JP7074345B2 - 一本鎖ｒｎａ編集オリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＲＮＡ配列の変異を特異的に修正するために、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによってＲＮＡ配列を標的化することによる、ＲＮＡ編集の分野に関する。

ＲＮＡ編集は、真核生物細胞が、しばしば部位特異的かつ正確な方法で、それらのＲＮＡ分子の配列を変化させ、それによってゲノムにコードされたＲＮＡのレパートリーを数桁増加させる自然プロセスである。ＲＮＡ編集酵素は、動物および植物界全体にわたって真核生物種について記載されており、これらのプロセスは、最も単純な生活形態（例えば、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））からヒトまでの後生動物における細胞ホメオスタシスの管理において重要な役割を果たす。ＲＮＡ編集の例は、それぞれアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼと呼ばれる酵素を介して生じる、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換およびシチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への変換である。最も広く研究されているＲＮＡ編集システムは、アデノシンデアミナーゼ酵素である。

アデノシンデアミナーゼは、問題の酵素に依存して、２～３本の二本鎖ＲＮＡ認識ドメインおよび触媒ドメインを含むマルチドメインタンパク質である。認識ドメインは、特異的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列および／またはコンホメーションを認識するが、触媒ドメインは、核酸塩基の脱アミノ化によって、多かれ少なかれあらかじめ定義された標的ＲＮＡの近くの位置でアデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換する。イノシンは、細胞の翻訳機構によってグアニンとして読み取られ、編集されたアデノシンがｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのコード領域にある場合、タンパク質配列を再コードすることができることを意味する。

ＡからＩへの変換はまた、標的ｍＲＮＡの５’非コード配列において生じ、Ｎ末端に伸長したタンパク質を生じる元の開始部位の上流に新しい翻訳開始部位を生成するか、またはＲＮＡのプロセシングおよび／または安定性に影響を及ぼし得、３’ＵＴＲもしくは他の転写物の非コード部分に生じる。さらに、ＡからＩへの変換はプレｍＲＮＡのイントロンまたはエキソンにおけるスプライス要素内で起き、それによりスプライシングのパターンを変えることがある。その結果として、エキソンが含まれるか、またはスキップされ得る。アデノシンデアミナーゼは、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２およびｈＡＤＡＲ３を含むＲＮＡ（ＡＤＡＲ）に作用するアデノシンデアミナーゼと呼ばれる酵素ファミリーの一部である。

アデノシンデアミナーゼを適用する標的ＲＮＡを編集するためのオリゴヌクレオチドの使用が記載されている（例えば、Montiel-Gonzalez et al. PNAS 2013, 110(45):18285-18290; Vogel et al. 2014. Angewandte Chemie Int Ed 53:267-271; Woolf et al. 1995. PNAS 92:8298-8302）。Montiel-Gonzalezら（2013）は、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列を認識するバクテリオファージ・ラムダＮタンパク質に融合されたｈＡＤＡＲ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む、遺伝子操作された融合タンパク質を用いた標的ＲＮＡの編集を記載した。天然のＡＤＡＲの基質認識特性を除去するために、ラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインで置き換えて、ｈＡＤＡＲ２の天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを除いた。著者らは、Ｎドメイン－デアミナーゼ融合タンパク質による配列特異的認識のためのｂｏｘＢ部分に融合された、編集のための標的配列に相補的な「ガイドＲＮＡ」部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。このようにすることにより、ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドがアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質を標的部位に忠実に方向付けて、標的ＲＮＡのガイドＲＮＡにより方向付けられた部位特異的なＡからＩへの編集がもたらされることがうまく示された。これらのガイドＲＮＡは、Montiel-Gonzalezら（2013）に開示されているが、５０ヌクレオチドより長く、一般に治療用途には長すぎる（製造および細胞侵入の困難性において）。治療法におけるこの方法の欠点は、切断型天然ＡＤＡＲタンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインに遺伝的に融合したバクテリオファージ・ラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインからなる融合タンパク質の必要性でもある。これは、標的細胞が、大きな障害である融合タンパク質で形質導入されるか、または標的細胞が、発現のために操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸構築物でトランスフェクトされることを必要とする。後者の必要条件は、遺伝子疾患を修正するためのヒト疾患に対する治療のような、多細胞生物における編集が達成される場合には、ささやかな障害ではない。

Ｖｏｇｅｌら（２０１４）は、ベンジルグアニン置換ガイドＲＮＡおよび、ＳＮＡＰ－タグドメイン（操作されたＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ）に遺伝的に融合されたＡＤＡＲ１または２のアデノシンデアミナーゼドメイン（ｄｓＲＮＡ結合ドメインを欠く）を含む遺伝子操作された融合タンパク質を用いた、ｅＣＦＰおよび第Ｖ因子ライデンをコードするＲＮＡの編集を開示した。遺伝子操作された人工デアミナーゼ融合タンパク質は、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン修飾を介してガイドＲＮＡに共有結合したそのＳＮＡＰタグドメインを介して、培養中のＨｅＬａ細胞の標的ＲＮＡ中の所望の編集部位を標的とすることができるものの、このシステムは、まずＡＤＡＲに遺伝的な修飾を施すことなくシステムを適用し、続いて標的ＲＮＡを有する細胞をトランスフェクションまたは形質導入して、この遺伝子操作されたタンパク質を細胞に提供する方法が明確ではない点で、Montiel-Gonzalezら（2013）によって記載された遺伝子操作されたＡＤＡＲと同様の欠点を有する。明らかに、このシステムは、例えば治療の場において人間への使用には容易に適用できない。

Woolfら（1995）は、比較的長い一本鎖アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（長さ２５～５２ヌクレオチド）を使用したより単純な手法を開示しており、そこでは、標的ＲＮＡおよびそれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの二本鎖の性質のために、より長いオリゴヌクレオチド（３４ｍｅｒおよび５２ｍｅｒ）が内在性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができた。標的ＲＮＡ配列に１００％相補的であったWoolfら（1995）のオリゴヌクレオチドは、細胞抽出物またはマイクロインジェクションによる両生類（アフリカツメガエル）卵母細胞において機能するようにしか見えず、特異性の重大な欠如に悩まされた：アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であった標的ＲＮＡ鎖中のほぼ全てのアデノシンが編集された。各ヌクレオチドが２’Ｏ－メチル修飾を含む長さ３４ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが試験され、不活性であることがWoolfら（1995）において示された。ヌクレアーゼに対する安定性を提供するために、５個の５’および３’末端ヌクレオチドにおいて２’Ｏ－メチル修飾ホスホロチオエートヌクレオチドで修飾された３４－ｍｅｒ ＲＮＡもまた試験された。このオリゴヌクレオチドの中央非修飾領域は、末端修飾がエキソヌクレアーゼ分解に対する保護を提供しつつ、内在性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができることが示された。Woolfら（1995）は、標的ＲＮＡ配列中の特定の標的アデノシンの脱アミノ化を達成していない。前述したように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの未修飾ヌクレオチドに対向する（opposite）ほぼ全てのアデノシンが編集された（したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５個の５’および３’末端ヌクレオチドが修飾されている場合は、中央非修飾領域のヌクレオチドに対向するほぼ全てのアデノシン、またはヌクレオチドが修飾されていない場合は、標的ＲＮＡ鎖中のほぼ全てのアデノシン）。ＡＤＡＲは任意のｄｓＲＮＡに作用し得ることが知られている。「無作為編集」（promiscuous editing）と呼ばれることもあるプロセスを通じて、酵素はｄｓＲＮＡ中の複数のＡを編集する。したがって、そのような無作為編集を回避し、治療適用性のために標的ＲＮＡ配列中の特定のアデノシンのみを標的とする方法および手段が必要とされている。Vogelら（2014）は、オリゴヌクレオチド中の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを編集すべきではないアデノシンに対向する位置で使用し、非修飾ヌクレオチドを標的ＲＮＡ上の特異的に標的化されたアデノシンのすぐ反対側で使用することにより、そのようなオフターゲット編集（off-target editing）を抑制することができることを示した。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドとの共有結合を有する組換えＡＤＡＲ酵素を使用することなく、標的ヌクレオチドにおける特定の編集効果が、その物に起こることは示されていない。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系として知られているオリゴヌクレオチドを使用するさらに別の編集技術が存在することに留意されたい。しかしながら、この編集複合体はＤＮＡに作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素またはそれをコードする発現構築物とガイドオリゴヌクレオチドとの標的細胞への同時送達が必要であるため、上に記載の操作されたＡＤＡＲシステムと同じ欠点もある。

上記に鑑み、内在性細胞経路および天然に利用可能なＡＤＡＲ酵素を利用して、哺乳動物細胞の内在性核酸を、生物全体においてもなお、先行技術の方法に付随する問題を起こすことなく、特異的に編集できる新しい技術および化合物が依然として必要とされている。

本発明は、一実施形態では、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide；ＡＯＮ）を用いた、前記細胞内に存在する哺乳動物ＡＤＡＲ酵素による前記標的ＲＮＡ中の特定の標的アデノシンの脱アミノ化のための、ＲＮＡ編集への標的化手法を提供することによって、先行技術による方法の欠点を排除する；ここで前記ＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡに相補的であり、前記ＡＯＮは、任意選択で、前記標的ＲＮＡとの１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎ（wobble）および／またはバルジ（bulge）を含み；ここでＡＯＮは、糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；ここでＡＯＮは、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる（非相補的な）部分（標的に対して非相補的であり、それ自体に関して非相補的な）を含まず；
ここでＡＯＮは、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニンまたは５’末端アミノ修飾は含まず；ここでＡＯＮは、ＳＮＡＰタグドメインに共有結合していない。本発明のＡＯＮは、その基本構造において、一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドであることが好ましい。好ましい実施形態では、標的アデノシンに対向するヌクレオチドはシチジンまたはウリジンであり、より好ましくはシチジンである。さらに別の好ましい態様では、標的アデノシンに対向するヌクレオチドからすぐ（directly）５’および／または３’にあるヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含む。可能な限りエンドヌクレアーゼによる分解を防止するために、好ましくは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドおよび反対側のヌクレオチドに直接隣接するヌクレオチドの一方または両方の他に、前記ＡＯＮ中の他の全てのヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキル基、好ましくは２’－Ｏ－メチル基を含む。別の好ましい態様では、標的ＲＮＡ配列中のアデノシンに対向する各ヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースを含む、標的アデノシンに対向するヌクレオチドを除いて、２’－Ｏ－アルキル基、好ましくは２’－Ｏ－メチル基を含む。さらにまた好ましい実施形態では、ＡＯＮは、標的アデノシンに対向するシチジン（単一のミスマッチであり得る）の他に、標的配列との少なくとも１つのさらなるミスマッチまたはゆらぎ塩基対を含む。少なくとも１つの追加のミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対の存在は、ＲＮＡ編集効率を増加させる可能性があり、これはなぜなら、その標的分子とのＡＯＮのオン／オフ速度変化、および／またはＡＤＡＲ分子のｄｓＲＮＡへの結合および／または認識が増加するため、また標的配列にも依存すると考えられるためである。本明細書に概説されるように、ＡＯＮと標的配列との間のさらなるミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対の１つの特に好ましい位置は（標的位置の好ましいＣ－Ａに加えて）、標的配列内の標的アデノシンの４ヌクレオチド上流（５’方向）の位置である。標的配列に依存して、さらなるミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対ならびにさらなるバルジ（ヌクレオチドの非対合および小さな外側ループストレッチ）がＲＮＡ編集効率を増加し得ることもまた本明細書に開示される。したがって、標的アデノシンに対向するシチジン（または他にも、標的アデノシンに対向するウリジン、これはミスマッチではないが、特定の標的配列にっって好ましい場合がある）間の差異の他に、ＡＯＮと標的配列との間にさらなるバルジ、ミスマッチおよび／またはゆらぎを有することが、本発明の好ましい態様である。好ましい態様において、ＡＯＮが導入される細胞はヒト細胞である。さらに別の好ましい態様において、本発明のＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、好ましくは、ＡＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５または６末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結しており、さらにより好ましくは、５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが（この場合は４つの）ホスホロチオエート連結している。一実施形態では、本発明のＡＯＮは５’キャップを有さない。本発明の別の実施形態では、ＡＯＮは、１７ｍｅｒまたは２０ｍｅｒではない。本発明の別の実施形態では、標的ＲＮＡ配列に相補的であるＡＯＮの部分は、１７ヌクレオチドより長いか、または１４ヌクレオチドより短い。本発明はまた、本発明によるＡＯＮおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル（Cadasil）症候群、シャルコー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型（Duchenne/Becker）筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病（Gaucher's Disease）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス（Hereditary Hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病（Primary Ciliary Disease）、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、および癌からなる群から選択される遺伝的障害の治療または予防における使用のための本発明によるＡＯＮに関する。

本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する特定の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、前記方法は、本発明によるＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；前記ＡＯＮを細胞に取り込ませるステップ；前記ＡＯＮを標的ＲＮＡ配列にアニーリングさせるステップ；野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物ＡＤＡＲ酵素が、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ；およびＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップを含む方法に関する。

本発明の好ましい実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；または１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）、ＢＤＮＦ（例えば、ＲＮＡレベルでＶａｌ６６Ｍｅｔ変異を修復するため）をコードするか、または標的ＲＮＡはＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）。

ＧＦＰ－停止標的配列（下鎖）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（上鎖）の相補性を示す図である。パネルＡ～Ｄにおいて、標的ＲＮＡの配列の部分は、５’から３’（各パネルにおいて下鎖）で示され、標的アデノシン（Ａ）を太字で示している。上鎖のオリゴヌクレオチドの配列は、３’から５’で示され、ミスマッチ、ゆらぎ、および「バルジ」を下線で示している。化学的修飾は示されていない。全てのパネルの下鎖は同じであり（配列番号５）、ＧＦＰ標的配列の部分のみを反映している。標的配列中のＵＡＧは、終止コドン（５’～３’）であり、ＡがＩに編集されたとき（Ｇとして読み取られる）、Ｔｒｐコドンを表すＵＧＧに変換され、ＧＦＰタンパク質が機能的なタンパク質として完全翻訳されることを可能にする。Ａ．上鎖ＡＯＮ ＡＤＡＲ５６（配列番号１）；Ｂ．上鎖ＡＯＮ ＡＤＡＲ５７（配列番号２）；Ｃ．上鎖ＡＯＮ ＡＤＡＲ５８（配列番号３）；Ｄ．上鎖ＡＯＮ ＡＤＡＲ５９（配列番号４）。 配列解析によってアッセイされた編集効率を示す図である。クロマトグラム（Ａ～Ｊ）は、標的部位（中心Ａの上にハイライト表示されている）および隣接するヌクレオチドにおけるヌクレオチド頻度を示す。ピークのヌクレオチド同一性は、クロマトグラムの下の配列と同じ色で示され、ここでＧは黒で表される。パネル（Ａ）では、非処理細胞（non-treated；ＮＴ）の結果が示され、パネル（Ｂ）ではトランスフェクション試薬のみが使用された（ＣＴＲＬ）。パネル（Ｃ）～（Ｊ）で示すように、ＡＯＮ ＡＤＡＲ５６からＡＤＡＲ５９を５０ｎＭまたは１００ｎＭの濃度で使用した。中央のＡの上のＧシグナルが明らかに増加している（隣接Ｇシグナルにおいて「肩」として示されているが、対照では肩が観察されない）が、これは全ての４つの場合において、４つのＡＯＮのいずれを使用しても、ＲＮＡ編集がその位置で起きたことを示している。 ＧＦＰ標的配列上にＡＤＡＲ２ａでトランスフェクトした細胞からのＨｅＬａ細胞溶解物中でＡＤＡＲ５９－２およびＡＤＡＲ７２－１（ＡＤＡＲ５９－２と比較して、さらなるゆらぎ塩基対を含む）を使用した後の配列決定結果を示す図である。さらなるゆらぎは、ＲＮＡ編集効率を増加する。編集された標的の位置を矢印で示す。 α－Ｌ－イズロニダーゼアッセイで測定した酵素活性（全タンパク質濃度に対して正規化した相対蛍光単位として）を示す図である。示されるように、２つの重複測定からの平均活性および標準偏差が各ＡＯＮについて示される。ＮＴ：無処理。 標的配列の上流の位置４の標的配列とのミスマッチにおいてのみ互いに異なる２対のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した後の図４と同じ酵素アッセイを示す図である。オリゴヌクレオチドと標的配列の間でのこの特定のさらなるバルジの正の効果を示している。 内在性ＡＤＡＲ活性のその後の分析のための、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の発現を評価する、８つの異なるヒト癌細胞株のウエスタンブロット（レーン番号は下のパネルの表に従う）を示す図である。 ＳＮＵ－４７５肝臓癌細胞において４つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ５６－２、ＡＤＡＲ５７－２、ＡＤＡＲ５８－２およびＡＤＡＲ５９－２、ここではそれぞれ５６－２、５７－２、５８－２および５９－２と略記する）とインキュベートしたＧＦＰｓｔｏｐ５７標的プラスミド由来のＰＣＲ産物の配列決定結果を示す図である。ＡＤＡＲ５９－２＝ＡＤＡＲ５９。ＡＤＡＲ酵素を過剰発現させる必要なくＲＮＡ編集が起きている。「Ｆｗｄ」＝フォワード配列決定。「Ｒｅｖ」＝リバース配列決定。標的アデノシンのスポット（フォワード配列のグアノシンへのシフトおよびリバース配列のシチジンへのシフト）を矢印によって示す。 ＭＣＦ７乳癌細胞における４つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ５６－２、ＡＤＡＲ５７－２、ＡＤＡＲ５８－２およびＡＤＡＲ５９－２、ここではそれぞれ５６－２、５７－２、５８－２および５９－２と略記する）とインキュベートしたＧＦＰｓｔｏｐ５７標的プラスミド由来のＰＣＲ産物の配列決定結果を示す図である。ＡＤＡＲ酵素を過剰発現させる必要なくＲＮＡ編集が起きている。「Ｆｗｄ」＝フォワード配列決定。標的アデノシンのスポット（グアノシンへのシフト）を矢印によって示す。ＡＤＡＲ５６－２、ＡＤＡＲ５７－２およびＡＤＡＲ５８－２では有意なシフトは観察されなかったが、ＡＤＡＲ５９－２では非常に有意なＲＮＡ編集のシフトが観察された。 ＡＤＡＲ５７－２（図７、左下も参照）で処理した後の標的アデノシン（矢印）を囲む領域の配列データを示し、標的アデノシンの近くおよびＡＯＮの標的領域の他のアデノシンにおいて脱アミノ化は起きないことを示す図である。 （Ａ）は、ＧＦＰｓｔｏｐ５７挿入を担持する発現プラスミドの地図を示す図である。ＧＦＰの核酸配列および得られたアミノ酸配列は（Ｂ）に提供され、トリプレット５８でのＴＡＧ停止のために、構築物が５７アミノ酸のタンパク質をコードすることを示す。本明細書に開示されるように、このＴＡＧ中のアデノシンは、イノシン（グアノシンとして読み取られる）に編集され、結果としてＴＧＧコドンを生じる。 （Ａ）は、ＧＦＰｓｔｏｐ５７挿入を担持する発現プラスミドの地図を示す図である。ＧＦＰの核酸配列および得られたアミノ酸配列は（Ｂ）に提供され、トリプレット５８でのＴＡＧ停止のために、構築物が５７アミノ酸のタンパク質をコードすることを示す。本明細書に開示されるように、このＴＡＧ中のアデノシンは、イノシン（グアノシンとして読み取られる）に編集され、結果としてＴＧＧコドンを生じる。 （Ａ）は、小核リボ核タンパク質ポリペプチドＡ（ＳＮＲＰＡ）遺伝子（配列番号１６）のＲＮＡ配列の５’末端部分を示す図である。上鎖において、コード配列は、ＵＡＧ終止コドン（太字）まで下線が引かれている。終止コドン内のＡのＩへのＲＮＡ編集（Ｇとして読まれる）はトリプトファン（Ｗ）をコードするＵＧＧを生じる；編集された配列もまた提供される（配列番号１７）。このリードスルーは理論的には、その後の終止コドン（また太字でも示される）まで翻訳されるとより２５アミノ酸長いタンパク質を生じる。（Ｂ）は、（Ａ）で与えられたＳＮＲＰＡの同じ５’末端部分を示す図である。コード配列の下に、ＡＤＡＲ８７－１、ＡＤＡＲ８９－１、ＡＤＡＲ８９－２およびＡＤＡＲ９４－１のＡＯＮ配列が与えられる。バルジ、ゆらぎおよびミスマッチには下線が引かれている。標的とされるアデノシンに対向するシチジンは、より大きなフォントで与えられる。ＡＤＡＲ８９－２およびＡＤＡＲ９４－１の中央トリプレット５’－ＣＣＡ－３’の３つのヌクレオシドはＤＮＡであるが、これらのオリゴヌクレオチドの他の全てのヌクレオシドはＲＮＡである。 ＡＯＮを用いたマウスＨｅｐａ １－６細胞における内在性ＳＮＲＰＡ ＲＮＡに対するＲＮＡ編集の結果を示す図である。パネル（Ａ）は非トランスフェクト（non-transfected；ＮＴ）対照を示す。パネル（Ｂ）は、ＡＤＡＲ２の短いアイソフォームをコードするプラスミドのみがトランスフェクトされた対照を示す。パネル（Ｃ）は、ＡＤＡＲ２過剰発現プラスミドでトランスフェクトされなかった細胞において、ＡＤＡＲ８９－１ ＡＯＮによるトランスフェクション後に所望の位置で（ＡからＩへの）ＲＮＡ編集が行われたことを示す矢印によって示されるＧピークの上昇を示す。パネル（Ｄ）は、ＡＤＡＲｓｈ発現プラスミドおよびＡＯＮの両方を用いた陽性対照を示す。 マウスＨｅｐａ １－６細胞におけるＡＤＡＲ８９－２およびＡＤＡＲ９４－１ ＡＯＮの導入後の配列決定結果を示し、標的化アデノシンに対向する中央トリプレットにＤＮＡヌクレオシドを有するＡＯＮでＲＮＡ編集が達成され得ることを示し、さらなるミスマッチが導入された場合、そのようなＲＮＡ編集はさらに増加し得ることを示す図である。

発明の詳細な説明
国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットは、ＲＮＡの標的化編集のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を開示し、ここでＡＯＮは標的ＲＮＡ配列に相補的な配列によって特徴付けられ（その中の「標的化部分」と呼ぶ）、好ましくは標的ＲＮＡに非相補的であるステム－ループ構造（その中の「リクルートメント（recruitment）部分」と呼ぶ）の存在によって特徴付けられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、「自己ループ化ＡＯＮ」と呼ばれる。リクルートメント部分は、標的配列と標的部分とのハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡに細胞中に存在する天然のＡＤＡＲ酵素をリクルートする際に働く。リクルートメント部分のおかげで、コンジュゲートされた主体または修飾された組換えＡＤＡＲ酵素の存在は必要ない。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットは、リクルートメント部分が、ＡＤＡＲ酵素のｄｓＲＮＡ結合領域によって認識されることが知られている天然基質（例えば、ＧｌｕＢ受容体）またはＺ－ＤＮＡ構造のいずれかを模倣するステム－ループ構造であると説明している。ステムループ構造は、単一の核酸鎖内に形成された２つの別個の核酸鎖または分子内ステムループ構造によって形成される分子間ステムループ構造であり得る。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されているリクルートメント部分のステムループ構造は、分子内ステムループ構造であり、ＡＯＮそれ自体内で形成され、ＡＤＡＲを誘引することができる。

本発明のＡＯＮは、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されているリクルートメント部分を含まない。本発明のＡＯＮは、分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まない。本発明のＡＯＮはより短く、生成するのがより安く、使用が容易で製造が容易である。さらに、ＡＤＡＲ酵素を細胞内の正常な機能から潜在的に隔離するという欠点を有していない。予期しないことに、本発明の発明者らは、ＡＯＮが相補的であるが重要なことに、上記のようなリクルートメント部分を欠いている標的ＲＮＡ配列中に存在する標的アデノシンを脱アミノ化するための標的ＲＮＡに相補的であるＡＯＮは、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素をなお利用して標的アデノシンを編集することができるようであることを見出した。好ましい態様において、本発明のＡＯＮは、標的アデノシンの位置にミスマッチを含み、ＡＯＮ中の対向するヌクレオチドはシチジンである。また、ウリジンが標的アデノシンに対向する場合（実際にはミスマッチではないが）、ＡＯＮは標的アデノシンの脱アミノ化を引き起こすことができる。本発明の発明者らは、さらなるミスマッチ、ゆらぎおよび／または外側ループバルジ（ワトソン－クリック塩基対形成規則に従って標的ＲＮＡと完全な塩基対を形成しないアンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドによって引き起こされる）は許容可能であり、ある場合には好ましいが、標的ＲＮＡ配列の特定の標的化された編集のためには数が増加することは必ずしも必須ではないことを見出した。本発明のＡＯＮ（そのＲＮＡ標的配列にハイブリダイズする場合）のミスマッチ、ゆらぎまたはバルジの数は、ＡＯＮの長さに依存して、ゼロであってもよく（標的アデノシンに対向するヌクレオシドがウリジンであり、残りのＡＯＮもまた標的配列に１００％相補的である場合）、１であってもよく（シトシンが反対側のヌクレオシドである場合、これは標的アデノシン位置に形成された１つのミスマッチであってもよい、もしくはＡＯＮの他のいくつかの位置である）またはそれ以上であってもよい（標的アデノシンで（ミス）マッチを含むかまたは含まない）。さらなるミスマッチ、ゆらぎまたはバルジは、標的アデノシンの上流および下流にあり得る。特定の好ましい実施形態では、ミスマッチまたはゆらぎは、標的アデノシンから４ヌクレオチド上流（５’末端に向かって）の位置に存在し、それは、標的アデノシンとウリジンが対になったときに唯一のミスマッチまたはゆらぎであってもよく、標的アデノシンに対向するヌクレオシドがシチジンである場合、さらなるミスマッチまたはゆらぎであってもよい。バルジまたはミスマッチは、単一の位置であってもよく（１つのミスマッチ、ゆらぎまたはバルジ塩基対によって引き起こされる）、完全に相補的でない一連のヌクレオチドであってもよい（複数の連続するミスマッチまたはゆらぎ塩基対またはバルジ、好ましくは２つまたは３つの連続するミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対および／またはバルジによって引き起こされる）。

いずれにしても、本発明によるＡＯＮは、本発明のＡＯＮを（かなり）短くすることを可能にするヘアピンまたはステムループ構造を必要としないという点で、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されているオリゴヌクレオチドを超える特定の利点を有する。さらに、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載のオリゴヌクレオチドは、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素を隔離する潜在的な危険性を有する。この文脈で隔離するということは、天然ＡＤＡＲタンパク質が、オリゴヌクレオチドの標的化部分と標的ＲＮＡとの間にｄｓＲＮＡ複合体が形成されていなくても、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載のオリゴヌクレオチドに結合し得ることを意味する。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されたオリゴヌクレオチドへのＡＤＡＲのこの（分子内ステム－ループ構造の存在による）直接的な結合は、標的ＲＮＡ配列の非存在下で、分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まない本発明のＡＯＮを用いる場合には起こらない。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されているオリゴヌクレオチドは特定の用途を有するが、多くの場合はヘアピンおよび／または（ステム）ループ構造の存在が好ましくは回避される。

したがって、本発明は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のために、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関し、前記ＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯＮは、任意選択で、相補的標的ＲＮＡ領域との１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含み；前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；前記ＡＯＮは、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン修飾を含まず；前記ＡＯＮは、５’末端アミノ修飾を含まず；前記ＡＯＮは、ＳＮＡＰタグドメインに共有結合していない。

好ましい態様では、標的アデノシンに対向するＡＯＮ中のヌクレオチドはＲＮＡではなくＤＮＡであり、さらにより好ましい態様では、標的アデノシンに対向するヌクレオチドならびに標的アデノシンに対向するヌクレオチドの５’側および／または３’側のヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドであるが、ＡＯＮ中の（ＤＮＡではない）ヌクレオチドの残りは、好ましくは２’－Ｏ－アルキル修飾リボヌクレオチドである。２つのヌクレオチドがＤＮＡである場合、他の全てはＲＮＡであってよく、および２’－Ｏメチル修飾されていてもよいが、特定の態様において、標的アデノシンに対向するヌクレオチドが２’－Ｏメチル修飾されていない限りにおいて、標的アデノシンに対向するトリプレットの３番目のヌクレオチドはＲＮＡであって、非修飾であってよい。１つの特定の態様において、本発明は、細胞内に存在する酵素（おそらくＡＤＡＲ酵素）による標的ＲＮＡ内に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮに関し、ここでＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に（部分的に）相補的であり、ここで標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、ここで標的アデノシンに対向するヌクレオチドの５’および／または３’のヌクレオチドはまた、２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、ＡＯＮの残りはリボヌクレオシド、好ましくは全て２’－Ｏメチル修飾を含む。

別の態様では、本発明は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ内に存在する標的アデノシンを脱アミノ化するための、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮに関し、ここで前記ＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、および前記ＡＯＮは、任意選択で、相補的標的ＲＮＡ領域との１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含み；前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；前記ＡＯＮは１７－ｍｅｒでも２０－ｍｅｒでもない。

別の態様では、本発明は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ内に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のために、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮに関し、ここで前記ＡＯＮは標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に対して相補的であり、および前記ＡＯＮは、任意選択で、相補的標的ＲＮＡ領域との１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含み；前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；前記ＡＯＮは１７ヌクレオチドより長いか、または１４ヌクレオチドより短い。

さらに別の態様では、本発明は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素によって標的ＲＮＡ内に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のために、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮに関し、前記ＡＯＮは標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり；前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；前記ＡＯＮは、任意選択で、相補的な標的ＲＮＡ領域との１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含む。好ましくは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、シチジン、デオキシシチジン、ウリジン、またはデオキシウリジンである。標的アデノシンに対向するヌクレオチドがシチジンまたはデオキシシチジンである場合、ＡＯＮは標的ＲＮＡとの少なくとも１つのミスマッチを含む。標的アデノシンに対向するヌクレオチドがウリジンまたはデオキシウリジンである場合、ＡＯＮは１００％相補的であってもよく、標的ＲＮＡに関してミスマッチ、ゆらぎまたはバルジを全く有さなくてもよい。しかしながら、好ましい態様において、標的アデノシンに対向するヌクレオチドがシチジン、デオキシシチジン、ウリジン、またはデキソユリジンであるか否かにかかわらず、ＡＯＮと標的ＲＮＡとの間に１つまたは複数のさらなるミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジが存在する。別の好ましい実施形態において、標的アデノシンに対向するヌクレオチドからする５’および／または３’にあるヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボース、またはこれら２つの混合物を含む（トリプレットは、その時、ＤＮＡ－ＤＮＡ－ＤＮＡ；ＤＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ；ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＤＮＡ；ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ；またはＲＮＡ－ＲＮＡ－ＲＮＡからなり；好ましくは、中央のヌクレオシドが２’－Ｏメチル修飾を持たない（ＲＮＡの場合）およびいずれかまたは両方の周囲のヌクレオシドもまた２’－Ｏメチル修飾を持たない）。その時、ＡＯＮ中の他の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル基、好ましくは２’－Ｏ－メチル基、または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）基または本明細書に開示されるような任意の修飾を有することが好ましい。本発明のＡＯＮは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を好ましくは含む。さらに好ましい態様では、ＡＯＮの５’末端および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結で結合している。より好ましくは、５’末端および３’末端の５個の末端ヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結で結合している。本発明の特定の一実施形態では、ＡＯＮは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長い。好ましくは、ＡＯＮは１００ヌクレオチドより短く、より好ましくは６０ヌクレオチドより短く、そしてさらにより好ましくは、ＡＯＮは１８から７０ヌクレオチド、１８から６０ヌクレオチド、または１８から５０ヌクレオチドを含む。本発明はまた、本発明によるＡＯＮと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、遺伝的障害の治療または予防における使用のための本発明によるＡＯＮであって、遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル（Cadasil）症候群、シャルコー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型（Duchenne/Becker）筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病（Gaucher's Disease）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス（Hereditary Hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病（Primary Ciliary Disease）、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、および癌からなる群から選択される、ＡＯＮに関する。別の態様では、本発明は、遺伝的障害の治療または予防のための薬剤の製造における本発明によるＡＯＮの使用であって、遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、および癌からなる群から選択される、ＡＯＮの使用に関する。本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、細胞内の標的ＲＮＡ中に存在する少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法に関し、本方法は、本発明によるＡＯＮを細胞に提供するステップ；前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡにアニーリングさせるステップ；野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含むＡＤＡＲ酵素により、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ；および任意選択で、前記標的ＲＮＡ中の前記イノシンの存在を同定するステップを含み、好ましくはここで最後のステップは、前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ；脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または機能的読み出しを使用するステップを含み、前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする。別の実施形態では、本発明は、前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；もしくは１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）、ＢＤＮＦ（例えば、ＲＮＡレベルでＶａｌ６６Ｍｅｔ変異を修復するため）をコードするか、または前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）、本発明によるＡＯＮまたは方法に関する。

ＡＯＮが１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含むことは本発明の重要な態様である。それによって、ＡＯＮの単一ヌクレオチドは、１つまたは複数の糖修飾を有することができる。ＡＯＮ内では、１つまたは複数のヌクレオチドがそのような糖修飾を有することができる。

編集が必要なヌクレオチドに対向する本発明のＡＯＮ内のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾（本明細書ではしばしば２’－ＯＭｅ基、または２’－Ｏ－メチル化と呼ばれる）を含まず、好ましくは２’－ＯＨ基を含むか、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボースであることもまた本発明の重要な態様である。このヌクレオチドのすぐ３’および／または５’にあるヌクレオチド（「隣接ヌクレオチド」）もまたそのような化学修飾を欠いていることが好ましいが、これらの隣接ヌクレオチドのうちの１つが２’－Ｏ－アルキル基（２’－Ｏ－メチル基のような）を含んでもよいが、好ましくは両方を含まないことが許容されると考えられる。どちらか一方、または両方の隣接ヌクレオチドは、２’－ＯＨまたは（本明細書で定義されているような）互換性のある置換基であり得る。

本発明のＡＯＮの別の重要な態様は、それがＡＯＮ自体を、潜在的にＡＤＡＲを隔離する構造として作用し得る分子内ヘアピンまたは他のタイプの（ステム－）ループ構造（本明細書においては「自動ルーピング」または「自己ルーピング」とも呼ぶ）に折りたたむことを可能にする、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡまたはＲＮＡ領域に相補的な部分を有さないことである。一態様では、本発明の一本鎖ＡＯＮは標的ＲＮＡと完全に相補的であるが、標的アデノシンの位置である少なくとも１つの位置で完全に対合していないことが好ましく、その時、そに対向するヌクレオシドがシチジンであることが好ましい。本発明の一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドはまた、標的アデノシン位置以外の位置に、標的配列との１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎまたはバルジ（反対側のヌクレオシドではない）を有してもよい。本発明のＡＯＮの標的配列とのこれらのゆらぎ、ミスマッチおよび／またはバルジは、標的ＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げないが、標的アデノシンの位置において、細胞内に存在するＡＤＡＲによるＲＮＡ編集効率を増加する。当業者は、生理学的条件下でのハイブリダイゼーションがなお起こるか否かを決定することができる。本発明の好ましい一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、Vogelら（2014）とは対照的に、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニンまたは５’末端アミノ修飾を含まず、ＳＮＡＰタグドメイン（操作されたＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ）に共有結合していない。ＳＮＡＰタグドメインは、ヒトＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に由来し、Ｏ６－ベンジルグアニン誘導体を用いて生細胞中で共有結合的に標識することができる。Vogelら（2014）は、全長２０または１７ヌクレオチドのガイドＲＮＡを開示しており、５’末端の最初の３ヌクレオチドは標的ＲＮＡ配列に結合しないが、ガイドＲＮＡをＳＮＡＰタグドメインに結合している。標的ＲＮＡ配列に結合するガイドＲＮＡの部分は、したがって１４または１７ヌクレオチドの長さである。５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン修飾の代わりに５’末端アミノ修飾を有する、同じ長さのガイドＲＮＡもまたVogelら（2014）に開示されているが、しかしながら、非常にわずか、または全く脱アミノ化または標的ＲＮＡ配列が検出されなかった。一実施形態では、本発明のＡＯＮは、標的ＲＮＡ配列との４つ未満のミスマッチおよび／またはゆらぎを含む。同様に、Montiel-Gonzalezら（2013）とは対照的に、本発明の好ましいＡＯＮは、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列を含まない。Montiel-Gonzalezら（2013）で使用されているｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列は、バクテリオファージ・ラムダＮ－タンパク質によって認識される、１７ヌクレオチドの短い一続き（配列ＧＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＣを有する、配列番号６）のＲＮＡである。バクテリオファージの初期オペロンにおける下流遺伝子の転写は、ｎｕｔとして知られるプロモーター近位エレメントを必要とする。この部位はＲＮＡの形でシスに作用して、バクテリオファージ・ラムダＮタンパク質および宿主因子からなる転写抗終結複合体を組み立てる。ｎｕｔ部位ＲＮＡは、ｂｏｘＢと呼ばれる小さなステムループ構造を含む。ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列は、ヘアピン（ステム－ループ）構造を形成する可能性を有する中断パリンドロームとして当該技術分野において知られている。その配列は、異なるゲノム特異的Ｎホモログをコードするバクテリオファージ・ラムダの類縁体間で異なる。Vogelら（2014）もMontiel-Gonzalezら（2013）も細胞内に存在する哺乳動物ＡＤＡＲ酵素を使用していないが、そのＡＤＡＲ酵素は野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む。Vogelら（2014）は、ＳＮＡＰタグドメインに融合したＡＤＡＲ１または２のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作融合タンパク質を使用し、Montiel-Gonzalezらは、バクテリオファージ・ラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインに融合した、ｈＡＤＡＲ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作融合タンパク質を使用している。先行技術とは対照的に、本発明のＡＯＮは、野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む、細胞内に存在する哺乳動物ＡＤＡＲ酵素を使用している。したがって、ＡＤＡＲのリクルートメントを可能にするために、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン、５’末端アミノ修飾、またはＳＮＡＰタグドメインを本発明のＡＯＮに組み込む必要はない。したがって、本発明によるＡＯＮは、Vogelら（2014）およびMontiel-Gonzalezら（2013）に記載のオリゴヌクレオチドに対して特定の長所を有する。本発明によるＡＯＮは、標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンを特異的に編集するために、内在性細胞経路と天然に入手可能なＡＤＡＲ酵素を利用することができる。一実施形態では、本発明のＡＯＮは、ヒトＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼに共有結合していない。好ましくは、本発明のＡＯＮはポリペプチドに共有結合していない。本発明のＡＯＮの別の態様では、ＡＯＮは５’キャップを持たない。真核生物において、５’キャップは、５’から５’三リン酸連結を介してＲＮＡに接続したグアニンヌクレオチドからなる。このグアノシンは７位がメチル化されており、７－メチルグアノシンと呼ばれる。本明細書に開示されるように、本発明の一本鎖ＲＮＡ編集誘導オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列中の特定の標的アデノシンヌクレオチドの脱アミノ化が可能である。理想的には、一つのアデノシンのみが脱アミノ化される。あるいは、１、２、または３個のアデノシンヌクレオチドが脱アミノ化されるが、好ましくは１個だけである。本発明のＡＯＮの特徴を踏まえると、修飾された組換えＡＤＡＲ発現の存在は不要であり、ＡＯＮに結合したコンジュゲート主体、または標的ＲＮＡ配列に相補的ではない長いリクルートメント部分の存在は不要である。それに加えて、本発明のＡＯＮは、野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む天然のＡＤＡＲ酵素による、標的ＲＮＡ配列に存在する標的アデノシンのイノシンへの特異的脱アミノ化を、ＲＮＡ／ＡＯＮ複合体における他の場所での無作為編集の危険無く、可能にする。

標的部位へのシチジンデアミナーゼのリクルートメントは、アデノシンデアミナーゼｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２の場合と同じように機能する。しかしながら、シチジンデアミナーゼは異なる結合要件を有し、シチジンの編集を決定するそれらの標的ＲＮＡ配列中の異なる構造を認識する。１つの特によく研究されているシチジンデアミナーゼはヒトＡｐｏｂｅｃ１である。オリゴヌクレオチド構築物を用いて編集部位を標的とし、常在性の天然に存在する編集主体をリクルートするためのＲＮＡ編集の一般原則は、シチジンデアミナーゼについて同じであり、本明細書に開示および請求される発明の一部である。

ＡＤＡＲ酵素の天然標的の解析により、これらが一般に、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２によって編集されたＲＮＡらせんを形成する２本の鎖間にミスマッチを含むことが示された。これらのミスマッチは編集反応の特異性を高めることが示唆されている（Stefl et al. 2006. Structure 14(2):345-355; Tian et al. 2011. Nucleic Acids Res 39(13):5669-5681）。ＡＯＮと標的ＲＮＡとの間の対合／ミスマッチヌクレオチドの最適パターンの特徴付けもまた、効率的なＡＤＡＲベースのＡＯＮ療法の開発にとって極めて重要であると思われる。本発明のＡＯＮの改善された特徴は、安定性ならびに適切なＡＤＡＲ結合および活性を確証するために所定の箇所で特定のヌクレオチド修飾を使用することである。これらの変化は変動してもよく、そしてＡＯＮの骨格、ヌクレオチドの糖部分、ならびに核酸塩基における修飾を含んでもよい。それらはまた、標的および二次構造に依存して、ＡＯＮの配列全体にわたって様々に分布し得る。ＡＤＡＲ酵素のＲＮＡ結合ドメイン内、ならびにデアミナーゼドメイン内の異なるアミノ酸残基の相互作用を支援するために、特定の化学修飾が必要となり得る。例えば、ヌクレオチド間のホスホロチオエート連結、および／または２’－Ｏ－メチル修飾は、ＡＯＮのいくつかの部分では許容され得るが、他の部分では、リン酸および／または２’－ＯＨ基と酵素との重要な相互作用を乱さないように避けるべきである。これらの設計規則の一部は、公開されているＡＤＡＲ２の構造に基づいているが、その他は経験的に定義される必要がある。ＡＤＡＲ１とＡＤＡＲ２とは異なる嗜好性が存在するかもしれない。修飾はまた、それらがＡＯＮの分解を防ぐように選択されるべきである。標的配列がＡＤＡＲ編集に最適ではない場合には、基質ＲＮＡに対する編集活性を高めるために特定のヌクレオチド修飾もまた必要であり得る。特定の配列コンテキストが編集により適していることが以前の研究により確証されている。例えば、標的配列５’－ＵＡＧ－３’（中央に標的Ａを有する）はＡＤＡＲ２にとって最も好ましい最近傍ヌクレオチドを含むが、一方、５’－ＣＡＡ－３’標的配列は好まれない（Schneider et al. 2014. Nucleic Acids Res 42(10):e87）。標的トリヌクレオチドに対向するヌクレオチドを慎重に選択することによって編集が高まる可能性が、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの最近の構造解析により示唆された。例えば、（真ん中に形成されたＡ－Ｃミスマッチを有する）反対鎖上の３’－ＧＣＵ－５’配列と対になった５’－ＣＡＡ－３’標的配列は、グアノシン塩基がＡＤＡＲ２のアミノ酸側鎖と立体的に衝突するため好ましくない。しかしながら、ここでは、イノシンのようなより小さな核酸塩基が、対抗するシチジンに対する塩基対合能力を依然として保持しながら、立体衝突を引き起こすことなく潜在的にこの位置によりよく適合することができると仮定される。最適以下の配列の活性を高めることができる修飾には、ＡＯＮの柔軟性を増大させるか、または逆にそれを編集に有利な立体配座に強制する骨格修飾の使用を含む。

本明細書で使用される用語の定義
本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」（イノシン中の核酸塩基）という用語は、そのような核酸塩基を指す。

「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。

「ヌクレオシド」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。

「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基－（デオキシ）リボシル－ホスホリンカー、ならびにそのリボース部分またはホスホ基の任意の化学修飾を指す。したがって、この用語は、固定化リボシル部分（メチレン基または任意の他の基を含む２’－４’架橋を含む、当技術分野で周知である）を含むヌクレオチド、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデートリンカーなどを含むリンカーを含むヌクレオチドを含む。

アデノシンとアデニン、グアノシンとグアニン、シトシンとシチジン、ウラシルとウリジン、チミンとチミジン、イノシンとヒポキサンチンという用語は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指すために互換的に使用されることがある。

文脈が異なることが明らかに必要でない限り、核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は互換的に使用されることがある。「リボヌクレオシド」および「デオキシリボヌクレオシド」、または「リボース」および「デオキシリボース」という用語は当該技術分野で使用されている通りである。

「オリゴヌクレオチド」に言及するときはいつでも、文脈がそうでないことを指示しない限り、オリゴリボヌクレオチドおよびデオキシオリゴリボヌクレオチドの両方が意味される。「オリゴリボヌクレオチド」に言及するときはいつでも、それは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＩを含み得る。「デオキシオリゴリボヌクレオチド」に言及するときはいつでも、それは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＩを含み得る。好ましい態様では、本発明のＡＯＮは化学修飾を含み得るオリゴリボヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチド構築物中にシトシンのようなヌクレオチドに言及するときはいつでも、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンおよびβ－Ｄ－グルコシル－５－ヒドロキシ－メチルシトシンが含まれ；アデニンに言及するときは、Ｎ６－メチルアデニンおよび７－メチルアデニンが含まれ；ウラシルに言及するときは、ジヒドロウラシル、４－チオウラシルおよび５－ヒドロキシメチルウラシルが含まれ；グアニンに言及するときは、１－メチルグアニンが含まれる。

ヌクレオシドまたはヌクレオチドに言及するときはいつでも、例えば２’－デスオキシ、２’－ヒドロキシ、および２’－Ｏ－メチルのような２’－Ｏ－置換変異体などのリボフラノース誘導体、ならびに２’－４’架橋変異体を含む他の修飾が含まれる。

オリゴヌクレオチドについて言及するときはいつでも、２つのモノヌクレオチド間の連結はホスホジエステル連結ならびに、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデートリンカーなどを含むその修飾であってもよい。

「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」および「からなる（consisting）」を包含する。例えば、「Ｘを含む」組成物は、Ｘのみからなってもよく、または例えばＸ＋Ｙのようにさらなる何かを含んでもよい。

数値ｘに関して「約」という用語は任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

「実質的に」という語は、「完全に」を除外するものではない。例えば、「Ｙを実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。関連する場合には、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略されることがある。

本明細書で使用される「相補的」という用語は、生理学的条件下でＡＯＮが標的配列にハイブリダイズするという事実を指す。この用語は、ＡＯＮ中の各々のおよび全てのヌクレオチドが標的配列中のその対向するヌクレオチドと完全な対合を有することを意味しない。言い換えれば、ＡＯＮは標的配列に相補的であり得るが、ＡＯＮと標的配列との間にはミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジがあってもよく、その一方でそのＡＯＮは生理学的条件下で依然として標的配列にハイブリダイズし、細胞内のＲＮＡ編集酵素は標的アデノシンを編集することができる。したがって、「実質的に相補的」という用語はまた、ミスマッチ、ゆらぎ、および／またはバルジの存在にもかかわらず、ＡＯＮと標的配列との間が十分にマッチするヌクレオチドをＡＯＮが有し、生理学的条件下でＡＯＮが標的ＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。本明細書に示されるように、ＡＯＮは相補的であり得るが、生理学的条件下でＡＯＮがその標的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列との１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジも含み得る。

核酸配列に関して「下流」という用語は、さらに３’方向に配列に沿うことを意味し；「上流」という用語はその逆を意味する。したがって、ポリペプチドをコードする任意の配列において、開始コドンはセンス鎖において終止コドンの上流にあるが、アンチセンス鎖において終止コドンの下流にある。

「ハイブリダイゼーション」への言及は典型的には特異的ハイブリダイゼーションを指し、非特異的ハイブリダイゼーションを除外する。プローブと標的との間の安定な相互作用の大部分が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性をプローブと標的とが有する場合であることが確実であるように、当技術分野において周知の技術を用いて、選択した実験条件下で特異的ハイブリダイゼーションを起こすことができる。

「ミスマッチ」という用語は、ワトソン－クリック型塩基対合則に従って完全な塩基対を形成しない、二本鎖ＲＮＡ複合体中の対向するヌクレオチドを指すために本明細書中で使用される。ミスマッチヌクレオチドは、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ対である。いくつかの実施形態では、本発明のＡＯＮは、４個未満のミスマッチ、例えば、０、１または２個のミスマッチを含む。ゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｕ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ａ、およびＩ－Ｃ塩基対である。

本発明によるＡＯＮは、例えば、すべてのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化糖部分（２’－ＯＭｅ）を提供することによって、ほぼ完全に化学修飾されていてもよい。しかしながら、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾を含まず、そしてなおさらなる好ましい態様において、標的アデノシンに対向する各ヌクレオチドの側方の２つの隣接するヌクレオチドの少なくとも一方、さらに好ましい態様において両方は、２’－ＯＭｅ修飾をさらに含まない。ＡＯＮ内の全てのヌクレオチドが２’－ＯＭｅ修飾を保持する完全修飾は、おそらくそれが標的位置でのＡＤＡＲ活性を妨げるため、ＲＮＡ編集に関する限り非機能的オリゴヌクレオチドをもたらす。一般に、標的ＲＮＡ中のアデノシンは、反対側のヌクレオチドに２’－ＯＭｅ基を提供することによって編集から保護することができ、または対向する塩基としてグアニンもしくはアデニンを提供することによってもまた、これら２つの核酸塩基は対向するアデノシンの編集を減少させることができる。

本発明に従って容易に使用することができるオリゴヌクレオチドの分野において様々な化学的性質および修飾が知られている。ヌクレオチド間の通常のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合のモノチオール化またはジチオール化によって、それぞれホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオエートエステルを生じることによって改変され得る。アミド化およびペプチドリンカーを含む、ヌクレオシド間連結の他の修飾が可能である。好ましい態様において、本発明のＡＯＮは、ＡＯＮの最末端のヌクレオチド間（したがって、好ましくは５’および３’末端の両方）に１、２、３、４またはそれ以上のホスホロチオエート連結を有し、４つのホスホロチオエート連結の場合、最終的に５つのヌクレオチドがそれに応じて結合されることを意味する。そのような連結の数は、標的配列に応じて、または毒性のような他の態様に基づいて、各末端で異なり得ることが当業者には理解されよう。

リボース糖は、低級アルキル（２’－Ｏ－ＭｅのようなＣ１－４）、アルケニル（Ｃ２－４）、アルキニル（Ｃ２－４）、メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、または他の置換基での２’－Ｏ部分の置換によって修飾されてもよい。２’ＯＨ基の好ましい置換基は、メチル、メトキシエチルまたは３，３’－ジメチルアリル基である。後者は、その嵩高さのためにヌクレアーゼ感受性を阻害する一方で、ハイブリダイゼーションの効率を改善するというその性質で知られている（Angus & Sproat FEBS 1993 Vol. 325, no. 1, 2, 123-7）。あるいは、リボース環の内側に２’－４’分子内架橋（通常２’酸素と４’炭素の間のメチレン架橋）連結を含む、ロックド核酸配列（ＬＮＡ）を適用してもよい。プリン核酸塩基および／またはピリミジン核酸塩基は、例えば複素環式環のアミノ化または脱アミノ化によってそれらの特性を変えるように修飾することができる。正確な化学的性質およびフォーマットは、オリゴヌクレオチド構築物ごとに、および用途ごとに異なってもよく、そして当業者の希望および好みに従って解決してもよい。

本発明によるＡＯＮは、通常、１０ヌクレオチドより長く、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６より多く、さらにより好ましくは１７ヌクレオチドより多くあるべきである。一実施形態では、本発明によるＡＯＮは、２０ヌクレオチドより長い。本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは１００ヌクレオチドより短く、さらにより好ましくは６０ヌクレオチドより短い。一実施形態では、本発明によるＡＯＮは、５０ヌクレオチドより短い。好ましい態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１８～７０ヌクレオチドを含み、より好ましくは１８～６０ヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは１８～５０ヌクレオチドを含む。したがって、最も好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドを含む。

（ヒトＡＤＡＲ酵素などの）ＲＮＡ編集主体が、いくつかの要因に依存して異なる特異性でｄｓＲＮＡ構造を編集することは、当技術分野において公知である。１つの重要な要因は、ｄｓＲＮＡ配列を構成する二本鎖の相補性の程度である。二本鎖の完全な相補性は通常、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインに非識別的にアデノシンを脱アミノ化させ、遭遇するあらゆるアデノシンと多かれ少なかれ反応する。ｈＡＤＡＲ１および２の特異性は、化学修飾を導入すること、および／またはｄｓＲＮＡ中にいくつかのミスマッチを確実に導入することによって増加させることができ、それはおそらく明らかに定義されていない方法でｄｓＲＮＡ結合ドメインを配置するのを助ける。さらに、脱アミノ化反応それ自体は、編集されるべきアデノシンに対向するミスマッチを含むＡＯＮを提供することによって増強され得る。ミスマッチは、好ましくは、編集されるべきアデノシンの反対側にシチジンを有する標的部分を提供することによって作り出される。代替として、ウリジンもアデノシンの反対側に使用することができるが、これは、当然のことながら、ＵとＡが対になっているため、「ミスマッチ」を生じないと予想される。標的鎖のアデノシンが脱アミノ化されると、標的鎖はイノシンを得るが、これは、ほとんどの生化学的プロセスで、細胞の生化学的機構によってＧとして「読み取られる」ことになる。したがって、Ｉは本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の標的部分における反対側のＣと完全に塩基対合することができるので、ＡからＩへの変換後、ミスマッチは解決される。ミスマッチが編集により解決された後、基質が解放され、そしてオリゴヌクレオチド構築物－編集主体複合体が標的ＲＮＡ配列から解放され、それは次にスプライシングおよび翻訳のような下流生化学プロセスに利用可能になる。標的するオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡにあまり強く結合するべきではないため、このオン／オフ速度も重要である。

標的ＲＮＡ配列を編集することの所望の特異性レベルは、標的ごとに異なり得る。本特許出願の指示に従って、当業者は、それらの必要性に従ってオリゴヌクレオチドの相補的部分を設計することができ、そして、いくらかの試行錯誤で、所望の結果を得ることができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは通常、通常のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＵおよびＣを含むが、例えば１つまたは複数のＧヌクレオチドの代わりにイノシン（Ｉ）も含み得る。

オリゴヌクレオチド構築物と重複する領域における標的ＲＮＡ配列中のアデノシンの望ましくない編集を防ぐために、オリゴヌクレオチドを化学的に修飾することができる。標的ＲＮＡ配列中のアデノシンに対向するヌクレオシドのリボシル部分の２’－Ｏ－メチル化は、ＡＤＡＲによるそのアデノシンの脱アミノ化を劇的に減少させることが当該技術分野において示されている（Vogelら、2014）。したがって、オリゴヌクレオチド構築物の所望の位置に２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）ヌクレオチドを含ませることによって、編集の特異性は劇的に改善される。２’－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）および２’－Ｏ－ジメチルアリル基のような、リボシル部分の他の２’－Ｏ置換もまた、標的ＲＮＡ配列中の対応する（反対側の）アデノシンの望ましくない編集を減少させ得る。これら全ての修飾は本発明のオリゴヌクレオチドに適用することができる。他の化学修飾もまた、オリゴヌクレオチド合成および設計の当業者には容易に利用可能である。そのような化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドの合成およびそれらを本発明による方法で試験することは過度の負担を与えず、他の修飾も本発明に包含される。

細胞内に存在するＲＮＡ編集分子は、通常、哺乳動物を含む後生動物に見られるＡＤＡＲ酵素のように、本質的にタンパク質性と予想される。好ましくは、細胞編集主体は酵素、より好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくはアデノシンデアミナーゼである。最も興味深いものは、ヒトＡＤＡＲ、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２であり、それらの任意のアイソフォーム、例えばｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０およびｐ１５０が含まれる。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を都合よく設計できるようにするための、当技術分野において公知のＲＮＡ編集酵素には、ヒトまたはヒト細胞におけるｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２のようなＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ならびにシチジンデアミナーゼが含まれる。ヒトＡＤＡＲ３（ｈＡＤＡＲ３）は先行技術に記載されているが、デアミナーゼ活性を有さないと報告されている。ｈＡＤＡＲ１は２つのアイソフォームで存在することが知られている；共通のプレｍＲＮＡからのオルタナティブスプライシングにより産生される、長い１５０ｋＤａのインターフェロン誘導型およびより短い１００ｋＤａ型である。その結果、細胞内に存在する１５０ｋＤａアイソフォームのレベルは、インターフェロン、特にインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）によって影響を受ける可能性がある。ｈＡＤＡＲ１はＴＮＦ－アルファによっても誘導される。これは併用療法を開発する機会を提供し、それによってインターフェロン－ガンマまたはＴＮＦ－アルファおよび本発明によるオリゴヌクレオチドは、組み合わせ製品として、または別々の製品として、同時または引き続き任意の順序で患者に投与される。特定の病状は、患者の特定の組織におけるＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－アルファのレベルの増加とすでに同時発生している可能性があり、編集を罹患組織に対してより特異的にするさらなる機会を創出している。

本発明のＡＯＮにおける化学修飾の例は、糖（リボース）部分内の架橋置換基（例えば、ＬＮＡまたはロックド核酸におけるような）によるもの、２’－Ｏ原子を、上記で特定したような長さを有するアルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル）、アルキニル（２’－Ｏ－アルキニル）、アルケニル（２’－Ｏ－アルケニル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシエチル、２’－ＭＯＥ）基で置換することによるものなどを含む糖部分の修飾である。さらに、骨格のホスホジエステル基は、チオール化、ジチオール化、アミド化などによって修飾されて、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどのヌクレオシド間連結を生じ得る。ヌクレオシド間連結は、ペプチド核酸配列などをもたらすために、ペプチド連結によって完全にまたは部分的に置き換えられてもよい。あるいは、またはさらに、核酸塩基は、イノシンまたは２’６’－ジアミノプリンなどをもたらすために、（脱）アミノ化によって修飾されてもよい。さらなる修飾は、ヌクレオチドのシチジン部分におけるＣ５のメチル化であってもよく、ＣｐＧ配列に関連していることが知られている潜在的な免疫特性を減少させる。

ｄｓＲＮＡ複合体が標的ＲＮＡ配列の中のＡをＩに脱アミノ化するためにＡＤＡＲ酵素をリクルートする場合、編集されるアデノシンと反対側のヌクレオチドとの間の塩基対、ミスマッチ、バルジまたはゆらぎは、アデノシン、グアニン、ウリジンまたはシチジン残基を含み得るが、好ましくはシチジン残基を含み得る。（ウリジンが適用されていない場合）編集部位に対向する潜在的なミスマッチを除いて、ＡＯＮの残りの部分は標的ＲＮＡと完全に相補的であり得る。しかしながら、本明細書に示されるように、特定の態様において、本発明は、限られた数の不完全マッチを含むＡＯＮに関する。細胞内の編集主体が他の標的部位にリダイレクトされる程度は、編集分子の認識ドメインに対する本発明によるオリゴヌクレオチドの親和性を変えることによって調節することができることを、当該技術分野の当業者は理解すると予想される。正確な修飾は、いくつかの試行錯誤によって、および／またはオリゴヌクレオチドと編集分子の認識ドメインとの間の構造的相互作用に基づくコンピューター計算方法によって決定することができる。

さらに、あるいは代替的に、細胞内に存在する編集主体のリクルートおよびリダイレクトの程度は、オリゴヌクレオチドの投与量および投与計画によって調節することができる。これは実験者（インビトロ）または臨床医によって、通常は第Ｉ相および／または第ＩＩ相臨床試験で決定されるものである。

本発明は真核生物、好ましくは後生動物、より好ましくは哺乳動物細胞における標的ＲＮＡ配列の修飾に関する。原則として、本発明は任意の哺乳動物種由来の細胞と共に使用することができるが、好ましくはヒト細胞と共に使用される。本発明は、例えば、皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液など任意の器官由来の細胞と共に使用することができる。本発明は、（ヒト）対象の罹患状態に関与する細胞、組織または器官における配列を修飾することに特に適している。そのような細胞には、肺または胃腸管の上皮細胞、生殖器官の細胞、筋肉細胞、眼の細胞、皮膚の細胞、肝臓、腎臓、膵臓などの組織および器官由来の細胞、免疫細胞、癌性細胞、腺細胞、脳細胞などが含まれるがこれらに限定されない。本発明はまた、生物体中に天然には存在しない哺乳動物細胞、例えば、細胞株またはＥＳ細胞を用いることができる。本発明は、多能性幹細胞、全能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などを含む様々な種類の幹細胞を使用することができる。細胞はインビトロまたはインビボに位置し得る。本発明の１つの利点は、生体内にインサイツで細胞を使用することができるが、培養中の細胞を使用することもできることである。いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボで処理され、次いで生体内に導入される（例えば、それらが元々由来した生物に再導入される）。本発明はまた、いわゆるオルガノイド内の細胞内の標的ＲＮＡ配列を編集するためにも使用することができる。オルガノイドは、三次元インビトロ由来組織と考えることができるが、個々の単離された組織を生成するために特定の条件を用いて駆動される（例えば、Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125参照）。治療環境では、それらは患者の細胞からインビトロで誘導することができるので有用であり、そしてオルガノイドは通常の移植片より拒絶される可能性が低い自己由来物質として患者に再導入することができる。したがって、別の好ましい実施形態によれば、本発明は、患者から採取された組織試料から（例えば、彼らの胃腸管から；Sala et al. J Surg Res. 2009；156(2)：205-12また、Sato et al. Gastroenterology 2011；141：1762-72参照）成長したオルガノイドに対して実践することができる；本発明によるＲＮＡ編集の際に、オルガノイド、またはオルガノイド内に存在する幹細胞は、臓器機能を改善するために患者に移植し戻すために使用され得る。治療される細胞は一般に遺伝的変異を有すると予想される。変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。本発明は典型的には、ＮからＡへの変異、ここでＮはＧ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であってよく、好ましくはＧからＡへの変異、またはＮからＣへの変異、ここでＮはＡ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であってよく、好ましくはＵからＣへの変異などの点突然変異を修飾するために用いられる。特定の目的の変異を含む遺伝子は以下に議論される。しかしながら、いくつかの実施形態において、本発明は、問題の疾患のための有用な研究手段を提供するために、細胞株または動物に疾患関連変異を導入することによる反対の方法で使用される。疾患モデルを作成する例として、我々は、ＣＥＰ２９０遺伝子における変異を作成するために、ヒト細胞における編集活性のリクルートメントを提供するオリゴヌクレオチド配列を提供し、先天性の子供の失明の最も一般的な形態である、レーバー先天黒内障（Leber's Congenital Amaurosis（ＬＣＡ １０））の形態の基礎を形成する潜在的なスプライス部位を作成した。

ＲＮＡ編集によって元に戻される変異は、染色体のレベル、またはミトコンドリアＤＮＡ、またはプレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡもしくはミトコンドリアＲＮＡを含むＲＮＡのような他の形態のＤＮＡのレベルで生じた可能性がある。行われる変更は、細胞または対象が感染している、真菌、酵母、寄生虫、キネトプラスチド、細菌、ファージ、ウイルスなどを含む病原体の標的ＲＮＡにあってもよい。その後、そのような細胞、対象または病原体の内部の標的配列上のＲＮＡレベルで編集を行うことができる。ウイルスなどの特定の病原体は、それらの核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを感染宿主（細胞）の細胞に放出する。他の病原体は感染した宿主内に存在または循環している。本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、感染した真核生物宿主の細胞内に存在する標的ＲＮＡ配列を編集するため、または真核生物宿主内に存在または循環する病原体の細胞内のＲＮＡ配列を編集するために、編集が行われる細胞が、それに投与されたオリゴヌクレオチド構築物と適合性のある編集主体を含む限りにおいて、使用され得る。

理論に拘束されることを望むものではないが、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集は、例えば成熟ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡを編集することができる、核内、転写またはスプライシング中、または細胞質内の一次転写物で起こると考えられている。編集酵素の異なるアイソフォームは異なって局在することが知られており、例えばｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０は主に核に、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１５０は細胞質に見られる。シチジンデアミナーゼによるＲＮＡ編集は、ｍＲＮＡレベルで起こると考えられている。成熟ｍＲＮＡにおけるミトコンドリアＲＮＡコドンまたは非コード配列の編集は排除されない。

本発明は、編集されるべき部位を標的とし、編集反応を引き起こすために細胞内に存在するＲＮＡ編集主体をリクルートすることができるオリゴヌクレオチドの使用を通して真核細胞における標的ＲＮＡ配列に変化を生じさせるために使用される。好ましい編集反応は、アデノシンをイノシンに、シチジンをウリジンにそれぞれ変換する、アデノシン脱アミノ化およびシチジン脱アミノ化である。標的ＲＮＡの５’または３’非翻訳領域、（潜在的）スプライス部位、エキソン（標的ＲＮＡから翻訳されるタンパク質中のアミノ酸の変化、コドン使用頻度、またはエキソンスプライシングサイレンサーまたはエンハンサーの変化によるスプライシング挙動、開始または終止コドンを導入または除去することによる）、イントロン（イントロンスプライシングサイレンサーまたはイントロンスプライシングエンハンサー、分岐点を変えることによってスプライシングを変化させる）および一般にＲＮＡ安定性、構造または機能に影響を及ぼす任意の領域において、変化し得る。標的ＲＮＡ配列は、点突然変異（遷移またはトランスバージョン）のような、修正希望または変更希望の変異を含み得る。あるいは、標的ＲＮＡ配列を計画的に変異させて、変異が以前に存在しなかった場所に、変化した表現型（またはＲＮＡウイルスのようなＲＮＡベースの生物の場合は遺伝子型）を作製する。例えば、標的ＲＮＡ配列に変化（突然変異）を有する細胞系または動物を作製することができ、これはアッセイにおいて、または（動物、オルガノイドなど）モデル系として、疾患を研究し、実験化合物を疾患に対して試験することなど、使用できる。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物および方法は、化合物スクリーニング、タンパク質工学などを含む、さらなる実験のために、例えば多種多様なタンパク質アイソフォームをコードする多種多様な標的ＲＮＡを有する細胞バンクを作製するための（アレイ形式の）ハイスループットスクリーニングシステムにおいて使用することができる。

標的ＲＮＡは、任意の細胞性またはウイルス性ＲＮＡ配列であり得るが、より一般的にはプレｍＲＮＡまたはタンパク質コード機能を有するｍＲＮＡである。

単に参照を容易にするために、そして本発明を限定することを意図せずに、表１は、本発明のオリゴヌクレオチドによって導かれるアデノシンデアミナーゼ編集によってもたらされ得る潜在的なコドン変化を説明するために提供される。表１は特に、いかなるＲＮＡ中のコード配列への本発明の適用性の限定として解釈されるべきではない；すでに指摘したように、本発明は、コード領域、イントロン、非コードエキソン（５’または３’非翻訳領域など）、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのいずれにおいても、アデノシンを含む任意のＲＮＡ標的に対して実施することができる。適用範囲の広さについての誤解を避けるために、コーディングの観点から重要でない（「サイレントな」）変更は、同じアミノ酸のいくつかのコドンが他のコドンよりも好まれるため、依然として特定のタンパク質の遺伝子発現を変える可能性があり、例えば、転写安定性または翻訳効率が異なると、コードされたタンパク質は変化がない場合よりも多かれ少なかれ豊富になることがもたらされ得る。

本発明によるオリゴヌクレオチドを用いて編集するための特に興味深い標的アデノシンは、グリコシル化、ヒドロキシル化、ミリストイル化、プロテアーゼによるタンパク質切断（タンパク質を成熟させるため、および／または細胞内経路指定の一部として）などの同時または翻訳後修飾についての、重要な機能、または触媒部位、他のタンパク質に対する結合部位、基質による結合、局在化ドメインなどの特徴を定義するアミノ酸残基に対するコドンの一部であるものである。

遺伝性疾患の宿主はＧからＡへの変異によって引き起こされ、変異した標的アデノシンでのアデノシン脱アミノ化は変異を野生型に戻すため、これらは好ましい標的疾患である。しかしながら、野生型への戻りは、有益な効果を得るのに必ずしも必要ではないかもしれない。野生型ヌクレオチドがＧ以外である場合、標的におけるＡからＧへの修飾もまた有益であり得る。ある状況ではこれが当てはまると予測されるかもしれず、別の状況ではこれはいくらかの試験が必要であるかもしれない。特定の状況において、標的ＲＮＡ中のＡから野生型がＧではないＧへの修飾は、サイレントであり得る（異なるアミノ酸に翻訳されない）か、そうでなければ重要ではない（例えば、アミノ酸が置換されるが、それはタンパク質の構造および機能を破壊しない保存的置換となる）か、またはそのアミノ酸は変化に対して一定の頑健性を有する機能的ドメインの一部である。本発明に従って編集することによってもたらされるＡからＧへの移行が、非コードＲＮＡ、またはＲＮＡの非コード部分にある場合、その結果もまた、重要ではないか、または元の変異よりも厳しくないかもしれない。当業者は、本発明の適用性が非常に広く、そして疾患を予防または治療することに限定さえされないことを理解すると予想される。本発明はまた、たとえ、特にそのような修飾が、例えば細胞または非ヒト動物モデルにおいて病的状態を誘導する場合であっても、その効果を研究するために転写物を修飾するためにも使用され得る。本発明によるオリゴヌクレオチドで予防および／または治療することができる遺伝病の好ましい例は、標的ＲＮＡ中の１つまたは複数のアデノシンの修飾が（潜在的に）有益な変化をもたらす任意の疾患である。

特に興味深い変異を含む、本発明による潜在的な標的ＲＮＡ配列である転写ＲＮＡ配列には、ＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子）、ジストロフィン、ハンチントン、ニューロフィブロミン１、ニューロフィブロミン２、ヘモグロビンのβグロビン鎖、ＣＥＰ２９０（中心体タンパク質２９０ｋＤａ）、βヘキソサミニダーゼＡのＨＥＸＡ遺伝子、およびアッシャー症候群と呼ばれる遺伝的盲目の形態の原因であるアッシャー遺伝子のいずれか１つ（例えば、ＵｓｈｅｒｉｎをコードするＵＳＨ２Ａ）から転写されるものが含まれるがそれらに限定されない。より広範なリストは下にさらに提示されている。標的配列はそれに応じて選択され、そしてオリゴヌクレオチド構築物は変異を修正するために所望の修飾を含むと予想される。ＣＦ変異の当業者は、Ｒ１１７Ｈ、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、およびＮ１３０３Ｋを含む１０００から２０００の変異がＣＦＴＲ遺伝子において知られていることを認識している。

一般に、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を用いて元に戻すことができる任意の標的ＲＮＡにおける変異は、アデノシンデアミナーゼリクルートメントの場合にはＧからＡへの変異、シチジンデアミナーゼリクルートメントの場合にはＵからＣへの変異であり、オリゴヌクレオチド構築物はそれに応じて設計することができる。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を用いて標的とすることができる変異はまた、アデノシンデアミナーゼをリクルートする場合にはＣからＡ、ＵからＡ（ＤＮＡレベルではＴからＡ）、およびシチジンデアミナーゼをリクルートする場合にはＡからＣおよびＧからＣへの変異を含む。後者の状況でのＲＮＡ編集は必ずしも変異を野生型に戻すことはできないかもしれないが、編集されたヌクレオチドは元の変異よりも改善をもたらすかもしれない。例えば、－翻訳時に短縮型タンパク質を生じる－インフレーム終止コドンを引き起こす変異は、その位置の元のアミノ酸ではないかもしれないがアミノ酸をコードするコドンに変更されるかもしれないが、少なくともいくらかの機能性を有する、少なくとも短縮型タンパク質よりも高い機能性を有する（全長）タンパク質を生じる。

標的配列は真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞に対して内在性である。したがって、標的配列は、例えば、細胞の歴史のある時点で人工的に導入された導入遺伝子またはマーカー遺伝子ではなく、むしろ細胞内に天然に存在する遺伝子である（突然変異型であろうと非突然変異型であろうと）。

代わりに、本発明によるオリゴヌクレオチドを適用することによって野生型配列を変異配列に変えることが有用であり得るので、本発明は変異の修正に限定されない。野生型アデノシンを修飾することが有利であり得る一例は、例えば、エキソンのスプライシングに必要とされる分岐部位であると思われるアデノシンを修飾することによって、前記エキソンのスキップを引き起こすことである。別の例は、アデノシンがタンパク質結合のための認識配列を規定するかもしくはその一部であるか、またはｍＲＮＡの安定性を規定する二次構造に関与する場合である。したがって、上記のように、本発明を使用して、疾患に対する研究ツールを提供し、既存の変異などよりも有害性が低い新しい変異を導入することができる。

投与されるオリゴヌクレオチドの量、投与量および投与計画は、細胞の種類、治療される疾患、標的集団、投与方法（例えば、全身性に対する局所性）、疾患の重篤度および副活性の許容されるレベルによって異なるが、これらはインビトロ研究中、前臨床試験中および臨床試験中での試行錯誤によって、評価することができ、またそうすべきである。修飾配列が容易に検出される表現型の変化をもたらす場合、試験は特に容易である。より高用量のオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸編集主体（例えばＡＤＡＲ）への結合について競合する可能性があり、それによって、ＲＮＡ編集に自由に参加できる主体の量を枯渇させるが、日常的な投与試験は、所与のオリゴヌクレオチドおよび所与の標的についてのそのような影響を明らかにすると予想される。

１つの適切な試験技術は、オリゴヌクレオチド構築物を細胞株または試験生物に送達し、その後の様々な時点で生検試料を採取することを含む。標的ＲＮＡの配列は生検試料中で評価することができ、そして修飾を有する細胞の割合は容易に追跡することができる。この試行が１回実行された後は、知識が保持され、生検試料を採取する必要なく将来の送達が実行され得る。

したがって、本発明の方法は、細胞の標的ＲＮＡ配列における所望の変化の存在を同定し、それによって標的ＲＮＡ配列が修飾されたことを確認するステップを含み得る。このステップは、典型的には、上に記載のように、標的ＲＮＡの関連部分、またはそのｃＤＮＡコピー（または標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合は、そのスプライシング産物のｃＤＮＡコピー）の配列決定を含み、したがって、配列の変化は容易に確認できる。あるいは、変化は、タンパク質のレベル（長さ、グリコシル化、機能など）によって評価してもよいし、または何らかの機能的読み出し、例えば標的ＲＮＡ配列によってコードされるタンパク質がイオンチャネルである場合は、（ｎ）（誘導性）電流によって評価してもよい。ＣＦＴＲ機能の場合、ヒトを含む哺乳動物におけるアッシングチャンバーアッセイ（Ussing chamber assay）またはＮＰＤ試験は、機能の回復または獲得を評価するために当業者に周知である。

細胞内でＲＮＡ編集が行われた後、例えば細胞分裂、編集されたＲＮＡの限定された半減期などのために、修飾されたＲＮＡは経時的に希釈される可能性がある。したがって、実際の治療用語では、本発明の方法は、十分な標的ＲＮＡが患者に明白な利益を提供するためにおよび／または経時的に有用性を維持するために修飾されるまで、オリゴヌクレオチド構築物の反復送達を含み得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは治療的使用に特に適しているので、本発明は本発明のオリゴヌクレオチドと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体は単に食塩水であり得る。これは、特に肺送達のためには、有用に等張性または低張性であり得る。本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む送達装置（例えばシリンジ、吸入器、ネブライザー）を提供する。

本発明はまた、本明細書中に記載されるように、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において標的ＲＮＡ配列を変化させるための方法において使用するための本発明のオリゴヌクレオチドを提供する。同様に、本発明は、本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において標的ＲＮＡ配列を変化させるための薬剤の製造における本発明のオリゴヌクレオチド構築物の使用を提供する。

本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ配列中に存在する少なくとも１つの特定の標的アデノシンを脱アミノ化する方法に関し、前記方法は：本発明によるＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；前記ＡＯＮを細胞に取り込ませるステップ；前記ＡＯＮを標的ＲＮＡ配列にアニーリングを可能にするステップ；野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物ＡＤＡＲ酵素が、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ；および任意選択で、ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップを含む。本発明によるＡＯＮの細胞内への導入は、当業者公知の一般的な方法によって行われる。脱アミノ化後、効果の読み取り（標的ＲＮＡ配列の変化）は様々な方法でモニターすることができる。したがって、標的アデノシンの所望の脱アミノ化が実際に行われたか否かの同定ステップは、一般に、標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの位置、およびアデノシンの存在によって生じる効果（点突然変異、早期終止コドン、異常なスプライス部位、オルタナティブスプライス部位、得られたタンパク質のミスフォールディングなど）に依存する。したがって、好ましい態様では、ＡからＩへの変換の最終的な脱アミノ化効果に応じて、同定ステップは：標的ＲＮＡを配列決定するステップ；前記脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；プレｍＲＮＡのスプライシングが前記脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または、機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップを含む。ＵＡＡ終止コドンがある場合、それは両方のアデノシンが脱アミノ化される必要があることを意味する。したがって、本発明はまた、互いに隣接している２つのアデノシンが、ＡＤＡＲのようなＲＮＡ編集酵素によって同時脱アミノ化されるオリゴヌクレオチドおよび方法に関する。この特定の場合において、ＵＡＡ終止コドンはＵＧＧ Ｔｒｐコードコドンに変換される（表１参照）。アデノシンのイノシンへの脱アミノ化は、標的位置で変異したＡにもはや被っていないタンパク質をもたらし得るため、イノシンへの脱アミノ化の同定はまた、機能的な読み取り、例えば、機能的タンパク質が存在するか否か、あるいはアデノシンの存在によって引き起こされる疾患が（部分的に）逆行しているかという評価でもあり得る。本明細書に記載の各疾患の機能評価は、一般に、当業者公知の方法に従うと予想される。標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、読み出しは、異常なスプライシングがまだ起こっているか、否か、または低いかどうかの評価であり得る。一方、標的アデノシンの脱アミノ化がスプライス部位を導入することを望まれる場合、必要な種類のスプライシングが実際に行われているか否かをチェックするために同様の手法を使用することができる。標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための非常に適切な方法は、もちろん、当業者に周知の方法を用いたＲＴ－ＰＣＲおよび配列決定である。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、任意選択で、１ｎｇ／ｍｌから１ｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の、医薬用途に適合する添加剤、賦形剤および他の成分を含む、例えば生理食塩水のような水溶液中または懸濁液中で適切に投与される。投与量は、適切には約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、腫瘍などへの吸入（例えば噴霧による）、鼻腔内、経口、注射または注入による、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、気管内、腹腔内、直腸内、直接注射によるものであり得る。投与は、固体形態、粉末形態、丸剤形態、またはヒトにおける医薬用途に適合する他の任意の形態であり得る。

本発明は、嚢胞性線維症、白皮症、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、パーキンソン病、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、様々な形態の癌（例えば、乳癌と卵巣癌とを関連付けられるＢＲＣＡ１および２）などの遺伝病の治療に特に適している。

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド構築物は全身的に送達され得るが、標的配列の表現型が見られる細胞にオリゴヌクレオチドを送達することがより典型的である。例えば、ＣＦＴＲの変異は、主に肺上皮組織に見られる嚢胞性線維症を引き起こすので、ＣＦＴＲ標的配列では、オリゴヌクレオチド構築物を特異的かつ直接的に肺に送達することが好ましい。これは吸入、例えば典型的にはネブライザーの使用による、粉末またはエアロゾルの吸収により便宜的に達成することができる。特に好ましいのは、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（Ｒａｐｉｄ）またはＲｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓからのｉ－ｎｅｂを含む、いわゆる振動メッシュを使用するネブライザーである。本発明者らは、オリゴヌクレオチド構築物の吸入使用が、オリゴヌクレオチド構築物の全身分布およびとりわけ、腸、肝臓、膵臓、腎臓および唾液腺組織における細胞による取り込みをもたらし得ることを見出した。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の吸入送達もこれらの細胞を効率的に標的化することができ、これはＣＦＴＲ遺伝子の場合、標的化は嚢胞性線維症にも関連する胃腸症状の改善をもたらし得ることが期待される。他の標的配列については、疾患および／または標的器官に依存して、投与は局所的（例えば皮膚上）、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、経口、眼内注射などであり得る。

いくつかの疾患では、粘液層が厚くなるため、肺を介した薬の吸収の減少をもたらす。そのような疾患の１つは慢性気管支炎であり、別の例は嚢胞性線維症である。ＤＮａｓｅ、高張食塩水またはマンニトールのような様々な形態の粘液正常化剤が利用可能であり、それらはＢｒｏｎｃｈｉｔｏｌの名称で市販されている。粘液正常化剤が、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物のようなＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド構築物と組み合わせて使用される場合、それらはそれらの薬剤の有効性を増大させる可能性がある。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象への、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは粘液正常化剤、好ましくは本明細書に記載の粘液正常化剤と組み合わされる。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の投与は、増強剤化合物、例えばＫａｌｙｄｅｃｏ（ｉｖａｃａｆｔｏｒ； ＶＸ－７７０）、または中和化合物（corrector compound）、例えばＶＸ－８０９（ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）および／またはＶＸ－６６１のようなＣＦの治療のための小分子の投与と組み合わせることができる。ＣＦにおける他の併用療法は、ＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－アルファを使用して、アデノシンデアミナーゼの誘導剤と組み合わせた本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の使用を含み得る。

代替的に、または粘液正常化剤と組み合わせて、粘液透過性粒子またはナノ粒子での送達を、例えば肺および腸の上皮細胞へのＲＮＡ編集分子の効率的な送達のために適用することができる。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象への、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは粘液透過性粒子またはナノ粒子での送達を用いる。

慢性および急性の肺感染症は、嚢胞性線維症のような疾患を持つ患者によく見られる。抗生物質治療は、細菌感染ならびに粘液の肥厚および／またはバイオフィルムの形成のような症状を軽減する。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物と組み合わせた抗生物質の使用は、オリゴヌクレオチド構築物のための標的細胞へのより容易な接近の機会（アクセス）のために、ＲＮＡ編集の有効性を増大させる可能性がある。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象への、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは細菌感染ならびに粘液の肥厚および／またはバイオフィルム形成のような症状を軽減するために抗生物質治療と組み合わせる。抗生物質は全身的にまたは局所的にまたはその両方で投与することができる。

例えば嚢胞性線維症患者に適用するために、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物、または本発明によるパッケージ化もしくは複合化オリゴヌクレオチド構築物は、ＤＮａｓｅ、マンニトール、高張生理食塩水および／または抗生物質および／またはＣＦの治療のための小分子、例えばイバカフトール（ivacaftor）などの増強剤化合物、または例えばルマカフトール（lumacaftor）および／もしくはＶＸ－６６１などの中和化合物のような任意の粘液正常化剤と組み合わせることができる。標的細胞への接近の機会を増加させるために、本発明によるオリゴヌクレオチドの投与の前に、気管支肺胞洗浄（Broncheo-Alveolar Lavage；ＢＡＬ）を適用して肺を洗浄することができる。

[実施例１]
異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＧＦＰ標的ＲＮＡ中の非センス変異の編集および配列分析
細胞ゲノムに安定に組み込まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現構築物を含むＨｅＬａ細胞を使用して、細胞系におけるＲＮＡ編集を最初に調べた。この構築物では、終止コドン（ＴＡＧ）がコドン位置５７に導入されており、その結果、ｍＲＮＡ中にトリプレットＵＡＧが生じる。このトリプレットの中央にあるアデノシンのところでＲＮＡを編集すると、結果的に正常な全長タンパク質の発現をもたらす。構築物（下記参照）および細胞株は、当業者に公知の技術を用いて作製された。

標的ＲＮＡと比較して異なるミスマッチを含む一組の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、このトリプレットの中央のＡを実際にＩに脱アミノ化することができるか否かを調べた（後にＧと読まれると予想される）。図１を参照されたい。ＵＡＧトリプレットの編集は、Ｔｒｐコドンを表すＵＧＧ、引き続き機能的ＧＦＰタンパク質をもたらすと予想される。標的ＲＮＡ中の他のアデノシンが編集されないことを確実にするために、終止コドンに対向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの３つのヌクレオチド（各オリゴヌクレオチド中の３’－ＡＣＣ－５’、中央のミスマッチＣを有する、図１を参照）は２’－ＯＭｅ基を含ませなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の他の全てのヌクレオチドは含ませた。さらに、試験した全てのオリゴヌクレオチドの両側の末端の４つの連結はホスホロチオエート連結であり、一方残りの連結は通常のホスホジエステル連結であった。

第一段階として、その位置のヌクレオチドが実際に本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかとＡＤＡＲ２との組み合わせによって編集され得ることを配列分析によって明らかになるか否かを調べた。このために、１ウェル（６ウェルプレート）ごとにＧＦＰｓｔｏｐ５７構築物を安定的に発現する０．４ｘ１０^６ ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地内に播種した。２４時間後、引き続きのＡＯＮトランスフェクションのための細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて２μｇのＡＤＡＲ２過剰発現プラスミド（ＲＣ２１２３２４；Ｏｒｉｇｅｎｅ）をトランスフェクトした。４８時間後、選択された細胞試料に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて、０、５０、または１００ｎＭの各ＡＯＮ（図１参照）をトランスフェクトした。さらに２４時間後、ＲＮＡを溶解細胞から単離し、ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。当業者公知の一般的なＲＴ－ＰＣＲおよび配列決定法を使用して、ＲＴ－ＰＣＲ（フォワードプライマー５’－ＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＡ－３’（配列番号７）およびリバースプライマー５’－ＧＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡ－３’（配列番号８））、続いてＰＣＲ産物のサンガー配列決定によってＲＮＡ編集の分析を行った。ＡからＩへの編集の効率はＲＴ－ＰＣＲ産物のサンガー配列決定によって分析することができる。ここでＡからＩへの編集は配列決定クロマトグラムにおいてＡからＧへのシグナルの強度の（部分的な）シフトとして明らかになるはずである。この方法は完全には定量的ではないが、ＡとＧの頻度の比はＡからＩへの編集効率のおよその推定値として使用することができる。予想どおり、ＡＯＮをトランスフェクトしなかった試料では、標的部位のＡピークと重なるＧのシグナルは観察されない（図２、パネルＡおよびＢ）。対照的に、ＡＯＮでトランスフェクトした試料では、重なっているＡおよびＧピーク（それぞれ図２の緑色および黒色）によって示されるように、Ｇへの部分的変化がこの位置で観察される。影響は様々である：各ＡＯＮで標的部位での少量の重なり合ったＧシグナルが観察され得るが、その影響はＡＯＮのＡＤＡＲ５８とＡＤＡＲ５９で最も強くなる（図２ Ｇ－Ｊ）。

ゆらぎ塩基対は、ＲＮＡ二次構造において基本的な役割を果たし、ｔＲＮＡ中に広く存在する。非常に多くの場合、ＲＮＡ配列におけるそれらの出現は、バルジＲＮＡ構造、ループおよびミスマッチと近い。ＡＯＮ中のゆらぎ塩基対の存在がＲＮＡ編集に及ぼす影響を調べるために、本発明の発明者らは５つのゆらぎ塩基対を含むＡＤＡＲ７２－１を設計した。ＧＦＰ標的ＲＮＡにおける非センス変異の編集を誘導するその能力（上記参照）を調べ、そして全く同じ配列を有するがゆらぎ塩基対を含まないオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ５９－２（＝ＡＤＡＲ５９、上記参照）と比較した：

上鎖はＡＯＮ、下鎖は５’から３’の標的ＲＮＡである。標的アデノシンは太字である。ミスマッチとゆらぎは下線が引かれ、矢印はさらなるゆらぎ塩基対の位置を示す。

ＡＤＡＲ５９－２（＝ＡＤＡＲ５９；配列番号４、実施例５も参照）およびＡＤＡＲ７２－１（配列番号３４）は、以下に示すように化学修飾されている：小文字は２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡヌクレオチドを表し、大文字のヌクレオチドは修飾されていないＲＮＡヌクレオチドを表す。星印は、ＡＯＮの３’および５’末端のヌクレオシド間ホスホロチオエート連結を表す。ミスマッチとゆらぎは下線で示される。

ＡＤＡＲ５９－２とＡＤＡＲ７２－１の両方を、過剰発現されたＡＤＡＲ２のアイソフォーム２（ＡＤＡＲ２ａ）を含むＨＥＫ２９３細胞溶解物を用いたインビトロ編集アッセイで試験した。過剰発現されたＡＤＡＲ２ａを有するがＡＯＮを有さないＨＥＫ２９３細胞溶解物を陰性対照として用いた。溶解物を得るために、まずＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて５００ｎｇのＡＤＡＲＢ１発現プラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ）で一晩トランスフェクトした。次に細胞をＬｙｓｉｓ－Ｍ試薬を用いて溶解した。２００ｎＭ ＡＯＮと９０ｎＭ鋳型ｓｓＲＮＡをインビトロ編集アッセイ緩衝液中、３０℃で３０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、細胞溶解物を添加し（１０μｌ）、反応混合物を３０℃で３０分間、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。次いで標的化ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出により抽出し、製造業者のプロトコルを用い、Ｍａｘｉｍａ ＲＴ試薬を用いて逆転写し、配列決定を上記のように準備した。図３に提供された配列決定データは、ＡＯＮが使用されなかった試料については検出可能なＡからＩへの編集がないことを示し：バックグラウンドを超えるＧシグナルは見られなかった。対照的に、オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ５９－２が編集アッセイにおいて使用された試料については、目に見えるＧシグナルが明らかに存在する。さらにより高い強度のＧシグナルがオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ７２－１について示されており、これは標的ＲＮＡ／ＡＯＮ配列中のさらなるゆらぎ塩基対の存在が、ＡからＩへの編集を増加させるのに役立つことを示している。

[実施例２]
ハーラー症候群の治療におけるＲＮＡ編集
本発明のシステムを使用するＲＮＡ編集のための１つの潜在的な疾患標的は、ムコ多糖症Ｉ型－ハーラー（ＭＰＳ Ｉ－Ｈ；ハーラー症候群）である。この疾患は、リソソーム酵素α－Ｌ－イズロニダーゼをコードするＩＤＵＡ遺伝子のｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異によって引き起こされる。本発明の方法および手段を用いてＡからＩを編集することは、潜在的に変異を野生型配列へ戻すと予想される。ハーラー症候群は、グリコサミノグリカンの蓄積による多臓器不全を引き起こすリソソーム蓄積障害である。内在性遺伝子に変異を有する、類似の変異（Ｗ３９２Ｘ）を有するマウスモデルが存在する。このマウスモデルで最初の実験を行い、様々な組織や臓器への影響を評価する。さらに、異なる組織におけるグリコサミノグリカンのレベルを評価して、編集手法の治療的可能性を評価する。

マウスＩｄｕａ遺伝子のエキソン９の配列の一部は以下の通りである（太字は変異）。

このＤＮＡ配列は配列番号１１であり、対応するＲＮＡ配列は配列番号１２である。

本発明の発明者らは、マウスモデルを使用して本明細書に概説したように、以下の配列を有する（上鎖は３’から５’へのオリゴヌクレオチド；下鎖は５’から３’への標的ＲＮＡ（配列番号１２）；ミスマッチおよびゆらぎには下線が引かれている）、ＲＮＡ編集に使用されるＩｄｕａ配列のこの部分に由来するプレｍＲＮＡに対する多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。

ＡＤＡＲ６５（配列番号１３）、ＡＤＡＲ６５－２（配列番号２４）、ＡＤＡＲ６５－２ｘ（配列番号２５）、ＡＤＡＲ６６（配列番号１４）、ＡＤＡＲ６７（配列番号１５）、ＡＤＡＲ９１（配列番号２６）およびＡＤＡＲ９３（配列番号２７）は、以下のように多くの化学修飾を有する。

小文字は２’－Ｏメチル修飾ＲＮＡヌクレオチドを表し、大文字ヌクレオチドは修飾されていないＲＮＡヌクレオチドであり（したがって、２’－Ｏメチル修飾はされていない）、その全てのヌクレオチド上に２’－Ｏメチル修飾を有するＡＤＡＲ６５－２を除いて、標的アデノシンの反対側にある中央シチジンを囲む。星印は、オリゴヌクレオチドの全ての末端における（４）ホスホロチオエート連結を表す。ミスマッチとゆらぎは下線で示される。ＡＤＡＲ９１は標的ＲＮＡと５つ（の領域）のミスマッチ／ゆらぎを有し、ＡＤＡＲ６７は４つを有し、ＡＤＡＲ９３とＡＤＡＲ６５－２Ｘはどちらも２つを有するが、ＡＤＡＲ６５、ＡＤＡＲ６５－２およびＡＤＡＲ６６のＡＯＮは標的アデノシンに対向するヌクレオチドでのみが異なる。ＡＤＡＲ６５およびＡＤＡＲ６６の修飾は同一であるが、ＡＤＡＲ６６はＡＤＡＲ６５よりも３’末端で２ヌクレオチド短い。

野生型配列の回復に対するこれらのＡＯＮの効果を、Ｉｄｕａによってコードされるα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の活性を測定するアッセイにおいて試験した。このために、Ｗ３９２Ｘマウス由来の不死化胚性線維芽細胞（１試料当たり７００００個）を増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）中で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いてＩｄｕａ Ｗ３９２Ｘ ｍＲＮＡを発現する１μｇのプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を同様に１００ｎＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、さらに４８時間培養した。次に細胞を回収し、そしてｍＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃７８５０１）中に溶解した。細胞断片を遠心分離によって溶解物から除去し、２５μｌの上清を酵素アッセイに使用した：０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中の２５μｌの３６０μＭ ４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニド（4-Methylumbelliferyl α-L-iduronide）を、溶解物試料に添加し、その後３７℃で２時間インキュベートした。２００μｌの０．１７Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．９）を添加することによって反応を停止させ、次いで得られた蛍光強度を測定した（励起波長３６５ｎｍおよび発光４５０ｎｍ）。結果は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定されるように、試料の総タンパク質濃度に対して正規化された。

結果（図４参照）は、これらの条件下で、オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ６５－２およびＡＤＡＲ９３－１を用いたトランスフェクションは、変異体Ｉｄｕａ ｍＲＮＡのみを発現する、オリゴヌクレオチド処理されていない細胞（ＮＴ）由来の試料で得られた蛍光と比較して、酵素活性のわずかな改善（２倍未満）しかもたらさなかったことを明らかに示している。対照的に、他のＡＯＮでは有意な増加が観察され、ＡＯＮ ＡＤＡＲ６７およびＡＤＡＲ９１は２倍を超える活性の増加をもたらし、そしてＡＯＮ ＡＤＡＲ６６、ＡＤＡＲ６５およびＡＤＡＲ６５－２Ｘは、それぞれ３、４および６倍を超える増加をもたらした。

続いて、オリゴヌクレオチド、標的ＲＮＡおよびＡＤＡＲタンパク質間の相互作用のモデリングデータに基づいて、本発明者らは、編集部位から４位上流のオリゴヌクレオチドのミスマッチが標的ＲＮＡへのＡＤＡＲタンパク質の結合を増強し、これにより、編集効率と編集レベルが向上し得ると考えた。４つのオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ９３－２、ＡＤＡＲ９３－３、ＡＤＡＲ９３－４およびＡＤＡＲ９３－５）は、マウスＩｄｕａ変異遺伝子（Ｗ３９２Ｘ）の標的プレｍＲＮＡを編集し、そのＷＴ配列を復元することに対する４位でのミスマッチの効果を試験するために設計された。

上鎖はオリゴヌクレオチドであり、下鎖は太字の変異（Ａ）を有する標的ＲＮＡである。ミスマッチとゆらぎは下線で示される。標的配列中の変異の４ヌクレオチド上流の位置における標的配列とのオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ９３－３とＡＤＡＲ９３－５との間のミスマッチが矢印で示される。ＡＤＡＲ９２－２は（そのミスマッチ以外は）ＡＤＡＲ９３－３と同一である。ＡＤＡＲ９３－４は（そのミスマッチ以外は）ＡＤＡＲ９３－５と同一である。ＡＤＡＲ９３－２（配列番号２８）、ＡＤＡＲ９３－３（配列番号２９）、ＡＤＡＲ９３－４（配列番号３０）およびＡＤＡＲ９３－５（配列番号３１）は、以下のように多くの化学修飾を有する：

小文字は２’－Ｏメチル修飾ＲＮＡヌクレオチドを表し、大文字ヌクレオチドは未修飾ＲＮＡヌクレオチドである（したがって、２’－Ｏメチル修飾はない）。ヌクレオシド間の星印は、ホスホロチオエート連結を表す。ミスマッチとゆらぎは下線で示される。

野生型配列の復元に対するこれら４つのオリゴヌクレオチドの効果を、上記のように編集および酵素アッセイにおいて試験した。図５（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、標的配列とのオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ９３－２およびＡＤＡＲ９３－５のＣ－Ａミスマッチの導入は、ミスマッチなしのオリゴヌクレオチドと比較した場合の蛍光シグナルの増加によって示される、編集に対するポジティブな効果を示した（それぞれＡＤＡＲ９３－２およびＡＤＡＲ９３－４）。これは、編集部位から上流の４位（上流＝標的配列中の５’側）とのさらなるミスマッチが、ＡＤＡＲタンパク質がさらに標的ＲＮＡに結合するのを助け、それがその後の編集効率の向上をもたらすことを示している。

[実施例３]
Ａ１ＡＴ欠損症の治療におけるＲＮＡ編集
本明細書に概説される手法を用いたＲＮＡ編集のための別の疾患標的は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子におけるｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異によって引き起こされるＡ１ＡＴ欠損症（Ａ１ＡＴＤ）である。標的は、インビトロおよびインビボ送達の両方についてのヒトｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異体配列である。マウスモデルはヒト化配列を含む。インビボ送達のために、本発明の教示に従って設計される構築物の主な標的は肝臓であり、これはこれがＡ１ＡＴの大部分が産生される場所である。評価は、ＲＮＡレベルで観察された編集活性、ならびに疾患に関連した肺および肝臓表現型の機能的救済に基づく。

[実施例４]
パーキンソン病の治療におけるＲＮＡ編集
本発明の手法を用いたＲＮＡ編集のさらなる疾患標的は、ＬＲＲＫ２遺伝子におけるｃ．６０５５Ｇ＞Ａ変異によって引き起こされるパーキンソン病である。これはパーキンソン病に関連する最も一般的な遺伝的原因である。マウスモデルを用いた直接注射から始めて、本明細書に提示されるように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて脳を標的化するために様々な方法が試験される。有効性の評価は、主にＲＮＡレベルで観察された編集活性に基づいている。変異によって引き起こされる機能亢進キナーゼ活性（例えば、Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅに影響を及ぼすことが公知である）が復帰することを立証するために、細胞のホスホプロテオームもまた研究されている。最終的に、マウスの黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの完全性に対する効果を評価する。

[実施例５]
内在性ＡＤＡＲによるＲＮＡ編集
外因性ＡＤＡＲ酵素を過剰発現することなくＲＮＡ編集が達成され得るか否かを調べるために、ＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２を発現する利用可能な細胞株をまず評価した。次いで、これらの細胞（ＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２を（過剰）発現する場合）は、実施例１に概説したようなＧＦＰ終止コドンを含む構築物で目的のオリゴヌクレオチドと共にトランスフェクトして、ＧＦＰ終止を編集する。以下の細胞株をＡＤＡＲ発現について最初に試験した：Ａ５４９（ヒト肺癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌）、Ｔ８４（ヒト大腸癌）、ＳＮＵ－４４９（ヒト肝細胞癌）、ＳＮＵ－４７５（ヒト肝細胞癌）、ＰＡＮＣ１（ヒト膵臓癌）、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ（ヒト神経芽腫）およびＭＣＦ７（ヒト乳癌）。Ａ５４９細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に保持し、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ＃６２７６５６６８）はＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ＋１０％ＦＢＳ中に保持し、Ｔ８４はＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）＋１０％ＦＢＳ中に保持し、ＳＮＵ－４４９（ＡＴＣＣ＃６３０１４１４６）はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に保持し、ＳＮＵ－４７５（ＡＴＣＣ＃６２９９６８４６）はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中に保持し、ＰＡＮＣ１はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に保持し、ＳＫ－Ｎ－ＳＨはＭＥＭＥ＋１０％ＦＢＳ＋５ｍｌ／Ｌ ＮａＰｙｒ＋５ｍｌ／Ｌ Ｇｌｕｔａｍａｘ中に保持し、およびＭＣＦ７細胞はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に保持した。各細胞株におけるＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の発現を、ウエスタンブロッティングを用いて確認した。このために、細胞を回収し、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＳＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者のプロトコルを使用してタンパク質定量を行った。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、分析のために膜に移した。最初に、ブロットをＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色して全タンパク質添加量を可視化した。これは全ての細胞株／レーンで等しく見えた（データは示さず）。次に、膜をＰＢＳ－Ｔで１回洗浄し、１０ｍｌの一次マウス抗ＡＤＡＲＢ１（ＳＡＢ１４０５４２６（Ｓｉｇｍａ）；０．０５％ＰＢＳ－Ｔ中で１：１０００）およびマウス抗ＡＤＡＲ１（ＧＴ１０６６ ａｂ １８４５２７（Ａｂｃａｍ）１：１０００、０．０５％ＰＢＳ－Ｔ中）およびウサギ抗チューブリン（０．０５％ＰＢＳ－Ｔ中で１：５０００）抗体溶液中、ローラーベンチ上で、４℃で一晩、インキュベートした。翌日、膜をＰＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄し、１：５０００の抗マウスＩＲＤｙｅ ８００ＣＷおよび１：５０００の抗ウサギＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ二次抗体溶液と共に室温で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳ－Ｔで３×５分間、次いでＰＢＳで５分間洗浄した。膜を、Ｏｄｄｙｓｅｙ ＣＬｘイメージングシステム（ＬｉＣｏｒ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅ）を用いて７００および８００波長および自動イメージング設定でスキャンした。

ウエスタンブロットを図６に示す。Ｂ－チューブリン発現から推定できるように、タンパク質添加量は全ての細胞株について同等であったが、ＡＤＡＲ１発現は、発現が有意に低いヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７を除いて全ての細胞株について同様であるように見える。一方、ＡＤＡＲ２の発現は、存在しているようであるが、有意に多くはないように見えるヒト肝細胞癌ＳＮＵ－４７５を除いて全ての細胞株で同様である。他の６つの細胞株は、匹敵するレベルまでＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２を発現するように見える。

全ての細胞株がＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２またはＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２の両方を発現することが判明したので、トランスフェクトするのが困難であると思われるＴ８４を除く全ての細胞を試験し、これらの内在性レベルのＲＮＡ編集酵素が、標的配列中の所定の位置でＲＮＡを編集するのに十分であったか否かを見た。このために、細胞を標的配列（ＧＦＰｓｔｏｐ５７）およびオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ＧＦＰｓｔｏｐ５７発現構築物（図１０Ａ）は、残基５８での停止による（アミノ酸配列については配列番号１０；図１０Ｂ）５７アミノ酸タンパク質をコードする安定に組み込まれたＧＦＰｓｔｏｐ５７配列（配列番号９；図１０Ｂ）を有するＨｅＬａ細胞株（実施例１）の生成に用いたものと同じ構築物である。

２ｍｌの培地の６ウェルプレート中に、１ウェルあたりおよそ０．３×１０^６細胞で細胞をプレーティングした。プレーティングの２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＯｐｔｉ－Ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ）を用い、当業者に公知の一般的な技術を適用して、１０００ｎｇのＧＦＰｓｔｏｐ５７プラスミドを細胞にトランスフェクトした。このトランスフェクションの６時間後に２ｍｌの新鮮培地を添加し、プレーティングの４８時間後に、細胞を１００ｎＭオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、さらに６時間後に、２ｍｌの新鮮培地を添加した。オリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクションの３０時間後に細胞を回収した。スクランブルオリゴおよびモック（Ｃｙ５）トランスフェクションを陰性対照として用いた。以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例１および図１ならびに配列番号１～４にそれぞれ示したものと同様にして試験した。

小文字は２’－Ｏメチル修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、大文字のヌクレオチドは未修飾ＲＮＡヌクレオチド（したがって、２’－Ｏメチル修飾なし）であり、ＧＦＰｓｔｏｐ５７の標的アデノシンに対向する中心Ｃを囲む。星印（＊）は、オリゴヌクレオチドの末端におけるヌクレオシド間のホスホロチオエート連結を表す。

トランスフェクションの３６時間後、ＲＮＡを溶解細胞から単離し、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲのための鋳型として使用した。ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーで確認した。ＲＮＡ編集の分析は、実施例１に概説したようにＲＴ－ＰＣＲ、続いてＰＣＲ生成物のサンガー配列決定により、一般的なＲＴ－ＰＣＲおよび当業者公知の配列決定法を用いて実行した。（ＡＤＡＲ５９－２でトランスフェクトされたＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を除く）ＧＦＰｓｔｏｐ５７構築物およびオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた残りの５つ全ての細胞株が１７５ヌクレオチド産物を生じることが、ＲＴ－ＰＣＲにより明らかになった（データは示さず）。異なる細胞株からのＰＣＲ産物を、ＧＦＰフォワード３（配列番号７、上記参照）およびＧＦＰリバース３プライマー（配列番号８、上記参照）を用いた配列分析に使用した。Ａ５４９、ＨＣＴ１１６およびＰＡＮＣ１における細胞はＴＡＧ→ＴＧＧ（順方向）またはＣＴＡ→ＣＣＡ（逆方向）からはバックグラウンドレベルを超える有意なシフトは検出できなかったが、ＳＮＵ－４４９細胞ではＡＤＡＲ５６－２およびＡＤＡＲ５９－２オリゴヌクレオチドでいくらかのシフトが見られた（データは示さず）。バックグラウンドをはるかに上回る明確な結果が、ＳＮＵ－４７５細胞およびＭＣＦ７細胞で得られた。図７は、配列決定においてフォワード（ＦＷＤ）およびリバース（ＲＥＶ）プライマーを用いたＳＮＵ－４７５（肝臓癌）細胞上の４つのオリゴヌクレオチドによる結果を示す。図８は、配列決定においてフォワード（ＦＷＤ）プライマーを用いたＭＣＦ７（乳癌）細胞上の４つのオリゴヌクレオチドによる結果を示す。これらの図は、標的位置における配列のとても明らかで有意なシフトを示したが、ここで内在性ＡＤＡＲによるＲＮＡ編集が４つ全てのオリゴヌクレオチドを用いたＳＮＵ－４７５細胞において観察された一方で、ＡＤＡＲ５９－２はＭＣＦ７において最良の結果を提供したように見える。図９は、ＡＤＡＲ５７－２使用後のシーケンス結果を提供する（図７の左下も参照）が、標的アデノシン（矢印）でのみ脱アミノ化が行われた一方で、周囲のアデノシンで無作為編集が行われておらず、本発明のＡＯＮと方法が非常に部位特異的な編集を保証することを示している。これらの結果は、本発明の発明者らが、標的配列およびＲＮＡ編集誘導性オリゴヌクレオチド（特定の修飾を有する）が導入された細胞において、ＲＮＡ編集酵素を過剰発現する必要なしに、すなわち内在性ＡＤＡＲタンパク質の酵素活性に依存することによって、部位特異的な様式で（すなわち、ＡＯＮによって標的化されたＲＮＡ配列内のただ１つのアデノシンが編集された；図９参照）、ＲＮＡ編集を達成したことを示す。

[実施例６]
内在性ＡＤＡＲによる内在性標的へのＲＮＡ編集
実施例５に概説したように内在性ＡＤＡＲ酵素を使用してＲＮＡ編集を達成した後、標的配列の同時トランスフェクションを使用せずに内在性ＡＤＡＲ酵素を使用したＲＮＡ編集もまた達成可能であるか否かを調べた。本発明の発明者らは、その比較的高い存在量および普遍的な発現のために、内在性標的として小核リボ核タンパク質ポリペプチドＡ（Ｓｎｒｐａ）を選択した。この遺伝子は、Ｕ１小核リボ核タンパク質のステムループＩＩと会合するタンパク質をコードし、これは前駆体ｍＲＮＡの５’スプライス部位に結合し、そしてスプライシングに必要とされる。ＡＯＮは、マウスＳｎｒｐａ ｍＲＮＡの野生型終止コドン（ＵＡＧ）を編集するように設計されており、これはその後、オープンリーディングフレームおよび下流の配列によってコードされる拡大タンパク質の伸長をもたらす可能性がある（図１１）。

まずＡＤＡＲ８７－１およびＡＤＡＲ８９－１（表２参照）の２つのＡＯＮが設計され、Ｃ５７／Ｌマウスで発生したＢＷ７７５６マウス肝癌由来の細胞株であるＨｅｐａ １－６細胞において試験された。通常の培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）中の２０００００細胞／ウェルのトランスフェクションの２４時間前に、細胞を６ウェルプレートにプレーティングした。２４時間後、細胞をトランスフェクトしなかった（ＮＴ対照およびＡＯＮ単独）か、または製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡＤＡＲ２の短いアイソフォームをコードする１０００ｎｇのプラスミド（ＡＤＡＲ２ｓｈ）でトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を添加する前に培地を交換し、ウェル中で培地をトランスフェクションなしでリフレッシュさせた。再度の２４時間後、細胞を再びトランスフェクトしなかった（ＮＴ対照）か、あるいはウェルあたり最終濃度１００ｎＭ ＡＯＮのＡＤＡＲ８７－１またはＡＤＡＲ８９－１を用いた。トランスフェクションの前に培地をリフレッシュさせた。

細胞を２回目のトランスフェクション後（またはＡＯＮ単独の場合は単一のトランスフェクション後）、３７℃で４８時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解のために４００μｌのＴｒｉｚｏｌを各ウェルに添加した。次いで、Ｔｒｉｚｏｌを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに回収し、製造業者によって提供された取扱説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｏ）を用いてＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡ濃度を測定し、Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡ合成に５００ｎｇのＲＮＡを使用した。第一段階において、１．２μｌ（２μＭ）の部分的に相補的なセンスオリゴヌクレオチドｍＳｎｒｐａ－ＳＯＮ３と共にインキュベートすることによって、ＡＯＮを標的ｍＲＮＡから解離させた：

５’－Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊ＵＵＧＣＣＡＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＵＵＵＵＣＣＵＣＣＣＡＵＧＣＣＵＡＣＵＣＣ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ－３’（配列番号２０）

ｍＳｎｒｐａ－ＳＯＮ３の星印は、ヌクレオシド間ホスホロチオエート連結を示す。このオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル化されている。製造業者のプロトコルを使用してｃＤＮＡ合成を実行した。フォワードプライマーＦｗ１＿ｍＳＮＲＰＡ ５’－ＧＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡ－３’（配列番号２１）およびリバースプライマーＲｅｖ１＿ｍＳＮＲＰＡ ５’－ＡＣＡＣＡＣＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴ－３’（配列番号２２）を用い、当業者に一般的に公知の方法を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒで確認し、Ｎｕｃｌｅｏ－Ｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製し、精製した産物をシークエンシングプライマーＳｎｒｐ－１－Ｆｗ１ ５’－ＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴ－３’（配列番号２３）を用いて配列決定した。

ＡＤＡＲ８７－１を使用した場合、バックグラウンドを超える編集は観察されなかった（データは示さず）。ＡＤＡＲ８９－１オリゴヌクレオチドによるＲＮＡ編集の結果を図１２に示す。パネル（Ａ）は、終止コドン位置（矢印で示す）で検出可能なＲＮＡ編集が全く無い非トランスフェクト（non-transfected；ＮＴ）対照を示す。パネル（Ｂ）は、ＡＤＡＲ２の短いアイソフォームをコードするプラスミドのみをトランスフェクトした対照を示す。パネル（Ｃ）は、矢印で示されるＧピークの上昇を示す。明らかにバックグラウンドを超えるこの増加は、ＡＤＡＲ２過剰発現プラスミドでトランスフェクトされなかった細胞において、（Ａ－＞Ｉ）ＲＮＡ編集が、ＡＤＡＲ８９－１ ＡＯＮのみによるトランスフェクション後に、所望の位置で行われたことを示す。パネル（Ｄ）は、ＡＤＡＲｓｈ発現プラスミドとＡＯＮの両方を用いた陽性対照を示す。この結果（パネルＣ）は、ＡＤＡＲ過剰発現の非存在下でかつ標的ＲＮＡの過剰発現を引き起こすプラスミドの同時トランスフェクションなしに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによって誘導ＲＮＡ編集が特異的に所望の位置で観察されたこれまでで最初の例であると考えられる。

ＡＤＡＲ８９－２およびＡＤＡＲ９４－１の２つのさらなるオリゴヌクレオチドを設計した（表２参照）：中央トリプレットＣＣＡ（真ん中のヌクレオチドＣは編集されるアデノシンの反対側である）はＤＮＡであり、残りのオリゴヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾である。ＡＤＡＲ８９－２の配列はＡＤＡＲ８９－１と同一であるが、ＡＤＡＲ９４－１の配列はＡＤＡＲ８９－２と比較してさらなる２つのミスマッチがある（図１２参照）。これらのＡＯＮを、Ｈｅｐａ １－６細胞において、この上の実施例に記載されているものと同じアッセイで試験した。得られた配列決定データを図１３に示すが、これは非トランスフェクト対照（ＮＣＴＲＬ）についてＲＮＡ編集が検出されないことを示す。オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ８９－２の配列決定データは、矢印で示す編集部位にＧヌクレオチドが存在することを示しており、これは中央トリプレットがＤＮＡ（ＲＮＡではなく）である場合にも良好な編集が得られることを示している。ヌクレアーゼにとても敏感な中央トリプレットＲＮＡヌクレオチドをＤＮＡで置き換えると、ＡＯＮの安定性が増す。オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ９４－１のＧピークのシグナルの明らかな上昇は、ＡＤＡＲ８９－２の配列の１０位と１４位にさらなる２つのミスマッチを挿入すると、内在性ＳｎｒｐａプレｍＲＮＡの編集にさらに好ましい効果があることを示しているが、これもまた、さらなるバルジ、ミスマッチおよび／またはゆらぎがＲＮＡ編集効率（全ての異なる標的において、配列、ＡＯＮ－ＲＮＡらせんの融解温度、重複、二次構造などの要因の多様性に依存する可能性が非常に高い）をさらに上昇させることができることを示す。

[実施例７]
ＢＤＮＦをコードするＲＮＡにおけるＶａｌ６６Ｍｅｔ変異を修復するためのＲＮＡ編集
一本鎖ＲＮＡ編集誘導オリゴヌクレオチドの設計は、様々なＲＮＡ標的ならびに変異を含むそのような標的に関連する様々な疾患および障害に使用することができる。最近確認されたアルツハイマー病の潜在的な標的の１つは、ＧからＡへの変異によってもまた引き起こされる脳由来神経栄養因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor；ＢＤＮＦ）Ｖａｌ６６Ｍｅｔ多型である（Boots et al. Neurology May 30, 2017. Vol 88(22):2098-2106）。本明細書に開示されるＡＯＮは、特定のＢＤＮＦ ｍＲＮＡ位置でＲＮＡを編集するために使用される。そのような目的に使用されるＡＯＮは、以下の配列を有する（ＢＤＮＦ標的配列である下鎖（配列番号３５）およびオリゴヌクレオチドを表す上鎖）。修飾は、２’－Ｏ－メチル（小文字）、ＤＮＡ（大文字）、ホスホロチオエート連結（星印）、ならびにミスマッチおよびゆらぎ（下線）である。標的アデノシンは太字で示される。

ＢＤＮＦ ＡＯＮ１（配列番号３６）

ＢＤＮＦ ＡＯＮ２（配列番号３７）

ＢＤＮＦ ＡＯＮ３（配列番号３８）

本発明は、単なる例示として上記で説明されており、本発明の範囲および本質内から逸
脱することなく変更がなされ得ることが理解されると予想される。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミ
ノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるアンチセンス
オリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって：
ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯ
Ｎは、任意選択で、前記相補的標的ＲＮＡ領域と１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎお
よび／またはバルジを含み；
ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含
み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボ
ースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成
することができる部分を含まず；
ｄ）前記ＡＯＮは、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン修飾を含まず；
ｅ）前記ＡＯＮは、５’末端アミノ修飾を含まず；
ｆ）前記ＡＯＮは、ＳＮＡＰタグドメインに共有結合していない、ＡＯＮ。
［２］
細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミ
ノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮであっ
て：
ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯ
Ｎは、任意選択で、前記相補的標的ＲＮＡ領域と１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎお
よび／またはバルジを含み；
ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含
み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボ
ースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成
することができる部分を含まず；
ｄ）前記ＡＯＮは、１７ｍｅｒまたは２０ｍｅｒではない、ＡＯＮ。
［３］
細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミ
ノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮであっ
て：
ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯ
Ｎは、任意選択で、前記相補的標的ＲＮＡ領域と１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎお
よび／またはバルジを含み；
ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含
み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボ
ースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成
することができる部分を含まず；
ｄ）前記ＡＯＮは、１７ヌクレオチドより長いか、または１４ヌクレオチドより短い、Ａ
ＯＮ。
［４］
細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミ
ノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮであっ
て：
ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり；
ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含
み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボ
ースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成
することができる部分を含まず；
ｄ）前記ＡＯＮは、任意選択で、前記相補的標的ＲＮＡ領域との１、２、３、４、５、６
、７、８、９または１０個のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含む、ＡＯＮ。
［５］
前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドが、シチジン、デオキシシチジン、ウ
リジン、またはデオキシウリジンである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
［６］
前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドからすぐ５’および／または３’にあ
るヌクレオチドが、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシ
リボースを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
［７］
前記ＡＯＮ中の他の全てのヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキル基、好ましくは２’－
Ｏ－メチル基を含む、請求項５または６に記載のＡＯＮ。
［８］
少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載
のＡＯＮ。
［９］
前記ＡＯＮの５’末端および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチ
ドが、ホスホロチオエート連結で結合している、請求項８に記載のＡＯＮ。
［１０］
５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で結合して
いる、請求項９に記載のＡＯＮ。
［１１］
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長い、請求項
１～１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
［１２］
１００ヌクレオチドより短い、好ましくは６０ヌクレオチドより短い、請求項１～１１
のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
［１３］
１８～７０ヌクレオチド、好ましくは１８～６０ヌクレオチド、より好ましくは１８～
５０ヌクレオチドを含む、請求項１１または１２に記載のＡＯＮ。
［１４］
請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＯＮおよび医薬的に許容される担体を含む医
薬組成物。
［１５］
遺伝的障害の治療または予防における使用のための請求項１～１３のいずれかに記載の
ＡＯＮであって、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アル
ファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮
症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル（Cadasil）症候群、シャル
コー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、
遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型（Duchenne/Becker）筋
ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン
関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病（Gaucher's Dise
ase）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス
（Hereditary Hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（
ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レーバ
ー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖
症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニー
マン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症
候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病（Primary Ciliary Disease）、プ
ロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網
膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血
、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫
不全、および癌からなる群から選択される、ＡＯＮ。
［１６］
遺伝的障害の治療または予防のための薬剤の製造における請求項１～１３のいずれか一
項に記載のＡＯＮの使用であって、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハー
ラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツ
ハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シ
ャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症
（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表
皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラ
クトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性
ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝
性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、
マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型および
ＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連
がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病、プロ
トロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜
色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、
脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不
全、および癌からなる群から選択される、ＡＯＮの使用。
［１７］
細胞内の標的ＲＮＡに存在する少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための
方法であって：
（ｉ）請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；
（ｉｉ）前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；
（ｉｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡにアニーリングさせるステップ；
（ｉｖ）野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含むＡＤＡＲ酵素
により、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ
；および
（ｖ）任意選択で、前記標的ＲＮＡ中の前記イノシンの存在を同定するステップ
を含む方法。
［１８］
ステップ（ｖ）が：
ａ）前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ；
ｂ）脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前
記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型の
タンパク質の存在を評価するステップ；
ｃ）両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＡＡ終止コ
ドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／ま
たは野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｄ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステ
ップ；または
ｅ）機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的Ｒ
ＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、
ステップ
を含む、請求項１７に記載の方法。
［１９］
前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、Ｃ
ＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１
－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；もしくは１０９６Ｇ＞Ａ変異
を編集するため）、ＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）、ＢＤＮＦ（
例えば、ＲＮＡレベルでＶａｌ６６Ｍｅｔ変異を修復するため）をコードするか、または
前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（
Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＡＯＮまた
は方法。

Claims (20)

1. 細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって：
   ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯＮは、前記相補的標的ＲＮＡ領域と１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含み；
   ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
   ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；
   ｄ）前記ＡＯＮは、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン修飾を含まず；
   ｅ）前記ＡＯＮは、５’末端アミノ修飾を含まず；
   ｆ）前記ＡＯＮは、ＳＮＡＰタグドメインに共有結合していない、ＡＯＮ。
2. 細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮであって：
   ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯＮは、前記相補的標的ＲＮＡ領域と１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含み；
   ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
   ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；
   ｄ）前記ＡＯＮは、１７ｍｅｒまたは２０ｍｅｒではない、ＡＯＮ。
3. 細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮであって：
   ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、前記ＡＯＮは、前記相補的標的ＲＮＡ領域と１つまたは複数のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含み；
   ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
   ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；
   ｄ）前記ＡＯＮは、１７ヌクレオチドより長いか、または１４ヌクレオチドより短い、ＡＯＮ。
4. 細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ中に存在する標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内で標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮであって：
   ａ）前記ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり；
   ｂ）前記ＡＯＮは、１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含み、ただし、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’－ＯＨ基を有するリボースまたは２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み；
   ｃ）前記ＡＯＮは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まず；
   ｄ）前記ＡＯＮは、前記相補的標的ＲＮＡ領域との１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のミスマッチ、ゆらぎおよび／またはバルジを含む、ＡＯＮ。
5. 前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドが、シチジン、デオキシシチジン、ウリジン、またはデオキシウリジンである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
6. 前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドからすぐ５’および／または３’にあるヌクレオチドが、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
7. 前記ＡＯＮ中の他の全てのヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキル基、好ましくは２’－Ｏ－メチル基を含む、請求項５または６に記載のＡＯＮ。
8. 少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
9. 前記ＡＯＮの５’末端および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で結合している、請求項８に記載のＡＯＮ。
10. ５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で結合している、請求項９に記載のＡＯＮ。
11. １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長い、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
12. １００ヌクレオチドより短い、好ましくは６０ヌクレオチドより短い、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
13. １８～７０ヌクレオチド、好ましくは１８～６０ヌクレオチド、より好ましくは１８～５０ヌクレオチドを含む、請求項１１または１２に記載のＡＯＮ。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＯＮおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
15. 遺伝的障害の治療または予防用の、請求項１～１３のいずれかに記載のＡＯＮを含む医薬組成物であって、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル（Cadasil）症候群、シャルコー・マリー・トゥース（Charcot-Marie-Tooth）病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型（Duchenne/Becker）筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病（Gaucher's Disease）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス（Hereditary Hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病（Primary Ciliary Disease）、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、および癌からなる群から選択される、医薬組成物。
16. 遺伝的障害の治療または予防のための薬剤の製造における請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＯＮの使用であって、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病タイプＡ、ＢおよびＣ、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性繊毛病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異のようなプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、および癌からなる群から選択される、ＡＯＮの使用。
17. 細胞内の標的ＲＮＡに存在する少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞をエクスビボで処理する方法であって：
    （ｉ）請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；
    （ｉｉ）前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；
    （ｉｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡにアニーリングさせるステップ；
    （ｉｖ）野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含むＡＤＡＲ酵素により、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ；および
    （ｖ）任意選択で、前記標的ＲＮＡ中の前記イノシンの存在を同定するステップ
    を含む方法。
18. ステップ（ｖ）が：
    ａ）前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ；
    ｂ）脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
    ｃ）両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されるＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
    ｄ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または
    ｅ）機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、
    ステップ
    を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；もしくは１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）、ＢＤＮＦ（例えば、ＲＮＡレベルでＶａｌ６６Ｍｅｔ変異を修復するため）をコードするか、または前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
20. 前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；もしくは１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、ＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）、ＢＤＮＦ（例えば、ＲＮＡレベルでＶａｌ６６Ｍｅｔ変異を修復するため）をコードするか、または前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）、請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
    

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