CN114514318A

CN114514318A - 寡核苷酸和靶rna的位点特异性编辑方法

Info

Publication number: CN114514318A
Application number: CN202080067219.7A
Authority: CN
Inventors: 福田将虎
Original assignee: Fukuoka University
Current assignee: FORRESTER
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-05-17
Also published as: EP4036230A1; EP4036230A4; US20220325281A1; WO2021060527A1; JPWO2021060527A1

Abstract

提供一种寡核苷酸，能够诱导腺苷脱氨酶1特异性编辑活性。该寡核苷酸用于诱导对靶RNA的位点特异性编辑，包括：确定靶RNA的第一寡核苷酸；和连接到所述第一寡核苷酸5’侧的第二寡核苷酸。第一寡核苷酸由以下组成：靶RNA中的腺苷残基对应的靶对应核苷酸残基；10至24个残基的寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的3’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列；以及3至6个残基的寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的5’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列。第二寡核苷酸的残基数为2至10，与靶RNA形成互补链，互补链包含至少一个错配碱基。

Description

寡核苷酸和靶RNA的位点特异性编辑方法

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸和靶RNA的位点特异性编辑方法。

背景技术

以基因组编辑技术的开发为契机，一种通过修饰作为生物体设计图的遗传信息，也就是细胞中的DNA信息来控制生命现象的方法，开始作为一种疾病治疗手段用于医疗和药物研发领域。由于DNA是细胞中恒定不变的分子，因此DNA修饰效果会永久存留在对象细胞或对象生物中。另一方面，RNA是一种瞬时遗传信息分子。因此，对RNA信息进行修饰可以赋予对象生物一种暂时性的而非永久性的遗传信息修饰效果。

作为RNA修饰技术，例如，国际公开号第2016/097212号中公开了一种寡核苷酸构建体，用于对靶RNA序列中的核苷酸进行位点特异性编辑，该寡核苷酸构建体包括：靶向部分，其包含与靶RNA的一部分互补的反义序列；以及募集部分，其存在于细胞中，并且可以与能够进行核苷酸编辑的RNA编辑实体相结合来进行募集。再如，国际公开号第2017/010556号中公开了一种导入位点特异性RNA突变的方法，是将双链特异性腺苷脱氨酶(ADAR)作用于靶RNA和靶编辑导向RNA的复合物。

作为具有RNA编辑活性的腺苷脱氨酶，已知的有ADAR1和ADAR2的同工型，这些被认为是活体内一种细胞类特异性的表达。例如，据研究ADAR1几乎不出现在人类骨骼肌细胞中。另一方面，据研究ADAR2几乎不出现在人类骨髄细胞中。此外，一般认为在人类细胞内出现更多的是ADAR1。

发明内容

发明要解决的问题

可以认为，如果可以诱导同工型特异的ADAR1的编辑活性，则能够对细胞类特异的RNA进行编辑。而且，能够在人类细胞中进行更高效的RNA编辑。因此，本发明的一个目的在于提供一种可以诱导ADAR1特异性编辑活性的寡核苷酸。

解决问题的方案

用于解决所述问题的具体方案如下所述，本发明包括以下方面。第一方面是一种寡核苷酸，用于诱导对靶RNA的位点特异性编辑，该寡核苷酸包括：确定靶RNA的第一寡核苷酸；以及连接到第一寡核苷酸5’侧的第二寡核苷酸。第一寡核苷酸由以下组成：靶RNA中的腺苷残基对应的靶对应核苷酸残基；10至24个残基的寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的3’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列；以及3至6个残基的寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的5’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列。第二寡核苷酸的残基数为2至10，与靶RNA形成互补链。第二寡核苷酸形成的互补链包含至少一个错配碱基。

第二方面是一种靶RNA的位点特异性编辑方法，包括：在存在腺苷脱氨酶1的情况下，使所述寡核苷酸和靶RNA进行接触。

发明效果

根据本发明，可以提供一种能够诱导ADAR1特异性编辑活性的寡核苷酸。

附图说明

图1为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图2为示出了靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

图3为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图4为示出了靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

图5A为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图5B为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图6为示出了靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

图7为示出了靶RNA在培养细胞中的编辑解析结果的图。

图8为示出了由培养细胞中的靶RNA编辑引起的发光强度变化的图。

图9为示出了靶RNA在培养细胞中的编辑解析结果的图。

图10为示出了由培养细胞中的靶RNA编辑引起的发光强度变化的图。

图11A为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图11B为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图12为示出了各种靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

图13A为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图13B为示出了由靶RNA和靶编辑导向RNA组成的复合物的示意图。

图14为示出了靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

图15为示出了靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

图16为示出了靶RNA在体外的编辑解析结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。但是，以下所示的实施方式用于具现化本发明的技术思想，并示意性地示出了寡核苷酸，本发明并不限于以下所示的寡核苷酸。

靶编辑导向RNA

用于诱导对靶RNA的位点特异性编辑的寡核苷酸(以下，也称靶编辑导向RNA)，包括：确定靶RNA的第一寡核苷酸；以及连接到第一寡核苷酸5’侧的第二寡核苷酸。第一寡核苷酸由以下组成：靶RNA中的腺苷残基对应的靶对应核苷酸残基；10至24个残基的寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的3’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列；以及3至6个残基的寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的5’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列。第二寡核苷酸的残基数为2至10，与靶RNA形成互补链，互补链包含至少一个错配碱基。

在确定靶RNA的第一寡核苷酸5’侧，寡核苷酸可以特异性地诱导ADAR1的编辑活性，该寡核苷酸包含短链第二寡核苷酸，该短链第二寡核苷酸能够与靶RNA形成包含至少一个错配碱基的互补链。可以认为这是因为，例如，错配碱基的存在有利于ADAR1的募集，但会阻碍ADAR2的募集。

在本实施方式的靶编辑导向RNA中，与传统型靶编辑导向RNA相比，长度较短，因此简单地降低了制造成本。此外，由于易于进行化学合成，因此除通过基因表达将靶编辑导向RNA导入细胞中的方法以外，将化学合成的靶编辑导向RNA直接导入细胞的方法也容易实现。与此同时，还可以将核酸药物开发等中使用的现有人工核酸等应用于靶编辑导向RNA。进而，通过提高细胞内分解耐性，提高细胞导入效率等，能够提供更高功能的靶编辑导向RNA。进一步地，靶编辑导向RNA由编辑诱导所需要的最少数量的残基构成，从而能够在保持对靶RNA的特异性的同时，抑制作为编辑靶的腺苷残基以外的位置处的脱靶编辑。

靶编辑导向RNA例如通过将催化靶编辑的ADAR中的ADAR1特异性地募集到靶RNA中，从而诱导对靶RNA的位点特异性编辑。ADAR是一种通过水解脱氨基反应，将双链RNA中的腺苷残基转化为肌苷残基的酶，广泛存在于哺乳动物的细胞中。由于肌苷残基的结构与鸟苷残基相似，因此在翻译RNA信息时将肌苷残基翻译为鸟苷残基，从而对RNA信息进行编辑。若在编码氨基酸的部分发生这样的RNA编辑，则即使基因组上没有DNA突变，也会发生氨基酸取代等，能够控制靶基因的功能。

当靶编辑导向RNA被导入哺乳动物的细胞中时，可以将细胞中存在的ADAR1特异性地募集到靶RNA中，从而能够诱导对靶RNA的位点特异性编辑。

本实施方式的靶编辑导向RNA能够诱导ADAR1特异性编辑活性。ADAR1特异性是指，例如，在体外(in vitro)中，对ADAR1的编辑诱导活性与对ADAR2的编辑诱导活性的比大于1，优选为1.5以上、2以上或者5以上。需要说明的是，对ADAR1和ADAR2的编辑诱导活性是在下述条件下进行评价的，对已知通过腺苷脱氨酶编辑的HTR2C RNA(血清素2C型受体mRNA前体)分别进行编辑反应时，调节ADAR1和ADAR2的浓度，以显示出ADAR1的A位点为大约30％、ADAR2的D位点为大约90％的编辑比例。此外，在In Cell中，利用使用相同表达载体构建的ADAR1表达质粒和ADAR2表达质粒，在相同条件下转染到细胞中进行表达的情况是指，ADAR1对相同靶编辑位点的编辑诱导效率更高的情况。

靶编辑导向RNA包含的第一寡核苷酸确定靶RNA。靶RNA没有特别限制，只要是包含作为编辑对象的腺苷残基即可，可以是细胞性RNA、病毒性RNA中的任一个，通常是编码蛋白质的mRNA前体或mRNA。靶RNA中的编辑位点可以存在于非翻译区域、剪接区域、外显子、内含子，或者影响RNA的稳定性、结构或功能的任一区域。此外，靶RNA还可以包含应该修改或改变的突变。再或者，靶RNA也可以是发生了突变以将其序列编码为与天然型不同的表达型的RNA。

靶RNA优选为编码蛋白质的RNA，被编码的蛋白质具体可以有：血清素受体、谷氨酸受体、膜电位依赖性钾通道、STAT3、NFkBIA、MAPK14等涉及信号传递的磷酸化蛋白质等。

靶编辑导向RNA可以应用于例如遗传性疾病的治疗。遗传性疾病有：囊性纤维化、白皮病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、CADASIL综合征、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker型肌营养不良症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症(Epidermolysis)、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、戈谢病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、血友病、遗传性血色素沉着症、亨特综合征、亨廷顿病、哈勒综合征、炎症性肠病(IBD)、遗传性多聚集综合征、先天性黑蒙症、莱施-尼汉(Lesch-Nyhan)综合征、Lynch综合征、马凡(Marfan)综合征、粘多糖贮积症、肌营养不良症、肌张力型营养不良型I和II、神经纤维瘤病、NieMann-Pick病A、B和C型、NY-eso1相关胰腺癌、帕金森病、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮尿症、庞贝病、原发性睫状体疾病、如凝血酶原G20210A突变等凝血酶原突变相关疾病、肺动脉高压、色素性视网膜炎、桑霍夫(Sandhoff)病、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌萎缩症、Stargardt病、Tay-sachs病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷、各种形式的癌症(例如BRCA1和2相关乳腺癌、卵巢癌等)等。

第一寡核苷酸由以下组成：靶RNA中与作为编辑靶的腺苷残基对应的靶对应核苷酸残基；10至24个残基的3’侧寡核苷酸，其连接到所述靶对应核苷酸残基的3’侧，且具有与靶RNA的相应序列互补的碱基序列；以及3至6个残基的3’侧寡核苷酸，其连接到靶对应核苷酸残基的5’侧，且具有与靶RNA的相应序列互补的碱基序列。与靶对应核苷酸残基的5’侧和3’侧分别连接的寡核苷酸与靶RNA形成双链，整体形成互补链(以下，也称第一互补链)，从而确定靶RNA以及靶RNA中的编辑靶位点。其中，互补的碱基序列中，除了形成Watson-Crick型碱基对的碱基序列，还包含例如形成G-U碱基对等热力学稳定的非Watson-Crick型摆动碱基对的碱基序列。

靶对应核苷酸残基为，与作为编辑靶的腺苷残基对应的核苷酸残基，例如胞苷残基、尿苷残基、腺苷残基或这些残基的衍生物。靶对应核苷酸残基优选为不与作为编辑靶的腺苷残基形成碱基对的碱基，更优选为胞苷残基或其衍生物，进一步优选为胞苷残基。

在第一寡核苷酸中，连接到靶对应核苷酸残基的3’侧，且具有与靶RNA互补的碱基序列的寡核苷酸的残基数为10以上24以下，优选为11以上、12以上或者13以上，还优选为22以下、20以下、18以下、16以下或者15以下。当残基数在所述范围内时，对ADAR1的特异性趋于进一步提高。

在第一寡核苷酸中，与靶对应核苷酸残基的3’侧连接的寡核苷酸可以具有相对于靶RNA不包含错配碱基的互补的碱基序列。在这种情况下，优选的是，靶RNA在作为编辑靶的腺苷残基的5’侧未连接有鸟苷残基。即，在与作为靶RNA编辑靶的腺苷残基的5’侧连接的碱基为腺苷残基、胞苷残基或尿苷残基的情况下，在第一寡核苷酸中，与靶对应核苷酸残基的3’侧连接的寡核苷酸优选具有相对于靶RNA不包含错配碱基的互补的碱基序列。

在第一寡核苷酸中，与靶对应核苷酸残基的3’侧连接的寡核苷酸可以包含与靶RNA的碱基序列非互补的碱基。例如，在作为编辑靶的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基的靶RNA中，编辑诱导活性可能会降低。但即使在这种情况下，也可以通过第一寡核苷酸具有包含与该鸟苷残基非互补的碱基的碱基序列来提高编辑诱导活性。与该鸟苷残基非互补的碱基例如可以为鸟苷残基。即，若靶RNA在作为编辑靶的腺苷残基的5’侧连接有鸟苷残基，则针对该靶RNA的靶编辑导向RNA可以在靶对应核苷酸残基的3’侧连接有鸟苷残基。

在第一寡核苷酸中，与靶对应核苷酸残基的5’侧连接且具有与靶RNA互补的碱基序列的寡核苷酸的残基数为3以上6以下，优选为3以上5以下、3以上4以下或者3。当残基数在所述范围内时，对ADAR1的特异性趋于进一步提高。

第二寡核苷酸与靶RNA形成包含一个以上错配碱基的互补链(以下，也称为第二互补链)。第二寡核苷酸的残基数为2以上10以下或者4以上8以下。第二寡核苷酸的残基数例如为3以上，优选为4以上或者5以上，再例如为10以下，优选为9以下、8以下或者7以下。当残基数在所述范围内时，编辑诱导趋于进一步增强。第二互补链中的错配碱基数例如为3以下，优选为1个。

第二互补链中的错配碱基可以形成错配碱基对，也可以来自于以下核苷酸残基，该核苷酸残基插入到形成完全互补链的靶RNA或者第二寡核苷酸中的至少一个中。错配碱基优选来自于插入到完全互补链中的核苷酸残基，更优选来自于插入到完全互补链的靶RNA侧中的核苷酸残基。这会使得编辑诱导趋于进一步增强。其中，错配碱基对是指，靶RNA和第二寡核苷酸中的对应的2个碱基是不会形成稳定的碱基对的组合。

第二互补链中的错配碱基的位置优选为，由靶RNA和第一寡核苷酸组成的第一互补链的靶RNA的3’侧或者第一寡核苷酸5’侧的第1至第3个残基中的任一个，更优选为第1个残基。

第二互补链中的错配碱基例如可以来自于插入到第1个残基中的核苷酸残基，该第1个残基与形成第一互补链的靶RNA的3’侧连接，也可以是形成于第1个残基的错配碱基对，该第1个残基是形成第一互补链的第一寡核苷酸的5’侧的第1个残基。

靶编辑导向RNA的一个形态是，与靶RNA形成第一互补链的第一寡核苷酸包含：作为靶对应核苷酸残基的胞苷残基；残基数为12至16的寡核苷酸，其具有与靶RNA的碱基序列为互补的碱基序列，且与靶对应核苷酸残基的3’侧连接；以及残基数为3的寡核苷酸，其具有与靶RNA的碱基序列为互补的碱基序列，且与靶对应核苷酸残基的5’侧连接，其中，第二寡核苷酸包含在形成第一互补链的靶RNA的3’侧的第2个残基之后具有互补的碱基序列且残基数为4至8的寡核苷酸。

构成靶编辑导向RNA的核苷酸残基可以是天然型核糖核苷酸残基，也可以是非天然型修饰核苷酸残基。修饰核苷酸残基包含有：修饰核苷之间的磷酸二酯键的残基、修饰核糖的2’羟基的残基、包含分子内交联核糖的残基、修饰嘌呤碱基和嘧啶碱基中的至少一种的残基等。磷酸二酯键部分的修饰的示例有：例如，硫代磷酸化、膦酸甲酯化、硫代膦酸甲酯化、二硫代磷酸酯化、氨基磷酸酯化、肽键取代等。核糖的2’羟基的修饰的示例有：2’-O-甲基化、2’-O-甲氧基乙基化、2’-O-氨基丙基(AP)化、2’-氟化、2’-O-甲基氨基甲酰乙基化、3，3-二甲基烯丙基化、脱氧核糖核苷酸化等。核糖的分子内交联的示例有2’位和4’位交联的核苷酸(2’，4’-BNA)。2’，4’-BNA有：例如，被称为LNA的锁核酸(α-L-亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)BNA或β-D-亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)BNA、被称为ENA的乙氧基(4’-(CH₂)₂-O-2’)BNA)、β-D-硫代(4’-CH₂-S-2’)BNA、氨氧基(4’-CH₂-O-N(R)-2’)BNA(R为H或CH₃)、被称为2’，4’-BNANC的羟氨基(4’-CH₂-N(R)-O-2’)BNA(R为H或CH₃)、2’，4’-BNACOC、3’-氨基-2’，4’-BNA、5’-甲基BNA、被称为cEt-BNA的(4’-CH(CH₃)-O-2’)BNA、被称为cMOE-BNA的(4’-CH(CH₂OCH₃)-O-2’)BNA、被称为AmNA的酰胺型BNA(4’-C(O)-N(R)-2’)BNA(R为H或CH₃)等。碱基部分的修饰的示例有：卤化；烷基化，例如甲基化、乙基化、正丙基化、异丙基化、环丙基化、正丁基化、异丁基化、仲丁基化、叔丁基化、环丁基化等；氢氧化；胺化；脱氨基化；去甲基化等。

靶RNA的位点特异性编辑方法

靶RNA的位点特异性编辑方法包括：在存在腺苷脱氨酶1的情况下，使靶RNA和靶编辑导向RNA进行接触，该靶编辑导向RNA是诱导对靶RNA的位点特异性编辑的寡核苷酸。靶编辑导向RNA与靶RNA形成含错配碱基的双链，通过特异性地募集腺苷脱氨酶1，可以位点特异性地将靶RNA包含的腺苷残基转化为肌苷残基。靶RNA的位点特异性编辑方法可以在体外进行，也可以在体内(in vivo)进行。

靶RNA的位点特异性编辑方法例如可以通过将上述靶编辑导向RNA导入或表达在具有靶RNA的真核细胞中来执行。将靶编辑导向RNA导入真核细胞的方法，可以从核酸药物中使用的各种方法中进行适当选择和应用。此外，通过将能够表达靶编辑导向RNA的质粒等导入真核细胞中，可以在真核细胞中表达靶编辑导向RNA。

通过将使用靶编辑导向RNA的靶RNA的位点特异性编辑方法应用于涉及糖链修饰位点、磷酸化位点、金属配位位点等细胞内蛋白质功能表达的氨基酸突变，能够提供一种暂时控制细胞内蛋白质功能的新方法论。此外，通过普及活体内蛋白质的功能控制方法，该方法基于使用靶编辑导向RNA的靶RNA位点特异性编辑方法，其将成为一项能够对生命科学领域研究的发展做出贡献的分子技术。

目前正在开发一种核酸药物，其利用了siRNA对靶蛋白质表达的抑制，或被称为适体的功能性RNA对靶蛋白质的功能控制。但是，尚未发现一种药物可以转化mRNA的信息，修饰mRNA编码的靶蛋白质的功能。因此，靶编辑导向RNA有望创造出具有前所未有药效的新型核酸药物。

例如，无义突变型遗传性疾病是一种由于基因上的点突变形成的终止密码子而无法合成原始蛋白质而引起的疾病。无义突变型遗传性疾病有：例如，肌营养不良症、多发性硬化症、阿尔茨海默病、神经组织退化、帕金森病等神经性疾病，以及癌症等。例如，通过靶编辑导向RNA编辑UAA、UAG、UGA等终止密码子，从而考虑作为对上述疾病具有前所未有的机制的核酸药物的用途。具体地，例如考虑，可以将作为终止密码子的UAG编辑为作为色氨酸密码子的UIG，从而控制蛋白质合成。

此外，可以得到如下启示，例如，细胞中发挥重要作用的蛋白质大多数都是通过磷酸化/去磷酸化来精密控制其功能的ON/OFF，磷酸化/去磷酸化的异常都会对包括癌症在内的各种疾病产生很大影响。蛋白质的磷酸化位点可以有Tyr、Thr、Ser等。通过靶编辑导向RNA，将编码这些氨基酸的密码子编辑为编码其他氨基酸的密码子，从而能够抑制蛋白质的磷酸化。具体地，例如，通过将作为Tyr密码子的UAC编辑为作为Cys密码子的UIC，能够控制细胞内蛋白质的磷酸化。

在其他方面中，本发明还包括：靶编辑导向RNA在制造用于治疗遗传性疾病的药物组合物中的应用，靶编辑导向RNA在治疗遗传性疾病中的应用，以及用于治疗遗传性疾病的靶编辑导向RNA。治疗对象例如为哺乳动物，哺乳动物包括人类。此外，治疗对象也可以是非人类动物。

实施例

以下，根据实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不限于这些实施例。

腺苷脱氨酶的制备

根据文献(Macbeth,MR.and Bass,BL.Methods Enzymol.424,319-331(2007)，FuKuda,M.et al.Sci.Rep.srep41478(2017))中的描述，使用酵母表达系对重组hADAR2和hADAR1p110进行合成/纯化，从而制备得到腺苷脱氨酶。此外，通过常规方法制备表达hADAR2、hADAR1p110和hADAR1p150的质粒(pYES_A_hADAR2p110、pYES_A_hADAR1p110、pYES_A_hADAR1p150)。

模板靶RNA的制备：Rluc_sRNA的合成

从psiCHECK^TM-2载体(Promega公司)中将通过常规方法转录制备的Rluc_WT RNA(序列编号1)制备为0.2nM。添加重组hADAR2使其最终浓度为1μM，在编辑反应缓冲液(editing reaction buffer)(20mM HEPES-KOH(pH7.5)、2mM MgCl₂、100mM NaCl、0.5mMDTT、0.01％TritonX-100、5％甘油(glycerol))中，在37℃下温育2小时，进行体外编辑反应。

通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀对编辑反应后的Rluc_WT RNA进行了纯化。接着，使用Primescript逆转录酶(Reverse Transcriptase)II(TaKaRa)，通过Rluc_WT_BamR01引物(序列编号2)合成了cDNA。之后，使用Rluc_WT_EcoF01引物(序列编号3)、Rluc_WT_BamR01引物(序列编号2)和PrimeStar GXL DNA聚合酶(Polymerase)(TaKaRa)，通过PCR(30个循环；变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃，60秒)扩增了cDNA。接着，将得到的cDNA作为插入DNA，并按照如下所述方式，克隆到pUC19质粒中。使用EcoRI(TaKaRa)和BamHI(TaKaRa)，在37℃下对插入DNA和pUC19质粒进行了1小时的限制性酶切之后，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，对各自的DNA进行了纯化。将限制性酶切后的pUC19质粒和插入DNA以1：3的摩尔比进行混合，使用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit)＜Mighty Mix＞(TaKaRa)进行了连接反应。将得到的连接样品转型为DH5α，并使用LB琼脂板，在37℃下培养过夜之后，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取了质粒。对得到的质粒DNA进行碱基序列解析，得到了Rluc_WT的A122突变为G的序列(Rluc_K41R)和克隆了Rluc_K41R的质粒DNA(pUC19-Rluc_K41R)。

以pUC19-Rluc_K41R为模板，通过PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，使用Rluc_NheF01引物(序列编号4)和RL_W104X_RV引物(序列编号5)对5’侧片段进行了第一次(1st)PCR，使用Rluc_XhoR01引物(序列编号6)和RL_W104X_FW引物(序列编号7)对3’侧片段进行了第一次PCR(30个循环；变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃，40秒)。接下来，将各自的PCR产物稀释100倍，使用Rluc_NheF01引物和Rluc_XhoR01引物，通过PrimeStar GXLDNA聚合酶(TaKaRa)，进行第二次PCR(30个循环；变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃，60秒)，并通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化，得到了具有将Rluc_K41R的G311突变为A的序列的DNA(Rluc_K41R_W104X)(序列编号10)。

使用NheI(TaKaRa)和XhoI(TaKaRa)，在37℃下对得到的DNA(Rluc_K41R_W104X)和psiCHECK^TM-2载体(Vector)(promega)进行1小时的限制性酶切之后，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，对各自的DNA进行了纯化。将限制性酶切后的Rluc_K41R_W104X和psiCHECK^TM-2载体以3：1的摩尔比进行混合，使用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit)＜Mighty Mix＞(TaKaRa)进行了连接反应。将得到的连接样品转型为DH5α，使用LB琼脂板，在37℃下培养过夜。在LB液体培养基中，将选出的菌落在37℃下培养过夜，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取了质粒。之后，确认了通过碱基序列解析得到的质粒的序列。

以确认了序列的质粒为模板，使用T7_Rluc_sRNA_F01引物(序列编号8)、Rluc_sRNA_R01引物(序列编号9)和PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(30个循环(变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃，20秒))，扩增用于体外转录反应的模板DNA，并通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行了纯化。使用AmpliScribe T7试剂盒(EpicentreBiotechnologies)，进行体外转录得到了Rluc_sRNA(序列编号11)。使用含8M尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶，将合成后的Rluc_sRNA切下并进行纯化，用于后续试验。

以下示出了Rluc_WT_RNA、Rluc_K41R_W104X和Rluc_sRNA的序列，以及上述使用的引物的序列。需要说明的是，表中的下划线表示编辑靶的腺苷残基。

表1

表2

表3

(实施例1)

通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1-gRNA01(序列编号12)、AD1-gRNA03(序列编号13)和AD1-gRNA04(序列编号14)，作为对模板靶RNA(Rluc_sRNA)的靶编辑导向RNA(以下，有时记为gRNA)。

表4

	序列	序列编号
			AD1-gRNA01	CAGCUCAACCAAGCGGUGAGGUACUUG	12
AD1-gRNA03	CAGCUCAACCAAGCGGUGAGGUAC	13
			AD1-gRNA04	CAGCAGCUCAACCAAGCGGUGAGGUAC	14

(参考例1)

基于国际公开号第2017/010556号中的描述，制备了在下方示出了序列的5’ASAD-gRNA(序列编号15；以下有时省略为5’AS)和3’AS AD-gRNA(序列编号16；以下有时省略为3’AS)，作为对于模板靶RNA(Rluc_sRNA)的靶编辑导向RNA。同时还通过常规方法制备了具有5’AS和3’AS中的反义区域(ASR)的序列的寡核糖核苷酸(以下，5’ASR：序列编号17；3’ASR：序列编号18)。

表5

在图1中示出了，表示由模板靶RNA和AD1-gRNA01等形成的复合物的概念图。如图1所述，在复合物中，与编辑靶的腺嘌呤残基(A)对应的gRNA的残基为胞苷残基(C)，由此形成了错配碱基对。此外，从模板靶RNA的编辑靶的腺嘌呤残基到3’侧的第4个残基的胞苷残基没有对应的gRNA侧的残基，呈现一种错配碱基插入到模板靶RNA中的状态。

编辑诱导活性的评价

使用上述制备的靶编辑导向RNA，按照如下所述的方式评价了编辑诱导活性。

退火反应

将0.3μM的Rluc_sRNA、0.9μM的实施例1和参考例1的gRNA，在退火缓冲液(10mMTri-HCl(pH7.6)，150mM NaCl)中，在80℃下加热3min，经15min冷却至25℃。

体外编辑反应

假设通过退火反应，Rluc_sRNA与gRNA完全形成了复合物，则计算以下的Rluc_sRNA-gRNA复合物浓度。在编辑反应缓冲液(editing reaction buffer)(20mM HEPES-KOH(pH7.5)，2mM MgCl₂，100mM NaCl，0.5mM DTT，0.01％TritonX-100，5％甘油(glycerol))中，向5nMRluc_sRNA-gRNA复合物中添加12.5nM重组hADAR2或250nM重组hADAR1，在37℃下温育1小时，进行了编辑反应。需要说明的是，在对已知由hADAR2和hADAR1编辑的HTR2C RNA(血清素2C型受体mRNA前体)分别进行编辑反应时，调节hADAR2和hADAR1的浓度以使它们各自显示相同程度的编辑比例。

编辑解析

通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀对编辑反应后的Rluc_sRNA进行纯化，并使用Primescript逆转录酶II(TaKaRa)，通过Rluc_sRNA_R0l引物(序列编号9)合成了cDNA。之后，使用Rluc_sRNA_F01引物(序列编号19)、Rluc_sRNA_R01引物(序列编号9)以及PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)，通过PCR(变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃，20秒)，扩增了cDNA。所得到的cDNA的序列解析是使用Rluc_sRNA_F01引物(序列编号19)和Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Cycle Sequence Kit)进行测序反应，并通过Applied Biosystem 3500基因分析仪(Genetic Analyzer)(Thermo FisherScientific)进行解析的。根据测序得到的色谱图，由靶位点(A311)的峰高比(G/(G+A))计算出了编辑比例(％)。结果在图2中示出。此外，由得到的编辑比例，计算出了hADAR2的编辑比例与hADAR1的编辑比例的比。结果在表7中示出。

表6

引物	序列	序列编号
			Rluc_sRNA_F01	GCTGGACTCCTTCATCAAC	19
Rluc_sRNA_R01	CCAGTCGTGGCCCAC从AG	9

表7

与现有的靶编辑导向RNA(5’AS，3’AS)相比，AD1-gRNA相对于hADAR1显示出了相同程度的编辑诱导活性。此外，AD1-gRNA相对于hADAR1显示出了特异性编辑诱导活性。

(实施例2)

通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1-gRNA03.1(序列编号20)、AD1-gRNA03.2(序列编号21)、ADl-gRNA03.3(序列编号22)和ADl-gRNA03.4(序列编号23)，作为对模板靶RNA(Rluc_sRNA)的靶编辑导向RNA。

表8

	序列	序列编号
			AD1-gRNA03.1	CUCAACCAAGCGGUGAGGUAC	20
AD1-gRNA03.2	GCAGCUCAACCAAGCGGUGAGGUAC	21
			AD1-gRNA03.3	CAGCAGCUCAACCAAGCGGUGAGGUAC	22
AD1-gRNA03.4	GUUCAGCAGCUCAACCAAGCGGUGAGGUAC	23

在图3中示出了，表示由模板靶RNA和AD1-gRNA03等形成的复合物的概念图。

编辑诱导活性的评价

对于得到的寡核糖核苷酸，用与上述相同的方式评价了编辑诱导活性。结果在图4和表9中示出。需要说明的是，由于使用了与上述不同批量的hADAR1，因此编辑反应所用的hADAR1和hADAR2的浓度与实施例1不同。

表9

可以看出，编辑诱导活性和特异性根据靶编辑导向RNA中的第二寡核苷酸的残基数而变化。

(实施例3)

用与上述相同的方式制备了模板靶RNA，其中，模板靶RNA中的错配碱基改为了A、U和G，而不是C。此外，还通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1-gRNA03Gm(序列编号24)。

表10

	序列	序列编号
			AD1-gRNA03Gm	CAGCUCGAACC从GCGGUGAGGUAC	24

在图5A和图5B中示出了，由改变了错配碱基的模板靶RNA和ADl-gRNA03形成的复合物，以及由模板靶RNA和AD1-gRNA03Gm形成的复合物的概念图。如图5B所示，在由模板靶RNA和AD1-gRNA03Gm形成的复合物中，不存在除编辑靶以外的错配碱基。

编辑诱导活性的评价

用与上述相同的方式评价了AD1-gRNA03对改变了错配碱基的模板靶RNA的编辑诱导活性，以及AD1-gRNA03Gm对模板靶RNA的编辑诱导活性。结果在图6和表11中示出。

表11

错配碱基的种类在一定程度上影响了对hADAR1的特异性编辑诱导活性。此外，在不存在错配碱基的AD1-gRNA03Gm中，对hADAR1的特异性降低了。

(实施例4)对培养细胞中的编辑诱导活性的评价1

按照如下所述的方式，构建了表达hADAR1p110的质粒pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110。此外，用相同的方式构建了表达ADAR2的质粒pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2。

以pYES/NT_A_ADAR1p110为模板，使用0.3μM HisADAR2_XbaF01引物(序列编号25)和0.3μM ADAR1-cMyc-lstR01引物(序列编号26)，在延伸反应3分钟的条件下进行了第一次PCR。以稀释了100倍的第一次PCR产物为模板，使用0.3μM HisADAR2_XbaF01引物(序列编号25)和0.3μM cMyc_2nd_HindR01引物(序列编号27)，在延伸反应3分钟的条件下进行了第二次PCR，扩增了插入DNA。使用XbaI和HindIII，在37℃下对插入DNA和pcDNA3.1(-)Hygro进行了1小时酶促反应。通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化之后，向20μL的E.coli DH5α感受态细胞(TaKaRa)中添加2μL，进行转型，在LB氨苄青霉素琼脂培养基中培养过夜。以产生的菌落为模板，使用0.3μM T7proGGG引物(序列编号28)和0.3μM BGH反向引物(序列编号29)，在延伸反应2分钟的条件下进行PCR，并进行插入检查，对产生目标片段长度的扩增产物的克隆体进行了液体培养。使用0.165μM T7proGGG引物、0.165μM BGH反向引物、0.165μMADAR1_seqF01引物(序列编号30)、0.165μM ADAR1_seqF02引物(序列编号31)和0.165μMADAR1_seqF03引物(序列编号32)，并使用Big Dye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Cycle Sequencing Kit)(ABI)对提取的质粒的序列进行了测序反应，从而进行了碱基序列解析。

表12

(A)细胞培养

将HeLa细胞在24-well Plate上传代培养48小时，使其成为5.0×10⁴细胞/孔。使用X-tremeGENE^TM HP DNA转染试剂(Transfection Reagent)(Roche)，对50ng的psiCHECK2^TM_Rluc_K41R_W104X，250ng的pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR1p110或pcDNA3.1(-)Hygro_ADAR2，以及250ng的表达gRNA的质粒进行了转染(Transfection)。作为表达gRNA的质粒，用与国际公开号第2019/111957号的参考例2相同的方式构建并使用了表达5’AS AD-gRNA、AD1-gRNA01或AD1-gRNA03的质粒。

(B)编辑解析方法

使用Sepasol RNA I Super G(nacalai)，从在24-孔板中培养的细胞中提取总RNA，并使用重组DNA酶I(Recombinant Dnase I)(TaKaRa)进行DNA酶(Dnase)处理之后，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行了纯化。进行使用了Primescript II逆转录酶(TaKaRa)、0.5μg总RNA、0.25μM Oligo(dT)17(序列编号33)的逆转录反应，扩增了cDNA。使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引物(序列编号34)和3’-Adp引物(序列编号35)进行了第一次PCR(30个循环(变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃，60秒))。以将第一次PCR产物稀释了200倍的cDNA为模板，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(TaKaRa)、Rluc_F01引物(序列编号34)和Rluc_R01引物(序列编号36)进行第二次PCR(30个循环(变性：98℃，10秒；退火：55℃，15秒；延伸：68℃60秒))，扩增了Rluc片段。使用Big DyeTerminator v3.1循环测序试剂盒(Cycle Sequence Kit)(Thermo Fisher Scientific)和0.165μM Rluc_sRNA_F01引物(序列编号19)，进行测序反应，通过Applied Biosystems3500基因分析仪(Thermo Fisher Scientific)进行了解析。根据测序得到的色谱图，由靶位点(A311)的峰高比(G/(G+A))计算出了编辑比例(％)。结果在图7和表14中示出。

表13

(C)萤光素酶报告基因检测方法

使用了双萤光素酶报告基因系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)。使用100μL的报告基因专用裂解液(Passive Lysis Buffer)(Promega)在24-孔板中培养的细胞中得到了细胞提取液。在20μL得到的细胞提取液中添加100μL LARII，60秒后，通过GloMax^(R)20/20光度计(Luminometer)(Promega)测定了萤火虫萤光素酶(Fireflyluciferase)(Fluc)的发光强度。之后，立刻添加100μL Stop&Glo Reagent，60秒后测定了海肾萤光素酶(Renilla luciferase)(Rluc)的发光强度。发光强度通过Fluc标准化。结果在图8和表14中示出。

表14

可以看出，即使是在细胞中，靶编辑导向RNA也会诱导ADAR1特异性RNA编辑活性。

(实施例5)对培养细胞中的编辑诱导活性的评价2

作为表达gRNA的质粒，除与上述相同地构建并使用了质粒外，该质粒表达在下方示出了序列的AD1-gRNA05(序列编号37)或AD1-gRNA06(序列编号38)，以与实施例4相同的方式，评价了培养细胞中的编辑诱导活性。结果在图9和图10中示出。此外，在图11A和图11B中示出了，表示由模板靶RNA和AD1-gRNA05或AD1-gRNA06形成的复合物的概念图。

表15

	序列	序列编号
			AD1-gRNA05	CAGCTCAACCAAGCGGTGAGGTACTTGTAG	37
AD1-gRNA06	CAGCTCAACCAAGCGGTGAGGTACTTGTAGTGA	38

表16

可以看出，通过延伸第一寡核苷酸，提高了细胞中的编辑诱导活性，而不会损害对ADAR1的选择性。

(实施例6)

用与上述相同的方式制备了在下方示出了序列的AcGFP_sRNA02(序列编号39)作为模板靶RNA。通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1g_03_GFP_A200(序列编号40)作为对模板靶RNA的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA，以及与实施例2相同地改变了hADAR1和hADAR2的浓度以外，以与实施例1相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_GFP_A200)对模板靶RNA(AcGFP)的编辑诱导活性。结果在图12和表21中示出。需要说明的是，在模板靶RNA的序列中，带下划线的加粗文字表示编辑靶的腺苷残基，下划线表示错配碱基。此外，编辑比例的比值是从存在hADAR1或hADAR2且存在靶编辑导向RNA的情况下的编辑诱导活性中，减去了不存在靶编辑导向RNA时的编辑诱导活性的值，而计算出来的。

表17

(实施例7)

用与上述相同的方式制备了在下方示出了序列的PINK1_s02(序列编号41)作为模板靶RNA。通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1g_03_PINK1_A1310(序列编号42)作为对模板靶RNA的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_PINK1_A1310)对模板靶RNA(PINK1_s02)的编辑诱导活性。结果在图12和表21中示出。

表18

(实施例8)

用与上述相同的方式制备了在下方示出了序列的SMAD_sRNA(序列编号43)作为模板靶RNA。通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1g_03_SMAD4(序列编号44)作为对模板靶RNA的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_SMAD4)对模板靶RNA(SMAD_sRNA)的编辑诱导活性。结果在图12和表21中示出。

表19

(实施例9)

用与上述相同的方式制备了在下方示出了序列的ACTB_s01(序列编号45)作为模板靶RNA。通过常规方法制备了在下方示出了序列的寡核糖核苷酸AD1g_03_ACTB(序列编号46)作为对模板靶RNA的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_ACTB)对模板靶RNA(ACTB_s01)的编辑诱导活性。结果在图12和表21中示出。

表20

表21

如实施例6至9的评价结果所示，即使改变了靶RNA，具有第二寡核苷酸的靶编辑导向RNA也能够诱导ADAR1特异性编辑活性，其中，第二寡核苷酸具有错配碱基。

(实施例10)

通过常规方法制备了AD1g_03_RL_A287(序列编号47)和AD1g_03_RL_A287_GG(序列编号48)，即对与实施例1中的编辑靶的位置不同的腺苷残基的靶编辑导向RNA，作为对实施例1中的模板靶RNA(Rluc_sRNA)的靶编辑导向RNA。

在模板靶RNA中作为编辑靶的腺苷残基的5’侧键合有鸟苷残基，对于该鸟苷残基，AD1g_03_RL_A287具有作为互补的碱基的胞苷残基，AD1g_03_RL_A287_GG具有作为非互补的碱基的鸟苷残基。如下，将模板靶RNA中作为编辑靶的腺苷残基用加粗文字表示，对与靶编辑导向RNA形成互补链的碱基序列添加下划线表示。图13A中示出了由模板靶RNA(Rluc_sRNA)和AD1g_03_RL_A287形成的复合物的概念图，图13B中示出了由模板靶RNA(Rluc_sRNA)和AD1g_03_RL_A287_GG形成的复合物的概念图。

除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_RL_A287和AD1g_03_RL_A287_GG)对模板靶RNA(Rluc_sRNA)的编辑诱导活性。结果在图14至图16以及表26中示出。图14中示出了使用了ADAR1的编辑诱导活性，图15中示出了使用了ADAR2的编辑诱导活性。图16和表26中示出了，将AD1g_03_RL_A287_GG用作靶编辑导向RNA时，ADAR1和ADAR2的编辑诱导活性以及编辑比例的比值。

表22

(实施例11)

通过常规方法制备了AD1g_03_GFP_A196(序列编号49)和AD1g_03_GFP_A196_GG(序列编号50)，即对与实施例6中的编辑靶的位置不同的腺苷残基的靶编辑导向RNA，作为对实施例6中的模板靶RNA(AcGFP_sRNA02)的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_GFP_A196和AD1g_03_GFP_A196_GG)对模板靶RNA(AcGFP_sRNA02)的编辑诱导活性。结果在图14至图16以及表26中示出。

表23

(实施例12)

通过常规方法制备了AD1g_03_PINK1_A1411(序列编号51)和AD1g_03_PINK1_A1411_GG(序列编号52)，即对与实施例7中的编辑靶的位置不同的腺苷残基的靶编辑导向RNA，作为对实施例7中的模板靶RNA(PINK1_s02)的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_PINK1_A1411和AD1g_03_PINK1_A1411_GG)对模板靶RNA(PINK1_s02)的编辑诱导活性。结果在图14至图16以及表26中示出。

表24

(实施例13)

通过常规方法制备了AD1g_03_SMAD4_A2151(序列编号53)和AD1g_03_SMAD4_A2151_GG(序列编号54)，即对与实施例8中的编辑靶的位置不同的腺苷残基的靶编辑导向RNA，作为对实施例8中的模板靶RNA(SMAD_sRNA)的靶编辑导向RNA。除改变了模板靶RNA和靶编辑导向RNA以外，以与实施例6相同的方式，评价了靶编辑导向RNA(AD1g_03_SMAD4_A2151和AD1g_03_SMAD4_A2151_GG)对模板靶RNA(SMAD_sRNA)的编辑诱导活性。结果在图14至图16以及表26中示出。

表25

表26

如图16和表26所示，具有第二寡核苷酸的靶编辑导向RNA能够诱导ADAR1特异性编辑活性，其中，第二寡核苷酸具有错配碱基。此外，如图14和图15所示，在靶RNA在编辑靶碱基的5’侧具有鸟苷残基的情况下，通过相对于鸟苷残基将错配碱基G导入靶编辑导向RNA，能够特别提高ADAR1的编辑诱导活性。

日本专利申请2019-177118号(申请日：2019年9月27日)的全部公开内容通过引用并入本说明书。本说明书中记载的所有文献、专利申请以及技术标准通过引用并入本说明书，与具体且单独地描述了通过引用并入各个文献、专利申请以及技术标准的情况的程度相同。

序列表

<110> 学校法人福冈大学

<120> 寡核苷酸和靶RNA的位点特异性编辑方法

<130> 675746

<160> 61

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 910

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rluc_WT

<400> 1

accauggcuu ccaaggugua cgaccccgag caacgcaaac gcaugaucac ugggccucag 60

uggugggcuc gcugcaagca aaugaacgug cuggacuccu ucaucaacua cuaugauucc 120

gagaagcacg ccgagaacgc cgugauuuuu cugcauggua acgcugccuc cagcuaccug 180

uggaggcacg ucgugccuca caucgagccc guggcuagau gcaucauccc ugaucugauc 240

ggaaugggua aguccggcaa gagcgggaau ggcucauauc gccuccugga ucacuacaag 300

uaccucaccg cuugguucga gcugcugaac cuuccaaaga aaaucaucuu ugugggccac 360

gacugggggg cuugucuggc cuuucacuac uccuacgagc accaagacaa gaucaaggcc 420

aucguccaug cugagagugu cguggacgug aucgaguccu gggacgagug gccugacauc 480

gaggaggaua ucgcccugau caagagcgaa gagggcgaga aaauggugcu ugagaauaac 540

uucuucgucg agaccaugcu cccaagcaag aucaugcgga aacuggagcc ugaggaguuc 600

gcugccuacc uggagccauu caaggagaag ggcgagguua gacggccuac ccucuccugg 660

ccucgcgaga ucccucucgu uaagggaggc aagcccgacg ucguccagau uguccgcaac 720

uacaacgccu accuucgggc cagcgacgau cugccuaaga uguucaucga guccgacccu 780

ggguucuuuu ccaacgcuau ugucgaggga gcuaagaagu ucccuaacac cgaguucgug 840

aaggugaagg gccuccacuu cagccaggag gacgcuccag augaaauggg uaaguacauc 900

aagagcuucg 910

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gaaggatcct tacaggtcct cctctgagat cagcttctgc tc 42

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gcagaattca ccatggcttc caaggtgtac gac 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gacgctagca ccatggcttc caaggtgtac gac 33

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cagctcgaac taagcggtga g 21

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gaactcgagt tacaggtcct cctctgagat cagcttctgc tc 42

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ctcaccgctt agttcgagct g 21

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ctaatacgac tcactatagg gctggactcc ttcatcaac 39

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccagtcgtgg cccacaaag 19

<210> 10

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rluc_K41R

<400> 10

atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca tgatcactgg gcctcagtgg 60

tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca tcaactacta tgattccgag 120

aggcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg ctgcctccag ctacctgtgg 180

aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca tcatccctga tctgatcgga 240

atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc tcctggatca ctacaagtac 300

ctcaccgctt agttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa tcatctttgt gggccacgac 360

tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc aagacaagat caaggccatc 420

gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg acgagtggcc tgacatcgag 480

gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa tggtgcttga gaataacttc 540

ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac tggagcctga ggagttcgct 600

gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac ggcctaccct ctcctggcct 660

cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg tccagattgt ccgcaactac 720

aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt tcatcgagtc cgaccctggg 780

ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc ctaacaccga gttcgtgaag 840

gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg aaatgggtaa gtacatcaag 900

agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cagtaa 936

<210> 11

<211> 279

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Rluc_sRNA

<400> 11

gggcuggacu ccuucaucaa cuacuaugau uccgagaggc acgccgagaa cgccgugauu 60

uuucugcaug guaacgcugc cuccagcuac cuguggaggc acgucgugcc ucacaucgag 120

cccguggcua gaugcaucau cccugaucug aucggaaugg guaaguccgg caagagcggg 180

aauggcucau aucgccuccu ggaucacuac aaguaccuca ccgcuuaguu cgagcugcug 240

aaccuuccaa agaaaaucau cuuugugggc cacgacugg 279

<210> 12

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 12

cagcucaacc aagcggugag guacuug 27

<210> 13

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 13

cagcucaacc aagcggugag guac 24

<210> 14

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 14

cagcagcuca accaagcggu gagguac 27

<210> 15

<211> 70

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 15

gguucagcag cucgaaccaa gggguggaau aguauaacaa uaugcuaaau guuguuauag 60

uaucccaccu 70

<210> 16

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 16

ggguggaaua guauaacaau augcuaaaug uuguuauagu aucccaccua accaagcggu 60

gagguacuu 69

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASR

<400> 17

gguucagcag cucgaaccaa g 21

<210> 18

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASR

<400> 18

ggaaccaagc ggugagguac uu 22

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gctggactcc ttcatcaac 19

<210> 20

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 20

cucaaccaag cggugaggua c 21

<210> 21

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 21

gcagcucaac caagcgguga gguac 25

<210> 22

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 22

cagcagcuca accaagcggu gagguac 27

<210> 23

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 23

guucagcagc ucaaccaagc ggugagguac 30

<210> 24

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 24

cagcucgaac caagcgguga gguac 25

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gctctagaac catggggggt tctcatc 27

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ctgagatcag cttctgctct actgggcaga gataaaag 38

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cgtaagcttc tacaggtcct cctctgagat cagcttctgc tc 42

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ctaatacgac tccactatag gg 22

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

tagaaggcac agtcgagg 18

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gcagcaccag gtgagtttcg 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gctcgtgaga tacctgaaca c 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gctccgtgtg gagatggcgc 20

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ctaatacgac tcactatagg gaccatggct tccaaggtgt ac 42

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

ggccacgcgt cgactagtac 20

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ttactgctcg ttcttcagca cg 22

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 37

cagctcaacc aagcggtgag gtacttgtag 30

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 38

cagctcaacc aagcggtgag gtacttgtag tga 33

<210> 39

<211> 160

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 39

gggugaaugg ccacaaguuc agcgugagcg gcgagggcga gggcgaugcc accuacggca 60

agcugacccu gaaguucauc ugcaccaccg gcaagcugcc ugugcccugg cccacccugg 120

ugaccacccu gagcuacggc gugcagugcu ucucacgcua 160

<210> 40

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 40

cugcacccgc agcucagggu gguc 24

<210> 41

<211> 223

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 41

ggcugaugag agcaucggcc ugcaguugcc cuucagcagc ugguacgugg aucggggcgg 60

aaacggcugu cugauggccc cagagguguc cacggcccgu ccuggcccca gggcagugau 120

ugacuacagc aaggcugaug ccuaggcagu gggagccauc gccuaugaaa ucuucgggcu 180

ugucaauccc uucuacggcc agggcaaggc ccaccuugaa agc 223

<210> 42

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 42

ucccacgccc aggcaucagc cuug 24

<210> 43

<211> 183

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 43

ggaugaccuu cgucgcuuau gcauacucag gaugaguuuu gugaaaggcu ggggaccgga 60

uuacccaaga cagagcauca aagaaacacc uugcuggauu gaaauucacu uacaccgggc 120

ccuccagcuc cuagacgaag uacuucauac caugccgauu gcagacccac aaccuuuaga 180

cug 183

<210> 44

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 44

guacuugucc aggagcugga gggc 24

<210> 45

<211> 250

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 45

ggacuuugau ugcacauugu uguuuuuuua auagucauuc caaauaugag augcguuguu 60

acaggaaguc ccuugccauc cuaaaagcca ccccacuucu cucuaaggag aauggcccag 120

uccucuccca aguccacaca ggggagguga uagcauugcu uucguguaaa uuauguaaug 180

caaaauuuuu uuaaucuucg ccuuaauacu uuuuuauuuu guuuuauuuu gaaugaugag 240

ccuucgugcc 250

<210> 46

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 46

aaagcaugcc aucaccuccc cugu 24

<210> 47

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 47

cuuguaugac ccaggaggcg auau 24

<210> 48

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 48

cuuguaugac gcaggaggcg auau 24

<210> 49

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 49

acgccgagcc cagggugguc acca 24

<210> 50

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 50

acgccgagcc gagggugguc acca 24

<210> 51

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 51

aggcgaggcc cccacugccu aggc 24

<210> 52

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 52

aggcgaggcc gccacugccu aggc 24

<210> 53

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 53

augaagacuc cgucuaggag cugg 24

<210> 54

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 54

augaagacuc ggucuaggag cugg 24

<210> 55

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 55

caaguaccuc accgcuuagu ucgagcug 28

<210> 56

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 56

guaccucacc gcuuaguucg agcug 25

<210> 57

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n 是 a, c, g 或 u

<400> 57

guaccucacc gcuuaguung agcug 25

<210> 58

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 58

guaccucacc gcuuaguucg agcug 25

<210> 59

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 59

cuacaaguac cucaccgcuu aguucgagcu g 31

<210> 60

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 60

ucacuacaag uaccucaccg cuuaguucga gcug 34

<210> 61

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 模板靶RNA

<400> 61

auaucgccuc cuggaucacu acaag 25

Claims

1.一种寡核苷酸，用于诱导对靶RNA的位点特异性编辑，所述寡核苷酸包含：

第一寡核苷酸，确定所述靶RNA；和

第二寡核苷酸，连接到所述第一寡核苷酸的5’侧，

所述第一寡核苷酸由以下组成：

靶对应核苷酸残基，与所述靶RNA中的腺苷残基对应；

10至24个残基的寡核苷酸，其连接到所述靶对应核苷酸残基的3’侧，且具有与所述靶RNA互补的碱基序列；以及

3至6个残基的寡核苷酸，其连接到所述靶对应核苷酸残基的5’侧，且具有与所述靶RNA互补的碱基序列，

所述第二寡核苷酸的残基数为2至10，与所述靶RNA形成互补链，

所述互补链包含至少一个错配碱基。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述第二寡核苷酸的残基数为4至8，所述互补链包含1个错配碱基。

3.根据权利要求1或者2所述的寡核苷酸，其中，所述错配碱基插入所述互补链中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述靶RNA包含所述错配碱基。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述位点特异性编辑是由腺苷脱氨酶1进行的酶反应引起的。

6.一种靶RNA的位点特异性编辑方法，包括：在存在腺苷脱氨酶1的情况下，使权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸和靶RNA进行接触。

7.根据权利要求6所述的编辑方法，其在真核细胞中进行。