KR20100024399A - 베타-카테닌의 조절용 ｒｎａ 길항제 화합물 - Google Patents

베타-카테닌의 조절용 ｒｎａ 길항제 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 올리고머성 화합물(올리고머)에 관한 것으로서, 이는 세포에서 베타-카테닌 mRNA를 표적으로 하고, 베타-카테닌의 발현을 감소시킨다. 베타-카테닌의 감소는 암을 포함하는, 과증식성 질환과 같은, 종류의 의학적 장애에 유용하다. 본 발명은 올리고머를 포함하는 치료적 조성물 및 치료 방법을 포함하는, 상기 올리고머를 사용한 베타-카테닌의 발현 조절 방법을 제공한다.

Description

베타-카테닌의 조절용 ＲＮＡ 길항제 화합물{RNA antagonist compound for the modulation of beta-catenin}
본 발명은 세포의 베타-카테닌 mRNA를 표적으로 하여, 베타-카테닌의 발현 감소를 유도하는 올리고머성 화합물(올리고머)과 관련된 것이다. 베타-카테닌 발현의 감소는 암을 포함하는, 과증식 질환과 같은, 종류의 의학적 장애에 유용하다. 본 발명은 올리고머를 포함하는 치료용 조성물 및 치료 방법을 포함하는, 상기 올리고머를 사용한 베타-카테닌의 발현 조절 방법을 제공한다.
베타-카테닌{또한 캐드헤린(cadherin)-관련 단백질 및 β-카테닌으로 알려짐}은 세포질 단백질의 카테닌 패밀리의 하나의 구성원이고 Wnt 단백질에 의해 개시되는 신호전달에 있어서 중추적 요소이며, 여러 가지 발생 과정의 매개자이다. 베타-카테닌은 성장인자 자극으로 인산화되어 세포 접착을 감소시킨다.
암 발생에서 베타-카테닌의 역할은 APC(adenomatous polyposis of the colon) 유전자의 발현 산물에 의해 조절된다고 보고되고 있다. APC 종양 억제 단백질이 베타-카테닌에 결합하는 한편, 베타-카테닌은 Tcf 및 Lef 전사인자와 상호 작용하는 것으로 나타났다. Morin et al.은 결장암에서 APC 단백질이 베타-카테닌 및 Tcf에 의해 전사 활성을 하향-조절한다고 보고하였다. 그들의 결과는 베타-카테닌의 조절이 APC의 종양 억제 효과에 있어서 중요하고, 이러한 조절은 APC 또는 베타-카테닌 중 하나의 돌연변이에 의해 방해될 수 있음을 나타낸다. 몇몇의 연구에서 다양한 암 세포주에서의 베타-카테닌 돌연변이의 검출을 보고하였고 비정상적으로 높은 양의 베타-카테닌이 흑색종 세포주에서 발견되고 있다.
Morin et al.은 인산화 위치에 영향을 미치는 베타-카테닌의 돌연변이는 세포가 APC에 의해 매개되는 베타-카테닌의 하향-조절에 대하여 반응하지 않게 하고, 이러한 방어 기작이 결장 종양화에 중요함을 밝혔다(Morin et al., Science, 1997, 275, 1787-1790).
미국 특허 제 6,066,500호에서 Bennett et al.은 베타-카테닌의 발현 조절용 안티센스 화합물, 조성물 및 방법을 기재한다.
암 발생에서 베타-카테닌의 발견을 고려하면, 효과적으로 베타-카테닌 기능을 억제할 수 있는 약제에 대한 필요성이 남아있다.
발명의 요약
본 발명은 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이인 올리고머를 제공하고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류의 베타-카테닌을 암호화하는 하나의 핵산에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적이다.
본 발명은 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이인 올리고머를 제공하고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 173 및 서열번호 174 ~ 193으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 핵산 서열에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적이다.
본 발명은 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이인 올리고머를 제공하고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 1 ~ 132로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 핵산 서열에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적이다.
또한 본 발명은 본 발명에 의한 올리고머를 포함하는 결합체를 제공하고, 올리고머의 뉴클레오염기 서열이 더해진 이러한 결합체는 본 발명의 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드(즉, 비-뉴클레오염기) 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분이 포함된다. 상기 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분은 콜레스테롤과 같은 스테롤기, 또는 세포로의 도입을 용이하게 하는 다른 부분이 구성 또는 포함될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 의한 올리고머를 포함하는 결합체를 제공하고, 올리고머의 뉴클레오염기 서열이 더해진 이러한 결합체는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은, 양전하 부분을 포함하는 폴리머릭 결합체를 포함하고, - 즉, 본 발명에 의한 올리고머는 선택적으로 페길레이트(pegylate)될 수 있다.
본 발명은 올리고머 또는 본 발명의 정의된 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 의한 올리고머, 약제에서의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 암과 같은, 본 발명에 기재된 것과 같은 과증식성 질환으로부터 선택되는 질환과 같은, 본 발명에 기재된 하나 또는 그 이상의 질병 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 올리고머의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 의한 올리고머, 암과 같은, 본 발명에 기재된 하나 또는 그 이상의 질환의 치료용 용도를 제공한다.
본 발명의 올리고머 또는 결합체를 포함하는 약제 및 다른 조성물도 제공한다. 또한 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 통해, 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo), 세포 또는 조직과 접촉을 포함하는 상기 세포 또는 조직에서 베타-카테닌의 발현의 하향-조절 방법을 제공한다.
또한 베타-카테닌의 발현, 또는 과발현과 관련된 질환 또는 병을 갖거나 갖기 쉽다고 의심되는 동물 또는 인간에게 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고머, 결합체 또는 조성물을 투여함으로써 상기 동물 또는 인간을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 베타-카테닌의 발현 억제 및 베타-카테닌의 활성과 관련된 질환의 치료를 위한 올리고머 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 암과 같은 과증식성 질환과 같은, 본 발명에 기재된 것과 같은, 질환 또는 장애 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 의한 올리고머, 결합체, 또는 약학적 조성물을 이것을 필요로 하는 환자에게 투여를 포함한다.
본 발명은 세포 또는 조직에서의 베타-카테닌 발현 억제 또는 감소 방법을 제공하고, 상기 세포 또는 조직에 본 발명에 의한 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 접촉하는 단계를 포함하는 상기 방법으로 베타-카테닌의 발현을 억제 또는 감소시킨다.
본 발명은 암세포와 같은, 세포에서의 세포사멸 유발 방법을 제공하고, 상기 세포 또는 조직에 본 발명에 따르는 올리고머, 결합체 또는 약학적 조성물을 접촉하는 단계를 포함하는 상기 방법으로 베타-카테닌의 발현을 억제 또는 감소 및/또는 세포사멸을 유발시킨다.
또한 본 발명은 서열번호 189, 192, 58 및 103으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 같은, 서열번호 1 ~ 132 및 서열번호 174 ~ 193으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적인 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성하는 올리고머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 189 또는 192와 같은, 서열번호 174 ~ 193으로부터 선택되는 서열에 존재하는 동일한 서열에 상응하는 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성하는 올리고머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 168 또는 171과 같은, 서열번호 133 ~ 174로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함 또는 구성하거나, 또는 상기 서열에 상응하는 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성하는 올리고머를 제공한다.
관련 사례
하기 관련 출원은 참조로서 본 문서에 삽입된다: US 60/915,371 및 US 61/023,244.
올리고머
본 발명은 올리고머성 조성물(본 발명에서 올리고머로서 기재됨)을, 서열번호 173으로 나타낸 베타-카테닌 핵산과 같은, 포유류 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 분자, 및 포유류 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 분자의 자연적으로 발생하는 대립형질 변이체(allelic variants)의 기능을 조절하는 용도로 사용한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "올리고머(oligomer)"는, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오염기(즉, 올리고뉴클레오티드)의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 나타낸다. 본 발명에서, 각각의 단일 뉴클레오염기도 모노머(monomer) 또는 유닛(unit)으로서 나타낼 수 있다. 상기 올리고머는 길이에 있어서 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 구성 또는 포함한다. 올리고머는 예를 들면, 리보핵산(ribonucleic acid, RNA), 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 또는 핵산 유사체(analogue), 또는 본 발명에 기재된 이의 혼합물, 바람직하게는 잠금핵산(locked Nucleic Acid, LNA)와 같은, 자연적인 뉴클레오티드 유닛을 포함할 수 있다. 따라서 기능이 유사하거나 특별히 향상된 기능을 가진 비자연적으로 발생하는 뉴클레오염기를 가지는 올리고머 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기, 당 및 인터뉴클레오염기 결합으로 구성된 올리고머도 포함한다. 전체적 또는 부분적으로 변형 또는 치환된 올리고머는 상기 올리고머의, 세포막 투과성, 세포 외부 및/또는 내부 뉴클레아제(nuclease)에 대한 뛰어난 저항성, 핵산 표적에 높은 특이성 및 친화도와 같은, 이러한 올리고머의 여러 가지 원하는 성질 때문에 천연의 형태보다 더 선호된다. LNA 유사체는 예를 들어, 상기 기재된 성질에 관하여 특히 선호된다. 따라서, 매우 바람직한 실시태양에 있어서 본 발명에 의한 올리고머는 10 ~ 50 사이의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 10 ~ 25 뉴클레오염기, 더욱 바람직하게는 10 ~ 16 뉴클레오염기, 및 가장 바람직하게는 12 ~ 16 사이의 뉴클레오염기를 형성하기 위한, LNA 유닛과 같은, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 유닛 또는 뉴클레오티드 유사체 유닛의 다른 집단화로부터 형성된다.
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 RNA(유닛)를 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 조성물은 선형 분자이거나 또는 선형 분자로서 합성되는 것이 바람직하다. 상기 올리고머는 단일 가닥 분자이고, 바람직하게는 예를 들면, 같은 올리고머{즉, 듀플렉스(duplexes)} 내의 동일한 부분과 상보적인, 적어도 3, 4 또는 5개의 연속된 뉴클레오염기의 짧은 부분을 포함하지 않고, 이에 있어서, 상기 올리고머는 이중 가닥이 아니다(본질적으로). 다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 siRNA가 아닌 것과 같이, 본래 이중 가닥이 아니다. 상기 올리고머는 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성한다. 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 상기 연속된 뉴클레오염기 부분으로 전체적으로 구성될 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 상기 연속된 뉴클레오염기 서열로 구성된다.
표적
본 발명에서 사용하는 용어 "표적 핵산"은 서열번호 173과 같은, 인간 베타-카테닌과 같이, 포유류 베타-카테닌 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 나타낸다. 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 또는 자연적으로 발생하는 이의 변이체, 및 RNA 핵산은 그로부터 유래 되었고, 비록 성숙한 mRNA가 바람직하더라도, 바람직하게는 pre-mRNA와 같은, mRNA이다. 다양한 실시태양에 있어서, 예를 들면 연구 또는 진단에 사용할 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고머성 조성물은 바람직하게는 표적 핵산에 혼성화 할 수 있다.
상기 용어 "표적 핵산"은, 다양한 실시태양에 있어서, 예를 들면, Accession Nos. X89579, X89593, X89592, X89591, X89588, X89585, X89584 및 X89578을 가지는 인간 유전자 엑손, 또는 서열번호 173과 같은 포유류 베타-카테닌 mRNA일 수 있다. 다른 포유류 베타-카테닌 mRNA의 예로는 Accession Numbers NM_001098209, NM_0010987210(인간 베타-카테닌 mRNA); NM_007614(생쥐 베타-카테닌 mRNA); NM_053357(랫트 베타-카테닌 mRNA); NM-001122762, DQ267491(말 베타-카테닌 mRNA); NM_214367(돼지 베타-카테닌 mRNA); BC119949, BT030683(소 베타-카테닌 mRNA)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 물론, 상기 accession number는 상기 cDNA 서열을 나타내고 mRNA 서열은 나타내지 않는 것으로 여겨지고 - 상기 성숙한 mRNA 서열은 물론 상기 cDNA 서열로부터 직접적으로 유래 될 수 있으며 - 티민(thymine,T) 잔기가 우라실(uracil, U) 잔기로 교체된다.
본 발명에서 사용하는 "혼성화"는 수소결합을 의미하고, 이는 상보적인 뉴클레오티드/뉴클레오염기 염기 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteem), 역 후그스틴 수소결합 등 일 수 있다. 왓슨과 크릭은 약 50년 전에 디옥시리보핵산(DNA)은 두 가닥의 반대편의 상보적인 뉴클레오염기 사이에 형성된 수소결합에 의해 나선형으로 서로 결합된 두 가닥으로 구성된다는 것을 밝혔다. 4개의 뉴클레오염기는, DNA에서 흔히 발견되는 구아닌(guanine, G), 아데닌(adenine, A), 티민(thymine, T) 및 시토신(cytosine, C)으로서 상기 G 뉴클레오염기는 C와 결합하고, 상기 A 뉴클레오염기는 T와 결합한다. RNA에서 뉴클레오염기 티민은 뉴클레오염기 우라실(Uracil,U)로 치환되고, 이는 상기 T 뉴클레오염기가 A와 결합하는 것과 유사하다. 표준 듀플렉스 형성에 참여하는 뉴클레오염기에서의 화학적 작용기는 왓슨-크릭 면을 구성한다. 후그스틴은 몇 년 뒤에 그들의 왓슨-크릭 면에 더불어 퓨린(purine) 뉴클레오염기(G 및 A)가 듀플렉스의 외부로부터 인식될 수 있고, 수소결합을 통하여 피리미딘 올리고뉴클레오티드에 결합함으로써 삼차 나선 구조를 형성하는 후그스틴 면을 갖는다는 것을 밝혔다.
가장 바람직하게는 본 발명의 조성물은 mRNA와 같은, 표적 핵산에 혼성화할 수 있다.
본 발명의 적절한 상기 올리고머 또는 결합체는 베타-카테닌 유전자의 발현 하향-조절과 같은 저해를 할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 올리고머는 표적 핵산에 결합하고 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 10% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 정상 발현 수준과 비교하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 발현 억제에 영향을 준다. 일부 실시태양에 있어서, 1 및 25 nM 사이의 본 발명의 올리고머 또는 결합체를 사용할 경우에 이러한 조절이 나타난다. 동일한 또는 다른 실시태양에 있어서, 발현 억제는 70% 억제 이하와 같은, 80% 억제 이하, 90% 억제 이하, 95% 억제 이하, 98% 억제 이하와 같은, 100% 이하이다. 발현 수준의 조절은 예를 들면, 표적 단백질에 대하여 고조된 적절한 항체를 사용한 SDS-PAGE에 따른 웨스턴 블랏(Western blot)과 같은 방법을 통해 단백질 수준 측정으로 파악할 수 있다. 또는, 발현 수준의 억제와 같은, 조절은 예를 들면, 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 정량적 RT-PCR을 통해 mRNA 수준 측정으로 파악할 수 있다. mRNA 수준을 통해 측정할 경우, 1 및 25 nM 사이와 같은, 적절한 투여량을 사용할 경우, 억제 또는 하향-조절의 수준은, 다양한 실시태양에 있어서, 전형적으로 본 발명의 조성물의 부재하에서 정상 수준의 10 ~ 20% 사이의 수준이다.
따라서 본 발명은 베타-카테닌 단백질 및/또는 mRNA를 발현하는 세포에서 베타-카테닌 단백질 및/또는 mRNA의 발현의 하향-조절 또는 억제 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포에서 베타-카테닌 단밸질 및/또는 mRNA의 발현을 하향-조절 및 억제하기 위해 본 발명에 따른 올리고머 또는 결합체를 상기 세포에 투여를 포함한다. 적절하게는 상기 세포는 인간 세포와 같은 포유류 세포이다. 상기 투여는, 다양한 실시태양에 있어서, 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 상기 투여는, 다양한 실시태양에 있어서, 생체 내(in vivo)에서 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "표적 핵산"은 서열번호: 173과 같은, 인간 베타-카테닌과 같은, 포유류 베타-카테닌 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 나타낸다. 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 또는 자연적으로 발생하는 이의 변이체, 및 RNA 핵산은 이로부터 유래되었고, 비록 성숙한 mRNA가 바람직하나, 바람직하게는 pre-mRNA와 같은, mRNA이다. 다양한 실시태양에 있어서, 예를 들어 연구 또는 진단에 사용할 경우, "표적 핵산"은 cDNA 또는 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고머는 바람직하게는 표적 핵산에 혼성화 할 수 있다.
상기 용어 "자연적으로 발생하는 이의 변이체"는 생쥐, 원숭이, 및 바람직하게는 인간과 같은, 포유류와 같은, 정의된 분류군에 자연적으로 존재하는 상기 베타-카테닌 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 변이체를 의미한다. 전형적으로는, 폴리뉴클레오티드의 "자연적으로 발생하는 변이체"라는 용어는 염색체의 전좌 또는 복제에 의한 염색체 Chr 3: 41.22 ~ 41.26 Mb에서 발견되는 베타-카테닌을 암호화하는 게놈 DNA의 대립형질 변이체, 및 이로부터 유래된 mRNA와 같은, RNA를 포함한다. 특정 폴리펩티드 서열을 나타낼 경우, 예를 들면, 상기 용어는 신호 펩티드 절단, 단백질 가수분해의 절단, 당화 등과 같은, co- 또는 post-번역의 변형에 의해 처리될 수 있는 단백질의 자연적으로 발생하는 형태도 포함한다.
상기 용어 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등과 같이, 1 이상 또는 1과 같은 정수를 포함한다. 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 조성물의 표적이 되는 핵산 또는 단백질을 나타낼 경우, 상기 용어 "적어도 하나"는 용어 "적어도 두 개" 및 "적어도 세 개" 및 "적어도 네 개"를 포함하고, 마찬가지로 상기 용어 "적어도 두 개"는 용어 "적어도 세 개" 및 "적어도 네 개"를 포함할 수 있다.
서열
본 발명의 상기 올리고머는 인간 베타-카테닌 mRNA를 표적할 수 있고, 그러한 것으로서 서열번호 173에 존재하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호: 1 ~ 132로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성하고, 상기 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오염기 부분)는 상기 선택된 서열에 대하여 하나, 두 개, 또는 세 개의 미스매치(mismatch)를 선택적으로 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 10 ~ 16(연속된) 뉴클레오염기의 서열을 구성 또는 포함할 수 있다. 16개 뉴클레오염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열의 예는 서열번호: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 및 118로 나타냈다. 더 짧은 서열은 이로부터 유래될 수 있다. 더 긴 서열은 각각의 서열번호에서 모두, 또는 적어도 10개 뉴클레오염기를 포함할 수 있다.
표 1 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열(모티프)
서열번호 서열 (5'-3') 길이 (염기) 비고
서열번호: 1 GAAAGCTGATGGACCA 16 안티센스 올리고 서열
서열번호: 2 GAAAGCTGATGGACC 15 상기와 같음
서열번호: 3 AAAGCTGATGGACCA 15 상기와 같음
서열번호: 4 GAAAGCTGATGGAC 14 상기와 같음
서열번호: 5 AAAGCTGATGGACC 14 상기와 같음
서열번호: 6 AAGCTGATGGACCA 14 상기와 같음
서열번호: 7 GAAAGCTGATGGA 13 상기와 같음
서열번호: 8 AAAGCTGATGGAC 13 상기와 같음
서열번호: 9 AAGCTGATGGACC 13 상기와 같음
서열번호: 10 AGCTGATGGACCA 13 상기와 같음
서열번호: 11 GAAAGCTGATGG 12 상기와 같음
서열번호: 12 AAAGCTGATGGA 12 상기와 같음
서열번호: 13 AAGCTGATGGAC 12 상기와 같음
서열번호: 14 AGCTGATGGACC 12 상기와 같음
서열번호: 15 GCTGATGGACCA 12 상기와 같음
서열번호: 16 CAGACTTAAAGATGGC 16 상기와 같음
서열번호: 17 CAGAATCCACTGGTGA 16 상기와 같음
서열번호: 18 GCACTGCCATTTTAGC 16 상기와 같음
서열번호: 19 GCACTGCCATTTTAG 15 상기와 같음
서열번호: 20 CACTGCCATTTTAGC 15 상기와 같음
서열번호: 21 GCACTGCCATTTTA 14 상기와 같음
서열번호: 22 CACTGCCATTTTAG 14 상기와 같음
서열번호: 23 ACTGCCATTTTAGC 14 상기와 같음
서열번호: 24 GCACTGCCATTTT 13 상기와 같음
서열번호: 25 CACTGCCATTTTA 13 상기와 같음
서열번호: 26 ACTGCCATTTTAG 13 상기와 같음
서열번호: 27 CTGCCATTTTAGC 13 상기와 같음
서열번호: 28 GCACTGCCATTT 12 상기와 같음
서열번호: 29 CACTGCCATTTT 12 상기와 같음
서열번호: 30 ACTGCCATTTTA 12 상기와 같음
서열번호: 31 CTGCCATTTTAG 12 상기와 같음
서열번호: 32 TGCCATTTTAGC 12 상기와 같음
서열번호: 33 GTAATAGCCAAGAATT 16 상기와 같음
서열번호: 34 ACTCTGCTTGTGGTCC 16 상기와 같음
서열번호: 35 ACTCTGCTTGTGGTC 15 상기와 같음
서열번호: 36 CTCTGCTTGTGGTCC 15 상기와 같음
서열번호: 37 ACTCTGCTTGTGGT 14 상기와 같음
서열번호: 38 CTCTGCTTGTGGTC 14 상기와 같음
서열번호: 39 TCTGCTTGTGGTCC 14 상기와 같음
서열번호: 40 ACTCTGCTTGTGG 13 상기와 같음
서열번호: 41 CTCTGCTTGTGGT 13 상기와 같음
서열번호: 42 TCTGCTTGTGGTC 13 상기와 같음
서열번호: 43 CTGCTTGTGGTCC 13 상기와 같음
서열번호: 44 ACTCTGCTTGTG 12 상기와 같음
서열번호: 45 CTCTGCTTGTGG 12 상기와 같음
서열번호: 46 TCTGCTTGTGGT 12 상기와 같음
서열번호: 47 CTGCTTGTGGTC 12 상기와 같음
서열번호: 48 TGCTTGTGGTCC 12 상기와 같음
서열번호: 49 CCACCAGCTTCTACAA 16 상기와 같음
서열번호: 50 GAGTCCAAAGACAGTT 16 상기와 같음
서열번호: 51 ACCCACTTGGCAGACC 16 상기와 같음
서열번호: 52 GCACAAACAATGGAAT 16 상기와 같음
서열번호: 53 GCAGCTACTCTTTGGA 16 상기와 같음
서열번호: 54 CTCCCTCAGCTTCAAT 16 상기와 같음
서열번호: 55 GCAGTCTCATTCCAAG 16 상기와 같음
서열번호: 56 TATCCACCAGAGTGAA 16 상기와 같음
서열번호: 57 CATCCATGAGGTCCTG 16 상기와 같음
서열번호: 58 CCATCTTGTGATCCAT 16 상기와 같음
서열번호: 59 CCATCTTGTGATCCA 15 상기와 같음
서열번호: 60 CATCTTGTGATCCAT 15 상기와 같음
서열번호: 61 CCATCTTGTGATCC 14 상기와 같음
서열번호: 62 CATCTTGTGATCCA 14 상기와 같음
서열번호: 63 ATCTTGTGATCCAT 14 상기와 같음
서열번호: 64 CCATCTTGTGATC 13 상기와 같음
서열번호: 65 CATCTTGTGATCC 13 상기와 같음
서열번호: 66 ATCTTGTGATCCA 13 상기와 같음
서열번호: 67 TCTTGTGATCCAT 13 상기와 같음
서열번호: 68 CCATCTTGTGAT 12 상기와 같음
서열번호: 69 CATCTTGTGATC 12 상기와 같음
서열번호: 70 ATCTTGTGATCC 12 상기와 같음
서열번호: 71 TCTTGTGATCCA 12 상기와 같음
서열번호: 72 CTTGTGATCCAT 12 상기와 같음
서열번호: 73 AAGCAAGCAAAGTCAG 16 상기와 같음
서열번호: 74 AAGCAAGCAAAGTCA 15 상기와 같음
서열번호: 75 AGCAAGCAAAGTCAG 15 상기와 같음
서열번호: 76 AAGCAAGCAAAGTC 14 상기와 같음
서열번호: 77 AGCAAGCAAAGTC 14 상기와 같음
서열번호: 78 GCAAGCAAAGTCAG 14 상기와 같음
서열번호: 79 AAGCAAGCAAAGT 13 상기와 같음
서열번호: 80 AGCAAGCAAAGTC 13 상기와 같음
서열번호: 81 GCAAGCAAAGTCA 13 상기와 같음
서열번호: 82 CAAGCAAAGTCAG 13 상기와 같음
서열번호: 83 AAGCAAGCAAAG 12 상기와 같음
서열번호: 84 AGCAAGCAAAGT 12 상기와 같음
서열번호: 85 GCAAGCAAAGTC 12 상기와 같음
서열번호: 86 CAAGCAAAGTCA 12 상기와 같음
서열번호: 87 AAGCAAAGTCAG 12 상기와 같음
서열번호: 88 GAAATTGCTGTAGCAG 16 상기와 같음
서열번호: 89 GAAATTGCTGTAGCA 15 상기와 같음
서열번호: 90 AAATTGCTGTAGCAG 15 상기와 같음
서열번호: 91 GAAATTGCTGTAGC 14 상기와 같음
서열번호: 92 AAATTGCTGTAGCA 14 상기와 같음
서열번호: 93 AATTGCTGTAGCAG 14 상기와 같음
서열번호: 94 GAAATTGCTGTAG 13 상기와 같음
서열번호: 95 AAATTGCTGTAGC 13 상기와 같음
서열번호: 96 AATTGCTGTAGCA 13 상기와 같음
서열번호: 97 ATTGCTGTAGCAG 13 상기와 같음
서열번호: 98 GAAATTGCTGTA 12 상기와 같음
서열번호: 99 AAATTGCTGTAG 12 상기와 같음
서열번호: 100 AATTGCTGTAGC 12 상기와 같음
서열번호: 101 ATTGCTGTAGCA 12 상기와 같음
서열번호: 102 TTGCTGTAGCAG 12 상기와 같음
서열번호: 103 GTGTTCTACACCATTA 16 상기와 같음
서열번호: 104 GTGTTCTACACCATT 15 상기와 같음
서열번호: 105 TGTTCTACACCATTA 15 상기와 같음
서열번호: 106 GTGTTCTACACCAT 14 상기와 같음
서열번호: 107 TGTTCTACACCATT 14 상기와 같음
서열번호: 108 GTTCTACACCATTA 14 상기와 같음
서열번호: 109 GTGTTCTACACCA 13 상기와 같음
서열번호: 110 TGTTCTACACCAT 13 상기와 같음
서열번호: 111 GTTCTACACCATT 13 상기와 같음
서열번호: 112 TTCTACACCATTA 13 상기와 같음
서열번호: 113 GTGTTCTACACC 12 상기와 같음
서열번호: 114 TGTTCTACACCA 12 상기와 같음
서열번호: 115 GTTCTACACCAT 12 상기와 같음
서열번호: 116 TTCTACACCATT 12 상기와 같음
서열번호: 117 TCTACACCATTA 12 상기와 같음
서열번호: 118 AACATGAAATAGATCC 16 상기와 같음
서열번호: 119 AACATGAAATAGATC 15 상기와 같음
서열번호: 120 ACATGAAATAGATCC 15 상기와 같음
서열번호: 121 AACATGAAATAGAT 14 상기와 같음
서열번호: 122 ACATGAAATAGATC 14 상기와 같음
서열번호: 123 CATGAAATAGATCC 14 상기와 같음
서열번호: 124 AACATGAAATAGA 13 상기와 같음
서열번호: 125 ACATGAAATAGAT 13 상기와 같음
서열번호: 126 CATGAAATAGATC 13 상기와 같음
서열번호: 127 ATGAAATAGATCC 13 상기와 같음
서열번호: 128 AACATGAAATAG 12 상기와 같음
서열번호: 129 ACATGAAATAGA 12 상기와 같음
서열번호: 130 CATGAAATAGAT 12 상기와 같음
서열번호: 131 ATGAAATAGATC 12 상기와 같음
서열번호: 132 TGAAATAGATCC 12 상기와 같음
또한, 본 발명은 특히 서열번호 1 ~ 132에 상응하는(즉, 역 상보적인), 베타-카테닌 유전자에 있는 표적 서열을 제공하고, 상기 표적 서열에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고머)는 베타-카테닌을 하향-조절할 수 있다. 예를 들면, 안티센스 뉴클레오티드 서열 서열번호: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 및 118에 상응하는 표적 서열은, 각각, 도 1에 나타냈다(굵은 글씨 및 밑줄로, 상응하는 올리고 서열번호를 위에 표시하였다).
본 발명의 올리고머는, 적절하게는, 서열번호: 174 ~ 193으로부터 선택되는 서열을 구성 또는 포함 또는 이로부터 유래(상기 서열번호 내에 나타난 상응하는 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 것과 같은)될 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열은 10 ~ 16 뉴클레오염기의 서열을 포함한다. 16 뉴클레오염기를 포함하는 서열의 예는 서열번호: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 및 118로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 나타나있다. 따라서 10, 11, 12, 13, 14 또는 15와 같은, 소수의 뉴클레오염기를 갖는 서열은, 예를 들면 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14 또는 15, 서열번호: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103, 및 118에 나타난 연속된 뉴클레오염기와 같은, 아위(sub)-서열에 상응하는 연속된 뉴클레오염기 서열을 가질 수 있다. 따라서, 더 짧은 서열은 이로부터 유래될 수 있다. 더 긴 서열은 예시된 서열번호로부터 모두, 또는 적어도 10 뉴클레오염기를 포함할 수 있다. 전형적으로 오직 상기 올리고뉴클레오티드의 서열의 한 부분이 서열번호 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103, 및 118로부터 선택되는 서열에 존재한다면, 상기 올리고뉴클레오티드의 서열의 나머지 부분은 상기 서열에 상응하는 뉴클레오티드 측면과 상동적이다. 두 개의 관심 서열 모티프는 서열번호 58 및 서열번호 103이다.
본 발명의 올리고머의 특정 고안(design) 역시 개시되는데, 예를 들면 그것은 서열번호: 133 ~ 152로, 특히 서열번호: 133, 134, 135, 136, 138, 141, 148, 149, 150, 151 및 152로 표시된다. LNA 올리고뉴클레오티드의 특정 고안 역시 개시되는데, 예를 들면 그것은 서열번호: 153 ~ 172로, 특히 서열번호: 153, 154, 155, 156, 158, 161, 168, 169, 170, 171 및 172로 표시된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 베타-카테닌 mRNA 및 단백질 발현의 강력한 억제자로 여겨진다.
어떠한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 포유류 베타-카테닌을 암호화하는 핵산의 동일한 부분과 완전히 상보적인(완벽하게 상보적인) 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성할 수 있다.
그러나, 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 표적 서열에 혼성화하고, 즉, 표적의 하향-조절과 같이 원하는 효과를 보이기 위해 여전히 표적에 충분히 결합하는 경우, 1, 2, 3 또는 4(또는 그 이상)개의 미스매치를 포함할 수 있다. 미스매치는, 예를 들면, 올리고머 뉴클레오염기 서열의 길이 증가 및/또는 뉴클레오염기 서열 내에 존재하는, LNA와 같은, 뉴클레오티드 유사체의 수의 증가에 의해 보완될 수 있다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 포유류 베타-카테닌을 암호화하는 핵산에 상응하는 부분과 같은, 표적 서열에 대해 1개 이하의 미스매치를 포함한다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 바람직하게는 서열번호: 1 ~ 132로 구성된 군으로부터 선택되는 상응하는 서열과, 100% 상동적(동일한)인 것과 같은, 상동체, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적이다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 바람직하게는 서열번호: 173에 존재하는 상응하는 서열과, 100% 상동적(동일한)인 것과 같은, 상동체, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적이다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 바람직하게는 서열번호: 173에 존재하는 하위-서열에, 100% 상보적(완벽하게 상보적)인 것과 같은, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96% 상보적, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적이다.
다양한 실시태양에 있어서, 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오염기 부분)는 서열번호: 1 ~ 132 또는 서열번호: 174 ~ 193으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 중 하나 또는 이의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오염기의 하위-서열로부터 선택되거나 구성되고, 상기 올리고머(또는 이의 연속된 뉴클레오염기 부분)는 상기 선택된 서열에 대하여 하나, 2개, 또는 3개의 미스매치를 선택적으로 포함할 수 있다.
다양한 실시태양에 있어서 상기 하위-서열은 12 ~ 18 뉴클레오염기 사이와 같은, 10 ~ 15, 12 ~ 25, 12 ~ 22 사이와 같은, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 연속된 뉴클레오염기로 구성될 수 있다. 적절하게는, 다양한 실시태양에 있어서, 상기 하위-서열은 본 발명의 올리고머의 연속된 뉴클레오염기 서열로서 같은 길이의 것이다.
그러나, 다양한 실시태양에 있어서 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 독립적으로, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오염기 5' 및/또는 3'과 같은, 5' 또는 3' 뉴클레오염기를 추가적으로 포함할 수 있다고 여겨지고, 이는 표적 서열에 비-상보적이다. 본 발명의 올리고머에 있어서, 다양한 실시태양에 있어서, 5' 또는 3' 측면에 추가적인 뉴클레오염기가 위치하는 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서, 연속된 뉴클레오염기 서열의 3' 말단은 1, 2, 또는 3개의 DNA 또는 RNA 유닛이 측면에 위치할 수 있다. 3' DNA 유닛은 올리고머의 고체상 합성에 종종 사용된다. 다양한 실시태양에 있어서, 이는 동일하거나 또는 다를 수 있고, 연속된 뉴클레오염기 서열의 5' 말단은 1, 2, 또는 3개의 DNA 또는 RNA 유닛이 측면에 위치할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오염기는 DNA 또는 RNA와 같은, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드이다. 다양한 실시태양에 있어서, 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오염기는 본 발명의 갭머(gapmer) 올리고머의 설명에 기재된 것에 따라 부분 D로 나타낼 수 있다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 1에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위(sub)-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 16에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 17에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 18에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 33에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 34에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 49에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 50에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 51에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 52에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 53에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 54에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 55에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 56에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 57에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 58에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 73에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 88에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 103에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 상기 올리고머는 서열번호 : 118에 따른 뉴클레오염기 서열, 또는 이의 하위-서열을 구성 또는 포함한다.
본 발명의 상기 올리고머 및 본 발명에 기재된 것과 같은, 포유류 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 사이의 "상동성(homology)" 또는 "상보성(complementarity)"을 결정할 경우, 상기 상동성의 결정은 본 발명의 조성물에 상응하는 뉴클레오염기 서열 및 포유류 베타-카테닌을 암호화하는 핵산에 상응하는 부위, 또는 이의 상보 서열로 간단한 정렬(alignment)을 통해 실시하고, 상기 상보성은 본 발명의 조성물(올리고머)에서 연속된 뉴클레오염기의 총 개수에 의해 정렬 및 나뉘는 염기의 개수를 측정하고 100을 곱하여 결정된다. 이러한 비교에 있어서, 만약 차이가 있으면, 이러한 차이는 본 발명의 뉴클레오염기 서열과 표적 핵산 사이의 차이에서의 뉴클레오염기의 개수가 있는 부분보다 단지 미스매치인 것이 바람직하다.
아미노산 및 폴리뉴클레오티드 상동성은 표준 셋팅: http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html, 방법: EMBOSS::water(local):Gap Open = 10.0, Gap extend = 0.5, Blosum 62 (단백질), 또는 뉴클레오티드/뉴클레오염기 서열에 대한 DNAfull을 사용한 ClustalW 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 정렬은 인간 및 원숭이, 생쥐 및/또는 쥐와 같은 다른 포유류 종으로부터 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 부위를 동정하기 위하여 사용될 수 있고, 적어도 인간으로부터 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 및 다른 포유류 종에서의 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 모두의 동일한 부위에 100% 상보적인 11, 12,, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 연속된 뉴클레오염기와 같은, 적어도 18개와 같은, 적어도 16개와 같은, 적어도 14개와 같은, 적어도 12개와 같은, 적어도 10개의 부위가 구성 또는 포함되는 올리고머와 같은, 인간 베타-카테닌 표적 핵산, 및 다른 포유류 종에 존재하는 상응하는 핵산 모두를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있게 하는 핵산 상보성에 충분한 확장이 있다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머는 인간에서의 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 및 베타-카테닌을 암호화하는 생쥐 핵산(즉, 두 인간 및 생쥐 서열에서 동일한 부위에 대해 80% ~ 100% 상보적)과 같은, 다른 포유류 종에서의 베타-카테닌을 암호화하는 핵산 모두에 상응하는 부위에 적어도 99%, 또는 100%와 같은, 적어도 98%와 같은, 적어도 95%와 같은, 적어도 90%와 같은, 적어도 85%와 같은, 적어도 80% 상동적인 연속된 뉴클레오염기 서열을 구성 또는 포함한다. 올리고머의 연속된 뉴클레오염기 서열은 인간 베타-카테닌 mRNA의 동일한 부위에 100% 상보적인 것이 바람직하다.
상기 용어 "상응하는"이란 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열 또는 연속된 뉴클레오염기 서열과 ⅰ) 서열번호: 173과 같은, 베타-카테닌 단백질을 암호화하는 mRNA와 같은, 핵산 표적의 역 상보적인, 및/또는 ⅱ) 서열번호: 1 ~ 132 또는 서열번호: 174 ~ 193으로 구성된 군과 같은 본 발명에서 제공되는 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 사이의 비교를 나타낸다. 뉴클레오티드 유사체(analogues)는 그와 동일하거나 상응하는 뉴클레오티드에 직접적으로 비교된다.
상기 용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 유사체에서의 뉴클레오염기 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드가 동일한 것임을 나타낸다. 예를 들면, 뉴클레오티드의 2-디옥시리보스(2-deoxyribose) 유닛이 아데닌과 결합되어 있을 경우, 상기 "상응하는 뉴클레오티드 유사체"는 아데닌과 결합된 5탄당(pentose) 유닛(2-디옥시리보스와 다른)을 포함한다.
길이
올리고머는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 연속된 뉴클레오염기 서열의 길이와 같은, 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성한다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 13, 14, 15, 16개의 연속된 뉴클레오염기 길이와 같은, 13 ~ 17 또는 12 ~ 16과 같은, 12 ~ 18과 같은, 총 10 ~ 25, 10 ~ 24, 12 ~ 25, 12 ~ 24 또는 10 ~ 22 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함 또는 구성한다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 총 10, 11, 12, 13 또는 14개의 연속된 뉴클레오염기 서열의 길이를 포함 또는 구성한다.
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 올리고머는 15, 16 또는 17 뉴크레오염기와 같은, 18개 이하의 뉴클레오염기와 같은, 20개 이하의 뉴클레오염기와 같은, 22개 이하의 뉴클레오염기로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머는 20개 이하의 뉴클레오염기를 포함한다.
뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체
본 발명에서 사용하는 용어 "뉴클레오티드"는 당 부분(sugar moiety), 염기 부분(base moiety) 및 공유적으로 결합된 인산기(phosphate group) 및 DNA 또는 RNA와 같은, 두 개의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA를 포함하는 배당체(glycoside)를 나타낸다. 변형된 당 및/또는 염기 부분을 포함하는 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드는 본 발명에서 "뉴클레오티드 유사체"로서 기재된다. 상기 용어 "뉴클레오염기"는 뉴클레오티드 유사체뿐만 아니라 자연적인(DNA- 또는 RNA-타입) 뉴클레오티드도 포함한다.
비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드는 2' 치환된 뉴클레오티드와 같은, 두 고리식(bicyclic)의 뉴클레오티드 또는 2' 변형된 뉴클레오티드와 같은, 변형된 당 부분을 가지는 뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오티드 유사체"는 당 및/또는 염기 부분에서의 변형에 의한 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드와 같은, 자연적인 뉴클레오티드의 변이체(variants)이다. 유사체는 올리고뉴클레오티드에 있어서 자연적인 뉴클레오티드에 대해 원칙적으로 단지 "침묵(silent)" 또는 "동등(equivalent)"하고, 즉, 표적 유전자 발현 억제에 작용하는 올리고뉴클레오티드 방법에 대한 기능적 효과가 없다. 이러한 "동일한" 유사체는 만약, 예를 들어, 제조가 쉽고 저렴하거나, 또는 저장 또는 제조 상태가 더욱 안정적이거나, 또는, 꼬리표 또는 라벨을 나타낸다면, 역시 유용할 것이다. 그러나, 바람직하게는, 상기 유사체는 예를 들면, 표적에 대해 증가된 결합 친화성 및/또는 세포 내의 뉴클레아제에 대해 증가된 저항성 및/또는 증가된 세포 내로의 운반의 용이함을 통하여 올리고머가 발현을 억제하는 작용 방법에 기능적 효과를 가질 수 있다.
상기 용어 "뉴클레오염기"는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 모두 포함하는 총괄적인 용어로서 사용된다. 뉴클레오염기 서열은 적어도 2개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 서열이다. 다양한 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오염기 서열은 DNA 유닛과 같은, 오직 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 뉴클레오염기 서열은 LNA 유닛과 같은, 오직 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 또는 다양한 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오염기 서열은 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 유닛을 포함할 수 있다.
상기 용어 "핵산"은 2개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 공유결합에 의해 형성된 분자를 의미한다.
상기 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
뉴클레오염기의 상기 "염기 부분(base moiety)"은 비자연적으로 발생하는 뉴클레오염기뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 뉴클레오염기의 염기를 포함한다. 따라서, 상기 염기 부분은 잘 알려진 퓨린(purine) 및 피리미딘(pyrimidine) 이종고리(heterocycles)뿐만 아니라 이종고리의 유사체 및 이의 호변체(tautomeres)를 포함한다.
이러한 염기 부분의 예는, 아데닌(adenine)에 한정하지 않고, 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 티미딘(thymidine), 우라실(uracil), 잔틴(xanthine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)을 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서, 올리고머에 존재하는 뉴클레오염기 중 적어도 하나는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것과 같은, 변형된 염기를 포함한다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체의 특별한 예는 예를 들면, Freier & Altmann, Nucl . Acid Res ., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann, Curr . Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, 및 Scheme 1에 기재되어 있다:
Figure 112009073912409-PCT00001
Scheme 1
따라서 상기 올리고머는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 단순한 서열을 포함 또는 구성하고 - 바람직하게는 2'-디옥시뉴클레오티드(본 발명에서는 일반적으로 "DNA"로서 기재)뿐만 아니라, 리보뉴클레오티드(본 발명에서는 일반적으로 "RNA"로서 기재), 또는 이러한 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및 하나 또는 그 이상의 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 조합, 즉 뉴클레오티드 유사체도 가능하다. 이러한 뉴클레오티드 유사체는 표적 서열에 대한 올리고머의 친화도를 적절하게 높일 수 있다.
적절하고 바람직한 뉴클레오티드 유사체의 예는 WO2007/031091에 기재되어 있고, 본 문서에 참조로서 상입되거나, 또는 본 문서에서 참조된다. 뉴클레오티드의 하나의 바람직한 변형은 2'-치환기를 제공하거나, 또는 결합 친화성을 높이는 다리{잠금핵산(locked nucleic acid - LNA} 구조를 만들기 위해 변형된 당 부분을 갖는 뉴클레오티드를 포함하고 증가된 뉴클레아제(nuclease) 저항성을 제공한다; 그것의 정상 포스포디에스테르(phosphodiester)에서부터 RNase H에 의해 절단될 수 있는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)와 같은, 뉴클레아제 공격에 더욱 저항적인 것까지의 인터뉴클레오티드 결합의 변형은 베타-카테닌 발현 조절에 있어서 안티센스 억제하게 한다. LNA 또는 2'-치환된 당과 같은, 올리고머에서 친화도가 높아진 뉴클레오티드 유사체의 결합은 특별하게 결합하는 올리고머의 크기를 감소시키고, 비특이적 또는 비정상적인 결합이 일어나기 전에 상기 올리고머의 크기 상한을 감소시킬 수도 있다.
다양한 실시태양에 있어서 상기 올리고머는 적어도 2개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 예를 들면, 6 또는 7 뉴클레오티드 유사체와 같이, 3 ~ 8 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 잠금핵산(locked nucleic acid, LNA); 예를 들면 뉴클레오티드 유사체의 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 8은 LNA일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA일 수 있다.
오직 뉴클레오티드로 구성되는, 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프(motif) 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 경우, 그 서열에 의해 정의 되는 본 발명의 올리고머는 올리고머/표적 듀플렉스(duplex)의 듀플렉스 안정성/Tm을 높이는(즉, 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체), LNA 유닛 또는 다른 뉴클레오티드 유사체와 같은, 상기 서열에 존재하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다고 인식될 것이다.
다양한 실시태양에 있어서, 올리고머의 뉴클레오티드 서열과 표적 서열 사이의 임의의 미스매치는 바람직하게는, 본 발명에 기재된 부분 B 내, 및/또는 본 발명에 기재된 부분 D 내, 및/또는 올리고뉴클레오티드에서 DNA 뉴클레오티드와 같은 비변형된 지점, 및/또는 연속된 뉴클레오염기 서열에서 5' 또는 3' 부분과 같은, 상기 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체 외부(예를 들어 부분 A 및 C)에서 발견된다.
상기 뉴클레오티드의 이러한 변형의 예는 결합 친화도를 높이거나 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있는 2'-치환기를 제공하거나 또는 다리(잠금 핵산) 구조 제작을 통한 변형 당 부분을 포함한다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는 옥시(oxy)-LNA(베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA과 같은), 및/또는 아미노(amino)-LNA(베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA과 같은) 및/또는 티오(thio)-LNA(베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA과 같은) 및/또는 ENA(베타-D-ENA 및 알파-L-ENA와 같은)와 같은, LNA이다.
일부 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머 내에 존재하는 뉴클레오티드 유사체(본 발명에 기재된 부분 A 및 C와 같은)는 예를 들면: 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛, LNA 유닛, 아라비노 핵산(arabino nucleic acid, ANA) 유닛, 2'-플루오로-ANA(2'-fluoro-ANA) 유닛, HNA 유닛, INA(intercalating nucleic acid -Christensen, 2002. Nucl . Acids . Res. 2002 30: 4918-4925는 참조로서 삽입)유닛 및 2'MOE 유닛으로부터 독립적으로 선택된다. 다양한 실시태양에 있어서 본 발명의 올리고머에 존재하는 뉴클레오티드 유사체의 상기 형태 중 오직 하나, 또는 이의 연속된 뉴클레오염기 서열이 있다.
다양한 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메톡시에틸-RNA{2'-O-methoxyethyl(2'MOE)-RNA}, 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 모노머 또는 LNA 뉴클레오티드 유사체이고, 이러한 본 발명의 유사체는 이러한 3가지 형태로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 포함하거나, 또는 상기 세 가지 형태로부터 선택되는 유사체의 오직 하나의 형태를 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 2'-MOE-RNA 뉴클레오티드 유닛과 같은, 2'-MOE-RNA이다. 다양한 실시태양에 있어서 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 유닛과 같은, 2'-플루오로-DNA이다.
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 3 ~ 7 또는 4 내지 8 사이의 LNA 유닛, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 LNA 유닛과 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛을 포함한다. 다양한 실시태양에 있어서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 베타-D-옥시-LNA, 및 하나 또는 그 이상의 하기 LNA 유닛: 베타-D 또는 알파-L의 구성 또는 이의 조합에서의 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 및/또는 ENA를 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서 모든 LNA 시토신 유닛은 5'메틸-시토신(5'methyl-Cytosine)이다. 본 발명의 다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머는 LNA 및 DNA 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는 LNA 및 DNA 유닛의 조합된 전체는 10 ~ 25이고, 바람직하게는 10 ~ 20이고, 더욱 바람직하게는 12 ~ 16이다. 본 발명의 다양한 실시태양에 있어서, 적어도 하나의 LNA 및 나머지 뉴클레오티드 유닛으로 구성되는 연속된 뉴클레오염기 서열과 같은, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 DNA 유닛이다. 다양한 실시태양에 있어서 상기 올리고머는 오직 LNA 뉴클레오티드 유사체 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드(RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드와 같은), 선택적으로는 포스포로티오에이트(phosphorothioate)와 같은 변형된 연쇄군(linkage group)을 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서, 올리고머에 존재하는 적어도 하나의 뉴클레오염기는 5-메틸시토신(5-methylcytosine), 이소시토신(isocytosine), 슈도이소시토신(pseudoisocytosine), 5-브로모우라실(5-bromouracil), 5-프로피닐우라실(5-propynyluracil), 6-아미노퓨린(6-aminopurine), 2-아미노퓨린(2-aminopurine), 이노신(inosine), 디아미노퓨린(diaminopurine), 및 2-클로로-6-아미노퓨린(2-chloro-6-aminopurine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 변형된 염기를 가진다.
LNA
상기 용어 "LNA"는 "잠금핵산(Locked Nucleic Acid)"으로 알려진, 두고리 뉴클레오티드 유사체를 나타낸다. LNA 모노머를 나타낼 수 있고, "LNA 올리고뉴클레오티드" 또는 LNA "올리고머"에 사용될 경우, 하나 또는 그 이상의 이러한 두고리 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고머를 나타낸다.
본 발명의 올리고머에 사용되는 LNA는 바람직하게는 화학식 Ⅰ의 구조를 갖는다.
Figure 112009073912409-PCT00002
상기 X는 O-, S-, -N(RN *)-, -C(R6R6 *)-으로부터 선택된다;
B는 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -4 알콕시(alkoxy), 선택적으로 치환된 C1 -4 알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C1 -4 아실록시(acyloxy), 뉴클레오염기, DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 선택된다;
P는 다음의 모노머, 또는 인터뉴클레오티드(internucleotide) 결합 또는 치환된 R5를 선택적으로 포함하거나 치환된 R5 *를 동일하게 사용가능한 5'-말단기와 같은, 5'-말단기에 대한 인터뉴클레오티드 결합을 위한 라디칼 위치를 나타낸다;
P*은 앞의 모노머, 또는 3'-말단기에 대한 인터뉴클레오티드 결합을 나타낸다;
R4 * 및 R2 *은 모두 C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 ＞C=Z로부터 선택되는 1 ~ 4 그룹/원자로 구성되는 이가라디칼(biradical)을 나타내고,
상기 Z는 각각 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐록시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되는 -O-, -S-, 및 -N(Ra)-, 및 Ra 및 Rb로부터 선택되고, 상기 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb 는 모두 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2), 및 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐록시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1-6-alkyl)amino}, 카바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{amino-C1-6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일옥시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되는, 각각의 치환기 R1 *, R2, R3, R5, R5 *, R6 및 R6 *을 나타낼 수 있고, 상기 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환될 수 있고, 두 이중의 치환기 모두는 옥소(oxo), 치옥소(thioxo), 이미노(imino), 또는 선택적으로 치환된 메틸렌을 나타내고, 또는 모두는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자/-O-, -S-, 및 -(NRN)-로부터 선택되는 군에 의해 선택적으로 중단 및/또는 종결된 1 ~ 5 탄소 원자 알킬렌 체인으로 구성되는 스피노 이중 라디칼로 형성될 수 있고, 두 인접한(비-이중의) 치환기는 이중 결합에 따르는 추가적인 결합을 나타낼 수 있고; 이중 라디칼에 존재하고 연관되지 않는 경우, RN *은 수소 및 C1 -4 알킬(alkyl); 및 이의 염기성염(basic salts) 및 산부가염(acid addition salts)으로부터 선택된다.
다양한 실시태양에 있어서 R5 *는 H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3, 및 -CH=CH2로부터 선택된다.
다양한 실시태양에 있어서 R4 * 및 R2 *는 모두 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, -C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-N(Rc)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-, -C(RaRb)-N(Rc)-O-, 및 -C(RaRb)-S-, -C(RaRb)-C(RcRd)-S-로부터 선택되는 이중 라티칼을 나타낸다. 상기 각각의 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf는 수소(hydrogen), 선택적으로 치환된 C1 -12-알킬(alkyl), 선택적으로 치환된 C2 -12-알케닐(alkenyl), 선택적으로 치환된 C2 -12 알키닐(alkynyl), 하이드록시(hydroxy), C1 -12-알콕시(alkoxy), C2 -12-알콕시알킬(alkoxyalkyl), C2 -12-알케닐록시(alkenyloxy), 카복시(carboxy), C1 -12-(알콕시카보닐(alkoxycarbonyl), C1 -12-알킬카보닐(alkylcarbonyl), 포르밀(formyl), 아릴(aryl), 아릴옥시-카보닐(aryloxy-carbonyl), 아릴옥시(aryloxy), 아릴카보닐(arylcarbonyl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로아릴옥시-카보닐(heteroaryloxy-carbonyl), 헤테로아릴옥시(heteroaryloxy), 헤테로아릴카보닐(heteroarylcarbonyl), 아미노(amino), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)아미노{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino}, 카바모일(carbamoyl), 모노- 및 디(C1 -6-알킬)-아미노-카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)-amino-carbonyl}, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐{amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1 -6-알킬-아미노카보닐{mono- 및 di(C1 -6-alkyl)amino-C1 -6-alkyl-aminocarbonyl}, C1 -6-알킬-카보닐아미노(C1 -6-alkyl-carbonylamino), 카바미노(carbamido), C1 -6-알카노일록시(C1 -6-alkanoyloxy), 설포노(sulphono), C1 -6-알킬설포닐옥시(C1 -6-alkylsulphonyloxy), 니트로(nitro), 아지도(azido), 설파닐(sulphanyl), C1 -6-알킬티오(C1 -6-alkylthio), 할로겐(halogen), DNA 삽입물질(intercalators), 광화학적 활성기, 열화학적 활성기, 킬레이팅기(chelating group), 리포터기(reporter group), 및 리간드(ligands)로부터 독립적으로 선택되고, 상기 아릴(aryl) 및 헤테로아릴(heteroaryl)은 선택적으로 치환되고, 두 이중의 치환기 Ra 및 Rb는 모두는 선택적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시태양에 있어서 R4 * 및 R2 *는 모두 -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3)-O-, -CH(CH2-O-CH3)-O-로부터 선택되는 이중 라디칼을 나타낸다.
모든 키랄 중심(chiral centers)을 위해, 비대칭기(asymmetric groups)는 R 또는 S 배향 중 어느 하나에 있을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 올리고머에 사용되는 LNA는 임의의 화학식에 따르는 적어도 하나의 LNA 유닛을 포함한다.
Figure 112009073912409-PCT00003
상기 Y는 -O-, -O-CH2- ,-S-, -NH-, 또는 N(RH)이고; Z 및 Z*은 인터뉴클레오티드 결합, 말단기 또는 보호기 사이에서 독립적으로 선택되고; B는 자연적 또는 비자연적 뉴클레오티드 염기 부분으로 구성되고, RH는 수소 및 C1 -4-알킬(C1-4-alkyl)로부터 선택된다.
특히 바람직한 LNA 유닛을 scheme 2에 나타낸다:
Figure 112009073912409-PCT00004
Scheme 2
상기 용어 "티오(thio)-LNA는 상기 일반 화학식에서 Y가 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오염기(Locked nucleobase, LNA)를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
상기 용어 "아미노(amino)-LNA"는 상기 일반 화학식에서 Y가 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)-로부터 선택되는 잠금 뉴클레오염기(Locked nucleobase, LNA)를 포함하고, 상기 R은 수소(hydrogen) 및 C1 -4-알킬(alkyl)로부터 선택된다. 아미노-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
상기 용어 "옥시(oxy)-LNA는 상기 일반 화학식에서 Y가 -O- 또는 -CH2-O-를 나타내는 잠금 뉴클레오염기(Locked nucleobase, LNA)를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 및 알파-L-배열 모두에 있을 수 있다.
상기 용어 "ENA"는 상기 일반 화학식에서 Y가 -CH2-O-(-CH2-O-의 산소 원자는 염기 B에 관하여 2'-위치에 결합)인 잠금 뉴클레오염기(Locked nucleobase, LNA)를 포함한다.
바람직한 실시태양에 있어서 LNA는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA), 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy-LNA), 베타-D-아미노-LNA(beta-D-amino-LNA) 및 베타-D-티오-LNA(beta-D-thio-LNA)로부터 선택되고, 바람직하게는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA)이다.
본 발명에 있어서, 상기 용어 "C1 -4-알킬(alkyl)"은 선형 또는 가지형의 포화 탄화수소 사슬을 뜻하고, 상기 사슬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 세크-부틸(sec-butyl) 및 터트-부틸(tert-butyl)과 같이, 1개 내지 4개의 탄소 원자를 가진다.
리보핵산분해효소 H 선별( RNAse H recruitment )
올리고머성 조성물은 번역, 또는 다른 방법의 입체적 배치의 방해와 같은, 표적 mRNA의 비 리보핵산분해효소 매개 분해에 의해 작용할 수 있다고 여겨지지만, 본 발명의 바람직한 올리고머는 리보핵산분해효소 H(RNase H)와 같은, 엔도리보핵산분해효소(RNase)의 선별을 할 수 있다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머, 또는 연속된 뉴클레오염기 서열은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기를 포함하는, 적어도 8 또는 적어도 9개의 연속된 뉴클레오염기 유닛(잔기)과 같은, 적어도 7개의 연속된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기 유닛과 같은, 적어도 6개의 부분를 포함하고, 상보적인 표적 RNA로 듀플렉스(duplex)를 형성할 경우, RNase를 선별할 수 있다. RNase를 선별할 수 있는 연속된 서열은 본 발명에 기재된 갭머(gapmer)에 나타낸 부분 B일 수 있다. 다양한 실시태양에 있어서 부분 B와 같은, RNase를 선별할 수 있는 연속된 서열의 크기는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오염기 유닛과 같이, 더 높을 수 있다.
EP 1 222 309는 시험관 내(in vitro)에서 RNase H의 활성 측정 방법을 제공하고, RNase H를 선별하는 능력을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 만약, 상보적인 RNA 표적이 제공될 경우, 상기 올리고머는 RNase H를 선별할 수 있다고 여겨진다. 2' 치환기가 없고, 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합기(linkage groups)가 있는, 오직 뉴클레오티드 동일한 DNA의 적어도 10% 이하 또는 20% 이하와 같은, 적어도 5%와 같은, 적어도 1%와 같은, EP 1 222 309의 실시예 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 사용하여, pmol/ℓ/min으로서 측정되는 초기 속도를 갖는다.
다양한 실시태양에 있어서, 만약 상보적인 RNA 표적 및 RNase H가 제공될 경우, 상기 올리고머는 RNase H를 선별할 수 있다고 여겨지고, EP 1 222 309의 실시예 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 사용하여, pmol/ℓ/min으로서 측정되는 RNase H 초기 속도는 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드 사이에 2' 치환기가 없고, 포르포로티오에이트(phosphorothioate) 결합기가 있는 오직 뉴클레오티드 동일한 DNA의 적어도 10% 이하 또는 20% 이하와 같은, 적어도 5% 이하와 같은, 적어도 1% 이하이다.
다른 실시태양에 있어서, 만약, 상보적인 RNA 표적 및 RNase H가 제공될 경우, 상기 올리고머는 RNase H를 선별할 수 있다고 여겨지고, EP 1 222 309의 실시예 91 ~ 95에 의해 제공되는 방법을 사용하여, pmol/ℓ/min으로서 측정되는 RNase H 초기 속도는 올리고뉴클레오티드에 있는 모든 뉴클레오티드 사이에 2' 치환기가 없고, 포르포로티오에이트(phosphorothioate) 결합기가 있는 오직 뉴클레오티드 동일한 DNA를 사용하여 측정된 초기 속도의 적어도 80%와 같은, 적어도 60%와 같은, 적어도 40%와 같은, 적어도 20%이다.
상보적인 표적 RNA로 듀플렉스를 형성할 때, 연속된 뉴클레오염기 서열을 형성하는 상기 올리고머의 부위는 전형적으로, RNA 표적에 의한 듀플렉스와 같은 DNA/RNA를 형성하는 뉴클레오티드 유닛으로 구성되는 RNase 선별을 할 수 있고 - 알파-L-배열에 있는 DNA 유닛 및 LNA 유닛을 포함할 수 있고, 특히 바람직하게는 알파-L-옥시-LNA일 수 있다.
본 발명의 올리고머는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 모두를 포함하는 뉴클레오염기 서열을 포함할 수 있고, 갭머(gapmer), 헤드머(headmer) 또는 믹스머(mixmer) 형태일 수 있다.
헤드머(headmer)는 3'-말단에 대한 RNAse에 의해 인식 및 절단되는 DNA 또는 변형된 뉴클레오티드(유사체) 유닛의 연속된 신장(적어도 7개의 이러한 뉴클레오티드와 같은)이 따르는 5'-말단에서 비-RNase 선별 뉴클레오티드 유사체의 연속된 신장에 의해 정의되고, 테일머(tailmer)는 3'-말단에 대한 비-RNAse 선별 뉴클레오티드 유사체의 연속된 신장이 따르는 5'-말단에서 RNase에 의해 인식 및 전달되는 DNA의 연속된 신장 또는 변형된 뉴클레오티드(유사체)(적어도 7개의 이러한 뉴클레오티드와 같은)에 의해 정의된다. 본 발명에 따른 다른 "융합(chemeric)" 올리고머는 ⅰ) RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 또는 변형된 뉴클레오티드 및 ⅱ) 비-RNase 선별 뉴클레오티드 유사체의 대체 조성물로 구성되는 "믹스머(mixmers)"라고 불린다. 일부 뉴클레오티드 유사체는 RNase H와 같은, RNase를 매개, 결합 및 절단할 수 있다. 알파-L-LNA가 어떤 확장에 대한 RNase 활성을 선별하기 때문에, 갭머(gapmer) 컨스트럭트(construct)에 대해 RNase에 의해 인식 및 절단되는 DNA 또는 변형된 뉴클레오티드의 작은 부위(예를 들면, 갭머 또는 부분 B)가 요구될 수 있고, 믹스머 컨스트럭션(construction)에 더욱 높은 유연성이 도입될 수 있다.
갭머 고안( gapmer design )
바람직하게는, 본 발명의 상기 올리고머는 갭머(gapmer)이다. 갭머 올리고머는 본 발명에 기재된 부분 B와 같은, 적어도 6 또는 7 DNA 뉴클레오티드 부위와 같은, RNaseH와 같은, RNase를 선별할 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기의 연속된 신장을 포함하는 올리고머이고, 상기 부분 B는 RNAse 선별을 할 수 있는 뉴클레오티드의 연속된 신장에서 1 ~ 6 사이의 뉴클레오티드 유사체 5 및 3'과 같은, 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체와 같은, 뉴클레오티드 유사체 부분의 5' 및 3' 측면에 위치하고 - 이러한 부분를 각각 부분 A 및 부분 C라고 한다.
바람직하게는 상기 갭머는 화학식(5' 에서 3'), A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C의 (폴리)뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 부분 A(5' 부분)는 LNA 유닛과 같은, 1 내지 6 사이의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함하고; 부분 B는 DNA 뉴클레오티드와 같은, RNAse(mRNA 표적과 같은, 상보적인 RNA 분자로 이루어진 듀플렉스에서 형성될 때)를 선별할 수 있는 적어도 5개의 연속된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기를 구성 또는 포함하고; 부분 C(3' 부분)는 LNA 유닛과 같은, 1 내지 6 사이의 뉴클레오티드 유사체와 같은, 적어도 하나의 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 구성 또는 포함하고; 존재할 경우, 부분 D는 DNA 뉴클레오티드와 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 유닛을 구성 또는 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서, 부분 A는 3 또는 4 LNA 유닛과 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체와 같은, LNA 유닛과 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 유사체로 구성; 및/또는 부분 C는 3 또는 4 LNA 유닛과 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체와 같은, 2 ~ 5 LNA 유닛과 같은, 2 ~ 5 사이의 뉴클레오티드 유사체와 같은, LNA 유닛과 같은, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 뉴클레오티드 유사체로 구성된다.
다양한 실시태양에 있어서 B는 RNAse를 선별할 수 있는 8개의 연속된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기와 같은, RNAse를 선별할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기, 또는 6 내지 10 사이, 또는 7 내지 9 사이를 구성 또는 포함한다. 다양한 실시태양에 있어서 부분 B는 1 ~ 12 DNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 DNA 뉴클레오티드 유닛을 구성 또는 포함하고, 바람직하게는 4 ~ 12 DNA 유닛이고, 더욱 바람직하게는 7 내지 10 사이의 DNA 유닛과 같은, 6 내지 10 사이의 DNA 유닛이고, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 DNA 유닛이다.
다양한 실시태양에 있어서 부분 A는 LNA와 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체로 구성되고, 부분 B는 7, 8, 9 또는 10 DNA 유닛으로 구성되며, 부분 C는 LNA와 같은, 3 또는 4 뉴클레오티드 유사체로 구성된다. 이러한 고안은 (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3을 포함하고, DNA 유닛과 같은, 하나 또는 2개의 뉴클레오티드 유닛을 가질 수 있는 부분 D를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 갭머 고안은 WO2004/046160에 기재되어 있고, 참조로서 본 발명에 통합된다.
US 가출원, 60/977409는 참조로서 본 발명에 통합되고, '쇼트머(shortmer)' 갭머 올리고머라 하며, 이는 다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 따른 갭머 올리고머일 수 있다.
다양한 실시태양에 있어서 상기 올리고머는 총 10, 11, 12, 13 또는 14 뉴클레오염기 유닛의 연속된 뉴클레오염기 서열로 구성되고, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 화학식(5' - 3'), A-B-C, 또는 선택적으로는 A-B-C-D 또는 D-A-B-C이고, 상기 부분 A(5' 부분)는 LNA 유닛과 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 유사체로 구성되고; 부분 B는 상보적인 RNA 분자(mRNA 표적과 같은)로 이루어진 듀플렉스에서 형성될 때 RNAse를 선별할 수 있는 7, 8 또는 9개의 연속된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기로 구성되고; 부분 C는 LNA 유닛과 같은, 1, 2 또는 3 뉴클레오티드 유사체로 구성된다. 존재할 경우, D 부분은 단일 DNA 유닛으로 구성된다.
다양한 실시태양에 있어서 A는 1개의 LNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 A는 2개의 LNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 A는 3개의 LNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 C는 1개의 LNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 C는 2개의 LNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 C는 3개의 LNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 7개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 8개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 9개의 뉴클레오티드 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 DNA 유닛과 같은, 1 ~ 9 사이의 DNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 DNA 유닛으로 구성된다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 알파-L-배열에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 LNA 유닛과 같은, 알파-L-배열에 존재하는 적어도 하나의 LNA 유닛을 포함한다. 다양한 실시태양에 있어서 B는 적어도 하나의 알파-L-옥시(oxy) LNA 유닛을 포함하거나 또는 상기 알파-L-배열에 존재하는 모든 LNA 유닛은 알파-L-옥시 LNA 유닛이다. 다양한 실시태양에 있어서 A-B-C에 존재하는 뉴클레오티드의 개수는 (뉴클레오티드 유사체 유닛-부분 B-뉴클레오티드 유사체 유닛): 1-8-1. 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, 또는; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 실시태양에 있어서 A-B-C의 뉴클레오티드의 개수는 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 실시태양에 있어서 A 및 C는 모두 각각 두 LNA 유닛으로 구성되고, B는 8 또는 9 뉴클레오티드 유닛, 바람직하게는 DNA 유닛으로 구성된다.
다른 갭머 고안은 2'-O-메톡시에틸-RNA(methoxyethyl-RNA, 2'MOE) 및 2'-플루오로(fluoro)-DNA 모노머로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체와 같은, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드 유사체로 구성되는 부분 A 및/또는 C, 및 5-10-5 및 4-12-4 갭머 고안과 같은, DNA 유닛(또는 뉴클레오염기)과 같은, 8, 9, 10, 11 또는 12 뉴클레오티드로 구성되는 B 부분에 있는 것을 포함한다. 또 다른 갭머 고안은 WO 2007/146511A2에 기재되어 있고, 참조로서 본 문서에 삽입된다.
결합기( Linkage groups )
상기 용어 "결합기(linkage group)" 또는 "인터뉴클레오티드 결합(internucleotide linkage)"은 두 뉴클레오티드 또는 뉴클레오염기, 두 뉴크레오티드 유사체, 및 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 등을 서로 공유적으로 결합할 수 있는 그룹(group)을 나타낸다. 특히 바람직한 실시예는 인산기(phosphate group) 및 포스포로티오에이트기(phosphorothioate group)를 포함한다.
본 발명의 상기 올리고머의 뉴클레오염기 또는 이의 연속된 뉴클레오염기 서열은 결합기를 통해 서로 연결되어 있다. 적절하게는 각 뉴클레오염기는 결합기를 통해 3' 인접 뉴클레오염기에 연결되어 있다.
적절한 결합기는 WO2007/031091에 기재된 것을 포함하고, 예를 들면, 상기 결합기는 WO2007/031091(본 문서에 참조로서 삽입)의 34쪽의 첫 번째 문단에 목록으로 기재되어 있다.
다양한 실시태양에 있어서, 정상 포스포디에스터(phosphodiester)에서 RNaseH에 의해 절단되고, 또한 표적 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 저해를 하는 포스포고티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate)와 같은, 뉴클레아제(nuclease) 공격에 더욱 저항성 있는 것으로 결합기를 변형하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 것으로서 적절한 황(S)을 함유된 결합기인 것이 바람직하다. 특히 갭머의 부분 B 갭에 대하여 포스포로티오에이트 결합기인 것 또한 바람직하다. 포스포로티오에이트 결합은 측면 부분(적절하게는, A 및 C, 및 A 또는 C에서 D 연결을 위해, 부분 D 내)에 사용될 수 있다.
특히, 예를 들어 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 A 및 C 부분과 같은 - 엔도-뉴클레아제 분해로부터 A 및 C 부분의 결합기를 보호하는 뉴클레오티드 유사체를 사용할 경우, 부분 A, B 및 C는 포스포디에스터 결합과 같은, 포스포로티오에이트 외의 결합기를 포함할 수 있다.
상기 올리고머의 결합기는 표적 RNA의 RNase H 절단을 위한 포스포디에스터, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트일 수 있다. 뉴클레아제 저항성 향상 및 제조의 편이와 같은 다른 이유를 위해, 포스포로티오에이트가 바람직하다.
본 발명의 상기 올리고머의 하나의 실시태양에 있어서, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트기에 의해 서로 결합되어 있다.
특히 뉴클레오티드 유사체 유닛 사이 또는 인접한, 하나 또는 2개의 결합과 같은, 다른 포스포로티오에이트 올리고머 내로의 포스포디에스터 결합의 포함은 올리고머의 생물학적 이용가능성 및/또는 생물학적-분배를 변형할 수 있고- WO2008/053314 참고, 본 문서에 참조로서 삽입된다.
일부 실시태양에 있어서, 적절하고 특별하지 않게 나타낸, 상기의 실시태양과 같은, 모든 존재하는 결합기는 포스포디에스터 또는 포스포로티오에이트, 또는 이의 혼합이다.
일부 실시태양에 있어서 모든 인터뉴클레오티드 결합기는 포스포로티오에이트이다.
본 발명에서 제공되는 것과 같은, 특별한 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 경우, 다양한 실시태양에 있어서, 결합이 본 발명에 기재된 것과 같은, 포스포로티오에이트 결합, 대안적인 결합일 경우, 예를 들면, 포스페이트(포스포디에스터) 결합이 쓰일 수 있고, 특별하게는 LNA 유닛과 같은, 뉴클레오티드 유사체 사이의 결합일 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 것과 같은, 특별한 갭머 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 경우, C 잔기가 5'메틸 변형된 시토신으로서 알려진 경우, 다양한 실시태양에 있어서, 올리고머에 존재하는 하나 또는 그 이상의 Cs는 변형되지 않은 C 잔기일 수 있다.
올리고머성 화합물( Oligomeric Compounds)
본 발명의 올리고머는 표 2에 나타낸, 서열번호 133 ~ 152로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
올리고머 고안
서열번호 서열 (5'- 3') 길이 (염기)
서열번호 : 133 G s A s A s asgscstsgsastsgsgsas C s C s A 16
서열번호 : 134 C s A s G s ascststsasasasgsasts G s G s C 16
서열번호 : 135 C s A s G s asastscscsascstsgsgs T s G s A 16
서열번호 : 136 G s C s A s cstsgscscsaststststs A s G s C 16
서열번호 : 137 G s T s A s astsasgscscsasasgsas A s T s T 16
서열번호 : 138 A s C s T s cstsgscststsgstsgsgs T s C s C 16
서열번호 : 139 C s C s A s cscsasgscststscstsas C s A s A 16
서열번호 : 140 G s A s G s tscscsasasasgsascsas G s T s T 16
서열번호 : 141 A s C s C s csascststsgsgscsasgs A s C s C 16
서열번호 : 142 G s C s A s csasasascsasastsgsgs A s A s T 16
서열번호 : 143 G s C s A s gscstsascstscstststs G s G s A 16
서열번호 : 144 C s T s C s cscstscsasgscststscs A s A s T 16
서열번호 : 145 G s C s A s gstscstscsaststscscs A s A s G 16
서열번호 : 146 T s A s T s cscsascscsasgsasgsts G s A s A 16
서열번호 : 147 C s A s T s cscsastsgsasgsgstscs C s T s G 16
서열번호 : 148 C s C s A s tscststsgstsgsastscs C s A s T 16
서열번호 : 149 A s A s G s csasasgscsasasasgsts C s A s G 16
서열번호 : 150 G s A s A s aststsgscstsgstsasgs C s A s G 16
서열번호 : 151 G s T s G s tstscstsascsascscsas T s T s A 16
서열번호 : 152 A s A s C s astsgsasasastsasgsas T s C s C 16
서열번호 : 148 C s C s A s tscststsgstsgsastscs C s A s T 16
서열번호 : 149 A s A s G s csasasgscsasasasgsts C s A s G 16
서열번호 : 150 G s A s A s aststsgscstsgstsasgs C s A s G 16
서열번호 : 151 G s T s G s tstscstsascsascscsas T s T s A 16
서열번호 : 152 A s A s C s astsgsasasastsasgsas T s C s C 16
서열번호: 133 ~ 152, 대문자는 뉴클레오티드 유사체 유닛을 나타내고 아래에 기입한 "S"는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 소문자는 뉴클레오티드(DNA)를 나타낸다. "S"의 부재(만약에 있다면)는 포스포디에스터 결합을 나타낸다.
결합체( Conjugates )
본 발명에서 사용되는 용어 "결합체"는 본 발명에 기재된 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드/비-뉴클레오티드-유사체(즉, 비-뉴클레오염기), 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분과 같은 올리고머의 공유결합{"결합(conjugation)"}에 의해 형성되는 이형 분자를 나타낸다. 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분의 예는 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기, 당단백질, 폴리머, 또는 이의 조합을 포함한다. 전형적인 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)일 수 있다.
그러므로, 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 올리고머는 폴리뉴클레오티드 부분, 즉, 전형적으로 뉴클레오염기의 연속된 서열로 구성된 뉴클레오티드/뉴클레오염기 부분, 및 다른 비-뉴클레오티드 부분을 모두 포함할 수 있다. 연속된 뉴클레오염기 서열로 구성된 본 발명의 상기 올리고머를 나타낼 경우, 화합물은 결합 성분과 같은, 비-뉴클레오티드/비-뉴클레오염기 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양에 있어서 올리고머성 화합물은 리간드/결합체에 결합될 수 있다. 이는 예를 들면, 올리고머성 화합물의 세포의 흡수 증가를 위해 사용될 수 있다. WO2007/031091은 적절한 리간드 및 결합체를 제공하고, 이는 참조로서 본 문서에 삽입된다.
본 발명은 본 발명에 기재된 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 결합체, 및 상기 화합물에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 제공한다. 그러므로, 다양한 실시태양에 있어서 본 발명의 화합물은 상기 핵산 또는 뉴클레오염기 서열로 구성되고, 본 발명에 기재된 것과 같이, 상기 화합물은 상기 화합물에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분도 포함한다(예를 들면, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하지 않음).
결합체는 본 발명의 올리고머의 활성, 세포의 분배 또는 세포의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 부분은 항체, 폴리펩티드, 콜레스테롤 부분, 담즙산, 티오에스터(thioester)와 같은 지질 부분, 예를 들면, 헥실-s-트리틸치올(Hexyl-s-tritylthiol), 티오콜레스테롤(thiocholesterol), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들면, 도데칸디올(dodecandiol) 또는 언데실 잔기(undecyl residues), 인지질(phospholipids), 예를 들면, 디-헥사데실-랙-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸암모늄 1, 2-디-o-헥사데실-랙-글리세로-3-h-포스포네이트(triethylammonium 1,2-di-o-hexadecyl-rac-glycero-3-h-phosphonate), 폴리아민(polyamine) 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(polyethylene glycol chain), 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid), 팔미틸 부분(palmityl moiety), 옥타데실아민(octadecylamine) 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부분(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety)을 포함하나 이에 한정하지 아니다.
본 발명의 올리고머는 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨제, 항박테리아 또는 항생제와 같은, 활성 약제 물질에 결합될 수 있다.
어떠한 실시태양에 있어서 결합된 부분은 콜레스테롤과 같은, 스테롤이다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 결합된 부분은 예를 들면, 길이에 있어서 3 ~ 10 아미노산 잔기와 같은, 2 ~ 20과 같은, 1 ~ 50 사이의 양전하 펩티드와 같은, 양전하 폴리머, 및/또는 폴리에틸글리콜(polyethylglycol, PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol)과 같은 폴리알킬렌옥사이드(polyalkylene oxide)를 포함 또는 구성하고 - WO 2008/034123 참고, 참조로서 본 문서에 삽입된다. 적절하게는 폴리알킬렌옥사이드와 같은, 양전하 폴리머는 WO 2008/034123에 기재된 방출가능한 링커(linker)와 같은 링커를 통해 본 발명의 올리고머에 결합될 수 있다.
활성화된 올리고머( Activated oligomers )
본 발명에서 사용되는 용어 "활성화된 올리고머(Activated oligomer)"는 올리고머를 하나 또는 그 이상의 결합된 부분에 공유 결합할 수 있게 하는, 즉, 자체는 핵산 또는 모노머가 아니며, 본 발명에 기재된 결합체를 형성하는 적어도 하나의 작용부(functional moiety)에 공유적으로 결합되는 본 발명의 올리고머를 나타낸다. 전형적으로는, 작용부는 예를 들면, 아데닌(adenine) 염기의 3'-하이드록실(hydroxyl)기 또는 엑소사이클릭(exocyclic) NH2기, 바람직하게는 친수성인 스페이서(spacer) 및 결합된 부분에 결합할 수 있는 말단기{예를 들면, 아미노(amino), 설피드릴(sulphydryl) 또는 하이드록실(hydroxyl)기}를 통해 올리고머에 공유적으로 결합할 수 있는 화학기(chemical group)로 구성될 것이다. 일부 실시태양에 있어서, 이러한 말단기는 보호되지 않고, 예를 들면, NH2기이다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 말단기는 예를 들면, Theodora W Greene 및 Peter G M Wuts에 의한 "Protective Groups in Organic Synthesis" 3판(John Wiley & Sons, 1999)에 기재된 것과 같은 임의의 적절한 보호기에 의해 보호된다. 적절한 하이드록실 보호기의 예는 아세테이트에스터(acetate ester)와 같은 에스터, 벤질(benzyl)과 같은 아랄킬(aralkyl)기, 디페닐메틸(diphenylmethyl), 또는 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 및 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl)을 포함한다. 적절한 아미노 보호기의 예는 벤질(benzyl), 알파-메틸벤질(alpha-methylbenzyl), 디페닐메틸(diphenylmethyl), 트리페닐메틸(triphenylmethyl), 벤질옥시카보닐(benzyloxycarbonyl), 터트- 부트옥시카모닐(tert-butoxycarbonyl), 및 트리콜로아세틸(trichloroacetyl) 또는 트리플루오로아세틸(trifluoroacetyl)과 같은 아실(acyl)기를 포함한다. 일부 실시태양에 있어서, 작용기는 자가절단(self-cleaving) 된다. 다른 실시태양에 있어서, 작용기는 생물 분해성이다. 예를 들면, 미국 특허 제 7,087,229호를 참고하고, 이는 그 전체에 있어서 본 문서에 참조로서 삽입된다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 올리고머의 5' 말단에 결합 부분의 공유 결합을 위해 5' 말단에서 작용화 된다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에서 작용화 될 수 있다. 또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 백본(backbone)을 따라 또는 이종고리 염기 부분에서 작용화 될 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 상기 5' 말단, 상기 3' 말단, 상기 백본 및 염기로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 부분에서 작용화 될 수 있다.
일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 작용부에 공유적으로 결합하는 하나 또는 그 이상의 모노머가 합성되는 동안 통합됨으로써 합성된다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 작용화 되지 않는 모노머로 합성되고, 상기 올리고머는 합성의 완결에 따라 작용화 된다. 일부 실시태양에 있어서, 올리고머는 아미노알킬(aminoalkyl) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 작용화 되고, 상기 알킬 부분은 화학식 (CH2)w를 갖고, 상기 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 상기 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있고, 상기 작용기는 에스터기(-O-C(O)-(CH2)wNH)를 통해 올리고머에 결합된다.
다른 실시태양에 있어서, 올리고머는 (CH2)w-설피드릴 (SH) 링커를 포함하는 방해된 에스터로 작용화 되고, 상기 w는 1 내지 10 범위의 정수, 바람직하게는 약 6이고, 상기 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄(straight chain) 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있고, 상기 작용기는 에스터기(-O-C(O)-(CH2)wSH)를 통해 올리고머에 결합된다.
일부 실시태양에 있어서, 설피드릴-활성화된 올리고뉴클레오티드는 폴리에틸렌글리콜 또는 펩티드(디설파이드 결합의 형성을 통해)와 같은 폴리머 부분으로 결합 된다.
상기 방해된 에스터를 포함하는 활성화된 올리고머는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 특히 PCT 출원 WO 2008/034122호 및 이의 실시예에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있고, 이는 그 전체에 있어서 본 발명에 참조로서 삽입된다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 올리고머는 미국 특허 제 4,962,029호 및 4,914,210호에 기재된 것과 같이 작용화 시약(reagent)을 이용한 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기의 올리고머로의 도입을 통해 작용화 되고, 즉, 사실상 선형 시약은 보호된 또는 비보호된 설피드릴, 아미노 또는 하이드록실기를 포함하는 반대편 말단에 친수성 스페이서(spacer)를 통해 연결된 하나의 말단에 포스포라미다이트(phosphoramidite)를 갖는다. 이러한 시약은 일차적으로 상기 올리고머의 하이드록실기와 반응한다. 일부 실시태양에 있어서, 이러한 활성화된 올리고머는 상기 올리고머의 5'-하이드록실기에 결합하는 작용화 시약을 가진다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 활성화된 올리고머는 3'-하이드록실기에 결합하는 작용화 시약을 가진다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본에 있는 하이드록실기에 결합하는 작용화 시약을 가진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 미국 특허 제 4,962,029호 및 4,914,210호에 기재된 것과 같은 하나 이상의 작용화 시약으로 작용화 되고, 이는 그 전체에 있어서 본 발명에 참조로서 삽입된다. 이러한 작용화 시약 및 이의 모노머 또는 올리고머로의 통합의 합성 방법은 미국 특허 제 4,962,029호 및 4,914,210호에 기재되어 있다.
일부 실시태양에 있어서, 고체상 결합 올리고머의 상기 5'-말단은 예를 들면, Diels-Alder Cycloaddition reaction을 통한 아미노산 또는 펩티드를 이용한 비보호된 올리고머의 결합에 의한, 디에닐포스포라미다이트(dienyl phosphoramidite) 유도체로 작용화 된다.
다양한 실시태양에 있어서, 2'-카바메이트(carbamate) 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈리미도)-디옥시리보오스{2'-(O-pentyl-N-phthalimido)-deoxyribose}당과 같은, 2'-당 변이체를 포함하는 모노머의 올리고머로의 통합은 올리고머의 당에 결합된 부분의 공유 결합을 촉진한다. 다른 실시태양에 있어서, 하나 또는 그 이상의 올리고머의 2'-부분에 아미노-포함 링커로 된 올리고머는 예를 들면, 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈리미딜아미노펜틸)-2'-디옥시아데노신-3'-N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포라미다이트{5'-dimethoxytrityl-2'-O-(e-phthalimidylaminopentyl)-2'-deoxyadenosine-3'--N,N-diisopropyl-cyanoethoxy phosphoramidite}와 같은, 시약을 사용하여 제조한다. 예를 들어, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171을 참고한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린 아미노기, 구아닌(guanine)의 엑소사이클릭 N2, 또는 시토신(cytosine)의 N4 또는 5 부분에 포함된, 뉴클레오염기에 아민(amine)-포함 작용부를 가질 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 이러한 작용화는 이미 올리고머 합성에 작용화된 상업적인 시약을 사용하여 수득할 수 있다.
일부 작용부는 상업적으로 이용가능하고, 예를 들면, 헤테로이중작용성 및 모노이중작용성 결합 부분은 Pierce Co.(Rockford, IⅡ)로부터 구입할 수 있다. 다른 상업적으로 이용가능한 결합기는 5'-아미노-개질제(modifier) C6 및 3'-아미노-개질제 시약이고, 이들은 Glen Research Corporation(Sterling, Va.)으로부터 구입할 수 있다. 5'-아미노-개질제 C6은 또한 Aminolink-2로서 ABI(Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)로부터 구입할 수 있고, 3'-아미노-개질제는 또한 Clontech Laboratories Inc.(Palo Alto, Calif.)로부터 구입할 수 있다.
조성물( Compositions )
본 발명의 올리고머는 약학적 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적절하게는, 이러한 조성물을 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함한다. WO2007/031091은 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 보조제를 제공하고, 이는 참조로서 본 발명에 삽입된다. 적절한 용량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료적 조성물과의 조합, 전구약물(pro-drug) 제형은 또한 WO2007/031091에서 제공되고, 이는 또한 참조로서 본 발명에 삽입된다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명에서 나타낸 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 최소한의 원하지 않는 독성 효과를 보이는 염을 나타낸다. 이러한 염의 비-한정적인 예로는 아연(zinc), 칼슘(calcium), 비스무트(bismuth), 바륨(barium), 마그네슘(magnesium), 알루미늄(aluminum), 구리(copper), 코발트(cobalt), 니켈(nickel), 카드뮴(cadmium), 나트륨(sodium), 칼륨(potassium), 및 이와 같은 것으로 형성된 유기 아미노산 및 염기 추가 염, 또는 아연 타닌산염 또는 이와 같은; 암모니아, /V,/V-디벤질에틸렌-디아민(/V,/V-dibenzylethylene-diamine), D-글루코사민(D-glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에티렌디아민(ethylenediamine); 또는 (a) 및 (b)의 (c) 조합으로부터 형성된 양이온으로 형성될 수 있다.
적용( Application )
본 발명의 상기 올리고머는 예를 들면, 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 사용될 수 있다.
연구에 있어서, 이러한 올리고머는 특별히 세포 및 실험 동물에서 베타-카테닌 단백질의 발현 또는 합성(전형적으로 mRNA의 분해 또는 저해에 의해 단백질 형성을 방해) 저해에 사용될 수 있고 그로 인해 치료적 중재(therapeutic intervention)를 위한 표적으로서 표적의 기능적 분석 또는 그것의 유용성의 평가를 촉진한다.
진단에 있어서 상기 올리고머는 노던 블랏팅(northern blotting), 인사이츄 하이브리다이제이션(in-situ hybridization) 또는 비슷한 방법에 의해 세포 또는 조직에서 베타-카테닌 발현을 탐지 및 정량하는데 사용될 수 있다.
치료를 위해, 질병 또는 장애를 가진 것으로 의심되는 동물 또는 인간은 본 발명에 따른 유효한 양의 올리고머와 같은, 올리고머성 화합물(또는 이의 결합체)을 처리하여 베타-카테닌의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있다. 또한 본 발명의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 상기 올리고머 또는 조성물의 투여에 의해 베타-카테닌의 발현과 관련된, 질환 또는 병을 가지거나 가지기 쉽다고 의심되는 사람을 치료하는 것과 같은, 포유류 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 화합물 또는 본 발명에서 나타낸 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 기재된 것과 같은 본 발명의 화합물 또는 결합제의 용도, 또는 본 발명에서 나타낸 장애의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제로서 사용하기 위해 본 발명에 기재된 올리고머, 조성물 또는 결합체와 관련된다. 적절하게는, 본 발명의 방법을 나타낼 경우, 본 발명의 상기 올리고머 또는 결합체의 투여는 예를 들면, 치료에 효과적인 양 또는 하나의 세포 또는 세포들에서의 베타-카테닌 발현의 저해 또는 하향-조절에 효과적인 양과 같은, 올리고머 또는 결합체의 유효한 양을 투여함으로써 수행된다.
또한 본 발명은 본 발명에서 나타낸 장애 치료 방법을 제공하고 상기 방법은 본 발명에 기재된 본 발명에 따른 화합물, 또는/및 본 발명에 따른 결합체, 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여를 포함한다.
다양한 실시태양에 있어서, 상기 올리고머, 또는 이의 결합체는, 예를 들면 표적 핵산에 수소결합을 통한 결합에 의해 인간에 있어서 원하는 치료 효과를 유도한다. 상기 올리고머, 또는 이의 결합체는 표적 mRNA에 수소결합을 통해 유전자 발현을 감소시키는 것에 의해 표적의 발현 감소(저해)를 야기한다. 본 발명에 기재된 올리고머성 화합물 및 결합체는 진단적 적용과 같이, 비-치료적 적용을 가질 수 있는 것으로 파악된다.
의학적 적응증( Medical Indications )
본 발명에 기재되 것으로서, 상기 장애는, 다양한 실시태양에 있어서, 결장암, 간세포암, 자궁내막암, 악성 흑색종, 자궁암, 췌장암, 뇌하수체암, 식도암, 폐암, 유방암, 신장암, 조혈계암, 자궁경부암, 중추신경계암, 골암, 담관암 및 부신암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암과 같은, 암과 같은, 과다증식성 장애로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 실시태양에 있어서 본 발명에 기재된 것으로서, 상기 장애는, 결장암, 간세포암, 자궁내막암, 및 악성 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 암이다.
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명에 기재된 것으로서, 상기 장애는, 간암 및 신장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암이다.
본 발명에 따른 상기 올리고머 및 다른 조성물은 베타-카테닌의 돌연변이된 이형의 과발현 또는 발현과 관련된 병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 것으로서, 질환, 장애 또는 병의 치료를 위한 약제의 준비 및 제조에 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 베타-카테닌의 비정상적인 수준 또는 베타-카테닌의 돌연변이 형태(대립형질 변이체와 같은, 본 발명에서 나타낸 질환 중 하나와 관련된 것과 같은)의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 본 발명에 기재된 화합물, 조성물, 또는 결합체의 용도에 관련된다.
본 발명의 하나의 실시태양은 하나 또는 그 이상의 LNA 유닛으로 구성되는 올리고머와 같은, 베타-카테닌을 표적으로 하는 약학적으로 유효한 양의 올리고머를 포유류에게 투여를 포함하는, 베타-카테닌의 비정상적 수준에 관련된 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 포유류에 대한 치료 방법을 나타낸다. 따라서 본 발명의 방법은 베타-카테닌의 비정상적 수준에 의해 발생하는 질환에 대한 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 양자택일적으로 말해서, 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명은 추가로 베타-카테닌의 비정상적 수준에 대한 치료 방법을 나타내고, 상기 방법은 본 발명의 올리고머, 또는 본 발명의 결합체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여를 포함한다.
본 발명에 기재된 것과 같은, 상기 질환 또는 장애는, 다양한 실시태양에 있어서 베타-카테닌 유전자에 돌연변이 또는 그것의 단백질 산물이 베타-카테닌과 관련 또는 상호작용하는 유전자와 관련될 수 있다. 따라서, 다양한 실시태양에 있어서, 상기 표적 mRNA는 베타-카테닌 서열의 돌연변이 형태이다.
본 발명의 흥미로운 하나의 실시태양은 본 발명에서 나타낸 질환, 장애 또는 병의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에서 정의된 올리고머(화합물) 또는 본 발명에서 정의된 결합체의 용도를 나타낸다.
또한 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 본 발명에서 정의된 올리고머, 조성물 또는 결합체에 관련된다.
또한, 본 발명은 본 발명에서 나타낸 것과 같은 질환 또는 병에 걸린 개체에 대한 치료 방법에 관련되고, 상기 방법은 본 발명에 기재된 것과 같이 본 발명에 따른 화합물, 및/또는 본 발명에 따른 결합체, 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여를 포함한다.
적절한 용량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형은 또한 WO2007/031091에서 제공되고 - 이는 참조로서 본 발명에 삽입된다. 또한 본 발명은 본 발명에 기재된 화합물 또는 결합체 또는 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. WO2007/031091은 적절하고 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제를 제공하고, 이것은 참조로서 본 발명에 삽입된다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 베타-카테닌의 비정상적 수준에 의해 발생하는 질환에 대한 치료 또는 예방을 위해 사용된다.
또한, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 베타-카테닌 변형 올리고머를 이러한 치료를 필요로 하는 인간에게 투여를 포함하는 질병 예방 및 치료 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 베타-카테닌 변형 올리고뉴클레오티드 화합물의 단기간의 투여의 용도를 포함한다.
양자택일적으로 말해서, 다양한 실시태양에 있어서, 본 발명은 또한 베타-카테닌의 비정상적 수준에 대한 치료 방법을 나타내고, 상기 방법은 본 발명의 올리고머, 또는 본 발명의 결합체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여 및 추가적으로 다른 약제 또는 다른 활성 성분의 투여를 포함한다. 상기 추가적인 투여는 본 발명의 화합물에 결합하고, 약학적 조성물에 존재하며, 개별적인 제형으로 투여되는 추가적인 약제 또는 추가적인 활성 성분의 투여일 수 있다.
또한 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 본 발명에서 정의된 올리고머, 조성물 또는 결합체와 관련된다.
또한 본 발명은 베타-카테닌의 비정상적 수준 또는 베타-카테닌의 돌연변이 형태의 발현(대립형질의 변이체와 같은, 본 발명에 나타낸 질환 중 하나와 관련된 것과 같은)의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에서 정의된 화합물, 조성물, 또는 결합체와 관련된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 것과 같은 질환 또는 병에 걸린 개체에 대한 치료 방법과 관련된다.
치료를 필요로 하는 환자는 질환 또는 장애에 걸리거나 걸리기 쉬운 환자이다.
다양한 실시태양에 있어서, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 현존하는 질환(예를 들면, 본 발명에서 나타낸 질환 또는 장애)의 치료, 또는 질환의 예방, 즉, 예방(prophylaxis)을 모두 나타낸다. 그러므로 본 발명에 기재된 치료는, 다양한 실시태양에 있어서, 예방(prophylactic)으로 여겨질 것이다.
본 발명에 기재된 것으로서, 질환 및 장애는, 다양한 실시태양에 있어서 베타-카테닌 유전자 또는 APC 유전자와 같은, 그것의 단밸질 산물이 베타-카테닌과 관련되거나 상호작용하는 유전자의 돌연변이와 관련될 수 있다. 그러므로, 다양한 실시태양에 있어서, 표적 mRNA는 베타-카테닌 서열의 돌연변이된 형태이고, 예를 들면 암과 관련된 SNP와 같은, 하나 또는 그 이상의 단일 점 돌연변이이다.
베타-카테닌의 비정상적 수준을 일으키는 베타-카테닌 또는 APC 유전자에 돌연변이가 있는 이러한 질환의 예는: (1) 결장암, APC 및 베타-카테닌은 모든 사례의 70% 이상에서 서로 돌연변이 된다(Powell et al., Nature, 1992; Morin et al., Science, 1997; Sparks et al., Cancer Res, 1998); (2) 간세포암, 베타-카테닌은 사례의 25% 이상에서 돌연변이 된다(de La Coste A, PNAS, 1998); (3) 자궁내막암, 베타-카테닌은 10% 이상 돌연변이 된다; 및 (4) 악성 흑색종, 베타-카테닌은 10% 이상 돌연변이 된다(Rubinfeld et al., Science, 1997).
이러한 질환의 다른 예는 난소, 췌장, 뇌하수체, 식도, 폐, 유방, 신장, 조혈계, 자궁경부, 중추신경계(CNS), 골, 담관, 및 부신의 암이다. 베타-카테닌 또는 APC 유전자의 돌연변이는 이러한 질환에 관련되는 것으로 알려져 왔다{Catalogue of Somatic Mutations in Cancer available from the Sanger Institute (United Kingdom) homepage http://www.sanger.ac.uk/}.
본 발명에 따른 암은 암의 상기 형태 중 하나로부터 선택될 수 있다.
추가 실시태양
하기 실시태양 또한 본 발명의 명세서 및 요약과 관련되고, 청구항에 기재된 실시태양을 포함하는 본 발명의 실시태양과 결합될 수 있다:
1. 서열번호: 173의 베타-카테닌 유전자 또는 이의 대립형질의 표적 서열에 결합하고 베타-카테닌의 발현을 하향-조절할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고머와 같은), 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 상응하는 10 ~ 50 뉴클레오염기의 서열을 포함.
2. 실시태양 1의 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표적 서열은 서열번호: 1 ~ 132 또는 이의 대립형질 변이체로 나타낸 베타-카테닌 유전자의 부분으로부터 선택된다.
3. 서열번호: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103, 및 118 또는 이의 대립형질 변이체로 나타낸 10 ~ 16 뉴클레오염기의 서열을 포함하는 실시태양 1 또는 실시태양 1의 상기 올리고뉴클레오티드.
4. 서열번호: 1 ~ 132로 나타낸 서열을 포함하는 실시태양 1 ~ 3 중 어느 하나에 의한 상기 올리고뉴클레오티드.
5. 서열번호: 133 ~ 172로 나타낸 상기 실시태양 중 어느 하나의 상기 올리고뉴클레오티드.
6. 상기 실시태양 중 어느 하나에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 뉴클레오염기 서열은 포스포디에스터, 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트로부터 독립적으로 선택되는 인터뉴클레오염기 결합을 포함한다.
7. 상기 실시태양 중 어느 하나의 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 뉴클레오티드의 적어도 2개는 뉴클레오티드 유사체이다.
8. 실시태양 5에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 뉴클레오염기 서열은 5' 에서 3' 방향에서 (ⅰ) 부분 A : 2 ~ 4 뉴클레오티드 유사체의 신장, 이에 뒤따르는 (ⅱ) 부분 B : 부분 A의 것과 다른 6 ~ 11 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 신장, 이에 뒤따르는 (ⅲ) 부분 C : 2 ~ 4 뉴클레오티드 유사체의 신장, 및 선택적으로 뒤따르는 (ⅳ) 부분 D : 하나 또는 2개의 뉴클레오티드.
9. 실시태양 8에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 부분 A는 2개의 뉴클레오티드 유사체 유닛 및/또는 하나의 뉴클레오티드 유사체 유닛과 부분 B의 하나의 뉴클레오염기 유닛 사이의 적어도 하나의 포스포디에스터 결합을 포함한다.
10. 실시태양 8 또는 실시태양 9에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 부분 C는 2개의 뉴클레오티드 유사체 유닛 및/또는 하나의 뉴클레오티드 유사체 유닛과 부분 B의 하나의 뉴클레오염기 유닛 사이의 적어도 하나의 포스포디에스터 결합을 포함한다.
11. 실시태양 1 내지 6 중 어느 하나에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 모든 인터뉴클레오염기 결합은 포스포로티오에이트이다.
12. 실시태양 7 내지 11 중 어느 하나에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체 유닛은 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA), 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA), 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA), 잠금핵산(locked nucleic acid, LNA), 아라비노 핵산(arabino nucleic acid, ANA), 2'-플루오로-ANA(2'-fluoro-ANA), HNA, INA 및 2'-MOE로부터 독립적으로 선택된다.
13. 실시태양 12에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-MOE-RNA, 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA), 및 LNA로부터 독립적으로 선택된다.
14. 실시태양 13에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체의 적어도 하나는 잠금핵산(LNA)이다.
15. 실시태양 14에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA이다.
16. 실시태양 12 내지 15 중 어느 하나에 의한 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, LNA는 베타-D-옥시-LNA(beta-D-oxy-LNA), 알파-L-옥시-LNA(alpha-L-oxy-LNA), 베타-D-아미노-LNA(beta-D-amino-LNA) 및 베타-D-티오-LNA(beta-D-thio-LNA)로부터 선택된다.
17. 상기 실시태양 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체.
18. 실시태양 17에 의한 결합체에 있어서, 상기 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분은 콜레스테롤과 같은 스테롤기를 구성 또는 포함한다.
19. 상기 실시태양 1 내지 16 중 어느 하나에 의한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물 또는 실시태양 17 또는 실시태양 18에 의한 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제.
20. 약제로서 사용을 위한 실시태양 1 내지 18 중 어느 하나에 의한 올리고뉴클레오티드 또는 결합체.
21. 베타-카테닌의 비정상적 수준 또는 질환 또는 병의 치료용 약제의 제조를 위한 베타-카테닌의 하향-조절을 나타내기 위한 실시태양 1 내지 18 중 어느 하나에 의한 올리고뉴클레오티드 또는 결합체의 용도.
22. 실시태앙 21에 의한 상기 용도에 있어서, 상기 질환 또는 병은 암이다.
23. 암에 걸린 개체에 대한 치료 방법, 실시태양 1 내지 19 중 어느 하나에 의한 약학적 조성물, 올리고뉴클레오티드 또는 결합체를 그것을 필요로 하는 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 방법.
24. 실시태양 21 ~ 23 중 어느 하나의 상기 용도 또는 방법에 있어서, 상기 암은 결장암, 간세포암, 자궁내막암, 악성 흑색종, 난소암, 췌장암, 뇌하수체암, 식도암, 폐암, 유방암, 신장암, 조혈계암, 자궁경부암, 중추신경계암, 골암, 담관암 및 부신암으로부터 선택된다.
25. 상기 베타-카테닌 내의 표적 서열에 있어서, 상기 표적 서열에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 베타-카테닌의 발현을 하향-조절할 수 있다.
26. 상기 실시태양 25의 표적 서열에 있어서, 상기 표적 서열은 서열번호 1 ~ 132 또는 이의 대립형질 변이체에 상보적인 상기 베타-카테닌의 부분으로부터 선택된다.
27. 세포와 실시태양 1 ~ 16 중 어느 하나에 의한 올리고뉴클레오티드와 세포의 접촉을 포함하는, 상기 베타-카테닌의 발현의 하향-조절 방법.
도 1: 서열번호 : 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 및 118의 올리고뉴클레오티드 서열에 상응하는 베타-카테닌 표적 서열, 각각을, 굵은 글씨 및 밑줄로 나타내고, 베타-카테닌 전사체(Genbank Accession number NM_001904 - 서열번호: 173)에서 그들의 위치를 나타낸다.
도 2: 베타-카테닌 발현을 SW480 세포에 형질전환한 뒤 24시간 후에 GAPDH에 대하여 표준화하였다.
도 3: 1 및 5 nM 농도의 올리고뉴클레오티드로 형질전환한 SW480 세포에서의 베타-카테닌 단백질의 조성을 웨스턴 블랏(Western blot)을 통하여 특정하였다. 튜뷸린(tubulin) 염색을 로딩(loading) 대조군으로서 사용하였고 서열번호: 194를 스크램블드(scrambled) 대조군 올리고뉴클레오티드로서 사용하였다.
도 4: 25 nM 농도의 올리고뉴클레오티드로 형질전환한 HCT116 세포에서 MTS 분석을 통하여 세포 증식을 측정하였고, 형질전환 후 시점마다 OD490으로서 측정하였다. 모의(mock) 형질전환한 세포 및 서열번호: 194(스크램블드 대조군)로 형질전환한 세포를 대조군으로서 사용하였다.
도 5: 3 × 25 ㎎/㎏의 올리고뉴클레오티드를 정맥내 주사한 후 생쥐 간에서의 식염수 처리한 대조군에 대해 상대적인 베타-카테닌 mRNA 발현을 QPCR을 통하여 측정하였다. 베타-카테닌 발현은 GAPDH에 대해 표준화하였고, 결과는 식염수 처리한 대조군에 대해 상대적으로 나타냈다.
실시예 1: 모노머 합성
상기 LNA 모노머의 구조 재료(building block) 및 유도체는 하기 발표된 방법 및 이에 언급된 참조에 따라 제조되었고 - WO07/031081 및 이에 언급된 참조를 참고한다.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드는 WO07/031081에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 표 1은 안티센스 올리고뉴클레오티드 부분 및 본 발명의 실시예를 나타낸다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드의 고안
본 발명에 따른, 일련의 올리고뉴클레오티드는 본 발명에서 서열번호: 173으로 나타낸, 발표된 서열 GenBank accession number NM_001904를 사용한 인간 베타-카테닌의 다른 표적 부분으로 고안되었다.
표 2는 본 발명의 올리고머 고안을 나타낸다. 표 3은 고안될 수 있는 본 발명의 올리고머의 24머 서열 부분을 나타내고 - 굵은 글씨는 표 1에 나타낸 것과 같은 16머 서열 부분을 나타낸다.
표 3 - 베타- 카테닌 24머 서열
16머 서열번호 쇼트머( Shortmer ) 서열번호 화합물번호 24머 서열번호 24-머 서열번호
서열번호 : 1 2 ~ 15 133 ~ 153 ttta gaaagctgatggacca taac 174
서열번호 : 16 134 ~ 154 cctc cagacttaaagatggc cagt 175
서열번호 : 17 135 ~ 155 aaca cagaatccactggtga acca 176
서열번호 : 18 19 ~ 32 136 ~ 156 aaac gcactgccattttagc tcct 177
서열번호 : 33 137 ~ 157 tgtc gtaatagccaagaatt taac 178
서열번호 : 34 35 ~ 48 138 ~ 158 cagc actctgcttgtggtcc acag 179
서열번호 : 49 139 ~ 159 catt ccaccagcttctacaa tagc 180
서열번호 : 50 140 ~ 160 ctga gagtccaaagacagtt ctga 181
서열번호 : 51 141 ~ 161 tacc acccacttggcagacc atca 182
서열번호 : 52 142 ~ 162 agct gcacaaacaatggaat ggta 183
서열번호 : 53 143 ~ 163 ccct gcagctactctttgga tgtt 184
서열번호 : 54 144 ~ 164 gtgg ctccctcagcttcaat agct 185
서열번호 : 55 145 ~ 165 atca gcagtctcattccaag ccat 186
서열번호 : 56 146 ~ 166 gcca tatccaccagagtgaa aaga 187
서열번호 : 57 147 ~ 167 agcc catccatgaggtcctg ggca 188
서열번호 : 58 59 ~ 72 148 ~ 168 aatt ccatcttgtgatccat tctt 189
서열번호 : 73 74 ~ 87 149 ~ 169 ttca aagcaagcaaagtcag tacc 190
서열번호 : 88 89 ~ 102 150 ~ 170 atta gaaattgctgtagcag tatt 191
서열번호 : 103 104 ~ 117 151 ~ 171 atta gtgttctacaccatta ctca 192
서열번호 : 118 119 ~ 132 152 ~ 172 caaa aacatgaaatagatcc acct 193
실시예 4: 시험관 내( in vitro ) 모델: 세포 배양
표적 핵산 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 상기 표적 핵산이 적절한 수준으로 존재한다면 임의의 다양한 세포 형태에서 시험할 수 있다. 표적은 내생적으로 또는 상기 핵산을 암호화하는 핵산의 일시적 또는 안정적인 형질전환에 의해 발현될 수 있다. 표적 핵산의 발현 수준은 일반적으로 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 실시간 PCR(Real-Time PCR), 리보뉴클레아제 보호(Ribonuclease pretection) 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 하기 세포 형태는 실례의 목적을 위해 제공되나, 상기 표적이 선택된 세포 형태에서 발현된다면, 다른 세포 형태도 일반적으로 사용될 수 있다.
세포는 하기와 같은 적절한 배지에서 배양하였고 37℃에서 95 ~ 98% 습도 및 5% CO2 하에서 유지하였다. 세포는 1주일에 2 ~ 3회 계대배양하였다.
SW480: 인간 결장암 세포주 SW480을 L-15 배지(Leibovitz) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + Glutamax Ⅰ + 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep)에서 배양하였다.
HCT116: 인간 결장암 세포주 HCT116을 McCoy's 5a modified medium(Sigma) + 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) + Glutamax Ⅰ + 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep)에서 배양하였다.
실시예 5: 시험관 내( in vitro ) 모델: 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 처리
상기 세포에 형질전환 운반체로서 양이온성 리포솜 제형 LipofectAMINE 2000(Gibco)을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 처리하였다. 세포는 6-웰 세포 배양 플레이트(NUNC)에 분주하여 75 ~ 90% 밀도가 되었을 때 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 최종 농도 1 nM 내지 25 nM 범위로 사용하였다. 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 제형은 혈청이 없는 OptiMEM(Gibco) 및 10 ㎍/㎖의 최종 지질 농도의 LipofectAMINE 2000을 사용하여 제조사가 지시한 방법에 따라 실시하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양하였고 올리고뉴클레오티드 함유 배양 배지를 제거하여 처리를 중지시켰다. 세포를 세척하여 혈청 함유 배지를 첨가하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후, 세포는 RNA 분석을 위해 수득하기 전에 20시간 동안 회복시켜다.
실시예 6: 시험관 내( in vitro ) 모델: RNA 및 cDNA 합성의 추출
세포주로부터 RNA를 분리하기 위해, 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 RNeasy mini kit(Qiagen cat. no. 74104)를 사용하였다.
첫 번째 가닥 합성은 Ambion으로부터 입수한 역전사효소(Reverse Transcriptase) 시약을 사용하여 실시하였다.
0.5 ㎍의 총 RNA의 각 시료는 RNase가 없는 H2O로 조절하였고(10.8 ㎕) 2 ㎕의 랜덤 데카머(random decamers)(50 μM) 및 4 ㎕의 dNTP mix(각 dNTP는 2.5 mM)를 혼합하여 70℃에서 3분간 가열한 후 시료를 즉시 얼음에서 냉각하였다. 시료를 얼음에서 냉각한 후, 2 ㎕ 10×완충용액 RT, 1 ㎕ MMLV 역전사효소(100 U/㎕) 및 0.25 ㎕ RNase 저해제(inhibitor)(10 U/㎕)를 각 시료에 첨가하여 42℃에서 60분 동안 배양하였고, 95℃에서 10분 동안 효소를 열 비활성화하였고, 그런 다음 시료를 4℃에서 냉각하였다.
실시예 7: 시험관 내( in vitro ): 실시간 PCR ( Real - time PCR )에 의한 베타- 카테닌 발현에 대한 올리고뉴클레오티드 저해의 분석
베타-카테닌 발현의 안티센스 조절은 당업계에 공지된 여러 가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 베타-카테닌 mRNA 수준은 예를 들면, 노던 블랏(Northern blot) 분석, 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive polymerase chain reactin, PCR), 또는 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 정량할 수 있다. 실시간 정량적 PCR이 바람직하다. RNA 분석은 총 세포의 RNA 또는 mRNA에서 실시될 수 있다. RNA 분리 및 노던 블랏 분석과 같은 RNA 분석 방법은 당업계에서 일반적이고 예를 들면, Molecular biology, John Wiley 및 Sons에 현행하는 프로토콜에서 알 수 있다.
실시간 정량적 PCR은 상업적으로 이용가능한 Applied Biosystem으로부터 구입가능한 Multi-Color Real time PCR Detection System을 사용하여 편리하게 실시할 수 있다.
베타- 카테닌 mRNA 수준의 실시간 정량적 PCR 분석
인간 베타-카테닌 mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 베타-카테닌 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. Hs00170025_m1)를 사용하여 정량하였다.
글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA 정량은 시료 제조에서 어떠한 편차를 표준화하기 위한 내생적 대조군으로서 사용하였다.
인간 GAPDH mRNA의 시료 조성은 제조사의 지시에 따라 인간 GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent(Applied Biosystems cat no. 4310884E)를 사용하여 정량하였다.
실시간 정량적 PCR은 당업계에 공지된 기술이고 예를 들면 Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6:986-994에서 알 수 있다.
실시간 PCR
실시예 8에 기재된 것에 의해 실시한 첫 번째 가닥 합성으로부터의 cDNA를 2 ~ 20배 희석하였고, Applied Biosystems의 Taqman 7500 FAST를 사용하여 실시간 정량적 PCR을 통해 분석하였다. 프라이머 및 탐침은 2×Taqman Fast Universal PCR master mix(2×)(Applied Biosystems Cat.# 4364103)로 혼합하였고 최종 부피 10 ㎕에 4 ㎕의 cDNA를 첨가하였다. 각 시료는 3회 분석하였다. cDNA의 2배 희석의 분석은 분석을 위해 제작된 표준곡선(standard curve)의 RNA를 발현하는 세포주로부터 정제된 물질로 제조되었다. 멸균 H20는 주형(template)이 없는 대조군을 위해 cDNA 대신에 사용하였다. PCR 프로그램은: 30초 동안 95℃, 그런 다음 95℃에서 3초, 60℃에서 30초가 40 사이클이었다. 표적 mRNA 서열의 상대적인 정량은 Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21.을 사용하여 산출된 임계 사이클(Thresold cycle)로부터 측정하였다.
실시예 8: 시험관 내( in vitro ): 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 베타- 카테닌 발현의 안티센스 저해
표 2의 올리고뉴클레오티드는 SW480 세포에서 1, 5 및 25 nM의 농도에서 베타-카테닌 mRNA 녹다운(knock down)에 대한 가능성을 위해 측정되었다. 결과는 5 nM에서 모의(mock) 형질전환된 세포와 관련된 베타-카테닌 mRNA의 하향-조절 퍼센트로서 표 4에 나타냈다. 소문자는 DNA 유닛을 나타내고, 굵은 대문자는 β-D-옥시-LNA(β-D-oxy-LNA) 유닛을 나타낸다. 모든 LNA C는 5'메틸 C이다. 아래에 기입한 "s"는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.
시험물질 서열 (5'-3') 베타- 카테닌 (% 저해)
서열번호 : 153 G s A s A s asgscstsgsastsgsgsas C s C s A 88.11%
서열번호 : 154 C s A s G s ascststsasasasgsasts G s G s C 86.4%
서열번호 : 155 C s A s G s asastscscsascstsgsgs T s G s A 76.6%
서열번호 : 156 G s C s A s cstsgscscsaststststs A s G s C 89.2%
서열번호 : 157 G s T s A s astsasgscscsasasgsas A s T s T 56.4%
서열번호 : 158 A s C s T s cstsgscststsgstsgsgs T s C s C 77.6%
서열번호 : 159 C s C s A s cscsasgscststscstsas C s A s A 49.7%
서열번호 : 160 G s A s G s tscscsasasasgsascsas G s T s T 60.1%
서열번호 : 161 A s C s C s csascststsgsgscsasgs A s C s C 75.6%
서열번호 : 162 G s C s A s csasasascsasastsgsgs A s A s T 10.8%
서열번호 : 163 G s C s A s gscstsascstscstststs G s G s A 48.3%
서열번호 : 164 C s T s C s cscstscsasgscststscs A s A s T 35.5%
서열번호 : 165 G s C s A s gstscstscsaststscscs A s A s G 25.5%
서열번호 : 166 T s A s T s cscsascscsasgsasgsts G s A s A 27.3%
서열번호 : 167 C s A s T s cscsastsgsasgsgstscs C s T s G 24.5%
서열번호 : 168 C s C s A s tscststsgstsgsastscs C s A s T 74.4%
서열번호 : 169 A s A s G s csasasgscsasasasgsts C s A s G 87.5%
서열번호 : 170 G s A s A s aststsgscstsgstsasgs C s A s G 91.5%
서열번호 : 171 G s T s G s tstscstsascsascscsas T s T s A 94.9%
서열번호 : 172 A s A s C s astsgsasasastsasgsas T s C s C 93.6%
서열번호 : 194 C s G s T s csasgstsastsgscsgs A s A s T s c
표 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호: 153, 154, 155, 156, 158, 161, 168, 169, 170, 171 및 172의 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 있어서 5 nM에서 베타-카테닌 발현의 74% 또는 더 높은 저해를 나타내므로 바람직하다.
또한 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 기초한 올리고뉴클레오티드이고, 예를 들면 길이(더 짧거나 더 긴) 및/또는 뉴클레오염기 조성(예를 들면, 유사체 유닛의 형태 및/또는 비율)의 변화이고, 이는 또한 베타-카테닌 발현의 효과적인 저해를 제공한다.
실시예 9: 시험관 내( in vitro ): 베타- 카테닌 단백질 수준의 웨스턴 블랏( Western blot ) 분석
형질전환된 세포에서 베타-카테닌 단백질 수준에 대한 올리고머성 화합물의 시험관 내(in vitro) 효과를 웨스턴 블랏팅(Western bltting)을 통해 측정하였다. 실시예 5에 기재된 것에 따라 올리고뉴클레오티드를 형질전환한 200.000 SW480 세포를 수득하여 프로테아제 저해 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche)이 첨가된 RIPA 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% Sodium Deoxycholate)에서 용해하였다. 총 단백질 농도는 BCA protein assay kit(Pierce)를 사용하여 측정하였다. 50 ㎍의 총 단백질을 3 ~ 8% 트리스아세테이트(Tris Acetate) 겔에서 분리하여 제조사의 지시에 따라 PVDF 막 위에 붙였다. 블로킹 완충용액(5% 저지방 분유가 첨가된 PBS-T)에서 하룻밤 동안 배양한 후, 상기 막을 항-베타-카테닌 항체(BD Transduction laboratories)로 하룻밤 동안 배양하였다. 로딩(loading) 튜뷸린(tubulin)의 대조군으로서 Neomarker의 단일클론 항체를 사용하여 확인하였다. 그런 다음, 막을 이차 항체를 사용하여 배양하였고 베타-카테닌 또는 튜뷸린 단백질은 chemiluminescens ECL+ detection kit(Amersham)를 사용하여 가시화하였다. 도 3에 나타내었다.
실시예 10: 증식하는 생존가능한 세포의 측정( MTS 분석)
HCT116 결장암 세포를 6 웰 플레이트의 웰 당 200,000 세포수의 밀도로 McCoy's 5a modified medium(Sigma M8403) + 2 mM Glutamax I(Gibco 35050-038) + 10% FBS(Brochrom #193575010) + 25 ㎍/㎖ Gentamicin(Sigma G1397 50 ㎎/㎖)에서 형질전환하기 하루 전까지 배양하였다. 다음날에 배지를 제거하였고 7.5 ㎍/㎖의 Lipofectamine2000(Invitrogen)이 함유된 1.2 ㎖ OptiMEM을 첨가하였다. 세포를 OptiMEM에 희석한 0.3 ㎖의 올리고뉴클레오티드를 첨가하기 전에 7분 동안 배양하였다. 최종 올리고뉴클레오티드의 농도는 25 nM이었다. 처리한 뒤 4시간 후, 배지를 제거하였고 세포를 트립신 처리하여 새 96 웰 플레이트(Scientific Orange no. 1472030100)의 웰 당 5000 세포의 밀도로 100 ㎕ McCoy's 5a modified medium(Sigma M8403) + 2 mM Glutamax I(Gibco 35050-038) + 10% FBS(Brochrom #193575010) + 25 ㎍/㎖ Gentamicin(Sigma G1397 50 ㎎/㎖)에서 배양하였다.
생존가능한 세포를 테트라졸리움 화합물[3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS] 및 전자 커플링 시약(electron coupling reagent)(phenazine ethosulfate; PES) (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)을 첨가하여 지시한 시간에 측정하였다. 생존가능한 세포는 490 ㎚에서 Powerwave(Biotek Instruments)로 측정하였다. OD490 ㎚는 시간/h에 대하여 작성하였다(도 4 참고).
실시예 11: 생쥐 간에서 베타- 카테닌 mRNA 의 저해
NMRI 생쥐를 25 ㎎/㎏ 올리고뉴클레오티드(서열번호: 156, 158, 168, 169, 171)로 3일 동안 연속하여 정맥내 주사하였다(5마리 생쥐의 그룹 크기). 안티센스 올리고뉴클레오티드를 0.9% 식염수(NaCl)에 용해하였다. 마지막 투여한 후 23시간 뒤 동물을 희생시키고 간 조직을 분리하여 RNA 정체 및 qPCR 분석을 할 때까지 RNA later에 보관하였다. 총 RNA를 추출하여 간 시료에서의 베타-카테닌 mRNA 발현을 mouse beta-catenin qPCR assay(cat. Mm00483033_m1, Applied Biosystems)를 사용하여 실시예 7에 기재된 qPCR을 통해 측정하였다. 결과는 도 5를 참고로, 생쥐 GAPDH(cat. no. 4352339E, Applied Biosystems)로 표준화하였고 식염수 처리된 대조군에 관련하여 작성하였다.
실시예 12: 서열번호: 161 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)의 결합체의 제조
서열번호: 161을 가지는 올리고머는 5' 말단에 일반적인 포스포라미다이트 케미스트리(phosphoramidite chemistry)를 사용한 올리고머의 5' 인산기에 대한 Fmoc와 같은 보호기로 보호된 헥산-1(hexan-1) 아민 아미노알킬기의 결합에 의해 작용화 되고, 화학식 1을 가지는 작용화된 올리고머를 수득하기 위해 결과적인 화합물 산화, 그것을 탈보호 및 정제한다:
Figure 112009073912409-PCT00005
상기 서열번호: 161에서 굵은 대문자 및 아래에 기재된 "S"는 상기 기재된 바와 같이 동일한 의미를 가진다.
화학식 2에 나타낸 것과 같은, 활성화된 PEG 용액:
Figure 112009073912409-PCT00006
상기 PEG 부분은 12,000의 평균 분자량을 가지고, PBS 완충용액에 있는 화학식 1의 화합물은 12시간 동안 실온에서 혼합하였다. 반응 용액을 메틸렌클로라이드(methylene chloride)로 3회 추출하였고 결합된 유기물층을 마그네슘설페이트(magnesium sulphate)로 건조시켜 여과하였고 감압하에서 용매를 증발시켰다. 잔류물을 이차 증류수에 녹여 음이온 교환 컬럼에 통과시켰다. 반응하지 않은 PEG 링커(linker)를 물로 녹여 분리하였고 산물은 NH4HCO3 용액으로 녹여 분리하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획을 모아 화학식 3의 결합체 생산에 대해 친지질화 하였다:
Figure 112009073912409-PCT00007
상기 서열번호: 161의 올리고머는 방출가능한 링커를 통해 12,000의 평균 분자량을 가지는 PEG 폴리머에 결합된다. 하기는 서열번호 168 및 171의 결합체의 예이다:
Figure 112009073912409-PCT00008
<110> Santaris A/S Enzon Pharmaceuticals, Inc. <120> RNA ANTAGONIST COMPOUNDS FOR THE MODULATION OF BETA-CATENIN <130> 9fpi-10-09 <150> PCT/EP2008/055365 <151> 2008-04-30 <150> US 61/023,244 <151> 2008-01-24 <150> US 60/915,371 <151> 2007-05-01 <160> 194 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 1 gaaagctgat ggacca 16 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 2 gaaagctgat ggacc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 3 aaagctgatg gacca 15 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 4 gaaagctgat ggac 14 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 5 aaagctgatg gacc 14 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 6 aagctgatgg acca 14 <210> 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<223> Artificial Sequence motif <400> 15 gctgatggac ca 12 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 16 cagacttaaa gatggc 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 17 cagaatccac tggtga 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 18 gcactgccat tttagc 16 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 19 gcactgccat tttag 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 20 cactgccatt ttagc 15 <210> 21 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 21 gcactgccat ttta 14 <210> 22 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 22 cactgccatt ttag 14 <210> 23 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 23 actgccattt tagc 14 <210> 24 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 24 gcactgccat ttt 13 <210> 25 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 25 cactgccatt tta 13 <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 26 actgccattt tag 13 <210> 27 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 27 ctgccatttt agc 13 <210> 28 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 28 gcactgccat tt 12 <210> 29 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 29 cactgccatt tt 12 <210> 30 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 30 actgccattt ta 12 <210> 31 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence motif <400> 31 ctgccatttt ag 12 <210> 32 <211> 12 <212> 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agccggctat tgtagaagct ggtggaatgc aagctttagg acttcacctg 1320 acagatccaa gtcaacgtct tgttcagaac tgtctttgga ctctcaggaa tctttcagat 1380 gctgcaacta aacaggaagg gatggaaggt ctccttggga ctcttgttca gcttctgggt 1440 tcagatgata taaatgtggt cacctgtgca gctggaattc tttctaacct cacttgcaat 1500 aattataaga acaagatgat ggtctgccaa gtgggtggta tagaggctct tgtgcgtact 1560 gtccttcggg ctggtgacag ggaagacatc actgagcctg ccatctgtgc tcttcgtcat 1620 ctgaccagcc gacaccaaga agcagagatg gcccagaatg cagttcgcct tcactatgga 1680 ctaccagttg tggttaagct cttacaccca ccatcccact ggcctctgat aaaggctact 1740 gttggattga ttcgaaatct tgccctttgt cccgcaaatc atgcaccttt gcgtgagcag 1800 ggtgccattc cacgactagt tcagttgctt gttcgtgcac atcaggatac ccagcgccgt 1860 acgtccatgg gtgggacaca gcagcaattt gtggaggggg tccgcatgga agaaatagtt 1920 gaaggttgta ccggagccct tcacatccta gctcgggatg ttcacaaccg aattgttatc 1980 agaggactaa ataccattcc attgtttgtg cagctgcttt attctcccat tgaaaacatc 2040 caaagagtag ctgcaggggt cctctgtgaa cttgctcagg acaaggaagc tgcagaagct 2100 attgaagctg agggagccac agctcctctg acagagttac ttcactctag gaatgaaggt 2160 gtggcgacat atgcagctgc tgttttgttc cgaatgtctg aggacaagcc acaagattac 2220 aagaaacggc tttcagttga gctgaccagc tctctcttca gaacagagcc aatggcttgg 2280 aatgagactg ctgatcttgg acttgatatt ggtgcccagg gagaacccct tggatatcgc 2340 caggatgatc ctagctatcg ttcttttcac tctggtggat atggccagga tgccttgggt 2400 atggacccca tgatggaaca tgagatgggt ggccaccacc ctggtgctga ctatccagtt 2460 gatgggctgc cagatctggg gcatgcccag gacctcatgg atgggctgcc tccaggtgac 2520 agcaatcagc tggcctggtt tgatactgac ctgtaaatca tcctttaggt aagaagtttt 2580 aaaaagccag tttgggtaaa atacttttac tctgcctaca gaacttcaga aagacttggt 2640 tggtagggtg ggagtggttt aggctatttg taaatctgcc acaaaaacag gtatatactt 2700 tgaaaggaga tgtcttggaa cattggaatg ttctcagatt tctggttgtt atgtgatcat 2760 gtgtggaagt tattaacttt aatgtttttt gccacagctt ttgcaactta atactcaaat 2820 gagtaacatt tgctgtttta aacattaata gcagcctttc tctctttata cagctgtatt 2880 gtctgaactt gcattgtgat tggcctgtag agttgctgag agggctcgag gggtgggctg 2940 gtatctcaga aagtgcctga cacactaacc aagctgagtt tcctatggga acaattgaag 3000 taaacttttt gttctggtcc tttttggtcg aggagtaaca atacaaatgg attttgggag 3060 tgactcaaga agtgaagaat gcacaagaat ggatcacaag atggaattta gcaaacccta 3120 gccttgcttg ttaaaatttt tttttttttt ttttaagaat atctgtaatg gtactgactt 3180 tgcttgcttt gaagtagctc tttttttttt tttttttttt ttttttttgc agtaactgtt 3240 ttttaagtct ctcgtagtgt taagttatag tgaatactgc tacagcaatt tctaattttt 3300 aagaattgag taatggtgta gaacactaat taattcataa tcactctaat taattgtaat 3360 ctgaataaag tgtaacaatt gtgtagcctt tttgtataaa atagacaaat agaaaatggt 3420 ccaattagtt tcctttttaa tatgcttaaa ataagcaggt ggatctattt catgtttttg 3480 atcaaaaact atttgggata tgtatgggta gggtaaatca gtaagaggtg ttatttggaa 3540 ccttgttttg gacagtttac cagttgcctt ttatcccaaa gttgttgtaa cctgctgtga 3600 tacgatgctt caagagaaaa tgcggttata aaaaatggtt cagaattaaa cttttaattc 3660 attcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3697 <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 174 tttagaaagc tgatggacca taac 24 <210> 175 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 175 cctccagact taaagatggc cagt 24 <210> 176 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 176 aacacagaat ccactggtga acca 24 <210> 177 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 177 aaacgcactg ccattttagc tcct 24 <210> 178 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 178 tgtcgtaata gccaagaatt taac 24 <210> 179 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 179 cagcactctg cttgtggtcc acag 24 <210> 180 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 180 cattccacca gcttctacaa tagc 24 <210> 181 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 181 ctgagagtcc aaagacagtt ctga 24 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 182 taccacccac ttggcagacc atca 24 <210> 183 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 183 agctgcacaa acaatggaat ggta 24 <210> 184 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 184 ccctgcagct actctttgga tgtt 24 <210> 185 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 185 gtggctccct cagcttcaat agct 24 <210> 186 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 186 atcagcagtc tcattccaag ccat 24 <210> 187 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 187 gccatatcca ccagagtgaa aaga 24 <210> 188 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 188 agcccatcca tgaggtcctg ggca 24 <210> 189 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 189 aattccatct tgtgatccat tctt 24 <210> 190 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 190 ttcaaagcaa gcaaagtcag tacc 24 <210> 191 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 191 attagaaatt gctgtagcag tatt 24 <210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 192 attagtgttc tacaccatta ctca 24 <210> 193 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer sequence motifs <400> 193 caaaaacatg aaatagatcc acct 24 <210> 194 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test substance <220> <221> variation <222> (1)..(15) <223> phosphorothiate linkage <220> <221> variation <222> (1)..(3) <223> LNA nucleobases <220> <221> variation <222> (13)..(15) <223> LNA nucleobases <400> 194 cgtcagtatg cgaatc 16

Claims (18)

  1. 총 10 ~ 24 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 25 뉴클레오염기 사이의 길이를 갖고;
    ⅰ) 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 192, 및 서열번호 89로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 부분과 100% 상동적; 이거나 또는
    ⅱ) 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 192, 및 서열번호 189로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 부분과 하나 이하의 미스매치(mismatch)를 포함하는 것 중 어느 하나인 올리고머.
  2. 총 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 연속된 뉴클레오염기 서열을 포함하는 10 ~ 50 뉴클레오염기 사이의 길이이고; 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 173 또는 이의 자연적으로 발생하는 변이체와 같은, 포유류 베타-카테닌 유전자 또는 mRNA에 상응하는 부분과 적어도 80% 상동적인 올리고머.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 189, 192, 58 및 103으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 같은, 서열번호 1 ~ 132 및 서열번호 174 ~ 193으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 부분 과 적어도 80% 상동적인 올리고머.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 서열번호 173에 상응하는 부분과 미스매치가 없거나 오직 1개 또는 2개의 미스매치를 포함하는 올리고머.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 서열은 상기 연속된 뉴클레오염기 서열로 구성되는 올리고머.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 10 ~ 18 뉴클레오티드 사이의 길이인 올리고머.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오염기 서열은 뉴클레오티드 유사체(analogues)를 포함하는 올리고머.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 잠금핵산(Locked Nucleic Acid, LNA) 유닛; 2'-O-알킬-RNA(2'-O-alkyl-RNA) 유닛, 2'-MOE-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA(2'-amino-DNA) 유닛, 및 2'-플루오로-DNA(2'-fluoro-DNA) 유닛으로 구성된 군으로부터 선택되는 당 변형된 뉴클레오티드와 같은, 당 변형된 뉴클레오티드인 올리고머.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 LNA인 올리고머.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 갭머(gapmer)인 올리고머.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-카테닌 유전자 또는 mRNA를 발현하는 세포에서 베타-카테닌 유전자 또는 mRNA의 발현을 저해하는 올리고머.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 168 및 서열번호 171과 같은, 서열번호 133 ~ 174로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고머.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 상기 올리고머, 및 상기 올리고머에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 결합체.
  14. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 상기 올리고머, 또는 제 13항의 결합체, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 암과 같은, 과증식성 질환의 치료용과 같은, 약제로서 사용을 위한 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 13항의 결합체.
  16. 암과 같은, 과증식성 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 올리고머 또는 제 13항에서 정의된 결합체의 용도.
  17. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 13항의 결합체, 또는 제 14항의 약학적 조성물을 암과 같은, 과증식성 질환에 걸리거나, 또는 걸리기 쉬운 환자에게 투여를 포함하는 암과 같은, 과증식성 질환의 치료 방법.
  18. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 올리고머, 또는 제 13항의 결합체를 베타-카테닌을 발현하는 세포에서 베타-카테닌을 저해하기 위하여 상기 세포로의 투여를 포함하는 베타-카테닌을 발현하는 세포에서 베타-카테닌의 저해 방법.
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