 AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 영역에 상보적이며, 상기 AON은 상보적 표적 RNA 영역과의 하나 이상의 미스매치, 워블 및/또는 벌지를 선택적으로 포함하고; AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH기를 갖는 리보스 또는 2'-H기를 갖는 데옥시리보스를 포함하면 하나 이상의 당 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고; AON은 ADAR 효소와 결합할 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않고; AON은 5'-말단 O6-벤질구아닌 변형을 포함하지 않으며; AON은 5'- 말단 아미노 변형을 포함하지 않고; AON은 SNAP 태그 도메인에 공유 결합되어 있지 않다.
바람직한 실시형태에서 표적 아데노신에 대향하는 AON에서의 뉴클레오타이드는 RNA가 아니라 DNA이고, 보다 바람직한 측면에서 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드뿐만 아니라 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드의 5' 및/또는 3' 뉴클레오타이드 역시 DNA 뉴클레오타이드이고, AON의 뉴클레오타이드의 나머지(DNA는 아님)는 바람직하게는 2'-O-알킬 변형된 리보뉴클레오타이드이다.
뉴클레오타이드가 DNA일 때 다른 모든 것들은 RNA 일 수 있고 2'-O 메틸로 변형될 수 있다. 반면에 특정 실시형태에서 표적 아데노신에 대향하는 트리플렛의 세 번째 뉴클레오타이드는 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-O 변형된 메틸이 아닌 경우 RNA 및 비변형일 수 있다.
하나의 특정 측면에서 본 발명은 세포 내에 존재하는 효소(아마도 ADAR 효소)에 의해 표적 RNA에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 위해 세포에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 AON에 관한 것으로, 여기서 AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 영역에(부분적으로) 상보적인 반면, 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드는 2'-H기를 갖는 데옥시 리보스를 포함하고, 상기 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드의 5' 및/또는 3' 뉴클레오타이드은 2'-H기를 지닌 데옥시리보스를 또한 포함하고, 상기 AON의 나머지 잔기는 바람직하게는 모두 2'-O 메틸 변형을 지니는 리보뉴클레오시드를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 위해 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 AON에 관한 것으로, 상기 AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 영역에 상보적이며, 상기 AON은 상보적 표적 RNA 영역과의 하나 이상의 미스매치, 워블 및/또는 벌지를 선택적으로 포함하고; AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH기를 지닌 리보스 또는 2'-H기를 지닌 데옥시리보스를 포함한다면 하나 이상의 당 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고; AON은 ADAR 효소에 결합할 수 있는 분자 내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않고; AON은 17-머 또는 20-머가 아니다.
또 다른 측면에서 본 발명은 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 위해 세포내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 AON에 관한 것으로, 상기 AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 영역에 상보적이며, 상기 AON은 상보적 표적 RNA 영역과의 하나 이상의 미스매치, 워블 및/또는 벌지를 선택적으로 포함하고; 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH기를 지닌 리보스 또는 2'-H기를 지닌 데옥시리보스를 포함하면 AON은 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고; AON은 ADAR 효소에 결합할 수 있는 분자 내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않고; AON은 17-머 뉴클레오타이드보다 길거나 14-머 뉴클레오타이드보다 짧다.
또 다른 측면에서 본 발명은 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 위해 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 AON에 관한 것으로, AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 영역에 상보적이며; AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH기를 지닌 리보스 또는 2'-H기를 지닌 데옥시리보스를 포함하면 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고; AON은 ADAR 효소에 결합할 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않으며; AON은 상보적 표적 RNA 영역과 함께 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 미스매치, 워블 및/또는 벌지를 선택적으로 포함한다. 바람직하게는 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드는 시티딘, 데옥시시티딘, 우리딘 또는 데옥시우리딘이다.
표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 시티딘 또는 데옥시시티딘인 경우, AON은 표적 RNA와 적어도 하나의 불일치를 포함한다. 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 우리딘 또는 데옥시우리딘 인 경우, AON은 100% 상보적일 수 있고 표적 RNA와 관련하여 어떠한 불일치, 워블 또는 벌지도 지니지 않을 수 있다. 그러나 바람직한 측면에서 AON과 표적 RNA 사이에 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 시티딘, 데옥시시티딘, 우리딘 또는 데옥시우리딘인지 여부에 관계없이 하나 이상의 부가적인 미스매치, 워블 및/또는 벌지가 존재한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드로와 직접 인접한 5'및/또는 3' 뉴클레오타이드는 2'-OH기를 갖는 리보스 또는 2'-H기를 갖는 데옥시리보스, 또는 이들 2종의 혼합물을 포함한다. 트리플렛은 DNA-DNA-DNA, DNA-DNA-RNA, RNA-DNA-DNA, RNA-DNA-RNA 또는 RNA-RNA-RNA로 구성되며, 바람직하게는 중간 뉴클레오시드가 2'-O 메틸 변형(RNA의 경우)을 지니지 않고 주변 뉴클레오시드 중 하나 또는 둘 모두 2'-O 메틸 변형을 지니지 않는다.
AON 내의 모든 다른 뉴클레오타이드가 2'-O-알킬기 바람직하게는 2'-O-메틸기 또는 2'-O-메톡시에틸기(2'-MOE)를 지니거나 본 명세서에 개시된 임의의 변형을 지니는 것이 바람직하다. 본 발명의 AON은 바람직하게는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 추가적인 바람직한 측면에서, AON의 5' 및 3' 말단의 2, 3, 4, 5 또는 6 말단 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결된다.
더욱 바람직하게는 5' 및 3' 말단의 말단 5개 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결된다. 본 발명의 하나의 특정 실시형태에서 AON은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 뉴클레오타이드보다 길다. 바람직하게는 AON은 100개 뉴클레오타이드보다 짧고 보다 바람직하게는 60개 이하이며 더욱 바람직하게는 18 내지 70개 뉴클레오타이드 18 내지 60개 뉴클레오타이드 또는 18 내지 50개 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바람직하게는 낭포성 섬유증, 허러(Hurler) 증후군, 알파 -1- 항 트립신(A1AT) 결핍증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 백반증, 근위축성 경화증, 천식, 지중해 빈혈, 카다실 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 근위부 척수성 근위축증(DSMA), 뒤센/베커 근이영양증, 이영양성 수포성 표피 박리증, 표피 박리증, 파브리 병, Factor V Leiden 관련 질환, 가족성 선종, 용종증, 갈락토스 혈증, 고쉐 병, 포도당 -6- 인산 탈수소 효소, 혈우병, 유전성 혈색소증, 헌터 증후군, 헌팅턴병, 염증성 장질환(IBD), 유전성 다응집 증후군, 레버 선천적 흑내장, 레쉬-니한 증후군, 린치 증후군, 마르팡 증후군, 뮤코다당증, 근이영양증, 근긴장성 이영양증 I형과 Ⅱ형, 신경 섬유종증, 니만-피크 병 A형, B형과 C형, NY-eso1 관련 암, 포이츠-제거스 증후군, 페닐케톤요증, 폼페 병, 원발성 섬모질환, 프로트롬빈 G20210A 변이 프로트롬빈 변이 관련 질환, 폐 고혈압, 망막 색소 변성증, 샌드호프 병, 중증 결합 면역 결핍 증후군(SCID), 겸상 적혈구 빈혈, 척추성 근위축증, 스타가르트 병, 테이-삭스 질병, 어셔 증후군, X- 연결된 면역 결핍 및 암과 같은 유전 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 AON에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 AON의 용도에 관한 것이다.
낭포성 섬유증, 허러(Hurler) 증후군, 알파 -1- 항 트립신(A1AT) 결핍증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 백반증, 근위축성 경화증, 천식, 지중해 빈혈, 카다실 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 근위부 척수성 근위축증(DSMA), 뒤센/베커 근이영양증, 이영양성 수포성 표피 박리증, 표피 박리증, 파브리 병, Factor V Leiden 관련 질환, 가족성 선종, 용종증, 갈락토스 혈증, 고쉐 병, 포도당 -6- 인산 탈수소 효소, 혈우병, 유전성 혈색소증, 헌터 증후군, 헌팅턴병, 염증성 장질환(IBD), 유전성 다응집 증후군, 레버 선천적 흑내장, 레쉬-니한 증후군, 린치 증후군, 마르팡 증후군, 뮤코다당증, 근이영양증, 근긴장성 이영양증 I형과 Ⅱ형, 신경 섬유종증, 니만-피크 병 A형, B형과 C형, NY-eso1 관련 암, 포이츠-제거스 증후군, 페닐케톤요증, 폼페 병, 원발성 섬모질환, 프로트롬빈 G20210A 변이 프로트롬빈 변이 관련 질환, 폐 고혈압, 망막 색소 변성증, 샌드호프 병, 중증 결합 면역 결핍 증후군(SCID), 겸상 적혈구 빈혈, 척추성 근위축증, 스타가르트 병, 테이-삭스 질병, 어셔 증후군, X- 연결된 면역 결핍 및 암과 같은 유전 질환의 치료 또는 예방에 사용되는 약제 제조용 AON의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서 본 발명은 세포내 표적 RNA에 존재하는 적어도 하나의 표적 아데노신을 탈아민화하는 방법에 관한 것으로 본 방법은 세포에 본 발명에 따른 AON을 제공하는 단계; AON의 세포에 의한 흡수(uptake)를 허용하는 단계; 표적 RNA에 AON의 어닐링을 허용하는 단계; 야생형 효소에서 발견되는 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함하는 ADAR 효소가 표적 RNA에서 표적 아데노신을 이노신으로 탈아민화시키는 것을 허용하는 단계; 및 최종 단계는 표적화된 RNA 서열을 확인하는 단계를 포함하는 표적 RNA에서 이노신의 존재를 선택적으로 확인하는 단계;를 포함한다.
표적 아데노신이 UGA 또는 UAG 정지 코돈에 위치하고, 탈아민화를 통해 UGG 코돈에 편집된 경우 기능으로 연장된 전체 길이 및/또는 야생형 단백질의 존재를 평가하는 단계; 2개의 표적 아데노신이 UAA 정지 코돈에 위치하고 두 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 UGG 코돈에 편집된 경우, 기능적으로 연장된 전체 길이 및/또는 야생형 단백질의 존재를 평가하는 단계; 상기 프리-mRNA의 스플라이싱이 탈아민화에 의해 변화되는지 여부를 평가하는 단계; 기능적인 판독을 통하여, 탈아민화 후 표적 RNA는 기능적으로 전체 길이로 연장된 야생형 단백질을 암호화한다.
다른 구체적 실시형태에서 본 발명은 AON 또는 본 발명에 따른 적용 방법에 관한 것으로 여기에서 표적 RNA 서열은 CFTR(예를 들면 1784G>A 변이의 편집), CEP290(예를 들면 c.2991 + 1655A>G 변이의 편집 ), 알파 -1- 항트립신(A1AT; 9989G> A 변이 또는 1096G>A 변이의 편집), LRRK2(예를 들면 G6055 변이의 편집), BDNF(예를 들면 RNA 수준의 Val66Met 변이의 교정)이거나 표적 RNA는 IDUA 유전자에 의해 코딩된 것이다(예를 들면 c.1205G>A(W402X) 변이의 편집)
본 발명의 중요한 측면은 AON이 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다는 것이다. 따라서 AON의 단일 뉴클레오타이드는 하나 또는 둘 이상의 당 변형을 지닐 수 있다. AON 내에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 그러한 당 변형을 지닐 수 있다.
본 발명의 또 다른 중요한 측면은 본 발명의 AON 내에서 편집될 필요가 있는 뉴클레오타이드에 대향하는 뉴클레오타이드는 본 명세서에서 종종 2'-OMe 기 또는 2'-O-메틸화로 언급되는 2'-O-메틸 변형을 포함하지 않는다는 것이고. 바람직하게는 2'-OH기를 포함하거나, 2'-H기를 지닌 데옥시리보스이다.
이 뉴클레오타이드의 3' 및/또는 5' 방향으로 직접적으로 인접한 뉴클레오타이드는 또한 이러한 화학적 변형이 결여되어 있는 것이 바람직하지만 이들 인접 뉴클레오타이드 중 하나는 2'-O-메틸기와 같은2'-O-알킬기를 포함 할수 있으나 인접 뉴클레오타이드 둘 모두는 바람직하지는 않다. 하나 또는 둘 모두의 인접 뉴클레오타이드는 2'-OH 또는 상용성(compatible) 치환일 수 있다.
본 발명의 AON의 또 다른 중요한 측면은 AON 그 자체가 내에서 분자 내 헤어핀 또는 자동 루프(auto looping) 또는 자체 루프(self-looping)와 같은 스템 루프 구조로 접힐 수 있는 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 또는 RNA 영역에 상보적인 부분을 지니지 않아 잠재적으로 ADAR을 격리하는 구조로 작용할 수 있다는 것이다.
하나의 측면에서 본 발명의 단일 가닥 AON은 표적 RNA와 완전히 상보적이다. 다만 표적 아데노신의 위치에 있는 하나 이상의 위치에서는 완벽하게는 쌍을 이루지 않으며 이때 대향하는 뉴클레오타이드는 바람직하게는 시티딘이다.
본 발명의 단일 가닥 RNA 편집 올리고뉴클레오타이드는 또한 표적 서열과 함께 표적 아데노신 위치 이외의 다른 위치에서 하나 이상의 미스매치, 워블 또는 벌지(대향하는 뉴클레오시드 없음)를 지닐 수 있다. 표적 서열을 지닌 본 발명의 AON의 이러한 워블, 미스매치 및/또는 벌지는 표적 RNA 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 방해하지 않지만 표적 아데닌 위치에서 세포 내에 존재하는 ADAR에 의한 RNA 편집 효율을 증가시킨다.
당업자는 여전히 생리적 조건 하에서의 혼성화가 일어나는지 여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 단일 가닥 RNA 편집 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단 O6-벤질구아닌 또는 5'-말단 아미노 변형을 포함하지 않으며, Vogel 등(2014)과는 달리 O6-알킬구아닌-DNA-알킬 트랜스퍼라제 유래 SNAP- 태그 도메인과 공유 결합되지 않는다.
SNAP-태그 도메인은 인간 DNA 복구 단백질 O6-알킬구아닌-DNA-알킬 트랜스퍼라제(AGT)로부터 유래된 것이며, O6-벤질구아닌 유도체를 사용하여 살아있는 세포에서 공유 결합으로 표지화시킬 수 있다. Vogel 등(2014)은 20 또는 17개 뉴클레오타이드의 총 길이를 지닌 가이드 RNA를 개시하였으며 여기서 5' 말단의 첫 번째 3개 뉴클레오타이드는 표적 RNA 서열에 결합하지 않고 가이드 RNA를 SNAP- 태그 도메인에 연결시켰다.
따라서 표적 RNA 서열에 결합하는 가이드 RNA 부분은 14 또는 17개 뉴클레오타이드 길이이다. 5'- 말단 O6-벤질 구아닌 변형 대신에 5'- 말단 아미노 변형을 지니는 동일한 길이의 가이드 RNA를 Vogel 등(2014)은 개시하였다. 그러나 매우 작은 탈아민화 또는 표적 RNA 서열도 검출되지 않았다. 하나의 실시형태에서 본 발명의 AON은 표적 RNA 서열과 함께 4개 이하의 미스매치 및/또는 워블을 포함한다.
유사하게 본 발명의 바람직한 AON은 Montiel-Gonzalez 등(2013)과는 대조적으로 boxB RNA 헤어핀 서열을 포함하지 않는다. Montiel-Gonzalez 등(2013)에서 사용된 boxB RNA 헤어핀 서열은 박테리오파지 람다 단백질에 의해 인식되는 17개 뉴클레오타이드(서열 GGCCCUGAAAAAGGGCC,서열번호:6)의 짧은 스트레치이다. 박테리오파지의 초기 오페론에서 다운스트림 유전자의 전사는 너트(nut)로 알려진 프로모터 - 프록시말 요소를 필요로 한다.
이 부위는 RNA의 cis 형태로 작용하여 박테리오파지 람다 N 단백질과 숙주 인자로 구성된 전사 항- 종결 복합체를 조립한다. 너트 사이트 RNA에는 boxB라는 작은 스템 루프 구조가 들어 있다. boxB RNA 헤어핀 서열은 헤어핀(줄기-루프) 구조를 형성할 수 있는 잠재력을 지닌 인터럽트 팔린드롬(interrupted palindrome)로서 당업계에 공지되어 있다. 개별적인 게놈-특이성 N 동족체를 코딩하는 박테리오파지 람다 친족사이에서 이 서열은 다양하다.
Vogel 등(2014) 또는 Montiel-Gonzalez 등(2013)은 세포 내에 존재하는 포유류 ADAR 효소를 사용하지 않으며 여기서 ADAR 효소는 야생형 효소에서 발견되는 바와 같은 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함한다. Vogel 등(2014)은 SNAP-태그 도메인에 융합된 ADAR1 또는 2의 아데노신 디아미나제 도메인을 포함하는 유전자 조작된 융합 단백질을 사용하고, Montiel-Gonzalez 등은 hADAR2 단백질의 아데노신 디아미나제 도메인을 포함하는 유전자 조작된 융합 단백질을 사용하여 박테리오파지 람다 N 단백질의 boxB 인식 도메인과 융합시킨다.
종래 기술과 달리 본 발명의 AON은 세포 내에 존재하는 포유류 ADAR 효소를 사용하며 여기서 ADAR 효소는 야생형 효소에서 발견되는 바와 같은 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함한다. 따라서 ADAR의 모집(recruitment)을 허용하기 위해 boxB RNA 헤어핀 서열, 5'-말단 O6-벤질구아닌, 5'-말단 아미노 변형 또는 SNAP- 태그 도메인을 본 발명의 AON에 통합시킬 필요가 없다. 따라서 본 발명에 따른 AON은 Vogel 등(2014년)와 Montiel-Gonzalez 등(2013)을 넘어 서는 장점을 지닌다. 본 발명에 따른 AON은 내인성 세포경로 및 천연적으로 이용 가능한 ADAR 효소를 이용하여 표적 RNA 서열에서 표적 아데노신을 특이적으로 편집할 수 있다.
하나의 실시형태에서 본 발명의 AON은 인간 O6-알킬구아닌-DNA-알킬 트랜스퍼라제에 공유 결합하지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 AON은 폴리펩티드에 공유 결합되지 않는다. 본 발명의 AON의 또 다른 측면에서 AON은 5' 캡을 지니지 않는다. 진핵 생물체에서 5' 캡은 5'에서 5' 트리인산 연결을 통해 RNA에 연결된 구아닌 뉴클레오타이드로 구성된다. 이 구아노신은 7 위치에서 메틸화되고 7-메틸 구아노신으로 칭한다.
본 명세서 내에 개시한 바와 같이 본 발명의 단일 가닥 RNA 편집-유도 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA 서열에서 특이적 표적 아데노신 뉴클레오타이드를 탈아민화 할 수 있다. 이상적으로는 오직 하나의 아데노신만이 탈아민화된다. 선택적으로 1, 2 또는 3개의 아데노신 뉴클레오타이드는 탈아민화되지만 바람직하게는 하나만 탈아민화이다.
본 발명의 AON의 특징을 함께 고려하면 변형된 재조합 ADAR 발현이 요구되지 않으며 AON에 부착된 콘쥬게이트 엔티티도 필요 없고 표적 RNA 서열에 상보적이지 않은 긴 모집 부위의 존재도 요구되지 않는다.
그 밖에도 본 발명의 AON은 야생형 효소에서 발견되는 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함하는 천연 ADAR 효소에 의해 표적 RNA 서열에 존재하는 표적 아데노신을 이노신으로 전환시키는 특이적 탈아민화를 허용하지만 RNA/AON 복합체 내의 임의의 장소에서 무작위 편집의 위험성은 지니지 않는다.
표적 부위에 대한 시티딘 디아미나제의 모집은 아데노신 디아미나제인 hADAR1 및 hADAR2와 동일한 방식으로 작용한다. 그러나 시티딘 디아미나제는 서로 다른 결합 요구 조건을 지니며 시티딘의 편집을 결정하는 표적 RNA 서열 내에서 다른 구조로 인식한다. 특히 잘 연구된 시티딘 디아미나제는 인간 Apobec1이다. 편집 사이트를 표적으로 하고 상주하고 자연적으로 존재하는 편집 실체를 모집하기 위해 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 사용하는 RNA 편집의 일반적인 원리는 시티딘 디아미나제와 동일하게 작용하고 이는 본 명세서 내에 개시되고 청구된 발명의 일부이다.
ADAR 효소의 천연적인 표적의 분석은 이것들이 일반적으로 ADAR1 또는 ADAR2에 의해 편집된 RNA 헬릭스를 형성하는 2 가닥 사이의 미스매치를 포함한다는 것을 나타낸다. 이러한 미스매치가 편집 반응의 특이성을 향상시킨다는 것이 제시되었다(Stefl 등, 2006, Structure 14(2) : 345-355, Tian 등. 2011. Nucleic Acids Res 39(13) : 5669-5681).
AON과 표적 RNA 사이의 쌍을 이루거나/미스매치된 뉴클레오타이드의 최적 패턴의 특징은 효과적인 ADAR-기반 AON 치료법의 개발에 결정적인 것으로 보인다. 본 발명의 AON의 개선된 특징은 적절한 ADAR 결합 및 활성뿐만 아니라 안정성을 보장하기 위해 소정의 스폿에서 특이적 뉴클레오타이드 변형의 사용이다. 이러한 변화는 다양할 수 있으며 AON의 백본, 뉴클레오 염기 부위 및 당 모이어티의 변형을 포함할 수 있다.
변형은 표적 및 2차 구조에 의존하여 AON의 서열 내에서 가변적으로 분포될 수 있다. 특정 화학적 변형은 ADAR 효소의 RNA-결합 도메인 및 디아미나제 도메인 내에서 서로 상이한 아미노산 잔기의 상호작용을 지지하는데 필요할 수 있다. 예를 들면 뉴클레오타이드간 포스포로티오에이트 결합 및/또는 2'-O-메틸 변형은 결합은 AON의 일부분에서 허용될 수 있지만 다른 부분에서는 인산염 및/또는 2'-OH 그룹 사이의 효소 상호작용을 방해하지 않도록 피해야 한다.
이러한 디자인 규칙의 일부는 ADAR2의 간행된 구조에 의해 안내되는 반면 다른 것들은 경험적으로 정해져야 한다. ADAR1 및 ADAR2를 위한 다른 선호가 있을 수 있다. 변형은 AON의 파괴 저하를 예방할 수 있도록 선택되어야 한다. 특정 뉴클레오타이드 변형은 또한 표적 서열이 ADAR 편집에 최적이 아니라 기질 RNA 상의 편집 활성을 보강시키는데 필요할 수 있다.
이전의 연구 결과는 특정 서열의 컨텍스트가 편집에 보다 적합하다는 것을 확립하였다. 예를 들면 표적 서열 5'-UAG-3'(중간에 표적 A를 가짐)은 ADAR2에 대해 가장 바람직한 가장 인접한 이웃 뉴클레오타이드를 함유하는 반면 5'-CAA-3' 표적 서열은 바람직하지 않았다(Schneider 등 2014, Nucleic Acids Res 42(10) : e87 참조). ADAR2 디아미나제 도메인의 최근 구조 분석은 표적 트리뉴클레오타이드에 대향하는 뉴클레오타이드를 신중하게 선택함으로써 편집능이 향상될 수 있음을 시사한다.
예를 들면 대향하는 가닥(중간에 AC 미스매치가 형성됨)의 3'-GCU-5'서열과 쌍을 이루는 5'-CAA-3' 표적 서열은 구아노신 염기가 ADAR2의 아미노산 측쇄와 입체 장애와 입체적으로 충돌하기 때문에 바람직하지 않다. 그러나 여기에서 이노신과 같은 더 작은 핵 염기가 입체적 충돌을 야기하지 않으면서 이 위치에 더 잘 들어맞을 수 있는 반면 대향하는 시티딘에 대한 염기쌍 형성 가능성도 여전히 유지된다고 판단한다. 차선책 서열의 활성을 향상시킬 수 있는 변형으로 AON의 유연성을 증가시키는 백본 변형의 사용이 포함될 수 있고 반대로는 편집이 선호하는 형태(conformation)로의 변형이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 '아데닌', '구아닌', '시토신', '티민', '우라실' 및 '하이포크산틴'(이노신의 핵 염기)이란 용어는 핵산 염기를 의미한다. '아데노신', '구아노신', '시티딘', '티미딘', '우리딘' 및 '이노신' 이라는 용어는(데옥시)리보실 당과 연결된 핵산 염기를 의미한다. 용어 '뉴클레오시드'는(데옥시)리보실 당과 연결된 핵 염기를 의미한다.
용어 '뉴클레오타이드'는 각각의 핵염기-(데옥시)리보실-포스포 링커 뿐만 아니라 리보스 잔기 또는 포스포 그룹의 화학적 변형을 포함한다. 따라서 이 용어는 고정된 리보솜 잔기(당업계에 공지된 메틸렌기 또는 임의의 다른기로 구성된 2'-4 ' 브리지를 포함함)를 포함하는 뉴클레오타이드, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로(디)티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로아미데이트 링커 등을 포함하는 링커를 포함한 뉴클레오타이드를 포함한다.
가끔 아데노신과 아데닌, 구아노신과 구아닌, 시토신과 시티딘, 우라실과 우리딘, 티민과 티미딘, 이노신과 하이포-크산틴은 상응하는 핵염기, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 때때로 핵염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오타이드라는 용어는 문맥에 분명히 다르게 요구되지 않는 한 상호 교환하여 사용된다. 용어 '리보뉴클레오시드' 및 '디옥시리보뉴클레오시드', 또는 '리보스' 및 '데옥시리보스' 는 당업계에서 사용되는 것과 같다.
'올리고뉴클레오타이드'에 대한 언급이 있을 때 다르게 지시하지 않는 한 올리고리보뉴클레오타이드 및 데옥시올리고리보뉴클레오타이드를 의미한다. '올리고리보 뉴클레오타이드'에 대한 언급이 있을 때 A, G, C, U 또는 I 염기를 포함할 수 있다. '데옥시 올리고뉴클레오타이드'를 언급할 때 염기 A, G, C, T 또는 I를 포함할 수 있다. 바람직한 측면에서 본 발명의 AON은 화학적 변형을 포함할 수 있는 올리고리보뉴클레오타이드이다.
시토신, 5- 메틸시토신, 5- 하이드록시메틸시토신 및 β-D-글루코실-5-하이드록시 - 메틸시토신과 같은 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트 내의 뉴클레오타이드를 언급할 때 아데닌은 N6-메틸 아데닌 및 7-메틸아데닌이 포함된다; 우라실은 디하이드로우라실, 4-티오우라실 및 5-하이드록시메틸우라실이 포함되어 있으며 구아닌은 1-메틸구아닌이 포함되어 있다.
뉴클레오시드 또는 뉴클레오타이드를 언급할 때, 2'-데속시(2-desoxy), 2'-하이드록시 및 예를 들면 2'-O-메틸과 같은 2'-O- 치환된 변이체와 같은 리보푸라노스 유도체뿐만 아니라 2'-4' 가교 변이체를 포함하는 다른 변형을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 언급할 때 2개의 모노-뉴클레오타이드 사이의 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포(디)티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포-아미드 링커 등을 포함하는 포스포디에스테르 결합뿐만 아니라 이들의 변형일 수 있다.
용어 '포함하는(comprising)' 은 '포함하는(including)' 뿐만 아니라 '구성된(consisting)'을 포함한다. X를 포함하는 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나 X+Y 같이 추가된 것을 포함할 수 있다. 수치 x와 관련하여 '약'이라는 용어는 바람직하게는 예를 들면 x+10 %를 의미한다. '실질적으로'라는 단어는 '완전히' 제외하지는 않는다는 의미로서 '실질적으로 Y를 함유하지 않는' 조성물은 Y를 완전히 포함하지 않을 수 있다. 관련하여 '실질적으로'라는 용어는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
본 명세서 내에서 사용된 용어 "상보적인"은 AON이 생리적 조건 하에서 표적 서열에 혼성화된다는 사실을 언급한다. 이 용어는 AON의 모든 뉴클레오타이드가 표적 서열의 반대 뉴클레오티드와 완벽하게 쌍을 이루는 것을 의미하지 않는다. 즉 AON은 표적 서열과 상보적이지만 AON과 표적 서열 사이에는 미스매치, 워블 및/또는 벌지가 있을 수 있으며 AON은 여전히 표적 서열과 혼성화 되는 생리적 조건 하에서 세포 RNA 편집 효소는 표적 아데노신을 편집할 수 있다.
"실질적으로 상보적" 이라는 용어는 또한 미스매치, 워블 및/또는 벌지의 존재에도 불구하고 AON이 AON과 표적 서열 사이에 충분히 매치 되는 뉴클레오타이드를 가지고 생리적 조건 하에서 AON이 표적 RNA에 혼성화한다는 것을 의미한다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이 AON은 상보적이 될 수 있지만 AON이 그의 표적에 혼성화 할 수 있는 생리적 조건 하에 있는 한 표적 서열과의 하나 이상의 미스 매치, 워블 및/또는 벌지를 포함할 수도 있다.
핵산 서열과 관련하여 '다운스트림'이라는 용어는 3' 방향으로 서열을 따라 더 멀리 있음을 의미한다. '업스트림'이라는 용어는 그 반대를 의미한다. 따라서 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 서열에서, 개시 코돈은 센스 가닥의 정지 코돈의 업스트림에 있지만 안티센스 가닥의 정지 코돈의 다운스트림에 있다.
'혼성화'에 대한 언급은 일반적으로 특이적 혼성화를 의미하며 비특이적 혼성화를 배제한다. 특이적 혼성화는 프로브와 표적 사이의 안정한 상호작용을 위해 프로브와 표적이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 보다 바람직하게는 최소 90%의 서열 동일성을 요구한다.
용어 "미스매치"는 본 명세서 내에서 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 짝짓기 룰에 따라 완벽한 염기쌍을 형성하지 않는 이중 가닥 RNA 복합체 내의 대향하는 뉴클레오타이드를 의미한다. 미스매치 뉴클레오타이드는 G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U 쌍이다. 일부 실시형태에서 본 발명의 AON은 4 개 미만의 미스매치 예를 들면 0, 1 또는 2개의 미스매치를 포함한다. 워블 기본 쌍은 G-U, I-U, I-A 및 I-C 염기쌍이다.
본 발명에 따른 AON은 예를 들면 모든 뉴클레오타이드에 2'-O-메틸화 당 잔기(2'-OMe)를 제공함으로써 거의 전체가 화학적으로 변형될 수 있다. 그러나 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형을 포함하지 않으며 또 다른 바람직한 측면에서 표적 아데노신에 대향하는 적어도 하나의 인접한 두개의 이웃하는 뉴클레오타이드는 2'-OMe 변형을 지니지 않는다.
AON 내의 모든 뉴클레오타이드가 2'-OMe 변형을 보유하는 완전한 변형은 RNA 편집이 진행되는 경우 비-기능성 올리고뉴클레오타이드로 작용하고 이는 아마도 표적 위치에서 ADAR 활성을 방해하기 때문이다. 일반적으로 표적 RNA의 아데노신은 대향하는 뉴클레오티드에 2'-OMe 그룹을 제공하여 보호하거나 대향하는 염기로 구아닌 또는 아데닌을 제공함으로써 이 두 핵산 염기가 대향하는 아데노신의 편집을 감소시킬 수 있다.
다양한 화학적 변형이 올리고뉴클레오타이드 분야에서 용이하게 사용될 수 있도록 본 발명의 분야에서 공지되어 있다. 뉴클레오타이드 간의 통상적인 뉴클레오티드사이드 연결은 포스포로티오에이트 에스테르 또는 포스포로디티오에이트 에스테르를 각각 생성하기 위해 포스포디에스테르 결합의 모노- 또는 디- 티오화에 의해 변경될 수 있다. 아미드화 및 펩티드 링커를 포함하는 뉴클레오타이드 간 결합의 다른 변형이 가능하다.
바람직한 실시형태에서 본 발명의 AON은 AON의 가장 말단부 뉴클레오타이드 바람직하게는 5' 및 3' 말단부 모두에서 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 가지며 이는 4 개의 포스포로티오에이트 결합의 경우 궁극적으로 5개의 뉴클레오타이드가 이에 따라 결합되는 것이다. 당업자는 이러한 결합의 수는 표적 서열 또는 독성과 같은 다른 측면에 기초하여 각각의 말단에서 변화할 수 있는 것으로 판단한다.
리보스 당은 2'-O 잔기로 저급 알킬(C1-4, 예컨대 2'-O-Me), 알케닐(C2-4), 알키닐(C2-4), 메 톡시에틸(2' -MOE) 또는 다른 치환체로 치환 변형시킬 수 있다. 2' OH 기의 바람직한 치환기는 메틸, 메톡시에틸 또는 3,3'-디메틸알릴기이다. 후자는 그 부피로 인해 뉴클레아제 감수성을 저해하는 특성으로 알려져 있으며 혼성화 효율을 향상시킨다(Angus & Sproat FEBS 1993 Vol. 325, no. 1, 2, 123-7).
선택적으로 리보스 고리 내부에 2'-4' 분자 내 브리지(통상적으로 2' 산소와 4' 탄소 사이의 메틸렌 가교)를 포함하는 로크 핵산 서열(LNA)이 적용될 수 있다. 퓨린 핵염기 및 피리미딘 핵 염기는 예를 들면 헤테로시클릭 고리의 아민화 또는 탈아민화에 의해 그 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 정확한 화학 및 포맷은 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트에서 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트로의 적용에 의존할 수 있으며 당업자의 희망 및 선호에 따라 해결될 수 있다.
본 발명에 따른 AON은 일반적으로 10개 뉴클레오타이드 이상이며 바람직하게는 11, 12, 13, 14, 15, 16개, 더욱 바람직하게는 17개 뉴클레오타이드 이상이어야 한다. 한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 20개 이상의 뉴클레오타이드이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 100개 뉴클레오타이드 보다 짧고 더욱 더 바람직하게는 60개 뉴클레오타이드보다 짧다. 하나의 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 50 뉴클레오타이드보다 짧다.
바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 18 내지 70개의 뉴클레오타이드를 포함하고 바람직하게는 18 내지 60개의 뉴클레오타이드를 포함하고 더욱 바람직하게는 18 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서 가장 바람직한 측면에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
RNA 편집 엔티티(인간 ADAR 효소와 같은)는 다수의 인자에 의한 다양한 특이성으로 dsRNA 구조를 편집한다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 한 가지 중요한 요소는 dsRNA 서열을 구성하는 2 가닥의 상보성 정도이다. 2 가닥의 완벽한 상보성은 대개 hADAR의 촉매 도메인이 비차별적 방식으로 마주 보는 모든 아데노신과 어느 정도 반응하여 아데노신을 탈아민화시킨다.
hADAR1과 2의 특이성은 화학적 변형을 도입 및/또는 dsRNA 결합 도메인을 아직 명확하게 정의되지 않은 방식으로 배치하는 데 도움이 되는 dsRNA의 여러 가지 미스매치를 보장함으로써 증가될 수 있다. 또한 탈아민화 반응 그 자체는 편집될 아데노신에 대향하는 미스매치를 포함하는 AON을 제공함으로써 향상될 수 있다.
상기 미스매치는 바람직하게는 편집하려는 아데노신에 대향하는 시티딘을 지닌 표적 부위을 제공함으로써 생성된다. 선택적으로 아데노신에 대향하여 우리딘이 사용되면 U와 A가 쌍을 이루기 때문에 '미스매치'가 발생하지 않을 것이다. 표적 가닥에서 아데노신이 탈아민화되면 표적 가닥은 대부분의 생화학적 프로세스에 대해 세포의 생화학적 기구에 의해 G로서 "판독"되는 이노신이 수득될 것이다.
따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 표적화 부분에서 I가 대향하는 C와 완벽하게 염기쌍을 형성할 수 있기 때문에 A가 I로 전환 후 미스매치가 해결되었다. 편집으로 인해 미스매치가 해결된 후 기질이 방출되고 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트 편집 실체 복합체가 표적 RNA 서열로부터 방출되어 이어서 스플라이싱 및 트랜스레이션과 같은 다운스트림 생화학적 프로세스가 적용 가능하게 된다. 또한 이러한 on/off 비율은 표적 올리고뉴클레오타이드가 표적 RNA에 너무 타이트하게 결합되어서는 안되기 때문에 중요하다.
표적 RNA 서열 편집의 바람직한 특이성 수준은 표적에 따라 달라질 수 있다. 본 특허 출원의 지침에 따라 당업자는 필요에 따라 올리고뉴클레오타이드의 상보적인 부분을 설계할 수 있으며 시행착오를 통해 원하는 결과를 얻는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 보통 정상 뉴클레오타이드 A, G, U 및 C를 포함하지만 예를 들면 하나 이상의 G 뉴클레오타이드 대신에 이노신(I)을 포함할 수도 있다.
올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트와 중첩되는 영역에서 표적 RNA 서열 내의 아데노신의 원하지 않는 편집을 방지하기 위해 올리고뉴클레오타이드를 화학적으로 변형시킬 수 있다. 당 업계에서는 표적 RNA 서열에서 아데노신에 대향하는 뉴클레오시드의 리보실 부분의 2'-O- 메틸화가 ADAR에 의한 아데노신의 탈아민을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(Vogel 등, 2014).
따라서 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 원하는 위치에 2'-메톡시(2'-OMe) 뉴클레오타이드를 포함시킴으로써 편집의 특이성이 현저하게 개선된다. 2'- 메톡시에틸(2'-MOE) 및 2'-O- 디메틸 알릴기와 같은 리보실 부분의 다른 2'-O 치환은 또한 표적 RNA 서열에서 상응하는(대향하는) 아데노신의 불필요한 편집을 감소시킬 수 있다. 이들 모든 변형은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 적용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 합성 및 디자인 분야의 당업자는 다른 화학적 변형도 용이하게 적용할 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드의 합성 및 본 발명에 따른 방법에서 이들의 시험은 과도한 부담을 주지 않으며 다른 변형도 본 발명에 포함된다.
세포에 존재하는 RNA 편집 분자는 일반적으로 포유류를 포함한 후생 동물에서 발견되는 ADAR 효소와 같이 본질적으로 단백질 형태이다. 바람직하게는 세포 편집 엔티티는 효소 보다 바람직하게는 아데노신 디아미나제 또는 시티딘 디아미나제, 더욱 바람직하게는 아데노신 디아미나제이다. 가장 중요한 것들은 hADAR1 p110 및 p150과 같은 임의의 이소- 형을 포함하는 인간 ADAR, hADAR1 및 hADAR2이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 편리하게 디자인할 수있는 당업계에 공지된 RNA 편집 효소는 인간 또는 인간 세포에서 hADAR1 및 hADAR2와 같은 RNA(ADAR)에 작용하는 아데노신 디아미나제 및 시티딘 디아미나제를 포함한다. 인간 ADAR3(hADAR3)은 선행 기술에 기재되어 있지만 디아미나제 활성이 없는 것으로 보고되었다. hADAR1은 두 개의 이소-형이 존재하는 것으로 알려져 있다. 150 kDa의 인터페론 유도성 버전과 더 짧은 100 kDa 버전이 공통적인 pre-mRNA로부터 선택적인 접합을 통해 생산된다.
결과적으로 세포에 존재하는 150kDa 이소-형의 수준은 인터페론 특히 인터페론-감마(IFN-γ)에 의해 영향을 받을 수 있다. hADAR1은 또한 TNF-alpha에 의해 유도될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 인터페론-감마 또는 TNF-알파 및 올리고뉴클레오타이드가 결합된 제품으로 또는 동시에 또는 임의의 순서로 별도의 제품으로서 환자에게 투여될 수 있는 병용 요법을 개발할 수 있는 기회를 제공한다. 특정 질환 상태는 환자의 특정 조직에서 증가된 IFN- 감마 또는 TNF- 알파 수준과 이미 일치될 수 있어 병에 걸린 조직에 대해 보다 구체적으로 편집할 수 있는 기회를 더 창출한다.
본 발명의 AON에서 화학적 변형의 예는 당(리보오스) 모이어티(예를 들면 LNA 또는 로크 핵산에서와 같은) 내의 치환체를 가교 결합을 포함하는 당 모이어티의 변형을 들 수 있으며 이는 상기한 알킬(예를 들면 : 2'-O- 메틸), 2'-O 알키닐(2'-O-알키닐), 알케닐(2'-O-알케닐), 알콕시 알킬(예를 들면 메톡시에틸, 2'-MOE) 그룹을 지닌 2-O 원자의 치환을 들 수 있다. 또한 골격의 포스포디에스테르기는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미 데이트 등의 뉴클레오시드 분자 간 결합을 생성하기 위해 티오에이션, 디티오화, 아미드화 등에 의해 변형될 수 있다. 펩티드 핵산 서열 등을 수득하기 위해 뉴클레오타이드 분자 간 결합의 전부 또는 일부가 펩티드 결합으로 대체될 수 있다.
선택적으로 또는 부가적으로, 핵산 염기는(탈)아민화에 의해 변형되어 이노신 또는 2' 6'- 디아 미노퓨린 등을 생성할 수 있다. 추가적인 변형은 CpG 서열과 관련된 것으로 알려진 잠재적인 면역 원성을 감소시키기 위해 뉴클레오티드의 시티딘 모이어티에서 C5의 메틸화 일 수 있다.
dsRNA 복합체가 표적 RNA 서열에서 A 를 I로 탈아민화시키는 ADAR 효소를 모집하는 경우 편집될 아데노신과 대향하는 뉴클레오타이드 간의 염기-쌍, 미스매치, 벌지 또는 워블은 아데노신 구아닌 우리딘 또는 시티딘 잔기일 수 있으나 바람직하게는 시티딘 잔기이다. 편집 부위 반대편의 잠재적 미스매치(우리딘이 적용되지 않은 경우)를 제외하고, AON의 나머지 부분은 표적 RNA와 완벽하게 상보적일 수 있다. 그러나 본 명세서에 나타낸 바와 같이 특정 측면에서 본 발명은 제한된 수의 불완전 매치을 포함하는 AON에 관한 것이다.
세포 내의 편집 엔티티가 다른 표적 부위로 재지향(redirect) 될 수 있을 정도로 편집 분자의 인식 도메인에 대한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 친화도를 변화시킴으로써 조절될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 정확한 변형은 일부 시행착오 및/또는 올리고뉴클레오타이드와 편집 분자의 인식 도메인 사이의 구조적 상호 작용에 기반한 계산 방법을 통해 결정될 수 있다.
추가적 또는 선택적으로 세포에 존재하는 편집 엔티티를 모집하고 재지향하는 정도는 올리고뉴클레오타이드의 용량 및 투약 요법에 의해 조절될 수 있다. 이것은 보통 임상 1 상 및/또는 2상 임상 시험의 시험자(시험관 내) 또는 임상 의사에 의해 결정될 것이다.
본 발명은 진핵 생물체 바람직하게는 후생동물, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포에서 표적 RNA 서열의 변형에 관한 것이다. 원칙적으로 본 발명은 임의의 포유류 종으로부터의 세포와 함께 사용될 수 있지만 바람직하게는 인간 세포와 함께 사용된다. 본 발명은 예를 들면 피부, 폐, 심장, 신장, 간, 췌장, 장, 근육, 동맥, 눈, 뇌, 혈액 등의 임의의 기관에서 세포와 함께 사용될 수 있다. 본 발명은(인간) 개체의 병리 상태에 관련된 세포, 조직 또는 기관의 서열을 변형시키는데 특히 적합하다.
그러한 세포는 폐 또는 위장관의 상피 세포, 생식 기관 세포, 근육 세포, 눈 세포, 피부 세포와 같은 조직 세포 간, 신장, 췌장, 면역 세포, 암세포, 샘세포 뇌세포와 같은 기관 세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 예를 들면 세포주 또는 배아 줄기(ES) 세포와 함께 생물체 내에 자연적으로 존재하지 않는 포유 동물 세포와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 다능성 줄기세포, 전능 줄기세포, 배아 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포 등을 포함하는 다양한 유형의 줄기 세포와 함께 사용될 수 있다. 상기 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 발견될 수 있다. 본 발명의 하나의 이점은 생물체 내에서 원위치 세포와 함께 사용될 수 있고 배양된 세포와 함께 사용될 수 있다는 점이다. 일정 실시형태에 있어서 세포는 생체 외에서 처리된 다음 생물체 내로 도입된다(예를 들어 원래 유도된 생물체 내로 재도입됨).
본 발명은 또한 소위 장기 유사체(organoid) 내의 세포에서 표적 RNA 서열을 편집하는데 사용될 수 있다. 장기 유사체는 3차원적인 시험관 유래 조직으로 여겨지며 개별적인 격리된 조직을 생성하기 위한 특정 조건을 사용하여 유도된다(예를 들어 Lancaster & Knoblich, Science 2014, 345, No. 6194 1247125 참조). 치료 환경에서 환자의 세포로부터 시험관에서 유래될 수 있기 때문에 유용하며 장기 유사체는 정상적인 이식보다 거부될 가능성이 적은 자가 물질로서 환자에게 다시 도입될 수 있다.
따라서 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면 본 발명은 환자로부터 취한 조직 샘플(예를 들면 위장관으로부터; Sala 등, J Surg Res.2009; 156(2) : 205-12, 또는 Sato 등 Gastroenterology 2011; 141 : 1762-72 참조) 로부터의 장기 유사체(organoid) 상에서 본 발명에 따르는 RNA 편집을 실용화하여 장기 유사체 또는 장기 유사체 내에 존재하는 줄기세포를 환자의 장기 기능의 개선을 위해 재 이식하기 위한 것이다. 처치된 세포는 일반적으로 유전적 변이를 지니며 이러한 변이는 이형 접합이거나 동형 접합일 수 있다.
본 발명은 전형적으로 N이 G, C, U(DNA 의 경우 T)인 경우 N에서 A로 변이 바람직하게는 G에서 A로 점 변이 또는 N이 A, G, U(DNA 의 경우 T)인 경우 N에서 C 로 변이 바람직하게는 U에서 C로 포인트 변이로 변형하여 사용하기 위한 것이다.
특히 흥미 있는 변이를 포함하는 유전자는 다음에서 논의된다. 그러나 일부 실시형태에서 본 발명은 문제의 질환에 대한 유용한 연구 도구를 제공하기 위해 질병 관련 변이를 세포주 또는 동물에 도입함으로써 반대 방향으로 사용된다. 질병 모델을 생성하는 예로서 선천적인 아동 실명의 가장 흔한 형태인 Lebers Congenital Amaurosis(LCA 10) 의 기반을 형성하는 암호화 스플라이스 부위를 생성시키기 위해 CEP290 유전자내에 변이 생성시켜 인간 세포에서 편집 활동을 모집하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 제공하기 위한 것이다.
RNA 편집을 통해 되돌릴 수 있는 변이는 염색체 또는 미토콘드리아 DNA 나 프리-mRNA, 리보솜 RNA 또는 미토콘드리아 RNA를 포함하는 RNA와 같은 DNA의 다른 형태에서 발생할 수 있다. 세포 또는 대상이 감염된 진균류, 효모, 기생충, 키네토플라스티드, 박테리아, 파지, 바이러스 등을 포함하는 병원균의 표적 RNA에 변화가 있을 수 있다. 이어서 편집은 그러한 세포, 대상 또는 병원균 내부의 표적 서열상의 RNA 수준에서 발생할 수 있다.
바이러스와 같은 특정 병원체는 핵산, DNA 또는 RNA를 감염된 숙주(세포)의 세포로 방출한다. 다른 병원체는 감염된 숙주에 상주하거나 순환한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트는 세포가 편집이 발생하는 곳에서 투여된 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트와 양립 가능한 편집 실체를 함유하는 한 감염된 진핵 숙주의 세포에 존재하는 표적 RNA 서열을 편집하거나 또는 진핵생물 숙주에 존재하거나 순환하는 병원체의 세포 내 RNA 서열을 편집하기 위해 사용될 수 있다.
이론에 구속되지 않는 다면 hADAR1 및 hADAR2를 통한 RNA 편집은 전사 또는 스플라이싱 중인 핵 또는 성숙한 mRNA, miRNA 또는 ncRNA가 편집 가능한 곳인 세포질 내에서 1차 전사체 위에서 일어나는 것으로 생각된다. 편집 효소의 상이한 이소-형은 예를 들면 핵 내에서 주로 발견되는 hADAR1 p110 세포질에서 발견되는 hADAR1 p150과 같이 차별적으로 국소화되어 있음이 알려져 있다. 시티딘 디아미나제에 의한 RNA 편집은 mRNA 수준에서 일어나는 것으로 생각된다. 성숙한 mRNA에서 미토콘드리아 RNA 코돈 또는 비 코딩 서열의 편집은 배제되지 않는다.
본 발명은 편집될 부위를 표적화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 진핵 세포에서 표적 RNA 서열을 변화시키고 편집 반응을 일으키기 위해 세포에 상주하는 RNA 편집 실체를 모집하는데 사용된다. 바람직한 편집 반응은 아데노신 탈아민화 및 시티딘 탈아민화이며, 각각 아데노신을 이노신으로 전환시키고 시티딘을 우리딘으로 전환시킨다.
변경은 암호화 스플라이싱 부위 내에서, 엑손 스플라이싱 사일런서 또는 인핸서를 변경하거나 시작 또는 정지 코돈의 도입 또는 제거를 통해 코돈 용도 또는 스플라이싱 행태로 표적 RNA에서 번역된 단백질내의 아미노산을 변경시킴으로서 엑손 내에서, 또는 인트론 스플라이싱 사일런서 또는 인트론 스플라이싱 인핸서 브랜치 포인트를 변경하여 스플라이싱을 변화시킴으로서 인트론 내에서 일반적으로 RNA 안정성, 구조 또는 기능에 영향을 미치는 임의의 영역 내에서 표적 RNA의 5'또는 3' 비번역 영역 내에 존재할 수 있다.
표적 RNA 서열은 점 변이(전이 또는 형질 전환)와 같은 교정 또는 변경하고자 하는 변이를 포함할 수 있다. 선택적으로 표적 RNA 서열을 변형된 표현형(또는 RNA 바이러스와 같은 RNA 기반 유기체의 경우에는 유전자형)을 생성하기 위해 이전에 변이가 없었던 곳에서 의도적으로 변이를 창출할 수 있다.
예를 들면 표적 RNA 서열에서 변화(변이)를 지니는 세포주 또는 동물을 생성할 수 있는데 이는 질병을 연구하기 위한(동물, 장기 유사체 등) 모델 시스템, 질병에 대한 화합물의 시험과 같은 에세이 내에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트 및 방법은 예를 들면 화합물 스크리닝, 단백질 공학 등과 같은 추가적 시험을 위해 예를 들면 매우 다양한 단백질 이소-형을 코딩하기 위해 다양한 종류의 표적 RNA를 지닌 세포 뱅크로 제조하여(정렬된 포맷으로) 스크리닝 시스템 내에서 사용될 수 있다. 표적 RNA는 임의의 세포 또는 바이러스 RNA 서열일 수 있지만 보다 일반적으로는 프리-mRNA 또는 단백질 코딩 기능을 갖는 mRNA이다.
순수하게 쉽게 참고하기 위해 본 발명의 범위를 제한하려는 의도 없이 표 1은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 의해 지시된 아데노신 디아미나제 편집에 의해 야기될 수 있는 잠재적 코돈 변화를 도시하기 위해 제공된다.
표 1은 특히 임의의 RNA에서의 코딩 서열에 대한 본 발명의 적용 가능성의 제한으로서 해석되지 않으며; 이미 지적한 바와 같이 본 발명은 miRNAs, tRNAs내의 코딩 영역, 인트론, 5'- 또는 3'- 비번역 영역과 같은 비-코딩 엑손에서 아데노신을 포함하는 임의의 RNA 표적에서 실용화 될 수 있다.
적용 가능성의 폭에 대한 오해를 피하기 위해 코딩 관점에서 중요하지 않은 변경(침묵')이 특정 단백질의 유전자 발현을 변경시킬 수 있다. 동일한 아미노산에 대한 일부 코돈이 다른 것보다 더 선호될 수 있으므로 예를 들면 상이한 전사 안정성 또는 번역 효율로 인해 변경 없이도 코드화시킨 단백질을 풍부하게 유도할 수 있다.
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Figure 112018124654285-pct00002
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 편집하기 위한 특히 흥미로운 표적인 아데노신은 동시- 또는 후-번역 변형을 위한 촉매 작용 부위, 다른 단백질과의 결합 부위, 기질과의 결합, 국소화된 도메인과 같은 주요 기능 또는 특징을 정의하는 아미노산 잔기에 대한 코돈의 일부이기 때문이다. 또한 글리코실화, 히드록실화, 미리스닐화(myristoylation), 프로테아제에 의한 단백질 분해(단백질 및/또는 세포 내 경로의 일부를 성숙시키기 위한) 등의 기능 또는 특성을 포함할 수 있다.
유전자 질환의 숙주는 G에서 A로 변이에 의해 유발되고 변이된 표적 아데노신에서 아데노신 탈아민화는 변이를 야생형으로 되돌릴 수 있기 때문에 바람직한 표적 질병이 된다. 그러나 야생형으로의 역전은 유익한 효과를 얻기 위해 항상 필요한 것은 아니다. 야생형 뉴클레오타이드가 G가 아닌 경우 표적에서 A에서 G 로의 변형은 또한 유익할 수 있다.
어떤 상황에서는 이것이 예상될 수 있으며 다른 경우에는 약간의 테스트가 필요할 수 있다. 특정 상황 하에서 야생형이 G가 아닌 경우 표적 RNA 내에서 A로부터의 변형은 침묵(다른 아미노산으로 번역되지 않음)이거나 그렇지 않으면 비한정적 예를 들면 아미노산은 치환되나 이는 단백질의 구조와 기능을 파괴시키지 않는 보존적 치환체를 구성하거나 아미노산은 변화에 대해 일정한 견고성을 갖는 기능성 도메인의 일부일 수 있다. 본 발명에 따른 편집에 의해 초래된 A에서 G로의 전이가 비암호화 RNA 또는 RNA의 비암호화 부분에 존재하는 경우 결과는 원래의 변이보다 중요하지 않거나 심각하지 않을 수 있다.
당업자는 본 발명의 적용성이 매우 넓고 질환의 예방 또는 치료에 국한되지 않는다는 점을 이해할 것이다. 본 발명은 또한 그러한 변형이 예를 들면 세포 내에서 또는 비인간 동물 모델 내에서 질병 상태를 유도하더라도 그의 효과를 연구하기 위해 전사체를 변형시키는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드로 예방 및/또는 치료될 수 있는 유전 질환의 바람직한 경우는 표적 RNA 내에서 하나 이상의 아데노신의 변형이 잠재적으로 유익한 변화를 가져올 수 있는 임의의 질환이다.
특별한 관심의 변이를 함유하는 본 발명에 따른 잠재적 표적 RNA 서열인 전사된 RNA 서열은 CFTR 유전자(낭성 섬유증 막 관통 전도 조절제), 디스트로핀, 헌팅틴, 뉴로피브로민 1, 뉴로 피브로민 2, 헤모글로빈의 β-글로빈 사슬, CEP290(중심성 단백질 290kDa), 베타-헥소사 미나디스 A의 HEXA 유전자, 어셔 증후군(Usher syndrome)이라는 유전적 실명의 한 원인인 어셔 유전자(Usher2)를 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다.
보다 광범위한 목록이 아래에 추가로 제시된다. 표적 서열은 그에 따라 선택되고 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트는 변이를 정정하기 위해 원하는 변형을 포함하고 있다. CF 변이 기술 분야의 당업자는 R117H, G542X, G551D, R553X, W1282X 및 N1303K를 포함하는 CFTR 유전자 내에서 1000 내지 2000개의 변이가 알려져 있음을 인지하고 있다.
일반적으로 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 사용하여 역전될 수 있는 임의의 표적 RNA에서의 변이는 아데노신 디아미나제 모집의 경우 G 에서 A로 변이이고 시티딘 디아미나제 모집의 경우 U 에서 C로 변이이며 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트는 그에 따라 설계되어야 한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 사용하여 표적화될 수 있는 변이는 아데노신 디아미나제를 모집하는 경우에는 C에서 A로, U에서 A로(DNA 수준에서는 T에서 A로) 변이이며 시티딘 디아미나제를 모집하는 경우에는 A에서 C로 및 G에서 C로 변이를 포함한다.
후자의 상황에서 RNA 편집이 반드시 변이를 야생형으로 되돌릴 수는 없지만 편집된 뉴클레오타이드는 원래의 변이보다 개선될 수 있다. 예를 들면 번역에서 트렁크화 절단된 단백질을 유도하는 프레임 내에 정지 코돈의 변이는 그 위치에서 원래 아미노산이 아닐 수 있는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변화시켜 적어도 일부 기능성을 지니는(전체 길이) 단백질에 트렁크화 절단된 단백질보다 적어도 더 많은 기능성을 부여할 수 있다.
표적 서열은 진핵 세포 바람직하게는 포유류 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포에 내포되어있다. 따라서 표적 서열은 예를 들면 세포 이력의 어느 시점에서 인위적으로 도입된 형질 전환 유전자 또는 표지 유전자가 아닌 세포 내에 자연적으로 존재하는 유전자(변이 또는 비변이 형태)이다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 적용함으로써 야생형 서열을 변이된 서열로 변화시키는 것도 유용할 수 있기 때문에 변이를 교정하는 것에 국한되지 않는다. 야생형 아데노신을 변형시키는 것이 유익할 수 있는 하나의 예로는 예를 들면 엑손의 스플라이싱에 필요한 분지 사이트인 아데노신을 변형시킴으로써 엑손의 스킵핑을 유발하는 것이다.
다른 실시예로는 아데노신이 단백질 결합을 위한 인식 서열의 일부이거나 한정하는 경우 mRNA의 안정성을 한정하는 2 차 구조에 관여되는 경우이다. 그러므로 언급한 바와 같이 본 발명은 질병에 대한 연구 도구를 제공하고, 현존하는 변이보다 덜 해로운 새로운 변이를 도입하는데 사용될 수 있다.
투여될 올리고뉴클레오타이드의 양, 용량 및 투여 방법은 세포의 유형, 치료될 질병, 표적 인구집단, 투여 형태(예를 들면 전신 대 국소), 질병의 중증도 및 수용 가능한 부작용 수준에 따라 상이할 수 있으나 시험관 내 연구, 전임상 시험 및 임상 시험을 통해 얻어진 시행 착오를 통해 평가될 수 있다.
시도는 변형된 서열이 쉽게 감지된 표현형 변화를 유도할 때 특히 간단하다. 더 많은 용량의 올리고뉴클레오타이드가 세포 내의 핵산 편집 실체(예를 들면 ADAR)와 결합하기 위해 완성될 수 있으며 이에 따라 RNA 편집에 참여하는 엔티티의 양을 고갈시킬 수 있으나 통상적인 용량 시험은 주어진 올리고뉴클레오타이드 및 주어진 표적에 대한 효과를 드러낼 수 있을 것이다.
하나의 적합한 시험 기법은 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 세포주 또는 시험 생물체에 전달한 다음 그 이후 다양한 시점에서 생검 시료를 채취하는 것을 포함한다. 표적 RNA의 서열은 생검 시료 내에서 평가할 수 있고 변형된 세포의 비율을 쉽게 판독할 수 있다. 이 시험이 한 번 수행된 후에는 지식이 보존되고 생검 샘플을 채취할 필요없이 추후의 전달을 수행할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법은 세포의 표적 RNA 서열에서 원하는 변화의 존재를 확인함으로써 표적 RNA 서열이 변형되었음을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 전형적으로 상기 논의된 바와 같이 표적 RNA의 관련 부분 또는 그의 cDNA 카피(표적 RNA가 프리-mRNA 인 경우 또는 그의 스플라이싱 생성물의 cDNA 카피)의 시퀀싱을 포함하며 이에 따라 서열의 변화를 쉽게 입증할 수 있다.
선택적으로 변형은 표적 RNA 서열에 의해 코드화된 단백질이 이온 채널일 때 유도성 전류와 같은 일부 기능적 판독에 의해 단백질의 레벨(길이, 글리코실화, 기능 등) 에서 평가될 수 있다. CFTR 기능의 경우에는 인간을 포함하는 포유 동물 내에서 Ussing chamber 분석 또는 NPD 시험이 당업자에게 기능의 회복 및 수득을 평가하기 위해 이미 공지되어 있다.
RNA 편집이 세포에서 발생된 후에 변형된 RNA는 예를 들면 세포 분열 또는 편집된 RNA의 제한된 반감기 등에 기인하여 시간이 지남에 따라 희석될 수 있다. 따라서 실제 치료학적 측면에서 본 발명의 방법은 시간이 지나도 이익을 유지할 수 있도록 충분한 표적 RNA가 변형되어 환자에게 가시적인 이익을 제공할 때까지 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 반복적으로 전달해야 하는 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 특히 치료용으로 적합하고 따라서 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 일부 실시형태에서 약제학적으로 허용 가능한 담체는 단순한 생리식염수 일 수 있다. 등장액 또는 저장액이 특히 폐 전달에 유용할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 전달 기구(예를 들면 주사기, 흡입기, 분무기)를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기술한 바와 같이 포유 동물, 바람직하게는 인간 세포에서 표적 RNA 서열의 변경을 생성하는 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 유사하게 본 발명은 본 명세서 내에 기술한 바와 같이 포유 동물, 바람직하게는 인간 세포에서 표적 RNA 서열을 변화시키는 약제의 제조에 있어서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 세포에서 표적 RNA 서열에 존재하는 적어도 하나의 특정 표적 아데노신의 탈아민화 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 세포에 본 발명에 따른 AON을 제공하는 단계; 상기 AON의 세포에 의한 흡수를 허용하는 단계; 상기 AON을 표적 RNA 서열에 어닐링시키는 단계; 야생형 효소에서 발견되는 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함하는 포유류 ADAR 효소가 상기 표적 RNA 서열에서 상기 표적 아데노신을 이노신으로 탈아민화시키는 것을 허용하는 단계; 및 선택적으로 RNA 서열에서 상기 이노신의 존재를 확인하는 단계; 를 포함한다. 본 발명에 따른 AON의 세포 내로의 도입은 당업자에게 공지된 일반적인 방법에 의해 수행된다.
탈아민화 후 효과의 판독(표적 RNA 서열의 변경)은 상이한 방식으로 모니터링할 수 있다. 따라서 표적 아데노신의 목적하는 탈아민화가 실제로 발생했는지 여부를 확인하는 단계는 일반적으로 표적 RNA 서열에서 표적 아데노신의 위치 및 아데노신의 존재에 의해 야기되는 효과에 의존한다. 즉 점 변이, 조기 정지 코돈, 비정상적 스플라이싱 부위, 대안적인 스플라이싱 부위, 수득되는 단백질의 미스폴딩 등 이다.
따라서 바람직한 측면에서, A 에서 I로의 전환에 따른 궁극적인 탈아민화 효과는 다음과 같은 식별 단계로 인식할 수 있다: 표적 RNA를 서열 분석하는 단계; 상기 표적 아데노신이 UGA 또는 UAG 정지 코돈에 위치하고 상기 탈아민화를 통해 UGG 코돈으로 편집된 경우 기능적으로 신장된 전체 길이 및/또는 야생형 단백질의 존재를 평가하는 단계; 2 개의 표적 아데노신이 UAA 정지 코돈에 위치할 때 2개의 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 UGG 코돈에 편집된 경우 기능적으로 신장된 전체 길이 및/또는 야생형 단백질의 존재를 평가하는 단계; 상기 탈아민화에 의해 프리-mRNA의 스플라이싱이 변경되었는지 여부를 평가하는 단계; 또는 상기 탈아민화 후 표적 RNA는 기능적으로 전체 길이 신장된 및/또는 야생형 단백질을 코드화에 있어서 기능적 판독을 사용하는 단계; 를 포함한다.
UAA 정지 코돈이 있는 경우 모든 아데노신을 탈아민화 할 필요가 있다. 따라서 본 발명은 또한 서로 인접한 2개의 아데노신이 ADAR과 같은 RNA 편집 효소에 의해 공동 탈아민화되는 올리고뉴클레오타이드 및 방법에 관한 것이다. 이 특별한 경우 UAA 정지 코돈은 UGG Trp 코딩 코돈으로 전환된다(표 1 참조).
아데노신의 이노신으로의 탈아민화는 더 이상 표적 위치에서 변이된 A로부터의 고통을 지니지 않는 단백질을 유도할 수 있기 때문에 예를 들면 기능성 단백질의 존재 여부 또는 심지어 아데노신의 존재에 의해 야기되는 질병이 부분적으로 역전된다는 평가와 같은 이노신으로의 탈아민화의 확인은 또한 기능적 판독일 수 있다. 본 명세서 내에 언급된 질병 각각에 대한 기능성 평가는 일반적으로 당업자에게 공지된 방법에 따른다.
표적 아데노신의 존재가 비정상적 스플라이싱을 야기할 때 판독은 비정상적 스플라이싱이 여전히 일어나고 있는지 아닌지 여부에 대한 평가일 수 있다. 다른 한편으로 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 스플라이싱 부위를 도입하고자 할 때 유사한 접근법이 필요한 스플라이싱 유형이 실제로 일어나는지 여부를 체크하는데 사용될 수 있다. 표적 아데노신의 탈아민화 후 이노신 존재를 확인하는 매우 적합한 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용하고 RT-PCR 및 서열 분석 과정이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 생리식염수, 현탁액 형태의 수용성 용액으로 약학적 용도에 부합되는 첨가제, 부형제 및 다른 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. 농도의 범위는 1 ng/ml 내지 1 g/ml 범위이며 바람직하게는 10 ng/ml 내지 500 mg/ml 범위이고 더욱 바람직하게는 100 ng/ml 내지 100 mg/ml 범위이다. 적합한 투여 용량은 약 1 ㅅg/kg 내지 약 100mg/kg, 바람직하게는 약 10 ㅅg/kg 내지 약 10mg/kg, 보다 바람직하게는 약 100 ㅅg/kg 내지 약 1mg/kg의 범위일 수 있다.
투여 방법은 흡입(예: 분무를 통한), 비강 내, 경구, 주사 또는 주입, 정맥 내, 피하, 피부 내, 두개 내, 근육 내, 기관 내, 복강 내, 직장 내, 종양내 직접 주입에 의한 것 일 수 있다. 투여는 고체 형태, 분말 형태, 환제 형태, 또는 인간의 의약 용도와 양립 가능한 임의의 다른 형태일 수 있다.
본 발명은 근위축성 ㅅ경화증, 천식, 지중해 빈혈, 카다실 증후군, 샤르코-마리-투스병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 근위부 척수성 근위축증(DSMA), 뒤센/베커 근이영양증, 이영양성 수포성 표피박리증, 표피 박리증, 파브리 병, Factor V Leiden 관련 질환, 가족성 선종, 용종증, 갈락토스 혈증, 고쉐 병, 포도당 -6- 인산 탈수소 효소, 혈우병, 유전성 혈색소증, 헌터 증후군, 헌팅턴병, 허러 증후군, 염증성 장질환(IBD), 유전성 다응집 증후군, 레버 선천적 흑내장, 레쉬-니한 증후군, 린치 증후군, 마르팡 증후군, 뮤코다당증, 근이영양증, 근긴장성 이영양증 I형과 II형, 신경 섬유종증, 니만-피크 병 A형, B형과 C형, NY-eso1 관련 암, 파킨슨병, 포이츠-제거스 증후군, 페닐케톤요증, 폼페 병, 원발성 섬모질환, 프로트롬빈 G20210A 변이 프로트롬빈 변이 관련 질환, 폐 고혈압, 망막 색소 변성증, 샌드호프 병, 중증 결합 면역 결핍 증후군(SCID), 겸상 적혈구 빈혈, 척추성 근위축증, 스타가르트 병, 테이-삭스 질병, 어셔 증후군, X- 연결된 면역 결핍 및 예를 들면 BRCA1 및 2 와 같은 유방암 난소암 등 다양한 종류의 암과 같은 유전 질환의 치료에 적합한 것이다.
특정 실시형태에서 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트는 전신으로 전달될 수 있지만 표적 서열의 표현형을 나타내는 세포에 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 것이 보다 일반적이다. 예를 들면 CFTR의 변이는 주로 폐 상피 조직에서 나타나는 낭성 섬유증을 야기함으로 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 특이적으로 CFTR 표적 서열을 지닌 폐에 직접 전달하는 것이 바람직하다.
이것은 전형적으로 분무기의 사용을 통해 분말 또는 에어로졸 형태로 제공되는 흡입에 의해 편리하게 달성될 수 있다. PARI eFlow(Rapid) 또는 Respironics 사의 i-neb를 포함하는 소위 진동 메쉬를 사용하는 분무기가 특히 바람직하다. 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 흡입 적용이 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 전신 분포 및 장, 간, 췌장, 신장 및 타액선 조직의 세포에 의한 흡수를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 흡입 전달은 이들 세포를 효율적으로 표적화할 수 있고, CFTR 유전자 타겟팅의 경우에 낭포성 섬유증과 관련된 위장관 증상의 개선을 유도할 수 있다. 다른 표적 서열의 경우 질병 및/또는 표적 기관에 따라 투여는 국소(예를 들어 피부), 피내, 피하, 근육 내, 정맥 내, 경구용, 눈 주입 등 일 수 있다.
일부 질병에서는 점액층의 두께가 증가하여 폐를 통한 의약의 흡수가 감소된다. 그러한 질병 중 하나는 만성 기관지염이며 다른 예는 낭포성 섬유증이다. 다양한 유형의 점액 정상화제로서 DNase, 고항염증제 또는 Bronchitol 이라는 상품명의 만니톨로 입수 가능하다.
점액 정상화제를 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트와 같은 RNA 편집 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트와 조합하여 사용되는 경우 이러한 약제의 유효성을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 투여 바람직하게는 인간 피험체로의 투여는 바람직하게는 본 명세서 내에 기재된 점액 정상화제와 같은 점액 정상화제와 결합하여 투여하는 것이다.
또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 투여는 예를 들면 Kalydeco(ivacaftor; VX-770) 과 같은 보강제 또는 예를 들면 VX-809 및/또는 VX 661과 같은 교정 화합물과 결합하여 CF 처리한 작은 분자 형태로 투여할 수 있다. CF 내의 병용 치료법은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 IFN-감마 또는 TNF-알파를 사용하여 아데노신 디아미나제의 유도제와 결합시키는 것을 포함할 수 있다.
선택적으로 또는 점액 정상화제와 결합시켜 점액 침투 입자 또는 나노 입자를 통한 전달은 예를 들면 폐 및 장의 상피 세포로의 RNA 편집 분자의 효율적인 전달에 적용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 피험자 바람직하게는 인간 개체에 투여하는 것은 점액 침투 입자 또는 나노 입자를 통한 전달이 바람직하게 사용한다.
낭포성 섬유증과 같은 질병이 있는 환자에게는 만성 및 급성 폐 감염이 종종 발생한다. 항생제 치료는 박테리아 감염 및 점액 농후화 및/또는 바이오필름 형성과 같은 증상을 감소시킨다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트와 결합된 항생제의 사용은 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트를 위한 표적 세포의 보다 용이한 접근에 따른 RNA 편집 효율성의 증가를 초래할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트의 피험체 바람직하게는 인간 개체로의 투여는 박테리아 감염 및 점액 농후화 및/또는 바이오필름 형성과 같은 증상의 감소를 위한 항생제 치료와 바람직하게 결합된다. 항생제는 전신 또는 국소 또는 둘 모두를 통해 투여될 수 있다.
예를 들면 낭포성 섬유증 환자에서의 적용을 위해 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트 또는 본 발명에 따른 패킹화 또는 복합화된 올리고뉴클레오타이드 컨스트럭트는 DNase, 만니톨, 저장 생리식염수 및/또는 항생제 및/또는 예를 들면 ivacaftor와 같은 보강제 또는 예를 들면 lumacaftor 및/또는 VX 661과 같은 교정 화합물 같은 CF 처리용 작은 분자와 결합하여 사용할 수 있다. 표적 세포에 대한 접근성을 증가시키기 위해 Broncheo-Alveolar Lavage(BAL)가 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 투여 전에 폐를 세정하기 위해 적용될 수 있다.
실시예
(실시예 1) 상이한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 서열 분석을 이용한 GFP 표적 RNA내에서 논-센스 변이의 편집
RNA 편집은 세포 게놈에 안정적으로 통합 된 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 발현 컨스트럭트를 포함하는 HeLa 세포를 이용한 세포 시스템에서 처음 조사되었다. 이 컨스트럭트 내에서 코돈 위치 57에 정지 코돈(TAG)이 도입되어 mRNA에서 트리플렛 UAG를 생성한다. 이 트리플렛의 중간에 아데노신에서 RNA를 편집하면 결국 정상적인 전체 길이 단백질이 발현될 것이다. 컨스트럭트(하기 참조) 및 세포주는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성하였다. 이 트리플렛의 중간에 A가 실제로 탈아민화 되어 I로(이후 G로 읽혀질 것임) 판독될 것인지 여부를 표적 RNA와 비교하여 다른 불일치를 포함하는 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세트를 사용하여 조사 되었다. 도 1 참조. UAG 트리플렛을 편집하면 Trp 코돈을 나타내는 UGG가 생성되고 이후에는 기능적 GFP 단백질이 생성된다.
표적 RNA에서 다른 아데노신이 편집되지 않도록 중지 코돈(중간에 미스매치된 C를 지닌 각각의 올리고뉴클레오타이드3'-ACC-5' 도 1)에 대향하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 오직 3개 뉴클레오타이드는 2'-OMe기를 함유하지 않았고, 반면에 안티센스 올리고뉴클레오타이드 내의 다른 모든 뉴클레오타이드는 함유하였다. 또한 모든 시험된 올리고뉴클레오타이드의 각 측면상의 말단 4개 결합은 포스포로티오에이트 결합이고 반면에 나머지 결합은 정상 포스포디에스테르 결합이다.
첫번째 단계는 그 위치에서 뉴클레오타이드가 본 발명에 따른 어느 올리고 뉴클레오타이드 및 ADAR2 와 결합하여 실제로 편집되었는지를 서열 분석을 통해 조사 하는 단계이다. 이를 위해, GFPstop57 컨스트럭트를 안정하게 발현하는 0.4 x 106 헬라 세포를 10%의 우태아 혈청을 포함하는 변형된 Dulbeccos modified Eagles 배지에 넣어 6- 플레이트에 웰 내로 접종시킨다. 24 시간 후에 Lipofectamine 3000을 이용하여 2 ㅅg ADAR2의 과발현 플라스미드(RC212324; Origene)에 후속 AON 트랜스펙션 세포를 형질 감염시킨다.
48시간 후에 선택된 세포 샘플을 Lipofectamine 3000을 사용하여 각각 0, 50 또는 100 nM의AON(도 1 참조)으로 형질 감염시켰다. 24 시간 후, 용해된 세포로부터 RNA를 분리하고 cDNA 합성을위한 주형으로 사용하였다. 정방 프라이머 5'-AGAGGGTGAAGGTGATGCAA-3'(서열번호: 7) 및 역방 프라이머 5'-GGGCATGGCACTCTTGAAAA-3'(서열번호: 8)로 RT-PCR을 수행하여 RNA 편집의 분석을행한다. 이어서 PCR 생성물의 Sanger 서열 분석을 당업자에게 공지된 일반적인 RT-PCR 및 서열 분석 방법을 사용하여 수행하였다.
A 에서I 로의 편집의 효율은 A에서 I로의 편집이 서열 분석 크로마토그램에서 A로부터 G의 시그널 강도의(부분적인) 시프트가 명백한 곳에서 RT-PCR 산물의 Sanger 서열 분석에 의해 분석될 수 있다. 이 방법이 완전히 정량적이지는 않지만 A 및 G 빈도의 비율은 A에서 I로의 편집 효율의 대략적인 추정치로 사용할 수 있다. 예상한 바와 같이 어떤 AON으로도 형질 감염되지 않은 샘플에서 표적 부위의 A 피크와 중첩되는 G에 대한 신호는 관찰되지 않았다(도 2, 패널 A 및 B). 대조적으로 AON으로 형질 감염된 샘플에서, 중첩되는 A 및 G 피크(각각 도 2에서 녹색 및 흑색)에 의해 지시된 바와 같이 G 로의 부분적 변화가 이 위치에서 관찰된다. 이 효과는 가변적이다. 표적부위에서 약간의 중첩 G 신호가 각 AON에서 관찰될 수 있지만 AON ADAR58 및 ADAR59에서 가장 강하게 나타났다(도 2 G 내지J).
워블 염기 쌍은 RNA 2차 구조에서 기본적인 역할을 하며 tRNA에 광범위하게 존재한다. 빈번히 RNA 서열에서 이들의 발생은 벌지형 RNA 구조, 루프 및 미스매치에 관련이 있다. RNA 편집상에서 AON내의 워블 염기쌍의 존재 효과를 조사하기 위해 본 발명의 발명자는 5개의 워블 염기쌍을 함유하는 ADAR72-1을 고안하였다. GFP 표적 RNA(상기 참조) 내에서 논-센스 변이의 편집을 유도하는 능력을 조사하고 정확히 동일한 서열을 가지나 워블 염기쌍이 없는 올리고뉴클레오타이드 ADAR59-2(= ADAR59, 상기 참조)와 비교하였다:
Figure 112018124654285-pct00003
상부 가닥은 AON이고, 하부 가닥은 5'에서 3'까지의 표적 RNA이다. 표적으로하는 아데노신은 굵게 표시됩니다. 불일치 및 워블은 밑줄이 그어져 있고 화살표는 추가 워블 기본 쌍의 위치를 나타낸다.
ADAR59-2(= ADAR59; 서열번호: 4, 실시예 5 참조) 및 ADAR72-1(서열번호: 34)은 아래와 같이 화학적으로 변형된다: 소문자는 2'-O-메틸 변형된 RNA 뉴클레오타이드를 나타내는 반면 대문자 뉴클레오타이드는 변형되지 않은 RNA 뉴클레오타이드이다. 별표는 AON의 3' 및 5' 말단에서 뉴클레오시드 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 미스매치 및 워블은 밑줄로 표시된다.
Figure 112018124654285-pct00004
ADAR59-2 및 ADAR72-1은 모두 ADAR2(ADAR2a)의 과발현된 이소-형 2를 갖는 HEK293 세포 용해물을 사용하여 시험관 내 편집 에세이를 통해 시험하였다. 과발현된 ADAR2a를 지닌 AON이 없는 HEK293 세포 용해물을 음성 대조군으로 사용하였다. 용해물을 얻기 위해 HEK293 세포를 먼저 Lipofectamine 3000을 사용하여 500 ng의 ADARB1 발현 플라스미드(OriGene)로 밤새 형질 감염시켰다. 그런 다음 Lysis-M 시약을 사용하여 세포를 용해시켰다.
200 nM AONs와 90 nM 주형ssRNA를 30℃에서 30분 동안 시험관 내 편집 에세이 완충액과 함께 미리 인큐베이션 시켰다. 사전 인큐베이션 후 세포 용해물(10 μl)를 첨가하고 반응 혼합물은 30℃에서 30분 동안 인큐베이션 시키고 연이어 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 시켰다. 이어서 페놀 클로로포름 추출에 의해 표적화된 RNA를 추출하고 제조자의 프로토콜을 사용하여 Maxima RT 시약을 사용하여 역전사시키고 상기한 바와 같이 서열 분석하였다.
도 3에 제공된 서열 분석 데이터에는 AON을 사용되지 않은 곳에는 샘플에 A에서 I로의 편집이 감지되지 않았다. 백그라운드 상에 G 신호가 보이지 않는다. 대조적으로 올리고뉴클레오타이드 ADAR59-2를 편집 에세이에 사용한 곳에서 샘플을 위한 가시적인 G 시그널이 명백히 존재한다. 또한 올리고뉴클레오타이드 ADAR72-1에 대해 G 시그널의 더 높은 강도가 표적 RNA/AON 서열에서 추가적인 워블 염기쌍의 존재가 A에서I로의 편집을 증가시키는데 도움이 됨을 나타낸다.
(실시예 2) 허러 증후군 치료에서의 RNA 편집
본 발명의 시스템을 사용하는 RNA 편집을 위한 하나의 잠재적인 질병 표적은 뮤코다당류 유형 I - Hurler(MPS I-H; 허러 증후군)이다. 이 질환은 리소좀 효소 α-L-이듀로니다제를 암호화하는 IDUA 유전자의 c.1205G>A(W402X) 변이에 의해 발생한다. 본 발명의 방법 및 수단을 사용하여 A에서 I로의 편집은 변이를 야생형 서열로 잠재적으로 역전시킬 수 있다.
허러 증후군(Hurler syndrome)은 리소좀성 저장 장애로서 글리코스아미노글리칸의 축적으로 인한 다발성 장기 부전을 유발한다. 내인성 유전자의 변이와 유사한 변이(W392X)를 지닌 마우스 모델이 존재한다. 초기 실험은 이 마우스 모델에서 수행되어 다른 조직 및 기관에서의 효과를 평가한다. 또한 다른 조직에서 글리코스아미노글리칸의 수준을 평가하여 편집 방법의 치료 가능성을 평가할 수 있다.
마우스 Idua 유전자의 엑손 9 서열의 일부는 다음과 같다(굵은 글씨체는 변이) :
Figure 112018124654285-pct00005
이 DNA 서열은 서열번호:11이고, 상응하는 RNA 서열은 서열번호:12이다. 본 발명의 발명자는 하기 서열을 지니는 마우스 모델을 사용하여 본 명세서에서 개략적으로 설명된 바와 같이 RNA 편집에 사용되는 Idua 서열의 이 부분으로부터 유래하는 프리-mRNA에 대한 다수의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생성하였다(상부 가닥은 3' 에서 5' 올리고뉴클레오타이드고 하부 가닥은 5'에서 3' 표적 RNA(서열번호:12)이고 미스매치 및 워블은 밑줄 친다.
Figure 112018124654285-pct00006
ADAR65(서열번호: 24), ADAR65-2(서열번호: 25), ADAR66(서열번호: 14), ADAR67(서열번호: 15), ADAR91(서열번호: 26) 및 ADAR93(서열번호: 27)은 다음과 같은 다수의 화학적 변형을 갖는다.
Figure 112018124654285-pct00007
소문자는 2'-O 메틸 변형된 RNA 뉴클레오타이드를 나타내고, 대문자 뉴클레오타이드는 비변형된 RNA 뉴클레오타이드(따라서 2'-O 메틸 변형은 없음)이고 ADAR65-2를 제외하고는 모두 표적 아데노신에 대향하는 중심 시티딘을 둘러싸고 모든 뉴클레오타이드에 2'-O 메틸 변형을 지닌다. 별표는 올리고뉴클레오타이드의 모든 말단에서의(4) 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 미스매치 및 워블은 밑줄로 표시한다.
ADAR91은 표적 RNA와 5 개의 미스매치/워블을 지니며 ADAR67은 4이고 ADAR93 및 ADAR65-2X는 모두 2인 반면 ADAR65, ADAR65-2 및 ADAR66 AON은 표적 아데노신의 대향하는 뉴클레오티드에서만 상이하다. ADAR65와 ADAR66은 변형에서 동일하지만 ADAR66은 3' 말단에서 ADAR65보다 2 뉴클레오타이드 길이가 짧다.
야생형 서열의 복원에 대한 이들 AON의 효과를 Idua에 의해 코딩된 α-L- 이두로니다제 효소의 활성을 측정하는 에세이를 통해 시험하였다. 이를 위해 W392X 마우스 유래 불멸화 배아 섬유아세포(샘플 당 70,000개)를 성장 배지(DMEM/10 % FCS)에서 배양하고, Lipofectamine 3000을 사용하여 Idua W392X mRNA를 발현하는 1 μg의 플라스미드로 형질 감염시켰다. 24시간 후 세포를 유사하게 100 nM(최종 농도)의 올리고뉴클레오타이드로 형질 감염시키고 추가 48시간 동안 배양하였다.
이어서 세포를 수집하고 mPER 완충액(Thermo Scientific # 78501)에서 용해시켰다. 세포 단편을 원심 분리에 의해 용해물로부터 제거하고 효소 분석을 위해 25㎕의 상등액을 사용하였다. 0.4M 포름산 나트륨 완충액(pH 3.5) 내에 360μM 의 4- 메틸럼벨리페릴 α-L- 이두로 니드 25㎕를 용해물 시료에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 0.17M 글리신 완충액(pH 9.9) 200㎕를 가하여 반응을 종결 시킨 후 얻어지는 형광 강도를 측정하였다(여기시 파장 365nm, 발광시 450nm). BCA 에세이(Pierce ™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific)으로 측정한 결과를 시료의 총 단백질 농도로 정규화시켰다.
그 결과(도 4 참조) 이러한 조건에서 올리고뉴클레오타이드 ADAR65-2 및 ADAR 93-1로의 형질 전환은 변이 Idua mRNA 만을 발현하는 비- 올리고뉴클레오타이드 처리 세포(NT) 샘플을 사용하여 얻은 형광에 비해 효소 활성이 2배 미만으로 약간 향상되었다. 대조적으로 AON ADAR67 및 ADAR91이 활성이 2배 이상 증가한 AON ADAR66, ADAR65 및 ADAR65-2X를 지닌 다른 AON에서는 유의적인 증가가 관찰되었으며 각각 3, 4 및 6배 이상의 증가를 초래하였다.
이어서 올리고뉴클레오타이드, 표적 RNA 및 ADAR 단백질 사이의 상호작용의 모델링 데이터에 기초하여 본 발명자는 편집 부위로부터 업스트림 4 번 위치의 올리고뉴클레오타이드의 미스매치가 표적 RNA에 대한 ADAR 단백질의 결합을 향상시킬 수 있고 이에 따라 편집 효율성과 편집 수준이 향상됨을 확인하였다. 4개의 올리고 뉴클레오타이드(ADAR93-2, ADAR93-3, ADAR93-4 및 ADAR93-5)는 마우스 Idua 변이 유전자(W392X)의 표적 프리-mRNA의 편집시 4번 위치에서의 미스매치의 영향을 시험하기 위해 설계되어 야생형 서열을 복원한다.
Figure 112018124654285-pct00008
상부 가닥은 올리고뉴클레오타이드이고 하부 가닥은 굵은 글씨체로 표시된 변이(A)를 지닌 표적 RNA이다. 미스매치와 워블에는 밑줄이 그어져 있다. 올리고뉴클레오타이드 ADAR93-3과 ADAR93-5와 표적 서열 간에서 업스트림 4번째 뉴클레오타이드인 위치의 표적 서열과의 미스메치는 화살표로 표시하였다. ADAR92-2는 미스매치 이외에는 ADAR93-3과 동일하다. ADAR93-4는 미스매치 이외에는 ADAR93-5와 동일하다. 다수의 화학적 변형을 지닌 ADAR93-2(서열번호: 28), ADAR93-3(서열번호: 29), ADAR93-4(서열번호: 30) 및 ADAR93-5 은 다음과 같다.
Figure 112018124654285-pct00009
소문자는 2'-O 메틸 변형된 RNA 뉴클레오타이드를 나타내고 대문자 뉴클레오타이드는 변형되지 않은 RNA 뉴클레오타이드(2'-O 메틸 변형은 없음)이다. 뉴클레오시드의 별표(asterisk)는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 미스매치 및 워블은 밑줄로 표시된다.
야생형 서열을 복원하는데 이들 4개의 올리고뉴클레오타이드의 효과를 전술한 바와 같은 편집 및 효소 에세이로 시험하였다. 도 5의 (A) 및 (B)에 나타난 바와 같이 올리고뉴클레오타이드 ADAR93-2 및 ADAR93-5의 C-A 미스매치의 표적 서열로의 도입은 편집에 긍정적인 효과를 나타내었고 미스매치(각각 ADAR93-2 및 ADAR93-4)를 지니지 않는 올리고뉴클레오타이드와 비교시 형광 시그널의 증가를 나타내었다. 이것은 편집 사이트(업스트림은 표적 서열에서 5'방향으로)의 4번 위치와의 부가적인 미스매치가 ADAR 단백질이 표적 RNA에 더 많이 결합하여 편집 효율성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
(실시예 3) A1AT 결핍증 치료에서의 RNA 편집
여기에 개략적으로 설명된 접근법을 사용하는 RNA 편집의 또 다른 질병 목표는 SERPINA1 유전자의 c.1096G>A 변이에 의해 유발된 A1AT- 결핍증(A1ATD)이다. 표적은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 전달을 위한 인간 c.1096G>A 변이 서열이다. 마우스 모델은 인간화된 서열을 포함한다. 생체 내 전달을 위해 본 발명의 지침에 따라 설계된 컨스트럭트의 주된 표적은 A1AT의 대부분이 생성되는 간이다. 평가는 질병과 관련된 폐 및 간 표현형의 기능적 구조뿐만 아니라 RNA 수준에서 관찰된 편집 활동을 기반으로 한다.
(실시예 4) 파킨슨병 치료에서의 RNA 편집
본 발명의 접근법을 사용하는 RNA 편집을 위한 추가 질병 표적은 LRRK2 유전자의 c.6055G>A 변이에 의해 야기되는 파킨슨병이다. 이것은 파킨슨병과 관련된 가장 일반적인 유전적 원인이다. 마우스 모델을 사용한 직접 주입을 비롯하여 본 명세서 내에서 제시된 바와 같이 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 뇌를 표적화하기 위한 다양한 방법이 시험된다. 효능의 평가는 주로 RNA 수준에서 관찰된 편집 활동을 기반으로 한다. 변이에 의해 야기된 과활성 키나아제 활성(예를 들면 Rab GTPases에 영향을 미치는 것으로 알려짐)이 역전된다는 것을 입증하기 위해 세포의 인산가요성도 또한 연구된다. 궁극적으로 마우스의 연령 유발성 도파민성 신경 세포의 통합적으로 미치는 영향을 평가한다.
(실시예 5) 내인성 ADAR에 의한 RNA 편집
RNA 편집이 외인성 ADAR 효소를 과다 발현시키지 않고 달성될 수 있는지를 조사하기 위해 이용 가능한 세포주가 ADAR1 및/또는 ADAR2를 어떻게 발현 되는지를 먼저 평가하였다. 이들 세포 ADAR1 및/또는 ADAR2를 발현하는 경우는 GFP 정지를 편집하기 위해 관심있는 올리고뉴클레오타이드와 함께 실시예 1에 개략된 바와 같이 GFP 정지 코돈을 포함하는 컨스트럭트로 형질 감염시킬 것이다.
A549(인간 폐암), HCT116(인간 결장암), T84(인간 결장암), SNU-449(인간 간세포암), SNU-475(인간 간세포암) PANC1(인간 췌장암), SK-N-SH(인간 신경모세포종) 및 MCF7(인간 유방암) 세포주를 ADAR 발현 시험을 위해 우선 시험하였다. A549 세포를 RPMI1640 + 10 % FBS에 넣고 HCT116(ATCC # 62765668)을 McCoys 5A + 10 % FBS에 넣고 T84를 DMEM: F12(1:1) + 10 % FBS에 넣고 SNU-449(ATCC # RPMI1640 +10 % FBS에 SNU-475(ATCC # 62996846)를 넣고 DMEM + 10 % FBS에 보관하고 SKE-N-SH를 MEME + 10 % FBS + 5ml/L NaPyr + 5ml/L Glutamax 에 넣고 MCF7 세포를 DMEM + 10 % FBS에 보관하였다.
각 세포주에서 ADAR1 및 ADAR2의 발현을 웨스턴 블로팅을 사용하여 확인하였다. 이를 위해 세포를 채취하고 단백질 정량을 Pierce BSA 단백질 에세이 키트(Thermo Scientific)을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고 분석을 위해 막으로 이송시켰다.
초기 단계로 블롯을 Ponceau S로 염색하여 총 단백질 로딩을 시각화하였으며 이는 모든 세포주/ 레인에 대해 동일하게 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 다음으로 막을 PBS-T내에서 1X 세척하고 프라이머리 마우스 항 -ADARB1(SAB1405426(Sigma), 0.05 % 1:1000, PBS-T 내에서 ) 및 마우스 항 -ADAR1(GT1066 ab 184527(Abcam) 1:1000, 0.05 % PBS-T 내에서) 및 토끼 항-튜불린(0.05 % PBS-T 내에서 1:5000) 항체 용액을 4 ℃에서 롤러 벤치 O/N 위에서 처리하였다.
다음날 막을 PBS-T로 3 x 5 분간 세척하고 1:5000 항- 마우스 IRDye 800CW와 1:5000 항- 토끼 IRDye 680RD 2 차 항체 용액으로 RT에서 1시간 동안 인큐베이션 시켰다. 막을 PBS-T로 3 x 5 분간 PBS로 5 분간 세척하였다. 멤브레인은 700 및 800 파장 및 자동 이미지 설정을 지닌 Oddysey CLx 이미지 시스템(LiCor Bioscence)을 사용하여 스캔하였다.
웨스턴 블로팅은 도 6에 나타내었다. 단백질 로딩이 모든 세포주에서 B- 튜불린 발현에서 추론할 수 있는 것과 동등한 반면 ADAR1 발현은 그 발현이 극도로 낮은 인간 유방암 세포주 MCF7을 제외한 모든 세포주에서 유사하였다. 한편 ADAR2 발현은 인간 간세포암 세포주인 SNU-475를 제외한 모든 세포주에서 유사하였고 이는 현실적으로 존재하는 것으로 보이지만 현저히 적다. 나머지 6 개의 세포주는 ADAR1과 ADAR2를 비슷한 수준으로 나타났다.
모든 세포주가 ADAR1 또는 ADAR2 또는 ADAR1 및 ADAR2 모두를 발현하는 것으로 판명되었기 때문에 T84를 제외한 모든 세포는 형질 감염되었으며, RNA 합성 효소의 내인성 수준이 표적 서열내의 미리 결정된 위치에서 RNA를 편집하기에 충분한지 여부를 확인하기 위해 시험되었다.
이 세포에 대해 표적 서열(GFPstop57) 및 올리고뉴클레오타이드로 형질 감염시켰다. GFPstop57 발현 컨스트럭트(도 10A)는 잔기 58(아미노산 서열에 대한 서열번호: 10, 도 10B)에서의 정지로 인한 것에 기인하는 57 아미노산 단백질을 코딩하는 안정적으로 통합된 GFPstop57 서열(서열번호: 9, 도 10B)을 지니는 HeLa 세포주(실시예 1)의 생성에서 사용된 것과 동일한 컨스트럭트이다.
세포를 2 ml의 배지에서 6- 웰 플레이트에 웰 당 약 0.3ㅧ106 세포로 도말 하였다. 도말 24시간 후 세포는 당업자에게 공지된 일반적인 기술을 적용하여 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 및 Opti-Mem(Gibco)를 사용하여 1000 ng GFPstop57 플라스미드로 형질 감염되었다. 형질 감염 6시간 후 2 ml의 신선한 배지를 첨가하고 플레이팅 48시간 후에 세포를 100 nM 올리고뉴클레오타이드로 형질 감염시키고 다시 6시간 후에 2 ml의 신선한 배지를 첨가하였다. 세포를 올리고뉴클레오타이드로 형질 감염시킨 30시간 후에 수집하였다. 스크램블 된 올리고 및 모의(Cy5) 형질 감염을 음성 대조군으로 사용하였다. 실시예 1 및 도 1 및 서열번호: 1 내지 4에 각각 나타난 것과 유사하게 하기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 시험하였다.
Figure 112018124654285-pct00010
소문자는 2'-O 메틸 변형된 RNA 뉴클레오타이드이고 대문자 뉴클레오타이드는 변형되지 않은 RNA 뉴클레오타이드(그러므로 2'-O 메틸 변형이 없음)이며 GFPstop57에서 표적 아데노신에 대향하는 중심 C를 둘러싸고 있다. 별표(*)는 올리고뉴클레오타이드의 말단에서 뉴클레오시드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
형질 감염 36시간 후에 용해된 세포로부터 RNA를 분리하고 cDNA 합성 및 PCR의 주형으로 사용하였다. RNA 품질은 Agilent 2100 bioanalyzer로 확인하였다. RNA 편집의 분석은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 RT-PCR에 의해 수행되었고 이어서 일반 RT-PCR 및 당업자에게 공지된 서열 분석 방법을 사용하여 PCR 생성물의 Sanger 서열 분석이 수행되었다. RT-PCR은 GFPstop57 컨스트럭트 및 올리고뉴클레오타이드(ADAR59-2로 형질 감염된 SK-N-SH 세포를 제외하고)로 형질 감염된 5개의 나머지 모든 세포주가 175개 뉴클레오타이드 생성물을 생성하는 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음).
상이한 세포주로부터의 PCR 생성물을 GFP forward3(서열번호: 7, 상기 참조) 및 GFP reverse3 프라이머(서열번호: 8, 상기 참조)를 사용하여 서열 분석에 사용하였다. A549, HCT116 및 PANC1 세포에서 TAG -> TGG(정방향) 또는 CTA -> CCA(역방향)에서 유의미한 변화는 백그라운드 수준 이상으로 검출되지 않았지만 SNU-449 세포에서는 ADAR56-2 및 ADAR59-2 올리고뉴클레오타이드에서 약간의 변화가 나타났다(데이터는 나타내지 않음).
백그라운드보다 훨씬 더 명확한 결과를 SNU-475 및 MCF7 세포에서 얻었다. 도 7은 서열 분석에서 정방향(FWD) 및 역방향(REV) 프라이머를 사용하여 SNU-475(간암) 세포상의 4개의 올리고뉴클레오타이드를 분석한 결과를 나타낸다. 도 8은 서열 분석에서 정방향(FWD) 프라이머를 사용하여 MCF7(유방암) 세포에서 4개의 올리고뉴클레오타이드를 분석한 결과를 나타낸다.
이 수치는 표적 위치의 서열에서 매우 명확하고 중요한 시프트를 나타내며 여기에서 4개의 모든 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 SNU-475 세포에서 내인성 ADAR을 지닌 RNA 편집이 관찰되는 동안 ADAR59-2는 MCF7에서 최상의 결과를 나타내었다. 도 9는 타겟 아데노신(화살표) 탈아민화에서만 발생하는 것을 나타내는 ADAR57-2(도 7의 좌 하단 참조)를 사용한 후의 서열 분석 결과를 제공하는 것으로 주변 아데노신 무차별 편집이 발생하지 않음을 나타내며 AON 및 본 발명의 방법은 매우 부위 특정 편집을 확신시킨다.
이러한 결과는 본 발명자들이 RNA 편집 효소를 과도하게 발현할 필요 없이 표적 서열 과 RNA 편집 유도체 올리고뉴클레오타이드(특이적으로 변형된 것)를 도입한 세포 내에서 RNA 편집이 즉 내인성 ADAR 단백질의 효소 활성 및 부위 특이적 방법에 의존하여(즉, AON에 의해 표적화된 RNA 서열 내의 오직 하나의 아데노신만이 편집되었다; 도 9 참조) 달성됨을 보여준다.
(실시예 6) 내인성 ADAR에 의한 내인성 표적상에 RNA 편집
실시예 5에서 기술된 내인성 ADAR 효소를 사용하여 RNA 편집을 달성한 후, 내인성 ADAR 효소를 사용한 RNA 편집이 또한 표적 서열의 동시 형질 감염 없이도 달성될 수 있는지 여부를 조사하였다. 본 발명의 발명자는 상대적으로 풍부하고 유비쿼터스한 발현에 의해 내인성 표적으로 작은 핵 리보뉴클레오타이드 폴리펩티드 A(Snrpa)를 선별하였다. 유전자는 U1 소 뉴클리어 리보뉴클레오단백질의 스템 루프 Ⅱ와 관련된 단백질을 암호화하며 이는 전구체 mRNA의 5' 스플라이스 부위에 결합하고 스플라이싱에 필요하다. AON은 마우스 Snrpa mRNA의 야생형 종결 코돈(UAG)을 편집하도록 설계되었으며 이는 오픈 리딩 프레임의 연장 및 다운스트림 서열에 의해 암호화된 확대된 단백질을 초래 할 가능성이 있다(도 11).
ADAR87-1과 ADAR89-1의 2 종의 AON(표 2 참조)을 C57/L 마우스에서 생성된 BW7756 마우스 간암 유래 세포주인 Hepa 1-6 세포에서 시험하였다. 정규 배양 배지(DMEM + 10 % FCS)에서 200,000 세포/웰의 세포을 형질 감염 24시간 전에 6-웰 플레이트에 세포를 플레이팅하였다.
24시간 후 세포를 NT 대조군과 AON 단독으로 형질 감염시키지 않거나 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 ADAR2(ADAR2sh)의 쇼트 이소형을 암호화하는 1000 ng 플라스미드로 형질 감염시켰다. 형질 감염 혼합물을 첨가하기 전에 배지를 교체하고 형질 감염 없이 웰 내에 배지를 다시 신선화 시켰다. 다시 24시간 후 세포를 다시 형질 감염시키지 않거나(NT 대조군) ADAR87-1 또는 ADAR89-1의 웰 당 100 nM AON의 최종 농도가 되게 하엿다. 형질 감염 전에 배지를 다시 신선화 시켰다.
37℃에서 두 번 형질 감염(또는 AON 단독의 경우, 단일 형질 감염 후)시킨 후 48시간 동안 세포를 배양하였다. 배지를 제거하고 세포를 1X PBS로 1회 세척하고 세포 용해를 위해 각 웰에 400㎕의 Trizol을 첨가하였다. 이어서 Trizol을 1.5 mL Eppendorf 튜브에 수집하고 RNA를 Direct-Zol RNA miniprep(Zymo)로 제조자 지침에 따라 추출하였다.
RNA 농도는 Nanodrop을 사용하여 측정하였고 500ng RNA는 Maxima 역상 트랜스크립타제 키트(ThermoFisher Scientific)로 cDNA 합성에 사용하였다. 첫 번째 단계에서 AON은 1.2 μl(2 μM) 부분 상보적 센스 올리고뉴클레오타이드 mSnrpa-SON3와 인큐베이션시켜 표적 mRNA로부터 해리시켰다.
5'-U*C*C*U*UUGCCAAGAAGUGGCACCUUUUCCUCCCAUGCCUACUCC*U*U*C*C-3'(서열번호: 20). mSnrpa-SON3의 별표는 뉴클레오시드간의 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 이 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸화되어 있다. cDNA 합성은 제조자의 프로토콜을 사용하여 수행하였다. PCR은 당업자에게 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 정방 프라이머 Fw1_mSNRPA 5'-GCCTTCGTGGAGTTTGACA-3'(서열번호: 21) 및 역방 프라이머 Rev1_mSNRPA 5'-ACACACGGCTCTGAGAAGGT-3'(서열번호: 22) 을 사용하여 수행되었다. PCR 생성물을 Agilent 2100 Bioanalyser에서 검사하고 Nucleo-Spin Gel 및 PCR 클린 업키트(Macherey-Nagel)로 정제하고 서열 분석 프라이머 Snrp-1-Fw1 5'-CGTGGAGTTTGACAATGAAGT-3'(서열번호: 23)으로 서열 분석하였다.
Figure 112018124654285-pct00011
A, C, G 및 U는 RNA이고; 밑줄친 C와 A는 DNA이다. mA, mC, mG 및 mU는 2'-O 메틸화리보뉴클레오타이드이고; 별표는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
ADAR87-1을 사용할 때 백그라운드 위에 편집은 관찰되지 않았다.(데이터는 표시되지 않음). ADAR89-1 올리고뉴클레오타이드에 의한 RNA 편집 결과를 도 12내에 제공한다. 패널 (A)는 중지 코돈 위치(화살표로 주어진)에서 어떠한 검출 가능한 RNA 편집이 없는 비 트랜스펙션(NT) 대조군을 나타낸다. 패널 (B)는 ADAR2의 쇼트 이소형을 코딩하는 플라스미드만이 형질 감염된 대조군을 나타낸다. 패널 (C)는 화살표로 표시된 G 피크의 상승을 나타낸다. 분명한 백그라운드 위에 이러한 증가는(A → I) RNA 편집이 ADAR2 과발현 플라스미드로 형질 감염되지 않은 세포에서 ADAR89-1 AON으로 형질 감염시킨 후 원하는 위치에서 일어남을 나타낸다.
패널(D)는 ADARsh 발현 플라스미드 및 AON 양성 대조군을 보여준다. 이 결과(패널 C)는 유도 된 RNA 편집이 표적 RNA의 과발현에 의해 야기된ADAR 과발현의 부재 및 플라스미드의 동시-형질 감염 없이 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 도입에 의해 원하는 위치에서 특이적으로 처음 관찰한 것으로 여겨진다.
2개의 올리고뉴클레오타이드를 추가적으로 설계하였다. 중앙 트리플렛 CCA(중심 뉴클레오타이드 C가 편집된 아데노신과 대향함)은 DNA이며 반면 올리고뉴클레오타이드의 나머지가 2-O-메틸 변형된 ADAR89-2 및 ADAR94-1(표 2 참조)를 설계하였다. ADAR89-2의 서열은 ADAR89-1과 동일하지만 ADAR94-1의 서열은 ADAR89-2와 비교하여 두 개의 추가적인 미스매치를 지닌다(도 12 참조).
이들 AON은 Hepa 1-6 세포에서 상기 실시예와 동일한 에세이로 시험하였다. 결과 서열 분석 데이터는 도 13에 묘사되어 있으며 비-형질 감염대조군(NCTRL)에 대해 RNA 편집이 검출되지 않았음을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드 ADAR89-2에 대한 서열 분석 데이터는 편집 부위에서 화살표로 표시된 바와 같이 G 뉴클레오타이드의 존재를 나타내며 이는 중앙 트리플렛이 DNA(RNA가 아님)일때 양호한 편집이 얻어질 수 있음을 나타낸다. 핵산 분해 효소에 매우 민감한 중앙 트리플렛 RNA 뉴클레오타이드를 DNA로 대체하는 것은 AON의 안정성을 증가시킬 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 ADAR94-1에 대한 G 피크를 위한 시그널의 명확한 증가는 ADAR89-2의 서열에서 10 및 14 위치에 2개의 추가 미스매치를 삽입하는 것이 내인성 Snrpa 프리-mRNA의 편집에 훨씬 더 긍정적인 효과를 나타내며 이는 추가 벌지, 미스매치 및/또는 워블이 RNA 편집 효율을 추가로 증가시킬 수 있음을 나타낸다(모든 상이한 표적에서 서열, AON-RNA 나선의 용융 온도, 중첩, 2차 구조, 등).
(실시예 7) BDNF를 인코딩하는 RNA에서 Val66Met 변이를 복구하기 위한 RNA 편집
올리고뉴클레오타이드를 유도하는 단일 가닥 RNA 편집의 설계는 다양한 RNA 표적 및 변이를 포함하는 그러한 표적과 관련된 다양한 질병 및 장애에 사용될 수 있다. 최근에 밝혀진 알츠하이머병의 잠재적 목표 중 하나는 G에서 A 변이에 의해 유발된 뇌유래 신경영양인자(BDNF) Val66Met 의 다형성이다(Boots et al. Neurology May 30, 2017. Vol 88(22): 2098 -2106).
본 명세서에 개시된 AON은 특정 BDNF mRNA 위치에서 RNA를 편집하는데 사용된다. 이러한 목적을 위해 사용되는 AON은 하기 서열을 지닌다. BDNF 표적서열(서열번호:35)인 하부 가닥 및 올리고뉴클레오타이드를 나타내는 상부 가닥이다. 변형은 2'-O-메틸(소문자), DNA(대문자), 포스포로티오에이트 결합(별표) 및 미스매치 및 워블(밑줄 긋기). 표적 아데노신은 굵게 표시하였다.
Figure 112018124654285-pct00012
본 발명은 단지 실시예로써 설명되었지만 본 발명의 사상 및 범위 내에서 변형이 이루어질 수 있다는 것으로 이해되어야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> PROQR THERAPEUTICS II B.V. <120> SINGLE-STRANDED RNA-EDITING OLIGONUCLEOTIDES <130> P068545WO <140> PCT/EP2017/065467 <141> 2017-06-22 <150> GB1610923.3 <151> 2016-06-22 <150> GB1614669.8 <151> 2016-08-30 <150> GB1702755.8 <151> 2017-02-21 <150> GB1706292.8 <151> 2017-04-20 <160> 38 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 1 ugaccuuuug auggacaagg uaccgguugu gaacagugau gaaag 45 <210> 2 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 2 ugaccuuuug uuggacaagg uaccgguugu gaagagugau gaaag 45 <210> 3 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 3 ugaccuuaac auggacaagg uaccgguugu gaacagcucu gaaag 45 <210> 4 <211> 53 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 4 gauggacaag guaccgguug ugaagaguca ugaaagagaa uagaagaagu uac 53 <210> 5 <211> 68 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 cuacuggaaa acuaccuguu ccauagccaa cacuugucac uacuuucucu uaugguguuc 60 aaugcuuu 68 <210> 6 <211> 17 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> boxB RNA hairpin sequence <400> 6 ggcccugaaa aagggcc 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 agagggtgaa ggtgatgcaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 gggcatggca ctcttgaaaa 20 <210> 9 <211> 734 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> GFPstop57 <400> 9 gctagcatgg ccagcaaagg agaagaactt ttcactggag ttgtcccaat tcttgttgaa 60 ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgct 120 acatacggaa agcttaccct taaatttatt tgcactactg gaaaactacc tgttccatag 180 ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct tttcccgtta tccggatcat 240 atgaaacggc atgacttttt caagagtgcc atgcccgaag gttatgtaca ggaacgcact 300 atatctttca aagatgacgg gaactacaag acgcgtgctg aagtcaagtt tgaaggtgat 360 acccttgtta atcgtatcga gttaaaaggt attgatttta aagaagatgg aaacattctc 420 ggacacaaac tcgagtacaa ctataactca cacaatgtat acatcacggc agacaaacaa 480 aagaatggaa tcaaagctaa cttcaaaatt cgccacaaca ttgaagatgg atccgttcaa 540 ctagcagacc attatcaaca aaatactcca attggcgatg gccctgtcct tttaccagac 600 aaccattacc tgtcgacaca atctgccctt tcgaaagatc ccaacgaaaa gcgtgaccac 660 atggtccttc ttgagtttgt aactgctgct gggattacac atggcatgga tgagctctac 720 aaataagcgg ccgc 734 <210> 10 <211> 238 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> GFPstop57 <400> 10 Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 11 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exon 9 of the Idua gene <400> 11 atggagaaca actctaggca gaggtctcaa aggctggggc tgtgttggac agcaatcata 60 cagtgggt 68 <210> 12 <211> 68 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 12 auggagaaca acucuaggca gaggucucaa aggcuggggc uguguuggac agcaaucaua 60 cagugggu 68 <210> 13 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 13 ccucuuguug agacccgucu ccagaguuuc cgaccccgac acaaccuguc 50 <210> 14 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 14 uuguugagac ccgucuccag aguuuccgac cccgacacaa ccuguc 46 <210> 15 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 15 ccucuuguug agacccgucu ccagagauuc agaccccgac aaccccuguc 50 <210> 16 <211> 99 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide A <400> 16 aagaucucuu uugccaagaa guagcgccuu ucccuaugga guaccccagu cccuuccccc 60 ccucccuugg cucagucccu gaagguaagu cccccuuag 99 <210> 17 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Edited Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide A <400> 17 aagaucucuu uugccaagaa guggcgccuu ucccuaugga guaccccagu cccuuccccc 60 ccucccuugg cucagucccu gaagguaagu cccccuuag 99 <210> 18 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 18 guaggcaugg gaggaaaagg ugccacuucu uggcaaagga 40 <210> 19 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 19 gacugaggua cuccauaggg aaaggugcca cuucuuggca aagga 45 <210> 20 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 20 uccuuugcca agaaguggca ccuuuuccuc ccaugccuac uccuucc 47 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 gccttcgtgg agtttgaca 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 acacacggct ctgagaaggt 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 cgtggagttt gacaatgaag t 21 <210> 24 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 24 ccucuuguug agacccgucu ccagaguuuc cgaccccgac acaaccuguc 50 <210> 25 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 25 ccucuuguug agaccugucu ccagaguuuc cgaccccgac acaaccuguc 50 <210> 26 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 26 ccucuuguug agacccgucu ccagagauuc agaccucgac aacuccuguc guua 54 <210> 27 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 27 ccucuuguug agacccgucu ccagaguuuc cgaccucgac aca 43 <210> 28 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 28 acacagcucc agccuuugag accucugccc agaguuguuc ucc 43 <210> 29 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 29 acacagcucc agccuuugag accucugccc agaauuguuc ucc 43 <210> 30 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 30 acacaucucc agccuaugac accucugccc agaguuguuc ucc 43 <210> 31 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 31 acacaucucc agccuaugac accucugccc agaauuguuc ucc 43 <210> 32 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 32 gacugaggua cuccauaggg aaaggugcca cuucuuggca aagga 45 <210> 33 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 33 gacugaggua cuccuuagag aaaggugcca cuucuuggca aagga 45 <210> 34 <211> 53 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 34 cauugaggaa gguaagagaa agugcugaga gguguuggcc auggagcagg uag 53 <210> 35 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 35 aucauuggcu gacacuuucg aacacaugau agaagagcug uuggaugagg accagaaagu 60 ucggcccaau g 71 <210> 36 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 36 cugugaaagc uugugcauua ucuucucgac aaccuacucc uggucuuuca ag 52 <210> 37 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 37 cugugaaagc uuguncauua ucuucucgac aaccuacucc uggucuuuca ag 52 <210> 38 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 38 cugugaaagc uugugcauua ucuucucguc aaacuacucc uguaauuuca ag 52

Claims (19)

  1. 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA 내에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 있어서,
    a) AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA에 상보적이며, AON 표적 RNA와 하나 이상의 미스매치, 워블(wobble) 또는 벌지(bulge)를 포함하고;
    b) AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH 그룹을 지닌 리보스 또는 2'-H 그룹을 지닌 데옥시리보스를 포함하는 경우 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며;
    c) AON은 ADAR 효소를 바인딩 시킬 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않으며;
    d) AON은 5'- 말단 O6-벤질구아닌 변형을 포함하지 않으며;
    e) AON은 5'- 말단 아미노 변형을 포함하지 않으며; 및
    f) AON은 SNAP- 태그 도메인에 공유 결합되지 않음;
    을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  2. 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA 내에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 있어서,
    a) AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA에 상보적이며, AON은 표적 RNA와 하나 이상의 미스매치, 워블(wobble) 또는 벌지(bulge)를 포함하고;
    b) AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH 그룹을 지닌 리보스 또는 2'-H 그룹을 지닌 데옥시리보스를 포함하는 경우 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며;
    c) AON은 ADAR 효소를 바인딩 시킬 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않으며; 및
    d) AON은 17-머 또는 20-머가 아님;
    을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드
  3. 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA 내에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 있어서,
    a) AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA에 상보적이며, AON은 표적 RNA와 하나 이상의 미스매치, 워블(wobble) 또는 벌지(bulge)를 포함하고;
    b) AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH 그룹을 지닌 리보스 또는 2'-H 그룹을 지닌 데옥시리보스를 포함하는 경우 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며;
    c) AON은 ADAR 효소를 바인딩 시킬 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않으며; 및
    d) AON은 17-머 보다 길고 또는 14-머 보다 짧음;
    을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드
  4. 세포 내에 존재하는 ADAR 효소에 의해 표적 RNA 내에 존재하는 표적 아데노신의 탈아민화를 통해 세포 내에서 표적 RNA와 이중 가닥 복합체를 형성할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 있어서,
    a) AON은 표적 아데노신을 포함하는 표적 RNA 영역에 상보적이며;
    b) AON은 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드가 2'-OH 그룹을 지닌 리보스 또는 2'-H 그룹을 지닌 데옥시리보스를 포함하는 경우 하나 이상의 당 변형을 지닌 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며;
    c) AON은 ADAR 효소를 바인딩 시킬 수 있는 분자 내 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 부분을 포함하지 않으며; 및
    d) AON은 표적 RNA 영역에 상보적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 미스매치, 워블 또는 벌지 등을 포함함;
    을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드는 시티딘, 데옥시시티딘, 우리딘 또는 데옥시우리딘임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 아데노신에 대향하는 뉴클레오타이드로부터 5' 또는 3' 방향으로 직접 연결된 뉴클레오타이드는 2'-OH 그룹을 지닌 리보스 또는 2'-H 그룹을 지닌 데옥시리보스를 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제 6항에 있어서, 다른 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-알킬 그룹을 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제 8항에 있어서, AON의 5' 및 3' 말단부의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 말단부 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결되어 있음을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  10. 제 9항에 있어서, 5' 및 3' 말단부에서 말단부 5개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결되어 있음을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, AON은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오타이드보다 더 긴 길이를 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  12. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, AON은 100개의 뉴클레오타이드보다 더 짧음을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제 12항에 있어서, AON은 18 내지 70개의 뉴클레오타이드를 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  14. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 AON과 약제학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 낭포성 섬유증, 허러(Hurler) 증후군, 알파 -1- 항 트립신(A1AT) 결핍증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 백반증, 근위축성 경화증, 천식, 지중해 빈혈, 카다실 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 근위부 척수성 근위축증(DSMA), 뒤센/베커 근이영양증, 이영양성 수포성 표피박리증, 표피 박리증, 파브리 병, Factor V Leiden 관련 질환, 가족성 선종, 용종증, 갈락토스 혈증, 고쉐 병, 혈우병, 유전성 혈색소증, 헌터 증후군, 헌팅턴병, 염증성 장질환(IBD), 유전성 다응집 증후군, 레버 선천적 흑내장, 레쉬-니한 증후군, 린치 증후군, 마르팡 증후군, 뮤코다당증, 근이영양증, 근긴장성 이영양증 I형과 Ⅱ형, 신경 섬유종증, 니만-피크 병 A형, B형과 C형, NY-eso1 관련 암, 포이츠-제거스 증후군, 페닐케톤요증, 폼페 병, 원발성 섬모질환, 폐 고혈압, 망막 색소 변성증, 샌드호프 병, 중증 결합 면역 결핍 증후군(SCID), 겸상 적혈구 빈혈, 척추성 근위축증, 스타가르트 병,테이-삭스 질병, 어셔 증후군, X- 연결된 면역 결핍 및 암에서 선택된 1종 이상의 유전 질환의 치료 또는 예방용으로 사용함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 낭포성 섬유증, 허러(Hurler) 증후군, 알파 -1- 항 트립신(A1AT) 결핍증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 백반증, 근위축성 경화증, 천식, 지중해 빈혈, 카다실 증후군, 샤르코-마리-투스 병, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 근위부 척수성 근위축증(DSMA), 뒤센/베커 근이영양증, 이영양성 수포성 표피박리증, 표피 박리증, 파브리 병, Factor V Leiden 관련 질환, 가족성 선종, 용종증, 갈락토스 혈증, 고쉐 병, 혈우병, 유전성 혈색소증, 헌터 증후군, 헌팅턴병, 염증성 장질환(IBD), 유전성 다응집 증후군, 레버 선천적 흑내장, 레쉬-니한 증후군, 린치 증후군, 마르팡 증후군, 뮤코다당증, 근이영양증, 근긴장성 이영양증 I형과 Ⅱ형, 신경 섬유종증, 니만-피크 병 A형, B형과 C형, NY-eso1 관련 암, 포이츠-제거스 증후군, 페닐케톤요증, 폼페 병, 원발성 섬모질환, 폐 고혈압, 망막 색소 변성증, 샌드호프 병, 중증 결합 면역 결핍 증후군(SCID), 겸상 적혈구 빈혈, 척추성 근위축증, 스타가르트 병,테이-삭스 질병, 어셔 증후군, X- 연결된 면역 결핍 및 암에서 선택된 1종 이상의 유전 질환의 치료 또는 예방용으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  16. 삭제
  17. 세포 내에서 표적 RNA 서열 내에 존재하는 적어도 하나의 표적 아데노신의 탈아민화 방법에 있어서, 상기 방법은
    (ⅰ) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 따른 AON을 제공하는 단계;
    (ⅱ) AON의 세포에 의한 업테이크를 허용하는 단계;
    (ⅲ) AON을 표적 RNA 서열에 어닐링을 허용하는 단계;
    (ⅳ) 야생형 효소에서 발견되는 천연 dsRNA 결합 도메인을 포함하는 포유류 ADAR 효소가 표적 RNA 서열에서 표적 아데노신을 이노신으로 탈아민화시키는 것을 허용하는 단계; 및
    (ⅴ) RNA 서열 내에서 이노신의 존재를 확인하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 단계 (ⅴ)는
    a) 표적 RNA 서열을 분석하는 단계;
    b) 표적 아데노신이 UGA 또는 UAG 정지 코돈에 위치하고 탈아민화를 통해 UGG 코돈으로 편집될 때 기능적, 연장적으로 전체 길이 또는 야생형 단백질의 존재를 평가하는 단계;
    c) 표적 2개의 아데노신이 UAA 정지 코돈에 위치하고 모든 표적 아데노신이 탈아민화를 통해 UGG 코돈으로 편집될 때 기능적, 연장적으로 전체 길이 또는 야생형 단백질의 존재를 평가하는 단계;
    d) 프리- mRNA 의 스플라이싱이 탈아민화에 의해 변경되는지 여부를 평가하는 단계; 또는
    e) 탈아민화 후 표적 RNA가 기능적, 연장적으로 전체 길이 또는 야생형 단백질 암호화시키는 것을 기능적으로 판독하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 삭제
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