TW200848077A - Compounds for the modulation of beta-cantenin expression - Google Patents
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Description
200848077 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於寡聚化合物(寡聚物),其靶向細胞中之β_ 連接蛋白mRNA,使得β_連接蛋白之表現降低。β_連接蛋 白表現之降低對於眾多醫學病症(諸如過度增生性疾病, 包括癌症)有益。本發明提供包含寡聚物之治療組合物及 使用該等寡聚物來調節卜連接蛋白表現之方法包括治療 方法。 h 本申請案主張2007年5月i曰申請之美國臨時申請案第 6〇/9丨5,371號及2008年i月24日申請之美國臨時申請案第 6!/〇23,244號之35 U.S.c. § 119⑷之權利,該等文獻之揭 示内容係以引用的方式全部併入本文中。 【先前技術】 β_連接蛋白(亦稱作鈣黏附蛋白相關蛋白)為胞内蛋白之 連接蛋白家族之成員及由Wnt蛋白引發之信號轉導路徑之 關鍵參與者,若干發育過程之介體。p_連接蛋白在生長因 子刺激後經歷磷酸化作用,使得細胞黏附降低。 已展不β_連接蛋白在癌症發展中之作用係由Apc(結腸腺 瘤息肉病)基因之表現產物調節。ApC腫瘤抑制蛋白與卜連 接蛋白結合,而展示連接蛋白與Tcf及Lef轉錄因子相互 作用。Morin 等人(Morin等人,Science,1997,275,1787_ 1790)報導APC蛋白下調在結腸癌中由卜連接蛋白及Tcf_4 介導之轉錄活化。其結果指示β_連接蛋白之調節對Apc之 腫瘤抑制作用為關鍵的且此調節可由Apc或卜連接蛋白之 131124.doc 200848077 突變而被阻遏。
Morin等人展示影響磷酸化位點之β_連接蛋白之突變使 得細胞對β·連接蛋白之APC介導之下調不敏感且此破壞機 制對結腸直腸腫瘤形成為關鍵的(Morin等人,Science 1997, 275, 1787-1790)。 右干研究報導各種癌細胞株中β_連接蛋白突變之偵測且 異常而之β-連接蛋白量已見於黑素瘤細胞株中。
Bennett等人之美國專利第6,〇66,5〇〇號描述調節卜連接蛋 白表現之反義化合物、組合物及方法。 因此仍需要能夠有 考慮到癌症發展中涉及β_連接蛋白, 效抑制β-連接蛋白功能之藥劑。 【發明内容】 本發明提供一種1〇_5〇個連續單體之寡聚物,其中該寡 聚物之序列與編碼哺乳動物β_連接蛋白之核酸之目標區域 的反向互補之序列有至少8〇%一致。
固醇基團(諸如膽固醇)或促進進 ’该結合部分係由固醇基 >中之其他部分組成或包含 入細胞中之其他部分。 131124.doc 200848077 本發明提供一種包含根據本發明之寡聚物之結合物,其 與含有帶正電基團之聚合結合部分(諸如聚乙二醇(PEG)) 共價鍵聯,亦即根據本發明之募聚物可視情況經聚乙二醇 化。 本發明提供醫藥組合物,其包含本發明之募聚物或結合 物’及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。 本發明進一步提供一種根據本發明之寡聚物或結合物, 其係用於藥物中。 本發明進一步提供本發明之寡聚物或結合物之用途,其 係用於製造供治療一或多種本文中提及之疾病(諸如過度 增生性疾病,例如癌症)用之藥物。 本發明進一步提供一種根據本發明之募聚物或結合物, 其係用於治療-或多種本文中提及之疾病,諸如癌症。 亦提供包3本發明之养聚物或結合物之醫藥組合物及其 他組合物。進一步提供下調細胞或組織中β_連接蛋白之表 現的方法,其包含在活體外或活體内使該等細胞或組織與 有效量之-或多種本發明之寡聚物、結合物或組合物接 觸。 亦揭示治療疑似患有或傾向於患上與卜連接蛋白表現或 過度表現相關之疾病或病狀之動物或人的方法,其係藉由 ^該動物或人投與治療或㈣有效量之—或多種本發^之 券聚物、結合物或組合物來進行。 此外,提供使用寡聚物來抑制連接蛋白表現及治療與 β -連接蛋白活性相關之疾病的方法。 131124.doc 200848077 本發明提供一種抑制或降低細胞或組織中β_連接蛋白之 表現的方法,該方法包含以下步驟:使該細胞或組織與有 效量之根據本發明之寡聚物、結合物或醫藥組合物接觸, 以使得β-連接蛋白之表現得以抑制或降低。 本發明提供一種於細胞(諸如癌細胞)中引發細胞凋亡之 方法,該方法包含以下步驟:使該細胞或組織與有效量之 根據本發明之寡聚物、結合物或醫藥組合物接觸,以使得 β-連接蛋白之表現得以抑制或降低及/或引發細胞凋亡。 本發明進一步提供一種募聚物,其包含連續共價鍵聯之 單體或由連續共價鍵聯之單體組成,其中該寡聚物包含一 第一區域,其中該第一區域之序列與SEQ ID NO: 1-132或 SEQ ID NO: 174-193之區域之序列有至少80%—致。在一 些實施例中,該序列係選自由SEQ ID NO: 189、192、58 及103組成之群。 本發明進一步提供一種募聚物,其包含一第一區域或由 一第一區域組成,其中該第一區域之序列與SEQ ID NO: 174-193之區域(諸如SEQ ID NO: 189或192之區域)之序列 一致。 本發明進一步提供一種募聚物,其包含同樣存在於SEq ID NO: 133-174中(諸如同樣存在於SEq id NO: 168或171 中)之序列或由同樣存在於SEQ ID NO: 133-174中(諸如同 樣存在於SEQ ID NO: 168或171中)之序列組成。 【實施方式】 寡聚物 131124.doc 200848077 在弟恶樣令’提供寡聚化合物(在本文中稱作募聚 =諸ΓΓ如適用於調節編碼哺乳動物β_連接蛋白之核酸分
η動1EQID Ν0:173中所示之卜連接蛋白核酸)及編碼 :二广連接蛋白之此等核酸分子之天然存在對偶基因 艾-0功能。本發明之寡聚物包含共價鍵聯之單體。 _術語”單體"包括天然存在於核酸中且不含經修飾之糖或 ^修飾之核鹼基的核苦與去氧核苷(統稱為"核芽”),亦即 核糖或去㈣糖與天然存在之未經㈣核驗基(驗基)部分 (亦卩不7及嘴啶雜環腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸嘧 咬或尿哺幻共價鍵結之化合物及"核苦類似物",其為確實 天然存在於核酸中或不天然存在於核酸中之核苦,其中該 糖部分不為核糖或去氧核糖(諸如雙環糖或2,修飾糖,諸如 2取代糖)’或该鹼基部分經修飾(例如,曱基胞嘧啶), 或兩者皆有。 ”Rna單體”為含有核糖及未經修飾之核鹼基的核苷。 ’’DNA單體”為含有去氧核糖及未經修飾之核鹼基的核 苷0 如下文中進一步描述,"鎖定核酸單體,,、”鎖定單體,,或 nLNA單體”為具有雙環糖之核苷類似物。 術語”相應核苷類似物,,及”相應核苷,,指示核苷類似物中 之鹼基部分與核苷中之驗基部分相同。舉例而言,當,,核 苷’’含有與腺嘌呤鍵聯之2-去氧核糖時,”相應核苷類似物,, έ有(例如)與腺嘌呤鹼基部分鍵聯之經修飾之糖。 術語’f寡聚物”、”寡聚化合物,,及,,寡核誓酸”在本發明之 131124.doc 200848077 上下文中可互換使用’且係指兩個或兩個以上連續單體由 (例如)磷酸酯基團(在核苷之間形成磷酸二酯鍵)或硫代碟 酸酯基團(在核苷之間形成硫代磷酸酯鍵)共價鍵聯而形成 之分子。寡聚物係由10-50個單體組成或包含1〇_5〇個單 體。 在一些實施例中,募聚物包含如本文中所提及之核普戍 核苷類似物或其混合物。"LNA募聚物,,或"LNA寡核苦酸,, 係指含有一或多個LNA單體之募核苷酸。 視情況包括於寡聚物中之核苷類似物可類似地充當相應 核芽,或可具有特定改良功能。其中一些或全部單體為核 苷類似物之募聚物因此等募聚物之若干所需性質(諸如穿 透細胞膜之能力、對細胞外及/或細胞内核酸酶之良好抵 抗力及對核酸目標之高親和力及特異性)而通常優於天然 形式。舉例而言,就上述性質之若干者而言,LNA單體尤 其較佳。 在各種實施例中,募聚物内存在之一或多種核苷類似物 為’’沉默的,,或在功能上與相應天然核苷”等效,,,亦即對寡 聚物用於抑制目標基因表現之方式不具有功能影響。然 而,例如當此等’’等效”核苷類似物更易於製造或更廉價, 或在儲存或製造條件下更穩定,或可併有標籤或標記時, 其為有用的。然而,通常,該等類似物將對寡聚物用於抑 J表現之方式具有功能影響;舉例* t,藉由對目標核酸 之目標區域產生增加之結合親和力及/或對細胞内核酸酶 之抵抗力增加及/或更易於輸送至細胞中。 131124.doc 200848077 本發明之寡聚物包含核苦 ,諸如LNA單體或其他核 口此,在各種實施例中,根據 單體與至少一個核苷類似 苦類似物單體。 孕體 術浯"至少一個”包含大於或等於1之整數,諸如i、2、 3、4、5、6、7、8、9、ι〇、η、12、13、14、15、16、 18 19、2G等等。在各種實施例中,諸如當提及本發 明之化合物之核酸或蛋白質目標時,術語"至少一個"包‘ 術語"至少兩個,,及,,至少三個"及,,至少四個"。同樣,術扭 ,,至少兩個"可包含術語,,至少三個"及”至少四個"。 f各種實施例中,寡聚物係由1〇_5〇個單體、較佳㈣ 個早體、更佳1〇·16個單體及甚至更佳12-16個單體組成。 在各種貫施例令,本發明之寡聚物不包含rna單體。 當用於指示本發明之寡聚物時,術語"區域”意謂寡聚物 内之多個連續單體’其中該"區域”中之單體數目小於寡聚 物中單體之總數。 根據本發明之寡聚物較佳為線性分子或合成為線性的。 在此等實施例中,寡聚物為單鏈分子,且通常不包含(例 士)至夕3、4或5個連續單體之短區域,其與同一寡聚物内 之另區域互補以使得該寡聚物形成内部雙鏈體。在各種 實施例中’寡聚物大體上不為雙鏈,㈣不為^财。 在一些實施例中,本發明之寡聚物係由一段連續單體組 成,其序列係由本文中所揭示之SEQ ID N〇鑑別(例如參見 表14)。在其他實施例中,寡聚物包含一第一區域,該區 域係由一段連績單體組成;及一或多個其他區域,其係由 131124.doc 200848077 至少一個其他單體組成。在一些實施例中,第一區域之序 列係由本文中所揭示之SEQ ID No鑑別。 目標核酸 術語’’核酸’’及’’聚核苷酸π在本文中可互換使用,且經定 義為由兩個或兩個以上如上文所述之單體共價鍵聯所形成 之分子。包括2個或2個以上單體,’’核酸”可為任何長度, 且術語統稱為π寡聚物”,其具有本文中所述之長度。術語 ’’核酸’’及’’聚核苷酸’’包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈及環狀分 子。 如本文中所用,術語π目標核酸π係指編碼哺乳動物β-連 接蛋白多肽(諸如人類β-連接蛋白(例如,具有寄存編號 Χ89579、Χ89593、Χ89592、Χ89591、Χ89588、Χ89585、 Χ895 84及Χ89578之人類基因外顯子))之核酸(諸如DNA), 或哺乳動物β-連接蛋白mRNA(諸如SEQ ID NO 173)。其他 哺乳動物β-連接蛋白mRNA之實例包括(但不限於)具有寄 存編號NM—001098209、NM—0010987210(人類 β-連接蛋白 mRNA) ; NM—007614(小鼠 β-連接蛋白 mRNA) ; ΝΜ—053357 (大鼠 β-連接蛋白 mRNA) ; NM-001122762、DQ267491(馬 β-連接蛋白mRNA) ; ΝΜ一214367(豬β-連接蛋白mRNA); BC119949、BT030683(牛β-連接蛋白mRNA)之β·連接蛋白 mRNA。”目標核酸”亦包括編碼β_連接蛋白之核酸或其天 然存在之變異體,及自其衍生之RNA核酸,較佳為 mRNA,諸如mRNA前體,但成熟mRNA較佳。在各種實施 例中’例如當用於研究或診斷中時,”目標核酸,,可為 131124.doc -12- 200848077 cDNA或自上述DNA或RNA核酸目標衍生之合成寡核芽 酸。根據本發明之寡聚物較佳能夠與目標核酸雜交。 術語”其天然存在之變異體”係指天然存在於指定分類學 群組(例如哺乳動物,諸如小鼠、猴及較佳人)中之卜連接 蛋白多肽或核酸序列之變異體。通常,當提及聚核苦酸之 ”天然存在之變異體"時,該術語亦可涵蓋編碼卜連接蛋白 之基因組DNA(其係藉由染色體易位或複製而存在於毕色 體⑽3: 41.22 - 41.26娜處)及職(諸如自盆衍生之 灿财)的任何對偶基因變異體。當提及特定多肽序 該術語亦包括蛋白質之天然存在形式,其因此可例 精由共轉澤修飾或轉譯後修飾(諸如信號狀斷裂、蛋白 水解斷裂、糖基化等)來加工。 本發明之寡聚物藉由寡聚物之單體與目標核 間的沃森-克里克(Watson心ick)驗基之 (Hoogsteen hydrogen bonH' 、+ f 隹氏虱鍵 gen b〇ndlng)或反向霍氏 之區域Γ目標區域")結合。 ,、目‘核酉夂 卞开力外况明,否則έ士人 由互補驗基之沃森-克里克配對進行, 係糟 列與目標區域之反向互補之處Μ 由於I來物之序 與目標結合;就本文中之目的而言,據稱寡丄养聚物 域”互補"或”部分互補",且 Μ物與目標區 的,,互補性”百分比為鱼 Α 。目標區域之序列 性”百分比。為與目標區域之反向互補序列的”一致 除非文中另外明確說明,否 標之區域,其具有使用 、 目標區域,,將為目 使用下文所述之比對程式及參數與指定 131124.doc 200848077 券t物(或其區域)之反向互補序列最佳比對的序列。
在測定本發明之寡聚物(或其區域)與編碼哺乳動物卜連 接蛋白之核酸(諸如本文中所揭示之核酸)之目標區域之間 的’’互補性,,程度時,該"互補性"(亦為"同源性")程度係表 不為寡聚物(或其區域)之序列與其所最佳比對之目標區域 之反向互補序列之間的一致性百分比。藉由計算兩個序列 之間一致的比對鹼基之數目,除以寡聚物中連續單體之總 數,且乘以100來計算該百分比。在此比較中,若存在間 隙,則較佳此等間隙僅錯配,而並非間隙内之單體數在本 發明之募聚物與目標區域之間不同的區域。 就本發明之目的而言可使用Clustal w算法使用標準設定 來測定胺基酸及聚核苦酸比對、序列—致性百分比及互補 http://www.ebi.ac.uk/emboss/aIign/index.html. 方法:EMBOSS:水(局部):間隙打開=1〇〇,間隙延伸= 〇·5’使用Blosum 62(蛋白質)’ stDNAfuU(對於核苦酸/核 鹼基序列而言)。 如將瞭解,視上下文而定,,,錯配"係指序列之非一致性 (例如’寡聚物之核驗基序列與其所結合之目標區域之反 向互補序列之間;例如’兩個經比對之編碼β連接蛋白之 核酸的驗基序列之間)’或序列之非互補性(例如,寡聚物 與其所結合之目標區域之間)。 適宜地,募聚物(或結合物,如下文進一步描述)能夠抑 制(諸如,下調)β-連接蛋白基因之表現。 在各種實施例中,與正常表現量相比,本發明之寡聚物 131124.doc 14 200848077 實現抑制β-連接蛋白mRNA表現至少10%、至少20%、更佳 至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% ° 在 各種實施例中,與正常表現量相比,本發明之寡聚物實現 抑制β-連接蛋白表現至少10%、至少20%、更佳至少30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95%。在一些實施 例中,當使用1 ηΜ本發明之寡聚物或結合物時,可見此抑 制作用。在各種實施例中,當使用25 ηΜ寡聚物或結合物 時,可見此抑制作用。 在各種實施例中,mRNA表現之抑制小於100%(亦即, 小於完全表現抑制),諸如小於98%抑制、小於95%抑制、 小於90%抑制、小於80%抑制、諸如小於70%抑制。在各 種實施例中,蛋白質表現之抑制小於100%(亦即,小於完 全表現抑制),諸如小於98%抑制、小於95%抑制、小於 90%抑制、小於80%抑制、諸如小於70%抑制。 可例如藉由諸如SDS-PAGE、接著西方墨點法(western blotting)之方法,使用對抗目標蛋白而產生之適合抗體, 藉由量測蛋白質含量來測定表現量之調節(亦即,抑制或 增加)。或者,可例如藉由北方墨點法(northern blotting)或 定量RT-PCR量測mRNA之含量來測定表現量之調節。當經 由mRNA含量來量測時,在各種實施例中,在使用適當劑 量(諸如1 ηΜ及25 ηΜ)時之抑制量通常為不存在本發明化 合物之情況下正常含量之1〇%-20%之量。 因此,本發明提供一種抑制(例如,下調)表現β-連接蛋 白及/或mRNA之細胞中β-連接蛋白及/或mRNA之表現的方 131124.doc -15- 200848077 法,該方法包含使該細胞與有效抑制(例如,下調)該細胞 中β_連接蛋白及/或mRNA之表現之量的根據本發明之寡聚 物或結合物接觸。該細胞適宜地為哺乳動物細胞,諸如人 類細胞。在某些實施例中,該接觸可在活體外發生。在其 他貝施例中’可藉由向哺乳動物投與本發明之化合物或結 合物而在活體内實現接觸。 本1¾明之券聚物通常與人類β—連接蛋白mRNA之目標區 域結合’且同樣包含具有與(例如)SEq id NO: 173之目標 區域之驗基序列互補或部分互補的鹼基序列之區域或由具 有與(例如)SEQ ID NO: 173之目標區域之鹼基序列互補或 部分互補的驗基序列之區域組成。與SEq ID NO: 173之最 佳比對目標區域之序列相比,本發明之寡聚物之序列可視 情況包含1、2、3、4或4個以上鹼基錯配。 在一些實施例中,本發明之寡聚物具有與選自由下文表 1中所示之SEQ ID NO: 1-132組成之群之序列一致的序 列。在其他實施例中,與選自由SEQ ID NO: 1-132組成之 群之序列相比,本發明之募聚物具有一個、兩個或三個鹼 基不同之序列。在一些實施例中,募聚物係由1 〇-丨6個連 績早體組成或包含1 0 -16個連績举體。由16個連續單體組 成之寡聚物之實例為SEQ ID NO: 1、16、17、18、33、 34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、 88、103及11 8。可自其衍生較短序列,例如,較短寡聚物 之序列可同樣存在於SEQ ID NO: 1-132之區域中。較長募 聚物可包括具有至少10個連續單體之序列(其同樣存在於 131124.doc -16- 200848077 SEQ ID NO: 1-132 中)的區域。 V- V;:; ':;::>r'f,7\ -;;>^ 反義募核苷1列(基元) SEQ ID NO . 序列(5’-3〇 ί - . 長度 (驗基) : ' * SEQ ID NO: 1 GAAAGCTGATGGACCA 16 反義寡核苷酸序列 SEQ ID NO: 2 GAAAGCTGATGGACC 15 同上 SEQ ID NO: 3 AAAGCTGATGGACCA 15 同上 SEQ ID NO: 4 GAAAGCTGATGGAC 14 同上 SEQ ID NO: 5 AAAGCTGATGGACC 14 同上 SEQ ID NO: 6 AAGCTGATGGACCA 14 同上 SEQ ID NO: 7 GAAAGCTGATGGA 13 同上 SEQ ID NO: 8 AAAGCTGATGGAC 13 同上 SEQ ID NO: 9 AAGCTGATGGACC 13 同上 SEQ ID NO: 10 AGCTGATGGACCA 13 同上 SEQ ID NO: 11 GAAAGCTGATGG 12 同上 SEQ ID NO: 12 AAAGCTGATGGA 12 同上 SEQ ID NO: 13 AAGCTGATGGAC 12 同上 SEQ ID NO: 14 AGCTGATGGACC 12 同上 SEQ ID NO: 15 GCTGATGGACCA 12 同上 SEQ ID NO: 16 CAGACTTAAAGATGGC 16 同上 SEQ ID NO: 17 CAGAATCCACTGGTGA 16 同上 SEQ ID NO: 18 GCACTGCCATTTTAGC 16 同上 SEQ ID NO: 19 GCACTGCCATTTTAG 15 同上 SEQ ID NO: 20 CACTGCCATTTTAGC 15 同上 SEQ ID NO: 21 GCACTGCCATTTTA 14 同上 SEQ ID NO: 22 CACTGCCATTTTAG 14 同上 SEQ ID NO: 23 ACTGCCATTTTAGC 14 同上 SEQ ID NO: 24 GCACTGCCATTTT 13 同上 SEQ ID NO: 25 CACTGCCATTTTA 13 同上 SEQ ID NO: 26 ACTGCCATTTTAG 13 同上 SEQ ID NO: 27 CTGCCATTTTAGC 13 同上 SEQ ID NO: 28 GCACTGCCATTT 12 同上 SEQ ID NO: 29 CACTGCCATTTT 12 同上 SEQ ID NO: 30 ACTGCCATTTTA 12 同上 SEQ ID NO: 31 CTGCCATTTTAG 12 同上 SEQ ID NO: 32 TGCCATTTTAGC 12 同上 SEQ ID NO: 33 GTAATAGCCAAGAATT 16 同上 SEQ ID NO: 34 ACTCTGCTTGTGGTCC 16 同上 SEQ ID NO: 35 ACTCTGCTTGTGGTC 15 同上 SEQ ID NO: 36 CTCTGCTTGTGGTCC 15 同上 SEQ ID NO: 37 ACTCTGCTTGTGGT 14 同上 131124.doc -17- 200848077 袅1 反義募核苷酸序列(基元) ( SEQIDNO 序列(5’-3’) 長度 (驗基) - 描述 SEQIDNO: 38 CTCTGCTTGTGGTC 14 同上 SEQ ID NO: 39 TCTGCTTGTGGTCC 14 同上 SEQ ID NO: 40 ACTCTGCTTGTGG 13 同上 SEQ ID NO: 41 CTCTGCTTGTGGT 13 同上 SEQ ID NO: 42 TCTGCTTGTGGTC 13 同上 SEQ ID NO: 43 CTGCTTGTGGTCC 13 同上 SEQ ID NO: 44 ACTCTGCTTGTG 12 同上 SEQ ID NO: 45 CTCTGCTTGTGG 12 同上 SEQ ID NO: 46 TCTGCTTGTGGT 12 同上 SEQ ID NO: 47 CTGCTTGTGGTC 12 同上 SEQ ID NO: 48 TGCTTGTGGTCC 12 同上 SEQ ID NO: 49 CCACCAGCTTCTACAA 16 同上 SEQ ID NO: 50 GAGTCCAAAGACAGTT 16 同上 SEQ ID NO: 51 ACCCACTTGGCAGACC 16 同上 SEQ ID NO: 52 GCACAAACAATGGAAT 16 同上 SEQ ID NO: 53 GCAGCTACTCTTTGGA 16 同上 SEQ ID NO: 54 CTCCCTCAGCTTCAAT 16 同上 SEQ ID NO: 55 GCAGTCTCATTCCAAG 16 同上 SEQ ID NO: 56 TATCCACCAGAGTGAA 16 同上 SEQ ID NO: 57 CATCCATGAGGTCCTG 16 同上 SEQ ID NO: 58 CCATCTTGTGATCCAT 16 同上 SEQ ID NO: 59 CCATCTTGTGATCCA 15 同上 SEQ ID NO: 60 CATCTTGTGATCCAT 15 同上 SEQ ID NO: 61 CCATCTTGTGATCC 14 同上 SEQ ID NO: 62 CATCTTGTGATCCA 14 同上 SEQ ID NO: 63 ATCTTGTGATCCAT 14 同上 SEQ ID NO: 64 CCATCTTGTGATC 13 同上 SEQ ID NO: 65 CATCTTGTGATCC 13 同上 SEQ ID NO: 66 ATCTTGTGATCCA 13 同上 SEQ ID NO: 67 TCTTGTGATCCAT 13 同上 SEQ ID NO: 68 CCATCTTGTGAT 12 同上 SEQ ID NO: 69 CATCTTGTGATC 12 同上 SEQ ID NO: 70 ATCTTGTGATCC 12 同上 SEQ ID NO: 71 TCTTGTGATCCA 12 同上 SEQ ID NO: 72 CTTGTGATCCAT 12 同上 SEQ ID NO: 73 AAGCAAGCAAAGTCAG 16 同上 SEQ ID NO: 74 AAGCAAGCAAAGTCA 15 同上 SEQ ID NO: 75 AGCAAGCAAAGTCAG 15 同上 SEQ ID NO: 76 AAGCAAGCAAAGTC 14 同上 SEQ ID NO: 77 AGCAAGCAAAGTC 14 同上 131124.doc -18- 200848077 :¾¾ SEQ ID NO 序列㈣ : 長度 (驗基) SEQ ID NO: 78 GCAAGCAAAGTCAG 14 同上 SEQ ID NO: 79 AAGCAAGCAAAGT 13 同上 SEQ ID NO: 80 AGCAAGCAAAGTC 13 同上 SEQ ID NO: 81 GCAAGCAAAGTCA 13 同上 SEQ ID NO: 82 CAAGCAAAGTCAG 13 同上 SEQ ID NO: 83 AAGCAAGCAAAG 12 同上 SEQ ID NO: 84 AGCAAGCAAAGT 12 同上 SEQ ID NO: 85 GCAAGCAAAGTC 12 同上 SEQ ID NO: 86 CAAGCAAAGTCA 12 同上 SEQ ID NO: 87 AAGCAAAGTCAG 12 同上 SEQ ID NO: 88 GAAATTGCTGTAGCAG 16 同上 SEQ ID NO: 89 GAAATTGCTGTAGCA 15 同上 SEQ ID NO: 90 AAATTGCTGTAGCAG 15 同上 SEQ ID NO: 91 GAAATTGCTGTAGC 14 同上 SEQ ID NO: 92 AAATTGCTGTAGCA 14 同上 SEQ ID NO: 93 AATTGCTGTAGCAG 14 同上 SEQ ID NO: 94 GAAATTGCTGTAG 13 同上 SEQ ID NO: 95 AAATTGCTGTAGC 13 同上 SEQ ID NO: 96 AATTGCTGTAGCA 13 同上 SEQ ID NO: 97 ATTGCTGTAGCAG 13 同上 SEQ ID NO: 98 GAAATTGCTGTA 12 同上 SEQ ID NO: 99 AAATTGCTGTAG 12 同上 SEQ ID NO: 100 AATTGCTGTAGC 12 同上 SEQ ID NO: 101 ATTGCTGTAGCA 12 同上 SEQ ID NO: 102 TTGCTGTAGCAG 12 同上 SEQ ID NO: 103 GTGTTCTACACCATTA 16 同上 SEQ ID NO: 104 GTGTTCTACACCATT 15 同上 SEQ ID NO: 105 TGTTCTACACCATTA 15 同上 SEQ ID NO: 106 GTGTTCTACACCAT 14 同上 SEQ ID NO: 107 TGTTCTACACCATT 14 同上 SEQ ID NO: 108 GTTCTACACCATTA 14 同上 SEQ ID NO: 109 GTGTTCTACACCA 13 同上 SEQ ID NO: 110 TGTTCTACACCAT 13 同上 SEQ ID NO: 111 GTTCTACACCATT 13 同上 SEQ ID NO: 112 TTCTACACCATTA 13 同上 SEQ ID NO: 113 GTGTTCTACACC 12 同上 SEQ ID NO: 114 TGTTCTACACCA 12 同上 SEQ ID NO: 115 GTTCTACACCAT 12 同上 SEQ ID NO: 116 TTCTACACCATT 12 同上 SEQ ID NO: 117 TCTACACCATTA 12 同上 131124.doc -19- 200848077 表1 反義寡核苷酸每列(基元) SEQ ID NO ,序列⑸力 長度 纖導痛:穆: SEQ ID NO: 118 AACATGAAATAGATCC 16 同上 SEQ ID NO: 119 AACATGAAATAGATC 15 同上 SEQ ID NO: 120 ACATGAAATAGATCC 15 同上 SEQ ID NO: 121 AACATGAAATAGAT 14 同上 SEQ ID NO: 122 ACATGAAATAGATC 14 同上 SEQ ID NO: 123 CATGAAATAGATCC 14 同上 SEQ ID NO: 124 AACATGAAATAGA 13 同上 SEQ ID NO: 125 ACATGAAATAGAT 13 同上 SEQ ID NO: 126 CATGAAATAGATC 13 同上 SEQ ID NO: 127 ATGAAATAGATCC 13 同上 SEQ ID NO: 128 AACATGAAATAG 12 同上 SEQ ID NO: 129 ACATGAAATAGA 12 同上 SEQ ID NO: 130 CATGAAATAGAT 12 同上 SEQ ID NO: 131 ATGAAATAGATC 12 同上 SEQ ID NO: 132 TGAAATAGATCC 12 同上 進一步提供目標核酸(亦即,編碼β-連接蛋白之DNA或 mRNA),其含有與SEQIDNO:l-132之募聚物之一或多者 互補或部分互補的目標區域,其中該等寡聚物能夠抑制 (例如下調)β-連接蛋白或mRNA之表現。舉例而言,與具 有 SEQ ID NO: 1、16、17、18、33、34、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、73、88、103及 118之序列 之反義寡聚物互補的人類β-連接蛋白mRNA之目標區域係 展示於圖1中(粗體且加下劃線,其中相應寡聚物SEQ ID NO如上文所示)。 本發明之寡聚物可適宜地包含具有特定序列(諸如選自 SEQ ID NO: 174-193之寡聚物,其同樣存在於本發明之較 短寡聚物中)之區域。該區域較佳包含10-16個單體。舉例 而言,SEQ ID NO: 174· 193各自包含一區域,其中該區域 131124.doc •20· 200848077 之序列同樣存在於分別具有SEQ ID NO: 1、16、17、18、 33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 73、88、103及11 8之較短募聚物中。在一些實施例中,具 有少於16個單體(諸如1〇、η、12、13、14或15個單體)之 寡聚物具有至少8個、至少9個、至少1 〇個、至少11個、至 少12個、至少13個、至少14個或15個連續單體之區域,其 中該區域之序列同樣存在於SEQ ID NO: 1、16、17、18、 33、 34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 73、88、103或11 8申。因此,在各種實施例中,較短寡聚 物係衍生自較長寡聚物。在一些實施例中,根據SEq NO所例示,較長寡聚物包括全部或至少1〇個連續單體。 通常’若本發明之寡聚物包含具有同樣存在於SEq ID N〇: 1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、73、88、103 或 118 中之序列之第一區 域,且該寡聚物比該第一區域長,則該寡聚物之其他區域 較佳側接同樣存在於SEQ ID NO: 1、16、17、18、33、 34、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、 88、103或118中之第一區域,該寡聚物之該側接區域具有 與側接目標核酸之目標區域之序列互補的序列。兩種此等 寡聚物為 SEQ ID NO·· 58及 SEQ ID NO: 103。 亦揭示本發明之募聚物之特定設計,例如以SEQ π) N〇:
133-1 52,尤其 SEQ ID NO: 133、134、135、136、138、 141、148、149、150、151及152所示者。亦揭示LNA募核 苷酸之特定設計,例如以SEQ ID NO: 153-172,尤其SEQ 131124.doc -21 - 200848077 ID NO: 153、154、155、1以, 156、158、161、168、169、 、71及172所示者。在較佳實施例中,本發明之寡取 物為β-連接蛋白_Α及蛋白質表現之有效抑制劑。來 在各種實施例令,寡聚物包含與編碼哺乳動物β-連接蛋 白之目標核酸之目標區域完全互補的單體之序列或由與編 碼哺乳動物β·連接蛋白之目標核酸之目標區域完全互 單體之序列組成。 /而,在一些實施例中,與最佳比對之目標區域相比, 寡聚物之序列包括1、2、3或4個(或4個以上)錯配,且仍足 以與該目標區域結合以實現Ρ·連接蛋白mRNA或蛋白質表 現之抑制。錯配對沃森-克里克氫鍵雙鏈體之失穩影響可 (例如)由s聚物之長度增加及/或寡聚4勿中存在之核苦類似 物(諸如LNA單體)之數目增加來補償。 在各種實施例中,與(例如)編碼哺乳動物卜連接蛋白之 核酸之最佳比對之目標區域的鹼基序列相比,募聚物鹼基 序列包含不大於3個、諸如不大於2個錯配。在各種實施例 中,與(例如)編碼哺乳動物β-連接蛋白之核酸之最佳比對 之目標區域的驗基序列相比,募聚物驗基序列僅包含單一 錯配。 本發明之募聚物或其區域之驗基序列較佳與選自由g E Q ID NO: 1-132組成之群之序列有至少80%—致,諸如至少 85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、甚至 1〇〇%—致。 131124.doc -22- 200848077 本發明之养聚物或其區域之鹼基序列較佳與SEq ID 173中存在之目標區域之序列有至少8〇%互補,諸如至少 85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、甚至loo%互補。 在各種實施例中,寡聚物(或其第一區域)之序列係選自 由 SEQ ID NO: 1-132 或 SEQ ID NO: 174-193 組成之群,或 選自由 SEQ ID NO: H32或 SEQ ID NO· 174-193之至少 10 個連續單體組成之群。在另一實施例中,當與該所選序列 或其區域最佳比對時,本發明之寡聚物或其第一區域之序 列視情況包含1、2或3個與SEQ ID NO·· 1-132或SEQ ID NO: 174-193或其至少ι〇個連續單體中的鹼基部分不同之 驗基部分。 在某些實施例中,單體區域係由i丨、12、1 3、14、i 5、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 26 、 27 、 28 或29個連續單體,諸如1(M5個、個、^以個,諸如 12-1 8個單體組成。在各種實施例中,該區域適宜地與本 發明之寡聚物具有相同長度。 在一些實施例中,募聚物在5,或3’端包含其他單體,諸 如’在寡聚物之5,端及/或3,端獨立地包含1、2、3、4或5 個其他單體,其與目標區域之序列不互補。在各種實施例 中’本發明之寡聚物包含一個與目標互補之區域,其在5, 及/或3’側接其他單體。在各種實施例中,該區域之3,端側 接1、2或3個DNA或RNA單體。在寡聚物之固態合成期間 131124.doc -23- 200848077 時常使用3’ DNA單體。在各種實施例中,其可相同或不 同,养聚物之5’端側接1、2或3個DNA* RNA單體。在某 些實施例中,其他5,或3,單體為核苷,諸如DNA或RNA單 體。在各種實施例中,其他5,或3,單體可表示區域〇,如本 文中間隙聚合物(gapmer)募聚物中所提及。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQ ID N0:1a根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 早體組成,具有根據SEQ ID n〇:16*根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEq ID n〇:174根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQIDN〇:33或根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQ ID N〇:3zUl根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 131124.doc -24- 200848077 單體組成’具有根據SEQIDNO:49或根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實_中’㈣本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQIDNO:50或根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中’根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQIDN0:51或根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據沾〇1〇>^^52或根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQIDN〇:535l根據其一區域之核鹼 基序列。 /某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續
C :體組成’具有根據SEq ID紙54或根據其—區域之核驗 基序列。 抑在,些實施例中’根據本發明之寡聚物係由或包含連續 =組成’具有根據SEQ ID肌55或根據其— 基序列。 ^ 。。在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 =組成,具有根據SEQIDN〇:56或根據其一區域之核鹼 基序列。 在某些實關中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 131124.doc -25- 200848077 單體組成,具有根據SEQIDN㈣錄據其—區域之核驗 基序列。 在某些實施例中,根據本發明之募聚物係由或包含連續 單體組成,具有根據SEQID N㈣或根據其__區域之核驗 基序列。 ”在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 皁體組成’ *有根據SEq ID肌73或根據其一區域之核驗
基序列。 X ί 。。在某些實施例中’根據本發明之募聚物係由或包含連續 單體組成’具有根據SEQlDN〇:885l根據其—區域之核驗 基序列。 ”在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 早體組成,具有根據SEQ ID Ν〇:1〇3或根據其—區域之核 鹼基序列。 在某些實施例中,根據本發明之寡聚物係由或包含連續 早體組成’具有根據SEQ m ν〇:118或根據其一區域之核 驗基序列。 序列比對可用於鑑別來自人類及一或多 物細如猴、小鼠及/或大鼠)之編碼β_連接蛋 區域,其中在該等物種之間存在足夠核酸段—致性以允許 設計靶向(亦即’ |充分特異性下結合以㈣其表現)人類 β·連接蛋白目標核酸及在不同哺乳動物物種中存在之相應 核酸的募核苷酸。 μ 在些貫施例中,此等寡聚物係由以下區域組成或包含 131124.doc -26- 200848077 以下區域:至少10個,諸如至少12個,諸如至少
如至少16個,諸如至少18個,諸如11、12、13、14、15 S !6、17或18個連續單體,其序列與編碼來自人類之㈣5接 蛋白之核酸及編碼來自不同哺乳動物物種之β_連接蛋白之 核酸的目標區域之序列丨〇〇%互補。 在一些實施例中,本發明之寡聚物包含具有以下序列 連續單體之區域或*且古,、,γd ^ , 匕4 ^由具有以下序列之連續單體之區域組
成:該序列與編碼人類β·連接蛋白之核酸及編碼來自不同 哺礼動物物種之卜連接蛋白之核酸(諸如編碼β•連接蛋白之 小咏核酸)的目標區域之序列至少8〇%、諸如至少以%、諸 ^至少㈣、諸如至少抓、諸如至少㈣或卿互補。 目標區域1 0 0 %互補。 長度 券聚物之連續核鹼基序列較佳與人類卜連接蛋白被财之 募聚物包含10-50個連續單體(諸如1〇、u、12、13 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或3 0個連續單體)或由1〇_5〇個連續單體(諸 如10 、 11 、 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 2〇 、 21 、 22 ' 23、24、25、26、27、28、29 或 30個連續單體)組 成0 在各種實施例中,寡聚物包含以下各物或由以下各物組 成:10-25個連續單體,12-25個或10_22個連續單體,諸如 12-18個連續單體,諸如13-17個或12-16個連續單體,諸如 13、14、15、16個連續單體。 131124.doc -27- 200848077 寡聚物包含1〇、11、12、13或14個連 12、13或14個連續單體組成。 根據本發明之寡聚物係由不大於22個 在各種實施例中 續單體或由10、11 在各種實施例中 連續單體,諸如不大於2〇個連續覃舻 士口口 疋只早體,诸如不大於1 8個連 續單體,諸如1 5、1 6或1 7個連續單I#相士 —甘a虚 、平般、、且成。在某些實施例 中本舍明之券聚物包含小於2 0個連續單體。 核苷及核苷類似物 在各種實施例中’寡聚物中存在之單體之至少—者為含 有經修飾之驗基(諸如選自由5_甲基胞_、異胞㈣、假 異胞㈣、5•漠尿㈣、5_丙炔基尿㈣、6_胺基嗓吟、 2_胺基嗓呤、肌芽、二胺基嗓呤及2'氣_6,基π票呤、黃嗓 7人Η不7、5 _甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、 5-演尿嘧啶、5_丙炔基尿嘧啶、6_胺基嗓呤、2_胺基嗓 吟、肌#、二胺基嗓吟及2氯·6胺基。票吟組成之群之驗 基)的核苷類似物。 在各種實施例中’募聚物中存在之單體之至少—者為含 有經修_之糖的核苦類似物。 在一些實施例中,募聚物之至少2個連續單體之間的鍵 不為攝酸二酯鍵。 在某些實施例中,募聚物包括至少一個具有經修飾之鹼 基的早體、至少一個具有經修飾之糖的單體(其可為同一 單體)及至少一個非天然存在的單體間鍵。 適用於本文中所述之募聚物中之核苷類似物的特定實例 係由(例如)Freier及 Altmann; /· U997, 25, 131124.doc -28- 200848077 4429-4443 及 Uhlmann; CW· > Dr叹仏ve/叩膽,, 2000, 3(2),293-2 13所述且描述於流程丨(其中一些核苷類似 物展示為核苷酸)及2中:
n B 0=P-S'
0 0' 0=P-0' Β
硫代磷酸酯
2,-Μ0Ε
Η CeNA ΡΝΑ
Ν 0=Ρ-〇· 2’-(3-羥基)丙基 3’ -胺基鱗酸酯
硼烷磷酸酯 〇tBH3 流程1 寡聚物因此可包含核苷(較佳DNA單體,但亦可能為 RN Α單體)之簡單序列或核苷與一或多種核苷類似物之組 合或由核苷(較佳DNA單體,但亦可能為rna單體)之簡單 序列或核苷與一或多種核苷類似物之組合組成。在一些實 131124.doc -29- 200848077 施例中’此等核苷類似物適宜地增強寡聚物對目標核酸之 目標區域的親和力。
V 適合且較佳核苷類似物之實例係描述於WO 2〇〇7/〇31()91 中,該文獻係以引用的方式全部併入本文中或於其中提 及。 在一些實施例中,核苷類似物包含經修飾以提供2,_取代 基之糖部分,諸如2,-0-烷基-核糖、2,_胺基_去氧核糖及2,_ 氟-去氧核糖。 在一些實施例中,核苷類似物包含其中存在產生雙環糖 (LNA)之橋接結構之糖,其增強結合親和力且亦可提供一 些增加之核酸酶抵抗力。在各種實施例中,乙^^八單體係選 自氧基-LNA(諸如β-D-氧基-LNA及α-L-氧基-LNA)及/或胺 基-LNA(諸如β-D-胺基-LNA及a-L-胺基-LNA)及/或硫基_ LNA(諸如β-D-硫基乩财及a心硫基_LNA)及/或ENa(諸如 β-D-ENA及a-L-ENA)。在某些實施例中,LNA單體為 氧基-LNA。LNA單體在下文中進一步描述。 在募聚物中併入增強親和力之核苷類似物(諸如LNA單 體或含有2,-取代糖之單體)可允許寡聚物之尺寸減小,且 在發生非特異性或異常結合之前亦可將上限降至募聚物之 尺寸。 在某些實施例中,寡聚物包含至少2個核苷類似物。在 一些實施例中,寡聚物包含3_8個核普類似物,例如6或7 個核苦類似物。在較佳實施例中,核苦類似物之至少一者 為鎖定核酸(LNA)單體;例如至少3個或至少4個或至少5個 131124.doc -30- 200848077 或至少6個或至少7個或8個核苷類似物為lna單體。在一 些實施例中,所有核苷類似物均為Lna單體。 將認識到當提及較佳寡聚物鹼基序列時,在某些實施例 中券聚物包含相應核苷類似物(諸如相應Lna單體)或其他 相應核苦類似物,其提高寡聚物/目標區域雙鏈體之雙鏈 體穩定性(Tm)(亦即增強親和力之核苷類似物)。 在各種較佳實施例中,寡聚物之鹼基序列與目標區域之 驗基序列之間的任何錯配(亦即非互補性X若存在)位於除 含有增強親和力之核苷類似物之募聚物的區域(例如區域A 或區域C)之外的區域中,諸如在如下文中所提及之區域B 内,及/或在如下文中所提及之區域D内,及/或在僅含有 核苷之寡聚物之區域中,及/或在與目標區域互補之寡聚 物區域之5’或3’的區域中。 在一些實施例中,本發明之寡聚物中(諸如在本文中提 及之區域A及區域C中)存在之核苷類似物獨立地選自(例 如):含有2’-0-烷基-核糖之單體、含有2,_胺基-去氧核糖 之單體、含有21-氟-去氧核糖之單體、[να單體、含有阿 拉伯糖糖之單體("ANA單體”)、含有2,_氟及NA糖之單體、 含有d-阿拉伯糖-己糖醇糖之單體(”hna單體。、如 Chdstensen’ 胸c/· 办.及以· 3〇: 4918_4925 (2〇〇2从其係 以引用的方式併入本文中)中所定義之插入單體及含有 2,ΜΟΕ糖之單體。在某些實施例中,僅存在本發明之募聚 物或其區域中存在之上述類型核苷類似物中的一者。 在某些實施例中,核苷類似物含有2,-〇_曱氧基乙美核 131124.doc 200848077 糖(2’MOE)或2’-說-去氧核糖或LNA糖,且同樣本發明之募 核苷酸可包含獨立地選自此三種類型類似物之核苷類似 物’或可僅包含選自此三種類型之一種類型類似物。在含 有核苷類似物之某些募聚物實施例中,該等核苦類似物之 至少一者含有2’-:\10丑-核糖,諸如2、3、4、5、6、7、8、 9或10個核苷類似物含有ΠΟΕ-核糖。在某些實施例中, 該等核苷類似物之至少一者含有2,_氟-去氧核糖,諸如2、 3 ' 4、5、6、7、8、9或10個核苷類似物含有2,_氟_去氧核 糖。 在各種實施例中,根據本發明之募聚物包含至少一個鎖 定核酸(LNA)單體,諸如i、2、3、4、5、6、7或8個LNA 單體,諸如3-7或4-8個LNA單體,或3、4、5、6或7個LNA 單體。在各種實施例中,所有核苷類似物均為lNA單體。 在一些實施例中,募聚物包含p_D_氧基_LNA單體及以下 LNA單元之一或多者:硫基·LNA單體、胺基_lna單體、 氧基-LNA單體及/或呈p_D或a_L構型之ena單體或其組 合。在某些實施例中,寡聚物中所有LNA單體之胞+定驗 基部分均為5-甲基胞㈣。在本發明之某些實施例中寡 聚物包含LNA單體與DNA單體。通常’ LNA單體與dna單 體之合併總數為H)-25、較佳㈣_2G、甚至更佳為12_16。 在本:明之某些實施例中,寡聚物或其區域係由至少一個 LNA:體組成’且剩餘單體為舰單體。在某些實施例 中寡來物僅包含視情況與經修飾之鍵聯基團(諸如硫代 碌酸酿基)鍵聯之LNA單體與核芽(諸如rna或囊單體, 131124.doc •32· 200848077 最佳為DNA單體)。 在各種μ %例中’寡聚物中存在之核苷類似物之至少一 /、有‘自由5甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5_ 、漠尿嘧啶、%丙炔基尿嘧啶、6-胺基嗓呤、2_胺基嗓呤、 肌# 胺基不及2_氯-6_胺基嗓呤組成之群的經修飾之 ' 驗基。
LNA 術語"LNA單體"係指含有雙環糖("lna糖")之核苦類似 物術e° LNA养核苷酸”及"LNA募聚物"係指含有一或多 個LNA單體之募聚物。 本發明之募聚物中所用iLNA單體較佳具有通式〗之結 構: R5
其中 X係選自-0-、-S-、-N(Rn*)-、-C(R6R6*)- · B係選自氫、視情況經取代之Cl_4烷氧基、視情況經取 代之C!·4烧基、視情況經取代之Cl_4醯氧基、核鹼基、 DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基 團、報導體基團及配位體; P表示連接至後績單體之核苦間鍵或5’ -末端基團之基團 位置’此核普間鍵或5f-末端基團視情況包括取代基r5或同 131124.doc -33- 200848077 樣可用之取代基r5+ ; P*表示連接至前接單體之核苷間鍵或3’-末端基團; R4*與R2*—起表示由1-4 、-C(Ra)=N_、_0_、-Si(Ra)2-、-S-、-S02-、_N(Ra)-及 >oz之基團/原子組成之雙基團; 其中Z係選自-0-、-S-及-N(Ra)-,且Ra& Rb各自獨立地 選自氫、視情況經取代之C 2烧基、視情況經取代之 Cm烯基、視情況經取代之Cm炔基、羥基、Ci i2烷氧 基、C2」2烷氧基烷基、C2·〗2烯氧基、羧基、C丨·丨2烷氧基 幾基、C】-】2烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳 氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基_羰基、雜芳氧基、 雜芳基羰基、胺基、單(Cw烷基)胺基及二(Cl6烷基)胺 基、胺f醯基、單(C1·6烷基)-胺基-羰基及二(C16烷基)_ 胺基-¾基、胺基-C!·6烧基•胺基羰基、單(CN6院基)胺基_ 1-6燒基-胺基|^基及一((^1_6烧基)胺基_(^6燒基-胺基幾 基、烷基-羰基胺基、胺甲醯胺基、Ci 6烷醯基氧基、 砜基、Cw烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、 烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學 活性基團、螯合基團、報導體基團及配位體,其中芳基 雜务基可視情況經取代且其中兩個成對取代基汉&及Rb 起可表示視情況經取代之亞甲基(=CH2),且 存在之取代基R1*、R2、R3、r5、r5*、R6&R6*各自獨立 地選自氫、視情況經取代之C112烷基、視情況經取代之 稀基、視情況經取代之C2.12炔基、經基、CbW氧基、 131124.doc -34- 200848077 C2_12烷氧基烧基、Cm烯氧基、羧基、Cn12烧氧基羰基、 CN12烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、 芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基 幾基、胺基、單(Cl-6烧基)胺基及二(Ci-6烧基)胺基、胺甲 醯基、單(CN0烷基)_胺基-羰基及二(c〗_6烷基)-胺基-魏基、 胺基-Ci_6烧基-胺基羰基、單(C〗·6烧基)胺基-cle6烧基-胺基 罗厌基及一(Ci·6烧基基- C】·6烧基-胺基魏基、c1-6烧基-幾 基胺基、胺甲醯胺基、C!.6烧醯基氧基、磯基、Cl6烧基石黃 醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、c! 烧硫基、函素、 DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、整合基 團、報導體基團及配位體,其中芳基及雜芳基可視情況經 取代’且其中兩個成對取代基一起可表示側氧基、硫酮 基、亞胺基或視情況經取代之亞曱基,或一起可形成由^ 5個碳原子伸烧基鏈組成之螺雙基團,該伸烷基鏈視情況 穿插有一或多個選自-0-、_S-及雜原子/基團及/ 或由一或多個選自-0-、-S-及_(NRn)-之雜原子/基團終 止’其中Rn係選自氫及Cl_4烧基’且其中兩個相鄰(非成 對)取代基可表示產生雙鍵之另一鍵;且rN*(當存在且不乎 及於雙基團中時)係選自氫及C1·4烧基;及其鹼性鹽及酸Z 成鹽。 在某些實施例中,R”係選自Η、-CH3、、 -ch2-o-ch3及-CH=CH2。 在各種實施例中,R4*及R2*—起表示選自以下各基團之 雙基團·· -C(RaRb)-0-、-qRaR^CCReRc^i、_c(RaRb)- 131124.doc -35- 200848077 C(ReRd)_C(ReRf)-0-、-C(RaRb)-0-C(ReRd)-、-C(RaRb)-0-C(RcRd)-0-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Re)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-〇-及-C(RaRb)-S-、 -C(RaRb)-C(RcRd)-S-,其中 Ra、Rb、Rc、Rd、RlRf各自 獨立地選自氫、視情況經取代之C〗_i2烷基、視情況經取代 之Cm烯基、視情況經取代之c2_12炔基、羥基、Chu烷氧 基、Cm烷氧基烷基、C2-12烯氧基、羧基、(^_12烷氧基羰 基、Cl基羰基、甲酿基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧 基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜 芳基羰基、胺基、單(Ci-6烷基)胺基及二(Cw烷基)胺基、 胺甲醯基、單(C〗·6烷基)-胺基-羰基及二(cK6烷基)_胺基-羰 基、胺基-Cw烷基-胺基羰基、單(Cw烷基)胺基-Cl 6烷基_ 胺基幾基及二(Cw烷基)胺基-Cw烷基-胺基羰基、Cl_6烷 基-¾基胺基、胺曱醯胺基、Cw烧醯基氧基、硬基、cK6 烧基續醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6烷硫基、鹵 素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯 合基團、報導體基團及配位體,其中芳基及雜芳基可視情 況經取代且其中兩個成對取代基Ra&Rb一起可表示視情況 經取代之亞甲基(=CH2)。 在另一貫施例中,R4及R2 一起表示選自以下基團之雙 基團:-ch2-〇-、-ch2_s_、-Ch2_nh…_CH2_N(CH3)、 -CH2-CHd、-CH2-CH(CH3)-、-ch2-ch2-s-、-ch2-ch2-
NH "CH2-CH2-CH2- % -CH2-CH2-CH2-O- ^ -CH2-CH 131124.doc -36- 200848077 CH(CH3). > -CH=CH-CH2· ^ -CH2-O-CH2-O- > -CH2-NH-0- 、-CH2-N(CH3)-〇-、-CH2-〇-CH2-、-CH(CH3)-0·、-CH(CHr 〇-CH3)-o … 對於所有對掌性中心而言,不對稱基團可見於π或s取向 中 本發明之寡聚物中所用之LNA單體較佳包含至少一個根 據下式中任一者之LNA單體:
C
*z
叩丞ai私1示遴丞,B構成天然存在 核酸中或不天然存在於 、 付 於核酸中之未經修飾之鹼基部分或細 修飾之鹼基部分,且rh 次、、二 係選自氫及C!-4烷基。 尤其較佳LNA單體展示於流程2中:
B
β-D-硫基-LNA
B β-D-ENA 131124.doc -37- 200848077
β-D-胺基-LNA 流程2 術語’’硫基-LNA”係指上文通式中之Y係選自S或-CH2-S-之LNA單體。硫基-LNA可為β-D或α-L構型。 術語π胺基-LNAM系指上文通式中之Y係選自-N(H)-、 N(R)-、CH2-N(H)-及-CH2-N(R)-之 LNA單體,其中 R係選 自氫及Cw烷基。胺基-LNA可為β-D或a-L構型。 術語’’氧基-LNA”係指上文通式中之Y表示-0-或-CH2-0-之LNA單體。氧基-LNA可為β-D或a-L構型。 術語’ΈΝΑ”係指上文通式中之Y為-CH2-0-之LNA單體 (其中-CH2-0-之氧原子連接至相對於鹼基B之2’位上)。 在一較佳實施例中,LNA單體係選自β-D-氧基-LNA單 體、a-L-氧基-LNA單體、β-D-胺基-LNA單體及β-D-硫基-LNA單體,尤其β-D-氧基-LNA單體。 在本發明之上下文中,術語”匸^烷基”意謂直鏈或支鏈 飽和烴鏈,其中該鏈具有1至4個碳原子,諸如甲基、乙 基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基及第三 丁基。 RNAseH募集 認識到募聚物可經由目標mRNA之非RNase介導之降解 (諸如藉由轉譯之空間位阻或其他機制)起作用;然而,本 131124.doc -38- 200848077 發明之較佳寡聚物能夠募集核糖核酸内切酶(RNase),諸 如 RNase Η。 通系,养聚物包含至少6個,諸如至少7個連續單體,諸 如至少8個或至少9個連續單體(包括7、8、9、10、11、 12、13、14、15或16個連續單體)之區域,當與目標rna 之目標區域形成雙鏈體時,其能夠募集RNase。能夠募集 RNase之养聚物之區域可為如下文所述之間隙聚合物之情 . 況中所提及的區域B。在某些實施例中,能夠募集RNase 之寡聚物之區域(諸如區域B)係由1〇、η、a、13、14、 15、16、17、18、19或20個單體組成。 ΕΡ 1 222 309提供測定RNaseH活性之活體外方法,其可 用於測定本發明之募聚物募集RNaseH之能力。若滿足以 下條件則認為募聚物能夠募集RNaseH :使用ep i 222 3〇9(其係以引用的方式併入本文中)之實例91_95所提供之 方法,當募聚物與RNA目標之互補目標區域接觸時,其具 有擁有相同鹼基序列但僅含有DNA單體之寡核苷酸(募核 苷酸中之所有單體之間不具有2,取代,具有硫代磷酸酯鍵 聯基團)之至少1 %、諸如至少5%、諸如至少丨〇%或小於 20%之初始速率(如以pm〇w/min所量測)。 在各種實施例中,若滿足以下條件則認為募聚物基本上 不能募集RNaseH :使用EP 1 222 309之實例91-95所提供之 方法’當寡聚物與RNA目標之互補目標區域及RNaseH接 觸時’ RNaseH初始速率(如以pm〇i/i/min所量測)小於使用 具有相同鹼基序列但僅含有DNA單體之寡核苷酸(寡核苷 131124.doc -39- 200848077 酉文中之所有單體之間不具有2,取代,具有硫代磷酸酯鍵聯 基團)測定之初始速率的1%、諸如小於5°/。、諸如小於10% 或小於20%。 在其他實施例中,若滿足以下條件則認為寡聚物能夠募 • 集RNaseH :使用EP } 222 3〇9之實例91·95所提供之方法, 當募聚物與RNA目標之互補目標區域及RNaseH接觸時, RNaSeH初始速率(如以pmol/1/min所量測)為使用具有相同 r 驗基序列但僅含有DNA單體之寡核苷酸(募核苷酸中之所 ‘有單體之間不具有2’取代,具有硫代磷酸酯鍵聯基團)測定 之初始速率的至少20%、諸如至少40%、諸如至少60%、 諸如至少80%。 通常,與目標RNA之互補目標區域形成雙鏈體且能夠募 集RNase之募聚物之區域可含有DNA單體及LNA單體且可 與目標區域形成DNA/RNA樣雙鏈體。LNA單體較佳為a-L 構型’尤其較佳為a-L-氧基LNA〇 本發明之寡聚物可包含核苷與核苷類似物,且可為間隙 聚合物、頭聚合物(headmer)或混合聚合物(mixmer)之形 式。 • ”頭聚合物”係定義為包含第一區域及與其連續之第二區 • 域的募聚物,其中該第二區域之5’端單體與該第一區域之 3*端單體鍵聯。該第一區域包含一段連續之非RNase募集 之核苦類似物,且該第二區域包含一段連續(諸如至少7個 連續單體)之DNA單體或可由RNase識別及裂解之核苷類似 物單體。 131124.doc -40- 200848077 ”尾聚合物(tailmer)"係定義為包含第一區域及與其連續 之第二區域的募聚物,其中該第二區域之5,端單體與該第 一區域之3’端單體鍵聯。該第一區域包含一段連續(諸如至 少7個此等單體)之dna單體或可由RNase識別及裂解之核 苦類似物單體,且該第二區域包含一段連續之非RNase募 集之核皆類似物單體。 其他’’嵌合’’寡聚物(稱作”混合聚合物”)係由(i)DNA單體 或可由RNase識別及裂解之核苷類似物單體及(ii)非RNase 募集之核苷類似物單體之交替組合物組成。 在一些實施例中,除增強寡聚物對目標區域之親和力之 外 些核普類似物亦介導RNase(例如,RNaseH)結合及 裂解。在一些實施例中,因為a_L_LNA單體在特定程度上 恢復RNase活性,所以含有a_L_LNA單體之募聚物之間隙 區域(例如’如下文中所提及之區域B)係由較少可由 識別及裂解之單體組成,且在混合聚合物結構中引入更大 靈活性。 間隙聚合物設計 本發明之募聚物較佳為間隙聚合物。 ”間隙聚合物,,為包含能夠募集RNase(諸如RNaseH)之一 段連續單體(諸如至少6或7個DNA單體之區域,在本文中 稱作區域B)的寡聚物,其中區域B在其5,端與3,端上由分別 稱作區域A及區域c之區域側接,區域a及區域c各自包含 以下各物或由以下各物組成:核苷類似物,諸如增強親和 力之核苷類似物,諸如1-6個核苷類似物。 131124.doc -41 - 200848077 該間隙聚合物較佳自5·至3,包含區域A_B_C4視情況a_b 一 C-D或D-A-B-C,其中:區域A係由以下各物組成或包含以 下各物·至少一個核苷類似物,諸如至少一個Lna單體, 諸如1-6個核苷類似物,諸如LNA單體;且區域B係由以下 各物組成或包含以下各物:能夠募集RNase之至少五個連 續單體(當與目標RNA分子(諸如mRNA目標)之互補目標區 域形成雙鏈體時),諸如DNA單體;且區域c係由以下各物 組成或包含以下各物:至少一個核苷類似物,諸如至少一 個LNA單體,諸如丨_6個核苷類似物,諸如LNA單體;且 區域D(若存在)係由以下各物組成或包含以下各物:1、2 或3個單體,諸如DNA單體。 在各種實施例中,區域A係由1、2、3、4、5或6個核苦 類似物,諸如LNA單體,諸如2-5個核苷類似物,諸如2巧 個LNA單體,諸如3或4個核苷類似物,諸如3或4個11^八單 體組成,及/或區域C係由1、2、3、4、5或ό個核苷類似 物,諸如LNA單體,諸如2-5個核苷類似物,諸如2_5個 LNΑ單體’諸如3或4個核苦類似物,諸如3或4個LNΑ單體 組成。 在某些實施例中,區域B係由以下各物組成或包含以下 各物·能夠募集RNase之5、6、7、8、9、1〇、11或12個連 續單體,或能夠募集RNase之6-10個或7_9個、諸如8個連 續單體。在某些實施例中,區域B係由以下各物組成或包 含以下各物:至少一個DNA單體,諸如U2個DNA單體, 較佳4-12個DNA單體,更佳6-10個DNA單體,諸如7_10個 131124.doc -42- 200848077 DNA單體,最佳8、9或i〇個DNA單體。 在某些實施例中,區域A係由3或4個核苷類似物(諸如 LN A單體)組成,區域b係由7、8、9或10個DN A單體組 成’且區域C係由3或4個核苷類似物(諸如LNA單體)組 成。此等設計包括(八-丑-(:)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9_4、4-9-3、3-8-3、3_8-4、4-8_3、3-7-3、3-7_4、4_ 7-3 ’且可進一步包括區域d,其可具有1或2個單體(諸如 DNA單體)。 其他間隙聚合物設計係揭示於W〇 2004/046160中,該文 獻係以引用的方式併入本文中。 美國臨時申請案60/977,409(其係以引用的方式併入本文 中)涉及’’短聚合物(sh〇rtmer),,間隙聚合物寡聚物,在某些 實施例中’其可為根據本發明之間隙聚合物募聚物。 在某些貫施例中,寡聚物係由1 0、1 i、12、1 3或14個連 縯單體組成’其中該寡聚物之區域具有類型(5,_3,)a_b_c 或視情況A-B-C-D或D-A-B-C,其中:區域a係由1、2或3 個核苷類似物單體(諸如LNA單體)組成;區域B係由在與 互補RNA分子(諸如mRNA目標)形成雙鏈體時能夠募集 RNAse之7、8或9個連續單體組成;且區域c係由丨、2或3 個核苷類似物單體(諸如LNA單體)組成。若存在,則區域 D係由單一 DNA單體組成。 在某些貫施例中’區域A係由1個LNA單體組成。在某此 實施例中,區域A係由2個LNA單體組成。在某些實施例 中,區域A係由3個LNA單體組成。在某些實施例中,區域 131124.doc -43- 200848077 C係由1個LNA單體組成。在某些實施例中,區域c係由2個 LNA單體組成。在某些實施例中,區域C係由3個LNA單體 組成。在某些實施例中,區域B係由7個核苷單體組成。在 某些實施例中,區域B係由8個核苷單體組成。在某些實施 例中’區域B係由9個核普單體組成。在某些實施例中,區 域B包含1-9個DNA單體,諸如2、3、4、5、6、7或8個 DNA單體。在某些實施例中,區域b係由DNA單體組成。 在某些實施例中’區域B包含至少一個呈α-L構型之LNA單 體,諸如2、3、4、5、6、7、8或9個呈a_L構型之LNA單
體。在某些實施例中,區域B包含至少一個a_L_氧基lNA 單體或其中呈a-L構型之所有LNA單體均為a-L-氧基LNA單 體。在某些實施例中,募聚物之A_B_C區域中存在之單體 的數目係選自由以下(核苷酸類似物單體_區域B _核苷類似 物單體)組成之群·· ^、1_8_2、Μ」、2_8_2、3_8j、 2-8-3 、 3_8-2 、 4_8-1 9-2、2-9-1、2-9-2、 、4-8_2 、 1-8-4 、 2-8-4 ;或 1-9-1 、 2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1
1-9-4 或 1-10-1 、 1_1〇_2 2-10-1 > 2-1〇-2 1-10-3及 3-10- 1。在某些實施例中,本發明寡聚物之A-B-C區域中存在之 單體的數目係選自由m、 3-7-2、3-7-4及4-7-3組成之群。在某些實施财,區域a 及區域C各自由兩個厲單體組成,且區域B係由8或9個核 苷早體、較佳DNA單體組成。 其他間隙聚合物設計包括以下設計·其中區域A及/或區 VC係由3、4、5或6個核_類似物,諸如含有2,·〇-甲氧基 131124.doc -44- 200848077 乙基-核糖(2’MOE)之單體及含有2,_ ι _去氧核糖之單體組 成,且區域B係由8、9、1〇、以12個核苷(諸如脈八單 體)組成,其中區域A_B_C具有5_1〇_5或4_12_4單體。其他 間隙聚合物設計係揭示於W〇 2007/1465 1 1A2中,該文獻 係以引用的方式併入本文中。 鍵聯基困 本發明之募聚物之單體係經由鍵聯基團偶合在一起。各 單體適宜地經由鍵聯基團與3,相鄰單體鍵聯。 術語f’鍵聯基團”或”核苷間鍵”意謂能夠將兩個連續單體 共價偶合在一起之基團。特定且較佳實例包括磷酸酯基團 (在相鄰核苦單體之間形成磷酸二酯)及硫代磷酸酯基團(在 相鄰核苷單體之間形成硫代磷酸酯)。 適合鍵聯基團包括WO 2007/03 1091内所列出之鍵聯基 團,例如WO 2007/03 1091(其係以引用的方式併入本文中) 之第34頁之第一段中列出之鍵聯基團。 在各種實施例中,較佳將鍵聯基團自其正常磷酸二酯修 飾為更抵抗核酸酶攻擊者(諸如硫代磷酸酯或硼烷磷酸 酯),可由RNaseH裂解之此兩者允許RNase介導之目標基 因表現之反義抑制。 如本文中所提供之適合含硫(8)鍵聯基團可較佳。硫代 磷酸酯鍵聯基團亦較佳,尤其對於間隙聚合物之間隙區域 (B)而言。硫代磷酸酯鍵亦可用於側接區域(適當時,A及 C,且對於將A或C與D鍵聯而言,且在區域D内)。 然而,區域A、B及C可包含除硫代磷酸酯外之鍵聯基團 131124.doc -45- 200848077 (諸如磷酸二酯鍵),尤其例如當使用核苷類似物保護區域 A及區域C中之鍵聯基團免於核酸内切酶降解時,諸如當 區域A及區域C包含LNA單體時。 募聚物中之鍵聯基團可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷 辑ί文酉曰以允§午目標RNA之RNaseH裂解。出於改良核酸酶 抗性及其他原因(諸如易於製造),硫代麟酸酯較佳。 在各種實施例中,寡聚物之相鄰單體藉由硫代磷酸酯基 團彼此鍵聯。 認識到在具有硫代磷酸酯主鏈、尤其具有在核苷類似物 單體之間或與核苷類似物單體相鄰(通常在區域A及/或區 域C中)的硫代填酸酯鍵聯基團之寡聚物中包括鱗酸二酯鍵 (諸如一或兩個鍵)可修飾寡聚物之生物可用性及/或生物分 布,參見WO 2008/053314,其係以引用的方式併入本文 中。 在一些實施例(諸如上文提及之實施例)中,若適當且未 特定說明,則所有剩餘鍵聯基團為磷酸二酯或硫代磷酸酯 或其混合物。 在一些實施例中,所有核苷間鍵聯基團為硫代磷酸酯。 當提及特定間隙聚合物募核苷酸序列(諸如本文中所提 供之間隙聚合物募核苦酸序列)時,應瞭解,在各種實施 例中,當鍵為硫代磷酸酯鍵時,可使用替代性鍵(諸如本 文中所揭示之鍵)’例如可使用鱗酸g旨(碌酸二g旨)鍵,尤其 對於核苷類似物(諸如LNA單體)之間的鍵而言。同樣,當 提及特定間隙聚合物募核苷酸序列(諸如本文中所提供之 131124.doc -46- 200848077 間隙聚合物寡核苦酸序列)時,若胞σ密σ定鹼基之一或多者 表示為5-甲基胞嘧啶,則寡聚物中存在之其他胞嘧啶鹼基 可未經修飾。 寡聚物 ’ 在某些實施例中,本發明之寡聚物係選自由如表2中所 示之SEQ ID NO: 133-152組成之群。 • 在表2中,大寫字母指示核苷類似物單體且下標”s”表示 硫代磷酸酯鍵。小寫字母表示核苷(DNA)單體。不存在 ^ ns”(若存在)指示磷酸二酯鍵。 1 表2 寡聚物設計 SEQ ID NO 序列(5’-3’) 長度(鹼基) SEQIDNO: 133 GsAsAsasgscstsgsastsgsgsasCsCsA 16 SEQ ID NO: 134 CsAsGsascststsasasasgsastsGsGsC 16 SEQ ID NO: 135 CsAsGsasastscscsascstsgsgsTsGsA 16 SEQ ID NO: 136 GsCsAscstsgscscsaststststsAsGsC 16 SEQ ID NO: 137 GsTsAsastsasgscscsasasgsasAsTsT 16 SEQ ID NO: 138 AsCsTscstsgscststsgstsgsgsTsCsC 16 SEQ ID NO: 139 CsCsAscscsasgscststscstsasCsAsA 16 SEQ ID NO: 140 GsAsGstscscsasasasgsascsasGsTsT 16 SEQ ID NO: 141 AsCsCscsascststsgsgscsasgsAsCsC 16 SEQ ID NO: 142 GsCsAscsasasascsasastsgsgsAsAsT 16 SEQ ID NO: 143 GsCsAsgscstsascstscstststsGsGsA 16 SEQ ID NO: 144 CsTsCscscstscsasgscststscsAsAsT 16 SEQ ID NO: 145 GsCsAsgstscstscsaststscscsAsAsG 16 SEQ ID NO: 146 TsAsTscscsascscsasgsasgstsGsAsA 16 SEQ ID NO: 147 CsAsTscscsastsgsasgsgstscsCsTsG 16 SEQ ID NO: 148 CsCsAstscststsgstsgsastscsCsAsT 16 SEQ ID NO: 149 AsAsGscsasasgscsasasasgstsCsAsG 16 SEQ ID NO: 150 GsAsAsaststsgscstsgstsasgsCsAsG 16 SEQ ID NO: 151 GsTsGststscstsascsascscsasTsTsA 16 SEQ ID NO: 152 AsAsCsastsgsasasastsasgsasTsCsC 16 結合物 在本揭示中,術語π結合物π指示一種由本文中所述之募 聚物與一或多種自身不為核酸或單體之部分(π結合部分") 131124.doc -47- 200848077 共價連接(”結合丨丨)所來士 μ 人 )所形成的化合物。此等結合部分之 匕括大分子化合物,諸如蛋 、 蛋白、聚合物或其組合。通常,蛋白質可為目標蛋白之: 體。典型聚合物可為聚乙二醇。w7/咖91提供= 部分及結合物’該文獻係以引用的方式併入本文中。… 因此,本文中提供結合物’其包含如本文中所述之寡聚 物及至少一個不為核酸 連接。因* ― 之結合部分與該寡聚物共價 續單體組成,罝有如太令由力本發明之养聚物係由連 結合物亦可^ 文中所揭示之特定驗基序列,則該 / i3至少—個結合部分與該寡聚物共價連接。 …ΐ實施例中’該寡聚物與—個增加寡聚化合物之細 胞攝取的部分結合。 取結可增強本發明寡聚物之活性、細胞分布或細胞攝 部分包括(但不限於)抗體;多肽;脂質部分,諸 如膽固醇邱八么 日貝口丨刀 石1臃 ,硫醚,例如己基-s-三苯甲基硫醇,
硫代膽固醆· nt H 知,知族鏈,例如十二烷二醇或十一烷基殘基; 鱗月曰,例如_ —-十六烷基-rac_甘油或丨,2_二_鄰十六 rac_甘油其。 烷乙酸.土 膦酸三乙銨;多元胺或聚乙二醇鏈;金剛 _ γ &根1基部分;十八烧基胺或己基胺基-幾基-氧基 膽固醇部分。 本發明> t η 々忒物亦可與活性藥物物質(例如阿司匹林 (aspirin)、 p _ 々洛分(ibuProfen)、磺胺藥(sulfa drug)、抗糖 i/L、、母菌劑或抗生素)結合。 在*某坦j # 汽也例中,結合部分為固醇,諸如膽固醇。 131124.doc -48- 200848077 在各種實施例中,結合部分包含帶正電聚合物或由帶正 電聚合物組成,諸如長度為例如1-50、諸如2-20、諸如3-1〇個胺基酸殘基之帶正電肽,及/或聚烷醚(諸如聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇),參見w〇 2〇〇8/〇34123,其係以引用的 方式併入本文中。帶正電聚合物(諸如聚烷醚)可適宜地經 由連接子(諸如WO 2008/034123中所述之可釋放連接子)與 本發明之寡聚物連接。 活化募聚物 如本文中所用,術語”活化寡聚物,,係指與至少一個允許 秦聚物與一或多個結合部分(亦即,自身不為核酸或單體 之部分)共價鍵聯之官能部分共價鍵聯(亦即官能化)形成本 文中所述之結合物的本發明寡聚物。通常,官能部分將包 含能夠經由(例如)3’-羥基或腺嘌呤鹼基之環外nh2基團與 养♦物共彳貝鍵結之化學基團,在一些實施例中具有親水性 之間隔基及能夠與結合部分(例如,胺基、巯基或羥基)結 合之末端基團。在一些實施例中,此末端基團未經保護, 例如為NH2基團。在其他實施例中,末端基團係由(例如) 任何適合保護基(諸如Theodora W Greene及Peter G M Wuts 之’’Protective Groups in Organic Synthesis,,,第 3 版(John
Wiley & Sons,1999)中所述之保護基)保護。適合羥基保護 基之實例包括酯,諸如乙酸酯;芳烷基,諸如苄基、二苯 基甲基或三笨基甲基及四氫哌喃基。適合胺基保護基之實 例包括苄基、α-甲基苄基、二苯基曱基、三苯基甲基、苄 氧羰基、第三丁氧羰基及醯基(諸如三氯乙醯基或三氟乙 131124.doc -49- 200848077 醯基)。 在二貝施例中,g能部分係自裂解。在其他實施例 中g^刀可經生物降解。例如參見美國專利第 7,087,229號’其係以引用的方式全部併入本文中。 在-些實施例中’本發明之募聚物在5,端經官能化以允 許結合部分與募聚物之⑼共價連接。在其他實施例中, 本發明之寡聚物可在3’端處經官能化。在其他實施例中, 本發明之募聚物可沿主鏈或在雜環鹼基部分上經官能化。 在其他實施例中,纟發明之募聚物可在一個以上獨立地選 自5’端、31端、主鏈及鹼基之位置上經官能化。 在一些實施例中,本發明之活化募聚物係藉由在合成期 間併入一或多個與官能部分共價連接之單體來合成。在其 他貝轭例中,本發明之活化寡聚物係以未經官能化之單體 來合成’且寡聚物係在合成完成後經官能化。 在一些實施例中,募聚物係以含有胺基烷基連接子之位 阻酯來官能化,其中烷基部分具有式(CH2)w,其中〜為在1 至1〇之範圍内之整數,較佳為約6,其中烷基胺基之烷基 部分可為直鏈或支鏈,且其中官能基係經由酯基(_〇_c(〇)_ (CH2)WNH)與募聚物連接。 在其他實施例中,募聚物係以含有(CH2)W-巯基(SH)連接 子之位阻酯來官能化,其中w為在1至10之範圍内之整數, 較佳為約6,其中烷基胺基之烷基部分可為直鏈或支鏈, 且其中官能基係經由酯基與募聚物連 接。在一些實施例中,魏基活化之寡核苷酸係與諸如聚乙 131124.doc -50- 200848077 二醇之聚合物部分或肽(經由形成二硫鍵)結合。 與至少一個官能部分共價鍵聯之活化寡聚物可藉由此項 技術中已知之任何方法且尤其藉由美國專利公開案第 2004/023 5 773號(其係以引用的方式全部併入本文中)及
Zhao荨人 ’(2〇〇7) 1 19:143-152;及
Zhao寺人 ’(2005)价16:758-766 中所揭 示之方法來合成。 在其他實施例中,本發明之寡聚物係藉助於大體上如美 國專利第4,962,029號及第4,914,210號中所述之官能化試劑 (亦即,在經由親水性間隔基鏈與相對端鍵聯之一端處具 有胺基磷酸酯之大體上線性試劑,其包含經保護或未經保 護之巯基、胺基或羥基)藉由將巯基、胺基或羥基引入募 聚物中來官能化。此等試劑主要與募聚物之羥基反應。在 一些實施例中’此等活化寡聚物具有與募聚物之5,_經基偶 合之官能化試劑。在其他實施例中,活化寡聚物具有與3,_ 經基偶合之官能化試劑。在其他實施例中,本發明之活化 募聚物具有與寡聚物主鏈上之羥基偶合之官能化試劑。在 其他實施例中’本發明之募聚物係經一種以上如美國專利 第4,962,029號及第4,914,210號(其係以引用的方式全部併 入本文中)中所述之官能化試劑官能化。合成此等官能化 試劑且將其併入單體或募聚物中之方法係揭示於美國專利 第 4,962,029號及第 4,914,210號中。 在一些實施例中’固相結合之募聚物之5 ’末端係經二稀 基胺基磷酸酯衍生物官能化,接著去保護募聚物經由狄爾 131124.doc -51 - 200848077 斯-阿爾德(Diels-Alder)環加成反應與(例如)胺基酸或肽結 合。 在各種實施例中’將含有2f -糖修飾之單體(諸如2 胺基 曱酸酯取代糖或2^(0-戊基-N-鄰苯二醯亞胺基)_去氧核糖) 併入寡聚物中有助於結合部分與寡聚物之糖之共價連接。 在其他實施例中,使用諸如5^二甲氧基三苯曱基_2,_〇-(e-鄰苯二醯亞胺基胺基戊基)-2’-去氧腺苷-3,-N,N-二異丙基一 氣基乙氧基胺基鱗酸S旨之試劑來製備在一或多個單體之2,_ 位置處具有含胺基之連接子的募聚物。例如參見
Manoharan等人 ’ Tetrahedron Letters,1991,34,7 1 71 〇 在其他實施例中’本發明之募聚物在核鹼基上(包括在 N 6σ示吟胺基上’在鳥σ示σ令之ί衣外N 2上或在胞σ密U定之n 4或5 位置上)具有含胺之官能部分。在一些實施例中,可藉由 使用已在募聚物合成中經官能化之商業試劑來達成此官能 化。 一些官能部分可購得,例如,異雙官能及同雙官能鍵聯 部分係獲自Pierce Co.(Rockford,111.)。其他市售鍵聯基團 為5 ^胺基-修飾劑C 6及3 ’ -胺基-修飾劑試劑,兩者均獲自
Glen Research Corporation(Sterling,Va·)。5’-胺基-修飾劑 C6 亦以 Aminolink-2 獲自 ABI(Applied Biosystems Inc·, Foster City,Calif·),且 3’-胺基-修飾劑亦獲自 ci〇ntech Laboratories Inc.(Palo Alto,Calif·)。 組合物 本發明之募聚物可以醫藥調配物及組合物形式使用。此 131124.doc -52- 200848077 等組合物適宜地包含醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、越 或佐劑。wo _勒则提供適合且較佳之醫藥學上可接 受之稀釋劑、載劑及佐劑,該文獻係以引用的方式併入本 文中。適合劑量、調配物、投藥途徑、組合物、劑型、與 其他治療劑之組合、前_配物亦提供於WO 2007/03^ 中,其亦係以引用的方式併入本文中。 如本文中所用,術語丨丨馨龜與, 文中所鑑別化合物之所之鹽"係指保持本 初之所而生物活性且顯示可接受程度之 性效應之鹽。此等鹽之非限制性實例可由有機胺基 : 下各物形成之鹼加成鹽形成:金屬陽離子,諸如 辞、舞、祕、銷、鎮、銘、銅、始、録、锅、 類似物;或由氨、一 評及 四乙銨或伸乙基二胺二基 入^ 攻之%離子,或⑷⑷與(b)之組 &,例如,丹寧酸辞鹽或其類似物。 應用 提及之Γ =用之# m'係指現有疾病(例如如下文所 &及之疾m症)之治療或疾狀預 將認識到:在某些實施例中,"治療"包括預防因此 研:=之募聚物可用作用於(例如)診斷、治療及預防之 中用於_p制細胞及實驗動物 m魏且&解—連接蛋白 或其作為治療干預之目標i有效性的而=目標之功能分析 131124.doc -53· 200848077
現 在診斷學中’寡聚物可用於藉由北方墨點法、原位雜交 類似技術來偵測及定量細胞及組織中之β·連接蛋白表
對於治療學而言,藉由投與有效量之根據本發明之募聚 物(或其結合物)來治療疑似患有可藉由調節β_連接蛋白之 表現來治療之疾病或病症的非人動物或人。進一步提供藉 由投與治療或預防有效量之—或多種本發明之募聚物或: 合物來治療疑似患有或傾向於患上與Ρ-連接蛋白表現相關 之疾病或病狀之哺乳動物(諸如人)的方法。 本發明亦提供如所述之本發明之化合物或結合物的用 途’其係用於製造供治療如本文中所提及之病症用的藥 物,或用於治療如本文中所提及之病症的方法中。 本發明亦係關於一種如本文中所述之募聚物、組合物或 結合物,其係用作藥物。 本發明亦提供一種治療如本文中所提及之病症的方法, 該方法包含向有需要之患者投與有效量之如本文中所述之 根據本發明之化合物及/或有效量之根據本發明之結合物 及/或根據本發明之醫藥組合物。 在各種貝施例中,养聚物或其結合物經由(例如)與目標 核酸氫鍵結而在人類中誘導所需治療作用。寡聚物經由與 目標之mRNA氫鍵結(雜交)而使目標之表現降低(抑制),進 而使得基因表現降低。亦預計本文中所揭示之寡聚物及結 合物可具有非治療性應用,諸如診斷應用。 本發明之化合物極佳能夠藉由沃森-克里克鹼基配對而 131124.doc -54- 200848077 與目標核酸(諸如β·連接蛋白mRNA)雜交 醫學適應症 在某些治療實施例中’待治療之病症係選自由過度辦生 性病症(諸如癌症)組成之群,該癌症係、諸如選自由以;各 病組成之群:結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、惡性 黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂體癌、食道癌、肺癌、乳 癌、腎癌、造企系統癌症、子宮頸癌、CNs癌、骨癌、膽 道癌及腎上腺癌。 °
在某些實施例中,病症為選自由結腸直腸癌、肝細胞 癌子呂内膜癌及惡性黑素瘤組成之群的癌症。 在某些實施例中,病症為選自由肝癌及腎癌組成之群的 癌症。 在某些實施例中,疾病或病症與卜連接蛋白基因或其蛋 白質產物與卜連接蛋白相關或與卜連接蛋白相互作用之基 因(諸如APC基因)的突變有關。因此,在各種實施例中, 目標mRNA為β-連接蛋白序列之突變形式,舉例而言,其 可包含一或多個單點突變,諸如與癌症相關之SNp。 β-連接蛋白或APC基因之突變導致異常程度之β_連接蛋 白活性的此等疾病之實例為:(丨)結腸直腸癌,在所有情況 之大於70%情況下,APC與β-連接蛋白共同突變(?0〜61丨等 人,Nature,1992,· Morin等人,Science,1997 ;外純缚 人’ Cancer Res,1998); (2)肝細胞癌,在大於25%之情況 下,β-連接蛋白突變(de La Coste A,PNAS,1998); (3)子 宮内膜癌’ β-連接蛋白突變>10% ;及(4)惡性黑素瘤,β一 131124.doc -55- 200848077 連接蛋白突變 >100/〇(Rubinfeld等人,Science,1997)。 此等疾病之其他實例為卵巢癌、胰腺癌、垂體癌、食道 癌、肺癌、乳癌、腎癌、造血系統癌症、子宮頸癌、cNS 癌、骨癌、膽道癌及腎上腺癌。已展示連接蛋白或APc 基因之突變與該等疾病相關(癌症中體細胞突變之目錄係 獲自 Sanger lnstitute(英國)主頁 hUp://www sanger ac uk/)。 在某些實施例中’疾病或病症與β_連接蛋白之突變形式 之$ έ 1相關。在某些實施例中,疾病或病症與卜連接 蛋白之野生型形式之異常含量相關。本發明之一態樣係關 於一種治療罹患或易患上與β _連接蛋白之異常含量相關之 病狀的哺乳動物之方法,其包含向該哺乳動物投與治療有 效量之向β-連接蛋白之本發明寡聚物或其I種組合物或 結合物。在一些實施例中,寡聚物包含一或多個[ΝΑ單 元0 適合劑量、調配物、投藥途徑、組合物 治療劑之組合、前藥調配物亦提供於w〇 2〇〇7/〇31〇91中, ,文獻係以引用的方式併人本文中。本發明亦提供一種醫 藥組合物,其包含如本文中所述之化合物或結合物或結合 物及醫藥學上可接受之稀釋劑、载劑或佐劑。w〇 2007/〇31〇91提供適合且較佳之醫藥學上可接受之稀釋 劑、載劑及佐劑’該文獻係以弓丨用的方式併人本文中。 :外直:文中所述之本發明涵蓋—種預防或治療疾病之 二 向需要此療法之人投與治療有效量之調節卜 連接蛋白之募聚物。本發明進一步涵蓋短期投與調節卜連 131124.doc -56- 200848077 接蛋白之寡核苷酸化合物(募聚物或結合物)的用途。 在各種實施例中,本發明係關於一種治療異常含量之β_ 連接蛋白之方法,其包含投與⑴有效量之本發明之結合物 或其組合物’及(ii)有效量之第二藥劑。在一些實施例 中,泫結合物與該第二藥劑之投與係同時進行。在其他實 施例中,該結合物與該第二藥劑之投與係依次進行。通 常,該第二藥劑與寡聚物共價鍵聯,形成結合物。 其他實施例
以下為其他實施例,且可與上述實施例及隨附申請專利 範圍中列出之實施例組合: 1· 一種反義寡核苷酸(諸如寡聚物),其能夠與seq ID NO: 173之β-連接蛋白基因或其對偶基因之目標序列結合 且下調β·連接蛋自之表現,該募核:g:酸包含對應於該目標 序列之10-50個核鹼基之序列。 2.如實施例1之反義寡核苷酸,其中該目標序列係選自 由SEQ m NO: W32表示之β_連接蛋白基因或其對偶基因 變異體之區域。 3·如實施例1或實施例2之寡核苷酸,其包含seq idn〇 1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、 之10-16個核 55、56、57、58、73、88、103 及 118 中所示 驗基之序列或其對偶基因變異體。
其包含如SEQ ID 4·如實施例1-3中任一者之募核苷酸 NO: 1-132所示之序列。
其係由SEQ ID 5 ·如前述實施例中任一者之募核苷酸, 131124.doc -57- 200848077 NO: 133-172 表示。 6·如前述實施例中任一者之募核苷酸,其中該核鹼基序 列包含獨立地選自磷酸二酯、硫代磷酸酯及硼烷磷酸酯之 核驗基間鍵。 7·如前述實施例中任一者之寡核苷酸,其中該等核鹼基 之至少兩者為核苷酸類似物。 ’ 8·如實施例5之募核苷酸,其中該核鹼基序列在5,至3,方 向上包含⑴區域A : —段2-4個核苷酸類似物,接著(ii)區 1 域B •一段11個不同於區域A之核苷酸或核苷酸類似物, 接著(ill)區域C : 一段2-4個核苷酸類似物,及視情況接著 (iv)區域D : —或兩個核苷酸。 9 ·如貫施例8之寡核苷酸,其中該區域a在兩個核苷酸類 似物單元及/或一核苷酸類似物單元與區域B之一核鹼基單 元之間包含至少一個磷酸二酯鍵。 10·如實施例8或實施例9之寡核苷酸,其中區域C在兩個 I 核苷酸類似物單元及/或一核苷酸類似物單元與區域B之一 核鹼基單元之間包含至少一個磷酸二酯鍵。 11 ·如實施例1至6中任一者之寡核苷酸,其中所有該等 • 核鹼基間鍵均為硫代磷酸酯。 • 12 ·如實施例7至11中任一者之寡核苦酸,其中該等核苦 酸類似物單元獨立地選自2’·0-烷基-RNA、2,-胺基-DNA、 2匕氟-DNA、鎖定核酸(LNA)、阿拉伯糖核酸(ΑΝΑ)、2,__ 氟·ΑΝΑ、HNA、INA及 2’-MOE。 13 ·如實施例12之寡核誓酸’其中該等核普酸類似物獨 131124.doc -58- 200848077 立地選自 2,-M0E-RNA、2,-氟-DNA 及 LNA。 14·如實施例13之寡核苷酸,其中該等核苷酸類似物之 至少一者為鎖定核酸(LNA)。 1 5 ·如貫施例丨4之寡核苷酸,其中所有該等核苷酸類似 物均為LNA。 16·如實施例丨2至15中任一者之募核苷酸,其中lNA係 選自β-D-氧基_LNA、a_L-氧基_LNA、β_〇_胺基―以^及卜 D-硫基-LNA。
1 7· —種結合物,其包含如前述實施例中任一者之募核 苷fee及至少一個與该养核苷酸共價連接之非核苷酸或非聚 核苦酸部分。 18.如實施例17之結合物,其中該非核苦酸或非聚核苦 酸部分係由諸如膽固醇之固醇基團組成或包含諸如膽固醇 之固醇基團。 19·一種醫藥組合物,其包含如實施例丨至η中任一者之 寡核苷酸或如實施例17或實施例18之結合物,及醫藥學上 可接受之稀釋劑、載劑或佐劑。 2 0.如實施例1至1 8中任一者之寘松讧分 τ你有之养核苷酸或結合物,苴传 用作藥物。 八 21. 一種如實施例1至18中任-者之寡核苦酸或結合物之 用途,其彻於製造供治療異f含量之μ接蛋白•連 接蛋白表現下調所指示之疾病或病狀用的藥物。 22. 如實施例2!之用途’其,該疾病或病狀為癌症。 23. 一種治療罹患癌症之個體的方法,該方法包含以下 131124.doc •59- 200848077 步驟:向有需要之該個體投與如實施例丨至19中任一者之 醫藥組合物、寡核苷酸或結合物。 24·如實施例21-23中任-者之用途或方法,其中該癌症 惡性黑素 乳癌、腎 膽道癌及 係選自結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜痒 瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂體癌、食道癌、肺癌 癌、造血系統癌症、子宮頸癌、CNS癌、骨癌 腎上腺癌。
25.-種β-連接蛋白基因内之目標序列,其中對應於該目 標序列之反義募核苷酸能夠下調卜連接蛋白之表現。 26·如實施例25之目標序列,i中哕 八Τ Θ目軚序列係選自與 SEQ ID NO: Μ32互補之β·連接蛋白基因或其對偶基因變 異體之區域。 27·—種下調細胞中之β-連接蛋白表現的方法,其包含使 該細胞與如實施例1-16中任一者之募核苷酸接觸。各 實例 實例1 :單艎合成 根據公開程序及其中引用之參考文獻來製備LNA單體架 構基塊及衍生物’參見WO 07/03 1081及其中引用之表' 獻。 $考文 實例2 :寡核苷酸合成 根據WO 07/〇31〇81中所述之方法來合成募核苦酸。表工 展示本發明之反義寡核苷酸基元之實例。 實例3 :寡核苷酸之設計 根據本發明,使用公開序列(GenBank寄存編龙 131124.doc -60· 200848077 NM—001904,在本文中呈現為SEQ ID NO: 173),設計一 系列寡核苷酸以靶向人類β-連接蛋白mRNA之不同區域。 表2展示本發明之寡聚物設計。表3展示24聚體序列基 元,可自其設計本發明之寡聚物,粗體類型表示併入較長 寡聚物中之如表1中所示之16聚體序列基元。 表3 P-連接蛋白24聚體序列 16聚體SEQ ID 短聚合物 SEQ ID 化合物ID 24聚體SEQ ID 24聚體 SEQ ID SEQ ID NO: 1 2-15 133-153 tttagaaagcteatesaccataac 174 SEQ ID NO: 16 134-154 cctccagacttaaaeateeccagt 175 SEQ ID NO: 17 135-155 aacacagaatccactseteaacca 176 SEQ ID NO: 18 19-32 136-156 aaac2cact2ccatttta2ctcct 177 SEQ ID NO: 33 137-157 tgtcstaatagccaaeaatttaac 178 SEQ ID NO: 34 35-48 138-158 cagcactctgcttetsstccacag 179 SEQ ID NO: 49 139-159 cattccaccaecttctacaatagc 180 SEQ ID NO: 50 140-160 ctgagactccaaasacasttctga 181 SEQ ID NO: 51 141-161 taccacccacttsscasaccatca 182 SEQ ID NO: 52 142-162 asct2cacaaacaate2aatsgta 183 SEQ ID NO: 53 143-163 ccctgcasctactctttgsatgtt 184 SEQ ID NO: 54 144-164 gtggctccctcascttcaatagct 185 SEQ ID NO: 55 145-165 atcaecastctcattccaaeccat 186 SEQ ID NO: 56 146-166 sccatatccaccaeastcaaaaga 187 SEQ ID NO: 57 147-167 agcccatccateasstcctssgca 188 SEQ ID NO: 58 59-72 148-168 aattccatcttstcatccattctt 189 SEQ ID NO: 73 74-87 149-169 ttcaaagcaascaaaetcaetacc 190 SEQ ID NO: 88 89-102 150-170 attaeaaattgctgtagcagtatt 191 SEQ ID NO: 103 104-117 151-171 attaetsttctacaccattactca 192 SEQ ID NO: 118 119-132 152-172 caaaaacatsaaatacatccacct 193 實例4 :活體外模型:細胞培養物 可於多種細胞類型之任一者中測試反義寡核苷酸對目標 核酸表現之影響,其限制條件為存在可量測之量的目標核 酸。可内源性表現目標核酸或藉由瞬間或穩定轉染來表現 該目標核酸。可使用(例如)北方墨點分析、即時PCR、核 糖核酸酶保護檢定來常規測定目標核酸之表現量。出於說 131124.doc -61 - 200848077 明性目的可提供以下細胞類型,但常規可使用其他細胞類 型,其限制條件為目標係於所選細胞類型中表現。將細胞 於如下文所述之適當培養基中培養且保持在37°C、95%-98%濕度及5% C02下。細胞常規每週傳代2-3次。 SW480 :將人類結腸直腸癌細胞株SW480於L-15培養基 (Leibovitz)+10%胎牛血清(FBS) + Glutamax I +pen/strep 中 培養。 HCT116 :將人類結腸直腸癌細胞株HCT116於McCoy’s 5a改良培養基(Sigma)+1 0%月台牛血清(FBS) + Glutamax I +pen/strep 中培養。 實例5 :活體外模型:用反義寡核苷酸處理 使用陽離子脂質體調配物LipofectAMINE 2000(Gibco)作 為轉染媒劑,用寡核苷酸來處理細胞。將細胞於6孔細胞 培養盤(NUNC)中接種且在75°/。-90%長滿時進行處理。所 用寡核苷酸濃度係在1 nM至25 nM最終濃度之範圍内。使 用不含血清之OptiMEM(Gibco)及最終脂質濃度為10 pg/mL 之LipofectAMINE 2000,基本上如製造商所述進行寡核苷 酸-脂質複合物之調配。將細胞在37°C下培育4小時且藉由 移除含寡核苷酸之培養基來停止處理。洗滌細胞且添加含 血清之培養基。在募核苦酸處理後,回收細胞歷時2 0小 時,隨後將其收集以進行RNA分析。 實例6 :活體外模型:RNA之萃取及cDNA合成 對於自細胞株分離RN A而言,根據由製造商提供之方案 來使用RNeasy微型套組(Qiagen目錄號74104)。 131124.doc -62- 200848077 使用來自Ambion之逆轉錄酶試劑根據製造商說明書來 進行第一鏈合成。
Kg總RNA用不含RNase之H20調 對於各樣品而言,將0.5 節至10·8 μΐ且與2 μΐ無規十聚體(5〇 _)及4 μ1 dNTP混合物
7熱至7〇C歷時3分鐘,隨後將該 在於冰上冷卻樣品之後,將2 μΐ 緩衝液 RT、1 μΐ MMLV 逆轉錄酶(1〇〇 u/|lU)及 〇25 μ1 RNase抑制劑(10 υ/μ1)添加至各樣品中,接著在42。〇下培 月60刀名里,在95 C下將酶熱滅活! 〇分鐘,且隨後將樣品冷 卻至4°C。 實例7 :活體外模型:藉由即時pCR分析卜連接蛋白表現 之寡核苷酸抑制作用 可以此項技術中已知之多種方式來檢定β_連接蛋白表現 之反義調節。舉例而言,可藉由(例如)北方墨點分析、競 爭性聚合酶鏈反應(PCR)或即時PCR來定量β_連接蛋白 mRNA含量。目前較佳為即時定量PCR。可對全細胞RNA 或mRNA進行RNA分析。RNA分離及RNA分析之方法(諸如 北方墨點分析)為此項技術中之常規方法且教示於(例 如)Current Protocols in Molecular Biology,j〇hn Wiley and
Sons 中。 可使用獲自Applied Biosystem之市售多色即時PcR偵測 系統(Multi-Color Real Time PCR Detection System)來便利 地實現即時定量PCR。 131124.doc -63- 200848077 P-連接蛋白mRNA含量之即時定量PCR分析 使用人類 β-連接蛋白 ABI Prism Pre-Developed TaqMan檢 定試劑(Applied Biosystems 目錄號Hs00170025—ml)根據製 造商說明書來定量人類β-連接蛋白mRNA之樣品含量。 使用甘油酸-3-磷:酸酷脫氫酶(GAPDH)mRNA量作為内源 性對照物以正規化樣品製備中之任何方差。 使用人類 GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan檢定 試劑(Applied Biosystems目錄號4310884E)根據製造商說明 書來定量人類GAPDH mRNA之樣品含量。即時定量PCR為 此項技術中熟知之技術且教示於(例如)Heid等人,Real time quantitative PCR, Genome Research (1996),6: 986-994 中。
即時PCR 將來自如實例8中所述進行的第一鏈合成之CDNA稀釋2_ 20 次,且使用來自 Applied Biosystems 之 Taqman 7500 FAST藉由即時定量PCR來分析。將引子及探針與 2xTaqman Fast Universal PCR 母混合液(Applied Bio systems目錄號4364 103)混合兩次且添加至4 μΐ cDN A中 至最終體積為1 〇 μΐ。一式三份來分析各樣品。檢定已自表 現所關注RNA之細胞株純化之物質上製備的cdNA之2倍稀 釋液,產生用於檢定之標準曲線。使用無菌H20替代cDNA 作為無模板對照物。PCR程式:95°C下30秒;接著40個週 期之 95°C 下 3秒、60°C 下 30秒。使用 Applied Biosystems Fast System SDS軟體1·3·1·21版,根據所計算之臨限週期 131124.doc -64- 200848077 來測定目標mRNA序列之相對量。 實例8 :活體外分析:寡核苷酸對人類p-連接蛋白表現之 反義抑制 在SW4 80細胞中在1 nM、5 nM及25 nM之濃度下對來自 表2之寡核苷酸評估其敲除β-連接蛋白mRNA之能力(參見 圖2)。結果列於表4中,其中資料係以在5 nM下β-連接蛋 白mRNA相對於經模擬物轉染細胞之下調百分比形式呈 現。小寫字母表示DNA單體,粗體大寫字母表示β-D-氧 基-LNA單體。所有LNA單體之胞嘧啶鹼基均為^曱基胞嘧 啶。下標nsn表示硫代磷酸酯鍵。 表4. '、' 測試物質 序列(5,·3,) . ' ' '' -,' P-連接蛋白 谈制%) SEQIDNO: 153 GsAsAsasgscstsgsastsgsgsasCsCsA 88.11% SEQIDNO: 154 CsAsGsascststsasasasgsastsGsGsC 86.4% SEQ ID NO: 155 CsAsGsasastscscsascstsgsgsTsGsA 76.6% SEQ ID NO: 156 GsCsAscstsgscscsaststststsAsGsC 89.2% SEQ ID NO: 157 GsTsAsastsasgscscsasasgsasAsTsT 56.4% SEQ ID NO: 158 AsCsTscstsgscststsgstsgsgsTsCsC 77.6% SEQ ID NO: 159 CsCsAscscsasgscststscstsasCsAsA 49.7% SEQ ID NO: 160 GsAsGstscscsasasasgsascsasGsTsT 60.1% SEQ ID NO: 161 AsCsCscsascststsgsgscsasgsAsCsC 75.6% SEQ ID NO: 162 GsCsAscsasasascsasastsgsgsAsAsT 10.8% SEQ ID NO: 163 GsCsAsgscstsascstscstststsGsGsA 48.3% SEQ ID NO: 164 CsTsCscscstscsasgscststscsAsAsT 35.5% SEQ ID NO: 165 GsCsAsgstscstscsaststscscsAsAsG 25.5% SEQ ID NO: 166 TsAsTscscsascscsasgsasgstsGsAsA 27.3% SEQ ID NO: 167 CsAsTscscsastsgsasgsgstscsCsTsG 24.5% SEQ ID NO: 168 CsCsAstscststsgstsgsastscsCsAsT 74.4% SEQ ID NO: 169 AsAsGscsasasgscsasasasgstsCsAsG 87.5% SEQ ID NO: 170 GsAsAsaststsgscstsgstsasgsCsAsG 91.5% SEQ ID NO: 171 GsTsGststscstsascsascscsasTsTsA 94.9% SEQ ID NO: 172 AsAsCsastsgsasasastsasgsasTsCsC 93.6% SEQ ID NO: 194 CsGsTscsasgstsastsgscsgsAsAsTsc 131124.doc -65- 200848077 如表 4 中所示,SEq ID NO: 153、154、i55、、 H 161、168、169、170、171及172之寡核苦酸在該等 實驗中在5 nM下顯示約74%或更大之β_連接蛋白出尺^^八表 現之抑制且因此較佳。 亦較佳為基於所說明之反義寡聚物序列之寡核苷酸,例 如改變長度(較短或較長)及/或單體含量(例如,核苷類似 物單體之類型及/或比例),其亦提供β_連接蛋白表現之良 好抑制。 實例9 :活體外分析:β_連接蛋白含量之西方墨點分析
藉由西方墨點法來測定寡聚化合物對轉染細胞中卜連接 蛋白含量之活體外影響。將200,000個如實例5中所述經寡 核苷酸轉染之SW480細胞收集且溶解於補充有蛋白酶抑制 片丨J k匕合液(Roche)之RIPA溶胞緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 7·4、150 mM NaC卜 1 mM EDTA、1% Triton X-100、〇.1% SDS、1%去氧膽酸納)中。使用BCA蛋白質檢定套組 (Pierce)來量測總蛋白濃度。根據製造商說明書 (Invitrogen)將50 pg總蛋白於3%-8%三羥甲基胺基甲烧乙 酸鹽(Tris Acetate)凝膠上操作且點塗於PVDF膜上。在於阻 斷緩衝液(補充有5%低脂奶粉之PBS-T)中隔夜培育後,用 抗-β-連接蛋白抗體(BD Transduction laboratories)將該等膜 培育隔夜。使用來自Neomarker之單株抗體偵測作為對照 物之負載微管蛋白。隨後用二次抗體培育膜且使用化學發 光ECL+偵測套組(Amersham)來目測β-連接蛋白或微管蛋 白。參見圖3。 131124.doc -66- 200848077 實例10:量測增殖活細胞(MTS檢定) 在轉染前一天將HCT11 6結腸直腸癌細胞在6孔培養盤中 在 McCoy’s 5a 改良培養基(Sigma M8403)+2 mM Glutamax I(Gibco 35050-038)+10% FBS(Brochrom #193575010)+25 pg/μΐ 健他黴素(Gentamicin)(Sigma G1397 50 mg/ml)中接種 至每孔200,000個細胞之密度。第二天移除培養基,接著 添加 1.2 ml 含有 7.5 pg/ml 月旨質體(Lipofectamine)2000 (Invitrogen)之OptiMEM。將細胞培育7分鐘,隨後添加0.3 f \ K ml稀釋於OptiMEM中之寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度為25 nM。在處理4小時後,移除培養基且將細胞胰蛋白酶化且 於清潔的96孔培養盤(Scientific Orange第1472030100號)中 於 100 μΐ McCoy’s 5a改良培養基(Sigma M8403) + 2 mM Glutamax I(Gibco 35050-038)+10% FBS(Brochrom #193575010)+ 25 pg/μΐ健他黴素(Sigma G1397 50 mg/ml)中接種至每孔 5000個細胞之密度。在藉由添加10 μΐ四唑鑌化合物[3-g (4,5-二甲基-2-基)-5-(3 -叛基曱氧基苯基)-2_(4_石黃酸基苯 基)-2H-四唑鏽内鹽;MTS]及電子偶合試劑(吩嗪硫酸乙 酯;PES)(CellTiter 96⑧水性單溶液細胞增殖檢定 ’ (AQueous One Solution Cell Proliferation Assay), 、 Promega)所示之時刻量測活細胞。用Powerwave(Biotek
Instruments)在490 nm下量測活細胞。將OD490 nm對時間/ 小時繪圖(參見圖4)。 實例11 :小鼠肝臟中β-連接蛋白mRNA之抑制作用 連續三天經靜脈内向NMRI小鼠投與25 mg/kg募核苷酸 131124.doc -67- 200848077 (SEQ ID NO: 156、158、168、169、171)(組大小為 5 隻小 鼠)。將反義寡核苷酸溶解於0.9%生理食鹽水(NaCl)中。 在最後一次給藥後24小時將動物處死,且對肝組織取樣且 將其儲存於RNA later中,直至RNA萃取及QPCR分析。萃 ’ 取總RNA且使用小鼠β-連接蛋白QPCR檢定(目錄號
Mm00483033—m 1,Applied Biosystems)藉由如實例 7 中所 • 述之QPCR來量測肝臟樣品中之β-連接蛋白mRNA表現。將 結果正規化為小鼠GAPDH(目錄號4352339E,Applied f
Biosystems)且相對於經生理食鹽水處理之對照物繪圖,參 見圖5。 實例12 :製備SEQ ID NO: 161與聚乙二醇之結合物 具有 SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 168 及 SEQ ID NO: 1 7 1之寡聚物分別藉由使用常規胺基磷酸酯化學將胺基烷 基(諸如經諸如Fmoc之阻斷基團阻斷之己-1-胺)與寡聚物之 5’磷酸酯基團連接,氧化所得化合物,將其去保護且將其 , 純化以達成官能化寡聚物而於5’末端上經官能化,該等官 1 能化募聚物具有式(ΙΑ)、(IB)及(1C): • 0
. II 一 Ρ一〇 一 AsMeCsMeCscsascststsgsgscsa^sAsMeCsMeC——OH 〇 (ΙΑ) Ο
一Ρ — 〇-MeCsMeCsAstscststsgstsgsastscsMeC5AsT一OH 〇- (IB) 131124.doc -68- 200848077
0-P-Ο-G ST sGststsCs^asCsasCsCgagTs T SA-OH 〇- (1C) 其中SEQ ID NO: 161、168及171中之粗體大寫字母及下標 ”s”具有與上述相同之含義,且MeC為5-甲基胞嘧啶。 將活化PEG(諸如式(II)中所示之活化PEG):
其中該PEG部分具有12,000之平均分子量,及各式(IA)、 (IB)及(C)之化合物於PBS緩衝液中之溶液在室溫下在單獨 容器中攪拌12小時。將反應溶液用二氯甲烷萃取三次且將 經合併之有機層經硫酸鎂乾燥且過濾,且在減壓下蒸發溶 劑。將所得殘餘物溶解於雙蒸餾水中且裝載於陰離子交換 管柱上。將未反應之PEG連接子用水溶離且將產物用 NH4HC03溶液溶離。將含有純產物之溶離份彙集且凍乾, 分別得到結合物SEQ ID NO: 161、168及171,如式 (ΠΙΑ)、(IIIB)及(IIIC)中所示:
/X^N^^^^O-P-O-AsCsCsCsasCststsgsgsCsasgACsC-OH 〇- (ΠΙΑ)
131124.doc -69- 200848077 其中SEQ ID NO: 161、168及171之募聚物各自經由連接子 與平均分子量為12,000之PEG聚合物連接。 特定實施例,參考文獻之引用 本發明之範,並*受本文巾所述之特定實施例限制。實 際上,根據前述描述及隨附圖式,除本文中所述者之外的 對本發明之各種修改對於熟習此項技術者而言將變得顯而 易見。此等修改意欲處於隨时請專利範圍之範嘴内。 包括專利中請案、專利及科學公開案之各種參考文獻係 引用於本文中’各茶考文獻之揭示内容係以引用的方式全 部併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖 1 由分別具有 SEQ ID NO: h 16、17、18、33、34、 49、50、51、52、53、54、55、%、57、58、73、88、
1〇3及U8之序列之募聚㈣向的卜連接蛋白序列係以粗體 且加下劃線展示’指示其〇•連接蛋白轉錄物(GenBanW 存編號 NM 一 001904-SEQIDNO: 173)中之位置。 圖2在SW480細胞轉染後24小日寺時正規化為GApDH之卜 連接蛋白表現。 囷3由西方墨點法量測之經濃度為i咖及5 nM之募核苦 酸轉染之SW彻細胞中之β_連接蛋白含量。使用微管蛋白 染色作為裝載對照物且使用SEQIDn〇:194作為雜亂對照 寡核苷酸。 圖4在轉染後不同時間點在經濃度為25 nM之寡核芽酸轉 染之HCTU6細胞中使用MTS檢以加例形式量測之細胞 131124.doc -70- 200848077 增殖。使用模擬物轉染細胞及經SEQ ID NO: 194(雜亂對 照物)轉染之細胞作為對照物。 圊5在用3x25 mg/kg寡核苷酸經靜脈内處理後由QPCR量 測之小鼠肝中相對於生理食鹽水處理對照物之β-連接蛋白 ^ mRNA表現。β-連接蛋白表現經正規化為GAPDH且相對於 4 生理食鹽水處理對照物來繪製結果。
‘ 圊6具有寄存編號ΝΜ_001904.3之人類β-連接蛋白mRNA 之核苷酸序列。 f 131124.doc 71
Claims (1)
- 200848077 十、申請專利範圍: 1· 一種由10至50個連續單體組成之寡聚物,其中相鄰單體 係藉由鱗酸S旨基或硫代磷酸自旨基共價鍵聯, 其中該寡聚物包含至少1 〇個連續單體之第一區域; 其中該第一區域之至少一個單體為核苷類似物; ,其中該第一區域之序列與哺乳動物β_連接蛋白 (catenin)基因或哺乳動物β_連接蛋白mRNA之最佳比對目 標區域之反向互補序列至少8〇%一致。 2·如凊求項1之养聚物,其中該第一區域之序列與SEq出 NO: 1-132、174-192或193中存在之一個至少1〇個連續單 體之區域的序列至少80%—致。 3·如凊求項2之泰聚物,其中該第一區域之序列與sEq出 NO: 58、103、189或192中存在之一個至少1〇個連續單 體之區域的序列至少80% —致。 4·如請求項2之寡聚物,其中該第一區域之序列與SEQ m NO: 168或171中存在之一個至少10個連續單體之區域的 ^ 序列至少80%—致。 5·如請求項1或2之寡聚物,其中與哺乳動物卜連接蛋白基 因或哺乳動物β-連接蛋白mRNA之反向互補之最佳比對 區域的序列相比,該第一區域之序列包含〇至2個錯配。 6.如請求項1-4中任一項之募聚物,其中該寡聚物之第一區 域係由1〇至18個連續單體組成。 7·如請求項6之寡聚物,其中該募聚物之第一區域係由16 個連續單體組成。 131124.doc 200848077 :求項1-4中任-項之募聚物,其中各核普類似物獨立 地廷自由LNA單體、含有2,_〇-烷基_核糖之單體、含有 一甲基核糖之單體、含有2’-胺基-去氧核糖之單體及 含有2’氟-去氧核糖之單體組成之群。 9·如巧求項8之募聚物,其中該核苷類似物為LNA單體。 1。·如請求们之寡聚物,其中該寡聚物為間隙?:合物 (gapmer),且其中該間隙聚合物自5,端至3,端包含:(1)區域A,其係由丨_6個連續單體組成,其中至少一個 單體為核苷類似物; (11)區域B,其5,端與區域A之3,端共價鍵聯,且其係由 -12個連續單體組成’其中至少—個單體為核苦;及 ㈣區域C ’其5,端與區域3之3,端共價鍵聯,且其係 由1-6個連續單體組成,其中至少—個單體為核苦類似 物0 11.如請求項H)之寡聚物,其中該寡聚物為間隙聚合物,且 其中該間隙聚合物自5,端至3,端包含·· ⑴區域A,其係由2·5個連續單體組成,其中所有單體 均為核苷類似物; _ (Π)區域Β’其5,端與區域八之3,端共價鍵聯,且其係由 6-10個連續單體組成’其中所有單體均為核芽;及 ㈣區域C,其5,端與區_之3,端共價鍵聯,且直係 由2-5個連續單體組成,其中所有單體均為核普類似物^ 12·如請求項H)或^之寡聚物,纟中所有核|類似 LNA單體。 ^ 131124.doc 200848077 13·如請求項1之募聚物,其中該募聚物係選自: 5f-MeC Mep s CsAstsCststsgstsgsastscsMeCsAsT-3f(SEQ ID Ν〇· 168) •,及 · τ s sGststscstsascsascscsasTsTsA-3,(SEQ ID NO: 171), 其中大寫字母表示卜D-氧基_LNA單體,小寫字母表示 A單體,下標”s”表示硫代磷酸酯鍵,表示含有^ 甲基胞嘧啶鹼基之β-D-氧基_LNA單體。 、'員1 4、1 〇、11及13中任一項之募聚物,其抑制表 現卜連接蛋白之細胞中人類β_連接蛋白基因或mRNA之 表現。 15. I種結合物,其包含如請求項丨_13中任一項之寡聚物共 饧連接於至少一個不為核酸或單體之部分。 種商藥組合物,其包含如請求項1-13中任一項之寡聚 物或如請求項15之結合物,及醫藥學上可接受之稀釋 劑、载劑、鹽或佐劑。 抑制細胞中β_連接蛋白表現的活體外方法,其包含 =4細胞與有效量之一種由10至50個連續單體組成之寡 接觸,其中相鄰單體係由磷酸酯基或硫代磷酸酯基 共價鍵聯, 其中該寡聚物包含至少10個連續單體之第一區域; 其中該第一區域之至少一個單體為核苷類似物; 其中該第一區域之序列與哺乳動物β-連接蛋白基因或 甫礼動物卜連接蛋白mRNA之最佳比對目標區域之反向 互補序列至少80%一致。 131124.doc 200848077 1 8· —種抑制細胞中卜連接蛋白表現的活體外方法,其包含 使鑪細胞與有效量之如請求項。之結合物接觸。 19· 一種由1〇至5〇個連續單體組成之寡聚物之用途,其係用 於製造供抑制哺乳動物組織中卜連接蛋白表現的藥物, 其中該募聚物之相鄰單體係由磷酸酯基或硫代磷酸酯基 共價鍵聯, 其中该养聚物包含至少丨0個連續單體之第一區域; 其中該第一區域之至少一個單體為核苷類似物; 其中該第一區域之序列與哺乳動物卜連接蛋白基因或 哺乳動物β-連接蛋白mRNA之最佳比對目標區域之反向 互補序列至少80% —致。 2〇· —種如請求項15之結合物之用途,其係用於製造供抑制 哺乳動物之組織中β-連接蛋白表現的藥物。 21·種由10至50個連續單體組成之寡聚物之用途,其係用 於製造供治療哺乳動物癌症的藥物,其中該寡聚物之相 W單體係由球酸酯基或硫代磷酸酯基共價鍵聯, 其中該寡聚物包含至少10個連續單體之第一區域; 其中該第一區域之至少一個單體為核苷類似物; 其中該第一區域之序列與哺乳動物卜連接蛋白基因或 哺乳動物卜連接蛋白mRNA之最佳比對目標區域之反向 互補序列至少80% —致。 22·如请求項21之用途,其中該癌症係選自結腸直腸癌、肝 、、、田胞癌、子宮内膜癌、惡性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、 垂體癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎癌、造血系統癌症、 131124.doc 200848077 子宮頸癌、中樞神經系統癌症、骨癌、膽道癌及腎上腺 癌。 23· —種由10至50個連續單體組成之活化募聚物,其中相鄰 單體係由鱗酸酯基或硫代罐酸酯基共價鍵聯,其中該活 化募聚物包含至少一個官能基共價連接於一或多個獨立 ‘選自5’端、3’端、核糖之2,-〇h及鹼基之位置。 24· —種由10-25個單體組成之寡聚物,其中相鄰單體係由磷 酸酯基或硫代磷酸酯基共價鍵聯, 其中遠养聚物包含由1 0-24個單體組成之第一區域, 其中該第一區域之序列同樣存在於SEq ID No: 189或 SEQ ID No: 192 中,或其中當與 SEq ID n〇: 189 或 SEQ ID No: 192之最佳比對區域相比時,該第一區域之序列 包含不多於一個錯配。 131124.doc
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