NO303018B1

NO303018B1 - AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider

Info

Publication number: NO303018B1
Application number: NO912585A
Authority: NO
Inventors: Hannelore Raesch; Anja Fraelich; Jose Flavio Ramalho-Ortigao; Matthias Montenarh; Hartmut Seliger
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 1998-05-18
Also published as: EP0464638B1; FI104177B1; TW206232B; EP0464638A2; HUT62010A; FI104177B; CA2045891A1; IL98672A0; IE912309A1; DE59108644D1; ES2099718T3; AU647143B2; CA2045891C; IL98672A; ZA915056B; NO912585L; HU912215D0; NZ238769A; AU7947591A; FI913169A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider.

Som antisense-oligonukleotid betegner man nukleinsyrefragmen-ter der sekvensene er komplementære med kodende eller "sens"-sekvensen av en "Messenger-RNA" henhv. til kodende tråd av DNA. Slike oligonukleotider blir anvendt for lnhibisjon av genekspresjonen in vitro eller i cellekultursystemer. Anvendelse av slike forbindelser innen det medisinsk-terapeu-tiske området, henhv. som antivirale-farmaka, er gjenstand for omfangsrike undersøkelser. Innen biologien har antisens-RNA-sekvenser som naturlig forekommende regulatorer av genekspresjonen i prokaryoter (T. Mizuno, M.-Y. Chou og M. Inouye, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 1966-1970 (1984)) og også i eukaryoter (S.M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772 (1986)) vært kjent. De bevirker en inhibering av translasjonen gjennom hybridisering på et tilsvarende "Messenger-RNA". I tallrike eksperimenter har det i mellom-tiden vært vist at slike anti-sense-RNA-sekvenser, når de er blitt transformert inn i bakterier (A. Hirashima, S.Sawaki,

Y. Inokuchi og M. Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)) eller eukaryote celler (J.G. Izant og H. Weintraub, Cell 36, 1007-1015 (1984)) også der har kunnet hindre gen-ekspresjonen og utviser bådet anti-virale (L.J. Chang og CM. Stoltzfus,

J. Virology 61, 921-924 (1987)) og også anti-onkogen-virkning (J.T. Holt, T.V. Gopal, A.D. Moutton og A.W. Nienhuis, PNAS USA 83, 4794-4798 (1986)). For slike undersøkelser har syntetiske oligonukleotider i forhold til biologisk anti-sense-RNA den fordelen av å ha høyere stabilitet og lettere tilgjengelighet. Det sistnevnte er basert på de i nyere tid sterkt forbedrede synteseteknikkene som gjør korte oligomerer (på f.eks. 12-30 baser) relativt lett tilgjengelig (E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14, 274-325 (1986); Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed., Macmillan Press, 1989; s. 7ff).

Det er blitt vist at slike korte oligomerer er virksomme som ekspresjonsmodulatorer. Dermed kan slike oligonukleotider også virke gjennom binding på DNA-dobbelt-tråden under dannelse av en trippel helix. For at begge, antisense oligonukleotidene og de triplex-dannende oligonukleotidene kan bli anvendt i biologiske systemer må følgende forutset-ning være oppfylt (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen ed. Macmillian Press, 1989, S. lff): 1. de må på den ene siden være vannoppløselige og på den andre siden må de lett passere den lipofile celle-membranen , 2. de må inne i cellen være tilstrekkelig nedbrytnings-stabile, dvs. være stabile mot nukleaser, 3. de må danne stabile hydrider med intracellulære nukleinsyrer ved fysiologiske temperaturer, 4. hybridiseringen må være selektiv; forskjellen i dissosiasjonstemperaturen til et oligonukleotid, som fører til feilparring, må være tilstrekkelig stor, slik at sistnevnte spesifikt kan bli utvasket.

I 1978 kunne Zamecznik og Stephenson, PNAS USA 75, 280-284 og 285-288 (1978)) for første gang vise at umodifiserte oligonukleotider kunne hemme formeringen av Rous Sarcom-vira. 01igonukleotidene ble anvendt i høye konsentrasjoner og eksperimentene ble først og fremst gjennomført i på forhånd oppvarmede medier for å inaktivere nukleaser. Nødvendigheten av dette trinnet fremkommer fra den raske enzymatiske nedbrytningen som fremmede nukleinsyrer går igjennom i serum og i celler.

Man har allerede tidlig gjennomført undersøkelser med det målet å modifisere oligonukleotider strukturelt slik at de ovennevnte kravene bedre blir oppfylt, spesielt bedre beskyttelse mot nuklease-nedbrytning. Disse forsøkene konsentrerer seg om en modifikasjon av fosfodiester-internukleotid-bindingen på grunn av at denne siste enden er angrepspunktet for alle nukleaser. Man kan hovedsakelig inndele de strukturmodifiserte internukleotid-bindingene i a) nukleosidsammenkobling med fosfor som sentralatom.

Disse kan igjen være:

ioniske/chirale

loniske/achirale

nøytrale/chirale

b) nøytrale/achirale fosforfrie nukleosidkoblinger.

Til de strukturmodifiserte som før ioniske internukleosid-koblinger hører trifosfat- og ditiofosfatkoblinger. Tiofos-fat-modifiserte oligonukleotider (oligodeoksynukleotider, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen. ed. Macmillan Press, 1989, S. 97ff) viser for tiden de beste inhiberingsvirkningene på genekspresjon i cellekulturer, men denne inhiberingen ser ikke ut til å være bundet på en spesifikk sekvens, idet også slike trifosfat-modifiserte oligonukleotider utviser inhiberingsvirkninger, som bare består av en nukleinsyre byggesten, f.eks. tiofosfatanaloger av oligocytidylater. Begrensende for anvendelse av tiofos-fat-modifiserte oligonukleotider er videre deres chiralitet.

På grunn av at det ved tilveiebringing av et ol igonukleot id på en base blir dannet 2<n_1>diastereomerer, har bare den minste delen av et tiofosfatbindings-inneholdende preparat gode hybridiseringsegenskaper.

I oligonukleotider med ditiofosfat-internukleosidbindinger (A. Grandas, William S. Marshall, John Nielsen und Martin H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 20, 543-546 (1989), G.M. Porritt, C.B. Reese, Tetrahedron Lett. 30, 4713-4716 81989)), blir chiralitetsproblemet omgått. Slike forbindelser er derimot opp til nå bare tilgjengelige ved hjelp av kompli-serte og arbeidskrevende fremgangsmåter med mange trinn. Dermed var det ikke mulig å gjennomføre omfangsrike undersøk-elser på hybridiseringsforholdet, spesielt i cellekulturer.

En annen klasse av kjemisk modifiserte oligonukleotider er slike med ikke-ioniske, dvs. nøytrale internukleosid-bindinger. Til denne typen av modifisert struktur tilhører oligonukleotider med fosfortriester- eller metylfosfornat-internukleosidbindinger (Oligodeoxynucleotider, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillian Press, 1989, S. 79ff).

Begge forbindelsesklasser er felles slik at den ioniserbare fosfatresten er erstattet med en uladet gruppe. Gjennom innføring av en slik sammenkobling blir disse oligonukleotid-analogene resistente overfor nukleaser, men har derimot den ulempen at de er dårlig oppløselige i vandig medium.

Oligonukleotider med nøytral/achiral internukleosidbinding kunne før bare bli oppnådd idet fosforatomet til internu-kleosid-bindingen ble erstattet med et annet sentralatom. Fosforsyreester-bindingen er en siloxan-sammenkobling. Oligonukleotider med siloxan-internukleosidbindinger (K.K. Ogilvie, J.F. Cormier, Tetrahedron Lett. 26, 4159 (1985), H. Seliger, G. Feger, Nucl. Nucl. 6 (182), 483-484 (1987)) ble syntetisert og er stabile overfor nukleaser.

Oligonukleotider med karbonat-, acetal- eller karboksamid-internukleosid-sammenkoblinger er kjent fra M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 31, 2385-2388 (1990), J. R. Tittensor, J. Chem. Soc.C. 1971, S. 2656 og J. Coull et al., Tetrahedron Lett. 28, 745 (1987).

Nukleaseresistente oligonukleotidanaloger kunne også bli oppnådd uten endring av fosfodiester-internukleotidbindingen idet sukkerrester med endret konfigurasjon ble anvendt. Dette ble oppnådd gjennom syntese av oligonukleotidanaloger der nukleobasene er bundet a-glykosidisk (oligodeoksynukleo-sider, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, S. 119ff). Slike oligonukleotidanaloger er derimot preparativt vanskelig tilgjengelig idet de må bli oppbygd utgående fra sukker og base. Dertil utviser de med hensyn på retningen av hybridiseringen delvis et normalt forhold.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider med Formel II

der

R<1>betyr hydrogen eller en rest med Formel III R 2 betyr hydrogen eller en rest med Formel IV

der minst en av restene R<1>eller R<2>betyr en rest med Formel III eller IV,

B betyr en base, som eksempelvis naturlige baser som adenin, tymin, cytosin, guanin eller unaturlige baser, som eksempelvis purin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, N<4->etanocytosin, henhv. promedikamentformer derav,

W og W betyr uavhengig av hverandre oksygen eller svovel,

Z og Z<1>betyr uavhengig av hverandre 0~, S~, C^-C^g-alkoksy,

fortrinnsvis C^-Cg-alkoksy, spesielt foretrukket er C^-C3-alkoksy, spesielt metoksy; C^-C^g-alkyl, fortrinnsvis C^-Cg-alkyl, spesielt foretrukket CI-C3-alkyl, spesielt metyl; NHR<3>, der R<3>fortrinnsvis er C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket er Cj-Cg-alkyl, spesielt Ci-C4-alkyl, eller C1-C4-alkoksy-C1-C5-

alkyl, fortrinnsvis metoksyetyl; NR<3>R<4>, der R<3>er definert som ovenfor og R<4>er fortrinnsvis C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket C-^-Cg-akyl, spesielt C±-C4~alkyl eller der R<3>og R<4>sammen med nitrogenatomet som bærer dem danner en 5-6-leddet heterocyklisk ring, som i tillegg inneholder et ytterligere heteroatom fra rekken 0, S, N, som f.eks. morfol in;

Y betyr en rest fra rekken,

0-Si(R)2, 0CH2, C(0)NR eller 0-CH2-C(0) der R

betyr C^-C^-alkyl, aryl eller C5henhv. C^, cykloalkyl; og

n betyr et helt tall på 5-60, fortrinnsvis 10-40 og

spesielt foretrukket er 15-25,

samt fysiologiske tålbare salter derav, idet de terapeutisk aktive nukleotidene er substituert med grupper som fremmer det intracellulære opptaket, som in vitro eller in vivo tjener som reportergrupper, og/eller grupper, som ved hybridisering av oligonukleotidet på biologisk DNA eller RNA angriper disse DNA- eller RNA molekylene under binding eller spaltning, kjennetegnet ved at man a) omsetter en nuleotidenhet med 3'- henhv. 5'-terminale fosfor (III)- eller fosfor (V)-grupperinger eller det

aktiverte derivatet derav med en ytterligere nukleotidenhet med 3<*->henhv. 5'-terminal fri

hydroksygruppe eller

b) bygger opp oligonukleotidet ved hjelp av fragmenter på samme måte, avspalter i de ifølge (a) eller (b)

oppnådde oligonuleotidene eventuelt en eller flere for beskyttelse av andre funksjoner temporært innførte beskyttelsesgrupper og overfører de på denne måten oppnådde oligonukleotidene med Formel I eventuelt til deres fysiologiske tålbare salt.

Under aryl skal det i denne sammenhengen forstås f. eks. fenyl, fenylsubstituert (1-3 ganger) med C^-C^-alkyl, C^-C^-alkoksy og/eller halogen.

Videre er oligonukleotider med Formel II nevnt som i tillegg er substituert med grupper som fremmer det intra-cellulære opptaket, som in vitro eller in vivo tjener som reportergrupper, og/eller grupper som ved hybridisering av oligonukleotidet på biologisk DNA eller RNA angriper disse DNA-eller RNA molekylene under binding eller spalting.

Eksempler på grupper som fremmer det intracellulære opptaket er lipofile rester som alkylrester, f.eks. med opp til 18 C-atomer eller kolesteryl, eller konjugater, som benytter naturlige bærersystemer, som f.eks. gallesyre eller peptider for den tilsvarende reseptoren (f.eks. reseptorformidlet endozytose). Eksempler på reportergrupper er fluoriserende grupper (f.eks. akridinyl, dansyl, fluoreskeinyl) eller kjemiluminiserende grupper som f.eks. akridiniumestergrupper.

01igonukleotid-konjugater, som bindes til nukleinsyrer og/eller spalter, inneholder akridin (N. Thuong et al., Tetrahedron Lett. 29, s. 5905, 1989) eller kloretylaminoaryl-kunjugat (oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Mc Millou Press, 1989, s. 173 ff).

Den karakteristiske strukturelle modifikasjonen av oligonukleotidet fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter at internukleotidbindingene på begge kjedeendene er forandret, dvs. istedet for biologiske 3'-5'-bindinger har foreliggende forbindelser 3'-3<*->henhv. 5'-5'-bindinger. Det ble overraskende oppdaget at disse minimale strukturmodifika-sjonene er tilstrekkelige for å stabilisere slike forbindelser mot nuklease-nedbrytning.

Som beskrevet nedenfor bevirker de bare uviktige struktur-modif ikasj onene et hybridiseringsforhold som nesten tilsvarer de biologiske oligonukleotidene. Dette resulterer også til en generell anvendbarhet av disse forbindelsene som inhibitorer av genekspresjonen i cellekulturer.

Fra litteraturen er det ikke blitt henvist til fremstilling av oligonukleotidanaloger med 3'3'- og 5'5'-internukleosidbindinger på begge kjedeendene og anvendelse som anti-sense-oligonukleotider. Analoger av dinukleosidfosfater, som enten inneholder 3'-3'- eller 5'-5'-bindinger, er blitt oppnådd og undersøkt i flere år som hovedprodukter (A-Myles, W. Hutzenlaub, G. Reits und W. Pfleidererø, Chem. Ber. 108, 2857-2871 (1975); H.Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub und W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2872-2877 (1975); J. Tomasz, Nucl.Nucl. 2(1), 51-61 (1983); M. Nemer, N. Theriault, A. Schifmann og K.K. Ogilvie, Vith International Round Table, Nucleosides, Nucleotides and their biological Applications, La Grande Motte, ed. J.L. Imbach, 94-96 (1984)) henhv. biprodukter (R. Letsinger, K.K. Ogilvie, J. Amer.Chem.Soc. 89, 4801-4802 (1967)) av tilsvarende kondensasjon. Slike dimerer er derimot på grunn av for lavt smeltepunkt i hovedsak ikke egnet for stabil hybridisering med cellulære nukleinsyrer. Oligonukleotider som bare i den ene enden har en 5'-5'-binding ble oppbygd for å innføre et tilkoblingssete for reportergrupper ved hjelp av prober (S.Agrawal, C. Christodoulou, M.J. Galt, Nucleic Acids Res 14, 6227-6245

(1986)). De er derimot ikke blitt undersøkt med hensyn på hybridiseringsforhold. For biofysikalske forsøk har man fremstilt selvkomplementære oligonukleotider som i midten av molekylet oppviser en enkelt 3<*->3'- henhv. 5'-5'-binding (J.H. van de Sande, N.B. Ramsin, M.W. German, W. Elhorst, B.W. Kalisch, E.V. Kitzing, R.T. Pon, R. c. Clegg, T.M. Jovin, Science 241, 551-5557 (1988)).

Fremstilling av oligonukleotider med terminal invertert 3'-3'- og 5'-5'-binding foregår på samme måte som fremstilling av biologiske oligonukleotider i oppløsning eller fortrinnsvis på fast fase, eventuelt under hjelp av et automatisk synteseapparat.

Som utgangskomponenter for fremstilling av oligonukleotider med terminal invertert 3'-3'-binding blir det for fast fase-syntese anvendt en baererharpiks hvorpå det på den første nukleosidmonomeren er koblet over 5'-OE-gruppen. For fremstilling av disse komponentene anvender man et baererharpiks fremstilt ifølge kjente fremgangsmåter (T. Atkinson, M. Smith in Oligonucleotide Synthesis, M.J. Geit (ed), 35-49

(1984)), fortrinnsvis kiselgel eller kontrollert poreglass, som er funksjonalisert med aminogruppen. Det blir omsatt med et på nukleobasen og på det 3'-0H gruppe-beskyttede nukleosid-derivatet som på forhånd var omdannet til 5'-p-nitro-fenyl-succinat. Som basebeskyttelsesgruppen anvendes fortrinnsvis acylgrupper, f.eks. benzoyl, isobutyryl eller fenoksyacetyl. 3'-posisjonen blir fortrinnsvis beskyttet med dimetoksytrityl-beskyttelsesgruppe som kan bli innført ifølge M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21

(1980), s. 3243-3246. Den videre oppbygningen av oligonu-kleotidkjeden helt til nest siste kjedeledd foregår ifølge fremgangsmåter kjent i litteraturen, fortrinnsvis under anvendelse av på 5'-0H-gruppe gjennom dimetoksytritylgrupper beskyttede nukleosid-3'-fosforsyre-esteramider eller nukleosid-3'-H-fosfonater. Som siste kjedeledd blir videre et på 3'-OH-gruppen, fortrinnsvis med dimetoksytrityl beskyttet nukleosid-5'-fosforsyre-esteramid henhv. nukleosid-H-fosfonat anvendt. Fremstilling av en slik oligonukleotidkjede med terminale dreide internukleotidforbindelser er angitt skjematisk nedenfor. (Fosforamidicyklus for fremstilling av oligonukleotider med 3'-3'- og 5'-5'-bindinger i endene). Fremstilling av oligonukleotider med 3'-3'- eller 5'-5'-bindinger foregår tilsvarende. Struktur- og sekvensanalysen foregår på den måten at det med 3'-3'- og 5 '-5'-enden oppbygde oligonukleotidet først blir terminalt merket. Dette foregår gjennom radioaktiv merking, fortrinnsvis ved hjelp av 5'-'y-<32>P-ATP/polynukloetidkinase. Denne radioaktive merkingen foregår på de frie 5'-0H-gruppene, dvs. overfor et oligonukleotid med bare biologiske 3'-5'-bindinger av den omvendte enden av nukleotidkjeden. Ytterligere sekvensanalyse foregår deretter ifølge kjente fremgangsmåter, fortrinnsvis gjennom base-spesifikke, statiske spaltninger, som beskrevet av Maxam og Gilbert (A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymology 65, 499-560

(1980) ).

På grunn av den radioaktive merkingen på den "bakvendte" molekylenden foregår nå også sekvensavlesningen, sammenlignet med et oligonukleotid med biologisk 3'-5'-binding, i motsatt retning. En utførlig testbeskrivelse er angitt i Eksempel 6.

01igonukleotidene med Formel II anvendes for hybridiserings-kjemiske, til hybridisering for tilbinding til dobbelt- eller enkelt-trådede nukleinsyrer beroende fremgangsmåter for regulering eller undertrykking av den biologiske funksjonen til nukleinsyrer samt for selektiv undertrykking av ekspresjonen av virale genomfunksjoner og for profylakse og terapi av virusfunksjoner, for undertrykking av onkogenfunksjonen og for terapi av kreftsykdommer.

Som mål for stabiliteten in vivo kan forholdet av et i blodserum oppløst ifølge oppfinnelsen oppbygd oligonukleotid med Formel I eller II bli undersøkt. Den generelle testen er beskrevet i Eksempel II og en tilsvarende in vitro test med en oppløsning av slangegift-fosfodiesterase i Eksempel 8. 01igonukleotidene ifølge oppfinnelsen blir mye langsommere oppbygd i forhold til 3'-5'-oligonukleotidene.

Eksempel 11 demonstrerer serumstabiliteten til oligonukleotider med terminal invertert 3'-3'-binding. Hybridiseringsforholdet fremkommer fra modellforsøk som beskrevet i Eksempel 9 der en rekke SV40-spesifikke sekvenser, som ifølge oppfinnelsen ble fremstilt med en 3<*->3'- og 5'-5'-ende, som i hybridiseringen med den tilsvarende mottråden fra SV 40-DNA oppviser et smeltepunkt, som ligger uvesentlig lavere enn smeltepunktet som blir målt ved hybridisering med en tilsvarende sekvens, som ble oppbygd, ikke i følge oppfinnelsen, dvs. uten 3'-3'- og 5'-5'-ende.

Virksomheten til oligonukleotidene ifølge oppfinnelsene som har terminale 3'-3'- henhv. 5'-5'-koblinger som inhibitorer av genekspresjonen fremkommer fra undertrykkingen av veksten til virus SV 40. (Eksempel 10) samt inhibisjonen av den in vitro ekspresjonen av onkogenproduktet p53 (Eksempel 12).

Eksempel 1

Fremstilling av 3 *-O-DMTr-desoksyribonukleosid-5'-(N,N-bis-diisopropyl-amino-p<->cyanetoksy-)fosforsyreesteramid.

Reaksjonsskjemaet, med utgangspunkt i basebeskyttede nukleo-sider, er angitt nedenfor:

a: B = Thymin

b: B =N<5->benzoyladenin

c: B = N<4->benzoylcytosin

d: B = N<2->isobutyrylguanin

DMTr = 4,4'-dimetoksytrityl

A) Fremstilling av 3'-5'-O-bis-DMTr-desoksyribonukleosid 2

Blanding: 6 mMol dT, dA<bz>,dCbz eller dG<lbu>

14,4 mMol DMTr-Cl

14,9 mMol TEA abs.

Det desoksyribonukleosid 1 blir oppløst i 50 ml absolutt pyridin og ved 0°C blir trietylamin og dimetoksytritylklorid tilsatt. Til slutt omrøres dette i 24 t ved romtemperatur og omsetningen foregår ved hjelp av tynnskiktskromatografi (løpemiddel: CH2Cl2/MeOH 9:1). Reaksjonen blir avsluttet gjennom tilsetning av metanol, oppløsningmidlet fjernet og resten tatt opp i diklormetan. Den organiske fasen blir flere ganger vasket med 1 M (NH4 )HCC<3-oppløsning og med E20, tørket over Na2S04og innrotert.

3'-5'-ditritylert produkt 2 kan bli renset gjennom kolonnekromatografi av overskytende tritanol henhv. 5'-DMTr-dN (kolonnemateriale: kiselgel 60H, elueringsmiddel; CH2-C12med økende metanol innhold, idet det ditritylerte desoksy-nukleosidet blir eluert med 1-1. 5% MeOH). Utbytte: 73-85$ d.Th. B) Spesifikk avspaltning av 5 '-dimetoksytritylgruppen.

Litteratur: M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron

Lett. 21, 3243-3246 (1980).

Blanding: 3 mMol 3'-5 '-0-bis-DMTr-dN 2

15 mMol ZnBr2

200 ml absolutt nitrometan.

s

v

Oppløsningen av 3'-5'-O-bis-DMTr-dN 2 i 100 ml nitrometan blir ved 0°C i ytterligere 100 ml nitrometan tilsatt til sinkbromidsuspensjonen. I tilfelle av beskyttet desoksyaden-osin ble reaksjonen videreført under avkjøling for å unngå en depurinering. Avspaltningen av dette nukleosidet var fullstendig allerede etter 60 min, hvilket kan bli fastslått ved hjelp av tynnskiktskromatografi. For tymidin og desoksy-guanosin er reaksjonen likeledes avsluttet etter 60 min. ved romtemperatur, mens 5'-ditrityleringen av bis-DMTr-desoksycy-tidin bare forløper ufullstendig. Her blir reaksjonen avsluttet etter 3 timer for å unngå avspaltning av også 3'-dimetoksytrietylgruppen.

Avbrudd av reaksjonen foregår ved tilsetning av 200 ml 1 M NH4Ac-oppløsning og produkt 3 blir ekstrahert med 200 ml C^Clgiog den organiske fasen blir enda en gang vasket med mettet NaCl-oppløsning og med H20, tørket over Na2S04og oppløsningsmidlet avdestillert i vakuum.

Hovedmengden av tritanol kan bli fjernet gjennom utfelling av råproduktet i ca. 500 ml n-heksan ved -15°C. Rensingen foregår da kromatografisk over en kiselgel 60H-kolonne med diklormetan med et økende innhold av metanol som elueringsmiddel.

Rf-verdiene til 3'-DMTr-desoksyribonukleosidet er forskjellig fra de tilsvarende 5'-triylerte monomerene på følgende måte (løpemiddel: CH2Cl2/MeH 24:1):

Utbytte: 48 - 65$ d.Th.

C) Fremstilling av 3'-O-DMTr-desoksytribonukleosid-5'-0-(N,N-di isopropylamino-e-cyanoetoksy-)fosforsyreesteramid 4.

Litteratur: H.Koster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557

(1984 ).

Blanding: 1 mMol 3'-O-DMTr-desoksyribonukleosid 3

1.5 mMol kloro-N,N-diisopropylamino-3-cyanoet-oksy-fosfin 4 mMol diisopropylamin.

Fosfityleringsreaksjonen ble gjennomført analogt med fremgangsmåten for fremstilling av 5'-O-DMTr-desoksytribonukleo-sid-3'-O-fosforsyreesteramid beskrevet av KSster et al.. For oppløsning av det beskyttende nukleosidet i absolutt CH2CI2, ble under argon diisopropylamin, tilslutt fosforyleringsmid-let tilført. Etter 30 min. ble reaksjonen avsluttet gjennom tilsetning av 30 ml etylacetat og oppløsningen ble ekstrahert 3 x med mettet NaCl-oppløsning, den organiske fasen ble tørket over Na2S04og oppløsningsmidlet avdestillert i vakuum. Råproduktet ble renset søylekromatografisk (kolonnemateriale; kiselgel 60H, elueringsmiddel:

petroleter/diklormetan/trietylamin 45:45:10).

Utbytte ved 4a; 93$ d.Th.

Eksempel 2

Fremstilling av tymidilyl-tymidin med en 3'-3'-fosfodiester-binding.

Nedenfor er reaksjonsveien for fremstilling av dimerblokken angitt:

A) Fremstilling av 5•-O-dimetoksytrityltymidin 5

Blanding: 20 ^ tymlain ^^ ^

24 mMol 4,4'-dimetoksytritylklorid (8.2 g) 1 mMol dimetylaminopyridin (122 mg) 28 mMol abs. trietylamin (3.8 ml)

Fremstilling av 5 ble gjennomført ifølge fremgangsmåten til R. A. Jones (G.S. Ti, B.L. Gaffney og R. A. Jones, H.Amer.Chem.Soc. 104, 1316-1319 (1982)). Tymidin ble gjennom 3 ganger koevaporering med 50 ml absolutt pyridin tørket, tatt opp i 100 ml pyridin og under isavkjøling ble 4,4'-DMTr-Cl og DMAP tilsatt som katalysator. Omsetningen ble kontrollert tynnskiktskromatografisk (Løpemiddel CH2Cl2/MeOH 9:1); og etter 4 timer kunne reaksjonen bli avsluttet gjennom tilsetning av 100 ml vann. Oppløsningen ble ekstrahert 3 x med eter, den organiske fasen tørket og innrotert og resten renset gjennom omkrystallisering i benzen.

Utbytte: 9.68 g DMTr-dT (89$).

B) Fremstilling av 5'-O-dimetoksytrityltymidin-3'0-(N,N-diisopropylamino-e-cyanoetoksy-)fosforsyreesteramid 6.

Fremstilling og rensing av 6 foregår tilsvarende syntese av 3'-0-DMTr-5'-0-fosforsyreesteramid 4 (Eksempel 1, C).

C) Fremstilling av 5'-0-acetyltymidin 8

Blanding: 2,0 mMol 3'-0-DMTr-dT 3a (1,1 g)

0,2 mMol dimetylaminopyridin (12,2 mg)

4 ml eddiksyreanhydrid

Litteratur: A.M. Michelson and A.R. Todd, J. Org. Chem.

1955, 2632-2638 (modifisert).

Til en oppløsning av 3'-0-DMTr-dT og DMAP i 20 ml absolutt pyridin ble AC2O dråpevis tilsatt under isavkjøling. Etter en reaksjonstid på 3 timer var omsetningen fullstendig (kontroll over DC; løpemiddel: CH2Cl2/MeOH 24:1). Produkt 7 ble utfelt i 400 ml isvann, det hvite bunnfallet ble sugd av og vasket med isvann og tørket.

Utbytte: 1.02 g 3'-O-DMTr-5'-0-Ac-dT (88$).

For avspaltning av 4,4'-dimetoksytritylgruppen ble 7 i 10 ml 80$ eddiksyre omrørt ved romtempertur. Gjennom tilsetning av 100 ml isvann ble reaksjonen avsluttet etter 3 timer og 4,4'-dimetoksytritanol ble utfelt som hvitt bunnfall. Det ble sugd av og det vandige filtratet innrotert. Den oljeholdige resten ble tatt opp i litt CH2CI2og utfelt i 200 ml n-heksan ved -15°C.

Utbytte: 455 mg 5'-0-acetyltymidin (94$)

D) Fremstilling og tymidilyl-(3 *-3')tymidin 10

Blanding: 1.0 mMol 5'-O-DMTr-tymidin-3'-0-(N.N-diisopro-py lamino-P-cyanoetoksy- )fosforsyreesteramid 6 (705,8 mg)

0.9 mMol 5'-0-acetyltymidin 8 (253 mg)

2.6 mMol tetrazol (182 mg)

9.0 mMol J2(1.14 g)

Syntese av dimerblokken 10 kan foregå ved hjelp av fremgangsmåten for fremstilling av 3'-5'-nukleosiddimerer beskrevet av K5ster (H. Kftster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557 (1984)). Blandingen av 5'-0-acetyltymidin og tetrazol ble oppløst i 30 ml absolutt CH3CN og under argon tilsatt til fosforsyreester-amidet. Blandingen av 9 mMol J2i 30 ml acetonitril/pyridin-/vann (24:5:1) ble tilført og etter ytterligere 15 minutter ble jod i overskudd redusert gjennom 5 ml av en 40$ H2SO4-oppløsning. Oppløsningen ble deretter redusert, resten tatt opp i CH2Cl2, 2 x vasket med mettet NaHC03-oppløsning og oppløsningsmidlet ble deretter destillert av. Råproduktet kunne bli renset ved kolonnekromatografi (kolonnemateriale: kiselgel 60H; elueringsmiddel:eddikester/diklor-metan 50:50).

Utbytte: 665 mg (75$).>

For avspaltning av acetyl- og p<->cyanoetylgruppen ble dimeren behandlet i 1 time med 5 ml konstant NH3ved romtemperatur og 4,4'-dimetoksytrietylgruppen kunne bli fjernet med 80$ eddiksyre.

20

Eksempel 3

Fremstilling av tymidilyl-tymidin med 5 '-5'fosfodiester-kobling 14.

Skjemaet nedenfor viser fremstilling av 14

De enkelte reaksjonstrinnene for fremstilling av mellomtrinn foregår tilsvarende fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 2.

Strukturen til begge dimerblokkene kunne bli verifisert gjennom FAB-massespektrometri og lH-kjerneresonans-spektro-skopi.

Eksempel 4

Belastning av CPG 10-1400-bærermateriale med 3'-O-dimetoksytrityl-desoksyribonukleosid-5'-O-succinat.

Funksjonalisering av CPG-bæreren med 3-aminopropylkjeder forgår ifølge forskriften til Atkinson og Smith (T. Atkinson, M. Smith in Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait(ed), 35-49 (1984 )). A) Fremstilling av 3'-O-DMTr-desoksyribonukleosid-5'-0-succinat 15.

Blanding: 1.0 mMol 3'-0-DMTr-dN 3

0.8 mMol Bernsteinsyreanhydrid (80 mg)

0.5 mMol dimetylaminopyridin (61 mg)

Reaksjon av Bernsteinsyreanhydrid med 5'-OE-gruppen til desoksyribonukleosidet ble gjennomført i 5 ml absolutt pyridin med DMAP som katalysator over natt ved romtemperatur. Etter fullstendig omsetning ble oppløsningen redusert og pyridin fjernet gjennom 3 ganger azeotrop destillasjon med toluen. Resten ble tatt opp i diklormetan, vasket med 10$ iskald sitronsyreoppløsning og E2O og den organiske fasen innrotert i vakuum. Råproduktet ble oppløst i ca. 3 ml toluen og utfelt i 200 ml n-heksan.

Utbytte: 79-84$.

B) Fremstilling av 3 *-O-DMTr-desoksyribonukleosid-5'-0-succinyl-p-nitrofenylester 16 og belastning av bærer (se følgende skjema).

Blanding: 0.8 mMol 3'-O-DMTr-dN-5'-O-succinat 15

0.8 mMol p-nitrofenol (112 mg)

2.0 mMol dicykloheksylkarbodiimid (412 mg)

3 g funksjonalisert CPG 10-1400

Det beskyttede succinerte desoksytribonukleosidet ble tilsatt til en oppløsning av p-nitrofenol i 5 ml absolutt dioksan og 0.2 ml pyridin og tilslutt ble DCC1 som kondensasjonsmiddel tilført. Etter kort tid falt dicykloheksylurinstoffet ut og etter 3 timer viser DC (DH2Cl2/MeOH 9:1) en fullstendig omsetning. Bunnfallet ble sugd av under argon og filtratet tilsatt direkte til en suspensjon av funksjonalisert bærermateriale i 15 ml absolutt DMF. 0.8 ml trietylamin tilføres og blandingen omrøres over natt. Den belastede bæreren ble deretter sugd av, vasket med metanol og eter og tørket i eksikator.

Belastningen av bæreren ble bestemt spektometrisk. Gjennom behandling av en bærerprobe (ca. 2 mg) med 10 ml av en 0.1 N p-toluensulfonsyreoppløsning i acetonitril blir 4,4'-dimet-oksytritylkationet avspaltet og gjennom måling av absorbsjonen til oppløsningen ved 498 nm er det mulig å beregne bærerbelastningen i pmol/g ved hjelp av ligningen

OD^gg/ ml x 10 ml x 14. 3 ( konst.)

mg bærer

For blokkering av ikke omsatte aminogrupper ble den belastede bæreren omrørt med en oppløsning av 1 ml eddiksyreanhydrid og 50 mg dimetylaminopyridin i 15 ml absolutt pyridin i 1 time ved romtemperatur, tilslutt sugd av, vasket med metanol og eter og tørket.

Eksempel 5

a) Fremstilling av oligonukleotider med terminale 3'-3'- og 5 '-5'-kobling.

Syntesen ble gjennomført i en DNA syntesemaskin fra firmaet Applied Biosystems, Forster City, USA, Modell 381A, under anvendelse av 0.2 pmol-standardprogrammer for alle kondensa-sjonstrinnene.

Syntesecyklusen er vist ovenfor. Som bærermateriale anvendes CPG 10-1400 beskrevet tidligere i beskrivelsen i Eksempel 4. Kondensasjonene ble gjennomført med de vanlige mikleosid-3'-fosforsyreesterne og tilslutt ble det i siste reaksjonscyklus som beskrevet i Eksempel 1 tilsatt 3'-0-DMTr-nukleosid-5'-0-(N ,N-di isopropylamino-p-cyano-etoksy- )fosforsyreesteramid. Etter avspaltning av oligonukleotidet fra bæreren med konst. NH3og fjerning av alle fosfat- og basebeskyttelsesgrupper gjennom oppvarming av ammoniakkoppløsningen ved 60° C over natt, ble proben avsaltet gjennom utfelling i etanol og målsekvensen ble renset gjennom polyakrylamidgel-elektroforese fra kortere fragmenter.

For våre undersøkelser fremstilte vi et eicosatymidylat med bare 3'-5'-bindinger samt et med terminale 3'-3'- og 5'-5'-bindinger. Sekvenser fra SV 40-genomet ble også valgt. Følgende oligonukleotider ble syntetisert: dT20; dT20(3*-3',5'-5' ); SV40TS17: 17-mer, Sens-sekvens fra SV40-genomet i posisjonene 5159-5176; SV40TAS17: 17-mer, Antisens-sekvens til SV40TS17; SV40TAS17(3'-3',5'-5'): 17-mer, Antisens-sekvens til SV40TS17 med en 3'-3'- henhv. 5'-5'-binding ved endene; SV40TS35: 35-mer, Sens-sekvens fra SV40-genomet i posisjonene 5142-5176; SV40TAS35: 35-mer, antisens-sekvens til SV40TS35; SV40TAS35(3'-3',5'-5'): 35-mer.antisens-sekvens til SV40TS35 med en 3'-3'-henhv. 5'-5'-binding ved endene; b) Fremstilling av oligonukleotider med terminale 3'-3'-bindinger.

Som bæremateriale anvendes CPG 10-1400 beskrevet i Eksempel 4. Kondensasjonene ble gjennomført med vanlige nukleosid-3'-fosforsyreestere.

Etter avspaltning av oligonukleotidet med bærer med konst. NH3og fjerning av alle fosfat- og basebeskyttelsesgrupper gjennom oppvarming av ammoniakk-oppløsningen til 60"C over natt ble proben avsaltet gjennom utfelling i etanol og delsekvensen renset gjennom polyakrylamid-gelelektroforese fra kortere fragmenter.

SV40TAS17(3'-3'): 17-mer, antisens-sekvens til SV40TS17 med

en 3 '-3'-binding i enden;

c) Syntese av oligonukleotider med terminale 5'-bindinger og 2 terminale tiofosfatrester.

Som bærermateriale anvendes kommersielt oppnåelig CPG-materiale som inneholder 5'-O-dimetoksytrityltymidin bundet over 3'-hydroksygruppen. Kondensasjonene ble gjennomført med vanlige nukleosld-3'-fosforsyreestere, vanligvis i siste reaksjonscyklus ble 3'-O-DMTr-nukleosid-5'-0-(N,N-diisopro-pylamino-e-cyano-etoksy)fosforsyreesteramid tilsatt som i Eksempel 1.

Ved den første av begge reaksjonscyklusene ble istedenfor den vanlige jod-oksydasjonen gjennomført en oksydasjon med elementær svovel (W.Stec et al. J.A.C.S. 106, S. 6077, 1984).

Etter avspaltning av oligonukleotidet fra bæreren med konst. NH3og fjerning av alle fosfat- og basebeskyttelsesgrupper gjennom oppvarmingen av ammoniakkoppløsningen ved 60°C over natt ble proben avsaltet gjennom utfelling i etanol og delsekvensen ble renset gjennom polyakrylamid-gelelektroforese fra kortere fragmenter.

Følgende oligonukleotid ble syntetisert:

SV40TAS17(5'-5'): 17-mer, antisens-sekvens til SV40TS17 med en 5'-5'-binding ved 5'-enden og to tiofosfatinternukleotidbindinger ved 3'-enden

Eksempel 6

Analyse av strukturen og sekvensen til et oligonukleotid med terminal 3'-3'- og 5'-5'-binding.

Sekvensering av oligonukleotidet foregår ifølge fremgangsmåten til Maxam og Gilbert (A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enxymology 65, 499-560 (1980)). 100 pmol av proben ble i nærvær av (-y-32P )-ATP/T4-polynukleotidkinase radioaktivt merket på 5'-OH-gruppen og ved hjelp av følgende basespesifikke reaksjoner gjennomført: (A+G) - reaksjon: protonering av basen gjennom maursyre G - reaksjon: omsetning med dimetylsulfat

(T+C) - reaksjon: hydrazinolyse

C - reaksjon: reaksjon med hydrazin i nærvær av 5M

NaCl

Gjennom behandling med 1 M piperidin ved 95°C ble oligonukleotid-kjedene spaltet på de modifiserte stedene, brudd-stykket kunne bli separert gjennom polyakrylamidgel-elektroforese (20$ akrylamid, 7M urinstoff) og detektert gjennom autoradiografi. Fig. 1 viser autoradiogrammet av sekvenser-ingen av SV40TS17, SV40TAS17 OG SV40TAS17(3'-3',5'-5') (for beskrivelse av oligonukleotidet se Eksempel 5). På grunn av at kjeden ble markert i 5'-OH-gruppen, kan basefølgen bare bli avlest ved 3'-5'-bindingen i 3'-5'-retningen. På grunn av 3'-3'-enden har oligonukleotidet SV40TAS17(3'-3'-5'-5')

til tross for dette den radioaktivt merkede 5'-OE-gruppen ved 3'-terminusen og leseretningen til sekvensen blir dermed omdreid (Fig. 1). Dette er også et bevis for 5'-5'-fosfodiester-bindingen ved 5'-terminusen til kjeden med en fri 3'-OH-gruppe, som gjennom enzymet polynukleotidkinase ikke kan bli fosforylert.

Eksempel 7

Undersøkelse av stabiliteten til et med 3'-3' og 5'-5'-endene

oligonukleotid i blodserumstesten

i

A) Kinasebehandling av et eicosatymidylat med 3'-3' og 5'-5'-ender.

Litteratur: T.Mizuno, M.-Y. Chou and M. Inouya, Proe.Nati.-Acad.Sci. USA 81, 1966-1970 (1984)

Blandingen blir inkubert i 30 min. ved 37°C, avsluttet gjennom tilsetning av 90jj1 EtøO og fraksjonert over en ®Sephadex G 50 kolonne. Produktfraksjonene blir slått sammen og lyofilisert.

b) Blodserumtest

Litteratur: S.M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772

(1986)

Blanding: 0.01 ODg^o radioaktivt fosforylert oligonukleotid for referansen 0.01 O<D>260^20»^or eksperimentet 0.01 OD26o<T>20med 3<*->3'- og 5'-5'koblede ender

50 pl friskt humant serum.

Serumet blir tilsatt til probene og kort omristet med hånd. Deretter blir med en gang 3 pl avpipitert for 0-verdi og tilsatt i 3pl formamid belastningsbuf f er, for å avbryte enzymaktiviteten. Til slutt blir probene inkubert ved 37°C.

For kinetikken blir etter bestemte tidsrom 3 pl tatt ut og avbrutt som beskrevet ovenfor.

Referanse: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min Eksperiment: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min, 90 min

Probene blir applisert på 20$ polyakrylamidgel og separert ved gelelektroforese og tilslutt autoradiografert. Autoradlogram av spaltningen med friskt humant serum fra venstre (se fig. 2): Referanse: 0-verdi, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min Eksperiment: 0-verdi, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min,

90 min

Allerede etter 5 min blir det vist at nedbrytningen av naturlig oligonukleotid har begynt. Spaltningen øker med tiden. Det modifiserte oligonukleotidet foreligger praktisk talt uforandret også etter 90 minutters inkubasjon. De svake båndene som ved alle verdiene av kinetikken sees er et resultat av aktiviteten til endo-nukleasene som er tilstede i serumet. Denne spaltningen er for en terapeutisk anvendelse av dette oligonukleotidet viktig og ønskelig, idet de garanterer den langsomme nedbrytningen av virkesubstansen og at det dermed ikke kan foregå en akkumulasjon av disse forbindelsene i kroppen.

Eksempel 8:

Undersøkelse av forholdet av oligonukleotider med terminal 3'-3'- og 5'-5'-binding mot slangegift-fosfodiesterase. A) Kinasebehandling av et eicosatymidylat med 3'-3' og 5'-5'-ender.

Som beskrevet i Eksempel 7.

B) Hydrolyse av et eicosatymidylat med 3'-3' og 5'-5'-ender ved hjelp av slangegiftfosfodiesterase

Litteratur: A-Hirashima, S.Sawaki, Y. Inokuchi and M.

Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)

Den radioaktivt fosforylerte proben (referanse; Tgo»eksperiment; T20med terminale 3'-3' og 5'-5'-binding) blir lyofilisert og RNÅ-bæreren og SQ-buffer blir tilsatt. Fra denne blandingen blir 5 pl avpipettert for 0-verdi og resten av oppløsningen blir omsatt med enzym og inkubert ved 37° C. For kinetikken til referansen blir etter 5 min, etter 15 min og etter 30 min hver 5 pl tatt ut og for kinetikken til Eicosatymidylatet med 3'-3' 5'-5'-ender blir 5 pl tatt ut etter 5 min, 30 min, 45 min, 60 min og 90 min. For desak-tivering av enzymet blir proben direkte etter uttaket oppvarmet i vannbad i 2 min ved 95°C. Probene blir lyofilisert og applisert på en analytisk 20% polyakrylamidgel. Etter gelelektrolytisk separering blir dette autoradiografert.

Autoradiogram av SVpdE-spaltingen (se fig. 3) fra venstre: T20(referanse), T20med terminale 3'-3'- og 5'-5'-koblinger, kinetikken til eksperimentet; etter 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, blanding av 0 min/15 min, blanding av 0 min/30 min, kinetikk til referansen; etter 5 min, 15 min, 30 min, 45 min.

5'-5'-bindingen blir som beskrevet øyeblikkelig avspaltet. At den videre spaltningen sammenlignet med referansen bare foregår langsomt er en tydelig strukturhenvisning. Etter spaltning av 5'-5'-fosfordiesterbindingen oppstår et molekyl som på spaltningssetet bærer en 5'-hydroksylfunksjon. Ved den andre terminusen er molekylet 5'-fosforylert. Begge termini er for slangegift-fosfodiesterase uangripelige. Den langsomme, men meget tydelige, videre nedbrytningen kan sannsynligvis tilbakeføres til den av fremstilleren (J.G. Izant and E. Weintraub, Cell 36, 1007-1015 (1984)) beskrevne blandingen av en enkelt tråds spesifikk endonuklease, som omdanner supercoiled PM2 DNA i åpne former. Lengden til sekvensen kan avleses. Bare 19 bånd kan avleses i det ved

den første verdien av kinetikken, etter 5 min, er 5'-5'-fosfodiesterbindingen allerede spaltet.

Eksempel 9:

Undersøkelser av hybridiseringsforholdet av oligonukleotider med terminale 3'-3'- og 5'-5'-ender.

For undersøkelse av hybridiseringsforholdet ble smeltekurver tatt opp i ekvimolare mengder (5.23 nMol) SV40TS17 og SV40TAS17(3'-3',5'-5') (for beskrivelse av oligonukleotider se Eksempel 5) oppløst i 1 ml av en 10 nM Na-cacodylat/100 mM NaCl-buffer, pH 7.0, oppvarmet til 70° C og forløpet av renatureringen ble formidlet ved langsom avkjøling (1 grd/min) gjennom måling av absorbsjonen til oppløsningen. For opptak av referansekurven ble like mengder SV40TAS17 anvendt. Analogt ble 4,75 nMol SV40TS35 og SV40TAS35 henholdsvis SV40TS35 og SV40TAS35(3'-3',5 *-5') i buffer, oppvarmet til 90"C og absorbsjonen ved avkjølingen målt. Det ble dannet smeltekurver som hadde følgende Tm-verdier:

Smeltetemperaturen ble gjennom den abiologiske koblingen bare redusert med 0.8° ved 17 mer henhv. 1.3°C ved 35 mer.

Eksempel 10

Inhibering av biosyntesen av SV40 T-antigen gjennom oligonukleotider med terminalt 3'-3'- og 5'-5'-forbinding.

A) Cellekultur

COSl-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) med 10$ føtalt kalveserum. Vevskulturskålene ble inkubert ved 37"C og 7.5°C i C02.

B) Radioaktiv merking og celleoppslemming

Omtrent 4 x IO<4>celler ble dyrket som monolag i vevskultur-skåler. De konfluente cellene ble vasket tre ganger med metionin-fritt DMEM og til slutt merket med 100 pCi<35->S-metionin. For antisens-moduleringseksperimenter ble cellene samtidig inkubert med oligonukleotid SV40TAS17(3'-3',5'-5') og radioaktiv metionin i 30 min ved 37°C. Til slutt ble cellene som inneholdt 10$ føtalt kalveserum og ikke merket metionin vasket to ganger med DMEM og ytterligere oppholdt i dette mediet i 30 min. For oppslemming ble cellene behandlet med iskaldt fosfat-bufret saltvann (PBS), fjernet fra skålene og 2 min ved 400 g sentrifugert. Celle-pelleten ble deretter lysert med 0.4 ml oppslemmingsbuffer (0.5$ nonidet P40, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0.1 M NaCl) pr. 3 x 10^ celler i 45 min på is. For å unngå proteolyse ble oppslemmingsbufferen tilført 1$ trasylol og fenylmetylsul-fonylfluorid helt til sluttkonsentrasjonen på 0.25 mg/ml. Lysatet ble deretter klarsentrifugert i 30 min ved 4"C i ultrasentrifugen (105 000 g). En alikot på 10 pl ble tatt ut og innholdet av protein ble målt ifølge fremgangsmåten til Lowry. For immunpresipitasjon ble like mengder totalprotein anvendt.

C) Immunpresipitasjon

Både for immunpresipitasjonen av SV40 villtype-T-antigen og også for i zytoplasma lokalisert mutant-T-antigen ble det monoklonale antistoffet PAbl08 anvendt. Antistoffet ble renset gjennom kromatografi på protein A-sepharose fra hybridom-supernatanten.

Celleekstraktet ble f or-presipitert med 100 pl av en 10$ suspensjon av varme-inaktiverte og med formaldehydfikserte bakterier fra stammen Staphylokokkus aureus (Cowan 1) over natt ved 4°C. Bakteriene ble deretter sentrifugert av, resten ble inkubert i minst 2 timer ved 4°C med de monoklonale antistoffene og gjennom tilsetning av S. aureus ble høyspesifikke immunkompleks dannet. Denne fremgangsmåten ble gjentatt opp til tre ganger for å oppnå fullstendig presipi-tasjon.

Til slutt ble immunpresipitåtene vasket; tre ganger med 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1$ Trasylol; to ganger med 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1$ nonidet P40 og en gang med 50 mM NH4HCO3. Dette ble deretter eluert i 45 min ved 4°C med 200 pl elueringsbuf f er (50 mM NH4HCO3, 1$ SDS, 1$ p<->merkaptoetanol) lyofilisert, oppløst gjennom koking i 10 minutter i 20 pl prøvebuffer (65 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5 & p, merkaptoetanol, 1$ glycerin, 0.01$ bromfenolblå) og applisert på en 3$ polyakrylamidgel (10$ SDS). Proteinene ble separert gjennom diskontinuerlig gelelektroforese og båndene kunne bli lokalisert ved fluoro-grafi på røntgenfilm (Kodak X-AR).

Med oligonukleotider som ifølge oppfinnelsen ble fremstilt slik at de overgikk translasjonsstart for T-antigenet, ble ved anvendelse i en ekstracellulær konsentrasjon på 30 pmolar registrert en 70$ inhibering av virusveksten. Dette står i motsetning til virksomheten av tilsvarende sekvenser som ikke var oppbygd ifølge oppfinnelsen, dvs. uten 3'-3'- og 5'-5'-bindinger. Her kunne ingen inhibering fastslås ved anvendelse av en lik konsentrasjon. Fig. 4 viser en tydelig inhibering av T-Ag-biosyntesen ved behandling av cellene med 30 pM SV40TAS17(3'-3',5<*>.5').

Eksempel 11

Sammenligning av serumstabiliteten til oligonukleotider som bare er modifisert ved 3<*->enden henhv. bare ved 5'-enden gjennom inverterte fosfodiesterbindinger.

Oligonukleotider ble nedbrutt av nuklease fortrinnsvis fra deres 3'-terminus (J.P. Shaw, K.Kent, J.Bird, J. Fishback, B. Froehler, Nucleid Acids Res. 9, 747-750 (1991). Det skal deretter bli undersøkt om en terminal 3'-3'-fosfodiesterbind-ing er tilstrekkelig for stabilisering av oligonukleotidet i blodserum. På grunn av at en 32p-merket fosfatrest blir avspaltet av fosfataser, spesielt ved en lengere behandling av proben med serum, ble fluoreskein anvendt for deteksjon av oligonukleotidene.

Følgende sekvenser ble fremstilt fra genomet til Xenopus levis:

Syntesen ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 5, idet det for den 10. konsentrasjonen ble anvendt et basemodifisert cytidin-fosforsyreesteramid C<*>, som muliggjorde en etterfølg-ende kovalent kobling med fluoreskein.Kobl ing av fluoreskein foregår ifølge veiledningen til firmaet Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology Auto Primer™ Synthesis Kit Instructions (XY-023-00-01). De modifiserte oligonukleotidene ble renset ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese.

Serumtest: 10 pMol oligonukleotid

140 pl friskt humant serum.

Probene ble inkubert ved 37"C. Etter 15 min, 30 min, 45min, 60 min, 8 t og 72 t ble 20 pl tatt ut, ekstrahert 2 x med fenol/kloroform/isoamylalkohol 25:24:1 og oligonukleotidene ble felt med etanol. Spaltningsproduktene ble separert på en 16$ polyakrylamidgel i en automatisk sekvenator A.L.F.

(Pharmacia, Freiburg) og detektert. Som Fig. 5 viser, oppviser oligonukleotidene nedbrytningsprodukter bare ved 5'-enden med en invertert internukleotidbinding bestående sekvens allerede etter 15 min serumbehandling og etter 60 min er de nærmest fullstendig nedbrutt. De ved 3'-enden gjennom 3'-3'-binding "beskyttede" oligonukleotid er derimot selv etter 72 timer først delvis nedbrutt.

Eksempel 12

Inhibering av genekspresjonen i et in vitro-ekspresjons-system.

For å kvantifisere inhiberingen av genekspresjonen ved hjelp av INV-oligonukleotider ble virkningen av tilsvarende antisens-oligonukleotider undersøkt med hensyn på ekspresjonen av p53 i et in vitrosystem som inneholder p53 mRNA (E. Reihsaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren. M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).

Antisens-sekvensen ble fremstilt

NH2(CH2 )6pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT (3'-3')T

og som sammenligningsprobe den tilsvarende sens-sekvensen NH2(CH2)6pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3'-3')A

Antisens-oligonukleotidet er rettet mot translasjonsstarten til onkoproteinet p53.

Ekspresjonen av proteiner ble undersøkt

1. uten tilsetning av oligonukleotid

2. ved tilsetning av 30 pM sens-sekvens

3. ved tilsetning av 1 pM antisens-sekvens

4. ved tilsetning av 10 pM antisens-sekvens

For kvantifisering ble svertingen av proteinbåndene bestemt densitometrisk (E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).

Fig. 6 viser at en tilsetning av 10 jjM antisens-oligonukleotid til ekspresjonssystemet bevirker en inhibering på ca. 70$. Ved reduksjon av konsentrasjonen til 1 jjM kan nærmest ingen inhibering bli fastslått og likeledes ved tilsetning av sens-sekvensen som ikke blir bundet på mRNA.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider med Formel II

der R<1>betyr hydrogen eller en rest med Formel III R<2>betyr hydrogen eller en rest med Formel IV

der minst en av restene R<1>eller R<2>betyr en rest med Formel III eller IV, B betyr en base, som eksempelvis naturlige baser som adenin, tymin, cytosin, guanin eller unaturlige baser, som eksempelvis purin, 2,6-diaminopurin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, N<4->etanocytosin, henhv. promedikamentformer derav, W og W betyr uavhengig av hverandre oksygen eller svovel, Z og Z<1>betyr uavhengig av hverandre 0~, S", C^^-C^^g-alkoksy, fortrinnsvis C-^-Cg-alkoksy, spesielt foretrukket er C1-C3~alkoksy, spesielt metoksy; C^-C^^g-alkyl, fortrinnsvis C^^-Cg-alkyl, spesielt foretrukket Cl-C3-alkyl, spesielt metyl; NHR<3>, der R<3>fortrinnsvis er C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket er C^-Cg-alkyl, spesielt C^-^-alkyl, eller C^-C4-alkoksy-Ci-C(,-alkyl, fortrinnsvis metoksyetyl; NR<3>R<4>, der R<3>er definert som ovenfor og R<4>er fortrinnsvis C^-C^g-alkyl, spesielt foretrukket C^-Cg-akyl, spesielt C4-alkyl eller der R<3>og R<4>sammen med nitrogenatomet som bærer dem danner en 5-6-leddet heterocyklisk ring, som i tillegg inneholder et ytterligere heteroatom fra rekken 0, S, N, som f.eks. morfolin; Y betyr en rest fra rekken

0-Si(R)2, OCH2, C(0)NR eller 0-CH2-C(0) der R betyr C^-C^-alkyl, aryl eller C5henhv. C5cykloalkyl; og n betyr et helt tall på 5-60, fortrinnsvis 10-40 og spesielt foretrukket er 15-25, samt fysiologiske tålbare salter derav, idet de terapeutisk aktive nukleotidene er substituert med grupper som fremmer det intracellulære opptaket, som in vitro eller in vivo tjener som reportergrupper, og/eller grupper, som ved hybridisering av oligonukleotidet på biologisk DNA eller RNA angriper disse DNA- eller RNA molekylene under binding eller spaltning,karakterisert vedat man a) omsetter en nuleotidenhet med 3'- henhv. 5'-terminale fosfor (III)- eller fosfor (V)-grupperinger eller det aktiverte derivatet derav med en ytterligere nukleotidenhet med 3'- henhv. 5'-terminal fri hydroksygruppe eller d) bygger opp oligonukleotidet ved hjelp av fragmenter på samme måte, avspalter i de ifølge (a) eller (b) oppnådde oligonuleotidene eventuelt en eller flere for beskyttelse av andre funksjoner temporært innførte beskyttelsesgrupper og overfører de på denne måten oppnådde oligonukleotidene med Formel I eventuelt til deres fysiologiske tålbare salt.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av oligonukleotider med Formel II ifølge krav 1, der R<2>betyr en rest med Formel IV og R<1>betyr hydrogen; R<1>henhv. R<2>betyr en rest med Formel III henhv. IV eller r<2>betyr hydrogen og R<1>betyr en rest med Formel III, der enten W eller Z i sistnevnte tilfelle ikke betyr oksygen,karakterisert vedat tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av oligonukleotidene med Formel II ifølge kravene 1 eller 2, hvor W betyr oksygen, eller Z og W betyr begge oksygen,karakterisert vedat tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av oligonukleotidene med Formel II, ifølge kravene 1 til 3, hvor R<2>betyr en rest med Formel IV og R<1>betyr hydrogen,karakterisertved at tilsvarende utgangsmaterialer anvendes.