CN107109413A

CN107109413A - 靶向的rna编辑

Info

Publication number: CN107109413A
Application number: CN201580069286.1A
Authority: CN
Inventors: B·克莱恩; G·J·普拉滕伯格
Original assignee: ProQR Therapeutics II BV
Current assignee: ProQR Therapeutics II BV
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: EP3712269A1; US20200199586A1; CN107109413B; US11781134B2; EP3234134B1; RU2711506C2; PL3234134T3; US20190040383A1; IL252386B; CA2968336C; CA2968336A1; ES2810375T3; RU2017117510A; NZ732182A; DK3234134T3; IL252386A0; BR112017011510A2; EP3234134A1; JP2017537618A; AU2022201266A1

Abstract

使用寡核苷酸构建体实现RNA编辑，所述寡核苷酸构建体包含(i)对于待编辑的靶核酸序列特异性的靶向部分和(ii)能够结合和募集天然存在于细胞中的核酸编辑实体的募集部分。核酸编辑实体比如ADAR通过靶向部分被重定向到预先选择的靶位点，从而促进与靶向部分相对应的靶RNA区域中的预先选择的核苷酸残基的编辑。

Description

靶向的RNA编辑

本申请要求英国专利申请1422511.4、1512467.0、1512595.8和1521987.6(分别于2014年12月17日、2015年7月16日、2015年7月17日和2015年12月14日提交)，其每个的全部内容并入本文作为参考用于所有目的。

技术领域

本发明在RNA编辑领域中，由此对靶RNA序列的核苷酸序列进行修饰例如以纠正突变。

背景技术

RNA编辑是一种天然的过程，通过这个过程，真核细胞通常以位点特异性和精确的方式改变RNA分子的序列，从而将基因组编码的RNA的全部数量(repertoire)增加数个数量级。已经描述了用于整个动物和植物界的真核物种的RNA编辑的酶，并且这些过程在从最简单的生命形式比如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)到人类的后生动物中管理细胞稳态方面起重要作用。RNA编辑的实例是分别通过称为腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶的酶的腺苷至肌苷以及胞苷至尿苷转变。最广泛研究的RNA编辑体系是腺苷脱氨酶。腺苷脱氨酶是包含识别结构域和催化结构域的多结构域蛋白。识别结构域识别特定的dsRNA序列和/或构象，而催化结构域通过核碱基(nucleobase)的脱氨基作用在靶RNA附近或多或少预定的位置将腺苷转变为肌苷。通过细胞的翻译装置将肌苷读作鸟嘌呤，这意味着如果编辑的腺苷在mRNA或mRNA前体的编码区中，则可以重新编码蛋白质序列。A至I转变也可以发生在靶mRNA的5’非编码序列中，在原始起始位点上游产生新的翻译起始位点，这产生N-末端延长的蛋白质。此外，A至I转换可以发生在mRNA前体中的内含子或外显子的剪接元件中，从而改变剪接模式。作为这种RNA编辑的结果，可以包含或跳过外显子。腺苷脱氨酶是称为作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)的酶的广大家族的一部分，包括人类脱氨酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

使用寡核苷酸来编辑靶RNA在本领域是已知的，例如，参见Montiel-Gonzalez等人(Proceedings of the National Academy of Sciences2013，2013年11月5日，第110卷，第45期，第18285-18290页)。作者描述了使用基因工程化的融合蛋白靶向编辑靶RNA，该融合蛋白包含hADAR1蛋白的腺苷脱氨酶结构域，与噬菌体λ蛋白N的所谓B-box结合结构域融合。已将hADAR1的天然识别结构域去除以消除天然ADAR的底物识别性质，并由λN-蛋白的B-box识别结构域代替。B-box是由N-蛋白B-box结合结构域识别的17个核苷酸的短链RNA。作者构建了一种包含与用于编辑的靶序列互补的向导RNA部分的反义寡核苷酸，其通过N-结构域-脱氨酶融合蛋白融合至用于序列特异性识别的B-box部分。作者巧妙地表明，向导RNA寡核苷酸如实地将腺苷脱氨酶融合蛋白引导至靶位点，导致靶RNA的gRNA定向的位点特异性A至I编辑。

所提出的方法的缺点是需要由噬菌体λN-蛋白的B-box结合结构域基因地融合至截短的天然ADAR蛋白的腺苷脱氨酶结构域而组成的融合蛋白。这需要用融合蛋白转导靶细胞(这是主要障碍)，或者用编码工程化的腺苷脱氨酶融合蛋白的核酸构建体转染靶细胞，以在靶细胞中表达。当在多细胞生物体中实现编辑时，比如在针对人类疾病的治疗中，后者构成不小的障碍。

Vogel等人(Angewandte Chemie.Int.Ed.2014，53，6267-71)公开了使用苄基鸟嘌呤取代的向导RNA和基因工程化的融合蛋白编辑eCFP和第五凝血因子编码RNA，该融合蛋白包含ADAR1或ADAR2的腺苷脱氨酶结构域基因地融合至SNAP-标签结构域(工程化的O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶)。尽管使用共价连接的向导RNA(通过苄基鸟嘌呤)，基因工程化的人工脱氨酶融合蛋白可以靶向培养中的Hela细胞的靶RNA中的所需编辑位点，但该体系具有与上述基因工程化的ADAR类似的缺点，因为不清楚如何应用该体系而不必首先基因地修饰ADAR，然后转染或转导携带靶RNA的细胞，从而为细胞提供这种基因工程化的蛋白质。显然，该体系不容易适用于人类，例如在治疗环境中。

使用寡核苷酸的另一种编辑技术称为CRISPR/Cas9体系，但这种编辑复合物对DNA起作用。后一种方法具有与上述工程化的ADAR体系相同的缺点，因为它需要将向导寡核苷酸与CRISPR/Cas9酶或编码它们的表达构建体共同递送至靶细胞。

因此，仍然需要可以利用内源性细胞通路以在哺乳动物细胞中甚至在整个生物体中编辑内源性核酸的新技术，而没有与现有技术的方法相关的问题。

发明内容

本发明通过提供使用寡核苷酸构建体进行RNA编辑的靶向方法来避免根据现有技术的方法的缺点，所述寡核苷酸构建体包含对于待编辑的靶核酸序列特异性的靶向部分和能够结合和募集天然存在于细胞中的核酸编辑实体的募集部分。寡核苷酸构建体的募集部分的功能是以足够的亲和力选择性地结合至细胞中内源的和存在的RNA编辑实体，通过本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分将这种实体重定向至预选的靶位点，从而促进在靶RNA中对应于寡核苷酸构建体的靶向部分的区域中对预选的核苷酸残基的编辑。

寡核苷酸构建体的靶向部分通常包含与待编辑的RNA序列中的靶位点互补的反义寡核苷酸序列。用于编辑靶RNA的这种靶向方法的一个优选实施方式是包含两部分的寡核苷酸构建体：包含与靶RNA序列互补的反义序列的靶向部分，和包含RNA编辑酶的识别序列的募集部分。

募集部分可以包含具有茎和环的发夹结构形式的dsRNA。发夹可以位于靶向部分的上游(5’)或下游(3’)(优选在上游)。或者，寡核苷酸构建体的募集部分可以以靶向部分中一部分位于募集部分的上游并且靶向部分中一部分位于募集部分的下游这样的方式中断靶向部分，导致寡核苷酸构建体的募集部分在寡核苷酸构建体退火至靶RNA后环出(loopout)。

根据另一个实施方式，募集部分包含模拟(即在结构上相同或相似于)已知待由天然存在的RNA编辑实体编辑的RNA序列的dsRNA片段。已知成为RNA编辑的天然底物的该RNA序列包含dsRNA片段，优选包含通过互补核碱基配对在自身上折叠回来的单个RNA片段，从而形成发夹或茎环结构。已经详细表征的已知的编辑的RNA序列的两个实例是3-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)亚型谷氨酸受体的B亚基(GluR-B)中。该模型体系包括两个频繁编辑的位点，其中将DNA编码的AGA编码为IGA，导致精氨酸至甘氨酸替换(R/G位点)以及不同的谷氨酰胺至精氨酸替换(Q/R位点)。已知GluR-B(R/G)位点包含茎环结构，其由包含3个错配、2个A·C和1个G·U摇摆碱基对的71个核苷酸组成。有趣的是，该环由符合系统发育保守的GCUMA序列的保守性好的五环结构GCUAA结构组成，其中M为A或C(AruscavageP.J.和Bass B.L.RNA.2000；6：257-269)。对于两个摇摆腺苷的编辑似乎有一些偏好，当与所编辑腺苷相对的碱基选自胞苷或尿苷时，优选胞苷，效率会提高。

该结构可以方便地按原样使用，或者在根据本发明的寡核苷酸构建体中使用时，通过减少或增加茎中摇摆核碱基对的数目以修饰编辑的特异性和/或重定向编辑至靶RNA序列中的优选位点，作为募集部分加以改编。此外，或者也可以通过缩短茎而不完全地消除识别，来修饰对于hADAR1的GluR-B的识别位点。这种缩短从可制造性或良好前景的成本等可以是方便的。

衍生自GluR-B结构域的募集部分的实例包括序列：5’-(AUAN^a)_nUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA(N^bUAU)_n-3’，其中N^a和N^b各自为可以是A、G、C或U的单个核苷酸，其条件是在形成茎环结构时N^a和N^b形成错配碱基对，并且n为1或0(即SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)。这种募集部分的一个有用的实例包括这样的序列，其中n＝1，在5’和3’方向上进一步延伸，例如其中每个延伸为1至10个核苷酸长(或更长，例如1至20个核苷酸或更多)。例如，如在SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：22(其中N^a＝N^b＝G)中所示，在每个方向上延伸3个另外的核苷酸得到(SEQ ID NO：23)5’-GGAAUAN^aUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAN^bUAUCCC-3’。这种进一步扩展可以提高校正效率。

基于全长天然GluR-B受体底物的募集部分的另一个实例是如下面在实施例中使用的5’-GUGGAAUAN^aUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAN^bUAUCCCAC-3’(SEQ ID NO：24；相对于前一段的延伸序列以下划线示出)。在实施例4中描述全长GluR-B受体募集部分与用于A1AT-转录物的具有与A1AT缺陷相关的9989位G至A突变的靶向部分组合。在实施例5中描述全长GluR-B受体募集部分与用于LRRK2转录物的具有与帕金森氏病相关的G2019S突变的靶向部分组合。

募集部分可以在5’或3’端连接到靶向部分，任选地通过包含一个或多个核苷酸的接头“L”、寡肽或另一种化学接头如聚乙二醇(PEG)连接。

靶向部分可以包含与由以下通式表示的靶RNA序列互补的序列：

N¹N²N³N⁴N⁵N⁶N⁷N⁸N⁹N¹⁰N¹¹N¹²N¹³N¹⁴N¹⁵N¹⁶N¹⁷CN¹⁸N¹⁹N²⁰(SEQ ID NO：8)，

其中N¹至N²⁰取决于靶RNA序列中的互补序列，各自独立地为A、G、C或U，其中当靶向部分退火至其靶RNA序列时，N⁴优选与靶RNA序列中的相对核苷酸形成错配碱基对，并且当靶向部分与其靶RNA序列退火时，N¹⁰和N¹⁶与靶RNA序列中的相对核苷酸形成摇摆碱基对，并且C是与靶RNA序列中的作为脱氨基靶标的腺苷相对的胞苷。

错配碱基对是G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U碱基对。摇摆碱基对是：G-U、I-U、I-A和I-C碱基对。靶向部分可以长于20个核苷酸，多达200个核苷酸或更多，尽管认为长于50个是不必要的，并且优选短于40个。更优选的是募集部分短于30个核苷酸，优选短于25个核苷酸。

优选地，当靶向部分与靶RNA序列退火时，靶向部分在每个与腺苷(如果靶RNA序列中的该腺苷不是编辑的靶标)相对的位置包含2’-O甲基。更通常地，为了保护靶向部分免于核酸酶降解，优选所有核苷酸都包含2’-O-甲基，除了与靶腺苷相对的核苷酸和所述相对核苷酸的相邻核苷酸(一个5’和一个3’)，其应包含2’-OH基团。

根据优选实施方式，募集部分包含DNA序列：(CG)₃N¹-Nⁿ(CG)₃，其中N¹至Nⁿ各自可以相同或不同，并且选自鸟苷、腺苷、胸苷、胞苷和肌苷，‘n’在2和20之间，优选在2和10之间，更优选在2和5之间，还更优选地在3和5之间，最优选地是4或5。因此，有三个CG重复位于至多20个中间核苷酸的侧翼。该DNA序列能够形成茎环结构。根据另外的优选实施方式，寡核苷酸构建体的募集部分是包含序列：(CG)₃T_n(CG)₃的DNA结构，其中n是3至5的整数，优选为4(CGCGCGTTTTCGCGCG；SEQ ID NO：5)。该DNA序列能够形成茎环结构。此外，在本领域中已经描述了(CG)₃T₄(CG)₃序列在生理条件下形成Z-DNA构象，并且该Z-DNA结构被hADAR1识别并结合(FEBS letters 458：11999Sep 10pg 27-31)。如上所述对于dsRNA募集部分，该Z-DNA募集部分可以位于靶向部分的上游或下游，或者中断靶向部分，在上游部分和下游部分中分开靶向部分，由此DNA募集部分在靶向部分退火至靶RNA时环出。根据本实施方式，胞苷碱基优选为5-甲基胞苷，以降低与CpG序列相关的潜在的免疫原性。

根据本发明的寡核苷酸包含靶向部分(即将寡核苷酸靶向至靶RNA序列中正确位置的部分)和募集部分(即具有募集编辑实体(例如ADAR)的主要功能的部分，并且不必要与作为编辑靶标的腺苷区域中的靶RNA互补、优选不互补)。这种二分体结构将本发明的寡核苷酸与已知的寡核苷酸比如现有技术(例如WO2014/011053、WO2005/094370、和Woolf等人，1995.PNAS USA 92，8298-8302)中公开的寡核苷酸清楚地区分开，后者基本上在整个长度上与靶标互补，并且不包含募集部分(当然不是不与靶RNA互补的部分，而是与本发明一样对编辑实体具有亲和力)。因此，根据本发明优选提供一种用于在真核细胞中定点编辑靶RNA序列中的核苷酸的寡核苷酸构建体，所述寡核苷酸构建体包含：

(a)靶向部分，其包含与该靶RNA的一部分互补的反义序列；和

(b)募集部分，其不与靶RNA序列互补，并且其能够结合和募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体并能够进行所述核苷酸的编辑。

根据另一个实施方式，本发明提供寡核苷酸构建体，其包含：

(a)靶向部分，其包含与该靶RNA的一部分互补的反义序列；和

(b)募集部分，其能够形成分子内茎环结构、结合和募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体并进行所述核苷酸的编辑。

根据另一个实施方式，募集部分可以是选择用于结合至细胞中存在的编辑实体的适配体(aptamer)。选择适配体的步骤在本领域中是众所周知的。可以选择与编辑实体结合而不消除脱氨酶活性的适配体作为募集部分，并且易于使用任何类型的接头包括规则(磷酸二酯)或修饰的(例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)核苷间键、肽基连接或任何其他化学连接比如聚乙二醇，与本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分融合。

根据本发明的另一个实施方式，可以选择与细胞中存在的编辑实体结合而不消除编辑活性的抗体、抗体片段、其结合结构域、或骆驼抗体，作为募集部分并且与本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分融合。

术语“寡核苷酸构建体”可以指单个寡核苷酸、两个或多个对彼此有亲和力(反义互补或其它)的寡核苷酸(包含适配体)的复合物、或寡核苷酸和蛋白质的结合部分(比如抗体、抗体片段或结合结构域)的复合物，其可以直接或通过PEG或其它接头连接。

因此，本发明提供寡核苷酸构建体和用于细胞中靶RNA序列的位点特异性编辑的方法，而不需要用基因工程化的编辑酶转导或转染细胞。由于寡核苷酸构建体的设计，将编辑实体比如ADAR募集并引导到由实验者选择的编辑位点。本发明的这些寡核苷酸构建体和方法可以方便地用于在靶RNA序列中进行改变，例如逆转参与或引起疾病的突变，从而减轻疾病的症状。已知RNA编辑实体非常有效地编辑其底物，其频率远远超过寡核苷酸介导的DNA或RNA修复。当用在治疗疾病时，这是非常有利的。

根据本发明的寡核苷酸构建体中的靶向部分和募集部分可以直接相邻。或者，靶向部分和募集部分可以通过接头共价连接。接头可以包含非特异性核苷酸残基(非特异性，在某种意义上，它们不必要与靶RNA序列互补，也不对细胞中存在的编辑实体具有亲和力)、(寡)肽接头或其它化学接头。根据另一个实施方式，可以将靶向部分和募集部分提供为两个分开的即非共价连接的寡核苷酸序列，其包含能够形成dsRNA或杂合DNA：RNA结构的反义互补序列。这种dsRNA或杂合寡核苷酸构建体的形成可以在施用于细胞或待治疗受试者之前或在体外或体内(例如，在待治疗受试者中)施用两个分开的寡核苷酸之后进行。

本发明提供用于在真核细胞、优选哺乳动物细胞中进行靶RNA序列改变的方法，包括以下步骤：(i)向所述细胞中引入包含靶向部分和募集部分的寡核苷酸构建体，靶向部分包含与靶RNA序列充分互补的序列以通过核碱基配对结合至所述靶RNA，募集部分包含由天然存在于所述真核(优选哺乳动物)细胞中的RNA编辑实体识别的序列；(ii)允许足够的时间用于使RNA编辑实体对靶RNA序列进行编辑反应；和(iii)鉴定RNA序列中改变的存在。

根据优选的实施方式，编辑反应由所述编辑实体在靶RNA序列与寡核苷酸构建体的靶向部分之间的重叠区域内的一个或多个核碱基上进行。根据优选的实施方式，寡核苷酸构建体的靶向部分包含与待编辑的核碱基相对的错配。根据另一个优选的实施方式，编辑反应包括通过靶RNA序列中腺苷核碱基的脱氨基作用进行的A至I转变。根据后一种方法，优选其中寡核苷酸构建体包含与待编辑的腺苷相对的C。根据另一个优选的方法，编辑反应是通过胞苷核碱基的脱氨基作用进行的C至U转变；根据后一种方法，优选寡核苷酸构建体的靶向部分包含与待编辑的靶RNA序列中的C相对的A。

本发明还提供一种用于在人细胞中编辑突变型CFTR靶RNA序列的方法，包括以下步骤：(i)向所述细胞中引入包含与CFTR靶RNA序列互补的靶向部分和能够募集hADAR编辑实体的募集部分的寡核苷酸构建体；和(ii)允许hADAR编辑实体有足够的时间在靶RNA序列与寡核苷酸构建体的靶向部分之间的重叠区域处或附近编辑核碱基。在根据本发明的优选的实施方式中，突变型CFTR靶RNA(mRNA前体或mRNA)包含G551D突变，并且编辑反应导致腺苷转变为肌苷，从而逆转所述靶RNA序列中的G551D突变。对于天冬氨酸(D)有两个密码子：GAU和GAC。因此，具有G551D突变的囊性纤维化患者可以在CFIR蛋白的密码子551的对应位置具有突变GAU或GAC。在密码子的第二个位置的A的脱氨基作用将导致形成I，其将由翻译装置读取为G。因此，在突变的密码子的第二个位置中A的脱氨基作用分别产生GIU或GIC，其实际上被读作GGU和GGC。GGU和GGC均编码甘氨酸，因此，通过腺苷脱氨酶对两种突变的G551D密码子进行RNA编辑将产生适当的甘氨酸编码的三联体，有效地将突变逆转成正常的CFTR蛋白。

本领域技术人员将清楚，G551D突变仅用作实例，而不以任何方式限制本发明的范围。确实存在由单碱基对替换引起的数千种遗传疾病，使用根据本发明的寡核苷酸构建体和方法、募集脱氨酶比如本文详细描述的腺苷脱氨酶或者胞苷脱氨酶用于逆转，单碱基对替换是可修改的。

将胞苷脱氨酶募集到靶位点的工作方式与腺苷脱氨酶hADAR1和hADAR2的工作方式相同。然而，胞苷脱氨酶具有不同的结合要求，并识别靶RNA序列中的不同结构，这决定着胞苷编辑。一个深入研究的胞苷脱氨酶(aminase)是人Apobec 1。使用寡核苷酸构建体靶向编辑位点并募集存在的、天然存在的编辑实体的RNA编辑的一般原理对于胞苷脱氨酶保持不变，并且是本文公开和要求保护的发明的一部分。

具体实施方式

根据本发明的寡核苷酸构建体是独特的，因为它们组合两个基本功能；它们以一定的亲和力结合到天然存在的RNA编辑实体，并且它们通过反义互补(Watson-Crick)碱基配对至待发生编辑的靶RNA序列中的位点，从而将RNA编辑实体募集到编辑位点。“天然存在的”实体存在于细胞中，而不需要在先的人为干预。因此，截短的或重组的酶(比如Montiel-Gonzalez等人和Vogel等人所述)不是天然存在于细胞中；它们可以存在于细胞中，但仅在人为干预(转导或转染)后才能存在。因此，本发明可以使用细胞内源的野生型RNA编辑实体来操作。

应当理解，这种募集不需要是定量的，因为细胞中存在的所有RNA编辑实体将被募集用于编辑所选择的靶RNA序列。如果存在编辑实体的百分比保持可用以对其天然底物起作用，则是期望的甚至认为是可取的。此外，在某些实施方式中，例如，其中寡核苷酸构建体的募集部分是包含腺苷的dsRNA序列，一旦RNA编辑实体的催化结构域由寡核苷酸构建体募集，则其可以作用于寡核苷酸构建体的募集部分，以及作用于通过靶向部分退火至靶RNA序列中的互补序列而产生的dsRNA部分的编辑底物上。这在所有情况下都不是问题，因为可能存在需要过度编辑的应用。在要避免过度编辑的情况下，靶向部分可以整体地化学修饰，例如通过向所有核苷酸提供2’-O-甲基化糖部分，除了与靶腺苷相对的核苷酸和位于与靶腺苷酸相对的每个核苷酸的侧翼的两个核苷酸(一个5’和一个3’)。通常，通过向相对的核苷酸提供2’-OMe基团，或者通过提供鸟嘌呤或腺嘌呤作为相对的碱基，可以保护靶RNA中的腺苷免于编辑，因为这两个核碱基能够阻止相对腺苷的编辑。

寡核苷酸构建体

根据本发明的寡核苷酸构建体的募集部分的特征在于dsRNA或dsDNA结构。在单个分子中建立双链寡核苷酸结构的一种方式是通过建立能够在其长度的至少一部分上在自身折叠回来的回文序列。这种茎环结构可能产生自(1)能够形成茎环结构的人工RNA序列、(2)能够形成茎环结构的人工DNA序列、(3)从细胞中存在的编辑实体的已知的底物RNA中获取的RNA序列。例如，根据本发明的寡核苷酸构建体可以包括在序列上与用于编辑活性的天然识别位点相似的募集部分，或者可以以适配体样的方式模拟该识别位点。以下将更详细地描述这些实施方式中的每一个。此外，本领域技术人员将能够基于更详细描述的每个实施方式来制备和设计募集部分。设计和测试对蛋白质具有亲和力的核酸结构的方法是本领域众所周知的。

根据本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分应当具有与靶位点的充分的重叠和互补性，以允许寡核苷酸构建体与靶RNA序列的序列特异性杂交。重叠的长度和量可以根据靶标而不同，但是可以由本领域普通技术人员常规地确定。通常，更长的序列提供更多的特异性——并因此提供更少的脱靶效应(例如通过非特异性结合)——和更强的与靶位点的结合。通常根据本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分应该长于10个核苷酸，优选大于11个、12个、13个、14个、15个、16个、更优选多于17个核苷酸。靶向部分优选短于200个核苷酸，更优选短于100个核苷酸，还更优选短于50个核苷酸，还更优选25个或更少的核苷酸。

根据一个实施方式，本发明提供用于在细胞中的靶RNA序列的一个或多个特定位置进行所需变化的寡核苷酸构建体，其通过募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体，该寡核苷酸构建体具有序列5’-X-(Y-X′)_n-L-Z-3’，其中X与特定位置下游的靶RNA序列互补，X′与特定位置上游的靶RNA序列互补，Y包含一个或多个核苷酸(例如，至多10个，优选在1个和5个之间，更优选在1个和3个之间，比如1个或2个)，其与靶RNA序列不互补，n为1至10的整数(优选1至5，更优选1至3，或为1)，L是任选的接头序列，并且可以包含任意数目的核苷酸(包括零)，并且Z是由所述RNA编辑实体识别并结合的序列。L还可以由不同的化学连接比如(寡)肽键、或PEG连接组成。

当n大于或等于1时，寡核苷酸构建体的靶向部分与靶RNA序列不完全互补，而是包含一个或多个错配或摇摆碱基，其通过增加靶RNA序列中的相对核苷酸的编辑频率而用于增强特异性。当n是两个或多个时，X′出现多于一次，并且两个或多个X′可以相同，这取决于靶RNA序列中的互补碱基的序列，但是很可能，两个或多个X′不相同。当n为0时，靶向部分与靶RNA序列在靶向部分的整个长度上完全互补，即与靶RNA序列没有任何错配。该实施方式可能导致腺苷脱氨酶以非特异性方式进行RNA编辑，这意味着寡核苷酸构建体的靶向部分与靶RNA序列之间的重叠区域中的所有腺苷同等可能转化为肌苷。可以通过确保不应被靶向或至少以较低频率靶向的腺苷遇到具有2’-O修饰的核糖部分比如2’-OMe的相对核苷酸(因为后者已知降低相对腺苷编辑的效率)，来限制腺苷的任何非特异性编辑。或者或另外，可以提供作为鸟嘌呤或腺嘌呤的相对碱基，因为这些核碱基通常阻碍相对碱基的脱氨基作用。

根据另一个实施方式，本发明提供用于在细胞中的靶RNA序列的特定位置进行所需变化的寡核苷酸构建体，其通过募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体，该寡核苷酸构建体具有序列5’-Z-L-(X′-Y)_n-X-3’，其中X与特定位置上游的靶RNA序列互补，X′与特定位置下游的靶RNA序列互补，Y包含一个或多个核苷酸，其与靶RNA序列不互补(例如，至多10个，优选1至5个，更优选1至3个，比如1或2个)，n为1至10的整数(优选1至5，更优选1至3，或为1)，L是任选的接头序列，并且可以包含任意数目的核苷酸，包括零，并且Z是由所述RNA编辑实体识别并结合的序列。L还可以由不同的化学连接，比如(寡)肽连接组成。

当n大于或等于1时，寡核苷酸构建体的靶向部分与靶RNA序列不完全互补，而是包含一个或多个错配或摇摆碱基，其通过增加靶RNA序列中的相对核苷酸的编辑频率而用于增强特异性。当n是两个或多个时，X′出现多于一次，并且两个或多个X′可以相同，这取决于靶RNA序列中的互补碱基的序列，但是很可能，两个或多个X′不相同。当n为0时，靶向部分与靶RNA序列在靶向部分的整个长度上完全互补，即与靶RNA序列没有任何错配。该实施方式可能导致腺苷脱氨酶以非特异性方式进行RNA编辑，这意味着寡核苷酸构建体的靶向部分与靶RNA序列之间的重叠区域中的所有腺苷同等可能转化为肌苷。可以通过确保不应被靶向或至少以较低频率靶向的腺苷遇到具有2’-O修饰的核糖部分比如2’-OMe的相对核苷酸(因为后者已知降低相对腺苷编辑的效率)，来限制腺苷的任何非特异性编辑。

本发明的寡核苷酸可以是杂和DNA/RNA分子，即在同一寡核苷酸内包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。

募集部分：优选的实施方式

募集部分应该足够长以提供由根据本发明的编辑实体识别的优选以Z-RNA或Z-DNA构象的结构，比如茎环RNA或DNA结构。如果编辑实体是hADAR1，则已知核酸序列通过hADAR1的150kDa突变体的Z-α结构域提供以识别和结合。

来自人工RNA或DNA茎环结构的募集部分

作为根据本发明的优选的募集部分的人工RNA或DNA茎环结构的实例包括序列(RY或YR)_nN_m(RY或YR)_n，其中R、Y和N表示核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，并且其中R为A或G，Y为T、U或C，N为A、G、C、T或U，n为大于或等于3，m为大于或等于1(优选m为大于或等于2，更优选m为大于或等于3，还更优选m为大于或等于4)，并且，其中N形成环并且两个(RY)_n或(YR)_n序列通过互补的Watson-Crick核碱基配对形成dsRNA茎结构(当所有核苷酸均为核糖核苷酸时)或dsDNA结构(当所有核苷酸都是脱氧核糖核苷酸时)。募集部分优选由所有核糖核苷酸或所有脱氧核糖核苷酸组成，尽管不排除包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的募集部分。

已知结合hADAR1的募集部分的特别优选的实例是(i)由(CG)_nT_m(CG)_n表示的DNA结构，其中n为3，并且m为大于或等于4、优选4或5，该DNA结构具有形成所谓Z-DNA结构的倾向，(ii)由式(RY)_nN_m(RY)_n表示的RNA结构，其中R是A或G，Y是C或U，N是任意的A、G、C或U，并且其中N可以全部相同或不同，n为大于或等于3，m为大于或等于4、优选为4或5，该RNA结构具有形成Z-RNA结构的倾向。Z-DNA和Z-RNA结构因下述事实在其较常见的对应体方面不同(对于dsDNA，B构象是最常见的形式，而对于dsRNA，A型最常见)：双螺旋是左旋的，与两者都是右旋的A和B形式相对，并且Z-DNA和Z-RNA的骨架中的核碱基在空间上以“之”字形排列的方式进行排列(因此是前缀“Z”)。

来自天然底物RNA的募集部分

形成茎环结构和凸起的非Z-RNA形成的dsRNA序列也作为募集部分发挥作用。除了上文详细描述的GluR-B，本领域已经描述了具有茎环和错配或摇摆碱基对的各种dsRNA结构，其与编辑实体的结合结构域相互作用，比如GluR-C和GluR-D、5-HT_2c血清素受体和几种初级转录物(pri-miRNA)和miRNA前体和miRNA。根据本发明的寡核苷酸构建体的募集部分中优选的环分别符合保守序列UNCG的四元环，其中N可以是任意的A、G、C或U，或者符合保守序列GCUMA的五元环，其中M为A或C。当募集部分包含来自本领域已知RNA编辑位点的茎环段时，可以“原样”采用该茎，或者可以以其它方式改变序列或长度、缩短或修饰，以改变其特征比如对于RNA编辑实体的亲和力，或出于可制造性或处理性、成本的原因或任何其他原因，只要募集功能不完全受到损害。这些结构可以容易地在体外制备并测试其结合、募集和重定向编辑实体的能力。本领域已知几种可以商业获得的编辑实体，包括hADAR，并且在根据本发明的寡核苷酸构建体中结合至dsRNA或dsDNA结构的试验中进行测试。这种试验对蛋白质-核酸相互作用领域的技术人员来说是容易获得的，并且包括电泳迁移率位移分析(EMSA)。

已经详细表征的已知的编辑的RNA序列的两个实例是3-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)亚型谷氨酸受体的B亚基(GluR-B)中。该模型体系包括两个频繁编辑的位点，其中将DNA编码的AGA编码为IGA，导致精氨酸至甘氨酸替换(R/G位点)以及不同的谷氨酰胺至精氨酸替换(Q/R位点)。已知GluR-B(R/G)位点包含茎环结构，其由包含3个错配、2个A·C和1个G·U摇摆碱基对的71个核苷酸组成。有趣的是，该环由符合系统发育保守的GCUMA序列的保守性好的五环结构GCUAA结构组成，其中M为A或C(Aruscavage P.J.和BassB.L.RNA.2000；6：257-269)。对于两个摇摆腺苷的编辑似乎有一些偏好，当与所编辑腺苷相对的碱基选自胞苷或尿苷时，优选胞苷，效率会提高。

作为根据本发明的优选的实施方式的衍生自GluR-B结构域的募集部分的实例，其包含序列：5’-(AUAN^a)_nUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA(N^bUAU)_n-3’，其中N^a和N^b各自是可以为A、G、C或U的单个核苷酸，其条件是在形成茎环结构时N^a和N^b形成错配碱基对，并且n为1或0(即SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)。

另一个优选的募集部分包括或由以下序列组成：5’-GUGGN^cAUAN^aUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAN^bUAUN^dCCAC-3’(SEQ ID NO：25)，其中：N^a、N^b、N^c和N^d各自可以是核苷酸A、G、C或U，其条件是在茎环形成时N^a和N^b形成错配的碱基对且N^c和N^d形成错配的碱基对；并且其中gcuaa五核苷酸形成环，并且与gcuaa相邻的上游和下游序列通过碱基配对形成茎。

寡核苷酸构建体的化学修饰

寡核苷酸领域中已知各种可以根据本发明容易地使用的化学物质和修饰。核苷酸之间的常规核苷间键可以通过磷酸二酯键的一巯基化(thioation)或二巯基化作用以分别产生硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯来改变。核苷间键的其他修饰是可能的，包括酰胺化和肽接头。可以通过用低级烷基(C1-4，比如2’-O-Me)、烯基(C2-4)、炔基(C2-4)，甲氧基乙基(2’-MOE)或其它取代基替换2’-O部分来修饰核糖。2’OH基团的优选的取代基是甲基、甲氧基乙基或3，3’-二甲基烯丙基基团。已知后者由于其蓬松性(bulkiness)而抑制核酸酶敏感性、同时提高杂交效率的性质(Angus和Sproat FEBS 1993Vol.325，no.1，2，123-7)。或者，可以应用在核糖环内部包含2’-4’分子内桥(通常为2’氧和4’碳之间的亚甲基桥)键的闭锁核酸序列(LNA)。可以修饰嘌呤核碱基和/或嘧啶核碱基以改变其性质，例如通过杂环的胺化作用或脱氨基作用。确切的化学物质和形式可以取决于寡核苷酸构建体和应用，并且可以根据本领域技术人员的愿望和偏好来制定。

长度

根据本发明的寡核苷酸构建体可以包含20至几百个核苷酸。由于实际原因比如可制造性和成本，寡核苷酸构建体应优选短于200个核苷酸。优选地，寡核苷酸构建体的长度为20至100个核苷酸，更优选为24至60个核苷酸，还更优选为30至50个核苷酸。寡核苷酸构建体的靶向部分优选包含多于10个核苷酸，优选多于11个、12个、13个、14个、15个、16个、还更优选多于17个核苷酸。更长的靶向部分为待编辑的RNA序列的靶位点提供更多的特异性，更少的由于无意的(脱靶)结合而导致的脱靶效应，以及更多的空间以产生二级结构，比如在靶向部分本身中的茎环结构、错配或摇摆碱基(由于与待编辑的位点处或其附近的靶RNA序列中的一个或多个互补碱基的错配)等等。优选的靶向部分与靶RNA序列在靶向部分的整个长度上互补，除了与待编辑的核苷酸相对的错配，以及任选的一个或两个摇摆碱基。

构象(Conformation)

本领域已知的，RNA编辑实体(比如hADAR)根据许多因素以不同特异性编辑dsRNA结构。一个重要因素是构成dsRNA序列的两条链的互补程度。两条链的完美互补通常导致hADAR的催化结构域以不区分的方式使腺苷脱去氨基，或多或少与其遇到的任何腺苷反应。通过提供包含与待编辑的腺苷相对的错配的靶向部分，可以通过确保dsRNA的错配来增加hADAR1的特异性以仅转变特定的腺苷。优选通过提供具有与待编辑的腺苷相对的胞苷或尿苷、最优选胞苷的靶向部分来产生错配。在靶标链中的腺苷脱氨时，靶标链将获得肌苷，对于大多数生物化学过程，细胞的生物化学装置将该肌苷“读取”为G。因此，在A至I转变后，已经解决了错配，因为I完全能够与根据本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分中的相对C进行碱基配对。在因为编辑而解决了错配之后，释放底物，并且从靶RNA序列中释放寡核苷酸构建体-编辑实体复合物，然后其可用于下游生物化学过程，比如剪接和翻译。

编辑靶RNA序列所需的特异性水平可以取决于应用。根据本专利申请中的说明书，本领域技术人员将能够根据需要设计寡核苷酸构建体的靶向部分，并且通过一些反复尝试获得期望的结果。

本发明的寡核苷酸构建体的靶向部分通常包含正常的核苷酸A、G、U和C，但也可以包含肌苷(I)，例如代替一个或多个G核苷酸。在根据本发明的寡核苷酸构建体的募集部分中，G也可以由I替代，但是必须注意，在期望的那些实施方式中，茎或环中的I不干扰Z-DNA或Z-RNA构象的形成。

编辑特异性

为了防止靶RNA序列在与寡核苷酸构建体重叠的区域中的不期望的腺苷编辑，可以对寡核苷酸构建体的靶向部分进行化学修饰。在本领域中已经表明，与靶RNA序列中腺苷相对的核苷的核糖基部分的2’-O-甲基化显著减少ADAR对该腺苷的脱氨基作用(Vogel等人，2014Angewandte Chemie Int.Ed.53，6267-71)。因此，通过在寡核苷酸构建体的所需位置包含2’-甲氧基(2’-OMe)核苷酸，可以显着提高编辑的特异性。设想核糖基部分的其它2’-O取代，比如2’-甲氧基乙基(2’-MOE)和2’-O-二甲基烯丙基也可以减少靶RNA序列中相应(相对)腺苷的不必要的编辑。寡核苷酸合成和设计领域的普通技术人员容易获得其它化学修饰。这种化学修饰的寡核苷酸构建体的合成以及在根据本发明的方法中对它们进行测试不会造成不必要的负担，并且本发明也包括其它修饰。

编辑实体

编辑实体通常在性质上是蛋白质的，比如在后生动物包括哺乳动物中发现的ADAR酶。编辑实体还可以包括核酸和蛋白质或肽的复合物，比如核糖核蛋白。编辑酶可以仅包括核酸或由核酸组成，比如核酶。所有这些编辑实体都包括在本发明中，只要它们是由根据本发明的寡核苷酸构建体募集的。优选地，编辑实体是酶，更优选为腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶，还更优选为腺苷脱氨酶。当编辑实体是腺苷脱氨酶时，Y优选为胞苷或尿苷、最优选胞苷。最感兴趣的之一是人ADAR，hADAR1和hADAR2，包括其任何亚型，比如hADAR1p110和p150。

可以方便地设计根据本发明的寡核苷酸构建体的本领域已知的RNA编辑酶，包括作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，比如人或人细胞中的hADAR1和hADAR2，以及胞苷脱氨酶。人ADAR3(hADAR3)已经在现有技术中描述，但据报道没有脱氨酶活性。

已知hADAR1以两种亚型存在；长150kDa的干扰素诱导型和较短的100kDa的型式，其通过来自普通mRNA前体的选择性剪接产生。有趣的是，只有较长的亚型能够结合至可以包含在根据本发明的寡核苷酸构建体的募集部分中的Z-DNA结构。因此，细胞中存在的150kDa亚型的水平可以受到干扰素、特别是干扰素-γ(IFN-γ)的影响。hADAR1也可由TNF-α诱导。这提供了开发联合疗法的机会，其中将干扰素-γ或TNF-α和包含作为根据本发明的募集部分的Z-DNA的寡核苷酸构建体作为组合产品或作为单独的产品同时或以任何顺序随后施用给患者。某些疾病状况可能与患者的某些组织中增加的IFN-γ或TNF-α水平相一致，创造了进一步使编辑对病变组织更特异性的机会。

靶向部分和募集部分都可以包括具有改变核酸酶抗性、改变结合的亲合力(表示为解链温度)或其它性质的化学修饰的核苷酸或由其组成。化学修饰的实例是糖部分的修饰，包括通过在糖(核糖)部分中交联取代基(例如像在LNA或闭锁核酸中)，通过用具有上述长度的烷基(例如2’-O-甲基)、炔基(2’-O-炔基)、烯基(2’-O-烯基)、烷氧基烷基(例如甲氧基乙基，2’-MOE)基团等替换2’-O原子。此外，骨架的磷酸二酯基团可以通过巯基化、二巯基化、酰胺化等进行修饰，以产生硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等核苷间键。核苷间键可以全部或部分地由肽键取代，以产生肽核酸(peptidonucleic acid)序列等。或者或另外，核碱基可以通过(脱)氨化来修饰，以产生肌苷或2’6’-二氨基嘌呤等。

进一步的修饰可以是核苷酸的胞苷部分中的C5的甲基化，以减少已知与CpG序列相关的潜在的免疫原性。

根据本发明的寡核苷酸构建体的总体结构可以从“一条腿的”发夹(图1和2)向“两条腿的”发夹(图3)变化，由此腿部包括一个或多个靶向部分，并且发夹的身体或核心提供募集部分(图1-3)。寡核苷酸构建体的腿将提供错配或摇摆核碱基来表示靶RNA中编辑位点(例如待编辑的腺苷或胞苷)的相对位点。例如，在寡核苷酸构建体募集ADAR活性的情况下，为了编辑靶RNA中的A至I转变，错配或摇摆可以包括腺苷、鸟嘌呤、尿苷或胞苷残基，优选胞苷残基。除了与编辑位点相对的错配或摇摆之外，靶向部分通常将与靶RNA完全互补，尽管可以允许有限数量的不完全匹配，比如摇摆或错配的碱基，而其不会不可接受地损害寡核苷酸构建体和靶RNA序列之间的特异性和/或结合强度。发夹的茎可以由完全互补的核苷酸序列组成，在整个长度上形成双链RNA结构。或者，发夹的茎可以包含一个或多个摇摆或非匹配的相对核苷酸，只要通过编辑活性对寡核苷酸构建体的识别没有不可接受地损坏。应当理解，细胞中编辑活性的功能作用在其天然编辑位点可能会降低，因为由根据本发明的寡核苷酸构建体对负责编辑活性的实体的募集。本领域普通技术人员将理解，将细胞内的编辑实体重定向到其他靶位点的程度可以通过改变根据本发明的寡核苷酸构建体的募集部分对编辑实体的识别结构域的亲和力来调节。通过降低寡核苷酸构建体的募集部分对编辑实体的亲和力可以通过以下方式中的任何一种或其组合来进行：包括通过改变茎的序列、环的大小或结构(序列、骨架的化学特性、核糖基、或核苷碱基)或两者的组合。可以通过一些反复尝试和/或通过基于寡核苷酸构建体的募集部分与编辑实体的识别结构域之间的结构相互作用的计算方法来确定确切的修饰。

另外或替代地，细胞中存在的编辑实体的募集和重定向的程度可以通过寡核苷酸构建体的配量(dosing)和配量方案来调节。通常在I期和/或II期临床试验中，这是由实验者(体外)或临床医生确定的。

优选地，本发明提供由包含用于编辑核酸序列的靶向部分和募集部分的单一寡核苷酸(图1、图2A、图3)组成的寡核苷酸构建体的用途。然而，包括使用两种寡核苷酸的寡核苷酸构建体(图2B)(例如一种包含靶向部分的寡核苷酸和一种包含募集部分的寡核苷酸)当然在本发明的范围内。因此，根据另一个实施方式，本发明提供两种单独的寡核苷酸，一种包含靶向部分并且另一种包含募集部分，由此以使得它们彼此具有亲和力的方式设计两种寡核苷酸，例如通过在两个功能部分之间的反义Watson-Crick碱基配对或者通过不具有特定的靶向或募集功能的序列，例如接头序列。这样的两组分体系在灵活性、可用性(例如在个性化医学的背景下)、可制造性、商品成本或其他方面可能具有优势。依照多组分体系的两种(或多种)寡核苷酸不一定必须严格区分不同的功能(靶向和募集)。例如，寡核苷酸可以仅在组装成复合物后产生靶向和募集功能。在两个寡核苷酸退火、形成dsRNA部分的情况下，它们实际上可以在退火时产生募集功能。退火是形成复合物的一种方式，但是很明显，两种(或多种)寡核苷酸组分可以通过其它方式聚合在一起，从而联合靶向和募集功能。包含多于两个寡核苷酸的寡核苷酸构建体并不排除在本发明的范围之外，尽管每个构建体的寡核苷酸的数目越大，该体系根据制造、分析、配方、给药或处理其他方面(包括物流和成本)越复杂。

哺乳动物细胞

本发明涉及真核细胞(优选后生动物、更优选哺乳动物细胞)中靶RNA序列的修饰。原则上，本发明可用于来自任何哺乳动物物种的细胞，但优选用于人细胞。

本发明可用于来自以下任何器官的细胞：例如皮肤、肺、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、肠、肌肉、腺体、眼睛、脑、血液等。本发明特别适用于修饰在(人)受试者的患病状态中密切相关的细胞、组织或器官中的序列。这样的细胞包括但不限于肺或胃肠道的上皮细胞、生殖器官的细胞、肌肉细胞、眼的细胞、皮肤的细胞、来自组织和器官(比如肝脏、肾脏、胰腺)的细胞、免疫细胞、癌细胞、腺细胞、脑细胞等。

本发明也可以用于并非天然存在于生物体中的哺乳动物细胞，例如，用于细胞系或胚胎干(ES)细胞。

本发明可用于各种类型的干细胞，包括多能干细胞、全能干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞等。

细胞可以定位于体外或体内。本发明的一个优势是其可以用于活体中原位的细胞，但也可以用于培养的细胞。在一些实施方式中，将细胞离体处理，然后将其引入活体(例如，重新引入至最初从其中衍生的生物体)。

本发明也可用于在所谓的类器官内的细胞中编辑靶RNA序列。可以认为类器官是三维体外衍生的组织，但是使用特定条件驱动以产生单独的分离的组织(例如，参见Lancaster和Knoblich，Science 2014，vol.345 no.6194 1247125)。在治疗环境中，它们是有用的，因为它们可以在体外从患者的细胞中衍生出来，然后可以将类器官作为自体移植材料重新引入患者，该材料与正常移植相比不太可能被排斥。因此，根据另一个优选的实施方式，本发明可以在从患者取得的组织样品(例如从其胃肠道，参见Sala等人J SurgRes.2009；156(2)：205-12，以及Sato等人Gastroenterology 2011；141：1762-72)中生长的类器官上实施；在根据本发明进行RNA编辑时，可以使用类器官或类器官中存在的干细胞，移植回患者以改善器官功能。

待治疗的细胞通常具有遗传突变。突变可以是杂合的或纯合的。本发明通常用于修饰点突变，比如N至A突变，其中N可以是G、C、U(在DNA水平上为T)，优选G至A突变；或N至C突变，其中N可以是A、G、U(在DNA水平上为T)，优选U至C突变。包含特别感兴趣的突变的基因将在下面讨论。然而，在一些实施方式中，以相反的方式通过将疾病相关的突变引入细胞系或动物中来使用本发明，以便为讨论中的疾病提供有用的研究工具。作为创建疾病模型的例子，我们提供了一个寡核苷酸序列，其在人细胞中提供用于编辑活性的募集，以在CEP290基因中产生突变，产生隐蔽剪接位点，其形成先天性儿童失明的最常见形式先天性利伯氏黑蒙(Leber’s Congenital Amaurosis)。

有待通过RNA编辑恢复的突变可以出现在染色体或DNA的某些其他形式(比如线粒体DNA)或RNA(包括mRNA前体、核糖体RNA或线粒体RNA)的水平上。待进行的改变可以在已经感染细胞或受试者的以下病原体的靶RNA中：包括真菌、酵母、寄生虫、动粒细胞、细菌、噬菌体、病毒等。随后，编辑可以在这种细胞、受试者或病原体内的靶序列的RNA水平上发生。某些病原体，比如病毒，将其核酸、DNA或RNA释放到感染的宿主(细胞)的细胞中。其他病原体在受感染的宿主中存在或循环。本发明的寡核苷酸构建体可用于编辑受感染真核宿主细胞中存在的靶RNA序列，或编辑真核宿主中存在或循环的病原体细胞内的RNA序列，只要待发生编辑的细胞包含与施用于其中的寡核苷酸构建体相容的编辑实体。

不希望束缚于理论，认为通过hADAR1和hADAR2的RNA编辑在转录或剪接期间发生在细胞核中的mRNA前体上。认为通过胞苷脱氨酶的RNA编辑发生在mRNA水平上。不排除成熟mRNA中线粒体RNA密码子或非编码序列的编辑。

靶序列和变化

本发明通过使用寡核苷酸构建体而用于使真核细胞中的靶RNA序列发生变化，该寡核苷酸构建体能够靶向待编辑的位点并募集细胞中存在的RNA编辑实体以引起编辑反应。优选的编辑反应是腺苷脱氨基作用和胞苷脱氨基作用，分别将腺苷转变成肌苷以及将胞苷转变成尿苷。这些变化可能是在靶RNA的5’或3’非翻译区、(隐蔽)剪接位点、外显子(改变从靶RNA翻译的蛋白质中的氨基酸，通过改变外显子剪接沉默子或增强子而改变密码子使用或剪接行为，通过引入或去除起始或终止密码子)、内含子(通过改变内含子剪接沉默子或内含子剪接增强子、分支点而改变剪接)以及通常影响RNA稳定性、结构或功能性的任何区域中。靶RNA序列可以包含可能希望校正或改变的突变，比如(转变或转换)。或者，故意地将靶RNA突变以产生之前没有突变的改变的表型(或基因型，在基于RNA的生物体例如RNA病毒的情况下)。例如，可以制备携带靶RNA序列中的变化(突变)的细胞系或动物，其可用于试验中，或作为(动物、类器官等等)模型体系来研究疾病，测试针对疾病的实验化合物等。根据本发明的寡核苷酸构建体和方法可以用于高通量筛选系统(以阵列形式)，用于制备具有大量靶RNA的细胞库，例如编码大量蛋白质亚型、用于进一步实验包括复合筛选、蛋白质工程等。

靶RNA可以是任何细胞的或病毒的RNA序列，但更通常是具有蛋白质编码功能的mRNA前体或mRNA。

为了便于参考，并且并不意在限制本发明，提供下表以说明由本发明的寡核苷酸引导的腺苷脱氨酶编辑可引起的潜在的密码子变化。不应将该表具体解释为将本发明的适用性限制于任何RNA的编码序列；如已经指出的，本发明可以在包含腺苷的任何RNA靶标上实施，无论是编码区、内含子、非编码外显子(比如5’-或3’非翻译区)、miRNA、tRNA、rRNA等。为了避免对适用性的范围的任何误解，从编码的角度来看，无关紧要(“沉默的”)的变化可能仍然会改变某种蛋白质的基因表达，因为相同氨基酸的某些密码子可能比其他氨基酸的更优选，并且可能导致例如不同的转录稳定性或翻译效率，导致编码的蛋白质相比于没有变化者而更加或者更不丰足。

用于使用根据本发明的寡核苷酸进行编辑的特别令人感兴趣的靶腺苷酸是那些作为定义关键功能或特征的氨基酸残基的密码子的一部分，这种氨基酸残基比如催化位点、其他蛋白质的结合位点、用于底物结合的结合位点、用于共翻译修饰或翻译后修饰比如糖基化、羟基化、肉豆蔻酰化、蛋白酶的蛋白切割(以成熟蛋白质和/或作为细胞内途径的一部分)等的定位结构域。

许多遗传性疾病是由G至A突变引起的，并且这些是优选的靶疾病，因为突变靶腺苷处的腺苷脱氨基作用会将突变逆转为野生型。然而，逆转至野生型对于获得有益的效果可能并不总是必要的。如果野生型核苷酸不是G，则靶标中A至G的修饰也可以是有益的。在某些情况下，可以预测是这种情况，其他可能需要进行一些测试。在某些情况下，从野生型不是G的靶RNA中的A至G的修饰可以是沉默的(未翻译成不同的氨基酸)、或其他方式无结果的(例如氨基酸被替换但它构成了不破坏蛋白质结构和功能的保守替换)、或者氨基酸是具有一定的变化稳定性(robustness)的功能结构域的一部分。如果根据本发明通过编辑产生的A至G转变是在非编码RNA或RNA的非编码部分中，则结果也可能与原始突变相比无关紧要的或不那么严重。本领域普通技术人员将理解，本发明的适用性非常广泛，并且甚至不限于预防或治疗疾病。本发明也可用于修饰转录物以研究其效果，即使或特别是当这种修饰在例如细胞或非人动物模型中诱导患病状态时。

可以用根据本发明的寡核苷酸预防和/或治疗的遗传性疾病的优选的实例是其中靶RNA中的一个或多个腺苷的修饰将带来(潜在的)有益变化的任何疾病。

作为根据本发明的潜在靶RNA序列的转录RNA序列，其包含特别感兴趣的突变，包括但不限于转录自CFTR基因(囊性纤维化跨膜电导调节子)、肌营养不良蛋白、亨廷顿蛋白(huntingtin)、神经纤维瘤蛋白1、神经纤维瘤蛋白2、血红蛋白的β-球蛋白链、CEP290(中心体蛋白质290kDa)、β-氨基己糖苷酶A的HEXA基因和负责称为尤塞氏综合症(Ushersyndrome)的遗传性失明的一种形式的尤塞氏(Usher)基因(例如编码Usherin的USH2B)的任何一种的那些。下面进一步提供一个更广泛的列表。将相应地选择靶序列，并且寡核苷酸构建体将包括所需的修饰以校正突变。

CF突变领域的技术人员认识到在CFTR基因中1000和2000之间的突变包括R117H、G542X、G551D、R553X、W1282X和N1303K是已知的。

通常，使用本发明的寡核苷酸构建体可逆转的任何靶RNA中的突变，在腺苷脱氨酶募集的情况下为G至A突变，并且在胞苷脱氨酶募集的情况下为U至C突变，并且能够相应地设计寡核苷酸构建体。可以使用根据本发明的寡核苷酸构建体进行靶向的突变，在募集腺苷脱氨酶的情况下还包括C至A、U至A(在DNA水平上为T至A)，并且在募集胞苷脱氨酶的情况下为A至C和G至C突变。尽管在后一种情况下的RNA编辑可能不一定将突变恢复为野生型，但编辑的核苷酸可能会比原始突变产生改善。例如，可以将引起读码框终止密码子的突变——在翻译后产生截短的蛋白质——改变成一个密码子，其编码的氨基酸可能不是该位置的原始氨基酸，但是其产生具有至少一些功能性(至少比截短的蛋白质更多功能性)的(全长)蛋白质。

靶序列对于真核细胞、优选哺乳动物、更优选人细胞是内源的。因此，靶序列不是例如已经在细胞经历中的某一点人工引入的转移基因或标志物基因，而是天然存在于细胞中的基因(无论是突变还是非突变形式)。

本发明不限于校正突变，因为相反，其可以通过应用本发明的寡核苷酸，用于将野生型序列改变为突变的序列。其中对于修饰野生型腺苷可能有利的一个实例是引起外显子的跳过，例如通过修饰恰好是剪接所述外显子所需的分支位点的腺苷。另一个实例是其中腺苷界定或者是用于蛋白质结合的识别序列的一部分的情形，或者参与限定mRNA稳定性的二级结构的情形。因此，如上所述，本发明可用于为疾病提供研究工具、引入比现有突变不那么有害的新突变等。

寡核苷酸构建体的应用

待施用的寡核苷酸构建体的量、剂量和配量方案可以根据细胞类型、待治疗的疾病、靶群体、给药模式(例如全身与局部相比)、疾病的严重程度和可接受的副作用水平而不同，但是在体外研究、临床前和临床试验中，这些可以并且应该通过反复尝试来评估。当修饰的序列导致容易检测到的表型变化时，这些试验特别明确。可能较高剂量的寡核苷酸可以竞争结合细胞内的核酸编辑实体(例如ADAR)，从而消耗可以自由参与RNA编辑的实体的量，但常规配量试验将显示任何给定寡核苷酸和给定靶标的这种效应。

一种合适的试验技术包括将寡核苷酸构建体递送至细胞系或测试生物体，然后在其后的不同时间点取活检样本。可以在活检样本中评估靶RNA的序列，并且随后可以容易地评估具有修饰的细胞的比例。在已经进行一次该试验之后，然后可以保留知识并且可以进行将来的递送，而无需采取活检样本。

因此，本发明的方法可以包括鉴定细胞的靶RNA序列中所需变化的存在的步骤，从而验证已经修饰了靶RNA序列。该步骤通常包括靶RNA或其cDNA拷贝(或如果靶RNA是mRNA前体的情况下，其剪接产物的cDNA拷贝)的相关部分的测序，如上所述，并且因此可以容易地验证序列变化。或者，该变化可以在蛋白质的水平(长度、糖基化、功能等)或通过某种功能的读出比如(诱导型)电流(例如当由靶RNA编码的蛋白质是离子通道时)来进行评估。在CFTR功能的情况下，包括人在内的哺乳动物的Ussing小室测定或NPD测试是本领域技术人员熟知的，以评估功能的恢复或获得。

在细胞中发生RNA编辑之后，修饰的RNA可以随时间而稀释，例如由于细胞分裂、编辑的RNA的有限半衰期等等。因此，在实际治疗条件中，本发明的方法可以包括重复递送寡核苷酸构建体，直到已经修饰足够的靶RNA，以向患者提供切实的益处和/或随时间而维持该益处。

寡核苷酸构建体的递送

本发明的寡核苷酸构建体特别适用于治疗用途，并因此本发明提供包含本发明的寡核苷酸构建体和药学上可接受的载体的药物组合物。在本发明的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以简单地是盐水溶液。这可以有用地是等渗或低渗的，特别是用于肺部输送。

本发明还提供包括本发明的药物组合物的递送装置(例如注射器、吸入器、雾化器)。

本发明还提供本发明的寡核苷酸构建体，如本文所述，其用于在哺乳动物、优选人细胞中进行靶RNA序列改变的方法。类似地，本发明提供本发明的寡核苷酸构建体如本文所述的在制备用于在哺乳动物、优选人细胞中进行靶RNA序列改变的药物中的用途。

用于治疗的配方、配量和给药模式

根据本发明的寡核苷酸构建体适当地以水溶液进行施用，例如盐水或悬浮液，其任选地包含与药物使用相容的添加剂、赋形剂和其它成分，浓度范围为1ng/ml至1g/ml，优选为10ng/ml至500mg/ml，更优选为100ng/ml至100mg/ml。剂量可以适当地在约1μg/kg至约100mg/kg之间，优选在约10μg/kg至约10mg/kg，更优选在约100μg/kg至约1mg/kg的范围内。给药可以通过吸入(例如通过雾化)(鼻内、口服)、通过注射或灌注(静脉内、皮下、皮内、颅内、肌内、气管内、腹膜内、直肠内)、通过直接注射入肿瘤等。给药可以以固体形式、粉末形式、丸剂形式，或以相容于在人中的药物使用的任何其它形式。

本发明特别适用于治疗遗传性疾病，比如囊性纤维化、白化病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、哮喘、β地中海贫血症、Cadasil综合征、进行性腓肌萎缩(Charcot-Marie-Tooth)病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、杜氏型和贝氏型肌营养不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy)、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、第五凝血因子相关疾病(Factor VLeiden associated disorders)、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病(Gaucher’sDisease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色素沉着病、亨特氏综合征(HunterSyndrome)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、赫勒氏综合症(Hurler Syndrome)、炎性肠病(IBD)、继发性多聚凝集综合征(Inherited polyagglutination syndrome)、Leber先天性黑内障、自毁容貌综合症(Lesch-Nyhan syndrome)、林奇综合征(Lynch syndrome)、马凡氏综合症(Marfan syndrome)、粘多糖贮积症、肌肉萎缩症、I型和II型强直性营养不良、神经纤维瘤病、A、B和C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、NY-eso1相关的癌症、帕金森氏病、黑斑息肉综合征(Peutz-Jeghers Syndrome)、苯丙酮酸尿症、庞贝氏病(Pompe’sdisease)、原发性睫状病、凝血酶原突变相关疾病比如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高压、色素性视网膜炎、Sandhoff病、严重联合免疫缺陷综合征(SCID)、镰刀形细胞贫血症、脊髓性肌肉萎缩症、Stargardt病、Tay-Sachs病、尤塞氏综合症(Usher syndrome)、X连锁免疫缺陷症、各种形式的癌症(例如BRCA1和BRCA2连锁的乳腺癌和卵巢癌)等。

在一些实施方式中，寡核苷酸构建体可以全身递送，但更有代表性的是将寡核苷酸构建体递送到在其中观察到靶序列表型的细胞。例如，CFTR中的突变导致囊性纤维化，其主要在肺上皮组织中观察到，因此对于CFTR靶序列，优选将寡核苷酸构建体特异性地并直接地递送至肺。这可以通过例如粉末或气溶胶的吸入方便地实现，通常通过使用雾化器。特别优选的是使用所谓的振动筛网的喷雾器，其包括来自伟康公司(Respironics)的PARIeFlow(Rapid)或i-neb。本发明人已经发现，寡核苷酸构建体的吸入使用可导致寡核苷酸构建体的全身分布并由肠、肝、胰腺、肾和唾液腺组织等中的细胞摄取。因此，预期根据本发明的寡核苷酸构建体的吸入递送也可以有效地靶向这些细胞，在CFTR基因靶向的情况下，这可以导致与囊性纤维化相关的胃肠道症状的改善。对于其它靶序列，取决于疾病和/或靶器官，给药可以是局部的(例如在皮肤上)、皮内、皮下、肌肉内、静脉内、口服、眼睛注射等。

在某些疾病中，粘液层显示厚度增加，导致药物通过肺的吸收减少。一种这样的疾病是慢性支气管炎，另一个实例是囊性纤维化。各种形式的粘液正常化剂(normalizer)是可用的，比如DNA酶、高渗盐水或可以以Bronchitol的名称商购的甘露醇。当粘液正常化剂与RNA编辑寡核苷酸构建体(比如本发明的寡核苷酸构建体)组合使用时，它们可能增加这些药物的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建体施用于受试者、优选人受试者，优选与粘液正常化剂、优选本文所述的那些粘液正常化剂组合。此外，施用根据本发明的寡核苷酸构建体可以与施用用于治疗CF的小分子组合，比如增效剂化合物例如Kalydeco(ivacaftor；VX-770)，或校正化合物，例如VX-809(lumacaftor)和/或VX-661。CF的其它组合疗法可以包括本发明的寡核苷酸构建体与腺苷脱氨酶的诱导剂(使用IFN-γ或TNF-α)组合使用。

或者，或与粘液正常化剂组合，可以应用粘液穿透颗粒或纳米颗粒中的递送，用于将RNA编辑分子有效递送至例如肺和肠的上皮细胞。因此，将本发明的寡核苷酸构建体施用于受试者、优选人受试者，优选使用粘液穿透颗粒或纳米颗粒中的递送。

慢性和急性肺部感染通常存在于患有比如囊性纤维化的疾病的患者中。抗生素治疗减少细菌感染和比如粘液增厚和/或生物膜形成的症状。与根据本发明的寡核苷酸构建体组合使用抗生素可以增加RNA编辑的有效性，这是由于寡核苷酸构建体更容易接近靶细胞。因此，将本发明的寡核苷酸构建体施用于受试者、优选人受试者，优选与抗生素治疗组合以减少细菌感染和比如粘液增厚和/或生物膜形成的症状。施用抗生素可以全身或局部或两者进行。

为了应用于例如囊性纤维化患者中，根据本发明的寡核苷酸构建体或根据本发明的包装或复合的寡核苷酸构建体可以与任何粘液正常化剂如DNA酶、甘露醇、高渗盐水和/或抗生素和/或用于治疗CF的小分子比如增效剂化合物例如ivacaftor或校正化合物例如lumacaftor和/或VX-661组合。

为了增加对靶细胞的接近，可以在施用根据本发明的寡核苷酸构建体之前，应用支气管肺泡灌洗液(BAL)来清洁肺。

本发明还提供包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3中任一个的核苷酸序列的寡核苷酸构建体：

GFP SEQ ID NO：1 5′-cgcgcgttttcgcgcgAC*C -3′

CEP290 SEQ ID NO：2 5′-cgcgcgttttcgcgcgAC*U-3′

CFTR SEQ ID NO：3 5′-cgcgcgttttcgcgcgAC*C-3′

相应序列SEQ ID NO：9G551D mRNA 3′-GCAACUA*GAGGUGAG-5′

小写字母＝具有形成Z-DNA结构倾向的DNA

粗体带下划线＝2’-O-甲基

斜体＝硫代磷酸酯核苷间键和2’-O-甲基

C*＝与待编辑的靶腺苷相对的碱基

类似地，本发明还提供包含SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：22中任一个的核苷酸序列的寡核苷酸构建体(以及任选地，对这样的核苷酸序列的实施例1中所述的核酸修饰)或SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQID NO：41(以及任选地对这些核苷酸序列的实施例2至5中所述的核酸修饰)。

通用

术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和次黄嘌呤(肌苷中的核碱基)是指这样的核碱基。

术语腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、尿苷和肌苷是指与(脱氧)核糖基糖连接的核碱基。

术语“核苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的核碱基。

术语核苷酸是指各自的核碱基-(脱氧)核糖基-磷酸连接物，以及核糖部分或磷酸基团的任何化学修饰。因此，该术语将包括：包含闭锁的核糖基部分(包含2’-4’桥、包含亚甲基或本领域中熟知的任何其它基团)的核苷酸、包含接头的核苷酸，该接头包括磷酸二酯、磷酸三酯、(二)硫代磷酸酯、甲基膦酸酯类、氨基磷酸酯接头等。

有时术语腺苷和腺嘌呤、鸟苷和鸟嘌呤、胞嘧啶和胞苷、尿嘧啶和尿苷、胸腺嘧啶和胸苷、肌苷和次黄嘌呤，可互换使用以指相应的核碱基、核苷或核苷酸。

有时术语核碱基、核苷和核苷酸可互换使用，除非上下文明确要求不同。

无论何时提及“寡核苷酸”，都是指寡核糖核苷酸和脱氧寡核糖核苷酸二者，除非上下文另有说明。无论何时提及寡核糖核苷酸，其可以包含碱基A、G、C、U或I。无论何时提及脱氧寡核糖核苷酸时，其可以包含碱基A、G、C、T或I。

无论何时提及寡核苷酸构建体中的核苷酸，包括比如胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶和β-D-葡糖基-5-羟基-甲基胞嘧啶；当提及腺嘌呤时，包括N6-甲基腺嘌呤和7-甲基腺嘌呤；当提及尿嘧啶时，包括二氢尿嘧啶、4-硫尿嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶；当提及鸟嘌呤时，包括1-甲基鸟嘌呤。

无论何时提及核苷或核苷酸，都包括呋喃核糖衍生物比如2’-脱氧，2’-羟基，和2’-O-替换的变体比如2’-O-甲基，以及包括2’-4’桥连突变体的其它修饰。

无论何时提及寡核苷酸，两个单核苷酸之间的键可以是磷酸二酯键以及其修饰，包括磷酸二酯、磷酸三酯、(二)硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯接头等。

术语“包括(comprising)”涵盖“包含(including)”以及“组成”。例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包含另外的某物，例如X+Y。

与数值x有关的术语“约”是任选的，并且指例如x±10％。

单词“基本上(substantially)”不排除“完全地”。例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在相关的情况下，从本发明的定义中可以省略“基本上”一词。

与核酸序列的术语“下游”是指在3’方向进一步延伸序列；术语“上游”是指反过来。因此，在编码多肽的任何序列中，起始密码子在有义链中在终止密码子的上游，但在反义链中在终止密码子的下游。

提及“杂交”通常是指特异性杂交，并排除非特异性杂交。特异性杂交可以使用本领域熟知的技术在所选择的实验条件下发生，以确保探针和靶标之间大部分稳定的相互作用，其中探针和靶标具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的序列同一性。

附图说明

图1：靶RNA序列和根据本发明的寡核苷酸构建体的简图；A：寡核苷酸构建体设计为单个寡核苷酸“单腿”构建体，其靶向部分在其3’端并且募集部分在其5’端。B：寡核苷酸构建体设计为单个寡核苷酸“单腿”构建体，其靶向部分在其5’末端并且募集部分在其3’端；将编辑实体描绘为灰色结构，描绘了左侧的识别结构域和右侧的催化结构域，表明靶位点处的脱氨基反应(闪光符号)。

图2：靶RNA结构与寡核苷酸构建体的简图：A示出在靶向部分和募集部分之间具有接头的寡核苷酸构建体；B示出其中寡核苷酸构建体包含两个寡核苷酸序列——非共价结合——通过Watson-Crick反义碱基配对通过它们各自的3’部分相互作用的实施方式。

图3：靶RNA结构与以“双腿”形式的寡核苷酸构建体的简图，其中靶向部分由募集部分分开(或“分裂”)；A示出相对于寡核苷酸构建体的募集部分，在靶RNA序列中的上游的编辑位点；B示出相对于寡核苷酸构建体的募集部分，在靶RNA序列中的下游的编辑位点。

图4：用pGFPstop57和指定的寡核苷酸进行脂质体转染后HeLa细胞中显示绿色荧光的孔的荧光显微法，除了：左上孔道(panel)是未处理的细胞；底部四个孔道是没有接收指定成分中的至少一个的对照。图4a和4b仅通过对比度不同。

图5：用pGFPstop57、pADAR2和寡核苷酸#11以两种质粒的不同比例进行脂质体转染后，HeLa细胞中显示绿色荧光的孔的荧光显微法。左上方孔道是未处理的细胞；底部孔道示出具有编码非突变GFP而不是pGFPstop57的质粒的细胞。

图6：未处理或用50nM或200nM寡核苷酸#11(或500nM对照寡核苷酸)与pGFPstop57一起转染后24或48小时，在HeLa细胞中显示绿色荧光的孔的荧光显微法。

图7：未处理(左峰)或转染的(右峰)HeLa细胞的FACS光谱。在7A-7F中，细胞用pGFPstop57和寡核苷酸#11转染。在7B-7F(但不是7A)中，细胞用pADAR2也进行转染。在7G和7H中，表达非突变型GFP。

如本文中对本发明的详细描述中所解释的，附图中所示的所有实施方式可以组合。

实施例

实施例1：通过定点A至I编辑，逆转GFP靶RNA中的无义突变

待使用的寡核苷酸构建体：5’-cgcgcgttttcgcgcgAC*C -3’(SEQ ID NO：1)。HeLa细胞(ATCC，CCL-2)在补充有10％热灭活的胎牛血清的DMEM培养基(Life Technologies)中培养。将细胞保持在具有5％CO₂的加湿空气气氛中。在转染前一天将细胞接种在24孔板中，并且这时它们达到70-80％融合。使用由于终止密码子TGA而具有消除的GFP活性的GFP报告子构建体。将100-200ng质粒DNA和500ng寡核苷酸(10-100pmol)构建体在适量的Opti-MEM I培养基(Life Technologies)和Lipofectamine 2000试剂中混合，并且根据制造商的程序转染细胞。将细胞在CO₂培养箱中在37℃下培养，并且4-6小时后更换培养基。48小时后，在荧光显微镜下分析细胞以评估寡核苷酸恢复GFP表达的效率。

进一步的实验再次使用由质粒(‘pGFPstop57’)表达的由于G→A点突变而具有内部TAG终止密码子的突变型GFP。另外用编码ADAR2的质粒转染细胞，以确保细胞能够进行RNA编辑。基于GFP突变特异性的靶向部分和基于GluR-B的募集部分的原理，制备各种寡核苷酸用于通过突变的A残基的脱氨基作用来恢复GFP表达。

测试了7种RNA寡核苷酸，以及这些靶向的短、中或长形式的GluR-B(S/M/L；募集部分的不同长度)。此外，它们具有任一顺序(上游/下游)的靶向和募集部分，并且在一些情况下，寡核苷酸包括化学修饰区域(对募集部分进行化学修饰以包含2’-OMe糖和硫代磷酸酯键；以相同的方式修饰靶向部分，除了突变的A位置(双下划线)及其两侧翼核苷酸)。所有寡核苷酸包含SEQ ID NO：7(下划线)，并且GFP靶向部分以粗体显示：

HeLa细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清的DMEM培养基中培养。将细胞保持在具有5％CO₂的加湿空气气氛中。在转染前一天将8x10⁴个细胞接种在24孔板的一个孔中，并且当它们达到70-80％融合时，根据制造商的程序通过使用Lipocetamine 2000用(i)寡核苷酸+GFPstop57质粒或(ii)寡核苷酸+GFPstop57+ADAR2质粒进行瞬时转染。在转染后24小时更新培养基，并且24小时后在荧光显微镜下检查GFP表达。

还进行FACS分析。将细胞用胰蛋白酶消化并收集在微量离心管中，然后重悬于流式细胞术染色缓冲液中。基于使用前向散射和侧向散射(不包括碎屑)的形态特性来选择完整细胞。在完整细胞中，计算GFP平均荧光强度(MFI)的中值和平均值。使用布局编辑器创建叠加直方图。

未用ADAR质粒转染的细胞的结果在图4中示出，并且高于对照所见水平(其由于细胞和/或培养基成分的自发荧光)的绿色荧光对于所有七种寡核苷酸都是清楚可见的。寡核苷酸#10和#11得到最好的结果(两者都具有长的GluR-B募集部分)，并且具有上游募集部分(#11)的寡核苷酸稍好一些。

因此选择寡核苷酸#11用于进一步与编码ADAR2的质粒组合的研究。图5再次示出用寡核苷酸#11处理的细胞发出荧光高于在阴性对照中所见的水平。为了比较，用编码非突变GFP的质粒转染细胞，并且看到预期的荧光(图5，底部孔道)。

测试不同浓度的寡核苷酸#11，范围为50-1500nM。图6示出在使用50nM和200nM的24或48小时后，连同未处理的细胞(左)和用500nM具有与寡核苷酸#11相同长度和化学修饰的对照寡核苷酸进行测试的对照细胞的实例结果。寡核苷酸#11显示荧光随时间依赖性增加，这用对照寡核苷酸未见。

通过FACS，寡核苷酸对GFP表达的影响也是可见的(图7)。用寡核苷酸#11与(7B-7F)或不与(7A)ADAR2质粒处理的细胞相对于未处理的细胞(左侧峰)显示GFP荧光的增加。非突变型GFP用作阳性对照(7G-7H)。

实施例2：通过定点的A至I编辑，在CEP290靶RNA中引入隐蔽剪接位点

待使用的寡核苷酸构建体：5’-cgcgcgttttcgcgcgAC*U -3′(SEQ ID NO：2)。

所有细胞系都是由皮肤活检产生的人成纤维细胞。FBL1(CL10-00008)和FBL2(CL12-00027)是野生型，并代表对照细胞系，FBL3(CL12-00035)和FBL4(CL12-00036)均为CEP290突变的纯合突变体(c.2991+1655A＞G)。所有细胞系在补充有20％的FBS、1％Pen/strep和1％丙酮酸钠的DMEM培养基(Life Technologies)中生长。

在转染前一天，将细胞以2x10⁵/孔的密度接种在6孔板中，总体积为2.5ml的培养基。转染之日，使用maxPEI(Poliscience)作为转染剂，将待测试的AON以100nM的终浓度加入到每个孔中，质量比寡核苷酸∶PEI为1∶4。24小时后，用PBS洗涤细胞，收集细胞裂解物并在-80℃冷冻。

使用Promega试剂盒ReliaPrep RNA Cell Miniprep System，从已经保存在-80℃的细胞裂解液中分离RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计对总RNA进行定量。

根据制造商的说明书，使用Verso cDNA合成试剂盒(Thermoscientific)，将400ngRNA用作模板用于cDNA合成。

将cDNA稀释2.5倍用于该反应，并将2μl这些稀释的cDNA用作模板。靶序列的扩增使用来自Life Technologies的AmpliTaq360DNA聚合酶。使用的引物是ex26_Fw(SEQ ID NO：10)和ex27_Rv(SEQ ID NO：11)，PCR条件如下：在95℃保持5分钟，在95℃变性30秒，在58℃退火30秒，并且在72℃延伸35秒，35个循环，72℃下最终延伸7分钟。

使用来自Agilent technologies的Agilent DNA 1000Kit，在Agilent2100Bioanalyzer中分析PCR片段。该试剂盒包含由相互连接的微通道组成的芯片，通过该芯片，将片段基于它们的尺寸分离，因为它们通过该芯片进行电泳驱动。为了测量CEP290 mRNA的表达水平，分别将野生型和突变型转录物扩增为93bp和117bp片段。人P0大核糖体蛋白mRNA(RPLP0)用作标准化。使用的引物是wt_Fw(SEQ ID NO：12)、wt-Rv(SEQ ID NO：13)、mt_Fw(SEQ ID NO：14)和mt_Rv(SEQ ID NO：15)。对于该反应，来自Life Technologies的SYBR选择的主混合物以及稀释10倍的cDNA作为模板。PCR程序为50℃进行2分钟，95℃进行2分钟，50个循环：95℃进行15秒、62.5℃进行1分钟。

实施例3：通过定点的A至I编辑，逆转突变型CFTR G551D靶RNA中的氨基酸替换

待使用的寡核苷酸构建体：5’-cgcgcgttttcgcgcgAC*C -3’(SEQ ID NO：3)。

细胞系是分别由皮肤和心脏心包膜活检产生的人成纤维细胞GM00142和GM03465，Coriell Institute Cell Repository)。它们都是杂合子：一个等位基因携带deltaF508缺失突变(Phe508Del)，并且第二个等位基因携带核苷酸1784处的G至A转变(1784G＞A)，其将gly-551密码子(GGT)转变为asp(GAT)，导致CFTR基因中外显子11的错义突变[Gly551Asp(G551D)]。所有的细胞系都在补充有15％的未灭活FBS和1％的Pen/strep的具有Earle氏盐和非必需氨基酸的EMEM(Life Technologies)中生长。

在转染前一天，将细胞以2x10⁵/孔的密度接种在6孔板中，总体积为2.5ml的培养基。转染当日，使用maxPEI(Poliscience)作为转染剂，将待测试的寡核苷酸以100nM的终浓度加入到每个孔中，质量比寡核苷酸∶PEI为1∶4。24小时后，用PBS洗涤细胞，收集细胞裂解物并在-80℃冷冻。

使用Promega试剂盒ReliaPrep RNA Cell Miniprep System，从已经保存在-80℃的细胞裂解液中分离RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计对总RNA进行定量。根据制造商的说明书，使用Verso cDNA合成试剂盒(Thermoscientific)，将400ng RNA用作模板用于cDNA合成。首先将0.4μM正向和反向引物、25μM的各dNTP、1×AmpliTaq360缓冲液、3.12530mM MgCl₂和1.0单位的AmpliTaq360聚合酶(所有都来自LifeTechnologies)组装，对1μl的cDNA进行PCR。使用的引物是SEQ ID NO：26(fwd)和SEQ IDNO：27(rev)。使用以下循环条件进行PCR循环。在95℃下进行7分钟的初始变性步骤，随后进行30次循环的95℃30秒、55℃30秒和72℃45秒。通过在72℃下7分钟的最终延伸期终止PCR扩增。在巢式PCR程序中使用1μl先前的PCR，该程序包含350.4μM正向引物和每样品的独特MiSeq index引物、25μM的各dNTP、1×AmpliTaq360缓冲液、3.125mM MgCl₂和1.0单位的AmpliTaq360聚合酶。使用以下循环条件进行PCR循环：在95℃下进行7分钟的初始变性步骤，随后进行25次循环的95℃30秒、60℃30秒和72℃45秒。在72℃下使用7分钟的最终延伸期终止反应。在将含有MiSeq序列引物序列的PCR产物载入测序仪之前，使用2.0荧光计(Life Technologies)根据制造商的方案测量纯化的PCR产物的浓度。总之，通过在工作溶液中制备2种储备标准品的20倍稀释液来为两种标准品制备测定管。对于每个样品，在10个单独的管中制备200μl工作溶液，将1μl PCR产物置于该溶液中并通过涡旋混合几秒钟。相对于两种标准品测量样品，并相应地计算以ng/μl计的浓度。PCR产物的测序在来自Illumina的MiSeq^TM系统上进行，该系统使用通过合成测序(sequencing-by-synthesis)以提供快速的高质量序列数据。

实施例4：通过靶向的A至I编辑来逆转α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)转录物中的氨基酸替换突变，用于治疗A1AT缺陷症

寡核苷酸(SEQ ID NO：28)：

ADAR45：rGrGrArArUrArGrUrArUrArArCrArArUrArUrgrcrurararArUrGrUrUrGrUrUrArUrArGrUrArUrCrCrCmC*mA*mG*mU*mCmCmCmUmUmUmCrUrCrGmUmCmGmAmUmGmG*mU*mC*mA*mG

ADAR47：mG*mG*mA*mA*mU*mA*mG*mU*mA*mU*mA*mA*mC*mA*mA*mU*mA*mU*mG*mC*mU*mA*mA*mA*mU*mG*mU*mU*mG*mU*mU*mA*mU*mA*mG*mU*mA*mU*mC*mC*mCmC*mA*mG*mU*mCmCmCmUmUmUmCrUrCrGmUmCmGmAmUmGmG*mU*mC*mA*mG

r＝无修饰

m＝2’O-Me

*＝硫代磷酸酯键

肝成纤维细胞的转染

肝成纤维细胞提供自Coriell Cell Repository(GM11423)，其从Z等位基因(ZZ)纯合的供体受试者中分离，该Z等位基因由SERPINA1基因的外显子5的核苷酸9989处的G＞A转变[9989G＞A]产生，导致在赖氨酸替换密码子342处的谷氨酸[Glu342Lys(E342K)]。将细胞保持在EMEM培养基(Life Technologies)中并以15％FBS进行补充。在转染前一天，将细胞接种在6孔板中，总体积为2ml的培养基。在转染当天，将寡核苷酸加入到1.5ml微量离心管中的1x PBS(Thermo Fisher Scientific)中，并与MaxPei(Polysciences)混合并共同孵育，并孵育20分钟。同时，从细胞中除去细胞培养基，并加入适量的含15％FBS的新鲜EMEM。然后将DNA/寡核苷酸-MaxPei稀释的混合物逐滴加入细胞。细胞在37℃下孵育，并且培养基在6-24小时后更新。

RNA分离

使用Reliaprep RNA Cell Miniprep System(Promega)根据制造商的程序进行RNA分离。简言之，除去培养基，并用冷PBS洗涤细胞。在6孔板的每个孔中加入250μl裂解缓冲液。将板缓缓摇动，并通过在孔表面上重复移液将细胞完全裂解。将85μl异丙醇按推荐的方式加入到裂解物中，并将裂解物转移至小柱，并以12,000-14,000g(RT)离心30秒，弃去液体。加入500μl RNA洗涤溶液，并以12,000-14,000g再次离心30秒。在无菌管中，通过将样品与24μl黄色核心缓冲液(Yellow Core Buffer)、3μl 0.09M MnCl₂、3μl DNA酶I合并来制备DNA酶I孵育主混合物，并将30μl新鲜制备的DNA酶I混合物加入至每个样品的柱中的膜，在室温下孵育15分钟。然后加入200μl柱洗涤溶液，并以12,000-14,000g离心15秒。然后加入500μl RNA洗涤溶液，并以12,000-14,000g离心30秒，并弃去液体。将小柱放入新的收集管中，并加入300μl RNA洗涤溶液，并以14,000g离心2分钟。将每个小柱放入洗脱管中，并将无核酸酶的水加入至膜并离心1分钟。最后，在Nanodrop测量RNA浓度。

cDNA合成

使用具有500ng或1000ng RNA输入的Verso cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher)进行cDNA合成。通过取所需量的RNA并通过加入水将其完成至总体积为11μl来制备RNA混合物。将混合物在70℃下加热5分钟，然后冷却。根据供应商提供的移液方案制备cDNA混合物。将9μl cDNA混合物放入反应管中，并加入11μl RNA混合物，并在热循环仪上在42℃下保持30分钟以及在95℃下保持2分钟。

PCR

使用AmpliTaq Gold 360DNA聚合酶1000U试剂盒(Applied Biosystems)进行PCR。通过加入1μl cDNA、2.5μl 10x缓冲液、3μl MgCl₂、0.5μl各dNTP、1μl各引物、0.5μl Taq聚合酶，并通过加入水至完成25μl，来制备PCR主混合物。PCR程序如下：95℃进行5分钟，进行35个循环的95℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，以及72℃进行7分钟。PCR后，在Bioanalyzer上使用DNA 1000试剂盒(Agilent)和程序运行样品。

PCR样品纯化

使用Nucleospin PCR清除试剂盒(Macherey-Nagel)纯化样品，以确保除去PCR产物的污染。将1体积的PCR样品与2体积NT1混合并将样品加载至凝胶，并将PCR清除柱置于收集管中，并以11000×g离心30秒。弃去液体，将柱放回收集管中。将700μl缓冲液NT3加入至凝胶，并以11000×g离心30秒。重复洗涤步骤，并将管以11000×g离心1分钟以除去缓冲液NT3。

将凝胶和PCR清除柱放入新的1.5ml微量离心管中，加入15-30μl缓冲液NE并在室温下孵育1分钟，然后以11000×g离心1分钟。通过使用Nanodrop方法测量DNA浓度。

限制性消化

PCR清除后，对SERPINA1扩增子进行Hyp99I限制性消化。该酶识别WT中CGACG序列中的最后一个G，并将扩增子切割成两段，但由于不存在第二个G，因此其不能在突变体型式中切割CGACA序列。因此，如果编辑成功，将会有一些WT DNA作为Hyp99I限制性消化的底物。1单位的Hyp99I(NEB)用于消化0.1μg DNA。使用0.5μg的DNA输入。将样品在不含核酸酶的水中稀释，并在37℃下孵育1-1.5小时，然后将样品在65℃下孵育20分钟后使酶失活。孵育后，使用DNA 1000试剂盒(Agilent)和程序将样品加载到Bioanalyzer上，以显示结果。

Taqman PCR

使用定制的SERPINA1SNP基因分型测定(ThermoFisher Scientific)进行SNP基因分型测定。该测定与限制酶消化测定并行进行，以探究哪种测定对于编辑检测更敏感。野生型和突变体SERPINA1特异性的探针分别附有不同的荧光基团VIC和FAM。因此，我们可以量化WT/突变体转录物的量的增加或减少。通过加入5μl主混合物和0.5μl探针-引物混合物制备反应混合物。使用的寡核苷酸序列是：WT探针(SEQ ID NO：29)、突变探针(SEQ ID NO：30)、正向引物(SEQ ID NO：31)和反向引物(SEQ ID NO：32)。将5.5μl反应混合物加入到96孔板的指定孔中。向每个孔中加入4.5μl cDNA。PCR程序运行如下：95℃进行10分钟，进行50个循环的92℃15秒和60℃90秒。通过使用CFX Manager分析结果。

实施例5：通过靶向的A至I编辑逆转LRRK2转录物中的氨基酸替换突变G2019S，用于治疗帕金森病

富含亮氨酸重复激酶2基因(LRRK2基因ID：120892)的催化性Roc-COR和激酶结构域的突变是家族性帕金森病(PD)的常见病因。我们开始使用AON靶向LRRK2mRNA前体转录物(转录RefSeq NM_198578.3)中的G2019S突变，AON能够通过全长或缩短的GluRB部分作为募集部分来募集ADAR1和ADAR2，该募集部分连接至对G6055位置处(参见下面的序列，突变的G带下划线)外显子41中的G至A突变周围的序列具有互补性的靶向部分。该突变也被鉴定为Genbank dbSNP变异rs34637584，通常称为G2019S。

在位置6055处突出显示wt G残基的LRRK2外显子41序列：

ATACCTCCACTCAGCCATGATTATATACCGAGACCTGAAACCCCACAATGTGCTGCTTTTCACACTGTATCCCAATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACGGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGGGGATAAAAACATCAGAGGGCACACCAG(SEQ ID NO：33)

突变体等位基因和翻译：

正常的等位基因和翻译(A至I编辑后)

已经设计了以下序列，以靶向LRRK2G2019S突变。粗体的核苷酸形成靶向部分；所有核苷酸均为2’-OMe，除了带下划线的那些；*表示PS键。AON的靶向部分的长度不同，为25个核苷酸(LRRK2-ADAR1和LRRK2-ADAR3)或30个核苷酸(LRRK-ADAR2和LRRK-ADAR4)。AON的募集部分的长度不同：缩短的GluRB募集部分(LRRK2-ADAR3和LRRK-ADAR4)和全长GluRB募集部分(IRRK2-ADAR1和LRRK-ADAR2)。

通过RNA测序、LRRK2(自)磷酸化状态的蛋白质印迹分析和建立的LRRK2相关线粒体表型(耗氧率和线粒体膜电位)的功能读数，在LRRK2G6055A突变体成纤维细胞中评估LRRK2的校正。参见：Tatiana等人(2012)Hum.Mol.Genet.21(19)：4201-4213；Smith等人(2015)Molecular Neurobiology，1-17；以及Grünewald等人(2014)Antioxidants&RedoxSignaling，20(13)，1955-1960。

使用Lipofectamine 2000将LRRK2G6055A纯合子成纤维细胞系fff-028(TelethonNetwork of Genetic Biobanks)、杂合子G6055A系ND29492、ND29542、ND29802和健康对照系GM023074、GM08402(Coriell Institute)用LRRK2-ADAR AON转染。48-96小时孵育后，进行以下分析：

1)为了检测A至I编辑的LRRK2转录物，裂解细胞，通过标准方法分离RNA，并使用以下SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的测序引物进行半定量RNA测序分析。A至I编辑的mRNA序列在LRRK2-ADAR-AON的转染后出现。

2)先前已经证实(Smith等人，2015)LRRK2G6055A蛋白在用线粒体膜去极化剂缬氨霉素(10μM)应激处理(24小时)后，由于激酶结构域的催化活性升高，与LRRK2wt相比表现出丝氨酸955处的自磷酸化水平升高。用LRRK2-ADAR-AON处理将缬氨霉素处理的LRRK2G6055A细胞的丝氨酸-955磷酸化至少部分降低，可能甚至完全达到野生型水平。这可以通过使用LRRK2磷酸化S955(Abcam克隆MJF-R11-(75-1))和总LRRK2(Abcam克隆MJFF2(c41-2))抗体的蛋白质印迹分析(Smith等人)进行评估。

3)LRRK2G6055A成纤维细胞显示线粒体呼吸(OXPHOS)的改变，包括增加的质子泄漏(Smith等人，2015；Grünewald等人，2014)，这在LRRK2-ADAR-AON转染后可逆转。使用Seahorse XF24细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)评估基础和强制呼吸条件下的耗氧率，该仪器是通过固态传感器探针以2秒的时间间隔测量培养基中溶解氧的浓度的装置。该分析可以与XF Xell Mito压力测试试剂盒(Seahorse Bioscience)一起进行，其通过用寡霉素、羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯基腙(FCCP)、鱼藤酮和抗霉素-A顺序处理，可以测定代谢参数比如基础呼吸、ATP产生、质子泄漏和最大呼吸。该测定根据制造商的说明书进行，并且质子泄漏定义为寡霉素处理后的剩余氧消耗。

4)与对照细胞相比，LRRK2G6055A成纤维细胞显示降低的线粒体膜电位(Smith等人，2015；Grünewald等人，2014)。线粒体膜电位用亲脂性阳离子染料四甲基罗丹明甲酯(TMRM)评估，其以非猝灭模式使用(0.5-30nM，经验确定)，负载在无酚红培养基中20分钟。染料负载后，通过活细胞共聚焦显微镜和图像分析测量稳态线粒体TMRM荧光。LRRK2-ADAR-AON转染可以将线粒体膜电位至少部分增加，可能甚至完全达到对照水平。

结论

上述实施例示出如何通过使用根据本发明的寡核苷酸构建体对靶RNA分子中的核苷酸进行定点编辑以在靶RNA序列进行所需的改变。实施例教导如何去除终止密码子以重新打开GFP表达构建体的读码框、创建剪接位点以改变编码CEP290的靶RNA的剪接模式、以及如何通过在编码突变体G551D CFTR蛋白的靶RNA序列中的密码子中进行改变以建立所需的氨基酸替换。可以方便地确认成功的RNA编辑，例如通过在GFP无义突变逆转的情况下观察荧光细胞、通过在CEP290编码RNA中引入隐蔽剪接位点的情况下观察来自野生型到突变体的凝胶中的RT-PR带的移位、以及在CFTR编码RNA中逆转G551D突变的情况下通过测序或通过使用功能测定法(例如Ussing小室测定法)，等等。也可以对α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和LRRK2进行类似的工作。

应当理解，本发明仅通过示例的方式进行描述，并且可以在保持在本发明的范围和精神内的同时进行修改。

序列表

SEQ ID NO：1编码eGFP中无义突变的DNA-RNA寡核苷酸构建体：

cgcgcgttttcgcgcgGCUGAACCACUGCAC

SEQ ID NO：2在hCEP290中创建隐蔽剪接位点的DNA-RNA寡核苷酸构建体：

cgcgcgttttcgcgcgGAGAUACUCACAAUU

SEQ ID NO：3编辑hCFTR中G551D突变的DNA-RNA寡核苷酸构建体：

cgcgcgttttcgcgcgCGUUGACCUCCACUC

SEQ ID NO：4以小写示出G551D hCFTR突变的hCFTR DNA(n为T或C)：

ATGCAGAGGTCGCCTCTGGAAAAGGCCAGCGTTGTCTCCAAACTTTTTTTCAGCTGGACCAGACCAATTTTGAGGAAAGGATACAGACAGCGCCTGGAATTGTCAGACATATACCAAATCCCTTCTGTTGATTCTGCTGACAATCTATCTGAAAAATTGGAAAGAGAATGGGATAGAGAGCTGGCTTCAAAGAAAAATCCTAAACTCATTAATGCCCTTCGGCGATGTTTTTTCTGGAGATTTATGTTCTATGGAATCTTTTTATATTTAGGGGAAGTCACCAAAGCAGTACAGCCTCTCTTACTGGGAAGAATCATAGCTTCCTATGACCCGGATAACAAGGAGGAACGCTCTATCGCGATTTATCTAGGCATAGGCTTATGCCTTCTCTTTATTGTGAGGACACTGCTCCTACACCCAGCCATTTTTGGCCTTCATCACATTGGAATGCAGATGAGAATAGCTATGTTTAGTTTGATTTATAAGAAGACTTTAAAGCTGTCAAGCCGTGTTCTAGATAAAATAAGTATTGGACAACTTGTTAGTCTCCTTTCCAACAACCTGAACAAATTTGATGAAGGACTTGCATTGGCACATTTCGTGTGGATCGCTCCTTTGCAAGTGGCACTCCTCATGGGGCTAATCTGGGAGTTGTTACAGGCGTCTGCCTTCTGTGGACTTGGTTTCCTGATAGTCCTTGCCCTTTTTCAGGCTGGGCTAGGGAGAATGATGATGAAGTACAGAGATCAGAGAGCTGGGAAGATCAGTGAAAGACTTGTGATTACCTCAGAAATGATTGAAAATATCCAATCTGTTAAGGCATACTGCTGGGAAGAAGCAATGGAAAAAATGATTGAAAACTTAAGACAAACAGAACTGAAACTGACTCGGAAGGCAGCCTATGTGAGATACTTCAATAGCTCAGCCTTCTTCTTCTCAGGGTTCTTTGTGGTGTTTTTATCTGTGCTTCCCTATGCACTAATCAAAGGAATCATCCTCCGGAAAATATTCACCACCATCTCATTCTGCATTGTTCTGCGCATGGCGGTCACTCGGCAATTTCCCTGGGCTGTACAAACATGGTATGACTCTCTTGGAGCAATAAACAAAATACAGGATTTCTTACAAAAGCAAGAATATAAGACATTGGAATATAACTTAACGACTACAGAAGTAGTGATGGAGAATGTAACAGCCTTCTGGGAGGAGGGATTTGGGGAATTATTTGAGAAAGCAAAACAAAACAATAACAATAGAAAAACTTCTAATGGTGATGACAGCCTCTTCTTCAGTAATTTCTCACTTCTTGGTACTCCTGTCCTGAAAGATATTAATTTCAAGATAGAAAGAGGACAGTTGTTGGCGGTTGCTGGATCCACTGGAGCAGGCAAGACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGGGTAAAATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAAAGCATGCCAACTAGAAGAGGACATCTCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAATCACACTGAGTGGAganCAACGAGCAAGAATTTCTTTAGCAAGAGCAGTATACAAAGATGCTGATTTGTATTTATTAGACTCTCCTTTTGGATACCTAGATGTTTTAACAGAAAAAGAAATATTTGAAAGCTGTGTCTGTAAACTGATGGCTAACAAAACTAGGATTTTGGTCACTTCTAAAATGGAACATTTAAAGAAAGCTGACAAAATATTAATTTTGCATGAAGGTAGCAGCTATTTTTATGGGACATTTTCAGAACTCCAAAATCTACAGCCAGACTTTAGCTCAAAACTCATGGGATGTGATTCTTTCGACCAATTTAGTGCAGAAAGAAGAAATTCAATCCTAACTGAGACCTTACACCGTTTCTCATTAGAAGGAGATGCTCCTGTCTCCTGGACAGAAACAAAAAAACAATCTTTTAAACAGACTGGAGAGTTTGGGGAAAAAAGGAAGAATTCTATTCTCAATCCAATCAACTCTATACGAAAATTTTCCATTGTGCAAAAGACTCCCTTACAAATGAATGGCATCGAAGAGGATTCTGATGAGCCTTTAGAGAGAAGGCTGTCCTTAGTACCAGATTCTGAGCAGGGAGAGGCGATACTGCCTCGCATCAGCGTGATCAGCACTGGCCCCACGCTTCAGGCACGAAGGAGGCAGTCTGTCCTGAACCTGATGACACACTCAGTTAACCAAGGTCAGAACATTCACCGAAAGACAACAGCATCCACACGAAAAGTGTCACTGGCCCCTCAGGCAAACTTGACTGAACTGGATATATATTCAAGAAGGTTATCTCAAGAAACTGGCTTGGAAATAAGTGAAGAAATTAACGAAGAAGACTTAAAGGAGTGCTTTTTTGATGATATGGAGAGCATACCAGCAGTGACTACATGGAACACATACCTTCGATATATTACTGTCCACAAGAGCTTAATTTTTGTGCTAATTTGGTGCTTAGTAATTTTTCTGGCAGAGGTGGCTGCTTCTTTGGTTGTGCTGTGGCTCCTTGGAAACACTCCTCTTCAAGACAAAGGGAATAGTACTCATAGTAGAAATAACAGCTATGCAGTGATTATCACCAGCACCAGTTCGTATTATGTGTTTTACATTTACGTGGGAGTAGCCGACACTTTGCTTGCTATGGGATTCTTCAGAGGTCTACCACTGGTGCATACTCTAATCACAGTGTCGAAAATTTTACACCACAAAATGTTACATTCTGTTCTTCAAGCACCTATGTCAACCCTCAACACGTTGAAAGCAGGTGGGATTCTTAATAGATTCTCCAAAGATATAGCAATTTTGGATGACCTTCTGCCTCTTACCATATTTGACTTCATCCAGTTGTTATTAATTGTGATTGGAGCTATAGCAGTTGTCGCAGTTTTACAACCCTACATCTTTGTTGCAACAGTGCCAGTGATAGTGGCTTTTATTATGTTGAGAGCATATTTCCTCCAAACCTCACAGCAACTCAAACAACTGGAATCTGAAGGCAGGAGTCCAATTTTCACTCATCTTGTTACAAGCTTAAAAGGACTATGGACACTTCGTGCCTTCGGACGGCAGCCTTACTTTGAAACTCTGTTCCACAAAGCTCTGAATTTACATACTGCCAACTGGTTCTTGTACCTGTCAACACTGCGCTGGTTCCAAATGAGAATAGAAATGATTTTTGTCATCTTCTTCATTGCTGTTACCTTCATTTCCATTTTAACAACAGGAGAAGGAGAAGGAAGAGTTGGTATTATCCTGACTTTAGCCATGAATATCATGAGTACATTGCAGTGGGCTGTAAACTCCAGCATAGATGTGGATAGCTTGATGCGATCTGTGAGCCGAGTCTTTAAGTTCATTGACATGCCAACAGAAGGTAAACCTACCAAGTCAACCAAACCATACAAGAATGGCCAACTCTCGAAAGTTATGATTATTGAGAATTCACACGTGAAGAAAGATGACATCTGGCCCTCAGGGGGCCAAATGACTGTCAAAGATCTCACAGCAAAATACACAGAAGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACATTTCCTTCTCAATAAGTCCTGGCCAGAGGGTGGGCCTCTTGGGAAGAACTGGATCAGGGAAGAGTACTTTGTTATCAGCTTTTTTGAGACTACTGAACACTGAAGGAGAAATCCAGATCGATGGTGTGTCTTGGGATTCAATAACTTTGCAACAGTGGAGGAAAGCCTTTGGAGTGATACCACAGAAAGTATTTATTTTTTCTGGAACATTTAGAAAAAACTTGGATCCCTATGAACAGTGGAGTGATCAAGAAATATGGAAAGTTGCAGATGAGGTTGGGCTCAGATCTGTGATAGAACAGTTTCCTGGGAAGCTTGACTTTGTCCTTGTGGATGGGGGCTGTGTCCTAAGCCATGGCCACAAGCAGTTGATGTGCTTGGCTAGATCTGTTCTCAGTAAGGCGAAGATCTTGCTGCTTGATGAACCCAGTGCTCATTTGGATCCAGTAACATACCAAATAATTAGAAGAACTCTAAAACAAGCATTTGCTGATTGCACAGTAATTCTCTGTGAACACAGGATAGAAGCAATGCTGGAATGCCAACAATTTTTGGTCATAGAAGAGAACAAAGTGCGGCAGTACGATTCCATCCAGAAACTGCTGAACGAGAGGAGCCTCTTCCGGCAAGCCATCAGCCCCTCCGACAGGGTGAAGCTCTTTCCCCACCGGAACTCAAGCAAGTGCAAGTCTAAGCCCCAGATTGCTGCTCTGAAAGAGGAGACAGAAGAAGAGGTGCAAGATACAAGGCTT

SEQ ID NO：5-募集部分实例

CGCGCGTTTTCGCGCG

SEQ ID NO：6-募集部分实例

AUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAU

SEQ ID NO：7-募集部分实例

UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA

SEQ ID NO：8-基因靶向部分

NNNNNNNNNNNNNNNNNCNNN

SEQ ID NO：9

GCAACUAGAGGUGAG

SEQ ID NO：10

TGCTAAGTACAGGGACATCTTGC

SEQ ID NO：11

AGACTCCACTTGTTCTTTTAAGGAG

SEQ ID NO：12

TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG

SEQ ID NO：13

AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT

SEQ ID NO：14

CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA

SEQ ID NO：15

CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT

SEQ ID NO：16

GUGUUGGCCAUGGAACAUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA

SEQ ID NO：17

UAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUGUUGGCCAUGGAACA

SEQ ID NO：18

GUGUUGGCCAUGGAACAUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA

SEQ ID NO：19

GUGUUGGCCAUGGAACAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAU

SEQ ID NO：20

GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUGUUGGCCAUGGAACA

SEQ ID NO：21

GUGUUGGCCAUGGAACAGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCC

SEQ ID NO：22

GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUGUUGGCCAUGGAACA

SEQ ID NO：23

GGAAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUCCC

SEQ ID NO：24

GUGGAAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUCCCAC

SEQ ID NO：25

GUGGNAUANUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUANUAUNCCAC

SEQ ID NO：26

GCCTGGCACCATTAAAGAAA

SEQ ID NO：27

GCATCTTTGTATACTGCTCTTGCT

SEQ ID NO：28

GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCCAGUCCCUUUCUCGUCGAUGGUCAG

SEQ ID NO：29

CCATCGACGAGAAAG

SEQ ID NO：30

CATCGACAAGAAAG

SEQ ID NO：31

TCCAGGCCGTGCATAAGG

SEQ ID NO：32

GCCCCAGCAGCTTCAG

SEQ ID NO：33

ATACCTCCACTCAGCCATGATTATATACCGAGACCTGAAACCCCACAATGTGCTGCTTTTCACACTGTATCCCAATGCTGCCATCATTGCAAAGATTGCTGACTACGGCATTGCTCAGTACTGCTGTAGAATGGGGATAAAAACATCAGAGGGCACACCAG

SEQ ID NO：34

GCTGACTACAGCATT GCTCAG

SEQ ID NO：35

ADYSIAQ

SEQ ID NO：36

GCTGACTACGGCATTGCTCAG

SEQ ID NO：37

ADYGIAQ

SEQ ID NO：38

GUGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAU

SEQ ID NO：39

GUGGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACGUACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAUCUU

SEQ ID NO：40

GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAU

SEQ ID NO：41

GGAAUAGUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUAGUAUCCCGUACUGAGCAAUGCcGUAGUCAGCAAUCUU

SEQ ID NO：42

GTTTGAGATACCTCCACTCAGC

SEQ ID NO：43

AGGTGCACGAAACCCTGGTG

Claims

1.一种用于在真核细胞中定点编辑靶RNA序列中的核苷酸的寡核苷酸构建体，所述寡核苷酸构建体包含：

(a)靶向部分，其包含与靶RNA的一部分互补的反义序列；和

(b)募集部分，其能够结合和募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体并能够进行所述核苷酸的编辑。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸构建体，其中所述募集部分不与靶序列互补，并且能够结合和募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体并能够进行所述核苷酸的编辑。

3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸构建体，其中所述募集部分能够(i)形成分子内茎环结构，(ii)结合和募集天然存在于所述细胞中的RNA编辑实体，并且(iii)进行所述核苷酸的编辑。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶向部分包含与所述靶RNA序列碱基配对时形成dsRNA结构的寡核糖核苷酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶向部分在与所述靶RNA序列中待编辑的所述核苷酸相对的位置包含非互补核苷酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中作为编辑靶标的所述核苷酸是腺苷或胞苷，并且所述RNA编辑实体包含脱氨酶活性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中作为编辑靶标的所述核苷酸是腺苷，并且所述编辑实体为腺苷脱氨酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述细胞是人细胞。

9.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述编辑实体包含hADAR1或hADAR2。

10.根据权利要求5所述的寡核苷酸构建体，其中所述非互补核苷酸是胞苷或尿苷，优选胞苷。

11.根据权利要求3所述的寡核苷酸构建体，其中能够形成分子内茎环结构的核酸序列是寡核糖核苷酸(RNA)序列。

12.根据权利要求11所述的寡核苷酸构建体，其中所述募集部分包括包含序列(RY或YR)_nN_m(RY或YR)_n的茎环结构，其中R是腺苷或鸟苷，Y是尿苷或胞苷，N是腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷或肌苷，n为3或更大，m为4或更大，并且其中N形成环且两个(RY)_n或(YR)_n序列通过互补碱基配对形成双链茎结构。

13.根据权利要求11或12所述的寡核苷酸构建体，其中所述环是具有以下序列的四核苷酸或五核苷酸：GCUMA，优选GCUAA，其中G是鸟苷，C是胞苷，M是腺苷或胞苷，并且U是尿苷。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述募集部分包含核苷酸序列：

5’-(AUAN^a)_nUAUAACAAUAUgcuaaAUGUUGUUAUA(N^bUAU)_n-3’

其中N^a和N^b各自是可以为A、G、C或U的单个核苷酸，条件是在形成茎环结构时N^a和N^b形成错配碱基对，并且n为1或0。

15.权利要求11或13所述的寡核苷酸构建体，其中所述募集部分包含选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的序列。

16.根据权利要求11或13所述的寡核苷酸构建体，其中dsRNA茎环结构衍生自或模拟编码人GluR蛋白的B结构域的RNA序列。

17.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述募集部分包括包含序列(CG)₃T₄(CG)₃(SEQ ID NO：5)的脱氧寡核苷酸序列，其中C是胞苷，G是鸟苷，并且T是胸苷。

18.根据权利要求1所述的寡核苷酸构建体，其中所述核苷酸中的一个或多个包含化学修饰。

19.根据权利要求18所述的寡核苷酸构建体，其中所述寡核苷酸构建体的靶向部分包含一个或多个2’-O核糖基取代的尿苷，优选2’-OMe取代的尿苷。

20.根据权利要求19所述的寡核苷酸构建体，其中与所述靶RNA序列中并非编辑靶标的腺苷相对的所有尿苷是2’-甲氧基-(2’-OMe)尿苷。

21.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶向部分和所述募集部分由接头序列分开，所述接头序列包含寡核苷酸序列、寡肽序列或另一共价化学连接比如PEG。

22.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶向部分基本上不间断，并形成所述寡核苷酸构建体的5’部分，并且所述募集部分形成所述寡核苷酸构建体的3’部分。

23.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶向部分基本上不间断，并形成所述寡核苷酸构建体的3’部分，并且所述募集部分形成所述寡核苷酸构建体的5’部分。

24.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶向部分被所述募集部分中断，使得所述靶向部分形成所述寡核苷酸构建体的5’部分和3’部分，并且所述募集部分形成所述寡核苷酸构建体的中间部分。

25.根据权利要求24所述的寡核苷酸构建体，其中当所述靶向部分通过互补碱基配对而退火至所述靶RNA序列时，所述募集部分环出。

26.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中寡核苷酸的长度为20至100个核苷酸之间，优选24至60个核苷酸之间，更优选30至50个核苷酸之间。

27.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸构建体，其中所述靶RNA序列选自信使RNA前体、信使RNA、核糖体RNA、转运RNA和miRNA。

28.一种用于在真核细胞中定点编辑靶RNA中的核苷酸的方法，所述真核细胞优选哺乳动物细胞、更优选人细胞，所述方法通过天然存在于所述细胞中并且能够进行所述核苷酸的编辑的RNA编辑实体的作用，所述方法包括以下步骤：(i)向所述细胞提供根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸构建体；(ii)允许足够的时间用于由所述细胞摄取所述寡核苷酸构建体、将所述寡核苷酸构建体退火至所述靶RNA序列、并且允许所述RNA编辑实体对所述靶RNA序列中的所述核苷酸进行编辑反应；和(iii)鉴定所述RNA序列中经过编辑的核苷酸的存在。

29.根据前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸构建体或方法，其中靶RNA编码CFTR(例如编辑1784G＞A突变)、CEP290(例如编辑c.2991+1655A＞G突变)、A1AT(例如编辑9989G＞A突变)、或LRRK2(例如编辑G6055突变)。