JP2021524235A - Ｒｎａ編集オリゴヌクレオチドの立体特異的結合 - Google Patents

Abstract

本発明は、特定位置に立体特異的ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合修飾を有し、ＲＮＡ編集の効率性を低下させる位置にこのような修飾を有さない、編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）に関する。ホスホロチオエートＲｐおよび／またはＳｐ立体配置修飾を有すべき位置、または有すべきではない位置の選択は、分子間の酸素を媒介した水素結合ネットワークに対する立体特異的結合の不適合性を明らかにした、コンピューターモデリングに基づく。【選択図】図２

Description

本発明は、医学分野に関する。より詳細には、細胞中の核酸分子をアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化して、デアミナーゼ活性を有する酵素によって、核酸配列での突然変異を修正することを含む、標的ヌクレオチドを特異的に変化させる、核酸編集の分野に関する。より具体的には、本発明は、キラリティを呈する１つまたは複数のヌクレオシド間結合を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、選択された位置での立体特異的バリアントを挿入することにより、好ましくは、酵素の関与および核酸編集の効率性を高めるために、最適化されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

ＲＮＡ編集は、真核細胞が、多くの場合、部位特異的で正確な方法で、そのＲＮＡ分子の配列を改変し、それにより、ゲノムがコードしたＲＮＡのレパートリーを数桁増加させる、天然のプロセスである。ＲＮＡ編集酵素は、動物界および植物界を通じて真核生物において記述されており、これらプロセスは、単純な生命体（例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans））からヒトに至る後生動物での細胞恒常性を制御する、重要な役割を担っている。ＲＮＡ編集の例は、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換、およびシチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への変換であり、それぞれ、アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼと言われる酵素により生じる。最も広く研究されているＲＮＡ編集システムは、アデノシンデアミナーゼ酵素である。

アデノシンデアミナーゼは、目的の酵素に依存して、触媒ドメイン、および、２〜３個の二本鎖ＲＮＡ認識ドメインを含むマルチドメインタンパク質である。認識ドメインは、特異的二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列および／または構造を認識する一方、触媒ドメインは、核酸塩基の脱アミノ化により、標的ＲＮＡでの近傍の、およそ予め定義された位置において、アデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換する。イノシンは、細胞の翻訳機構により、グアニンとして読み込まれ、編集されたアデノシンが、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのコード領域にある場合、タンパク質配列を再コードすることができる。ＡからＩへの変換はまた、元の開始点の上流に新規の翻訳開始点を作成する、標的ｍＲＮＡの５’非コード配列（Ｎ末端の拡張されたタンパク質を生じる）で起こるか、または、３’ＵＴＲもしくは転写の他の非コード部分（ＲＮＡのプロセッシングおよび／もしくは安定性に影響を与えることができる）で起こり得る。加えて、ＡからＩへの変換は、プレｍＲＮＡのイントロンまたはエクソンにおいてスプライスエレメントで起こり、それにより、スプライシングのパターンを改変し得る。その結果として、エクソンは、含まれ得るか、またはスキップし得る。アデノシンデアミナーゼは、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、およびｈＡＤＡＲ３を含む、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）として知られている酵素のファミリーの一部である。

アデノシンデアミナーゼを適用する標的ＲＮＡを編集するオリゴヌクレオチドの使用が報告されている（例えば、Montiel-Gonzalez et al. PNAS 2013, 110(45):18285-18290、Vogel et al. 2014. Angewandte Chemie Int Ed 53:267-271、Woolf et al. 1995. PNAS 92:8298-8302）。Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら（２０１３）は、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘパリン配列を認識する、バクテリオファージλＮタンパク質に融合しているｈＡＤＡＲ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む、遺伝子操作された融合タンパク質を使用する標的ＲＮＡの編集について記載した。ｈＡＤＡＲ２の天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、天然ＡＤＡＲの基質認識特性をなくし、それをλＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインで置き換えるために、除去している。著者らは、Ｎドメインデアミナーゼ融合タンパク質による配列特異的認識のためのｂｏｘＢ部分に融合している、編集するための標的配列に相補的である「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）部分を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを作成した。これを行ったことにより、ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドが、アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質を標的部位に正確に配向し、その結果、ガイドＲＮＡ指向性で部位特異的である標的ＲＮＡのＡからＩへの編集をもたらしたことが簡潔に示された。これらガイドＲＮＡは、５０ヌクレオチド超の長さであるが、一般に、製造の困難さと細胞への侵入が限定的であることにより、治療適用には長すぎる。治療環境でのこの方法の不利な点は、切断された天然ＡＤＡＲタンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインに遺伝的に融合した、バクテリオファージλＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインからなる融合タンパク質が必要なこともある。標的細胞が融合タンパク質で形質導入されるか（これは主要な障害である）、または、標的細胞が、発現用の操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸構築物でトランスフェクトされるかのいずれかが必要である。後者の要件は、例えば、遺伝的疾患を治すヒト疾患に対する療法において、編集が、多細胞生物で達成される場合、軽微な障害とはならない。

Ｖｏｇｅｌら（２０１４）は、ベンジルグアニン置換ガイドＲＮＡと、ＳＮＡＰタグドメイン（操作されたＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ）に遺伝的に融合した、（ｄｓＲＮＡ結合ドメインを欠く）ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作された融合タンパク質とを使用した、ｅＣＦＰおよび第Ｖ因子ライデンをコードするＲＮＡの編集を開示した。遺伝子操作された人工デアミナーゼ融合タンパク質は、そのＳＮＡＰタグドメインが５’末端Ｏ６−ベンジルグアニン修飾によってガイドＲＮＡに共有結合していることにより、培養下のＨｅＬａ細胞内の標的ＲＮＡの所望の編集部位に対して標的化され得るが、このシステムは、どのようにして、まずＡＤＡＲを遺伝子改変することなくシステムを適用し、続いて標的ＲＮＡを有する細胞にトランスフェクトまたは形質導入して、この遺伝作されたタンパク質を有する細胞を提供するかが明らかではないという点で、Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら（２０１３）に記載の遺伝子操作されたＡＤＡＲと同様の欠点がある。明らかに、このシステムは、例えば治療環境での、ヒトにおける使用に容易に適用することができない。

Ｗｏｏｌｆら（１９９５）は、比較的長い一本鎖アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（２５〜５２ヌクレオチド長）を使用する、より単純な手法であって、より長いオリゴヌクレオチド（３４マーおよび５２マー）が、標的ＲＮＡおよびそれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの二本鎖の性質により、内因性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができる、手法を開示した。標的ＲＮＡ配列に１００％相補的である、Ｗｏｏｌｆら（１９９５）のオリゴヌクレオチドは、細胞抽出物または両生類（ゼノプス類（Xenopus））の卵母細胞において、ミクロ注入により、唯一機能するようであり、特異性の重度の欠如に悩まされ、アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であった標的ＲＮＡ鎖におけるほぼ全てのアデノシンを編集した。各ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を有する、オリゴヌクレオチド、３４ヌクレオチド長は、Ｗｏｏｌｆら（１９９５）が試験し、不活性であることを示した。ヌクレアーゼに対する安定性をもたらすために、５’末端および３’末端の５ヌクレオチドで２’−Ｏ−メチル修飾させたホスホロチオエートヌクレオチドで修飾させた、３４マーのＲＮＡも試験した。中央の非修飾領域のこのオリゴヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ分解に対する保護を実現する末端修飾で、内因性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができることが示された。Ｗｏｏｌｆら（１９９５）は、標的ＲＮＡ配列における特異的な標的アデノシンの脱アミノ化を達成しなかった。上述した通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて非修飾のヌクレオチドに対向するほぼ全てのアデノシンを編集した（したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の５ヌクレオチドが修飾された場合での中央の非修飾領域のヌクレオチドに対向するほぼ全てのアデノシン、または、ヌクレオチドが修飾されなかった場合での標的ＲＮＡ鎖でのほぼ全てのアデノシン）。

ＡＤＡＲは、任意のｄｓＲＮＡで作用することができることが知られている。「無作為編集（promiscuous editing）」と時に称されるプロセスによって、酵素は、ｄｓＲＮＡにおいて、多数のＡを編集する。ゆえに、このような無作為編集を回避し、治療適用可能性に対して、標的ＲＮＡ配列で特定のアデノシンのみを標的化する、方法および手段の必要性が存在する。Ｖｏｇｅｌら（２０１４）は、このような標的外編集が、編集すべきではないアデノシンに対向する位置でのオリゴヌクレオチドにおいて、２’−Ｏ−メチル修飾させたヌクレオチドを使用することにより抑制することができ、標的ＲＮＡの特異的に標的化されたアデノシンに直接対向する非修飾ヌクレオチドを使用することができることを示した。しかし、この論文では、標的ヌクレオチドでの特異的な編集効果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと共有結合する組換えＡＤＡＲ酵素を使用せずに、生じるということが示されなかった。

国際公開第２０１６／０９７２１２号では、ＲＮＡの標的化編集のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、標的ＲＮＡ配列に相補的な配列（以下、「標的化部分」と称す）、および好ましくは標的ＲＮＡに相補的ではないステム−ループ構造（以下、「動員部分」と称す）の存在によって特徴付けられるＡＯＮが開示される。このようなオリゴヌクレオチドは、「自己ルーピングＡＯＮ」と称す。動員部分は、細胞に存在する天然のＡＤＡＲ酵素を、標的配列と標的化部分のハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡに動員する働きがある。動員部分があるため、コンジュゲートされる実体も、修飾された組換えＡＤＡＲ酵素の存在も必要としない。国際公開第２０１６／０９７２１２号では、動員部分は、天然基質（例えばＧｌｕＢ受容体）またはＡＤＡＲ酵素のｄｓＲＮＡ結合領域により認識されるとして知られているＺ−ＤＮＡ構造のいずれかを模倣するステム−ループ構造であると記載されている。ステム−ループ構造は、２つの別々の核酸鎖により形成される分子間のステム−ループ構造、または、単一の核酸鎖内に形成される分子内のステム−ループ構造であり得る。国際公開第２０１６／０９７２１２号に記載の動員部分のステム−ループ構造は、ＡＯＮ自体内に形成され、ＡＤＡＲを引き付けることができる分子内のステム−ループ構造である。

国際公開第２０１７／２２０７５１号および国際公開第２０１８／０４１９７３号では、動員部分を含まないが、１つまたは複数のミスマッチ、またはいわゆる「揺らぎ」もしくは膨らみを除いて標的化された領域に（ほぼ完全に）相補的である、ＡＯＮが記載されている。唯一のミスマッチは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドであり得るが、他の実施形態では、ＡＯＮは、標的配列領域に結合した場合、多数の膨らみおよび／または揺らぎを有すると記載されている。ＡＯＮの配列を、ＡＤＡＲを引き付けることができるように注意深く選択した場合、動員部分を欠くＡＯＮ、および内因性ＡＤＡＲ酵素で、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでのＲＮＡ編集を達成することが可能であったようである。標的アデノシンに直接対向するＡＯＮでのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を有さないとして記載されていた。ＡＯＮの残りが、糖物質での２’−Ｏ−アルキル修飾（例えば２’−Ｏ−メチル）を有する、ＤＮＡヌクレオチド、または、ＲＮＡ編集の効率性をさらに改善した、および／もしくはヌクレアーゼに対する耐性を高めた特定の化学修飾を含有する（もしくはＤＮＡであった）、いわゆる「セントラルトリプレット（Central Triplet）」内の、もしくはセントラルトリプレットを直接囲んでいるヌクレオチドでもあり得た。このような効果は、分解に対するＡＯＮを「保護する」センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）を使用する場合、さらに改善することさえできた（ＰＣＴ欧州特許出願公開第２０１８／０５１２０２号明細書に記載、未公開）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとして知られている、オリゴヌクレオチドを使用するさらに別の編集技術が存在することに、さらに留意されたい。しかし、この編集複合体は、ＤＮＡで作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは上述の操作されたＡＤＡＲシステムの同様の欠陥にも悩まされるが、その原因は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素、または、ガイドオリゴヌクレオチドと共にこれをコードする発現構築物の標的細胞への共送達を必要とするためである。何人かの研究者らは、例えば、Ｃａｓ９、および、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的発見則にしたがって設計されたガイドＲＮＡによりＤＮＡ標的部位に誘導される、デアミナーゼ活性を有する酵素を含む融合タンパク質を利用することによる、ＤＮＡ配列の塩基編集で実験している。

上記で概説した達成にもかかわらず、（内因性）細胞経路、および、デアミナーゼ活性を有する酵素、例えば、哺乳動物細胞に対して、生物全体に対してさえ、疾患を緩和するために内因性核酸を、より特異的に、より効果的に編集するために、天然に発現されるＡＤＡＲ酵素を利用することができる、新規の化合物の必要性は依然として残る。

本発明は、細胞内の標的核酸分子との二本鎖複合体を形成することができ、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素を動員することができる、オリゴヌクレオチド組成物であって、標的核酸分子が、ヌクレオチド脱アミノ化活性を有する酵素による脱アミノ化のための標的ヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、標的ヌクレオチドとミスマッチする、標的ヌクレオチドに対向する位置を含み、オリゴヌクレオチドが、１つの立体特異的立体配置が濃縮されている、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチド組成物に関する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、主にＲｐ立体配置を有する少なくとも１つのヌクレオチド間結合、および、主にＳｐ立体配置を有する少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。別の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を伴わない、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。好ましくは、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である。また好ましいのは、本発明によるオリゴヌクレオチド組成物であり、標的ヌクレオチドが、イノシンに脱アミノ化するアデノシンであり、翻訳機構により、グアニンとして読み込まれるオリゴヌクレオチド組成物である。本発明はまた、本明細書で特徴付けられるオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

別の態様では、本発明は、細胞内の標的ＲＮＡ分子と二本鎖複合体を形成することができ、ＡＤＡＲ活性を有する内因性酵素を動員することができる、（編集）オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）であって、標的ＲＮＡ分子が、ＡＤＡＲ活性を有する酵素による脱アミノ化のための標的アデノシンを含み、ＥＯＮが、３つの連続するヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、ここで標的アデノシンに直接対向するヌクレオチドが、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチド（位置０）であり、位置が、ＥＯＮの５’末端および３’末端に向かってそれぞれ正（＋）および負（−）に増分し、ＥＯＮが、標的アデノシンとミスマッチする、位置０でのヌクレオチドを含む、（編集）オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）に関する。さらに別の態様では、本発明は、遺伝的障害の処置または予防での使用のための、本発明によるＥＯＮに関する。本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ分子に存在する少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に本発明によるＥＯＮを供給するステップ、ＥＯＮの細胞による取込みを可能にするステップ、標的ＲＮＡ分子へのＥＯＮのアニーリングを可能にするステップ、ＡＤＡＲ活性を有する哺乳動物酵素が、標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ、および任意で、標的ＲＮＡ中のイノシンの存在を同定するステップを含む方法に関する。

ホスホロチオエート結合に対する、ＲｐおよびＳｐ立体特異的立体配置の描写である。 ＩＤＵＡ−ＲＮＡ標的化ＥＯＮからの２５ｎｔ長の領域のヌクレオチドを示す、本明細書に記載のコンピュータ解析の結果を示す。ＥＯＮ配列は、５’から３’（配列番号１）で提供される。各接続に対して、ＥＯＮ酸素−リン酸骨格により媒介された、潜在的な水素結合ネットワークを保存しながら、ＲｐおよびＳｐホスホロチオエート結合挿入の適合性について、構造評価を実施した。白丸は、ＲｐまたはＳｐホスホロチオエート結合が許容されるヌクレオチドの特徴を明らかにする。黒丸は、ホスホロチオエートが除外されるべき位置を示す。 上部に、ＩＤＵＡ−ＲＮＡを標的化するＥＯＮの領域に対する、立体特異的ホスホロチオエートパターンの概要を示す。ＥＯＮ配列は、５’から３’（配列番号１）で提供される。ヌクレオチド配列の下に、ヌクレオチドの順番を記載し、「０」位置が、標的配列で脱アミノ化された標的アデノシンに対向するヌクレオチドを指す。ＥＯＮの５’末端に向かって、ヌクレオチドの番号付けは、＋１２に増えていく一方、ＥＯＮの３’末端に向かって、ヌクレオチドの番号付けは、−１２に減っていく。ゆえに、この特定の例では、（潜在的にはより長いＥＯＮの）２５ヌクレオチド分を示す。結合の番号付けは異なり、ヌクレオチドの５’結合が、ヌクレオチドの一部とされている。結合の番号付けは、最上行に記載する。理解できる通り、最上行の「０」と称される結合は、ヌクレオチド「０」の５’結合であり、結合の番号付けは、５’末端に向かって＋１２に増え、結合の番号付けは、３’末端に向かって−１２に減っていく。最大「結合」＋１２が、この特定の例では結合していないが、５’末端でより長い場合、任意の所与のＥＯＮでの次のヌクレオチドに結合することができることは理解すべきである。同様なことが３’末端でも真であり、追加のヌクレオチドが結合することができる。モデリングは、１つのヌクレオチド（５’結合を含む）を、いわゆる「構造モデリング単位（structuring modelling unit）」として使用して、示された２５ヌクレオチドで行われた。結合丸印の上の「Ｒ」は、その位置での好ましいＲｐ立体配置を示す。同様に、結合丸印の上の「Ｓ」は、その位置での好ましいＳｐ立体配置を示す。ＲｐおよびＳｐの両方を許容する位置には、丸印の上は空白とした。丸印の上のバツ印「×」は、ホスホロチオエートが除外される／回避されるべき位置を示す。最下部では、Ｒｐおよび／またはＳｐホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドの概略図を示す。簡潔にするために、この図は、１１ヌクレオチド（１０結合位置）（配列番号２）のみに限定する。白丸の下の黒丸は、Ｒｐ立体配置を表す一方、白丸の上の黒丸は、Ｓｐ立体配置を表す。ＰＳでの両方の丸が白である場合、ＲｐおよびＳｐの両方ともに許容される。位置−３、−４、および−５でのヌクレオチドの間（２結合）では、立体特異的ホスホロチオエートは、回避しなければならない（ＰＳでのバツ印で示す）。

標的ＲＮＡにおいて標的アデノシンの編集効率性に悪影響を及ぼさずに、（ＲＮＡ）編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）の薬物動態特性を改善する必要性が常に存在する。多くの化学修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの生成中に存在し、その特性は、効果的な編集オリゴヌクレオチドの設計の要望に不適合である。より良好な薬物動態特性の探索において、全てではないが、いくつかのヌクレオチドのリボースの２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）修飾が、驚くべきことに、効果的なＡＤＡＲの関与および編集に適合するようであったことが先に見出された（英国特許第１８０２３９２．９号明細書、未公開）。向上した薬物動態特性の例は、細胞の取込み、および、細胞内輸送、安定性などである。２’−ＭＯＥ修飾の特性が知られていた一方、ＡＤＡＲの関与および脱アミノ化に対するその適合性は知られていなかった。２’−ＭＯＥがＡＤＡＲに適合している、又は適合していないオリゴヌクレオチド内の位置を解明した。

脱アミノ化、より特に、アデノシンデアミナーゼ活性を有する酵素による脱アミノ化などの、標的化させた塩基編集に対するガイドとしてのオリゴヌクレオチド特性を改善するさらなる試みでは、本発明者は、異なるヌクレオシド間結合の許容性に関して、オリゴヌクレオチドを調べた。より特に、本発明者らは、キラルホスホネート（phosphonate）中心などのキラル中心を有する、ヌクレオシド間結合を調べた。より特に、本発明者は、オリゴヌクレオチドにおいてホスホロチオエート結合が許容されるか、もし許容されるならば、ホスホロチオエートが許容される特定の位置でキラリティを制御することにより、ヌクレオシド間結合と、標的核酸とヘリカル複合体を形成する場合にオリゴヌクレオチドと相互作用する、脱アミノ化活性を有する酵素のそのアミノ酸残基との間の水素結合相互作用が改善するかどうかを調べた。以下の章では、知見および結論のより詳細な説明は、標的アデノシン周囲において、標的アデノシンの脱アミノ化のためにＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員し、イノシンに変換する、標的部位で標的ＲＮＡに結合するように設計された、化学修飾されたＥＯＮの相互作用に基づいてなされる。しかし、本発明が、ＡＤＡＲを動員して、標的アデノシンをイノシンへと変換するために設計されたオリゴヌクレオチドまたは方法に限定されないことは明らかであるべきである。少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、キラル中心（Ｘホスホネート（phosphonate）部分（Ｘは、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲ^１Ｒ^１、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ^＋、−Ｓｅ−Ｚ^＋、または−ＢＨ_３−Ｚ^＋であり得、Ｒ^１は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、Ｚ^＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、もしくはヘテロ環イミニウムイオンであり、そのいずれかが一級、二級、三級、もしくは四級であるか、またはＺは、一価の金属イオンである）を含む）を含む限り、本発明が、標的核酸に結合し、ヌクレオチド（アデノシンおよびシチジンを含む）脱アミノ化活性を有する、任意のタンパク質（天然に発現されるタンパク質、ならびに、異なるまたは同じ起源の融合タンパク質を含む外来タンパク質）を動員することができる、任意のオリゴヌクレオチドを包含することを理解すべきである。コンピューターモデリングを使用するこのような結合それ自体の許容性の決定、ならびに、キラル中心を含む結合の好ましいＳｐまたはＲｐ立体異性体の決定の両方は、本発明の一部を形成する。

特定の態様では、本発明は、ヌクレオシド間結合により結合しているヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、その少なくとも１つが、キラリティを呈し、相補的核酸配列と結合することにより二本鎖核酸構造を形成する場合、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素を、上記相補的核酸配列の標的ヌクレオチドに動員することが可能であり、上記オリゴヌクレオチドの上記ヌクレオシド間結合の少なくとも１つと、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する上記酵素との水素相互作用に最適化されていることを特徴とする、オリゴヌクレオチドに関する。キラリティは、立体異性体を有する可能性を有するとして定義される。本発明は、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素と相互作用するオリゴヌクレオチドでのキラリティを有する、ヌクレオチド間結合のキラル制御についてである。本発明の一態様では、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素との水素相互作用に負の影響を及ぼさない位置にキラリティを呈する、少なくとも１つのヌクレオシド間結合を配置することにより、水素相互作用に最適化されている、オリゴヌクレオチド（組成物）に関する。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素との最も安定した水素相互作用を助ける１つまたは複数の位置において、ヌクレオシド間結合の立体特異的形態を選択することにより、水素相互作用に最適化されている。

本発明の発明者らは、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド間のホスホロチオエート結合の立体特異性が、このようなオリゴヌクレオチドの薬物動態特性および／またはＲＮＡ編集の効率性に影響を及ぼすかどうかを調べた。これが、本発明の対象である。本明細書に開示される知見は、原則として、天然または組換え、切断されたまたは全長、他のタンパク質に融合しているか否かを問わず、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲデアミナーゼドメインに関与する合成オリゴヌクレオチドを利用する、塩基編集の任意の形態を使用することができる（例えば、Stafforst and Schneider, 2012, Angew Chem Int 51:11166-11169、Schneider et al. 2014, Nucleic Acids Res 42:e87、Montiel-Gonzalez et al. 2016, Nucleic Acids Res 44:e157）。

本発明はまた、以下の２つの立体異性体の形態ＲｐおよびＳｐ：

式Ｉ（Ｒｐ）および式ＩＩ（Ｓｐ）
（式中、Ｘは、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲ^１Ｒ^１、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ^＋、−Ｓｅ−Ｚ^＋、または−ＢＨ_３−Ｚ^＋であり、Ｒ^１は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、Ｚ^＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、もしくはヘテロ環イミニウムイオンであり、そのいずれかが一級、二級、三級、もしくは四級であるか、または、Ｚは、一価の金属イオンである）
を有するヌクレオチド間結合に関する。

本発明は、キラリティを呈するヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、本発明によるオリゴヌクレオチドにさらに関する。好ましい実施形態では、ヌクレオシドデアミナーゼ活性を有する酵素は、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン、または、その突然変異もしくは誘導体、または、それを用いた融合タンパク質を含む。また別の好ましい実施形態では、本発明は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオシド間結合で最適化されている、オリゴヌクレオチドに関する。さらに好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、キラリティを呈する、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の立体特異的ヌクレオシド間結合を含む。

インビトロ研究では、結合親和性、相補的ＲＮＡへの配列特異的結合、およびヌクレアーゼに対する安定性などの、アンチセンスヌクレオチドの特性が、リン原子の立体配置の影響を受けていることが示されている。国際公開第２０１０／０６４１４６号では、キラルＸホスホネート（phosphonate）部分を含む、リン原子修飾された核酸の立体制御合成の方法が開示されている。

治療適用で使用される化学修飾されたオリゴヌクレオチドは、多くの場合、ホスホロチオエート結合（本明細書やその他の場所では、多くの場合、ＰＳと略される）を有する。この修飾の最も重要な役割は、ポリマーを、ヌクレアーゼ媒介の分解から保護することである。これは、ＲＮＡ末端でのエキソヌクレアーゼの分解を阻害し、エンドヌクレアーゼの攻撃を内部で制限する。注目すべきは、ＰＳリッチなオリゴヌクレオチドが、タンパク質に対してより良好な親和性を有すると報告されていることである（Brown D.A. et al., Effect of phosphorothioate modifications of oligodeoxynucleotides on specific protein binding, J Biol Chem, 1994、Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, Second Edition, 2007, edited by Stanley T. Crooke）。しかし、このような結合は、非特異的な接触により媒介される可能性が最も高い。生物学的分子では、硫黄−リン酸結合による酸素−リン酸の置換は、天然タンパク質／ＲＮＡ複合体により確立された分子間の水素結合ネットワークを妨げる可能性がある。実際に、研究では、硫黄原子が、非常に不十分な水素結合受容体であるが、適度に良好な水素結合供与体であることが実証された（Zhou et al. Geometric characteristics of hydrogen bonds involving sulfur atoms in proteins, Proteins, 2009）。しかし、タンパク質構造では、メチオニンおよびシステインの硫黄原子は、水素受容体であると報告されている（Singleton et al. X-ray structure of pyrrolidone carboxyl peptidase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis, Structure, 1999、Diaz et al. Unusual Cys-Tyr covalent bond in a large catalase, J. Mol. Biol., 2004）。理論研究およびいくつかの実験データでは、ＯＨ．．ＳおよびＮＨ．．Ｓの水素結合の存在を確認されているが、硫黄の電気陰性度は、酸素と比較して低い。２つの極性基の間の相対角が、結合力を規定するという真実に加えて、本発明の発明者らは、その手法において、電気陰性度が水素結合形成に対する主要なパラメーターであるとみなした。ゆえに、この構造に基づくオリゴヌクレオチド設計に対して、ＥＯＮ酸素−リン酸骨格とＡＤＡＲ２デアミナーゼドメイン側鎖との間の潜在的な水素結合接触は、保存されるべきであると仮定した。本発明の発明者らは、これらの接続が、２つの分子パートナー間の相互作用をより良好に支持することを提案する。立体特異的ホスホロチオエート結合では、酵素とそのリガンドとの間の相互作用を微調整する高い可能性が示される。実際に、立体化学的なコードは、結合したＲＮａｓｅ Ｈ１で収集され、ミポメルセン由来のオリゴヌクレオチド配列の分析と結び付けて考察した構造データにより、最近、注目されている（Iwamoto et al. 2017. Nat Biotechnol 35:845-851）。ミポメルセンの一次配列を有するこれらオリゴヌクレオチドは、ＲｐおよびＳｐを示す、純粋なまたは合わせた立体特異的ホスホロチオエート結合から構成される（図１）。著者らは、そのＡＳＯギャップマーに対して、Ｓｐ結合が、インビトロでの脂肪親和性および安定性を高めることを実証した。同時に、立体化学的に制御されたＰＳ立体配置を有するＡＳＯギャップマーが、効力、および生物学的半減期を調節することを報告した。最終的に、酵素的活性の著しい改善をもたらす、ＲＮａｓｅ Ｈ１側鎖に相互作用するＰＳ結合トリプレットの立体特異性を最適化した。その結果として、治療的オリゴヌクレオチドの物理化学的で薬理学的な特徴に対して、立体特異的ＰＳ結合の重要性が確認される。この新型の化学的性質を利用して、本発明の発明者らは、ＥＯＮ設計に対するそのコンピュータ的手法に、立体特異的ホスホロチオエート結合を挿入することを決定した。目標は、立体特異的ＰＳ結合の挿入と、ＡＤＡＲ２デアミナーゼ側鎖およびＥＯＮ酸素−リン酸骨格に関与する潜在的な分子間の水素結合接触の保存との間の適合性をモニタリングすることだった。このため、公表されたＲＮＡ結合ＡＤＡＲ２デアミナーゼ構造（Matthews et al. 2016. Nat Struct Mol Biol 23:426-433）を用いてインシリコモデリングを開始し、新規の構造計算に必要な距離の分子内および分子間ネットワークを生成した。ＲｐおよびＳｐ立体化学的立体配置を含む、特異的ライブラリーを、計算ソフトウェア用に作成した。ねじれ角の空間において分子動力学でのシミュレーテッドアニーリングを組み合わせたＣＹＡＮＡ３．０（Guntert P et al, J.Mol.Biol, 1997）は、タンパク質−ＲＮＡアンサンブルの計算を可能にした。これら複合体は、ＩＤＵＡ標的配列にアニールした化学修飾ＥＯＮにより形成される、二本鎖ＲＮＡに結合したＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインから構成された。ＡＤＡＲ２デアミナーゼ結合界面にわたる２５ｎｔ長のＥＯＮの各ホスホロチオエート結合に対して、ＲｐおよびＳｐ立体配置を首尾よく導入した。各立体配置に対して、２００個のタンパク質−ＲＮＡ複合体を計算し、２０個の最低構造を、ＡＭＢＥＲ１６パッケージの制限された分子動力学を使用して、続く精製のために選択した。合計で、１０，０００個の構造を計算し、１０００個の最もエネルギー的に好都合なものを分析した。先に述べた通り、構造研究では、ＲｐおよびＳｐホスホロチオエート結合が、酸素−リン酸骨格とＡＤＡＲ２デアミナーゼ側鎖との間の潜在的な水素結合接触を改変せずに、ＥＯＮに許容されるかどうかを決定した（図２）。いくつかの位置に対して、ホスホロチオエート結合が、最も安定した水素結合ネットワーク（酸素媒介）の保存に適合していないことが結論付けられた。実際、これは、これらの位置で、ホスホロチオエート修飾が存在しないのが好ましいことを意味する。しかし、ＥＯＮがホスホロチオエート修飾を有するヌクレオチド間を完全に網羅しない場合、不安定性の潜在的な危険性に対して均衡させるべきである。Ｒｐ、Ｓｐ、もしくはこれら２つのいずれかに好ましいと見出された位置、または他方でＰＳを全く有すべきではない位置が、ヌクレオチド配列に関係なく、任意の所与のＥＯＮに適用可能であることは理解すべきである。ゆえに、本明細書に例示する通り、ＩＤＵＡ標的化ＥＯＮ配列を使用する場合、位置の教示は、任意の他の種類の標的配列を標的化する、任意の所与のＥＯＮ配列に適用可能である。明らかに、本明細書に概説した通り、デアミナーゼ活性を有する酵素としてＡＤＡＲ２で、モデリングを行ったが、当業者は、ＥＯＮが他のデアミナーゼ活性を有する酵素でモデリングされる場合、結果が変化しうることは理解しているだろう。

本方法は、本発明者らが、ＡＤＡＲ活性を有する酵素（好ましくはＡＤＡＲ２）のデアミナーゼドメインとＥＯＮとの間の最適化した分子間の水素結合ネットワークに適合する、立体特異的ホスホロチオエート結合のパターンを強調することを可能にした。構造的に基づいた立体化学コードは、図３に示す。そのヌクレオシドに対してホスホロチオエート結合の位置の両義性を緩和するために、ＥＯＮの拡張された領域内で選択された命名は、図３に詳細を示す。とりわけ、図３において、標的配列の標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、「０」ヌクレオチド位置として示し、結合の番号付けに対する「０」位置は、５’末端に向かってヌクレオチド間を１／２ずれる。

本発明は、細胞内の標的核酸分子と二本鎖複合体を形成することができ、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素を動員することができる、オリゴヌクレオチド組成物であって、標的核酸分子が、ヌクレオチド脱アミノ化活性を有する酵素による脱アミノ化のための標的ヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、標的ヌクレオチドとミスマッチする、標的ヌクレオチドに対向する位置を含み、オリゴヌクレオチドが、１つの立体特異的立体配置が濃縮されている、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチド組成物に関する。当業者は、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、Ｃａｓ１３などの、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する、様々な酵素を承知している。本発明は、ＡＤＡＲ２ヌクレオチドデアミナーゼドメインでモデル化しているが、これに限定するものではなく、本開示の教示により、当業者は、相互作用するヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する任意の酵素に対する、任意の（編集）オリゴヌクレオチドの立体特異性をモデリングすることができる。当業者はまた、本発明のほとんどの部分である、ボラノホスフェート（boranophosphate）、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoate）、およびいくつかのアルキル置換されたホスホネート（phosphonate）（アルキルホスホネート（alkylphosphonate））などの、キラリティを呈する、様々なヌクレオシド間結合を承知している。好ましい実施形態では、組成物の「立体特異的純度」は、６０％であり、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは９０％以上である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、主にＲｐ立体配置を有する少なくとも１つのヌクレオチド間結合、および、主にＳｐ立体配置を有する少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を伴わない、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。さらに別の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）リボース修飾を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含み、２’−ＭＯＥリボース修飾を含まない１つまたは複数のヌクレオチドを含み、２’−ＭＯＥリボース修飾は、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素が、標的ヌクレオチドを脱アミノ化するのを妨げない位置にある。また、別の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、２’−ＭＯＥリボース修飾を含まない位置で２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）リボース修飾を含む、および／またはオリゴヌクレオチドは、２’−ＭＯＥリボース修飾を含まない位置でデオキシヌクレオチドを含む。本発明の全ての態様では、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である。さらに別の好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチド長であり、また、オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチドより短く、好ましくは６０ヌクレオチドより短い。高度に好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドであり、標的ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中のアデノシンであり、アデノシンは、イノシンに脱アミノ化し、翻訳機構により、グアニンとして読み込まれる。さらに好ましい態様では、アデノシンは、ＵＧＡもしくはＵＡＧ終止コドンに位置し、ＵＧＧコドンに編集されるか、または２つの標的ヌクレオチドは、ＵＡＡ終止コドンにおける２つのアデノシンであり、コドンは、両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集され、オリゴヌクレオチドにおける２つのヌクレオチドは、標的核酸とミスマッチする。本発明はまた、本明細書で特徴付けられるオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

本発明は、細胞内の標的ＲＮＡ分子と二本鎖複合体を形成することができ、ＡＤＡＲ活性を有する内因性酵素を動員することができる、編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）であって、標的ＲＮＡ分子が、ＡＤＡＲ活性を有する酵素による脱アミノ化のための標的アデノシンを含み、ＥＯＮが、主にＲｐ立体配置、または、主にＳｐ立体特異的立体配置を有する少なくとも１つのヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む、編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）に関する。ある種の位置が、好ましくはＲｐ立体配置を有するのに対して、他の位置は、好ましくはＳｐ立体配置を有することを見出した。また、同じ位置で、２つの立体配置のどちらが存在すべきかは、２つのいずれかが導入されるので、問題ではないことを見出した。一方、ある種の位置で、実際、ホスホロチオエート修飾は、ＲｐまたはＳｐ立体配置のいずれかでＥＯＮ−タンパク質相互作用が阻害されるので、導入されるべきではないことが好ましかったことも見出した。とりわけ、本明細書に示す通り、ホスホロチオエート修飾は、一般に、分解を防止するために導入される（その結果、ＲＮＡ編集の効率性が高まる）。当業者は、一方でのＥＯＮとＡＤＡＲ酵素との間のより良好またはより弱い相互作用、ならびに、他方でのインビボＥＯＮの高いまたは低い安定性の間の一種のバランスを導入することを理解する。当業者は、最も効果的なＲＮＡ編集結果を得るためのホスホロチオエート修飾を有すべき位置、または有すべきではない位置がどれかを決定するために、インビトロならびにインビボでの方法を使用することができる。この決定は、明らかに、ＥＯＮ自身の配列および標的配列、場合によってはプレｍＲＮＡの構造、使用してみえるＡＤＡＲ活性を有する酵素（ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）、ＲＮＡ編集が行われるべき細胞などに基づく。本発明は、本方法を適用し、ＥＯＮで潜在的に標的化した任意の疾患に使用することができる、各可能なＥＯＮを決定するためのツールを当業者に提供する。

好ましくは、本発明によるＥＯＮは、２’−ＭＯＥリボース修飾、さらにより好ましくは、２’−ＭＯＥリボース修飾を有さない位置に、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）リボース修飾を有するヌクレオチドを含む。本明細書に概説した通り（図３）、ＥＯＮは、ＥＯＮヌクレオチド配列の位置０と称される、標的アデノシンに直接対向するヌクレオチドを含む。好ましくは、ＥＯＮは、位置−１および／または０での１つまたは２つのデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）を含み、位置は、ＥＯＮの５’末端および３’末端に向かってそれぞれ正（＋）および負（−）に増分する。好ましい態様では、ＥＯＮは、位置−１およびまたは０に、２’−ＭＯＥ修飾を含まない。より好ましくは、本発明のＥＯＮは、位置＋６、＋１、０、−１、−２、−３、−４、および／または−５に、２’−ＭＯＥ修飾を含まない。ＡＤＡＲ活性を有する酵素は、二本鎖ＲＮＡ複合体中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することができる酵素である。好ましくは、ＡＤＡＲ活性を有する酵素は、（ヒト）ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である。また、好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。好ましい一実施形態では、本発明によるＥＯＮは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドより長く、好ましくは、ＥＯＮは、１００ヌクレオチドより短く、より好ましくは６０ヌクレオチドより短い。

図３は、結合の位置、および２５ヌクレオチドのＥＯＮ（の部分）に対する結合の番号付けを示し、結合の番号付け０は、ヌクレオチドの番号付けで０と称される、ヌクレオチドの５’結合である。好ましくは、結合の番号付けを使用して、番号０、＋１、＋２、＋３、＋９、＋１１、＋１２、−２、−７、−８、−９、−１０、−１１、および／または−１２の結合は、ＲｐまたはＳｐ立体配置を有するかどうかが問題ではない修飾を有する。また好ましくは、結合のこの番号付けを使用して、番号＋４、−１、−３、および／または−６の結合は、好ましくはＲｐ立体配置を有するが、結合＋１０のみ、好ましくはＳｐ立体配置での修飾を有する。また、結合のこの番号付けを使用して、番号＋５、＋６、＋７、＋８、−４、および／または−５の結合は、好ましくは（ホスホロチオエート）修飾を有さないが、好ましくは野生型ヌクレオチド間接続を有する。この番号付けは、当然任意に選ばれるが、ヌクレオチド間結合修飾の立体異性体の形態も、デアミナーゼ活性を有する好ましい酵素としてＡＤＡＲ２と相互作用する場合、ヌクレオチド配列に関係なく、任意の種類のＥＯＮに適用可能である。

本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。適した薬学的に許容される担体は、当業者に周知されている。本発明はまた、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル症候群、シャルコー−マリー−ツース症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ−ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン−ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連がん、ポイツ−イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ−ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の処置または予防での使用のための、本発明によるオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル症候群、シャルコー−マリー−ツース症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ−ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン−ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連がん、ポイツ−イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ−ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の処置または予防のための医薬の製造における、本発明によるＥＯＮの使用に関する。

また別の実施形態では、本発明は、細胞内の標的ＲＮＡ分子に存在する、少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に、本発明によるＥＯＮを供給するステップ、ＥＯＮの細胞による取込みを可能にするステップ、標的ＲＮＡ分子へのＥＯＮのアニーリングを可能にするステップ、ＡＤＡＲ活性を有する哺乳動物酵素が、標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ、および、任意で、標的ＲＮＡ中のイノシンの存在を同定するステップを含む、方法に関する。好ましくは、イノシンの存在は、（ｉ）標的ＲＮＡ配列をシークエンシングすること、（ｉｉ）標的アデノシンが、ＵＧＡもしくはＵＡＧ終止コドンに位置し、脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、（ｉｉｉ）２つの標的アデノシンが、ＵＡＡ終止コドンに位置し、両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、（ｉｖ）プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または、（ｖ）機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、ことのいずれかにより検出される。明らかに、２つの標的アデノシンが脱アミノ化する必要がある場合、結合の番号付け（単一の標的アデノシンについて本明細書に概説した通り）は、したがって、ホスホロチオエート修飾の特異的な立体異性体の形態が、ＥＯＮ自身で改変されないが、デアミナーゼ活性を有する酵素との相互作用に関するので、調節すべきである。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ、本明細書では、多くの場合、編集オリゴヌクレオチドまたはＥＯＮと称す）は、好ましくは、国際公開第２０１６／０９７２１２号に記載の動員部分を含まない。本発明のＥＯＮは、好ましくは、分子内のステム−ループ構造を形成することができる部分を含まない。一実施形態では、本発明は、終止コドンに存在するアデノシンをイノシンに改変する（Ｇとして読み込まれる）ために、（プレ）ｍＲＮＡに存在する早期停止終止コドン（ＰＴＣ）を標的化し、次いで、翻訳の間のリードスルー、および全長機能性タンパク質をもたらす、ＥＯＮに関する。特定の一実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症（ＣＦ）の処置に使用するためのＥＯＮに関し、またさらに好ましい実施形態では、本発明は、ＣＦの処置に使用するためのＥＯＮであって、Ｇ５４２Ｘ（ＵＧＡＧ）、Ｗ１２８２Ｘ（ＵＧＡＡ）、Ｒ５５３Ｘ（ＵＧＡＧ）、Ｒ１１６２Ｘ（ＵＧＡＧ）、Ｙ１２２Ｘ（ＵＡＡ、両アデノシン）、Ｗ１０８９Ｘ、Ｗ８４６Ｘ、およびＷ４０１Ｘ突然変異などのＰＴＣが、ＲＮＡ編集によってコドンをコードするアミノ酸に修飾され、それにより翻訳が全長タンパク質で可能になる、ＥＯＮに関する。本発明の教示、立体特異的ホスホロチオエート結合修飾について許容部分および非許容部分のコンピューターモデリングは、本明細書に概説した通り、ＥＯＮで標的化し得、ＲＮＡ編集によって処置することができる全ての遺伝的疾患に適用可能である。これは、これらの立体特異的修飾に対する好ましい位置および好ましくない位置を正確に示すために、標的配列、適用可能なＥＯＮ、およびＡＤＡＲタンパク質の含量に依存する。コンピューターモデリングが、このようなＥＯＮのＲＮＡ編集の効率性を高める、Ｒｐおよび／またはＳｐ立体特異的ホスホロチオエート立体配置で修飾することができるか、または修飾すべきではない、治療的ＥＯＮ内の好ましい位置を見出すために適用することができると示したのは、これが初めてである。

本発明は、標的ＲＮＡの標的アデノシンの脱アミノ化のためのＥＯＮであって、ＥＯＮが標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に相補的であり、任意で、ＥＯＮが相補的な標的ＲＮＡ領域との、１つまたは複数のミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみを含み、ＥＯＮが１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含むが、ただし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、２’−ＯＨ基を有するリボース、または２’−Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、さらに、ＥＯＮが標的アデノシンに対向するヌクレオチドに対してある種の位置で２’−ＭＯＥ修飾を有さず、さらに、本明細書でさらに定義する通り、ＥＯＮ内の他の位置で２’−ＭＯＥ修飾を有する、ＥＯＮに関する。ＥＯＮは、好ましくは、ＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内のステム−ループ構造を形成することができる部分を含まない。ＥＯＮは、好ましくは、５’末端Ｏ６−ベンジルグアニン修飾を含まない。ＥＯＮは、好ましくは、５’末端アミノ修飾を含まない。ＥＯＮは、好ましくは、ＳＮＡＰタグドメインに共有結合しない。別の好ましい実施形態では、標的ＲＮＡは、ヒトＣＦＴＲである。より好ましい実施形態では、終止コドンは、ヒトＣＦＴＲ（プレ）ｍＲＮＡにおける早期停止終止コドンであり、さらにより好ましいのは、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、Ｙ１２２Ｘ、Ｗ１０８９Ｘ、Ｗ８４６Ｘ、およびＷ４０１ＸからなるＣＦＴＲにおける終止コドン突然変異の群から選択される。より好ましくは、ヒトＣＦＴＲにおけるスプライス突然変異は、６２１＋１Ｇ＞Ｔ、および１７１７−１Ｇ＞Ａからなる群から選択される。一態様では、本発明は、嚢胞性線維症（ＣＦ）の処置に使用するためのＥＯＮであって、ＣＦＴＲ（プレ）ｍＲＮＡに存在するＰＴＣに存在するアデノシンの脱アミノ化を可能にし、ＰＴＣが、疾患を最終的に引き起こす初期の翻訳終止をもたらす、ＥＯＮに関する。

また別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡに存在する疾患関連スプライス突然変異での標的アデノシンの脱アミノ化に使用するために、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することができる、本発明によるＥＯＮであって、標的アデノシンに対向するＥＯＮでのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾を有さず、標的アデノシンに対向するヌクレオチドからのヌクレオチド直接的５’および／または３’が、ＲＮＡ編集においてＥＯＮをより安定に、および／または、より効果的にする、糖修飾、および／または塩基修飾を有する、ＥＯＮに関する。別の好ましい態様では、標的アデノシンに対向するＥＯＮでのヌクレオチドは、ＲＮＡではなくＤＮＡであり、さらにより好ましい態様では、標的アデノシンに対向するヌクレオチド、ならびに標的アデノシンに対向するヌクレオチドのヌクレオチド５’および／または３’は、ＤＮＡヌクレオチドであるが、ＥＯＮでのヌクレオチドの（ＤＮＡではない）残りは、好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾されたリボヌクレオチドである。２つのヌクレオチドがＤＮＡである場合、他の全ては、ＲＮＡであり得、２’−ＯＭｅまたは２’−ＭＯＥ修飾され得る一方、特定の態様では、標的アデノシンに対向するトリプレットでの第三のヌクレオチドは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ修飾されていない限り、ＲＮＡであり得、修飾され得ない。特定の一態様では、本発明は、細胞に存在する酵素（おそらくＡＤＡＲ酵素）による、標的ＲＮＡに存在する標的アデノシンの脱アミノ化のためのＥＯＮであって、ＥＯＮが標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ領域に（部分的に）相補的であり、標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、２’−Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、標的アデノシンに対向するヌクレオチドのヌクレオチド５’および／または３’もまた、２’−Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、ＥＯＮの残りが、好ましくは全て２’−ＯＭｅまたは２’−ＭＯＥ修飾を有するリボヌクレオシドを含む、ＥＯＮに関する。編集する必要がある、２つの連続するアデノシン（例えば、Ｙ１２２Ｘ突然変異における：ＵＡＡ）の場合、２つのアデノシンに対向するＥＯＮでのヌクレオチドが、両方とも２’−Ｏ−メチル修飾を有さないことが好ましい。別の好ましい態様では、本発明によるＥＯＮは、１７マーまたは２０マーではない。また別の態様では、本発明によるＥＯＮは、１７ヌクレオチドより長いか、または１４ヌクレオチドより短い。好ましい実施形態では、本発明によるＥＯＮは、相補的な標的ＲＮＡ領域との、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみを含む。好ましくは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、シチジン、デオキシシチジン、ウリジン、またはデオキシウリジンである。標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、シチジン、またはデオキシシチジンである場合、ＥＯＮは、標的ＲＮＡ分子との、少なくとも１つのミスマッチを含む。標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、ウリジン、またはデオキシウリジンである場合、ＥＯＮは、１００％相補的であり、標的ＲＮＡに関して、いかなるミスマッチ、揺らぎ、または膨らみも有さない。しかし、好ましい態様では、１つまたは複数のさらなるミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、シチジン、デオキシシチジン、ウリジン、またはデオキシウリジンであろうと、ＥＯＮと標的ＲＮＡとの間に存在する。別の好ましい実施形態では、（トリプレットを形成する標的アデノシンに対向するヌクレオチドと共に）標的アデノシンに対向するヌクレオチドからのヌクレオチド直接的５’および／もしくは３’は、２’−ＯＨ基を有するリボース、または２’−Ｈ基を有するデオキシリボース、またはこれら２つの混合物を含む（次いで、トリプレットは、ＤＮＡ−ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＲＮＡ−ＲＮＡからなり、中央のヌクレオシドは、（ＲＮＡの場合）２’−Ｏ−メチル修飾を有さず、周囲のヌクレオシドのいずれかまたは両方とも２’−Ｏ−メチル修飾を有さない）。次いで、ＥＯＮでの他の全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキル基、好ましくは２’−Ｏ−メチル基、もしくは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）基、または本明細書に開示される任意の修飾を有することが好ましい。本発明のＥＯＮは、好ましくは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。２’−ＯＭｅおよび２’−ＭＯＥは、立体特異的ＰＳの位置に影響を及ぼさず、疎水性、融解温度などを含む、ＥＯＮ特性の包括的効果のみが、観察することができる。このため、組合せは、影響を及ぼし得る。しかし、デアミナーゼドメインの結合のために、妨げてはならない。全ての上述した化学修飾は、原則として、骨格に関与するが、一次配列には関与しないので、他の疾患モデルに適用することができる。計算は、系統的に、親和性がＲＮＡ標的間で大きく変わる可能性があることが示される場合を除き、他の疾患モデルに繰り返すべきではない。これは、局所結合を移動させることを示唆する。

本発明の特定の一実施形態では、ＥＯＮは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドより長い。好ましくは、ＥＯＮは、１００ヌクレオチドより短く、より好ましくは６０ヌクレオチドより短く、さらにより好ましくは、ＥＯＮは、１８〜７０ヌクレオチド、１８〜６０ヌクレオチド、または１８〜５０ヌクレオチドを含む。本発明はまた、本発明によるＥＯＮおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル症候群、シャルコー−マリー−ツース症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ−ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン−ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連がん、ポイツ−イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の処置または予防での使用のための、本発明によるＥＯＮに関する。特に好ましい実施形態では、本発明によるＥＯＮは、嚢胞性線維症（ＣＦ）の処置に使用され、ヒトＣＦＴＲ（プレ）ｍＲＮＡに存在するＰＴＣに存在する標的アデノシンの脱アミノ化のために使用される。別の態様では、本発明は、疾患、好ましくは嚢胞性線維症の処置または予防のための医薬の製造における、本発明によるＥＯＮの使用に関する。本発明のまた別の実施形態では、細胞内の標的ＲＮＡでのＰＴＣに存在する、少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に、本発明によるＥＯＮを供給するステップ、ＥＯＮの細胞による取込みを可能にするステップ、標的ＲＮＡへのＥＯＮのアニーリングを可能にするステップ、野生型酵素で発見された天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含むＡＤＡＲ酵素が、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ、および任意で、標的ＲＮＡ中のイノシンの存在を同定するステップを含み、好ましくは、最終ステップが、標的ＲＮＡ配列をシークエンシングすること、標的アデノシンが、ＵＧＡもしくはＵＡＧ終止コドンに位置し、脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、２つの標的アデノシンが、ＵＡＡ終止コドンに位置し、両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、ことを含む方法に関する。特に好ましい一実施形態では、本発明は、本発明によるＥＯＮまたは方法であって、標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、Ｙ１２２Ｘ、Ｗ１０８９Ｘ、Ｗ８４６Ｘ、Ｗ４０１Ｘ、６２１＋１Ｇ＞Ｔ、または１７１７−１Ｇ＞Ａ突然変異を編集）をコードする、ＥＯＮまたは方法に関する。

ＥＯＮが、１つまたは複数の糖修飾を含む、１つまたは複数のヌクレオチドを含むことが、本発明の重要な態様である。これにより、ＥＯＮの単一のヌクレオチドは、１つ、または２つ以上の糖修飾を有し得る。ＥＯＮ内に、１つまたは複数のヌクレオチドは、このような糖修飾を有し得る。

また、編集する必要があるヌクレオチドに対向する本発明のＥＯＮ内のヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾（本明細書では、多くの場合、２’−ＯＭｅ基、または２’−Ｏメチル化と称す）を含有せず、好ましくは、２’−ＯＨ基を含むか、または２’−Ｈ基を有するデオキシリボースであることは、本発明の重要な態様である。これら近接ヌクレオチドの１つが、２’−Ｏ−アルキル基（例えば２’−Ｏ−メチル基）を含有し得るが、好ましくは両方が含有しないことが許容されると信じられているが、このヌクレオチドの直接的３’および／または５’であるヌクレオチド（「近接ヌクレオチド」）がまた、このような化学修飾が欠如していることが好ましい。近接ヌクレオチドのいずれか１つまたは両方は、２’−ＯＨ、または適合する置換（上記で定義）であり得る。

好ましくは、本発明のＥＯＮは、ＥＯＮそれ自体が、分子内のヘアピンまたは他の種類の（ステム）ループ構造にフォールディングすること（本明細書では、「自動ルーピング」または「自己ルーピング」とも称す）を可能にし、ＡＤＡＲを捕捉する構造として潜在的に作用し得る、標的アデノシンを含む、標的ＲＮＡまたはＲＮＡ領域に相補的である部分を有さない。一態様では、本発明の一本鎖ＥＯＮは、好ましくは、標的アデノシンの位置である、少なくとも１つの位置で完璧に対形成しないが（そこで、対向するヌクレオシドは、好ましくはシチジンである）、標的ＲＮＡに完全に相補的である。本発明の一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドはまた、標的アデノシン位置以外の位置で、標的配列との１つまたは複数のミスマッチ、揺らぎ、または膨らみ（対向するヌクレオシドではない）を有し得る。標的配列との本発明のＥＯＮのこれら揺らぎ、ミスマッチ、および／または膨らみは、標的ＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを防げないが、標的アデノシン位置で、細胞に存在するＡＤＡＲによるＲＮＡ編集の効率性に加える。当業者は、生理学的条件下でのハイブリダイゼーションが依然として起こるかどうかを決定することができる。先行技術に対して、本発明のＥＯＮは、細胞に存在する哺乳動物のＡＤＡＲ酵素を使用し、ＡＤＡＲ酵素は、野生型酵素で発見された天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む。本発明によるＥＯＮは、内因性細胞経路および天然で利用可能なＡＤＡＲ酵素、または、標的ＲＮＡ配列での標的アデノシンを特異的に編集する（さらに未知のＡＤＡＲ様酵素であり得る）ＡＤＡＲ活性を有する酵素を利用することができる。本明細書に開示する通り、本発明の一本鎖ＲＮＡ編集を導入するオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列での特異的な標的アデノシンヌクレオチドを脱アミノ化することができる。理想的に、ただ１つのアデノシンが脱アミノ化される。あるいは、１、２、または３個のアデノシンヌクレオチドは脱アミノ化されるが、好ましくはただ１つである。本発明のＥＯＮの特徴を共に取る場合、修飾された組換えＡＤＡＲ発現を必要とせず、ＥＯＮに結合するコンジュゲートされた物質、または、標的ＲＮＡ配列に相補的ではない長い動員部分の存在を必要としない。加えて、本発明のＥＯＮは、ＲＮＡ／ＥＯＮ複合体での他の場所での無作為編集の危険なしに、野生型酵素で発見された天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む、天然ＡＤＡＲ酵素による、イノシンへの標的ＲＮＡ分子に存在する標的アデノシンの特異的脱アミノ化を可能にする。

ＡＤＡＲ酵素の天然標的の分析により、これらが、一般に、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２により編集されるＲＮＡらせんを形成する、二本鎖間のミスマッチを含むことが示された。これらのミスマッチにより、編集反応の特異性を向上させることが示唆されている（Stefl et al. 2006. Structure 14(2):345-355、Tian et al. 2011. Nucleic Acids Res 39(13):5669-5681）。ＥＯＮと標的ＲＮＡとの間の対形成した／ミスマッチしたヌクレオチドの最適なパターンの特徴付けもまた、効果的なＡＤＡＲに基づくＥＯＮ療法の開発に重要であるようである。本発明のＥＯＮの改善された特徴は、安定性、ならびに、適したＡＤＡＲ結合および活性を確保する、予め定義された点での特異的なヌクレオチド間結合修飾の使用である。これらの変化は、変化することができ、ヌクレオチドの糖部分、ならびに核酸塩基において、ＥＯＮの骨格での修飾をさらに含むことができる。これらはまた、標的および二次構造に依存して、ＥＯＮの配列を通して、可変的に分散することができる。特異的な化学修飾は、ＡＤＡＲ酵素のＲＮＡ結合ドメイン内の異なるアミノ酸残基、ならびにデアミナーゼドメイン中のアミノ酸残基の相互作用を支持するために必要とされ得る。例えば、立体特異的ホスホロチオエート立体配置修飾、および／または、２’−Ｏ−メチル修飾は、ＥＯＮのいくつかの部分に許容されるのに対して、他の部分では、これらは、リン酸および／または２’−ＯＨ基を有する酵素の重要な相互作用を妨害しないように、回避すべきである。これらの設計の規則の一部は、ＡＤＡＲ２の公表された構造により誘導されるが、他の部分は、経験的に規定しなければならない。異なる参照が、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２に存在し得る。修飾はまた、これらが、ＥＯＮの分解を防ぐように選択しなければならない。特異的なヌクレオチド修飾はまた、標的配列がＡＤＡＲ編集に最適ではない、基質ＲＮＡでの編集活性を向上させる必要があり得る。先の作業により、ある種の配列状況が、編集により適していることが確立されている。例えば、標的配列５’−ＵＡＧ−３’（中央に標的Ａを有する）は、ＡＤＡＲ２に対して最も好ましい隣接ヌクレオチドを含有する一方、５’−ＣＡＡ−３’標的配列は、好ましくない（Schneider et al. 2014. Nucleic Acids Res 42(10):e87）。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの最近の構造解析では、標的トリヌクレオチドに対向するヌクレオチドの慎重な選択により編集を向上させる可能性を示唆する。例えば、５’−ＣＡＡ−３’標的配列は、（このトリプレットの中央に形成されるＡ−Ｃミスマッチを有する）対向する鎖上の３’−ＧＣＵ−５’配列と対形成されるが、グアノシン塩基がＡＤＡＲ２のアミノ酸側鎖と立体的に衝突するので、好ましくない。しかし、ここで、イノシンなどの、より小さい核酸塩基が、対向するシチジンに対する塩基対形成能を依然として維持しながら、立体衝突を起こさないこの位置に潜在的にぴったり合うと仮定されている。最適以下の配列の活性を向上させることができる修飾は、ＥＯＮの柔軟性を高めるか、または、逆に、編集に好都合である構造に強制的に合わせるための、骨格修飾の使用を含む。

本明細書で使用する用語の定義
用語「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」、および「ヒポキサンチン」（イノシンでの核酸塩基）とは、本明細書で使用される場合、それ自体で核酸塩基を指す。

用語「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」、および「イノシン」とは、（デオキシ）リボシル糖に結合する核酸塩基を指す。

用語「ヌクレオシド」とは、（デオキシ）リボシル糖に結合する核酸塩基を指す。

用語「ヌクレオチド」とは、各々の核酸塩基−（デオキシ）リボシル−ホスホリンカー（phospholinker）、ならびにリボース部分またはホスホ基の任意の化学修飾を指す。ゆえに、本用語は、ロックドリボシル部分（当該技術分野に周知のメチレン基または任意の他の基を含む２’−４’架橋を含む）を含むヌクレオチド、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオネート（phosphoro(di)thioate）、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）のリンカーなどを含むリンカーを含むヌクレオチドを含む。

時に、用語、アデノシンおよびアデニン、グアノシンおよびグアニン、シトシンおよびシチジン、ウラシルおよびウリジン、チミンおよびチミジン、イノシンおよびヒポキサンチンは、互換的に、対応する核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを指すのに使用される。

時に用語、核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドは、文脈が明らかに異なる必要がない限り、互換的に使用される。用語「リボヌクレオシド」および「デオキシリボヌクレオシド」、または「リボース」および「デオキシリボース」は、当該技術分野で使用される通りである。

「オリゴヌクレオチド」を参照する場合はいつも、文脈が別途指示しない限り、オリゴヌクレオチドおよびデオキシオリゴヌクレオチドの両方を意味する。「オリゴヌクレオチド」を参照する場合はいつも、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはＩを含み得る。「デオキシオリゴヌクレオチド」を参照する場合はいつも、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＩを含み得る。好ましい態様では、本発明のＥＯＮは、化学修飾を含み得るオリゴヌクレオチドであり、ある種の特定位置にデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）を含み得る。

シトシンなどのオリゴヌクレオチド構築物中のヌクレオチドを参照する場合はいつも、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、およびβ−Ｄ−グルコシル−５−ヒドロキシ−メチルシトシンを含み、アデニンを参照する場合はいつも、Ｎ６−メチルアデニン、および７−メチルアデニンを含み、ウラシルを参照する場合はいつも、ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、および５−ヒドロキシメチルウラシルを含み、グアニンを参照する場合はいつも、１−メチルグアニンを含む。

ヌクレオシドまたはヌクレオチドを参照する場合はいつも、２’−デソキシ、２’−ヒドロキシなどのリボフラノース誘導体、および２’−Ｏ−メチルなどの２’−Ｏ−置換バリアント、ならびに、２’−４’架橋バリアントを含む他の修飾を含む。

オリゴヌクレオチドを参照する場合はいつも、２つのモノヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結合、ならびにその修飾であり得、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオネート（phosphoro(di)thioate）、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロアミデート（phosphor-amidate）のリンカーなどを含む。

用語「含む（comprising）」とは、「含む（including）」、ならびに「からなる（consisting）」を包含し、例えば、「Ｘを含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、または、追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含み得る。

数値Ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、Ｘ±１０％を意味する。

単語「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、「Ｙを実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。関連して、単語「実質的に」とは、本発明の定義から省略され得る。

用語「相補的」とは、本明細書で使用される場合、ＡＯＮ（または、本明細書で多くの場合、称される、ＥＯＮ）が、生理学的条件下、標的配列にハイブリダイズするという事実を指す。この用語は、ＡＯＮのあらゆるヌクレオチドが、標的配列の対向するそのヌクレオチドと完璧な対形成を有することは意味していない。換言すると、ＡＯＮが、標的配列に相補的であり得ると同時に、生理学的条件下、細胞ＲＮＡ編集酵素が標的アデノシンを編集することができるように、ＡＯＮが標的配列に依然としてハイブリダイズしながら、ＡＯＮと標的配列との間にミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみが存在し得る。したがって、用語「実質的に相補的な」とは、ミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみの存在に関わらず、ＡＯＮが、生理学的条件下、標的ＲＮＡにハイブリダイズするように、ＡＯＮと標的配列との間に、十分にマッチするヌクレオチドを有することも意味する。本明細書に示す通り、ＡＯＮは、相補的であり得るが、ＡＯＮが、生理学的条件下、その標的にハイブリダイズする限り、標的配列との、１つまたは複数のミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみも含み得る。

核酸配列に関する用語「下流」とは、３’方向の配列に沿ってさらに遠いことを意味し、用語「上流」とは、逆を意味する。ゆえに、ポリペプチドをコードする任意の配列において、開始コドンは、センス鎖の終止コドンの上流であるが、アンチセンス鎖の終止コドンの下流である。

「ハイブリダイゼーション」に対する参照は、典型的には、特異的なハイブリダイゼーションを指し、非特異的なハイブリダイゼーションを排除する。特異的なハイブリダイゼーションは、当該技術分野に周知の技術を使用して、プローブと標的との間の安定した相互作用の多くが、プローブおよび標的が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する場合であることを確実にする、選ばれた実験条件下で生じ得る。

用語「ミスマッチ」とは、ワトソン−クリック型塩基対の規則による完璧な塩基対を形成しない二本鎖ＲＮＡ複合体における、対向するヌクレオチドを指すために、本明細書で使用される。ミスマッチしたヌクレオチドは、Ｇ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｕ−Ｃ、Ａ−Ａ、Ｇ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｕ−Ｕ対である。いくつかの実施形態では、本発明のＥＯＮは、４個未満のミスマッチ、例えば、０、１、または２個のミスマッチを含む。揺らぎの塩基対は、Ｇ−Ｕ、Ｉ−Ｕ、Ｉ−Ａ、およびＩ−Ｃ塩基対である。

用語「スプライス突然変異」とは、エクソンからのイントロンのスプライシングが妨げられ、異常なスプライシングにより、続く翻訳が、フレームから外れて、コードされたタンパク質の早期停止をもたらすという意味において、スプライシング機構が機能不全である、プレｍＲＮＡをコードする遺伝子における突然変異に関する。多くの場合、このようなより短いタンパク質は、迅速に分解され、本明細書に記載するような任意の機能性活性を有さない。好ましい態様では、ＥＯＮにより、本発明の方法によって標的化されるスプライス突然変異は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子、より好ましくはスプライス突然変異６２１＋１Ｇ＞Ｔおよび１７１７−１Ｇ＞Ａに存在する。正確な突然変異は、ＲＮＡ編集に対する標的である必要はなく、（例えば、６２１＋１Ｇ＞Ｔの場合）スプライス突然変異の近接または近傍アデノシンが、標的ヌクレオチドであり、Ｉへの変換により、正常状態に戻るスプライス突然変異に修正される可能性がある。当業者は、スプライス突然変異の部位または領域内のアデノシンのＲＮＡ編集の後、正常なスプライシングが復元されるか否かを決定する方法を承知している。

本発明によるＥＯＮは、例えば、２’−Ｏ−メチル化糖部分（２’−ＯＭｅ）、および／または２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分（２’−ＭＯＥ）を有するヌクレオチドをもたらすことにより、その全体のほとんどで化学修飾され得る。しかし、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾を含まず、またさらに好ましい態様では、少なくとも１つの近接ヌクレオチドが、好ましい態様では、標的アデノシンに対向する各ヌクレオチドを挟む、２つの近接ヌクレオチドの両方が、２’−ＯＭｅ修飾をさらに含まない。ＥＯＮ内の全てのヌクレオチドが２’−ＯＭｅ修飾を有する完全な修復は、ＲＮＡ編集を行うことについて、非機能性オリゴヌクレオチドをもたらすが、その理由は、おそらく、標的化された位置でＡＤＡＲ活性を妨害するからである。一般に、標的ＲＮＡでのアデノシンは、２’−ＯＭｅ基で対向するヌクレオチドを生成することによって、または、対向する塩基としてグアニンもしくはアデニンを生成することによって編集から保護することができ、これはこれら２つの核酸塩基もまた、対向するアデノシンの編集を低減することができるからである。

本発明にしたがって容易に使用することができるオリゴヌクレオチドの様々な化学的性質および修飾は、分野で知られている。ヌクレオチド間の正常なヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合のモノまたはジチオエート化により改変して、それぞれ、ホスホロチオエートエステル、またはホスホロジチオエート（phosphorodithioate）エステルを得ることができる。アミド化およびペプチドリンカーを含む、ヌクレオシド間結合の他の修飾も可能である。

リボース糖は、低級アルキル（Ｃ１〜４、例えば２’−Ｏ−Ｍｅ）、アルケニル（Ｃ２〜４）、アルキニル（Ｃ２〜４）、メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、または他の置換基での２’−Ｏ部分の置換により修飾することができる。２’ＯＨ基の好ましい置換基は、メチル、メトキシエチル、または、３，３’−ジメチルアリル基である。後者は、ハイブリダイゼーションの効率性を改善しながら、そのかさ高性によりヌクレアーゼ感受性を阻害する、その特性で知られている（Angus & Sproat FEBS 1993 Vol. 325, no. 1, 2, 123-7）。あるいは、リボース環内の２’−４’分子間架橋（通常、２’酸素および４’炭素間のメチレン架橋）結合を含む、ロックド核酸配列（ＬＮＡ）を適用することができる。プリン核酸塩基、および／またはピリミジン核酸塩基は、例えば複素環のアミノ化または脱アミノ化により、修飾して、その特性を改変することができる。正確な化学的性質および形式は、オリゴヌクレオチド構築物ごと、および、適用ごとに依存し得、当業者の要望および趣向にしたがって成し遂げることができる。

本発明によるＥＯＮは、通常、１０ヌクレオチドより長く、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチド超であり、さらにより好ましくは１７ヌクレオチド超であるべきである。一実施形態では、本発明によるＥＯＮは、２０ヌクレオチドより長い。本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは１００ヌクレオチドより短く、さらにより好ましくは６０ヌクレオチドより短い。一実施形態では、本発明によるＥＯＮは、５０ヌクレオチドより短い。好ましい態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１８〜７０ヌクレオチドを含み、より好ましくは１８〜６０ヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは１８〜５０ヌクレオチドを含む。ゆえに、最も好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドを含む。

ＲＮＡ編集物質（例えば、ヒトＡＤＡＲ酵素）が、いくつかの要因に依存して、特異性を変化させることでｄｓＲＮＡ構造を編集することは、当該技術分野で知られている。１つの重要な要因は、ｄｓＲＮＡ配列を構成する二本鎖の相補性の度合いである。二本鎖の完璧な相補性は、通常、非特徴的な方法でアデノシンを脱アミノ化し、それが遭遇する任意のアデノシンと多かれ少なかれ反応する、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインをもたらす。ｈＡＤＡＲ１および２の特異性は、化学修飾を導入すること、および／または、ｄｓＲＮＡでのいくつかのミスマッチを確保することにより高めることができ、おそらく、未だに明らかに定義されていない方法で、ｄｓＲＮＡ結合ドメインの位置付けを助ける。あるいは、脱アミノ化反応自身は、編集されるアデノシンに対向するミスマッチを含む、ＥＯＮを生成することにより向上することができる。ミスマッチは、好ましくは、編集されるアデノシンに対向するシチジンを有する、標的化部分を生成することにより作成される。代替として、ウリジンもまた、アデノシンに対向して使用することができるが、これは、当然のことながら、ＵとＡとの対により、「ミスマッチ」は起こらない。標的鎖でアデノシンを脱アミノ化すると、標的鎖は、大半の生化学的なプロセスに対して、Ｇとして細胞の生化学的機構により「読み込まれる」イノシンを得る。ゆえに、ＡからＩへの変換の後、Ｉは、完璧に、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の標的化部分における対向するＣと塩基対形成することができるので、ミスマッチは解消される。編集によりミスマッチが解消された後、基質が放出され、オリゴヌクレオチド構築物−編集物質複合体が標的ＲＮＡ配列から放出され、次いで、スプライシングおよび翻訳などの、下流の生化学的なプロセスで利用可能となる。また、標的化したオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡに非常に密に結合すべきではないので、オン／オフ比は重要である。

標的ＲＮＡ配列を編集する特異性の所望のレベルは、標的ごとに依存し得る。本特許出願における指示にしたがって、当業者は、必要性にしたがってオリゴヌクレオチドの相補的な部分を設計することが可能であり、いくらかの試行錯誤をして、所望の結果を得ることが可能であろう。

本発明のオリゴヌクレオチドは、通常、正常のヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、およびＣを含むが、例えば１つまたは複数のＧヌクレオチドの代わりに、イノシン（Ｉ）を含むこともある。

オリゴヌクレオチド構築物と重なる領域での標的ＲＮＡ配列におけるアデノシンの望まれない編集を防ぐために、オリゴヌクレオチドを、化学修飾することができる。標的ＲＮＡ配列におけるアデノシンに対向するヌクレオシドのリボシル部分の２’−Ｏ−メチル化が、ＡＤＡＲによるそのアデノシンの脱アミノ化を劇的に減らすことが、当該技術分野において示されている（Ｖｏｇｅｌら、２０１４）。ゆえに、オリゴヌクレオチド構築物の所望の位置に２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチドを含むことにより、編集の特異性は、劇的に改善する。リボシル部分の他の２’−Ｏ置換、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）および２’−Ｏ−ジメチルアリル基もまた、標的ＲＮＡ配列における相当する（対向する）アデノシンの望まない編集を低減することができる。これら全ての修飾は、本発明のオリゴヌクレオチドに適用することができる。他の化学修飾もまた、オリゴヌクレオチドの合成および設計の当業者にとって、容易に利用できる。このような化学修飾されたオリゴヌクレオチドの合成、および本発明による方法でのそれらの試験は、過度の負担を有するものではなく、他の修飾は、本発明により包含される。

細胞に存在するＲＮＡ編集分子は、通常、哺乳動物を含む、後生動物で見られるＡＤＡＲ酵素など、天然でタンパク質性である。好ましくは、細胞の編集物質は、酵素であり、より好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくはアデノシンデアミナーゼである。これらは、ＡＤＡＲ活性を有する酵素である。最も興味深いものは、ヒトＡＤＡＲ、ｈＡＤＡＲ１、およびｈＡＤＡＲ２であり、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０およびｐ１５０などの、任意のそのアイソフォームを含む。当該技術分野で知られているＲＮＡ編集酵素は、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物が簡便に設計され得るが、ヒトまたはヒト細胞におけるｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２などの、ＲＮＡで作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ならびにシチジンデアミナーゼを含む。ヒトＡＤＡＲ３（ｈＡＤＡＲ３）は、先行技術に記載されているが、報告によると、デアミナーゼ活性は有さない。ｈＡＤＡＲ１が、２つのアイソフォーム、長い１５０ｋＤａのインターフェロン誘導型、および通常のプレｍＲＮＡから代替的なスプライシングによって生成されるより短い１００ｋＤａ型で存在することが知られている。その結果、細胞に存在する１５０ｋＤａアイソフォームのレベルは、インターフェロン、特にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の影響を受ける可能性がある。ｈＡＤＡＲ１もまた、ＴＮＦ−αに誘導される。これは、併用療法を開発する機会を提供し、それによりインターフェロンγまたはＴＮＦ−α、および本発明によるオリゴヌクレオチドは、組合せ製品、または別々の製品のいずれかとして、同時に、または続いて、任意の順でのいずれかで、患者に投与される。ある種の疾患状態は、既に、患者のある種の組織における高いＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αレベルと一致し得、病変組織に対してより特異的な編集を行うさらなる機会を作る。

本発明のＥＯＮにおける化学修飾の例は、糖部分の修飾であり、糖（リボース）部分内の架橋置換基（例えば、ＬＮＡまたはロックド核酸内の）による修飾、２’−Ｏ原子の、上述したような長さを有する、アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、アルキニル（２’−Ｏ−アルキニル）、アルケニル（２’−Ｏ−アルケニル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシエチル、２’−ＭＯＥ）基での置換による修飾などが含まれる。加えて、骨格のホスホジエステル基は、チオエート化、ジチオエート化、アミド化などにより修飾して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）など、ヌクレオシド間結合を得ることができる。ヌクレオシド間結合は、ペプチド結合で完全にまたは部分的に置き換えて、ペプチド核酸配列などで得ることができる。あるいは、または加えて、核酸塩基は、（脱）アミノ化により修飾させて、イノシンまたは２’６’−ジアミノプリンなどを得ることができる。さらなる修飾は、ＣｐＧ配列に関連することが知られている潜在的な免疫原性の特性を低減させる、ヌクレオチドのシチジン部分における、Ｃ５のメチル化であり得る。

ｄｓＲＮＡ複合体が、ＡＤＡＲ酵素を動員して、標的ＲＮＡ配列においてＡからＩへ脱アミノ化する場合、編集されるアデノシンと対向するヌクレオチドとの間の塩基対、ミスマッチ、膨らみ、または揺らぎは、アデノシン、グアニン、ウリジン、またはシチジン残基を含み得るが、好ましくはシチジン残基を含む。（ウリジンを適用しない場合）編集部位に対向する潜在的なミスマッチを除いて、ＥＯＮの残存部分は、標的ＲＮＡに完璧に相補的であり得る。しかし、本明細書に示す通り、ある種の態様では、本発明は、限られた数の不完全なミスマッチを含むＥＯＮに関する。細胞内の編集物質を他の標的部位に再配向する程度は、編集分子の認識ドメインに対する、本発明によるオリゴヌクレオチドの親和性を変化させることにより調節され得ることは、当業者なら理解されよう。正確な修飾は、いくらかの試行錯誤を通して、ならびに／または、オリゴヌクレオチドと編集分子の認識ドメインとの間の構造的相互作用に基づく計算方法によって決定することができる。

加えて、またはあるいは、細胞に存在する編集物質を動員し、再配向する程度は、オリゴヌクレオチドの投与および投与レジメンにより調節され得る。これは、（インビトロ）実験者または通常、第Ｉ相および／または第ＩＩ相の臨床試験において、臨床医により決定されることである。

本発明は、真核細胞、好ましくは後生動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞における標的ＲＮＡ配列の修飾に関係する。原則として、本発明は、任意の哺乳動物種由来の細胞で使用することができるが、好ましくはヒト細胞で使用する。本発明は、任意の臓器、例えば、皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液などに由来する細胞で使用することができる。本発明は、（ヒト）対象の疾患状態に関与する、例えば、ヒト対象が嚢胞性線維症に罹患する場合の細胞、組織、または臓器の配列を修飾するのに特に適している。このような細胞として、限定されないが、肺の上皮細胞が挙げられる。細胞は、インビトロまたはインビボに位置することができる。本発明の一利点は、生体中のインシチュでの細胞で使用することができるが、培養下の細胞でも使用することができることである。いくつかの実施形態では、細胞をエクスビボで処置し、次いで、生体内に導入する（例えば、本来由来する生物内に再導入する）。本発明はまた、いわゆるオルガノイド内の細胞において、標的ＲＮＡ配列を編集するのに使用することができる。オルガノイドは、３次元のインビトロ由来の組織と考えられるが、個別の単離された組織を生成する特定の条件を使用して駆動される（例えば、Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125を参照）。治療環境では、オルガノイドはインビトロで患者の細胞に由来することができ、通常の移植より拒絶されにくい自己由来の物質として患者に再導入することができるので、有用である。処置される細胞は、一般に、遺伝子突然変異を有する。突然変異は、ヘテロ接合またはホモ接合であり得る。本発明は、典型的には、ＮからＡへの突然変異（Ｎは、Ｇ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であり得る）、好ましくはＧからＡへの突然変異、またはＮからＣへの突然変異（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であり得る）、好ましくはＵからＣへの突然変異などの、点突然変異を修飾するのに使用される。

理論により拘束されることは望むものではないが、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集は、転写もしくはスプライシングの間の核内、または、例えば、成熟ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｎｃＲＮＡを編集することができる細胞質の一次転写物で起こると考えられている。編集酵素の異なるアイソフォームは示差的に局在化することが知られている（例えば、核内で多く見られるｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０、および細胞質で多く見られるｈＡＤＡＲ１ ｐ１５０）。シチジンデアミナーゼによるＲＮＡ編集は、ｍＲＮＡレベルで起こると考えられている。

本発明は、編集反応をもたらすために、編集される部位を標的化し、細胞に存在するＲＮＡ編集物質を動員することが可能なオリゴヌクレオチドの使用によって、真核細胞での標的ＲＮＡ配列を変化させるために使用される。好ましい編集反応は、アデノシンからイノシンに変換するアデノシン脱アミノ化である。標的ＲＮＡ配列は、点突然変異（転移またはトランスバージョン）などの、修正または改変することを望むことができる突然変異を含むことができる。標的ＲＮＡは、任意の細胞またはウイルスＲＮＡ配列であり得るが、より通常では、プレｍＲＮＡまたはタンパク質コーティング機能を有するｍＲＮＡである。

多くの遺伝的疾患は、ＧからＡへの突然変異により起こり、突然変異した標的アデノシンでのアデノシン脱アミノ化が、とりわけＰＴＣの場合、突然変異を、機能性、全長および／もしくは野生型タンパク質を生じるコドンに逆行させることから、これらは、好ましい標的疾患である。本発明によるオリゴヌクレオチドで予防および／または処置することができる遺伝的疾患の好ましい例は、標的ＲＮＡでの１つまたは複数のアデノシンの修飾が、（潜在的な）有益な変化をもたらす、任意の疾患である。とりわけ好ましいのは、嚢胞性線維症であり、より具体的には、ＣＦＴＲ ＲＮＡでの疾患誘導性ＰＴＣにおけるアデノシンのＲＮＡ編集が好ましい。ＣＦ突然変異の当業者は、Ｇ５４２Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｒ１１６２Ｘ、Ｙ１２２Ｘ、Ｗ１０８９Ｘ、Ｗ８４６Ｘ、Ｗ４０１Ｘ、６２１＋１Ｇ＞Ｔ、または１７１７−１Ｇ＞Ａを含む１０００〜２０００の突然変異が、ＣＦＴＲ遺伝子で知られていることを認識する。

標的配列は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞に内在する。

投与されるオリゴヌクレオチドの量、投与量、および投与レジメンは、細胞の種類ごと、処置される疾患、標的集団、投与の様式（例えば、全身対局所）、疾患の重症度、および副活性の許容レベルで異なり得るが、これらは、インビトロ研究、前臨床試験、および臨床試験の間、試行錯誤により評価することができ、評価されるべきである。修飾された配列により容易に検出される表現型の変化が生じる場合、試験は、特に単純である。より高用量のオリゴヌクレオチドが、細胞内で核酸編集物質（例えばＡＤＡＲ）への結合について競合し、それにより、ＲＮＡ編集を行わない物質の量を枯渇させる可能性があるが、通常の投与試験により、所与のオリゴヌクレオチドおよび所与の標的に対する任意のこのような効果が明らかになる。

１つの適した試験技術は、オリゴヌクレオチド構築物を細胞株、または試験生物に送達すること、次いで、その後の様々な時点で生検サンプルを採取することを含む。標的ＲＮＡの配列は、生検サンプルで評価することができ、修飾を有する細胞の割合は、続いて容易に評価することができる。この試験を一旦行うと、その後、情報を保持することができ、生検サンプルの採取を必要とせずに、今後の送達を行うことができる。ゆえに、本発明の方法は、細胞の標的ＲＮＡ配列での所望の変化の存在を同定し、それにより、標的ＲＮＡ配列が修飾されることを検証するステップを含むことができる。このステップは、典型的には、上述の通り、標的ＲＮＡの関連する部分、またはそのｃＤＮＡコピー（もしくは、標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合、そのスプライシング生成物のｃＤＮＡコピー）をシークエンシングすることを含むだろうし、配列変化は、容易に検証することができる。あるいは、変化は、タンパク質のレベル（長さ、グリコシル化、機能など）で、または、標的ＲＮＡ配列でコードされるタンパク質が、例えば、イオンチャンネルである場合、（誘導）電流などの、いくつかの機能的な読み出しにより、評価することができる。ＣＦＴＲ機能の場合、機能の復元または獲得を評価するために、ヒトを含む哺乳動物における、Ｕｓｓｉｎｇチャンバ−アッセイ、またはＮＰＤ試験が、当業者に周知である。

ＲＮＡ編集が、細胞内で起こった後、修飾されたＲＮＡは、例えば、細胞分裂、編集されるＲＮＡの半減期の制限などにより、経時的に希釈され得る。ゆえに、実用的な治療の点で、本発明の方法は、十分な標的ＲＮＡを修飾して、患者に目に見える利点を提供する、および／または経時的に利点を維持するまで、オリゴヌクレオチド構築物の反復送達を含み得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、特に、治療的使用に適しているので、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、単純に生理食塩水溶液であり得る。これは、特に肺内送達に対して、有用に等張性または高張性であり得る。本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む、送達デバイス（例えば、シリンジ、吸入器、ネブライザー）を提供する。

本発明はまた、本明細書に記載される、哺乳動物、好ましくはヒト細胞での標的ＲＮＡ配列において変化をもたらすための方法における使用のための、本発明のオリゴヌクレオチドを提供する。同様に、本発明は、本明細書に記載される、哺乳動物、好ましくはヒト細胞での標的ＲＮＡ配列において変化をもたらすための医薬の製造における、本発明のオリゴヌクレオチド構築物の使用を提供する。

本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する、少なくとも１つの特異的な標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に、本発明によるＥＯＮを供給するステップ、ＥＯＮの細胞による取込みを可能にするステップ、標的ＲＮＡ分子へのＥＯＮのアニーリングを可能にするステップ、野生型酵素で発見された天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素が、標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ、および、任意で、ＲＮＡ配列中のイノシンの存在を同定するステップを含む、方法に関する。

本発明によるＥＯＮの細胞内への導入は、当業者に知られている一般的な方法で行われる。脱アミノ化の後、効果の読み出し（標的ＲＮＡ配列の改変）を、異なる方法によってモニタリングすることができる。ゆえに、標的アデノシンの所望の脱アミノ化が、実際に行われたかどうかを同定するステップは、一般に、標的ＲＮＡ配列での標的アデノシンの位置、および、アデノシンの存在により生じる効果に依存する（点突然変異、初期終止コドン）。ゆえに、好ましい態様では、ＡからＩへの変換の最終的な脱アミノ化効果に依存して、同定するステップは、標的ＲＮＡをシークエンシングすること、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または、機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、ことを含む。ＵＡＡ終止コドンがある場合、両方のアデノシンを脱アミノ化する必要があることを意味する。ゆえに、本発明はまた、互いに隣接する２つのアデノシンが、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集酵素により共脱アミノ化される、オリゴヌクレオチドおよび方法に関する。この特定の場合、ＵＡＡ終止コドンは、ＵＧＧ Ｔｒｐコードコドンに変換される。アデノシンのイノシンへの脱アミノ化により、標的位置での突然変異したＡにもはや有さないタンパク質をもたらすことができるため、イノシンへの脱アミノ化の同定はまた、機能的な読み出し、例えば、機能的タンパク質が存在するかどうかの評価、または、さらに、アデノシンの存在により引き起こされる疾患が（部分的に）逆行することの評価であり得る。本明細書に記載の疾患の各々に対する機能的評価は、一般に、当業者に知られている方法にしたがう。標的アデノシンの脱アミノ化の後のイノシンの存在を同定する非常に適した方法は、もちろん、当業者に周知の方法を使用する、ＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンシングである。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、薬学的な使用に適合する、添加物質、賦形剤、または他の成分を任意で含む、水溶液、例えば、生理食塩水で、または、懸濁液で、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、適切に投与される。投与量は、適切には、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、吸入（例えば、ネブライザーによって）、鼻腔内、経口、注射または注入、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、気管内、腹腔内、直腸内などであり得る。投与は、固体形態、散剤、丸剤の形態、または、ヒトにおける薬学的な使用に適合する任意の他の形態であり得る。本発明は、特に、嚢胞性線維症などの遺伝的疾患を処置するのに適している。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド構築物は、全身に送達することができるが、オリゴヌクレオチドを、標的配列の表現型と分かる細胞に送達することがより典型的である。例えば、ＣＦＴＲにおける突然変異は、肺の上皮組織で主に見られる嚢胞性線維症を引き起こすので、ＣＦＴＲ標的配列を用いて、オリゴヌクレオチド構築物を、特異的かつ直接的に肺に送達することが好ましい。これは、吸入により、例えば、散剤またはエアゾール剤により、典型的には、ネブライザーの使用を介して適宜的に達成することができる。とりわけ好ましいのは、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（Ｒａｐｉｄ）またはＲｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ製のｉ−ｎｅｂを含む、いわゆるメッシュ振動式を使用する、ネブライザーである。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の吸入送達がまた、これら細胞を効果的に標的化することができ、ＣＦＴＲの場合、遺伝子標的化により、嚢胞性線維症にも関連する消化管症状の改善をもたらすことが予想される。いくつかの疾患では、粘膜層は、厚さを増し、肺を介する薬の吸収を低下させることを示す。このような疾患の１つは、慢性気管支炎であり、別の例は、嚢胞性線維症である。粘膜ネブライザーの様々な形態が利用可能で、例えば、ＤＮアーゼ、高張性生理食塩水、またはマンニトールであり、Ｂｒｏｎｃｈｉｔｏｌの名称で市販されている。粘膜ネブライザーを、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物などの、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド構築物と組み合わせて使用する場合、これらは、薬の有効性を高めることができる。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは、粘膜ネブライザー、好ましくは本明細書に記載の粘膜ネブライザーと組み合わせる。加えて、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の投与は、増強化合物、例えばＫａｌｙｄｅｃｏ（ｉｖａｃａｆｔｏｒ；ＶＸ−７７０）、または矯正化合物（corrector compound）、例えばＶＸ−８０９（ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）および／またはＶＸ−６６１などの、ＣＦの処置のための小分子の投与と組み合わせることができる。ＣＦにおける他の併用療法は、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを使用して、アデノシンデアミナーゼのインデューサーと組み合わせて使用することを含むことができる。あるいは、または粘膜ネブライザーと組み合わせて、粘膜透過性粒子またはナノ粒子での送達は、ＲＮＡ編集分子の、例えば肺および腸の上皮細胞への効果的な送達に適用することができる。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは、粘膜透過性粒子またはナノ粒子での送達を使用する。慢性および急性肺感染症は、多くの場合、嚢胞性線維症などの疾患の患者に存在する。抗生物質による処置は、細菌感染、ならびに、粘膜肥厚および／またはバイオフィルム形成などの、その症状を低減する。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物と組み合わせる抗生物質の使用により、オリゴヌクレオチド構築物に対して標的細胞がより容易に接近するため、ＲＮＡ編集の効率性が高まる。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは、細菌感染、ならびに、粘膜肥厚および／またはバイオフィルム形成などの、その症状を低減するために、抗生物質による処置と組み合わせる。抗生物質は、全身に、もしくは局所的に、またはその両方で投与することができる。嚢胞性線維症患者への適用に対して、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物、またはパッケージもしくは複合化した本発明によるオリゴヌクレオチド構築物は、任意の粘膜ネブライザー、例えば、ＤＮアーゼ、マンニトール、高張性生理食塩水、ならびに／または、抗生物質、ならびに／または、増強化合物、例えばｉｖａｃａｆｔｏｒ、もしくは矯正化合物、例えばｌｕｍａｃａｆｔｏｒおよび／もしくはＶＸ−６６１などの、ＣＦの処置のための小分子と組み合わせることができる。標的細胞への接近を増すため、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を適用して、本発明によるオリゴヌクレオチドの投与の前に、肺を清浄することができる。

[実施例１]
コンピューターモデリングに基づく、一本鎖アンチセンス編集オリゴヌクレオチドの設計
本発明の発明者らは、モデリングデータが、標的ＲＮＡの編集を改善する（または編集の効率性を高める）ために編集オリゴヌクレオチド（ＥＯＮ）に組み込むことができる、構造的特徴の同定を支持し得ることを想定した。ＡＤＡＲの立体障害を回避し、さらにタンパク質をより効果的に動員するように、ＥＯＮのヌクレオチドを化学修飾することにより、最適以下の配列状況に対処した。本プロセスを誘導するため、存在するＲＮＡ結合ＡＤＡＲ２構造を、開始点（構造テンプレート）として使用した。二本鎖ＲＮＡとの相互作用におけるＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの公表された構造（Matthews et al., Nature Structural and Molecular Biology, 2016）を解析し、新規の構造計算に必要な距離の分子内および分子間距離のネットワークを生成した。分子内および分子間距離の値に対して、上限値を規定した。分子内距離に対して、上限値は、ＲＮＡ結合ＡＤＡＲ２デアミナーゼＸ線構造で観察される距離に相当する。分子間距離に対して、上限値は、結合界面での側鎖の適用を可能にする、観察された距離より大きい、１〜３Å間に設定した。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの二次構造エレメントに対して、上限距離および下限距離を挿入し、αらせんおよびβシートで古典的に検出される水素結合ネットワークを特徴付けた。二面角制限は、公表された構造から導かれた。この手法は、当業者に知られている、溶液中のタンパク質−ＲＮＡ構造を解明するために使用される標準的な方法（核磁気共鳴分光法）に基づき、捻れ角ならびに分子動力学ステップを統合する。機能的に最適化されているＥＯＮに結合するＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの構造を、ＣＹＡＮＡ３．９７（Herrmann et al., J. Mol. Biol., 2002）で計算し、選択した原子モデルを、ｆｆ９９ＳＢ力場を使用する陰的水（implicit water）でのシミュレーテッドアニーリングにより、ＡＭＢＥＲ１６（Case D.A. et al., J. Comput. Chem., 2005）のＳＡＮＤＥＲモジュールで精製した。インシリコでは、Ｉｄｕａ ＲＮＡ標的にアニールしたＥＯＮからなる二本鎖ＲＮＡ複合体を使用した。このプロトコルは、タンパク質側鎖および二本鎖ＲＮＡ−ＥＯＮらせん間の相互作用の原子的な詳細の探索を可能にした。相互作用を、ＥＯＮの酸素−リン酸骨格の化学修飾により調節した。

[実施例２]
ＲＮＡ編集におけるインシリコモデリングされたＥＯＮの使用
上記で概説した通り、許容および非許容の立体特異的ホスホロチオエート立体配置修飾のパターンを決定し、ＲＮＡ編集実験においてこれをさらに実証するために、酵素的アッセイを行って、実験的に方法を確認する。これらのハーラー症候群モデル実験の手順は、国際公開第２０１７／２２０７５１号に記載される。第一の実験では、様々な位置での修飾を有するいくつかのＥＯＮを試験する。第二の実験では、立体特異的ホスホロチオエートＲｐおよび／またはＳｐ修飾を、本明細書に概説したような原子スケールモデリング結果と一致した、ＥＯＮでの特異的な位置で統合する。早期停止コドン（Ｗ３９２Ｘ）で改変したＩｄｕａ遺伝子を過剰発現するＭＥＦ細胞におけるオリゴヌクレオチドのトランスフェクションの後、α−Ｌ−イズロニダーゼ（Ｉｄｕａ遺伝子でコードされたタンパク質）の酵素的活性を、多数の対照に関して定量化する。ＥＯＮをこれらのＲＮＡ標的に結合し、続いてＡＤＡＲで編集することで、酵素機能を復元する。

Claims (18)

1. 細胞内の標的核酸分子と二本鎖複合体を形成することができ、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素を動員することができる、オリゴヌクレオチド組成物であって、前記標的核酸分子が、ヌクレオチド脱アミノ化活性を有する前記酵素による脱アミノ化のための標的ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、式
   

   

   
   （式中、Ｘは、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、−ＮＲ^１Ｒ^１、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、−Ｓ−Ｚ^＋、−Ｓｅ−Ｚ^＋、または−ＢＨ_３−Ｚ^＋であり、Ｒ^１は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリールであり、Ｚ^＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、もしくはヘテロ環イミニウムイオンであり、そのいずれかが一級、二級、三級、もしくは四級であるか、またはＺは、一価の金属イオンである）
   によるＲｐまたはＳｐ立体特異的立体配置が濃縮されている、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチド組成物。
2. 前記標的ヌクレオチドに対向し、前記標的ヌクレオチドとミスマッチする、ヌクレオチド位置０と称すヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチド間結合の番号付けが、結合番号０がヌクレオチド位置０からの５’結合となるようにし、前記オリゴヌクレオチドでのヌクレオチド位置および結合位置がいずれも、５’末端および３’末端に向かってそれぞれ正（＋）および負（−）に増分する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 主にＲｐ立体配置を有する少なくとも１つの前記ヌクレオチド間結合が、結合位置＋４、−１、−３、および／または−６にある、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
4. 主にＳｐ立体配置を有する少なくとも１つの前記ヌクレオチド間結合が、結合位置＋１０にある、請求項２または３に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
5. 前記オリゴヌクレオチドが、非修飾ホスホジエステルである少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
6. 非修飾ホスホジエステルである少なくとも１つの前記ヌクレオチド間結合が、結合位置＋５、＋６、＋７、＋８、−４、および／または−５にある、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
7. 前記オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）リボース修飾を含む１つまたは複数のヌクレオチドを含み、２’−ＭＯＥリボース修飾を含まない１つまたは複数のヌクレオチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
8. 前記オリゴヌクレオチドが、２’−ＭＯＥリボース修飾を含まない位置で２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）リボース修飾を含む、および／または前記オリゴヌクレオチドが、２’−ＭＯＥリボース修飾を含まない位置でデオキシヌクレオチドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
9. ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する前記酵素が、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２などの、アデノシン脱アミノ化活性を有するデアミナーゼドメインを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
10. ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する前記酵素が、天然に発現される真核アデノシン脱アミノ化酵素、好ましくはＡＤＡＲ２である、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
11. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチド長であり、１００ヌクレオチドより短く、好ましくは６０ヌクレオチドより短い、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
12. 前記標的ヌクレオチドが、イノシンに脱アミノ化するアデノシンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
13. 前記アデノシンが、ＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドンに位置し、ＵＧＧコドンに編集される、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
15. 嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル症候群、シャルコー−マリー−ツース症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ−ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン−ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連がん、ポイツ−イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ−ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の処置または予防での使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
16. 嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、色素欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、カダシル症候群、シャルコー−マリー−ツース症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、先天性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ−ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン−ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連がん、ポイツ−イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ−ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の処置または予防のための医薬の製造における、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物の使用。
17. 細胞内の標的核酸分子に存在する少なくとも１つの標的ヌクレオチドの脱アミノ化のための方法であって、
    （ｉ）前記細胞に、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド組成物を供給するステップ、
    （ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの前記細胞による取込みを可能にするステップ、
    （ｉｉｉ）前記標的核酸分子への前記オリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にするステップ、
    （ｉｖ）ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する哺乳動物酵素が、前記標的核酸分子中の前記標的ヌクレオチドを脱アミノ化することを可能にするステップ、および
    （ｖ）任意で、前記標的核酸中の脱アミノ化した前記ヌクレオチドの存在を同定するステップ
    を含む方法。
18. ステップ（ｖ）が、
    ａ）脱アミノ化した前記標的ヌクレオチドを含む、前記標的核酸分子の領域をシークエンシングすること、
    ｂ）前記標的ヌクレオチドが、ＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドンに位置するアデノシンであり、脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、
    ｃ）２つの標的アデノシンが、ＵＡＡ終止コドンに位置し、両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、
    ｄ）前記標的核酸が、プレｍＲＮＡである場合、前記プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または
    ｅ）機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の前記標的核酸が、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、こと
    を含む、請求項１７に記載の方法。
    

Images