JP2017536366A

JP2017536366A - Ｌｎａキラルホスホロチオエート

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Publication number: JP2017536366A
Application number: JP2017526905A
Authority: JP
Inventors: ナンナアルベク; ヘンリックフリデンランドハンセン; コッホ　トロールス; トロールスコッホ; ジェイコブラバン; クリストフローゼンバーム; ピーターヘッジドーン
Original assignee: ロシュイノベーションセンターコペンハーゲンエーエス
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2017-12-07
Also published as: EP3220921A1; EP3221329A1; WO2016079181A1; JP2017536119A; WO2016079183A1; US20180016575A1; US20180112217A1

Abstract

本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供する。

Description

発明の分野
本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供する。

背景
Koziolkiewicz et al. (NAR 1995 24; 5000-5005)（非特許文献1）は、ホスホロチオエート連結が[全Rp]立体配置、もしくは[全Sp]立体配置、またはジアステレオマーの無作為混合物のいずれかである、15マーのDNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示している。ハイブリッドまたは[全Rs]オリゴヌクレオチドに比べて、[全Rp]は、RNアーゼH依存性分解に対して「より感受性である」ことが判明し、より高い二重鎖熱安定性を有することが判明した。実用化のために、[全Rp]オリゴはそれらの3'末端で[Sp]ホスホロチオエートによって保護すべきであることが示唆されている。

Stec et al. (J. Am. Chem. Soc. 1998, 120; 7156-7167)（非特許文献2）は、オキサチアホスホランアプローチによるPS-オリゴの立体制御された合成における使用のための、5'-DMT-デオキシリボヌクレオシド3'-O-(2-チオ-“スピロ”-4,4-ペンタメチレン-1,2,3-オキサチアホスホラン)の新しいモノマーについて報告している。

Karwowski et al. (Bioorganic & Med. Chem. Letts. 2001 11; 1001-1003)（非特許文献3）は、LNAジヌクレオシドホスホロチオエートの立体制御された合成のためのオキサチアホスホランアプローチを用いている。R立体異性体ジヌクレオチドはヘビ毒ホスホジエステラーゼによって容易に加水分解された。

Krieg et al. (Oligonucleotides 13;491-499)（非特許文献4）は、CpG PS-オリゴによる免疫刺激がそれらのP-キラリティーのキラリティーに依存するかどうかを調査した。CpG PS Rpオリゴは、Spオリゴに比べて、はるかに高いMAPK活性化およびIκB分解の誘導を示した。異なる立体異性体オリゴヌクレオチドの取り込みの差についての証拠はなかった。Rpオリゴヌクレオチドは、急速な分解によると思われる短い持続時間（48時間未満）を有していた。免疫刺激のために、急速な短期使用にはRpキラリティーを有するCpGオリゴ、および長期効果にはSpオリゴが推奨される。

Levin et al. Chapter 7 Antisense Drug Technology 2008; 183-215（非特許文献5）は、ホスホロチオエートのキラリティーについて概観し、特にSp立体異性体のエキソヌクレアーゼ抵抗性により、ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチドのキラリティーがそれらの薬物動態に大いに影響することを確認している。ホスホロチオエートキラリティーのPK効果は、エキソヌクレアーゼ分解を妨げる3'および5'末端での2'修飾により第二世代ASOにおいてあまり著しくないと報告されているが、おそらくはRp末端残基を有する個々の分子はエキソヌクレアーゼに対してより感受性であると考えられ、すなわち、より長い半減期に関して、末端にSp残基を有する分子はより長い半減期を有するであろう。

Wave Life Sciences Poster (TIDES, May 3-6 2014, San Diego)（非特許文献6）: ミポメルセン内の524,288種の可能な異なる立体異性体の計算に基づき、彼らはTm、RNアーゼH動員、親油性、代謝安定性、インビボでの有効性、および特異的活性に関して顕著に異なる7つの立体異性体を例示している。

Wan et al, Nucleic Acids Research, November 14, 2014（非特許文献7）（早期公開）は、ギャップ領域のキラリティーがDNA-オキサザホスホリン（oxazaphospholine）アプローチ（Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 16031-16037（非特許文献8））を用いて制御された31種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示し、ギャップマーのギャップ領域におけるPSキラリティーを制御することで、立体的に無作為なPS ASOの混合物に比べて、治療的適用のために著しい利益が提供されることはないと結論付けた。Wanらはさらに、キラルPS ASOの合成および特徴付けに関連するさらなる複雑さおよび費用が、それらの有用性を最小化するとしている。

Swayze et al., 2007, NAR 35(2): 687-700（非特許文献9）は、LNAアンチセンス化合物は動物において効力を改善するが、著しい肝毒性を引き起こすと報告している。WO 2008/049085（特許文献1）は、LNA隣接領域に2'-O-MOEを含むLNA混合ウィングギャップマーについて報告しており、これらは一定のLNA化合物の毒性を明らかに低減するが、効力を著しく低下させる。

WO 2014/012081（特許文献2）およびWO 2014/010250（特許文献3）は、オリゴヌクレオチドの合成のためのキラル試薬を提供している。

WO 2015/107425（特許文献4）は、キラルに規定されたオリゴヌクレオチドのキラルデザインについて報告しており、一定のキラルに規定された化合物はRNアーゼH切断パターンを変更し得ることを報告している。

WO 2008/049085 WO 2014/012081 WO 2014/010250 WO 2015/107425

Koziolkiewicz et al. (NAR 1995 24; 5000-5005) Stec et al. (J. Am. Chem. Soc. 1998, 120; 7156-7167) Karwowski et al. (Bioorganic & Med. Chem. Letts. 2001 11; 1001-1003) Krieg et al. (Oligonucleotides 13;491-499) Levin et al. Chapter 7 Antisense Drug Technology 2008; 183-215 Wave Life Sciences Poster (TIDES, May 3-6 2014, San Diego) Wan et al, Nucleic Acids Research, November 14, 2014 Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 16031-16037 Swayze et al., 2007, NAR 35(2): 687-700

本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供する。立体的に規定された、なる用語は、本明細書において、立体選択的、なる用語と交換可能に用いられる。

本発明は、少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドであって、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結がSp立体配置またはRp立体配置のいずれかであり、かつヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1個がLNAヌクレオシドである、オリゴヌクレオチドを提供する。

いくつかの態様において、本発明のLNAオリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドである。本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供し；ここでLNAオリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドである。

ギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、本発明のLNAオリゴヌクレオチドのいくつかの態様において、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対の他のヌクレオシドは、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである。

ギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、本発明のLNAオリゴヌクレオチドのいくつかの態様において、少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシド間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結は立体特異的、SpまたはRpである。

本発明のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドのいくつかの態様において、ギャップマーの各ウィングは、少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間の1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。

ギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、本発明のLNAオリゴヌクレオチドのいくつかの態様において、隣接するLNAヌクレオシドの間のすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は立体特異的である。

本発明のオリゴヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドであり、すなわち、少なくとも1個のLNAユニットを含む。本発明のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドのいくつかの態様において、DNAヌクレオシドなどの、他のヌクレオシドユニットをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAユニットなどの、少なくとも1個の2'置換ヌクレオシド類縁体ユニットをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のLNAユニット、少なくとも1個の2'置換ヌクレオシド類縁体ユニット、例えば、少なくとも1個の2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）ユニットまたは少なくとも1個の2'-フルオロ-DNAユニット、および少なくとも1個のDNAユニットを含む。

本発明のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドのいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RNアーゼHを動員することができる領域Y'を含み、これはLNAまたは2'置換ヌクレオシド類縁体ユニットなどの、1〜6個のヌクレオシド類縁体ユニットと5'および3'で隣接している。

いくつかの態様において、ヌクレオシド類縁体ユニットは独立に2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAユニット（モノマー）またはLNAヌクレオシドユニット（モノマー）からなる群より選択される。したがって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1個のLNAユニット、および2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）または2'-フルオロ-DNAユニットなどの少なくとも1個の2'置換ヌクレオシド類縁体ユニットの両方を含む。

いくつかの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、本発明のオリゴヌクレオチド中に存在するヌクレオシド類縁体はLNAユニットである。

いくつかの態様において、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド中のLNAユニットは、(R)-cETおよび(S)-cETを含むか、またはそれらからなる群より選択される。

いくつかの態様において、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド中のLNAユニットは、ベータ-D-オキシLNAユニットを含むか、またはベータ-D-オキシLNAユニットである。

本発明は、本発明の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを含む結合体をさらに提供する。

本発明は、本発明の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容される溶媒（水または食塩水などの）、希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、薬学的組成物をさらに提供する。

本発明は、医学において用いるための、本発明の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは結合体をさらに提供する。

本発明のオリゴマーを含む薬学的および他の組成物も提供する。さらに提供するのは、細胞または組織中の標的核酸、例えば、mRNAまたはマイクロRNAなどのRNAの発現をダウンレギュレートする方法であって、該細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、本発明の1つまたは複数のオリゴマー、結合体または組成物の有効量と接触させる段階を含む方法である。

同様に開示するのは、RNAの発現、または過剰発現に関連する疾患または状態を有することが疑われる、またはそれになりやすい動物（非ヒト動物またはヒト）の処置法であって、非ヒト動物またはヒトに、本発明の1つまたは複数のオリゴマー、結合体または薬学的組成物の治療的または予防的有効量を投与することによる方法である。

本発明は、細胞または組織中の標的核酸の発現を阻害する（例えば、ダウンレギュレートすることにより）方法であって、細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、1つまたは複数のオリゴマー、結合体、またはその薬学的組成物の有効量と接触させて、標的核酸の発現のダウンレギュレーションに影響をおよぼす段階を含む方法を提供する。

本発明は、ギャップ領域内に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含むLNA-ギャップマーオリゴヌクレオチドであって、LNA-ギャップマーが少なくとも1個のベータ-D-オキシLNAヌクレオシドユニットを含む、オリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、ギャップ領域内に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、12ヌクレオチド長よりも長いLNA-ギャップマーオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、LNA-ギャップマーは、少なくとも1個のベータ-D-オキシLNAヌクレオシドユニットまたは少なくとも1個のScETヌクレオシドユニットを含む。

本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなLNAオリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書において記載または特許請求するものなどの、LNAギャップマーであってもよい。そのようなオリゴヌクレオチドは立体選択的と記載してもよい。

いくつかの態様において、本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。立体的に規定されたホスホロチオエート連結を、立体選択的または立体特異的ホスホロチオエート連結と呼んでもよい。

いくつかの態様において、本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対を含み、ここで立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結はRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつここでヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1つはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対の他のヌクレオシドは、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである。

本発明は、同じ核酸塩基配列および化学的修飾（立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外）を有する立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（親）に比べて、インビボまたはインビトロで毒性が低減されている、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド/立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、LNA-ギャップマー、またはミックスマー、トータルマー、または本明細書に開示するほかのオリゴヌクレオチドデザインのうちの一つなどのギャップマーであってもよい。毒性の比較のために、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する。

本発明は、オリゴヌクレオチドにおける立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の使用を提供し、ここでオリゴヌクレオチドは、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含まない同一のオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する。

本発明は、毒性低減オリゴヌクレオチド（立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の合成のための、立体制御性ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）の体内分布を変更する方法であって、
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作製する段階、
b. 段階a.で作製したライブラリを、それらの体内分布についてスクリーニングする段階、
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、変更された（好ましいなどの）体内分布を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を提供する。

いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは異なる立体異性体の混合物であってもよく、したがって本発明の方法は、親オリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性、増強された特異性、変更された体内分布、増強された効力などの、1つまたは複数の改善された特性を有する、個々の立体的に規定されたオリゴヌクレオチド、または個々の立体異性体（子オリゴヌクレオチド）を同定する方法を含み得ることが理解される。

いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、肝臓への増強された体内分布を有する。

いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、増強された肝臓/腎臓体内分布比を有する。

いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、増強された腎臓/肝臓体内分布比を有する。

いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、腎臓への増強された体内分布を有する。

いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、肝細胞での増強された細胞への取込を有する。

いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、腎細胞での増強された細胞への取込を有する。

増強された機能特性を有する化合物に言及する場合、増強は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに関してなされていてもよい。

体内分布試験は典型的にはインビボで実施するが、例えば、異なる種類の細胞中、例えば、インビトロでの肝細胞（例えば、初代肝細胞）または腎細胞（例えば、PTEC-TERT1細胞などの腎上皮細胞）での細胞への取込を比較することにより、インビトロ系で実施してもよい。

本発明のLNAオリゴヌクレオチドの概略図。領域X'およびZ'はLNAヌクレオシドと3'ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含み、かつ、例えば、すべてはそれらの間、ならびに任意に領域X'とY'との間および領域Y'とZ'との間に立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有するLNAヌクレオシドであってもよい。図は、15箇所のヌクレオシド間ホスホロチオエート連結を有する3-10-3ギャップマーオリゴヌクレオチドを示す。ウィング領域X'およびY'におけるヌクレオシド間連結は本明細書に記載のとおりであってもよく、例えば、無作為にRpまたはSpホスホロチオエート連結であってもよい。図1の表部分は、ギャップ領域Y'のすべてのヌクレオシド間連結も無作為に組み込まれたRpまたはSpホスホロチオエート連結（M）である親化合物（P）を提供し、化合物1〜10では、ホスホロチオエート連結のうち1箇所がRpホスホロチオエートヌクレオシド間連結（R）として立体的に規定されている。化合物1〜10において、ホスホロチオエート連結のうち1箇所がSpホスホロチオエートヌクレオシド間連結（S）として立体的に規定されている以外は、図1のとおり。 3箇所のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が、S（化合物#10）またはR（化合物#14）立体配置のいずれかに固定されているLNAオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性（ALT）を、すべてのヌクレオシド間連結がRおよびS立体配置の混合物であるジアステレオ異性体の親混合物（化合物#1）のALTと比較した。肝臓中のオリゴヌクレオチド含有量。腎臓中のオリゴヌクレオチド含有量。脾臓中のオリゴヌクレオチド含有量。それぞれのLNAで3日間処理した細胞の、上清中のLDHレベルおよび細胞内ATPレベルの変化。標的ノックダウン（Myd88）を48時間後に評価した。初代肝細胞におけるインビトロ毒性スクリーニング：それぞれのLNAで3日間処理した細胞の、上清中のLDHレベルおよび細胞内ATPレベルの変化。データは平均値であり、媒体対照に対する割合（％）として表す（#56についてはn=4実験の三つ組で、他のLNAについてはすべてn＝2実験の三つ組）。腎臓近位尿細管細胞におけるインビトロ毒性スクリーニング：10μMおよび30μMのLNA Myd88立体変種で処理したPTEC-TERT1の、9日後に測定した生存度（細胞ATP）。

発明の詳細な説明
LNAモノマー
LNAモノマー（BNAとも呼ぶ）は、リボース環の2'位と4'位との間にビラジカルがあるヌクレオシドである。2'−4'ビラジカルは架橋とも呼ぶ。LNAモノマーは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、オリゴヌクレオチドの相補的DNAまたはRNA配列への結合親和性を増強することが公知であり、典型的にはオリゴヌクレオチド/標的二重鎖を融解するために必要な温度（T_m）の上昇として測定または計算される。

本発明は、オリゴヌクレオチドの合成法において用い得る、LNA-オキサザホスホリンモノマーを提供する。例えば、LNAオキサザホスホリンモノマーは、本明細書における式1A、1B；2A、2B、3A、3B；4A、4B；5A、5B；6A、6B、または7A〜7Hのとおりであってもよい。

オリゴマー
本発明は、細胞内で標的核酸を阻害するなどの、調節する際に用いるためのLNAオリゴマー化合物（本明細書においてLNAオリゴマーまたはLNAオリゴヌクレオチドとも呼ぶ）を使用する。少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、本明細書においてLNAオリゴヌクレオチドまたはLNAオリゴマーと呼んでもよい。オリゴヌクレオチドおよびオリゴマーなる用語は本明細書において交換可能に用いられる。

LNAオリゴマーは、少なくとも1つの「ロックド核酸」（LNA）ヌクレオシド、例えば2'位と4'位との間に共有結合架橋（ラジカルとも呼ぶ）（2'−4'架橋）を含むヌクレオシドを含む。LNAヌクレオシドは「二環式ヌクレオシド」とも呼ぶ。LNAオリゴマーは、典型的には、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、ギャップマーを含むか、またはギャップマーである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、ミックスマーを含むか、またはミックスマーである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、トータルマーを含むか、またはトータルマーである。

いくつかの態様において、オリゴマー中に存在するヌクレオシド類縁体はすべてLNAであり、かつオリゴマーは、任意にDNAヌクレオシドなどのRNAまたはDNAをさらに含んでもよい（例えば、ギャップマーまたはミックスマー中に）。

様々な態様において、本発明の化合物はRNA（ユニット）を含まない。いくつかの態様において、オリゴマーは、線状分子であるか、または線状分子として合成される、単一の連続配列を有する。したがって、オリゴマーは、一本鎖分子であってもよい。いくつかの態様において、オリゴマーは、同じオリゴマー内の同等の領域に相補的な、例えば、少なくとも3、4または5個の連続ヌクレオチドの短い領域（すなわち、二重鎖）を含まない。いくつかの態様において、オリゴマーは（本質的に）二本鎖でなくてもよい。オリゴマーは本質的に二本鎖ではなく、例えばsiRNAではない。いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、（実質的に）相補的オリゴヌクレオチドとの二重鎖の形ではなく、例えば、siRNAではない。

本発明の文脈における「オリゴマー」なる用語は、複数のヌクレオチドの共有結合により生成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を意味する。本明細書において、1個のヌクレオチド（ユニット）をモノマーまたはユニットと呼んでもよい。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」および「モノマー」なる用語は交換可能に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、A、T、G、CまたはUなどの、塩基の配列であることが理解されよう。

いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは10〜20ヌクレオチド長、例えば10〜16ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは12〜20または12〜24ヌクレオチド長、例えば12〜20または12〜24ヌクレオチド長である。

いくつかの態様において、本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、ホスホロチオエートLNAギャップマーオリゴヌクレオチドであって、中心領域のヌクレオシド間連結のうち少なくとも1箇所は立体的に規定されており、かつ中心領域はRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含み；かつ任意にLNAまたは2'置換ヌクレオシド領域（X'）または（Z'）のうち少なくとも1つはベータ-D-オキシLNAヌクレオシドである、オリゴヌクレオチドを提供する。

いくつかの態様において、ギャップマーは、少なくとも5個以上の連続ヌクレオシドの中心領域（Y'）、ならびに1〜6個のLNAまたは2'置換ヌクレオシドを含む5'ウィング領域（X'）および1〜6個のLNAまたは2'置換ヌクレオシドを含む3'ウィング領域（Z'）を含む。

本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、RNアーゼHを動員可能な少なくとも5個以上の連続ヌクレオシドの中心領域（Y'）、ならびに1〜6個のLNAヌクレオシドを含む5'ウィング領域（X'）および1〜6個のLNAヌクレオシドを含む3'ウィング領域（Z'）を含んでもよく、ここで中心領域のヌクレオシド間連結のうち少なくとも1箇所は立体的に規定されており、かつここで中心領域はRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含む。適切には、領域Y'は6、7、8、9、10、11または12個（またはいくつかの態様において13、14、15または16個）の連続ヌクレオチド、例えばDNAヌクレオチドを有してもよく、かつ領域Y'に隣接する領域X'およびZ'のヌクレオチドはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、領域X'およびZ'は1〜6個のヌクレオチドを有し、各側部（X'およびZ'）におけるその少なくとも1個はLNAである。いくつかの態様において、領域X'および領域Z'におけるすべてのヌクレオチドはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはLNAおよびDNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、混合ウィングLNAギャップマーであってもよく、ここでウィング領域の1つにおけるLNAヌクレオシドのうち少なくとも1個（または各ウィングにおける少なくとも1個のLNA）はDNAヌクレオシド、または2'置換ヌクレオシド、例えば2'MOEヌクレオシドで置き換えられている。いくつかの態様において、LNAギャップマーはウィング領域において2'置換ヌクレオシドを含まない。

領域X'-Y'-Z'のヌクレオチドの連続配列におけるヌクレオチドの間のヌクレオシド間連結はすべて、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結であってもよい。いくつかの態様において、領域Y'内のヌクレオシド間連結はすべて、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、領域X'およびY'内のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、領域X'とY'との間および領域Y'とZ'との間のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、領域X'-Y'-Z'の連続ヌクレオシド内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

LNAヌクレオシドに隣接する、またはウィング領域の一方もしくは両方における少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入（任意で、ギャップ領域における、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入を含む）を用いて、オリゴヌクレオチドの生物学的側面を調節してもよく、例えば、毒性側面を調節してもよい。

いくつかの態様において、ギャップ領域におけるホスホロチオエート連結のうち2、3、4または5箇所は立体的に規定されている。いくつかの態様において、ギャップ領域における残りのヌクレオシド間連結は立体的に規定されていない：それらはオリゴヌクレオチド種の集団においてRpおよびSpの（例えば、ラセミ）混合物として存在する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドにおける残りのヌクレオシド間連結は立体的に規定されていない。いくつかの態様において、ギャップ領域におけるすべてのヌクレオシド間連結は立体的に規定されている。本明細書におけるギャップ領域（Y'と呼ぶ）は、RNアーゼHを動員可能なヌクレオチドの領域であり、かつ、例えば、少なくとも5個の連続DNAヌクレオシドの領域であってもよい。いくつかの態様において、ギャップおよびウィング領域におけるすべてのヌクレオシド間連結は立体的に規定されている（すなわち、X'-Y'-Z'内）。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドにおけるすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドにおけるすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

典型的には、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートをRpおよびSpホスホロチオエート連結の無作為混合物（ラセミ混合物とも呼ぶ）として合成する。本発明において、ギャップ領域オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート連結のうち少なくとも1箇所が立体的に規定されている、すなわち、少なくとも75％、例えば少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、または（本質的に）オリゴヌクレオチド試料中に存在するオリゴヌクレオチド分子のすべてで、RpまたはSpのいずれかである、ギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、立体的に規定されている、立体選択的である、または立体的に特定されていると言ってもよい：それらは立体特異的な少なくとも1箇所のホスホロチオエート連結を含む。立体的に規定されたおよび立体的に特定された/立体選択的、なる用語は、本明細書において交換可能に用いてもよい。立体的に規定された、立体選択的および立体的に特定された、なる用語は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結（RpまたはSp）を記載するために用いてもよく、またはそのようなホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを記載するために用いてもよい。立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、任意の1つの位置で少量の別の立体異性体を含み得ることが理解され、例えば、Wanらは、NAR, November 2014において報告したギャップマーの98％の立体選択性を報告している。

いくつかの態様において、オリゴマーのギャップ領域における連結のうち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15箇所は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。

いくつかの態様において、オリゴマー中の連結の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマー中のすべてのホスホロチオエート連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。立体的に規定された（立体特異性）とは、規定されたヌクレオシド間連結におけるRpまたはSpヌクレオシド間連結のいずれかの高い比率、すなわち、少なくとも75％の組み込みを意味することが理解されるべきである。

LNAモノマー（二環式核酸、BNAとも呼ぶ）は、リボース環の2'位と4'位との間にビラジカルがあるヌクレオシドである。2'−4'ビラジカルは架橋とも呼ぶ。LNAモノマーは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、オリゴヌクレオチドの相補的DNAまたはRNA配列への結合親和性を増強することが公知であり、典型的にはオリゴヌクレオチド/標的二重鎖を融解するために必要な温度（T_m）の上昇として測定または計算される。

いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、ギャップマーを含むか、またはギャップマーである。いくつかの態様において、オリゴマー中に存在するヌクレオシド類縁体はすべてLNAである。

本発明の文脈における「オリゴマー」なる用語は、複数のヌクレオチドの共有結合により生成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を意味する。本明細書において、1個のヌクレオチド（ユニット）をモノマーまたはユニットと呼んでもよい。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」および「モノマー」なる用語は交換可能に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、A、T、G、CまたはUなどの、塩基の配列であることが理解されよう。モノマーなる用語は本明細書において、オリゴヌクレオチドの各ユニット（ヌクレオシド/ヌクレオチド）ならびにオリゴヌクレオチド合成において用いられる（ホスホラミダイト）モノマーの両方を記載するために用いる。

利点
治療的適用のためのオリゴヌクレオチドの従来の発見は、遺伝子歩行（gene-walk）と呼ばれる、大きな部分または核酸標的の全体にさえおよぶ、多数の化合物のスクリーニングを含む。そのようなアプローチはmRNA中の利用可能な標的部位を同定する際に有用であるが、インビトロでのハイブリダイゼーション特性に基づいて選択される化合物をもたらす。

本発明は、インビボ（例えば、薬理学的）有用性のための、遺伝子歩行により同定したオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドを最適化するための方法を提供する。特に、本発明のモノマーを、血清タンパク質結合、体内分布、細胞内取込などの、有益なインビボ特性を増強するため、または毒性もしくは炎症感受性などの望ましくない特性を低減するために、オリゴマーの合成において用いてもよい。本発明のモノマーを、インビボでLNAオリゴヌクレオチドの肝毒性を低減するために用いてもよい。LNA肝毒性はモデルマウス系を用いて判定してもよく、例えば、EP 1 984 381を参照されたい。本発明のモノマーを、LNAオリゴヌクレオチドの腎毒性を低減するために用いてもよい。LNA腎毒性はモデルラット系を用いて判定してもよく、Kim-1バイオマーカーを用いて判定することが多い（例えば、WO 2014118267参照）。本発明のモノマーを、インビボでLNAオリゴマーの免疫原性を低減するために用いてもよい。EP 1 984 381によれば、4'-CH₂-O-2'基を有するLNAは特に毒性である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性、生体内安定性、標的親和性、RNアーゼH活性、および/または親油性を有し得る。したがって、本発明は、インビボでのオリゴマーの活性を増強する方法ならびにオリゴマーの薬理学的および/または毒物学的側面を改善する方法の両方を提供する。

利点
RNアーゼH動員
実施例に示すとおり、いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチド（親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有する。事実、本発明者らは、一般に、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の、RNアーゼH動員LNAオリゴヌクレオチド、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドへの導入が、親（立体的に規定されていない）の活性の最大30倍までの、増強されたRNアーゼH動員活性をもたらすことを見出して驚いた。したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、RNアーゼH動員活性が増強されたオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御された（立体特異的とも呼ぶ）ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。

本発明は、RNA標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）のRNアーゼH動員活性を増強するための方法であって：
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作製する段階
b. 段階a.で作製したライブラリを、RNA標的に対するそれらのインビトロRNアーゼH動員活性についてスクリーニングする段階、
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
d. 任意で、段階c.で同定した立体的に規定された変種のうち少なくとも1つを製造する段階
を含む方法を提供する。

本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有するLNAオリゴヌクレオチドを提供する。

それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（例えば、親オリゴヌクレオチド）は、同じ核酸塩基配列および立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外の化学的修飾を有する、立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結以外の化合物の部分、例えば、ヌクレオシド内に、立体的に規定された中心を含んでもよい。

LNAオリゴヌクレオチドにおけるキラルに規定されたホスホロチオエート連結の使用は、驚くことに、RNアーゼH活性の増大をもたらす。これは、ギャップ領域が立体的に規定されたRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含む場合に見られると考えられる。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、少なくとも2箇所のRpおよび少なくとも2箇所のSpの、立体的に規定されたヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、そのギャップ領域内の立体的に規定されたヌクレオシド間連結（ウィング領域に隣接するヌクレオシド間連結を含む）のRp対Spの比率は、約0.25〜約0.75の間である。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、立体的に規定されたRpまたはSpヌクレオシド間連結のいずれかである、少なくとも2箇所の連続ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、立体的に規定されたRpまたはSpヌクレオシド間連結のいずれかである、少なくとも3箇所の連続ヌクレオシド間連結を含む。

いくつかの態様において、例えば、実施例7において提供するRNアーゼH動員アッセイを用いて、LNAオリゴヌクレオチドは、同等の非立体選択的LNAオリゴヌクレオチドに比べて、増強されたヒトRNアーゼH動員活性を有する。いくつかの態様において、RNアーゼH活性の増大は、同等の非立体選択的LNAオリゴヌクレオチド（例えば、親オリゴヌクレオチド）のRNアーゼH活性の少なくとも2×、例えば少なくとも5×、例えば少なくとも10×である。実施例7は、RNアーゼH活性（RNアーゼH動員とも呼ぶ）を評価するために用い得る、適切なRNアーゼHアッセイを提供する。

RNアーゼH活性の、活性における顕著な改善は、ギャップ領域がRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含み、かついくつかの態様において、ギャップ領域が少なくとも2箇所のRpヌクレオシド間連結および少なくとも2箇所のSpヌクレオシド間連結、例えば少なくとも3箇所のRpヌクレオシド間連結および/または少なくとも3箇所のSpヌクレオシド間連結を含んでもよい、LNAギャップマー化合物で見出されることが明らかにされている。

RNアーゼH活性の、活性における顕著な改善は、ギャップ領域のヌクレオシド間連結が立体的に規定されているLNAギャップマー化合物で見出されることが明らかにされている。したがって、いくつかの態様において、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドがある。いくつかの態様において、領域X'および/またはZ'内のヌクレオシド間連結のうち少なくとも1箇所はRpヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、オリゴマー中または領域X'中の最も5'端のヌクレオシド間連結はSpヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、隣接領域X'およびZ'は少なくとも1箇所のSpヌクレオシド間連結および少なくとも1箇所のRpヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴマーまたは領域Z'の3'ヌクレオシド間連結はSpヌクレオシド間連結である。

いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドまたは親オリゴヌクレオチドに比べて、改善された効力を有する。

特異性およびミスマッチ識別力
実施例に示すとおり、いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたミスマッチ識別力（または増強された標的特異性）を有する。事実、本発明者らは、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の、RNアーゼH動員LNAオリゴヌクレオチド、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドへの導入が、増強されたミスマッチ識別力（または標的特異性）をもたらし得ることを見出して驚いた。したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、ミスマッチ識別力（または標的特異性）が増強されたオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性ホスホロチオエートモノマーの使用を提供する。

したがって、本発明は、細胞中のRNA標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）のミスマッチ識別力（または標的特異性）を増強するための方法であって：
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作製する段階
b. 段階a.で作製したライブラリを、RNA標的に対するそれらの活性および存在する少なくとも1つの他のRNAに対するそれらの活性についてスクリーニングする段階、
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、少なくとも1つの他のRNAに対する低減された活性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を提供する。少なくとも1つの他のRNAに対する低減された活性は、意図する標的/意図しない標的（少なくとも1つの他のRNA）の活性の比として判定してもよい。この方法は、増強されたRNアーゼH動員活性および増強されたミスマッチ識別力（すなわち、増強された標的指向特異性）の両方を有する本発明のオリゴヌクレオチドを同定するために、RNA標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）のRNアーゼH動員活性を増強する方法と組み合わせてもよい。

本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたミスマッチ識別力（または増強された標的特異性）を有するLNAオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたRNアーゼH動員活性および増強されたミスマッチ識別力（または増強された標的特異性）を有するLNAオリゴヌクレオチドを提供する。

したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、増強されたミスマッチ識別力（または標的特異性）および増強されたRNアーゼH動員活性を有するオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性/立体制御された（立体的に規定された、または立体特異的と呼ぶこともできる）ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。

いくつかの態様において、立体制御性ホスホラミダイトモノマーはLNA立体特異的ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御性ホスホラミダイトモノマーはDNA立体制御性ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体特異的ホスホラミダイトモノマーは2'修飾立体特異的ホスホラミダイトモノマー、例えば、2'メトキシエチル立体特異的ホスホラミダイトRNAモノマーである。立体特異的ホスホラミダイトモノマーは、いくつかの態様において、オキサザホスホリンモノマー、例えば、DNA-オキサザホスホリンLNA-オキサザホスホリンモノマーであってもよい。いくつかの態様において、立体特異的ホスホラミダイトモノマーは、A、T、U、C、5-メチル-CまたはG核酸塩基からなる群より選択される核酸塩基を含んでもよい。

インビボ最適化
本発明は、インビボ（例えば、薬理学的）有用性のための、遺伝子歩行（gene-walk）により同定したオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドを最適化するための方法を提供する。特に、本発明のモノマーを、血清タンパク質結合、体内分布、細胞内取込などの、有益なインビボ特性を増強するため、または毒性もしくは炎症感受性などの望ましくない特性を低減するために、オリゴマーの合成において用いてもよい。

低減された毒性
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）の毒性を低減する方法であって：
a. 親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作製する段階、
b. 段階a.で作製したライブラリを、細胞中でのそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階、
c. 親オリゴヌクレオチドに比べて、細胞中で低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を提供する。

いくつかの態様において、低減された毒性は低減された肝毒性である。オリゴヌクレオチドの肝毒性は、インビボで、例えば、マウスにおいて評価してもよい。インビボ肝毒性アッセイは、典型的には、ALT、ASTまたはGGTなどの、肝損傷の血清マーカーの定量に基づく。正常の上限の3倍を超えるレベルをインビボ毒性の指標と考える。インビボ毒性は、マウスで、例えば、30mg/kgの単一用量のオリゴヌクレオチド、および7日後の毒性評価（7日インビボ毒性アッセイ）を用いて評価してもよい。

細胞毒性の適切なマーカーには、LDHの上昇、または細胞ATPの減少が含まれ、これらのマーカーを、例えば、初代細胞または細胞培養物を用いて、インビトロで細胞毒性を判定するために用いてもよい。肝毒性の判定のために、初代肝細胞を含む、マウスまたはラット肝細胞を用いてもよい。入手可能であれば、ヒト肝細胞などの初代霊長類肝細胞を用いてもよい。マウス肝細胞において、LDHの上昇は毒性の指標である。細胞ATPの低減は毒性の指標である。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、初代マウス肝細胞において、例えば、実施例8において提供するアッセイを用いて判定して、低減されたインビトロ肝毒性を有する。

いくつかの態様において、低減された毒性は低減された腎毒性である。腎毒性は、血清クレアチニンレベルの上昇、またはkim-1 mRNA/タンパク質の上昇を含む、腎損傷マーカーの使用により、インビボで評価してもよい。適切には、マウスまたは齧歯類を用いてもよい。

インビトロ腎傷害アッセイを用いて腎毒性を評価してもよく、kim-1 mRNA/タンパク質の上昇、または細胞ATPの変化（減少）を含んでもよい。いくつかの態様において、PTEC-TERT1細胞を用いて、例えば、細胞ATPレベルを測定することにより、インビトロで腎毒性を判定してもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、実施例9において提供するアッセイを用いて、PTEC-TERT1細胞で判定して、低減されたインビトロ腎毒性を有する。

毒性を評価するために用い得る、他のインビトロ毒性アッセイには、カスパーゼアッセイ、および細胞生存度アッセイ、例えば、MTSアッセイが含まれる。いくつかの態様において、本発明の毒性低減オリゴヌクレオチドは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結、例えば少なくとも2、3、または4箇所の立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結を含む。実施例は、インビトロおよびインビボで低減された肝毒性を有する、立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結を含む化合物を例示する。いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結は、LNAギャップマーのギャップ領域内に存在する。いくつかの態様において、本発明の毒性低減オリゴヌクレオチドは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたSpヌクレオチド間連結、例えば少なくとも2、3、または4箇所の立体的に規定されたSpヌクレオチド間連結を含む。実施例は、少なくとも1箇所の立体的に規定されたSpヌクレオシド間連結を含む、低減された腎毒性を有する化合物を例示する。いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたSpヌクレオチド間連結は、LNAギャップマーのギャップ領域内に存在する。

本発明は、毒性低減オリゴヌクレオチド、例えば、肝毒性低減または腎毒性低減オリゴヌクレオチドの合成のための立体制御された（立体特異的、または立体的に特定していると呼んでもよい）ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。いくつかの態様において、立体制御されたホスホラミダイトモノマーはLNA立体制御ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御されたホスホラミダイトモノマーはDNA立体制御ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御されたホスホラミダイトモノマーは2'修飾立体制御ホスホラミダイトモノマー、例えば、2'メトキシエチル立体制御ホスホラミダイトRNAモノマーである。立体制御されたホスホラミダイトモノマーは、いくつかの態様において、オキサザホスホリンモノマー、例えば、DNA-オキサザホスホリンLNA-オキサザホスホリンモノマーであってもよい。

本発明のモノマーを、インビトロまたはインビボでLNAオリゴヌクレオチドの肝毒性を低減するために用いてもよい。

LNA肝毒性はモデルマウス系を用いて判定してもよく、例えば、EP 1 984 381を参照されたい。本発明のモノマーを、LNAオリゴヌクレオチドの腎毒性を低減するために用いてもよい。LNA腎毒性はモデルラット系を用いて判定してもよく、Kim-1バイオマーカーを用いて判定することが多い（例えば、WO 2014118267参照）。本発明のモノマーを、インビボでLNAオリゴマーの免疫原性を低減するために用いてもよい。EP 1 984 381によれば、4'-CH₂-O-2'基を有するLNAは特に毒性である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性、生体内安定性、標的親和性、RNアーゼH活性、および/または親油性を有し得る。したがって、本発明は、インビボでのオリゴマーの活性を増強するための方法ならびにオリゴマーの薬理学的および/または毒物学的側面を改善するための方法の両方を提供する。

いくつかの態様において、LNAオリゴヌクレオチドは、同等の非立体選択的LNAオリゴヌクレオチドに比べて、例えば実施例6において提供するアッセイを用いて測定した、低減されたインビボ肝毒性、または例えば実施例8において提供するアッセイを用いて測定した、低減されたインビトロ肝毒性、または例えば実施例9において提供するアッセイを用いて測定した、低減された腎毒性などの、低減された毒性を有する。低減された毒性は、当技術分野において公知の他の方法、例えば、カスパーゼアッセイおよび初代肝細胞毒性アッセイ（例えば、実施例8）を用いて評価してもよい。

標的
オリゴヌクレオチドの標的は、典型的には、生理的条件下でオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な核酸である。標的核酸は、例えば、mRNAまたはマイクロRNAであってもよい（標的遺伝子なる用語に含まれる）。そのようなオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ぶ。

適切には、本発明のオリゴマーは標的遺伝子の発現をダウンレギュレート（例えば、低減または除去）可能である。これに関して、本発明のオリゴマーは、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中の標的遺伝子の阻害に影響をおよぼし得る。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは標的核酸に結合し、正常な発現レベルに比べて少なくとも10％または20％、より好ましくは正常な発現レベル（オリゴマーまたは結合体非存在下での発現レベルなどの）に比べて少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％の発現の阻害に影響をおよぼす。いくつかの態様において、そのような調節は、0.04〜25nM、例えば0.8〜20nMの濃度の本発明の化合物を用いる場合に見られる。同じまたは異なる態様において、発現の阻害は100％未満、例えば98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば70％未満の阻害である。発現レベルの調節は、タンパク質レベルを測定することにより、例えば、標的タンパク質に対して産生させた適切な抗体を用いてのSDS-PAGEと、それに続くウェスタンブロッティングなどの方法により、判定してもよい。または、発現レベルの調節は、mRNAのレベルを測定することにより、例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的RT-PCRにより判定することもできる。mRNAレベルにより測定する場合、適切な用量、例えば0.04〜25nM、例えば0.8〜20nMの濃度を用いる場合のダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの態様において、典型的には、本発明の化合物、結合体または組成物非存在下での正常レベルの10〜20％のレベルまでである。

したがって、本発明は、標的タンパク質および/またはRNAを発現している細胞中の標的タンパク質および/または標的RNAの発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法であって、該細胞に本発明のオリゴマーまたは結合体を投与して、該細胞中の標的タンパク質またはRNAの発現をダウンレギュレートまたは阻害する段階を含む方法を提供する。適切には、細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。投与は、いくつかの態様において、インビトロで行ってもよい。投与は、いくつかの態様において、インビボで行ってもよい。

オリゴマーは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列の逆相補体に対応する、連続ヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。

本発明のオリゴマー（またはその領域）と核酸の標的領域との間の「相補性」の程度を判定する際に、「相補性」（同様に「相同性」または「同一性」）の程度は、オリゴマー（またはその領域）の配列と、それと最もよく整列する標的領域（または標的領域の逆相補体）の配列との間の同一性パーセンテージ（または相同性パーセンテージ）として表す。パーセンテージは、2つの配列間で同一の整列した塩基の数を計数し、オリゴマー中の連続モノマーの総数で除し、かつ100をかけることよって算出する。そのような比較において、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、本発明のオリゴマーと標的領域との間でギャップ内のモノマーの数が異なる区域であるよりも、単なるミスマッチであることが好ましい。

本明細書において用いられる「相同」および「相同性」なる用語は、「同一性」および「同一」なる用語と交換可能である。

「対応の」および「対応する」なる用語は、オリゴマーのヌクレオチド配列（すなわち、核酸塩基または塩基配列）または連続ヌクレオチド配列（第1領域）と、i）標的タンパク質をコードするmRNAなどの、核酸標的の逆相補体の部分配列のいずれかから選択されるさらなる配列の同等の連続ヌクレオチド配列との間の比較を意味する。WO2014/118267は、治療的に関連する多くの標的mRNA、ならびに本発明を用いて最適化し得るオリゴマー配列を提供する（例えば、表1を参照されたく、NCBI Genbank標準はWO2014/118257に開示されるとおりである）。

（表１）

1つの態様において、標的はMyd88、ApoB、およびPTENからなる群より選択される。

「対応するヌクレオチド類縁体」および「対応するヌクレオチド」なる用語は、ヌクレオチド類縁体および天然ヌクレオチド中のヌクレオチドが同一であることを示すことが意図される。例えば、ヌクレオチドの2-デキシリボースユニットがアデニンに連結されている場合、「対応するヌクレオチド類縁体」はアデニンに連結されたペントースユニット（2-デオキシリボースとは異なる）を含む。

本明細書において用いられる「逆相補体」、「逆相補的」および「逆相補性」なる用語は、「相補体」、「相補的」および「相補性」なる用語と交換可能である。

長さ
オリゴマーは、長さが7〜30、例えば7〜26または8〜25、例えば9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチド、例えば長さが10〜20ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの態様において、LNAオリゴマーの長さは10〜16ヌクレオチド、例えば12、13または14ヌクレオシドである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、「小さなLNA」などの7、8、9ヌクレオチド長である。

いくつかの態様において、オリゴマーは、長さが合計10〜22、例えば12〜18、例えば13〜17または12〜16、例えば13、14、15、16連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、オリゴマーは、長さが合計10、11、12、13、または14連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18以下のヌクレオチド、例えば15、16または17ヌクレオチドからなる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、20未満のヌクレオチドを含む。オリゴマー、または連続ヌクレオチド配列の長さの範囲が示される場合、それは範囲に示される下限および上限の長さを含む、例えば、10〜30（またはその間）は、10および30の両方を含むことが理解されるべきである。

いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、20未満、例えば18未満、例えば16以下または15もしくは14以下の長さを有する。

立体選択的LNAモチーフ
前述のとおり、本発明は、少なくとも1つのヌクレオチド対を含むオリゴヌクレオチドであって、ヌクレオチド対の間のヌクレオシド間連結がRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1個がLNAヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドを提供する。そのようなヌクレオチド対は本明細書において「LNAジヌクレオチド」と呼ぶ。LNAジヌクレオチドは立体特異的ホスホロチオエートLNAジヌクレオチドと呼んでもよい。

いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNAジヌクレオチドなどの、複数のLNAジヌクレオチドを含む。

いくつかの態様において、オリゴマーは、5'末端LNAジヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、3'末端LNAジヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、5'および3'末端LNAジヌクレオチドの両方を含み、5'および/または3'末端LNAジヌクレオチドにおけるホスホロチオエート連結の立体特異性は、SpまたはRpホスホロチオエート連結から独立に、または依存して選択されてもよい。

オリゴマーが5'および3'末端LNAジヌクレオチドの両方を含むいくつかの態様において、オリゴマーはギャップマーオリゴヌクレオチドであってもよく、したがって、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の連続DNAヌクレオチドなどの、少なくとも5個以上の連続DNAヌクレオシドの中心領域を含む。立体特異的DNAホスホロチオエートユニットを含むギャップマーは当技術分野において公知である（例えば、Wan et al, NAR November 2014参照）。いくつかの態様において、DNAギャップ領域は、連続DNAユニットの間に少なくとも1箇所の立体特異的PS連結を含む。いくつかの態様において、DNAギャップ領域におけるすべてのホスホロチオエート連結は立体特異的ホスホロチオエート連結である。ホスホロチオエート連結がギャップ領域の一部であるかどうかを考える場合、標準的オリゴヌクレオチド合成法は5'−3'方向に進行するため、5'ウィングとギャップの最初のDNAヌクレオシドとの間のヌクレオシド間連結は、ヌクレオシド間連結がウィングモノマーから始まるため、ウィングの一部であるが、ギャップの3'DNAヌクレオシドと3'ウィング領域の5'ヌクレオシドとの間のヌクレオシド間連結は、ギャップ領域の一部であると考える。

いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、例えば、LNAユニットの間またはLNAと2'置換ヌクレオシドユニットとの間のすべてのヌクレオシド間連結が立体特異的ホスホロチオエート連結であるギャップマーである。いくつかの態様において、ギャップマーであり得る、本発明のオリゴマーは、立体特異的ホスホロチオエート連結またはホスホジエステル連結などの非ホスホロチオエート連結のいずれかである、LNAユニットの間またはLNAと2'置換ヌクレオシドユニットとの間のすべてのヌクレオシド間連結を有する。

スクリーニング法
本発明は、立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列の毒性を低減する方法であって：
a. インビボまたはインビトロで毒性表現型を有する、立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（親）を提供する段階
b. 親ギャップマーオリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（子）のライブラリを作製する段階
c. 段階b.で作製したライブラリをインビボまたはインビトロ毒性アッセイでスクリーニングする段階
d. 立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、1つまたは複数の立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定する段階
を含む方法を提供する。

立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書において開示する、本発明のオリゴヌクレオチドのとおりであってもよい。いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチド、例えば本明細書において開示するLNAギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのライブラリは、少なくとも2、例えば少なくとも5または少なくとも10または少なくとも15または少なくとも20の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。

スクリーニング法は、少なくとも1つの他の機能パラメーター、例えば、RNアーゼH動員活性、RNアーゼH切断特異性、体内分布、標的特異性、標的結合親和性、および/またはインビボもしくはインビトロ効力の1つまたは複数について、子オリゴヌクレオチドをスクリーニングする段階をさらに含んでもよい。

したがって、本発明の方法を用いて、親オリゴヌクレオチドに関連する毒性を低減してもよい。オリゴヌクレオチドの毒性はインビトロまたはインビボで評価してもよい。インビトロアッセイには、カスパーゼアッセイ（例えば、WO2005/023995に開示されているカスパーゼアッセイ参照）または肝細胞毒性アッセイ（例えば、Soldatow et al., Toxicol Res (Camb). 2013 Jan 1; 2(1): 23-39.参照）が含まれる。インビボ毒性は、多くの場合、前臨床スクリーニングで、例えば、マウスまたはラットにおいて同定される。インビボ毒性は肝毒性であり、これは典型的には血清中の肝臓トランスアミナーゼレベル、例えば、ALTおよび/もしくはASTを分析することにより測定し、または、例えば、腎毒性であってもよく、これは腎毒性の分子マーカー、例えば、血清クレアチニンレベル、もしくは腎傷害マーカーmRNA、kim-1のレベルを測定することによりアッセイしてもよい。細胞ATPレベルを用いて、肝毒性または腎毒性などの細胞毒性を判定してもよい。

スクリーニング法により同定した、選択した子オリゴヌクレオチドは、したがって、より安全で有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

立体制御されたモノマー
立体制御されたモノマーは、オリゴヌクレオチド中の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結、すなわちSpまたはRpのいずれかを付与する、オリゴヌクレオチド合成において用いられるモノマーである。いくつかの態様において、モノマーはホスホラミダイトなどのアミダイトであってもよい。したがって、モノマーは、いくつかの態様において、立体制御性/制御されたホスホラミダイトなどの、立体性御製/制御されたアミダイトであってもよい。適切なモノマーは実施例、またはOka et al., J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 16031-16037 9 16031において提供される。同様に、WO 10064146、WO 11005761、WO 13012758、WO 14010250、WO 14010718、WO 14012081、およびWO 15107425も参照されたい。立体制御された/立体制御性なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、立体特異的/立体的に特定されたまたは立体的に規定されたモノマーと呼んでもよい。

立体制御されたモノマーは、したがって、立体制御された「ホスホロチオエート」モノマーと呼んでもよいため。立体制御された、および立体制御性、なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。いくつかの態様において、立体制御性モノマーは、オリゴヌクレオチド合成中に硫化剤と共に用いる場合、新しく組み込んだヌクレオシドの3'側（または伸長したオリゴヌクレオチド鎖の5'側）に立体的に規定されたヌクレオシド間連結を生成する。

立体的に規定されたホスホロチオエート連結を有するギャップ領域
Wanらにおいて報告されたとおり、ホスホロチオエート連結の無作為ラセミ混合物に比べて、ギャップマー中に全てがRpであるまたは全でたSpであるギャップ領域を導入することに利点はほとんどない。本発明は、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入がオリゴヌクレオチドの生物学的特性を実質的に改善し得るという、驚くべき利点に基づいており、例えば、利点の項を参照されたい。これは、ギャップ領域中に1箇所またはいくつか、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を導入すること、あるいはすべてのホスホロチオエート連結を立体的に特定することのいずれかによって達成し得る。

いくつかの態様において、中心領域（Y'）のヌクレオシド間連結の1、2、3、4または5箇所だけが立体選択的ホスホロチオエート連結であり、残りのヌクレオシド間連結は無作為にRpまたはSpである。

いくつかの態様において、中心領域（Y'）のヌクレオシド間連結のすべては立体選択的ホスホロチオエート連結である。

いくつかの態様において、中心領域（Y'）は少なくとも5個の、ホスホロチオエート連結した連続DNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも8または9 DNAヌクレオシド長である。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも10または11 DNAヌクレオシド長である。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも12または13 DNAヌクレオシド長である。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも14または15 DNAヌクレオシド長である。

立体選択的DNAモチーフ
本発明者らは以前、あるDNAジヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性側面に寄与し得ることを特定した（Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013, 23; 302-310）。本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のDNAジヌクレオチドの毒性は、DNAジヌクレオチド、特に毒性、例えば、肝毒性に寄与することが公知のジヌクレオチドのDNAヌクレオシドの間に立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を導入することにより調節してもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、cc、tg、tc、ac、tt、gt、caおよびgcからなる群より選択されるDNAジヌクレオチドモチーフを含み、ここでジヌクレオチドのDNAヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結、例えばSpまたはRpホスホロチオエートヌクレオシド間連結のいずれかである。典型的には、そのようなジヌクレオチドは、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内にあってもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、前述のDNAジヌクレオチドモチーフのリストから、独立せずにまたは独立して選択される、少なくとも2つ、例えば少なくとも3つのジヌクレオチドを含む。

RNアーゼ動員
オリゴマー化合物は、翻訳の立体障害、または他の方法などによる、標的mRNAの非RNアーゼ仲介性分解を介して機能し得ることが理解され、いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、RNアーゼHなどのエンドリボヌクレアーゼ（RNアーゼ）を動員することが可能である。

そのようなオリゴマーは、相補的標的RNAと共に二重鎖に形成されるとRNアーゼを動員することができる、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個の連続ヌクレオチドを含む、少なくとも6個、例えば少なくとも7個の連続ヌクレオチドユニット、例えば少なくとも8個または少なくとも9個の連続ヌクレオチドユニット（残基）の領域からなる、連続ヌクレオチド配列（領域Y'）を含むことが好ましい。RNアーゼを動員することができる連続配列は、本明細書に記載のギャップマーの文脈において言及する領域Y'であってもよい。いくつかの態様において、領域Y'などの、RNアーゼを動員することができる連続配列のサイズは、より大きい、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドのユニットであってもよい。

EP 1 222 309は、RNアーゼH活性を判定するためのインビトロでの方法を提供しており、これを用いてRNアーゼHを動員する能力を判定してもよい。オリゴマーは、相補的RNA標的と共に提供された場合に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法を用い、pmol/l/分で測定して、同じ塩基配列を有するが、DNAモノマーのみを含み、2'置換はなく、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマーの間にホスホロチオエート連結基を有する、DNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて判定した初期速度の少なくとも1％、例えば少なくとも5％、例えば少なくとも10％または20％を超える初期速度を有するならば、RNアーゼHを動員することができると見なされる。

いくつかの態様において、オリゴマーは、相補的RNA標的、およびRNアーゼHと共に提供された場合に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法を用い、pmol/l/分で測定して、RNアーゼHの初期速度が、2'置換はなく、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する、等価のDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて判定した初期速度の1％未満、例えば5％未満、例えば10％未満または20％未満であれば、RNアーゼHを動員することが基本的にできないと見なされる。

他の態様において、オリゴマーは、相補的RNA標的、およびRNアーゼHと共に提供された場合に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法を用い、pmol/l/分で測定して、RNアーゼHの初期速度が、2'置換はなく、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する、等価のDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて判定した初期速度の少なくとも20％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも80％であれば、RNアーゼHを動員することができると見なされる。

典型的には、相補的標的RNAと共に二重鎖に形成されると、RNアーゼを動員することができる、連続ヌクレオチドユニットを形成するオリゴマーの領域は、RNA標的と共にDNA/RNA様二重鎖を形成するヌクレオチドユニットからなる。第1の領域などの、本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでもよく、かつ、例えば、ギャップマー、ヘッドマーまたはテールマーの形であってもよい。

「ヘッドマー」は、領域X'およびそれに連続する領域Y'を含むオリゴマーと定義され、領域Y'の最も5'端のモノマーが領域X'の最も3'端のモノマーに連結されている。領域X'は非RNアーゼ動員ヌクレオシド類縁体の連続配列を含み、領域Y'はRNアーゼによって認識可能かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類縁体モノマーの連続配列（少なくとも7つの連続モノマーなどの）を含む。

「テールマー」は、領域X'およびそれに連続する領域Y'を含むオリゴマーと定義され、領域Yの最も5'端のモノマーが領域X'の最も3'端のモノマーに連結されている。領域X'はRNアーゼによって認識可能かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類縁体モノマーの連続配列（少なくとも7つの連続モノマーなどの）を含み、領域X'は非RNアーゼ動員ヌクレオシド類縁体の連続配列を含む。

いくつかの態様において、オリゴマーの標的領域に対する親和性を増強することに加えて、いくつかのヌクレオシド類縁体はRNアーゼ（例えば、RNアーゼH）結合および切断も仲介する。α-L-LNA（BNA）モノマーはRNアーゼH活性をある程度まで動員するため、いくつかの態様において、α-L-LNAモノマーを含むオリゴマーのギャップ領域（例えば、本明細書において言及する領域Y'）は、RNアーゼHによって認識可能かつ切断可能なより少数のモノマーからなり、ミックスマー構造により高い柔軟性が導入される。

ギャップマー設計
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、LNAギャップマーを含むか、またはLNAギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNアーゼHなどのRNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列、例えば本明細書において領域Y'（Y'）と呼ぶ、少なくとも5、6または7個のDNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、ここで領域Y'は5'および3'の両方で、親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体の領域（これらの領域はそれぞれ領域X'（X'）およびZ'（Z'）と呼ばれる）が、（RNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列の5'および3'で）隣接している。ギャップマーの例はWO2004/046160、WO2008/113832、およびWO2007/146511に開示されている。本発明のLNAギャップマーオリゴマーは、領域X'またはZ'に少なくとも1つのLNAヌクレオシド、例えば、領域X'に少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび領域Z'に少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、領域X'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドまたは領域Z'における少なくとも1つのLNA LNAヌクレオチドは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、領域X'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドおよび領域Z'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、領域X'とY'との間のヌクレオシド間連結を任意に含む、領域X'内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、領域Y'とZ'との間のヌクレオシド間連結を任意に含む、領域Z'内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、領域X'とY'および/またはY'とZ'との間のヌクレオシド間連結を任意に含む、領域X'および領域Z'内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。

いくつかの態様において、RNアーゼを動員することができるモノマーは、DNAモノマー、アルファ-L-LNAモノマー、C4'アルキル化DNAモノマー（PCT/EP2009/050349およびVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）、およびUNA（非連結核酸）ヌクレオチド（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）からなる群より選択される。UNAは、典型的には、リボースのC2-C3 C-C結合が除去されて、非ロックド「糖」残基を形成する、非ロックド核酸である。好ましくは、ギャップマーは、式（5'から3'）、X'-Y'-Z'の（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、ここで：領域X'（X'）（5'領域ウィング）は少なくとも1個の高親和性ヌクレオチド類縁体、例えば少なくとも1個のLNAユニット、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えばLNAユニットからなるか、またはそれらを含み、かつ；領域Y'（Y'）はRNアーゼを動員することができる（mRNA標的などの、相補的RNA分子との二重鎖に形成されると）少なくとも5個の連続ヌクレオチド、例えばDNAヌクレオチドからなるか、またはそれらを含み、かつ；領域Z'（Z'）（3'領域）は少なくとも1個の高親和性ヌクレオチド類縁体、例えば少なくとも1個のLNAユニット、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えばLNAユニットからなるか、またはそれらを含む。

いくつかの態様において、領域X'は1、2、3、4、5もしくは6個のLNAユニット、例えば2〜5個のLNAユニット、例えば3個もしくは4個のLNAユニットを含むか、もしくはそれらからなり；かつ/または領域Z'は1、2、3、4、5もしくは6個のLNAユニット、例えば2〜5個のLNAユニット、例えば3個もしくは4個のLNAユニットからなるか、もしくはそれらを含む。

いくつかの態様において、領域X'は1、2、3、4、5もしくは6個の2'置換ヌクレオチド類縁体、例えば2'MOEを含み；かつ/または領域Z'は1、2、3、4、5もしくは6個の2'置換ヌクレオチド類縁体、例えば2'MOEユニットを含む。

いくつかの態様において、2'位の置換基はF；CF₃、CN、N₃、NO、NO₂、O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはNアルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル、O-アルキル-N-アルキルもしくはN-アルキル-O-アルキルからなる群より選択され、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または無置換C₁-C₁₀アルキルまたはC₂-C₁₀アルケニルおよびアルキニルであり得る。2'置換基の例には、nが1〜約10である、O(CH₂)OCH₃、およびO(CH₂)NH₂、例えば、MOE、DMAOE、DMAEOEが含まれるが、それらに限定されない。

いくつかの態様において、Y'はRNアーゼを動員することができる5、6、7、8、9、10、11もしくは12個の連続ヌクレオチド、またはRNアーゼを動員することができる6〜10個、もしくは7〜9個、例えば8個の連続ヌクレオチドからなるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、領域Y'は少なくとも1個のDNAヌクレオチドユニット、例えば1〜12個のDNAユニット、好ましくは4〜12個のDNAユニット、より好ましくは6〜10個のDNAユニット、例えば7〜10のDNAユニット、例えば8、9または10個のDNAユニットからなるか、またはそれらを含む。

いくつかの態様において、領域X'は3個または4個のヌクレオチド類縁体、例えばLNAからなり、領域X'は7、8、9または10個のDNAユニットからなり、かつ領域Z'は3個または4個のヌクレオチド類縁体、例えばLNAからなる。そのような設計には（X'-Y'-Z'）3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3が含まれる。

さらなるギャップマー設計はWO2004/046160において開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。WO2008/113832は、参照により本明細書に組み入れられている米国特許仮出願第60/977,409号からの優先権を主張し、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーに言及している。いくつかの態様において、本明細書において提示するオリゴマーは、そのようなショートマーギャップマーであってもよい。

いくつかの態様において、オリゴマー、例えば、領域X'は、合計10、11、12、13または14ヌクレオチドユニットの連続ヌクレオチド配列からなり、ここで連続ヌクレオチド配列は式（5'-3'）、X'-Y'-Z'を含むか、またはこの式のものであり、ここで：X'は1、2または3個の親和性増強ヌクレオチド類縁体ユニット、例えばLNAユニットからなり；Y'は、相補的RNA分子（mRNA標的などの）との二重鎖に形成されると、RNアーゼを動員することができる7、8または9個の連続ヌクレオチドユニットからなり；かつZ'は1、2または3個の親和性増強ヌクレオチド類縁体ユニット、例えばLNAユニットからなる。

いくつかの態様においてオリゴマーは、合計10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチドユニットの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は式（5'-3'）、X'-Y'-Z'を含むか、またはこの式のものであり、ここで：X'は1、2、3または4個のLNAユニットを含み；Y'は、相補的RNA分子（mRNA標的などの）との二重鎖に形成されると、RNアーゼを動員することができる7、8、9または10個の連続ヌクレオチドユニット、例えば、DNAヌクレオチドからなり；かつZ'は1、2、3または4個のLNAユニットを含む。

いくつかの態様において、X'は1個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、X'は2個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、X'は3個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Z'は1個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Z'は2個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Z'は3個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Y'は7個のヌクレオチドユニットからなる。いくつかの態様において、Y'は8個のヌクレオチドユニットからなる。いくつかの態様において、Y'は9個のヌクレオチドユニットからなる。一定の態様において、領域Y'は10個のヌクレオシドモノマーからなる。一定の態様において、領域Y'は1〜10個のDNAモノマーからなるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、Y'は1〜9個のDNAユニット、例えば2、3、4、5、6、7、8または9個のDNAユニットを含む。いくつかの態様において、Y'はDNAユニットからなる。いくつかの態様において、Y'はアルファ-L立体配置の少なくとも1個のLNAユニット、例えばアルファ-L立体配置の2、3、4、5、6、7、8または9個のLNAユニットを含む。いくつかの態様において、Y'は少なくとも1個のアルファ-L-オキシLNAユニットを含み、またはここでアルファ-L立体配置のすべてのLNAユニットはアルファ-L-オキシLNAユニットである。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'中に存在するヌクレオチドの数は（ヌクレオチド類縁体ユニット-領域Y'-ヌクレオチド類縁体ユニット）：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、または；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1からなる群より選択される。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'中のヌクレオチドの数は：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群より選択される。一定の態様において、領域X'およびY'のそれぞれは3個のLNAモノマーからなり、かつ領域Y'は8または9または10個のヌクレオシドモノマー、好ましくはDNAモノマーからなる。いくつかの態様において、X'およびZ'はいずれも、それぞれ2個のLNAユニットからなり、かつY'は8または9個のヌクレオチドユニット、好ましくはDNAユニットからなる。様々な態様において、他のギャップマー設計には、領域X'および/またはZ'が3、4、5または6個のヌクレオシド類縁体、例えば2'-O-メトキシエチル-リボース糖（2'-MOE）を含むモノマーまたは2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含むモノマーからなり、かつ領域Y'が8、9、10、11または12個のヌクレオシド、例えばDNAモノマーからなるものであって、領域X'-Y'-Z'は3-9-3、3-10-3、5-10-5または4-12-4モノマーを有するものが含まれる。さらなるギャップマー設計はWO 2007/146511A2に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書において報告するギャップマー設計において、ギャップ領域（Y'）は1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結を含んでもよく、かつギャップ領域の残りのヌクレオシド間連結は、例えば、非立体特異的ヌクレオシド間連結であってもよく、または立体的に規定されたホスホロチオエート連結であってもよい。ギャップ領域が少なくとも5個の連続DNA（または他のRNアーゼH動員ヌクレオシド）を含まないための、ベータ-D-オキシLNAまたはScETヌクレオシドなどのベータ-D-LNAによるギャップ領域（G）の分裂は、通常はRNアーゼH動員を妨害するが、いくつかの態様において、ギャップの分裂はRNアーゼH動員の保持をもたらし得ることが理解される。これは、典型的には、少なくとも3または4個の連続DNAヌクレオシドの保持によって達成され、典型的には、配列特異的または化合物特異的でさえある−Rukov et al., NAR published online on July 28^th 2015を参照されたく、これは、いくつかの場合には標的RNAのより特異的切断を提供するRNアーゼHを動員する、「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。したがって、いくつかの態様において、領域Gは、ベータ-D-オキシLNAヌクレオシドを含んでもよい。いくつかの態様において、LNAヌクレオシドが5'または3'で少なくとも3個の（5'）および3個の（3'）または少なくとも3個の（5'）および4個の（3'）または少なくとも4個の（5'）および3個の（3'）DNAヌクレオシドと隣接し、ここでオリゴヌクレオチドはRNアーゼHを動員することができるように、ギャップ領域Gは、ギャップ領域内にLNAヌクレオチド（例えば、ベータ-D-オキシ、ScETまたはアルファ-L-LNA）を含む。

BNAおよびLNAギャップマー：BNAおよびLNAなる用語は交換可能に用いられる。BNAギャップマーは、少なくとも1つのBNAヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域A）である。LNAギャップマーは、少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域A）である。

本明細書において報告するギャップマー設計において、5'領域（X'）および/または3'領域（Z'）は1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結を含んでもよく、かつ残りのヌクレオシド間連結は、例えば、非立体特異的ヌクレオシド間連結であってもよく、または立体特異的ホスホロチオエート連結であってもよい。いくつかの態様において、領域X'およびY'（5'および3'ウィング領域）のヌクレオシド間連結はすべて立体特異的ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結は立体特異的ホスホロチオエート連結である。

スプライススイッチングオリゴマー
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはスプライススイッチングオリゴマー、すなわち、プレmRNAを標的として、プレmRNAの代替スプライシングを引き起こすオリゴマーである。

スプライススイッチングオリゴマーの標的には、TNF受容体が含まれてもよく、例えば、SSOはWO2007/058894、WO08051306 A1およびPCT/EP2007/061211（参照により本明細書に組み入れられる）において開示されるTNFR SSOの1つまたは複数であってもよい。

スプライススイッチングオリゴマーは、典型的（本質的）にはRNアーゼHを動員することができず、したがって、ギャップマー、テールマーまたはヘッドマー設計は一般に望ましくない。しかし、ミックスマーおよびトータルマー設計はSSOに適した設計である。

スプライススイッチングオリゴマーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおけるジストロフィン欠乏を標的とするためにも用いられている。

ミックスマー
ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの所期の標的を分解するために、RNアーゼ酵素（RNアーゼHなどの）を動員するように設計された化合物である。そのような化合物には、DNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドならびにギャップマー、ヘッドマーおよびテールマーが含まれる。これらの化合物は、典型的には、少なくとも5または6 DNAヌクレオチドの領域を含み、ギャップマーの場合は、いずれかの側に親和性増強ヌクレオチド類縁体が隣接している。

本発明のオリゴマーは、RNアーゼ（RNアーゼHなどの）に無関係のメカニズムにより機能してもよい。非RNアーゼH（または非RNアーゼ）メカニズムにより機能するオリゴマーの例はミックスマーおよびトータルマーである。

「ミックスマー」なる用語は、天然および非天然両方のヌクレオチドを含むオリゴマーを意味し、ここで、ギャップマー、テールマー、およびヘッドマーとは対照的に、5個よりも長い連続配列はなく、いくつかの態様においては4個以上の連続、例えば3個以上の連続天然ヌクレオチド、例えばDNAユニットはない。いくつかの態様において、ミックスマーは5個よりも長い連続配列ヌクレオシド類縁体、例えばBNA（LNA）は含まず、いくつかの態様においては4個以上の連続、例えば3個以上の連続ヌクレオシド類縁体、例えばBNA（LNA）は含まない。そのようなミックスマーにおいて、残りのヌクレオシドは、例えば、DNAヌクレオシド、ならびに/または本明細書において言及するものなどの、非二環式ヌクレオシド類縁体において、例えば、2'-O-MOEおよび/もしくは2'フルオロなどの2'置換ヌクレオシド類縁体であってもよい。

いくつかの態様において、2'位の置換基はF；CF₃、CN、N₃、NO、NO₂、O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはNアルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル、O-アルキル-N-アルキルもしくはN-アルキル-O-アルキルからなる群より選択され、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または無置換C₁-C₁₀アルキルまたはC₂-C₁₀アルケニルおよびアルキニルであり得る。2'置換基の例には、nが1〜約10である、O(CH₂)nOCH₃、およびO(CH₂)nNH₂、MOE、DMAOE、DMAEOEが含まれるが、それらに限定されない。

本発明のオリゴマーはミックスマーであってもよく、事実、様々なミックスマー設計は、特にマイクロRNAを標的とする場合のオリゴマーもしくはその第1の領域（抗miR）、mRNA上のマイクロRNA結合部位（ブロックマー）、またはスプライススイッチングオリゴマー（SSO）として非常に有効である。例えば、WO2007/112754（LNA-AntimiR(商標)）、WO2008/131807（LNAスプライススイッチングオリゴ）を参照されたい。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーはBNAおよび2'置換ヌクレオシド類縁体を、任意にDNAヌクレオシドと共に含んでもよい。例えば、WO07027894およびWO2007/112754を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み入れられる。具体例には、LNA、2'-O-MOEおよびDNA、LNA、2'フルオロおよび2'-O-MOE、2'-O-MOEおよび2'フルオロ、2'-O-MOEおよび2'フルオロおよびLNA、またはLNAおよび2'-O-MOEおよびLNAおよびDNAを含むオリゴマーまたは第1の領域が含まれる。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、ヌクレオチド類縁体および天然ヌクレオチド、または1つの型のヌクレオチド類縁体および第2の型のヌクレオチド類縁体の反復パターンの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。反復パターンは、例えば、1つおきまたは2つおきのヌクレオチドはBNA（LNA）などのヌクレオチド類縁体であり、かつ残りのヌクレオチドはDNAなどの天然ヌクレオチドであるか、もしくは本明細書において言及する2'フルオロ類縁体の2'MOEなどの2'置換ヌクレオチド類縁体であるか、またはいくつかの態様において、本明細書において言及するヌクレオチド類縁体の群から選択されてもよい。LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体の反復パターンは、固定の位置、例えば、5'または3'末端でヌクレオチド類縁体と組み合わせてもよいことが理解される。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーの最初のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類縁体である。

同じであっても、異なってもよい、いくつかの態様において、3'末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの2番目のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類縁体である。

同じであっても、異なってもよい、いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーの7番目および/または8番目のヌクレオチド同じであっても、異なってもよい、いくつかの態様において、3'末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの9番目および/または10番目のヌクレオチドは、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類縁体である。

同じであっても、異なってもよい、いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーの5'末端は、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類縁体である。

前記設計の特徴は、いくつかの態様において、抗miRミックスマーなどの、ミックスマー設計に組み込んでもよい。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、4連続DNAヌクレオチドユニットまたは3連続DNAヌクレオチドユニットよりも長い領域を含まない。いくつかの態様において、ミックスマーは2連続DNAヌクレオチドユニットよりも長い領域を含まない。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、少なくとも2つの連続LNAユニットなどの、少なくとも2個の連続ヌクレオチド類縁体ユニットからなる少なくとも1つの領域を含む。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、少なくとも3つの連続LNAユニットなどの、少なくとも3個の連続ヌクレオチド類縁体ユニットからなる少なくとも1つの領域を含む。

いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、7連続LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体ユニットよりも長い領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、6連続LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体ユニットよりも長い領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、5連続LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体ユニットよりも長い領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、4連続LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体ユニットよりも長い領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、3連続LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体ユニットよりも長い領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、2連続LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体ユニットよりも長い領域を含まない。

以下の態様は、ミックスマーまたはトータルマーオリゴマー（例えば、領域Aのとおり）に適用してもよい。

本発明のオリゴマー（例えば領域A）は、いくつかの態様において、LNAおよび非LNAヌクレオチド（DNAまたは2'置換ヌクレオチド類縁体など）の少なくとも2つの交互領域を含んでもよい。

本発明のオリゴマーは、いくつかの態様において、式：5'([LNAヌクレオチド]_1-5および[非LNAヌクレオチド]_1-4)_2-12.3'の連続配列を含んでもよい。

いくつかの態様において、連続ヌクレオチド配列（またはオリゴマー）の5'ヌクレオチドはLNAヌクレオチドである。

いくつかの態様において、連続ヌクレオチド配列の3'ヌクレオチドはLNAなどのヌクレオチド類縁体であるか、または2、3、4、5個の3'ヌクレオチドはLNAヌクレオチド、もしくは増強された血清安定性をオリゴマーに与える他のヌクレオチド類縁体などのヌクレオチド類縁体である。

いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、式5'([LNAヌクレオチド]_1-5-[非LNAヌクレオチド]_1-4)_2-11-[LNAヌクレオチド]_1-53'を有する。

いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、LNAおよび非LNAヌクレオチドの2、3または4連続領域を有し、例えば、式5'([LNAヌクレオチド]_1-5および[非LNAヌクレオチド]_1-4)_2-3を、任意にさらなる3'LNA領域[LNAヌクレオチド]_1-5と共に含む。

いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、5'([LNAヌクレオチド]_1-3および[非LNAヌクレオチド]_1-3)_2-5を、任意にさらなる3'LNA領域[LNAヌクレオチド]_1-3と共に含む。

いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、5'([LNAヌクレオチド]_1-3および[非LNAヌクレオチド]_1-3)₃を、任意にさらなる3'LNA領域[LNAヌクレオチド]_1-3と共に含む。

いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドはすべてDNAヌクレオチドである。

いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドは独立に、または依存して、DNAユニット、RNAユニット、2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、および2'-フルオロ-DNAユニットからなる群より選択される。

いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドは、（任意に独立に2'置換ヌクレオシド類縁体からなる群より選択され、例えば（任意に独立に）2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、 2'-アミノ-DNAユニット、2'-AP、2'-FANA、2'-(3-ヒドロキシ)プロピル、および2'-フルオロ-DNAユニット、ならびに/またはモルホリノ、ペプチド核酸（PNA）、CeNA、非連結核酸（UNA）、ヘキシトール核酸（HNA）、ビシクロ-HNA（例えば、WO2009/100320参照）などの他の（任意に）糖修飾されたヌクレオシド類縁体からなる群より選択される。いくつかの態様において、ヌクレオシド類縁体は、第1の領域のその標的核酸（または相補的DNAもしくはRNA配列）に対する親和性を増大させる。様々なヌクレオシド類縁体がFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213に開示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドはDNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドならびに任意に親和性増強ヌクレオチド類縁体および/または血清安定性を増強するヌクレオチド類縁体であり得る他のヌクレオチド類縁体（非LNAヌクレオチドの項に挙げるヌクレオチド類縁体などの）を含む。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド類縁体の連続ヌクレオチド配列からなる。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなる。

いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、8〜12、例えば8〜10、または10〜20、例えば12〜18または14〜16塩基の長さである。

いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を有する相補的一本鎖RNA核酸分子と二重鎖を形成することができ、ここで二重鎖は少なくとも65℃などの、少なくとも約60℃のT_mを有する。

T_mアッセイの例：オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドおよびRNA標的（PO）二重鎖を、500mlのRNアーゼ非含有水中3mMになるように希釈し、500mlの2×T_m緩衝液（200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mMリン酸Na、pH7.0）と混合する。溶液を95℃で3分間加熱し、次いで室温で30分間アニーリングさせる。二重鎖の融点（T_m）を、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を用い、Peltier温度プログラマーPTP6を備えたLambda 40 UV/VIS Spectrophotometerで測定する。温度を20℃から95℃まで上昇させ、次いで25℃まで低下させて、260nmで吸光度を記録する。第1の誘導体ならびに融解およびアニーリング両方の極大を用いて、二重鎖のT_mを評価する。

トータルマー
トータルマーは、糖修飾されたヌクレオシド類縁体などの、非天然ヌクレオシドだけを含む一本鎖オリゴマーである。

本発明の第1の領域はトータルマーであってもよく、事実、様々なトータルマー設計は、例えば、特にマイクロRNAを標的とする場合のオリゴマーもしくはその第1の領域（抗miR）として、またはスプライススイッチングオリゴマー（SSO）として、非常に有効である。いくつかの態様において、トータルマーは、反復配列XYXまたはYXYなどの、少なくとも1つのXYXまたはYXY配列モチーフを含むか、またはそれからなり、ここでXはLNAであり、Yは2'-O-MOE RNAユニットおよび2'-フルオロDNAユニットなどの、代わりの（すなわち、非LNA）ヌクレオチド類縁体である。前記配列モチーフは、いくつかの態様において、例えば、XXY、XYX、YXYまたはYYXであってもよい。

いくつかの態様において、トータルマーは、7〜16ヌクレオチドの間、例えば9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド、例えば7〜12ヌクレオチドの間の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。

いくつかの態様において、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも30％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも50％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば95％、例えば100％のBNA（LNA）ユニットを含む。残りのユニットは、2'-O_アルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、LNAユニット、PNAユニット、HNAユニット、INAユニット、および2'MOE RNAユニットからなる群、または2'-OMe RNAユニットおよび2'-フルオロ DNAユニットの群より選択されるものなどの、本明細書において言及する非LNAヌクレオチド類縁体から選択されてもよい。

いくつかの態様において、トータルマーは、LNAユニットだけからなる連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、LNAトータルマーなどのトータルマーは、7〜12ヌクレオシドユニット長である。いくつかの態様において、トータルマー（オリゴマーまたはその第1の領域として）は、WO2009/043353（参照により本明細書に組み入れられる）において言及されるとおり、マイクロRNAを標的としてもよい（すなわち、抗miR）。

いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドならびに任意に親和性増強ヌクレオチド類縁体および/または血清安定性を増強するヌクレオチド類縁体であり得る他のヌクレオチド類縁体を含む。

本発明のオリゴマーによるマイクロRNA調節
いくつかの態様において、成熟マイクロRNAまたはその一部などの、マイクロRNA配列に対応するか、またはそれに完全に相補的な、連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、LNA-抗miR(登録商標)（LNAミックスマーまたはトータルマー）などのオリゴマーオリゴマー。マイクロRNAのインビボ活性を制御する際の本発明の使用は、マイクロRNAは典型的には対象における多くのmRNAを調節するという事実により、最も重要であると考えられる。したがって、治療的抗miRを不活化する能力が非常に望ましい。

多くのマイクロRNAはいくつかの疾患に関連している。例えば、WO2009/043353参照。オリゴマーは、いくつかの態様において、マイクロRNA（の対応する領域）に完全に相補的な連続ヌクレオチド配列を標的としてもよい（すなわち、それを含むか、またはそれからなる。マイクロRNAは、マイクロRNA-21、マイクロRNA-221、miR-122またはmiR-33（miR33a & miR-33b）などの、肝臓発現マイクロRNAであってもよい。

したがって、本発明のいくつかの局面は、マイクロRNAの発現に関連する疾患の処置に関する。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはその第1の領域は、マイクロRNA配列、例えば成熟マイクロRNA配列、例えばmiRBase（http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_summary.pl?org=hsa）において発表されたヒトマイクロRNAに対応するか、またはそれに完全に相補的な、連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、マイクロRNAはウイルスマイクロRNAである。執筆時点で、miRbase 19において、miRBaseには1600の前駆体および各ヒトマイクロRNAの成熟マイクロRNA配列を含む2042の成熟ヒトmiRNA配列があり、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、hsa-miR122（NR_029667.1 GI:262205241）、例えば成熟has-miR-122に対応するか、またはそれに完全に相補的な、連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、hsa-miR122（NR_029667.1 GI:262205241）、例えば成熟has-miR-122に、オリゴマーの長さ全体にわたって対応するか、またはそれに完全に相補的な、連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1の領域がmiR-122を標的とする場合、オリゴマーはC型肝炎感染の処置における使用のためのものである。

いくつかの態様において、オリゴマーが、例えば、代謝症候群、アテローム性硬化症、高コレステロール血症および関連障害などの代謝疾患の処置における使用において、hsa-miR-33、例えばhsa-miR-33a

またはhsa-miR-33b

を標的とする場合。Najafi-Shoushtar et al, Science 328 1566-1569, Rayner et al., Science 328 (1570-1573), Horie et al., J Am Heart Assoc. 2012, Dec 1(6)を参照されたい。代謝疾患において指示される他の肝臓発現マイクロRNAには、miR-758、miR-10b、miR-26およびmiR-106bが含まれ、これらはコレステロール排出を直接調節することが公知である（Daevalos & Fernandez-Hernando, Pharmacol Res. 2013 Feb参照）したがって、標的は、miR-122（MIMAT0004590）、miR-33（MIMAT0000091、MIMAT0003301）、miR-758（MIMAT0003879）、miR-10b（MIPF0000033）、miR-26a（MIMAT0000082）およびmiR-106b（MIMAT0004672）からなる群より選択されるマイクロRNAであり得る。マイクロRNAの参照文献はmiRBase 19版である。

抗miRオリゴマー
好ましいオリゴマーまたはその第1の領域「抗miR」設計およびオリゴマーは、WO2007/112754、WO2007/112753、PCT/DK2008/000344ならびに米国特許第仮出願第60/979217号および第61/028062号において開示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1の領域は、ミックスマーまたはトータルマーである抗miRである。抗miRなる用語は、したがって、オリゴマーなる用語と置き換えてもよい。

抗miRオリゴマーは、マイクロRNA配列、またはその対応する部分配列に完全に相補的な、または本質的に相補的な（すなわち、1個または2個のミスマッチを含んでもよい）連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含むオリゴマーである。これに関して、抗miRは、全成熟マイクロRNAに相補的な、もしくは本質的に相補的な連続ヌクレオチド配列を含んでもよく、または抗miRは成熟マイクロRNAまたはプレ-マイクロRNAの部分配列に相補的な、もしくは本質的に相補的な連続ヌクレオチド配列を含んでもよく、そのような部分配列（およびしたがって対応する連続ヌクレオチド配列）は典型的には少なくとも8ヌクレオチド長、例えば8〜25ヌクレオチドの間、例えば9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24ヌクレオチド長、例えば10〜17または10〜16ヌクレオチドの間、例えば12〜15ヌクレオチドの間である。

抗miRの多くの設計が示唆されており、典型的には治療的使用のための抗miR、例えばその連続ヌクレオチド配列は、1個または複数個のヌクレオチド類縁体ユニットを含む。

いくつかの態様において、抗miRは本明細書に記載のギャップマー構造を有してもよい。しかし、WO2007/112754およびWO2007/112753において説明されているとおり、ミックスマー、またはトータルマーなどの、他の設計が好ましいこともある。

WO2007/112754およびWO2007/112753はいずれも参照により本明細書に組み入れられ、これらは抗miRオリゴマーおよびオリゴマーが成熟マイクロRNAに相補的な抗miRオリゴマー設計を提供する。

いくつかの態様において、抗miRの部分配列はmiRNAシード領域に対応する。いくつかの態様において、オリゴマーの第1または第2の3'核酸塩基はマイクロRNA配列の第2の5'ヌクレオチドに対応する。

いくつかの抗miR態様において、オリゴマーの領域の3'末端から数えてオリゴマーの核酸塩基ユニット1〜6（両端を含む）は、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。

いくつかの抗miR態様において、オリゴマーの領域の3'末端から数えてオリゴマーの核酸塩基ユニット1〜7（両端を含む）は、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。

いくつかの抗miR態様において、オリゴマーの領域の3'末端から数えてオリゴマーの核酸塩基ユニット2〜7（両端を含む）は、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。

いくつかの態様において、抗miRオリゴマーは、miRNAシード領域に相補的な領域内の位置で、少なくとも1個のLNAユニットなどの、少なくとも1個のヌクレオチド類縁体ユニットを含む。抗miRオリゴマーは、いくつかの態様において、miRNAシード領域に相補的な領域内の位置で、1〜6および1〜7のLNAユニットなどの、1〜6または1〜7のヌクレオチド類縁体ユニットを含んでもよい。

いくつかの態様において、本発明の抗miRは7、8または9ヌクレオチド長で、ヒトまたはウイルスマイクロRNAのシード領域に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチドのうち少なくとも80％、例えば85％、例えば90％、例えば95％、例えば100％はLNAである。

いくつかの態様において、本発明の抗miRは7、8または9ヌクレオチド長で、ヒトまたはウイルスマイクロRNAのシード領域に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチドのうち少なくとも80％はLNAであり、かつここでヌクレオチド間結合のうち少なくとも1つの80％、例えば85％、例えば90％、例えば95％、例えば100％はホスホロチオエート結合である。

いくつかの態様において、抗miRは、3'末端から数えて、3〜8の位置に1個または2個のLNAユニットを含む。これは、RNA：RNA二重鎖と構造が似ている二重鎖の、オリゴ：マイクロRNA二重鎖によって形成されるA-ヘリックスの安定性にとって有益と考えられる。

WO2007/112754の48ページ、15行目〜51ページ、9行目の表は、抗マイクロRNAオリゴマー（すなわち、オリゴマーまたはその第1の領域であり得る抗miR）の例を提供し、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

マイクロRNA様物質
いくつかの態様において、オリゴマーは、1つまたは複数のmRNA標的の発現を抑制するために、細胞中に導入することができるmiRNA様物質の形である。miRNA様物質は、典型的には、全長miRNA配列に完全に相補的である。miRNA様物質は、本明細書において提供または言及するmiRNA配列の1つまたは複数の対応する領域に相同の、連続ヌクレオチド配列を含む化合物である。miRNA様物質または抗miRの使用は、（任意に）mRNA標的をさらに抑制するか、またはmiRNAを発現抑制（ダウンレギュレート）し、それにより内因性miRNAの機能を阻害し、mRNA標的の抑制解除および発現増大を引き起こすために、用いることができる。

アプタマー
いくつかの態様において、オリゴマーは治療的アプタマー、すなわちシュピーゲルマー（spiegelmer）であってもよい。アプタマーは、受容体リガンドなどのリガンドであってもよく、したがって、標的指向部分（すなわち、さらなる結合体）として用いてもよいことに留意されたい。本発明の文脈におけるアプタマー（例えば、シュピーゲルマー）は、ヌクレオチドの配列よりもその立体配座構造に基づいて選択された、20〜50ヌクレオチド長の核酸であり、これらはインビボで標的タンパク質と直接結合することによりその治療効果を誘発し、したがって、それらの標的の逆相補体を含まず、事実、それらの標的は核酸ではなく、タンパク質である。オリゴマーまたはその第1の領域であり得る具体的アプタマーには、Macugen（OSI Pharmaceuticals）またはARC1779（Archemix、Cambridge、MA）が含まれる。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1の領域は、アプタマーではない。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1の領域は、アプタマーまたはシュピーゲルマーではない。

本発明のオリゴマーは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。治療のために用いられる化合物の大多数はホスホロチオエートヌクレオチド間連結を用いるが、他のヌクレオシド間連結を用いることもできる。しかし、いくつかの態様において、本発明のオリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、ギャップ領域中の連結はすべてホスホロチオエートであり、かつウィング領域のヌクレオシド間連結はホスホロチオエートまたはホスホジエステル連結のいずれであってもよい。

本明細書に記載のオリゴマーのヌクレオシドモノマーは［ヌクレオシド間］連結基を介して一緒に結合される。適切には、各モノマーは3'隣接モノマーに連結基を介して連結される。

当業者であれば、本発明の文脈において、オリゴマーの末端の5'モノマーは5'連結基を含まないが、5'末端基を含んでもよく、または含まなくてもよいことを理解するであろう。

「連結基」または「ヌクレオチド間連結」なる用語は、2個のヌクレオチドを一緒に共有結合することができる基を意味することが意図される。具体的かつ好ましい例には、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が含まれる。

本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列を、連結基を介して一緒に結合する。適切には、各ヌクレオチドを、連結基を介して3'隣接ヌクレオチドに連結する。

適切なヌクレオチド間連結には、WO2007/031091内に挙げられているもの、例えば、WO2007/031091（参照により本明細書に組み入れられる）の34ページの最初のパラグラフに挙げられているヌクレオチド間連結が含まれる。

いくつかの態様において、ヌクレオチド間連結をその通常のホスホジエステルからヌクレアーゼの攻撃に対してより抵抗性のもの、例えばホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへと修飾することが望ましく、これら2種類の連結はRNアーゼHによって切断可能であり、標的遺伝子の発現を低減する際のアンチセンス阻害の経路も可能にする。

本明細書において提供される適切な硫黄（S）含有ヌクレオチド間連結、例えばホスホロチオエートまたはホスホジチオエートが好ましいこともある。

ギャップマーのために、オリゴマー中のヌクレオチド間連結は、標的化RNAのRNアーゼH切断を可能にするために、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであってもよい。ヌクレアーゼ抵抗性の改善、および製造の容易さなどの他の理由のために、ホスホロチオエートが通常は好ましい。

WO09124238は、中性ヌクレオシド間連結により3'または5'末端に連結された少なくとも1個の二環式ヌクレオシド（LNA）を有するオリゴマー化合物に言及している。したがって、本発明のオリゴマーは、1つまたは複数のホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタールまたはチオホルムアセタールなどの、中性ヌクレオシド間連結により3'または5'末端に連結された少なくとも1個の二環式ヌクレオシドを有してもよい。残りの連結はホスホロチオエートであってもよい。

ヌクレオシドおよびヌクレオシド類縁体
いくつかの態様において、「ヌクレオシド類縁体」および「ヌクレオチド類縁体」なる用語は、交換可能に用いられる。

本明細書において用いられる「ヌクレオチド」なる用語は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間連結基などの共有結合された基（連結基）を含むグリコシドを意味し、DNAまたはRNAなどの天然ヌクレオチド、および本明細書において「ヌクレオチド類縁体」とも呼ぶ、修飾された糖および/または塩基部分を含む非天然ヌクレオチドの両方を含む。本明細書において、単一ヌクレオチド（ユニット）はモノマーまたは核酸ユニットと呼んでもよい。

生化学の分野において、「ヌクレオシド」なる用語は一般に、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを指すために用い、したがってオリゴマーのヌクレオチドの間でヌクレオチド間連結により共有結合されているヌクレオチドユニットを指す場合に用いてもよい。バイオテクノロジーの分野において、「ヌクレオチド」なる用語は、核酸モノマーまたはユニットを指すために用いることが多く、したがって、オリゴヌクレオチドの文脈において、塩基を指すこともあり、例えば、「ヌクレオチド配列」は、典型的には核酸塩基配列を意味する（すなわち、糖骨格およびヌクレオシド間連結の存在が暗に示される）。同様に、特にヌクレオシド間連結基の1つまたは複数が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」なる用語は「ヌクレオシド」を指すこともあり、例えば、ヌクレオシド間の連結の存在または性質を明記している場合であっても、「ヌクレオチド」なる用語を用いてもよい。

当業者であれば理解するであろうとおり、オリゴヌクレオチドの5'末端ヌクレオチドは5'ヌクレオチド間連結基を含まないが、5'末端基を含んでもよく、または含まなくてもよい。

非天然ヌクレオチドには、二環式ヌクレオチドなどの修飾糖部分を有するヌクレオチド、または2'置換ヌクレオチドなどの2'修飾ヌクレオチドが含まれる。

「ヌクレオチド類縁体」は、糖および/または塩基部分の修飾による、DNAまたはRNAヌクレオチドなどの天然ヌクレオチドの変種である。類縁体は、原理的には、オリゴヌクレオチドの文脈において、天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」または「等価」であり得、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するようはたらくやり方に、機能的効果を持たない。そのような「等価」の類縁体は、それにもかかわらず、例えば、製造がより容易もしくは安価である、または保存もしくは製造条件に対してより安定である、またはタグもしくは標識に相当するならば、有用であり得る。しかし、好ましくは、類縁体は、例えば、標的に対する高い結合親和性および/または細胞内ヌクレアーゼに対する高い抵抗性および/または細胞への輸送の高い容易さを生じることにより、オリゴマーが発現を阻害するようはたらくやり方に機能的効果を有する。ヌクレオシド類縁体の具体例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213によって記載され、以下のスキーム1に示される。

したがって、オリゴマーは、天然ヌクレオチド、好ましくは2'-デオキシヌクレオチド（本明細書において一般に「DNA」と呼ぶ）であるが、おそらくはリボヌクレオチド（本明細書において一般に「RNA」と呼ぶ）、またはそのような天然ヌクレオチドと、1つもしくは複数の非天然ヌクレオチド、すなわちヌクレオチド類縁体との組み合わせの単純な配列を含むか、またはそれからなってもよい。そのようなヌクレオチド類縁体はオリゴマーの標的配列に対する親和性を適切に増強し得る。

適切かつ好ましいヌクレオチド類縁体の例は、WO2007/031091により提供されるか、またはその中で言及される。

オリゴマー、例えばLNAまたは2'-置換糖における親和性増強ヌクレオチド類縁体の組み込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズ低下を可能にし得、非特異的または異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズの上限も低下させ得る。

いくつかの態様において、オリゴマーは少なくとも1個のヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは少なくとも2個のヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは3〜8個のヌクレオチド類縁体、例えば、6または7個のヌクレオチド類縁体を含む。最も好ましい態様において、前記ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも1個はロックド核酸（LNA）であり；例えば、ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または8個はLNAであり得る。いくつかの態様において、すべてのヌクレオチド類縁体はLNAであり得る。

ヌクレオチドだけからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する場合、その配列によって規定される本発明のオリゴマーは、該配列中に存在するヌクレオチドの1つまたは複数の代わりに、オリゴマー/標的二重鎖の二重鎖安定性/T_mを上げる、対応するヌクレオチド類縁体、例えばLNAユニットまたは他のヌクレオチド類縁体（すなわち、親和性増強ヌクレオチド類縁体）を含んでもよいことが理解されるであろう。

ヌクレオチドのそのような修飾の例には、糖部分を修飾して、結合親和性を増強し、同時にヌクレアーゼ抵抗性の増大を提供し得る、2'置換基を提供すること、または架橋（ロックド核酸）構造を生じることが含まれる。

好ましいヌクレオチド類縁体は、LNA、例えばオキシ-LNA（ベータ-D-オキシ-LNA、およびアルファ-L-オキシ-LNAなどの）、および/またはアミノ-LNA（ベータ-D-アミノ-LNAおよびアルファ-L-アミノ-LNAなどの）および/またはチオ-LNA（ベータ-D-チオ-LNAおよびアルファ-L-チオ-LNAなどの）および/またはENA（ベータ-D-ENAおよびアルファ-L-ENAなどの）である。最も好ましいのはベータ-D-オキシ-LNAである。

いくつかの態様において、本発明のオリゴマー内（本明細書において言及する領域X'およびY'内などの）に存在するヌクレオチド類縁体は、独立に、例えば：2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、LNAユニット、アラビノ核酸（ANA）ユニット、2'-フルオロ-ANAユニット、HNAユニット、INA（インターカレーティング核酸、Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、参照により本明細書に組み入れられる）ユニットおよび2'MOEユニットから選択される。いくつかの態様において、本発明のオリゴマー内には前述のヌクレオチド類縁体の型の1つ、またはその連続ヌクレオチド配列だけが存在する。

いくつかの態様において、ヌクレオチド類縁体は2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマーまたはLNAヌクレオチド類縁体であり、したがって本発明のオリゴヌクレオチドは、これら3つの型の類縁体から独立に選択されるヌクレオチド類縁体を含んでもよく、または3つの型から選択される類縁体の1つの型だけを含んでもよい。いくつかの態様において、前記ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも1つは2'-MOE-RNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-MOE-RNAヌクレオチドユニットである。いくつかの態様において、前記ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも1つは2'-フルオロDNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-フルオロ-DNAヌクレオチドユニットである。

いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、少なくとも1個のロックド核酸（LNA）ユニット、例えば1、2、3、4、5、6、7、または8個のLNAユニット、例えば3〜7個、もしくは4〜8個のLNAユニット、または3、4、5、6もしくは7個のLNAユニットを含む。いくつかの態様において、すべてのヌクレオチド類縁体はLNAである。いくつかの態様において、オリゴマーはベータ-D-オキシ-LNA、および以下のLNAユニットの1つまたは複数の両方を含んでもよい：ベータ-Dもしくはアルファ-L配置のいずれか、またはその組み合わせのチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および/またはENA。いくつかの態様において、すべてのLNAシトシンユニットは5'メチル-シトシンである。本発明のいくつかの態様において、オリゴマーはLNAおよびDNAユニットの両方を含んでもよい。好ましくは、LNAおよびDNAユニットを合わせた合計は10〜25個、例えば10〜24個、好ましくは10〜20個、例えば10〜18個、さらにより好ましくは12〜16個である。本発明のいくつかの態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列、例えば連続ヌクレオチド配列は、少なくとも1個のLNAからなり、残りのヌクレオチドユニットはDNAユニットである。いくつかの態様において、オリゴマーは、任意でホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオチド間連結を有する、LNAヌクレオチド類縁体および天然ヌクレオチド（例えばRNAまたはDNA、最も好ましくはDNAヌクレオチド）だけを含む。

「核酸塩基」なる用語は、ヌクレオチドの塩基部分を意味し、天然ならびに非天然変種の両方を含む。したがって「核酸塩基」は、公知のプリンおよびピリミジン複素環のみならず、その複素環式類縁体および互変異性体も含む。

核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンが含まれるが、それらに限定されない。

いくつかの態様において、オリゴマー内に存在する核酸塩基のうち少なくとも1つは、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾核酸塩基である。

LNA
「LNA」なる用語は、「ロックド核酸」として公知の、二環式ヌクレオシド類縁体を意味する。これはLNAモノマーを指してもよく、または、「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で用いる場合、LNAは1つまたは複数のそのような二環式ヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチドを指す。LNAヌクレオチドは、例えば、以下に記載するビラジカルR^4* - R^2*として示す、リボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基（架橋などの）の存在によって特徴付けられる。

本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられるLNAは、好ましくは、一般式Iの構造、ならびにその塩基性塩および酸付加塩を有する：

ここで、すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく；
式中、Xは-O-、-S-、-N(R^N*)-、-C(R⁶R^6*)-から選択され、例えば、いくつかの態様において、-O-であり；
Bは水素、置換されていてもよいC_1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC_1-4-アルキル、置換されていてもよいC_1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され；好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり；
Pは、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間連結または5'末端基は任意で置換基R⁵または同等に適用可能な置換基R^5*を含み；
P^*は、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または3'末端基を示し；
R^4*およびR^2*は一緒に、-C(R^aR^b)-、-C(R^a)=C(R^b)-、-C(R^a)=N-、-O-、-Si(R^a)₂-、-S-、-SO₂-、-N(R^a)-、および>C=Zから選択される1〜4つの基/原子からなる二価のリンカー基を示し、ここでZは-O-、-S-、および-N(R^a)-から選択され、かつR^aおよびR^bはそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC_1-12-アルキル、置換されていてもよいC_2-12-アルケニル、置換されていてもよいC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルコキシアルキル、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基R^aおよびR^bは一緒に、置換されていてもよいメチレン（=CH₂）を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく、かつ；
存在する置換基R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*、R⁶およびR^6*はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC_1-12-アルキル、置換されていてもよいC_2-12-アルケニル、置換されていてもよいC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルコキシアルキル、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基は一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを示してもよく；；ここでR^Nは水素およびC_1-4-アルキルから選択され、かつここで2つの隣接（非ジェミナル）置換基はさらなる結合を示して二重結合をもたらしてもよく；かつR^N*は、存在し、ビラジカルに関与しない場合、水素およびC_1-4-アルキルから選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、C(R^aR^b)-C(R^aR^b)-、C(R^aR^b)-O-、C(R^aR^b)-NR^a-、C(R^aR^b)-S-、およびC(R^aR^b)-C(R^aR^b)-O-からなる群より選択される基からなるビラジカルを示し、ここで各R^aおよびR^bは任意で独立に選択されてもよい。いくつかの態様において、R^aおよびR^bは、任意で独立に水素および_C1-6アルキルからなる群より選択されてもよく、例えばメチル、例えば水素である。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、R-またはS-配置のいずれかの、ビラジカル-O-CH(CH₂OCH₃)-（2'O-メトキシエチル二環式核酸、Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、R-またはS-配置のいずれかの、ビラジカル-O-CH(CH₂CH₃)-（2'O-エチル二環式核酸、Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、R-またはS-配置のいずれかの、ビラジカル-O-CH(CH₃)-を示す。いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、ビラジカル-O-CH₂-O-CH₂-（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、ビラジカル-O-NR-CH₃-（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。

いくつかの態様において、LNAユニットは以下の群：

から選択される構造を有する。

いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。

いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は水素である。

いくつかの態様において、R^1*、R²、R³は独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。

いくつかの態様において、R^1*、R²、R³は水素である。

いくつかの態様において、R⁵およびR^5*はそれぞれ独立にH、-CH₃、-CH₂-CH₃、-CH₂-O-CH₃、および-CH=CH₂からなる群より選択される。適切には、いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかは水素であるが、他の基（それぞれR⁵またはR^5*）はC_1-5アルキル、C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニル、置換C_1-6アルキル、置換C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルキニルまたは置換アシル（-C(=O)-）からなる群より選択され；ここで各置換された基はハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニル、置換C_2-6アルキニル、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、COOJ₁、CN、O-C(=O)NJ₁J₂、N(H)C(=NH)NJ,J₂またはN(H)C(=X)N(H)J₂から独立に選択される置換基で一または多置換されており、ここでXはOまたはSであり；かつ各J₁およびJ₂は、独立に、H、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニル、置換C_2-6アルキニル、C_1-6アミノアルキル、置換C_1-6アミノアルキルまたは保護基である。いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかは置換C_1-6アルキルである。いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかは置換メチレンであり、ここで好ましい置換基にはF、NJ₁J₂、N₃、CN、OJ₁、SJ₁、O-C(=O)NJ₁J₂、N(H)C(=NH)NJ₁J₂またはN(H)C(O)N(H)J₂から独立に選択される1つまたは複数の基が含まれる。いくつかの態様において、各J₁およびJ₂は、独立にHまたはC_1-6アルキルである。いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかはメチル、エチルまたはメトキシメチルである。いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかはメチルである。さらなる態様において、R⁵またはR^5*のいずれかはエチレニルである。いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかは置換アシルである。いくつかの態様において、R⁵またはR^5*のいずれかはC(=O)NJ₁J₂である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような5'修飾二環式ヌクレオチドはWO 2007/134181に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、Bは、核酸塩基類縁体および天然核酸塩基、例えばプリンもしくはピリミジン、または置換プリンもしくは置換ピリミジン、例えば本明細書において言及する核酸塩基、例えばアデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシルからなる群より選択される核酸塩基、および/または修飾もしくは置換核酸塩基、例えば5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2'チオ-チミン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、および2,6-ジアミノプリンを含む、核酸塩基である。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、-C(R^aR^b)-O-、-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-O-、-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-C(R^eR^f)-O-、-C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-、-C(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-O-、-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-、-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-C(R^eR^f)-、-C(R^a)=C(R^b)-C(R^cR^d)-、-C(R^aR^b)-N(R^c)-、-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-N(R^e)-、-C(R^aR^b)-N(R^c)-O-、および-C(R^aR^b)-S-、-C(R^aR^b)-C(R^cR^d)-S-から選択されるビラジカルを示し、ここでR^a、R^b、R^c、R^d、R^e、およびR^fはそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC_1-12-アルキル、置換されていてもよいC_2-12-アルケニル、置換されていてもよいC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルコキシアルキル、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつ2つのジェミナルな置換基R^aおよびR^bは一緒に、置換されていてもよいメチレン（=CH₂）を示してもよい。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。

さらなる態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、-CH₂-O-、-CH₂-S-、-CH₂-NH-、-CH₂-N(CH₃)-、-CH₂-CH₂-O-、-CH₂-CH(CH₃)-、-CH₂-CH₂-S-、-CH₂-CH₂-NH-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-CH(CH₃)-、-CH=CH-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-O-、-CH₂-NH-O-、-CH₂-N(CH₃)-O-、-CH₂-O-CH₂-、-CH(CH₃)-O-、および-CH(CH₂-O-CH₃)-O-、ならびに/または、-CH₂-CH₂-、および-CH=CH-から選択されるビラジカル（二価の基）を示す。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、ビラジカルC(R^aR^b)-N(R^c)-O-を示し、ここでR^aおよびR^bは独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素であり、かつ；ここでR^cは水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、ビラジカルC(R^aR^b)-O-C(R^cR^d)-O-を示し、ここでR^a、R^b、R^c、およびR^dは独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*はビラジカル-CH(Z)-O-を形成し、ここでZはC_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニル、置換C_1-6アルキル、置換C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオからなる群より選択され；かつここで置換された基はそれぞれ独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、OC(=X)J₁、OC(=X)NJ₁J₂、NJ³C(=X)NJ₁J₂およびCNから独立に選択される、任意で保護された置換基で一または多置換されており、ここで各J₁、J₂およびJ₃は、独立に、HまたはC_1-6アルキルであり、かつXはO、SまたはNJ₁である。いくつかの態様において、ZはC_1-6アルキルまたは置換C_1-6アルキルである。いくつかの態様において、Zはメチルである。いくつかの態様において、Zは置換C_1-6アルキルである。いくつかの態様において、前記置換基はC_1-6アルコキシである。いくつかの態様において、ZはCH₃OCH₂-である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような二環式ヌクレオチドはUS 7,399,845において開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は水素である。いくつかの態様において、R^1*、R²、R^{3 *}は水素であり、かつR⁵、R^5*の1つまたは両方は、前述およびWO 2007/134181に記載のとおり、水素以外であってもよい。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、架橋中に置換アミノ基を含むビラジカルを示し、例えばビラジカル-CH₂-N(R^c)-からなるか、またはそれを含み、ここでR^cはC_1-12アルキルオキシである。いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、ビラジカル-Cq₃q₄-NOR-を示し、ここでq₃およびq₄は独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択され；ここで各置換された基は、独立に、ハロゲン、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、COOJ₁、CN、O-C(=O)NJ₁J₂、N(H)C(=NH)NJ₁J₂またはN(H)C(=X=N(H)J₂から独立に選択される置換基で一または多置換されており、ここでXはOまたはSであり；かつJ₁およびJ₂は、それぞれ独立に、H、C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニル、C_1-6アミノアルキルまたは保護基である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような二環式ヌクレオチドはWO2008/150729に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は水素である。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³は水素であり、かつR⁵、R^5*の1つまたは両方は、前述およびWO 2007/134181に記載のとおり、水素以外であってもよい。いくつかの態様において、R^4*およびR^2*は一緒に、ビラジカル（二価の基）C(R^aR^b)-O-を示し、ここでR^aおよびR^bはそれぞれ独立にハロゲン、C₁-C₁₂アルキル、置換C₁-C₁₂アルキル、C₂-C₁₂アルケニル、置換C₂-C₁₂アルケニル、C₂-C₁₂アルキニル、置換C₂-C₁₂アルキニル、C₁-C₁₂アルコキシ、置換C₁-C₁₂アルコキシ、OJ₁ SJ₁、SOJ₁、SO₂J₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(=O)OJ₁、C(=O)NJ₁J₂、C(=O)J₁、O-C(=O)NJ₁J₂、N(H)C(=NH)NJ₁J₂、N(H)C(=O)NJ₁J₂またはN(H)C(=S)NJ₁J₂であり；またはR^aおよびR^bは一緒に、=C(q3)(q4)であり；q₃およびq₄はそれぞれ、独立に、H、ハロゲン、C₁-C₁₂アルキルまたは置換C₁-C₁₂アルキルであり；各置換された基は、独立に、ハロゲン、C₁-C₆アルキル、置換C₁-C₆アルキル、C₂-C₆アルケニル、置換C₂-C₆アルケニル、C₂-C₆アルキニル、置換C₂-C₆アルキニル、OJ₁、SJ₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(=O)OJ₁、C(=O)NJ₁J₂、C(=O)J₁、O-C(=O)NJ₁J₂、N(H)C(=O)NJ₁J₂またはN(H)C(=S)NJ₁J₂から独立に選択される置換基で一または多置換されており、かつ；各J₁およびJ₂は、独立に、H、C1-C₆アルキル、置換C1-C₆アルキル、C₂-C₆アルケニル、置換C₂-C₆アルケニル、C₂-C₆アルキニル、置換C₂-C₆アルキニル、C1-C₆アミノアルキル、置換C1-C₆アミノアルキルまたは保護基である。そのような化合物はWO2009006478Aに開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、R^4*およびR^2*はビラジカル-Q-を形成し、ここでQはC(q₁)(q₂)C(q₃)(q₄)、C(q₁)=C(q₃)、C[=C(q₁)(q₂)]-C(q₃)(q₄)またはC(q₁)(q₂)-C[=C(q₃)(q₄)]であり；q₁、q₂、q₃、q₄はそれぞれ独立に、H、ハロゲン、C_1-12アルキル、置換C_1-12アルキル、C_2-12アルケニル、置換C_1-12アルコキシ、OJ₁、SJ₁、SOJ₁、SO₂J₁、NJ₁J₂、N₃、CN、C(=O)OJ₁、C(=O)-NJ₁J₂、C(=O)J₁、-C(=O)NJ₁J₂、N(H)C(=NH)NJ₁J₂、N(H)C(=O)NJ₁J₂またはN(H)C(=S)NJ₁J₂であり；各J₁およびJ₂は、独立に、H、C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニル、C_1-6アミノアルキルまたは保護基であり；かつ、任意で、ここでQがC(q₁)(q₂)(q₃)(q₄)であり、かつq₃またはq₄の1つがCH₃である場合、q₃もしくはq₄の他方またはq₁およびq₂の1つのうち少なくとも1つはH以外である。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は水素である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような二環式ヌクレオチドはWO2008/154401に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は独立に水素、ハロゲン、C_1-6アルキル、置換C_1-6アルキル、C_2-6アルケニル、置換C_2-6アルケニル、C_2-6アルキニルまたは置換C_2-6アルキニル、C_1-6アルコキシル、置換C_1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C_1-6アミノアルキルまたは置換C_1-6アミノアルキルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³、R⁵、R^5*は水素である。いくつかの態様において、R^1*、R²、R³は水素であり、かつR⁵、R^5*の1つまたは両方は、前述およびWO 2007/134181またはWO2009/067647に記載（アルファ-L-二環式核酸類縁体）のとおり、水素以外であってもよい。

さらなる二環式ヌクレオシド類縁体およびそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける使用は、WO2011 115818、WO2011/085102、WO2011/017521、WO09100320、WO10036698、WO09124295およびWO09006478に開示されている。そのようなヌクレオシド類縁体は、いくつかの局面において、本発明の化合物において有用であり得る。

いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いるLNAは、好ましくは、一般式IIの構造を有する：

式中、Yは-O-、-CH₂O-、-S-、-NH-、N(R^e)および/または-CH₂-からなる群より選択され；ZおよびZ^*は独立にヌクレオチド間連結、R^H、末端基または保護基の間で選択され；Bは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、かつR^Hは水素およびC_1-4-アルキルから選択され；R^a、R^b R^c、R^dおよびR^eは、任意で、独立に、水素、置換されていてもよいC_1-12-アルキル、置換されていてもよいC_2-12-アルケニル、置換されていてもよいC_2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C_1-12-アルコキシ、C_2-12-アルコキシアルキル、C_2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C_1-12-アルコキシカルボニル、C_1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C_1-6-アルキル)アミノ-C_1-6-アルキル-アミノカルボニル、C_1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C_1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C_1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C_1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基R^aおよびR^bは一緒に、置換されていてもよいメチレン（=CH₂）を示してもよく；かつR^Hは水素およびC_1-4-アルキルから選択される。いくつかの態様において、R^a、R^b、R^c、R^dおよびR^eは、任意で、独立に、水素およびC_1-6アルキルからなる群より選択され、例えばメチルである。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく、例えば、2つの例示的な立体化学異性体にはベータ-Dおよびアルファ-Lイソ型が含まれ、これらは以下のとおりに例示されうる。

具体的な例示的LNAユニットを以下に示す。

「チオ-LNA」なる用語は、上の一般式中のYがSまたは-CH₂-S-から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ-LNAは、ベータ-Dおよびアルファ-L配置の両方であり得る。

「アミノ-LNA」なる用語は、上の一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH₂-N(H)-、および-CH₂-N(R)-から選択される、ロックドヌクレオチドを含み、ここでRは水素およびC_1-4-アルキルから選択される。アミノ-LNAは、ベータ-Dおよびアルファ-L配置の両方であり得る。

「オキシ-LNA」なる用語は、上の一般式中のYが-O-を表す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ-LNAは、ベータ-Dおよびアルファ-L配置の両方であり得る。

「ENA」なる用語は、上の一般式中のYが-CH₂-O-（ここで-CH₂-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'位に連結している）である、ロックドヌクレオチドを含む。R^eは水素またはメチルである。

いくつかの例示的態様において、LNAはベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNAおよびベータ-D-チオ-LNAから選択され、特にベータ-D-オキシ-LNAである。

結合体
この文脈において、「結合体」なる用語は、本明細書に記載のオリゴマーの1つまたは複数の非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分への共有結合（「結合」）によって形成される、不均一分子を示すことが意図される。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせなどの、高分子作用物質が含まれる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的ポリマーはポリエチレングリコールであり得る。

したがって、様々な態様において、本発明のオリゴマーは、典型的にはヌクレオチドの連続配列からなるポリヌクレオチド領域、およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでもよい。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合、化合物は、結合成分などの、非ヌクレオチド成分を含んでもよい。

本発明の様々な態様において、オリゴマー化合物は、例えば、オリゴマー化合物の細胞への取込を増大させるために用い得る、リガンド/結合体に連結する。WO2007/031091は適切なリガンドおよび結合体を提供し、これらは参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、本明細書に記載の本発明の化合物、および該化合物に共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む結合体も提供する。したがって、本発明の化合物が本明細書において開示する特定された核酸またはヌクレオチド配列からなる、様々な態様において、化合物は該化合物に共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、1つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体を含まない）を含んでもよい。

いくつかの態様において、非ヌクレオチド部分（結合部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、タンパク質、例えば酵素、抗体もしくは抗体断片またはペプチド；親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）またはその組み合わせ部分、例えば脂質、リン脂質、ステロール；ポリマー、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール；受容体リガンド；小分子；レポーター分子；および非ヌクレオシド炭水化物からなる群より選択される。

結合（結合部分への）は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞への取込を増強させ得る。そのような部分には、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたは1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホン酸トリエチルアンモニウム、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれるが、それらに限定されない。

本発明のオリゴマーは、活性薬物物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質に結合してもよい。

一定の態様において、結合部分はステロール、例えばコレステロールである。

様々な態様において、結合部分は、長さが、例えば、1〜50、例えば2〜20、例えば3〜10アミノ酸残基の正に荷電したペプチド、および/またはポリエチレングリコール（PEG）もしくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドなどの、正に荷電したポリマーを含むか、またはそれらからなる、WO 2008/034123を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる。適切には、ポリアルキレンオキシドなどの正に荷電したポリマーは、本発明のオリゴマーに、WO 2008/034123に記載の遊離可能なリンカーなどのリンカーを介して連結してもよい。

例として、以下のGalNAc結合部分を本発明の結合体において用いてもよい。

本発明は、本発明のオリゴマーを含む結合体をさらに提供し、これは本発明のオリゴマーに共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（「結合部分」）を含む。いくつかの態様において、本発明の結合体はオリゴマーに、生体切断可能なリンカーを介して共有結合し、リンカーは、例えば、ホスホジエステル連結ヌクレオチド、例えば1〜5個のPO連結DNAヌクレオシドの領域であってもよい（WO2014/076195、参照により本明細書に組み入れられる）。好ましい結合基には、炭水化物結合体、例えばGalNAc結合体、例えば三価GalNAc結合体（例えば、WO2014/118267を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）または親油性結合体、例えばステロール、例えばコレステロール（WO2014/076195、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれる。

活性化オリゴマー
本明細書において用いられる「活性化オリゴマー」なる用語は、オリゴマーの1つまたは複数の結合部分、すなわち、それ自体は核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にして、本明細書に記載の結合体を形成する、少なくとも1つの官能性部分に共有結合した（すなわち、官能基化した）、本発明のオリゴマーを意味する。典型的には、官能性部分は、例えば、3'-ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外NH₂基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは親油性であるスペーサー、および結合部分に結合することができる末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を含む。いくつかの態様において、この末端基は保護されておらず、例えば、NH₂基である。他の態様において、末端基は、例えば、“Protective Groups in Organic Synthesis” by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの、任意の適切な保護基で保護されている。適切なヒドロキシル保護基の例には、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが含まれる。適切なアミノ保護基の例には、ベンジル、アルファ-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基が含まれる。いくつかの態様において、官能性部分は自己切断性である。他の態様において、官能性部分は生体分解性である。例えば、米国特許第7,087,229号を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、オリゴマーの5'末端への結合部分の共有結合を可能にするために、本発明のオリゴマーを5'末端で官能基化する。他の態様において、本発明のオリゴマーを3'末端で官能基化することもできる。さらに他の態様において、本発明のオリゴマーを骨格に沿って、または複素環塩基部分で官能基化することもできる。さらに他の態様において、本発明のオリゴマーを、5'末端、3'末端、骨格および塩基から独立に選択される複数の位置で官能基化することもできる。

いくつかの態様において、本発明の活性化オリゴマーは、官能性部分に共有結合される1つまたは複数のモノマーを合成中に組み込むことにより合成する。他の態様において、本発明の活性化オリゴマーは、官能基化していないモノマーで合成し、合成完了後にオリゴマーを官能基化する。いくつかの態様において、オリゴマーを、アミノアルキルリンカーを含むヒンダードエステルで官能基化し、ここでアルキル部分は式(CH₂)_wを有し、ここでwは1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、ここでアルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であり得、かつここで官能基はオリゴマーにエステル基（-O-C(O)-(CH₂)₂NH）を介して連結している。

他の態様において、オリゴマーを(CH₂)₂-スルフヒドリル（SH）リンカーを含むヒンダードエステルで官能基化し、ここでwは1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、ここでアルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であり得、かつここで官能基はオリゴマーにエステル基（-O-C(O)-(CH₂)₂SH）を介して連結している。

いくつかの態様において、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドを、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と結合する（ジスルフィド結合の形成を介して）。

前述のヒンダードエステルを含む活性化オリゴマーは、当技術分野において公知の任意の方法により、特にPCT公報WO 2008/034122に開示される方法およびその中の実施例により合成することができ、この開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

さらに他の態様において、本発明のオリゴマーを、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基をオリゴマー中に、実質的に米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能基化試薬、すなわち、一端にホスホラミダイトを有し、親油性スペーサー鎖を通じて保護または無保護スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む他端に連結された、実質的に直鎖の試薬によって導入することにより官能基化する。そのような試薬は主にオリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの態様において、そのような活性化オリゴマーは、オリゴマーの5'-ヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。他の態様において、活性化オリゴマーは、3'-ヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。さらに他の態様において、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの骨格上のヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。さらなる態様において、本発明のオリゴマーは、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能基化試薬の複数で官能基化し、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。そのような官能基化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマーに組み込む方法は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に開示されている。

いくつかの態様において、固相結合オリゴマーの5'末端をジエニルホスホラミダイト誘導体で官能基化し、続いて脱保護したオリゴマーを、例えば、アミノ酸またはペプチドと、ディールス-アルダー付加環化反応により結合させる。

様々な態様において、2'-カルバメート置換糖または2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖などの2'-糖修飾を含むモノマーの、オリゴマー中への組み込みは、オリゴマーの糖への結合部分の共有結合を容易にする。他の態様において、1つまたは複数のモノマーの2'位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーを、例えば、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'--N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホラミダイトなどの、試薬を用いて調製する。例えば、Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171参照。

さらなる態様において、本発明のオリゴマーは、N6プリンアミノ基上、グアニンの環外N2上、またはシトシンのN4もしくは5位上を含む、核酸塩基上のアミン含有官能性部分を有し得る。様々な態様において、そのような官能基化は、オリゴマー合成においてすでに官能基化されている市販の試薬を用いることにより達成してもよい。

いくつかの官能性部分は市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分がPierce Co.（Rockford、Ill.）から入手可能である。他の市販の連結基は5'-アミノ-修飾試薬C6および3'-アミノ修飾試薬で、いずれもGlen Research Corporation（Sterling、Va.）から入手可能である。5'-アミノ-修飾試薬C6はABI（Applied Biosystems Inc.、Foster City、Calif.）からもAminolink-2として入手可能で、3'-アミノ-修飾試薬はClontech Laboratories Inc.（Palo Alto、Calif.）からも入手可能である。いくつかの態様においていくつかの態様において。

組成物
本発明のオリゴマーを、薬学的製剤および組成物中で用いてもよい。適切には、そのような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。PCT/DK2006/000512は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており、これは参照により本明細書に組み入れられる。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もPCT/DK2006/000512において提供され、これは参照により本明細書に組み入れられる。

適用
本発明のオリゴマーを、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いてもよい。

研究において、そのようなオリゴマーを用いて、細胞および実験動物における標的タンパク質の合成を特異的に阻害し（典型的には、mRNAを分解または阻害し、それによりタンパク質生成を防止することにより）、それにより標的の機能分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にしてもよい。

診断において、オリゴマーを用いて、細胞および組織における標的の発現を、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーションまたは同様の技術により検出および定量してもよい。

治療のために、標的の発現を調節することにより処置し得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、本発明のオリゴマー化合物を投与することにより処置する。さらに提供するのは、標的の発現に関連する疾患または障害を有する、または罹りやすいことが疑われる、ヒトの処置法などの、哺乳動物の処置法であって、本発明の1つまたは複数のオリゴマーまたは組成物の治療的または予防的有効量を投与することによる方法である。典型的には、本発明の結合体または薬学的組成物を有効量で投与する。

本発明は、本明細書において言及する障害の処置用薬剤の製造のため、または本明細書において言及する障害の処置法のための、前述の本発明の化合物または結合体の使用も提供する。

本発明は、本明細書において言及する障害の処置法であって、本明細書に記載の本発明の化合物、および/または本発明の結合体、および/または本発明の薬学的組成物を、それを必要としている患者に投与する段階を含む方法も提供する。

医学的適応
本発明のオリゴマーおよび他の組成物を、標的の変異体の過剰発現または発現に関連する状態の処置のために用いることができる。

本発明は、本明細書において言及する疾患、障害または状態の処置用薬剤の製造における、本発明の化合物の使用をさらに提供する。

一般的には、本発明の1つの局面は、異常なレベルの標的に関連する状態を患っている、またはそれに罹りやすい哺乳動物の処置法であって、その哺乳動物に、1つまたは複数のLNAユニットを含む標的指向オリゴマーの治療的有効量を投与する段階を含む方法を目的とする。本発明のオリゴマー、結合体または薬学的組成物を、典型的には、有効量で投与する。

態様
本発明は、少なくとも1つの立体的に特定されたホスホロチオエート部分を含む、当技術分野において二環式核酸（BNA）とも呼ばれるロックド核酸（LNA）の提供に基づいている。本発明は、LNAオキサザホスホリンSpモノマーを提供する。本発明は、LNAオキサザホスホリンRpモノマーを提供する。本発明は、BNAオキサザホスホリンSpモノマーを提供する。本発明は、BNAオキサザホスホリンRpモノマーを提供する。

本発明は、オリゴヌクレオチド合成におけるLNAオキサザホスホリンRpモノマーの使用を提供する。本発明は、オリゴヌクレオチド合成におけるLNAオキサザホスホリンSpモノマーの使用を提供する。

いくつかの態様において、本発明は、式1Aまたは1BのLNAモノマーを提供する：

式中、
Bは水素、置換されていてもよいC_1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC_1-4-アルキル、置換されていてもよいC_1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され；好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり；
R¹およびR²は5員複素環を形成し
R⁴は水素またはC¹-C⁶アルキルであり
R³はフェニルまたは置換フェニルであり、
R^5*は水素またはC¹-C⁶アルキルであり、
ビラジカルR2^*-R4^*は二価リンカー基を示す。

いくつかの態様において、Bは、例えば、保護核酸塩基であってもよく、R^5*は水素であってもよく、かつR³は水素またはメチルであってもよい。

R^4*-R^2*基は、LNAの説明の項で本明細書に記載のとおりであってもよく、例えば-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択されてもよく、ここでR'はC₁-C₆アルキルの水素である。好ましい基は-CH₂-O-または-CH₂-CH₂-O-であり、ここで任意にR^5*は水素である。

いくつかの態様において、LNAモノマーは、式2Aまたは2Bのとおりである：

式中、R5^*、R4^*-R2^*およびBは式1Aおよび1Bについて定義したとおりであり、かつRは、例えば、水素またはメチルなどのC¹-C⁶アルキルであってもよい。R5^*は、例えば、水素またはメチルであってもよい。

いくつかの態様において、本発明のLNAモノマーは、式3Aまたは3Bのものである：

式中、BおよびR5^*は上の式1Aまたは1BのLNAモノマーについて記載したとおりであってもよく、かつ式中Y-Xは本明細書においてR^4*-R^2*基について記載したとおりであってもよく、例えば-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択されてもよく、ここでR'はC₁-C₆アルキルの水素である。

いくつかの態様において、本発明のLNAモノマーは、式4Aまたは4Bのものである：

式中、Bは上の式1Aまたは1BのLNAモノマーについて記載したとおりであってもよく、かつRは水素またはメチルなどのC¹-C⁶アルキルであってもよい。

いくつかの態様において、LNAモノマーは、式5Aまたは5Bのとおりであってもよい：

いくつかの態様において、LNAモノマーは、式6Aまたは6Bのとおりであってもよい：

式中、Bは水素、置換されていてもよいC_1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC_1-4-アルキル、置換されていてもよいC_1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され；好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり；
R¹およびR²は5員複素環を形成し
R⁴は水素またはC¹-C⁶アルキルであり
R³はフェニルまたは置換フェニルであり、
R^5*は水素またはC¹-C⁶アルキルであり、
ビラジカルR2^*-R4^*は二価リンカー基を示す。

いくつかの態様において、Bは、例えば、保護核酸塩基であってもよく、R^5*は水素であってもよく、かつR⁴は水素またはメチルであってもよい。

-Y-X-基は、LNAの説明の項で本明細書に記載のR^4*-R^2*基について記載したとおりであってもよく、例えば-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択されてもよく、ここでR'はC₁-C₆アルキルの水素である。

本発明は、オリゴヌクレオチド合成のための、本発明のLNAモノマーの使用も提供する。

本発明は、LNAオリゴヌクレオチドの合成法であって、本発明のモノマーをオリゴヌクレオチド合成支持体、または先行ヌクレオチドのいずれかに連結する段階を含む方法を提供する。方法は、標準のホスホラミダイト合成プロトコルを用いてもよいが、上記連結段階のために長い連結時間を必要とすることがある。例えば、Wan et al., NAR November 2014（早期公開）によって用いられた方法を参照されたく、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、連結は、4,5ジシアノイミダゾールまたはテトラゾールなどの、活性化剤存在下で実施する。連結段階の後に酸化またはチオール化段階を行ってもよい。本発明は、本発明の方法によって調製したオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明は、少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対を含むオリゴヌクレオチドであって、ヌクレオチド対の間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結はRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1つはLNAヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドを提供する。そのようなヌクレオチド対は本明細書においてLNAジヌクレオチドと呼ぶ。いくつかの態様において、ヌクレオチド対の両方のヌクレオシドはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、ヌクレオチド対のヌクレオシドの一方はLNAヌクレオシドであり、他方は非DNAヌクレオシド、例えばヌクレオシド類縁体、例えば2'置換ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ヌクレオチド対のヌクレオシドの一方は5'LNAヌクレオシドを有する。いくつかの態様において、ヌクレオチド対のヌクレオシドの一方は5'LNAヌクレオシドおよびLNAまたは2'置換ヌクレオシドなどのLNA以外のヌクレオシドのいずれかである3'ヌクレオチドを有する。いくつかの態様において、ヌクレオチド対のヌクレオシドの一方は5'LNAヌクレオシドおよび3'DNAヌクレオチドを有する。いくつかの態様において、ヌクレオチド対のヌクレオシドの一方は3'LNAヌクレオシドを有し、他方は非DNAヌクレオシド、例えばヌクレオシド類縁体、例えば2'置換ヌクレオシドである。オリゴヌクレオチドは少なくとも3ヌクレオチド長であり、例えば、7〜30ヌクレオチド長を有してもよい。オリゴヌクレオチドおよびオリゴマーなる用語は、本明細書において交換可能に用いられる。

典型的には、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートはRpおよびSpホスホロチオエート連結の無作為混合物として合成する。本発明において、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート連結のうち少なくとも1箇所が、オリゴヌクレオチド試料中に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも75％、例えば少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％または少なくとも95％、または少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、またはすべて（すなわち高比率）でRpまたはSpのいずれかである、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは立体選択的であると言う：それらは、少なくとも1箇所の立体特異的なホスホロチオエート連結を含む。立体選択的オリゴヌクレオチドは、任意の1つの位置で、少量の代わりの立体異性体を含み得ることが理解され、例えば、WanらはNAR, November 2014において報告したギャップマーについて98％の立体選択性を報告している。

いくつかの態様において、オリゴマーは少なくとも2つの1つのヌクレオチド対を含み、ここでヌクレオチド対の間のヌクレオシド間連結はRp立体配置またはSp立体配置のいずれかであり、かつここでヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1つはLNAヌクレオチドである。

いくつかの態様において、オリゴマー中の連結の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30箇所は、立体選択的ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマー中の連結の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％は、立体選択的ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマー中のホスホロチオエート連結のすべては立体選択的ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマーのヌクレオシド間連結のすべては立体特異的ホスホロチオエート連結である。立体特異性とは、指定のヌクレオシド間連結におけるRpまたはSpいずれかのヌクレオシド間連結の高比率の組み込みを意味することが理解されるべきである。

本発明は、少なくとも1箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結および少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、長さが例えば6〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、5個もしくは6個よりも長い連続DNAユニット、または7個以下の連続DNAユニット、または8個以下の連続DNAユニット、または9個以下の連続DNAユニットの領域を含まない、オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、少なくとも1箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結および少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、LNAミックスマーまたはLNAトータルマーを提供する。いくつかの態様において、オリゴマーは、前述のLNAジヌクレオチドの1個または複数個を含む。

本発明は、続く(3')ヌクレオシドに立体特異的ホスホロチオエート連結によって連結された、少なくとも1個のLNAヌクレオシドを有するギャップマーオリゴマーを提供する。

本発明は、少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が立体特異的、SpまたはRpである、ギャップマーオリゴマーを提供する。いくつかの態様において、ギャップマーの各ウィングは、少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間の1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、隣接するLNAヌクレオシドの間のすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は立体特異的である。

本発明は、本発明のオリゴマーまたは結合体、および薬学的に許容される溶媒（水または食塩水などの）、希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、薬学的組成物を提供する。

本発明は、医学において用いるための、本発明のオリゴマーをさらに提供する。

同様に開示するのは、RNAの発現、または過剰発現に関連する疾患または状態を有することが疑われる、またはそれになりやすい動物（非ヒト動物またはヒト）の処置法であって、非ヒト動物またはヒトに本発明の1つまたは複数のオリゴマー、結合体または薬学的組成物の治療的または予防的有効量を投与することによる方法である。

本発明の態様、これらは本明細書において記載または特許請求する本発明の他の態様と組み合わせてもよい。
1.
式1Aまたは1BのLNAモノマー：

式中、
Bは水素、置換されていてもよいC_1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC_1-4-アルキル、置換されていてもよいC_1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され；好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり；
R¹およびR²は5員複素環を形成し
R⁴は水素またはC₁-C₆アルキルであり
R³はフェニルまたは置換フェニルであり、
R^5*は水素またはC₁-C₆アルキルであり、
ビラジカルR2^*-R4^*は二価リンカー基を示す。
2.
式2Aまたは2B：

の前記モノマーであり、式中、Rが水素またはC¹-C⁶アルキルである、態様1記載のLNAモノマー。
3.
RがHまたはメチルである、態様2記載のLNAモノマー。
4.
式3Aまたは3B：

の前記モノマーであり、式中、Y-Xが、-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択され、ここでR'が水素またはメチルなどのC₁-C₆アルキルである、態様1または2に記載のLNAモノマー。
5.
ビラジカルR2^*およびR4^*または-Y-X-が一緒に-CH₂-O-または-CH(CH₃)-O-を示す、前記態様のいずれか一項記載のLNAモノマー。
6.
式4Aまたは4B：

の、前記態様のいずれか一項記載のLNAモノマー。
7.
式5Aまたは5B：

の、前記態様のいずれか一項記載のLNAモノマー。
8.
式6Aまたは6B：

の、前記態様のいずれか一項記載のLNAモノマー。
9.
Bが、核酸塩基、例えばプリンまたはピリミジン核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、5'-メチルシトシン、チミジン、およびウラシルからなる群より選択される核酸塩基；またはその塩基保護された核酸塩基である、態様1〜8のいずれか一項記載のLNAモノマー。
10.
R¹およびR²が5員複素環を形成し、R⁴が水素であり、R³がフェニルであり、R4^*-R2^*ビラジカルが-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-、CH₂-NR'からなる群より選択され、ここでR'が水素またはC₁-C₆アルキルである、態様1〜9のいずれか一項記載のLNAモノマー。
11.
R4^*-R2^*ビラジカルがベータ-D位である、態様1〜10のいずれか一項記載のLNAモノマー。
12.
R4^*-R2^*ビラジカルが-CH₂-O-である、態様1〜11のいずれか一項記載のLNAモノマー。
13.
LNAオリゴヌクレオチドの合成のための、態様1〜12のいずれか一項記載のLNAオリゴマーの使用。
14.
LNAオリゴヌクレオチドの合成法であって、態様1〜12のいずれか一項記載のモノマーをオリゴヌクレオチド合成支持体、または先行ヌクレオチドのいずれかに連結する段階を含む方法。
15.
連結が、4,5ジシアノイミダゾールまたはテトラゾールなどの、活性化剤存在下で行われる、態様14記載の方法。
16.
連結する段階の後にチオール化する段階を行う、態様14または15に記載の方法。
17.
態様13〜16のいずれか一項記載の方法によって生成したオリゴヌクレオチド。
18.
LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
19.
少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対を含む、前記オリゴヌクレオチドであって、ヌクレオチド対の間のヌクレオシド間連結がRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1個がLNAヌクレオチドである、態様18記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
20.
ヌクレオチド対の他のヌクレオチドが、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである、態様19記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
21.
非ヌクレオシド部分と共有結合した、態様18〜20のいずれか一項記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド
を含む、結合体。
22.
態様18〜20のいずれか一項記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは態様20記載の結合体、および
薬学的に許容される溶媒（水または食塩水などの）、希釈剤、担体、塩またはアジュバント
を含む、薬学的組成物。
23.
医学において用いるための、態様18〜20のいずれか一項記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは態様20記載の結合体。

配列
本明細書において用いる化合物は、以下の核酸塩基配列を有する。

実施例1
DNA 3'-O-オキサザホスホリジンモノマーの合成を、以前に記載された通りに実施した（Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008 130: 16031 - 16037、およびWan et al., NAR 2014, November, online publication）。

LNA 3'-O-オキサザホスホリジンモノマーの合成
合成スキーム

α-フェニル-2-ピロリジンメタノール（P5-LおよびP5-D）を文献（Oka et al., JACS, 2008, 16031-16037.）に記載の通りに合成した。

3-OAP-LNA T

L-3-OAP-LNA Tの合成：
PCl₃（735μL、6.30mmol）をトルエン（7mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（7mL）中のP5-L（1.12g、6.30mmol）およびNMM（1.38mL、12.6mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエン（4mL）で洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（8mL）に溶解し、次の段階で用いた。

THF（16mL）中の5'-ODMT-LNA-T（2.40g、4.20mmol）の溶液に、NEt₃（4.10mL、29.4mmol）を加えた。反応混合物を-74℃まで冷却し、THF中の2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃（2回）、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt₃ 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.00g（収率30％）として単離した。

D-3-OAP-LNA Tの合成
PCl₃（1.05mL、9.0mmol）をトルエン（12mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（12mL）中のP5-D（1.13g、12mmol）およびNMM（2.06mL、24mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（18mL）に溶解し、次の段階で用いた。

THF（30mL）中の5'-ODMT-LNA-T（3.44g、6.0mmol）の溶液に、NEt₃（5.82mL、42mmol）を加えた。反応混合物を-74℃まで冷却し、THF中の2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃（2回）、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt₃ 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.86g（収率36％）として単離した。

3-OAP-LNA MeC

L-3-OAP-LNA MeCの合成
PCl₃（110μL、1.25mmol）をトルエン（3mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（3mL）中のP5-L（222mg、1.25mmol）およびNMM（275μL、2.5mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（5mL）に溶解し、次の段階で用いた。

THF（2.5mL）中の5'-ODMT-LNA-C（338mg、0.50mmol）の溶液に、NEt₃（485μL、3.6mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、次いで蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で1.45時間撹拌した。EtOAc（30mL）を加え、反応混合物を飽和NaHCO₃（2×20mL）、食塩水（20mL）で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン中EtOAc 20％〜30％＋トルエン10％＋NEt₃ 7％）で精製した。生成物を白色泡状物228mg（収率47％）として単離した。

D-3-OAP-LNA MeCの合成
PCl₃（1.10mL、12.3mmol）をトルエン（10mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（10mL）中のP5-D（2.17g、12.3mmol）およびNMM（2.70mL、2.5mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（10mL）に溶解し、次の段階で用いた。

THF（20mL）中の5'-ODMT-LNA-C（3.38g、5mmol）の溶液に、NEt₃（4.85mL、35mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で1.45時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃（2回）、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン中EtOAc 20％〜30％＋トルエン10％＋NEt₃ 7％）で精製した。生成物を白色泡状物1.09g（収率23％）として単離した。

3-OAP-LNA A

L-3-OAP-LNA Aの合成
PCl₃（184μL、2.1mmol）をトルエン（5mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（5mL）中のP5-L（373mg、2.10mmol）およびNMM（463μL、4.20mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエン（4mL）で洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（5mL）に溶解し、次の段階で用いた。

THF（7mL）中の5'-ODMT-LNA-A（960mg、1.40mmol）の溶液に、NEt₃（1.36mL、9.80mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAc（50mL）を加え、反応混合物を飽和NaHCO₃（2×30mL）、食塩水（30mL）で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt₃ 6〜7％）で精製した。生成物を白色泡状物455mg（収率35％）として単離した。

D-3-OAP-LNA Aの合成
PCl₃（0.84mL、9.63mmol）をトルエン（12mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（12mL）中のP5-D（1.70g、9.63mmol）およびNMM（2.12mL、19.3mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（12mL）に溶解し、次の段階で用いた。

THF（20mL）中の5'-ODMT-LNA-A（3.77、5.50mmol）の溶液に、NEt₃（5.30mL、38.5mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt₃ 6〜7％）で精製した。生成物を白色泡状物1.86g（収率36％）として単離した。

3-OAP-LNA G

D-3-OAP-LNA Gの合成
PCl₃（1.09mL、12.4mmol）をトルエン（12.5mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（12.5mL）中のP5-D（2.20g、12.4mmol）およびNMM（2.73mL、27.8mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（19mL）に溶解し、次の段階で用いた。

合成前に、5'-ODMT-LNA-Gをトルエンと、次いでピリジン（順序は必須）と共に同時蒸発させた。THF（15mL）およびピリジン（8mL）中の5'-ODMT-LNA-G（3.26g、5.0mmol）の溶液に、NEt₃（4.85mL、35.0mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc中THF 10％〜20％＋NEt₃ 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.49g（収率33％）として単離した。

L-3-OAP-LNA Gの合成
PCl₃（1.00mL、11.4mmol）をトルエン（10mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（10mL）中のP5-L（2.02g、11.4mmol）およびNMM（2.50mL、22.7mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（7mL）に溶解し、次の段階で用いた。

合成前に、5'-ODMT-LNA-Gをトルエンと、次いでピリジン（順序は必須）と共に同時蒸発させた。THF（20mL）およびピリジン（12mL）中の5'-ODMT-LNA-G（2.86g、4.54mmol）の溶液に、NEt₃（4.40mL、31.8mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc中THF 10％〜20％＋NEt₃ 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.44g（収率34％）として単離した。

一般的合成の説明
蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの合成：PCl₃（1当量）をトルエンに溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン中のP5-L（1当量）およびNMM（2.1当量）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHFに溶解し、次の段階で用いた。

THF（およびGヌクレオシドの場合はピリジン）中の5'-ODMT-LNAヌクレオシド（1当量）の溶液に、NEt₃（7当量）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジン（2.5当量）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO₃、食塩水で抽出し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィで精製した。

LNAモノマーの構造の図

以下のLNA-オキサザホスホリンLNAモノマーをOka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 16031-16037に開示されている方法を用いて合成した。

前記LNAモノマーをオリゴヌクレオチド合成において用い、HPLCにより判定して、立体制御ホスホラミダイトLNAオリゴヌクレオチドを生じたことが示された。

実施例2
Myd88を標的とする以下のLNAオリゴヌクレオチドを合成する。

大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x＝RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s＝Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r＝Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。

実施例3
親化合物#1はマウスにおいて肝毒性があることがわかっている。化合物#1〜27#をインビボアッセイでそれらの肝毒性について評価する：1群につき5匹のNMRI雌マウスを用い、15mg/kgの化合物を各マウスに第0、3、7、10および14日に投与し、第16日に屠殺する。血清ALTを測定する。肝毒性は、NMRIマウスを用いる以外は、EP 1 984 381、実施例41に記載の通りに測定してもよく、またはインビトロ肝細胞毒性アッセイを用いて測定してもよい。

実施例4
Seth et al J. Med. Chem 2009, 52, 10-13において毒性であると同定された以下のLNAオリゴヌクレオチドを合成する。

実施例5
親化合物#28はマウスにおいて肝毒性があることがわかっている。化合物#28〜27#をインビボアッセイでそれらの肝毒性について評価する：1群につき5匹のNMRI雌マウスを用い、15mg/kgの化合物を各マウスに第0、3、7、10および14日に投与し、第16日に屠殺する。血清ALTを測定する。肝毒性は、NMRIマウスを用いる以外は、EP 1 984 381、実施例41に記載の通りに測定してもよく、またはインビトロ肝細胞毒性アッセイを用いて測定してもよい。

実施例6. 3箇所の固定PSヌクレオシド間連結を有する化合物ライブラリの、インビボでの耐容性および組織含有量
C57BL6/Jマウス（5匹/群）に、単一用量の食塩水または食塩水中の30mg/kg LNA-アンチセンスオリゴヌクレオチド（seq ID # 1、10、または14）を第0日に静脈内注射し、第8日に屠殺した。

すべての群について、血清を採取し、ALTを測定した。オリゴヌクレオチド含有量を、LNA投与群でELISA法を用いて測定した。

結論：
3箇所のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が、S（化合物#10）またはR（化合物#14）配置のいずれかに固定されている、LNAオリゴヌクレオチドの部分群の肝毒性の可能性（ALT）を、すべてのヌクレオシド間連結がRおよびS配置の混合物であるジアステレオ異性体の親混合物（化合物#1）のALTと比較した。1つの部分群（化合物#14）で、ALT読み出し値は親混合物（化合物#1）よりも有意に低く、他の化合物部分群（化合物#10）では、ALT読み出し値は親とほぼ同等であると認められる（図3）。さらに、肝臓取込の特徴（図4a）は、ALT読み出し値が低いLNAオリゴヌクレオチドの部分群（化合物#14）は、親LNA混合物（化合物#1）と同程度に肝臓に取り込まれるが、ALTが親混合物（化合物#1）と同等の他の部分群（化合物#10）は、肝臓への取込が少ないことを示している。腎臓取込（図4b）は、親LNA（化合物#1）および1つの部分群（化合物#10）でほぼ同等であり、他のLNAオリゴヌクレオチドの部分群（化合物#14）では高い。脾臓への取込は3つの化合物群すべてでほぼ同等である（図4c）。一般に、いくつかの位置において立体化学を固定し、それによりLNAオリゴヌクレオチドの部分群を生じることで、LNAオリゴヌクレオチドの親混合物に比べて、取込および肝毒性の可能性などの特性の相違が誘導されることがわかる。

材料と方法：
実験設計：
（表２）

投与。表2に従って、受け取り時約20gのC57BL/6JBom雌動物に、10ml/kg BW（第0日の体重による）の食塩水中で製剤した化合物または食塩水単独を静脈内投与した。

肝および腎組織の採取。表2に従って、動物を70％CO₂−30％O₂で麻酔し、頚椎脱臼により屠殺した。肝臓の半分および腎臓を凍結し、組織分析のために用いた。

肝臓および腎臓中のオリゴヌクレオチド含有量をサンドイッチELISA法により測定した。

ALTレベルを測定した。

実施例7 キラルに規定されたホスホロチオエートLNAギャップマーのRNアーゼH活性
用いた親化合物、3833を用いた：

ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、下付き文字sは無作為sまたはrホスホロチオエート連結（オリゴヌクレオチド合成中にキラルに規定されていない）を表し、かつCの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。

一連の完全にキラルに規定された3833の変種を、SまたはRのいずれかで例示するとおり、12箇所のヌクレオシド間の位置それぞれにおいてRおよびSの独特のパターンで設計した。RNアーゼH動員活性および切断パターンを、ヒトRNアーゼHを用いて判定し、親化合物3833（キラリティー混合物）ならびに3833の完全ホスホジエステル連結変種（完全PO）、および中心DNAギャップ領域内にホスホジエステル連結を含みLNA側部に無作為PS連結を含む、3833化合物（POギャップ）と比較した。

化合物

すべての化合物を単一の実験で評価したが、*印を付けたものは例外で、別の実験を行った。

実験：
RNアーゼH1（組換えヒト）によるRNAのLNAオリゴヌクレオチド仲介性切断。
LNAオリゴヌクレオチド15pmolおよび5'fam標識RNA 45pmolを13μLの水に加えた。アニーリング緩衝液6μL（200mM KCl、2mM EDTA、pH7.5）を加え、温度を90℃まで2分間上昇させた。試料を室温に戻し、3μLの750mM KCl、500mM トリス-HCl、30mM MgCl₂、100mMジチオスレイトール、pH8.3中のRNアーゼH酵素（0,15U）を加えた。試料を37℃で30分間維持し、EDTA溶液4μL（0.25M）を加えて反応を停止した。

切断したRNA試料のAIE-HPLC
試料15μLを200μLの緩衝液A（10mM NaClO4、1mM EDTA、20mM トリス-HCL pH7.8）に加えた。試料をAIE−HPLCにかけた：注入量50μL（カラム：DNA pac 100 2×250、勾配：0分、0.25mL/分、100％A、22分、22％B（1mM NaClO4、1mM EDTA、20mMトリス-HCL pH7.8）、25分、0.25mL/分、100％B、30分、0.25mL/min、100％B、31分、0.5mL/分、0％B、35分、0.25mL/分、0％B、40分、0.25mL/分、0％B。シグナル検出：蛍光発光518nm、励起494nm。

結果
すべてのリン連結がチオール化された、配列G^mCattggtatT^mCAを有するLNAオリゴヌクレオチド。連結中のチオホスフェートの特定のキラリティーを記す。何も記していない場合、キラリティーはRおよびSの混合である。AIE-HPLC保持時間の下に、すべてのピーク面積合計に対するピーク面積のパーセンテージを示す。異なるLNAオリゴヌクレオチドの活性の順位を、キラリティー混合LNAオリゴヌクレオチド3833の酵素反応後に残った全長RNAを、他のLNAオリゴヌクレオチドでの残ったRNAで除した％から計算する。

結論
Sキラリティーが選択された最後の5'連結およびスポットキラリティーが選択されたLNAオリゴヌクレオチド17298〜17301を除いて、LNAオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート連結のキラリティーは無作為に選択されている。LNAオリゴヌクレオチドの完全ジエステルおよびギャップにおいてジエステルのみの変種は、混合キラル変種3833よりも低い活性を有する。キラル配列はRNAの活性化および切断を増強する。特定のキラルLNAオリゴヌクレオチドのほとんどについて、RNアーゼH1の活性化はキラリティー混合3833のものよりも良好にはたらいた。特定の配列のうち最良のものは、3833よりも実質的に多くのRNA切断を開始した（30分後に98.4％対47.7％）。特定のLNAオリゴヌクレオチドそれぞれの特徴は、1ヶ所から数ヶ所の切断点まで変動する、それらの独特なRNA切断パターンである。

実施例8 初代肝細胞におけるインビトロ毒性スクリーニング
マウス肝臓灌流
初代マウス肝細胞を、10〜13週齢雄C57B16マウスから、逆行性2段階コラゲナーゼ肝臓灌流により単離した。簡単に言うと、餌を与えたマウスをペントバルビタールナトリウム（120mg/kg、i.p.）で麻酔した。灌流チューブを右心室から尾大静脈中に挿入した。総腸骨静脈遠位の尾大静脈の結紮後、門脈を切開し、2段階肝臓灌流および細胞単離を行った。肝臓をまず、カルシウム無し、EGTA（0.5mM）を補充したHEPES（20mM）緩衝化ハンクス平衡塩溶液からなる前灌流溶液で5分間灌流し、続いてCaCl2（5mM）およびコラゲナーゼ（0.2U/ml；II型コラゲナーゼ、Worthington）を含むNaHCO3（25mM）補充ハンクス液で12分間灌流した。流速は7ml/分に維持し、すべての溶液を37℃に維持した。インサイチュー灌流後、肝臓を摘出し、肝臓被膜を機械的に切開し、フェノールレッドを含まないウィリアム培地E（WME）（Sigma W-1878）に細胞を懸濁し、1組のナイロンセルストレーナー（40および70メッシュ）を通してろ過した。死滅細胞をパーコール（Sigma P-4937）遠心分離段階（パーコール密度：1.06g/ml、50g、10分）およびWME中での追加の遠心分離（50xg、3分）により除去した。

用いた化合物

肝細胞培養
細胞培養のために、初代マウス肝細胞を、10％ウシ胎仔血清、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（0.1mg/mL）を補充したWMEに、約5×10⁶細胞/mlの密度で懸濁し、コラーゲンコーティングした96穴プレート（Becton Dickinson AG、Allschwil、Switzerland）中に0.25×10⁶細胞/ウェルの密度で播種した。細胞を3〜4時間予備培養して細胞培養プレートに接着させた後、オリゴヌクレオチド処理を開始した。PBSに溶解したオリゴヌクレオチドを細胞培養物に加え、細胞上に3日間放置した。細胞毒性レベルを、細胞毒性検出キット（Roche 11644793001、Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim、Germany）を製造者のプロトコル通りに用いて、培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の量を測定することにより判定した。細胞ATPレベルの判定のために、本発明者らはCellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay（G9242、Promega Corporation、Madison WI、USA）を製造者のプロトコル通りに用いた。各試料を三つ組で試験した。

標的ノックダウン分析
マウス肝細胞からのmRNA精製製造者の指示に従ってのRNアーゼなしのDNアーゼIを含むRNeasy 96 Kit（Qiagen、Hombrechtikon、Switzerland）処理。cDNAをiScript一本鎖cDNA合成キット（Bio-Rad Laboratories AG、Reinach、Switzerland）を用いて合成した。定量的リアルタイムPCRアッセイ（qRT-PCR）を、Roche SYBR Green I PCR KitおよびLight Cycler 480（Roche Diagnostics、Rotkreuz、Switzerland）を、特異的DNAプライマーと共に用いて実施した。分析をΔCt閾値法により行って、RPS12 mRNAに比べての発現を判定した。各分析反応を、条件毎に2試料を用い、二つ組で実施した。結果を図5および6に示す。化合物#58および#60は、標的（Myd88）に対する有効なアンチセンス活性を保持しているが、有意に低減された毒性を有する。これらの化合物はRpの立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。

実施例9 腎毒性スクリーニングアッセイ
実施例6および8で用いたのと同じ化合物を、以下のRPTEC-TERT1培養、オリゴヌクレオチド処理および生存度アッセイで用いた。

RPTEC-TERT1（Evercyte GmbH、Austria）を、製造者の指示に従い、PTEC培地（1％Pen/Strep、10mM Hepes、5.0μg/mlヒトインスリン、5.0μg/mlヒトトランスフェリン、8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム、0.1μMヒドロコルチゾン、10ng/mlヒト組換え上皮成長因子、3.5μg/mlアスコルビン酸、25ng/mlプロスタグランジンE1、3.2pg/ml トリヨード-L-サイロニンおよび100μg/mlジェネテシンを含むDMEM/F12）中で培養した。生存度アッセイのために、PTEC-TERT1を96穴プレート（Falcon、353219）中にPTEC培地中2×10⁴細胞/ウェルの密度で播種し、コンフルエントになるまで増殖させた後、オリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチドをPBSに溶解し、細胞培養物に10または30μMの最終濃度で加えた。培地を交換し、オリゴヌクレオチドを3日ごとに新しく加えた。9日間のオリゴヌクレオチド処理後、細胞生存度を、CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay（G7571、Promega Corporation、Madison WI、USA）を製造者のプロトコル通りに用いての細胞ATPレベルの測定により判定した。三つ組ウェルの平均ATP濃度および標準偏差を計算した。PBSを媒体対照とした。

結果を図8に示す。化合物#10は、立体的に特定されていない化合物#1および化合物#14に比べて低減された腎毒性を示す。立体的に特定された化合物#57、#58、#60は、親化合物（#56）に比べて有意に低減された腎毒性を示す。

実施例10 キラルに規定されたホスホロチオエートLNAギャップマーのミスマッチ特異性
用いた実験手順は、親3833化合物と比べて様々な位置にミスマッチを導入した代替RNA基質を用いた以外は、実施例7に記載の通りであった。完全マッチRNA基質およびミスマッチRNA基質に対するRNアーゼH活性を判定した。

（表３）3833のRNアーゼH活性に対するミスマッチの影響

ミスマッチを大きいフォントサイズを用いて示す。RNアーゼH切断は30分後に分析した。切断生成物はミスマッチの位置によって変化する。

（表４）3833の立体的に規定された変種のRNアーゼH活性に対するミスマッチの影響

完全マッチRNA基質に対して、キラルに規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、混合キラリティーを有するASOよりも著しくRNアーゼH仲介性RNA切断を活性化する傾向がある。しかし、ミスマッチRNAの顕著に低減されたRNアーゼH切断を有する、選択したホスホロチオエート（ASO）配置のキラルに規定されたオリゴヌクレオチドを見出すことができ、改善されたミスマッチ選択性を有する個々の立体的に規定された化合物を同定するための、オリゴヌクレオチドのキラルに規定された変種のライブラリをスクリーニングする能力が強調されている。

実施例11
用いた親化合物、4358を用いた：

一連の完全にキラルに規定された4358の変種を、SまたはRのいずれかで例示するとおり、11箇所のヌクレオシド間の位置それぞれにおいてRおよびSの独特のパターンで設計した。RNアーゼH動員活性および切断パターンを、ヒトRNアーゼHを用いて判定し、親化合物4358（キラリティー混合物）と比較した。得られた結果は以下のとおりであった。

体内分布試験は典型的にはインビボで実施するが、例えば、異なる種類の細胞中、例えば、インビトロでの肝細胞（例えば、初代肝細胞）または腎細胞（例えば、PTEC-TERT1細胞などの腎上皮細胞）での細胞への取込を比較することにより、インビトロ系で実施してもよい。
[本発明1001]
LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1002]
少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対を含み、ここで少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結が、Sp立体配置またはRp立体配置のいずれかであり、かつ少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチドヌクレオシド対のヌクレオシドのうち少なくとも1個がLNAヌクレオシドである、本発明1001の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1003]
少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチドヌクレオチド対の他のヌクレオシドが、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである、本発明1002の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1004]
LNAオリゴヌクレオチドがギャップマーオリゴヌクレオチドである、本発明1001〜1003のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1005]
少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が立体特異的なSpまたはRpである、本発明1004の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1006]
ギャップマーの各ウィングが、少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間の1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、本発明1004の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1007]
隣接するLNAヌクレオシドの間のすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結が立体特異的である、本発明1004の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1008]
オリゴヌクレオチドが、RNアーゼHを動員することができる領域Y'を含み、これが1〜6個のヌクレオチド類縁体ユニットと5'および3'で隣接している、本発明1004〜1008のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1009]
ヌクレオシド類縁体ユニットが独立に2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマーまたはLNAヌクレオシド類縁体からなる群より選択される、本発明1008の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1010]
ヌクレオシド類縁体ユニットがLNAユニットである、本発明1009の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1011]
LNAユニットが(R)-cETおよび(S)-cETからなる群より選択される、本発明1001〜1010のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1012]
LNAユニットがベータ-D-オキシLNAユニットである、本発明1001〜1011のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
[本発明1013]
非ヌクレオシド部分と共有結合した、本発明1001〜1012のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド
を含む、結合体。
[本発明1014]
本発明1001〜1012のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは本発明1013の結合体、および
薬学的に許容される溶媒（水または食塩水など）、希釈剤、担体、塩またはアジュバント
を含む、薬学的組成物。
[本発明1015]
医学において用いるための、本発明1011〜1013のいずれかの立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは本発明1013の結合体。

立体制御されたモノマー
立体制御されたモノマーは、オリゴヌクレオチド中の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結、すなわちSpまたはRpのいずれかを付与する、オリゴヌクレオチド合成において用いられるモノマーである。いくつかの態様において、モノマーはホスホラミダイトなどのアミダイトであってもよい。したがって、モノマーは、いくつかの態様において、立体制御性/制御されたホスホラミダイトなどの、立体制御性/制御されたアミダイトであってもよい。適切なモノマーは実施例、またはOka et al., J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 16031-16037 9 16031において提供される。同様に、WO 10064146、WO 11005761、WO 13012758、WO 14010250、WO 14010718、WO 14012081、およびWO 15107425も参照されたい。立体制御された/立体制御性なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、立体特異的/立体的に特定されたまたは立体的に規定されたモノマーと呼んでもよい。

立体的に規定されたホスホロチオエート連結を有するギャップ領域
Wanらにおいて報告されたとおり、ホスホロチオエート連結の無作為ラセミ混合物に比べて、ギャップマー中に全てがRpであるまたは全てがSpであるギャップ領域を導入することに利点はほとんどない。本発明は、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入がオリゴヌクレオチドの生物学的特性を実質的に改善し得るという、驚くべき利点に基づいており、例えば、利点の項を参照されたい。これは、ギャップ領域中に1箇所またはいくつか、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を導入すること、あるいはすべてのホスホロチオエート連結を立体的に特定することのいずれかによって達成し得る。

ギャップマー設計
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、LNAギャップマーを含むか、またはLNAギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNアーゼHなどのRNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列、例えば本明細書において領域Y'（Y'）と呼ぶ、少なくとも5、6または7個のDNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、ここで領域Y'は5'および3'の両方で、親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体の領域（これらの領域はそれぞれ領域X'（X'）およびZ'（Z'）と呼ばれる）が、（RNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列の5'および3'で）隣接している。ギャップマーの例はWO2004/046160、WO2008/113832、およびWO2007/146511に開示されている。本発明のLNAギャップマーオリゴマーは、領域X'またはZ'に少なくとも1つのLNAヌクレオシド、例えば、領域X'に少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび領域Z'に少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、領域X'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドまたは領域Z'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、領域X'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドおよび領域Z'における少なくとも1つのLNAヌクレオチドは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、領域X'とY'との間のヌクレオシド間連結を任意に含む、領域X'内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、領域Y'とZ'との間のヌクレオシド間連結を任意に含む、領域Z'内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、領域X'とY'および/またはY'とZ'との間のヌクレオシド間連結を任意に含む、領域X'および領域Z'内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。

いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、ヌクレオチド類縁体および天然ヌクレオチド、または1つの型のヌクレオチド類縁体および第2の型のヌクレオチド類縁体の反復パターンの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。反復パターンは、例えば、1つおきまたは2つおきのヌクレオチドはBNA（LNA）などのヌクレオチド類縁体であり、かつ残りのヌクレオチドはDNAなどの天然ヌクレオチドであるか、もしくは本明細書において言及する2'MOEまたは2'フルオロ類縁体などの2'置換ヌクレオチド類縁体であるか、またはいくつかの態様において、本明細書において言及するヌクレオチド類縁体の群から選択されてもよい。LNAユニットなどのヌクレオチド類縁体の反復パターンは、固定の位置、例えば、5'または3'末端でヌクレオチド類縁体と組み合わせてもよいことが理解される。

R^4*-R^2*基は、LNAの説明の項で本明細書に記載のとおりであってもよく、例えば-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択されてもよく、ここでR'は水素またはC ₁ -C ₆ アルキルである。好ましい基は-CH₂-O-または-CH₂-CH₂-O-であり、ここで任意にR^5*は水素である。

式中、BおよびR5^*は上の式1Aまたは1BのLNAモノマーについて記載したとおりであってもよく、かつ式中Y-Xは本明細書においてR^4*-R^2*基について記載したとおりであってもよく、例えば-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択されてもよく、ここでR'は水素またはC ₁ -C ₆ アルキルである。

-Y-X-基は、LNAの説明の項で本明細書に記載のR^4*-R^2*基について記載したとおりであってもよく、例えば-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-およびCH₂-NR'からなる群より選択されてもよく、ここでR'は水素またはC ₁ -C ₆ アルキルである。

いくつかの態様において、オリゴマーは少なくとも1つのヌクレオチド対を含み、ここでヌクレオチド対の間のヌクレオシド間連結はRp立体配置またはSp立体配置のいずれかであり、かつここでヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1つはLNAヌクレオチドである。

本発明は、少なくとも1箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結および少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、長さが例えば6〜30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、5個もしくは6個よりも長い連続DNAユニット、または7個よりも長い連続DNAユニット、または8個よりも長い連続DNAユニット、または9個よりも長い連続DNAユニットの領域を含まない、オリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、少なくとも1箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結および少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、LNAミックスマーまたはLNAトータルマーを提供する。いくつかの態様において、オリゴマーは、前述のLNAジヌクレオチドの1個または複数個を含む。

の、前記態様のいずれか一項記載のLNAモノマー。
9.
Bが、核酸塩基、例えばプリンまたはピリミジン核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、5'-メチルシトシン、チミン、およびウラシルからなる群より選択される核酸塩基；またはその塩基保護された核酸塩基である、態様1〜8のいずれか一項記載のLNAモノマー。
10.
R¹およびR²が5員複素環を形成し、R⁴が水素であり、R³がフェニルであり、R4^*-R2^*ビラジカルが-CH₂-O-、-CH₂-CH₂-O-、CH(CH₃)-O-、-CH₂-S-、CH₂-NR'からなる群より選択され、ここでR'が水素またはC₁-C₆アルキルである、態様1〜9のいずれか一項記載のLNAモノマー。
11.
R4^*-R2^*ビラジカルがベータ-D位である、態様1〜10のいずれか一項記載のLNAモノマー。
12.
R4^*-R2^*ビラジカルが-CH₂-O-である、態様1〜11のいずれか一項記載のLNAモノマー。
13.
LNAオリゴヌクレオチドの合成のための、態様1〜12のいずれか一項記載のLNAモノマーの使用。
14.
LNAオリゴヌクレオチドの合成法であって、態様1〜12のいずれか一項記載のモノマーをオリゴヌクレオチド合成支持体、または先行ヌクレオチドのいずれかに連結する段階を含む方法。
15.
連結が、4,5ジシアノイミダゾールまたはテトラゾールなどの、活性化剤存在下で行われる、態様14記載の方法。
16.
連結する段階の後にチオール化する段階を行う、態様14または15に記載の方法。
17.
態様13〜16のいずれか一項記載の方法によって生成したオリゴヌクレオチド。
18.
LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
19.
少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対を含む、前記オリゴヌクレオチドであって、ヌクレオチド対の間のヌクレオシド間連結がRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつヌクレオチド対のヌクレオシドのうち少なくとも1個がLNAヌクレオチドである、態様18記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
20.
ヌクレオチド対の他のヌクレオチドが、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである、態様19記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
21.
非ヌクレオシド部分と共有結合した、態様18〜20のいずれか一項記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド
を含む、結合体。
22.
態様18〜20のいずれか一項記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは態様21記載の結合体、および
薬学的に許容される溶媒（水または食塩水などの）、希釈剤、担体、塩またはアジュバント
を含む、薬学的組成物。
23.
医学において用いるための、態様18〜20のいずれか一項記載の立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは態様21記載の結合体。

（表３）3833のRNアーゼH活性に対するミスマッチの影響

Claims

LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間に少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対を含み、ここで少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結が、Sp立体配置またはRp立体配置のいずれかであり、かつ少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチドヌクレオシド対のヌクレオシドのうち少なくとも1個がLNAヌクレオシドである、請求項1記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
少なくとも1つの立体特異的ホスホロチオエートヌクレオチドヌクレオチド対の他のヌクレオシドが、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである、請求項2記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
LNAオリゴヌクレオチドがギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が立体特異的なSpまたはRpである、請求項4記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
ギャップマーの各ウィングが、少なくとも2個の隣接するLNAヌクレオシドの間の1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、請求項4記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
隣接するLNAヌクレオシドの間のすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結が立体特異的である、請求項4記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドが、RNアーゼHを動員することができる領域Y'を含み、これが1〜6個のヌクレオチド類縁体ユニットと5'および3'で隣接している、請求項4〜8のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
ヌクレオシド類縁体ユニットが独立に2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマーまたはLNAヌクレオシド類縁体からなる群より選択される、請求項8記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
ヌクレオシド類縁体ユニットがLNAユニットである、請求項9記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
LNAユニットが(R)-cETおよび(S)-cETからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
LNAユニットがベータ-D-オキシLNAユニットである、請求項1〜11のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド。
非ヌクレオシド部分と共有結合した、請求項1〜12のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチド
を含む、結合体。
請求項1〜12のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項13記載の結合体、および
薬学的に許容される溶媒（水または食塩水など）、希釈剤、担体、塩またはアジュバント
を含む、薬学的組成物。
医学において用いるための、請求項11〜13のいずれか一項記載の立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたは請求項13記載の結合体。