HU215147B

HU215147B - Eljárás terminális 3'- 3' - ,illetve 5'- 5' -intermolekuláris kötéseket tartalmazó oligonukleotid analógok előállítására

Info

Publication number: HU215147B
Application number: HU215/91A
Authority: HU
Inventors: Anja Fröhlich; Matthias Montenarh; Jose Flavio Ramalho-Ortigao; Hannelore Rösch; Hartmut Seliger
Original assignee: Hoechst Ag.
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 2000-03-28
Also published as: EP0464638A2; EP0464638B1; HU912215D0; NZ238769A; NO303018B1; IL98672A0; DE59108644D1; ATE151076T1; JP3186795B2; IE912309A1; KR100200400B1; PT98169A; AU7947591A; CZ285408B6; US5750669A; ZA915056B; DK0464638T3; NO912585D0; GR3023432T3; JPH05222088A

Abstract

A találmány szerint előállított oligonukleotidok (I) vagy (II)általános képletében R1 jelentése hidrogénatom vagy (III) általánosképletű csoport, R2 jelentése hidrogénatom vagy (IV) általános képletűcsoport, ahol R1 és R2 közül legalább egyik jelentése hidrogénatomtóleltérő, B jelentése bázis, W és W’ jelentése oxigénatom vagy kénatom,Z és Z’ jelentése egymástól függetlenül O–- vagy S–-ion,alkoxicsoport, alkilcsoport, valamint –NHR3 vagy –NR3R4 általánosképletű csoport, Y jelentése –O–Si(R)2–, –OCH2–, C(O)NR– vagyOCH2–C(O) képletű csoport, ahol R jelentése alkilcsoport, arilcsoportvagy cikloalkilcsoport, n értéke 5–60 közötti egész szám. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás terminális 3’,3’-, illetve 5’,5’-intermolekuláris kötéseket tartalmazó oligonukleotid analógok előállítására.

Antiszenz oligonukleotidoknak azokat a nukleinsavfragmenseket nevezik, amelyek szekvenciája komplementer a messenger-RNS kódoló- vagy „szenz”-szekvenciájával, illetve a DNS kódolószálával. Az ilyen típusú oligonukleotidokat növekvő mértékben alkalmazzák az in vitro vagy a sejttenyészetben végrehajtott génkifejeződés gátlására. Az ilyen anyagok gyógyszerészeiben és terápiában, például vírus elleni gyógyszerként történő felhasználását széleskörűen vizsgálják. A biológiában régóta ismert, hogy az antiszenz RNS-szekvenciák természetes úton szabályozzák a gének kifejeződését a prokariótákban [T. Mizuno, Μ. Y. Chou és M. Inouye: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1966-1970. (1984)] és eukariótákban [S. M. Heywood: Nucleic Acids Rés. 14, 6771-6772. (1986)]. Ezek az anyagok egy megfelelő messenger-RNS-re történő hibridizálással gátolják a transzlációt. Számos kísérletben igazolódott, hogy ezek az antiszenz RNS-szekvenciák baktériumokba [A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi és M. Inouye: PNAS USA 83, 7726-7730. (1986)], vagy eukarióta sejtekbe [J. G. Izant és H. Weintraub: Cell 36,1007-1015. (1984)] bevive gátolják a génkifejeződést, és emellett vírus elleni [L. J. Chang és C. M. Stolzfus: J. Virology, 61, 921-924. (1987)], valamint antionkogén [J. T. Holt, T. V. Gopal, A. D. Moutton és A. W. Nienhuis: PNAS USA, 83, 4794-4798. (1986)] hatást fejtenek ki. Az ilyen vizsgálatokban a szintetikus oligonukleotidok a biológiai antiszenz RNS-sel szemben azzal az előnnyel rendelkeznek, hogy stabilitásuk nagyobb, és könnyebben előállíthatók. Ez utóbbi azokra a javított szintézistechnikákra utal, amelyek segítségével a rövidebb oligomerek (például 12-30 bázis) viszonylag könnyen előállíthatók [E. Sonveaux: Bioorganic Chemistry, 14, 274-325. (1986); J. S. Cohen: Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, Macmillan Press, 7ff, (1989)].

Kimutatható, hogy a kifejeződést az ilyen rövid oligomerek is hatékonyan befolyásolják. Emellett ezek az oligonukleotidok hatásukat úgy is kifejthetik, hogy egy hármas hélix kialakulása mellett a kettős szálú DNShez kötődnek. Ahhoz, hogy mindkét oligonukleotidtípust, vagyis az antiszenz oligonukleotidot és a triplexképző oligonukleotidot biológiai rendszerben fel tudjuk használni, a következő feltételeket kell kielégíteni [J. S. Cohen: Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, Macmillan Press, lff (1989)]:

1. Egyrészt megfelelő vízoldékonysággal kell rendelkezni, másrészt azonban könnyen át kell hatolni a lipofil sejtmembránon.

2. A sejten belül megfelelő stabilitással kell rendelkezni, vagyis ellent kell állni a nukleázok lebontásának.

3. Fiziológiai hőmérsékleten stabil hibridet kell képezni az intracelluláris nukleinsavakkal.

4. Szelektív hibridizálás szükséges, vagyis a hibás párosodást eredményező oligonukleotidhoz viszonyított disszociációs hőmérséklet-különbségnek elég nagynak kell lenni ahhoz, hogy ez utóbbi specifikusan kimosható legyen.

1978-ban Zamecznik és Stephenson [PNAS USA 75, 280-284. és 285-288. (1978)] először tudta kimutatni, hogy a módosítatlan oligonukleotid gátolni tudja a Rous-szarkómavírus szaporodását. Az oligonukleotidot azonban nagyon nagy koncentrációban alkalmazzák, amelyhez a nukleázok inaktiválása érdekében a kísérletet előzetesen felmelegített közegben hajtják végre. Az intézkedés szükségességét az magyarázza, hogy az idegen nukleinsavak szérumban és sejtekben gyors enzimatikus bomlást szenvednek.

Régóta kísérleteznek az oligonukleotidok olyan irányú szerkezeti módosításával, amellyel a fenti követelmények jobban kielégíthetők, elsősorban a nukleáz enzimek lebontó hatásával szembeni ellenállás javítható. Ezek a kísérletek elsősorban a foszfodiészter intemukleotidkötés módosítására koncentrálnak, mivel ezek jelentik a nukleázok támadási pontját. A szerkezetében módosított intemukleotidkötések az alábbiak szerint csoportosíthatók:

a) központi atomként foszforatomot tartalmazó nukleozidkötések, ezek lehetnek ionos/királis kötések ionos/akirális kötések, semleges/királis kötések;

b) semleges/akirális foszformentes nukleozidkötés.

A fentihez hasonló, de ionos intemukleozidkötéshez tartozó szerkezetében módosított kötések a tiofoszfát- és ditiofoszfátkötések. Pillanatnyilag a módosított tiofoszfátkötéssel rendelkező oligonukleotidok [J. S. Cohen: Oligodeoxynukleotiden, Antisense Inhibitors of Gene Expression, Macmillan Press, 97ff (1989)] rendelkeznek a legerősebb gátló hatással a génkifejeződés sejttenyészetben történő gátlása során, ez a gátlás azonban nem kapcsolódik specifikus szekvenciához, mivel az olyan, módosított tiofoszfátkötéssel rendelkező oligonukleotidok is mutatnak gátló hatást, amelyek csak egy nukleinsavépítő elemet tartalmaznak, például az oligocitidilát tiofoszfát analógja. A módosított tiofoszfátkötést tartalmazó oligonukleotidok alkalmazását korlátozza továbbá ezek kiralitása.

Mivel n bázisból álló oligonukleotid előállítása során 2ⁿ-' darab diasztereomer képződik, a tiofoszfátkötést tartalmazó készítménynek csak csekély része rendelkezik megfelelő hibridizálási képességgel.

Ditiofoszfát intemukleozidkötéssel rendelkező oligonukleotidoknál [A. Grandas, W. S. Marshall, J. Nielsen és Μ. H. Caruthers: Tetrahedron Letters, 20, 543-546. (1989); G. M. Porritt, C. B. Reese: Tetrahedron Letters 30, 4713-4716. (1989)] a kiralitásprobléma megkerülhető. Ezek a vegyületek eddig azonban csak komplikált és nagy veszteségekkel járó, többlépéses szintézissel voltak előállíthatók. Ezért hibridizálási képességüket és sejttenyészetben mutatott viselkedésüket részletesen nem tudták vizsgálni.

A kémiailag módosított oligonukleotidok másik csoportját képezik a nemionos, vegyis semleges internukleozidkötéssel rendelkező oligonukleotidok. Az ilyen típusú módosított szerkezettel rendelkező vegyületekhez tartoznak a foszfotriészter vagy metil-fosz2

HU 215 147 Β fonát intemukleozidkötéssel rendelkező oligonukleotidok [J. S. Cohen: Oligodeoxynukleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, Macmillan Press, 79ff (1989)].

Mindkét vegyületcsoport közös jellemzője, hogy az ionizálható foszfátmaradékot töltés nélküli csoporttal helyettesítjük. Az ilyen kötés kialakításával az oligonukleotid analógok ellenállnak a nukleázoknak, hátrányuk azonban, hogy vizes közegben rosszul oldódnak.

A semleges/akirális intemukleozidkötéssel rendelkező oligonukleotidok eddig csak úgy voltak előállíthatok, hogy az intemukleozidkötés foszforatomját más központi atomra cserélik. A foszforsav-észter kötéshez hasonlít a sziloxánkötés. A sziloxán intemukleozidkötéssel rendelkező oligonukleotidok [K. K. Ogilvie, J. F. Cormier: Tetrahedron Letters., 26, 4159. (1985); H. Seliger, G. Feger: Nucl. Nucl. 6 (182), 483-484. (1987)] előállíthatok, és nukleázokkal szemben stabilak.

A karbonát-, acetál- vagy karboxamid intemukleozid kötéssel rendelkező oligonukleotidok szintén ismertek [M. Matteucci: Tetrahedron Letters 31, 2385-2388. (1990); J. R. Tittensor: J. Chem. Soc. C„ 1971, 2656. J. Coull és munkatársai: Tetrahedron Letters 28, 745. (1987)].

Nukleázokkal szemben ellenállóképes oligonukleotid analógok előállíthatok a foszfodiészter intemukleotidkötés megváltoztatása nélkül is, ha megváltoztatott konfigurációval rendelkező cukormaradékot alkalmazunk. Ez történik olyan oligonukleotid analógok szintézise során, amelyeknél a nukleobázisok a-glikozidos kötéssel vannak lekötve [J. S. Cohen: Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, Macmillan Press, 119ff (1989)]. Az ilyen oligonukleotid analógok azonban preparatív úton nehezen állíthatók elő, mivel ezeket cukorból és bázisból kiindulva kell felépíteni. Emellett, a hibridizálás irányítottsága vonatkozásában részben abnormálisán viselkednek.

A találmány tárgya eljárás I általános képletű oligonukleotidok előállítására, a képletben R¹ jelentése hidrogénatom vagy III általános képletű csoport,

R² jelentése hidrogénatom vagy IV általános képletű csoport, ahol R¹ és R² közül legalább egyik jelentése hidrogénatomtól eltérő,

B jelentése bázis, például természetes bázis, így adenin, timin, citozin vagy guanin, valamint nem természetes bázis, például purin, 2,6-diamino-purin, 7-deaza-adenin, 7-deaza-guanin, N⁴-etáno-citozin, valamint ezek előzetes formái,

W és W’ jelentése egymástól függetlenül oxigénatom vagy kénatom,

Z és Z’ jelentése egymástól függetlenül O~- vagy S~ion,

Z és Z’ jelentése egymástól függetlenül O~- vagy S~ion, 1-18 szénatomos alkoxicsoport, előnyösen 1-8 szénatomos alkoxicsoport, különösen előnyösen 1-3 szénatomos alkoxicsoport, elsősorban metoxicsoport; 1-18 szénatomos alkilcsoport, előnyösen 1-8 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyösen 1-3 szénatomos alkilcsoport, elsősorban metilcsoport; -NHR³ általános képletű csoport, ahol

R³ jelentése előnyösen 1-18 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyösen 1-8 szénatomos alkilcsoport, elsősorban 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy alkoxirészében 1-4 szénatomos és alkilrészében 1-6 szénatomos alkoxi-alkilcsoport, előnyösen metoxi-etil-csoport;

-NR³R⁴ általános képletű csoport, ahol R³ jelentése a fenti,

R⁴ jelentése előnyösen 1-18 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyösen 1-8 szénatomos alkilcsoport, elsősorban 1 -4 szénatomos alkilcsoport, vagy

R³ és R⁴ a kapcsolódó nitrogénatommal együtt 5-6 tagú heterociklusos gyűrűt képez, amely további heteroatomként oxigénatomot, kénatomot vagy nitrogénatomot tartalmaz, előnyösen morfolingyűrü,

Y jelentése -O-Si(R)₂-, -OCH₂-, C(O)NR- vagy

OCH₂-C(O) képletű csoport, ahol R jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, arilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport, n értéke 5-60 közötti, előnyösen 10-40 közötti, különösen előnyösen 15-25 közötti egész szám.

A találmány szerinti eljárás kiterjed az I vagy II általános képletű vegyületek fiziológiailag alkalmazható sóinak előállítására is.

A fenti értelmezésben „arilcsoport” kifejezés alatt például fenilcsoportot vagy egy-három 1-6 szénatomos alkilcsoporttal, 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy halogénatommal szubsztituált fenilcsoportot értünk.

Előnyösek az I általános képletű oligonukleotidok.

Előnyösek továbbá azok az I általános képletű oligonukleotidok, amelyek képletében R² jelentése IV általános képletű csoport, és R¹ jelentése hidrogénatom;

R¹, illetve R² jelentése III, illetve IV általános képletű csoport; vagy

R² jelentése hidrogénatom és

R¹ jelentése III általános képletű csoport, amelyben W vagy Z jelentése oxigénatomtól eltérő.

Különösen előnyösek azok az I általános képletű oligonukleotidok, amelyek képletében

W jelentése oxigénatom vagy

Z és W jelentése oxigénatom.

Ezen belül kiemeljük azokat az I általános képletű oligonukleotidokat, amelyek képletében

R² jelentése IV általános képletű csoport, és R¹ jelentése hidrogénatom.

Külön kiemeljük továbbá azokat az I és II általános képletű oligonukleotidokat, amelyek olyan további csoportokkal szubsztituálva vannak, amelyek az intracelluláris felvételt megkönnyítik, amelyek in vitro vagy in vivő „riporter”-csoportként szolgálnak, és/vagy amelyek az oligonukleotidnak biológiai DNS-re vagy RNS-re történő hibridizálása során a DNS- vagy RNS-molekulát kötés kialakításával vagy felhasításával megtámadják.

HU 215 147 Β

Az intracelluláris felvételt megkönnyítő csoportokra példaként említhetők a lipofil csoportok, így például a legfeljebb 18 szénatomos alkilcsoportok, a koleszterilcsoport, vagy természetes hordozórendszereket kihasználó konjugátumok, például galluszsav vagy a megfelelő receptor peptidje (lásd például receptor által közvetített endocitózis). Az úgynevezett riportercsoportokra példaként említhetők a fluoreszkáló csoportok (például akridinilcsoport, danzilcsoport vagy fluoreszceinilcsoport) vagy a kemilumineszkáló csoportok, például akridinium-észter-csoport.

A nukleinsavon kötődő és/vagy hasító oligonukleotid konjugátumokra példaként említhető az akridin [N. Thuong és munkatársai: Tetrahedron Letters, 29, 5905. (1988)], a pszorálok (U. Peiles és munkatársai: Nucleic Acid Rés. 17, 285. (1989)] vagy a klór-etilamino-aril konjugátumok [J. S. Cohen: Oligodeoxynucleotides, Antesense Inhibitors of Gene Expression, McMilliou Press, 173ff (1989)].

A találmány szerint előállított oligonukleotidok jellemző szerkezeti módosítása abban áll, hogy az internukleotid kötést mindkét láncvégen megváltoztattuk, vagyis a biológiai 3’-5’-kötés helyett 3’-3’-, illetve 5’5’-kötést alakítottunk ki. Meglepő módon azt találtuk, hogy ez a minimális szerkezeti módosítás elegendő ahhoz, hogy az ilyen típusú vegyületeket a nukleázok lebontó hatásával szemben stabilizáljuk.

Ez a csekély szerkezeti módosítás, mint ezt később részletesen tárgyaljuk, olyan hibridizálási viselkedést eredményez, amely majdnem egybeesik a biológiai oligonukleotidok viselkedésével. Ebből következik, hogy ezek a vegyületek sejttenyészetekben a génkifejeződés gátlására általánosan felhasználhatók.

Az irodalomban nem található utalás olyan oligonukleotid analógok előállítására, amelyek a két láncvégen 3’-3’- és 5’-5’-intemukleozidkötéssel rendelkeznek, és ugyanúgy nem ismert ezek antiszenz oligonukleotidként történő alkalmazása sem. Az olyan dinukleozid-foszfát analógok, amelyek 3’-3’- vagy 5’-5’-kötést tartalmaznak, régóta ismertek megfelelő kondenzációs reakciók fő termékeként [A. Myles, W. Hutzenlaub, G. Reits és W. Pfleiderer: Chem. Bér. 108, 2857-2871. (1975); H. Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub és W Pfleiderer: Chem. Bér. 108, 2872-2877. (1975); J. Tornász: Nucl. Nucl. 2(1), 51-61. (1983); M. Nemer, N. Therault, A. Schifmann és K. K. Ogilvie: Vth International Round Table, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, La Grande Motte, J. L. Imbach, 94-96. (1984)], illetve melléktermékeként [L. Letsinger, K. K. Ogilvie: J. Amer. Chem. Soc. 89, 4801-4802. (1967)]. Az ilyen dimer vegyületek azonban a túl alacsony olvadáspont miatt nem alkalmasak arra, hogy celluláris nukleinsavakkal stabil hibridet alakítsanak ki. Génszondák kialakításánál a riportercsoport hordozójaként olyan oligonukleotidokat állítottak elő, amelyek csak egyik végükön tartalmaznak 5’-5’-kötést [S. Agrawal, C. Christodoulu, M. J. Gait: Nucleic Acids Rés. 14, 6227-6245. (1986)]. Ezeket azonban hibridizálási körülmények között nem vizsgálták. Biofizikai kísérletekhez önkomplementer oligonukleotidokat állítottak elő, amelyek a molekula közepén egyetlen 3’-3’-, illetve 5’-5’-kötést tartalmaznak [J. H. van de Sande, N.

B. Ramsin, M. W. Germán, W. Elhorst, B. W. Kalisch,

Ε. V. Kitzing, R. T. Pon, R. C. Clegg, T. M. Jovin:

Science, 241, 551-557. (1988)].

A terminálisán invertált 3’-3’- és 5’-5’-kötést tartalmazó oligonukleotidok előállítását a biológiai oligonukleotidok szintézisével azonos módon oldatban vagy előnyösen szilárd fázisban, adott esetben automatikus szintetizáló berendezés segítségével végezzük.

A találmány értelmében az I általános képletű oligonukleotidokat úgy állítjuk elő, hogy

a) valamely, 3’-, illetve 5’-terminális foszfor(III)vagy foszfor(V)csoporttal rendelkező nukleotidegységet vagy ennek aktivált származékát valamely, 3’-, illetve 5’-terminális szabad hidroxilcsoporttal rendelkező nukleotidegységgel reagáltatunk, vagy

b) az oligonukleotidot fragmensekből azonos módon felépítjük, majd az a) vagy b) pont szerint előállított oligonukleotidról a további funkciós csoportok védelmére adott esetben ideiglenesen felvitt egy vagy több védőcsoportot lehasítjuk, és a kapott I általános képletű oligonukleotidot kívánt esetben fiziológiailag alkalmazható sóvá alakítjuk.

A terminálisán invertált 3’-3’-kötéssel rendelkező oligonukleotidok előállításához a szilárd fázisú szintézisben kiindulási komponensként olyan hordozógyantát alkalmazunk, amelyre az első nukleozid monomert az 5’-hidroxilcsoporton keresztül felvisszük. A kiindulási komponens előállításához irodalomból ismert módszerrel [T. Atkinson, M. Smith: Oligonucleotide Synthesis, M. J. Geit, 35-49. (1984)] előállított hordozógyantát, például Kiesel-gélt vagy szabályozott pórusméretű üveggyöngyöt alkalmazunk, amelyre aminocsoportokat viszünk fel. Ezt a nukleobázison és a 3’-hidroxilcsoporton védett nukleozidszármazékkal reagáltatjuk, amelyet előzetesen 5’-p-nitro-fenil-szukcinát-származékká alakítunk. Bázis védőcsoportként alkalmazható például acilcsoport, így benzoilcsöpört, izobutirilcsoport vagy fenoxi-acetil-csoport. A 3’-pozíciót előnyösen dimetoxi-tritil védőcsoporttal blokkoljuk, amelyet M. D. Matteucci és Μ. H. Caruthers: Tetrahedron Letters 27, 3243-3246. (1980) módszerével viszünk fel. Az oligonukleotid lánc további felépítését az utolsó előtti lánctag hozzákapcsolásáig az irodalomból ismert módon, például az 5’-hidroxilcsoporton dimetoxi-tritil-csoporttal védett nukleozid-3-foszforossav-észteramid vagy nukleozid-3’-Hfoszfonát alkalmazásával végezzük. Utolsó lánctagként ismét valamely, a 3’-hidroxilcsoporton előnyösen dimetoxi-tritil-csoporttal védett nukleozid-5’-foszforossavészteramidot, illetve nukleozid-H-foszfonátot alkalmazunk. A terminálisán megfordított intemukleotid kötéssel rendelkező oligonukleotid lánc előállítását vázlatosan az A reakcióvázlatban mutatjuk be (a végeken 3’-3’- és 5’-5’-kötést tartalmazó oligonukleotidok előállítására alkalmazott foszfor-amidit ciklus). A 3’-3’- vagy 5’-5’kötéseket tartalmazó oligonukleotidokat azonos módon állítjuk elő.

HU 215 147 Β

A szerkezeti és szekvenciaanalízist úgy végezzük, hogy a 3’-3’- és 5’-5’-végeken felépített oligonukleotidot először terminálisán megjelöljük. Ezt radioaktív jelöléssel végezzük, előnyösen 5’-gamma-³²P-ATP/polinukleotid-kináz felhasználásával. A radioaktív jelölés a szabad 5’-hidroxilcsoporton következik be, vagyis a csak biológiai 3’-5’-kötéssel rendelkező oligonukleotiddal ellentétben a nukleotidlánc megfordított végén. A további szekvenciaanalízist az irodalomból ismert módon, például bázisspecifikus statisztikus hasítással [A. M. Maxam és W. Gilbert: Methods in Enzymology 65, 499-560. (1980)] végezzük.

A „megfordított” molekulavégen bekövetkező radioaktív jelölés alapján a szekvencia leolvasása is fordított irányban történik a biológiai 3’-5’-kötéssel rendelkező oligonukleotidokhoz képest. A részletes vizsgálati leírást a 6. példában adjuk meg.

Az I és II általános képletű oligonukleotidok kettős szálú vagy egyszálú nukleinsavhoz történő hozzákapcsolódáson alapuló hibridkémiai szabályozásban vagy a nukleinsavak biológiai funkciójának visszaszorításában, valamint vírusos genomfunkciók kifejeződésének szelektív visszaszorításában, vírusfunkciók megelőzésében és terápiájában, onkogén funkciók visszaszorításában, és rákos megbetegedések terápiájában alkalmazhatók.

Az in vivő stabilitás mértékeként a vérszérumban oldott, találmány szerint előállított I vagy II általános képletű oligonukleotid viselkedését tekinthetjük. Az általános tesztet a 7. példában ismertetjük, a kígyóméreg foszfodiészteráz-oldatban végzett megfelelő in vitro tesztet a 8. példában ismertetjük. A találmány szerint előállított oligonukleotidok a 3’-5’-oligonukleotidokkal ellentétben sokkal lassabban bomlanak.

All. példa a terminálisán invertált 3’-3’-kötést tartalmazó oligonukleotidok szérumstabilitását mutatja be.

A hibridizálási viselkedésmodell-kísérletekből, például a 9. példában leírt kísérletből állapítható meg, amelyben egy sor SV40-specifikus szekvencia, amelyeket a találmány értelmében 3’-3’- és 5’-5’-végekkel állítottunk elő, a megfelelő SV40-DNS ellenszállal hibridizálva olyan olvadáspontot mutatnak, amely csak elhanyagolható mértékben alacsonyabb, mint az az olvadáspont, amelyet a megfelelő, de nem találmány szerint, vagyis 3’-3’- és 5’-5’-végek nélkül előállított szekvenciával végzett hibridizálás során kapunk. A találmány értelmében terminális 3’-3’-, illetve 5’-5’-kötéssel ellátott oligonukleotidoknak a génkifejeződés gátlásában kifejtett hatékonyságát az SV40 vírus növekedésének visszaszorításában (10. példa), valamint a p53 onkogén termék in vitro kifejezésének gátlásában (12. példa) mutatjuk be.

1. példa ’-O-DMTr-Dezoxirobonukleozid-5 ’-(N N-bisz-diizopropil-amino-$-cián-etoxi)-foszforossav-észteramid szintézise

A bázikusan védett nukleozidból kiinduló folyamatot a B reakcióvázlat szemlélteti, ahol a esetben B jelentése timin;

b esetben B jelentése N⁵-benzoil-adenin;

c esetben B jelentése N⁴-benzoil-citozin;

d esetben B jelentése N²-izobutiril-guanin; és DMTr jelentése 4,4’-dimetoxi-tritil.

A) 3’,5’-0-Bisz-DMTr-dezoxiribonukleozid-2 előállítása

Kiindulási elegy: 6 mmol dT, dA^bz, dC^bz vagy dG^ibu

14,4 mmol DMTr-Cl 14,9 mmol abszolút TEA.

A dezoxiribonukleozid-l-et 50 ml abszolút piridinben oldjuk és 0 °C hőmérsékleten trietil-amint és dimetoxi-tritil-kloridot adunk hozzá. Ezután 24 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük, amelynek során az átalakulást vékonyréteg-kromatográfiásan (fúttatószer: CH₂Cl₂/MeOH 9:1) követjük. A reakciót metanol hozzáadásával megállítjuk, az oldószert eltávolítjuk, és a maradékot diklór-metánban felvesszük. A szerves fázist 1 mol/1 (NH₄)HCO₃-oldattal többször extraháljuk, majd vízzel mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, és forgó vákuumbepárlóban bepároljuk.

A 3’-5’-ditritilezett 2. számú termék oszlopkromatográfiásan megtisztítható a felesleges tritanoltól, illetve 5’-DMTr-dN-től (oszlop: Kiesel-gél 60H, eluálószer: CH₂-C1₂ növekvő metanoltartalommal, a ditritilezett dezoxinukleozid 1-1,5 tömeg% metanoltartalomnál eluálódik).

Kitermelés: az elméleti 73-85%-a.

B) Az 5 ’-Dimetoxi-tritil-csoport specifikus leválasztása

Irodalom: M. D. Matteucci és Μ. H. Caruthers: Tetrahedron Letters, 21, 3243-3246. (1980).

Reakcióelegy: 3 mmol 3’-5’-O-bisz-DMTr-dN 2 15 mmol ZnBr₂

200 ml abszolút nitro-metán.

A 3’-5’-O-bisz-DMTr-dN-2-t 100 ml nitro-metánban oldjuk, és 0 °C hőmérsékleten a cink-bromid további 100 ml nitro-metánban felvett szuszpenziójához adjuk. Védett dezoxiadenozin esetében a reakciót hűtés közben végezzük a deurinezés elkerülése érdekében. A hasítás ennél a nukleozidnál már 60 perc után teljes, ami vékonyréteg-kromatográfiásan könnyen megállapítható. Timidin és dezoxiguanozin esetében a reakció szobahőmérsékleten szintén 60 percen belül befejeződik, míg a bisz-DMTr-dezoxi-citidin 5’-detritilezése nem játszódik le teljes egészében. Ebben az esetben a reakciót 3 óra elteltével megszakítjuk a 3’dimetoxi-tritil-csoport lehasításának elkerülése érdekében.

A reakció megállítását 200 ml 1 mol/1 NH₄Ac-oldat hozzáadásával végezzük, a 3. számú terméket 200 ml CH₂Cl₂-vel extraháljuk, a szerves fázist telített nátriumklorid-oldattal és vízzel mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert vákuumban ledesztilláljuk.

A tritanol fő tömege leválasztható, ha a nyersterméket mintegy 500 ml n-hexánban -15 °C hőmérsékleten elválasztjuk. A tisztítást kromatográfiásan Kiesel-gél 60H oszlopon növekvő mennyiségű metanolt tartalmazó diklór-metán eluálószerrel végezzük. A 3’-DMTrdezoxiribonukleozid Rf-értéke a megfelelő 5’-tritilezett

HU 215 147 Β monomer Rf-értékétől az alábbiak szerint tér el (futtatószer CH₂Cl₂/MeOH 24:1):

	3’-DMTr-dN	5’-DMTr-dN
dT	0,28	0,21
Da^bz	0,55	0,29
dC^bz	0,53	0,31
dG‘^bu	0,32	0,14
Kitermelés	: az elméleti 48-	-65%-a.

C) 3 '-O-DMTr-Dezoxirikonukleozid-5 ’-O-(N,N-diizopropil-amino-fi-ciano-etoxi)-foszforossav-észteramid-4 előállítása

Irodalom: H. Köster: Nucleic Acids Rés. 12, 4539-4557. (1984)

Reakcióelegy: 1 mmol 3’-O-DMTr-dezoxiribonukleozid-3

1,5 mmol klór-N,N-diizopropil-amino-B-cian-etoxi-foszfín mmol diizopropil-amin.

A foszfitilezési reakciót Köster és munkatársai módszerével végezzük, és így 5’-O-DMTr-dezoxiribonukleozid-3’-0-foszforossav-észteramidot állítunk elő. A védett nukleozid abszolút CH₂Cl₂-ben felvett oldatához argonatmoszféra alatt diizopropil-amint, majd a foszforilezőszert adagoljuk. 30 perc elteltével a reakciót 30 ml etil-acetát hozzáadásával megállítjuk, az oldatot telített nátrium-klorid-oldattal háromszor extraháljuk, a szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert vákuumban ledesztilláljuk. A nyersterméket oszlopkromatográfiásan tisztítjuk (oszlop: Kieselgél 60H, eluálószer: petrol-éter/diklór-metán/trietilamin 45:45:10)

A 4a. lépés kitermelése: az elméleti 93%-a.

2. példa

3’,3’-Foszfodiészter-kötéssel rendelkező timidilil-timidin előállítása

A dimer blokkot a C reakcióvázlat szerint állítjuk elő.

A) 5 ’-O-Dimetoxi-tritil-timidin-5 előállítása

Reakcióelegy: 20 mmol timidin (4,84 g) mmol 4,4’-dimetoxi-tritil-klorid (8,2 g) mmol dimetil-amino-piridin (122 mg) mmol abszolút trietanol-amin (3,8 ml)

Az 5. számú vegyületet R. A. Jones módszerével [G. S. Ti, B. L. Gaffney és R. A. Jones: H. Amer. Chem. Soc. 104, 1316-1319. (1982)] állítjuk elő. A timidint egyenként 50 ml abszolút piridinnel végzett háromszoros együttes bepárlással szárítjuk, 100 ml piridinben felvesszük, és jeges hűtés közben 4,4’-DMTrCl-lel és DMAP-katalizátorral elegyítjük. A reakciót vékonyréteg-kromatográfiásan követjük (futtatószer: CH₂Cl₂/MeOH 9:1), majd 4 óra elteltével 100 ml víz hozzáadásával megállítjuk. Az oldatot éterrel háromszor extraháljuk, a szerves fázist szárítjuk, forgó vákuumbepárlóban bepároljuk, és a maradékot benzolból átkristályosítjuk.

Kitermelés: 9,68 gDMTr-dT (89%).

B) 5 '-O-Dimetoxi-tritil-timidin-3 '-O-(N,N-diizopropilamino-fi-cian-etoxi)-foszforossav-észteramid-6 előállítása

A 6. számú vegyület előállítását és tisztítását 3’-ODMTr-5’-O-foszforossav-észter-4 szintézisével (IC. példa) analóg módon végezzük.

C) 5 ’-O-Acetil-timidin-8 előállítása Reakcióelegy: 2,0 mmol 3’-O-DMTr-dT-3a (1,1 g)

0,2 mmol dimetil-amino-piridin (12,2 mg) ml ecetsavanhidrid.

Irodalom: A. M. Michelson és A. R. Todd: J. Org. Chem. 1955, 2632-2638. (módosított változat).

A 3’-O-DMTr-dT és a DMAP 20 ml abszolút piridinben felvett oldatához jeges hűtés közben hozzácsepegtetjük az ecetsavanhidridet. 3 óra reakcióidő után az átalakulás teljes (vékonyréteg-kromatográfia, futtatószer: CH₂Cl₂/MeOH 24:1). A 7. számú terméket 400 ml jeges vízzel kicsapjuk, a fehér csapadékot szűrjük, jeges vízzel mossuk és szárítjuk.

Kitermelés 1,02 g 3’-O-DMTr-5’-O-Ac-dT (88%)

A 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport lehasításához 7. számú vegyületet 10 ml 80 tömeg%-os ecetsavban kevertetjük szobahőmérsékleten. 100 ml jeges víz hozzáadásával a reakciót 3 óra elteltével megszakítjuk, amelynek hatására 4,4’-dimetoxi-tritanol válik le fehér csapadék formájában. Ezt kiszűrjük, a vizes szűrletet forgó vákuumbepárlóban bepároljuk. Az olajos maradékot kevés CH₂Cl₂-ben felvesszük, és 200 ml n-hexánban -15 °C hőmérsékleten kicsapjuk.

Kitermelés: 455 mg 5 ’-O-acetil-timidin (94%).

D) Timidilil-(3 ’,3)-timidin-10 előállítása

Reakcióelegy: 1,0 mmol 5’-O-DMTr-timidin-3’-O(N,N-diizopropil-amino-B-ciano-etoxi)-foszforossav-észteramid-6 (705,8 mg)

0,9 mmol 5’-O-acetil-timidin-8 (253 mg)

2,6 mmol tetrazol (182 mg)

9,0 mmol jód (1,14 g).

A 10. számú dimer blokk szintézisét Köster módszerével [H. Köster: Nucleic Acids Rés. 12, 4539-4557. (1984)] végezzük, amelyet 3’-5’-nukleozid dimerek előállításához dolgozott ki. Az 5’-O-acetil-timidin és a tetrazol 30 ml abszolút CH₃CN-ben felvett oldatát argonatmoszféra alatt a foszforossav-észteramidhoz adjuk. A jódot 30 ml acetonitril/piridin/víz 24:5:1 elegyben felvesszük, és hozzáadjuk a reakcióelegyhez, majd 15 perc elteltével a felesleges jódot 5 ml 40 tömeg%-os H₂SO₃-oldattal redukáljuk. Az oldatot ezután bepároljuk, a maradékot CH₂Cl₂-ben felvesszük, teliített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kétszer mossuk, és az oldószert ledesztilláljuk. A nyersterméket oszlopkromatográfiásan tisztítjuk (oszlop: Kiesel-gél 60H, eluálószer: ecetsav/diklór-metán 50:50).

Kitermelés: 665 mg (75%).

Az acetilcsoport és a B-cián-etil-csoport lehasításához a dimert 1 órán keresztül 5 ml koncentrált ammóniával kezeljük szobahőmérsékleten, a 4,4’-dime6

HU 215 147 Β toxi-tritil-csoportot 80 tömeg%-os ecetsavval távolítjuk el.

3. példa

5’,5-Foszfodiészter-kötést tartalmazó timidilil-timidin14 előállítása

A 14. számú vegyület előállítását a D reakcióvázlat mutatja.

A szintézis egyes reakciólépéseit a 2. példában leírt módszerekkel végezzük.

A két dimer blokk szerkezetét FAB-tömegspektrometriás és 1 H-magrezonancia spektroszkópiás módszerrel azonosítottuk.

4. példa

CPG 10-1400-hordozóanyagnak 3 ’-O-dimetoxi-tritildezoxiribonukleozid-5 ’-O-szukcinát felvitele CPG 10-1400 hordozóanyagra

A CPG hordozóanyagra 3-amino-propil-láncot viszünk fel Atkinson és Smith módszerével [T. Atkinson és M. Smith: Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait, 35-49. (1984)].

A) 3 ’-O-DMTr-dezoxiribonuk/eozid-ő ’-O-szukcinát15 előállítása

Reakcióelegy: 1,0 mmol 3’-O-DMTr-dN 3

0,8 mmol borostyánkősavanhidrid (80 mg)

0,5 mmol dimetil-amino-piridin (61 mg).

A borostyánkősavanhidridet a dezoxiribonukleozid 5’-hidroxilcsoportjával reagáltatjuk 5 ml abszolút piridinben katalizátorként DMAP-t alkalmazva. A reakciót egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten végezzük. A teljes átalakulás után az oldószert bepároljuk, és a piridint toluollal végzett háromszoros azeotróp desztillálással eltávolítjuk. A maradékot diklór-metánban felvesszük, 10 tömeg%-os jéghideg citromsavoldattal és vízzel mossuk, és a szerves fázist vákuumban forgó bepárlóban bepároljuk. A nyersterméket mintegy 3 ml toluolban oldjuk, és 200 ml n-hexánnal kicsapjuk.

Kitermelés: (79-84%)

B) 3 '-O-DMTr-dezoxiribonukleozid-5 ’-O-szukcinil-pnitro-fenil-észter 16 előállítása és hordozóanyagra történő felvitele (Lásd az E reakcióvázlatot.)

Reakcióelegy: 0,8 mmol 3’-O-DMTr-dN-5’-Oszukcinát 15

0,8 mmol p-nitro-fenol (112 mg)

2,0 mmol diciklohexil-karbodiimid (412 mg) g funkciós csoporttal ellátott CPG 10-1400.

A védett, szukcinilezett dezoxiribonukleozidot a pnitro-fenol 5 ml abszolút dioxánban és 0,2 ml piridinben felvett oldatához adjuk, és ez után hozzáadjuk a DCCI kondenzálószert. Rövid időn belül kiválik a diciklohexil-karbamid és 3 óra elteltével a reakció vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat (CH₂Cl₂/MeOH 9:1) szerint teljesen lejátszódik. A csapadékot argonatmoszféra alatt szűrjük, és a szűrletet közvetlenül a funkciós csoporttal ellátott hordozóanyag 15 ml abszolút DMF-ben felvett szuszpenziójához adjuk. Hozzáadunk 0,8 ml trietil-amint, és az elegyet egy éjszakán keresztül rázzuk. Az anyagot tartalmazó hordozót szűrjük, metanollal és éterrel mossuk, és exikkátorban szárítjuk. Az anyagot tartalmazó hordozót spektrometriásan ellenőrizzük. Mintegy 2 mg mintát 10 ml 0,1 n p-toluolszulfonsavoldattal (acetonitril) kezelve lehasítjuk a 4,4’-dimetoxitritil-kationt, és abszorpcióját 498 nm-en mérjük. A felvitt anyag mennyiségét az alábbi egyenlettel számoljuk: OD₄₉₈/ml χ 10 ml χ 14,3 mg hordozóanyag

A felvitt anyag mennyiségét pmol/g értékben fejezzük ki.

Eredmények: 3 ’-DMTr-dT hordozóanyag:

pmol/g

3’-DMTr-dG^ibu hordozóanyag:

pmol/g

3’-DMTr-dA^bz hordozóanyag:

pmol/g ’-DMTr-dC^bz hordozóanyag:

pmol/g.

A reagálatlan aminocsoportok megvédéséhez az anyagot tartalmazó hordozót 1 ml ecetsavanhidrid és 50 mg dimetil-amino-piridin 15 ml abszolút piridinben felvett oldatával kezeljük 1 órán keresztül szobahőmérsékleten rázás közben, majd szűrjük, metanollal és éterrel mossuk, és szárítjuk.

5. példa

A) Terminális 3’,3’-és 5 ',5’-kötéssel rendelkezőoligonukleotidok szintézise

A szintézist Applied Biosystems, Modell 381A típusú (Forster City, USA) DNS-szintetizáló berendezésen végezzük minden kondenzációs lépésnél 0,2 pmol standard programot alkalmazva. A szintézis ciklusát az A reakcióvázlat mutatja. Hordozóanyagként a 4. példában leírt CPG 10-1400-at alkalmazzuk. A kondenzációkat a szokásos nukleozid-3’ foszforossav-észterrel végezzük, csupán az utolsó reakcióciklusban alkalmazzuk az 1. példában leírt 3’-O-DMTr-nukleozid-5’-O(N,N-diizopropil-amino-fi-cián-etoxi)-foszforossavészteramidot. Az oligonukleotidot koncentrált ammóniával lehasítjuk a hordozóanyagról, és eltávolítjuk a foszfát- és bázis védőcsoportokat, amelyhez az ammóniaoldatot egy éjszakán keresztül 60 °C hőmérsékleten melegítjük. A mintát etanolban végzett kicsapással sómentesítjük, és a célszekvenciát poliakrilamid gélelektroforézissel megtisztítjuk a rövidebb fragmensektől.

A vizsgálatokhoz csak 3’-5’-kötéseket, valamint terminálisán 3’-3’- és 5’-5’-kötést tartalmazó eikozatimidilátot szintetizálunk. Ezen kívül az SV40-genomból származó szekvenciákat alkalmazzuk. A következő oligonukleotidokat szintetizáljuk:

dT₂₀;

dT₂₀(3’-3’,5’-5’);

SV40TS17: 17-mer, szenz-szekvencia az SV40-genomból az 5159-5176 pozícióknál;

5’-AGC TTT GCA AAG ATG GA-3’

HU 215 147 Β

SV40TAS17: 17-mer, antiszenz-szekvencia

SV40TS 17-hez;

5’-TCC ATC TTT GCA AAG CT-3’ SV40TAS17(3’-3’, 5’-5’): 17-mer, antiszenz-szekvencia SV40TS 17-hez a végeken 3’-3’-, illetve 5’-5’kötéssel;

3’-T(5’-5’)CC ATC TTT GCA AAG C(3’-3’)T-5’ SV40TS35: 35-mer, szenz-szekvencia az SV40-genomból az 5142-5176 pozícióknál;

5’-AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT

TTA AAC AGA AG-3’

SV40TAS35: 35-mer, antiszenz-szekvencia

SV40TS35-höz;

5’-TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT

GCA AAG CT-3’

SV40TAS35(3’-3’,5’-5’): 35-mer, antiszenz-szekvencia SV40TS35-höz a végeken 3’-3’-, illetve 5’-5’kötéssel;

3’-T(5’-5’)CT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAGC(3’-3’)T-5’

B) Terminális 3 ’-3 ’-kötést tartalmazó oligonukleotidok szintézise

Hordozóanyagként a 4. példában leírt CPG

10-1400-at alkalmazzuk. A kondenzálást a szokásos nukleozid-3 ’-foszforossav-észterrel végezzük.

Az oligonukíeotidot koncentrált ammóniával lehasítjuk a hordozóról, a foszfát- és bázis védőcsoportok eltávolításához az ammóniaoldatot egy éjszakán keresztül 60 °C hőmérsékleten melegítjük, a mintát etanolból kicsapva sómentesítjük, és a célszekvenciát poliakrilamid gélelektroforézissel megtisztítjuk a rövidebb fragmensektől.

SV40TAS17(3’-3’): 17-mer, antiszenz-szekvencia

SV40TS 17-hez a végén 3’-3’-kötéssel;

3’-TCC ATC TTT GCA AAG C(3’-3’)T-5’

C) Terminális 5’-kötést és 2-terminális tiofoszfátmaradékot tartalmazó oligonukleotidok előállítása Hordozóanyagként a kereskedelmi forgalomban kapható CPG anyagot alkalmazzuk, amely a 3’-hidroxilcsoporton 5’-O-dimetoxi-tritil-timidin-csoportot tartalmaz. A kondenzálást a szokásos nukleozid-3’foszforossav-észterrel végezzük, csupán az utolsó reakcióciklusban alkalmazzuk az 1. példában leírt 3’-ODMTr-nukleozid-5’-O-(N,N-diizopropilamino-B-ciánetoxi)-foszforossav-észteramidot.

Az első két reakcióciklusban a szokásos jódos oxidálás helyett az oxidálást elemi kénnel [W. Stec és munkatársai: J. A. C. S. 106, 6077. (1984)] végezzük.

Az oligonukíeotidot koncentrált ammóniával lehasítjuk a hordozóról, a foszfát- és bázis védőcsoportok eltávolításához az ammóniaoldatot egy éjszakán keresztül 60 °C hőmérsékleten melegítjük, a mintát etanolból kicsapva sómentesítjük, és a célszekvenciát poliakrilamid gélelektroforézissel megtisztítjuk a rövidebb fragmensektől. A következő oligonukíeotidot szintetizáljuk:

SV40TAS17(5’-5’): 17-mer, antiszenz-szekvencia

SV40TS17-hez az 5’-végen 5’-5’-kötéssel és a 3’végen két tiofoszfát intemukleotid kötéssel; 3’-T(5’-5’)CC ATC TTT GCA AAG(P_s)C(P_s)T-3’

6. példa

Terminális 3 ’-3'- és 5 ’-5 ’-kötést tartalmazó oligonukleotid szerkezetének és szekvenciájának analízise

Az oligonukleotid szekvenálását Maxam és Gilbert módszerével [A. M. Maxam és W. Gilbert: Methods in Enzymology, 65, 499-560. (1980)] végezzük. Minden 100 pmol mintát az 5’-hidroxilcsoporton (gamma-³²P)ATP/T4-polinukleotid-kináz jelenlétében radioaktív jelöléssel látunk el, és ezután a következő bázisspecifikus reakciókat végezzük el:

(A+G) reakció: a bázist hangyasavval protonáljuk;

G reakció: dimetil-szulfátos reakció;

(T+C) reakció: hidrazinolízis;

C reakció: hidrazinos reakció 5 mol/l nátrium-klorid jelenlétében.

Az oligonukleotid láncot 1 mol/l piperidinnel kezelve 95 °C hőmérsékleten a módosított helyen hasítjuk, a töredékeket poliakrilamid gélelektroforézissel (20 tömeg% akrilamid, 7 mol/l karbamid) elválasztjuk, és autoradiográfiásan detektáljuk. Az 1. ábra az SV40TS17, SV40TAS17 és SV40TAS17(3’-3’,5’-5’) szekvenálásának autoradiogramját mutatja (az oligonukleotid leírását lásd az 5. példában). Mivel a láncot az 5’-hidroxilcsoporton jelöljük meg, a bázissorrend csak a 3’-5’-kötéseknél és csak a 3’-5’-irányban olvasható le. Az SV40TAS17(3’-3’,5’-5’) oligonukleotid 3’3’ vége következtében azonban a radioaktív jelölésű 5’-hidroxilcsoport a 3’ terminuson helyezkedik el, ezért a szekvencia leolvasásának iránya megfordul (1. ábra). Ez is egyik bizonyítéka annak, hogy a lánc 5’-terminális részén szabad 3’-hidroxilcsoport mellett 5’-5’-foszfodiészter-kötés található, amely a polinukleotid-kináz enzimmel nem foszforilezhető.

7. példa

A 3’-3’ és 5 ’-5' végekkel ellátott oligonukleotid stabilitásának vizsgálata vérszérumtesztben

A) 3 ’-3 ’ és 5 ’-5 ’ végekkel rendelkező eikoza-timidilát kinázozása

Irodalom: T. Mizuno, M-Y. Chou és M. Inouya: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1966-1970. (1984)

Reakcióelegy: 1 μΐ oligonukleotid (0,01 OD₂₆₀) μΐ 10 χ kinázpuffer μΐ T4-polinukleotid kináz μΐ gamma-³²P-dATP) (speciális aktivitás: 6000 Ci/mmol) μΐ víz.

A reakcióelegyet 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a reakciót 90 μΐ víz hozzáadásával megszakítjuk, és az elegyet Sephadex G50 oszlopon frakcionáljuk. A termékffakciókat egyesítjük, és liofilizáljuk.

B) Vérszérumteszt

Irodalom: S. M. Heywood: Nucleic Acids Rés. 14, 6771-6772.(1986)

Reakcióelegy: 0,01 OD₂₆₀ radioaktív foszforilezett oligonukleotid referenciaanyag

0,01 OD₂₆₀ T₂₀, a kísérlethez OD₂₆₀és T₂₀ 3’-3~’- és 5’-5’-végekkel μΐ friss emberi szérum.

HU 215 147 Β

A szérumot hozzáadjuk az adott mintához, és kézzel összerázzuk. Ezután rögtön 3 μΐ mintát pipettával eltávolítunk a zéróérték meghatározásához, és 3 pl formamid loading pufferbe töltjük az enzimaktivitás letöréséhez. Ezután a mintát 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kinetika meghatározásához adott időpontokban 3 pl mintát eltávolítunk, és a fent leírt módon letörjük.

Referencia: 5 perc, 8 perc, 11 perc, 15 perc, 30 perc Kísérlet: 5 perc, 8 perc, 11 perc, 15 perc, 30 perc, perc.

A mintát 20 tömeg%-os poliakrilamid gélen felvesszük, és gélelektroforézissel elválasztjuk, majd autoradiográfiásan vizsgáljuk.

A friss emberi szérummal végzett hasítás autoradiogrammját a 2. ábra mutatja, ahol balról számolva a következő mintákat látjuk:

Referencia: O-érték, 5 perc, 8 perc, 11 perc, 15 perc, 30 perc

Kísérlet: O-érték, 5 perc, 8 perc, 11 perc, 15 perc, perc, 90 perc.

Már 5 perc elteltével kimutatható, hogy a természetes oligonukleotid lebontása megkezdődött. A hasítás az idő előrehaladtával fokozódik. A módosított oligonukleotid 90 perces inkubálás után is gyakorlatilag változatlan marad. A kinetikai vizsgálat minden értékénél látható gyenge sávok a szérumban jelen lévő endonukleázaktivitásból származnak. Ez a hasítási érték az oligonukleotid terápiás felhasználása vonatkozásában fontos és kívánatos, mivel garantálja a hatóanyag lassú lebontását, és elkerüli az anyagnak a testben történő felhalmozását.

8. példa

Terminális 3 ’-3 és 5 ’-5 '-kötéssel rendelkező oligonukleotid viselkedésének vizsgálata kígyóméreg foszfodiészterázzal szemben

A kinázozást a 7. példában leírt módon végezzük.

B) 3 ’-3 ’ és 5 ’-5 ’ végekkel rendelkező eikoza-timidilát hidrolízise kígyóméreg foszfodiészterázzal Irodalom: A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi és

M. Inouye: PNAS USA 83, 7726-7730. (1986) Reakcióelegy: 5 pl RNS-hordozó pl SQ-puffer 1 pl SVpdE(l,5 u/pl).

A radioaktívan foszforilezett mintát (referencia:

T₂₀, kísérlet: terminális 3’-3’- és 5’-5’-kötéseket tartalmazó T₂₀) liofilizáljuk, és hozzáadjuk az RNS-hordozót és az SQ-puffert. Ebből az elegyből a zéróérték meghatározásához 5 pl részletet eltávolítunk, az oldat maradékát enzimmel elegyítjük, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kinetika meghatározásához a referenciaanyagból 5 perc, 15 perc és 30 perc után 5-5 pl mintát veszünk, míg az eikoza-timidilátból 5 perc, 30 perc, 45 perc, 60 perc és 90 perc után 5-5 pl mintát veszünk. Az enzim dezaktiválásához a mintát közvetlenül a mintavétel után 2 percre 95 °C hőmérsékletű vízfürdőre helyezzük. A mintát liofilizáljuk, és analitikai 20 tömeg%-os poliakrilamid gélre visszük. Gélelektrolitikus elválasztás után autoradiográfiásan vizsgáljuk.

Az SVpdE-hasítás autoradiogrammját a 3. ábra mutatja, ahol balról a következő minták helyezkednek el: T₂₀ (referencia), terminális 3’-3’- és 5 ’-5’-kötésekkel rendelkező T₂₀, kísérleti minta kinetikája 5 perc, 15 perc, 30 perc, 45 perc, 60 perc, 90 perc után, 0 perc/15 perc elegye, 0 perc/30 perc elegye, referencia kinetikája 5 perc, 15 perc, 30 perc, 45 perc után.

Az 5’-5’-kötés, mint említettük, azonnal hasad. Az a tény, hogy a további hasítás a referenciához viszonyítva nagyon lassan halad előre, egyértelműen igazolja a szerkezetet. Az 5’-5’-foszfodiészterkötés hasítása után olyan molekula keletkezik, amely a hasítási helyen egy 5’-hidroxilcsoportot hordoz. A molekula másik végén 5’-foszfátcsoport található. A kígyóméreg foszfodiészteráz mindkét véget meg tudja támadni. A lassú, de egyértelmű további lebontás feltehetően az előállító [J. G. Izant és H. Weintraub: Cell 36, 1007-1015. (1984)] által említett kis mennyiségű, egy szálra specifikus endonukleázra vezethető vissza, amely a szuperkoil PM2 DNS-t nyitott formára alakítja. A szekvencia hossza egyértelműen leolvasható. A felvételen csak 19 sáv található, mivel az 5’-5’foszfodiészterkötés a kinetika első értékénél, 5 perc után lehasad.

9. példa

Terminális 3 '-3 ’- és 5 ’-5 ’-végekkel rendelkező oligonukleotidok hibridizálási viselkedésének vizsgálata

A hibridizálási viselkedés vizsgálatához olvadékgörbét veszünk fel ekvimoláris mennyiségű (5,23 nmol) SV40TS17-ről és SV40TAS17-(3’-3’-, 5’-5’-)-ről. (Az oligonukleotidok leírását lásd az 5. példában.) A görbe felvételét 1 ml 10 nmol/1 nátrium-kakodilát/100 mmol/1 nátrium-klorid-puffer (pH=7,0) elegyben felvett oldatban végezzük, ezt 70 °C hőmérsékletre melegítjük, és a renaturálódás folyamatát lassú lehűtés (1 °C/perc) mellett az oldat abszorpciójának mérésével határozzuk meg. A referenciagörbe felvételéhez azonos mennyiségű SV40TAS17-et alkalmazunk. Analóg módon 4,75 nmol SV40TS35-öt és SV40TAS35-öt, illetve SV40TS35-öt és SV40TAS35-(3’-3’-, 5’-5’-)-t a pufferral elkeverünk, és 90 °C hőmérsékletre melegítünk. A lehűlés során mérjük az abszorpciót. A kapott olvadékgörbék a következő T_m-értéket adják:

SV40TS17 . SV49TAS 17 54,1 °C

SV40TS17 . SV40TAS17(3’-3’,5’-5’) 53,3 °C

SV40TS35 . SV40TAS35 65,5 °C

SV40TS35 . SV40TAS35(3’-3’,5’-5’) 64,2 °C

Az olvadék-hőmérséklet tehát a biológiaitól eltérő kötés kialakításával a 17-memél 0,6 fokkal, illetve a 3 5-mernél 1,3 fokkal csökkent.

10. példa

SV40T antigén bioszintézisének gátlása terminális 3’3’- és 5 ’-5 '-kötéssel rendelkező oligonukleotiddal A) Sejttenyészet

COS 1-sejteket 10 tömeg% magzati borjúszérumot tartalmazó Dulbecco szerint módosított Eagle-közeg9

HU 215 147 Β ben (DMEM) tenyésztünk. A tenyészedényeket 37 °C hőmérsékleten 7,5% C0₂ mellett inkubáljuk.

B) Radioaktív jelölés és sejtfeltárás

Mintegy 4χ 10⁴ sejtet egysejtes rétegben szövettenyésztésre alkalmas edénybe viszünk. A fuzionált sejttömeget háromszor metioninmentes DMEM-mel mossuk, majd 100 pCi ³⁵S-metioninnal jelöljük. Az antiszenz jelleg megváltozásának vizsgálatához a sejteket egyidejűleg SV40TAS17-(3’-3’,5’-5’) oligonukleotiddal és radioaktív metioninnal 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a sejteket háromszor 10 tömeg% magzati borjúszérumot tartalmazó és metionintól mentes DMEM-mel mossuk, és további 30 percen keresztül ebben a közegben hagyjuk. A feltáráshoz a sejteket jéghideg foszfátpufferrel pufferolt sóoldattal (PBS) kezeljük, az edényről levakarjuk, és 2 percen keresztül 400 g értéken centrifugáljuk. A sejtpelletet ezután 0,4 ml feltáró pufferrel (0,5 tömeg% Nonidet P40, 100 mmol/1 trisz-HCl, pH=9,0, 0,1 mol/1 NaCl) 3 χ 10⁶ sejtre számolva 45 percen keresztül jégen roncsoljuk. A proteolízis elkerülése érdekében a feltáró pufferhez 1 tömeg% trazilolt és 0,25 mg/ml végkoncentrációig fenil-metilszulfonilfluoridot adunk. A lizátumot 30 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten ultracentrifugában (105 000 g) tisztára centrifugáljuk. Egy 10 μΐ-es alikvot részt kiveszünk, és a fehérjetartalmat Lowry módszerével meghatározzuk. Az immunkicsapásos vizsgálathoz az összfehéije azonos mennyiségét alkalmazzuk.

C) Immunkicsapás

Az immunkicsapásos vizsgálathoz mind az SV40 vad típusú T-antigénnél, mind a citoplazmában lokalizált mutáns T-antigénnél a PAb 108 monoklonális antitestet alkalmazzuk. Az antitestet kromatográfiásan protein A szefarózon megtisztítjuk a hibridómamaradékoktól. A sejtextraktumot 100 μΐ 10 tömeg%-os, hővel inaktivált és formaldehiddel fixált Staphylococcus aureus (Cowan 1) baktériumszuszpenzióval egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten kezeljük. A baktériumokat ezután lecentrifugáljuk, a felülúszót legalább 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten a monoklonális antitesttel inkubáljuk, és S. aureus hozzáadásával kialakítjuk a specifikus immunkomplexet. Ezt a folyamatot háromszor megismételjük a teljes kicsapás biztosítása érdekében. Ezután az immuncsapadékot mossuk: háromszor 50 mmol/1 trisz-HCl, pH=8,0; 500 mmol/1 LiCl, 1 mmol/1 DTT, 1 mmol/1 EDTA és 1 tömeg% trazilol eleggyel, kétszer 50 mmol/1 trisz-HCl, pH = 7,4, 0,15 mol/1 NaCl, 5 mmol/1 EDTA és 1 tömeg% Nonidet P40 eleggyel, és egyszer 50 mmol/1 NH₄HCO₃-mal. Ezután 45 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten 200 μΐ elúciós pufferrel (50 mmol/1 NH₄HCO₃, 1 tömeg% SDS és 1 tömeg% β-merkapto-etanol) eluáljuk, liofilizáljuk, 10 perces forralással 20 μΐ mintapufferben (65 mmol/1 trisz-HCl, pH=6,8, 5 tömeg% B-merkaptoetanol, 1 tömeg% glicerin és 0,01 tömeg bróm-fenolkék) oldjuk, és 3 tömeg%-os poliakrilamid gélre (10 tömeg% SDS) visszük. A fehérjéket szakaszos gélelektroforézissel elválasztjuk, a sávokat fluorográfiásan röntgenfilmen (Kodak X-AR) lokalizáljuk.

A találmány értelmében a T-antigén transzlációs starthelyének áthidalásával előállított oligonukleotidokkal 30 pmol/l extracelluláris koncentrációban 70%-osan gátoljuk a vírus növekedését. Ez ellentétben van azokkal a megfelelő szekvenciákkal, amelyeket nem a találmány szerinti eljárással, vagyis 3’-3’- és 5’-5’-kötés nélkül állítunk elő. Ezeknél ugyanis azonos koncentrációban gátlás nem mutatható ki.

A sejtek 30 pmol/l SV40TAS17-(3’-3’,5’-5’) oligonukleotiddal történő kezelésével elért T-Ag-bioszintézis-gátlást a 4. ábrán mutatjuk.

11. példa

Olyan oligonukleotidok szérumstabilitásának összehasonlítása, amelyek csak a 3 ’-végen, illetve csak az 5 ’végen tartalmaznak módosított invertált foszfodiészterkötést

Az oligonukleotidokat, előnyösen a 3’-terminális végről kiindulva, nukleázzal lebontjuk [J. P. Shaw, K. Kent, J. Bírd, J. Fishback, B. Froehler: Nucleid Acids Rés. 19, 747-750. (1991)]. Ezáltal azt vizsgáljuk, hogy önmagában egy terminális 3’-3’-foszfodiészterkötés elegendő az oligonukleotid vérszérumban történő stabilizálásához. Mivel a 32p jelölésű foszfátcsoportot, különösen a szérummal végzett hosszú idejű kezelés esetén, a foszfatázok lehasítják, az oligonukleotid detektálásához fluoreszceint alkalmazunk.

A Xenopus levis genomjából a következő szekvenciákat szintetizáljuk:

Xelev 1: 3’-A(5’-5’)GC CTC AAA C*AT GTG TGA CG-3’

Xelev 2: 5’-AGC CTC AAA C*AT GTG TGA C(3’3’)G-5’

A szintézist az 5. példában leírt módon végezzük, amelynek során a tizedik kondenzációnál bázismódosított citidin-foszforossav-észteramid C*-t alkalmazunk, amely később lehetővé teszi kovalens kötés kialakítását a fluoreszceinnel. A fluoreszcein megkötését a Pharmacia cég előírásai szerint végezzük (Pharmacia LKB Biotechnology Autó Primer™ Synthesis Kit Instructions, XY-023-0001). A módosított oliognukleotidokat poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk.

Szérumteszt: 10 pmol oligonukleotid

140 μΐ friss humán szérum.

A mintákat 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 15 perc, 30 perc, 45 perc, 60 perc, 8 óra és 72 óra időközökben 20 μΐ mintát veszünk, kétszer fenol/kloroform/izoamil-alkohol 25:24:1 eleggyel extraháljuk, és az oligonukleotidot etanollal kicsapjuk. A hasítási termékeket 16 tömeg%-os poliakrilamid gélen automatikus A. L. F. szekvenálóval (Pharmacia, Freiburg) elválasztjuk, és detektáljuk. Mint az 5. ábra mutatja, csak az 5’-végén egy invertált intemukleotidkötéssel ellátott szekvencia mutat hasítást 15 perces szérumos kezelés után, és 60 perc elteltével szinte teljesen elbomlik. A 3’végén csak 3 ’-3 ’-kötéssel „védett” oligonukleotid azonban 72 óra elteltével is csak részlegesen van lebontva.

12. példa

Génkifejeződés gátlása in vitro kifejezési rendszerben

HU 215 147 Β

A génkifejeződés INV-oligonukleotiddal történő gátlásának vizsgálatához meghatározzuk a megfelelő antiszenz oligonukleotid hatását p53 kifejezésére p53 mRNS-t tartalmazó in vitro rendszerben [E. Reihsaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli: Oncogene 5, 137—144.(1990)].

Ehhez az alábbi antiszenz-szekvenciát szintetizáljuk:

NH₂(CH₂)₆pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT(3’-3’)T

Összehasonlító anyagként a megfelelő szenz-szekvenciát alkalmazzuk:

NH₂(CH₂)₆pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3’-3’)A

Az antiszenz-oligonukleotid a p53 onkoprotein transzlációs starthelyére irányul.

A következő körülmények között vizsgáljuk a fehérjék kifejeződését:

1. oligonukleotid hozzáadása nélkül;

2. 30 pmol/l szenz-szekvencia hozzáadásával;

3. 1 pmol/l antiszenz-szekvencia hozzáadásával;

4. 10 μπιοί/ΐ antiszenz-szekvencia hozzáadásával.

A minőségi elemzéshez denzitometriásan meghatározzuk a fehérjesávok elfeketedését [E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli: Oncogene 5, 137-144.(1990)].

A 6. ábra egyértelműen mutatja, hogy 10 μιηοΐ/ΐ antiszenz oligonukleotid hozzáadásával a kifejező rendszerben mintegy 70%-os gátlás következik be. Ha a koncentrációt 1 μιηοΐ/ΐ értékre csökkentjük, gátló hatás gyakorlatilag nem mutatható ki. Gátló hatás nem detektálható szenz-szekvencia hozzáadásakor, amely az mRNS-hez nem kötődik.

Claims

1. Eljárás (I) vagy (II) általános képletű oligonukleotidok és ezek fiziológiailag alkalmazható sói előállítására, a képletben

R¹ jelentése hidrogénatom vagy (III) általános képletű csoport,

R² jelentése hidrogénatom vagy (IV) általános képletű csoport, ahol R¹ és R² közül legalább az egyik jelentése hidrogénatomtól eltérő,

W és W’ jelentése egymástól függetlenül oxigénatom vagy kénatom,

Z és Z’jelentése egymástól függetlenül O^_- vagy S^_ion, 1-18 szénatomos alkoxicsoport, előnyösen 1-8 szénatomos alkoxicsoport, különösen előnyösen 1-3 szénatomos alkoxicsoport, elsősorban metoxicsoport; 1-18 szénatomos alkilcsoport, előnyösen 1-8 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyösen 1-3 szénatomos alkilcsoport, elsősorban metilcsoport; -NHR³ általános képletű csoport, ahol

R³ jelentése előnyösen 1-18 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyösen 1-8 szénatomos alkilcsoport, elsősorban 1 -4 szénatomos alkilcsoport, vagy alkoxirészében 1-4 szénatomos és alkilrészében 1-6 szénatomos alkoxi-alkil-csoport, előnyösen metoxi-etil-csoport;

-NR³R⁴ általános képletű csoport, ahol R³ jelentése a fenti,

R³ és R⁴ a kapcsolódó nitrogénatommal együtt 5-6 tagú heterociklusos gyűrűt képez, amely további heteroatomként oxigénatomot, kénatomot vagy nitrogénatomot tartalmaz, előnyösen morfolingyűrű,

Y jelentése -O-Si(R)₂-, -OCH₂-, C(O)NR- vagy

OCH₂-C(O) képletű csoport, ahol R jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, arilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport, n értéke 5-60 közötti, előnyösen 10-40 közötti, különösen előnyösen 15-25 közötti egész szám, azzal jellemezve, hogy

b) az oligonukleotidot ffagmensekből azonos módon felépítjük, majd az a) vagy b) pont szerint előállított oligonukleotidról a további funkciós csoportok védelmére adott esetben ideiglenesen felvitt egy vagy több védőcsoportot lehasítjuk, és a kapott (I) általános képletű oligonukleotidot kívánt esetben fiziológiailag alkalmazható sóvá alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű oligonukleotidok előállítására, amelyek képletében

R² jelentése (IV) általános képletű csoport, és R¹ jelentése hidrogénatom,

R¹, illetve R² jelentése (III), illetve (IV) általános képletű csoport, vagy

R² jelentése hidrogénatom és

R¹ jelentése (III) általános képletű csoport, ahol utóbbi esetben W vagy Z jelentése oxigénatomtól eltérő, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű oligonukleotidok előállítására, amelyek képletében

W jelentése oxigénatom vagy

Z és W jelentése oxigénatom, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

HU 215 147 Β

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan (I) általános képletü oligonukleotidok előállítására, amelyek képletében

R² jelentése (IV) általános képletü csoport és R¹ jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan (I) vagy (II) általános képletü oligonukleotidok előállítására, amelyek az intracelluláris felvételt elősegítő, in vitro vagy in vivő riportercsoportként szolgáló és/vagy az oligonukleotid biológiai DNS-sel vagy RNS-sel végzett hibridizálása során a DNS-t vagy RNS-t kötés kialakításával vagy hasítással támadó csoportokkal vannak szubsztituálva, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

6. Eljárás egy vagy több, 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított vegyületet és adott esetben fiziológiailag alkalmazható, előnyösen intravénás vagy topikális adagolásra alkalmas segédanyagot tartalmazó készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy ezeket egy vagy több hordozóanyaggal keverjük, és a keveréket a megfelelő adagolási formára alakítjuk.

7. (I) vagy (II) általános képletü oligonukleotidok és ezek fiziológiailag alkalmazható sói, a képletben

R¹ jelentése hidrogénatom vagy (III) általános képletü csoport,

R² jelentése hidrogénatom vagy (IV) általános képletü csoport, ahol R¹ és R² közül legalább egyik jelentése hidrogénatomtól eltérő,

W és W’ jelentése egymástól függetlenül oxigénatom vagy kénatom,

Z és Z’ jelentése egymástól függetlenül O - vagy Sion, 1-18 szénatomos alkoxicsoport, előnyösen 1-8 szénatomos alkoxicsoport, különösen előnyösen 1-3 szénatomos alkoxicsoport, elsősorban metoxicsoport; 1-18 szénatomos alkilcsoport, előnyösen 1-8 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyösen 1 -3 szénatomos alkilcsoport, elsősorban metilcsoport; -NHR³ általános képletü csoport, ahol

-NR³R⁴ általános képletü csoport, ahol R³ jelentése a fenti,

Y jelentése -O-Si(R)₂~, -OCH₂-, C(O)NR- vagy

OCH₂-C(O) képletü csoport, ahol R jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, arilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport, n értéke 5-60 közötti, előnyösen 10-40 közötti, különösen előnyösen 15-25 közötti egész szám.

8. A 7. igénypont szerinti (I) általános képletü oligonukleotidok, amelyek képletében

R² jelentése (IV) általános képletü csoport, és R¹ jelentése hidrogénatom,

R¹, illetve R² jelentése (III), illetve (IV) általános képletü csoport, vagy

R² jelentése hidrogénatom és

R¹ jelentése (III) általános képletü csoport, ahol utóbbi esetben W vagy Z jelentése oxigénatomtól eltérő.

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti (I) általános képletü oligonukleotidok, amelyek képletében

W jelentése oxigénatom vagy

Z és W jelentése oxigénatom.

10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képletü oligonukleotidok, amelyek képletében R² jelentése (IV) általános képletü csoport és

R¹ jelentése hidrogénatom.

11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti (I) vagy (II) általános képletü oligonukleotidok, amelyek az intracelluláris felvételt elősegítő, in vitro vagy in vivő riportercsoportként szolgáló és/vagy az oligonukleotid biológiai DNS-sel vagy RNS-sel végzett hibridizálása során a DNS-t vagy RNS-t kötés kialakításával vagy hasítással támadó csoportokkal vannak szubsztituálva.

12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti (I) vagy (II) általános képletü oligonukleotidok hibridizáló kémiai, kettős szálú vagy egyszálú nukleinsavakra történő kötődésen alapuló, és a nukleinsavak biológiai funkciójának szabályozására vagy elnyomására, valamint vírusos genomfunkciók szelektív elnyomására, vírusfunkciók megelőzésére vagy kezelésére, onkogén funkciók elnyomására, vagy rákos betegségek kezelésére szolgáló eljárásban történő alkalmazásra.

13. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, 7-11. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet és adott esetben fiziológiailag alkalmazható, előnyösen intravénás vagy topikális adagolásra alkalmas hordozóanyagot és/vagy segédanyagot tartalmaz.