JP2023535918A - Ｒｎａ編集用のアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンのイノシンへの脱アミノ化に使用するための、２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは「編集ＡＯＮ」であり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり、編集ＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、ヘルパーＡＯＮは、編集ＡＯＮに相補的なひと続きのヌクレオチドとは別の標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、編集ＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物に関する。

Description

本発明は、医学の分野、特に、細胞のＲＮＡ分子をアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）により標的化し、標的ＲＮＡ分子に存在する標的ヌクレオチドを特異的に変化させる、ＲＮＡ編集の分野に関する。本発明は、デアミナーゼ活性を有する（内因性）酵素を係合することによって、標的ＲＮＡ分子での疾患を起こし得る突然変異したヌクレオチドなどの特異的なヌクレオチドを補正することを目的とする。

ＲＮＡ編集は、真核細胞が、多くの場合、部位特異的で正確な方法で、そのＲＮＡ分子の配列を改変し、それにより、ゲノムをコードしたＲＮＡのレパートリーを数桁増加させる、自然なプロセスである。ＲＮＡ編集酵素は、動物界および植物界を通じて真核生物において記述されており、これらプロセスは、単純な生命体（例えば、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans））からヒトに至る後生動物での細胞恒常性を制御する、重要な役割を担っている。ＲＮＡ編集の例は、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換、およびシチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への変換であり、それぞれ、アデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼと言われる酵素により生じる。最も広く研究されているＲＮＡ編集システムは、アデノシンデアミナーゼ酵素を含むシステムである。アデノシンデアミナーゼは、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２、ならびにｈＡＤＡＲ３を含む、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）として知られている酵素のファミリーの一部である。しかし、ｈＡＤＡＲ３に対して、デアミナーゼ活性は、未だに示されていない。

ＡＤＡＲは、目的の酵素に依存して、触媒ドメインを含むマルチドメインタンパク質、および、２～３個の二本鎖ＲＮＡ認識ドメインである。各認識ドメインは、特異的二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列および／または構造を認識する。触媒ドメインの重要な機能は、核酸塩基の脱アミノ化により、標的ＲＮＡでの近傍の、およそ予め定義された位置において、ＡをＩに変換することであるが、触媒ドメインはまた、ｄｓＲＮＡらせんの部分を認識および結合する役割を担う。イノシンは、細胞の翻訳機構により、グアノシンとして読み込まれ、編集されたアデノシンが、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのコード領域にある場合、タンパク質配列を再コードすることができる。Ａ＞Ｉ変換はまた、元の開始点の上流に新規の翻訳開始点を作成する、標的ｍＲＮＡの５’非コード配列（Ｎ末端の拡張されたタンパク質を生じる）で起こるか、または、３’ＵＴＲもしくは転写の他の非コード部分（ＲＮＡのプロセッシングおよび／もしくは安定性に影響を与えることができる）で起こり得る。加えて、Ａ＞Ｉ変換は、プレｍＲＮＡのイントロンまたはエクソンにおいてスプライスエレメントで起こり、それにより、スプライシングのパターンを改変し得る。その結果として、エクソンは（部分的または完全に）、含まれ得るか、またはスキップし得る。

アデノシンデアミナーゼを応用して標的ＲＮＡを編集するためのオリゴヌクレオチドの使用が報告されている（例えば、Montiel-Gonzalez et al. 2013. Proc Natl Acad Sci USA 110(45):18285-18290；Vogel et al. 2014. Angewandte Chemie Int Ed 53:267-271；Woolf et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:8298-8302）。Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚら（２０１３）によって記載された方法の不利な点は、切断された天然ＡＤＡＲタンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインに遺伝的に融合した、バクテリオファージλＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインからなる融合タンパク質が必要なことである。主要な障害である融合タンパク質で形質導入されるか、または、標的細胞が、発現用の操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸構築物でトランスフェクトされるかのいずれかの標的細胞を必要とする。Ｖｏｇｅｌら（２０１４）に記載のシステムは、どのようにして、まずＡＤＡＲを遺伝子改変することなくシステムを適用し、続いて標的ＲＮＡを有する細胞をトランスフェクトまたは形質導入して、細胞にこの遺伝子操作されたタンパク質を供給するかが明らかではないという点で、同様の欠点がある。明らかに、このシステムは、（例えば治療環境での）ヒトにおける使用に容易に適用することができない。標的ＲＮＡ配列に１００％相補的である、Ｗｏｏｌｆら（１９９５）のオリゴヌクレオチドは、細胞抽出物またはゼノプス類（Xenopus）の卵母細胞において、ミクロ注入により、唯一機能するようであり、特異性の重度の欠如に悩まされ、アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であった標的ＲＮＡ鎖におけるほぼ全てのアデノシンを編集した。各ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾を有する、オリゴヌクレオチド、３４ヌクレオチド長は、Ｗｏｏｌｆら（１９９５）が試験し、不活性であることを示した。ヌクレアーゼに対する安定性をもたらすために、５’末端および３’末端の５ヌクレオチドで、２’－ＯＭｅ修飾させ、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）結合で修飾させた、３４マーのＲＮＡも試験した。中央の非修飾領域のこのオリゴヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ分解に対する保護を実現する末端修飾で、内因性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができることが示された。しかし、このシステムは、標的ＲＮＡ配列における特異的な標的アデノシンの脱アミノ化を示さなかった。上述した通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて非修飾のヌクレオチドに対向するほぼ全てのアデノシンを編集した（したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の５ヌクレオチドが修飾された場合での中央の非修飾領域のヌクレオチドに対向するほぼ全てのアデノシン、または、ヌクレオチドが修飾されなかった場合での標的ＲＮＡ鎖でのほぼ全てのアデノシン）。

ＡＤＡＲは、任意のｄｓＲＮＡで作用することができることが当該技術分野で知られている。「無作為編集（promiscuous editing）」と時に称されるプロセスによって、酵素は、ｄｓＲＮＡにおいて、多数のＡのものを編集する。ゆえに、このような無作為編集を回避し、治療適用可能である標的ＲＮＡ分子で特定のアデノシンのみを標的化する、方法および手段の必要性が存在する。Ｖｏｇｅｌら（２０１４）は、このような標的外編集が、編集すべきではないアデノシンに対向する位置でのオリゴヌクレオチドにおいて、２’－ＯＭｅ修飾させたヌクレオチドを使用することにより抑制することができ、標的ＲＮＡの特異的に標的化されたアデノシンに直接対向する非修飾ヌクレオチドを使用することができることを示した。しかし、標的ヌクレオチドでの特異的な編集効果は、ＡＯＮと共有結合する組換えＡＤＡＲ酵素を使用せずに、生じるということが示されなかった。

国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットでは、ＲＮＡの標的化編集のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、標的ＲＮＡ配列に相補的な配列（以下、「標的化部分」と称す）、および好ましくは標的ＲＮＡに相補的ではないステム－ループ構造（以下、「動員部分」と称す）の存在によって特徴付けられるＡＯＮが開示される。このようなオリゴヌクレオチドは、「自己ルーピングＡＯＮ」と称す。動員部分は、細胞に存在する天然のＡＤＡＲ酵素を、標的配列と標的化部分のハイブリダイゼーションにより形成されるｄｓＲＮＡに動員する働きがある。動員部分があるため、コンジュゲートされる実体も、修飾された組換えＡＤＡＲ酵素の存在も必要としない。動員部分は、天然基質（例えばＧｌｕＢ受容体）またはＡＤＡＲ酵素のｄｓＲＮＡ結合領域により認識されるとして知られているＺ－ＤＮＡ構造のいずれかを模倣するステム－ループ構造であった。ステム－ループ構造は、２つの別々の核酸鎖により形成される分子間ステム－ループ構造、または、単一の核酸鎖内に形成される分子内ステム－ループ構造であり得る。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載の動員部分のステム－ループ構造は、分子内であり、ＡＯＮ自体内に形成され、ＡＤＡＲを引き付けることができる。国際公開第２０１７／２２０７５１号パンフレットおよび国際公開第２０１８／０４１９７３号パンフレットでは、動員部分を含まないが、１つまたは複数のミスマッチを除いた標的化された領域、またはいわゆる「揺らぎ」もしくは膨らみに（ほぼ完全に）相補的である、ＡＯＮが記載されている。唯一のミスマッチは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドであり得るが、他の実施形態では、ＡＯＮは、標的配列領域を結合した場合、多数の膨らみおよび／または揺らぎに関して記載されていた。ＡＯＮの配列を、ＡＤＡＲを引き付けることができるように注意深く選択した場合、動員部分が欠乏するＡＯＮ、および内因性ＡＤＡＲ酵素で、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでのＲＮＡ編集を達成することが可能であったと思われた。「オーファンヌクレオチド」は、標的ＲＮＡ分子での標的アデノシンに直接対向して位置するＡＯＮ内のヌクレオチドとして定義されるが、２’－ＯＭｅ修飾を有さなかった。オーファンヌクレオチドはまた、ＡＯＮの残りが糖物質（例えば２’－ＯＭｅ）での２’－Ｏ－アルキル修飾を有したＤＮＡヌクレオチド（糖物質が２’修飾を有さない）、またはＲＮＡ編集の効率性をさらに改善した、および／もしくはヌクレアーゼに対する耐性を高めた特定の化学修飾を含有する（もしくはＤＮＡであった）いわゆる「セントラルトリプレット（Central Triplet）」（＝ＡＯＮ内に２つの直接的な近接ヌクレオチドを有するオーファンヌクレオチド）内の、もしくはセントラルトリプレットを直接囲んでいるヌクレオチドでもあり得た。そのような効果は、分解からＡＯＮを「保護する」センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）を使用することにより、さらに改善することさえできた。これは、国際公開第２０１８／１３４３０１号パンフレットに記載されていた。

国際公開第２０１９／１５８４７５号パンフレット、国際公開第２０１９／２１９５８１号パンフレット、ＰＣＴ／欧州特許第２０２０／０５３２８３号明細書（未刊）、およびＰＣＴ／欧州特許第２０２０／０５９３６９号明細書（未刊）には、ＡＯＮの安定性および／またはＲＮＡ編集の効率を増加させるために、オリゴヌクレオチド骨格および／または糖部分の非常に特定の位置に特定の化学修飾を有する、ＲＮＡ編集用ＡＯＮが記載されており、ＰＣＴ／欧州特許２０２０／０６０２９１号明細書（未刊）には、例えば（天然で生じる）ＲＮＡ編集が、ある特定のがんおよびウイルス感染症で見られるような疾患をもたらす場合に、指定の位置におけるＲＮＡ編集を阻害するためのＡＯＮの使用が記載されている。

上記で概説した様々な取り組みにも関わらず、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによるＲＮＡ編集は、主に、比較的大型の分子を用いて達成されていたようである。問題は、ＡＯＮが大型になると共に、それ単独で細胞に進入させることがより困難になることである。さらに、長鎖ＡＯＮは、短鎖ＡＯＮよりも分解し易い。ゆえに、（内因性）細胞経路およびデアミナーゼ活性を有する酵素、例えば天然に発現されるＡＤＡＲ酵素を依然として利用して、哺乳動物細胞において、全生物においてでさえ、より特異的におよびより効率的に内因性核酸を編集して疾患を緩和することができる、改善された、およびこの特定の場合ではより短い化合物が依然として必要とされている。

本発明は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化に使用するための、２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは「編集ＡＯＮ」（“Editing AON”）であり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」（“Helper AON”）であり、編集ＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチド（stretch of nucleotides）に相補的であり、標的アデノシンに直接対向する（directly opposite）編集ＡＯＮ中のヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで修飾されていないシチジンである「オーファンヌクレオチド」（“orphan nucleotide”）であり、ヘルパーＡＯＮは、編集ＡＯＮに相補的なひと続きのヌクレオチドとは別の（separate from）標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、編集ＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物に関する。好ましい態様では、ヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮは、標的ＲＮＡと連続的に二本鎖複合体を形成し、ヘルパーＡＯＮは、編集ＡＯＮに相補的な標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドの３’側に位置する標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、ヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮに相補的な配列間にヌクレオチドギャップは存在しない。好ましい態様では、このセットは、標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成した後、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員して、標的アデノシンのイノシンへの脱アミノ化をもたらすように構成されている。好ましい態様では、編集ＡＯＮは、１９、２０、または２１ヌクレオチド長であり、ヘルパーＡＯＮは、１７、１８、または１９ヌクレオチド長である。本明細書で概説するように、編集ＡＯＮが２１ヌクレオチド長であり、ヘルパーＡＯＮが１７ヌクレオチド長であり、連続したひと続きの３８ヌクレオチドとしての標的ＲＮＡ分子に対して共に配置され、ヘルパーＡＯＮと編集ＡＯＮとの間にギャップがない場合に、特に良好な結果が得られた。別の好ましい態様では、編集ＡＯＮにおけるオーファンヌクレオチドは、５’末端から６番目、７番目、または８番目のヌクレオチドである。

別の実施形態では、本発明は、細胞内の標的ＲＮＡ中の少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に、本発明による組成物に存在するヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮを含むＡＯＮのセットを供給するステップ、標的ＲＮＡへのＡＯＮのアニーリングを可能にして、二本鎖核酸分子を形成するステップ、上記細胞に内因的に存在するＡＤＡＲ酵素が、二本鎖核酸分子と複合体を形成し、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンをイノシンへと脱アミノ化することを可能にするステップ、および任意で、標的ＲＮＡ中の脱アミノ化したヌクレオチドの存在を同定するステップを含む方法に関する。

本発明はまた、標的ＲＮＡに存在する少なくとも１つの標的アデノシンを脱アミノ化するためのインビトロ、インビボ、またはエクスビボ方法であって、本発明による２つのＡＯＮのセットを含む組成物を供給するステップ、標的ＲＮＡへのＡＯＮのアニーリングを可能にして、二本鎖核酸分子を形成するステップ、ＡＤＡＲ酵素が、二本鎖核酸分子と複合体を形成し、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンをイノシンへと脱アミノ化することを可能にするステップ、および標的ＲＮＡ中の脱アミノ化したアデノシンの存在を同定するステップを含む方法に関する。

本発明はまた、標的ＲＮＡ中の標的ヌクレオチドの脱アミノ化に使用するための「編集ＡＯＮ」と称される一本鎖ＡＯＮであって、ＡＯＮは、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することが可能であり、編集ＡＯＮは、標的ヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドと相補的であり、標的アデノシンに直接対向する編集ＡＯＮ中のヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで修飾されていない「オーファンヌクレオチド」であり、編集ＡＯＮは、１６～２２ヌクレオチド、好ましくは１９、２０、または２１ヌクレオチド、より好ましくは２１ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、一本鎖ＡＯＮに関する。本発明は、好ましくは標的ヌクレオチドとしてのアデノシンの脱アミノ化のために構成された配列を含む１６～２２ヌクレオチド長の編集ＡＯＮを提供する。その構造が短いにも関わらず、本発明の編集ＡＯＮは、本明細書に開示のヘルパーＡＯＮの非存在下でさえ、脱アミノ化活性を有する酵素に係合することができ、標的ヌクレオチドは、脱アミノ化酵素によりイノシンへと脱アミノ化されるアデノシンである。好ましい態様では、本発明の編集ＡＯＮは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含み、オーファンヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を有さない。

図面の簡単な説明
本発明の１つまたは複数の実施形態は、ここで、添付の図面を参照しながら単なる例として記載する。

（Ａ）５’から３’の標的マウスアミロイド前駆体タンパク質（ｍＡＰＰ）ＲＮＡ配列（配列番号１）を示し、その下に２１個のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が示されている。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿３９、＿６２、および＿６７は、配列番号２の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３５Ａ、＿１３９Ａ、＿１４０Ａ、および＿１４１Ａは、配列番号３の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３５Ｂ、＿１３６Ｂ、＿１３９Ｂ、＿１４０Ｂ、および＿１４１Ｂは、配列番号４の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ａおよび＿１４５Ａは、配列番号５の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ｂおよび＿１４５Ｂは、配列番号６の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３６ＡおよびｍＡＰＰＥｘ１７＿１３７Ａは、配列番号７の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３７ＢおよびｍＡＰＰＥｘ１７＿１３８Ｂは、配列番号８の配列を有する。ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３８Ａは、配列番号９の配列を有する。ＡＯＮの各々の化学修飾は（Ｂ）に提供されている：アスタリスクは、２つのヌクレオシド間のホスホロチオエート（phosphonoacetate）（ＰＳ）結合を示し；下線がない小文字のヌクレオチドは２’－ＯＭｅで修飾されており；下線付きの小文字のヌクレオチドは２’－ＭＯＥで修飾されており；大文字のヌクレオチドはＤＮＡであり；太字で大文字のＣは、編集する必要のある標的配列中のアデノシンに直接対向するオーファンヌクレオチド（ＤＮＡ）を表す。 図１－１の説明と同じ。 ３８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－６２を単一のＡＯＮとしておよびＲＮＡ編集の陽性対照として使用することにより達成された、インビトロ生化学アッセイでの編集百分率を、ｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ならびにｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１７ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ａおよび編集ＡＯＮとしての２１ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ｂを含む分割ＡＯＮのセットで達成されたレベルと比較して示す。両セットが、適正で迅速な高レベルのＲＮＡ編集を提供することが可能だったことが明らかに示されており、１７／２１ｎｔのセット（ｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ａおよび－Ｂ）は、３８ｎｔの陽性対照ＡＯＮ（ｍＡＰＰＥｘ１７＿６２）と同様に機能し、１９／１９ｎｔのセット（ｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ａおよび－Ｂ）よりもわずかに効率的に機能した。 ３８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－６７を単一のＡＯＮとしておよびＲＮＡ編集の陽性対照として使用することにより達成された、インビトロ生化学アッセイでの編集百分率を、ｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４０Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４０Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ならびにｉｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１７ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１４５Ａおよび編集ＡＯＮとしての２１ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ｂを含む分割ＡＯＮのセットで達成されたレベルと比較して示す。３つのセットは全て、著しいＲＮＡ編集を提供することができ、ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａおよび－Ｂのセットは、２つの他のセットよりも優れていた。 ３８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿６２を単一のＡＯＮとしておよびＲＮＡ編集の陽性対照として使用することにより達成された、インビトロ生化学アッセイでの編集百分率を、ｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ｉｉ）単一の編集ＡＯＮとしてのｍＡＰＰＥｘ１７＿１３９Ｂ；ｉｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１７ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ａおよび編集ＡＯＮとしての２１ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ならびにｉｖ）単一の編集ＡＯＮとしてのｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ｂで達成されたレベルと比較して示す。両セットは効率的なＲＮＡ編集をもたらしたが、編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ｂを単独で使用した場合でも高レベルのＲＮＡ編集が得られた。対照的に、編集ＡＯＮとしてのｍＡＰＰＥｘ１７＿１３９Ｂの使用は、単独で使用した場合、高レベルの編集を示さなかった。 ３８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿６７を単一のＡＯＮとしておよびＲＮＡ編集の陽性対照として使用することにより達成された、インビトロ生化学アッセイでの編集百分率を、ｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ｉｉ）単一の編集ＡＯＮとしてのｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ｂ；ｉｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１７ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａおよび編集ＡＯＮとしての２１ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１４５Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ならびにｉｖ）単一の編集ＡＯＮとしてのｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ｂで達成されたレベルと比較して示す。図３に示すように、ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａおよび－Ｂのセットは、中程度のレベルのＲＮＡ編集を示し、編集ＡＯＮとしての単一のｍＡＰＰＥｘ１７）１４１Ｂの使用は、高レベルの編集をもたらさなかった。ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａおよび－Ｂのセットで達成されたレベルは、図３に示したものと同等であり、編集ＡＯＮとしての単一のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ｂの使用は、適正なレベルのＲＮＡ編集を示した。 編集ＡＯＮおよびヘルパーＡＯＮの種々のセットのトランスフェクション後、ならびにヘルパーＡＯＮを細胞に共トランスフェクションしなかった別々の編集ＡＯＮのトランスフェクション後に得られた編集百分率を示す。示されている通り、ＡＯＮのセットおよび単一の編集ＡＯＮは、細胞に内因的に存在するＡＤＡＲを動員して、標的アデノシンの脱アミノ化をもたらすことができる。陰性対照は、未トランスフェクトサンプル（ＮＴ）、モックトランスフェクトサンプル、および対照スクランブルＡＯＮによるトランスフェクションだった。２つの陽性対照ＡＯＮ、ｍＡＰＰＥｘ１７＿６２および＿６７（各々、３８ｎｔ長）は約１３％～約２８％編集に到達することができたが、セットならびに単一のＡＯＮもＲＮＡ編集をもたらすことができ、セットｍＡＰＰＥｘ１７＿１４０Ａ／Ｂ、ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａ／Ｂ、ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａ／Ｂ、および単一の編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ｂが最も良好に機能した。 ３８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿３９を単一のＡＯＮとしておよびＲＮＡ編集の陽性対照として使用することにより達成された、インビトロ生化学アッセイでの編集百分率を、ｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３５Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３５Ｂを含む分割ＡＯＮのセット；ｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３６Ａおよび編集ＡＯＮとしての１９ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３６Ｂを含む分割および１ｎｔギャップ付きＡＯＮのセット；ｉｉｉ）ヘルパーＡＯＮとしての１８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３７Ａおよび編集ＡＯＮとしての１８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３７Ｂを含む分割および２ｎｔギャップ付きＡＯＮのセット；ならびにヘルパーＡＯＮとしての１７ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３８Ａおよび編集ＡＯＮとしての１８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７－１３８Ｂを含む分割および３ｎｔギャップ付きＡＯＮのセットで達成されたレベルと比較して示す。分割ＡＯＮは、相補性の連続配列を共に形成しない（換言すると、標的ＲＮＡに結合した際に「ギャップ」が存在する）ものの依然としてＲＮＡ編集を達成することができるが、分割ＡＯＮが互いに連続している２つの配列を有しギャップが形成されない場合よりも効率がより低いようである。ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３５Ａおよび－Ｂのセットの性能ならびに単一の３８ｎｔ長のｍＡＰＰＥｘ１７＿３９ ＡＯＮを参照されたい。

詳細な説明
全ての前述のＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ、本明細書および他所では「編集オリゴヌクレオチド」とも称されることが多く、「ＥＯＮ」と略されることが多い）は、標的ＲＮＡ配列に対して完全に相補的であるかまたは部分的に相補的であるかのいずれかである配列を有する、単一分子中の単一のひと続きのヌクレオチドからなる。長さが比較的短いＡＯＮを有することが望ましいが、これまでのところ、最も最適で試験済みのＡＯＮは、およそ３５～６０ヌクレオチドの長さを有する。これは、一般に、エクソンスキッピング、スプライス調節、または転写／翻訳阻害に使用される典型的なＡＯＮよりもはるかに長い。そのようなＡＯＮは、一般に、１６～２４ヌクレオチドの最適な長さを有する。ＡＯＮに基づく療法の一般的な制限要因は、オリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれる能力（それ自体で送達された場合、または送達ビヒクルを適用しない「ネイキッド」の場合）、その体内分布、およびヌクレアーゼ媒介性分解に対するその耐性である。当業者は、様々な化学修飾が、そのような制限の克服を支援することができることを承知しており、当該技術分野で詳細に記載されている。そのような現在一般的に使用されている化学修飾の例は、糖の２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）および２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾、ならびにヌクレオシド間のホスホロチオエート化（phosphorothioated）（ＰＳ）結合の使用である。ＰＣＴ／欧州特許２０２０／０５９３６９号明細書（未刊）には、ＡＯＮのオーファンヌクレオチドを取り囲むある特定の位置での、メチルホスホネート（methylphosphonate）（ＭＰ）結合修飾の使用が記載されている。また、ＡＯＮにおいて、全てではないが、いくつかの位置でホスホノアセテート（phosphonoacetate）結合修飾および／またはアンロックド核酸（unlocked nucleic acid）（ＵＮＡ）リボース修飾が、ヌクレオチド脱アミノ化活性および続く脱アミノ化を有する酵素の効果的な関与に適合するようであったことが見出された（ＰＣＴ／欧州特許第２０２０／０５３２８３号明細書、未刊）。ホスホノアセテート（phosphonoacetate）およびＵＮＡ修飾の特性が知られていた一方、ヌクレオチド脱アミノ化活性および脱アミノ化反応を有する酵素の関与に対するその適合性は知られていなかった。ＵＮＡ修飾では、リボース２’および３’炭素原子間で、炭素－炭素結合が存在しない。したがって、ＵＮＡリボース修飾は、オリゴヌクレオチドでの局所的な柔軟性を高める。ＵＮＡは、分解に対する改善した耐性によって改善した薬物動態特性などの効果をもたらすことができる。ＵＮＡはまた、毒性を低減し、標的外効果を低減するのに関係し得る。ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素との結合の妨害が著しいので、ＵＮＡリボース修飾は、好ましくは、オーファンヌクレオチドで回避すべきである。ＵＮＡリボース修飾は、ＡＯＮでのリボース修飾のみであり得るが、ＵＮＡ修飾は、ＵＮＡ修飾と異なる位置またはＵＮＡ修飾と同じ位置のいずれかで、リボース２’基への修飾に加えて存在することができる。ＡＯＮのリボース２’基は、２’－Ｈ（つまり、ＤＮＡ）、２’－ＯＨ（つまり、ＲＮＡ）、２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、２’－Ｆ、または２’－４’－結合（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ））、または他の２’置換から独立して選択することができる。２’－４’結合は、メチレンリンカーまたは拘束エチルリンカー（ｃＥｔ）などの当該技術分野で知られているリンカーから選択することができる。それにもかかわらず、これまで使用されてきたＥＯＮは比較的長いため、体内分布、細胞進入、およびインビボでのＲＮＡ編集の効率に懸念が残り、制限を受ける可能性がある。本発明の発明者らは、今ここに、本明細書で概説するように、こうした問題に対する解決策を見出した。本発明者らは、ＡＯＮのセット（好ましくは、セット中には２つのオリゴヌクレオチドのみを有する）の使用を企図し、その後、単一の短鎖ＡＯＮのみを使用し、それでも効率的なＲＮＡ編集を達成した。

本発明は、標的ＲＮＡ中の標的ヌクレオチド（好ましくは、アデノシン）の脱アミノ化に使用するための、２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは「編集ＡＯＮ」であり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり、編集ＡＯＮは、標的アデノシンを含む標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、標的ヌクレオチドに直接対向する編集ＡＯＮ中のヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで修飾されていない「オーファンヌクレオチド」であり（標的ヌクレオチドがアデノシンである場合、オーファンヌクレオチドは好ましくはシチジンである）、ヘルパーＡＯＮは、編集ＡＯＮに相補的なひと続きのヌクレオチドとは別の標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、編集ＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物に関する。好ましい態様では、ヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮは、標的ＲＮＡと連続的に二本鎖複合体を形成し、ヘルパーＡＯＮは、編集ＡＯＮに相補的な、標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドの３’側に位置する、標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、ヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮに相補的な配列間にヌクレオチドギャップは存在しない。これは、ＡＯＮが、標的ＲＮＡ中の同じ配列またはその一部に相補的になるようには重複しないことを意味する。本明細書に示す通り、ヘルパーＡＯＮと編集ＡＯＮとの間に１、２、または３ヌクレオチドのギャップが存在してもＲＮＡ編集を達成することができ、最も良好な結果は、ヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮが、標的ＲＮＡ分子にギャップなく連続的にアラインした場合に得られた。好ましくは、ヘルパーＡＯＮは、標的ＲＮＡに対して１００％相補的である。好ましくは、編集ＡＯＮは、オーファンヌクレオチドと標的ヌクレオチドとの間にミスマッチがある場合を除いて、標的ＲＮＡと完全に相補的である。好ましい態様では、このセットは、標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成した後、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員して、標的ヌクレオチドの脱アミノ化をもたらすことができる。

編集ＡＯＮのヌクレオチド番号付けは、オーファンヌクレオチドが０であり、オーファンヌクレオチドの５’側のヌクレオチドが＋１となる。数え方は、５’末端に向かって正に増分し、３’末端に向かって負（－）に増分し、オーファンヌクレオチドの３’側の最初のヌクレオチドは－１である。

編集ＡＯＮのヌクレオチド間結合の番号付けは、結合番号０がオーファンヌクレオチドからの５’結合となるようにし、オリゴヌクレオチドでの結合位置は、５’末端に向かって正（＋）に増分し、３’末端に向かって負（－）に増分する。

好ましくは、編集ＡＯＮは、１つまたは複数のホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）結合を含む。好ましくは、ＰＳ結合は、編集ＡＯＮの各末端の最も末端側の４、５、６、７、または８つのヌクレオチドを接続する。より好ましくは、ＰＳ結合は、例えば編集ＡＯＮが２１ヌクレオチド長である場合、編集ＡＯＮの結合位置＋６、＋５、＋４、＋３、＋２、および＋１に存在する。また、好ましくは、ＰＳ結合は、例えば編集ＡＯＮが２１ヌクレオチド長である場合、編集ＡＯＮの結合位置－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、および－１３に存在する。

好ましくは、編集ＡＯＮは、２’－ＯＭｅ修飾を含む糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。本発明による２１ｎｔ長のＡＯＮでは、ＡＯＮの５’末端の２’－ＯＭｅ修飾の好ましい位置は、ヌクレオチド位置＋２、＋３、＋３、＋４、＋５、＋６、および／または＋７（好ましくは＋１位の５’側に位置する全てのヌクレオチド）である。本発明による２１ｎｔ長のＡＯＮでは、ＡＯＮの３’末端の２’－ＯＭｅ修飾の好ましい位置は、ヌクレオチド位置－２、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、および／または－１３である。－４位の３’側に位置する全てのヌクレオチドの糖部位が２’－ＯＭｅ基で修飾されていることが好ましい。

好ましくは、編集ＡＯＮは、２’－ＭＯＥ修飾を含む糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。２’－ＭＯＥ修飾を有するヌクレオチドの好ましい位置は、編集ＡＯＮの位置＋１および／または－４である。

好ましくは、オーファンヌクレオチドは、糖部分に２’－Ｈを有し、したがってＤＮＡヌクレオチドと称される。オーファンヌクレオチドの３’側および／または５’側のヌクレオチドもＤＮＡであり、より好ましくは３’側の（位置－１）のヌクレオチドはＤＮＡである。

好ましくは、編集ＡＯＮは、以下の構造：

による少なくとも１つのメチルホスホネート（methylphosphonate）（ＭＰ）ヌクレオシド間結合を含む。

本発明による編集ＡＯＮにおけるＭＰ結合の好ましい位置は結合位置－１であり、それにより位置－１のヌクレオシドは位置－２のヌクレオシドに接続されるが、ＭＰ結合の他の位置が明示的に排除されるわけではない。

好ましくは、編集ＡＯＮは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を含む糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。２’－Ｆ修飾を有するヌクレオチドの好ましい位置は、編集ＡＯＮの位置－３である。

好ましくは、編集ＡＯＮは、少なくとも１つのホスホノアセテート（phosphonoacetate）ヌクレオシド間結合を含む。

好ましくは、本発明による編集ＡＯＮは、アンロックド核酸（ＵＮＡ）リボース修飾を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。

上記で概説した好ましい修飾は、ヘルパーＡＯＮにも導入することができるが、そのＡＯＮは、オーファンヌクレオチドが２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥなどの２’修飾を有し得ず、適正に機能するためには好ましくはＤＮＡであるべきであるという点で、編集ＡＯＮで見られる不安定性の問題を被らない。ヘルパーＡＯＮは、好ましくは、ＡＯＮの各末端に４つのＰＳ結合修飾を含み、それにより各末端の５つの末端ヌクレオシドが接続されている。加えて、ヘルパーＡＯＮは、好ましくは、２’－ＯＭｅおよび／または２’－ＭＯＥ修飾で完全に修飾されており、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥ修飾を有するヌクレオチドの数は異なっていてもよい。一般に、ＤＮＡは、ヘルパーＡＯＮには存在しないが、明示的に除外されているわけではない。ヘルパーＡＯＮは、標的ＲＮＡに対して１００％相補的であり得るが、デアミナーゼ酵素を動員する能力を追加することができる１つまたは複数のミスマッチ、揺らぎ、または膨らみも含み得る。

好ましくは、編集ＡＯＮは１９、２０、または２１ヌクレオチド長であり、オーファンヌクレオチドは、５’末端から６番目、７番目、または８番目のヌクレオチドであり、ヘルパーＡＯＮは、１７、１８、または１９ヌクレオチド長である。本発明は、薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明に従って使用するための組成物にさらに関する。

本発明は、標的ＲＮＡ中の標的ヌクレオチドの脱アミノ化に使用するための、「編集ＡＯＮ」と称される一本鎖ＡＯＮであって、ＡＯＮは、細胞内の標的ＲＮＡと二本鎖複合体を形成することが可能であり、編集ＡＯＮは、標的ヌクレオチドを含む標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドと相補的であり、標的アデノシンに直接対向する編集ＡＯＮ中のヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで修飾されていない「オーファンヌクレオチド」であり、編集ＡＯＮは、１６～２２ヌクレオチド、好ましくは１９、２０、または２１ヌクレオチド、より好ましくは２１ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、一本鎖ＡＯＮに関する。本発明は、好ましくは標的ヌクレオチドとしてのアデノシンの脱アミノ化のために構成された配列を含む１６～２２ヌクレオチド長の編集ＡＯＮを提供する。その構造が短いにも関わらず、本発明の編集ＡＯＮは、本明細書に開示のヘルパーＡＯＮの非存在下でさえ、脱アミノ化活性を有する酵素に係合することができ、好ましくは、標的ヌクレオチドは、脱アミノ化酵素によりイノシンへと脱アミノ化されるアデノシンである。好ましい態様では、本発明の編集ＡＯＮは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含み、オーファンヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥリボース修飾を有さない。

本発明による組成物または本発明による単一の編集ＡＯＮは、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症（albinism）、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ、シャルコー－マリー－ツース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、（栄養障害型）表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス（hematochromatosis）、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群（Inherited polyagglutination syndrome）、レーバー先天性黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、（常染色体優性）色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群（例えば、アッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から選択される遺伝的障害の処置または予防に使用される。

本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ中の少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に本発明によるヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮを含むＡＯＮのセットまたは本発明の単一の編集ＡＯＮを供給するステップ、標的ＲＮＡへのＡＯＮのアニーリングを可能にして、二本鎖核酸分子を形成するステップ、上記細胞に内因的に存在するＡＤＡＲ酵素が、二本鎖核酸分子と複合体を形成し、標的ＲＮＡ中の標的ヌクレオチド（好ましくは、アデノシン）を脱アミノ化することを可能にするステップ、および任意で、標的ＲＮＡ中の脱アミノ化したヌクレオチドの存在を同定するステップを含む方法にも関する。本発明の方法における同定ステップは、標的ＲＮＡの領域をシークエンシングすることであって、領域は標的ヌクレオチドの位置を含む、シークエンシングすること、標的ヌクレオチドが、ＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドンのアデノシンであり、脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合、プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、使用すること、を含み得る。

本発明はまた、標的ＲＮＡ中に存在する少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のためのインビボ、エクスビボ、またはインビトロの方法であって、本発明による２つのＡＯＮのセットまたは本発明による単一の編集ＡＯＮを供給するステップ、標的ＲＮＡへのＡＯＮのアニーリングを可能にして、二本鎖核酸分子を形成するステップ、ＡＤＡＲ酵素が、二本鎖核酸分子と複合体を形成し、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンをイノシンへと脱アミノ化することを可能にするステップ、および標的ＲＮＡ中の脱アミノ化したアデノシンの存在を同定するステップを含む方法にも関する。

本発明の全ての態様では、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する酵素は、好ましくはＡＤＡＲ酵素、より好ましくはＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である。高度に好ましい態様では、編集ＡＯＮは、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ編集一本鎖ＡＯＮであり、標的ヌクレオチドは、好ましくは、標的ＲＮＡ中のアデノシンであり、アデノシンはイノシンに脱アミノ化され、イノシンは翻訳機構によりグアノシンとして読み込まれる。さらに好ましい実施形態では、アデノシンは、ＵＧＡもしくはＵＡＧ終止コドンに位置し、ＵＧＧコドンに編集されるか、または２つの標的ヌクレオチドは、ＵＡＡ終止コドンにおける２つのアデノシンであり、コドンは、両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集され、オリゴヌクレオチドにおける２つのヌクレオチドは、標的核酸とミスマッチである。

本発明によるヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮは、ＰＳリンカー修飾以外の、またはＰＳリンカー修飾に加えて、ヌクレオシド間結合修飾を含むことができる。一実施形態では、このような他の１つのヌクレオシド間結合は、ホスホノアセテート（phosphonoacetate）またはメチルホスホネート（methylphosphonate）修飾結合であり得る。別の実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルであり得、ホスホジエステルのＯＨ基は、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルチオ、アシル、－ＮＲ１Ｒ１、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、－Ｓ－Ｚ＋、－Ｓｅ－Ｚ＋、もしくは－ＢＨ３－Ｚ＋で置換されており、Ｒ１は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアリールであり、Ｚ＋は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、もしくはヘテロ環イミニウムイオンであり、そのいずれかも一級、二級、三級、もしくは四級であるか、または、Ｚは、一価の金属イオンである。ＰＳ結合修飾の使用が好ましい。

本発明の編集ＡＯＮでは、オーファンヌクレオチドは、一般に、２’－Ｈ基を有するデオキシリボースを含み、好ましくは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥ修飾を有するリボースを含まない。さらに、本発明の編集ＡＯＮは、一般に、ＡＯＮ内の他の位置に２’－ＭＯＥ修飾をさらに含む。ヘルパーＡＯＮについても同じことが真である。本発明のＡＯＮは、好ましくは、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載の動員部分を含まない。本発明のＡＯＮは、分子内ステム－ループ構造を形成することができる部分を含まない。ＡＯＮは、５’末端Ｏ６－ベンジルグアニン修飾を含まない。ＡＯＮは、５’末端アミノ修飾を含まない。ＡＯＮは、ＳＮＡＰタグドメインに共有結合で結合されていない。本発明によるＡＯＮにおけるヌクレオチド間結合の番号付けは、結合番号０がオーファンヌクレオチドからの５’結合であり、それ自体が「０」ヌクレオチドとなるようにする。

本発明はまた、（プレ）ｍＲＮＡに存在する早期停止終止コドン（ＰＴＣ）を標的化して、終止コドンに存在するアデノシンをイノシン（Ｇとして読み込まれる）に改変することができ、それによりひいては翻訳中のリードスルーおよび全長機能性タンパク質がもたらされる、ＡＯＮに関する。本発明の教示は、本明細書に概説した通り、ＡＯＮで標的化し得、ＲＮＡ編集によって処置することができる全ての遺伝的疾患に適用可能である。一例は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異に起因するアッシャー症候群ＩＩ型である。

一態様では、本発明は、標的ＲＮＡ分子に存在する疾患関連スプライス突然変異での標的アデノシンの脱アミノ化に使用するための、細胞内の標的ＲＮＡ分子と二本鎖複合体を形成することができるＡＯＮ（または２つのＡＯＮのセット）であって、編集ＡＯＮのオーファンヌクレオチドは２’－ＯＭｅ修飾を有さず、オーファンヌクレオチドからのヌクレオチド直接的５’および／または３’（オーファンヌクレオチドと共に、ヌクレオチドがセントラルトリプレットを形成する）が、ＲＮＡ編集により安定し、および／または、より効果的にＡＯＮをもたらす、糖修飾および／または塩基修飾を有し、好ましくは、ＡＯＮにある少なくとも１つの結合がＰＳ修飾を含むように改変されている、ＡＯＮに関する。好ましい一態様では、２つのヌクレオシドを接続する少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ＭＰ修飾を有する。編集ＡＯＮ中の２つのヌクレオチドがＤＮＡである場合、他の全てはＲＮＡであり得、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで修飾され得る。一態様では、本発明によるＡＯＮまたはＡＯＮの各々（２つのセットの場合）は、相補的な標的ＲＮＡ領域との２、３、または４つのミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみを含む。好ましくは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドは、シチジン、デオキシシチジン、ウリジン、デオキシウリジンであるか、または脱塩基である。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３７５８０号パンフレット（未刊）には、オーファンヌクレオチド位置にシチジンアナログを用いて、ＡＯＮのＲＮＡ編集効率をより高くすることが記載されている。その理由は、そのようなシチジンアナログがＡＤＡＲ酵素とより強固に相互作用するためである。オーファンヌクレオチド位置にシチジンアナログ（シュードイソシチジン（ｐｉＣ）またはＢｅｎｎｅｒの塩基Ｚ（ｄＺ）など）を組み込むことも、本発明の好ましい態様である。標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、シチジンまたはデオキシシチジンである場合、ＡＯＮは、標的ＲＮＡ分子との少なくとも１つのミスマッチを含む。標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、ウリジンまたはデオキシウリジンである場合、ＡＯＮは、１００％相補的であり得、標的ＲＮＡに関連して、いかなるミスマッチ、揺らぎ、または膨らみも有さない。しかし、一態様では、１つまたは複数のさらなるミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみは、標的アデノシンに対向するヌクレオチドが、シチジン、デオキシシチジン、シュードイソシチジン、Ｂｅｎｎｅｒの塩基Ｚ、ウリジン、またはデオキシウリジンであるかどうかに関わりなく、ＡＯＮと標的ＲＮＡとの間に存在し得る。別の好ましい実施形態では、オーファンヌクレオチドからのヌクレオチド直接的５’および／もしくは３’は、２’－ＯＨ基を有するリボース、または２’－Ｈ基を有するデオキシリボース、またはこれら２つの混合物を含む。したがって、中央にオーファンヌクレオチドを有するセントラルトリプレットは、ＤＮＡ－ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡ、またはＲＮＡ－ＲＮＡ－ＲＮＡからなり、オーファンヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ修飾を有さず（ＲＮＡの場合）、周囲のヌクレオチドのいずれかまたは両方も２’－ＯＭｅ修飾を有さない。その場合、ＡＯＮの他の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル基、好ましくは２’－ＯＭｅ基、もしくは２’－ＭＯＥ基、または本明細書に開示される任意の修飾を有することが好ましい。標的配列との本発明のＡＯＮの揺らぎ、ミスマッチ、および／または膨らみは、標的ＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを防げないが、標的アデノシンの位置で細胞に存在するＡＤＡＲによりＲＮＡ編集の効率性に加える。当業者は、生理学的条件下でのハイブリダイゼーションが依然として起こるかどうかを決定することができる。本発明のＡＯＮは、細胞に存在する哺乳動物のＡＤＡＲ酵素を動員（係合）することができ、ＡＤＡＲ酵素は、野生型酵素で発見されたその天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む。本発明によるＡＯＮは、内因性細胞経路および天然で利用可能なＡＤＡＲ酵素またはＡＤＡＲ活性を有する酵素（まだ同定されていないＡＤＡＲ様酵素であり得る）を利用して、標的ＲＮＡ配列の標的アデノシンを特異的に編集することができる。本明細書に開示する通り、本発明の一本鎖ＡＯＮは、ＲＮＡ編集の分野においてこれまで示されているものよりも著しく短いにも関わらず、標的ＲＮＡ分子にある、アデノシンなどの特異的な標的を脱アミノ化することが可能である。理想的には、１つのヌクレオチドのみが脱アミノ化される。あるいは、１、２、または３つのさらなるヌクレオチドが脱アミノ化されるが、好ましくは１つのみである。本発明のＡＯＮは、様々なヌクレオチドデアミナーゼ酵素、例えばＡＤＡＲ用に設計し、それらと共に使用することができる。ＡＤＡＲは、好ましくは天然で発現されるが、人工的に（例えば、組換え発現またはタンパク質合成によって）産生することもできる。ＡＤＡＲは、野生型であり得るか、または修飾することができる。本発明のＡＯＮの特徴と合わせて、修飾された組換えＡＤＡＲ発現を必要としない。本発明のＡＯＮは、ＡＯＮに結合するコンジュゲートされた物質に関して特に限定されない。しかし、ＡＯＮに結合するコンジュゲートされた物質を必要としない。そのため、ＡＯＮに結合するコンジュゲートされた物質が欠乏するＡＯＮは、好ましい実施形態を形成する。標的ＲＮＡ配列に相補的ではない長い動員部分の存在を必要としない。その結果、標的ＲＮＡ配列に相補的ではない長い動員部分が欠乏するＡＯＮは、好ましい実施形態を形成する。本発明のＡＯＮは、ＲＮＡ編集のために当該技術分野で使用されるものよりも小型であるが、本明細書に示されるように、依然として内因性ＡＤＡＲを動員し、部位特異的ＲＮＡ編集をもたらすことができる。本発明の編集ＡＯＮは（ヘルパーＡＯＮの支援を受けてまたは受けずに）、細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト細胞に好ましくは内因的に存在する、脱アミノ化活性を有する物質、好ましくは酵素と係合して、標的核酸分子中の標的ヌクレオチドの脱アミノ化をもたらすことが可能である。好ましい標的核酸分子は、ＲＮＡ分子である。二本鎖ＡＯＮ／標的核酸分子複合体は、ワトソン－クリック型塩基対によって相互作用する。本発明の好ましい一態様では、ＡＯＮは、結合位置０、－２、－４、および／または－６に１つまたは複数のＭＰ結合を含む。特に好ましい実施形態では、ＡＯＮは、位置０および／または－２にＭＰ結合を含む。好ましい一態様では、ＡＯＮは、少なくとも１つのＰＳ、少なくとも１つのホスホノアセテート（phosphonoacetate）ヌクレオチド間結合、および／またはアンロックド核酸（ＵＮＡ）リボース修飾を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。より好ましい態様では、ＰＳ結合は、各末端の最大３、４、または５つのヌクレオシドを接続する、ＡＯＮの両末端に存在する。本明細書で概説するように、以前のＲＮＡ編集用ＡＯＮは３５～４０ｎｔ長の範囲であったが、本発明は、１９、２０、および２１ヌクレオチドの範囲である単一のＡＯＮも、ＡＤＡＲを動員しＲＮＡ編集をもたらすことが可能であることを示す。

別の好ましい態様では、本発明のＡＯＮは、リボースの２’位での置換を含む１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含み、置換は、－ＯＨ；－Ｆ；置換または未置換、直鎖または分岐鎖の低級（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、またはアラルキル、１つまたは複数のヘテロ原子により中断され得る；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；－Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アリル；－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；－メトキシ；－アミノプロポキシ；－メトキシエトキシ（２’－ＭＯＥ）；－ジメチルアミノオキシエトキシ；および－ジメチルアミノエトキシエトキシからなる群から選択される。本発明による編集ＡＯＮは、好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長であり、好ましくは２１ヌクレオチド長である。本発明によるヘルパーＡＯＮは、好ましくは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長であり、好ましくは１７ヌクレオチド長である。

別の実施形態では、本発明は、本発明によるＡＯＮ（または本発明による２つのＡＯＮのセット）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体は、当業者に知られている。

別の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ、シャルコー－マリー－ツース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、（栄養障害型）表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、（常染色体優性）色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群（例えば、アッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）、Ｘ連結型免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびにがんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の処置のための医薬の製造における、本発明によるＡＯＮまたは本発明による２つのＡＯＮ（編集ＡＯＮおよびヘルパーＡＯＮ）のセットの使用に関する。

また別の実施形態では、本発明は、細胞内の標的核酸分子、好ましくはＲＮＡ標的分子に存在する少なくとも１つの標的ヌクレオチド、好ましくはアデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に、本発明による編集ＡＯＮ、本発明による２つのＡＯＮ（編集ＡＯＮ＋ヘルパーＡＯＮ）のセット、または本発明による医薬組成物を供給するステップ、標的核酸分子へのＡＯＮのアニーリングを可能にするステップ、ヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する哺乳動物酵素が、標的核酸分子中の標的ヌクレオチドを脱アミノ化することを可能にするステップ、および任意で、標的核酸分子中の脱アミノ化したヌクレオチドの存在を同定するステップを含む方法に関する。本発明によるＡＯＮの使用によって係合されるヌクレオチドデアミナーゼ活性を有する哺乳動物酵素は、好ましくは、アデノシンデアミナーゼ酵素であり、標的核酸分子において標的ヌクレオチドを改変することが可能であり、次いで、標的ヌクレオチドは、好ましくは、イノシンに脱アミノ化されたアデノシンである。脱アミノ化されたヌクレオチドの存在を同定する任意のステップは、好ましくは、標的核酸分子の領域をシークエンシングすることであって、領域が、脱アミノ化された標的ヌクレオチドを含む、シークエンシングすること、標的ヌクレオチドが、ＵＧＡもしくはＵＡＧ終止コドンに位置するアデノシンであり、脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、２つの標的アデノシンが、ＵＡＡ終止コドンに位置し、両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、標的ＲＮＡ分子がプレｍＲＮＡである場合、プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の標的核酸分子が、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、使用することにより行われる。

別の実施形態では、本発明は、対象を、好ましくはそれを必要とする対象を処置する方法であって、対象は、アデノシン（例えばＰＴＣ）の出現に関与する突然変異に起因する遺伝的障害に罹患しており、そのアデノシンのイノシンへの脱アミノ化は、疾患を緩和、予防、または改善することになり、この方法は、本発明による編集ＡＯＮまたは本発明による２つのＡＯＮ（編集ＡＯＮ＋ヘルパーＡＯＮ）のセットまたは本発明による医薬組成物を対象に投与するステップ、対象の細胞において、ＡＯＮとその特異的で相補的な標的核酸との二本鎖核酸複合体の形成を可能にするステップ、ｈＡＤＡＲ１またはｈＡＤＡＲ２などの、脱アミノ化活性を有する内因的に存在する酵素の係合を可能にするステップ、および酵素が標的核酸分子の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップを含み、それにより遺伝的疾患を緩和、予防、または改善する、方法に関する。本方法に従って処置され得る遺伝的疾患は、好ましくは、限定されないが、本明細書に列挙された遺伝的疾患である（上記参照）。

定義
用語「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」、および「ヒポキサンチン」（イノシンでの核酸塩基）とは、本明細書で使用される場合、それ自体で核酸塩基を指す。用語「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」、および「イノシン」とは、（デオキシ）リボシル糖に結合する核酸塩基を指す。用語「ヌクレオシド」とは、リン酸基を伴わない、（デオキシ）リボシル糖に結合する核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドおよび１つまたは複数のリン酸基からなる。ゆえに、用語「ヌクレオチド」とは、それぞれの核酸塩基－（デオキシ）リボシル－ホスホリンカー（phospholinker）、ならびにリボース部分またはホスホ基の任意の化学修飾を指す。ゆえに、この用語は、ロックドリボシル部分（メチレン基または任意の他の基を含む２’－４’架橋を含む）を含むヌクレオチド、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、ホスホジエステル、ホスホノアセテート（phosphonoacetate）、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）、ホスホロ（ジ）チオエート（phosphoro(di)thioate）、メチル（メチレン）ホスホネート（methyl(ene)phosphonate）（ＭＰ）、およびホスホロアミデート（phosphoramidate）リンカーなどを含むリンカーを含むヌクレオチドを含む。時に、用語、アデノシンおよびアデニン、グアノシンおよびグアニン、シチジンおよびシトシン、ウラシルおよびウリジン、チミンおよびチミジン／ウリジン、イノシンおよびヒポキサンチンは、互換的に使用して、一方で対応する核酸塩基、および、他方でヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す。時に、用語、核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドは、文脈が明らかに異なる必要がない限り、例えば、ヌクレオシドが近接ヌクレオシドに結合され、これらのヌクレオシド間の結合が修飾される場合、互換的に使用される。この場合、ヌクレオシドは、修飾されたリンカーであるか、またはヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであるとみなすことができる。上述の通り、ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよび１つまたは複数のリン酸基である。用語「リボヌクレオシド」および「デオキシリボヌクレオシド」、または「リボース」および「デオキシリボース」は、当該技術分野で使用される通りである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ＥＯＮ」、または「ＡＯＮ」を参照する場合はいつも、文脈が別途指示しない限り、オリゴヌクレオチドおよびデオキシオリゴヌクレオチドの両方を意味する。「オリゴヌクレオチド」を参照する場合はいつも、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはＩを含み得る。「デオキシオリゴヌクレオチド」を参照する場合はいつも、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＩを含み得る。

好ましい態様では、本発明のＡＯＮは、化学修飾を含み得るオリゴヌクレオチドであり、ある種の特定位置にデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）を含み得る。オリゴヌクレオチド、オリゴ、ＯＮ、オリゴヌクレオチド組成物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＯＮ、（ＲＮＡ）編集オリゴヌクレオチド、ＥＯＮ、およびＲＮＡ（アンチセンス）オリゴヌクレオチドなどの用語は、本明細書で、互換的に使用することができる。シトシンなどのオリゴヌクレオチド構築物中のヌクレオチドを参照する場合はいつも、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、およびβ－Ｄ－グルコシル－５－ヒドロキシ－メチルシトシンを含み、アデニンを参照する場合はいつも、Ｎ６－メチルアデニン、および７－メチルアデニンを含み、ウラシルを参照する場合はいつも、ジヒドロウラシル、４－チオウラシル、および５－ヒドロキシメチルウラシルを含み、グアニンを参照する場合はいつも、１－メチルグアニンを含む。ヌクレオシドまたはヌクレオチドを参照する場合はいつも、２’－デソキシ、２’－ヒドロキシなどのリボフラノース誘導体、および２’－Ｏ－メチルなどの２’－Ｏ－置換バリアント、ならびに、２’－４’架橋バリアントを含む他の修飾を含む。オリゴヌクレオチドを参照する場合はいつも、２つのモノヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結合、ならびにその修飾であり得、ホスホノアセテート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ＰＳ、ホスホロ（ジ）チオエート（phosphoro(di)thioate）、ＭＰ、ホスホロアミデート（phosphor-amidate）のリンカーなどを含む。

用語「含む（comprising）」とは、「含む（including）」、ならびに「なる（consisting）」を包含し、例えば、「Ｘを含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、または、追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含み得る。数値Ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、Ｘ±１０％を意味する。単語「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、「Ｙを実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。関連して、単語「実質的に」とは、本発明の定義から省略され得る。

用語「相補的」とは、本明細書で使用される場合、ＡＯＮが、生理学的条件下、標的配列にハイブリダイズするという事実を指す。この用語は、ＡＯＮの各ヌクレオチドが、標的配列の対向するそのヌクレオチドと完璧な対形成を有することは意味していない。換言すると、ＡＯＮが、標的配列に相補的であり得ると同時に、生理学的条件下、細胞ＲＮＡ編集酵素が標的アデノシンを編集することができるように、ＡＯＮが標的配列に依然としてハイブリダイズしながら、ＡＯＮと標的配列との間にミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみが存在し得る。したがって、用語「実質的に相補的な」とは、ミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみの存在に関わらず、ＡＯＮが、生理学的条件下、標的ＲＮＡにハイブリダイズするように、ＡＯＮと標的配列との間に、十分にマッチするヌクレオチドを有することも意味する。本明細書に示す通り、ＡＯＮは、相補的であり得るが、ＡＯＮが、生理学的条件下でその標的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列との、１つまたは複数のミスマッチ、揺らぎ、および／または膨らみも含み得る。

核酸配列に関する用語「下流」とは、３’方向の配列に沿ってさらに遠いことを意味し、用語「上流」とは、逆を意味する。ゆえに、ポリペプチドをコードする任意の配列において、開始コドンは、センス鎖の終止コドンの上流であるが、アンチセンス鎖の終止コドンの下流である。

「ハイブリダイゼーション」に対する参照は、典型的には、特異的なハイブリダイゼーションを指し、非特異的なハイブリダイゼーションを排除する。特異的なハイブリダイゼーションは、選ばれた実験条件下、当該技術分野に周知の技術を使用して行って、プローブと標的との間の安定した相互作用の多くが、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性のプローブおよび標的である状態にあることを確保することができる。用語「ミスマッチ」とは、ワトソン－クリック型塩基対の規則による完璧な塩基対を形成しない二本鎖ＲＮＡ複合体における、対向するヌクレオチドを指すために、本明細書で使用される。ミスマッチしたヌクレオチドは、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ対である。いくつかの実施形態では、本発明のＡＯＮは、４個未満のミスマッチ、例えば、０、１、または２個のミスマッチを含む。揺らぎの塩基対は、Ｇ－Ｕ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ａ、およびＩ－Ｃ塩基対である。

本発明のＡＯＮ、より詳細には編集ＡＯＮは、標的ＲＮＡ分子に存在する標的ヌクレオチドに直接対向するヌクレオチドを含む。標的ヌクレオチドに直接対向するＡＯＮでのヌクレオチドは、本明細書で、「オーファンヌクレオチド」として定義される。「セントラルトリプレット」とは、オーファンヌクレオチド、ならびにその３’および５’近接ヌクレオチドからなるＡＯＮ内の領域として定義される（ゆえに、セントラルトリプレット＝中央にオーファンヌクレオチドを伴う３つのヌクレオチド）。

用語「スプライス突然変異」とは、プレｍＲＮＡをコードする遺伝子における突然変異に関し、スプライシング機構は、エクソンからのイントロンのスプライシングが分散し、異常なスプライシングにより、続く翻訳が、フレームから外れて、コードされたタンパク質の早期停止をもたらす、センスにおける機能不全である。多くの場合、このようなより短いタンパク質は、迅速に分解され、本明細書に記載するような任意の機能性活性を有さない。正確な突然変異は、ＲＮＡ編集に対する標的である必要はなく、スプライス突然変異の近接または近傍アデノシンが、標的ヌクレオチドであり、Ｉへの変換により、正常状態に戻るスプライス突然変異に修正される可能性がある。当業者は、スプライス突然変異の部位または領域内のアデノシンのＲＮＡ編集の後、正常なスプライシングが復元されるかどうかを決定する方法を承知している。

本発明によるＡＯＮは、例えば、ヌクレオシドに２’－Ｏ－メチル化糖部分（２’－ＯＭｅ）、および／または２’－Ｏ－メトキシエチル糖部分（２’－ＭＯＥ）を供給することにより、ヌクレオシドのほとんどその全体で化学修飾され得る。しかし、オーファンヌクレオチドは、好ましくは、２’－ＯＭｅ修飾を含まず、またさらに好ましい態様では、少なくとも１つの近接ヌクレオチドが、好ましい態様では、標的アデノシンに対向する各ヌクレオチドを挟む２つの近接ヌクレオチドの両方が、２’－ＯＭｅ修飾をさらに含まない。ＡＯＮの全てのヌクレオチドが２’－ＯＭｅ修飾を有する完全な修飾は、ＲＮＡ編集（当該技術分野で知られている）を行う限り、非機能性オリゴヌクレオチドをもたらすが、その理由は、おそらく、標的化された位置でＡＤＡＲ活性を妨害するからである。一般に、標的ＲＮＡでのアデノシンは、２’－ＯＭｅ基で対向するヌクレオチドを生成することによるか、または、対向する塩基としてグアニンもしくはアデニンを生成することによる編集から保護することができ、これら２つの核酸塩基もまた、対向するアデノシンの編集を低減することができる。様々な化学的性質および修飾は、本発明に従って容易に使用することができるオリゴヌクレオチドの分野で知られている。ヌクレオチド間の正常なヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合のモノまたはジチオエート化により改変して、それぞれ、ホスホロチオエートエステル、またはホスホロジチオエート（phosphorodithioate）エステルを得ることができる。アミド化およびペプチドリンカーを含む、ヌクレオシド間結合の他の修飾も可能である。ＭＰ結合は、公知の化学的性質を使用して形成することができる。

ＲＮＡ編集物質（例えば、ヒトＡＤＡＲ酵素）が、いくつかの要因に依存して、特異性を変化させることでｄｓＲＮＡ構造を編集することは、当該技術分野で知られている。１つの重要な要因は、ｄｓＲＮＡ配列をもたらす二本鎖の相補性の度合いである。二本鎖の完璧な相補性は、通常、非特徴的な方法でアデノシンを脱アミノ化し、それが遭遇する任意のアデノシンと反応する、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインをもたらす。ｈＡＤＡＲ１および２の特異性は、化学修飾を導入すること、および／または、ｄｓＲＮＡでのいくつかのミスマッチを確保することにより高めることができ、おそらく、未だに明らかに定義されていない方法で、ｄｓＲＮＡ結合ドメインの位置付けを助ける。あるいは、脱アミノ化反応自身は、編集されるアデノシンに対向するミスマッチを含む、ＡＯＮを生成することにより向上することができる。ミスマッチは、好ましくは、編集されるアデノシンに対向するシチジンを有する、標的化部分を生成することにより作成される。代替として、また、ウリジンは、アデノシンに対向して使用することができるが、これは、当然のことながら、ＵとＡとの対により、「ミスマッチ」は起こらない。標的鎖でアデノシンを脱アミノ化すると、標的鎖は、最も生化学的なプロセスに対して、Ｇとして細胞の生化学的機構により「読み込まれる」イノシンを得る。ゆえに、ＡからＩへの変換の後、Ｉは、完璧に、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の標的化部分における対向するＣと塩基対形成することができるので、ミスマッチは解消される。編集によりミスマッチが解消された後、基質を放出し、オリゴヌクレオチド構築物－編集物質複合体を標的ＲＮＡ配列から放出し、次いで、スプライシングおよび翻訳などの、下流の生化学的なプロセスで利用可能となる。また、標的化したオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡに非常に密に結合すべきではないので、オン／オフ比は重要である。標的ＲＮＡ配列を編集する特異性の所望のレベルは、標的ごとに依存し得る。本特許出願における指示に従って、当業者は、必要性に従ってオリゴヌクレオチドの相補的な部分を設計することが可能であり、いくらかの試行錯誤をして、所望の結果を得ることが可能であろう。

細胞に存在するＲＮＡ編集分子は、通常、哺乳動物を含む、後生動物で見られるＡＤＡＲ酵素などの、天然でのタンパク質性である。好ましくは、細胞の編集物質は、酵素であり、より好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくはアデノシンデアミナーゼである。これらは、ＡＤＡＲ活性を有する酵素である。最も興味深いものは、ヒトＡＤＡＲ、ｈＡＤＡＲ１、およびｈＡＤＡＲ２であり、任意のそのアイソフォームを含む。当該技術分野に知られているＲＮＡ編集酵素は、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物が適宜的に設計され得るが、ヒトまたはヒト細胞におけるｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２などの、ＲＮＡで作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ならびにシチジンデアミナーゼを含む。ｈＡＤＡＲ１が、２つのアイソフォーム、長い１５０ｋＤａの誘導型インターフェロン、およびより短い１００ｋＤａ型に存在し、通常のプレｍＲＮＡから代替的なスプライシングによって生成されることが知られている。その結果、細胞で利用可能な１５０ｋＤａアイソフォームのレベルは、インターフェロン、特にインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の影響を受ける可能性がある。ｈＡＤＡＲ１は、ＴＮＦ－αによっても誘導される。これは、併用療法を開発する機会を提供し、それによりＩＦＮ－γまたはＴＮＦ－α、および本発明によるＡＯＮは、組合せ製品、または別々の製品のいずれかとして、同時に、または続いて、任意の順でのいずれかで、患者に投与される。ある種の疾患状態は、既に、患者のある種の組織における高いＩＦＮ－γ、またはＴＮＦ－αレベルと一致し得、病変組織に対してより特異的な編集を行うさらなる機会を作る。細胞内の編集物質を他の標的部位に再配向する程度は、編集分子の認識ドメインに対する、本発明によるＡＯＮの親和性が変化することにより調節され得ることは、当業者なら理解されよう。正確な修飾は、いくらかの試行錯誤を通して、ならびに／または、ＡＯＮと編集分子の認識ドメインとの間の構造的相互作用に基づく計算方法によって決定することができる。加えて、またはあるいは、細胞に存在する編集物質を動員し、再配向する程度は、ＡＯＮの投与および投与レジメンにより調節され得る。これは、通常、臨床試験において、（インビトロ）実験者または臨床医により決定されることである。

本発明は、真核細胞、好ましくは後生動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞における標的ＲＮＡ配列の修飾に関係する。本発明は、任意の臓器、例えば、皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液などに由来する細胞で使用することができる。本発明は、（ヒト）対象の疾患状態に関与する細胞、組織、または臓器の配列を修飾するのに特に適している。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボに位置することができる。本発明の一利点は、生体中のインシチュでの細胞で使用することができるが、培養下の細胞でも使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞をエクスビボで処置し、次いで、生体内に導入する（例えば、本来由来する生物内に再導入する）。本発明はまた、いわゆる類器官内の細胞において、標的ＲＮＡ配列を編集するのに使用することができる。類器官は、３次元のインビトロ由来の組織と考えられるが、個別の単離された組織を生成する特定の条件を使用して駆動される。治療環境では、インビトロで患者の細胞に由来することができるので、類器官は、通常の移植より拒絶されにくい自己由来の物質として患者に再導入することができることから有用である。処置される細胞は、一般に、遺伝子突然変異を有する。突然変異は、ヘテロ接合またはホモ接合であり得る。本発明は、典型的には、ＮからＡへの突然変異（Ｎは、Ｇ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であり得る）、好ましくはＧからＡへの突然変異、またはＮからＣへの突然変異（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であり得る）、好ましくはＵからＣへの突然変異などの、点突然変異を修飾するのに使用される。

理論を拘束することは望まないが、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集は、転写もしくはスプライシングの間の核内、または、例えば、成熟ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｎｃＲＮＡを編集することができる細胞質の一次転写物で起こると考えられている。編集酵素の異なるアイソフォームは、示差的に局在化することが知られており、例えば、ｈＡＤＡＲ１の１００ｋＤａアイソフォームは核内で多く見られ、ｈＡＤＡＲ１の１５０ｋＤａアイソフォームは細胞質で多く見られる。シチジンデアミナーゼによるＲＮＡ編集は、ｍＲＮＡレベルで起こると考えられている。

多くの遺伝的疾患は、ＧからＡへの突然変異により起こり、突然変異した標的アデノシンでのアデノシン脱アミノ化が、とりわけＰＴＣに関係する場合、突然変異を、機能性全長および／もしくは野生型タンパク質が発生するコドンに逆行させることから、これらは、好ましい標的疾患である。本発明によるオリゴヌクレオチドで予防および／または処置することができる遺伝的疾患の好ましい例は、標的ＲＮＡでの１つまたは複数のアデノシンの修飾が、（潜在的な）有益な変化をもたらす、任意の疾患である。とりわけ好ましいのは、アッシャー症候群、スタルガルト病、および嚢胞性線維症である。

本発明による標的化編集が、突然変異したまたは野生型のヌクレオチドであろうとなかろうと、任意のアデノシン（またはシトシン）に適用することができることは明らかであるべきである。例えば、編集は、異なる特性でのＲＮＡ配列を作成するのに使用することができる。このような特性は、コーディング特性（改変させたタンパク質の特性もしくは機能をもたらす、異なる配列もしくは長さを有するタンパク質を生じる）、または結合特性（ＲＮＡ自身もしくは標的もしくは結合パートナーの阻害もしくは過剰発現を起こす；発現経路全体が、標的ＲＮＡでｍｉＲＮＡもしくはその同族配列を記録することにより改変することができる）であり得る。タンパク質の機能または局在化は、機能性ドメインまたは認識モチーフにより、そのまま変化することができ、限定されないが、シグナル配列、標的化または局所化シグナル、タンパク質分解切断または翻訳に伴うもしくは翻訳後の修飾に対する認識部位、酵素の触媒部位、結合パートナーに対する結合部位、分解または活性化に対するシグナルなどが挙げられる。ＲＮＡのこれらおよびその他の形態、ならびにタンパク質「工学」は、疾患を予防、遅延、もしくは処置しようとしまいと、またはいかなる他の目的のために、医学または生物工学において、診断、予防、治療、調査ツールなどとして、本発明により包含される。

投与されるＡＯＮの量、投与量、および投与レジメンは、細胞の種類ごと、処置される疾患、標的集団、投与の様式（例えば、全身対局所）、疾患の重症度、および副活性の許容レベルで異なり得るが、これらは、インビトロ研究、前臨床試験、および臨床試験の間、試行錯誤により評価することができ、評価されるべきである。修飾された配列により容易に検出される表現型の変化が生じる場合、試験は、特に単純である。より高用量のＡＯＮが、細胞内で核酸編集物質（例えばＡＤＡＲ）に結合するために競合し、それにより、ＲＮＡ編集を行わない物質の量を消耗する可能性があるが、通常の投与試験により、所与のＡＯＮおよび所与の標的に対する任意のこのような効果が明らかになる。

１つの適した試験技術は、ＡＯＮを細胞株、または試験生物に送達すること、次いで、その後の様々な時点で生検サンプルを採取することを含む。標的ＲＮＡの配列は、生検サンプルで評価することができ、修飾を有する細胞の割合は、続いて容易に行うことができる。この試験を一旦行うと、その後、情報を保持することができ、生検サンプルの採取を必要とせずに、今後の送達を行うことができる。ゆえに、本発明の方法は、細胞の標的ＲＮＡ配列での所望の変化の存在を同定し、それにより、標的ＲＮＡ配列が修飾されることを検証するステップを含むことができる。このステップは、典型的には、上述の通り、標的ＲＮＡの関連する部分、またはそのｃＤＮＡコピー（もしくは、標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合、そのスプライシング生成物のｃＤＮＡコピー）をシークエンシングすることを含むので、配列変化は、容易に検証することができる。あるいは、変化は、タンパク質のレベル（長さ、グリコシル化、機能など）で、または、標的ＲＮＡ配列でコードされるタンパク質が、例えば、イオンチャンネルである場合、（誘導）電流などの、いくつかの機能的な読み出しにより、評価することができる。

ＲＮＡ編集が、細胞内で起こった後、修飾されたＲＮＡは、例えば、細胞分裂、編集されるＲＮＡの半減期の制限などにより、経時的に希釈することができる。ゆえに、実用的な治療の点で、本発明の方法は、十分な標的ＲＮＡを修飾して、患者に目に見える利点を提供する、および／または経時的に利点を維持するまで、ＡＯＮの繰り返す送達を含み得る。

本発明のＡＯＮは、特に、治療的使用に適しているので、本発明は、本発明のＡＯＮおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、単純に生理食塩水溶液であり得る。これは、特に肺内送達に対して、有用に等張性または高張性であり得る。本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む、送達デバイス（例えば、シリンジ、吸入器、ネブライザー）を提供する。

本発明はまた、本明細書に記載の通り、哺乳動物、好ましくはヒト細胞での標的ＲＮＡ配列において変化させるための方法での使用のための、本発明のＡＯＮを提供する。同様に、本発明は、本明細書に記載の通り、哺乳動物、好ましくはヒト細胞での標的ＲＮＡ配列において変化させるための医薬の製造における、本発明のＡＯＮの使用を提供する。

本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する、少なくとも１つの特異的な標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、細胞に、本発明によるＡＯＮを供給するステップ、ＡＯＮの細胞による取込みを可能にするステップ、標的ＲＮＡ分子へのＡＯＮのアニーリングを可能にするステップ、野生型酵素で発見された天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素が、標的ＲＮＡ分子中の標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ、および、任意で、ＲＮＡ配列中のイノシンの存在を同定するステップを含む、方法に関する。

好ましい態様では、ＡからＩへの変換の最大脱アミノ化効果に依存して、同定するステップは、標的ＲＮＡをシークエンシングすること、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または、機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の標的ＲＮＡが、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、使用することを含む。アデノシンのイノシンへの脱アミノ化により、標的位置での突然変異したＡにもはや悩まされることがないタンパク質をもたらすことができることにより、イノシンへの脱アミノ化の同定はまた、機能的な読み出し、例えば、機能的タンパク質が存在するかどうかの評価、または、さらに、アデノシンの存在により引き起こされる疾患が（部分的に）逆行することの評価であり得る。本明細書に記載の疾患の各々に対する機能的評価は、一般に、当業者に知られている方法に従う。標的アデノシンの脱アミノ化の後のイノシンの存在を同定する非常に適した方法は、もちろん、当業者に周知の方法を使用する、ＲＴ－ＰＣＲおよびシークエンシングである。

本発明によるＡＯＮは、水溶液、例えば、生理食塩水、または、１ｎｇ／ｍｌ～１ｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、薬学的な使用に適合する、添加物質、賦形剤、および他の成分を任意で含む、懸濁液で、適切に投与される。投与量は、適切には、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、吸入（例えば、ネブライザーによって）、鼻腔内、経口、注射または注入、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、硝子体内、筋肉内、気管内、腹腔内、直腸内などであり得る。投与は、固体形態、散剤、丸剤、ゲル剤、点眼剤の形態、またはヒトでの薬学的使用に適合する任意の他の形態であり得る。

[実施例１]
ＡからＩへの編集のための分割アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計。
本発明の発明者らは、単一の３８ｎｔ長のＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が、インビボでのＲＮＡ編集の効率だけでなく、製造に関しても問題を生じさせ得ることを認識した。そのような比較的「大型の」ＡＯＮが、トランスフェクション剤を使用せずにインビボで細胞にどの程度効率的に進入することができるかは不明であると考えられていた。特に、当該技術水準では、これに対する解決策は言及されておらず、したがって本発明者らは、一方がより長いＡＯＮの５’部分に対応することになり、他方がこのより長鎖型の３’部分に対応することになる２つの短いＡＯＮの使用を調査した。５’部分に対応するＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり、３’部分に対応するＡＯＮは、標的ＲＮＡ分子において編集の標的となるアデノシンに対向する「オーファンヌクレオチド」を含むため、「編集ＡＯＮ」とみなされることになる。モデルとして、マウスアミロイド前駆体タンパク質（ｍＡＰＰ）をコードする（プレ）ｍＲＮＡを標的として選択した。図１Ａは、標的ｍＡＰＰ ｍＲＮＡの配列、ならびに異なる化学修飾を有するものの全てが陽性対照としての機能を果たす、ｍＡＰＰＥｘ１７－３９、－６２、および－６７と称される３つの３８ｎｔ長のＡＯＮの配列を示す（図１Ｂ）。ｍＡＰＰｅｘ１７－６２は、ｍＡＰＰ野生型（プレ）ｍＲＮＡのエクソン１７にある標的配列中のアデノシン（図１Ａでは太字で下線付き）の編集を誘導することができることがまず見出された（データは示さず）。上述した通り、３８ヌクレオチドという長さは、ＲＮＡ編集の分野で使用されるほとんどのＲＮＡ編集ＡＯＮでは、非常に一般的である。本発明者らは、このＡＯＮの配列を、以下の通り、まず各ＡＯＮが１９ｎｔ長であるＡＯＮの４つの異なるセットを生成することにより３８ｎｔのＡＯＮ配列を対称的に分割し、また次いで３８ｎｔのＡＯＮ配列を非対称的に分割することにより、および３８ｎｔのＡＯＮ配列を２つの部分に分割し、より短いＡＯＮ間に１、２、または３ヌクレオチドのギャップを残すことにより、２つの別々の部分に分割することを決めた。
対称性分割：
ｍＡＰＰＥｘ１７－１３５Ａ（１９ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１３５Ｂ（１９ｎｔ）
ｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ａ（１９ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ｂ（１９ｎｔ）
ｍＡＰＰＥｘ１７－１４０Ａ（１９ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１４０Ｂ（１９ｎｔ）
ｍＡＰＰＥｘ１７－１４１Ａ（１９ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１４１Ｂ（１９ｎｔ）
非対称性分割：
ｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ａ（１７ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１４４Ｂ（２１ｎｔ）
ｍＡＰＰＥｘ１７－１４５Ａ（１７ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１４５Ｂ（２１ｎｔ）
ギャップ付き分割：
ｍＡＰＰＥｘ１７－１３６Ａ（１８ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１３６Ｂ（１９ｎｔ） － １ｎｔギャップ
ｍＡＰＰＥｘ１７－１３７Ａ（１８ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１３９Ｂ（１８ｎｔ） － ２ｎｔギャップ
ｍＡＰＰＥｘ１７－１３８Ａ（１７ｎｔ）およびｍＡＰＰＥｘ１７－１３８Ｂ（１８ｎｔ） － ３ｎｔギャップ

「Ａ」で示されるＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」とも称され、「Ｂ」で示されるＡＯＮは「編集ＡＯＮ」とも称される。ＡＯＮは、各実験で陽性対照として使用した単一の３８ｎｔ ＡＯＮに沿って、様々な化学修飾を有していた。ＡＯＮは、様々なＲＮＡ／ＤＮＡ、ＰＳ結合、２’－ＯＭｅ、および／または２’－ＭＯＥ修飾を有していた（詳細については、図１Ｂを参照）。全てのＡＯＮは、編集しようとするＡに対向するヌクレオチド（オーファンヌクレオチド）および２つのそれを取り囲むヌクレオチド（５’側に１つおよび３’側に１つ）を除いて（これら３つのヌクレオチドはＤＮＡだった）、糖部分の２’位が、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチルのいずれかで完全に修飾されていた（図１Ｂを参照）。図１Ｂに見ることができるように、ＰＳ結合の数は様々だった。１７／２１以外の他の非対称性分割も実施可能であることが認識されるべきである（Ａ／Ｂ：１８／２０、２０／１８、２１／１７）。

[実施例２]
インビトロ生化学アッセイにおける、ＡからＩへの編集のための分割ＡＯＮのセットの使用。
上記で参照されている全てのセットの編集効力を、インビトロ生化学編集アッセイで測定し、同様の化学修飾を有する陽性対照３８ｎｔ ＡＯＮと比較した。

ｍＡＰＰ標的ＲＮＡを得るために、Ｔ７プロモーターの配列およびｍＡＰＰの配列（の一部）を含んでいたｍＡＰＰ Ｇブロック（ＩＤＴ）をテンプレートとして使用し、フォワードプライマー５’－ＣＴＣＧＡＣＧＣＡＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＣ－３’（配列番号１０）およびリバースプライマー５’－ＴＧＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＡＧ－３’（配列番号１１）を使用してＰＣＲを実施した。次いで、ＰＣＲ生成物を、インビトロ転写のテンプレートとして使用した。この反応には、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キットを使用した。ＲＮＡを尿素ゲルで精製し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で抽出し、フェノール－クロロホルムで精製した。精製したＲＮＡを、生化学編集アッセイの標的として使用した。

全ての単一のＡＯＮおよび対称性／非対称性／ギャップ付きＡＯＮのセットを、緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＮａＣｌ）中、１：３比の標的ＲＮＡ対ＡＯＮで（２００ｎＭ標的ＲＮＡおよび６００ｎＭ ＡＯＮ）、ｍＡＰＰ標的ＲＮＡにアニーリングさせた。サンプルを、９５℃で３分間加熱し、次いで室温までゆっくりと冷却した。次に、編集反応を実施した。二本鎖核酸複合体を、最終濃度が６ｎＭ ＡＯＮおよび２ｎＭ標的ＲＮＡになるように、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、ミニ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼＩ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ポリＡ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｔＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および編集反応緩衝液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３％グリセロール、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．００３％ＮＰ－４０、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０．５ｍＭ ＤＴＴ）と混合した。混合物に精製ＡＤＡＲ２（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を６ｎＭの最終濃度になるように添加することにより、反応を開始させた。インキュベーションを、所定の時間（０秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、２５分、および５０分）にわたって３７℃で継続した。沸騰した３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液９５μｌを添加することにより各反応を停止させた。

次いで、停止させた反応混合物のアリコート６μｌを、ランダムヘキサマープライマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にＭａｘｉｍａ逆転写酵素キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用した。ＲＮＡの最初の変性を、９５℃で５分間、プライマーおよびｄＮＴＰの存在下で行い、続いて、１０℃まで穏やかに冷却した後、第一の鎖合成を、６２℃の伸長温度を使用して総体積２０μｌで製造業者の説明書に従って行った。

生成物を、製造業者の説明書に従ってＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ３６０ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、テンプレートとしてｃＤＮＡ １μｌとのＰＣＲによるパイロシークエンシング解析のために増幅した。以下のプライマーを、濃度１０μＭで使用した：パイロ配列フォワード ｍＡＰＰ、５’－ＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴ－３’（配列番号１２）、およびパイロ配列リバース ｍＡＰＰビオチン、５’－５ＢｉｏｓＧ／ＣＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＴ－３’（配列番号１３）。後者のプライマーはまた、パイロシークエンシング反応中の自動処理の必要に応じて、その５’末端にコンジュゲートされたビチオンを含有する。ＰＣＲを、以下の熱サイクルプロトコルを使用して行った：９５℃で５分間の最初の変性、次に９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクル、ならびに７２℃で７分間の最終伸長。

逆転写反応でのｃＤＮＡ合成の間のシチジンとのイノシンの塩基対として、ＰＣＲの間の編集される位置に組み込まれるヌクレオチドは、グアノシンである。グアノシン（編集済み）対アデノシン（未編集）の百分率は、パイロシークエンシングによって定義された。ＰＣＲ生成物のパイロシークエンシングおよび以下のデータ解析は、ＰＣＲ生成物の１０μｌ入力、および４μＭの以下のシークエンシングプライマー：ｍＡＰＰ配列、５’－ＴＣＧＧＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧ－３’（配列番号１４）を用いて、ＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ４８ Ａｕｔｏｐｒｅｐ機器（ＱＩＡＧＥＮ）により製造業者の説明書に従って行った。この標的ＲＮＡ鎖に特異的に定義される設定は、２セットの配列情報を含んだ。第一のセットは、解析するための機器に対する配列を定義し、プリンの場合、アデノシンまたはグアノシンのいずれかを含有する位置の可能性は「Ｒ」で示される：ＧＣＧＧＣＧＴＴＧＴＣＡＴＲＧＣＡＡＣＣＧＴＧＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号１５）。分配順は、以下の通り、この解析に対して定義した：ＴＧＣＧＣＧＴＧＴＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣ（配列番号１６）。機器により行われた解析は、その位置で検出されたアデノシンおよびグアノシンの百分率として選択されたヌクレオチドに対する結果を示し、したがって、選ばれた位置でのＡからＩへの伸長は、その位置でのグアノシンの百分率により測定される。

第１の実験では、単一の３８ｎｔ ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿６２を、２つのセット：ｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３９Ａおよび－Ｂを含む対称性セットならびにｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ａおよび－Ｂを含む非対称性セットと比較した。図２は、この実験の結果を示す。驚くべきことに、２つの短鎖ＡＯＮの組合せを適正なＲＮＡ編集に適用することができ、非対称性セットは陽性対照ＡＯＮよりも優れていたことが見出された。対称性セットのＡＯＮも、長鎖ＡＯＮおよび非対称性セットよりも速度はやや遅いものの、著しいＲＮＡ編集をもたらした。

第２の実験では、単一の３８ｎｔ ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿６７を、３つのセット：ｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４０Ａおよび－Ｂを含む対称性セット、ｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａおよび－Ｂを含む非対称性セット、およびｉｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａおよび－Ｂを含む非対称性セットと比較した。図３は、この実験の結果を示す。３つのセット全てを適正なＲＮＡ編集に適用することができ、全てのセットで良好な結果が得られたが、非対称性セットは２つの対称性セットよりも良好に機能したことが見出された。非対称性分割ＡＯＮの編集効力がより高いのは、ＡＤＡＲ２／ＲＮＡ複合体（図示せず）およびＡＤＡＲ２のＲＢＤ２領域の構造データに基づく分割の位置決め（が好ましいこと）によるものであり得る。本発明者らの知る限りでは、本発明の発明者らは、１６～２２ｎｔの比較的短い長さを有する２つのオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ編集を達成することができることを初めて示した。当業者であればもちろん明らかであるが、この場合の「非対称性」は、分割ＡＯＮの長さが、対照ＡＯＮの元の長さである３８ヌクレオチドに基づいていることを意味し、その基本配列が、例えば３４ヌクレオチドである（長鎖ＡＯＮの３’末端から４ヌクレオチドが切断されている）場合、２つの分割ＡＯＮの長さは等しくなり（各々１７ｎｔ長）、「対称性」であるとみなされることになる。同じことが、例えば、３６ヌクレオチド長である陽性対照ＡＯＮでも真である。当然のことながら、陽性対照が、例えば３７ｎｔまたは３５ｎｔの長さである場合、分割は常に「非対称性」になるだろう。ゆえに、用語「対称性」および「非対称性」は、本明細書で使用される場合、元の陽性対照ＡＯＮを様々に分割することに基づくものに過ぎず、したがって、こうした用語はある程度随意に適用される。

[実施例３]
インビトロ生化学アッセイにおける、ＡからＩへの編集のための分割ＡＯＮのセットおよび単一の短鎖編集ＡＯＮの使用。
次いで、上記に記載のものと同様の実験設定において、ヘルパーＡＯＮ（分割ＡＯＮの「Ａ」型）を適用することなく、単一の短鎖編集ＡＯＮ（分割ＡＯＮの「Ｂ」型）のみを使用してもＲＮＡ編集が実施可能であるかどうかを調査した。このために、単一の３８ｎｔ ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿６７を、以下の通り、ＡＯＮの２つのセットおよび２つの単一の短鎖編集ＡＯＮと比較した：ｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３９Ａおよび－Ｂを含む対称性セット、ｉｉ）単一の編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３９Ｂ、ｉｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ａおよび－Ｂを含む非対称性セット、およびｉｖ）単一の編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ｂ。図４は、この実験の結果を示す。驚くべきことに、単一のｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ｂ ＡＯＮ（２１ｎｔ）の使用は、同じＡＯＮをそのヘルパーＡＯＮと共に用いた場合および陽性対照を用いた場合に得られたレベルにほぼ到達する著しいＲＮＡ編集をもたらしたことが見出された。これは、本発明者らが、２１ヌクレオチドという短いＡＯＮを用いてＲＮＡ編集を得ることができたことを示しており、この分野でこれまで理解されていたことを考慮すると非常に注目に値する。この実験では、この単一の短鎖ＡＯＮは、ｍＡＰＰ１３９Ａおよび－Ｂをセットで共に使用した場合よりもさらにより高いレベルのＲＮＡ編集に到達した。編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ｂは、そのヘルパーＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４４Ａと共にセットで使用すると、効力がさらに増進された。

またさらなる実験では、単一の３８ｎｔ ｍＡＰＰＥｘ１７＿６７を、以下の通り、ＡＯＮの２つのセットおよび２つの他の単一の短鎖編集ＡＯＮと比較した：ｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａおよび－Ｂを含む対称性セット、ｉｉ）単一の編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ｂ、ｉｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａおよび－Ｂを含む非対称性セット、およびｉｖ）単一の編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ｂ。図５は、この実験の結果を示す。ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４１Ａおよび－Ｂの対称性セットはうまく機能しなかったが、単一の短鎖ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ｂはより良好に機能し（非常に効果的だったわけではないが）、それはヘルパーＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１４５Ａの追加によってさらに増進された。この場合もまた、非対称性セット（陽性対照の観点で生成された）の方が、ＡＯＮの対称性セットよりも良好に作用することが示された。

こうした実験は、非対称性分割ＡＯＮおよび２１ｎｔ編集ＡＯＮを単独で使用すると、適正なＲＮＡ編集結果がもたらされることを明らかにするが、長鎖陽性対照およびヘルパーＡＯＮの存在と比較して異なる単一のＡＯＮ間で観察される変動性は、正確な長さ、５’および／または３’位置におけるＡＯＮの開始、ならびにこうした単一のＡＯＮの各々に存在する化学修飾によるものである可能性が高い。化学修飾の最良の組合せを提供するにはさらなる最適化が必要である（ＰＳ結合の位置、２’－ＯＭｅおよび２’－ＭＯＥ修飾の位置、ある特定の位置における他のまたは追加の（２’）修飾の導入可能性、ＤＮＡヌクレオチドの数および／または位置など）。長さおよび化学修飾は、標的とする特定の（プレ）ｍＲＮＡに応じて調整しなければならず、したがって標的ＲＮＡの特定の配列にも依存する可能性があることは排除することができない。いずれにせよ、本発明の発明者らは、発明者らの知る限り、１９～２１ヌクレオチド長と短いオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ編集を達成することができることを最初に示した。

[実施例４]
内因性ＡＤＡＲを動員することにより細胞内でＡからＩへの編集を行うための、分割ＡＯＮのセットおよび単一の短鎖編集ＡＯＮの使用。
次に、分割ＡＯＮが（組合せで、および編集ＡＯＮとして単独で）、細胞内で野生型内因性ｍＡＰＰ ＲＮＡを編集することができるかどうかを調査した。そのために、野生型ＡＰＰ遺伝子を有するマウス網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を使用した。簡潔に言うと、トランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレート１つ当たり２．５×１０^５個の細胞を播種した。トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って１００ｎＭ ＡＯＮおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った（１：２の比で、１μｇ ＡＯＮ対２μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）。未トランスフェクション（ＮＴ）、モックトランスフェクション、およびスクランブルオリゴヌクレオチド（ｓｃｒ－ｍＡＰＰ－３、図１Ｂを参照）を陰性対照として共に使用した。ＲＮＡは、製造業者の説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）キットを使用してトランスフェクション４８時間後に細胞から抽出し、ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマーおよびオリゴｄＴプライマーの組合せを用いて、製造業者の説明書に従ってＭａｘｉｍａ逆転写酵素キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して調製した。ｃＤＮＡを５倍に希釈し、この希釈液１μＬを、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）に対するテンプレートとして使用した。ＢｉｏＲａｄのＱＸ－２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを使用して、核酸標的配列の絶対定量化のためのｄｄＰＣＲアッセイを実施した。ＲＴ ｃＤＮＡ合成反応から得られた希釈ｃＤＮＡ １μｌを、ｄＵＴＰを含まないプローブ用のｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を含む、反応混合の２１μｌの全混合物で使用し、以下のフォワードおよびリバースプライマーを用いたＴａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型アッセイを、以下の遺伝子特異的プローブと組み合わせた：
フォワードプライマー：５’－ＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＡＣ－３’（配列番号１７）
リバースプライマー：５’－ＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧ－３’（配列番号１８）
野生型プローブ（ＨＥＸ ＮＦＱ標識）：５’－／５ＨＥＸ／ＣＧＴ Ｔ＋ＧＴ ＣＡＴ＋Ａ＋Ｇ＋Ｃ ＡＡＣ ＣＧＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号１９）
突然変異型プローブ（ＦＡＭ ＮＦＱ標識）：５’－／５６－ＦＡＭ／ＣＧＴ ＴＧＴ ＣＡＴ＋Ｇ＋Ｇ＋Ｃ ＡＡＣ ＣＧ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’（配列番号２０）

ｃＤＮＡを含む総体積２１μｌのＰＣＲミックスを、マルチチャンネルピペットを使用して、ｄｄＰＣＲカートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）の中列に充填した。複製を、２つのカートリッジに分割した。下列は、プローブ用のドロップレット生成油（ＢｉｏＲａｄ）７０μｌで充填した。ラバーガスケットの置換の後、ドロップレットを、ＱＸ２００ドロップレット生成器で生成した。カートリッジの上列から油状乳化物４２μｌを、９６ウェルＰＣＲプレートに移した。ＰＣＲプレートを、ＰＸ１プレートシーラーを使用して、１７０℃で４分間、スズ箔で密封し、その後、以下のＰＣＲプログラムを行った：９５℃で１０分間の酵素活性化を１サイクル、９５℃で３０分間の変性および５５．８℃で１分間のアニーリング／伸長を４０サイクル、９８℃で１０分間の酵素不活性化と続く８℃での保管を１サイクル。ＰＣＲの後、プレートを、ＱＸ２００ドロップレットリーダーで読み出し、解析した。

図６に示す結果は、単独でまたは対応するヘルパーＡＯＮと組み合わせて使用した全ての編集ＡＯＮが、マウスＲＰＥ細胞内でｍＡＰＰ標的ＲＮＡを編集することが可能であり、こうした細胞内で内因性ＡＤＡＲを動員することができたことを明らかにしている。ｍＡＰＰｅｘ１７－１４０Ａ＋Ｂ、ｍＡＰＰｅｘ１７－１４１Ａ＋Ｂ、およびｍＡＰＰｅｘ１７－１４５Ａ＋Ｂは、３８ｎｔ長のＡＯＮ ｍＡＰＰｅｘ１７－６２およびｍＡＰＰｅｘ１７－６７による標的ＲＮＡの編集と比較すると、効力はより低いものの、ｍＡＰＰｅｘ１７－１３９Ａ＋ＢセットおよびｍＡＰＰｅｘ１７－１４４Ａ＋Ｂセットよりも高い非常に類似したＲＮＡ編集レベルを示した。この実験ではトランスフェクション試薬が使用され、インビボでまたはトランスフェクション試薬を使用しない場合のインビトロで起こること（ギムノシス性取込み（gymnotic uptake））とは異なることに留意されたい。トランスフェクションでは、オリゴヌクレオチドの長さはあまり重要ではないが、トランスフェクション試薬の非存在下では、オリゴヌクレオチドが長いほど細胞に進入しにくくなることが知られている。図６は、単一の編集ＡＯＮ ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３９Ｂ、－１４０Ｂ、－１４１Ｂ、－１４４Ｂ、および－１４５Ｂが全てＲＮＡ編集をもたらしたことも明らかにしている。これは、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドのそのような短鎖型も、内因性ＡＤＡＲを動員することが可能であり、内因性標的のＲＮＡ編集をもたらすことが可能であることを示す。これは驚くべき観察結果だった。

[実施例５]
インビトロ生化学アッセイにおける、ＡからＩへの編集のための分割およびギャップ付きＡＯＮのセットの使用。
次いで、本発明者らは、ＲＮＡ編集をもたらすために分割ＡＯＮが標的ＲＮＡ中の連続したひと続きに相補的でなければならないことが必要であるかどうか、または分割ＡＯＮ間に１、２、または３ヌクレオチドの小さなギャップがあっても適正な編集が得られるかどうかを検討した。そのために、実施例２および３で考察したものと同じ生化学アッセイを適用した。単一の３８ｎｔ ｍＡＰＰＥｘ１７＿３９を、以下の通り、分割（ギャップ付き）ＡＯＮの３つのセット、および各々１９ｎｔ長の２つの連続ＡＯＮの１つの対称性セットと比較した：ｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３５Ａおよび－Ｂを含む対称性セット、ｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３６Ａおよび－Ｂを含む１ｎｔギャップセット、ｉｉｉ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３７Ａおよび－Ｂを含む２ｎｔギャップセット、ならびにｉｖ）ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３８Ａおよび－Ｂを含む３ｎｔギャップセット。こうしたＡＯＮの特定の化学修飾については、図１Ｂを参照されたい。図７は、この実験の結果を示す。全てのセットがＲＮＡ編集をもたらす能力を示した。これはオリゴヌクレオチドのセット内の２つのＡＯＮ間にギャップが許容されることを示す。しかし、ギャップが存在する場合、ＲＮＡ編集の効力が低下したことも観察された。これは２つの分割ＡＯＮが、標的配列中の連続したひと続きのヌクレオチドに対して完全な１００％の相補性を提供する配列を有することが好ましいことを示す。興味深いことに、ｍＡＰＰＥｘ１７＿１３５Ａ＋Ｂの組合せは、陽性対照ｍＡＰＰＥｘ１７＿３９で観察されたＲＮＡ編集のレベルおよび速度と同等のＲＮＡ編集のレベルおよび速度を示した。この場合もまた、１７～２１ヌクレオチドの範囲である２つの別々のオリゴヌクレオチドの使用を使用して、標的（プレ）ｍＲＮＡ分子中の標的アデノシンのイノシンへの脱アミノ化を得ることができることを示す。

Claims (16)

1. 標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化に使用するための、２つの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）のセットを含む組成物であって、一方のＡＯＮは「編集ＡＯＮ」であり、他方のＡＯＮは「ヘルパーＡＯＮ」であり、前記編集ＡＯＮは、前記標的アデノシンを含む前記標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、前記標的アデノシンに直接対向する前記編集ＡＯＮ中のヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥで修飾されていないシチジンである「オーファンヌクレオチド」であり、前記ヘルパーＡＯＮは、前記編集ＡＯＮに相補的な前記ひと続きのヌクレオチドとは別の前記標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、前記ヘルパーＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有し、前記編集ＡＯＮは１６～２２ヌクレオチドの長さを有する、組成物。
2. 前記ヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮが、前記標的ＲＮＡと連続的に二本鎖複合体を形成し、前記ヘルパーＡＯＮは、前記編集ＡＯＮに相補的な前記標的ＲＮＡ中の前記ひと続きのヌクレオチドの３’側に位置する前記標的ＲＮＡ中のひと続きのヌクレオチドに相補的であり、前記ヘルパーＡＯＮおよび前記編集ＡＯＮに相補的な配列間にヌクレオチドギャップは存在しない、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ヘルパーＡＯＮが、前記標的ＲＮＡと１００％相補的である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記編集ＡＯＮが、前記標的アデノシンに対向するシチジンとのミスマッチを除いて、前記標的ＲＮＡと完全に相補的である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記セットが、前記標的ＲＮＡと前記二本鎖複合体を形成した後、内因性ＡＤＡＲ酵素を動員して、前記標的アデノシンのイノシンへの脱アミノ化をもたらすように構成されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記編集ＡＯＮが、１つまたは複数のホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）結合を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記編集ＡＯＮが、２’－ＯＭｅ修飾を含む糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド、および／または２’－ＭＯＥ修飾を含む糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記オーファンヌクレオチドが、前記糖部分に２’－Ｈを有する（ＤＮＡ）、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記オーファンヌクレオチドの５’側のヌクレオチドおよび／または３’側のヌクレオチドがＤＮＡである、請求項８に記載の組成物。
10. 前記編集ＡＯＮが、少なくとも１つのホスホノアセテート（phosphonoacetate）ヌクレオシド間結合、少なくとも１つのメチルホスホネート（methylphosphonate）ヌクレオシド間結合、および／またはアンロックド核酸（ＵＮＡ）リボース修飾を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記編集ＡＯＮが、１９、２０、または２１ヌクレオチド長であり、前記オーファンヌクレオチドが、５’末端から６番目、７番目、または８番目のヌクレオチドであり、前記ヘルパーＡＯＮが、１７、１８、または１９ヌクレオチド長である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物
12. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ、シャルコー－マリー－ツース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー、（栄養障害型）表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障（例えば、ＬＣＡ１０）、レッシュ－ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、Ｉ型およびＩＩ型筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニーマン－ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ－イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビン突然変異関連障害（例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異）、肺高血圧症、（常染色体優性）色素性網膜炎、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイサックス病、アッシャー症候群（例えば、アッシャー症候群Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、ならびに、がんからなる群から好ましくは選択される、遺伝的障害の療法での使用のための、好ましくは処置または予防での使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 細胞内の標的ＲＮＡ中の少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、
    （ｉ）前記細胞に、請求項１から１１のいずれか一項に定義されたヘルパーＡＯＮおよび編集ＡＯＮを含むＡＯＮのセットを供給するステップ、
    （ｉｉ）前記標的ＲＮＡへの前記ＡＯＮのアニーリングを可能にして、二本鎖核酸分子を形成するステップ、
    （ｉｉｉ）前記細胞に内因的に存在するＡＤＡＲ酵素が、前記二本鎖核酸分子と複合体を形成し、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンをイノシンへと脱アミノ化することを可能にするステップ、および
    （ｉｖ）任意で、前記標的ＲＮＡ中の脱アミノ化した前記ヌクレオチドの存在を同定するステップ
    を含む方法。
15. ステップ（ｉｖ）が、
    ａ）前記標的ＲＮＡの領域であって、前記標的アデノシンの位置を含む領域をシークエンシングすること、
    ｂ）前記標的アデノシンが、ＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドンに存在し、脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集される場合、機能性、伸長型、全長および／もしくは野生型タンパク質の存在を評価すること、
    ｃ）前記標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合、前記プレｍＲＮＡのスプライシングが、脱アミノ化により改変したかどうかを評価すること、または
    ｄ）機能的な読み出しを使用することであって、脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能性、全長、伸長型および／もしく野生型タンパク質をコードする、使用すること
    を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 標的ＲＮＡに存在する少なくとも１つの標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、
    （ｉ）請求項１から１１のいずれか一項に特徴付けられている２つのＡＯＮのセットを供給するステップ、
    （ｉｉ）前記標的ＲＮＡへの前記ＡＯＮのアニーリングを可能にして、二本鎖核酸分子を形成するステップ、
    （ｉｉｉ）ＡＤＡＲ酵素が、前記二本鎖核酸分子と複合体を形成し、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンをイノシンへと脱アミノ化することを可能にするステップ、および
    （ｉｖ）前記標的ＲＮＡ中の脱アミノ化した前記アデノシンの存在を同定するステップ
    を含む方法。