CN110352244A

CN110352244A - 化学修饰的编辑rna的单链寡核苷酸

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Publication number: CN110352244A
Application number: CN201780068116.0A
Authority: CN
Inventors: J·J·图鲁宁; A·阿尔托; B·克莱恩; L·范辛特菲特; J·A·G·布代
Original assignee: ProQR Therapeutics II BV
Current assignee: ProQR Therapeutics II BV
Priority date: 2016-09-01
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: JP2019526260A; KR20190042660A; ZA201901016B; US11851656B2; EP3507366A1; DK3507366T3; AU2017320901B2; AU2017320901A1; CN110352244B; US20210238597A1; WO2018041973A1; US20190218552A1; PL3507366T3; ES2837076T3; US10941402B2; CA3035293A1; NZ751483A; KR102501980B1; JP7244922B2; PT3507366T

Abstract

本发明涉及能够在真核细胞中对靶RNA序列的靶核苷酸(腺苷)进行特异性编辑的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸本身不形成分子内发夹或茎‑环结构，并且其中所述寡核苷酸在与靶RNA序列中待编辑的核苷酸相对的位置包含非互补核苷酸。

Description

化学修饰的编辑RNA的单链寡核苷酸

技术领域

本发明涉及医药领域。特别地，它涉及RNA编辑领域，其中RNA序列由单链反义寡核苷酸靶向以校正基因突变和/或改变特定靶RNA的序列。更具体地，本发明涉及对编辑RNA的单链寡核苷酸的化学修饰，其使得寡核苷酸更稳定并提高其RNA编辑效率。

背景技术

RNA编辑是真核细胞改变其RNA分子序列的自然过程，通常以位点特异性和精确的方式改变，从而将基因组编码的RNA的谱系增加几个数量级。已经描述了用于整个动物和植物界的真核物种的RNA编辑酶，并且这些过程在从最简单的生命形式如秀丽隐杆(Caenorhabditis)线虫到人类的后生动物中在控制细胞稳态方面起重要作用。RNA编辑的实例分别是通过称为腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶的酶，腺苷(A)至肌苷(I)和胞苷(C)至尿苷(U)的转换。最广泛研究的RNA编辑体系是腺苷脱氨酶。

腺苷脱氨酶是多结构域蛋白，包含识别结构域和催化结构域。识别结构域识别特定的双链RNA(dsRNA)序列和/或构象，而催化结构域通过核碱基的脱氨基作用将靶RNA中附近的、或多或少预定位置的腺苷转化为肌苷。通过细胞的翻译机制将肌苷读作鸟苷，这意味着，如果所编辑的腺苷位于mRNA或前mRNA的编码区中，则其能够重编码蛋白序列。

A至I转换也可发生在靶mRNA的5’非编码序列中，在原始起始位点的上游产生新的翻译起始位点，其产生N-末端延长的蛋白。编辑事件也能够发生在3’UTR处并影响基于miRNA的调节和多腺苷酸化。此外，A至I转换可发生在前mRNA中的内含子或外显子中的剪接元件中，从而改变剪接的模式。因此，可包括或跳过外显子。腺苷脱氨酶是称为作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)的酶家族的一部分，ADAR包括人脱氨酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

应用腺苷脱氨酶使用寡核苷酸编辑靶RNA是本领域已知的。Montiel-Gonzalez等人(PNAS 2013,110(45):18285–18290))描述了使用基因工程融合蛋白编辑靶RNA，该融合蛋白包含hADAR2蛋白的腺苷脱氨酶结构域，与识别boxB RNA发夹序列的噬菌体λN蛋白融合。已除去hADAR2的天然dsRNA结合结构域以消除天然ADAR的底物识别特性，并用λN蛋白的boxB识别结构域代替它。作者创造了一种反义寡核苷酸，其包含与用于编辑的靶序列互补的‘引导RNA’部分，该部分与用于通过N-结构域-脱氨酶融合蛋白进行序列特异性识别的boxB部分融合。通过这样做，巧妙地显示引导RNA寡核苷酸如实地将腺苷脱氨酶融合蛋白导向靶位点，导致引导RNA导向的对靶RNA的位点特异性A至I编辑。Montiel-Gonzalez等人(2013)公开的引导RNA长度超过50个核苷酸。该方法在治疗环境中的缺点是需要一种融合蛋白，该融合蛋白由噬菌体λN蛋白的boxB识别结构域基因融合至截短的天然ADAR蛋白的腺苷脱氨酶结构域组成。它需要用融合蛋白转导靶细胞，这是一个主要障碍，或者用编码工程化腺苷脱氨酶融合蛋白的核酸构建体转染靶细胞用于表达。当要在多细胞生物体中实现编辑时，比如在针对人类疾病以纠正遗传病症的治疗中，后一种要求构成不小的障碍。

Vogel等人(2014.Angewandte Chemie Int Ed 53:267-271)公开了对编码eCFP和因子V Leiden的RNA的编辑，其使用苄基鸟苷取代的引导RNA和基因工程化融合蛋白，该融合蛋白包含ADAR1或2的腺苷脱氨酶结构域(缺乏dsRNA结合结构域)基因融合至SNAP-标签结构域(工程化的O6-烷基鸟苷-DNA-烷基转移酶)。虽然基因工程化的人工脱氨酶融合蛋白可以通过其SNAP标签结构域靶向培养中的HeLa细胞的靶RNA中所需的编辑位点，该SNAP标签结构域通过5’-末端O6-苄基鸟苷修饰与引导RNA共价连接，但该系统具有与Montiel-Gonzalez等人(2013)描述的基因工程化ADAR类似的缺点，因为不清楚如何应用该系统而不必首先对ADAR进行基因修饰并随后转染或转导携带靶RNA的细胞，以向细胞提供这种基因工程化蛋白。显然，该系统不易适用于人类，例如在治疗环境中。

Woolf等人(1995.Proc Natl Acad Sci USA 92:8298-8302)公开了一种更简单的方法，其使用相对长的单链反义RNA寡核苷酸(长度为25-52个核苷酸)，其中较长的寡核苷酸(34-聚体和52聚体)由于靶RNA和杂交寡核苷酸的双链特性，能够促进靶RNA通过内源性ADAR的编辑。Woolf等人(1995)的与靶RNA序列100％互补的寡核苷酸似乎通过显微注射仅在细胞提取物或两栖动物(非洲爪蟾)卵母细胞中起作用，并且严重缺乏特异性：靶RNA链中与反义寡核苷酸互补的几乎所有腺苷都被编辑。对长度为34个核苷酸的寡核苷酸(其中每个核苷酸包含2’-O-甲基修饰)进行测试并且在Woolf等人(1995)中显示无活性。为了提供针对核酸酶的稳定性，还对在5’-和3’-末端5个核苷酸处用经2’-O-甲基修饰的硫代磷酸酯核苷酸修饰的34-聚体RNA进行了测试。显示该寡核苷酸的中心未修饰区域能够促进靶RNA通过内源ADAR的编辑，末端修饰提供针对外切核酸酶降解的保护。Woolf等人(1995)没有实现靶RNA序列中特定靶腺苷的脱氨基作用。与反义寡核苷酸中未修饰核苷酸相对的几乎所有腺苷都被编辑(因此，如果反义寡核苷酸的5’-和3’-末端5个核苷酸被修饰，则与中心未修饰区域中的核苷酸相对的几乎所有腺苷都被编辑，或者，如果没有核苷酸被修饰，则靶RNA链中的几乎所有腺苷都被编辑)。ADAR作用于任何双链RNA(dsRNA)。通过有时称为“混杂编辑”的过程，酶将编辑dsRNA中的多个腺苷。因此，需要避免这种混杂编辑并且仅靶向靶RNA序列中的特定腺苷的方法和手段。Vogel等人(2014)表明，通过在寡核苷酸中与不应编辑的腺苷相对的位置使用2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且与靶RNA上被特异性靶向的腺苷直接相对地使用非修饰核苷酸，能够抑制这种脱靶编辑。然而，在不使用与反义寡核苷酸特异性形成共价键的重组ADAR酶的情况下，未显示发生靶核苷酸上的特异性编辑效应。

WO 2016/097212公开了用于RNA的靶向编辑的反义寡核苷酸(AON)，其中AON的特征在于与靶RNA序列互补的序列(其中称为“靶向部分”)和存在茎-环结构(其中称为“募集部分”)。这种寡核苷酸称为“axiomer AON”或“自环AON”。募集部分用于将存在于细胞中的天然ADAR酶募集至通过靶序列与靶向部分杂交形成的dsRNA。由于募集部分，不需要缀合的实体或存在修饰的重组ADAR酶。WO 2016/097212描述到募集部分是模拟天然底物(例如GluB受体)或已知由ADAR酶的dsRNA结合区识别的Z-DNA结构的茎-环结构。茎-环结构可以是两个单独的核酸链形成的分子间茎-环结构，或在单个核酸链内形成的分子内茎-环结构。如WO 2016/097212中所述的募集部分的茎-环结构是分子内茎-环结构，其在AON本身内形成，并且能够吸引ADAR。

使用寡核苷酸的另一种编辑技术称为CRISPR/Cas9系统，但该编辑复合物作用于DNA。后一种方法具有与上述工程化ADAR系统相同的缺点，因为它需要将CRISPR/Cas9酶或编码其的表达构建体与引导寡核苷酸一起共递送至靶细胞。

鉴于上述情况，仍然需要能够利用内源性细胞通路和天然可用的ADAR酶来特异性编辑哺乳动物细胞中、甚至整个生物中的内源性核酸的新技术和化合物，而没有现有技术的方法相关的问题。

发明内容

本发明通过提供一种RNA编辑的靶向方法，消除了根据现有技术的方法的缺点，其在一个实施方式中使用一种反义寡核苷酸(AON)，该AON能够在细胞、优选人细胞中与靶RNA序列形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶使靶RNA序列中的靶腺苷脱氨基，所述AON包含3个连续核苷酸的中心三联体，其中与靶腺苷直接相对的核苷酸是中心三联体的中间核苷酸，其中中心三联体的中间核苷酸不具有2’-O-甲基修饰；并且其中所述中心三联体中的1、2或3个核苷酸包含糖修饰和/或碱基修饰和/或磷酸二酯修饰(比如(二)硫代磷酸酯或(二)氨基磷酸酯)。本发明的AON优选在其基本结构中是单链寡核糖核苷酸。

本发明还涉及根据本发明的AON，其用于治疗或预防遗传性疾病，该遗传性疾病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合征、进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、肺慢性阻塞性疾病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker肌肉萎缩症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病(Fabry disease)、因子V莱顿相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇病(Gaucher's Disease)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、血友病、遗传性血细胞色素沉着症、Hunter综合征(Hunter Syndrome)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington's disease)、炎性肠病(IBD)、遗传性多聚凝集综合征、莱伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合征、Lynch综合征、Marfan综合征、粘多糖贮积症、肌肉萎缩症、I型和II型强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、A型、B型和C型Niemann-Pick病、NY-eso1相关癌症、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮酸尿症、庞佩氏病(Pompe's disease)、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病比如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病(Sandhoff Disease)、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞血症、脊髓性肌萎缩症、斯特格氏病(Stargardt'sDisease)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs Disease)、Usher综合征、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征和癌症。

本发明还涉及对细胞中靶RNA序列中存在的特定的靶腺苷进行脱氨基化的方法，所述方法包括以下步骤：提供具有根据本发明的AON的所述细胞；使所述AON被细胞摄取；使所述AON退火(anneal)至靶RNA序列；使包括野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的哺乳动物ADAR酶将所述靶RNA序列中的所述靶腺苷脱氨基化成肌苷；和任选地在RNA序列中鉴别所述肌苷的存在。

在本发明的优选实施方式中，靶RNA序列编码CFTR(例如编辑1784G>A突变)、CEP290(例如编辑c.2991+1655A>G突变)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT；例如编辑9989G>A突变；或1096G>A突变)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(GNAQ；例如编辑548G>A突变)、或LRRK2(例如编辑G6055突变)，或其中靶RNA由IDUA基因编码(例如编辑c.1205G>A(W402X)突变)。

附图说明

图1示出反义寡核苷酸(AON；上面的链)与人突变的SERPINA1靶RNA序列(下面的链；SEQ ID NO：1)的互补性，其中靶腺苷A为粗体。ADAR60系列的AON序列在这里示出为3’到5’(与图2所示的方向不同)，AON的中心三联体带下划线。如所提供的实例中所述被修饰的中心三联体中的位置由字母YXZ表示。

图2示出本文公开的用于测试RNA编辑和稳定性评估的反义寡核苷酸(AON)和正义寡核苷酸(SON)。独立序列具有所示的SEQ ID NO。具体的YXZ碱基修饰在第三栏中提及。小写的核苷酸是RNA和2’-O-甲基修饰的。大写的核苷酸是RNA，除了括号内的[NNN]核苷酸是DNA。描述为(nnn)的小写核苷酸是2’-氟代RNA修饰的核苷酸。描述为<nnn>的小写核苷酸是2’-NH₂ RNA修饰的核苷酸。描述为{N}的核苷酸是解锁核酸(UNA)。idT表示3’反向T修饰，其增强抗降解性并且还阻止AON的3’末端在PCR扩增期间延伸。*＝硫代磷酸酯键；’＝3’-亚甲基膦酸酯键；”＝5’-亚甲基膦酸酯键；^＝3’-氨基磷酸酯键；#＝2’-5’磷酸二酯键。

图3示出AON的核酸酶抗性，在含有FBS的培养基(由RX表示)中孵育后通过变性凝胶电泳测定。将对照在PBS(CTL)中孵育。AON的标识(ADAR60-1至ADAR60-21)显示在组(panel)上方(缩写为60-1至60-21，另见图2)。较低的条带(由箭头指示)是由AON的裂解产生的降解产物，而较高的条带是全长AON。标记物(Marker)泳道含有低分子量标记物，10-100nt(Affymetrix)，具有14个5nt(10nt-50nt)和10nt(50nt-100nt)增量的寡核苷酸片段。对于降解的易感性由条带的比率表示，较低产物的较高普遍性表明较低的稳定性。

图4示出AON(上面的链)与人突变的IDUA靶RNA序列(下面的链；SEQ ID NO：2)的互补性，其中靶腺苷A为粗体。ADAR68系列的AON序列在这里示出为3’到5’(与图2所示的方向不同)，AON的中心三联体带下划线。如所提供的实例中所述被修饰的中心三联体中的位置由字母XXY表示。

图5示出针对突变的小鼠Idua基因(Hurler模型)的寡核苷酸ADAR65-1、-18、-20、-21和-22的稳定性，在含有FBS的培养基中孵育后通过变性凝胶电泳测定。将对照在PBS中孵育。箭头指向降解产物。上面的条带是全长AON。标记物泳道(M)含有低分子量标记物，10-100nt(Affymetrix)，具有14个5nt(10nt-50nt)和10nt(50nt-100nt)增量的寡核苷酸片段。AON对两种不同时间孵育(2h和18h)降解的敏感性由条带的比率表示，较低产物的较高普遍性表明稳定性降低。

图6示出另外的ADAR65寡核苷酸的稳定性，在PBS或FBS中孵育2h或18h后通过变性凝胶电泳测定，类似于图5。

图7示出四种ADAR93寡核苷酸的稳定性，其中ADAR93-2在中心三联体中含有未修饰的RNA，而相反地，其它三种(ADAR93-6、-8和-9)在中心三联体中含有两个或三个DNA核苷酸。其它修饰的差异如图2所示。在PBS、DMEM+15％FBS、单供体人脑脊液(CSF)和混合性别人肝溶酶体(Lyso)中孵育2h、24h或3天后，通过变性凝胶电泳测定稳定性。

图8示出在使用具有过表达ADAR2的HEK293细胞裂解物和SERPINA1突变体ssRNA靶标的体外编辑测定后，通过RT-PCR产生的PCR片段的Sanger测序分析。使用ADAR60-1(A)和ADAR60-15(B)，参见图2。阴性对照是用ADAR60-15但不用细胞裂解物的相同测定(C)，以及在不存在AON的情况下使用HEK293细胞裂解物(具有ADAR2过表达)的相同测定(D)。所有组上方的序列均为SEQ ID NO：35。

图9示出从稳定表达GFP W57X构建体并转染有ADAR2并分别转染有两种寡核苷酸(ADAR59-2和ADAR59-10)的细胞进行RT-PCR扩增的GFP RNA的测序结果，其中ADAR59-10的中间三联体中腺嘌呤是2-氨基嘌呤。ADAR59-2没有这种修饰，参见图2。它示出这种特殊修饰对RNA编辑效率的增强作用。两组上方的序列是SEQ ID NO：36。

图10示出通过从分离自小鼠HEPA1-6细胞(A)和CMT64细胞(B)的RNA经由cDNA产生的PCR产物的测序结果，上述细胞或未转染(NT，左图)，或用非靶向对照寡核苷酸转染(NTO，中图)或用ADAR94-1转染(右图)以编辑小鼠Snrpa mRNA的终止密码子。在箭头指示的位置观察到明显高于背景水平的RNA编辑。A和B中所有三组上方的序列是SEQ ID NO：37。

图11示出从分离自小鼠HEPA1-6细胞的RNA经由cDNA产生的PCR产物的测序结果，该细胞用单独的ADAR94-1转染，或ADAR94-1与SON2组合转染，如图10中所述。两组上方的序列是SEQ ID NO：38。

图12示出从分离自原代小鼠肺细胞的RNA经cDNA产生的PCR产物的测序结果，该原代小鼠肺细胞或未转染(NT，左图)，用与保护性正义寡核苷酸SON2退火的对照寡核苷酸(ADAR87-1)转染(中图)，或用与SON2退火的靶向小鼠Snrpa RNA的寡核苷酸(ADAR94-1)转染(右图)。在用ADAR94-1+SON2转染后，观察到G信号的明显增加(箭头指示的位置)，这表明在离体原代细胞中，内源性ADAR对内源性靶标能够实现高度特异性和显著的RNA编辑。所有三组上方的序列是SEQ ID NO：37，与图10相同。

图13示出AON的编辑能力，作为通过ddPCR测量的总靶RNA中被编辑的mRNA的百分比。NT：未处理。

图14示出在α-L-艾杜糖苷酶测定中测量的酶活性(作为标准化为总蛋白质浓度的相对荧光单位)，该测定是存在wt Idua mRNA的指示，wt Idua mRNA是用编辑RNA的AON转染后RNA编辑的结果。携带突变的Idua基因的小鼠胚胎成纤维细胞用也表达小鼠突变的Idua基因的表达质粒转染，随后用所示的AON转染。对于每种AON，示出两次重复测量的平均活性和标准偏差。NT：未转染AON。

具体实施方式

如上所述，WO 2016/097212公开了AON用于靶向的RNA编辑，其中AON的特征在于“靶向部分”和“募集部分”。WO 2016/097212描述了募集部分是模拟天然底物(例如GluB受体)或已知由ADAR酶的dsRNA结合区识别的Z-DNA结构的茎-环结构。如WO2016/097212中所述的募集部分的茎-环结构是分子内茎-环结构，其在AON本身内形成，并且能够吸引ADAR。由于这种结构，非常长的AON存在潜在的缺点，如制造、稳定性、副作用方面的问题，并且它们比更短形式的AON更昂贵。

本发明的AON不包含如WO 2016/097212中所述的募集部分。本发明的AON不包含能够形成分子内茎-环结构的部分。本发明的AON较短，这使得它们生产成本更低，更易于使用并且更易于制造。此外，它们没有在细胞中潜在地螯合ADAR酶使其失去正常功能的缺点。出乎意料的是，发现与靶RNA互补以使存在于AON与之互补的靶RNA序列中的靶腺苷脱氨基的AON——但重要的是其缺乏如上所述的募集部分——似乎仍然能够利用存在于细胞中的ADAR酶编辑靶腺苷。在一个优选的方面，本发明的AON包含靶腺苷位置的一个错配，其中相对的核苷酸是胞苷。此外，当尿苷与靶腺苷相对(实际上不会是错配)时，AON能够引起靶腺苷的脱氨基作用。PCT/EP2017/065467描述了另外的错配(导致形成的dsRNA中的所谓‘凸起(bulge)’，这由AON中不与靶RNA形成根据Watson-Crick碱基配对规则的完美的碱基对的核苷酸引起)是可容许的，在某些情况下是优选的，但对于靶RNA序列的特异性靶向编辑不是必需的。AON中的凸起数(当它与其RNA靶序列杂交时)可以是一个(通常是在靶腺苷位置形成的凸起)或更多，这取决于AON的长度。另外的诱发凸起的错配可以是靶腺苷的上游以及下游。凸起可以是单错配凸起(由一对错配的碱基对引起)或多错配凸起(由多于一对连续的错配碱基对引起，优选两对或三对连续的错配碱基对)。

与WO 2016/097212和PCT/EP2017/065467中描述的寡核苷酸相比，根据本发明的AON具有某些优点，因为不需要发夹或茎-环结构，这允许本发明的AON(相当)更短。WO2016/097212中所述的寡核苷酸具有螯合细胞中存在的ADAR酶的潜在风险。在该上下文中，螯合(sequestering)意味着即使在寡核苷酸的靶向部分和靶RNA之间不存在dsRNA复合物的形成的情况下，天然ADAR蛋白也可以与寡核苷酸结合。由于存在分子内茎-环结构而导致在不存在靶RNA序列的情况下ADAR与寡核苷酸的这种直接结合在使用本发明的AON时不会发生，本发明的AON不包含能够形成分子内茎-环结构的部分。存在许多其中优选避免发夹和/或(茎-)环结构存在的情况。

本发明的一个重要方面是AON包含一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸。因此，AON的单个核苷酸可具有一个或多于一个糖修饰。在AON内，一个或多个核苷酸可以具有这样的糖修饰。

本发明的一个重要方面是本发明的AON中与需要编辑的核苷酸相对的核苷酸不含有2’-O-甲基修饰(本文和其它地方通常称为2’-OMe基团，称为2’-O-甲基化，或称为2’-O-甲基)。优选地，直接位于该核苷酸的3’和5’的核苷酸(中心三联体中的“相邻核苷酸”)也缺乏这样的化学修饰，尽管认为可以容许相邻核苷酸的一个或两个可含有2’-O-烷基(如2’-O-甲基)。中心三联体的一个或两个相邻核苷酸或全部三个核苷酸可以是2’-OH或相容的取代(如本文所定义)。

本发明的AON的另一个重要方面是它不具有允许AON本身在生理条件下折叠成分子内发夹或(茎-)环结构的其它类型(在本文中也称为“自环化”或“自环”)的部分(其与靶序列或包含靶腺苷的区域不互补)，其可能潜在地充当螯合ADAR的结构。在一个优选的方面，本发明的单链AON与靶RNA完全互补，尽管它可以任选地在几个位置错配、尤其在靶腺苷的位置错配。

与Vogel等人(2014)相比，本发明的优选AON不包括5’-末端O6-苄基鸟苷或5’-末端氨基修饰，并且不与SNAP-标签结构域(工程化的O6-烷基鸟苷-DNA-烷基转移酶)共价连接。SNAP-标签结构域衍生自人DNA修复蛋白O6-烷基鸟苷-DNA-烷基转移酶(AGT)，并且可以使用O6-苄基鸟苷衍生物在活细胞中共价标记。Vogel等人(2014)公开了总长度为20或17个核苷酸的引导RNA，其中5’末端处的前三个核苷酸不与靶RNA序列结合，但将引导RNA与SNAP-标签结构域连接。因此，与靶RNA序列结合的引导RNA部分的长度为14或17个核苷酸。Vogel等人(2014)还公开了相同长度的引导RNA，其具有5’-末端氨基修饰而不是5’-末端O6-苄基鸟苷修饰，但是仅检测到非常少的、或没有靶RNA序列的脱氨基。在一个实施方式中，本发明的AON包含与靶RNA序列的0、1、2或3个错配，其中单个错配可包含多个连续核苷酸。

类似地，与Montiel-Gonzalez等人(2013)相比，本发明的优选AON不包含boxB RNA发夹序列。Montiel-Gonzalez等人(2013)使用的boxB RNA发夹序列是17个核苷酸的短链RNA，其由噬菌体λN蛋白识别。噬菌体早期操纵子的下游基因的转录需要称为nut的启动子近端元件。该位点在RNA的形式中以顺式起作用以组装转录抗终止复合物，其由噬菌体λN蛋白和宿主因子组成。nut-位点RNA包含称为boxB的小茎-环结构。boxB RNA发夹序列在本领域中已知为具有形成发夹(茎环)结构潜力的中断的回文结构。其序列在编码不同基因组特异性N同源物的噬菌体λ的亲属之间变化。

Vogel等人(2014)和Montiel-Gonzalez等人(2013)都没有使用存在于细胞中的哺乳动物ADAR酶，其中ADAR酶包含其在野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域。Vogel等人(2014)使用包含融合至SNAP-标签结构域的ADAR1或2的腺苷脱氨酶结构域的基因工程化融合蛋白，并且Montiel-Gonzalez等使用包含融合至噬菌体λN蛋白的boxB识别结构域的hADAR2蛋白的腺苷脱氨酶结构域的基因工程化融合蛋白。与现有技术相比，本发明的AON使用存在于细胞中的哺乳动物ADAR酶，其中ADAR酶包含其在野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域。因此，不需要将boxB RNA发夹序列、5’-末端O6-苄基鸟苷、5’-末端氨基修饰或SNAP-标签结构域掺入本发明的AON中，以允许募集ADAR。因此，根据本发明的AON具有优于Vogel等人(2014)和Montiel-Gonzalez等人(2013)中所述的寡核苷酸的某些优点。根据本发明的AON能够利用内源性细胞通路和天然可用的ADAR酶来特异性编辑靶RNA序列中的靶腺苷。在一个实施方式中，本发明的AON不与人O6-烷基鸟苷-DNA-烷基转移酶共价连接。优选地，本发明的AON不与多肽共价连接。在本发明的AON的另一方面，AON不具有5’帽。在真核生物中，5’帽由通过5’至5’三磷酸键与RNA连接的鸟苷核苷酸组成。该鸟苷在7位被甲基化，并且称为7-甲基鸟苷。

本发明的AON能够使靶RNA序列中的特定靶腺苷核苷酸脱氨基。因此，理想地，仅一个腺苷脱氨基。或者，例如当靶腺苷彼此非常接近时，1、2或3个腺苷核苷酸脱氨基。然后，需要在单个AON中存在两个或多个“中心三联体”，并且根据距离，可以使用这些。然而，如果距离太大而不能通过单个AON覆盖多个靶腺苷，则AON优选仅包含一个与指定的单个靶腺苷相对的中心三联体。

综合考虑本发明的AON的特征：不需要修饰的重组ADAR表达；不需要连接到AON的共轭实体；或不需要存在与靶RNA序列不互补的长募集部分。除此之外，本发明的AON确实允许存在于靶RNA序列中的靶腺苷特异性脱氨基成为肌苷，其通过包含如野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的天然ADAR酶进行，而没有在dsRNA复合物的其它地方混杂编辑的风险。

将胞苷脱氨酶募集到靶位点的工作方式与腺苷脱氨酶hADAR1和hADAR2的工作方式相同。然而，胞苷脱氨酶具有不同的结合要求并且识别其靶RNA序列中决定胞苷编辑的不同结构。一种得到很好研究的胞苷脱氨酶是人Apobec1。使用寡核苷酸构建体靶向编辑位点并募集存有的、天然存在的编辑实体进行RNA编辑的一般原理对于胞苷脱氨酶保持相同，并且是本文公开和要求保护的发明的一部分。

对ADAR酶的天然靶标的分析表明，这些通常包括形成由ADAR1或2编辑的RNA螺旋的两条链之间的错配。已经表明这些错配增强了编辑反应的特异性(Stefl等人2006.Structure 14(2):345-355；Tian等人2011.Nucleic Acids Res 39(13):5669-5681)。在AON和靶RNA之间配对/错配核苷酸的最佳模式的表征对于开发基于ADAR的有效AON疗法似乎也是至关重要的。

本发明的AON的另一个改善特征是在预定点处使用特定核苷酸修饰以确保稳定性以及适当的ADAR结合和活性。这些改变可以变化，并且可以包括AON主链中、核苷酸的糖部分中以及核碱基或磷酸二酯键中的修饰。它们也可以在整个AON序列中可变地分布。可能需要特定修饰来支持ADAR酶的RNA结合结构域内的不同氨基酸残基的相互作用，以及脱氨酶结构域中的相互作用。例如，在AON的某些部分可以容许核苷酸之间的硫代磷酸酯键或2’-O-甲基修饰，而在其它部分，应该避免它们，以免破坏酶与磷酸酯和2’-OH基团的关键相互作用。这些设计规则的一部分由ADAR2的已公布结构指导，而其它设计则必须根据经验进行限定。对于ADAR1和ADAR2可能存在不同的偏好。还应该选择修饰使得它们防止AON的降解。

在靶序列对于ADAR编辑非最佳时，特异性核苷酸修饰也可能是增强对底物RNA的编辑活性所必需的。以前的工作已经确定某些序列环境更适合编辑。例如，靶序列5’-UAG-3’(在中间具有靶标A)含有ADAR2最偏好的最近邻核苷酸，而5’-CAA-3’靶序列则不被偏好(Schneider等人2014.Nucleic Acids Res 42(10):e87)。最近对ADAR2脱氨酶结构域的结构分析暗示了通过仔细选择与靶三核苷酸相对的核苷酸来增强编辑的可能性。例如，与相对链上的3’-GCU-5’序列配对的5’-CAA-3’靶序列(在中间形成A-C错配)不被偏爱，因为鸟苷碱基与ADAR2的氨基酸侧链在空间上冲突。然而，这里假定较小的核碱基(比如肌苷)可能更好地适合该位置而不引起空间冲突，同时仍保留与相对胞嘧啶的碱基配对潜力。能够增强次优序列活性的修饰包括使用增加AON灵活性的骨架修饰，或相反地，使其成为有利于编辑的构象。

本文使用的术语定义

本文使用和定义的‘中心三联体’是靶RNA中与靶腺苷相对的三个核苷酸，其中中心三联体中的中间核苷酸与靶腺苷直接相对。中心三联体不必位于AON的中间(中心)，它可以位于更适合某个靶标的AON的偏3’以及5’端。因此，当涉及化学修饰和靶向靶腺苷时，这方面的中心具有更多的处于催化活性中心中的三联体的含义。还应注意，AON有时描述为3’至5’，尤其是当靶序列从5’至3’显示时。然而，每当在本文中讨论AON内的核苷酸的顺序时，它总是从AON的5’至3’。例如，ADAR60-1中的中心三联体的第一个核苷酸是5’-UCG-3’三联体的U。该位置也可以根据AON内的特定核苷酸表示，同时仍然坚持5’至3’方向性，在这种情况下，所述核苷酸的5’的其它核苷酸标记为负的位置，并且其3’的那些标记为正的位置。例如，中心三联体中的C是与靶腺苷相对的核苷酸(在0位置)，在这种情况下U将是-1核苷酸，然后G将是+1核苷酸等。

本文概述并且在本文公开的AON的大多数实例中，中心三联体外的核苷酸是2’-O-甲基修饰的。然而，这不是本发明的AON的要求。在那些核苷酸中使用2’-O-甲基化确保AON的那些部分的适当稳定性，但也可应用其它修饰，例如2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰。

本文使用的术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和“次黄嘌呤”(肌苷中的核碱基)是指核碱基本身。

术语“腺苷”、“鸟苷”、“胞苷”、“胸苷”、“尿苷”和“肌苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的核碱基。

术语“核苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的核碱基。

术语“核苷酸”是指各自的核碱基-(脱氧)核糖基-磷酸连接体，以及核糖部分或磷酸基团的任何化学修饰。因此，该术语将包括含有锁核糖基部分(包含2’-4’桥，其包含亚甲基或本领域公知的任何其它基团)的核苷酸，包括含有磷酸二酯、磷酸三酯、(二)硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯连接体等的连接体的核苷酸。

有时，术语腺苷和腺嘌呤、鸟苷和鸟嘌呤、胞嘧啶和胞苷、尿嘧啶和尿苷、胸腺嘧啶和胸苷、肌苷和次黄嘌呤可互换使用，指相应的核碱基、核苷或核苷酸。

有时，术语核碱基、核苷和核苷酸可互换使用，除非上下文明确要求不同。

每当提及“寡核苷酸”时，除非上下文另有规定，否则均指寡核糖核苷酸和脱氧寡核糖核苷酸。每当提及“寡核糖核苷酸”时，它可包括碱基A、G、C、U或I。每当提及“脱氧寡核糖核苷酸”时，它可包括碱基A、G、C、T或I。在优选的方面，本发明的AON是可包含化学修饰的寡核糖核苷酸。

每当提及寡核苷酸构建体中的核苷酸时，比如胞嘧啶，包括5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、吡咯并胞苷和β-D-葡糖基-5-羟基-甲基胞嘧啶；当提及腺嘌呤时，包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、3-脱氮腺苷、7-脱氮腺苷、8-叠氮基腺苷、8-甲基腺苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-脱氮鸟苷、N6-甲基腺嘌呤和7-甲基腺嘌呤；当提及尿嘧啶时，包括5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶和噻吩并尿嘧啶、二氢尿嘧啶、4-硫尿嘧啶和5-羟基甲基尿嘧啶；当提及鸟苷时，包括7-甲基鸟苷、8-氮杂-7-脱氮鸟苷、噻吩并鸟苷和1-甲基鸟苷。

每当提及核苷或核苷酸时，包括呋喃核糖衍生物，比如2’-脱氧、2’-羟基、2-氟核糖和2’-O-取代的变体如2’-O-甲基，以及其它修饰，包括2’-4’桥接变体。

每当提及寡核苷酸，两个单核苷酸之间的键可以是磷酸二酯键以及其修饰，包括磷酸二酯、磷酸三酯、(二)硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯连接体等。

术语“包括”涵盖“包含/含有”以及‘由......组成’，例如‘包括X’的组合物可仅由X组成，或者可包括另外的组份，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”是可选的，并且指，例如x+10％。

“基本上”一词并不排除“完全”，例如‘基本上不含Y’的组合物可完全不含Y。在相关的情况下，“基本上”一词可从本发明的定义中省略。

与核酸序列相关的术语‘下游’是指进一步沿着3’方向的序列；术语‘上游’是指相反。因此，在编码多肽的任何序列中，起始密码子在正义链中在终止密码子的上游，但是在反义链中在终止密码子的下游。

提及“杂交”，通常是指特异性杂交，并且排除非特异性杂交。使用本领域公知的技术，特异性杂交可以在选择的实验条件下进行，以确保探针和靶标之间的大多数稳定相互作用是探针和靶标具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的序列同一性。

本文使用的术语“错配”是指双链RNA复合物中不形成根据Watson-Crick碱基配对规则的完美的碱基对的相对核苷酸。错配碱基对是G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U碱基对。在一些实施方式中，本发明的AON包含0、1、2或3个错配，其中单个错配可包含数个连续的核苷酸。摆动碱基对是：G-U、I-U、I-A和I-C碱基对。

根据本发明的AON可几乎全部被化学修饰，例如通过向所有核苷酸提供2’-O-甲基化的糖部分(2’-OMe)。然而，与靶腺苷相对的核苷酸不包含2’-O-甲基修饰，并且在又一个优选方面，位于与靶腺苷相对的核苷酸侧翼的两个相邻核苷酸中的至少一个不包含2’-O-甲基修饰。完全修饰，其中AON中的所有核苷酸都具有2’-O-甲基修饰(包括中心三联体)，就RNA编辑而言，导致非功能性寡核苷酸，可能是因为它阻碍了靶位置处的ADAR活性。通常，通过提供具有2’-O-甲基的相对核苷酸，或通过提供鸟苷或腺苷作为相对碱基，可保护靶RNA中的腺苷免于编辑，因为这两个核碱基也能够减少相对腺苷的编辑。

在寡核苷酸领域中已知各种化学作用和修饰，其能够根据本发明容易地使用。核苷酸之间常规的核苷间键可通过磷酸二酯键的单-或二-硫醇化(thioation)来改变，分别产生硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。核苷间键的其它修饰是可能的，包括酰胺化和肽连接体。在一个优选的方面，本发明的AON在AON的最末端核苷酸(因此，优选在5’和3’端)之间具有一个、两个、三个、四个或更多个硫代磷酸酯键，这意味着在四个硫代磷酸酯键的情况下，最终的5个核苷酸相应地连接。本领域技术人员将理解，这种键的数量可对于每个末端进行变化，这取决于靶序列，或基于其它方面，比如毒性。

可通过用低级烷基(C1-4，比如2’-O-甲基)、烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、甲氧基乙基(2’-O-MOE)、-H(如在DNA中)或其它取代基取代2’-O部分来修饰核糖。2’-OH基团的优选取代基是甲基\甲氧基乙基或3,3’-二甲基烯丙基。后者因其膨松性而已知具有抑制核酸酶敏感性的特性，同时改善杂交效率(Angus&Sproat.1993.FEBS Vol.325,no.1,2,123-7)。或者，可应用锁核酸序列(LNA)，其包含核糖环内部的2’-4’分子内桥(通常是2’氧和4’碳之间的亚甲基桥)键。可修饰嘌呤核碱基和/或嘧啶核碱基以改变它们的特性，例如通过杂环的氨基化或脱氨基作用。精确的化学作用和形式可以取决于不同的寡核苷酸构建物以及不同的应用，并且可根据本领域技术人员的预想和偏好来解决。在本领域中，认为寡核苷酸中的4个或更多个连续DNA核苷酸(4个连续的脱氧核糖)产生所谓的gapmer，当与其RNA同源序列退火时，其诱导RNaseH切割靶RNA。根据本发明，通常尽可能避免RNaseH切割靶RNA。

根据本发明的AON长度通常应当大于10个核苷酸，优选大于11、12、13、14、15、16个核苷酸，再更优选大于17个核苷酸。在一实施方式中，根据本发明的AON的长度大于20个核苷酸。根据本发明的寡核苷酸的长度优选小于100个核苷酸，再更优选小于60个核苷酸。在一实施方式中，根据本发明的AON的长度小于50个核苷酸。在优选的方面，根据本发明的寡核苷酸包括18-70个核苷酸，更优选包括18-60个核苷酸，再更优选包括18-50个核苷酸。因此，在最优选的方面，本发明的寡核苷酸包括18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。

在本领域中已经知晓，RNA编辑实体(例如人ADAR酶)以不同的特异性对dsRNA结构进行编辑，其取决于若干因素。一重要的因素是构成dsRNA序列的两个链的互补程度。两条链的完美互补性通常导致hADAR的催化结构域以无判别力方式对腺苷进行脱氨基化，差不多作用于与其遇到的任何腺苷。通过保证dsRNA中的若干错配，推测其有助于以尚未清楚定义的方式将dsRNA结合结构域定位，可以增加hADAR1和2的特异性。此外，通过提供包括与要编辑的腺苷相对的错配的AON，可以加强脱氨基化反应自身。优选地，通过提供具有与要编辑的腺苷相对的胞苷的靶向部分，产生错配。作为另外可选的方式，相对于腺苷也可以使用尿苷，可以理解地，由于U和A成对，这将不会导致“错配”。靶标链中的腺苷一经脱氨基化，靶标链将会获得肌苷，其在大多数生化过程中被细胞的生化机制“读取”为G。因此，在A到I的转化之后，错配得以解决，因为I能够完美地与根据本发明的寡核苷酸构建物的靶向部分中相对的C进行碱基配对。在由于编辑解决错配之后，释放出底物，并从靶标RNA序列释放出寡核苷酸构建物-编辑实体复合物，其则变为可用于下游生化过程，例如剪接和翻译。

编辑靶RNA序列的所需特异性水平可取决于应用。按照本专利申请中的说明，本领域技术人员将能够根据其需要设计寡核苷酸的互补部分，并且通过一些反复试验，获得所需结果。

本发明的寡核苷酸通常将包含正常核苷酸A、G、U和C，但也可包括肌苷(I)，例如代替一个或多个G核苷酸。

为了防止靶RNA序列在与寡核苷酸构建物重叠的区域中发生不期望的腺苷的编辑，可以对寡核苷酸进行化学修饰。在本领域中已经显示，与靶RNA序列中腺苷相对的核苷的核糖基-部分的2’-O-甲基化大大降低了该腺苷被ADAR脱氨基化(Vogel等人2014)。这对于在治疗环境中使用这种AON是严重缺点，本发明的目的是至少部分地解决在AON中具有未修饰(这使得其易于降解)的RNA核苷酸的问题。

细胞中的RNA编辑分子通常是蛋白质性质的，例如在后生动物包括哺乳动物中发现的ADAR酶。优选地，编辑实体是酶，更优选腺苷脱氨基酶或胞苷脱氨基酶，再更优选腺苷脱氨基酶。最引人关注的之一是人ADAR、hADAR1和hADAR2，包括其任意同种型，例如hADAR1p110和p150。RNA编辑酶是本领域已知的，可以方便地针对其设计根据本发明的寡核苷酸构建物，包括作用于RNA的腺苷脱氨基酶(ADAR)，例如人或人细胞中的hADAR1和hADAR2，以及胞苷脱氨基酶。现有技术中已对人ADAR3(hADAR3)进行了说明，但据报道其不具有脱氨基酶活性。已知hADAR1以两种同种型存在；长的150kDa干扰素诱导型版本和较短的100kDa版本，其通过从常见的前mRNA的选择性剪接产生。所以，细胞中存在的150kDa同种型的水平可以受干扰素、特别是干扰素-γ(IFN-γ)影响。hADAR1通过TNF-α也是可诱导的。这便提供了开发联合疗法的机会，由此将干扰素-γ或TNF-α和根据本发明的寡核苷酸作为组合产品或者作为单独的产品，同时或者以任意顺序依次给予患者。某些疾病病症可能已经与患者某些组织中IFN-γ或TNF-α水平增加相符，产生进一步的机会以使得编辑对于患病组织更具有特异性。

本发明的AON中化学修饰的例子是糖部分的修饰，包括，通过糖(核糖)部分内的交联取代基(例如，如在锁定核酸LNA中那样)，通过将2'-O原子用具有以上指定长度的烷基(例如，2'-O-甲基)、炔基(2'-O-炔基)、烯基(2'-O-烯基)、烷氧基烷基(例如，甲氧基乙基2'-O-MOE)取代，等等。此外，骨架的磷酸二酯基可以通过硫代化、二硫代化、酰胺化等修饰，生成硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等核苷间键。核苷酸间键可以全部或部分地被肽键取代，以生成肽核酸(peptidonucleic acid)序列等。另外可选地，或者额外地，核碱基可以通过(脱)氨基化修饰，以生成肌苷或2'6'-二氨基嘌呤等。其他修饰可以是核苷酸胞苷部分中C5上的甲基化，以产生已知与CpG序列有关的潜在免疫原性特性。

在dsRNA复合物募集ADAR酶以将靶标RNA序列中的A脱氨基化成I的情形中，要编辑的腺苷与相对的核苷酸之间的碱基对、错配、凸起或摆动可以包括腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷残基，但优选胞苷残基。除了编辑位点相对的潜在错配以外(当不应用尿苷时)，AON的其余部分可以与靶标RNA完美地互补。但是，如本文中所示，在某些方面，本发明涉及包括有限数量的不完美匹配的AON。本领域普通技术人员将会理解，细胞内部编辑实体重新定向至其他靶标位点的程度可以通过改变根据本发明的寡核苷酸对于编辑分子识别结构域的亲和力来调节。通过一些试错和/或通过基于寡核苷酸与编辑分子识别结构域之间的结构相互作用的计算方法，可以确定精确的修饰。

额外地，或者另外可选地，募集和重新定向细胞中编辑实体的程度可以通过寡核苷酸的给药量(dosing)和剂量方案(dosing regimen)来调节。这可以由实验人员(在体外)或者临床医生确定，通常是在I期和/或II期临床试验中。本发明涉及真核生物、优选后生动物、更优选哺乳动物细胞中靶标RNA序列的修饰。原则上，本发明可以用于来自任意哺乳动物物种的细胞，但优选用于人细胞。

本发明可以用于来自任意器官例如皮肤、肺、心脏、肾、肝、胰腺、肠、肌肉、腺体、眼、大脑、血液等的细胞。本发明特别适合于与(人)受试者疾病状态有关的细胞、组织或器官中的序列进行修饰。这些细胞包括但不限于肺或胃肠道的上皮细胞、生殖器官的细胞、肌肉细胞、眼细胞、皮肤细胞、来自例如肝、肾、胰腺的器官和组织的细胞、免疫细胞、癌细胞、腺细胞、脑细胞等。本发明还可以用于并非在有机体中天然存在的哺乳动物细胞，例如，用于细胞系或者用于胚胎干(ES)细胞。本发明可以用于各种类型的干细胞，包括多能干细胞、全能干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。细胞可以位于体外或体内。本发明的一优势在于，它可以用于原位处于活的有机体中的细胞，但它也可以用于培养的细胞。在一些实施方式中，将细胞离体处理，然后引入到活的有机体中(例如，重新引入到其最初源自的有机体中)。本发明还可以用于编辑所谓的类器官内的细胞中的RNA序列。类器官可以认为是三维的体外产生的组织，但使用特定的条件驱使以产生独立的、分离的组织(例如，参见，Lancaster&Knoblich,Science 2014,vol.345no.6194 1247125)。在治疗环境中，它们是有益的，因为它们可以在体外获自患者的细胞，然后可以将类器官作为比起常规移植物排斥可能性更低的自体材料重新引入到患者中。因此，根据另一优选的实施方式，本发明可以在从取自患者的组织样品生长的类器官上实施(例如，取自其胃肠道；参见Sala等人J SurgRes.2009；156(2):205-12，以及Sato等人Gastroenterology 2011；141:1762-72)；一经根据本发明进行RNA编辑，可以将类器官或者处于类器官中的干细胞用于移植回患者体内，以改善器官功能。

要治疗的细胞通常会具有基因突变。突变可以是杂合的或纯合的。本发明将典型地用于修饰点突变，例如，N到A的突变，其中N可以是G、C、U(在DNA水平上为T)，优选为G到A的突变，或者N到C的突变，其中N可以是A、G、U(在DNA水平上为T)，优选U到C的突变。以下对含有特别关注的突变的基因进行讨论。但是，在一些实施方式中，通过将疾病相关的突变引入到细胞系或动物中，本发明以相反的方式使用，以提供所关注疾病的可用的研究工具。作为创建疾病模型的实例，人们可以提供一种寡核苷酸序列，其用于在人细胞中募集编辑活性，以在CEP290基因中产生突变，从而产生隐藏的剪接位点，形成莱伯氏先天性黑内障的形式(最常见的先天性儿童失明形式)的基础。还可以设想，靶向非突变序列用于RNA编辑，例如以改变特定靶RNA的剪接，使得该靶基因的突变形式以另一种方式翻译，从而缓解疾病。本领域技术人员知晓为各种目的修饰靶RNA的所有类型的可能性。

要通过RNA编辑恢复的突变可以在染色体或一些其他形式的DNA例如线粒体DNA、或者RNA包括前mRNA、核糖体RNA或线粒体RNA的水平上产生。要进行的改变可以是在细胞或受试者已感染的病原体的靶标RNA中，上述病原体包括真菌、酵母、寄生虫、动质体(kinetoplastids)、细菌、噬菌体、病毒等。随后，编辑可以在RNA水平上在这些细胞、受试者或病原体内部的靶标序列上进行。某些病原体例如病毒，将其核酸、DNA或RNA释放至感染宿主(细胞)的细胞中。其他病原体在感染的宿主中停留或循环。本发明的寡核苷酸构建物可以用于编辑在受感染的真核生物宿主细胞中存在的靶标RNA序列，或者编辑在真核生物宿主中存在或循环的病原体细胞内部的RNA序列，只要其中要进行编辑的细胞含有与向其施用的寡核苷酸构建物相容的编辑实体即可。

无意拘泥于理论，据信通过hADAR1和hADAR2进行的RNA编辑在细胞核中在转录或剪接过程中在初级转录物上发生，或者在细胞质中发生，其中例如可以对成熟mRNA、miRNA或ncRNA进行编辑。已知编辑酶的不同同种型定位不同，例如，hADAR1 p110主要发现在细胞核中，hADAR1 p150在细胞质中。据信通过胞苷脱氨基酶进行RNA编辑在mRNA水平上进行。并不排除成熟mRNA中线粒体RNA密码子或非编码序列的编辑。

通过使用能够靶向要编辑的位点、并募集位于细胞中的RNA编辑实体以引起编辑反应的寡核苷酸，本发明用于在真核生物细胞中的靶标RNA序列中产生变化。优选的编辑反应是腺苷脱氨基化和胞苷脱氨基化，其分别将腺苷转化成肌苷和将胞苷转化成尿苷。变化可以位于靶标RNA的5'或3'未翻译区中、(隐蔽)剪接位点中、外显子中(通过改变外显子剪接沉默子或增强子，通过引入或除去启动或终止密码子，改变从靶标RNA翻译的蛋白质中的氨基酸、密码子使用或剪接行为)、内含子中(通过改变内含子剪接沉默子或内含子剪接增强子、分支点，改变剪接)、及通常是在影响RNA稳定性、结构或功能的任意区域中。靶标RNA序列可以包括人们可能希望改正或改变的突变，例如点突变(转换或颠换)。另外可选地，靶标RNA序列有意地突变成产生变化的表型(或者基因型，在基于RNA的有机体例如RNA病毒的情形中)，其中之前没有突变。例如，可以使得细胞系或动物在靶标RNA序列中携带变化(突变)，其可以用于检验中，或者用作(动物、类器官等)模型系统以研究疾病、针对疾病的测试实验化合物等。根据本发明的寡核苷酸构建物和方法可以用于高通量筛选系统(阵列形式)，用以产生具有大量各种各样靶标RNA的细胞库，例如，其编码大量各种各样的蛋白质同种型，用于进一步实验，包括化合物筛选、蛋白质改造等。靶标RNA可以是任何细胞或病毒RNA序列，但通常是具有蛋白质编码功能的前mRNA或mRNA。

单纯出于方便参考的目的，而无意于限制本发明，提供表1以说明可以由通过本发明的寡核苷酸导向的腺苷脱氨基酶编辑引起的可能的密码子变化。具体地，表1不应当解释成将本发明的应用限于任何RNA中的编码序列；如已经指出，本发明可以在任何包括腺苷的RNA靶标上实施，无论腺苷是在编码区、内含子、非编码外显子(例如5'-或3'未翻译区)中还是在miRNA、tRNA、rRNA等中。为了避免关于应用广泛性的误解，从编码角度而言无关紧要的(“沉默”)的变化仍可以改变某些蛋白质的基因表达，因为对于相同的氨基酸来说，一些密码子相比于其他可以更加优选，例如，可以导致不同的转录稳定性或翻译效率，造成编码的蛋白质变得比没有变化时的丰度更高或更低。

表1

使用根据本发明的寡核苷酸所编辑的特别令人关注的靶标腺苷是氨基酸残基的密码子的一部分，上述氨基酸残基定义了关键的功能或特性，例如催化位点，其他蛋白质的结合位点，底物的结合，定位结构域，用于共翻译或翻译后修饰例如糖基化、羟基化、豆蔻酰化，通过蛋白酶进行蛋白质切割(以使蛋白质成熟和/或作为分子内路径的一部分)等。

许多遗传病是由G到A的突变造成的，这些疾病是优选的目标疾病，因为在突变的靶标腺苷处进行的腺苷脱氨基化会将突变逆转成野生型。但是，逆转成野生型并非总是必然得到有益效果。如果野生型核苷酸是G以外的其他核苷酸，在目标中将A修饰成G也可以是有益的。在某些情形中，这一点可以预测是该种情况，在其他情形中，这一点需要一些测试。在某些情形中，将靶标RNA中的A修饰成G(其中野生型不是G)可能是沉默的(不翻译成不同的氨基酸)，或者是不重要的(例如，氨基酸被置换，但其构成不破坏蛋白质结构和功能的保守置换)，或者氨基酸是具有一定变化稳健性(robustness)的功能性结构域的一部分。如果根据本发明进行编辑造成的A到G的转变是在非编码RNA或者RNA的非编码部分中，结果也可以是无关紧要的，或者严重性比原始突变要低。本领域普通技术人员将会认识到，本发明的应用性非常广泛，甚至并不限于疾病的预防或治疗。本发明还可以用于甚至即便是或者具体地当这些修饰导致患病状态时，例如在细胞或非人动物模型中，对转录物进行修饰以研究其效果。

可以用根据本发明的寡核苷酸预防和/或治疗的遗传病的优选例子是其中靶标RNA中的一个或多个腺苷的修饰将带来(潜在)有益变化的任何疾病。

含有特别关注的突变的、作为根据本发明的潜在靶标RNA序列的转录RNA序列包括，但不限于，从以下转录者：CFTR基因(囊性纤维化跨膜转导调节物)、肌营养不良蛋白、亨廷顿蛋白(huntingtin)、神经纤维素1、神经纤维素2、血红蛋白的β-球蛋白链、CEP290(中心体蛋白质290kDa)、β-氨基己糖苷酶A的HEXA基因、和对称作Usher综合征的遗传性失明形式有责任的任一种Usher基因(例如，编码Usherin的USH2B)。下文进一步列出更加广泛的列表。靶标序列将由此选择，寡核苷酸构建物将包括所需的修饰以对突变进行改正。

CF突变领域的技术人员认识到，CFTR基因中1000-2000个突变是已知的，包括R117H、G542X、G551D、R553X、W1282X和N1303K。

通常，可以使用根据本发明的寡核苷酸构建物逆转的任意靶标RNA中的突变，在腺苷脱氨基酶募集的情形中是G到A的突变，在胞苷脱氨基酶募集的情形中是U到C的突变，可以由此设计寡核苷酸构建物。可以使用根据本发明的寡核苷酸构建物靶向的突变还包括C到A、U到A(在DNA水平上为T到A)(在募集腺苷脱氨基酶的情况下)、以及A到C和G到C突变(在募集胞苷脱氨基酶的情况下)。尽管在后一种情形中RNA编辑可能不必要将突变恢复成野生型，编辑的核苷酸可以导致相对于原始突变的改善。例如，导致框内终止密码子的突变——在翻译时导致截短的蛋白质——可以变成编码如下氨基酸的密码子：该氨基酸不是在该位置处的初始氨基酸，但其产生具有至少一些功能性、至少比截短的蛋白质功能性更多的(全长)蛋白质。

靶标序列对于真核生物、优选哺乳动物、更优选人细胞是内源性的。因此，例如，靶标序列不是在细胞史中在某些点处人工引入的转基因或标记基因，而是细胞中天然存在的基因(无论是突变还是非突变形式)。

本发明并不限于改正突变，因为通过应用根据本发明的寡核苷酸，其可以反过来用于将野生型序列变化成突变的序列。修饰野生型腺苷可能有利的一个例子是导致跳过外显子，例如通过对正好是剪接所述外显子所需的分支位点的腺苷进行修饰。另一例子是，腺苷定义了蛋白质结合的识别序列或者构成其一部分，或者参与了定义RNA稳定性的二级结构。因此，如上所述，本发明可以用于提供疾病研究工具，以引入比现有突变有害程度低的新的突变等。

要给予的寡核苷酸的量、剂量和剂量方案可以取决于不同的细胞类型、要治疗的疾病、靶标人群、给药方式(例如，全身与局部)、疾病严重程度和可接受的副活性水平而变化，但这些均可以且应当在体外研究中、在临床前和临床试验中通过试错进行评价。当修饰的序列导致易于检测的表型变化时，试验尤其直接。有可能较高剂量的寡核苷酸可以竞争结合细胞内的核酸编辑实体(例如，ADAR)，从而耗尽自由参与RNA编辑的实体量，但常规的剂量试验将会揭示指定寡核苷酸和指定靶标的任意这些效果。

一项合适的试验技术涉及到将寡核苷酸构建物递送至细胞系或测试有机体，然后在之后的不同时间点取活检样品。靶标RNA的序列可以在活检样品中评价，具有修饰的细胞的比例能够很容易获知。该试验已进行之后，则可以保留该知识，并可以在无需取活检样品的情况下进行未来的递送。

本发明的方法因此可以包括在细胞的靶标RNA序列中鉴别所需改变的存在的步骤，从而验证靶标RNA序列已得以修饰。该步骤将典型地包括对靶标RNA或其cDNA拷贝(或者在靶标RNA是前mRNA的情形中，其剪接产物的cDNA拷贝)的相关部分进行测序，如上文所述，从而可以容易地验证序列的变化。另外可选地，变化可以在蛋白质水平上评价(长度、糖基化、功能等)，或者通过一些功能读出评价，例如，当由靶标RNA序列编码的蛋白质是离子通道时，通过(诱导型)电流评价。在CFTR功能的情形中，在包括人的哺乳动物中的尤斯灌流室(Ussing chamber)检验或NPD测试是本领域技术人员公知的，用以评价功能的恢复或获得。

细胞中已发生RNA编辑之后，修饰的RNA可以随时间而稀释，例如，因为细胞分裂、编辑的RNA的半衰期有限等。因此，在实际治疗期间，本发明的方法可以涉及重复递送寡核苷酸构建物，直至足够的靶标RNA得以修饰，以便为患者提供切实的益处和/或随着时间保持益处。

本发明的寡核苷酸特别适合用于治疗用途，因此本发明提供一种药物组合物，其包括本发明的寡核苷酸和药学可接受的载体。在本发明一些实施方式中，药学可接受的载体可以仅是盐水溶液。等渗的或低渗的可以是有用的，特别是对于肺部递送。本发明还提供包括本发明的药物组合物的递送装置(例如，注射器、吸入器、雾化器)。

如本文所述，本发明还提供在哺乳动物、优选人细胞中的靶标RNA序列中产生变化的方法中使用的本发明的寡核苷酸。类似地，如本文所述，本发明提供本发明的寡核苷酸构建物在制造用于在哺乳动物、优选人细胞的靶标RNA序列中产生变化的药物中的用途。

本发明还涉及对细胞中靶标RNA序列中存在的至少一种特定的靶标腺苷进行脱氨基化的方法，所述方法包括以下步骤：对所述细胞提供具有根据本发明的AON；使所述AON被细胞摄取；使所述AON退火至靶标RNA序列；使包括野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的哺乳动物ADAR酶将所述靶标RNA序列中的所述靶标腺苷脱氨基化成肌苷；和任选地，鉴别RNA序列中所述肌苷的存在。将根据本发明的AON引入到细胞中通过本领域技术人员已知的通常方法进行。脱氨基化之后效果(靶标RNA序列的变化)的读出可以通过不同的方式监测。因此，靶标腺苷的所需脱氨基化是否已实际发生的鉴别步骤通常取决于靶标腺苷在靶标RNA序列中的位置，以及腺苷的存在招致的效果(点突变、早期终止密码子、异常剪接位点、选择剪接位点、产生的蛋白质的错误折叠等)。因此，在优选的方面，取决于A到I转变的最终的脱氨基化效果，鉴别步骤包括：对靶标RNA进行测序；当所述靶标腺苷位于通过所述脱氨基化编辑成UGG密码子的UGA或UAG终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；当两个靶标腺苷位于通过两个靶标腺苷的脱氨基化编辑成UGG密码子的UAA终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；评价前mRNA的剪接是否被所述脱氨基化改变；或者使用功能性读出，其中所述脱氨基化之后的靶标RNA编码功能性、全长、延长的和/或野生型蛋白质。在存在有UAA终止密码子的情形中，这意味着两个腺苷均需被脱氨基化。因此，本发明还涉及其中两个彼此紧挨着的腺苷通过RNA编辑酶(例如ADAR)被共脱氨基化(co-deaminated)的寡核苷酸和方法。在该特殊情形中，将UAA终止密码子转化成UGG Trp-编码密码子(参见表1)。由于将腺苷脱氨基化成肌苷可以导致蛋白质不再受靶标位置处突变的A影响，鉴别脱氨基化成为肌苷也可以是个功能性读出，例如，评价是否存在有功能性蛋白质，或者甚至是评价因存在腺苷而导致的疾病是否得以(部分)逆转。本文所述的每种疾病的功能性评价通常是根据技术人员已知的方法。当靶标腺苷的存在导致异常剪接时，读出可以是评价异常剪接是否仍然发生，还是不发生，还是较少发生。另一方面，当想要将靶标腺苷的脱氨基化引入剪接位点时，则类似的方法可以用于检查所需的剪接类型是否实际上发生。靶标腺苷的脱氨基化之后鉴别肌苷存在的非常适合的方式当然是使用本领域技术人员公知的方法进行RT-PCR和测序。

本发明涉及一种反义寡核苷酸(AON)，其能够在细胞、优选人细胞中与靶RNA序列形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶使靶RNA序列中的靶腺苷脱氨基，所述AON包含3个连续核苷酸的中心三联体，其中与靶腺苷直接相对的核苷酸是中心三联体的中间核苷酸，其中所述中心三联体中的1、2或3个核苷酸包含糖修饰和/或碱基修饰；其条件是中间核苷酸不具有2’-O-甲基修饰。与不携带糖和/或碱基修饰的AON相比，本发明的核苷酸的糖和/或碱基修饰使AON更稳定，和/或引起改善的靶腺苷的脱氨基的诱导。在一个优选的实施方式中，当形成双链复合物时，与靶腺苷直接相对的非互补核苷酸是胞苷。该胞苷与AON中直接地其5’和3’的核苷酸一起形成如本文所定义的中心三联体。尽管AON与中心三联体外的靶RNA序列之间可能存在其它错配，但中心三联体中心的胞苷与靶序列中的靶腺苷形成至少一个错配，使得该错配可由存在于细胞中的ADAR编辑。细胞优选是人细胞，ADAR优选是人ADAR，更优选是所述细胞中的内源性ADAR，而不需要通过重组方法过表达。无论如何，中心三联体中的中间核苷酸不具有2’-O-甲基修饰，允许细胞的RNA编辑酶起作用。在一个实施方式中，中心三联体中除中间核苷酸外的1或2个核苷酸由肌苷取代。这可能是优选的，以允许更好地适应ADAR酶。在另一个优选的实施方式中，AON不包含能够形成分子内茎-环结构的部分，该分子内茎-环结构能够结合哺乳动物ADAR酶。

如图1、2和4所示，中心三联体描述为YXZ或XXY。提供了不同的碱基修饰。技术人员理解，这些碱基修饰在某种程度上取决于与中心三联体中的核苷酸相对的核苷酸。因此，在YXZ的实例中，其中X是与靶腺苷相对的中间核苷酸，X可以是胞苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、尿苷或吡咯并胞苷，而Y和/或Z可以是肌苷、5-甲基胞苷、吡咯并胞苷、假尿苷、4-硫尿苷、噻吩并尿苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、噻吩并鸟苷、5-甲氧基尿苷、二氢尿苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲基尿苷、8-氮杂-7-脱氮鸟苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-甲基腺苷、8-甲基腺苷、3-脱氮腺苷、7-脱氮腺苷、8-叠氮基腺苷等，取决于与中心三联体相对的核苷酸；因此取决于靶RNA序列和与之相关的疾病。因此，在一个优选的实施方式中，所述碱基修饰选自2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、3-脱氮腺苷、7-脱氮腺苷、7-甲基腺苷、8-叠氮基腺苷、8-甲基腺苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲基胞苷、吡咯并胞苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-脱氮鸟苷、7-甲基鸟苷、8-氮杂-7-脱氮鸟苷、噻吩并鸟苷、肌苷、4-硫代尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基尿苷、二氢尿苷、假尿苷、和噻吩并尿苷。

在另一个优选的实施方式中，糖修饰选自脱氧核糖(即DNA)、解锁核酸(UNA)和2’-氟核糖。在一个特别优选的方面，本发明涉及包含3个连续核苷酸的中心三联体的AON，其中与靶腺苷直接相对的核苷酸是中心三联体的中间核苷酸，并且其中所述中心三联体中的1个、优选2个、甚至更优选所有3个核苷酸都是DNA核苷酸以使得AON更稳定和/或更有效地诱导靶腺苷的脱氨基。在另一个优选的方面，AON的其余部分由RNA核苷酸组成，其优选(但不是必须)是2’-O-甲基修饰的。其它稳定化修饰可在中心三联体外部使用。与根据本发明的靶向编辑很好相容的其它核糖修饰是2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、LNA、2’-F和2’-NH₂。可以应用中心三联体外部的核苷酸的糖修饰(如本文所列)的不同组合。在另一个优选的方面，根据本发明的AON包含至少一个选自以下的核苷间键修饰：硫代磷酸酯、3’-亚甲基膦酸酯(即3’-O-甲基膦酸酯核苷酸间的键)、5’-亚甲基膦酸酯(即5’-O-甲基膦酸酯核苷酸间的键)、3’-氨基磷酸酯(即N-3’-氨基磷酸酯核苷酸间的键)和2’-5’-磷酸二酯(即2’-5’-磷酸二酯核苷酸间的键)。特别优选的是硫代磷酸酯键。根据本发明的进一步优选的AON是其中AON的5’和3’末端的2、3、4、5或6个末端核苷酸用硫代磷酸酯键连接，优选其中5’和3’末端处的末端5个核苷酸用硫代磷酸酯键连接的AON。如本文所公开，中心三联体内的核苷酸也可通过硫代磷酸酯键连接，尽管看起来在中心三联体中优选存在多于一个这样的键以使AON稳定并且在RNA编辑中有活性。在进一步优选的方面，AON与保护性正义寡核苷酸(SON)退火以提高稳定性，并且假设，延长的活性是由于双链反义寡核苷酸+SON复合物的更稳定特性。SON不一定必须具有与反义寡核苷酸相同的长度。它可能更长、相同长度或更短。

在一个优选的方面，AON中在中心三联体外部的所有核苷酸包含2’-O-烷基，比如2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基。中心三联体外部的核苷酸也可以是DNA，只要DNA段不会导致gapmer。此外，AON优选长于10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸，并且优选短于100个核苷酸，更优选短于60个核苷酸。在另一个优选的实施方式中，AON包含18至70个核苷酸，更优选包含18至60个核苷酸，甚至更优选包含18至50个核苷酸。本发明还涉及一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项的AON和药学上可接受的载体。

根据本发明的寡核苷酸适当地在水性溶液例如盐水或悬浮液中给药，其任选地包括与药学用途相容的添加剂、赋形剂或其他成分，浓度范围为1ng/ml至1g/ml，优选10ng/ml至500mg/ml，更优选100ng/ml至100mg/ml。给药量范围可以适当地为大约1μg/kg至大约100mg/kg，优选大约10μg/kg至大约10mg/kg，更优选大约100μg/kg至大约1mg/kg。给药可以是通过吸入(例如，通过雾化)、鼻内、口服、通过注射或输注、静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内、气管内、腹膜内、直肠内、通过直接注射到肿瘤中等。给药可以是固体形式的，可以是粉剂、丸剂的形式，或者是与人类药用相容的任何其他形式。

本发明特别适合用于治疗遗传病，例如囊性纤维化、白化病、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合征、进行性神经性腓骨肌萎缩症、肺慢性阻塞性疾病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker肌肉萎缩症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、因子V莱顿相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇病、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、血友病、遗传性血细胞色素沉着症、Hunter综合征、亨廷顿氏舞蹈症、Hurler综合症、炎性肠病(IBD)、遗传性多聚凝集综合征、莱伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合征、Lynch综合征、Marfan综合征、粘多糖贮积症、肌肉萎缩症、I型和II型强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、A型、B型和C型Niemann-Pick病、NY-eso1相关癌症、帕金森氏病、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮酸尿症、庞佩氏病、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病比如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞血症、脊髓性肌萎缩症、斯特格氏病、泰-萨克斯病、Usher综合征、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征、各种形式的癌症(例如，BRCA1和2相关的乳腺癌和卵巢癌)等。

在一些实施方式中，寡核苷酸构建物可以全身给药，但更典型的是将寡核苷酸递送至观察到靶标序列表型的细胞。例如，CFTR中的突变导致主要在肺上皮组织中观察到的囊性纤维化，因此，对于CFTR靶标序列，优选将寡核苷酸构建物特定地、直接地递送至肺部。这一点可以方便地通过将例如粉末或气溶胶典型地经由使用雾化器吸入来实现。特别优选使用所谓的振动筛网的雾化器，包括来自Respironics的PARI eFlow(快速)或i-neb。发明人已经发现，核苷酸构建物的吸入应用可以导致寡核苷酸构建物的全身分布，并被肠、肝、胰腺、肾和唾液腺组织等中的细胞摄取。因此，预计根据本发明的寡核苷酸构建物的吸入给药也可以有效地靶向这些细胞，其中在CFTR基因的情形中，该靶向可以导致也与囊性纤维化相关的胃肠道症状的减轻。对于其他靶标序列，取决于疾病和/或靶标器官，给药可以是局部(例如，在皮肤上)、皮肤内、皮下、肌肉内、静脉内、口服、眼部注射等。

在一些疾病中，粘液层表现出厚度增加，导致药物经由肺的吸收降低。这种疾病之一是慢性支气管炎，另一例子是囊性纤维化。可获得各种形式的粘液正常化药剂(mucusnormalizer)，例如脱氧核糖核酸酶(DNAse)、高渗盐水或甘露醇，其均以Bronchitol的名称市售。当粘液正常化药剂与RNA编辑寡核苷酸构建物例如根据本发明的寡核苷酸构建物结合使用时，它们可能增加这些药物的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建物给予受试者、优选人受试者，优选地与粘液正常化药剂结合，优选本文所述的那些粘液正常化药剂。此外，根据本发明的寡核苷酸构建物的给药可以与用于治疗CF的小分子的给药相结合，上述小分子是例如增效剂化合物例如Kalydeco(ivacaftor；VX-770)，或者改正剂(corrector)化合物例如VX-809(lumacaftor)和/或VX-661。CF的其他组合疗法可以包括将根据本发明的寡核苷酸构建物的使用结合腺苷脱氨基酶诱导物，使用IFN-γ或TNF-γ。

另外可选地，或者与粘液正常化药剂结合，以粘液穿透颗粒或纳米颗粒给药，可以用于将RNA编辑分子有效递送至例如肺和肠的上皮细胞。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建物给予受试者、优选人受试者，优选地使用以粘液穿透颗粒或纳米颗粒给药。

慢性和急性肺部感染常常存在于例如囊性纤维化的疾病患者中。抗生素治疗减轻细菌感染和例如粘液增厚和/或形成生物膜的症状。由于寡核苷酸构建物更易于接近靶标细胞，将抗生素与根据本发明的寡核苷酸构建物结合使用可以增加RNA编辑的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建物给予受试者、优选人受试者，优选地与抗生素治疗结合，以减轻细菌感染和例如粘液增厚和/或形成生物膜的症状。抗生素可以全身或局部或以这两种方式给药。

对于例如在囊性纤维化患者中的应用，根据本发明的寡核苷酸构建物、或者包装或复合的根据本发明的寡核苷酸构建物，可以与以下任意者组合：粘液正常化药剂，例如脱氧核糖核酸酶、甘露醇、高渗盐水，和/或抗生素，和/或用于CF治疗的小分子，例如增效剂化合物例如ivacaftor，或者改正剂化合物例如lumacaftor和/或VX-661。

为了增加对靶标细胞的接近，可以应用支气管肺泡灌洗(Broncheo-AlveolarLavage，BAL)，以便在给予根据本发明的寡核苷酸之前清洁肺部。

本发明的发明人在本文中显示，对靶向RNA和募集ADAR酶的AON的某些修饰产生增加的稳定性，并且通过这种方式，在体内环境中具有更好的适用性。然而，稳定性是一回事。除了通过阻止核酸酶介导的降解来稳定AON之外，理想地选择修饰的核苷酸，使得它们支持并优选地改善ADAR酶的结合和/或催化活性。ADAR2脱氨酶结构域和dsRNA底物之间相互作用的已知结构特征(在Matthews等人2016.Nat Struct Mol Biol 23:426-433中非常详细地提供)可用于合理地选择最适合ADAR2酶的催化中心的修饰的AON。从Matthews等人(2016)公开的(彩色)结构可以看出，ADAR2从dsRNA螺旋的小沟接触编辑位点；图2中，组A：垂直于dsRNA螺旋轴的复合物结构的视图。粉红色RNA链是编辑链，蓝色链是互补链。向外翻转的靶碱基(N)以红色示出。蛋白质通过其小沟与螺旋接触。组B：沿dsRNA螺旋轴的结构视图。组C：ADAR2 E488Q脱氨酶结构域和RNA双链体之间的接触概述。红色表示编辑的靶标链，蓝色表示互补链(相当于此处显示的AON)。虚线表示脱氨酶结构域的氨基酸侧链(指示的氨基酸本体和位置)与RNA链的相互作用。Matthews等人(2016)的图5A详细显示编辑位点5’的核苷酸(在靶标链上)和另一条链上的互补核苷酸的相互作用的空间填充模型。在上组中，5’核苷酸是尿苷，并且与相对腺苷的相互作用通过ADAR2脱氨酶结构域的甘氨酸489稳定。下组显示C(在所编辑的核苷酸的5’)与互补G的模拟相互作用。在这种情况下，与甘氨酸的相互作用导致与2-氨基的冲突，这降低了编辑效率。用肌苷替换相对链(或AON)上的鸟苷碱基将解决这种空间冲突。

对于碱基修饰，本发明的发明人推断出投射到螺旋的主要沟槽中的化学修饰(Sharma和Watts 2015,Future Med.Chem.7(16),2221–2242)将最少地干扰ADAR2的功能。有关不同AON的详细信息，请参见图2和实例。对于嘧啶核苷酸，这种修饰包括碱基的4或5位的取代基，包括4-硫尿苷(参见例如ADAR60-13)、5-甲基尿苷(参见例如ADAR60-14)、5-甲氧基尿苷(参见例如ADAR60-26)、5-甲基胞苷(参见例如ADAR60-9、-11至16、-20、26、-27和-29至-32以及ADAR68-1至-6)和5-羟基甲基胞苷(参见例如ADAR60-28)。对于嘌呤核苷酸，碱基7和8位的取代基将类似地引导入大沟，包括7-甲基鸟苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂-7-脱氮鸟苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-甲基腺苷、8-甲基腺苷、3-脱氮腺苷、7-脱氮腺苷或8-叠氮基腺苷(分别参见ADAR60-29、-30、-31和-32，以及ADAR68-1、-2、-3、-4和-5)。

对于AON的骨架修饰(即核苷酸的核糖基部分或核苷酸间的键的修饰)，本发明的发明人推断出不改变RNA螺旋的A形式结构的修饰只会适度地干扰ADAR2的功能。ADAR2脱氨酶结构域的结构信息还表明，在某些位置，保留与酶的氨基酸侧链接触的化学基团是重要的，比如磷酸基团和2’-羟基。允许保留这些特征的修饰包括UNA(参见例如ADAR60-8和-9)、3’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、3’-氨基磷酸酯、或2’-5’磷酸二酯修饰(分别参见ADAR60-22、-23、-24和-25)。在一些情况下，对于特定核苷酸上的给定取代基，ADAR2不存在直接相互作用。在这种情况下，可以使用其它化学基团来保护AON免受核酸酶的影响，但是这些基团足够小以免引起ADAR2的空间干扰，例如，2’-氟代修饰或2’-H(脱氧)，因为它不大于天然存在的羟基(参见例如ADAR60-7)。

可以选择修饰的核苷酸，不仅提供增强的核酸酶保护和对ADAR2结合的最小干扰，而且还特异性地增加ADAR2的功能性。特定的核苷酸修饰可能、尤其是对当靶序列对于ADAR编辑来说并非最佳时增强底物RNA的编辑活性而言是必需的。以前的工作已经确定某些序列环境更适合编辑。例如，靶序列5’-UAG-3’(在中间具有靶标A)对于ADAR2来说含有最优选的最近邻核苷酸，而5’-CAA-3’靶序列不受偏爱(Schneider等人2014)。ADAR2脱氨酶结构域的结构分析暗示了通过仔细选择与靶三核苷酸相对的核苷酸来增强编辑的可能性(Matthews等人2016)。例如，与相对链上的3’-GCU-5’序列配对的5’-CAA-3’靶序列(在中间形成A-C错配)不受偏爱，因为鸟苷碱基的氨基与ADAR2的氨基酸侧链空间冲突。然而，假设缺少氨基的较小核碱基(比如肌苷)可以更好地适合该位置而不引起空间冲突，同时仍然保持与相对胞嘧啶的碱基配对潜力(参见例如ADAR60-10至-19、和-26、-27、-28和-32)。肌苷也可以在不同的序列环境中使用。例如，靶序列5’-UAG-3’可与AON中心三联体序列5’-CCI-3’配对，从而形成U-I摆动碱基对，其能够提供靶腺苷所需的增加的灵活性，以从螺旋中翻出进入酶的活性位点(参见例如ADAR68-6)。

除了核酸酶保护之外，骨架修饰还可以具有另外的益处，比如为编辑位点周围的核苷酸提供增加的灵活性，这已被表明是使底物正确定位于酶的活性位点中的重要因素。UNA是一种这样的骨架修饰，因为糖部分的开放结构允许增加的移动(参见ADAR60-8和-9)。相反，可以增强次优序列活性的修饰还包括使用迫使其进入有利于编辑的构象的骨架修饰。

实施例

实施例1.靶向人SERPINA1 RNA的AON中的化学修饰以增加稳定性

未公布的专利申请PCT/EP2017/065467描述一种通过使用反义寡核苷酸(AON)进行靶向的A至I编辑的方法。尽管这些AON中的大多数核苷酸是2’-O-甲基化RNA并且具有硫代磷酸酯键，但它们在AON的部分中含有少许、通常为3个未修饰的RNA核苷酸(‘中心三联体’)，中间核苷酸与靶腺苷及其2个相邻核苷酸直接相对。这是因为先前已经表明，当中心三联体的核苷酸是2’-O-甲基化时，A至I编辑受到强烈抑制(Vogel等人，2014)。然而，含有未修饰的RNA核苷酸的AON本质上在生物学上不稳定，因为核酸酶可以水解这些位置的残基。这可能是有效使用AON作为例如治疗剂的缺点，因为它们可能在到达其靶标之前受到降解。

本发明的发明人研究在中心三联体处具有未修饰的RNA核苷酸的AON的稳定性，以及通过使用不是2’-O-甲基化的化学修饰是否可以增加这种AON的稳定性。

首先，作为非限制性实例，用于RNA编辑选择的靶标是SERPINA1RNA中的c.1096G>A突变，其引起A1AT-缺陷(A1ATD)。A1ATD是使用本文所概述的方法进行RNA编辑的疾病靶标的实例。在图1A和B中，示意性地示出示例性AON与SERPINA1靶标的互补性。ADAR60-1与靶序列的互补性如图1A所示，而ADAR60系列中的中心三联体(5’-YXZ-3’)如图1B所示。许多在骨架中以及在中心三联体的核苷酸碱基中具有不同修饰的靶向突变RNA的AON，通过在37℃下将它们在含有15％胎牛血清(FBS)的细胞培养基(MEM)中孵育30分钟(RX)，测试其稳定性。作为阴性对照，将AON在磷酸盐缓冲盐水(PBS；CTL)中孵育。然后将样品在变性聚丙烯酰胺凝胶(含8M尿素的15％PAGE凝胶)中分离，随后用甲苯胺蓝染色以观察AON及其片段。具有其各自序列及其修饰的AON如图2所示。图3的三组显示使用ADAR60系列的AON的稳定性测定的结果。含有未修饰的5’-UCG-3’RNA中心三联体的ADAR60-1在FBS存在下在30分钟内被有效切割(～降解)(至约50％)。当AON在对照缓冲液中孵育时，一些降解甚至是明显的。当三个RNA核苷酸的位置发生移位时，降解速率不降低(ADAR60-3)。重要的是，将未修饰的RNA核苷酸数量减少到2(而不是3)会导致降解减少(ADAR60-2)。这里作为阴性对照的完全2’-O-甲基化的AON在这些条件下保持稳定(ADAR60-4)，中心三联体已变为DNA核苷酸的AON也是如此(ADAR60-6)。这至少表明当中心三联体不是2’-O-甲基化时，AON易于降解，这可以通过向中心三联体中加入至少一个2’-O-甲基化核苷酸或者将整个中心三联体修改为DNA核苷酸来解决。糖的另一种修饰，在中心三联体的3个位置中的2个位置通过解锁核酸(UNA)取代RNA也导致稳定性增加(ADAR60-8)，当与三联体中间的碱基修饰5-甲基胞嘧啶结合时更是如此(ADAR60-9)。在中心三联体的第一个位置之后包含一个硫代磷酸酯键(5’-U*CG-3’，其中星号代表硫代磷酸酯键)不会明显增加稳定性(ADAR60-5)。对于增加硫代磷酸酯键的数量的进一步实验，参见下面的实施例2。

用肌苷取代鸟苷也导致降解明显减少(ADAR60-10)。当这种修饰与取代胞苷的5-甲基胞苷相结合(ADAR60-11)时，稳定性保持，当两种修饰与取代尿苷的假尿苷相结合(ADAR60-12)时，稳定性进一步增加。

用修饰的核苷酸取代中心三联体的所有3个核苷酸似乎对稳定性产生最大的影响。每个位置的确切修饰可以改变，这极大地影响了AON的稳定性。在与其它ADAR60-12相似的AON中，用4-硫尿苷(ADAR60-13)或2,6-二氨基嘌呤(ADAR60-16)取代假尿苷导致AON具有相当的稳定性，而相反，5-甲基尿苷(ADAR60-14)降低稳定性，并且噻吩并尿苷(ADAR60-15)导致AON几乎完全降解，甚至比未修饰的RNA三联体降解更多。

用吡咯并胞苷取代中心三联体中的中间C导致比用5-甲基胞苷取代甚至更显著的稳定性：具有吡咯并胞苷和肌苷的AON在这些条件下几乎完全稳定，无论它们是否在三联体的第一个位置含有假尿苷或未修饰的尿苷(分别为ADAR60-18和ADAR60-17)。在这种情况下，用噻吩并尿苷取代尿苷(ADAR60-19)还是导致稳定性降低，但没有到与ADAR60-15相同的程度。

与中心三联体的其它两个位置类似，最后一个位置也可以用不同的碱基修饰进行修饰以实现稳定性。这里，不用肌苷，而是使用噻吩并鸟苷，与假尿苷以及5-甲基胞苷或吡咯并胞苷(分别为ADAR60-20和ADAR60-21)组合。在这些条件下，两个AON都完全稳定；与其它类似的ADAR60-12和ADAR60-20相比，噻吩并鸟苷的稳定性增加显著。

可以设想，为了提高稳定性而实现类似效果的其它组合是例如由7-甲基鸟苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂-7-脱氮鸟苷、或7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷取代鸟苷(分别参见ADAR60-29、-30、-31和-32)，或者由5-羟基甲基胞嘧啶取代胞苷(参见ADAR60-28)，或由5-甲氧基尿苷或二氢尿苷取代尿苷(分别参见ADAR60-26和-27)。稳定化也通过中心三联体的糖和骨架修饰实现，包括2’-氟、3’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、3’-氨基磷酸酯、或2’-5’磷酸二酯修饰(2’至5’骨架键；分别参见ADAR60-7、-22、-23、-24和-25)。

本实施例中显示的结果表明，并非每种修饰都可用于减少RNA编辑反义寡核苷酸的降解，但许多修饰确实增加稳定性，并且中心三联体中以及可能周围的修饰应该仔细地选择。用指定的化学方法修饰中心三联体中的核苷酸肯定增加寡核苷酸的稳定性。总之，本实施例中给出的结果表明，中心三联体中核苷酸的修饰(组合)能够提高稳定性，并且一次修饰几个碱基会导致增量稳定化。

实施例2.靶向小鼠Idua RNA的AON中的硫代磷酸酯键以增加稳定性

在前面的实施例中，显示在中心三联体内的第一个位置之后包含一个硫代磷酸酯键不会明显增加稳定性(图3A；ADAR60-5)。为了更深入地研究这一点，测试在中心三联体区域内包含更多的硫代磷酸酯键是否仍然具有影响并且增加稳定性。

为此，本发明的发明人选择Hurler综合征作为模型系统，也称为粘多糖贮积症I型-Hurler(MPS I-H)，其在人中由IDUA基因的c.1205G>A(W402X)突变引起。突变的人基因中的靶序列是5’-UAG-3’(中间具有靶标A，见图4A)，那么AON的中心三联体则是5’-CCA-3’(包括中心的、错配的C；参见图4B的5’-XXY-3’标注)或5’-CUA-3’。还存在对于该突变的小鼠模型(W392X)，其中Idua基因是突变的。Hurler小鼠模型也用于其它体内实验(见下文)。设计具有系列号ADAR65的寡核苷酸(参见图2)，以靶向突变的小鼠Idua基因。测试ADAR65-1、ADAR65-18、ADAR65-20、ADAR65-21和ADAR65-22以观察另外的硫代磷酸酯键是否将增加寡核苷酸的稳定性。令人惊讶的是，在中心三联体区域中包含3个或更多个硫代磷酸酯确实提供稳定性增加的AON(图5)。ADAR65-1在中心三联体区域没有另外的硫代磷酸酯键并且明显降解，而ADAR65-22在中心三联体区域内和周围具有6个硫代磷酸酯键，即使在FBS中孵化18h后，也显然更稳定。类似地，与(像ADAR65-1一样)除了寡核苷酸的末端键外在中心三联体区域中没有另外的硫代磷酸酯的ADAR65-18相比，在中心三联体区域中分别具有5个和3个硫代磷酸酯键的ADAR65-20和ADAR65-21的稳定性增加。

将碱性修饰比如5-甲基胞苷和脱氧2-氨基嘌呤连同核糖修饰比如脱氧核糖(DNA)、2’-O-甲基、2’-氟以及磷酸骨架(硫代磷酸酯键)组合。使用如上所述相同的测定法测试ADAR65-13、-14、-15、-16、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29和-30(图2)的稳定性。图6中描述的结果显示可以使用多种组合来获得稳定性，即使是在FBS中孵育18h后。

此外，对于在中心三联体中具有RNA(ADAR93-2)或DNA(ADAR93-6、ADAR93-8、ADAR93-9)和不同数量的硫代磷酸酯核苷酸(ADAR93-2中28个，ADAR93-6中8个，ADAR93-8中21个，ADAR93-9中22个)的AON，分析其在各种生物溶液中的稳定性。PBS用作阴性对照。为了模拟AON在血液和中枢神经系统中可能经受的生理条件，将AON分别在含有15％FBS的细胞培养基(DMEM)或单供体人脑脊液(CSF)中孵育。为了评估溶酶体的酸性微环境和其中的核酸酶是否会影响AON稳定性，还将寡核苷酸在混合性别人肝脏溶酶体(Lyso)中孵育。将200pmol的AON在每种条件下孵育2h、24h或3天，之后将样品在变性聚丙烯酰胺凝胶(具有8M尿素的12％PAGE凝胶)中分离。将凝胶用甲苯胺蓝溶液染色并在水中脱色以观察AON及其片段。结果显示在图7中，并且(再次)表明含有RNA而在中心三联体中没有修饰的寡核苷酸(ADAR93-2)在FBS、CSF和Lyso中非常易于降解，因为在这些不同的情况下，几乎所有的寡核苷酸都被快速消化，而它们在单独的PBS中保持相对稳定。然而，改变中心三联体以包括两个或三个DNA核苷酸显著增加寡核苷酸在三种不同环境中的稳定性，甚至长达三天。

还设计了潜在靶向人IDUA基因的c.1205G>A(W402X)突变的反义寡核苷酸ADAR68、ADAR68-1、-2、-3、-4和-5(参见图2)。经修饰的中心三联体可由例如两个5-甲基胞苷与一个取代腺苷的核苷酸比如7-甲基腺苷、8-甲基腺苷、3-脱氮腺苷、7-脱氮腺苷、或8-叠氮基腺苷组合(图2中的ADAR68-1、-2、-3、-4和-5)组成。然而，腺苷也可由能够与相对的尿苷形成摆动碱基对的修饰碱基取代，比如肌苷(ADAR68-6)。测试这些AON的稳定性以及它们编辑靶序列的RNA的能力。

实施例3.在中心三联体中具有组合化学碱基修饰的AON的RNA编辑活性

核苷酸磷酸二酯、糖和碱基修饰用于增加寡核苷酸对抗核酸酶的稳定性。重要的是，本发明的发明人设想，这种化学核苷酸修饰也可以用于其它目的，比如增加AON与其靶RNA的结合，以获得更好的识别和/或增加蛋白质作用于AON与其特异性靶RNA序列的双链复合物上的酶活性。

本发明人首先想知道AON的中心三联体中的核苷酸碱基化学修饰的组合是否可以增强ADAR2的编辑活性。为此，ADAR60-1和ADAR60-15(参见图2和3)用于研究增强ADAR2酶对人突变的SERPINA1靶RNA分子的编辑活性的这种影响。这两个AON具有相同的序列和长度，并且都具有磷酸基团的化学硫代磷酸酯修饰以及中心三联体外部的核糖的2’-O-甲基修饰。ADAR60-1的中心三联体中的核苷酸未经修饰，而ADAR60-15的中心三联体中的核苷酸碱基经化学修饰，如图2所示。5-甲基胞苷与用于编辑的靶腺苷相对。使用具有ADAR2的过表达同种型2(ADAR2a)的HEK293细胞裂解物和携带c.1096G>A突变的SERPINA1靶标RNA，在体外编辑测定中测试ADAR60-1和ADAR60-15。不含细胞裂解物的ADAR60-15以及具有过表达ADAR2a的HEK293细胞裂解物但不含寡核苷酸用作阴性对照。SERPINA1模板ssRNA通过体外转录500ng SERPINA1mut DNA序列(通过PCR从SERPINA1mut基因片段扩增)获得，其使用MEGAscript试剂盒(Life Technology)，应用本领域技术人员已知的一般技术并遵循制造商的方案，并使用T1promoterF1正向引物(5’-GCGAAGCTTAATACGACTC-3’；SEQ IDNO：3)和Serpina1-R2反向引物(5’-CCATGAAGAGGGGAGACTTC-3’；SEQ ID NO：4)。SERPINA1mut DNA模板具有以下序列(靶腺苷以粗体和下划线表示)：

靶ssRNA具有以下序列(靶腺苷以粗体和下划线表示)：

使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对靶ssRNA进行凝胶纯化。为了获得裂解物，首先使用Lipofectamine 3000用500ng ADARB1表达质粒(OriGene)转染HEK293细胞过夜。然后使用裂解-M试剂裂解细胞。在30℃下将200nM AON和90nM SERPINA1模板ssRNA在体外编辑测定缓冲液中一起预孵育30分钟。预孵育后，加入细胞裂解物(10μl)并将反应混合物在30℃孵育30分钟，随后在37℃孵育30分钟。然后通过苯酚氯仿提取来提取靶向的RNA，并使用Maxima RT试剂，使用制造商的方案，并使用Serpina1-F2正向引物(5’-TCAACTGGGCATCACTAAGG-3’；SEQ ID NO：7)和Serpina1-R2反向引物(见上文)进行逆转录。然后，通过PCR扩增cDNA，并使用Serpina1-R1引物(5’-CATGAAGAGGGGAGACTTGG-3’；SEQ IDNO：8)通过Sanger测序进行分析。

图8显示当ADAR60-1与SERPINA1mut ssRNA靶标孵育时，未检测到A至G变化(组A，箭头指示的位置)。然而，相比之下，ADAR60-15的使用(组B)显示出明显可检测且显著的A至G变化，证实了靶SERPINA1 RNA的编辑。阴性对照反应(组C和D)显示没有A至G编辑。结论是，与没有这种修饰的寡核苷酸(ADAR60-1)相比，ADAR60-15中的核苷酸碱基化学修饰能够增强ADAR2的RNA编辑活性。

实施例4.使用在中心三联体中包含2-氨基嘌呤修饰的AON对GFP靶RNA中的无义突变进行RNA编辑

RNA编辑还在含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的表达构建体的细胞中进行研究，该表达构建体稳定整合到细胞基因组中(关于细节和构建，参见WO2016/097212)。在该构建体中，在密码子位置57处引入终止密码子(TAG)，在靶RNA中产生三联体UAG。在该三联体中间的腺苷处编辑RNA最终将产生编码Trp的密码子，然后导致全长蛋白质的表达。使用本领域普通技术人员已知的技术产生构建体和细胞系(含有稳定整合的GFP W57X质粒的细胞)。为了确保靶RNA中没有其它腺苷受到编辑，AON中只有与终止密码子相对的三个核苷酸(寡核苷酸中的5’-CCA-3’，中间具有错配的C，参见ADAR59-2和ADAR59-10，图2)不含有2’-O-甲基修饰，而反义寡核苷酸中的所有其它核苷酸都含有2’-O甲基修饰。此外，所有测试的寡核苷酸每侧的末端5个核苷酸通过硫代磷酸酯键连接，而其余的键是正常的键。在ADAR59-10中，寡核苷酸的中心三联体中的A经化学修饰为2-氨基嘌呤，而ADAR59-2没有该特定的修饰。Matthews等人(2016)的图5B表明在该位置的2-氨基嘌呤修饰导致活性减少(但未消除)。然而，修饰仍可间接地增强RNA编辑，例如通过潜在地提供增强的核酸酶抗性或增强细胞过程。

首先含有稳定GFP W57X的细胞用1μg的ADAR2过表达质粒转染(参见前面的实施例)，然后在24h后在单独的批次中分别转染150nM各寡核苷酸(均用Lipofectamine 2000)。然后，在AON转染后24h，分离RNA用于cDNA合成，随后进行RT-PCR和测序以揭示RNA编辑是否已经发生。

如图9所示，用ADAR59-10观察到的编辑水平与没有2-氨基嘌呤修饰的对照(ADAR59-2)相比得到改善。这表明，尽管对催化活性本身具有负面影响，但AON修饰可通过间接方式对整体编辑水平产生积极影响。通过将这种修饰与支持增强的稳定性和/或编辑活性的其它修饰的核苷酸组合(如本文所公开)，现在能够产生有效激活RNA编辑的稳定的AON。

实施例5.使用在中心三联体中包含DNA修饰的AON对GFP靶RNA中的无义突变进行编辑

与前面实施例中描述的类似，使用GFPstop57质粒研究AON中的许多其它修饰的有效RNA编辑。为此，将寡核苷酸ADAR59-2、ADAR59-10和ADAR59-22与对照寡核苷酸ADAR65-1和不转染任何寡核苷酸的对照情况进行比较(参见图2)。详细地，在含有10％FBS的DMEM中，6孔板每孔接种0.3x10⁶ MCF-7细胞。24h后，使用Lipofectamine 2000，用50ng GFPstop57质粒转染细胞。再次24h后，使用Lipofectamine 2000，用100nM的各AON转染选择的细胞样品。再次24h后，从裂解的细胞中分离RNA并用作模板用于cDNA合成，其使用Maxima cDNA合成试剂盒，使用500ng RNA输入进行。使用液滴数字PCR(ddPCR)将这些样品用于定量编辑分析。用于核酸靶序列的绝对定量的ddPCR测定使用Bio-Rad的QX-200液滴数字PCR系统进行。将从RT-PCR获得的1μl cDNA用于20μl反应混合物的总混合物中，包括无dUTP的用于探针的ddPCR Supermix(Bio Rad)，进行Taqman SNP基因型测定(Thermo Fisher Scientific)，结合以下基因特异性探针的相关正向和反向引物为：

正向引物：5’-ACCCTTAAATTTATTTGCACTA-3’(SEQ ID NO：9)反向引物：5’-CACCATAAGAGAAAGTA-3’(SEQ ID NO：10)

野生型探针-FAM NFQ标记：5’-CTGTTCCATGGCCAAC-3’(SEQ ID NO：11)

突变型探针-VIC NFQ标记：5’-CTGTTCCATAGCCAAC-3’(SEQ ID NO：12)

使用多通道移液器将总体积为20μl的包含eDNA的PCR混合物填充到ddPCR盒(BioRad)的中间行中。重复分为两个盒。底部行填充70μl用于探针的液滴生成油(Bio Rad)。更换橡胶垫圈后，在QX200液滴发生器中产生液滴。将来自盒顶行的40μl油乳液转移至96孔PCR板。使用PX1平板密封器在170℃下用锡箔密封PCR板4秒，然后进行以下PCR程序：1个循环的酶活化在95℃下进行10分钟，40个循环的变性在95℃下进行30秒，以及退火/延伸在59.7℃下进行1分钟，1个循环的酶失活在98℃下进行10分钟，然后在8℃下储存。PCR后，读取平板并用QX200液滴读数器分析。如上文所讨论关于GFPstop57衍生的RNA，使用不同反义寡核苷酸进行RNA编辑后获得的cDNA的ddPCR结果在表2中提供。这表明在PCR产物群体中，单独转染质粒或与对照寡核苷酸一起转染后，未检测到wt拷贝。但是，用ADAR59-2、ADAR59-10和ADAR59-22转染确实在总群体中产生大量的野生型拷贝。使用ADAR59-22(其携带与靶腺苷相对的C周围的两个DNA核苷酸)导致RNA编辑高达8.3％wt拷贝。这表明在中心三联体内使用DNA核苷酸有利于使用内源性ADAR酶进行有效的RNA编辑，因为在该实验中没有使用另外的RNA编辑酶。

样品	Mut拷贝/μl	WT拷贝/μl	％WT总计
				50ng GFPstp+No oligo	40，2	0	0，0
50ng GFPstp+ADAR65-1	42，1	0	0，0
				50ng GFPstp+ADAR59-2	60，5	2，8	4，4
50ng GFPstp+ADAR59-10	121	6，8	5，3
				50ng GFPstp+ADAR59-22	173	15，7	8，3

表2.给出每μl的突变(Mut)拷贝数以及每μl的野生型(WT)拷贝数。右栏中给出了整个群体中WT拷贝的百分比。

因此，在一个优选的实施方式中，本发明还涉及根据本发明的AON，其中中心三联体中的核苷酸是DNA核苷酸，更优选其中中心三联体中的与靶腺苷相对的C的每侧的两个核苷酸是DNA核苷酸。

实施例6.在体外对内源性靶标用内源性ADAR进行RNA编辑

然后研究是否有可能用内源性ADAR蛋白对内源性靶标实现RNA编辑，因此不过表达任何一种。编码小鼠核内小核糖核蛋白多肽A(SNRPA)的RNA由于其中等丰度和普遍存在的表达而选为内源性靶标。SNRPA与U1核内小核糖核蛋白的茎环II相联系，其结合前体mRNA的5’剪接位点并且为剪接所必需。蛋白质经由二聚化通过对其自身前mRNA的多腺苷酸化抑制进行自调节，并且已经涉及剪接和多腺苷酸化的偶联。设计AON用于编辑小鼠Snrpa(前)mRNA的野生型终止密码子(UAG)，其随后可能导致信使的延伸并导致由下游序列编码的25个氨基酸增加的较大的蛋白质。SNRPA蛋白的原始大小约为31.68kDa，扩大的蛋白质计算为约34.43kDa。图2显示ADAR94-1的序列，其在中心三联体中含有三个DNA核苷酸，而所有其它核苷酸是2’-O-甲基修饰的RNA。两端的五个末端核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。与中心三联体外部的靶序列相比含有凸起的ADAR94-1(参见PCT/EP2017/065467)在HEPA1-6和CMT-64细胞系中进行测试。HEPA1-6衍生自在C57/L小鼠中出现的BW7756小鼠肝细胞瘤。CMT-64分离自C57BL/lcrf小鼠的原发性肺泡肿瘤肿块中。在转染前24h将细胞接种在6孔板中，密度对于HEPA1-6为1.75x10⁵细胞/孔，对于CMT-64为1.5x10⁵细胞/孔。两种细胞系在常规培养基(DMEM+10％FBS)中培养。细胞或未转染(NT对照)，用不相关的非靶向寡核苷酸(NTO对照；200nM的50聚体寡核苷酸)转染，或用终浓度为100nM的ADAR94-1加上认为进一步稳定AON的小鼠特异性Snrpa相关的正义寡核苷酸(SON2，参见图2)转染，根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)。未公布的专利申请GB 1700939.0描述使用保护性正义寡核苷酸(SON)以在RNA编辑中进一步稳定反义寡核苷酸(AON)。将ADAR94-1和SON2稀释至100μM储液并以1：1的比例混合，并用以下退火程序孵育：60℃5分钟，55℃5分钟，50℃5分钟，45℃5分钟，40℃5分钟，35℃5分钟，30℃5分钟，20℃5分钟，10℃直至使用。在转染之前，将培养基更换为1.7mL/孔新鲜培养基并加入转染混合物(300μl)，总共2mL/孔。转染后24h，向每个孔中加入2mL新鲜培养基。将细胞再孵育24h。然后，除去培养基，用1×PBS洗涤细胞一次，然后向每个孔中加入350μl Trizol进行细胞裂解。然后收集裂解的细胞，按照制造商提供的说明书用Direct-Zol RNA miniprep(Zymo)提取RNA。选择不使用该试剂盒的柱上DNAse，而是使用TURBO DNA-free^TM试剂盒对RNA样品进行DNAse处理。为此，向每个样品中加入0.5μl RNAse抑制剂，其余步骤根据制造商的说明书进行。使用Nanodrop测量RNA浓度，并使用Maxima Reverse Transcriptase试剂盒(ThermoFisher Scientific)使用制造商的方案将400ng RNA用于cDNA合成。使用正向引物Fw1_mSNRPA(5’-GCCTTCGTGGAGTTTGACA-3’SEQID NO:13)和反向引物Rev1_mSNRPA(5’-ACACACGGCTCTGAGAAGGT-3’SEQ ID NO:14)，使用本领域技术人员通常已知的方法进行PCR。PCR产物在Agilent 2100生物分析仪上检查，并用Nucleo-Spin Gel和PCR clean-up试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。用测序引物Snrp-1-Fw1(5’-CGTGGAGTTTGACAATGAAGT-3’SEQ ID NO:15)对纯化的产物进行测序。

HEPA1-6细胞的测序结果显示在图10A中，CMT64细胞的测序结果显示在图10B中。显然，未转染的(NT，左组)和非靶向寡核苷酸(NTO，中组)对照显示在终止密码子处没有可检测的RNA编辑(箭头指示的终止密码子的中间位置)。然而，正如在右组中清楚可见，当使用ADAR94-1寡核苷酸(这里与保护性SON2寡核苷酸组合)时，在HEPA1-6细胞中和CMT64细胞中都可检测到显著的RNA编辑。图11显示该SNRPA RNA编辑也可以在没有保护性SON的情况下实现，但是添加SON提高了RNA编辑水平。该+/-SON实验的程序与上述相似并在HEPA1-6细胞中进行。

这些结果显示，使用内源性ADAR酶能够对内源性靶RNA序列实现RNA编辑，在该非限制性实例中，使用Snrpa靶RNA作为模型。重要的是，它表明当AON的中心三联体由三个连续的DNA核苷酸组成时(而AON的其余部分由RNA核苷酸组成，优选经2’-O-甲基修饰)，可以实现非常清楚且显著的RNA编辑水平。

因此，在一个优选的方面，本发明涉及包含3个连续核苷酸的中心三联体的编辑RNA的AON，其中与靶腺苷直接相对的核苷酸是中心三联体的中间核苷酸，其中所述中心三联体中的1个、优选2个、甚至更优选所有3个核苷酸是DNA核苷酸，以使得AON更稳定和/或更有效地诱导靶腺苷的脱氨基。在另一个优选的方面，AON的其余部分由RNA核苷酸组成，优选经2’-O-甲基修饰。

实施例7.内源性ADAR对于离体内源性靶标的RNA编辑

在发现了先前实施例中描述的Snrpa靶序列的体外ADAR介导RNA编辑的证据后，研究是否有可能使用相同的ADAR94-1寡核苷酸(参见图2和实施例6)，用鼠野生型原代肺细胞中的内源性ADAR蛋白实现离体RNA编辑。使用来自Miltenyi Biotec的小鼠肺解离试剂盒(Article nr.130-095-927)从具有C57BL/6J背景的小鼠中分离细胞。简言之，根据制造商在无菌条件下制备所有试剂。通过CO₂窒息处死小鼠并用PBS灌注。然后从体内解剖小鼠肺并转移到冰上含有PBS的50ml管中。随后将小鼠肺切成单叶并转移到含有试剂盒特异性酶混合物的gentleMACS C-管中。使用gentleMACS程序37C_m_LDK_1处理组织。在程序终止后，将样品应用于MACS SmartStrainer(70μm)并在4℃下以300×g离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10ml DMEM+10％FBS中，计数并在合适的培养瓶中培养直至进一步处理。为了转染，将细胞以3.0x10⁵个细胞/孔的密度种板。如实施例6中所述，寡核苷酸与SON2退火。细胞或未转染(NT)，用终浓度100nM的靶向人SNRPA序列的寡核苷酸(ADAR87-1+SON2)转染，或用终浓度100nM的靶向小鼠Snrpa序列的寡核苷酸(ADAR94-1+SON2)转染，按照制造商的方案，使用Turbofect(ThermoFisher Scientific)。对于ADAR87-1的序列，请参见图2(另见PCT/EP2017/065467)。转染后6h，用新鲜DMEM+10％FBS替换培养基，转染后细胞总共培养48h。在这48h后，用1xPBS洗涤细胞一次，并向每个孔中加入350μl Trizol用于细胞裂解。根据制造商的方案用Direct-Zol RNA miniprep(Zymo)提取RNA。使用Nanodrop测量RNA浓度，并根据制造商的方案使用Maxima Reverse Transcriptase试剂盒(ThermoFisher Scientific)将500ng RNA用于cDNA合成。使用正向引物Fw2_mSNRPA(5’-GCTCTCCATGCTCTTCAACC-3’SEQ IDNO:16)和反向引物Rev2_mSNRPA(5’-TCAGGGACTGAGCCAAGG-3’SEQ ID NO:17)，使用本领域技术人员通常已知的方法进行PCR。PCR产物在Agilent2100生物分析仪上检查，并用Nucleo-Spin Gel和PCR clean-up试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。用测序引物Snrp-1-Fw1(见上文)对纯化的产物进行测序。测序结果显示在图12中。TAG终止密码子中的靶向的A用箭头表示。ADAR介导的编辑将在DNA序列中作为TAG密码子中A峰下的G峰可见。未转染的(NT，左)和非靶向的对照寡核苷酸(ADAR87-1+SON2，中间)在TAG终止密码子处未显示可检测的RNA编辑。然而，当用ADAR94-1+SON2(右组)转染细胞时，在TAG终止密码子中观察到清楚的可检测编辑。

结论是，使用内源性Snrpa靶RNA作为模型，可以用内源性ADAR实现RNA编辑。此外，由于本实施例中使用的细胞直接从小鼠中分离，因此表明使用(治疗性)寡核苷酸对内源性靶标使用内源性ADAR进行位点特异性RNA编辑在体内可行。除此之外，并且如实施例6中已经显示，它表明当靶向AON的中心三联体由三个连续的DNA核苷酸组成时(而AON的其余部分由优选2’-O-甲基修饰的RNA核苷酸组成)，用内源性水平的ADAR可以实现非常清楚和显著水平的RNA编辑。

实施例8.通过ddPCR测量的鼠WT原代肺细胞中对Snrpa(前)mRNA的RNA编辑

此外，对在所谓中心三联体外部位置的核苷的化学修饰进行研究，以进一步改善RNA编辑能力。如前面的实施例中所述，使用ADAR89-10、-15和-20也在Snrpa模型中测试。在-1位处的核苷的核糖经2’-O-甲基修饰，并且对+2和+3位的核苷修饰如下：ADAR89-10中2’-O-甲基，ADAR89-15中脱氧核糖(DNA)，以及ADAR89-20中2’-NH₂(图2)。如先前实施例中所述，在原代肺细胞测定中测试这些AON的编辑能力，并通过ddPCR技术如下进行分析。使用BioRad的QX-200液滴数字PCR系统进行核酸靶序列的绝对定量。将1μl从RT-PCR(1/10稀释)获得的cDNA用于20μl反应混合物的总混合物中，包括无dUTP的用于探针的ddPCR Supermix(Bio Rad)，进行Taqman SNP基因型测定(Thermo Fisher Scientific)，结合以下基因特异性探针的相关正向和反向引物为：

正向引物5’-GCAAGGCTTTAAGATCACACAAA-3’(SEQ ID NO：18)

反向引物5’-GGAAGGGACTGGGGTACTC-3’(SEQ ID NO：19)

wt探针(HEX IBFQ标记)

5’-TTTGCCAAGAAGTAGCGCCTTTCCCT-3’(SEQ ID NO：20)

突变型探针(FAM IBFQ标记)

5’-TTTGCCAAGAAGTGGCGCCTTTCCCT-3’(SEQ ID NO：21)

使用多通道移液管将总体积为20μl的包含cDNA的PCR混合物填充到ddPCR盒(BioRad)的中间行中。重复分为两个盒。底部行填充70μl用于探针的液滴生成油(Bio Rad)。更换橡胶垫圈后，在QX200液滴发生器中产生液滴。将来自盒顶行的40μl油乳液转移至96孔PCR板。使用PX1平板密封器在170℃下用锡箔密封PCR板4秒，然后进行以下PCR程序：1个循环的酶活化在95℃下进行10分钟，40个循环的变性在95℃下进行30秒，以及退火/延伸在63.8℃下进行1分钟，1个循环的酶失活在98℃下进行10分钟，然后在8℃下储存。在PCR程序后，读取平板并用QX200液滴读数器分析，设置如下：绝对定量，无dUTP的用于探针的Supermix，Ch1 FAM野生型和CH2 HEX突变型。图13中提供的结果显示，所有AON均实现靶RNA的显著编辑，ADAR89-20表现最佳。

实施例9.靶向小鼠IDUA RNA以进行RNA编辑的AON中的化学修饰

然后，发明人自问是否可以进一步组合产生稳定化的修饰，以及具有这种组合的AON是否将在Hurler模型中的RNA编辑中起作用(也参见实施例2)。在测量由小鼠Idua基因编码的α-L-艾杜糖苷酶的活性的测定中，测试这些AON对恢复野生型序列的影响。为此，将来自W392X突变小鼠的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(每个样品70,000个)在生长培养基(DMEM/10％FCS)中培养，并使用Lipofectamine 3000用1μg携带全长Idua W392X cDNA的表达质粒转染。在24h后，用100nM(终浓度)的ADAR65系列的各AON(参见图5和6的稳定性结果)类似地转染细胞，并培养另外48h。然后收集细胞并在mPER缓冲液(Thermo Scientific#78501)中裂解。通过离心从裂解物中除去细胞片段，并将25μl上清液用于酶促5测定：将25μl在0.4M甲酸钠缓冲液(pH 3.5)中的360μM 4-甲基伞形基(umbelliferyl)α-L-艾杜糖醛酸酯(iduronide)加入裂解物样品，然后在37℃下孵育2h。通过加入200μl 0.17M甘氨酸缓冲液(pH 9.9)终止反应，然后测量所得荧光强度(激发波长365nm和发射波长450nm)。将结果标准化为样品的总蛋白质浓度，如通过BCA测定(Pierce^TM BCA蛋白质测定试剂盒，ThermoScientific)测量的10。

图14中提供的结果显示，所有转染的ADAR65寡核苷酸与未转染(NT)水平相比都能够增加α-L-艾杜糖醛酸酶活性，表明靶(前)mRNA得到编辑。似乎大多数应用的AON实际上非常有效地编辑靶RNA。与稳定性测定(图5和6)比较可以看出，许多AON(特别是ADAR65-23至ADAR65-30)显示高稳定性并且还显示恢复α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活性的良好能力，表明在中心三联体内使用DNA核苷酸和2’-氟代修饰以及硫代磷酸酯键是有用的，因此是本发明的优选实施方式。

Claims

1.一种反义寡核苷酸(AON)，其能够与细胞中、优选人细胞中靶RNA序列形成双链复合物，用于通过所述细胞中存在的ADAR酶使所述靶RNA序列中的靶腺苷脱氨基，所述AON包含3个连续核苷酸的中心三联体，其中与所述靶腺苷直接相对的核苷酸是所述中心三联体的中间核苷酸，其中所述中心三联体中的1、2或3个核苷酸包含糖修饰和/或碱基修饰，以使所述AON更稳定和/或更有效地诱导所述靶腺苷的脱氨基；条件是所述中间核苷酸不具有2’-O-甲基修饰。

2.根据权利要求1所述的AON，其中所述中心三联体中的2或3个核苷酸不具有2’-O-甲基修饰。

3.根据权利要求1或2所述的AON，其中所述中心三联体中的2或3个核苷酸不具有2’-O-烷基修饰。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的AON，其中所述中心三联体中的1或2个核苷酸被肌苷取代，优选不是中间核苷酸被肌苷取代。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的AON，其中所述AON不包含能够形成分子内茎-环结构的部分，所述分子内茎-环结构能够结合哺乳动物ADAR酶。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的AON，其中所述糖修饰选自脱氧核糖(DNA)、解锁核酸(UNA)和2’-氟核糖。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的AON，其中所述AON包含至少一种选自硫代磷酸酯、3’-亚甲基膦酸酯、5’-亚甲基膦酸酯、3’-氨基磷酸酯和2’-5’-磷酸二酯的核苷间键修饰。

8.根据权利要求7所述的AON，其中所述AON的5’和3’末端的2、3、4、5或6个末端核苷酸通过硫代磷酸酯键连接，优选其中所述5’和3’末端处的末端5个核苷酸通过硫代磷酸酯和/或LNA键连接。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的AON，其中所述碱基修饰选自2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、3-脱氮腺苷、7-脱氮腺苷、7-甲基腺苷、8-叠氮基腺苷、8-甲基腺苷、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞苷、吡咯并胞苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-脱氮鸟苷、7-甲基鸟苷、8-氮杂-7-脱氮鸟苷、噻吩并鸟苷、肌苷、4-硫代尿苷、5-甲氧基尿苷、二氢尿苷和假尿苷。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的AON，其中所述中心三联体中的中间核苷酸是胞苷或尿苷。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的AON，其中所述AON中的在所述中心三联体外的一个或多个核苷酸包含选自以下的修饰：DNA、2’-O-烷基比如2’-O-甲基、2’-O-MOE基、2’-F基、2’-NH2基和LNA；或其组合。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的AON，其中所述AON长于10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸，并且其中所述AON短于100个核苷酸，优选短于60个核苷酸。

13.根据权利要求12所述的AON，其中所述AON包含18至70个核苷酸，优选包含18至60个核苷酸，更优选包含18至50个核苷酸。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的AON，以及药学上可接受的载体。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的AON，其用于治疗或预防遗传性疾病，所述遗传性疾病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合征、进行性神经性腓骨肌萎缩症、肺慢性阻塞性疾病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker肌肉萎缩症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、因子V莱顿相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇病、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、血友病、遗传性血细胞色素沉着症、Hunter综合征、亨廷顿氏舞蹈症、炎性肠病(IBD)、遗传性多聚凝集综合征、莱伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合征、Lynch综合征、Marfan综合征、粘多糖贮积症、肌肉萎缩症、I型和II型强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、A型、B型和C型Niemann-Pick病、NY-eso1相关癌症、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮酸尿症、庞佩氏病、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病比如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞血症、脊髓性肌萎缩症、斯特格氏病、泰-萨克斯病、Usher综合征、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征和癌症。

16.根据权利要求1至13中任一项所述的AON在制备用于治疗或预防遗传性疾病的药物中的用途，所述遗传性疾病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合征、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合征、进行性神经性腓骨肌萎缩症、肺慢性阻塞性疾病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩症(DSMA)、Duchenne/Becker肌肉萎缩症、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、因子V莱顿相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇病、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、血友病、遗传性血细胞色素沉着症、Hunter综合征、亨廷顿氏舞蹈症、炎性肠病(IBD)、遗传性多聚凝集综合征、莱伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合征、Lynch综合征、Marfan综合征、粘多糖贮积症、肌肉萎缩症、I型和II型强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、A型、B型和C型Niemann-Pick病、NY-eso1相关癌症、Peutz-Jeghers综合征、苯丙酮酸尿症、庞佩氏病、原发性睫状体病、凝血酶原突变相关疾病比如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞血症、脊髓性肌萎缩症、斯特格氏病、泰-萨克斯病、Usher综合征、X-连锁免疫缺陷、Sturge-Weber综合征和癌症。

17.一种用于使细胞中靶RNA序列中存在的至少一个特定靶腺苷脱氨基的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)向所述细胞提供根据权利要求1至13中任一项所述的AON；

(ii)允许所述细胞摄取所述AON；

(iii)允许所述AON退火至所述靶RNA序列；

(iv)允许包含野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的哺乳动物ADAR酶将所述靶RNA序列中的所述靶腺苷脱氨基成为肌苷；和

(v)任选地鉴定所述RNA序列中所述肌苷的存在。

18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(v)包括：

a)对所述靶RNA序列进行测序；

b)当所述靶腺苷位于UGA或UAG终止密码子中时，评估功能性、延长、全长和/或野生型蛋白质的存在，所述终止密码子通过脱氨基作用编辑成为UGG密码子；

c)当两个靶腺苷位于UAA终止密码子中时，评估功能性、延长、全长和/或野生型蛋白质的存在，所述终止密码子通过两个靶腺苷的脱氨基作用编辑成为UGG密码子；

d)评估前mRNA的剪接是否通过脱氨基作用被改变；或

e)使用功能性读出，其中所述脱氨基作用后的所述靶RNA编码功能性、全长、延长和/或野生型蛋白质。

19.根据前述权利要求中任一项所述的AON或方法，其中所述靶RNA序列编码CFTR(例如编辑1784G＞A突变)、CEP290(例如编辑c.2991+1655A＞G突变)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT；例如编辑9989G＞A突变；或1096G＞A突变)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(GNAQ；例如编辑548G＞A突变)或LRRK2(例如编辑G6055A突变)，或其中所述靶RNA由IDUA基因编码(例如编辑c.1205G＞A(W402X)突变)。