JP2010524486A - β−カテニンを調節するためのＲＮＡアンタゴニスト化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞におけるβ−カテニンｍＲＮＡを標的とし、β−カテニンの発現を低減させる、オリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。β−カテニンの発現の低減は、癌を含めた過剰増殖性疾病など、さまざまな内科的疾患にとって有益である。本発明は、オリゴマーを含む治療用組成物、および、治療方法を含めた、前記オリゴマーを用いてβ−カテニンの発現を調節する方法を提供する。

Description

本発明は、細胞におけるβ−カテニンｍＲＮＡを標的としてβ−カテニンの発現の低減に導くオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。β−カテニン発現を低減することは、癌を含めた過剰増殖性疾病などのさまざまな内科的疾患にとって有益である。本発明は、オリゴマーを含む治療用組成物、および、治療方法を含めた、前記オリゴマーを用いてβ−カテニンの発現を調節する方法を提供する。

β−カテニン（カドヘリン結合タンパク質およびβ−カテニンとしても知られている）は、細胞質タンパク質のカテニンの種類の１つであり、複数の発達過程の伝達物質であるＷｎｔタンパク質によって開始されるシグナリング経路において中心的役割を果たす。β−カテニンは、成長因子の刺激によりリン酸化され、その結果、細胞の接着性が低減する。

癌の発生におけるβ−カテニンの役割は、ＡＰＣ（結腸の腺腫様ポリープ）遺伝子の発現産物により調節されることが示されてきた。ＡＰＣ腫瘍抑制タンパク質はβ−カテニンに結合し、一方β−カテニンはＴｃｆおよびLｅｆ転写因子と相互作用することが示された。Ｍｏｒｉｎらは、ＡＰＣタンパク質が、結腸癌においてβ−カテニンおよびＴｃｆ−４により媒介される転写活性化をダウンレギュレートすると報告している。彼らの結果は、β−カテニンの調節がＡＰＣ腫瘍抑制効果にとってきわめて重要であること、および、この調節がＡＰＣまたはβ−カテニンのいずれかにおける突然変異によって回避され得ることを示している。複数の研究が、さまざまな癌細胞株におけるβ−カテニンの突然変異検出について報告しており、メラノーマ細胞株において異常に多い量のβ−カテニンが確認されている。

Ｍｏｒｉｎらは、リン酸化部位に影響を及ぼすβ−カテニンの突然変異によって、細胞がβ−カテニンのＡＰＣ媒介性ダウンレギュレーションに感応しなくなり、この途絶された機序が結腸直腸腫瘍形成にとってきわめて重要であることを示した（非特許文献１）。

Ｂｅｎｎｅｔｔらに発行された特許文献１は、β−カテニンの発現を調節するためのアンチセンス化合物、組成物および方法について記載している。

米国特許第６，０６６，５００号明細書

Ｍｏｒｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７， ２７５， １７８７−１７９０

癌の発生におけるβ−カテニンの示唆を考慮すると、β−カテニンの機能を有効に阻害する能力のある薬剤が依然として必要とされている。

本発明は、合計１０〜５０個の核酸塩基の隣接した核酸塩基配列を含む、長さ１０〜５０個の核酸塩基のオリゴマーであって、前記隣接した核酸塩基配列が、哺乳動物のβ−カテニンをコードする核酸の対応領域と少なくとも８０％の相同性を有しているオリゴマーを提供する。

本発明は合計１０〜５０個の核酸塩基の隣接した核酸塩基配列を含む長さ１０〜５０個の核酸塩基のオリゴマーであって、前記隣接した核酸塩基配列が、配列番号１７３および配列番号１７４〜１９３からなる群より選択される核酸配列の対応領域と少なくとも８０％の相同性を有しているオリゴマーを提供する。

本発明は合計１０〜５０個の核酸塩基の隣接した核酸塩基配列を含む長さ１０〜５０個の核酸塩基のオリゴマーであって、前記隣接した核酸塩基配列が、配列番号１〜１３２からなる群より選択される核酸配列の対応領域と少なくとも８０％の相同性を有しているオリゴマーを提供する。

本発明はさらに、本発明に係るオリゴマーを含む複合体、例えばオリゴマーの核酸塩基配列に加えて、本発明のオリゴマーに共有結合により連結された少なくとも１つの非ヌクレオチド（すなわち非核酸塩基）または非ポリヌクレオチド部分を含む複合体を提供する。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、コレステロールなどのステロール基または細胞内への進入を容易にするその他の部分から構成されるか、またはこれらを含んでいてよい。

本発明は、本発明に係るオリゴマーを含む複合体、例えば、オリゴマーの核酸塩基配列に加えて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの正電荷部分を含むポリマー複合体を含む複合体を提供する（すなわち、本発明に係るオリゴマーは、随意的にＰＥＧ化されていてよい）。

本発明は、本発明のオリゴマーまたは定義された通りの複合体と、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。

本発明はさらに、医薬用途のための、本発明に係るオリゴマーを提供する。

本発明はさらに、本明細書中で言及されている疾病のうちの１つ以上、例えば癌などの本明細書中で言及されているような過剰増殖性疾病から選択される疾病の治療用の薬剤の製造を目的とする本発明のオリゴマーの使用を提供する。

本発明はさらに、癌などの本明細書中で言及されている疾病のうちの１つ以上のものの治療に使用するため、本発明に係るオリゴマーを提供する。

本発明のオリゴマーまたは複合体を含む医薬組成物およびその他の組成物も同様に提供されている。さらには、インビトロまたはインビボで細胞または組織を本発明のオリゴマー、複合体または組成物のうちの１つ以上と接触させるステップを含む、細胞または組織におけるβ−カテニンの発現をダウンレギュレートする方法を提供する。

同様に、本発明のオリゴマー、複合体または組成物のうちの１つ以上を、治療上または予防上有効な量で、動物またはヒトに投与することによって、β−カテニンの発現または過剰発現に関連する疾病または病状を有することが疑われるか、またはその罹患傾向が疑われる動物またはヒトを治療する方法について開示する。

さらに、β−カテニンの発現阻害およびβ−カテニン活性に関連する疾病の治療のためにオリゴマーを使用する方法も提供されている。

本発明は、癌などの過剰増殖性疾病などの本明細書中で言及されているような疾病または疾患を治療する方法であって、本発明に係るオリゴマー、複合体または医薬組成物を、必要としている患者に投与するステップを有してなる方法を提供する。

本発明は、細胞または組織におけるβ−カテニンの発現を阻害または低減する方法であって、β−カテニンの発現が阻害または低減されるように本発明に係るオリゴマー、複合体または医薬組成物と前記細胞または組織を接触させるステップを有してなる方法を提供する。

本発明は、癌細胞などの細胞においてアポトーシスをひき起こす方法であって、β−カテニンの発現が阻害または低減されかつ／またはアポトーシスがひき起こされるような形で本発明に係るオリゴマー、複合体または医薬組成物と前記細胞または組織を接触させるステップを有してなる方法を提供する。

本発明はさらに、配列番号１〜１３２および配列番号１７４〜１９３からなる群より選択される配列、例えば配列番号１８９、１９２、５８および１０３からなる群より選択される配列に対応する領域に対して少なくとも８０％の相同性を有する隣接した核酸塩基配列を含むかまたはそれからなるオリゴマーを提供する。

本発明はさらに、配列番号１７４〜１９３からなる群より選択される、例えば配列番号１８９または１９２などの配列に存在する等価の配列に対応する隣接した核酸塩基配列を含むかまたはそれからなるオリゴマーを提供する。

本発明はさらに、配列番号１３３〜１７４からなる群より選択される、例えば配列番号１６８または１７１などの配列を含むまたはそれからなる、或いは前記配列に対応する隣接した核酸塩基配列を含むかまたはそれからなるオリゴマーを提供する。

関連出願

以下の関連出願は、参照することにより本明細書に援用される：米国仮特許出願第６０／９１５，３７１号明細書および米国仮特許出願第６１／０２３，２４４号明細書。

それぞれ配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８のオリゴヌクレオチド配列に対応するβ−カテニン標的配列は、ボールド体で示され、下線がほどこされており、β−カテニン翻訳におけるそれらの位置を表わしている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１９０４−配列番号１７３）。 ＳＷ４８０細胞におけるトランスフェクションから２４時間後にＧＡＰＤＨに正規化されたβ−カテニン発現。 ウェスタンブロット法によって測定された１および５ｎＭの濃度のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニンタンパク質含有量。負荷対照としてチュブリン染色を使用し、スクランブル対照オリゴヌクレオチドとして配列番号１９４を使用した。 トランスフェクション後のさまざまな時点のＯＤ４９０として測定された２５ｎＭの濃度のオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞における、ＭＴＳアッセイを用いて測定された細胞増殖。対照として、モックトランスフェクトされた細胞および配列番号１９４を用いてトランスフェクトされた細胞（スクランブル対照）を使用した。 ３×２５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの静脈内投与での治療後、ＱＰＣＲによって測定されたマウスの肝臓における生理食塩水処理した対照と比較した、β−カテニンｍＲＮＡ発現。β−カテニンの発現をＧＡＰＤＨに正規化し、結果を、生理食塩水処理した対照と比較してプロットした。

オリゴマー
本発明は、配列番号１７３に示されているβ−カテニン核酸などの哺乳動物β−カテニンをコードする核酸分子、および哺乳動物β−カテニンをコードする、これら核酸分子の天然の対立遺伝子変異体の機能の調節に使用するため、オリゴマー化合物（本明細書ではオリゴマーと称する）を利用する。

本発明との関連において「オリゴマー」という用語は、２つ以上の核酸塩基の共有結合による連結により形成される分子（すなわちオリゴヌクレオチド）を意味する。本明細書では、各々の単一の核酸塩基は、モノマーまたは単位とも称される。オリゴマーは、長さが核酸塩基１０〜５０個である隣接した核酸塩基配列からなるか、長さが核酸塩基１０〜５０個である隣接した核酸塩基配列で構成されている。１つのオリゴマーは、好ましくはロックされた核酸（ＬＮＡ）を含めた、本明細書中で言及されているような天然ヌクレオチド単位、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）または核酸類似体、またはそれらの混合物で構成されていて差し支えない。したがってそれには、天然の核酸塩基、糖、および核酸塩基間の連結からなるオリゴマー、ならびに同様に機能するか、または特定の改善された機能を伴って機能する、非天然の核酸塩基を有するオリゴマーが含まれる。完全にまたは部分的に修飾された、または置換されたオリゴマーは、これらのオリゴマーが有する複数の望ましい特性、例えば細胞膜に侵入する能力、細胞外および／または細胞内ヌクレアーゼに対する優れた耐性および核酸標的に対する高い親和力および特異性などを理由として、多くの場合、天然型よりも好ましい。ＬＮＡ類似体は、例えば上述の特性に関して、特に好適である。したがって、極めて好ましい実施形態においては、本発明に係るオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体単位の両方、例えばＬＮＡ単位から構築されるか、または、ヌクレオチド類似体単位のさまざまな集団から構築されて、核酸塩基１０〜５０個のオリゴヌクレオチド、好ましくは核酸塩基１０〜２５個、より好ましくは核酸塩基１０〜１６個、さらに一層好ましくは核酸塩基１２〜１６個のオリゴヌクレオチドを形成する。

さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、ＲＮＡ（単位）を含まない。本発明に係る化合物は、直鎖分子であるかまたは、直鎖分子として合成されることが好ましい。オリゴマーは１本鎖分子であり、例えば、同一のオリゴマー（２重鎖である）内の等価の領域に対し相補的な、少なくとも３、４、または５個の隣接核酸塩基からなる短い領域を含まないことが好ましい。この点において、オリゴマーは（本質的に）２本鎖ではない。さまざまな実施形態において、オリゴマーは、ｓｉＲＮＡが２本鎖ではないのと同様に、本質的に２本鎖ではない。オリゴマーは、１つの隣接した核酸塩基配列を含むか、または１つの隣接した核酸塩基配列からなる。さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、すべて、隣接した核酸塩基配列から構成されて差し支えない。さまざまな実施形態において、オリゴマーの核酸塩基配列は、隣接した核酸塩基配列からなる。

標的
本明細書中で使用する「標的核酸」という用語は、配列番号１７３などのヒトβ−カテニンのような乳動物β−カテニンポリペプチドをコードするＤＮＡ、核酸をコードするβ−カテニン、またはその天然変異体、およびそれから誘導されたＲＮＡ核酸のことをいい、好ましくはｍＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ前駆体であり、成熟ｍＲＮＡであることが好ましい。さまざまな実施形態において、例えば、研究または診断に使用される場合、「標的核酸」は、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的から誘導された合成オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡであってよい。本発明に係るオリゴマー化合物は、好ましくは、標的核酸にハイブリッド形成することができる。

「標的核酸」という用語は、さまざまな実施形態において、例えば、登録番号Ｘ８９５７９、Ｘ８９５９３、Ｘ８９５９２、Ｘ８９５９１、Ｘ８９５８８、Ｘ８９５８５、Ｘ８９５８４およびＸ８９５７８を有するヒト遺伝子エクソン、または、配列番号１７３などの哺乳動物β−カテニンｍＲＮＡであってよい。その他の哺乳動物β−カテニンｍＲＮＡの例としては、登録番号ＮＭ＿００１０９８２０９、ＮＭ＿００１０９８７２１０（ヒトβ−カテニンｍＲＮＡ）；ＮＭ＿００７６１４（マウスβ−カテニンｍＲＮＡ）；ＮＭ＿０５３３５７（ラットβ−カテニンｍＲＮＡ）；ＮＭ＿００１１２２７６２、ＤＱ２６７４９１（ウマβ−カテニンｍＲＮＡ）；ＮＭ＿２１４３６７（ブタβ−カテニンｍＲＮＡ）；ＢＣ１１９９４９、ＢＴ０３０６８３（ウシβ−カテニンｍＲＮＡ）があるが、これらに限定されるわけではない。当然のことながら、上述の登録番号は、ｍＲＮＡ配列そのものではなくｃＤＮＡ配列を意味するが、成熟ｍＲＮＡ配列は当然ｃＤＮＡ配列から直接誘導することが可能であり、チミン（Ｔ）残基は、ウラシル（Ｕ）残基によって置き換えられている、ということを認識すべきである。

本明細書で使用されている「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオチド／核酸塩基の塩基間の、ワトソン−クリック、フーグスティーン、逆フーグスティーン水素結合などであり得る水素結合を意味する。ワトソンおよびクリックはおよそ５０年前に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が、２本鎖における相対する相補的核酸塩基間で形成される水素結合によりらせん立体配置にまとめられた２本鎖で構成されているということを示した。ＤＮＡ内に一般的に見出される４つの核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であり、そのうちＧ核酸塩基はＣと対合し、Ａ核酸塩基はＴと対合する。ＲＮＡ中、核酸塩基チミンは核酸塩基ウラシル（Ｕ）により置換され、この核酸塩基ウラシル（Ｕ）はＴ核酸塩基と同様Ａと対合する。標準的２重鎖形成に関与する核酸塩基内の化学基は、ワトソン−クリック面を構成する。フーグスティーンはその２〜３年後に、プリン核酸塩基（ＧおよびＡ）がそのワトソン−クリック面に加えて、２重鎖の外側から認識可能であり水素結合を介してピリミジンオリゴヌクレオチドを結合させて３重らせん構造を形成するのに使用され得るフーグスティーン面を有することを示した。

本発明の化合物が、ｍＲＮＡなどの標的核酸に対してハイブリッド形成できることがきわめて好ましい。

適切には、本発明のオリゴマーまたは複合体は、β−カテニン遺伝子の発現をダウンレギュレートするなどの阻害能力を有する。さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、標的核酸に結合し、正常な発現レベルに比べて少なくとも１０％または２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の発現阻害をもたらす。一部の実施形態では、かかる調節は、１ｎＭと２５ｎＭの本発明のオリゴマーまたは複合体を用いた場合に見られる。同一または異なる実施形態では、発現阻害は１００％未満、例えば阻害９８％未満、阻害９５％未満、阻害９０％未満、阻害８０％未満、例えば阻害７０％未満である。発現レベルの調節は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥと、後続する標的タンパク質に発生させた適切な抗体を用いたウェスタンブロット法などの方法によって、タンパク質レベルを測定することにより決定してよい。或いは、発現レベルの阻害などの調節は、例えばノーザンブロット法または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどによりｍＲＮＡレベルを測定することによって決定可能である。ｍＲＮＡレベルを介して測定を行う場合、１ｎＭおよび２５ｎＭなどの適切な投薬量を使用した場合の阻害またはダウンレギュレーションのレベルは、さまざまな実施形態において、典型的に、本発明の化合物の不在下での正常レベルの１０〜２０％のレベルである。

したがって、本発明は、β−カテニンタンパク質および／またはｍＲＮＡを発現している細胞においてβ−カテニンタンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法であって、前記細胞内でβ−カテニンタンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートまたは阻害するために、前記細胞に対し本発明に係るオリゴマーまたは複合体を投与するステップを有してなる方法を提供する。適切には、細胞はヒト細胞などの哺乳動物の細胞である。投与は、さまざまな実施形態において、インビトロで行なわれてよい。投与は、さまざまな実施形態においてインビボで行なわれてよい。

本明細書で使用されている「標的核酸」という用語は、配列番号１７３などのヒトβ−カテニンなどの哺乳動物のβ−カテニンポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。核酸をコードするβ−カテニンまたはその天然の変異体およびそれから誘導されたＲＮＡ核酸、好ましくはｍＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ前駆体などであるが、好ましくは成熟ｍＲＮＡである。さまざまな実施形態において、例えば研究または診断において使用される場合、「標的核酸」は、上述のＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的から誘導される合成オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡであってよい。本発明に係るオリゴマーは好ましくは、標的核酸にハイブリッド形成できる。

「その天然の変異体」という用語は、マウス、サルおよび好ましくはヒトなどの哺乳動物のような明確な分類群における、天然β−カテニンポリペプチドまたは核酸配列の変異体を意味する。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然の変異体」に言及する場合、この用語は同様に、染色体の転座または重複により染色体Ｃｈｒ３：４１．２２−４１．２６Ｍｂに見出されるβ−カテニンをコードするゲノムＤＮＡのあらゆる対立遺伝子変異体、およびそれから誘導されたｍＲＮＡなどのＲＮＡも包含してよい。特異的ポリペプチド配列について言及される場合、例えば、この用語は、シグナルペプチドの開裂、タンパク質分解性の開裂、グリコシル化など、翻訳と同時または翻訳後の修飾によりプロセシングされ得る、タンパク質の天然の形態をも含む。

「少なくとも１つ」という用語は、１以上の整数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などを含む。

さまざまな実施形態、例えば本発明の化合物の核酸またはタンパク質標的に言及する場合などにおいて、「少なくとも１つ」という用語には、「少なくとも２つ」および「少なくとも３つ」および「少なくとも４つ」という用語が含まれ、同様に、「少なくとも２つ」という用語は、「少なくとも３つ」および「少なくとも４つ」という用語が含まれうる。

配列
本発明のオリゴマーは、ヒトβ−カテニンｍＲＮＡを標的として差し支えなく、かくして、配列番号１７３内に存在するヌクレオチド配列または配列番号１〜１３２からなる群より選択される配列に対応する隣接した核酸塩基配列を含むか、またはこれで構成され、ここで前記オリゴマー（またはその隣接核酸塩基部分）は随意的に、前記選択される配列に対する１個、２個または３個のミスマッチを含んでいてよい。さまざまな実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、１０〜１６個の（隣接）核酸塩基の配列からなるかまたはこれらを含んでいる。１６個の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列の例が、配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８中に示されている。より短い配列をこれから誘導することができる。より長い配列は、それぞれの配列番号からのすべてのまたは少なくとも１０個の核酸塩基を含み得る。

本発明はさらに、β−カテニン遺伝子内の標的配列、特に配列番号１〜１３２に対応するもの（すなわちその逆補体）において、前記標的配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）がβ−カテニンをダウンレギュレートできる標的配列を提供する。例えば、それぞれアンチセンスオリゴヌクレオチド配列である配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８に対応する標的配列が、図１中に示されている（上述の対応するオリゴ配列番号を伴い、ボールド体で下線付き）。

本発明のオリゴマーは、適切には、配列番号１７４〜１９３から選択される配列を含むかまたはこれからなるか、またはこれから誘導されていてよい（例えば前記配列ＩＤ内に見出される対応する隣接した核酸塩基配列を含んでいる）。好ましくは、配列は、１０〜１６個の核酸塩基の配列を含む。１６個の核酸塩基を含む配列の例は、配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８からなる群より選択される配列ＩＤ中に示されている。したがって、１０、１１、１２、１３、１４または１５個などのように核酸塩基数が比較的少ない配列は、例えば配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８内に見出される少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個または１５個の隣接核酸塩基のサブ配列に対応する隣接した核酸塩基配列を有し得る。したがって、それから比較的短い配列を誘導することができる。比較的長い配列は、これらの例示された配列番号からのすべてのまたは少なくとも１０個の核酸塩基を含んでいてよい。典型的には、配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８から選択される配列ＩＤ内にオリゴヌクレオチドの配列の一部のみが存在する場合には、オリゴヌクレオチドの配列の残りの部分は、前記配列ＩＤにフランキングする対応するヌクレオチドと相同である。２つの有利な配列モチーフは配列番号５８および配列番号１０３である。

本発明のオリゴマーの具体的設計、例えば配列番号１３３〜１５２、特に配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１４１、１４８、１４９、１５０、１５１および１５２に示されているものも同様に開示されている。例えば配列番号１５３〜１７２、特に配列番号１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１６１、１６８、１６９、１７０、１７１および１７２に示されているものなどのＬＮＡオリゴヌクレオチドの具体的設計も同様に開示されている。好ましい実施形態においては、本発明のオリゴマーは、β−カテニンｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の強力な阻害物質であるものと考えられている。

特定の実施形態では、オリゴマーは、哺乳動物β−カテニンをコードする核酸の等価領域に対する全面的相補性（完全相補性）を有する隣接した核酸塩基配列を含むか、またはこれから成っていてよい。

しかしながら、一部の実施形態では、オリゴマーは、標的配列にハイブリッド形成する場合、１、２、３または４個（またはそれ以上）のミスマッチを含み、それでも十分に標的に結合して所望の効果すなわち標的のダウンレギュレーションを示す。ミスマッチは例えば、オリゴマー核酸塩基配列の長さの伸長および／または核酸塩基配列内部に存在するＬＮＡなどのヌクレオチド類似体の数の増加により補償され得る。

さまざまな実施形態において、隣接した核酸塩基配列は、哺乳動物β−カテニンをコードする核酸の対応する領域などの標的配列に対する３個以下、例えば２個以下のミスマッチを含む。

さまざまな実施形態において、隣接した核酸塩基配列は、哺乳動物β−カテニンをコードする核酸の対応する領域などの標的配列に対するミスマッチを２個以上含まない。

本発明のオリゴマーの核酸塩基配列または隣接した核酸塩基配列は、好ましくは、配列番号１〜１３２からなる群より選択される対応配列に対して少なくとも８０％の相同性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性、例えば１００％の相同性（同一性）を有する。

本発明のオリゴマーの核酸塩基配列または隣接した核酸塩基配列は、好ましくは、配列番号１７３中に存在する対応配列に対して少なくとも８０％の相同性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性、例えば１００％の相同性（同一性）を有する。

本発明のオリゴマーの核酸塩基配列または隣接した核酸塩基配列は、好ましくは、配列番号１７３中に存在するサブ配列に対して少なくとも８０％の相補性、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％の相補性、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、例えば１００％の相補性（完全な相補性）を有する。

さまざまな実施形態において、オリゴマー（またはその隣接核酸塩基部分）は、配列番号１〜１３２または配列番号１７４〜１９３からなる群より選択される配列の１つ、またはその少なくとも１０個の隣接核酸塩基のサブ配列から選択されるかまたはそれを含み、ここで前記オリゴマー（またはその隣接核酸塩基部分）は随意的に前記選択される配列に対する１個、２個または３個のミスマッチを含んでいてよい。

さまざまな実施形態において、サブ配列は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９の隣接核酸塩基、例えば１０〜１５、１２〜２５、１２〜２２個、例えば１２〜１８個の核酸塩基から成っていてよい。適切には、さまざまな実施形態において、サブ配列は、本発明のオリゴマーの隣接した核酸塩基配列と同一の長さを有する。

しかしながら、さまざまな実施形態において、オリゴマーの核酸塩基配列は、標的配列に対し非相補的である、さらなる５’または３’核酸塩基、例えば独立して１、２、３、４または５個のさらなる核酸塩基５’および／または３’を含んでいてよい、ということが認識されている。この点において、本発明のオリゴマーは、さまざまな実施形態において、さらなる核酸塩基により５’および／または３’でフランキングされている隣接した核酸塩基配列を含んでいてよい。さまざまな実施形態において、隣接した核酸塩基配列の３’末端は、１、２または３個のＤＮＡまたはＲＮＡ単位によりフランキングされている。３’ＤＮＡ単位は、オリゴマーの固相合成に頻繁に使用される。同一であっても異なるものであってもよいさまざまな実施形態において、隣接した核酸塩基配列の５’末端は、１、２、または３個のＤＮＡまたはＲＮＡ単位によってフランキングされる。さまざまな実施形態において、さらなる５’または３’核酸塩基は、天然のヌクレオチド例えばＤＮＡまたはＲＮＡである。さまざまな実施形態において、さらなる５’または３’核酸塩基は、本明細書中でギャップマーオリゴマーに関連して言及される領域Ｄを表わし得る。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号１に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号１６に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号１７に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号１８に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号３３に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号３４に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号４９に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５０に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５１に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５２に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５３に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５４に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５５に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５６に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５７に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号５８に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号７３に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号８８に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号１０３に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、配列番号１１８に従った核酸塩基配列またはそのサブ配列からなるかまたはこれで構成されている。

本発明のオリゴマー（または隣接した核酸塩基配列）と本明細書中で開示されているような哺乳動物β−カテニンをコードする核酸の間の「相同性」または「相補性」を決定する場合、相同性の決定は、本発明の化合物の対応する核酸塩基配列および哺乳動物β−カテニンをコードする核酸（すなわち標的核酸）の対応領域またはその補体の単なるアラインメントによって行なってよく、相同性は、整列する塩基の数を計数し本発明の化合物（オリゴマー）内の隣接核酸塩基の合計数により除し、１００を乗じることにより決定される。かかる比較においては、ギャップが存在する場合、かかるギャップは、ギャップ内の核酸塩基数が本発明の核酸塩基配列と標的核酸の間で異なっている領域ではなく、むしろ単にミスマッチであることが好ましい。

アミノ酸およびポリヌクレオチド相同性は、標準的環境を用いてＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して決定可能である。.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html、方法：ＥＭＢＯＳ：：ｗａｔｅｒ（ｌｏｃａｌ）：Ｇａｐ Ｏｐｅｎ＝１０．０、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ＝０．５、ヌクレオチド／核酸塩基配列用ＤＮＡｆｕｌｌまたはＢｌｏｓｕｍ ６２（タンパク質）を使用、を参照のこと。ヒト由来のβ−カテニンをコードする核酸および異なる哺乳動物種由来のβ−カテニンをコードする核酸の両方の等価の領域に対する１００％の相補性を有する少なくとも１０、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１８、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８の隣接核酸塩基の領域からなるかまたはこれらで構成されているオリゴマーなどの、ヒトβ−カテニン標的核酸および異なる哺乳動物種内に存在する対応する核酸の両方を標的とするオリゴヌクレオチドの設計を可能にするのに十分な核酸相補性の広がり（stretch）が存在する場合、かかるアラインメントは同様に、ヒトおよびサル、マウスおよび／またはラットなどの異なる哺乳動物種に由来するβ−カテニンをコードする核酸の領域を特定するためにも使用可能である。

さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、ヒト由来のβ−カテニンをコードする核酸およびβ−カテニンをコードするマウス核酸などの異なる哺乳動物種由来のβ−カテニンをコードする核酸の両方の対応する領域に対する少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％または１００％の相同性を有する（すなわちヒトおよびマウスの両方の配列に対する等価領域の両方に対し８０％〜１００％の相補性を有する）隣接した核酸塩基配列を含むかまたはそれからなる。オリゴマーの隣接した核酸塩基配列は、ヒトβ−カテニンｍＲＮＡの等価領域に対する１００％の相補性を有することが好ましい。

「〜に対応する」（「corresponding to」および「corresponds to」）という用語は、オリゴマーまたは隣接した核酸塩基配列の核酸塩基配列と、ｉ）配列番号１７３などの、β−カテニンタンパク質をコードするｍＲＮＡなどの核酸標的の逆補体および／またはｉｉ）配列番号１〜１３２または配列番号１７４〜１９３からなる群などの本明細書中で提供されているヌクレオチドの配列という等価ヌクレオチド配列との間の比較を意味する。ヌクレオチド類似体は、その等価物または対応するヌクレオチドと直接比較される。

「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類似体における核酸塩基と天然のヌクレオチドが同一であることを示すことが意図されている。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンに連結されている場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結された（２−デオキシリボースとは異なる）ペントース単位を含む。

長さ
オリゴマーは、合計１０〜５０個の核酸塩基、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の隣接核酸塩基の長さの隣接した核酸塩基配列を含むか、またはこれからなる。

さまざまな実施形態において、オリゴマーは、合計１０〜２５、１０〜２４、１２〜２５、１２〜２４または１０〜２２個、例えば１２〜１８、例えば１３〜１７または１２〜１６個、例えば１３、１４、１５、１６個の隣接核酸塩基という長さの隣接した核酸塩基配列を含むか、またはこれからなる。

さまざまな実施形態において、オリゴマーは、合計１０、１１、１２、１３または１４個の隣接核酸塩基という長さの隣接した核酸塩基配列を含むか、またはこれからなる。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、２２個以下の核酸塩基例えば２０個以下の核酸塩基、例えば１８個以下の核酸塩基、例えば１５、１６または１７個の核酸塩基からなる。さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、２０個未満の核酸塩基を含む。

ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体
本明細書で使用する「ヌクレオチド」という用語は、糖部分、塩基部分および共有結合により連結されたリン酸基を含むグリコシドを意味し、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの両方の天然ヌクレオチドを網羅するが、好ましくはＤＮＡである。修飾された糖および／または塩基部分を含む非天然ヌクレオチドは、本明細書において「ヌクレオチド類似体」と称される。「核酸塩基」という用語は、天然（ＤＮＡまたはＲＮＡタイプ）のヌクレオチドならびにヌクレオチド類似体の両方を包含するように使用されている。

非天然ヌクレオチドは、修飾糖部分を有するヌクレオチド、例えば二環式ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチド例えば２’置換ヌクレオチドを含む。

「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分内の修飾による、天然ヌクレオチドの変異体、例えばＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドなどである。類似体は、本質的に、オリゴヌクレオチドに関連しては天然ヌクレオチドと「等価である」か、または単に「サイレント」であり得る、すなわちオリゴヌクレオチドが標的遺伝子の発現を阻害する作用をするような機能的効果を一切有していない可能性がある。それでも、このような「等価」類似体は、例えば、製造がより容易または安価であるか、または貯蔵または製造条件に対しさらに安定しているか、或いはまたタグまたは標識である場合には、有益であるかもしれない。しかしながら、類似体は、例えば標的に対する結合親和力の増加および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増加および／または細胞内への輸送容易性の増大を生み出すことにより、オリゴマーが発現を阻害する作用をするような機能的効果を有することが好適である。

「核酸塩基」という用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を包含する総称として用いられる。核酸塩基配列は、少なくとも２つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む配列である。さまざまな実施形態において、核酸塩基配列はＤＮＡ単位などのヌクレオチドのみで構成されていてよく、別の実施形態においては、核酸塩基配列はＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体のみで構成されていてよく、またさまざまな実施形態において、核酸塩基配列はヌクレオチドとヌクレオチド類似体単位の両方を含んでいてよい。

「核酸」という用語は、２つ以上のヌクレオチドの共有結合による連結により形成された分子として定義される。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で同義的に使用される。

核酸塩基の「塩基部分」は、天然ならびに非天然の両方の核酸塩基の塩基を網羅する。したがって塩基部分は、公知のプリンおよびピリミジンの複素環のみならず、複素環類似体およびその互変異性体も網羅する。

かかる塩基部分の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

さまざまな実施形態においては、オリゴマー内に存在する核酸塩基の少なくとも１つが、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンからなる群より選択されるような修飾塩基を含む。

ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体の具体例は、例えばＦｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３によって、および以下のスキーム１に記載されている：

スキーム１
したがってオリゴマーは、天然ヌクレオチド、好ましくは２’−デオキシヌクレオチド（ここでは一般に「ＤＮＡ」と呼ばれる）の単純配列のみならず場合によってはリボヌクレオチド（ここでは一般に「ＲＮＡ」と呼ばれる）、またはかかる天然ヌクレオチドおよび１つ以上の非天然ヌクレオチドの組合せ、すなわちヌクレオチド類似体を含むか、またはそれからなる。かかるヌクレオチド類似体は、適切には、標的配列に対するオリゴマーの親和力を増強し得る。

適切なおよび好ましいヌクレオチド類似体の例は、参照することにより本明細書に援用される国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット中に記載されているか、またはその中で言及されている。ヌクレオチドの１つの好ましい修飾には、糖部分が修飾されて２’−置換基を提供するか、または、結合親和力を増強し、恐らくは幾分かのヌクレアーゼ耐性の増大をも提供する架橋（ロックされた核酸−ＬＮＡ）構造を生成し、ヌクレオチド間連結をその正常なホスホジエステルからホスホロチオエートまたはボラノホスフェート（これら２つは、ＲＮａｓｅＨにより開裂され、β−カテニン発現を調節する上であのアンチセンス阻害経路をも可能にする）などのヌクレアーゼ攻撃に対する耐性がさらに高いホスホジエステルへと修飾されているヌクレオチドが含まれる。親和力増強ヌクレオチド類似体をオリゴマー例えばＬＮＡまたは２’−置換された糖に取込むことで、特異的に結合するオリゴマーのサイズを低減することができ、同様に、非特異的または異常な結合が発生する前のオリゴマーのサイズまで上限を低減することができる。

さまざまな実施形態において、オリゴマーは少なくとも２個のヌクレオチド類似体を含む。一部の実施形態では、オリゴマーは３〜８個のヌクレオチド類似体、例えば６個または７個のヌクレオチド類似体を含む。一部の好ましい実施形態においては、前記ヌクレオチド類似体のうち少なくとも１個は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）である。例えば、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または８個がＬＮＡであってよい。一部の実施形態では、すべてのヌクレオチド類似体はＬＮＡであってよい。

ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する場合、その配列により定義される本発明のオリゴマーは、オリゴマー／標的２重鎖の２重鎖安定性／Ｔｍを上昇させるＬＮＡ単位またはその他のヌクレオチド類似体（すなわち親和力増強ヌクレオチド類似体）などのように、前記配列内に存在するヌクレオチドのうちの１個以上に代って対応するヌクレオチド類似体を含んでいてよい、ということが認識されるであろう。

さまざまな実施形態において、オリゴマーのヌクレオチド配列と標的配列の間にミスマッチがある場合、それらは好ましくは、親和力増強ヌクレオチド類似体の外側の領域（例えば領域ＡおよびＣ）内、例えば本明細書で言及される領域Ｂおよび／または本明細書で言及されている領域Ｄの内部、および／またはオリゴヌクレオチド内の非修飾の例えばＤＮＡヌクレオチドの部位、および／または隣接した核酸塩基配列に対して５’または３’にある領域内に見出される。

ヌクレオチドのかかる修飾の例としては、糖部分を修飾して２’−置換基を提供するか、または、結合親和力を増強させてヌクレアーゼ耐性の増加をも提供しうる架橋（ロックされた核酸）構造を生成することが含まれる。

好ましいヌクレオチド類似体はＬＮＡ、例えばオキシ−ＬＮＡ（例えばβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、およびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）、および／またはアミノ−ＬＮＡ（例えばβ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）および／またはチオ−ＬＮＡ（例えばβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）および／またはＥＮＡ（例えばβ−Ｄ−ＥＮＡおよびα−Ｌ−ＥＮＡ）である。さまざまな実施形態において、ＬＮＡ単位はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。

一部の実施形態においては、本発明のオリゴマーの内部（例えば本明細書中で言及した領域ＡおよびＢ内）に存在するヌクレオチド類似体は独立して、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（インターカレート核酸、参照することにより本明細書に援用されるＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，２００２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００２ ３０：４９１８−４９２５）単位および２’ＭＯＥ単位から選択される。さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーまたはその隣接した核酸塩基配列には上述のタイプのヌクレオチド類似体は１個しか存在しない。

さまざまな実施形態において、ヌクレオチド類似体は２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡ−モノマーまたはＬＮＡヌクレオチド類似体であり、したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３つのタイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体類を含んでいてよく、そうでなければ３つのタイプから選択される１つのタイプの類似体のみを含んでいてよい。さまざまな実施形態において、前記ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１個が２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチド単位である。さまざまな実施形態において、前記ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも１個が２’−フルオロＤＮＡ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチド単位である。

さまざまな実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、少なくとも１個のロックされた核酸（ＬＮＡ）単位、例えば１、２、３、４、５、６、７または８個のＬＮＡ単位、例えば３〜７個または４〜８個のＬＮＡ単位、または、３、４、５、６または７個のＬＮＡ単位を含む。さまざまな実施形態において、すべてのヌクレオチド類似体はＬＮＡである。一部の実施形態において、オリゴマーはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、または以下のＬＮＡ単位のうちの１個以上の両方を含んでいてよい：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／またはβ−Ｄまたはα−Ｌ立体配置のいずれかのＥＮＡ、またはそれらの組合せ。さまざまな実施形態において、すべてのＬＮＡシトシン単位は、５’メチル−シトシンである。本発明のさまざまな実施形態において、オリゴマーはＬＮＡおよびＤＮＡ単位の両方を含んでいてよい。好ましくは、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の組合せ合計は１０〜２５個、好ましくは１０〜２０個、さらに一層好ましくは１２〜１６個である。本発明のさまざまな実施形態においては、オリゴマーの核酸塩基配列、例えば隣接した核酸塩基配列は、少なくとも１個のＬＮＡからなり、残りのヌクレオチド単位はＤＮＡ単位である。さまざまな実施形態において、オリゴマーは、随意的にホスホロチオエートなどの修飾連結基を伴って、ＬＮＡヌクレオチド類似体および天然ヌクレオチド（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）のみを含む。

さまざまな実施形態において、オリゴマー中に存在する核酸塩基のうちの少なくとも１つが５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンからなる群より選択される修飾塩基を有する。

ＬＮＡ
「ＬＮＡ」という用語は、「ロックされた核酸」として公知の二環式ヌクレオチド類似体を意味する。それは、ＬＮＡモノマーを意味してもよく、そうでなければ、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」またはＬＮＡ「オリゴマー」に関連して使用される場合、１個以上のかかる二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴマーを意味する。

本発明のオリゴマーの中で使用されるＬＮＡは好ましくは、

という一般構造式Ｉの構造を有し、
式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ*）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６*）−から選択され；
Ｂは、水素、随意的に置換されたＣ_１−４−アルコキシ、随意的に置換されたＣ_１−４−アルキル、随意的に置換されたＣ_１−４−アシルオキシ、核酸塩基、ＤＮＡインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、リポーター基、およびリガンドから選択され；
Ｐは、後続するモノマーに対するヌクレオチド間連結または５’末端基のためのラジカル位置を表わし、かかるヌクレオチド間連結または５’末端基は随意的に置換基Ｒ^５を含むか、または置換基Ｒ^５*も同様に適用可能であり；
Ｐ^*は、先行するモノマーに対するヌクレオチド間連結または３’末端基を表わし；
Ｒ^４*およびＲ^２*は一緒になって、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−Ｓ−、−ＳＯ_２−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−および＞Ｃ＝Ｚから選択される１〜４基／原子からなるビラジカルを表わし、
ここでＺは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒ^ａ）−から選択され、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは各々独立して、水素、随意的に置換されたＣ_１−１２−アルキル、随意的に置換されたＣ_２−１２−アルケニル、随意的に置換されたＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは随意的に置換されていてよく、２つのジェミナル置換基Ｒ^ａおよびＲ^ｂは一緒になって、随意的に置換されたメチレン（＝ＣＨ_２）を表わしてよく、
存在する置換基Ｒ^１*、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^５*、Ｒ^６およびＲ^６*の各々は、独立して、水素、随意的に置換されたＣ_１−１２−アルキル、随意的に置換されたＣ_２−１２−アルケニル、随意的に置換されたＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは随意的に置換されていてよく、２つのジェミナル置換基は一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノまたは随意的に置換されたメチレンを表わしてよく、そうでなければ一緒になって、−Ｏ−、−Ｓ−および−（ＮＲ^Ｎ）−から選択される１つ以上のヘテロ原子／基により随意的に中断および／または終結されている１〜５個の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロ・ビラジカルを形成してよく、式中Ｒ^Ｎは水素およびＣ_１−４−アルキルから選択され、２つの隣接する（非ジェミナル）置換基は２重結合をもたらすさらなる結合を表わしていてよく、Ｒ^Ｎ*が存在しかつビラジカルに関与していない場合、それは水素およびＣ_１−４−アルキル、そしてその塩基性塩および酸付加塩から選択される。

さまざまな実施形態において、Ｒ^５*は、Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３および−ＣＨ＝ＣＨ_２から選択される。

さまざまな実施形態において、Ｒ^４*およびＲ^２*は一緒になって、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｃ（Ｒ^ｅＲ^ｆ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｏ−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｃ（Ｒ^ｅＲ^ｆ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｎ（Ｒ^ｃ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｎ（Ｒ^ｅ）−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｎ（Ｒ^ｃ）−Ｏ−および−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｓ−、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−Ｃ（Ｒ^ｃＲ^ｄ）−Ｓ−から選択されるビラジカルを表わし、ここで、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは各々独立して、水素、随意的に置換されたＣ_１−１２−アルキル、随意的に置換されたＣ_２−１２−アルケニル、随意的に置換されたＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ_２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは随意的に置換されていてよく、２つのジェミナル置換基Ｒ^ａおよびＲ^ｂは一緒になって、随意的に置換されたメチレン（＝ＣＨ_２）を表わしてよい。

さらなる実施形態においては、Ｒ^４*およびＲ^２*は一緒になって、−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３）−Ｏ−から選択されるビラジカルを表わす。

すべてのキラル中心では、不斉基は、ＲまたはＳ配向のいずれでも存在しうる。

好ましくは、本発明のオリゴマーに用いられるＬＮＡは、以下の構造式のいずれかにしたがった少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む：

式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−、−ＮＨ−、またはＮ（Ｒ^Ｈ）であり；ＺおよびＺ^*は独立して、ヌクレオチド間連結、末端基または保護基から選択され；Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１−４−アルキルから選択される。

特に好ましいＬＮＡ単位が、スキーム２に示されている：

スキーム２
「チオ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般構造式におけるＹが、Ｓまたは−ＣＨ_２−Ｓ−から選択されているロックされた核酸塩基（ＬＮＡ）を含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。

「アミノ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般構造式におけるＹが−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−から選択されているロックされた核酸塩基（ＬＮＡ）を含み、式中Ｒは水素およびＣ_１−４−アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。

「オキシ−ＬＮＡ」という用語は、上記の一般構造式におけるＹが−Ｏ−または−ＣＨ_２−Ｏ−を表わしているロックされた核酸塩基（ＬＮＡ）を含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。

「ＥＮＡ」という用語は、上記の一般構造式におけるＹが−ＣＨ_２−Ｏ−であるロックされた核酸塩基（ＬＮＡ）を含む（ここで−ＣＨ_２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂとの関係において２’位に連結されている）。

好ましい実施形態においては、ＬＮＡはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、特にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。

本明細書に関連して、「Ｃ_１−４−アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルなどの１〜４個の炭素原子を有する線状または分岐した飽和炭化水素鎖を意味することが意図されている。

ＲＮＡｓｅＨの採用
オリゴマー化合物は、翻訳の立体障害またはその他の方法などによる標的ｍＲＮＡの非ＲＮａｓｅ媒介型の分解を介して機能し得ると認識されているが、本発明の好ましいオリゴマーには、ＲＮａｓｅＨなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を採用することができる。

さまざまな実施形態において、オリゴマーまたは隣接した核酸塩基配列は、相補的標的ＲＮＡとの２重鎖の形で形成された場合に、ＲＮａｓｅを採用することができる７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の連続的ヌクレオチドまたは核酸塩基を含む少なくとも６個例えば少なくとも７個の連続するヌクレオチドまたは核酸塩基単位、例えば少なくとも８個または少なくとも９個の連続的核酸塩基単位（残基）の領域を含む。ＲＮＡｓｅを採用することのできる隣接配列は、本明細書に記載されるようなギャップマーに関連して言及される領域Ｂであってよい。さまざまな実施形態において、領域Ｂなどの、ＲＮＡｓｅを採用することのできる隣接配列のサイズは、核酸塩基単位１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個など、さらに大きいものであってよい。

欧州特許第１２２２３０９号明細書は、ＲＮａｓｅＨを採用する能力を判定するのに使用できるＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供している。欧州特許第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜９５で提供された方法論を用いると、相補的ＲＮＡ標的と共に提供された場合に、オリゴヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオネート連結基を伴い、２’置換が全く無い状態で、等価のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、または２０％未満のｐｍｏｌ／ｌ／分単位で測定された初期速度を有している場合、オリゴマーはＲＮａｓｅＨを採用できるものとみなされる。

さまざまな実施形態において、欧州特許第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜９５で提供された方法論を用いると、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮａｓｅＨと共に提供された場合に、ｐｍｏｌ／ｌ／分単位で測定されたＲＮａｓｅＨの初期速度が、オリゴヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオネート連結基を伴い、２’置換が全く無い状態で、等価のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定された初期速度の１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満、または２０％未満である場合、オリゴマーは本質的にＲＮａｓｅＨを採用できないものとみなされる。

その他の実施形態においては、欧州特許第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜９５で提供された方法論を用いると、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮａｓｅＨ共とに提供された場合に、ｐｍｏｌ／ｌ／分単位で測定されたＲＮａｓｅＨの初期速度が、オリゴヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオネート連結基を伴い、２’置換が全く無い状態で、等価のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチド（すなわち同一の塩基配列を有するもののＤＮＡ単位のみを含むオリゴヌクレオチド）を用いて決定された初期速度の少なくとも２０％例えば少なくとも４０％例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％である場合、オリゴマーはＲＮａｓｅＨを採用できるものとみなされる。

典型的には、連続核酸塩基配列を形成するオリゴマーの領域は、相補的標的ＲＮＡと２重鎖の形態で形成された場合、ＲＮａｓｅを採用でき、ＲＮＡ標的とＤＮＡ／ＲＮＡ様の２重鎖を形成するヌクレオチド単位からなり、α−Ｌ立体配置であるＤＮＡ単位およびＬＮＡ単位の両方を含んでいてよいが、特に好ましいのはα−Ｌ−オキシＬＮＡである。

本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含む核酸塩基配列を含んでいてよく、ギャップマー、ヘッドマー、またはミックスマーの形態をしていてよい。

ヘッドマーは、５’末端にある非ＲＮａｓｅ採用ヌクレオチド類似体の隣接した広がりとそれに続く３’末端に向かってＲＮａｓｅにより認識および開裂可能なＤＮＡまたは修飾ヌクレオチド（類似体）単位（例えば少なくとも７個のこのようなヌクレオチド）の隣接した広がりにより定義され、テイルマーは、５’末端でＲＮａｓｅにより認識および開裂可能なＤＮＡまたは修飾ヌクレオチド（類似体）（例えば少なくとも７個のこのようなヌクレオチド）の隣接した広がりとそれに続く３’末端に向かう非ＲＮａｓｅ採用ヌクレオチド類似体の隣接した広がりによって定義される。「ミックスマー」と呼ばれる本発明に係るその他の「キメラ」オリゴマーは、ｉ）ＲＮａｓｅにより認識および開裂可能なＤＮＡまたは修飾ヌクレオチドおよびｉｉ）非−ＲＮａｓｅ採用ヌクレオチド類似体の代替組成物からなる。一部のヌクレオチド類似体は同様に、ＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅの結合および開裂を媒介することもできるかもしれない。α−Ｌ−ＬＮＡはＲＮａｓｅ活性を或る程度採用することから、ギャップマー構成体のためのＲＮａｓｅにより認識および開裂可能なＤＮＡまたは修飾ヌクレオチドの所要領域（例えばギャップ−または領域Ｂ）はさらに小さくなると考えられ、ミックスマー構成内により高い柔軟性が導入されるものと考えられる。

ギャップマー設計
好ましくは、本発明のオリゴマーは、ギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、ＲＮＡｓｅ、例えばＲＮＡｓｅＨ、例えば本明細書において領域Ｂと呼ばれる少なくとも６個または７個のＤＮＡヌクレオチドの領域を採用できるヌクレオチドまたは核酸塩基の隣接ストレッチを含むオリゴマーであり、ここで領域Ｂは、５’および３’の両方で、ヌクレオチド類似体の領域、例えば親和力増強ヌクレオチド類似体、例えばＲＮＡｓｅを採用することのできるヌクレオチドの隣接ストレッチに対する５’および３’の１〜６個のヌクレオチド類似体によってフランキングされており、これらの領域はそれぞれ領域ＡおよびＣと呼ばれる。

好ましくは、ギャップマーは、構造式（５’−３’）、Ａ−Ｂ−Ｃまたは随意的にＡ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃの（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、ここで領域Ａ（５’領域）は少なくとも１つのヌクレオチド類似体例えば少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば１〜６個のヌクレオチド類似体例えばＬＮＡ単位からなるか、またはこれらで構成されており；領域Ｂは、（ｍＲＮＡ標的などの相補的ＲＮＡ分子との２重鎖の形態で形成された場合に）ＲＮＡｓｅを採用できる少なくとも５個の連続ヌクレオチドまたは核酸塩基例えばＤＮＡヌクレオチドからなるか、またはこれらで構成されており；領域Ｃ（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも１つのＬＮＡ単位例えば１〜６個のヌクレオチド類似体例えばＬＮＡ単位からなるか、またはこれらで構成されており；領域Ｄが存在する場合、それは、ＤＮＡヌクレオチドなどの１、２、または３個のヌクレオチド単位からなるか、またはこれらで構成されている。

さまざまな実施形態において、領域Ａは１、２、３、４、５または６個のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡ単位、例えば２〜５個のヌクレオチド類似体、例えば２〜５個のＬＮＡ単位、例えば３個または４個のヌクレオチド類似体、例えば３または４個のＬＮＡ単位からなり；かつ／または領域Ｃは１、２、３、４、５または６個のヌクレオチド類似体例えばＬＮＡ単位、例えば２〜５個のヌクレオチド類似体、例えば２〜５個のＬＮＡ単位、例えば３個または４個のヌクレオチド類似体、例えば３個または４個のＬＮＡ単位からなる。

さまざまな実施形態において、Ｂは、ＲＮＡｓｅを採用できる５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の連続ヌクレオチドまたは核酸塩基、またはＲＮＡｓｅを採用できる６〜１０個、または７〜９個、例えば８個の連続ヌクレオチドまたは核酸塩基からなるか、またはこれらで構成されている。さまざまな実施形態において、領域Ｂは、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド単位、例えば１〜１２個のＤＮＡ単位、好ましくは４〜１２個のＤＮＡ単位、より好ましくは６〜１０個のＤＮＡ単位例えば７〜１０個のＤＮＡ単位、最も好ましくは８、９または１０個のＤＮＡ単位からなるか、またはこれらで構成されている。

さまざまな実施形態において、領域Ａは、３個または４個のヌクレオチド類似体例えばＬＮＡからなり、領域Ｂは７、８、９または１０個のＤＮＡ単位からなり、領域Ｃは３個または４個のヌクレオチド類似体例えばＬＮＡからなる。かかる設計には、（Ａ−Ｂ−Ｃ）３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３が含まれ、１個または２個のヌクレオチド単位例えばＤＮＡ単位を有し得る領域Ｄがさらに含まれていてよい。

さらなるギャップマー設計は、国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレット中で開示されており、参照することにより本明細書に援用される。

参照することにより本明細書に援用される米国仮特許出願第６０／９７７４０９号明細書は、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーについて言及しており、これはさまざまな実施形態において本発明に係るギャップマーオリゴマーであってよい。

さまざまな実施形態において、オリゴマーは合計１０、１１、１２、１３または１４個の核酸塩基単位の隣接した核酸塩基配列からなり、ここで隣接した核酸塩基配列は構造式（５’−３’）、Ａ−Ｂ−Ｃまたは随意的にＡ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃのものであり、式中Ａは１、２または３個のヌクレオチド類似体単位例えばＬＮＡ単位からなり；Ｂは、相補的ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ標的）との２重鎖の形態で形成された場合にＲＮＡｓｅを採用できる７、８、または９個の隣接ヌクレオチドまたは核酸塩基単位からなり；Ｃは、１、２、または３個のヌクレオチド類似体単位例えばＬＮＡ単位からなる。存在する場合、Ｄは、単一のＤＮＡ単位からなる。

さまざまな実施形態において、Ａは１個のＬＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ａは２個のＬＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ａは３個のＬＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｃは１個のＬＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｃは２個のＬＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｃは３個のＬＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｂは７個のヌクレオチド単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｂは８個のヌクレオチド単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｂは９個のヌクレオチド単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｂは１〜９個のＤＮＡ単位、例えば２、３、４、５、６、７または８個のＤＮＡ単位で構成されている。さまざまな実施形態において、Ｂは、ＤＮＡ単位からなる。さまざまな実施形態において、Ｂは、α−Ｌ−立体配置にある少なくとも１個のＬＮＡ、例えばα−Ｌ−立体配置にある２、３、４、５、６、７、８または９個のＬＮＡ単位で構成されている。さまざまな実施形態において、Ｂは、少なくとも１個のα−Ｌ−オキシＬＮＡ単位で構成されているが、そうでなければここでα−Ｌ−立体配置にあるすべてのＬＮＡ単位はα−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。さまざまな実施形態において、Ａ−Ｂ−Ｃ内に存在するヌクレオチドの数は、１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４、または；１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、または；１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１（ヌクレオチド類似体単位−領域Ｂ−ヌクレオチド類似体単位）からなる群より選択される。さまざまな実施形態において、Ａ−Ｂ−Ｃ内のヌクレオチドの数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４および４−７−３からなる群より選択される。さまざまな実施形態において、ＡおよびＣは両方とも、各々２つのＬＮＡ単位からなり、Ｂは８または９個のヌクレオチド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなる。

その他のギャップマー設計には、領域Ａおよび／またはＣが３、４、５または６個のヌクレオチド類似体、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）および２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーからなる群より選択されるヌクレオチド類似体からなり、領域Ｂが８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチド、例えばＤＮＡ単位（または核酸塩基）からなる設計、例えば５−１０−５および４−１２−４ギャップマー設計が含まれる。さらなるギャップマー設計が、参照することにより本明細書に援用される国際公開第２００７／１４６５１１Ａ２号パンフレット中に開示されている。

連結基
「連結基」または「ヌクレオチド間連結」という用語は、２つのヌクレオチドまたは核酸塩基、２つのヌクレオチド類似体、およびヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを合わせて共有結合によりカップリングさせることのできる基を意味するように意図されている。具体的なおよび好ましい例としては、リン酸基およびホスホロチオエート基が含まれる。

本発明のオリゴマーまたはその隣接した核酸塩基配列の核酸塩基は、連結基を介して合わせてカップリングされる。適切には、各々の核酸塩基が、連結基を介して３’隣接核酸塩基に連結されている。

適切な連結基としては、国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット中に列挙されているもの、例えば国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット（参照することにより本明細書に援用される）の３４頁の第１段落で列挙されている連結基が含まれる。

さまざまな実施形態において、連結基をその正規のホスホジエステルから、ヌクレアーゼ攻撃に対しより高い耐性をもつもの、例えばホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへと修飾することが好ましい。これらは、ＲＮａｓｅＨにより開裂可能であり、同様に、標的遺伝子の発現を低減する上でアンチセンス阻害経路を可能にする
本明細書中で提供される、適切な硫黄（Ｓ）含有連結基が好ましいであろう。特にギャップマーのギャップ領域（Ｂ）については、ホスホロチオエート連結基も同様に好ましい。ホスホロチオエート連結は、フランキング領域（適宜、ＡおよびＣ、そしてＡまたはＣをＤに連結するため、および領域Ｄ内）に使用してもよい。

しかしながら、領域Ａ、ＢおよびＣは、例えばヌクレオチド類似体の使用がエンドヌクレアーゼ分解由来の領域ＡおよびＣ内の連結基を保護する場合、例えば領域ＡおよびＣがＬＮＡヌクレオチドを含む場合に、ホスホジエステル連結などのホスホロチオエート以外の連結基を含んでいてよい。

オリゴマー内の連結基は、標的化ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ開裂を可能にするべくホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであってよい。改善されたヌクレアーゼ耐性やその他の理由、例えば製造の容易さなどの理由で、ホスホロチオエートが好適である。

本発明のオリゴマーの一態様においては、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基を用いて互いに連結される。

ホスホロジエステル結合、例えば１つまたは２つの結合を、別の形であればホスホロチオエートであるオリゴマー内、特にヌクレオチド類似体単位の間またはそれらに隣接して（典型的には領域Ａおよび／または領域Ｃ）に内含することにより、オリゴマーの生物学的利用能および／またはインビボ分布を修飾できるということが認識されている。参照することにより本明細書に援用される国際公開第２００８／０５３３１４号パンフレットを参照のこと。

一部の実施形態、例えば上記で言及されている実施形態においては、適切かつ具体的に指示されていない場合、すべての残りの連結基はホスホジエステルまたはホスホロチオエートまたはそれらの混合物のいずれかである。

一部の実施形態においては、すべてのヌクレオチド間連結基がホスホロチオエートである。

本明細書中で提供されるものなどの特異的ギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、さまざまな実施形態において、結合がホスホロチオエート結合である場合、本明細書が開示されているものなどの代替連結を使用してよく、例えば、ＬＮＡなどのヌクレオチド類似体単位間での結合のためには、リン酸（ホスホジエステル）結合を使用してよいということが理解される。同様にして、本明細書で提供されているものなどの特異的ギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、Ｃ残基に５’メチル修飾シトシンとして注釈が付されている場合、さまざまな実施形態において、オリゴマー内に存在するＣのうちの１つ以上が未修飾のＣ残基であってよい。

オリゴマー化合物
本発明のオリゴマーは、表２に示されているように、配列番号１３３〜１５２からなる群より選択されてよい。

表２−オリゴマー設計 配列番号１３３〜１５２、大文字は、ヌクレオチド類似体を表わし、下付き文字「ｓ」はホスホロチエート結合を表わす。小文字はヌクレオチド（ＤＮＡ）単位を表わす。「ｓ」が無い場合（該当する場合）、これはホスホジエステル連結を表わす。

複合体
本明細書に関連して、「複合体」という用語は、１つ以上の非ヌクレオチド／非ヌクレオチド類似体（すなわち非核酸塩基）または非ポリヌクレオチド部分に対する本明細書中に記載されているオリゴマーの共有結合による連結（「複合」）によって形成された非相同分子を表わすことが意図されている。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例としては、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはそれらの組合せなどの高分子作用物質が含まれる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質のための抗体であってよい。典型的ポリマーは、ポリエチレングリコールであってよい。

したがって、さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、ポリヌクレオチド領域、すなわち典型的には核酸塩基の隣接配列からなるヌクレオチド／核酸塩基領域およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでいてよい。隣接した核酸塩基配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合、化合物は、非ヌクレオチド／非核酸塩基の構成要素、例えば複合体の構成要素を含んでいてよい。

本発明のさまざまな実施形態においては、オリゴマー化合物は、例えばオリゴマー化合物の細胞取込みを増大させるために用いることのできるリガンド／複合体に連結される。国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットは、適切なリガンドおよび複合体を提供しており、参照することにより本明細書に援用される。

本発明は同様に、本明細書中に記述されている本発明に係る化合物、およびこの化合物に対して共有結合により連結された少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む複合体をも提供している。したがって、本発明の化合物が本明細書中で開示されている規定の核酸または核酸塩基配列からなるさまざまな実施形態において、化合物は同様に、この化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないもの）をも含んでいてよい。

複合体は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させ得る。かかる部分には抗体、ポリペプチド、脂質部分例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

本発明のオリゴマーは同様に、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質などの活性薬物物質に複合化されてもよい。

一部の実施形態では、複合化された部分はステロール例えばコレステロールである。

さまざまな実施形態において、複合化された部分は、正荷電ポリマー、例えば長さがアミノ酸残基１〜５０個、例えば２〜２０個、例えば３〜１０個である正荷電ペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールを含むか、またはこれらからなる。参照することにより本明細書に援用される国際公開第２００８／０３４１２３号パンフレットを参照のこと。適切には、正荷電ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドを、国際公開第２００８／０３４１２３号パンフレットに記載の放出可能なリンカーなどのリンカーを介して本発明のオリゴマーに連結させてよい。

活性化オリゴマー
本明細書中で使用される「活性化オリゴマー」という用語は、本明細書中に記述されている複合体を形成するため、１つ以上の複合化部分すなわちそれ自体核酸またはモノマーでない部分に対するオリゴマーの共有結合による連結を可能にする少なくとも１つの官能部分に対し共有結合により連結されている（すなわち官能化されている）本発明のオリゴマーを意味する。典型的には、官能部分は、例えばアデニン塩基の環外ＮＨ_２基または３’−ヒドロキシル基を介してオリゴマーに共有結合できる化学基、好ましくは親水性であるスペーサ、そして複合化部分に対して結合できる末端基（例えばアミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を含む。一部の実施形態においては、この末端基は保護されておらず、例えばＮＨ２基である。その他の実施形態においては、末端基は例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ Ｇ Ｍ Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）に記載されているものなど、任意の適切な保護基によって保護される。適切なヒドロキシル保護基の例としては、エステル、例えば酢酸エステル、アラルキル基、例えばベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルおよびテトラヒドロピラニルが含まれる。適切なアミノ保護基の例としては、ベンジル、α−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えばトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルが含まれる。一部の実施形態においては、官能部分は自己開裂性である。その他の実施形態においては、官能部分は生物分解性である。例えば、その全体が参照することにより本明細書に援用される米国特許第７，０８７，２２９号明細書を参照のこと。

一部の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、オリゴマーの５’末端への複合化部分の共有結合による連結を可能にするため、５’末端で官能化されている。その他の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、３’末端において官能化され得る。さらにその他の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、主鎖に沿ってか、または複素環塩基部分上で官能化され得る。さらにその他の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、主鎖および塩基からなる群から独立して選択される２つ以上の位置において官能化され得る。

一部の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーは、官能部分に対し共有結合により連結した１つ以上のモノマーを合成に取込むことによって合成される。その他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーは官能化されていないモノマーを用いて合成され、オリゴマーは合成完了時点で官能化される。一部の実施形態においては、オリゴマーはアミノアルキルリンカーを含むヒンダードエステルを用いて官能化され、ここでアルキル部分は（ＣＨ_２）_ｗという構造式を有し、式中ｗは１〜１０の範囲内、好ましくは約６の整数であり、ここでアルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分岐鎖であってよく、官能基はエステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｗＮＨ）を介してオリゴマーに連結される。

その他の実施形態においては、オリゴマーは、（ＣＨ２）_ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカーを含むヒンダードエステルで官能化され、ここで、ｗは１〜１０の範囲内、好ましくは約６の整数であり、ここでアルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分岐鎖であってよく、官能基はエステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｗＳＨ）を介してオリゴマーに連結される。

一部の実施形態においては、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドが、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と（ジスルフィド結合の形成を介して）複合化される。

上述の通りのヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当該技術分野において公知のあらゆる方法によって、特にその全体が参照することにより本明細書に援用される、国際公開第２００８／０３４１２２号の国際公開パンフレットおよびその中の実施例に開示される方法によって合成可能である。

さらに別の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、実質的に米国特許第４，９６２，０２９号明細書および４，９１４，２１０号明細書に記載される官能化試薬、すなわち一方の終端で親水性スペーサ鎖を通して、保護された、または保護されていないスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシ基を含む反対側の終端に連結されたホスホラミダイトを有する実質的に直鎖の試薬を用いてオリゴマー内にスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシ基を導入することによって官能化される。かかる試薬は、主としてオリゴマーのヒドロキシル基と反応する。一部の実施形態においては、かかる活性化オリゴマーは、オリゴマーの５’−ヒドロキシル基にカップリングされた官能化試薬を有する。その他の実施形態では、活性化オリゴマーは、３’−ヒドロキシル基にカップリングされた官能化試薬を有する。さらにその他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの主鎖上でヒドロキシル基にカップリングされた官能化試薬を有する。さらなる実施形態においては、本発明のオリゴマーは、その全体が参照することにより本明細書に援用される米国特許第４，９６２，０２９号明細書および同４，９１４，２１０号明細書中に記載されている官能化試薬のうちの２つ以上を用いて官能化される。かかる官能化試薬を合成しかつそれらをモノマーまたはオリゴマー内に取込む方法は、米国特許第４，９６２，０２９号明細書および同４，９１４，２１０号明細書中で開示されている。

一部の実施形態においては、固相結合オリゴマーの５’末端は、ジエニルホスホラミダイド誘導体で官能化され、続いて、ディールス・アルダー付加環化反応を介して例えばアミノ酸またはペプチドを用いた脱保護オリゴマーの複合化が行なわれる。

さまざまな実施形態において、２’−糖修飾を含むモノマー例えば２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖をオリゴマー内に取込むことで、オリゴマーの糖に対する複合化部分の共有結合による連結が容易になる。その他の実施形態においては、１つ以上のモノマーの２’位においてアミノ含有リンカーを伴うオリゴマーが、例えば５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタリミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’‐‐Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を用いて調製される。例えばＭａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９１，３４，７１７１を参照のこと。

さらなる実施形態においては、本発明のオリゴマーは、Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上またはシトシンのＮ４または５位上を含め、核酸塩基上にアミン含有官能部分を有していてよい。１つの実施形態においては、かかる官能化は、オリゴマー合成内ですでに官能化されている市販の試薬を使用することにより達成されてよい。

一部の官能部分は、市販されており、例えばヘテロ２官能およびホモ２官能性連結部分がＰｉｅｒｃｅ Ｃｏ．（米国イリノイ州ロックフォード所在）から入手可能である。その他の市販の連結基は、共にＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国バージニア州スターリング所在）から入手可能である５’−アミノ−修飾因子Ｃ６および３’−アミノ−修飾因子試薬である。５’−アミノ−修飾因子Ｃ６はＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州フォスターシティ所在））からもＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２として入手可能であり、３’−アミノ−修飾因子はＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州パロアルト所在）から入手可能である。

組成物
本発明のオリゴマーは、医薬調合物および組成物中に使用してもよい。適切には、かかる組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットは、適切でかつ好ましい薬学的に許容できる希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており、これらは参照することにより本明細書に援用される。適切な投薬量、調合物、投与経路、組成物、剤形、その他の治療薬との組合せ、プロドラッグ調合物も同様に、国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットに提供されており、これらも同じく参照することにより本明細書に援用される。

本明細書中で使用される「薬学的に許容できる塩」という用語は、本書で特定された化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果を最小限に抑える塩を意味する。かかる塩の限定的意味のない例は、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンまたは、アンモニア、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンから形成されたカチオンで形成された塩基付加塩、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ、例えばタンニン酸塩亜鉛などと有機アミノ酸を用いて形成可能である。

応用
本発明のオリゴマーは、例えば診断、治療および予防のための研究用試薬として利用されてよい。

研究においては、細胞および実験動物において（典型的にはｍＲＮＡを分解または阻害しかくしてタンパク質形成を防止することにより）β−カテニンタンパク質の発現または合成を特異的に阻害し、かくして標的の機能的分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にする目的で、かかるオリゴマーを使用してよい。

診断においては、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションまたは類似の技術により細胞および組織におけるβ−カテニン発現を検出し定量化する目的でオリゴマーを使用してよい。

治療に関しては、β−カテニンの発現を調節させることによって治療可能な疾病または疾患を有する疑いのある動物またはヒトが、本発明に係る有効量のオリゴマー（またはその複合体）などのオリゴマー化合物を投与することによって治療される。さらには、本発明のオリゴマーまたは組成物のうちの１つ以上を治療上または予防上有効な量で、投与することによってβ−カテニンの発現と関連する疾病または病状を有することが疑われるか、またはその罹患傾向が疑われるヒトを治療する方法などの、哺乳動物の治療方法が提供される。

本発明は同様に、本明細書中で言及されるような疾患の治療のための薬剤の製造を目的とした、記載される本発明の化合物または複合体の使用、または本明細書中で言及されている疾患の治療方法をも提供する。

本発明は同様に、薬剤として使用するための本明細書中で記載されているオリゴマー、組成物または複合体にも関する。適切には、本発明の方法に言及する場合、本発明のオリゴマーまたは複合体の投与は、例えば治療を提供するのに有効である量または１つまたは複数の細胞内のβ−カテニン発現を阻害またはダウンレギュレートするのに有効である量などの有効量のオリゴマーまたは複合体を投与することにより、本発明のオリゴマーの投与が実施される。

本発明は同様に、本明細書中で記載されている本発明に係る化合物および／または本発明に係る複合体および／または本発明に係る医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、本明細書中で言及されている疾患の治療方法をも提供している。

さまざまな実施形態において、オリゴマーまたはその複合体は、例えば標的核酸に対する水素結合による結合を通してヒトにおいて所望の治療効果を誘発する。オリゴマーまたはその複合体は、標的のｍＲＮＡに対する水素結合（ハイブリダイゼーション）によりもたらされる遺伝子発現の低減を介して標的の発現の低減（阻害）をひき起こす。本明細書中で開示されているオリゴマー化合物および複合体が診断の利用分野などの非治療的利用分野を有していてよいということも想定されている。

医学的適応症
本明細書中で言及されている疾患はさまざまな実施形態において、過剰増殖性疾患、例えば癌、例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、悪性黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、造血系癌、子宮頸癌、ＣＮＳ（中枢神経系）癌、骨癌、胆道癌および副腎癌からなる群より選択される癌からなる群より選択される。

さまざまな実施形態において、本明細書中で言及されている疾患は、結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌および悪性黒色腫からなる群より選択される癌である。

さまざまな実施形態において、本明細書中で言及されている疾患は、肝臓癌および腎臓癌からなる群より選択される癌である。

本発明に係るオリゴマーおよびその他の組成物は、β−カテニンの突然変異型の過剰発現または発現に関連する病状の治療のために使用可能である。

本発明はさらに、本明細書中で言及される疾病、疾患または病状の治療のための薬剤の調製または製造における本発明の化合物の使用を提供する。

本発明はさらに、β−カテニンまたはβ−カテニンの突然変異体の形態（例えば対立遺伝子変異体、例えば本明細書中で言及されている疾病の１つに関連する対立遺伝子変異体）の発現レベルの異常を治療するための薬剤の製造を目的とする、本明細書中で定義された通りの化合物、組成物または複合体の使用に関する。

本発明のもう１つの態様は、β−カテニンレベルの異常に関連する病状を患うか、またはその罹患傾向を有する哺乳動物を治療する方法であって、１つ以上のＬＮＡ単位を含むオリゴマーなどの、β−カテニンに対し標的化されたオリゴマーを治療上有効な量で、哺乳動物に投与するステップを含む治療方法を対象とする。したがって、本発明の方法は、β−カテニンレベルの異常によってひき起こされる疾病に対する治療または予防を目的として利用されてよい。喚言すると、さまざまな実施形態において、本発明はさらに、β−カテニンレベルの異常を治療するための方法であって、本発明のオリゴマーまたは本発明の複合体または本発明の医薬組成物を、それを必要としている患者に投与するステップを有してなる方法を対象とする。

本明細書中で言及されている疾病または疾患は、さまざまな実施形態において、β−カテニン遺伝子またはそのタンパク質産物がβ−カテニンと関連するか、またはβ−カテニンと相互作用する遺伝子における突然変異と関連づけされ得る。したがって、さまざまな実施形態において、標的ｍＲＮＡは、β−カテニン配列の突然変異型である。

本発明の１つの興味深い態様は、本明細書中で言及される疾病、疾患または病状の治療のための薬剤の調製を目的とした、本明細書中で定義されるオリゴマー（化合物）または本明細書中で定義される複合体の使用を対象とする。

本発明は同様に、薬剤としての使用のための、本明細書中で定義されるオリゴマー、組成物または複合体にも関する。

その上、本発明は、本書で言及されているものなどの疾病または病状を患う対象を治療する方法であって、本明細書中で記載される本発明に係る化合物および／または本発明に係る複合体および／または本発明に係る医薬組成物を、それを必要としている患者に投与するステップを有してなる方法に関する。

適切な投薬量、調合物、投与経路、組成物、剤形、その他の治療薬との組合せ、プロドラッグ調合物が同様に、国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレット中に提供されており、これらは参照することにより本明細書に援用される。本発明はまた、本明細書に記載される化合物または複合体、および薬学的に許容できる希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物をも提供する。国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットは適切で好ましい薬学的に許容できる希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており、これらは参照することにより本明細書に援用される。

本発明の方法は、好ましくは、β−カテニンレベルの異常によってひき起こされる疾病に対する治療または予防のために利用される。

さらに、本明細書中で記載されている発明は、かかる療法を必要とするヒトに対する治療上有効な量のβ−カテニン調節オリゴマーを含む、一疾病の予防または治療方法を包含している。本発明はさらに、β−カテニン調節オリゴヌクレオチド化合物（オリゴマーまたは複合体）の短期間投与の使用をも包含する。

喚言すると、さまざまな実施形態において、本発明はさらに、β−カテニンレベルの異常を治療するための方法であって、必要とする患者に対し本発明のオリゴマー、本発明の複合体または本発明の医薬組成物を投与するステップを含み、さらに、さらなる作用物質またはさらなる活性成分の投与を含む方法も対象とする。前記さらなる投与は、さらなる作用物質またはさらなる活性成分が本発明の化合物に結合するか、または医薬組成物中に存在するか、または別々の調合物の形で投与されるものである。

本発明は同様に、薬剤として使用するための本明細書中で定義されるオリゴマー、組成物または複合体にも関する。

本発明はさらに、β−カテニンまたはβ−カテニンの突然変異型（例えば対立遺伝子変異体、例えば本明細書中で言及されている疾病の１つに関連する対立遺伝子変異体）の発現レベルの異常を治療するための薬剤の製造を目的とする、本明細書中で定義される化合物、組成物または複合体の使用に関する。

さらに、本発明は、本明細書で言及されているものなどの疾病または病状を患う対象を治療する方法にも関する。

治療を必要とする患者は、その疾病または疾患を患うまたは患う可能性の高い患者である。

さまざまな実施形態において、本明細書中で使用される「治療」という用語は、既存の疾病（例えば本明細書中で言及されているような疾病または疾患）の治療または疾病の防止すなわち予防の両方を意味する。したがって、本明細書中で言及されている治療は、さまざまな実施形態において、予防的であってよい。

本明細書中で言及されている疾病または疾患は、さまざまな実施形態において、β−カテニン遺伝子または、そのタンパク質産物がβ−カテニンと関連するか、またはβ−カテニンと相互作用するＡＰＣ遺伝子などの遺伝子の中での突然変異に関連し得る。したがって、さまざまな実施形態において、標的ｍＲＮＡはβ−カテニン配列の突然変異形態であり、例えば、癌に関連するＳＮＰなどの単一点突然変異を１つ以上含んでいてよい。

β−カテニンまたはＡＰＣ遺伝子内の突然変異がβ−カテニン活性レベルの異常を導くような疾病の例としては、（１）結腸直腸癌、ＡＰＣおよびβ−カテニンは全症例のうち７０％超において相互に突然変異を受けている（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２；Ｍｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７；Ｓｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９８）；（２）肝細胞癌、β−カテニンは、２５％超の症例において突然変異を受けている（ｄｅ Ｌａ Ｃｏｓｔｅ Ａ，ＰＮＡＳ，１９９８）；（３）子宮内膜癌、β−カテニンは１０％超で突然変異を受けている；および（４）悪性黒色腫、β−カテニンは１０％超で突然変異を受けている（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７）がある。

かかる疾病のさらなる例としては、卵巣、膵臓、下垂体、食道、肺、乳房、腎臓、造血系、子宮頸、ＣＮＳ、骨、胆道および副腎の癌がある。β−カテニンまたはＡＰＣ遺伝子内の突然変異がこれらの疾病に関連することが示されている（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（英国所在）から出された、癌における体細胞突然変異のカタログ(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)、ホームページhttp://www.sanger.ac.uk/）。

本発明に関して言及される癌は、上述の形態の癌のうちの１つから選択されてよい。

さらなる実施形態
以下の実施形態も同様に、本発明の詳細な説明および概要に関連しており、特許請求の範囲で言及されている実施形態を含めて、詳細な説明および概要において言及される本発明の実施形態と以下の実施形態を組合せてよい：
１． 配列番号１７３のβ−カテニン遺伝子またはその対立遺伝子の標的配列に結合し、β−カテニンの発現をダウンレギュレートすることができ、標的配列に対応する１０〜５０個の核酸塩基の配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばオリゴマー）。

２． 標的配列が、配列番号１〜１３２で表わされるβ−カテニン遺伝子またはその対立遺伝子変異体の領域から選択されている、実施形態１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

３． 配列番号１、１６、１７、１８、３３、３４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、７３、８８、１０３および１１８に示される１０〜１６個の核酸塩基配列またはその対立遺伝子変異体を含む、実施形態１または実施形態２のオリゴヌクレオチド。

４． 配列番号１〜１３２として示される配列を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

５． 配列番号１３３〜１７２により表わされる実施形態１〜４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

６． 前記核酸塩基配列が、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートから独立して選択される核酸塩基間連結を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

７． 前記核酸塩基のうちの少なくとも２つがヌクレオチド類似体である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

８． 前記核酸塩基配列が、５’から３’の方向で、（ｉ）領域Ａ、すなわち２〜４個のヌクレオチド類似体の広がりと、それに続く（ｉｉ）領域Ｂ、すなわち領域Ａのものとは異なる６〜１１個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の広がりとそれに続く（ｉｉｉ）領域Ｃ、すなわち２〜４個のヌクレオチド類似体の広がり、および随意的にそれに続く（ｉｖ）領域Ｄ、すなわち１個または２個のヌクレオチドを含む、実施形態５に記載のオリゴヌクレオチド。

９． 領域Ａが、２個のヌクレオチド類似体単位の間および／または領域Ｂの核酸塩基単位とヌクレオチド類似体単位の間に少なくとも１個のホスホジエステル連結を含む、実施形態８に記載のオリゴヌクレオチド。

１０． 領域Ｃが、２個のヌクレオチド類似体単位の間および／または領域Ｂの核酸塩基単位とヌクレオチド類似体単位の間に少なくとも１個のホスホジエステル連結を含む、実施形態８または実施形態９に記載のオリゴヌクレオチド。

１１． すべての核酸塩基間連結がホスホロチオエートである、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

１２． 前記ヌクレオチド類似体単位が、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＩＮＡおよび２’−ＭＯＥの中から独立して選択される、実施形態７〜１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

１３． ヌクレオチド類似体が、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡおよびＬＮＡから独立して選択される、実施形態１２に記載のオリゴヌクレオチド。

１４． 前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つがロックされた核酸（ＬＮＡ）である、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド。

１５． すべてのヌクレオチド類似体がＬＮＡである、実施形態１４に記載のオリゴヌクレオチド。

１６． ＬＮＡがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡから選択される実施形態１２〜１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。

１７． 実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに対して共有結合により連結された少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む複合体。

１８． 前記非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分が、コレステロールなどのステロール基からなるか、またはこれを含む、実施形態１７に記載の複合体。

１９． 実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたは実施形態１７または実施形態１８に記載の複合体および薬学的に許容できる希釈剤、担体またはアジュバンドを含む医薬組成物。

２０． 薬剤としての使用を目的とした、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたは複合体。

２１． β−カテニンレベルの異常およびβ−カテニン発現のダウンレギュレーションが必要とされる疾病または疾患の治療のための薬剤の製造を目的とした実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたは複合体の使用。

２２． 前記疾病または状態が癌である、実施形態２１に記載の使用。

２３． 癌を患う対象を治療する方法であって、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の医薬組成物、オリゴヌクレオチドまたは複合体を、それを必要としている対象に投与するステップを有してなる方法。

２４． 癌が、結腸直腸癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、悪性黒色腫、卵巣、膵臓、下垂体、食道、肺、乳房、腎臓、造血系、子宮頸、ＣＮＳ、骨、胆道および副腎の癌から選択されている、実施形態２１〜２３のいずれか１つの使用または方法。

２５． 対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドがβ−カテニンの発現をダウンレギュレートできる、β−カテニン遺伝子内の標的配列。

２６． 配列番号１〜１３２に相補的なβ−カテニン遺伝子またはその対立遺伝子変異体の領域から選択されている、実施形態２５の標的配列。

２７． 実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドと細胞を接触させるステップを含む、細胞内のβ−カテニンの発現をダウンレギュレートする方法。

実施例１：モノマー合成
ＬＮＡモノマー構築ブロックおよび誘導体を、以下の公開された方法およびその中で引用されている参考文献にしたがって調製した。国際公開第０７／０３１０８１号パンフレットおよびその中に引用されている参考文献を参照のこと。

実施例２：オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドを、国際公開第０７／０３１０８１号パンフレットに記載される方法にしたがって合成した。表１は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドモチーフの例を示す。

実施例３：オリゴヌクレオチドの設計
本発明に従い、一連のオリゴヌクレオチドを、本明細書中に配列番号１７３として提示されている公開された配列Ｇｅｎ Ｂａｎｋ登録番号ＮＭ_００１９０４を用いてヒトβ−カテニンの異なる領域を標的とするように設計した。

表２は、本発明のオリゴマー設計を示す。表３は、本発明のオリゴマーを設計する基となってよい２４マーの配列モチーフを示す。太字は表１に示されているような１６マー配列モチーフを表わす。

実施例４：インビトロモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、さまざまな細胞型のいずれにおいてもテストすることができる。標的は内生的に、または、この核酸をコードする核酸の過渡的または安定したトランスフェクションによって発現され得る。標的核酸の発現レベルは、例えばノーザンブロット分析、実時間ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、定型的に判定され得る。例示を目的として以下の細胞型が提供されるが、選択される細胞型の中で標的が発現されることを条件として、その他の細胞型を定型として使用することができる。

細胞を、以下に記す適切な培地内で培養し、９５〜９８％の湿度および５％のＣＯ_２で３７℃に維持した。細胞を一週間に２〜３回、定期的に継代させた。

ＳＷ４８０：ヒト結腸直腸癌細胞系ＳＷ４８０をＬ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）＋１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で培養した。

ＨＣＴ１１６：ヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６をＭｃＣｏｙの５ａ修正培地（Ｓｉｇｍａ）＋１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で培養した。

実施例５：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理
トランスフェクションビヒクルとしてカチオンリポソーム調合物Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ ２０００（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、オリゴヌクレオチドで細胞を処理した。６ウェルの細胞培養平板（ＮＵＮＣ）に細胞を塗沫し、集密性が７５〜９０％になった時点で処理した。使用したオリゴヌクレオチド濃度は、１ｎＭ〜２５ｎＭの範囲の最終濃度であった。無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００の１０μｇ／ｍＬという最終脂質濃度を用いて本質的にメーカーが記述する通りにオリゴヌクレオチド−脂質複合体の調合を実施した。細胞を４時間３７℃でインキュベートし、オリゴヌクレオチド含有培地を除去することで処理を停止させた。細胞を洗浄し、血清含有培地を添加した。オリゴヌクレオチド処理の後、細胞を２０時間回復させてからＲＮＡ分析のために収穫した。

実施例６：インビトロモデル：ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成
細胞系からＲＮＡを単離するために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）を、メーカーにより提供されたプロトコルにしたがって使用した。

メーカーの使用説明書にしたがって、Ａｍｂｉｏｎ製の逆転写酵素試薬を用いて、最初の鎖の合成を実施した。

各試料について、０．５μｇの全ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＨ_２Ｏで（１０．８μｌ）に調整し、２μｌのランダムデカマー（５０μｌ）および４μｌのｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰ２．５ｍＭ）と混合し、３分間７０℃まで加熱し、その後試料を氷上で急冷した。試料を氷上で冷却した後、２μｌの１０倍緩衝液ＲＴ、１μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（１００Ｕ／μｌ）および０．２５μｌのＲＮａｓｅ阻害物質（１０Ｕ／μｌ）を各試料に添加し、その後６０分間４２℃でインキュベートし、１０分間９５℃で酵素を熱で不活性化し、その後試料を４℃まで冷却した。

実施例７：インビトロモデル：実時間ＰＣＲによるβ−カテニン発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
β−カテニン発現のアンチセンス調節を、当該技術分野において公知のさまざまな方式でアッセイすることができる。例えば、β−カテニンｍＲＮＡレベルを例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または実時間ＰＣＲによって定量化することができる。現在では、実時間定量ＰＣＲが好まれている。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて実施できる。ＲＮＡ単離およびＲＮＡ分析の方法、例えばノーザンブロット分析が、当該技術分野において定型であり例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓの中で教示されている。

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から入手可能な市販のＭｕｌｔｉ‐Ｃｏｌｏｒ実時間ＰＣＲ検出システムを用いて、実時間定量（ＰＣＲ）を適切に達成することができる。

β−カテニンｍＲＮＡレベルの実時間定量ＰＣＲ分析
ヒトβ−カテニンｍＲＮＡの試料含有量を、ヒトβ−カテニンＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ．ｎｏ．Ｈｓ００１７００２５＿ｍ１）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがって定量化した。

試料調製におけるあらゆるばらつきを正規化するために、内因性対照として、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ数量を使用した。

ヒトＧＡＰＤＨｍＲＮＡの試料含有量を、ヒトＧＡＰＤＨ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号４３１０８８４Ｅ）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがって定量化した。

実時間定量ＰＣＲは当該技術分野において周知の技術であり、例えばＨｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），６：９８６−９９４の中で教示されている。

実時間ＰＣＲ
実施例８で記述されている通りに実施された最初の鎖の合成から得られたｃＤＮＡを２〜２０倍に希釈し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＴａｑｍａｎ ７５００ＥＡＳＴを用いて実時間定量ＰＣＲによって分析した。プライマおよびプローブを２倍のＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（２ｘ）(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号４３６４１０３）と混合し、１０μｌの最終体積になるまで４μｌのｃＤＮＡに添加した。各試料を、トリプリケートで分析した。関心対象のＲＮＡを発現する細胞系から精製した材料上で調製されたｃＤＮＡの２倍希釈物をアッセイすることによって、アッセイについての標準曲線が生成された。無鋳型対照については、ｃＤＮＡに代って無菌Ｈ_２Ｏを使用した。ＰＣＲプログラム：３０分間９５℃とそれに続けて９５℃３秒、６０℃３０秒の４０サイクル。標的ｍＲＮＡ配列の相対数量を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｆａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．３．１．２１．を用いて計算上の閾値サイクルから決定した。

実施例８：インビトロ分析：オリゴヌクレオチドによるヒトβ−カテニン発現のアンチセンス阻害
表２からのオリゴヌクレオチドを、ＳＷ４８０細胞において１、５および２５ｎＭの濃度でβ−カテニンｍＲＮＡをノックダウンするそれらの潜在性について評価した（図２を参照のこと）。データは、表４中に、５ｎＭでモックトランスフェクトされた細胞との関係におけるβ−カテニンｍＲＮＡのダウンレギュレーション百分率として提示されている。小文字はＤＮＡ単位を表わし、ボールド体の大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を表わす。すべてのＬＮＡＣは５’メチルＣである。下付き文字「ｓ」はホスホロチエート連結を表わす。

表４に示されているように、配列番号１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１６１、１６８、１６９、１７０、１７１および１７２のオリゴヌクレオチドは、これらの実験において５ｎＭで約７４％以上のβ−カテニンｍＲＮＡ発現の阻害を実証しており、したがって好ましいものである。

同様に好ましいのは、同じくβ−カテニン発現の優れた阻害を提供する、例えば長さを変動させる（より短くまたはより長く）および／または核酸塩基含有量（例えば類似体単位のタイプおよび／または割合）を変動させる例示されたアンチセンスオリゴ配列に基づくオリゴヌクレオチドである。

実施例９：インビトロ分析：β−カテニンタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
トランスフェクションを受けた細胞のβ−カテニンタンパク質レベルに対するオリゴマー化合物のインビトロ効果を、ウェスタンブロット法により判定した。実施例５で記載されている通りにオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを受けた２００，０００個のＳＷ４８０細胞を回収し、プロテアーゼ阻害物質カクテル（Ｒｏｃｈｅ）で補充されたＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、１％のデオキシコール酸ナトリウム）中にこれを溶解させた。全タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて測定した。３〜８％のトリスアセテートゲル上に５０μｇの全タンパク質を走らせ、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書にしたがってＰＶＤＦ膜上でブロットした。遮断緩衝液（５％の低脂肪粉乳を補充したＰＢＳ−Ｔ）中で一晩インキュベートした後、抗β−カテニン抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と共に膜を一晩インキュベートした。負荷対照として、Ｎｅｏ ｍａｒｋｅｒから得られたモノクローナル抗体を用いてチュブリンを検出した。その後、膜を二次抗体と共にインキュベートし、β−カテニンまたはチュブリンタンパク質を、化学発光ＥＣＬ^＋検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて視覚化した。図３を参照のこと。

実施例１０：増殖する生存細胞の測定（ＭＴＳアッセイ）
ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞を、トランスフェクションの前日に、６ウェル平板内でＭｃＣｏｙの５ａ修正培地（Ｓｉｇｍａ社製Ｍ８４０３）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ社製３５０５０−０３８）＋１０％のＦＢＳ（Ｂｒｏｃｈｒｏｍ社製＃１９３５７５０１０）＋２５μｇ／μｌのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ１３９７ ５０ｍｇ／ｍｌ）中で、１ウェルあたり２００，０００細胞の密度まで塗沫した。翌日、培地を除去しその後、７．５μｇ／ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含有する１．２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭを添加した。７分間細胞をインキュベートしてから、ＯｐｔｉＭＥＭ中に希釈した０．３ｍｌのオリゴヌクレオチドを添加した。最終オリゴヌクレオチド濃度は２５ｎＭであった。４時間の処理後、培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、１００μｌのＭｃＣｏｙの５ａ修正培地（Ｓｉｇｍａ社製Ｍ８４０３）＋２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ社製３５０５０−０３８）＋１０％のＦＢＳ（Ｂｒｏｃｈｒｏｍ社製＃１９３５７５０１０）＋２５μｇ／μｌのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製Ｇ１３９７ ５０ｍｇ／ｍｌ）中において、透明な９６ウェル平板（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ社製ｎｏ．１４７２０３０１００）内で１ウェルあたり５０００細胞の密度に塗沫した。１０μｌのテトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトシキフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ］および電子結合試薬（フェナジンエトスルフェート；ＰＥＳ）（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加することにより、指示された時点で生存細胞を測定した。Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）において４９０ｎｍで生存細胞を測定した。ＯＤ４９０ｎｍを時間数（時間単位）に対しプロットした（図４参照）。

実施例１１：マウスの肝臓におけるβ−カテニンｍＲＮＡの阻害
連続三日間、２５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド（配列番号１５６、１５８、１６８、１６９、１７１）をＮＭＲＩマウスに静脈内投薬した（群の大きさはマウス５匹）。０．９％の生理食塩水（ＮａＣｌ）中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを溶解させた。最終投薬から２４時間後に動物を屠殺し、肝臓組織の試料を採取し、その後のＲＮＡ抽出およびＱＰＣＲ分析までＲＮＡ中に保管した。全ＲＮＡを抽出し、肝臓試料内のβ−カテニンｍＲＮＡ発現を、マウスβ−カテニンＱＰＣＲアッセイ（カタログ番号Ｍｍ００４８３０３３＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施例７で記載されている通りにＱＰＣＲにより測定した。結果をマウスＧＡＰＤＨ（カタログ番号４３５２３３９Ｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に対し正規化し、生理食塩水で処理した対照との関係においてプロットした。図５を参照のこと。

実施例１２：配列番号１６１とポリエチレングリコールの複合体の調製
遮断基、例えばＦｍｏｃで遮断されたヘキサン−１−アミンなどのアミノアルキル基を、定型ホスホラミダイト化学反応を用いてオリゴマーの５’リン酸基に連結させ、得られた化合物を酸化させ、それを脱保護し、精製して以下の構造式（Ｉ）をもつ官能化オリゴマーを達成することにより、５’末端で官能化させる：

式中、配列番号１６１におけるボールド体の大文字および下付き文字「ｓ」は、上述のものと同一の意味を有する。

活性化ＰＥＧ溶液、例えば以下の構造式（ＩＩ）のものなど：

（式中、ＰＥＧ部分は１２，０００の平均分子量を有する）および、構造式（Ｉ）の化合物のＰＢＳ緩衝液中の溶液を、１２時間室内で撹拌する。反応溶液を、塩化メチレンで３回抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させる。残渣を、再蒸留水中に溶解させ、アニオン交換カラム上に負荷する。未反応ＰＥＧリンカーを水で溶出させ、生成物をＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液で希釈する。純粋生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させて構造式（ＩＩＩ）の複合体を得る：

式中、配列番号１６１のオリゴマーは、放出可能なリンカーを介して１２，０００の平均分子量をもつＰＥＧポリマーに連結されている。以下に記すのは、配列番号１６８および１７１の複合体の例である：

Claims (18)

1. 合計１０〜２４個の核酸塩基の隣接した核酸塩基配列を含む、長さが１０〜２５個の核酸塩基のオリゴマーであって、
   ｉ）前記隣接した核酸塩基配列が、配列番号１９２および配列番号８９からなる群より選択される配列の対応領域に対して１００％の相同性を有するか、または
   ｉｉ）前記隣接した核酸塩基配列が、配列番号１９２および配列番号１８９からなる群より選択される配列の対応領域に対して単一のミスマッチしか含まない、
   オリゴマー。
2. 合計１０〜５０個の核酸塩基の隣接した核酸塩基配列を含む、長さが１０〜５０個の核酸塩基のオリゴマーであって、
   前記隣接した核酸塩基配列が、哺乳動物β−カテニン遺伝子またはｍＲＮＡに対応する領域に対して少なくとも８０％の相同性を有する、
   オリゴマー。
3. 前記隣接した核酸塩基配列が、配列番号１〜１３２および配列番号１７４〜１９３からなる群より選択される配列に対応する領域に対して少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする請求項１または２記載のオリゴマー。
4. 前記隣接した核酸塩基配列が、配列番号１７３の対応領域とのミスマッチを含まないか、あるいは１個または２個しか含まないことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載のオリゴマー。
5. 前記オリゴマーの核酸塩基配列が、前記隣接した核酸塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載のオリゴマー。
6. 前記隣接した核酸塩基配列が、長さが１０〜１８個のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載のオリゴマー。
7. 前記隣接した核酸塩基配列が、ヌクレオチド類似体を含むことを特徴とする請求項１〜６いずれか１項記載のオリゴマー。
8. 前記ヌクレオチド類似体が、糖修飾ヌクレオチドであることを特徴とする請求項７記載のオリゴマー。
9. 前記ヌクレオチド類似体がＬＮＡであることを特徴とする請求項７記載のオリゴマー。
10. ギャップマーであることを特徴とする請求項７〜９いずれか１項記載のオリゴマー。
11. β−カテニン遺伝子またはｍＲＮＡを発現している細胞において、前記β−カテニン遺伝子またはｍＲＮＡの発現を阻害することを特徴とする請求項１〜１０いずれか１項記載のオリゴマー。
12. 前記オリゴマーが配列番号１３３〜１７４からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１１いずれか１項記載のオリゴマー。
13. 請求項１〜１２いずれか１項記載のオリゴマーと、
    前記オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分と
    を含む複合体。
14. 請求項１〜１２いずれか１項記載のオリゴマー、または請求項１３記載の複合体と、
    薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントと
    を含む医薬組成物。
15. 薬剤として使用するための、請求項１〜１２いずれか１項記載のオリゴマーまたは請求項１３記載の複合体。
16. 過剰増殖性疾患の治療用の薬剤を製造するための、請求項１〜１２いずれか１項記載のオリゴマーまたは請求項１３記載の複合体の使用方法。
17. 過剰増殖性疾患の治療方法であって、
    請求項１〜１２いずれか１項記載のオリゴマー、または請求項１３記載の複合体、または請求項１４記載の医薬組成物を、過剰増殖性疾患を患っているか、患う可能性の高い患者に投与するステップを有してなる方法。
18. β−カテニンを発現している細胞におけるβ−カテニンを阻害する方法であって、
    前記細胞においてβ−カテニンを阻害するように、前記細胞に対して請求項１〜１２いずれか１項記載のオリゴマーまたは請求項１３記載の複合体を投与するステップを有してなる方法。

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