NO303018B1 - AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider - Google Patents
AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider Download PDFInfo
- Publication number
- NO303018B1 NO303018B1 NO912585A NO912585A NO303018B1 NO 303018 B1 NO303018 B1 NO 303018B1 NO 912585 A NO912585 A NO 912585A NO 912585 A NO912585 A NO 912585A NO 303018 B1 NO303018 B1 NO 303018B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- oligonucleotides
- alkyl
- formula
- residue
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 58
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 21
- -1 methoxyethyl Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 5
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical group P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 3
- 125000006569 (C5-C6) heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 claims description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 2
- GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L pentamethonium bromide Chemical compound [Br-].[Br-].C[N+](C)(C)CCCCC[N+](C)(C)C GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 3
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910003849 O-Si Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229910003872 O—Si Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 8
- 230000008827 biological function Effects 0.000 abstract description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 9
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical compound Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N nitromethane Chemical compound C[N+]([O-])=O LYGJENNIWJXYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100121705 Drosophila melanogaster sens gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 2
- LZTRCELOJRDYMQ-UHFFFAOYSA-N triphenylmethanol Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(O)C1=CC=CC=C1 LZTRCELOJRDYMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- SBKCKZYFAIFJPV-UHFFFAOYSA-N (6-amino-7h-purin-2-yl)-phenylmethanone Chemical compound N=1C=2N=CNC=2C(N)=NC=1C(=O)C1=CC=CC=C1 SBKCKZYFAIFJPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006274 (C1-C3)alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 1-[5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OCC1C(O)CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIRAVPPUGSNYOU-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]benzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIRAVPPUGSNYOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 3-n-(2-benzyl-1,3-dihydroxypropan-2-yl)-1-n-[(1r)-1-(4-fluorophenyl)ethyl]-5-[methyl(methylsulfonyl)amino]benzene-1,3-dicarboxamide Chemical compound N([C@H](C)C=1C=CC(F)=CC=1)C(=O)C(C=1)=CC(N(C)S(C)(=O)=O)=CC=1C(=O)NC(CO)(CO)CC1=CC=CC=C1 ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTRXFCGYDLPIDD-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1-benzoylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1C(=O)C1=CC=CC=C1 ZTRXFCGYDLPIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100348617 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) NIK1 gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000911790 Homo sapiens Sister chromatid cohesion protein DCC1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100007329 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100027040 Sister chromatid cohesion protein DCC1 Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- ACYSKFODOKGJMA-IVZWLZJFSA-N [(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl acetate Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 ACYSKFODOKGJMA-IVZWLZJFSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- QNVFXUDUJZRUOX-UHFFFAOYSA-N argon;n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound [Ar].CC(C)NC(C)C QNVFXUDUJZRUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- XESTYUYENKNHHR-UHFFFAOYSA-N bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethanol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(O)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 XESTYUYENKNHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol group Chemical group [C@@H]1(CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)[C@H](C)CCCC(C)C HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002862 dinucleoside phosphate Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940102001 zinc bromide Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
- G01R15/00—Details of measuring arrangements of the types provided for in groups G01R17/00 - G01R29/00, G01R33/00 - G01R33/26 or G01R35/00
- G01R15/14—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks
- G01R15/18—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers
- G01R15/186—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers using current transformers with a core consisting of two or more parts, e.g. clamp-on type
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider.
Som antisense-oligonukleotid betegner man nukleinsyrefragmen-ter der sekvensene er komplementære med kodende eller "sens"-sekvensen av en "Messenger-RNA" henhv. til kodende tråd av DNA. Slike oligonukleotider blir anvendt for lnhibisjon av genekspresjonen in vitro eller i cellekultursystemer. Anvendelse av slike forbindelser innen det medisinsk-terapeu-tiske området, henhv. som antivirale-farmaka, er gjenstand for omfangsrike undersøkelser. Innen biologien har antisens-RNA-sekvenser som naturlig forekommende regulatorer av genekspresjonen i prokaryoter (T. Mizuno, M.-Y. Chou og M. Inouye, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 1966-1970 (1984)) og også i eukaryoter (S.M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772 (1986)) vært kjent. De bevirker en inhibering av translasjonen gjennom hybridisering på et tilsvarende "Messenger-RNA". I tallrike eksperimenter har det i mellom-tiden vært vist at slike anti-sense-RNA-sekvenser, når de er blitt transformert inn i bakterier (A. Hirashima, S.Sawaki,
Y. Inokuchi og M. Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)) eller eukaryote celler (J.G. Izant og H. Weintraub, Cell 36, 1007-1015 (1984)) også der har kunnet hindre gen-ekspresjonen og utviser bådet anti-virale (L.J. Chang og CM. Stoltzfus,
J. Virology 61, 921-924 (1987)) og også anti-onkogen-virkning (J.T. Holt, T.V. Gopal, A.D. Moutton og A.W. Nienhuis, PNAS USA 83, 4794-4798 (1986)). For slike undersøkelser har syntetiske oligonukleotider i forhold til biologisk anti-sense-RNA den fordelen av å ha høyere stabilitet og lettere tilgjengelighet. Det sistnevnte er basert på de i nyere tid sterkt forbedrede synteseteknikkene som gjør korte oligomerer (på f.eks. 12-30 baser) relativt lett tilgjengelig (E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14, 274-325 (1986); Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed., Macmillan Press, 1989; s. 7ff).
Det er blitt vist at slike korte oligomerer er virksomme som ekspresjonsmodulatorer. Dermed kan slike oligonukleotider også virke gjennom binding på DNA-dobbelt-tråden under dannelse av en trippel helix. For at begge, antisense oligonukleotidene og de triplex-dannende oligonukleotidene kan bli anvendt i biologiske systemer må følgende forutset-ning være oppfylt (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen ed. Macmillian Press, 1989, S. lff): 1. de må på den ene siden være vannoppløselige og på den andre siden må de lett passere den lipofile celle-membranen , 2. de må inne i cellen være tilstrekkelig nedbrytnings-stabile, dvs. være stabile mot nukleaser, 3. de må danne stabile hydrider med intracellulære nukleinsyrer ved fysiologiske temperaturer, 4. hybridiseringen må være selektiv; forskjellen i dissosiasjonstemperaturen til et oligonukleotid, som fører til feilparring, må være tilstrekkelig stor, slik at sistnevnte spesifikt kan bli utvasket.
I 1978 kunne Zamecznik og Stephenson, PNAS USA 75, 280-284 og 285-288 (1978)) for første gang vise at umodifiserte oligonukleotider kunne hemme formeringen av Rous Sarcom-vira. 01igonukleotidene ble anvendt i høye konsentrasjoner og eksperimentene ble først og fremst gjennomført i på forhånd oppvarmede medier for å inaktivere nukleaser. Nødvendigheten av dette trinnet fremkommer fra den raske enzymatiske nedbrytningen som fremmede nukleinsyrer går igjennom i serum og i celler.
Man har allerede tidlig gjennomført undersøkelser med det målet å modifisere oligonukleotider strukturelt slik at de ovennevnte kravene bedre blir oppfylt, spesielt bedre beskyttelse mot nuklease-nedbrytning. Disse forsøkene konsentrerer seg om en modifikasjon av fosfodiester-internukleotid-bindingen på grunn av at denne siste enden er angrepspunktet for alle nukleaser. Man kan hovedsakelig inndele de strukturmodifiserte internukleotid-bindingene i a) nukleosidsammenkobling med fosfor som sentralatom.
Disse kan igjen være:
ioniske/chirale
loniske/achirale
nøytrale/chirale
b) nøytrale/achirale fosforfrie nukleosidkoblinger.
Til de strukturmodifiserte som før ioniske internukleosid-koblinger hører trifosfat- og ditiofosfatkoblinger. Tiofos-fat-modifiserte oligonukleotider (oligodeoksynukleotider, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen. ed. Macmillan Press, 1989, S. 97ff) viser for tiden de beste inhiberingsvirkningene på genekspresjon i cellekulturer, men denne inhiberingen ser ikke ut til å være bundet på en spesifikk sekvens, idet også slike trifosfat-modifiserte oligonukleotider utviser inhiberingsvirkninger, som bare består av en nukleinsyre byggesten, f.eks. tiofosfatanaloger av oligocytidylater. Begrensende for anvendelse av tiofos-fat-modifiserte oligonukleotider er videre deres chiralitet.
På grunn av at det ved tilveiebringing av et ol igonukleot id på en base blir dannet 2<n_1>diastereomerer, har bare den minste delen av et tiofosfatbindings-inneholdende preparat gode hybridiseringsegenskaper.
I oligonukleotider med ditiofosfat-internukleosidbindinger (A. Grandas, William S. Marshall, John Nielsen und Martin H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 20, 543-546 (1989), G.M. Porritt, C.B. Reese, Tetrahedron Lett. 30, 4713-4716 81989)), blir chiralitetsproblemet omgått. Slike forbindelser er derimot opp til nå bare tilgjengelige ved hjelp av kompli-serte og arbeidskrevende fremgangsmåter med mange trinn. Dermed var det ikke mulig å gjennomføre omfangsrike undersøk-elser på hybridiseringsforholdet, spesielt i cellekulturer.
En annen klasse av kjemisk modifiserte oligonukleotider er slike med ikke-ioniske, dvs. nøytrale internukleosid-bindinger. Til denne typen av modifisert struktur tilhører oligonukleotider med fosfortriester- eller metylfosfornat-internukleosidbindinger (Oligodeoxynucleotider, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillian Press, 1989, S. 79ff).
Begge forbindelsesklasser er felles slik at den ioniserbare fosfatresten er erstattet med en uladet gruppe. Gjennom innføring av en slik sammenkobling blir disse oligonukleotid-analogene resistente overfor nukleaser, men har derimot den ulempen at de er dårlig oppløselige i vandig medium.
Oligonukleotider med nøytral/achiral internukleosidbinding kunne før bare bli oppnådd idet fosforatomet til internu-kleosid-bindingen ble erstattet med et annet sentralatom. Fosforsyreester-bindingen er en siloxan-sammenkobling. Oligonukleotider med siloxan-internukleosidbindinger (K.K. Ogilvie, J.F. Cormier, Tetrahedron Lett. 26, 4159 (1985), H. Seliger, G. Feger, Nucl. Nucl. 6 (182), 483-484 (1987)) ble syntetisert og er stabile overfor nukleaser.
Oligonukleotider med karbonat-, acetal- eller karboksamid-internukleosid-sammenkoblinger er kjent fra M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 31, 2385-2388 (1990), J. R. Tittensor, J. Chem. Soc.C. 1971, S. 2656 og J. Coull et al., Tetrahedron Lett. 28, 745 (1987).
Nukleaseresistente oligonukleotidanaloger kunne også bli oppnådd uten endring av fosfodiester-internukleotidbindingen idet sukkerrester med endret konfigurasjon ble anvendt. Dette ble oppnådd gjennom syntese av oligonukleotidanaloger der nukleobasene er bundet a-glykosidisk (oligodeoksynukleo-sider, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, S. 119ff). Slike oligonukleotidanaloger er derimot preparativt vanskelig tilgjengelig idet de må bli oppbygd utgående fra sukker og base. Dertil utviser de med hensyn på retningen av hybridiseringen delvis et normalt forhold.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider med Formel II
der
R<1>betyr hydrogen eller en rest med Formel III R 2 betyr hydrogen eller en rest med Formel IV
der minst en av restene R<1>eller R<2>betyr en rest med Formel III eller IV,
B betyr en base, som eksempelvis naturlige baser som adenin, tymin, cytosin, guanin eller unaturlige baser, som eksempelvis purin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, N<4->etanocytosin, henhv. promedikamentformer derav,
W og W betyr uavhengig av hverandre oksygen eller svovel,
Z og Z<1>betyr uavhengig av hverandre 0~, S~, C^-C^g-alkoksy,
fortrinnsvis C^-Cg-alkoksy, spesielt foretrukket er C^-C3-alkoksy, spesielt metoksy; C^-C^g-alkyl, fortrinnsvis C^-Cg-alkyl, spesielt foretrukket CI-C3-alkyl, spesielt metyl; NHR<3>, der R<3>fortrinnsvis er C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket er Cj-Cg-alkyl, spesielt Ci-C4-alkyl, eller C1-C4-alkoksy-C1-C5-
alkyl, fortrinnsvis metoksyetyl; NR<3>R<4>, der R<3>er definert som ovenfor og R<4>er fortrinnsvis C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket C-^-Cg-akyl, spesielt C±-C4~alkyl eller der R<3>og R<4>sammen med nitrogenatomet som bærer dem danner en 5-6-leddet heterocyklisk ring, som i tillegg inneholder et ytterligere heteroatom fra rekken 0, S, N, som f.eks. morfol in;
Y betyr en rest fra rekken,
0-Si(R)2, 0CH2, C(0)NR eller 0-CH2-C(0) der R
betyr C^-C^-alkyl, aryl eller C5henhv. C^, cykloalkyl; og
n betyr et helt tall på 5-60, fortrinnsvis 10-40 og
spesielt foretrukket er 15-25,
samt fysiologiske tålbare salter derav, idet de terapeutisk aktive nukleotidene er substituert med grupper som fremmer det intracellulære opptaket, som in vitro eller in vivo tjener som reportergrupper, og/eller grupper, som ved hybridisering av oligonukleotidet på biologisk DNA eller RNA angriper disse DNA- eller RNA molekylene under binding eller spaltning, kjennetegnet ved at man a) omsetter en nuleotidenhet med 3'- henhv. 5'-terminale fosfor (III)- eller fosfor (V)-grupperinger eller det
aktiverte derivatet derav med en ytterligere nukleotidenhet med 3<*->henhv. 5'-terminal fri
hydroksygruppe eller
b) bygger opp oligonukleotidet ved hjelp av fragmenter på samme måte, avspalter i de ifølge (a) eller (b)
oppnådde oligonuleotidene eventuelt en eller flere for beskyttelse av andre funksjoner temporært innførte beskyttelsesgrupper og overfører de på denne måten oppnådde oligonukleotidene med Formel I eventuelt til deres fysiologiske tålbare salt.
Under aryl skal det i denne sammenhengen forstås f. eks. fenyl, fenylsubstituert (1-3 ganger) med C^-C^-alkyl, C^-C^-alkoksy og/eller halogen.
Videre er oligonukleotider med Formel II nevnt som i tillegg er substituert med grupper som fremmer det intra-cellulære opptaket, som in vitro eller in vivo tjener som reportergrupper, og/eller grupper som ved hybridisering av oligonukleotidet på biologisk DNA eller RNA angriper disse DNA-eller RNA molekylene under binding eller spalting.
Eksempler på grupper som fremmer det intracellulære opptaket er lipofile rester som alkylrester, f.eks. med opp til 18 C-atomer eller kolesteryl, eller konjugater, som benytter naturlige bærersystemer, som f.eks. gallesyre eller peptider for den tilsvarende reseptoren (f.eks. reseptorformidlet endozytose). Eksempler på reportergrupper er fluoriserende grupper (f.eks. akridinyl, dansyl, fluoreskeinyl) eller kjemiluminiserende grupper som f.eks. akridiniumestergrupper.
01igonukleotid-konjugater, som bindes til nukleinsyrer og/eller spalter, inneholder akridin (N. Thuong et al., Tetrahedron Lett. 29, s. 5905, 1989) eller kloretylaminoaryl-kunjugat (oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Mc Millou Press, 1989, s. 173 ff).
Den karakteristiske strukturelle modifikasjonen av oligonukleotidet fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter at internukleotidbindingene på begge kjedeendene er forandret, dvs. istedet for biologiske 3'-5'-bindinger har foreliggende forbindelser 3'-3<*->henhv. 5'-5'-bindinger. Det ble overraskende oppdaget at disse minimale strukturmodifika-sjonene er tilstrekkelige for å stabilisere slike forbindelser mot nuklease-nedbrytning.
Som beskrevet nedenfor bevirker de bare uviktige struktur-modif ikasj onene et hybridiseringsforhold som nesten tilsvarer de biologiske oligonukleotidene. Dette resulterer også til en generell anvendbarhet av disse forbindelsene som inhibitorer av genekspresjonen i cellekulturer.
Fra litteraturen er det ikke blitt henvist til fremstilling av oligonukleotidanaloger med 3'3'- og 5'5'-internukleosidbindinger på begge kjedeendene og anvendelse som anti-sense-oligonukleotider. Analoger av dinukleosidfosfater, som enten inneholder 3'-3'- eller 5'-5'-bindinger, er blitt oppnådd og undersøkt i flere år som hovedprodukter (A-Myles, W. Hutzenlaub, G. Reits und W. Pfleidererø, Chem. Ber. 108, 2857-2871 (1975); H.Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub und W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2872-2877 (1975); J. Tomasz, Nucl.Nucl. 2(1), 51-61 (1983); M. Nemer, N. Theriault, A. Schifmann og K.K. Ogilvie, Vith International Round Table, Nucleosides, Nucleotides and their biological Applications, La Grande Motte, ed. J.L. Imbach, 94-96 (1984)) henhv. biprodukter (R. Letsinger, K.K. Ogilvie, J. Amer.Chem.Soc. 89, 4801-4802 (1967)) av tilsvarende kondensasjon. Slike dimerer er derimot på grunn av for lavt smeltepunkt i hovedsak ikke egnet for stabil hybridisering med cellulære nukleinsyrer. Oligonukleotider som bare i den ene enden har en 5'-5'-binding ble oppbygd for å innføre et tilkoblingssete for reportergrupper ved hjelp av prober (S.Agrawal, C. Christodoulou, M.J. Galt, Nucleic Acids Res 14, 6227-6245
(1986)). De er derimot ikke blitt undersøkt med hensyn på hybridiseringsforhold. For biofysikalske forsøk har man fremstilt selvkomplementære oligonukleotider som i midten av molekylet oppviser en enkelt 3<*->3'- henhv. 5'-5'-binding (J.H. van de Sande, N.B. Ramsin, M.W. German, W. Elhorst, B.W. Kalisch, E.V. Kitzing, R.T. Pon, R. c. Clegg, T.M. Jovin, Science 241, 551-5557 (1988)).
Fremstilling av oligonukleotider med terminal invertert 3'-3'- og 5'-5'-binding foregår på samme måte som fremstilling av biologiske oligonukleotider i oppløsning eller fortrinnsvis på fast fase, eventuelt under hjelp av et automatisk synteseapparat.
Som utgangskomponenter for fremstilling av oligonukleotider med terminal invertert 3'-3'-binding blir det for fast fase-syntese anvendt en baererharpiks hvorpå det på den første nukleosidmonomeren er koblet over 5'-OE-gruppen. For fremstilling av disse komponentene anvender man et baererharpiks fremstilt ifølge kjente fremgangsmåter (T. Atkinson, M. Smith in Oligonucleotide Synthesis, M.J. Geit (ed), 35-49
(1984)), fortrinnsvis kiselgel eller kontrollert poreglass, som er funksjonalisert med aminogruppen. Det blir omsatt med et på nukleobasen og på det 3'-0H gruppe-beskyttede nukleosid-derivatet som på forhånd var omdannet til 5'-p-nitro-fenyl-succinat. Som basebeskyttelsesgruppen anvendes fortrinnsvis acylgrupper, f.eks. benzoyl, isobutyryl eller fenoksyacetyl. 3'-posisjonen blir fortrinnsvis beskyttet med dimetoksytrityl-beskyttelsesgruppe som kan bli innført ifølge M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21
(1980), s. 3243-3246. Den videre oppbygningen av oligonu-kleotidkjeden helt til nest siste kjedeledd foregår ifølge fremgangsmåter kjent i litteraturen, fortrinnsvis under anvendelse av på 5'-0H-gruppe gjennom dimetoksytritylgrupper beskyttede nukleosid-3'-fosforsyre-esteramider eller nukleosid-3'-H-fosfonater. Som siste kjedeledd blir videre et på 3'-OH-gruppen, fortrinnsvis med dimetoksytrityl beskyttet nukleosid-5'-fosforsyre-esteramid henhv. nukleosid-H-fosfonat anvendt. Fremstilling av en slik oligonukleotidkjede med terminale dreide internukleotidforbindelser er angitt skjematisk nedenfor. (Fosforamidicyklus for fremstilling av oligonukleotider med 3'-3'- og 5'-5'-bindinger i endene). Fremstilling av oligonukleotider med 3'-3'- eller 5'-5'-bindinger foregår tilsvarende. Struktur- og sekvensanalysen foregår på den måten at det med 3'-3'- og 5 '-5'-enden oppbygde oligonukleotidet først blir terminalt merket. Dette foregår gjennom radioaktiv merking, fortrinnsvis ved hjelp av 5'-'y-<32>P-ATP/polynukloetidkinase. Denne radioaktive merkingen foregår på de frie 5'-0H-gruppene, dvs. overfor et oligonukleotid med bare biologiske 3'-5'-bindinger av den omvendte enden av nukleotidkjeden. Ytterligere sekvensanalyse foregår deretter ifølge kjente fremgangsmåter, fortrinnsvis gjennom base-spesifikke, statiske spaltninger, som beskrevet av Maxam og Gilbert (A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymology 65, 499-560
(1980) ).
På grunn av den radioaktive merkingen på den "bakvendte" molekylenden foregår nå også sekvensavlesningen, sammenlignet med et oligonukleotid med biologisk 3'-5'-binding, i motsatt retning. En utførlig testbeskrivelse er angitt i Eksempel 6.
01igonukleotidene med Formel II anvendes for hybridiserings-kjemiske, til hybridisering for tilbinding til dobbelt- eller enkelt-trådede nukleinsyrer beroende fremgangsmåter for regulering eller undertrykking av den biologiske funksjonen til nukleinsyrer samt for selektiv undertrykking av ekspresjonen av virale genomfunksjoner og for profylakse og terapi av virusfunksjoner, for undertrykking av onkogenfunksjonen og for terapi av kreftsykdommer.
Som mål for stabiliteten in vivo kan forholdet av et i blodserum oppløst ifølge oppfinnelsen oppbygd oligonukleotid med Formel I eller II bli undersøkt. Den generelle testen er beskrevet i Eksempel II og en tilsvarende in vitro test med en oppløsning av slangegift-fosfodiesterase i Eksempel 8. 01igonukleotidene ifølge oppfinnelsen blir mye langsommere oppbygd i forhold til 3'-5'-oligonukleotidene.
Eksempel 11 demonstrerer serumstabiliteten til oligonukleotider med terminal invertert 3'-3'-binding. Hybridiseringsforholdet fremkommer fra modellforsøk som beskrevet i Eksempel 9 der en rekke SV40-spesifikke sekvenser, som ifølge oppfinnelsen ble fremstilt med en 3<*->3'- og 5'-5'-ende, som i hybridiseringen med den tilsvarende mottråden fra SV 40-DNA oppviser et smeltepunkt, som ligger uvesentlig lavere enn smeltepunktet som blir målt ved hybridisering med en tilsvarende sekvens, som ble oppbygd, ikke i følge oppfinnelsen, dvs. uten 3'-3'- og 5'-5'-ende.
Virksomheten til oligonukleotidene ifølge oppfinnelsene som har terminale 3'-3'- henhv. 5'-5'-koblinger som inhibitorer av genekspresjonen fremkommer fra undertrykkingen av veksten til virus SV 40. (Eksempel 10) samt inhibisjonen av den in vitro ekspresjonen av onkogenproduktet p53 (Eksempel 12).
Eksempel 1
Fremstilling av 3 *-O-DMTr-desoksyribonukleosid-5'-(N,N-bis-diisopropyl-amino-p<->cyanetoksy-)fosforsyreesteramid.
Reaksjonsskjemaet, med utgangspunkt i basebeskyttede nukleo-sider, er angitt nedenfor:
a: B = Thymin
b: B =N<5->benzoyladenin
c: B = N<4->benzoylcytosin
d: B = N<2->isobutyrylguanin
DMTr = 4,4'-dimetoksytrityl
A) Fremstilling av 3'-5'-O-bis-DMTr-desoksyribonukleosid 2
Blanding: 6 mMol dT, dA<bz>,dCbz eller dG<lbu>
14,4 mMol DMTr-Cl
14,9 mMol TEA abs.
Det desoksyribonukleosid 1 blir oppløst i 50 ml absolutt pyridin og ved 0°C blir trietylamin og dimetoksytritylklorid tilsatt. Til slutt omrøres dette i 24 t ved romtemperatur og omsetningen foregår ved hjelp av tynnskiktskromatografi (løpemiddel: CH2Cl2/MeOH 9:1). Reaksjonen blir avsluttet gjennom tilsetning av metanol, oppløsningmidlet fjernet og resten tatt opp i diklormetan. Den organiske fasen blir flere ganger vasket med 1 M (NH4 )HCC<3-oppløsning og med E20, tørket over Na2S04og innrotert.
3'-5'-ditritylert produkt 2 kan bli renset gjennom kolonnekromatografi av overskytende tritanol henhv. 5'-DMTr-dN (kolonnemateriale: kiselgel 60H, elueringsmiddel; CH2-C12med økende metanol innhold, idet det ditritylerte desoksy-nukleosidet blir eluert med 1-1. 5% MeOH). Utbytte: 73-85$ d.Th. B) Spesifikk avspaltning av 5 '-dimetoksytritylgruppen.
Litteratur: M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron
Lett. 21, 3243-3246 (1980).
Blanding: 3 mMol 3'-5 '-0-bis-DMTr-dN 2
15 mMol ZnBr2
200 ml absolutt nitrometan.
s
v
Oppløsningen av 3'-5'-O-bis-DMTr-dN 2 i 100 ml nitrometan blir ved 0°C i ytterligere 100 ml nitrometan tilsatt til sinkbromidsuspensjonen. I tilfelle av beskyttet desoksyaden-osin ble reaksjonen videreført under avkjøling for å unngå en depurinering. Avspaltningen av dette nukleosidet var fullstendig allerede etter 60 min, hvilket kan bli fastslått ved hjelp av tynnskiktskromatografi. For tymidin og desoksy-guanosin er reaksjonen likeledes avsluttet etter 60 min. ved romtemperatur, mens 5'-ditrityleringen av bis-DMTr-desoksycy-tidin bare forløper ufullstendig. Her blir reaksjonen avsluttet etter 3 timer for å unngå avspaltning av også 3'-dimetoksytrietylgruppen.
Avbrudd av reaksjonen foregår ved tilsetning av 200 ml 1 M NH4Ac-oppløsning og produkt 3 blir ekstrahert med 200 ml C^Clgiog den organiske fasen blir enda en gang vasket med mettet NaCl-oppløsning og med H20, tørket over Na2S04og oppløsningsmidlet avdestillert i vakuum.
Hovedmengden av tritanol kan bli fjernet gjennom utfelling av råproduktet i ca. 500 ml n-heksan ved -15°C. Rensingen foregår da kromatografisk over en kiselgel 60H-kolonne med diklormetan med et økende innhold av metanol som elueringsmiddel.
Rf-verdiene til 3'-DMTr-desoksyribonukleosidet er forskjellig fra de tilsvarende 5'-triylerte monomerene på følgende måte (løpemiddel: CH2Cl2/MeH 24:1):
Utbytte: 48 - 65$ d.Th.
C) Fremstilling av 3'-O-DMTr-desoksytribonukleosid-5'-0-(N,N-di isopropylamino-e-cyanoetoksy-)fosforsyreesteramid 4.
Litteratur: H.Koster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557
(1984 ).
Blanding: 1 mMol 3'-O-DMTr-desoksyribonukleosid 3
1.5 mMol kloro-N,N-diisopropylamino-3-cyanoet-oksy-fosfin 4 mMol diisopropylamin.
Fosfityleringsreaksjonen ble gjennomført analogt med fremgangsmåten for fremstilling av 5'-O-DMTr-desoksytribonukleo-sid-3'-O-fosforsyreesteramid beskrevet av KSster et al.. For oppløsning av det beskyttende nukleosidet i absolutt CH2CI2, ble under argon diisopropylamin, tilslutt fosforyleringsmid-let tilført. Etter 30 min. ble reaksjonen avsluttet gjennom tilsetning av 30 ml etylacetat og oppløsningen ble ekstrahert 3 x med mettet NaCl-oppløsning, den organiske fasen ble tørket over Na2S04og oppløsningsmidlet avdestillert i vakuum. Råproduktet ble renset søylekromatografisk (kolonnemateriale; kiselgel 60H, elueringsmiddel:
petroleter/diklormetan/trietylamin 45:45:10).
Utbytte ved 4a; 93$ d.Th.
Eksempel 2
Fremstilling av tymidilyl-tymidin med en 3'-3'-fosfodiester-binding.
Nedenfor er reaksjonsveien for fremstilling av dimerblokken angitt:
A) Fremstilling av 5•-O-dimetoksytrityltymidin 5
Blanding: 20 ^ tymlain ^^ ^
24 mMol 4,4'-dimetoksytritylklorid (8.2 g) 1 mMol dimetylaminopyridin (122 mg) 28 mMol abs. trietylamin (3.8 ml)
Fremstilling av 5 ble gjennomført ifølge fremgangsmåten til R. A. Jones (G.S. Ti, B.L. Gaffney og R. A. Jones, H.Amer.Chem.Soc. 104, 1316-1319 (1982)). Tymidin ble gjennom 3 ganger koevaporering med 50 ml absolutt pyridin tørket, tatt opp i 100 ml pyridin og under isavkjøling ble 4,4'-DMTr-Cl og DMAP tilsatt som katalysator. Omsetningen ble kontrollert tynnskiktskromatografisk (Løpemiddel CH2Cl2/MeOH 9:1); og etter 4 timer kunne reaksjonen bli avsluttet gjennom tilsetning av 100 ml vann. Oppløsningen ble ekstrahert 3 x med eter, den organiske fasen tørket og innrotert og resten renset gjennom omkrystallisering i benzen.
Utbytte: 9.68 g DMTr-dT (89$).
B) Fremstilling av 5'-O-dimetoksytrityltymidin-3'0-(N,N-diisopropylamino-e-cyanoetoksy-)fosforsyreesteramid 6.
Fremstilling og rensing av 6 foregår tilsvarende syntese av 3'-0-DMTr-5'-0-fosforsyreesteramid 4 (Eksempel 1, C).
C) Fremstilling av 5'-0-acetyltymidin 8
Blanding: 2,0 mMol 3'-0-DMTr-dT 3a (1,1 g)
0,2 mMol dimetylaminopyridin (12,2 mg)
4 ml eddiksyreanhydrid
Litteratur: A.M. Michelson and A.R. Todd, J. Org. Chem.
1955, 2632-2638 (modifisert).
Til en oppløsning av 3'-0-DMTr-dT og DMAP i 20 ml absolutt pyridin ble AC2O dråpevis tilsatt under isavkjøling. Etter en reaksjonstid på 3 timer var omsetningen fullstendig (kontroll over DC; løpemiddel: CH2Cl2/MeOH 24:1). Produkt 7 ble utfelt i 400 ml isvann, det hvite bunnfallet ble sugd av og vasket med isvann og tørket.
Utbytte: 1.02 g 3'-O-DMTr-5'-0-Ac-dT (88$).
For avspaltning av 4,4'-dimetoksytritylgruppen ble 7 i 10 ml 80$ eddiksyre omrørt ved romtempertur. Gjennom tilsetning av 100 ml isvann ble reaksjonen avsluttet etter 3 timer og 4,4'-dimetoksytritanol ble utfelt som hvitt bunnfall. Det ble sugd av og det vandige filtratet innrotert. Den oljeholdige resten ble tatt opp i litt CH2CI2og utfelt i 200 ml n-heksan ved -15°C.
Utbytte: 455 mg 5'-0-acetyltymidin (94$)
D) Fremstilling og tymidilyl-(3 *-3')tymidin 10
Blanding: 1.0 mMol 5'-O-DMTr-tymidin-3'-0-(N.N-diisopro-py lamino-P-cyanoetoksy- )fosforsyreesteramid 6 (705,8 mg)
0.9 mMol 5'-0-acetyltymidin 8 (253 mg)
2.6 mMol tetrazol (182 mg)
9.0 mMol J2(1.14 g)
Syntese av dimerblokken 10 kan foregå ved hjelp av fremgangsmåten for fremstilling av 3'-5'-nukleosiddimerer beskrevet av K5ster (H. Kftster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557 (1984)). Blandingen av 5'-0-acetyltymidin og tetrazol ble oppløst i 30 ml absolutt CH3CN og under argon tilsatt til fosforsyreester-amidet. Blandingen av 9 mMol J2i 30 ml acetonitril/pyridin-/vann (24:5:1) ble tilført og etter ytterligere 15 minutter ble jod i overskudd redusert gjennom 5 ml av en 40$ H2SO4-oppløsning. Oppløsningen ble deretter redusert, resten tatt opp i CH2Cl2, 2 x vasket med mettet NaHC03-oppløsning og oppløsningsmidlet ble deretter destillert av. Råproduktet kunne bli renset ved kolonnekromatografi (kolonnemateriale: kiselgel 60H; elueringsmiddel:eddikester/diklor-metan 50:50).
Utbytte: 665 mg (75$).>
For avspaltning av acetyl- og p<->cyanoetylgruppen ble dimeren behandlet i 1 time med 5 ml konstant NH3ved romtemperatur og 4,4'-dimetoksytrietylgruppen kunne bli fjernet med 80$ eddiksyre.
20
Eksempel 3
Fremstilling av tymidilyl-tymidin med 5 '-5'fosfodiester-kobling 14.
Skjemaet nedenfor viser fremstilling av 14
De enkelte reaksjonstrinnene for fremstilling av mellomtrinn foregår tilsvarende fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 2.
Strukturen til begge dimerblokkene kunne bli verifisert gjennom FAB-massespektrometri og lH-kjerneresonans-spektro-skopi.
Eksempel 4
Belastning av CPG 10-1400-bærermateriale med 3'-O-dimetoksytrityl-desoksyribonukleosid-5'-O-succinat.
Funksjonalisering av CPG-bæreren med 3-aminopropylkjeder forgår ifølge forskriften til Atkinson og Smith (T. Atkinson, M. Smith in Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait(ed), 35-49 (1984 )). A) Fremstilling av 3'-O-DMTr-desoksyribonukleosid-5'-0-succinat 15.
Blanding: 1.0 mMol 3'-0-DMTr-dN 3
0.8 mMol Bernsteinsyreanhydrid (80 mg)
0.5 mMol dimetylaminopyridin (61 mg)
Reaksjon av Bernsteinsyreanhydrid med 5'-OE-gruppen til desoksyribonukleosidet ble gjennomført i 5 ml absolutt pyridin med DMAP som katalysator over natt ved romtemperatur. Etter fullstendig omsetning ble oppløsningen redusert og pyridin fjernet gjennom 3 ganger azeotrop destillasjon med toluen. Resten ble tatt opp i diklormetan, vasket med 10$ iskald sitronsyreoppløsning og E2O og den organiske fasen innrotert i vakuum. Råproduktet ble oppløst i ca. 3 ml toluen og utfelt i 200 ml n-heksan.
Utbytte: 79-84$.
B) Fremstilling av 3 *-O-DMTr-desoksyribonukleosid-5'-0-succinyl-p-nitrofenylester 16 og belastning av bærer (se følgende skjema).
Blanding: 0.8 mMol 3'-O-DMTr-dN-5'-O-succinat 15
0.8 mMol p-nitrofenol (112 mg)
2.0 mMol dicykloheksylkarbodiimid (412 mg)
3 g funksjonalisert CPG 10-1400
Det beskyttede succinerte desoksytribonukleosidet ble tilsatt til en oppløsning av p-nitrofenol i 5 ml absolutt dioksan og 0.2 ml pyridin og tilslutt ble DCC1 som kondensasjonsmiddel tilført. Etter kort tid falt dicykloheksylurinstoffet ut og etter 3 timer viser DC (DH2Cl2/MeOH 9:1) en fullstendig omsetning. Bunnfallet ble sugd av under argon og filtratet tilsatt direkte til en suspensjon av funksjonalisert bærermateriale i 15 ml absolutt DMF. 0.8 ml trietylamin tilføres og blandingen omrøres over natt. Den belastede bæreren ble deretter sugd av, vasket med metanol og eter og tørket i eksikator.
Belastningen av bæreren ble bestemt spektometrisk. Gjennom behandling av en bærerprobe (ca. 2 mg) med 10 ml av en 0.1 N p-toluensulfonsyreoppløsning i acetonitril blir 4,4'-dimet-oksytritylkationet avspaltet og gjennom måling av absorbsjonen til oppløsningen ved 498 nm er det mulig å beregne bærerbelastningen i pmol/g ved hjelp av ligningen
OD^gg/ ml x 10 ml x 14. 3 ( konst.)
mg bærer
For blokkering av ikke omsatte aminogrupper ble den belastede bæreren omrørt med en oppløsning av 1 ml eddiksyreanhydrid og 50 mg dimetylaminopyridin i 15 ml absolutt pyridin i 1 time ved romtemperatur, tilslutt sugd av, vasket med metanol og eter og tørket.
Eksempel 5
a) Fremstilling av oligonukleotider med terminale 3'-3'- og 5 '-5'-kobling.
Syntesen ble gjennomført i en DNA syntesemaskin fra firmaet Applied Biosystems, Forster City, USA, Modell 381A, under anvendelse av 0.2 pmol-standardprogrammer for alle kondensa-sjonstrinnene.
Syntesecyklusen er vist ovenfor. Som bærermateriale anvendes CPG 10-1400 beskrevet tidligere i beskrivelsen i Eksempel 4. Kondensasjonene ble gjennomført med de vanlige mikleosid-3'-fosforsyreesterne og tilslutt ble det i siste reaksjonscyklus som beskrevet i Eksempel 1 tilsatt 3'-0-DMTr-nukleosid-5'-0-(N ,N-di isopropylamino-p-cyano-etoksy- )fosforsyreesteramid. Etter avspaltning av oligonukleotidet fra bæreren med konst. NH3og fjerning av alle fosfat- og basebeskyttelsesgrupper gjennom oppvarming av ammoniakkoppløsningen ved 60° C over natt, ble proben avsaltet gjennom utfelling i etanol og målsekvensen ble renset gjennom polyakrylamidgel-elektroforese fra kortere fragmenter.
For våre undersøkelser fremstilte vi et eicosatymidylat med bare 3'-5'-bindinger samt et med terminale 3'-3'- og 5'-5'-bindinger. Sekvenser fra SV 40-genomet ble også valgt. Følgende oligonukleotider ble syntetisert: dT20; dT20(3*-3',5'-5' ); SV40TS17: 17-mer, Sens-sekvens fra SV40-genomet i
posisjonene 5159-5176; SV40TAS17: 17-mer, Antisens-sekvens til SV40TS17; SV40TAS17(3'-3',5'-5'): 17-mer, Antisens-sekvens til SV40TS17 med en 3'-3'- henhv. 5'-5'-binding ved endene; SV40TS35: 35-mer, Sens-sekvens fra SV40-genomet i
posisjonene 5142-5176; SV40TAS35: 35-mer, antisens-sekvens til SV40TS35; SV40TAS35(3'-3',5'-5'): 35-mer.antisens-sekvens til SV40TS35 med en 3'-3'-henhv. 5'-5'-binding ved endene; b) Fremstilling av oligonukleotider med terminale 3'-3'-bindinger.
Som bæremateriale anvendes CPG 10-1400 beskrevet i Eksempel 4. Kondensasjonene ble gjennomført med vanlige nukleosid-3'-fosforsyreestere.
Etter avspaltning av oligonukleotidet med bærer med konst. NH3og fjerning av alle fosfat- og basebeskyttelsesgrupper gjennom oppvarming av ammoniakk-oppløsningen til 60"C over natt ble proben avsaltet gjennom utfelling i etanol og delsekvensen renset gjennom polyakrylamid-gelelektroforese fra kortere fragmenter.
SV40TAS17(3'-3'): 17-mer, antisens-sekvens til SV40TS17 med
en 3 '-3'-binding i enden;
c) Syntese av oligonukleotider med terminale 5'-bindinger og 2 terminale tiofosfatrester.
Som bærermateriale anvendes kommersielt oppnåelig CPG-materiale som inneholder 5'-O-dimetoksytrityltymidin bundet over 3'-hydroksygruppen. Kondensasjonene ble gjennomført med vanlige nukleosld-3'-fosforsyreestere, vanligvis i siste reaksjonscyklus ble 3'-O-DMTr-nukleosid-5'-0-(N,N-diisopro-pylamino-e-cyano-etoksy)fosforsyreesteramid tilsatt som i Eksempel 1.
Ved den første av begge reaksjonscyklusene ble istedenfor den vanlige jod-oksydasjonen gjennomført en oksydasjon med elementær svovel (W.Stec et al. J.A.C.S. 106, S. 6077, 1984).
Etter avspaltning av oligonukleotidet fra bæreren med konst. NH3og fjerning av alle fosfat- og basebeskyttelsesgrupper gjennom oppvarmingen av ammoniakkoppløsningen ved 60°C over natt ble proben avsaltet gjennom utfelling i etanol og delsekvensen ble renset gjennom polyakrylamid-gelelektroforese fra kortere fragmenter.
Følgende oligonukleotid ble syntetisert:
SV40TAS17(5'-5'): 17-mer, antisens-sekvens til SV40TS17 med
en 5'-5'-binding ved 5'-enden og to tiofosfatinternukleotidbindinger ved 3'-enden
Eksempel 6
Analyse av strukturen og sekvensen til et oligonukleotid med terminal 3'-3'- og 5'-5'-binding.
Sekvensering av oligonukleotidet foregår ifølge fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enxymology 65, 499-560 (1980)). 100 pmol av proben ble i nærvær av (-y-32P )-ATP/T4-polynukleotidkinase radioaktivt merket på 5'-OH-gruppen og ved hjelp av følgende basespesifikke reaksjoner gjennomført: (A+G) - reaksjon: protonering av basen gjennom maursyre G - reaksjon: omsetning med dimetylsulfat
(T+C) - reaksjon: hydrazinolyse
C - reaksjon: reaksjon med hydrazin i nærvær av 5M
NaCl
Gjennom behandling med 1 M piperidin ved 95°C ble oligonukleotid-kjedene spaltet på de modifiserte stedene, brudd-stykket kunne bli separert gjennom polyakrylamidgel-elektroforese (20$ akrylamid, 7M urinstoff) og detektert gjennom autoradiografi. Fig. 1 viser autoradiogrammet av sekvenser-ingen av SV40TS17, SV40TAS17 OG SV40TAS17(3'-3',5'-5') (for beskrivelse av oligonukleotidet se Eksempel 5). På grunn av at kjeden ble markert i 5'-OH-gruppen, kan basefølgen bare bli avlest ved 3'-5'-bindingen i 3'-5'-retningen. På grunn av 3'-3'-enden har oligonukleotidet SV40TAS17(3'-3'-5'-5')
til tross for dette den radioaktivt merkede 5'-OE-gruppen ved 3'-terminusen og leseretningen til sekvensen blir dermed omdreid (Fig. 1). Dette er også et bevis for 5'-5'-fosfodiester-bindingen ved 5'-terminusen til kjeden med en fri 3'-OH-gruppe, som gjennom enzymet polynukleotidkinase ikke kan bli fosforylert.
Eksempel 7
Undersøkelse av stabiliteten til et med 3'-3' og 5'-5'-endene
oligonukleotid i blodserumstesten
i
A) Kinasebehandling av et eicosatymidylat med 3'-3' og 5'-5'-ender.
Litteratur: T.Mizuno, M.-Y. Chou and M. Inouya, Proe.Nati.-Acad.Sci. USA 81, 1966-1970 (1984)
Blandingen blir inkubert i 30 min. ved 37°C, avsluttet gjennom tilsetning av 90jj1 EtøO og fraksjonert over en ®Sephadex G 50 kolonne. Produktfraksjonene blir slått sammen og lyofilisert.
b) Blodserumtest
Litteratur: S.M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772
(1986)
Blanding: 0.01 ODg^o radioaktivt fosforylert oligonukleotid for referansen 0.01 O<D>260^20»^or eksperimentet 0.01 OD26o<T>20med 3<*->3'- og 5'-5'koblede ender
50 pl friskt humant serum.
Serumet blir tilsatt til probene og kort omristet med hånd. Deretter blir med en gang 3 pl avpipitert for 0-verdi og tilsatt i 3pl formamid belastningsbuf f er, for å avbryte enzymaktiviteten. Til slutt blir probene inkubert ved 37°C.
For kinetikken blir etter bestemte tidsrom 3 pl tatt ut og avbrutt som beskrevet ovenfor.
Referanse: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min Eksperiment: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min, 90 min
Probene blir applisert på 20$ polyakrylamidgel og separert ved gelelektroforese og tilslutt autoradiografert. Autoradlogram av spaltningen med friskt humant serum fra venstre (se fig. 2): Referanse: 0-verdi, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min Eksperiment: 0-verdi, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min,
90 min
Allerede etter 5 min blir det vist at nedbrytningen av naturlig oligonukleotid har begynt. Spaltningen øker med tiden. Det modifiserte oligonukleotidet foreligger praktisk talt uforandret også etter 90 minutters inkubasjon. De svake båndene som ved alle verdiene av kinetikken sees er et resultat av aktiviteten til endo-nukleasene som er tilstede i serumet. Denne spaltningen er for en terapeutisk anvendelse av dette oligonukleotidet viktig og ønskelig, idet de garanterer den langsomme nedbrytningen av virkesubstansen og at det dermed ikke kan foregå en akkumulasjon av disse forbindelsene i kroppen.
Eksempel 8:
Undersøkelse av forholdet av oligonukleotider med terminal 3'-3'- og 5'-5'-binding mot slangegift-fosfodiesterase. A) Kinasebehandling av et eicosatymidylat med 3'-3' og 5'-5'-ender.
Som beskrevet i Eksempel 7.
B) Hydrolyse av et eicosatymidylat med 3'-3' og 5'-5'-ender ved hjelp av slangegiftfosfodiesterase
Litteratur: A-Hirashima, S.Sawaki, Y. Inokuchi and M.
Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)
Den radioaktivt fosforylerte proben (referanse; Tgo»eksperiment; T20med terminale 3'-3' og 5'-5'-binding) blir lyofilisert og RNÅ-bæreren og SQ-buffer blir tilsatt. Fra denne blandingen blir 5 pl avpipettert for 0-verdi og resten av oppløsningen blir omsatt med enzym og inkubert ved 37° C. For kinetikken til referansen blir etter 5 min, etter 15 min og etter 30 min hver 5 pl tatt ut og for kinetikken til Eicosatymidylatet med 3'-3' 5'-5'-ender blir 5 pl tatt ut etter 5 min, 30 min, 45 min, 60 min og 90 min. For desak-tivering av enzymet blir proben direkte etter uttaket oppvarmet i vannbad i 2 min ved 95°C. Probene blir lyofilisert og applisert på en analytisk 20% polyakrylamidgel. Etter gelelektrolytisk separering blir dette autoradiografert.
Autoradiogram av SVpdE-spaltingen (se fig. 3) fra venstre: T20(referanse), T20med terminale 3'-3'- og 5'-5'-koblinger, kinetikken til eksperimentet; etter 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, blanding av 0 min/15 min, blanding av 0 min/30 min, kinetikk til referansen; etter 5 min, 15 min, 30 min, 45 min.
5'-5'-bindingen blir som beskrevet øyeblikkelig avspaltet. At den videre spaltningen sammenlignet med referansen bare foregår langsomt er en tydelig strukturhenvisning. Etter spaltning av 5'-5'-fosfordiesterbindingen oppstår et molekyl som på spaltningssetet bærer en 5'-hydroksylfunksjon. Ved den andre terminusen er molekylet 5'-fosforylert. Begge termini er for slangegift-fosfodiesterase uangripelige. Den langsomme, men meget tydelige, videre nedbrytningen kan sannsynligvis tilbakeføres til den av fremstilleren (J.G. Izant and E. Weintraub, Cell 36, 1007-1015 (1984)) beskrevne blandingen av en enkelt tråds spesifikk endonuklease, som omdanner supercoiled PM2 DNA i åpne former. Lengden til sekvensen kan avleses. Bare 19 bånd kan avleses i det ved
den første verdien av kinetikken, etter 5 min, er 5'-5'-fosfodiesterbindingen allerede spaltet.
Eksempel 9:
Undersøkelser av hybridiseringsforholdet av oligonukleotider med terminale 3'-3'- og 5'-5'-ender.
For undersøkelse av hybridiseringsforholdet ble smeltekurver tatt opp i ekvimolare mengder (5.23 nMol) SV40TS17 og SV40TAS17(3'-3',5'-5') (for beskrivelse av oligonukleotider se Eksempel 5) oppløst i 1 ml av en 10 nM Na-cacodylat/100 mM NaCl-buffer, pH 7.0, oppvarmet til 70° C og forløpet av renatureringen ble formidlet ved langsom avkjøling (1 grd/min) gjennom måling av absorbsjonen til oppløsningen. For opptak av referansekurven ble like mengder SV40TAS17 anvendt. Analogt ble 4,75 nMol SV40TS35 og SV40TAS35 henholdsvis SV40TS35 og SV40TAS35(3'-3',5 *-5') i buffer, oppvarmet til 90"C og absorbsjonen ved avkjølingen målt. Det ble dannet smeltekurver som hadde følgende Tm-verdier:
Smeltetemperaturen ble gjennom den abiologiske koblingen bare redusert med 0.8° ved 17 mer henhv. 1.3°C ved 35 mer.
Eksempel 10
Inhibering av biosyntesen av SV40 T-antigen gjennom oligonukleotider med terminalt 3'-3'- og 5'-5'-forbinding.
A) Cellekultur
COSl-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) med 10$ føtalt kalveserum. Vevskulturskålene ble inkubert ved 37"C og 7.5°C i C02.
B) Radioaktiv merking og celleoppslemming
Omtrent 4 x IO<4>celler ble dyrket som monolag i vevskultur-skåler. De konfluente cellene ble vasket tre ganger med metionin-fritt DMEM og til slutt merket med 100 pCi<35->S-metionin. For antisens-moduleringseksperimenter ble cellene samtidig inkubert med oligonukleotid SV40TAS17(3'-3',5'-5') og radioaktiv metionin i 30 min ved 37°C. Til slutt ble cellene som inneholdt 10$ føtalt kalveserum og ikke merket metionin vasket to ganger med DMEM og ytterligere oppholdt i dette mediet i 30 min. For oppslemming ble cellene behandlet med iskaldt fosfat-bufret saltvann (PBS), fjernet fra skålene og 2 min ved 400 g sentrifugert. Celle-pelleten ble deretter lysert med 0.4 ml oppslemmingsbuffer (0.5$ nonidet P40, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0.1 M NaCl) pr. 3 x 10^ celler i 45 min på is. For å unngå proteolyse ble oppslemmingsbufferen tilført 1$ trasylol og fenylmetylsul-fonylfluorid helt til sluttkonsentrasjonen på 0.25 mg/ml. Lysatet ble deretter klarsentrifugert i 30 min ved 4"C i ultrasentrifugen (105 000 g). En alikot på 10 pl ble tatt ut og innholdet av protein ble målt ifølge fremgangsmåten til Lowry. For immunpresipitasjon ble like mengder totalprotein anvendt.
C) Immunpresipitasjon
Både for immunpresipitasjonen av SV40 villtype-T-antigen og også for i zytoplasma lokalisert mutant-T-antigen ble det monoklonale antistoffet PAbl08 anvendt. Antistoffet ble renset gjennom kromatografi på protein A-sepharose fra hybridom-supernatanten.
Celleekstraktet ble f or-presipitert med 100 pl av en 10$ suspensjon av varme-inaktiverte og med formaldehydfikserte bakterier fra stammen Staphylokokkus aureus (Cowan 1) over natt ved 4°C. Bakteriene ble deretter sentrifugert av, resten ble inkubert i minst 2 timer ved 4°C med de monoklonale antistoffene og gjennom tilsetning av S. aureus ble høyspesifikke immunkompleks dannet. Denne fremgangsmåten ble gjentatt opp til tre ganger for å oppnå fullstendig presipi-tasjon.
Til slutt ble immunpresipitåtene vasket; tre ganger med 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1$ Trasylol; to ganger med 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1$ nonidet P40 og en gang med 50 mM NH4HCO3. Dette ble deretter eluert i 45 min ved 4°C med 200 pl elueringsbuf f er (50 mM NH4HCO3, 1$ SDS, 1$ p<->merkaptoetanol) lyofilisert, oppløst gjennom koking i 10 minutter i 20 pl prøvebuffer (65 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5 & p, merkaptoetanol, 1$ glycerin, 0.01$ bromfenolblå) og applisert på en 3$ polyakrylamidgel (10$ SDS). Proteinene ble separert gjennom diskontinuerlig gelelektroforese og båndene kunne bli lokalisert ved fluoro-grafi på røntgenfilm (Kodak X-AR).
Med oligonukleotider som ifølge oppfinnelsen ble fremstilt slik at de overgikk translasjonsstart for T-antigenet, ble ved anvendelse i en ekstracellulær konsentrasjon på 30 pmolar registrert en 70$ inhibering av virusveksten. Dette står i motsetning til virksomheten av tilsvarende sekvenser som ikke var oppbygd ifølge oppfinnelsen, dvs. uten 3'-3'- og 5'-5'-bindinger. Her kunne ingen inhibering fastslås ved anvendelse av en lik konsentrasjon. Fig. 4 viser en tydelig inhibering av T-Ag-biosyntesen ved behandling av cellene med 30 pM SV40TAS17(3'-3',5<*>.5').
Eksempel 11
Sammenligning av serumstabiliteten til oligonukleotider som bare er modifisert ved 3<*->enden henhv. bare ved 5'-enden gjennom inverterte fosfodiesterbindinger.
Oligonukleotider ble nedbrutt av nuklease fortrinnsvis fra deres 3'-terminus (J.P. Shaw, K.Kent, J.Bird, J. Fishback, B. Froehler, Nucleid Acids Res. 9, 747-750 (1991). Det skal deretter bli undersøkt om en terminal 3'-3'-fosfodiesterbind-ing er tilstrekkelig for stabilisering av oligonukleotidet i blodserum. På grunn av at en 32p-merket fosfatrest blir avspaltet av fosfataser, spesielt ved en lengere behandling av proben med serum, ble fluoreskein anvendt for deteksjon av oligonukleotidene.
Følgende sekvenser ble fremstilt fra genomet til Xenopus levis:
Syntesen ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 5, idet det for den 10. konsentrasjonen ble anvendt et basemodifisert cytidin-fosforsyreesteramid C<*>, som muliggjorde en etterfølg-ende kovalent kobling med fluoreskein.Kobl ing av fluoreskein foregår ifølge veiledningen til firmaet Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology Auto Primer™ Synthesis Kit Instructions (XY-023-00-01). De modifiserte oligonukleotidene ble renset ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese.
Serumtest: 10 pMol oligonukleotid
140 pl friskt humant serum.
Probene ble inkubert ved 37"C. Etter 15 min, 30 min, 45min, 60 min, 8 t og 72 t ble 20 pl tatt ut, ekstrahert 2 x med fenol/kloroform/isoamylalkohol 25:24:1 og oligonukleotidene ble felt med etanol. Spaltningsproduktene ble separert på en 16$ polyakrylamidgel i en automatisk sekvenator A.L.F.
(Pharmacia, Freiburg) og detektert. Som Fig. 5 viser, oppviser oligonukleotidene nedbrytningsprodukter bare ved 5'-enden med en invertert internukleotidbinding bestående sekvens allerede etter 15 min serumbehandling og etter 60 min er de nærmest fullstendig nedbrutt. De ved 3'-enden gjennom 3'-3'-binding "beskyttede" oligonukleotid er derimot selv etter 72 timer først delvis nedbrutt.
Eksempel 12
Inhibering av genekspresjonen i et in vitro-ekspresjons-system.
For å kvantifisere inhiberingen av genekspresjonen ved hjelp av INV-oligonukleotider ble virkningen av tilsvarende antisens-oligonukleotider undersøkt med hensyn på ekspresjonen av p53 i et in vitrosystem som inneholder p53 mRNA (E. Reihsaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren. M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).
Antisens-sekvensen ble fremstilt
NH2(CH2 )6pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT (3'-3')T
og som sammenligningsprobe den tilsvarende sens-sekvensen NH2(CH2)6pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3'-3')A
Antisens-oligonukleotidet er rettet mot translasjonsstarten til onkoproteinet p53.
Ekspresjonen av proteiner ble undersøkt
1. uten tilsetning av oligonukleotid
2. ved tilsetning av 30 pM sens-sekvens
3. ved tilsetning av 1 pM antisens-sekvens
4. ved tilsetning av 10 pM antisens-sekvens
For kvantifisering ble svertingen av proteinbåndene bestemt densitometrisk (E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).
Fig. 6 viser at en tilsetning av 10 jjM antisens-oligonukleotid til ekspresjonssystemet bevirker en inhibering på ca. 70$. Ved reduksjon av konsentrasjonen til 1 jjM kan nærmest ingen inhibering bli fastslått og likeledes ved tilsetning av sens-sekvensen som ikke blir bundet på mRNA.
Claims (4)
1.
Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider med Formel II
der
R<1>betyr hydrogen eller en rest med Formel III R<2>betyr hydrogen eller en rest med Formel IV
der minst en av restene R<1>eller R<2>betyr en rest med Formel III eller IV,
B betyr en base, som eksempelvis naturlige baser som
adenin, tymin, cytosin, guanin eller unaturlige baser, som eksempelvis purin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, N<4->etanocytosin, henhv. promedikamentformer derav,
W og W betyr uavhengig av hverandre oksygen eller svovel,
Z og Z<1>betyr uavhengig av hverandre 0~, S", C^^-C^^g-alkoksy,
fortrinnsvis C-^-Cg-alkoksy, spesielt foretrukket er C1-C3~alkoksy, spesielt metoksy; C^-C^^g-alkyl, fortrinnsvis C^^-Cg-alkyl, spesielt foretrukket Cl-C3-alkyl, spesielt metyl; NHR<3>, der R<3>fortrinnsvis er C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket er C^-Cg-alkyl, spesielt C^-^-alkyl, eller C^-C4-alkoksy-Ci-C(,-alkyl, fortrinnsvis metoksyetyl; NR<3>R<4>, der R<3>er definert som ovenfor og R<4>er fortrinnsvis C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket C^-Cg-akyl, spesielt C4-alkyl eller der R<3>og R<4>sammen med nitrogenatomet som bærer dem danner en 5-6-leddet heterocyklisk ring, som i tillegg inneholder et ytterligere heteroatom fra rekken 0, S, N, som f.eks. morfolin;
Y betyr en rest fra rekken
0-Si(R)2, OCH2, C(0)NR eller 0-CH2-C(0) der R betyr C^-C^-alkyl, aryl eller C5henhv. C5cykloalkyl; og
n betyr et helt tall på 5-60, fortrinnsvis 10-40 og
spesielt foretrukket er 15-25,
samt fysiologiske tålbare salter derav, idet de terapeutisk aktive nukleotidene er substituert med grupper som fremmer det intracellulære opptaket, som in vitro eller in vivo tjener som reportergrupper, og/eller grupper, som ved hybridisering av oligonukleotidet på biologisk DNA eller RNA angriper disse DNA- eller RNA molekylene under binding eller spaltning,karakterisert vedat man a) omsetter en nuleotidenhet med 3'- henhv. 5'-terminale fosfor (III)- eller fosfor (V)-grupperinger eller det aktiverte derivatet derav med en ytterligere nukleotidenhet med 3'- henhv. 5'-terminal fri hydroksygruppe eller d) bygger opp oligonukleotidet ved hjelp av fragmenter på samme måte, avspalter i de ifølge (a) eller (b) oppnådde oligonuleotidene eventuelt en eller flere for beskyttelse av andre funksjoner temporært innførte beskyttelsesgrupper og overfører de på denne måten oppnådde oligonukleotidene med Formel I eventuelt til deres fysiologiske tålbare salt.
2.
Fremgangsmåte for fremstilling av oligonukleotider med Formel II ifølge krav 1, der R<2>betyr en rest med Formel IV og R<1>betyr hydrogen; R<1>henhv. R<2>betyr en rest med Formel III henhv. IV eller r<2>betyr hydrogen og R<1>betyr en rest med Formel III, der enten W eller Z i sistnevnte tilfelle ikke betyr oksygen,karakterisert vedat tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.
3.
Fremgangsmåte for fremstilling av oligonukleotidene med Formel II ifølge kravene 1 eller 2, hvor W betyr oksygen, eller Z og W betyr begge oksygen,karakterisert vedat tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.
4.
Fremgangsmåte for fremstilling av oligonukleotidene med Formel II, ifølge kravene 1 til 3, hvor R<2>betyr en rest med Formel IV og R<1>betyr hydrogen,karakterisertved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4021019 | 1990-07-02 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO912585D0 NO912585D0 (no) | 1991-07-01 |
NO912585L NO912585L (no) | 1992-01-03 |
NO303018B1 true NO303018B1 (no) | 1998-05-18 |
Family
ID=6409497
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO912585A NO303018B1 (no) | 1990-07-02 | 1991-07-01 | AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5750669A (no) |
EP (1) | EP0464638B1 (no) |
JP (1) | JP3186795B2 (no) |
KR (1) | KR100200400B1 (no) |
AT (1) | ATE151076T1 (no) |
AU (1) | AU647143B2 (no) |
CA (1) | CA2045891C (no) |
CZ (1) | CZ285408B6 (no) |
DE (1) | DE59108644D1 (no) |
DK (1) | DK0464638T3 (no) |
ES (1) | ES2099718T3 (no) |
FI (1) | FI104177B (no) |
GR (1) | GR3023432T3 (no) |
HU (1) | HU215147B (no) |
IE (1) | IE912309A1 (no) |
IL (1) | IL98672A (no) |
NO (1) | NO303018B1 (no) |
NZ (1) | NZ238769A (no) |
PT (1) | PT98169B (no) |
SK (1) | SK279544B6 (no) |
TW (1) | TW206232B (no) |
ZA (1) | ZA915056B (no) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223618A (en) * | 1990-08-13 | 1993-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
DE59306170D1 (de) * | 1992-09-24 | 1997-05-22 | Hoechst Ag | Oligoribonucleotid- und Ribozym-Analoga mit terminalen 3'-3'-bzw.5'-5'-Verknüpfungen |
CA2159629A1 (en) * | 1993-03-31 | 1994-10-13 | Sanofi | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
US6015886A (en) * | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
US6605708B1 (en) | 1993-07-28 | 2003-08-12 | Hybridon, Inc. | Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom |
US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
US9096636B2 (en) * | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US7309692B1 (en) * | 1996-07-08 | 2007-12-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1 |
US6977244B2 (en) | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
CN1060177C (zh) * | 1997-06-28 | 2001-01-03 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 3′-单磷酸化寡核苷酸 |
US7285288B1 (en) | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US7704962B1 (en) | 1997-10-03 | 2010-04-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Small oligonucleotides with anti-tumor activity |
US20030180789A1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-09-25 | Dale Roderic M.K. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
DE19935756A1 (de) * | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
DE19935303A1 (de) | 1999-07-28 | 2001-02-08 | Aventis Pharma Gmbh | Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5 |
US6271360B1 (en) | 1999-08-27 | 2001-08-07 | Valigen (Us), Inc. | Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors |
EP1702983A3 (en) | 2000-04-13 | 2007-01-10 | Medical University of South Carolina | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, DNAzymes and antisense oligonucleotides and methods of use thereof |
JP2004503560A (ja) * | 2000-06-13 | 2004-02-05 | プロリゴ・エルエルシー | 固相オリゴ合成の普遍固形支持体とその製造及び使用の方法 |
US7262286B2 (en) * | 2000-09-26 | 2007-08-28 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes |
GB0114007D0 (en) * | 2001-06-08 | 2001-08-01 | Isis Innovation | Oilgonucleotides |
US7070933B2 (en) * | 2001-09-28 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Inversion probes |
EP1460898A4 (en) * | 2002-01-03 | 2006-05-24 | Univ Texas | OLIGONUCLEOTIDES ANTISENSE WT1 INHIBITING BREAST CANCER |
EP1474432A1 (en) * | 2002-02-04 | 2004-11-10 | Biomira Inc. | Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides |
WO2004044132A2 (en) | 2002-11-05 | 2004-05-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modified oligonucleotides for use in rna interference |
WO2004044138A2 (en) | 2002-11-05 | 2004-05-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
AU2005252663B2 (en) * | 2004-06-03 | 2011-07-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation |
US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
CA2679750A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-23 | Nexus Dx, Inc. | Methods for detecting nucleic acids in a sample |
EP2781523A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-24 | Miltenyi Biotec GmbH | Lipophilic oligonucleotide analogs |
KR101323476B1 (ko) * | 2013-06-12 | 2013-10-31 | 조선미 | 건물용 층간소음 방지재와 이를 이용한 층간소음 방지구조 및 그 시공 방법 |
LU92821B1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-20 | Mologen Ag | Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides |
GB2542425A (en) | 2015-09-21 | 2017-03-22 | Mologen Ag | Means for the treatment of HIV |
WO2017177169A1 (en) * | 2016-04-08 | 2017-10-12 | Rana Therapeutics, Inc. | Multimeric coding nucleic acid and uses thereof |
US11603532B2 (en) | 2017-06-02 | 2023-03-14 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
AU2019252680A1 (en) * | 2018-04-12 | 2020-10-22 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4123610A (en) * | 1977-03-09 | 1978-10-31 | The United States Government | Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith |
US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
DE3332068A1 (de) * | 1983-09-06 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von nukleosidalkyl-, aralkyl- und arylphosphoniten und -phosphonaten |
US4795700A (en) * | 1985-01-25 | 1989-01-03 | California Institute Of Technology | Nucleic acid probes and methods of using same |
US5276019A (en) * | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
WO1989009221A1 (en) * | 1988-03-25 | 1989-10-05 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
AU5418290A (en) * | 1989-03-31 | 1990-11-05 | University Patents Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections |
-
1991
- 1991-06-26 ES ES91110570T patent/ES2099718T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 DE DE59108644T patent/DE59108644D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 AT AT91110570T patent/ATE151076T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-26 EP EP91110570A patent/EP0464638B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 DK DK91110570.8T patent/DK0464638T3/da active
- 1991-06-28 FI FI913169A patent/FI104177B/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 NZ NZ238769A patent/NZ238769A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 CA CA002045891A patent/CA2045891C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-30 IL IL9867291A patent/IL98672A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 IE IE230991A patent/IE912309A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 PT PT98169A patent/PT98169B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 NO NO912585A patent/NO303018B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 SK SK2014-91A patent/SK279544B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 HU HU215/91A patent/HU215147B/hu unknown
- 1991-07-01 ZA ZA915056A patent/ZA915056B/xx unknown
- 1991-07-01 CZ CS912014A patent/CZ285408B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 AU AU79475/91A patent/AU647143B2/en not_active Expired
- 1991-07-01 KR KR1019910011064A patent/KR100200400B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-02 JP JP18820291A patent/JP3186795B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-27 TW TW080105851A patent/TW206232B/zh not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-01 US US08/282,503 patent/US5750669A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-15 GR GR970401081T patent/GR3023432T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO303018B1 (no) | AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider | |
US6531584B1 (en) | 2'modified oligonucleotides | |
US7321029B2 (en) | 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use | |
AU767646B2 (en) | Oligonucleotide N3'-P5' thiophosphoramidates: their synthesis and use | |
US6399754B1 (en) | Sugar modified oligonucleotides | |
JP3787265B2 (ja) | 2’−o−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法 | |
JP2002520420A (ja) | 部位特異的キラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド | |
AU665113B2 (en) | Oligoribonucleotide and ribozyme analogs with terminal 3'-3' and/or 5'-5' linkages | |
JPH0813274B2 (ja) | 遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド | |
JP2003520200A (ja) | 2’−o−アセトアミド修飾モノマーおよびオリゴマー | |
WO2001002423A2 (en) | 2'-guanidinyl-substituted oligonucleotides and gene expression modulation therewith | |
JP7263236B2 (ja) | 新規二環式ヌクレオシドおよびそれから調製されたオリゴマー | |
RU2088588C1 (ru) | Олигонуклеотиды и способ их получения | |
JP2003513883A (ja) | ホスホロアミダイト組成物を用いるオリゴマー合成法 | |
Dong | DNA complexes containing novel aromatic residues | |
Koga et al. | Synthesis of telomere-mimic carbocyclic 5′-nor oligodeoxynucleotides | |
PL219355B1 (pl) | Modyfikowany deoksyrybozym 10-23 o ustabilizowanej odporności na hydrolizę oraz podwyższonej aktywności katalitycznej i sposób jego wytwarzania | |
WO1996018640A9 (no) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |