JP2002520420A - 部位特異的キラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

部位特異的キラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド

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JP2002520420A
JP2002520420A JP2000560140A JP2000560140A JP2002520420A JP 2002520420 A JP2002520420 A JP 2002520420A JP 2000560140 A JP2000560140 A JP 2000560140A JP 2000560140 A JP2000560140 A JP 2000560140A JP 2002520420 A JP2002520420 A JP 2002520420A
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クック，フィリップ・ダン
マノハラン，ムティア
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom

Abstract

(57)【要約】 野性型核酸の活性を模倣及び／又はモジュレートする、新規なキラル化合物を開示する。一般に、これらの化合物は、５’末端と３’末端のヌクレオシド間結合がキラル的にＳｐであり、内部ヌクレオシド間結合がキラル的にＲｐであるホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願へのクロスリファレンス 本特許出願は、“修飾ヌクレオチド間結合を有するホスホロチオエート・オリ
ゴヌクレオチド”なる名称の出願第０９／１１５，０２７号（１９９８年７月１
４日出願）（これの内容は本明細書にその全体で援用される）の一部継続出願で
ある。
【０００２】発明の分野 本発明は、治療薬(therapeutics)、診断薬(diagnostics)のために及び研究試
薬として有用であるヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
の設計及び合成に関する。ヌクレオシド間結合の全てがキラルであるホスホロチ
オエート・オリゴヌクレオチドが提供される。このような化合物はヌクレアーゼ
分解に耐性であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの活性をモジュレートすることができる。
【０００３】発明の背景 たいていの疾患状態を包含する、多細胞生物におけるたいていの身体状態はタ
ンパク質によって影響を受けることは周知である。このようなタンパク質は、直
接作用するか、それらの酵素機能若しくは他の機能を介して作用するかいずれで
あっても、動物及びヒトにおける多くの疾患と調節機能に大きな割合で寄与する
。疾患状態に関して、古典的な治療学は、このようなタンパク質の疾患誘発機能
又は疾患強化機能を緩和しようと試みて、このようなタンパク質との相互作用に
一般に集中している。新しい治療アプローチでは、このようなタンパク質の実際
の産生をモジュレートすることが望ましい。タンパク質の産生を妨害することに
よって、最小の副作用で最大の治療効果を得ることができる。それ故、好ましく
ないタンパク質形成をもたらす遺伝子発現を妨害する又は他のやり方でモジュレ
ートすることが、このような治療アプローチの一般的な目的である。
【０００４】 遺伝子発現を阻害するための１つの方法は、オリゴヌクレオチド、特に特定の
ターゲット・メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的であるオリゴヌク
レオチドの使用による方法である。幾つかのオリゴヌクレオチドがこのような使
用のために現在臨床試験を受けている。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチ
ドは、抗ウイルス剤としての使用を含めて、種々な疾患状態に対するヒト臨床試
験において治療薬として現在用いられている。
【０００５】 例えば、タンパク質の間接的及び直接的の両方の調節剤としての使用の他に、
オリゴヌクレオチドは診断試験にも用途を見出している。このような診断試験は
生物学的流体、組織、無傷の細胞又は単離細胞成分を用いて実施することができ
る。遺伝子発現の阻害に関しては、診断用途は、オリゴヌクレオチドが核酸の相
補鎖とハイブリダイズできることを利用する。ハイブリダイゼーションは、Ｗａ
ｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ及び／又はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対を介したＲＮＡ又は
ＤＮＡへのオリゴマー化合物の配列特異的水素結合である。このような塩基対の
塩基は相互に相補的であるといわれる。
【０００６】 オリゴヌクレオチドは研究試薬としても広く用いられる。これらは多くの他の
生物学的分子の機能を理解するために並びに他の生物学的分子の製造に有用であ
る。例えば、ＰＣＲ反応にプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いることは
、拡大する営利的産業を生じている。ＰＣＲは商業的実験室及び研究実験室の頼
みのつなになっており、ＰＣＲの用途は増加している。例えば、ＰＣＲテクノロ
ジーは現在、法的、古生物学的、進化的研究及び遺伝的カウンセリングの分野に
用途を見出している。商業化は、分子生物学的に訓練されていない要員をＰＣＲ
の適用において助成するキットの開発を生じている。天然と合成の両方のオリゴ
ヌクレオチドがこのようなＰＣＲテクノロジーにプライマーとして用いられる。
【０００７】 オリゴヌクレオチドは他の実験室方法にも用いられる。これらの用途の幾つか
はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、第２版，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編集，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；及びＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌ等編集，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３の
ような、一般実験室マニュアルに述べられている。このような用途は、抗体とオ
リゴマー化合物とによる発現ライブラリーのスクリーニング、ＤＮＡ配列決定、
ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅、及びクローン化Ｄ
ＮＡの位置指定突然変異誘発における合成オリゴヌクレオチドプローブとしての
使用を包含する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上記文献）の第２巻参照。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（上記文献）の第２巻にお
ける“ＤＮＡ−タンパク質相互作用とポリメラーゼ連鎖反応”も参照のこと。
【０００８】 診断薬における及び研究試薬としてと治療的存在としてのオリゴヌクレオチド
の有用性を高めるために、多くの化学的修飾がオリゴヌクレオチド中に導入され
ている。このような修飾はターゲット鎖への結合を高めるため（即ち、融点、Ｔ
ｍを高めるため）、オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド−ターゲッ
ト複合体の同定を容易にするため、細胞透過性を高めるため、オリゴヌクレオチ
ドの構造若しくは活性を分解若しくは妨害するヌクレアーゼ及び他の酵素に対し
て安定にするため、ターゲットにひと度配列特異的に結合したものにある形式の
破壊（停止イベント）を与えるために、及びオリゴヌクレオチドの薬物動態的性
質を改良するために設計された修飾を包含する。
【０００９】 多くの細胞ターゲットを阻害するために、オリゴヌクレオチドの相補性が利用
されている。相補性オリゴヌクレオチドは一般にアンチセンス・オリゴヌクレオ
チドであると説明される。これらの研究の結果を述べた種々なレビューがＰｒｏ
ｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．とＢｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｆ．
、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１９９６，３６
，１０７−１２９を含めて、発表されている。これらのオリゴヌクレオチドは強
力な研究ツール及び診断薬であることが実証されている。効果的であることが判
明しているある一定のオリゴヌクレオチドは、現在ヒト臨床試験に用いられてい
る。
【００１０】 他の治療薬と同様に、オリゴヌクレオチドの薬理学的活性は、特定の細胞内タ
ーゲットにおけるこれらの作用剤の有効濃度に影響する多くの要因に依存する。
オリゴヌクレオチドに対する１つの重要な要因は、ヌクレアーゼの存在下での種
の安定性である。非修飾天然生成オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによって迅
速に分解されるので、これらが有用な治療薬であるとは考えられない。非修飾オ
リゴヌクレオチドのリン酸バックボーン(phosphate backbone)を修飾するための
利用可能な方法の限定は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド診断薬及び治療薬
のためにヌクレアーゼ耐性と、充分なハイブリダイゼーション性質とを与える他
の修飾方法の絶えず、長い間感じられた必要性を生じている。
【００１１】 ホスホロチオエート修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドは非常に多
くのターゲットに対して治療効果を示している。この成功はある程度は、天然生
成ホスホジエステル・バックボーンに比べて、ホスホロチオエート・バックボー
ンの大きいヌクレアーゼ耐性によるものである。ホスホロチオエート結合は、ホ
スホジエステル結合とは異なり、２種類のエナンチオマー：ＲｐとＳｐを有する
。３’−Ｒｐ結合がＨＵＶＥＣ細胞のサイトゾル中で少なくとも１種類のエキソ
ヌクレアーゼに対して不安定であることが判明している（Ｋｉｚｉｏｌｋｉｅｗ
ｉｃｚ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９
７，１６巻、１６７７−１６８２）。Ｋｉｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ等，Ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９７，７，
４３−４８；Ｋｉｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ，Ｍａｒｉａ，Ｇｅｎｄａｓｚｅｗｓ
ｋａ，Ｅｄｙｔａ，Ｍａｓｚｅｗｓｋａ，Ｍａｒｉａ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏ
ｆ Ｓｔｅｒｅｏｒｅｇｕｌａｒ Ｏｌｉｇｏ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）ｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ；Ｄｉａｓｔ
ｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ３’−Ｅｘｏｎｕ
ｃｌｅａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９７，
１６（７−９）１６７７−１６８２も参照のこと。
【００１２】 薬物としてのオリゴヌクレオチドの特定の特徴は、それらがｉｎ ｖｉｖｏで
有効であるほど充分に長く安定でなければならないことである。その結果、多く
の研究が、オリゴヌクレオチド治療薬の特異的結合性を維持しながら、オリゴヌ
クレオチド治療薬の安定性を強化することに集中している。最近、幾つかのグル
ープが、キラル・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド類似体がターゲット
ＲＮＡに対する強化された結合性（Ｒｐ異性体）と、エキソヌクレアーゼに対す
る顕著な安定化（Ｓｐ異性体）とを有することを報告している（Ｋｉｚｉｏｌｋ
ｉｅｗｉｃｚ等，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｖ．，１９９７，７，４３−４８；Ｂｕｒｇｅｒｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．１９７９，２５４，６８８９−９３；及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ等，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５，４１４５−６２）
。
【００１３】 現在、Ｐ−キラル・オリゴヌクレオチドを大規模に製造する方法は存在しない
。現在の方法は、キラル構築ブロックの立体異性体の合成とクロマトグラフィー
単離を包含する（Ｓｔｅｃ等，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ
．，１９９４，３３，７０９；Ｓｔｅｃ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１
９９５，１１７，１２０１９；及びＳｔｅｃ ＷＪ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆ
ｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌに
よって編集，６３−８０頁（１９９３、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓとこれに引用
された参考文献）。この方法はシントンの非立体特異的合成という欠点を有する
。最近、Ｊｕｓｔと共同研究者は、ジヌクレオチド・ホスホロチオエートトリエ
ステルを９７％ｅｅで形成するためのキラル補助剤(chiral auxiliary)の使用を
提示している（Ｗａｎｇ，ＪＣ．とＪｕｓｔ Ｇ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，３８，７０５−７０８）。しかし、リンにおけるキ
ラル補助保護基を除去することの困難さが報告されている。この方法は便利な大
規模自動化合成に関してまだ検討されていない。
【００１４】 ペンタデカマー５’−ｄ（ＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡ ＧＣＴＣＴ）−３’の立体
規則的ホスホロチオエート類似体がオキサチアホスホラン方法によって合成され
ている（Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，１９９５，２３，５０００−５００５）。この場合に、ヌクレアーゼＰ１に
よる、及びこれとは独立的に、蛇毒ホスホジエステラーゼによる酵素分解を用い
てジアステレオマー純度が判定された。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチ
ド（ＰＳ−オリゴ）と対応する相補的ペンタデカリボヌクレオチド(pentadecarb
onucleotide)とによって形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが細菌ＲＮアー
ゼＨによって処理された。［全て−Ｒｐ］配置のＰＳ−オリゴを含有するＤＮＡ
−ＲＮＡ複合体は、［全て−Ｓｐ］カウンターパート又はいわゆるペンタデカ（
ヌクレオシド・ホスホロチオエート）のジアステレオマーのランダム混合物のい
ずれかを含有するハイブリッドと比べて、ペンタデカリボヌクレオチドのＲＮア
ーゼＨ依存性分解をより受けやすいことが判明した。ＲＮアーゼＨ作用のこの立
体依存性は、これらのホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ズしたポリリボヌクレオチド（４７５ｎｔ）に関しても観察された。ＰＳ−オリ
ゴ−ＲＮＡハイブリッドの溶融試験の結果は、［全て−Ｓｐ］−オリゴ（ヌクレ
オシド・ホスホロチオエート）又はジアステレオマーのランダム混合物によって
形成された低い安定性のヘテロダイマーと比べて、オリゴリボヌクレオチドと［
全て−Ｒｐ］−オリゴ（ヌクレオシド・ホスホロチオエート）との間に形成され
たヘテロダイマーの高い安定性の見地から、観察された立体鑑別の合理化を可能
にした。
【００１５】 （Ｓ）−１−（インドル−２−イル）−プロパン−２−オールをキラル補助剤
として用いて、ジヌクレオチド・ホスホロチオエートトリエステルを９７％ｅｅ
で形成した（Ｗａｎｇ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９７，３
８，７０５−７０８）。
【００１６】 キラル補助剤としてヒドロキシ（インドリル）ブチロニトリルＩを用いて、＞
９８％のジアステレオマー過剰によるジヌクレオチド・ホスホロチオエートの立
体選択性調製が報告されている（Ｗａｎｇ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．，１９９７，３８，３７９７−３８００）。
【００１７】 １，２−Ｏ−シクロペンチリデン−５−デオキシ−５−イソプロピルアミノ−
Ｄ−キシロフラノースとそのエナンチオマーをキラル補助剤として用いて、それ
ぞれＳｐ及びＲｐジチミジン・ホスホロチオエートを９８％ジアステレオマー過
剰で、触媒としてホスホロアミダイト・メトドロギース(phosphoramidite metho
dologies)と２−ブロモ−４，５−ジシアノイミダゾールを用いて形成した（Ｊ
ｉｎ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，３６４７−３６５４）。
【００１８】 原核ＤＮＡポリメラーゼとオリゴヌクレオチド鋳型／プライマーとを用いて、
オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートを合成した（Ｌａｃｋｅｙ等，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９９７，１９，４７５−４７８）。この方法は
ＤＮＡポリメラーゼと鋳型／プライマーとの回収を容易にし、ミリグラム規模で
は成功である。したがって、ヒト免疫不全ウイルスゲノムのエキソン７における
配列と相補的なオリゴヌクレオチド（ＧＰｓ０１９３）の合成を特定するように
、再使用可能な鋳型／プライマーが設計された。ｄＮＴＰＳ（Ｒｐ＋Ｓｐ）基質
を用いたＤＮＡポリメラーゼによる３’−末端の伸長は、キラル純粋な（Ｒｐ）
立体化学を有する指定オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートを生成した。こ
の生化学的合成は（自動化固相合成の２４時間に比べて）６０分間以内に本質的
に完成して、＜５％の中間長さオリゴヌクレオチド生成物を生じ、これは各ヌク
レオチドの添加に関する＞９９．７％の段階的収率に対応した。
【００１９】 ホスホロチオエート・オリゴデオキシリボヌクレオチドを２つの明確な三重ら
せんモチーフ中の二重らせんＤＮＡを認識するそれらの能力に関して試験した（
Ｈａｃｉａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，５３６７−５３６
９）。ホスホロチオエート又は立体規則性（全て−Ｒｐ）ホスホロチオエート結
合のジアステレオマー混合物を含有するプリン富化オリゴヌクレオチドは、対応
する天然ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドのアフィニティと同様なアフィ
ニティで三重らせん複合体を形成することが判明している。これとは対照的に、
ジアステレオマー性又は立体規則性（全てＲｐ）結合の混合物を含有するピリミ
ジン富化ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは測定可能なアフィニティに
よって二重らせんＤＮＡに結合しない。これらの観察は三重らせん構造と生物学
的用途に関して意味を有する。
【００２０】 立体規則性（全てＲｐ）オリゴデオキシリボヌクレオチド・ホスホロチオエー
トの合成のために酵素によるプロトコールが確立されている。２５マーオリゴデ
オキシヌクレオチド・ホスホロチオエートが合成されて、生物物理的及び生化学
的性質に関して研究されている（Ｔａｎｇ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９８５−９９０）。
【００２１】 ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）におけるオリゴ（ヌクレオシド・ホスホロ
チオエート）（ＰＳ−オリゴ）の安定性が研究されている（Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅ
ｗｉｃｚ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９
９７，１６，１６７７−１６８２）。ＨＵＶＥＣのサイトゾル画分は、天然及び
ＰＳ−オリゴマーの分解の原因である３’−エキソ−核分解活性(nucleolytic a
ctivity)を有する。酵素はＲｐ特異性である、即ち、この酵素はリン原子におけ
るＲｐ配置のヌクレオチド間ホスホロチオエート機能(function)を開裂するが、
Ｓｐ配置を開裂しない。
【００２２】 オキサチアホスホラン方法によって合成された立体規則性オリゴデオキシリボ
ヌクレオシド・ホスホロチオエート（ＰＳ−オリゴ）の酵素加水分解が、それら
のジアステレオマー純度の判定に用いられている（Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ
等，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＤｒｕｇＤｅｖ．，１９
９９，９，１７１−１８１）。このために、確立されたジアステレオ選択性を有
する２種類の周知酵素、ヌクレアーゼＰ１と蛇毒ホスホジエステラーゼ（ｓｖＰ
ＤＥ）が用いられている。しかし、ｓｖＰＤＥの幾つかの不利益な性質のために
、他の［Ｒｐ］特異的エンドヌクレアーゼの探索が行われた。Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓから単離された細胞外細菌エンドヌクレアーゼはＰＳ−
オリゴを基質として受容し、［Ｒｐ］配置のホスホロチオエート結合を加水分解
するが、ヌクレオチド間［Ｓｐ］−ホスホロチオエートはその作用に対して耐性
である。異なる配列の非修飾オリゴヌクレオチドとホスホロチオエート・オリゴ
ヌクレオチドを用いて行われた開裂実験は、Ｓｅｒｒａｔｉａヌクレアーゼが以
前に報告されたよりもオリゴデオキシリボヌクレオチドの認識と加水分解により
選択的であることを実証している。酵素によって示される基質特異性は開裂部位
におけるヌクレオチド配列によってのみでなく、隣接配列の長さと塩基配列によ
っても影響される。Ｓｅｒｒａｔｉａヌクレアーゼは立体的に画定された(stere
odefined)ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドのジアステレオマー純度の分
析に有用でありうるが、その配列優先性のために、ｓｖＰＤＥと共にこの酵素を
用いることが信頼性を高める。
【００２３】 全てのＤＮＡバックボーン結合の立体規則性Ｒｐ−ホスホロチオエート修飾を
含有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの第１ＮＭＲ溶液構造が提示されている。
酵素合成ホスホロチオエートＤＮＡオクタマー（全て−Ｒｐ）−ｄ（ＧＣＧＴＣ
ＡＧＧ）とその相補的ＲＮＡｒ（ＣＣＵＧＡＣＧＣ）との複合体はＡ−形ファミ
リー内に総合コンフォーメーションを有した（Ｂａｃｈｅｌｉｎ等，Ｎａｔ．Ｓ
ｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，５，２７１−２７６）。ＤＮＡ鎖のたいて
いのらせんパラメーターと糖パッカーとはＡ−形とＢ−形との中間の値を想定す
る。同じ配列の非修飾ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドとの密接な構造類似性は、天
然複合体と硫黄置換複合体の両方がＲＮアーゼＨによって認識され、消化される
ことができる理由を説明することができる。
【００２４】 新たなモノマー、５’−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシリボヌクレオシド ３’−Ｏ−
（２−チオ−“スピロ”−４，４−ペンタ−メチレン−１，３，２−オキサチア
ホスホラン）類を作製して、オキサチアホスホラン・アプローチによるＰＳ−オ
リゴの立体制御合成(stereo-controlled synthesis)に用いた（Ｓｔｅｃ等，Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，７１５６−７１６７）。これ
らのモノマーとそれらの２−オキソ類似体を、ホスフェート及びＰ−立体画定(P
-stereo-defined)ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を有する“キメラ”
構築体（ＰＳ／ＰＯ−オリゴ）の合成に用いた。単一カップリング工程の収率は
約９２〜９５％であり、生じたオリゴマーは核酸塩基−及び糖−ホスホロチオエ
ート・バックボーン修飾を有さない。熱解離研究は、［Ｒｐ］−、［Ｓｐ］−又
は［混合］−ＰＳ／ＰＯ−Ｔ１０と、各鋳型に対するｄＡ１２、ｄＡ３０又はポ
リ（ｄＡ）とによって形成されたヘテロ二重らせん(duplex)に関して、融点並び
に解離プロセスのＧｉｂｂｓ自由エネルギーは実際に等しい。オキサチアホスホ
ラン・モノマーの１つの結晶組織学的分析に由来する立体化学的証拠は オキサチアホスホラン開環縮合の機構へのペンタコーディネート中間体の関与を
強力に支持する。
【００２５】 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド−３’−Ｏ−（
２−チオノ−１，３，２−オキサチアホスホラン）類の別々のジアステレオマー
の、３’−酸素を介して固体サポートに結合した２’−ＴＢＤＭＳｉ−保護リボ
ヌクレオシドによるＤＢＵ−補助１，３，２−オキサチアホスホラン開環縮合は
９６〜１００％立体特異性によって生じ、脱保護後に、［Ｒｐ］−又は［Ｓｐ］
−ジリボヌクレオシド３’，５’−ホスホロチオエートＩ（Ｂ＝アデニン、シト
シン、グアニン、ウラシル）を６５〜９７％収率で生成する（Ｓｉｅｒｚｃｈａ
−ｌａ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，６７１３−６７１６）。
カップリング時間又はＤＢＵ濃度を高めることによって、これらの収率を改良す
る試みは不成功であった。ダイマー（Ｉ）のリンにおける絶対配置は、立体特異
性ヌクレアーゼ、蛇毒ＰＤＥ又はヌクレアーゼＰ１による処理によって定められ
た。ヌクレアーゼＰ１による下記ダイマーの［Ｒｐ］−対［Ｓｐ］−ジアステレ
オマーの識別は、ジデオキシリボヌクレオシド３’、５’−ホスホロチオエート
に関して観察されたよりも非常に不充分(much less profound)である。
【化１７】
【００２６】 ジアステレオマー的に純粋な５’−Ｏ−ＤＭＴ−ヌクレオシド３’−Ｏ−（２
−チオ−１，３，２−オキサチアホスホラン）（Ｂ＝Ｔ、Ａｄｅｂｚ、Ｃｙｔｂ
ｚ）を立体規則性ホスホロチオエートの合成に用いた（Ｓｔｅｃ等，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，１２０１９−１２０２９）。オキサチ
アホスホラン開環縮合は強有機塩基、好ましくはＤＢＵの存在を必要とする。単
一カップリング工程の収率は約９５％であり、生じたＳ−オリゴは核酸塩基−及
び糖−ホスホロチオエート・バックボーン修飾を有さない。生成物のジアステレ
オマー的純度を、ヌクレアーゼＰ１と、蛇毒ホスホジエステラーゼとＳｅｒｒａ
ｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓエンドヌクレアーゼとの混合物とによるジアステ
レオ選択性分解に基いて評価した。ヘテロ二重らせんホスホロチオエート／ＤＮ
Ａとホスホロチオエート／ＲＮＡの熱解離研究は、これらの安定性は立体化学依
存性及び配列依存性であることを示した。
【化１８】
【００２７】 四員環状硫黄化合物は動力学的及び熱力学的に形成されやすい化合物であるこ
とが、既に報告されている（Ｅｌｉｅｌ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１
９８５，１０７，２９４６−２９５２）。ｐ−置換３−（アリールチオ）−３−
メチル−１−Ｂｕ トシレートのＫ及びＫｓに関するＨａｍｍｅｔｔ ＬＦＥＲ
と、生成物比率に対する溶媒及び塩効果とを含めた生成物研究と速度研究との組
み合わせは、分枝鎖３−（アルキルチオ）及び（３−アリールチオ）プロピルト
シレートの加溶媒分解における近接性補助が真実であり、顕著なＴｈｏｒｐｅ−
Ｉｎｇｏｌｄ効果が明らかであることを実証する。この観察は、発明者らにキラ
ル・ホスホロチオエートを合成するためのキラル補助剤として図２〜７に示した
化合物を設計させた。同様な刊行物において、非環状アルコキシ置換ｐ−トルエ
ンスルホネートの加溶媒分解における酸素の隣接基関与が例示されている（Ｅｌ
ｉｅｌ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８５，５０，２７０７−２７１１）。Ｐ
ｈＣＨ2ＯＣＲＲ１ＣＲ２Ｒ３ＣＨＲ４ＯＴｓ（Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１〜Ｒ４＝Ｈ；Ｒ
＝Ｒ１＝Ｍｅ，Ｒ２〜Ｒ４＝Ｈ；Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ４＝Ｍｅ，Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ＝
Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ２＝Ｍｅ；Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ４＝Ｈ，Ｒ２＝Ｒ３＝Ｍｅ；
Ｔｓ＝Ｏ2ＳＣ6Ｈ4Ｍｅ−ｐ）のメタノリシスは部分的転位を伴って進行して、
２−又は３−位置にジェミナル(geminal)Ｍｅ基（Ｒ２＝Ｒ３＝Ｍｅ又はＲ＝Ｒ
１＝Ｍｅ）が存在するときにのみ、隣接基関与を生じる。
【００２８】 “環化に対する新たなｇｅｍ−及びｖｉｃ−２置換基効果”なるタイトルの最
近のレビュー文献（Ｊｕｎｇ，Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｅ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ，１９９
９，８４３−８４６）では、環化に対する幾つかの新たなｇｅｍ−２置換基効果
の概要が説明される、例えば、ｇｅｍ−ジアルコキシ、−ジカルボアルコキシ及
び−ジチオアルコキシ効果が発見されている。さらに、かれらは新たな近接２置
換基効果をも観察している。ラジカル環化に対するケタールの新規な環サイズ効
果は研究されている。同じ著者による同様な文献では、ブロモアルケンと五員ケ
タールＩ（Ｒ＝Ｂｒ、ｎ＝１）との、水素化トリブチルスズによる反応が非環状
生成物Ｉ（Ｒ＝Ｈ，ｎ＝１）のみを生成し、対応ブロモアルケンと六員ケタール
Ｉ（Ｒ＝Ｂｒ、ｎ＝２）との反応は、新規なケタール環サイズ効果で、シクロブ
タンＩＩの良好な収率を生じた。さらに、ｇｅｍ−ジカルボアルコキシ効果はこ
れらの系において有効であった、例えばブロモアルケントリエステル、（Ｅ）−
ＭｅＯ2ＣＣＨ：ＣＨＣＨ2Ｃ（ＣＯ2Ｅｔ）2ＣＨ2ＯＣ（：Ｓ）ＯＰｈの環化は
シクロブタンＩＩＩの妥当な収率を生じた。
【化１９】
【００２９】 この理論によると、構造３、８、１４、１８，２０及び２５の全てはジェミナ
ル２置換基を有する。四員環状チオ化合物の同時形成を伴ってキラルホスホロチ
オエートを合成するためのこの概念の使用は新規である。
【００３０】 ３’−末端にキラルＳｐホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を有するオ
リゴヌクレオチドは国際出願ＷＯ９９／０５１６０（ＰＣＴによって１９９９年
２月４日公開）に開示されている。
【００３１】発明の概要 本発明は、治療薬、診断薬及び研究試薬として有用であるヌクレアーゼ耐性ホ
スホロチオエート・オリゴヌクレオチドを提供する。好ましい実施態様では、本
発明は複数個の共有結合ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物であって、 式：
【化２０】 ［式中、Ｔ1とＴ2はそれぞれ、独立的にヒドロキシル、保護されたヒドロキシル
、固体サポートへの共有結合、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート基、又は５’若しくは３’−置換基で
あり；各ＳｐはキラルＳｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合であり；各
Ｌｐは独立的にキラルＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合、ラセミホ
スホロチオエート・ヌクレオシド間結合、又はキラルホスホロチオエート・ヌク
レオシド間結合以外のヌクレオシド間結合であり；各ｎとｍは独立的に１〜１０
０であり；各ｐは０〜１００であり；この場合、ｎ、ｍ及びｐの合計は３〜約２
００である；各Ｎｕは独立的に式：
【化２１】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保護された
ヒドロキシル、２’−置換基若しくは保護された２’−置換基である）を有する
］で示される前記オリゴマー化合物を提供する。
【００３２】 幾つかの好ましい実施態様では、各Ｒ1はＨ又はヒドロキシルである。他の好
ましい実施態様では、Ｒ1はＣ1−Ｃ10Ｏ−アルキル又はＣ1−Ｃ10置換Ｏ−アル
キルであり、２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルがさらに好ましい
。
【００３３】 幾つかの好ましい実施態様では、各Ｎｕは独立的にアデノシン、グアノシン、
ウリジン、５−メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンであ
る。 幾つかのさらに好ましい実施態様では、ｐは１又は２である。他のより好まし
い実施態様では、ｎとｐはそれぞれ１であり、ｍは３〜約２０である。
【００３４】 幾つかの好ましい実施態様では、Ｔ1とＴ2はそれぞれ、独立的にヒドロキシル
又は保護されたヒドロキシルである。他の好ましい実施態様では、各ＬｐはＲｐ
ホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合である。さらに他の好ましい実施態様
では、少なくとも１つのＬｐはラセミホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合
である。さらに他の好ましい実施態様では、少なくとも１つのＬｐは、キラルホ
スホロチオエート・ヌクレオシド間結合以外のヌクレオシド間結合である。
【００３５】 幾つかの好ましい実施態様では、Ｒ1はＨ、ヒドロキシル及び保護されたヒド
ロキシル以外の２’−置換基又は保護された２’−置換基である。
【００３６】 本発明はまた、式：
【化２２】 ［式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり、Ｒ4はヒドロキシル保護基であり、Ｒ1 はＨ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’−置換基又は保護された２
’−置換基であり、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］で示される化合物を提供す
る。
【００３７】 幾つかの好ましい実施態様では、キラル補助基は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、
Ｖ又はＶＩ：
【化２３】 のいずれかで示される。
【００３８】 他の好ましい実施態様では、Ｂｘはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−
メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンである。 他の好ましい実施態様では、各Ｒ1はＨ又はヒドロキシルである。さらに他の
好ましい実施態様では、Ｒ1はＣ1−Ｃ10Ｏ−アルキル又はＣ1−Ｃ10置換Ｏ−ア
ルキルであり、２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルがさらに好まし
い。
【００３９】 幾つかの好ましい実施態様では、少なくとも１つのＲ1は２’−Ｏ−メトキシ
エチル又は２’−Ｏ−メチルがである。他の好ましい実施態様では、Ｒ1は、Ｈ
、ヒドロキシル及び保護されたヒドロキシル以外の２’−置換基又は保護された
２’−置換基である。
【００４０】 本発明はさらに、本発明の１種類以上の化合物と、許容される製薬的キャリヤ
ーとを含む薬剤組成物を提供する。
【００４１】 本発明はさらに、式：
【化２４】 ［式中、Ｔ1とＴ2はそれぞれ、独立的にヒドロキシル、保護されたヒドロキシル
、固体サポートへの共有結合、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート基、又は５’若しくは３’−置換基で
あり；各ＳｐはＳｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合であり；各Ｌｐは
独立的にＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合、ラセミホスホロチオエ
ート・ヌクレオシド間結合、又はキラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結
合以外のヌクレオシド間結合であり；各ｎとｍは独立的に１〜１００であり；各
ｐは０〜１００であり；この場合、ｎ、ｍ及びｐの合計は３〜約２００である；
各Ｎｕは独立的に式：
【化２５】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保護された
ヒドロキシル、２’−置換基若しくは保護された２’−置換基である）を有する
］で示されるオリゴマー化合物の製造方法であって、 （ａ）式：
【化２６】 ［式中、Ｒ4は不安定なヒドロキシル保護基であり、Ｒ3は固体サポートへの共有
結合である］で示される化合物を用意する工程と； （ｂ）前記不安定なヒドロキシル保護基を脱ブロックして、脱ブロック済みヒド
ロキシル基を形成する工程と； （ｃ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式：
【化２７】 ［式中、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］で示される他の化合物と、縮合試薬と
によって任意に処理して、伸長された(extended)化合物を形成する工程と； （ｄ）工程（ｂ）と（ｃ）とを任意に繰り返す工程と； （ｅ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式：
【化２８】 ［式中、Ｒ5はＲｐキラル補助基又は活性化リン基である］を有する化合物と縮
合試薬とによって処理して、さらに伸長された化合物を形成する工程と； （ｆ）工程（ｅ）と（ｆ）とを任意に繰り返して、さらにヌクレオシドを加える
工程と； （ｇ）前記不安定なヒドロキシル保護基を脱ブロックして、脱ブロック済みヒド
ロキシル基を形成する工程と； （ｈ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式：
【化２９】 ［式中、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］を有する化合物と縮合試薬とによって
処理して、保護されたオリゴマー化合物を形成する工程と； （ｉ）工程（ｈ）と（ｉ）とを任意に繰り返して、追加のヌクレオシドを加える
ことによって、さらなる保護されたオリゴマー化合物を形成する工程と を含む前記方法を提供する。
【００４２】 好ましくは、この方法は工程（ｉ）の生成物を脱ブロックする工程をさらに含
む。 本発明の方法の幾つかの好ましい実施態様では、Ｓｐキラル補助基は式Ｉ、Ｉ
Ｉ若しくはＩＩＩ：
【化３０】 のいずれか、又は式ＩＶ、Ｖ若しくはＶＩ：
【化３１】 のいずれかを有する。
【００４３】 本発明の方法のより好ましい実施態様は、キャッピング剤による処理を含む、
１つ以上のキャッピング工程をさらに含む。このようなキャッピング工程が、カ
ップリング工程後に、例えば工程ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｈ及び／又はｉの１つ以上の
後に行われることが好ましい。
【００４４】 幾つかの好ましい実施態様では、本発明の方法はさらに１つ以上の酸化工程を
含み；前記酸化工程は酸化剤による処理を含む。幾つかの好ましい実施態様では
、 このような酸化工程はカップリング工程後に、例えば工程ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｈ及
び／又はｉの１つ以上の後に行われる。
【００４５】 本発明の方法の幾つかの好ましい実施態様では、前記不安定なヒドロキシル保
護基がジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル又は９−フェニル
−キサンテンである。本発明の方法のさらに好ましい実施態様では、前記複素環
式塩基部分がプリン又はピリミジンであり、前記プリン又はピリミジンは好まし
くは独立的にアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、シチジ
ン、５−メチルシチジン又はチミンである。
【００４６】 本発明の化合物及び方法の幾つかの好ましい実施態様では、ｎ、ｍ及びｐの合
計は５〜約５０であり、より好ましくは８〜約３０であり、さらにより好ましく
は１０〜約２５である。 本発明の方法のさらに好ましい実施態様では、Ｔ1とＴ2とは独立的にヒドロキ
シル又は保護されたヒドロキシルである。 本発明の方法のなお、さらに好ましい実施態様では、各ＬｐはＲｐホスホロチ
オエート・ヌクレオシド間結合である。
【００４７】 本発明の方法のなお、さらに好ましい実施態様では、少なくとも１つのＬｐは
ラセミホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合である。 本発明の方法の幾つかのより好ましい実施態様では、ｎとｐがそれぞれ１であ
り、ｍは３〜約２０である。他の幾つかの好ましい実施態様では、ｎとｐはそれ
ぞれ２であり、ｍは３〜約２０である。
【００４８】 他の好ましい実施態様では、ｐは０である。 幾つかの好ましい実施態様では、少なくとも１つのＲ1はＨ、ヒドロキシル及
び保護されたヒドロキシル以外の２’−置換基又は保護された２’−置換基であ
る。 他の好ましい実施態様では、活性化リン基はホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホ
ネート又はリン酸三エステルである。
【００４９】 さらに他の好ましい実施態様では、固体サポートへの共有結合はサルコシニル
−スクシノニル・リンカーである。 他の好ましい実施態様では、式：
【化３２】 ［式中、Ｒ62はＨ又はヒドロキシル保護基であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保
護されたヒドロキシル、２’‐置換基又は保護された２’‐置換基であり；Ｂは
複素環式塩基部分であり；Ｒ62は式Ｉ〜ＶＩ：
【化３３】 から選択されるキラル補助基である］で示される化合物を提供する。
【００５０】 本発明によると、さらに、式：
【化３４】 ［式中、ｑは０〜約５０であり；Ｒ62はＨ又はヒドロキシル保護基であり；Ｒ1
はＨ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’‐置換基又は保護された２
’‐置換基であり；Ｒ64はＨ、ヒドロキシル保護基、又は固体サポートへのリン
カーであり；Ｒ63は下記ラジカル：
【化３５】 から成る群から選択されるラジカルである］で示される化合物を提供する。
【００５１】 幾つかの好ましい実施態様では、各Ｒ1はＨ又はヒドロキシルである。他の好
ましい実施態様では、Ｒ1はＣ1−Ｃ10Ｏ−アルキル又はＣ1−Ｃ10置換Ｏ−アル
キルであり、２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルが好ましい。
【００５２】 幾つかの好ましい実施態様では、Ｂは独立的にアデニン、グアニジン、ウリジ
ン、５−メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンである。 他の好ましい実施態様では、ｑは５〜約５０であり、８〜約３０が好ましく、
１０〜約２５がより好ましい。幾つかの特に好ましい実施態様では、ｑは０又は
１である。
【００５３】 生物におけるタンパク質の産生又は活性をモジュレートする方法であって、前
記生物を本発明の化合物と接触させることを含む方法及び、タンパク質の好まし
くない産生を特徴とする疾患を有する生物の治療方法であって、前記生物を本発
明の化合物と接触させることを含む方法も、本発明によって提供される。
【００５４】 本発明はさらに、核酸の分析方法であって、前記核酸を含有すると疑われる溶
液を本発明の化合物と接触させることを含む前記方法を提供する。
【００５５】発明の詳細な説明 本発明は、少なくとも１つのキラルＳｐヌクレオシド間結合を有する第１ ５
’−領域と、キラルＲｐヌクレオシド間結合、ラセミホスホロチオエート・ヌク
レオシド間結合、又はキラル若しくはラセミホスホロチオエート・ヌクレオシド
間結合以外のヌクレオシド間結合を有する第２領域とを有するオリゴマー化合物
を提供する。本発明はさらに、３領域を有し、第１領域と第２領域とが上記で定
義した通りであり、第３領域が１つ以上のＳｐホスホロチオエート・ヌクレオシ
ド間結合を有するオリゴマー化合物を提供する。本発明によると、２又は３領域
を有する、このようなオリゴマー化合物の製造方法をも提供する。オリゴマー化
合物（２領域）の５’末端又はオリゴマー化合物の両翼（例えば、３領域化合物
の３’末端と５’末端）におけるＳｐ形態の存在がエキソヌクレアーゼ分解に対
する感受性を減ずる。第２領域におけるＲｐ形態の存在は相補的核酸に対する化
合物のアフィニティを高める。
【００５６】 本発明の１態様では、高いキラル純度のＲｐ及びＳｐヌクレオシド間結合（即
ち、“キラルＳｐ”、“キラルＲｐ”、“Ｓｐ”又は“Ｒｐ”結合）を有するキ
ラル化合物を製造する。本明細書で用いる高いキラル純度とは、９０％以上の指
定エナンチオマーの％を表示する意味である。Ｓｐヌクレオシド間結合を有する
ダイマーとオリゴマーの製造は米国特許第５，２１２，２９５号、第５，５８７
，３６１号及び第５，５９９，７９７号に記載されており、これらの特許の内容
は本明細書に援用される。
【００５７】 認識されるように、本発明は、それらの天然生成カウンターパートに比べて増
強された安定性を有するオリゴヌクレオチド類に関する。細胞外及び細胞内ヌク
レアーゼは一般に本発明の化合物を認識しない（それ故、本発明の化合物に結合
しない）。
【００５８】 本発明はさらに、５’末端及び３’末端に少なくとも１つのＳｐヌクレオシド
間結合を有するオリゴマー化合物の製造方法を包含する。好ましい実施態様では
、オリゴマー化合物は５’末端及び３’末端における１つ以上のＳｐヌクレオシ
ド間結合を有し、内部(internal)ヌクレオシド間結合が全てＲｐホスホロチオエ
ート結合である。このようなオリゴマー化合物は、固体サポートに結合したモノ
マーを、得られるヌクレオシド間結合に定義された立体化学を与える反応性リン
部分を有するモノマーによって処理することによって製造される。最初のモノマ
ー（単数又は複数種類）はＳｐヌクレオチド間結合を与えるように選択される。
次のセクションはＲｐ又はラセミヌクレオシド間結合を有するように製造され、
最終セクションは最初のセクションと同様に１つ以上のＳｐヌクレオシド間結合
を有するように製造される。モノマー類は以下の実施例に例示するように製造さ
れる。
【００５９】 選択されたキラル補助基中に存在するｇｅｍ−ジアルキル置換基は、四員オキ
サチアン、六員オキサジン又はアミド構造を放出する生成物形成を容易にする。
これらの化合物は（＋）−プレゴン及び（−）−プレゴンから便利に合成するこ
とができる（（Ｒ）−４’−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノール及び（
Ｓ）−４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノール）。
【００６０】 幾つかの好ましい実施態様では、式：
【化３６】 ［式中、Ｔ1とＴ2はそれぞれ、独立的にヒドロキシル、保護されたヒドロキシル
、固体サポートへの共有結合、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート基、又は５’若しくは３’−置換基で
あり；各ＳｐはＳｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合であり；各Ｌｐは
独立的にＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合、ラセミホスホロチオエ
ート・ヌクレオシド間結合、又はキラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結
合以外のヌクレオシド間結合であり；各ｎとｍは独立的に１〜１００であり；各
ｐは０〜１００であり、この場合、ｎ、ｍ及びｐの合計は３〜約２００である；
各Ｎｕは独立的に式：
【化３７】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保護された
ヒドロキシル、２’−置換基若しくは保護された２’−置換基である）を有する
］で示されるオリゴマー化合物の製造方法であって、 （ａ）式：
【化３８】 ［式中、Ｒ4は不安定なヒドロキシル保護基であり、Ｒ3は固体サポートへの共有
結合である］で示される化合物を用意する工程と； （ｂ）前記不安定なヒドロキシル保護基を脱ブロックして、脱ブロック済みヒド
ロキシル基を形成する工程と； （ｃ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式：
【化３９】 ［式中、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］で示される他の化合物と、縮合試薬と
によって任意に処理して、伸長された化合物を形成する工程と； （ｄ）工程（ｂ）と（ｃ）とを任意に繰り返す工程と； （ｅ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式：
【化４０】 ［式中、Ｒ5はＲｐキラル補助基又は活性化リン基である］を有する化合物と縮
合試薬とによって処理して、さらに伸長された化合物を形成する工程と； （ｆ）工程（ｅ）と（ｆ）とを任意に繰り返して、さらにヌクレオシドを加える
工程と； （ｇ）前記不安定なヒドロキシル保護基を脱ブロックして、脱ブロック済みヒド
ロキシル基を形成する工程と； （ｈ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式：
【化４１】 ［式中、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］を有する他の化合物と縮合試薬とによ
って処理して、保護されたオリゴマー化合物を形成する工程と； （ｉ）工程（ｈ）と（ｉ）とを任意に繰り返して、追加のヌクレオシドを加える
ことによって、さらなる保護されたオリゴマー化合物を形成する工程と を含む前記方法を提供する。
【００６１】 本発明の方法では、ヌクレオシドモノマー単位のカップリングは成長する鎖の
５’末端ヒドロキシルを脱ブロックする（即ち、５’保護基を除去する）ことに
よって先行される。このような“脱ブロック”は当業者に知られた多様な試薬に
よって達成することができる。１つの適当な試薬は２％ジクロロ酢酸（ｖ／ｖ）
のジクロロメタン溶液、又は３％ジクロロ酢酸（ｖ／ｖ）のトルエン溶液である
。
【００６２】 本発明が、連続するヌクレオシドモノマーのカップリング間に１つ以上のキャ
ッピング工程を包含することが好ましい。酸化工程の前後に、キャッピング工程
を行うことができ、カップリング工程後に、例えば、工程ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｈ及
び／又はｉの１つ以上の後で行うことが好ましい。このようなキャッピング工程
は一般に、カップリング・サイクルで反応しなかった鎖をブロックすることによ
って、オリゴマー鎖の短縮を防止することで有利であることが知られている。キ
ャッピングに用いられる代表的な１つのキャッピング試薬は、無水酢酸である。
他の適当なキャッピング試薬及び方法は、米国特許第４，８１６，５７１号（１
９８９年３月２８日発行）に見出すことができ、この特許はその全体で本明細書
に援用される。
【００６３】 幾つかの好ましい実施態様では、本発明の方法はさらに１つ以上の酸化工程を
含み、前記酸化工程は酸化剤による処理を含む。酸化剤の選択は、生じる結合が
例えばホスホジエステル、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート結合の
いずれであるかを決定する。幾つかの好ましい実施態様では、酸化工程はカップ
リング工程後に、例えば、工程ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｈ及び／又はｉの１つ以上の後
で行われる。
【００６４】 ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合の製造に用いられる
酸化剤（“硫化剤”としても知られる）はＢｅａｕｃａｇｅ試薬（例えば、Ｉｙ
ｅｒ，Ｒ．Ｐ．等，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１２５３−１
２５４と；Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５，
４６９３−４６９９参照）；テトラエチルチウラムジスフィド（例えば、Ｖｕ，
Ｈ．，Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．
，１９９１，３２，３００５−３００８参照）；ジベンゾイルテトラスルフィド
（例えば，Ｒａｏ、Ｍ．Ｖ．等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９
２，３３，４８３９−４８４２参照）；ジ（フェニルアセチル）ジスルフィド（
例えば、Ｋａｍｅｒ，Ｐ．Ｃ．Ｊ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１
９８９，３０，６７５７−６７６０参照）；ビス（Ｏ，Ｏ−ジイソプロポキシホ
スフィノチオイル）ジスルフィド（Ｓｔｅｃ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．，１９９３，３４，５３１７−５３２０参照）；３−エトキシ−１，２，
４−ジチアゾリン−５−オン（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，１９９６，２４，１６０２−１６０７；及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２４，３６４３−３６４４参照）；ビス（ｐ−クロ
ロベンゼンスルホニル）ジスルフィド（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３，４０２９−４０３３参照）；硫黄、例えば
トリアリール、トリアルキル、トリアラルキル若しくはトリアルカリールホスフ
ィンのようなリガンドと組み合わせた硫黄を包含する。前記参考文献はそれらの
全体において本明細書に援用される。
【００６５】 ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合の形成に用いられる有用な酸化
剤は、ヨウ素／テトラヒドロフラン／水／ピリジン又は過酸化水素／水又はｔｅ
ｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド又は例えばｍ−クロロ過安息香酸のような任意
の過酸(per acid)を包含する。硫化の場合には、この反応は空気、特に酸素を排
除して無水条件下で行われるが、酸化の場合には、この反応は水性条件下で行わ
れることができる。
【００６６】 固体サポートは、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの米国特許第４，４１５，７３
２号、第４，４５８，０６６号、第４，５００，７０７号、第４，６６８，７７
７号、第４，９７３，６７９号及び第５，１３２，４１８号、及びＫｏｓｔｅｒ
の米国特許第４，７２５，６７７号及び第Ｒｅ．３４，０６９号に記載されてい
るような固相合成方法に固相として役立つことができる基質である。リンカーは
固体サポートを、固相合成方法における最初のシントンの官能基（例えば、ヒド
ロキシル基）に結合させるために役立つ短い分子として当該技術分野に知られて
いる。適当なリンカーは、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ａｎｄ
Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｋｓｔ
ｅｉｎ，Ｆ．編集，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９９１，第１章，１−２３
頁に開示されている。
【００６７】 本発明による固体サポートは、例えば制御多孔質ガラス(controlled pore glass
) （ＣＰＧ）、オキサリル制御多孔質ガラス(oxalyl-controlled pore glass)（例
えば、Ａｌｕｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９１
，１９，１５２７参照，これはその全体において本明細書に援用される）、Ｔｅ
ｎｔａＧｅｌサポート−−−アミノポリエチレングリコール由来サポート（例え
ば、Ｗｒｉｇｈｔ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９３，３
４，３３７３参照，これはその全体において本明細書に援用される）、及びＰｏ
ｒｏｓ−−−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを含めた、固相方法
に用いるために適当であると当該技術分野に一般に知られた固体サポートを包含
する。
【００６８】 本発明の方法の幾つかの好ましい実施態様では、Ｓｐキラル補助基は式Ｉ、Ｉ
Ｉ若しくはＩＩＩ：
【化４２】 のいずれか、又は式ＩＶ、Ｖ若しくはＶＩ：
【化４３】 のいずれかで示される。
【００６９】 モノマーのシントンの添加の終了時に、完成したオリゴマーを固体サポートか
ら開裂する。保護された官能基の脱保護に先行する又は続くことができる開裂工
程は、好ましい実施態様では、保護基及びキラル補助基を有さない化合物を生成
する。適当な開裂試薬は、例えば５０℃における２時間のＮＨ4ＯＨ（２８％）
のような、当該技術分野で知られた開裂試薬を包含する。
【００７０】 ターゲット核酸にハイブリダイズ可能である、本発明によるオリゴヌクレオチ
ドは好ましくは約５〜約５０ヌクレオシドを含む。このような化合物が約８〜約
３０ヌクレオシドを含むことが好ましく、１０〜約２５ヌクレオシドが特に好ま
しい。本明細書で用いる限り、ターゲット核酸は、相補的核酸様化合物とハイブ
リダイズ可能である任意の核酸である。さらに本発明に関して、“ハイブリダイ
ゼーション”は、相補的核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓ
ｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合でありうる水素結合を意味する。本
明細書で用いる限り、“相補的”は２つの核酸塩基の間の正確に対合する能力を
意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成によって対合する相
補的核酸塩基である。本明細書で用いる限り、“相補的”及び“特異的にハイブ
リダイズ可能な”とは、ヌクレオシド・サブユニットを含有する第１核酸様オリ
ゴマーと第２核酸様オリゴマーとの間の正確な対合又は配列相補性を意味する。
例えば、第１核酸のある一定の位置における核酸塩基が第２核酸の同じ位置にお
ける核酸塩基と水素結合を形成することができる場合に、第１核酸と第２核酸と
はその位置において相互に相補的であると見なされる。各分子中の充分な数の対
応位置が相互に水素結合することができる核酸塩基によって占められる場合に、
第１核酸と第２核酸とは相互に相補的である。したがって、“特異的にハイブリ
ダイズ可能な”及び“相補的”は、本発明の化合物とターゲットＲＮＡ分子との
間に安定で特異的な結合が生ずるような、充分な相補度を表示するために用いら
れる用語である。本発明のオリゴマー化合物が、特異的にハイブリダイズ可能で
あるためにそのターゲットＲＮＡ配列に対して１００％相補的である必要がない
ことは理解されるであろう。ターゲットＲＮＡ分子に対するオリゴマー化合物の
結合がターゲットＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性の損失を生じるときに、
及び特異的な結合が望ましい条件下で、即ち、ｉｎ ｖｉｖｏ分析若しくは治療
的処置の場合に生理的条件下で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の場合に分析が行わ
れる条件下で、非ターゲット配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を避
けるために充分な相補度が存在するときに、オリゴマー化合物は特異的にハイブ
リダイズ可能である。
【００７１】 本発明で用いる限り、“キラル補助基(chiral auxiliary)”なる用語は、オリ
ゴマー・ホスホロチオエートの合成の過程中にリン結合の保護基として機能する
基を含む意味である。キラル補助基は最終オリゴマー化合物中の各ヌクレオシド
間結合にＳｐ又はＲｐキラリティーを与える。したがって、キラル補助基は成長
する鎖上に残留することができ、反復合成計画(iterative synthetic regime)の
終了時に除去される。キラル補助基の除去は反復合成の完了後に単回処理で便利
に達成することができる。好ましいキラル補助基を本発明のモノマーの製造に用
いられるものとして図に示す（化合物３、８、１４、１８、２０及び２５参照）
。
【００７２】 本明細書に述べる化合物及び方法に有用な、代表的な複素環塩基部分は、アデ
ニン、グアニン、シトシン、ウリジン及びチミン、並びに他の非天然生成及び天
然核酸塩基、例えば、キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデ
ニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体；アデニン及びグアニン
の２−プロピル及び他のアルキル誘導体；５−ハロ ウラシル及びシトシン；６
−アゾ ウラシル、シトシン及びチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；
４−チオウラシル；８−ハロ、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒド
ロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン；５−トリフルオロメチル及び
他の５−置換ウラシル及びシトシン；７−メチルグアニンを包含する。他の天然
生成核酸塩基と非天然生成核酸塩基は米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒ
ｉｇａｎ等）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ（Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅとＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編集，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９９３）中，Ｓａｎｇｈｖｉによる第１５章；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ等，Ａｎ
ｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ版，１９９１，
３０，６１３−７２２（特に、６２２と６２３頁参照）；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎ
ｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編集，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８−８５９頁；及びＣｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５−６０７に開示さ
れているものを包含し、これらの参考文献の各々はそれらの全体において本明細
書に援用される。“ヌクレオシド塩基”なる用語はさらに、最も古典的な意味で
はヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として役立つ、ある一定の“
ユニバーサル塩基”を包含する類似ヌクレオシド塩基(like nucleosidic bases)
として役立ちうる複素環式化合物を包含するように意図される。３−ニトロピロ
ールがユニバーサル塩基として特に挙げられる。
【００７３】 好ましい複素環式塩基部分はアデニン、Ｎ6−ベンゾイルアデニン、シトシン
、Ｎ4−ベンゾイルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ4−ベンゾイル−５−メチ
ルシトシン、チミン、ウラシル、グアニン、Ｎ2−イソブチリルグアニン及び２
−アミノアデニンを包含する。
【００７４】 他の天然生成及び非天然生成複素環式塩基部分は、米国特許第３，６８７，８
０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ等）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅとＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編集，Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）中，Ｓａｎｇｈｖｉによる第１５章；Ｅｎｇｌｉ
ｓｃｈ等，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
版，１９９１，３０，６１３−７２２（特に、６２２と６２３頁参照）；Ｃｏｎ
ｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編集，Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，８５８−８５９頁；及びＣｏｏｋ
，Ｐ．Ｄ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６
，５８５−６０７に開示されているものを包含し、これらの参考文献の各々はそ
れらの全体において本明細書に援用される。“複素環式塩基部分”なる用語はさ
らに、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基と
して役立つ、ある一定の“ユニバーサル塩基”を包含するヌクレオシド塩基とし
て役立ちうる複素環系を包含するように意図される。３−ニトロピロールがユニ
バーサル塩基として特に挙げられる。
【００７５】 一般に、“ヘテロ”なる用語は炭素以外の原子、好ましくは、但し非排他的に
、 Ｎ、Ｏ又はＳを意味する。したがって、“ヘテロシクロアルキル”なる用語は１
個以上のヘテロ原子（即ち、非炭素原子）を有するアルキル環系を意味する。好
ましいヘテロシクロアルキル基は例えばモルホリノ基を包含する。本明細書で用
いる限り、“ヘテロシクロアルケニル”なる用語は、１個以上の二重結合と１個
以上のヘテロ原子を有する環系を意味する。好ましいヘテロシクロアルケニル基
は、例えば、ピロリジノ基を包含する。
【００７６】 本明細書で用いる限り、“２’−置換基”又は“５’若しくは３’置換基”
なる用語はリボフラノシル部分の２’−位置に酸素原子によって又は酸素原子な
しに付着した基を包含する。本発明に従う糖置換基は、非限定的に、フルオロ、
Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−
アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール及び
式（Ｏ−アルキル）m（ｍは１〜約１０である）のポリエーテルを包含する。こ
れらのポリエーテルのうちで好ましいのは、線状及び環状ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧｓ）、（ＰＥＧ）含有基、例えばクラウンエーテル、及びＯｕｃｈｉ
等，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９９２，９，９
３；Ｒａｖａｓｉｏ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，４３２９；及
びＤｅｌｇａｒｄｏ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １９９２，９，２
４９によって開示されているものであり、これらの参考文献の各々はその全体に
おいて本明細書に援用される。他の糖修飾はＣｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．，Ａｎｔｉ−Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５−６０７に開示さ
れている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダ
ゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、及びアルキルアミノ置換が、“２’及び
５’置換を含むピリミジン・ヌクレオチド（単数又は複数）を有するオリゴマー
化合物”なるタイトルの米国特許出願第０８／３９６，９０１号（１９９５年３
月６日出願）に記載されており、この出願はその全体において本明細書に援用さ
れる。
【００７７】 本発明に従う他の糖置換基は２’−ＳＲ及び２’−ＮＲ2基を包含し、この場
合、各Ｒは独立的に水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニ
ル若しくはアルキニルである。２’−ＳＲヌクレオシドは米国特許第５，６７０
，６３３号（１９９７年９月２３日発行）に開示されており、これはその全体に
おいて本明細書に援用される。２’−ＳＲモノマー・シントンの組み込みはＨａ
ｍｍ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２，３４１５−３４２０によっ
て開示されている。２’−ＮＲヌクレオシドはＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｍ．，Ｊ
．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，６２７３−６２８１と；Ｐｏｌｕｓｈ
ｉｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９６，３７，３２２７−３
２３０に開示されている。本発明に従う他の代表的な糖置換基は、式ＸＩ又はＸ
ＩＩのいずれかを有するものを包含する：
【化４４】
【００７８】 上記式中： Ｚ0はＯ、Ｓ又はＮＨであり； ＥはＣ1−Ｃ10アルキル、Ｎ（Ｑ1）（Ｑ2）又はＮ＝Ｃ（Ｑ1）（Ｑ2）であり
； 各Ｑ1とＱ2は、独立的に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、置換アルキル、ジアルキ
ルアミノアルキル、窒素保護基、テザード(tethered)若しくは非テザード(untet
hered)・コンジュゲート基、固体サポートへのリンカーであり； 又はＱ1とＱ2は一緒に、窒素保護基に又は、ＮとＯから選択される少なくとも
１つの付加的なヘテロ原子を含むことができる環構造に加えられる； ｑ1は１〜１０であり； ｑ2は１〜１０であり； ｑ3は０又は１であり； ｑ4は０、１又は２であり； ｑ5は１〜１０であり； 各Ｍ1は、独立的に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8ハロアルキル、Ｃ（＝
ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ2、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ2又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ2であ
り； Ｍ2はＨ又はＣ1−Ｃ8アルキルであり； Ｚ1、Ｚ2及びＺ3は、約４〜約７個の炭素原子を有する、又は約３〜約６個の
炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有する環系を含み、前記ヘテロ原子
は酸素、窒素及び硫黄から選択され、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族
、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり；及び Ｚ4はＯＭ1、ＳＭ1又はＮ（Ｍ1）2であり； Ｚ5は１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、２〜
約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアル
キニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｑ1）（Ｑ2）、ＯＱ1
、ハロ、ＳＱ1又はＣＮである。
【００７９】 式ＸＩの代表的な２’−Ｏ−糖置換基は、“キャップされた２’−オキシエト
キシオリゴヌクレオチド”なるタイトルの米国特許出願第０９／１３０，９７３
号（１９９８年８月７日出願）に開示されており、これはその全体において本明
細書に援用される。
【００８０】 式ＸＩＩの代表的な環状２’−Ｏ−糖置換基は、“コンフォーメーション的に
予め構成されたＲＮＡターゲット２’−修飾オリゴヌクレオチド”なるタイトル
の米国特許出願第０９／１２３，１０８号（１９９８年７月２７日出願）に開示
されており、これはその全体において本明細書に援用される。
【００８１】 リボシル環上にＯ−置換を有する糖も本発明に従うものである。環Ｏの代表的
な置換は、非限定的に、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦ及びＣＦ2を包含する。例えば、Ｓｅ
ｃｒｉｓｔ等，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２１，Ｐｒｏｇｒａｍ ＆ Ａｂｓｔｒａｃ
ｔｓ，Ｔｅｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ，Ｎｕ
ｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ、１
９９２年９月１６〜２０日を参照のこと、これはその全体において本明細書に援
用される。
【００８２】 オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’−位置
及び５’末端ヌクレオチドの５’−位置において他の修飾を行うこともできる。
例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの１つの付加的な修飾は、オリゴヌクレオ
チドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取り込みを強化する、１
つ以上の部分又はコンジュゲートを化学的に結合することを包含する。このよう
な部分は、非限定的に、例えばコレステロール部分のような脂質部分（Ｌｅｔｓ
ｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８
６，６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキ
シル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂｉｏｏｒ
ｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９３，３，２７６５）、チオコレステ
ロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２
，２０，５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残
基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，
１１１；Ｋａｂａｎｏｖ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７
；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ等，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）、リ
ン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアン
モニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホ
ネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９
５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０
，１８，３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａ
ｒａｎ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５，
１４，９６９）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈ
ｒａ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２
２９）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシ
コレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈ
ｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）を包含する。
【００８３】 本発明のモノマーは、例えば活性化リン酸(phosphate)基又は活性化亜リン酸(
phosphite)基のような、適当な活性化リン基を包含することができる。本明細書
で用いる限り、活性化リン酸基又は活性化亜リン酸基なる用語は、他のモノマー
又はオリゴマー化合物のヒドロキシル基と反応して、リン含有ヌクレオチド間結
合を形成する活性化モノマー又はオリゴマーを意味する。このような活性化リン
基はＰIII又はＰV原子価状態の活性化リン原子を含有する。このような活性化リ
ン原子は当該技術分野で知られており、非限定的に、ホスホロアミダイト、Ｈ−
ホスホネート及びホスフェートトリエステルを包含する。好ましい合成固相合成
(synthetic solid phase synthesis)は活性化ホスフェートとしてホスホロアミ
ダイトを用いる。ホスホロアミダイトはＰIII化学を用いる。中間体のホスフィ
ット化合物を次に既知方法を用いてＰV状態に酸化して、好ましい実施態様では
、ホスホジエステル又はホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生成する。
他の活性化ホスフェート及びホスフィットはＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｒｅｐｏ
ｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ３０９（ＢｅａｕｃａｇｅとＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ、１９９２，４８，２２２３−２３１１）に開示されている。
【００８４】 複素環式塩基部分及び２’−糖置換基に配置されたものを含めた官能基は合成
中に保護基（ブロッキング基）によってルーチンにブロックされ、後に脱ブロッ
クされる。一般に、ブロッキング基は特定の反応条件に対する分子の化学的官能
基(functionality)を不活性にして、後で分子のこのような官能基から分子の残
りの部分を実質的に損傷することなく除去されることができる。ＧｒｅｅｎとＷ
ｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１９９１参照。例えば、アミノ基は例えばフタルイミド、９−フルオレニルメ
トキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トリフェニルメチルスルフェニル、ｔ−ＢＯＣ
又はベンジル基のような窒素保護基によってブロックすることができる。カルボ
キシル基はアセチル基として保護することができる。代表的なヒドロキシル保護
基はＢｅａｕｃａｇｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３
によって記載されている。好ましいヒドロキシル保護基は酸置換活性基(acid-la
bile groups)、例えば、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル
、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）、
及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）である。化
学官能基は先駆体形にそれらを含めることによって“ブロックされる”こともで
きる。したがって、アジド基は容易にアミンに転化されるので、アジド基はアミ
ンの“ブロックされた”形と見なされることができる。オリゴヌクレオチド合成
に用いられる、他の代表的な保護基はＡｇｒａｗａｌ等，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，編集者，Ｈ
ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、２６巻，１−７２
頁で考察されている。
【００８５】 本発明に関連して用いられる“ヌクレオシド”なる用語は、複素環式塩基とそ
の糖から構成された単位を意味する。“ヌクレオチド”なる用語は、その３’又
は５’糖ヒドロキシル基にリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【００８６】 本明細書で用いる限り、“オリゴヌクレオチド”なる用語は、天然生成と非天
延生成（即ち、合成）の両方の、結合したヌクレオシドのオリゴマーを包含する
ように意図される。このような結合は一般的に１つのヌクレオシドの３’炭素と
第２ヌクレオシドの５’炭素との間に形成される（即ち、３’−５’結合）が、
他の結合（例えば、２’−５’結合）が形成されることもできる。
【００８７】 天然生成オリゴヌクレオチドは、天然に生成するオリゴヌクレオチドであり；
例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル核酸塩基を有する
リボース及びデオキシリボース・ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドである
。本明細書で用いる限り、非天然生成オリゴヌクレオチドは、修飾糖、ヌクレオ
シド間結合及び／又は核酸塩基部分を含有するオリゴヌクレオチドである。この
ようなオリゴヌクレオチド類似体は天然生成又は合成野生型(synthetic wild ty
pe)オリゴヌクレオチドとは通常、構造的に識別可能であるが、まだこれらと機
能的に(functionally)相互交換可能である。したがって、非天然生成オリゴヌク
レオチドは、所望のＲＮＡ又はＤＮＡ鎖の構造及び／又は機能を、例えばターゲ
ットにハイブリダイズすることによって効果的に模倣するように機能する、この
ような構造の全てを包含する。
【００８８】 本明細書で用いる限り、“アルキル”なる用語は、非限定的に、直鎖、分枝鎖
及び脂環式炭化水素基を包含する。本発明のアルキル基は置換されることができ
る。代表的なアルキル置換基は米国特許第５，２１２，２９５号、１２欄、４１
−５０行に開示されており、これはその全体において本明細書に援用される。置
換基は、非限定的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキ
シル、アルコキシ、アルコール、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオ
アルコキシ、チオアルキル、トリフルオロメチル、ハロ、ニトリル、トリフルオ
ロメトキシ及びアジドを包含する。本明細書で用いる限り、“低級アルキル”な
る用語は、炭素数１０以下のアルキル基を意味するように意図される。
【００８９】 本発明によるアルケニル基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有す
る直鎖、分枝鎖及び環状炭化水素基を意味し、アルキニル基は、少なくとも１つ
の炭素−炭素三重結合を含有する直鎖、分枝鎖及び環状炭化水素基を意味する。
本発明のアルケニル及びアルキニル基は置換されることができる。
【００９０】 アリール基は置換及び非置換の芳香族環状部分であり、非限定的に、フェニル
、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニル及びキシリル基を包含す
る。アルカリール基は、アリール部分がアルキル部分をコア構造に結合させる基
であり、アラルキル基は、アルキル部分がアリール部分をコア構造に結合させる
基である。
【００９１】 本明細書で用いる限り、“オリゴヌクレオシド”なる用語は、非リン結合部分
を有する２つ以上のヌクレオシド・サブユニットを含有するオリゴマー又はポリ
マーを包含する。本発明によるオリゴヌクレオシドは、グリコシル結合を通して
核酸塩基に結合したリボフラノース部分を有する。本発明のためにオリゴヌクレ
オチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合によって共有結合した少なくとも２つの
ヌクレオシドと、ヌクレオチドによる少なくとも１つのリン含有共有結合を有す
る混合バックボーン・オリゴマーであり、この場合にモノマーヌクレオチド又は
ヌクレオシド単位の少なくとも１つは本発明の方法を用いて製造された２’−Ｏ
−置換化合物である。オリゴヌクレオチド／ヌクレオシドは、リン含有及び／又
は非リン含有結合によってカップリングした複数個のヌクレオチドとヌクレオシ
ドとを付加的に有することができる。
【００９２】 本明細書で用いる限り、“アラルキル”なる用語は、アリール基、例えばベン
ジル基を有するアルキル基を意味する。“アルカリール”なる用語は、アルキル
基、例えばメチルフェニル基を有するアリール基を意味する。本明細書で用いる
限り、“アリール”なる用語は芳香族環状基を意味し、非限定的に、フェニル、
ナフチル、アントラシル、フェナントリル及びピレニルを包含する。好ましいア
リール及びアラルキル基は、非限定的に、フェニル、ベンジル、キシリル、ナフ
チル、トルイル、ピレニル、アントラシル、アズリル、フェネチル、シンナミル
、ベンズヒドリル及びメシチルを包含する。置換のために典型的な置換基は、非
限定的に、ヒドロキシル、アルコキシ、アルコール、ベンジル、フェニル、ニト
ロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、
又はアルキニル基を包含する。
【００９３】 本明細書で用いる限り、“アルカノイル”なる用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）−アル
キルの基としてのその慣用的な意味を有する。好ましいアルカノイル基はアセチ
ル基である。
【００９４】 本発明の方法によって合成されるキラル純粋な糖間結合を有するホスホロチオ
エート・オリゴヌクレオチドは、多くの方法によって分析することができる。例
えば、実質的にキラル純粋な全て−Ｓｐ又は全て−Ｒｐ糖間結合を有する生成配
列特異的ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの形態分析は、［31Ｐ］ＮＭ
Ｒ化学シフトの使用によって判定することができる。このような化学シフトはホ
スホロチオエート・ジヌクレオチドのＲｐエピマーを同定するために用いられて
いる。ＬｕｄｗｉｇとＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３１−６
３５（１９８９）参照。
【００９５】 本発明の方法は、キラルＳｐヌクレオシド間結合の他に、他のキラル及び非キ
ラルヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物を製造するために有用である
。本明細書で定義する限り、他のキラル及び非キラルヌクレオシド間結合は、バ
ックボーンにリン原子を保持するもの及びバックボーンにリン原子を保持しない
ものを包含する意味である。本明細書のために、及び当該技術分野でときには参
照される限り、それらのヌクレオシド間結合にリン原子を有さない修飾オリゴヌ
クレオチドは、オリゴヌクレオシドであると見なされることもできる。
【００９６】 好ましい修飾オリゴヌクレオシド結合は、例えば、正常な３’−５’結合を有
する、ホスホロチオエート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート
；ホスホトリエステル；アミノアルキル−ホスホトリエステル；３’−アルキレ
ンホスホネート及びキラルホスホネートを含めたメチル及び他のアルキルホスホ
ネート；３’−アミノホスホロアミダイト及びアミノアルキルホスホロアミダイ
トを含めたホスホロアミダイト；チオノホスホロアミダイト；チオノアルキルホ
スホネート；チオノアルキルホスホトリエステル；及びボラノホスフェート(bor
anophosphates)；これらの２’−５’結合類似体；並びにヌクレオシド単位の隣
接対が３’−５’対５’−３’又は２’−５’対５’−２’結合した逆の極性を
有するものを包含する。種々な塩、混合塩及び遊離酸形も包含される。
【００９７】 上記リン含有結合の製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に、米国
特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１
号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５,１８８,８９７号
；第５，２６４，４２３号；第５，２６７，０１９号；第５，２７８，３０２号
；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号
；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号
；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号
；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号
；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号
；及び第５，６２５，０５０号を包含し、これらのうちのあるものは本出願と共
通に所有されており、またこれらの各々は本明細書に援用される。
【００９８】 それらのなかにリン原子を包含しない、好ましい修飾オリゴヌクレオシド結合
は、アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子と
アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘ
テロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合を包含する。これらは、モルホリ
ノ結合を有するもの（一部は、ヌクレオシドの糖部分から形成）；シロキサン・
バックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホン・バックボーン；ホルム
アセチル及びチオホルムアセチル・バックボーン；メチレンホルムアセチル及び
チオホルムアセチル・バックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメー
ト・バックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ・バックボーン；ス
ルホネート及びスルホンアミド・バックボーン；アミド・バックボーン；及び混
合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ2構成成分部分を有する他のバックボーンを包含する。
【００９９】 上記オリゴヌクレオシドの製造を教示する、代表的な米国特許は、非限定的に
、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，
４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５,２３５，
０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，
９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，
９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，
２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，
２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，
２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，
３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７
７，４３９号を包含し、これらのうちのあるものは本出願と共通に所有されてお
り、またこれらの各々は本明細書に援用される。
【０１００】 本発明のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの配列のフィデリティ(fid
elity)は、Ｓ１ヌクレアーゼに対するヘテロ二本鎖(heteroduplexes)の感受性を
利用して判定することができる。
【０１０１】 ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルを［α−32Ｐ］
コルジセピントリホスフェート、即ち、３’−デオキシアデノシン−５’−トリ
ホスフェートによって標識することによって、ホスホロチオエート・オリゴヌク
レオチドの配列をさらに実証することができる。生成するオリゴヌクレオチドに
酵素分解を行うことができる。
【０１０２】 実質的にキラル純粋な糖間結合を有するホスホロチオエート・オリゴヌクレオ
チドの、同じラセミ配列に比べた、相補的鎖に結合する相対的能力を、各オリゴ
ヌクレオチドの相補的鎖とのハイブリダイゼーション複合体の融点の測定によっ
て比較する。二重らせんの特徴的な物理的性質である融点（Ｔm）は、５０％ら
せん形対コイル状（ハイブリダイズされない）形が存在する温度（℃）を意味す
る。ＵＶスペクトルを用いて、ハイブリダイゼーションの形成と破壊（溶融）を
判定することによって、Ｔmが測定される。ハイブリダイゼーション中に生じる
塩基重層はＵＶ吸収の低下（低色素性(hypochromicity)）を付随する。したがっ
て、ＵＶ吸収の低下はＴm上昇を意味する。Ｔmが高ければ高いほど、鎖の結合強
度は大きい。非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合はＴmに基いて強い不安定化
効果を有する。したがって、塩基対合の最適フィデリティにできる限り密接する
ことが、オリゴヌクレオチドがそのターゲットＲＮＡに最適結合するために望ま
しい。
【０１０３】 本発明のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは種々なエキソヌクレアー
ゼ及びエンドヌクレアーゼの分解力に対するそれらの耐性に関しても評価される
。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによって処理して、
次に、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）とその後の適当な染
料、例えばＳｔａｉｎｓ ＡｌｌTM（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）による染色によって分析する。分解生成物はレーザー・デンシ
トメトリー(laser densitometry)を用いて定量する。
【０１０４】 ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド−ＲＮＡヘテロ二本鎖の、ＲＮアー
ゼＨの触媒活性に対する感受性を容易に評価される。ホスホロチオエート・オリ
ゴヌクレオチドを放射性標識したターゲットｍＲＮＡ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼによって合成）と共にハイブリダイゼーションのための種々な温度にお
いてインキュベートすることができる。次に、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ，Ｊ．とＨｕｎ
ｔ，Ｔ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８６，６４３３−６４５１の方法
に従って、ヘテロ二本鎖をＥ．ｃｏｌｉからのＲＮアーゼＨと共に３７℃におい
てインキュベートすることができる。次に、生成物をＲＮアーゼＨ活性に関して
ノーザンブロット分析によって評価する、この場合に生成物を１．２％アガロー
ス／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動させ、ニトロセルロースに移す。次に、
ターゲットｍＲＮＡに相補的な、ランダムプライマー［32Ｐ］標識ｃＤＮＡを用
いて、フィルター(filters)を検査(probe)し、オートラジオグラフィーによって
定量する。次に、ヘテロ二本鎖の、ＲＮアーゼＨに対する基質として作用する相
対的能力に対するキラリティーの効果を、種々なホスホロチオエート類似体に関
して算出する。
【０１０５】 Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮアーゼＨと哺乳動物のＲＮアーゼＨとの触媒作用に対する
ヘテロ二本鎖の感受性の比較を行う。ヘテロ二本鎖をウサギ網状赤血球リゼイト
中で翻訳条件下でインキュベートして、内因性ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの触
媒開裂に関してノーザンブロット分析によって分析する。これは哺乳動物のＲＮ
アーゼＨ活性に対するキラリティーの効果の測定を可能にする。
【０１０６】 治療的及び製薬的使用に関しては、本発明の化合物を例えば溶液、懸濁液、錠
剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル剤及び注射可能な組成物のような、製薬的に
受容されるキャリヤー中に取り入れることができる。投与量は例えば状態の性質
と重症度、状態のステージ、及び患者の状態のような要因に依存する。オリゴヌ
クレオチドの有効量は約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１０００μｇ／ｋｇ体重であり
うる。
【０１０７】 本発明のオリゴマー化合物は、診断薬、治療薬並びに研究試薬及びキットとし
て用いることができる。本発明のオリゴマー化合物は適当な製薬的に受容される
希釈剤又はキャリヤーを含めることによって、薬剤組成物として用いることもで
きる。これらの化合物はさらに、タンパク質の好ましくない産生を特徴とする疾
患を有する生物の治療に用いることができる。このために、この好ましくないタ
ンパク質をコードする核酸の鎖と特異的にハイブリダイズすることができる配列
を有するオリゴヌクレオチドに、生物を接触させる。このタイプの処置は単細胞
原核及び真核生物から多細胞真核生物までの範囲の多様な生物に行うことができ
る。その遺伝的、代謝的又は細胞的調節の基本的部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写
又はＲＮＡ−タンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、本発明による治療的及
び／又は予防的処置を受けやすい。見たところでは、例えば細菌、酵母、原生動
物、藻類、全ての植物及び温血動物を含めた全ての高等動物体のような種々な生
物が処置されることができる。さらに、多細胞真核生物の各細胞はそれらの細胞
活性の不可欠な部分(integral parts)としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写及びＲＮＡ−タ
ンパク質翻訳を有するので、多細胞真核生物の各細胞を処置することができる。
さらに、真核細胞のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア及びクロロプラスト）
の多くも転写及び翻訳機構を包含する。したがって、単細胞、細胞集団又はオル
ガネラも、治療用又は診断用オリゴヌクレオチドによって処置することができる
生物の定義内に含めることができる。
【０１０８】 治療用組成物の形成と、それらのその後の投与とは当業者の熟練(skill)の範
囲内であると考えられる。一般に、治療薬としては、このような治療を必要とす
る患者に、本発明によるオリゴマーが通常製薬的に受容されるキャリヤー中に含
めて、患者の年齢及び治療される疾患状態の重症度に依存して０．０１μｇ〜１
００ｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で投与される。さらに、この治療は１回投与であ
ることも、又は特定の疾患の性質、その重症度及び患者の総合状態に依存して変
化し、１日１回から２０年間毎に１回までに及ぶことがありうる一定の期間にわ
たって続けられうる計画であることも可能である。治療後に、患者の状態の変化
に関して、及び疾患状態の症状の軽減に関して患者をモニターする。患者が現在
の投与量レベルに有意に反応しない場合にはオリゴマーの投与量を高めることが
でき、疾患状態の症状の軽減が観察される場合又は疾患状態が除去された場合に
は、投与量を減ずることができる。
【０１０９】 場合によっては、本発明のオリゴマーに他の伝統的な治療法(therapeutic mod
alities)を組み合わせて患者を治療することがより効果的である可能性がある。
例えば、ＡＩＤＳのために治療される患者にはＡＺＴと組み合わせてオリゴマー
を投与することができる、又はアテローム硬化症を有する患者は治療した動脈の
再閉塞を防止するために血管形成術後に本発明のオリゴマーによって治療するこ
とができる。
【０１１０】 投与は治療される疾患状態の重症度と反応とに依存し、治療過程は数日間から
数か月間まで、又は治癒が生ずるまで又は疾患状態の軽減が得られるまで持続す
る。最適投与スケジュールは患者の体内における薬物蓄積の測定から算出するこ
とができる。通常に熟練した人は最適の投与量、投与方法及び反復速度を容易に
判定することができる。最適投与量は個々のオリゴマーの相対的効力に依存して
変化し、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効で
あると判明したＥＣ50に基いて算出されうる。一般に投与量は０．０１μｇ〜１
００ｇ／ｋｇ体重であり、これを１日間に、１週間に、１か月間に又は１年間に
１回以上、或いは２年間毎〜数年間毎に１回さえも投与することができる。
【０１１１】 上首尾な治療後に、疾患状態の再発を防止するために、オリゴマーを０．０１
μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で１日に１回以上から数年間毎に１
回まで投与する維持療法を患者に受けさせることが望ましいと考えられる。
【０１１２】 本発明の薬剤組成物は、局所治療又は全身治療のいずれが望ましいかに依存し
て及び治療される領域に依存して多くの方法で投与することができる。投与は局
所的（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮）、経口的又は非経口的であることが
できる。非経口投与は静脈内点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、又は鞘内
若しくは心室内(intraventricular)投与を包含する。
【０１１３】 局所投与用製剤は経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ
、座薬、スプレイ、液体及び粉末を包含しうる。慣用的な製薬的キャリヤー、水
性基剤、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必要であるか又は望ましいと考えられる
。被覆コンドーム、グローブ等も有用であると考えられる。
【０１１４】 経口投与用組成物は粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性媒質中の懸濁液若し
くは溶液、カプセル剤、薬袋(sachet)又は錠剤を包含する。増粘剤、フレーバー
剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいと考えられる。 鞘内又は心室内投与用組成物は、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤をも含
有しうる無菌水溶液を包含しうる。
【０１１５】 非経口投与用製剤は、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤をも含有しうる無
菌水溶液を包含しうる。
【０１１６】 このタイプの処置は単細胞原核及び真核生物から多細胞真核生物までの範囲の
多様な生物に行うことができる。その遺伝的、代謝的又は細胞的調節の基本的部
分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写又はＲＮＡ−タンパク質翻訳を利用するいずれの生
物も、本発明による治療的及び／又は予防的処置を受けやすい。見たところでは
、例えば細菌、酵母、原生動物、藻類、全ての植物及び温血動物を含めた全ての
高等動物体のような種々な生物が処置されることができる。さらに、多細胞真核
生物の各細胞はそれらの細胞活性の不可欠な部分(integral parts)としてＤＮＡ
−ＲＮＡ転写及びＲＮＡ−タンパク質翻訳を有するので、多細胞真核生物の各細
胞を処置することができる。さらに、真核細胞のオルガネラ（例えば、ミトコン
ドリア及びクロロプラスト）の多くも転写及び翻訳機構を包含する。したがって
、単細胞、細胞集団又はオルガネラも、治療用又は診断用オリゴヌクレオチドに
よって処置することができる生物の定義内に含めることができる。
【０１１７】 非常に多くの変更及び修正を本発明の好ましい実施態様に加えることができ、
このような変更及び修正が本発明の要旨から逸脱せずに行われうることを、当業
者は理解するであろう。それ故、特許請求の範囲は、本発明の実際の要旨及び範
囲内に入るような同等の変更の全てを包含するように意図される。
【０１１８】 本発明の化合物には多くの治療適応症と、一般的な用途が存在する。典型的な
適応症と用途は以下を包含する： 特に重要な１つの治療適応症は乾癬である。乾癬は、乾燥した、充分な限局性
の銀色スケーリングを有する種々なサイズの小隆起とプラークを特徴とする一般
に慢性及び再発性の疾患である。この疾患は若干の病巣から運動不能性関節炎若
しくは皮膚剥脱を伴う広範囲に及ぶ皮膚病まで重症度において変化する。乾癬の
究極的原因は不明であるが、生ずる厚いスケーリングは恐らく表皮細胞の増殖に
よると考えられる（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５版，２２８３−２２８５，Ｂｅｒｋｏｗ等
編集，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）
の阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗増殖効果と抗炎症効果の両方を有するこ
とが判明している。例えばシクロスポリンＡとアントラリンのような、幾つかの
抗乾癬薬はＰＫＣを阻害することが判明しており、ＰＫＣの阻害が乾癬を治療す
るための治療アプローチとして提案されている（Ｈｅｇｅｍａｎｎ，Ｌ．とＧ．
Ｍａｈｒｌｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ，Ｈ．Ｍｕ
ｋｈｔａｒ編集，３５７−３６８頁，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ，ＦＬ，１９９２）。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）タンパク質をターゲッ
トとするアンチセンス化合物は、Ｃｏｏｋ等への米国特許第５，６２０，９６３
号と、Ｂｏｇｇｓ等への第５，６８１，７４７号に記載されている。
【０１１９】 重要な他のタイプの治療適応症は皮膚の炎症性障害である。これらは例えば扁
平苔癬、毒性表皮壊死(toxic epidermal necrolyis)（ＴＥＮ）、多形紅斑等を
含めた、多様な形態で生ずる（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５版，２２８６−２２９２，Ｂｅ
ｒｋｏｗ等編集，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）。ＩＣＡＭ−１の発現は
多様な炎症性皮膚障害、例えばアレルギー性接触皮膚炎、固定薬疹、扁平苔癬及
び乾癬に関連付けられている（ＨＯ等，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ
．，１９９０，２２，６４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏ
ｇｙ，１９８９，１３５，１０４５；Ｌｉｓｂｙ等，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ．，１９８９，１２０，４７９；Ｓｈｉｏｈａｒａ等，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ．，１９８９，１２５，１３７１；Ｐｅｇｅｚｌ等，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ
．Ｏｒａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．，１９９６，８１，６８２）。
さらに、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の腹腔内投与は、マウスにお
ける皮膚へのオバルブミン誘導好酸球浸潤を減少する（Ｈａｋｕｇａｗａ等，Ｊ
．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７，２４，７３）。ＩＣＡＭ−１をターゲットとす
るアンチセンス化合物は米国特許第５，５１４，７８８号と第５，５９１，６２
３号及び同時係属米国特許出願第０９／００９，４９０号と第０９／０６２，４
１６号（それぞれ、１９９８年１月２０日と１９９８年４月１７日出願）に記載
されており、これらは全てＢｅｎｎｅｔｔ等へ付与されたものである。
【０１２０】 皮膚炎症性障害に関する他のアンチセンス・ターゲットはＶＣＡＭ−１とＰＥ
ＣＡＭ−１である。ＶＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の腹腔内投与は、
マウス皮膚中へのオバルブミン誘導好酸球浸潤を減少する（Ｈａｋｕｇａｗａ等
，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７，２４，７３）。ＶＣＡＭ−１をターゲット
とするアンチセンス化合物は米国特許第５，５１４，７８８号と第５，５９１，
６２３号に記載されている。ＰＥＣＡＭ−１タンパク質は、多様な細胞種類の表
面に発現される糖タンパク質である（検討のためには、Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９７，９９，３と、ＤｅＬｉｓｓｅｒ等，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９４，１５，４９０参照）。ＰＥＣＡＭ−１は、細胞
−細胞相互作用に直接関与する他に、細胞相互作用に関与する他の分子の活性及
び／又は発現をも調節するように思われる（Ｌｉｔｗｉｎ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１９９７，１３９，２１９）、したがって、幾つかの細胞：細胞相互
作用の重要なメディエーターである。ＰＥＣＡＭ−１をターゲットとするアンチ
センス化合物は同時係属米国特許出願第０９／０４４，５０６号（１９９８年３
月１９日に、Ｂｅｎｎｅｔｔ等によって出願）に記載されている。
【０１２１】 オリゴヌクレオチドの重要な他のタイプの治療適応症は、皮膚の多様な癌を包
含する。典型的な皮膚癌は良性腫瘍（いぼ、色素性母斑等）と、例えば、基底細
胞癌、扁平上皮癌、悪性メラノーマ、Ｐａｇｅｔ病、Ｋａｐｏｓｉ肉腫等のよう
な悪性腫瘍とを包含する（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５版，２３０１−２３１０，Ｂｅｒｋ
ｏｗ等編集，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）。腫瘍発生、高増殖状態の維
持及び転移に関与する多くの分子ターゲットが皮膚癌を予防若しくは抑制するた
め、又は皮膚癌の他の組織への伝播を防止するために標的にされる。
【０１２２】 ｒａｓ癌遺伝子は、例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子が一般にヒト腫瘍の約３０
％に検出されており、この値が外分泌膵臓の癌では１００％に近いという事実に
よって癌に関係があるとされているグアニン結合タンパク質である（検討のため
には、Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、１９９０
，１５，４６９参照）。Ｈ−ｒａｓとＫ−ｒａｓをターゲットとするアンチセン
ス化合物は、Ｌｉｍａ等への米国特許第５，５８２，９７２号、Ｍｏｎｉａ等へ
の第５，５８２，９８６号、及びＣｏｏｋ等への第５，６６１，１３４号に、及
び公開ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０８００３に記載されている。
【０１２３】 プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）タンパク質も腫瘍発生に関係があるとされて
いる。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）タンパク質をターゲットとするアンチセ
ンス化合物は、Ｃｏｏｋ等への米国特許第５，６２０，９６３号と、Ｂｏｇｇｓ
等への第５，６８１，７４７号に記載されている。
【０１２４】 ＡＰ−１サブユニットとＪＮＫタンパク質も、特に、腫瘍発生と転移における
それらの役割に関して重要である。転移プロセスは、（１）癌細胞がその細胞外
マトリックスから分離し、（２）分離した癌細胞が動物の身体の他の部分に、し
ばしば循環系を介して移動して、（３）遠位の不適当な細胞外マトリックスに付
着することによって、病巣を形成し、この病巣から二次腫瘍が発生しうるという
一連のイベントを含む。正常な細胞は、このようなイベントが生じるとしても、
侵襲する若しくは転移する及び／又はアポトーシス（プログラムされた細胞死）
を受ける能力を有さない（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，１９９６
，２７５，７２）。しかし、多くのヒト腫瘍は１種類以上のマトリックス・メタ
ロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）の高レベルの活性を有する（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓ
ｔｅｖｅｎｓｏｎ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９３，９
，５４１；Ｂｅｒｎｈａｒｄ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ
．Ｓ．Ａ．），１９９４，９１，４２９３）。ＭＭＰｓは細胞外マトリックスの
成分を分解する能力を有する酵素のファミリーである（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａ
ｎｓｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ，Ｂｉｏｌ．，１９９５，７，７２８）。特に
、このファミリーの１メンバー、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−９（Ｍ
ＭＰ−９）はしばしば腫瘍及び他の罹患組織においてのみ発現されることが見出
される（Ｈｉｍｅｌｓｔｅｉｎ等，Ｉｎｖａｓｉｏｎ ＆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉ
ｓ，１９９４，１４，２４６）。
【０１２５】 幾つかの研究が、ＭＭＰ−９遺伝子の調節がＡＰ−１転写因子によって制御さ
れうることを示している（Ｋｅｒｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４２，１
２４２；Ｋｅｒｒ等，Ｃｅｌｌ，１９９０，６１，２６７；Ｇｕｍ等，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，１０６７２；Ｈｕａ等，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，１９９６，５６，５２７９）。ＡＰ−１機能の阻害はＭＭＰ−９発現
を弱めることが判明している（米国特許出願第０８／８３７，２０１）。ＡＰ−
１は、２つのサブユニット、ｆｏｓとｊｕｎの遺伝子産物を有するヘテロダイマ
ータンパク質である。ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎをターゲットとするアンチセン
ス化合物は同時係属米国特許出願第０８／８３７，２０１号（１９９７年３月１
４日、Ｄｅａｎ等によって出願）に記載されている。
【０１２６】 さらに、ＡＰ−１はある一定の状況下ではＪｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ
ｓ）によるアミノ末端位置のＪｕｎサブユニットのリン酸化によってそれ自体活
性化される。したがって、１つ以上のＪＮＫｓの阻害がＡＰ−１活性の低下を生
じ、したがってＭＭＰ発現を減ずることが期待されている。ＪＮＫｓをターゲッ
トとするアンチセンス化合物は同時係属米国特許出願第０８／９１０，６２９号
（１９９７年８月１３日、Ｄｅａｎ等によって出願）に記載されている。
【０１２７】 皮膚の感染性疾患はウイルス、細菌又は真菌作因によって惹起される。Ｌｙｍ
ｅ病の場合には、そのマダニ伝染性(tick borne)病因、スピロヘータＢｏｒｒｅ
ｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて内皮細胞上のＩＣ
ＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及びＥＬＡＭ−１の発現をアップレギュレートする（Ｂ
ｏｇｇｅｍｅｙｅｒ等，Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９９４，２，１
４５）。さらに、抗炎症薬プレドニゾロンによるこの疾患の仲介(mediation)は
ある程度、接着分子のこのアップレギュレーションの仲介によると考えられる(
Ｈｕｒｔｅｎｂａｃｈ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，１９９
６，１８，２８１）。したがって、Ｌｙｍｅ病の治療的仲介（又は防止）のため
の可能なターゲットはＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及びＥＬＡＭ−１を包含する
（上記文献）。
【０１２８】 本発明の組成物及び方法を用いる治療に従いやすい他の感染性皮膚疾患は、ウ
イルス、細菌又は真菌作因による感染から生じる障害を包含する（Ｔｈｅ Ｍｅ
ｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，
１５版，２２６３−２２７７，Ｂｅｒｋｏｗ等編集，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，
１９８７）。
【０１２９】 真菌作因によって惹起される皮膚感染症に関して、米国特許第５，６９１，４
６１号はＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を阻害するためのアンチセン
ス化合物を提供する。
【０１３０】 ウイルス作因によって惹起される皮膚感染症に関して、米国特許第５，１６６
，１９５号、第５，５２３，３８９号及び第５，５９１，６００号はヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。米国特許第５，
００４，８１０号は単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５ ｍＲＮＡにハイブリダイ
ズして、その複製を阻害することができるオリゴマーを提供する。米国特許第５
，１９４，４２８号と第５，５８０，７６７号はインフルエンザウイルスに対す
る抗ウイルス活性を有するアンチセンス化合物を提供する。米国特許第４，８０
６，４６３号は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製を阻害するためのアンチセンス化合物と
それらを用いる方法とを提供する。米国特許第４，６８９，３２０号、第５，４
４２，０４９号、第５，５９１，７２０号及び第５，６０７，９２３号はサイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）に対して特異的な抗ウイルス剤としてアンチセンス化
合物に関する。米国特許第５，２４２，９０６号は潜在的Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａ
ｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染症の治療に有用なアンチセンス化合物を提供する。
米国特許第５，２４８，６７０号、第５，５１４，５７７号及び第５，６５８，
８９１号はヘルペスウイルス感染症の治療に有用なアンチセンス化合物を提供す
る。米国特許第５，４５７，１８９号と第５，６８１，９４４号は乳頭腫ウイル
ス感染症の治療に有用なアンチセンス化合物を提供する。本明細書に援用される
、これらの特許に開示されるアンチセンス化合物は、指定された病原性作因によ
って惹起又は悪化される疾患からの予防的、緩和的又は治療的解放を生じるため
に本発明の組成物と併用されることができる。
【０１３１】 本発明の組成物に用いられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、動物にお
ける疾患又は身体状態に対する身体の種々な遺伝的成分の性質、機能及び可能な
関係を判定するためにも用いることができる。今までは、遺伝子の機能は主とし
て動物（例えば、トランスジェニック・マウス）における遺伝子の機能欠損突然
変異（例えば、“ノックアウト”突然変異）の構築によって試験されている。こ
のようなタスクは困難であり、時間がかかり、“ノックアウト”突然変異が致命
的表現型を生じるので、動物の発達に本質的な遺伝子に対しては行うことができ
ない。さらに、機能欠損表現型は動物のライフサイクルの特定部分又は疾患状態
中に一時的に導入することができない；“ノックアウト”突然変異は常に存在す
る。“アンチセンス・ノックアウト”、即ち直接の遺伝子操作によるのではなく
、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる遺伝子の発現の選択的モジュレーシ
ョンはこれらの制限を克服する（例えば、Ａｌｂｅｒｔ等，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９４，１５，２５
０）。さらに、幾つかの遺伝子は、例えば選択的スプライシングのようなプロセ
スの結果として多様なｍＲＮＡ転写体を生じる；“ノックアウト”突然変異は典
型的にこのような遺伝子から生じるあらゆる形態のｍＲＮＡ転写体を除去するの
で、特定のｍＲＮＡ転写体の生物学的役割の試験に用いることができない。アン
チセンス・オリゴヌクレオチドは、ニューロン死におけるＮ−メチル−Ｄ−アス
パラテート受容体の役割を研究するためにラットに、プロテインキナーゼＣ−ａ
の生物学的役割を研究するためにマウスに、及び不安における神経ペプチドＹ１
受容体の役割を試験するためにラットに全身投与されている（それぞれ、Ｗａｈ
ｌｅｓｔｅｄｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６３：２６０；Ｄｅａｎ等，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１：１１７
６２；及びＷａｈｌｅｓｔｅｄｔ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９：５２
８）。関連タンパク質の複合ファミリーを研究している場合には、“アンチセン
ス・ノックアウト”（即ち、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの全身投与によ
る遺伝子の阻害）は、このファミリーの特定メンバーを試験するための最も精確
な手段を表すことができる（一般に、Ａｌｂｅｒｔ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９４，１５：２５０参照）。オリゴヌクレオチド及
び他の核酸の単純な(simple)非−非経口投与のための組成物と方法を提供するこ
とによって、本発明はこれら及び他の欠点を克服する。
【０１３２】 本発明のオリゴヌクレオチドを含む治療用組成物又は薬剤組成物の投与は当業
者の熟練の範囲内であると考えられる。一般に、治療又は予防を必要とする患者
に、本発明の化合物を含む組成物が通常製薬的に受容されるキャリヤー中に含め
て、患者の年齢及び治療される障害又は疾患状態の重症度に依存して０．０１μ
ｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で投与される。投与は治療される疾患状態
の重症度と反応性とに依存し、治療の経過は数日間から数か月間にまで、又は疾
患状態の治癒若しくは軽減若しくは予防が達成されるまで持続する。最適投与ス
ケジュールは患者の体内における薬物蓄積の測定から算出することができる。通
常に熟練した人は最適の投与量、投与方法及び反復速度を容易に判定することが
できる。最適投与量は個々のアンチセンス化合物の相対的効力に依存して変化し
、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であると
判明したＥＣ50に基いて算出されうる。
【０１３３】 本発明に関して、“治療計画(treatment regimen)”なる用語は、本発明の１
種類以上の組成物の投与の治療的、緩和的及び予防的モダリティ(modalities)を
包含する意味である。特定の治療計画は特定の疾患又は障害の性質、その重症度
及び患者の総合状態に依存して変化し、１日１回から２０年間毎に１回までに及
ぶことがありうる一定の期間にわたって続けられうる。治療後に、患者の状態の
変化に関して、及び障害若しくは疾患状態の症状の軽減に関して患者をモニター
する。患者が現在の投与量レベルに有意に反応しない場合には組成物の投与量を
高めることができ、障害若しくは疾患状態の症状の軽減が観察される場合又は障
害若しくは疾患状態が除去された場合には、投与量を減ずることができる。
【０１３４】 本発明のオリゴヌクレオチドの治療有効量を投与するために、最適投与スケジ
ュールが用いられる。本発明のために“治療有効量”なる用語は、予定された目
的を好ましくない副作用（例えば、毒性、被刺激状態又はアレルギー反応）なし
に達成するために有効である、オリゴヌクレオチド含有薬剤組成物の量を意味す
る。個人の必要量は変化しうるが、薬剤組成物の有効量の最適範囲の判定は当該
技術分野の熟練の範囲内である。ヒトの投与量は動物研究から補外することがで
きる（Ｋａｔｏｃｓ等，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，２７章，Ｇｅｎｎａｒｏ編集，Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０）。一般に、薬剤組
成物の有効量を与えるために必要な投与量は当業者によって調節することができ
、レシピエントの年齢、健康、物理的状態、体重、疾患又は障害の種類と程度、
治療の回数、同時療法（存在するならば）の性質並びに所望の効果（単数又は複
数種類）の性質及び範囲に依存して変化する（Ｎｉｅｓ等，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆
Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３章，９版，Ｈａｒｄｍａｎ等編集，ＭｃＧ
ｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６）。
【０１３５】 上首尾な治療後に、疾患状態の再発を防止するために、バイオアクティブ剤(b
ioactive agent)を０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲の維持用量で１日
に１回以上から２０年間毎に１回まで投与する維持療法を患者に受けさせること
が望ましいと考えられる。例えば、自己免疫又は炎症性状態に罹患しやすいと知
られている又は疑われる個体の場合には、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の
範囲である予防投与量の１日に１回以上から２０年間毎に１回までの投与によっ
て、予防効果を得ることができる。同様な形式で、個体を何らかの医学的治療の
結果として生ずると予想される炎症性状態に、例えば細胞、組織若しくは器官の
個体中への移植に由来する対宿主性移植片病に対して低感受性にすることができ
る。
【０１３６】 高リスク個体のための予防モダリティも本発明によって包含される。本明細書
で用いる限り、“高リスク個体”なる用語は、疾患又は障害の発生又は再発を受
ける確率が正常よりも有意に高いことが、例えば、個体若しくはファミリーの病
歴又は遺伝的検査から判明している個体を表す意味である。例えば、対象動物は
、特定の疾患又は障害の頻繁な発生を包含する個体及び／又はファミリーの病歴
を有することができる。他の例として、対象動物は、当該技術分野で知られた方
法による遺伝的スクリーニングによって判定された、このような発生率を有して
いることができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｎｉｔｏ
ｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ，
ＯＴＡ−ＢＡ−４５５，５章，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎ
ｇ Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９０，７５−９９頁
参照）。高リスク個体に関する治療計画の一部として、疾患又は障害の発生又は
再発を防止するために、個体を予防的に処置することができる。“予防有効量”
なる用語は、疾患又は障害の発生又は再発の防止として観察される効果を生じる
薬剤組成物の量を表す意味である。薬剤組成物の予防有効量は、薬剤組成物が有
する効果を、活性剤を含まない第２薬剤組成物を同様な状態の個体に投与すると
きに観察される効果に比較することによって、典型的に判定される。
【０１３７】 治療的使用に関して、何らかのタンパク質によってモジュレートされた疾患に
罹患した動物にオリゴヌクレオチド類似体を投与する。このような疾患に罹患し
たと疑われる患者に疾患の症状を軽減するために有効である量のオリゴヌクレオ
チド類似体を投与することが好ましい。当業者は、このような治療計画のための
最適の投与量と治療スケジュールとを判定することができる。
【０１３８】 モジュレートされる予定であるＲＮＡ又はＤＮＡ部分が、その形成又は活性が
モジュレートされるべきであるタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ部分を
含むように予め選択されることが好ましい。したがって、用いられる組成物のタ
ーゲッティング部分はＤＮＡ若しくはＲＮＡの予め選択された部分に相補的であ
るように、即ち、その部分に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドであるよ
うに選択される。
【０１３９】 本発明の好ましい実施態様によると、本発明の化合物は、ｔａｔ タンパク質
をコードするＨＩＶ ｍＲＮＡに、又はＨＩＶ ｍＲＮＡのＴＡＲ領域にハイブ
リダイズする。他の好ましい実施態様では、化合物はＨＩＶ ｍＲＮＡのＴＡＲ
領域の二次構造を模倣し、このようにすることによって、ｔａｔ タンパク質を
結合する。他の好ましい化合物はヘルペス、乳頭腫及び他のウイルスに対して相
補的に配列形成する。
【０１４０】 本発明による治療剤を例えば経口的、静脈内又は筋肉内にのように内部的に(i
nternally)投与することが、一般に好ましい。例えば、経皮的、局所的又は病巣
内にのような、他の投与形式も使用可能である。座薬に含めることも有用であり
うる。一部の実施態様のためには、薬理学的に受容されるキャリヤーの使用も好
ましい。
【０１４１】 本発明は、研究及び診断のためにＲＮＡを選択的に結合する方法にも関する。
このような選択的な強い結合は、このようなＲＮＡ又はＤＮＡを、分解ヌクレア
ーゼに対して耐性であり、既知オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似
体よりも強く、かつ大きいフィデリティでハイブリダイズする本発明の組成物と
相互作用させることによって達成される。
【０１４２】 実施例 一般： 溶媒は蒸留によって乾燥させた： ＴＨＦはナトリウムベンゾフェノンケチル上で；アセトニトリルとトリエチル
アミンは水素化カルシウム上で；ピリジンは酸化バリウム上で乾燥させた。ＤＢ
Ｕは真空下で蒸留してから、４Å Ｌｉｎｄｅ モレキュラーシーブ上でアルゴ
ン下において貯蔵する。ＰＣｌ3を最初にアルゴン下で２時間還流させることに
よって脱気させ、分留させ、アルゴン下で貯蔵する。水はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｉｎｃ．から入手したＨＰＬＣ等級である。
【０１４３】 実施例１ ４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノールの異性体的に純粋なＲ異性体と
Ｓ異性体 Ｒ−４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノールとＳ−４−メルカプト−
４−メチル−２−ペンタノールとをＥｌｉｅｌとＭｏｒｒｉｓ−Ｎａｔｓｃｈｋ
ｅの方法（Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｍｏｒｒｉｓ−Ｎａｔｓｃｈｋｅ、Ｓ．，Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８４，１０６，２９３７−２９４２）に従って
合成する。
【０１４４】 実施例２ Ｒｐ先駆体、化合物１ 予めアルゴンによってフラッシュし、セプタムによってシールした、２０ｍｌ
の乾燥ＴＨＦを含有する乾燥１００ｍｌ丸底フラスコ中に、ＰＣｌ3（１．３ｍ
ｌ，１５ｍｍｏｌ）を注射器によって導入する。このフラスコをドライアイス／
アセトン浴中で−７８℃に冷却し、トリエチルアミン（６．９ｍｌ、５０ｍｍｏ
ｌ）を含有するＴＨＦ（１５ｍｌ）中の（Ｒ）−４−メルカプト−４−メチル−
２−ペンタノール（１５ｍｍｏｌ）の溶液を注射器によって加える。この反応混
合物を−７８℃において３０分間撹拌してから、０℃に１時間温度上昇させる。
この反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2と飽和ＮａＨＣＯ3とに分配し、飽和ＮａＣｌによ
って洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
【０１４５】 実施例３ 化合物２ ヘキサン中の化合物１をモルホリンによって、０℃において細心に滴加して処
理する。低温浴を除去して、混合物を室温においてさらに１時間撹拌する。モル
ホリン塩酸塩を濾過によって取り出し、化合物２をシリカゲル カラムクロマト
グラフィーによって精製する。
【０１４６】 実施例４ Ｒｐ結合、構造３を合成するために用いられるモノマーの一般的合成方法 −７８℃における乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴヌク
レオシド（２’−Ｏ−デオキシ、５’−Ｏ−ＤＭＴ−６−Ｎ−ベンゾイルアデノ
シン、２’−Ｏ−デオキシ、５’−Ｏ−ＤＭＴ−４−Ｎ−ベンゾイルシチジン、
２’−Ｏ−デオキシ、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２−Ｎ−イソブチルグアノシン、２’
−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン又は修飾され、任意に保護された
５−Ｏ−ＤＭＴ−ヌクレオシド）１０ｍｍｏｌに、ＴＨＦ中の１Ｈ−テトラゾー
ル（１１ｍｍｏｌ）の１５ｍｍｏｌ溶液２０ｍｌを注射器によって加える。この
反応混合物を−７８℃において３０分間撹拌し、冷却浴を除去し、溶液を室温に
温度上昇させる。この溶液に、ＴＨＦ中の化合物２（１１ｍｏｌ）を２〜４時間
撹拌しながら滴加する。硫化試薬３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−
１，１−ジオキシド（ＣＨ3ＣＮ中２％）（Ｉｙｅｒ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１２５３）を１時間撹拌しながら加える。溶媒を
蒸発させ、ヌクレオシドオキサチアン中間体をシリカゲル カラムクロマトグラ
フィーによって精製して、構造３を有するそれぞれのモノマー化合物を得る。
【０１４７】 実施例５ 固体サポートへのチミジンの結合（５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ） 文献の方法（Ｄａｍｈａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９
０，１８，３８１３−３８２１）に従って、チミジンを固体サポートに結合させ
た。乾燥６ｍｌ Ｈｙｐｏｖｉａｌに、５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン（１０９ｍ
ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、サルコシニル−スクシノニル・リンカー付きＣＰＧ（Ｂ
ｒｏｗｎ等，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９８９，８９１）
（１．０ｇ）、４−ＤＭＡＰ（１２ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン
（８０μｌ）、ＤＥＣ（３８４ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（５ｍ
ｌ）を加えた。混合物を室温において２４時間振とうした。ペンタクロロフェノ
ール（１３４ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに１６時間振とうし
た。ＣＰＧを濾別し、ピリジン、ＣＨ2Ｃｌ2及びエーテルによって連続的に洗浄
した。ＣＰＧを試薬等級のピペリジン（５ｍｌ）によって処理し、スラリーを１
０分間振とうした。得られたＣＰＧを濾別し、ＣＨ2Ｃｌ2及びエーテルによって
連続的に洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥したＣＰＧに、等しい割合の２種類
の溶液、ＴＨＦ中０．５Ｍ無水酢酸とＴＨＦ中０．５Ｍ４−ＤＭＡＰ／２，４，
６−トリメチルピリジン（各４ｍｌ）を混合した。スラリーを２時間振とうし、
ピリジン、ＣＨ2Ｃｌ2、ＴＨＦ及びエーテルによって連続的に洗浄した。負荷量
(loading amount)をＴｒｉｔｙｌ Ａｎａｌｙｓｉｓによって測定した、３７．
９ｍｏｌ／ｇ。１，２−ジクロロエタン中の３％トリクロロ酢酸による脱トリチ
ルは固定されたチミジンを生じた。
【０１４８】 実施例６ 固体サポート結合Ｔ−Ｒｐ−Ｔダイマー、化合物４ 焼結ガラスロート(sintered glass funnel)に、５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ（２
７ｍｇ，１ｍｏｌ）とアセトニトリル中の構造３の溶液（塩基はチミンである）
（０．２ｍｌ，０．１Ｍ）とを加え、続いて３０μｌのＤＢＵ（０．２ｍｍｏｌ
）を注射器によって加える。１５分間後に、固体サポートをアセトニトリル（３
ｘ２ｍｌ）によって洗浄し、次にＢｅａｕｃａｇｅ試薬（０．２ｍｌ，ＴＨＦ中
０．１Ｍ）を加える。固体サポートは無水ＣＨ3ＣＮによる洗浄時に標題ダイマ
ーを生じる。
【０１４９】 実施例７ Ｔ−Ｒｐ−Ｔダイマー、化合物５ 化合物４を５０℃においてＮＨ4ＯＨ（２８％）によって２時間処理する。溶
液を蒸発乾燥させ、残渣を水（１ｍｌ）中に溶解し、濾過する。固体サポートか
ら開裂させた生成粗物質をＨＰＬＣによって精製及び分析して、化合物５、キラ
ルＲｐヌクレオシド間結合を有するＴＴダイマーを得る。
【０１５０】 実施例８ 化合物６ 化合物１の製造、実施例２に用いた方法に従って、化合物６を製造する。Ｓ−
４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノール（１５ｍｍｏｌ）をＰＣｌ3（
１５ｍｍｏｌ）によって処理して、精製時に化合物６を得る。
【０１５１】 実施例９ 化合物７ ヘキサン中の化合物６をモルホリンによって、０℃において細心に滴加して処
理する。低温浴を除去して、混合物を室温においてさらに１時間撹拌する。モル
ホリン塩酸塩を濾過によって取り出し、化合物７をシリカゲル カラムクロマト
グラフィーによって精製する。
【０１５２】 実施例１０ Ｓｐ結合に用いるモノマー、構造８ 化合物７をテトラゾールの存在下で５’−Ｏ−ＤＭＴヌクレオシドと反応させ
、続いて硫黄（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を添加して、所望のオキサチアン・リン
誘導体化合物８を得る。この方法は上記実施例４においてＲｐ異性体に関して説
明する。化合物８をシリカゲル カラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０１５３】 実施例１１ 固体サポート結合Ｔ−Ｓｐ−Ｔダイマー、化合物９ 焼結ガラスロートに、５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ（実施例５）（２７ｍｇ，１ｍ
ｍｏｌ）、アセトニトリル中の化合物８の溶液（０．２ｍｌ，０．１Ｍ）、及び
３０μｌのＤＢＵ（０．２ｍｍｏｌ）を注射器によって加える。１５分間後に、
固体サポートをアセトニトリル（３ｘ２ｍｌ）によって洗浄し、次にＢｅａｕｃ
ａｇｅ試薬（０．２ｍｌ，ＴＨＦ中０．１Ｍ）を加える。固体サポートは、１０
分間放置した後に、無水ＣＨ3ＣＮによって洗浄すると、標題ダイマーを生じる
。
【０１５４】 実施例１２ Ｔ−Ｓｐ−Ｔダイマー、化合物１０ 化合物９を５０℃においてＮＨ4ＯＨ（２８％）によって２時間処理する。溶
液を蒸発乾燥させ、残渣を水（１ｍｌ）中に溶解し、濾過する。化合物１０をＨ
ＰＬＣを用いて精製及び分析する。四員チアン形成は生成物（化合物１０）の形
成を容易にする。
【０１５５】 実施例１３ ５−メチル−２−（１−メチル−１−チオエチル）シクロヘキサノール。化合物
１１ 化合物１１は、文献方法（Ｌｙｎｃｈ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
．，１９８１，２２，２８５５−２８８８と、Ｌｙｎｃｈ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．，１９８４，１０６，２９４３−２９４８）に従って、エナンチオ
マー的に純粋な形で容易に入手可能な、（＋）−プレゴンから得られる。
【０１５６】 実施例１４ 化合物１２ −７８℃において２当量のピリジンを含有するＣＨ2Ｃｌ2に、化合物１１と三
塩化リンとを等モル割合で加える。１時間撹拌した後に、ピリジニウム塩酸塩(p
yridinium hydrochloride)を濾別し、溶液を濃縮して、精製して、化合物１２を
得る。
【０１５７】 実施例１５ 化合物１３ ヘキサン中の化合物１２をモルホリンによって、０℃において細心に滴加して
処理する。低温浴を除去して、混合物を室温においてさらに１時間撹拌する。モ
ルホリン塩酸塩を濾過によって取り出し、化合物１３をシリカゲル カラムクロ
マトグラフィーによって精製する。
【０１５８】 実施例１６ Ｒｐ結合に用いるキラルモノマー、構造１４ 乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の選択された２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴヌクレオシ
ド（２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン、
２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−４−Ｎ−ベンゾイルシトジン、２’−
Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２−Ｎ−ブチリルグアノシン、２’−Ｏ−デ
オキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン又は修飾され、任意に保護された５−Ｏ−
ＤＭＴ−ヌクレオシド）１０ｍｍｏｌに、１Ｈテトラゾール（１１ｍｍｏｌ）を
加える。化合物１３（１１ｍｏｌ）を２〜４時間撹拌しながら滴加する。得られ
る中間体をＢｅａｕｃａｇｅ試薬によって、化合物３に関して上述したように酸
化する。ヌクレオシドオキサチアン中間体をシリカゲル カラムクロマトグラフ
ィーによって精製する。
【０１５９】 実施例１７ 構造１５を有するキラルダイマーの一般的製造方法 化合物１４を５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ（実施例５）又は他の固体サポート結合
５’−ＯＨ−ヌクレオシドと、ＤＢＵを用いて縮合させて、化合物４に関して上
述したように、構造１５を有する化合物を得る。構造１５を有するダイマーを実
施例７の方法に従って処理して、ＣＰＧからダイマーを開裂して、リンを脱ブロ
ックすることによって、構造１５ａを有する脱ブロック済み遊離ダイマーを得る
。
【０１６０】 実施例１８ 化合物１６ Ｆｌｕｋａから商業的に入手可能な（−）−プレゴンから出発して、（−）−
５−メチル−２−（１−メチル−１−チオエチル）シクロヘキサノールの異性体
を文献方法（Ｌｙｎｃｈ、同上）に従って得る。化合物（−）−５−メチル−２
−（１−メチル−１−チオエチル）シクロヘキサノールを、−７８℃において、
２当量のピリジンを含有するＣＨ2Ｃｌ2中のＰＣｌ3によって処理する。１時間
撹拌した後に、ピリジニウム塩酸塩を濾別して、溶液を濃縮して、精製して、化
合物１６を得る。
【０１６１】 実施例１９ 化合物１７ ヘキサン中の化合物１６をモルホリンによって、０℃において細心に滴加して
処理する。低温浴を除去して、混合物を室温においてさらに１時間撹拌する。モ
ルホリン塩酸塩を濾過によって取り出し、化合物１７をシリカゲル カラムクロ
マトグラフィーによって精製する。
【０１６２】 実施例２０ 構造１８を有するモノマーの合成 乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の選択された２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴヌクレオシ
ド（２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン、
２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−４−Ｎ−ベンゾイルシトジン、２’−
Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２−Ｎ−ブチリルグアノシン、２’−Ｏ−デ
オキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン又は修飾され、任意に保護された５−Ｏ−
ＤＭＴ−ヌクレオシド）１０ｍｍｏｌに、１Ｈテトラゾール（１１ｍｍｏｌ）を
加え、その後に化合物１７（１１ｍｏｌ）を滴加し、２〜４時間撹拌する。硫化
試薬 ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（ＣＨ 3 ＣＮ中２％、Ｉｙｅｒ同上）を加えて、１時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、粗
物質をシリカゲル カラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１８を
得る。
【０１６３】 実施例２１ 化合物１８を用いるＳｐダイマーの一般的製造方法 化合物１８を５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ（実施例５）又は他の固体サポート結合
５’−ＯＨ−ヌクレオシドと、ＤＢＵを用いて縮合させて、化合物４に関して上
述したように、構造１８を有する化合物を得る。化合物１８から製造したダイマ
ーをＣＰＧから開裂して、脱ブロックすることによって、脱ブロック済み遊離Ｓ
ｐキラルダイマーを得る。
【０１６４】 実施例２２ ５ｃ−メチル−２ｔ［（１−メチル−１−メチルアミノ）エチル］−シクロヘキ
サン−１ｒ−オール （＋）−プレゴンを用いる文献方法（Ｈｅ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９
９０，５５，２１１４−２１１９）に従って、最初に５ｃ−メチル−２ｔ［（１
−メチル−１−ベンジルアミノ）エチル］−シクロヘキサン−１ｒ−オールを製
造することによって、標題化合物を合成する。この化合物にＰｄ／Ｈ2による水
素化分解を受けさせて、対応するアミノアルコールを得る（ベンジル基の除去）
。次に、このアミノアルコールを１当量のＨＣＨＯによって処理した後に、Ｎａ
ＣＮＢＨ3還元を行って、標題化合物を得る。
【０１６５】 実施例２３ 化合物２０ −７８℃において２当量のピリジンを含有するＣＨ2Ｃｌ2に、化合物１９と三
塩化リンとを等モル割合で加える。１時間撹拌した後に、ピリジニウム塩酸塩を
濾別し、溶液を濃縮して、精製して、クロロ−中間体化合物を得る。ヘキサン中
のクロロ−中間体化合物をモルホリンによって、０℃において細心に滴加して処
理する。低温浴を除去して、混合物を室温においてさらに１時間撹拌する。モル
ホリン塩酸塩を濾過によって取り出し、モルホリノ化合物をシリカゲル カラム
クロマトグラフィーによって精製する。
【０１６６】 乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の選択された２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴヌクレオシ
ド（２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン、
２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−４−Ｎ−ベンゾイルシトジン、２’−
Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２−Ｎ−ブチリルグアノシン、２’−Ｏ−デ
オキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン又は修飾され、任意に保護された５−Ｏ−
ＤＭＴ−ヌクレオシド）１０ｍｍｏｌに、１Ｈテトラゾール（１１ｍｍｏｌ）を
加え、その後にモルホリノ化合物（１１ｍｏｌ）を滴加し、２〜４時間撹拌する
。硫化試薬 ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド
（ＣＨ3ＣＮ中２％、Ｉｙｅｒ同上）を加えて、１時間撹拌する。溶媒を蒸発さ
せ、ヌクレオシド・オキサチアン中間体化合物２０をシリカゲル カラムクロマ
トグラフィーによって精製する。
【０１６７】 実施例２４ 化合物２１ 化合物２０を５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ（実施例５）又は他の固体サポート結合
５’−ＯＨ−ヌクレオシドと、ＤＢＵを用いて縮合させて、化合物４に関して上
述したように、構造２１を有する化合物を得る。形成された遊離アミンをキャッ
プするために、キャッピング工程を加える。
【０１６８】 実施例２５ 化合物２１からＲｐダイマー２１ａの形成 化合物２１を濃水酸化アンモニウムによって１６時間処理して、開裂した脱ブ
ロック済みダイマーをＲｐ異性体及びキラルアジュバント由来生成物２２及び２
３として得る。
【０１６９】 実施例２６ 化合物２４ 天然生成（−）−プレゴン（Ｆｌｕｋａから入手可能）から、文献方法（Ｈｅ
等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８７，４３，４９７９−４９８７）に従って
、化合物２４をキラルアジュバントとして得る。化合物１９に関して例示した方
法に従って、化合物２４を得る。
【０１７０】 実施例２７ モノマー、化合物２０ 化合物１９をＴＨＦ溶媒中の過剰なＨｕｎｉｇ塩基と共にＰＣｌ3（１当量）
によって、−５℃において１０分間処理する。得られるクロロ化合物を遊離３’
−ＯＨ基を有する選択された２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴヌクレオシド（
２’−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン、２’
−Ｏ−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−４−Ｎ−ベンゾイルシトジン、２’−Ｏ−
デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２−Ｎ−ブチリルグアノシン、２’−Ｏ−デオキ
シ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン又は修飾され、任意に保護された５−Ｏ−ＤＭ
Ｔ−ヌクレオシド）によって処理する。ＴＬＣ及び13Ｃ ＮＭＲ分析を用いて、
単独ジアステレオマーの形成を明らかにする。この粗物質を飽和炭酸水素ナトリ
ウムによって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。得られる物質を結晶
化によって、又はシリカゲル カラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０１７１】 実施例２８ 保護されたダイマー、化合物２１ 精製化合物２０を５’−ＨＯ−Ｔ−ＣＰＧ（実施例５）又は他の固体サポート
結合５’−ＯＨ−ヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−デオキシ−６−Ｎ−ベンゾ
イルアデノシン、２’−Ｏ−デオキシ−４−Ｎ−ベンゾイルシチジン、２’−Ｏ
−デオキシ−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン、又は修飾され、任意に保護され
た５’−ＯＨ’−３’−ＣＰＧ−ヌクレオシド）と、カップリング剤としてテト
ラゾールを用いて２時間縮合させる。得られる遊離アミンを無水酢酸によってキ
ャップして、ダイマーをＢｅａｕｃａｇｅ試薬によって酸化して、化合物２１を
得る。化合物２１を固体サポートから開裂して、濃水酸化アンモニウムによる処
理（３０％、１２時間）によって脱保護する。キラル補助基を化合物２２又は２
３として取り出して、オリゴマーをＨＰＬＣによって精製する。ヌクレオシドダ
イマーを８０％酢酸水溶液によって処理して、５’−トリチル基を除去する。Ｒ
ｐ形態を以下の方法において述べるように割り当てる。
【０１７２】 実施例２９ Ｓｐダイマー、化合物２５ 化合物２５を化合物２４から、化合物２０に関して述べたように合成する。化
合物２５は、Ｒｐ異性体に関して既述したようにヌクレオシド−ＣＰＧとカップ
リングし、精製したときに、Ｓｐ異性体を生成する。
【０１７３】 実施例３０ キラル純粋な５’−ＴSpＴRpＴRpＴRpＴRpＴSpＴ−３’ホスホロチオエートヘプ
タマーの合成 エステル結合によってＣＰＧ（制御多孔質ガラス）に結合した５’−Ｏ−ジメ
トキシトリチルチミジン ５０ｍｇ（２μｍｏｌｅ）をガラス反応器に入れ、３
％ジクロロ酢酸（ｖ／ｖ）のトルエン溶液を加えて、５’−ヒドロキシル基を脱
保護する。生成物をアセトニトリルによって洗浄して、アセトニトリル中の化合
物８（Ｂ＝Ｔ）の０．２Ｍ溶液（２５倍過剰）と、アセトニトリル中のＤＢＵの
０．５Ｍ溶液（２００倍過剰）とを加えて、室温において１５分間反応させる。
生成物をアセトニトリルによって洗浄した後に、アセトニトリル中のＢｅａｕｃ
ａｇｅ試薬の０．２Ｍ溶液を加え、反応を室温において５分間進行させる。この
硫化工程をさらに１回５分間繰り返す。サポートをアセトニトリルによって洗浄
し、次に無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液と、Ｎ−メチルイミ
ダゾール／ＴＨＦとを加えて、いずれの未反応５’−ヒドロキシル基をもキャッ
プする。生成物をアセトニトリルによって洗浄する。
【０１７４】 次のサイクルでは、化合物３（Ｂ＝Ｔ）を供給モノマー(incoming monomer)と
して用いて、サイクルを繰り返す。この完全なサイクルをさらに４回繰り返して
、Ｒｐ結合を導入する。最終サイクルでは、末端Ｓｐ結合を導入する供給モノマ
ーとして、化合物８を用いる。このヘプタマーを含有する固体サポートを３０％
水酸化アンモニウム水溶液によって室温において９０分間処理する。水溶液を濾
過して、減圧下で濃縮して、キラル純粋なホスホロチオエートヘプタマーを得る
。
【０１７５】 実施例３１ キラル純粋な５’−ｄ（ＧSpＡRpＣSpＴ）−３’ホスホロチオエートテトラマー
の合成 エステル結合によってＣＰＧ（制御多孔質ガラス）に結合した５’−Ｏ−ジメ
トキシトリチルチミジン ５０ｍｇ（２μｍｏｌｅ）をガラス反応器に入れ、ト
ルエン中の３％ジクロロ酢酸（ｖ／ｖ）のトルエン溶液を加えて、５’−ヒドロ
キシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルによって洗浄して、アセトニト
リル中のＢ＝ｄＣBZによる化合物８の０．２Ｍ溶液（２５倍過剰）と、アセトニ
トリル中のＤＢＵの０．５Ｍ溶液（２００倍過剰）とを加えて、室温において１
５分間反応させる。生成物をアセトニトリルによって洗浄した後に、アセトニト
リル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬の０．２Ｍ溶液を加え、室温において５分間反応
させる。この硫化工程をさらに１回５分間繰り返す。サポートをアセトニトリル
によって洗浄し、次に無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液と、Ｎ
−メチルイミダゾール／ＴＨＦとを加えて、いずれの未反応５’−ヒドロキシル
基をもキャップして、続いてアセトニトリルによって洗浄する。
【０１７６】 次のサイクルでは、化合物３（Ｂ＝ｄＡBZ）を供給モノマーとして用いて、サ
イクルを繰り返す。したがって、アセトニトリル中の化合物３（Ｂ＝ｄＡBZ）の
０．２Ｍ溶液（２５倍過剰）とアセトニトリル中のＤＢＵの０．５Ｍ溶液（２０
０倍過剰）とを加えて、室温において１５分間反応させる。生成物をアセトニト
リルによって洗浄した後に、アセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬の０．２
Ｍ溶液を加え、室温において５分間反応させる。この硫化工程をさらに１回５分
間繰り返す。サポートをアセトニトリルによって洗浄し、次に無水酢酸／ルチジ
ン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦとを加えて
、いずれの未反応５’−ヒドロキシル基をもキャップする。生成物をアセトニト
リルによって洗浄する。トルエン中３％ジクロロ酢酸（ｖ／ｖ）の溶液を加えて
、５’−ヒドロキシル基を脱保護して、生成物をアセトニトリルによって洗浄す
る。
【０１７７】 アセトニトリル中のＢ＝ｄＧiBuによる化合物８（０．２Ｍ溶液）（２５倍過
剰）と、アセトニトリル中のＤＢＵの０．５Ｍ溶液（２００倍過剰）とを加えて
、室温において１５分間反応させる。生成物をアセトニトリルによって洗浄し，
次にアセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬の０．２Ｍ溶液を加え、室温にお
いて５分間反応させる。この硫化工程をさらに１回５分間繰り返す。サポートを
アセトニトリルによって洗浄し、次に無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８
）の溶液と、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦとを加えて、いずれの未反応５’
−ヒドロキシル基をもキャップする。生成物をアセトニトリルによって洗浄する
。
【０１７８】 所望のテトラマーを脱ブロックし、３０％水酸化アンモニウム水溶液による室
温における９０分間の処理とその後の５５℃への１２時間の加熱とによって、固
体サポートから開裂させる。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、５’−ｄＧSp −ｄＡRp−ｄＣSpＴ−３’の標題ホスホロチオエートテトラマーを得る。
【０１７９】 実施例３２ オリゴヌクレオチド合成：一般的方法 表１に列挙するオリゴヌクレオチドは上記方法に従って合成される。キラル的
に混合した部位（ＲｐとＳｐ）を形成するためには、商業的なアミダイト（Ｐｅ
ｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、標準合成条件を用いる。
【０１８０】 適当な核酸塩基によってＲｐ結合を導入するためには、モノマー３、１４又は
２０を用いる。 適当な核酸塩基によってＳｐ結合を導入するためには、モノマー８、１８又は
２５を用いる。 用いる固体サポートは、サルコシニル−スクシノニル・リンカーを有する制御
多孔質ガラスＣＰＧ（Ｂｒｏｗｎ等，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ
ｍ．，１９８９，８９１）である。 用いる硫化試薬は３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオ
キシド（ＣＨ3ＣＮ中２％、Ｉｙｅｒ 同上）である。
【０１８１】 無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液と、Ｎ−メチルイミダゾー
ル／ＴＨＦとを混合物に加えて、いずれの未反応５’−ヒドロキシル基をもキャ
ップする。 キラル純粋なオリゴヌクレオチドの合成のために好ましい試薬は上記に列挙さ
れている。当業者は多くの他の試薬及び材料が同様に本発明に受容されること及
びこのリストが排他的ではないことを理解するであろう。
【０１８２】
【表１】
【０１８３】 実施例３３ オリゴヌクレオチド精製のための一般的方法 最終モノマー又はブロックマー(blockmer)を加えた後に、固体サポート結合オ
リゴヌクレオチドを１〜５ｍｌの２８．０〜３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ4
ＯＨ）中で５５℃において約１６時間脱保護（トリチル−オン）する（小規模）
。さらに大きい規模のオリゴヌクレオチド合成（２０μｍｏｌ／合成）では、２
０ｍｌの２８．０〜３０％水酸化アンモニウムを用いる。一般に、オリゴヌクレ
オチドを５〜２０ｍｌの２８．０〜３０％ＮＨ4ＯＨ中で５５℃において約１６
時間開裂させ、脱保護する。
【０１８４】 開裂及び脱保護後に、Ｇｅｌｍａｎの０．４５μｍナイロン・アクロディスク
・シリンジフィルター（nylon acrodisc syringe filter)を用いて、粗オリゴヌ
クレオチドをＣＰＧから濾過する。Ｓａｖａｎｔ ＡＳ１６０自動高速ｖａｃに
おいて、過剰なＮＨ4ＯＨを蒸発させる。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８
４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで２
６０ｎｍにおいて粗収率を測定する。次に、粗サンプルをＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａ
ｃｋａｒｄエレクトロスプレイ質量分析計での質量分析（ＭＳ）と、Ｂｅｃｋｍ
ａｎｎ Ｐ／ＡＣＥシステム５０００上での毛管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）とによ
って分析する。トリチル−オン オリゴヌクレオチドを逆相分取高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する。ＨＰＬＣ条件は次の通りである：
９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐ
ａｋ Ｃ４カラム（７．８ｘ３００ｍｍ）；溶媒Ａ：５０ｍＭトリエチルアンモ
ニウムアセテート（ＴＥＡ−Ａｃ），ｐＨ７．０；溶媒Ｂ：１００％アセトニト
リル；２．５ｍｌ／分流量；勾配：最初の５分間は５％Ｂ、次の５５分間はＢを
６０％に直線的に増加させる。大規模の２０μｍｏｌ合成からの大きいオリゴ収
量を大型ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｂｏｂｄａｐａｋ ＨＣｌ８ＨＡ）上
で精製して、流量を５．０ｍｌ／分に高める。適当な画分を回収して、溶媒を高
速ｖａｃによって除去する。オリゴヌクレオチドを８０％酢酸中で約４５分間脱
トリチルして、再び凍結乾燥する。脱トリチルしたオリゴヌクレオチドをＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５（サイズ排除クロマトグラフィー）に通し、適当なサンプ
ルをＰｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクターによって回収することによって
、遊離トリチルと過剰な塩とを除去する。選択した画分の濃縮によって、精製オ
リゴヌクレオチドを得て、これをＣＧＥ、ＨＰＬＣ（流量：１．５ｍｌ／分；Ｗ
ａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム、３．９ｘ３００ｍｍ）及びＭＳ
によって純度に関して分析する。最終収率を２６０ｎｍにおける分光光度計によ
って測定する。
【０１８５】方法１ キラルチオエート類の立体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）の決定 キラルチオエート類のＲｐおよびＳｐ立体配置は、報告されている方法にした
がい、決定する（Ｓｌｉｍ， Ｇ．， Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９１ １９， １１８３−１１８８）。Ｒｐ
異性体は、ＨＰＬＣにおいて逆相カラムで「速い溶出物（フラクションＩ）」と
して溶出する。該異性体はＰ１ヌクレアーゼには耐性であるが、ヘビ毒ホスホジ
エステラーゼにより加水分解される。逆に、Ｓｐ異性体は、ＨＰＬＣ逆相カラム
で「遅い」溶出物（フラクションＩＩ）として溶出する。この立体化学は、ヘビ
毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）からの防御を提供するが、本異性体はＰ１
ヌクレアーゼにより加水分解される。
【０１８６】 ヘビ毒ホスホジエステラーゼによる消化 各Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチド二量体（逆相による初期および後期溶出ピーク両
方）ＨＰＬＣのアリコット（２ ＯＤ）を、反応体積１５０μｌ中、０．１ Ｍ
Ｔｒｉｓ． ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）、０．３ ｍＭ ジチオスレイトール（
ＤＴＴ）、０．３ ｍＭ ＭｇＣｌ2中で、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（０．
１μｇ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）およびウシアルカリホスファターゼ（６．０μ
ｇ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、３７℃で８時間処理する。産物を逆相ＨＰ
ＬＣにより解析する。Ｒｐ異性体（初期溶出ピーク）は加水分解されるが、Ｓｐ
異性体は損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままである。
【０１８７】 ヌクレアーゼＰ１による消化 各Ｐ＝Ｓオリゴヌクレオチド二量体のアリコット（２ ＯＤ）を、蒸留水（１
２０μｌ）中でヌクレアーゼＰ１（２．０μｇ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い
、３７℃で１時間消化する。溶液を１６μｌの０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（
ｐＨ ８．５）で緩衝し、そしてウシアルカリホスファターゼ（６．０μｇ、Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、３７℃で１時間消化する。産物を逆相ＨＰＬＣに
より解析する。この場合、Ｓｐ異性体は分解されるが、Ｒｐ異性体はヌクレアー
ゼに耐性である。
【０１８８】方法２ キメラ性キラルオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性の評価 マウス実験法 試験する各オリゴヌクレオチドに関し、約２５ ｇの体重の９匹の雄ＢＡＬＢ
／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、マサチューセッツ州ウィルミントン
）を用いる（Ｃｒｏｏｋｅら， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈ
ｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３）。１週間の順応後、マウスの尾に、
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ ７．０中に加えられているオリゴヌク
レオチド（５ ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈注射する。各群から、後眼窩出血（投与
後、０．２５、０．５、２または４ ｌｖいずれか）および末端出血（投与後、
１、３、８または２４時間いずれか）を集める。末端出血（およそ０．６−０．
８ ｍｌ）は、ケタミン／キシラジン麻酔後、心臓穿刺により集める。血液をＥ
ＤＴＡ被覆収集試験管に移し、そして遠心分離し、血漿を得る。最後に、各マウ
スから肝臓および腎臓を集める。ＣＧＥによる、損なわれていないオリゴヌクレ
オチド内容物の決定のための解析に、血漿および組織ホモジネートを用いる。す
べての試料は、収集後直ちにドライアイス上で凍結し、そして解析まで−８０℃
で保存する。
【０１８９】 キメラ性キラルオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性の評価 配列番号５を比較研究に用い、あらかじめ決定された位でのキラルヌクレオチ
ド連結の影響を、各位でラセミ連結を有する同一配列と比べ、決定した。キャピ
ラリーゲル電気泳動解析により、ＩＳＩＳ ３０８２（ＸＶＩ、均一２’−デオ
キシホスホロチオエート）に比べ、キラル３’−Ｓｐ−キャップ化オリゴマーの
相対ヌクレアーゼ耐性が示された。ヌクレアーゼに対するＳｐ連結の耐性のため
、化合物ＸＶＩＩおよびＸＶＩＩＩは、血漿、腎臓および肝臓中で安定であるが
、ＸＶＩ（３０８２）は安定でないことが見出される。逆に、５’，−３’−ビ
ス Ｓｐキャップ化オリゴマーからのデータにより、組織（肝臓および腎臓）に
おけるのと同様、血漿における総エキソヌクレアーゼ分解（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏ
ｌｙｔｉｃ）安定性が示される。化合物は、１、３、および２４時間などの多様
な時点で安定である。いかなる分解も検出されないという事実により、５’−エ
キソヌクレアーゼ類および３’−エキソヌクレアーゼは組織に広く行き渡ってお
り、そしてエンドヌクレアーゼ類は活性でないことが立証される。さらに、単一
キラル連結（Ｓｐチオエート連結）は末端でのヌクレアーゼに対するゲートキー
パーとして十分である。
【０１９０】方法３ キメラ性ＲｐおよびＳｐ修飾オリゴヌクレオチドを用いたＲＮアーゼＨ研究 オリゴヌクレオチドの32Ｐ標識 オリゴリボヌクレオチド（センス鎖）は、[32Ｐ]ＡＴＰ、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ、および標準法（Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ， ニューヨーク（１９８９））を用い、32Ｐで５’端標識する。標識ＲＮＡ
は１２％変性ＰＡＧＥ上の電気泳動により精製する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ（１９８９））。標識オリゴヌクレオチドの比活性
は、およそ６０００ ｃｐｍ／ｆｍｏｌである。
【０１９１】 ＲＮアーゼＨ切断パターンの決定 ７５０ ｎＭ アンチセンスオリゴヌクレオチド、５００ ｎＭ センスオリ
ゴリボヌクレオチド、および１００，０００ ｃｐｍの32Ｐ標識センスオリゴリ
ボヌクレオチドを含む１２０μｌの反応緩衝液（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ ７．５）、２０ ｍＭ ＫＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ ｍ
Ｍ ＤＴＴ）中にハイブリダイゼーション反応を調製した。反応を９０℃で５分
間加熱し、そして１単位のＩｎｈｉｂｉｔ−ＡＣＥを添加する。試料を３７℃で
一晩インキュベーションした。ハイブリダイゼーション反応は、初期速度測定の
ため、１．５ ｘ １０．８-8 ｍｇの大腸菌ＲＮアーゼＨ酵素と３７℃でイン
キュベーションし、そしてその後、特定の時点で反応停止した。試料は、先に記
載されるように、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）アッセイにより、または変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により、解析した（Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．， Ｌ
ｅｍｏｎｉｄｉｓ， Ｋ．Ｍ．， Ｎｅｉｌｓｏｎ， Ｌ．， Ｇｒｉｆｆｅｙ
， Ｒ．， Ｌｅｓｎｉｋ， Ｅ．Ａ．，およびＭｏｎｉａ， Ｂ．Ｐ．， Ｋ
ｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ１： ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ＲＮＡ ｄｕｐｌｅ
ｘｅｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ， ３１２， ５９９（１９９５）；Ｌｉｍａ，
Ｗ．Ｆ．およびＣｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
６， ３９０−３９８， １９９７）。これらのアッセイにおいて、Ｓｐ−（Ｒ
ｐ）ｎ−Ｓｐ種のキラル的に純粋な化合物は、ジアステレオマー混合化合物より
、優れたＲＮアーゼＨ切断活性を示した。
【０１９２】 ７５０ ｎＭ アンチセンスオリゴヌクレオチド、５００ ｎＭ センスオリ
ゴリボヌクレオチド、および１００，０００ ｃｐｍの32Ｐ標識センスオリゴリ
ボヌクレオチドを含む１２０μｌの反応緩衝液（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ ７．５）、２０ ｍＭ ＫＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ ｍ
Ｍ ＤＴＴ）中にハイブリダイゼーション反応を調製した。反応を９０℃で５分
間加熱し、そして１単位のＩｎｈｉｂｉｔ−ＡＣＥを添加する。試料を３７℃で
一晩インキュベーションした。ハイブリダイゼーション反応は、初期速度測定の
ため、１．５ ｘ １０．８-8 ｍｇの大腸菌ＲＮアーゼＨ酵素と３７℃でイン
キュベーションし、そしてその後、特定の時点で反応停止した。試料は、先に記
載されるように、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）アッセイにより、または変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により、解析した（Ｃｒｏｏｋｅら， Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｊ．， １９９５， ３１２， ５９９；Ｌｉｍａ， Ｗ．Ｆ．およびＣｒ
ｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７， ３６， ３
９０−３９８）。
【０１９３】方法４ キラル的に定義されているホスホロチオエートオリゴマーを用いたＨ−ｒａｓ遺
伝子発現の調節 Ｈ−ｒａｓターゲッティングアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｔ−２４細
胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）においてＨ−ｒａｓ ｍＲＮＡを特異的
に減少させる能力に関し試験した。Ｔ−２４細胞は、完全増殖培地、１０％ウシ
胎児血清および１００単位／ミリリットルのペニシリンおよび１００マイクログ
ラム／ミリリットルのストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で、加湿インキュベ
ーター中、３７℃で日常的に維持した。アンチセンス実験のため、Ｔ−２４細胞
は、完全増殖培地中、２ｘ１０5細胞／ウェルの密度で、６−ウェルプレート（
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、ニュージャージー州フラ
ンクリンレークス）に蒔き、そして上述のようにインキュベーションした。蒔い
た２４時間後、増殖培地を吸引し、そして血清不含培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ、Ｌｉ
ｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）で単層を
一度洗浄する。オリゴヌクレオチドを、１００ナノモルのオリゴヌクレオチドあ
たり１ミリリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎあたり３マイクログラムの一定の比
で、血清不含ＯｐｔｉｍｅｍおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中に処方した。オリゴヌ
クレオチド処理のため、各ウェルに処方オリゴヌクレオチド２ミリリットルを添
加し、そして細胞を３７℃で４時間インキュベーションした。インキュベーショ
ン後、処方化オリゴヌクレオチドを単層から吸引し、増殖培地で置き換え、そし
て一晩インキュベーションした。処理２４時間後、製造者のプロトコルにしたが
い、ＲＮＡｚｏｌ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ， Ｉｎｃ．、テキサス州フレンズウッド
）を用い、総ＲＮＡを調製する。標準的プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）に
したがい、１．２％アガロース・ホルムアルデヒドゲルを通じ、ＲＮＡを分画化
し、そしてナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に移す。標準的32Ｐランダムプライミ
ング標識およびハイブリダイゼーションプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー， １９８９）を
用い、ナイロン膜をＨ−ｒａｓ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に関し探査した。ハイブリダイ
ゼーション後、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用い、膜を画像化し、そしてＩｍ
ａｇｅ Ｑｕａｎｔ ５．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用い、画像を定量化した。画像解析後
、膜のＨ−ｒａｓプローブを剥がし、そしてＧ３ＰＤＨ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、
カリフォルニア州パロアルト）に関し再探査し、そして上述のように解析した。
Ｈ−ｒａｓシグナルはＧ３ＰＤＨに対し規準化する。Ｈ−ｒａｓシグナルに関す
る平均規準化パーセントコントロールの三つ組および標準偏差を計算する。本方
法を用い、化合物ＩＶ、ＶおよびＶＩを試験する。化合物ＶおよびＶＩは、より
速い有効なＨ−ｒａｓメッセージの減少を示す。
【０１９４】方法５ ＩＣＡＭ−１発現の測定 ＨＵＶＥＣのオリゴヌクレオチド処理 細胞は、３７℃にあらかじめ温めたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）で３回洗浄した。オリゴヌクレオチドを、Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭ中の１０ ｇ／ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）とあらかじめ混合し、続いて望ましい濃度に希釈
し、そして洗浄した細胞に適用した。基底および未処理（オリゴヌクレオチドな
し）コントロール細胞もまた、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎで処理した。細胞を３７℃
で４時間インキュベーションし、その時点で培地を除去し、そして５ ｍｇ／ｍ
ｌ ＴＮＦ−α（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むまたは含まない標準増殖
培地で置き換える。示される時間まで、３７℃でのインキュベーションを続ける
。
【０１９５】 蛍光活性化細胞分取装置によるＩＣＡＭ−１タンパク質発現の定量化 ＰＢＳ中の０．２５％トリプシンを用いた簡単なトリプシン処理により、プレ
ート表面から細胞を除去した。トリプシン活性を、ＰＢＳ（＋Ｍｇ／Ｃａ）中の
２％のウシ血清アルブミンおよび０．２％アジ化ナトリウムの溶液で失活させる
。細胞を遠心分離（１０００ ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ遠心分離装置）
により沈澱させ、ＰＢＳに再懸濁し、そして３ ｌ／１０5細胞のＩＣＡＭ−１
特異的抗体、ＣＤ５４−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｉｎ）で染色した。穏やかに攪
拌しながら、細胞と抗体を暗所中、４℃で３０分間インキュベーションした。遠
心分離法により細胞を洗浄し、そしてその後、０．５％ ホルムアルデヒド（Ｐ
ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む０．３ ｍｌのＦａｃｓＦｌｏｗ緩衝液（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁した。その後、細胞表面ＩＣＡＭ−
１の発現を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを用いたフロ
ーサイトメトリーにより、測定する。コントロールＩＣＡＭ−１発現のパーセン
テージは、以下のように計算する： [（オリゴヌクレオチド処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ−１値）／（未
処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ−１値）]（Ｂａｋｅｒら， Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９
７， ２７２， １１９９４−１２０００）。 オリゴマーＩ、ＩＩおよびＩＩＩを用い、ＩＣＡＭ−１発現を試験した際、Ｉ
ＣＡＭ−１発現データにより、ＨＵＶＥＣ細胞において、オリゴマーＩＩおよび
ＩＩＩはオリゴマーＩより有効であることが明らかになることが観察される。該
オリゴマーは、おそらく、オリゴマーＩＩの場合、ヌクレアーゼ耐性の改善によ
り、そしてオリゴマーＩＩＩの場合、ＲＮアーゼＨ活性の亢進およびヌクレアー
ゼ耐性の改善により、作用している。
【０１９６】方法６ ５−リポキシゲナーゼ解析およびアッセイ Ａ．治療法 治療的使用のため、５−リポキシゲナーゼの過剰なまたは異常な供給により特
徴付けられる疾患を有すると疑われる動物を、本発明の巨大分子の投与により処
置する。一般の当業者は、容易に最適投薬量、投薬方法論および反復率を決定す
ることが可能である。こうした処置は、一般的に、治癒が達成されるまで、また
は疾患状態の縮小が達成されるまで続ける。いくつかの疾患に関しては、長期処
置の可能性がある。
【０１９７】 Ｂ．研究試薬 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、未精製細胞リゼイトにおける、あるいは
部分的に精製されたまたは完全に精製されたＲＮＡ調製における５−リポキシゲ
ナーゼｍＲＮＡを切断するまたは別に修飾するのに用いる際、研究試薬としても
有用であるであろう。本発明の本適用は、例えば、細胞を標準法により溶解し、
最適にＲＮＡを抽出し、そしてその後、約３０℃ないし約５０℃の温度で、約４
−１０の範囲のｐＨの、例えば５０ ｍＭリン酸からなる緩衝液中の、例えば約
１００ないし約５００ ｎｇ／１０ ｍｇ総ＲＮＡの範囲の濃度の組成物で処理
することにより、達成される。切断された５−リポキシゲナーゼＲＮＡは、アガ
ロースゲル電気泳動および放射標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
により、または他の標準法により、解析することが可能である。
【０１９８】 Ｃ．診断法 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、診断適用において、特に多様な組織にお
ける特定のｍＲＮＡ種の発現、あるいは異常なまたは突然変異ＲＮＡ種の発現の
測定にも有用であるであろう。本例において、巨大分子は異常配列に相補的であ
るよう設計することにより、異常ｍＲＮＡをターゲッティングするが、正常ｍＲ
ＮＡにはハイブリダイズしないであろう。 標準法により、組織試料をホモジナイズし、そしてＲＮＡを抽出してもよい。
未精製ホモジネートまたは抽出物を処理し、例えばターゲットＲＮＡの切断を達
成してもよい。産物をその後、切断部位の５’側上の領域に相補的な結合オリゴ
ヌクレオチドを含む固体支持体（サポート）にハイブリダイズさせてもよい。ｍ
ＲＮＡの正常および異常５’領域両方が、固体支持体に結合するであろう。異常
ＲＮＡの３’領域は切断され、支持体に結合しないであろうし、そしてしたがっ
て、正常ｍＲＮＡから分離されるであろう。 調節のためターゲッティングされるｍＲＮＡ種は、５−リポキシゲナーゼに関
連する；が、一般の当業者は、本発明はそのように限定されず、そして一般的に
適用可能であることを認識するであろう。酵素５−リポキシゲナーゼ産生の阻害
または修飾は、疾患の処置において、有意な治療上の利点を有すると期待される
。組成物の有効性を評価するため、アッセイまたは一連のアッセイが必要である
。
【０１９９】 Ｄ．ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ ５−リポキシゲナーゼに関する細胞アッセイは、好ましくは、ヒト前骨髄細胞
白血病細胞株ＨＬ−６０を用いる。これらの細胞は、多様な既知の剤により、単
球様細胞または好中球様細胞のいずれかに分化するよう、誘導することが可能で
ある。１．３％ ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯでの細胞の処理は、該細胞の
好中球への分化を促進することが知られる。現在、基底ＨＬ−６０細胞は、検出
可能なレベルの５−リポキシゲナーゼタンパク質を合成せず、またはロイコトリ
エン類（５−リポキシゲナーゼの下流産物）を分泌しないことが見出されてきて
いる。ＤＭＳＯを用いた細胞の分化は、ＤＭＳＯ添加４８時間後、５−リポキシ
ゲナーゼタンパク質の出現およびロイコトリエン生合成を引き起こす。したがっ
て、５−リポキシゲナーゼタンパク質合成の誘導は、これらの細胞において５−
リポキシゲナーゼ合成に干渉するオリゴヌクレオチドの解析のための試験系とし
て利用することが可能である。 オリゴヌクレオチドのための第二の試験系は、５−リポキシゲナーゼが、基質
と反応した際、自らを不活性化する、「自殺」酵素であるという事実を利用する
。１０μＭのＡ２３１８７、カルシウムイオノホアでの、分化ＨＬ−６０または
５−リポキシゲナーゼを発現している他の細胞の処理は、細胞質ゾルから膜への
５−リポキシゲナーゼの転位に続き、該酵素の活性化を促進する。活性化および
いくつかの過程の触媒作用後、酵素は触媒的に不活性になる。したがって、カル
シウムイオノホアでの細胞の処理は、内因性５−リポキシゲナーゼを不活性化す
る。ロイコトリエンＢ4を合成する能力により測定されるように、細胞がＡ２３
１８７処理から回復するのにおよそ２４時間かかる。５−リポキシゲナーゼに対
して向けられる巨大分子は、以下の定量的アッセイを用い、２つのＨＬ−６０モ
デル系における活性に関し、試験してもよい。該アッセイは、損なわれていない
細胞における５−リポキシゲナーゼタンパク質合成の阻害の最も直接的な測定か
ら、損なわれていない細胞における５−リポキシゲナーゼ活性の測定など、より
下流の事象まで、記載される。 損なわれていない細胞に対し、オリゴヌクレオチドが発揮することが可能であ
り、そして容易に定量化することが可能な、直接的な効果は、５−リポキシゲナ
ーゼタンパク質合成の特異的阻害である。本技術を行うため、35Ｓ−メチオニン
（５０μＣｉ／ｍｌ）を用い、３７℃で２時間細胞を標識し、新たに合成された
タンパク質を標識してもよい。細胞を抽出し、総細胞タンパク質を可溶化し、そ
して５−リポキシゲナーゼ抗体で５−リポキシゲナーゼを免疫沈降し、その後、
プロテインＡセファロースビーズから溶出する。免疫沈降タンパク質を、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そしてオートラジオグラフィ
ーのため曝露する。免疫沈降５−リポキシゲナーゼの量は、走査型濃度計により
定量化する。
【０２００】 これらの実験から予測される結果は、以下の通りであろう。コントロール細胞
から免疫沈降された５−リポキシゲナーゼタンパク質の量は１００に規準化され
るであろう。細胞を１μＭ、１０μＭ、および３０μＭの本発明の巨大分子で４
８時間処理することにより、免疫沈降５−リポキシゲナーゼは、それぞれコント
ロールの５％、２５％および７５％減少するであろう。 細胞ホモジネート中の５−リポキシゲナーゼ酵素活性の測定もまた用い、ロイ
コトリエン類を合成することが可能な、存在する酵素の量を定量化してもよい。
現在、逆相ＨＰＬＣを用い、細胞ホモジネート中の５−リポキシゲナーゼ酵素活
性を定量化するため、放射測定アッセイが開発されてきている。細胞は、プロテ
アーゼ阻害剤およびＥＤＴＡを含む緩衝液中で、超音波処理により破壊する。細
胞ホモジネートを１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離し、そして５−リポ
キシゲナーゼ活性に関し、上清を解析する。１０μＭ 14Ｃ−アラキドン酸、２
ｍＭ ＡＴＰ、５０μＭ 遊離カルシウム、１００μｇ／ｍｌ ホスファチジ
ルコリン、および５０ ｍＭ ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ ７．０と、細胞
質ゾルタンパク質を、３７℃で５分間インキュベーションする。等体積のアセト
ンの添加により反応を停止し、そして酢酸エチルで脂肪酸を抽出する。Ｎｏｖａ
ｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ミルフォ
ード）上の逆相ＨＰＬＣにより、基質および反応産物を分離する。Ｂｅｃｋｍａ
ｎモデル１７１放射クロマトグラフィー検出装置により、放射能ピークを測定す
る。ジ−ＨＥＴＥおよびモノ−ＨＥＴＥに変換されたアラキドン酸の量を５−リ
ポキシゲナーゼ活性の測定値として用いる。 １μＭ、１０μＭ、および３０μＭの有効な本発明の巨大分子での、ＤＭＳＯ
分化ＨＬ−６０細胞の７２時間の処理に関し、予測される結果は、以下の通りで
あろう。コントロール細胞は、２００ ｐｍｏｌのアラキドン酸／５分間／１０ 6 細胞を酸化する。１μＭ、１０μＭ、および３０μＭの有効なオリゴヌクレオ
チドで処理した細胞は、それぞれ１９５ ｐｍｏｌ、１４０ ｐｍｏｌ、および
６０ ｐｍｏｌのアラキドン酸／５分間／１０6細胞を酸化するであろう。 細胞における総５−リポキシゲナーゼタンパク質の測定のための定量的競合酵
素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が開発されてきている。大腸菌で発現さ
せ、そして抽出、Ｑ−セファロース、ヒドロキシアパタイト、および逆相ＨＰＬ
Ｃにより精製したヒト５−リポキシゲナーゼを標準としてそしてマイクロタイタ
ープレートを被覆する一次抗原として用いる。２５ ｎｇの精製５−リポキシゲ
ナーゼを、４℃で一晩マイクロタイタープレートに結合させる。１５０ ｍＭ
ＮａＣｌの存在下の、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ＴＢＳ）、ｐＨ
７．４で希釈した５％ヤギ血清を用い、ウェルを９０分間ブロッキングする。細
胞抽出物（０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１２，０００ ｘ ｇで３０
分間）または精製５−リポキシゲナーゼを、マイクロタイターウェル中で、総体
積１００μｌ中、１：４０００希釈の５−リポキシゲナーゼポリクローナル抗体
と９０分間インキュベーションした。抗体は、ウサギを精製ヒト組換え５−リポ
キシゲナーゼで免疫することにより調製する。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を
含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）でウェルを洗浄し、その後、１：１０００希釈のペルオ
キシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、ペンシルバニア州マルバーン）１００μｌと、２５℃で６０分間インキュベー
ションする。ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、そしてペルオキシダーゼ標識二次抗体
の量を、テトラメチルベンジジンの発色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）により測定
する。 １μＭ、１０μＭ、および３０μＭで３０マー（ｍｅｒ）オリゴヌクレオチド
を用いた、こうしたアッセイから予測される結果は、それぞれ１０6細胞あたり
、３０ ｎｇ、１８ ｎｇおよび５ ｎｇの５−リポキシゲナーゼであろうし、
未処理細胞は約３４ ｎｇの５−リポキシゲナーゼを含むであろう。 ５−リポキシゲナーゼ生合成阻害の最終的な影響は、刺激された細胞から放出
されるロイコトリエン類の量の減少である。ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞は、カ
ルシウムイオノホアＡ２３１８７での刺激に際し、ロイコトリエンＢ４を放出す
る。細胞培地中に放出されるロイコトリエンＢ４は、商業的に入手可能な診断キ
ット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、マサチューセッツ州ボストン
）を用いたラジオイムノアッセイにより定量化することが可能である。ロイコト
リエンＢ４産生は、好中球様細胞に細胞を分化させるＤＭＳＯを添加した４８時
間後、ＨＬ−６０細胞において検出することが可能である。細胞（２ ｘ １０ 5 細胞／ｍｌ）は、１．３％ ＤＭＳＯの存在下で、増加する濃度の巨大分子を
用い、４８−７２時間処理されるであろう。細胞を洗浄し、そして１％の脱脂ウ
シ血清アルブミンを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中で２ ｘ １０6
細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。細胞を１０μＭのカルシウムイオノホアＡ２３
１８７で１５分間刺激し、そして５ ｘ １０5細胞から産生されたＬＴＢ４の
量を、製造者に記載されるようにラジオイムノアッセイにより測定する。 本アッセイを用い、５−ＬＯ ｍＲＮＡに対して向けられるオリゴヌクレオチ
ドで、以下の結果が得られる可能性があるであろう。細胞は、１．３％ ＤＭＳ
Ｏの存在下で、１μＭ、１０μＭまたは３０μＭのいずれかの巨大分子で７２時
間処理されるであろう。５ ｘ １０5細胞から産生されるＬＴＢ4の量は、それ
ぞれ、約７５ ｐｇ、５０ ｐｇ、および３５ ｐｇであることが期待されるで
あろうし、未処理分化細胞は、７５ ｐｇのＬＴＢ4を産生するであろう。
【０２０１】 Ｅ．ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ マウスにおける５−リポキシゲナーゼの産生阻害は、以下のプロトコルにした
がい、立証することが可能である。アラキドン酸の局所適用は、皮膚におけるロ
イコトリエンＢ4、ロイコトリエンＣ4およびプロスタグランジンＥ2の迅速な産
生の後、浮腫および細胞浸潤を生じる。５−リポキシゲナーゼの特定の阻害剤は
、本アッセイで活性を示すことが知られてきている。該アッセイのため、２ ｍ
ｇのアラキドン酸をマウスの耳に適用し、対側性の耳をコントロールとする。ア
ラキドン酸投与１時間後の生検から採取したホモジネートにおいて、ミエロペル
オキシダーゼ活性により、多形核細胞浸潤をアッセイする。浮腫性反応は、耳の
厚さおよびパンチ生検の湿重量の測定により、定量化する。生検標本において産
生されるロイコトリエンＢ4の測定は、該組織における５−リポキシゲナーゼ活
性の直接測定として行う。オリゴヌクレオチドは、該化合物の最適活性を可能に
するため、アラキドン酸投与の１２ないし２４時間前に両耳に局所投与されるで
あろう。両耳は、アラキドン酸への曝露前に０．１μｍｏｌ、０．３μｍｏｌ、
または１．０μｍｏｌのいずれかの巨大分子を用い、２４時間前処理する。値は
、濃度あたり３匹の動物に関する平均として表す。０．１μｍｏｌ、０．３μｍ
ｏｌ、および１．０μｍｏｌに関し、多形核細胞浸潤阻害は、それぞれ、コント
ロール活性の約１０％、７５％および９２％であると期待される。浮腫の阻害は
、それぞれ約３％、５８％および９０％であると期待される一方、ロイコトリエ
ンＢ4産生の阻害は、それぞれ約１５％、７９％および９９％であると期待され
るであろう。 本明細書に言及されるまたは引用される各特許、出願、印刷刊行物、および他
の公表文献は、完全に本明細書に援用されることが意図される。 当業者は、本発明の好ましい態様に、多くの変化および修飾を作成してもよく
、そしてこうした変化および修飾は、本発明の精神から逸脱することなく作成さ
れることが可能であることを認識するであろう。したがって、付随する請求項は
、本発明の真の精神および範囲内に属する、こうした同等の変動をすべて包含す
ることが意図される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｒｐ及びＳｐキラル・ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合の構造を示す
。
【図２】 キラルアジュバント（Ｒ）−４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノール
と、それに由来する、Ｒｐキラル・ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を
生じるキラル構築ブロックを示す。
【図３】 キラルアジュバント（Ｓ）−４−メルカプト−４−メチル−２−ペンタノール
と、それに由来する、Ｓｐキラル・ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を
生じるキラル構築ブロックを示す。
【図４】 （＋）−プレゴンから得られる（＋）−５−メチル−２−（１−メチル−１−
チオエチル）シクロヘキサノールと、それに由来する、Ｒｐキラル・ホスホロチ
オエート・ヌクレオチド間結合を生じるキラル構築ブロックを示す。
【図５】 （−）−プレゴンから得られる（−）−５−メチル−２−（１−メチル−１−
チオエチル）シクロヘキサノールと、それに由来する、Ｓｐキラル・ホスホロチ
オエート・ヌクレオチド間結合を生じるキラル構築ブロックを示す。
【図６】 （＋）−プレゴンから得られる５Ｃ−メチル−２ｔ−［（１−メチル−１−ベ
ンジル−アミノ）エチル］−シクロヘキサンー１ｔ−オールと、それに由来する
、Ｒｐキラル・ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生じるキラル構築ブ
ロックを示す。
【図７】 （−）−プレゴンから得られる５Ｃ−メチル−２ｔ−［（１−メチル−１−ベ
ンジル−アミノ）エチル］−シクロヘキサンー１ｔ−オールと、それに由来する
、Ｓｐキラル・ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生じるキラル構築ブ
ロックを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 マノハラン，ムティア アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，レポサド・ドライブ 7634 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ34 QQ53 QR32 QR55 QR83 QS12 QS34 QX02 QX07 4C057 LL21 LL44 MM05 4C084 AA13 NA14 ZA452 ZA552 ZA892 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA45 ZA89 ZC55

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複数個の共有結合ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物であ
    って、式： 【化１】 ［式中、Ｔ1とＴ2はそれぞれ、独立的にヒドロキシル、保護されたヒドロキシル
    、固体サポートへの共有結合、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、ヌクレオチ
    ド、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート基、又は５’若しくは３’−置換基で
    あり；各ＳｐはキラルＳｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合であり；各
    Ｌｐは独立的にキラルＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合、ラセミホ
    スホロチオエート・ヌクレオシド間結合、又はキラルホスホロチオエート・ヌク
    レオシド間結合以外のヌクレオシド間結合であり；各ｎとｍは独立的に１〜１０
    ０であり；各ｐは０〜１００であり；この場合、ｎ、ｍ及びｐの合計は３〜約２
    ００である；各Ｎｕは独立的に式： 【化２】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保護された
    ヒドロキシル、２’−置換基若しくは保護された２’−置換基である）を有する
    ］で示される前記オリゴマー化合物。
  2. 【請求項２】 各Ｒ1がＨ又はヒドロキシルである、請求項１記載のオリゴ
    マー化合物。
  3. 【請求項３】 Ｒ1がＣ1−Ｃ10Ｏ−アルキル又はＣ1−Ｃ10置換Ｏ−アルキ
    ルである、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  4. 【請求項４】 Ｒ1が２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルであ
    る、請求項３記載のオリゴマー化合物。
  5. 【請求項５】 各Ｎｕが独立的にアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−
    メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンである、請求項１記
    載のオリゴマー化合物。
  6. 【請求項６】 ｎ、ｍ及びｐの合計が５〜約５０である、請求項１記載のオ
    リゴマー化合物。
  7. 【請求項７】 ｎ、ｍ及びｐの合計が８〜約３０である、請求項１記載のオ
    リゴマー化合物。
  8. 【請求項８】 ｎ、ｍ及びｐの合計が１０〜約２５である、請求項１記載の
    オリゴマー化合物。
  9. 【請求項９】 ｐが１又は２である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  10. 【請求項１０】 ｎとｐがそれぞれ１であり、ｍが３〜約２０である、請求
    項１記載のオリゴマー化合物。
  11. 【請求項１１】 Ｔ1とＴ2とが独立的にヒドロキシル又は保護されたヒドロ
    キシルである、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  12. 【請求項１２】 各ＬｐがＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合で
    ある、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  13. 【請求項１３】 少なくとも１つのＬｐがラセミホスホロチオエート・ヌク
    レオシド間結合である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１つのＬｐがキラルホスホロチオエート・ヌク
    レオシド間結合以外のヌクレオシド間結合である、請求項１記載のオリゴマー化
    合物。
  15. 【請求項１５】 Ｒ1がＨ、ヒドロキシル及び保護されたヒドロキシル以外
    の２’−置換基又は保護された２’−置換基である、請求項１記載のオリゴマー
    化合物。
  16. 【請求項１６】 請求項１記載の化合物と、受容可能な製薬的キャリヤーと
    を含む薬剤組成物。
  17. 【請求項１７】 式： 【化３】 ［式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり、Ｒ4はヒドロキシル保護基であり、Ｒ1 はＨ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’−置換基又は保護された２
    ’−置換基であり、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］で示されるヌクレオシド。
  18. 【請求項１８】 前記キラル補助基が式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶ
    Ｉ： 【化４】 のいずれかで示される、請求項１７記載のヌクレオシド。
  19. 【請求項１９】 Ｂｘがアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウ
    リジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンである、請求項１７記載のヌ
    クレオシド。
  20. 【請求項２０】 各Ｒ1がＨ又はヒドロキシルである、請求項１７記載のヌ
    クレオシド。
  21. 【請求項２１】 Ｒ1がＣ1−Ｃ10アルキル又はＣ1−Ｃ10置換アルキルであ
    る、請求項１７記載のヌクレオシド。
  22. 【請求項２２】 Ｒ1が２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルで
    ある、請求項２１記載のヌクレオシド。
  23. 【請求項２３】 少なくとも１つのＲ1が２’−Ｏ−メトキシエチル又は２
    ’−Ｏ−メチルである、請求項１７記載のヌクレオシド。
  24. 【請求項２４】 Ｒ1がＨ、ヒドロキシル及び保護されたヒドロキシル以外
    の２’−置換基又は保護された２’−置換基である、請求項１７記載のヌクレオ
    シド。
  25. 【請求項２５】 式： 【化５】 ［式中、Ｔ1とＴ2はそれぞれ、独立的にヒドロキシル、保護されたヒドロキシル
    、固体サポートへの共有結合、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、ヌクレオチ
    ド、オリゴヌクレオチド、コンジュゲート基、又は５’若しくは３’−置換基で
    あり；各ＳｐはＳｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合であり；各Ｌｐは
    独立的にＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合、ラセミホスホロチオエ
    ート・ヌクレオシド間結合、又はキラルＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド
    間結合以外のヌクレオシド間結合であり；各ｎとｍは独立的に１〜１００であり
    ；各ｐは０〜１００であり；この場合、ｎ、ｍ及びｐの合計は３〜約２００であ
    る；各Ｎｕは独立的に式： 【化６】 （式中、Ｂｘは複素環式塩基部分であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保護された
    ヒドロキシル、２’−置換基若しくは保護された２’−置換基である）を有する
    ］で示されるオリゴマー化合物の製造方法であって、 （ａ）式： 【化７】 ［式中、Ｒ4は不安定なヒドロキシル保護基であり、Ｒ3は固体サポートへの共有
    結合である］で示される化合物を用意する工程と； （ｂ）前記不安定なヒドロキシル保護基を脱ブロックして、脱ブロック済みヒド
    ロキシル基を形成する工程と； （ｃ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式： 【化８】 ［式中、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］で示される他の化合物と、縮合試薬と
    によって任意に処理して、伸長された化合物を形成する工程と； （ｄ）工程（ｂ）と（ｃ）とを任意に繰り返す工程と； （ｅ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式： 【化９】 ［式中、Ｒ5はＲｐキラル補助基又は活性化リン基である］を有する化合物と縮
    合試薬とによって処理して、さらに伸長された化合物を形成する工程と； （ｆ）工程（ｅ）と（ｆ）とを任意に繰り返して、さらにヌクレオシドを加える
    工程と； （ｇ）前記不安定なヒドロキシル保護基を脱ブロックして、脱ブロック済みヒド
    ロキシル基を形成する工程と； （ｈ）前記脱ブロック済みヒドロキシル基を式： 【化１０】 ［式中、Ｒ2はＳｐキラル補助基である］を有する化合物と縮合試薬とによって
    処理して、保護されたオリゴマー化合物を形成する工程と； （ｉ）工程（ｈ）と（ｉ）とを任意に繰り返して、追加のヌクレオシドを加える
    ことによって、さらなる保護されたオリゴマー化合物を形成する工程と を含む前記方法。
  26. 【請求項２６】 工程（ｉ）の生成物を脱ブロックする工程をさらに含む、
    請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記Ｓｐキラル補助基が式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ： 【化１１】 のいずれかを有する、請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記Ｒｐキラル補助基が式ＩＶ、Ｖ又はＶＩ： 【化１２】 のいずれかを有する、請求項２５記載の方法。
  29. 【請求項２９】 さらに１つ以上のキャッピング工程を含み、前記キャッピ
    ング工程がキャッピング剤による処理を含む、請求項２５記載の方法。
  30. 【請求項３０】 さらに１つ以上の酸化工程を含み、前記酸化工程が酸化剤
    による処理を含む、請求項２５記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記不安定なヒドロキシル保護基がジメトキシトリチル、
    モノメトキシトリチル、トリチル又は９−フェニル−キサンテンである、請求項
    ２５記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記複素環式塩基部分がプリン又はピリミジンである、請
    求項２５記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記プリン又はピリミジンが独立的にアデノシン、グアノ
    シン、ウリジン、５−メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミ
    ンである、請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 ｎ、ｍ及びｐの合計が５〜約５０である、請求項２５記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】 ｎ、ｍ及びｐの合計が８〜約３０である、請求項２５記載
    の方法。
  36. 【請求項３６】 ｎ、ｍ及びｐの合計が１０〜約２５である、請求項２５記
    載の方法。
  37. 【請求項３７】 Ｔ1とＴ2とが独立的にヒドロキシル又は保護されたヒドロ
    キシルである、請求項２５記載の方法。
  38. 【請求項３８】 各ＬｐがＲｐホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合で
    ある、請求項２５記載の方法。
  39. 【請求項３９】 少なくとも１つのＬｐがラセミホスホロチオエート・ヌク
    レオシド間結合である、請求項２５記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ｎとｐがそれぞれ１であり、ｍが３〜約２０である、請求
    項２５記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ｎとｐがそれぞれ２であり、ｍが３〜約２０である、請求
    項２５記載の方法。
  42. 【請求項４２】 ｐが０である、請求項２５記載の方法。
  43. 【請求項４３】 少なくとも１つのＲ1がＨ、ヒドロキシル及び保護された
    ヒドロキシル以外の２’−置換基又は保護された２’−置換基である、請求項２
    ５記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記活性化リン基がホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネー
    ト又はリン酸三エステルである、請求項２５記載の方法。
  45. 【請求項４５】 固体サポートへの前記共有結合がサルコシニル−スクシノ
    ニル・リンカーである、請求項２５記載の方法。
  46. 【請求項４６】 生物におけるタンパク質の産生又は活性をモジュレートす
    る方法であって、前記生物を請求項１記載の化合物と接触させることを含む前記
    方法。
  47. 【請求項４７】 タンパク質の好ましくない産生を特徴とする疾患を有する
    生物の治療方法であって、前記生物を請求項１記載の化合物と接触させることを
    含む前記方法。
  48. 【請求項４８】 核酸の分析方法であって、前記核酸を含有すると疑われる
    溶液を請求項１記載の化合物と接触させることを含む前記方法。
  49. 【請求項４９】 式： 【化１３】 ［式中、Ｒ62はＨ又はヒドロキシル保護基であり；Ｒ1はＨ、ヒドロキシル、保
    護されたヒドロキシル、２’‐置換基又は保護された２’‐置換基であり；Ｂは
    複素環式塩基部分であり；Ｒ62は式Ｉ〜ＶＩ： 【化１４】 から選択されるキラル補助基である］で示される化合物。
  50. 【請求項５０】 各Ｒ1がＨ又はヒドロキシルである、請求項４９記載のオ
    リゴマー化合物。
  51. 【請求項５１】 Ｒ1がＣ1−Ｃ10Ｏ−アルキル又はＣ1−Ｃ10置換Ｏ−アル
    キルである、請求項４９記載のオリゴマー化合物。
  52. 【請求項５２】 Ｒ1が２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルで
    ある、請求項５１記載のオリゴマー化合物。
  53. 【請求項５３】 各Ｎｕが独立的にアデノシン、グアノシン、ウリジン、５
    −メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンである、請求項４
    ９記載のオリゴマー化合物。
  54. 【請求項５４】 式： 【化１５】 ［式中、ｑは０〜約５０であり；Ｒ62はＨ又はヒドロキシル保護基であり；Ｒ1
    はＨ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、２’‐置換基又は保護された２
    ’‐置換基であり；Ｒ64はＨ、ヒドロキシル保護基、又は固体サポートへのリン
    カーであり；Ｒ63は下記ラジカル： 【化１６】 から成る群から選択されるラジカルである］で示される化合物。
  55. 【請求項５５】 各Ｒ1がＨ又はヒドロキシルである、請求項５４記載のオ
    リゴマー化合物。
  56. 【請求項５６】 Ｒ1がＣ1−Ｃ10Ｏ−アルキル又はＣ1−Ｃ10置換Ｏ−アル
    キルである、請求項５４記載のオリゴマー化合物。
  57. 【請求項５７】 Ｒ1が２’−Ｏ−メトキシエチル又は２’−Ｏ−メチルで
    ある、請求項５４記載のオリゴマー化合物。
  58. 【請求項５８】 各Ｎｕが独立的にアデノシン、グアノシン、ウリジン、５
    −メチルウリジン、シチジン、５−メチルシチジン又はチミンである、請求項５
    ４記載のオリゴマー化合物。
  59. 【請求項５９】 ｑが５〜約５０である、請求項５４記載のオリゴマー化合
    物。
  60. 【請求項６０】 ｑが８〜約３０である、請求項５４記載のオリゴマー化合
    物。
  61. 【請求項６１】 ｑが１０〜約２５である、請求項５４記載のオリゴマー化
    合物。
  62. 【請求項６２】 ｑが１である、請求項５４記載のオリゴマー化合物。
  63. 【請求項６３】 ｑが０である、請求項５４記載のオリゴマー化合物。
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