SK279544B6

SK279544B6 - H výrobya farmaceutické prostriedky s ich obsahom

Info

Publication number: SK279544B6
Application number: SK2014-91A
Authority: SK
Inventors: Hannelore R�Sch; Anja Fr�Hlich; Jose F. Ramalho-Ortigao; Matthias Montenarh; Hartmut Seliger
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 1998-12-02
Also published as: EP0464638A3; IL98672A0; IE912309A1; HUT62010A; DE59108644D1; FI913169A0; CZ285408B6; PT98169A; EP0464638B1; DK0464638T3; ES2099718T3; NO912585L; NZ238769A; KR100200400B1; IL98672A; JP3186795B2; FI913169A; AU647143B2; CA2045891C; ZA915056B

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka biológie, konkrétne analógov oligonukleotidov s terminálnymi 3 '-3prípadne 5 '-5 '-internukleotidovými väzbami.

Doterajší stav techniky

Ako oligonukleotidy s reťazcom p^rot> zmyslu kódu sa označujú fragmenty nukleových kyselín, ktorých reťazec ie komplementárny ku kódovému reťazcu v zmysle kódu mRNA, prípadne ku kódogénnemu reťazcu DNA. Takéto oligonukleotidy sa vo vzrastajúcej miere používajú na inh¹ biciu expresie génov in vitro alebo v bunkových kultúrových systémoch. Použitie týchto látok v medicínsko - terapeutickej oblasti, napríklad ako protivírusových farmák, je predmetom rozsiahleho výskumu.

V biológii sú už dlho známe RNA reťazce proti zmyslu kódu ako prírodné regulátory expresie génov v prokaryotických organizmoch (T. Mizuno, M. Y. Chou a M. Inouye, Proc. Natl. Acad. _Sci USA 81, 1966- 1970 (1984) a tiež v eukaryotických organizmoch (S. M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771 - 6772 (1986)). Spôsobujú inhibovanie translácie hybridizáciou príslušných mRNA. V mnohých experimentoch bolo možné medzitým dokázať, že tieto RNA reťazce proti zmyslu kódu, keď sa injikujú v baktériách (A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi a M. Inouye, PNAS USA 83, 7726 - 7730 (1986)) alebo eukaryotických bunkách (J. G. Izant a H. Weintraub, Celí 36, 1007 - 1015 (1984)), i tam môžu brániť expresii génov a ukazujú tak protivírusový (L. J. Chang a C. M. Stolzfus, J. Virology 61, 921 - 924 (1987), ako aj protinádorový úč*‘ nok (J. T. Holt, T. V. Gopal, A. D. Moutton a A. W. Nienhuis, PNAS USA 83, 4794 - 4798 (1986). Pre tieto výskumy majú syntetické oligonukleotidy proti biologickým RNA proti zmyslu kódu výhodu väčšej stability a ľahšej prístupnosti. Ľahšia prístupnosť je dôsledkom zlepšenej techniky syntézy v poslednom čase, ktorá dnes relatívne ľahko sprístupňuje kratšie oligoméry (s napr. 12 - 30 bázami) (E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14, 274 - 325 (1986), Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, str. 7fí).

Ukázalo sa, že už takéto krátke oligoméry sú účinné ^a ko modulátory expresie. Okrem toho môžu tieto oligonukleotidy tiež pôsobiť väzbou na DNA-dvojitý reťazec za vzniku trojitého helixu. Aby sa oligonukleotidy s reťazcom proti zmyslu kódu a oligonukleotidy vo forme triplexu mohli nasadiť v biologických systémoch, musia však byť splnené nasledujúce predpoklady (Oligodeoxynukleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, str. lff).

1· musia byť jednak dobre rozpustné vo vode, a jednak ľahko prechádzať lipofílnou bunkovou membránou

2- musia byť vo vnútri bunky dostatočne stabilné proti odbúraniu, t. j. stabilné proti nukleázam

3. musia s intrabunkovými nukleovými kyselinami pri fyziologických teplotách tvoriť stabilné hybridy

4- hybridizácia musí byť selektívna; rozdiel disociačnej teploty k oligonukleotidu, ktorý poskytuje defektne párovanie, musí byť dostatočne veľký, aby sa posledné mohlo ešte špecificky vymývať.

V r. 1978 mohli Zamecznik a Stephenson, PNAS USA 75, 280 - 284 a 285 - 288 (1978) prvýkrát ukázať, že n^e‘ modifíkované oligonukleotidy môžu obmedzovať vírusy Rous Sarcom. Oligonukleotidy boli však použité vo veľmi vysokých koncentráciách, preto boli experimenty väčšinou vykonávané vo vopred vyhriatych médiách, aby sa nukleá^ΖΥ inaktivovali. Nutnosť týchto opatrení sa vysvetľuje rýchlym enzymatickým odbúraním, ktorému sú cudzie nukleové kyseliny v sére a bunkách vystavené.

Preto sa už skôr vykonávali pokusy s cieľom modifik⁰vať oligonukleotidy štruktúrne tak, aby lepšie spĺňali m^e_nované požiadavky, hlavne aby boli lepšie chránené proti nukleázovemu odoúraniu. Tieto pokusy sa predovšetkým koncentrujú na modifikáciu fosfodiesterovej intemukleotidovej väzby, pretožp táto je posledným koncom pôsobiska všetkých nukleáz. Štruktúrne modifikované intemukleotidové väzby sa zásadne môžu deliť na

a) nukleozidové väzby s fosforom ako centrálnym atómom. Tieto opäť môžu byť

- iónovo/chirálne

- iónovo/achirálne -neutrálne/chirálne.

b) neutrálne/achirálne bezfosforové nukleozidové väzby.

K štruktúrne modifikovaným, ako skôr k iónovým intemukleozidovým väzbám, patria tiofosfátové a ditiofosfátové väzby. Tiofosfátom modifikované oligonukleotidy (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression. J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, str. 97ff) ukazujú toho času najlepšie efekty inhibície expresie génov v bunkových kultúrach, no nezdá sa, že je táto inhibícia viazaná na špecifický reťazec, pretože i takéto tiofosfátmi modifikované oligonukleotidy ukazujú inhibičné efekty, ktoré pozostávajú len zo základu nukleovej kyseliny, napríklad tiofosfátové analógy oligocytidylátu. Ohraničením pre nasadenie tiofosfátom modifikovaných oligonukleotidov je ďalej ich chiralita.

Pretože pri príprave oligonukleotidov s n bázou 2”’’ sa tvoria diastereoméry, má iba najmenší podiel preparátu obsahujúceho tiofosfátové väzby dobré hybridizačné vlasínosti.

Pri oligonukleotidoch s ditiofosfátovými intemukleozidovými väzbami (A. Grandas, William S. Marshall, John Nieísen a Martin M. Caruthers, Tetrahedron Lett. 20, 543 - 546 (1989), G. M. Porritt, C. B. Reese, Tetrahedron Lett. 30, 4713 - 4716 (1989)), sa problém chirality obchádza. Tieto zlúčeniny však sú doteraz prístupné iba pomocou komplikovaných a stratových mnohostupňových syntéz. Preto sa doteraz nemohli vykonávať rozsiahle pokusy s ohľadom na hybridizačné správanie predovšetkým v buⁿ kových kultúrach.

Ďalšou triedou chemicky modifikovaných oligonukleotidov sú oligonukleotidy sneiónovými, t.j. neutrálnymi intemukleozidovými väzbami. K tomuto druhu modifikovaných štruktúr patria oligonukleotidy s fosfotriesterovými alebo metylfosfonátovými intemukleozidovými väzbami (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, str. 79ff).

Obom triedam zlúčenín je spoločné, že ionizovateľný fosfátový zvyšok je nahradený nenabitou skupinou. Zavedením takejto väzby sa stávajú oligonukleotidové analógy rezistentné proti nukleázam, sú však nevýhodné pre zlú rozpustnosť vo vodnom prostredí.

Oligonukleotidy s neutrálne/achirálnou intemukleozidovou väzbou sa doteraz mohli získavať iba tým, že atóm fosforu intemukleozidovej väzby bol nahradený iným centrálnym atómom. Väzbe esteru kyseliny fosforečnej je p°” dobná siloxanová väzba. Oligonukleotidy so siloxanovymi intemukleozidovými väzbami (K. K. Ogilvie, J. F. Cormier, Tetrahedron Lett. 26, 4159 (1985), H. Seliger, G. Feger, Nucl. Nucl. 6 (1982), 483 - 484 (1987), boli syntetizované a sú stabilné proti nukleázam.

Oligonukleotidy s uhličitanovými, acetalovými alebo karboxamidovými intemukleozidovými väzbami sú známe z M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 31, 2385 - 2388 (1990), J. R. Tittensor, J. Chem. Soc. C. 1971, str. 2656 a J. Coull et al., Tetrahedron Lett. 28, 745 (1987).

Nukleázovo rezistentné analógy nukleotidov sa mohli tiež vyrábať bez zmeny fosfodiesterovej intemukleotidovej Stým, že boli nasadené cukrové zvyšky zmenenej gurácie. To sa vykonalo syntézou oligonukleotidových analógov, pri ktorých sú nukleobázy viazané aglykozidicky (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, str. 119ff). Tieto analógy oligonukleotidov však sú preparatívne ťažko prístupné, pretože sa musia stavať od cukrov a báz. Okrem toho majú, pokiaľ ide o zmysel smeru hybridi_zá_cie, čiastočne nenormálne správanie.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú oligonukleotidy vzorcov (I) alebo (II),

O

•ΚΙ!²

---------------1---------------------------------------------1 z - P « f í¹)

kde

R¹ znamená vodík alebo zvyšok vzorca (III)

<ra>

R² znamená vodík alebo zvyšok vzorca (IV)

o

I Z’ - I «' pričom však aspoň jeden zo zvyškov R¹ alebo R² predstavuje zvyšok vzorca (III) alebo (IV),

B predstavuje bázu, ako napríklad prírodnú bázu ako adenín, tymín, cytozín, guanín alebo neprírodné bázy, ako napríklad purín, 2,6-diaminopurín, 7-deazaadenín, 7-deazaguanín, N⁴-etanocytozín, prípadne ich prekurzorové formy W a W' nezávisle od seba znamenajú kyslík alebo síru,

Z a Z' nezávisle od seba znamenajú O; S; alkoxyskupinu s 1 až 18 atómami uhlíka, výhodne alkoxyskupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, obzvlášť výhodne alkoxyskupinu s 1 až 3 atómami uhlíka, hlavne metoxyskupinu; _aikyi s 1 až 18 ^a_tómami uhlíka, výhodne alkyl s 1 až 8 atómami uhlíka, najmä výhodne alkyl s 1 až 3 atómami uhlíka, hlavne ^me_tyl; NHR³ s R³ znamenajú výhodne _aikyl s 1 až 18 atómami uhlíka, obzvlášť výhodne alkyl s 1 až 8 atómami uhlíka, hlavne alkyl s 1 až 4 atómami uhlíka alebo alkoxy-alkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v alkoxyzvyšku a s 1 až 6 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku, výhodne metoxyetyl; NR³R⁴, kde R³ má uvedený význam a R⁴ znamená výhodne alkyl s až 18 atómami uhlíka, najmä výhodne alkyl s 1 až 8 at°mami uhlíka, hlavne _a|kyl s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo kde R³ a R⁴ spolu s nosným atómom dusíka znamenajú 5až 6-členný heterocyklický kruh, ktorý môže navyše obs^a~ hovať ďalší heteroatóm z radu O, S, N, ako napríklad morfolín,

Y znamená zvyšok z radu -O-Si(R)₂, OCH₂, C(O)NR alebo OCH₂-C(O), kde R predstavuje _alkyi _s j až 6 atómami uhlíka, aryl alebo cykloalkyl s 5, prípadne 6 atómami uhlíka, a n znamená celé číslo 5 až 60, výhodne 10 až 40 a hlavne 15 až 25, ako aj ich fyziologicky znášanlivé soli.

Pod arylom sa v tejto súvislosti chápu napríklad fenyl, fenyl substituovaný (1- až 3- krát) alkylom s 1 až 6 atómami uhlíka, alkoxyskupinou s 1 až 6 atómami uhlíka a/alebo halogénom.

Prednosť majú oligonukleotidy vzorca (I).

Ďalej sú výhodné oligonukleotidy vzorca (I), v ktorom R² znamená zvyšok vzorca (IV) a R¹ znamená vodík; R¹, prípadne R² znamená zvyšok vzorcov (III), prípadne (IV); alebo R² znamená vodík a R¹ zvyšok vzorca (III), pričom buď W, alebo Z ^v poslednom prípade neznamenajú kyslík.

Obzvlášť i e ďalej potrebné menovať oligonukleotidy vzorca (I), kde W znamená kyslík alebo Z a W obidva predstavujú kyslík.

Celkom obzvlášť výhodné sú oligonukleotidy vzorca (I), kde R² predstavuje zvyšok vzorca (IV) a R¹ znamená vodík.

Ďalej je potrebné menovať oligonukleotidy vzorcov (I) a (II), ktoré sú navyše substituované skupinami, ktoré podporujú intrabunkové absorpcie, ktoré slúžia ako značiace skupiny in vitro alebo in vivo a/alebo skupiny, ktoré pri hybridizácii oligonukleotidu na biologické DNA alebo RNA tieto molekuly DNA alebo RNA napádajú za viazania alebo štiepenia.

Ako príklad skupín, ktoré podporujú intrabunkovú absorpciu, sú lipofilné zvyšky, ako alkylové zvyšky napríklad až s 18 atómami uhlíka alebo cholesteryl alebo konjugáty, ktoré využívajú prírodné prcnášacie systémy, ako napríklad kyselinu žlčovú alebo peptidy pre príslušné receptory (napr. endocytózu).

Príkladmi pre značiace skupiny sú fluoreskovacie skupiny (napríklad akridinyl, danzyl, fluoresceinyl) alebo chemiluminiscenčné skupiny, ako napríklad akridíniumesterové skupiny.

Oligonukleotidové konjugáty, ktoré nukleové kyseliny viažu a/alebo štiepia, obsahujú akridin (N. Thuong et al., Tetrahedron Lett. 29, str. 5905, (1988), psoraly (U. Peiles et al., Nucleic Acid Res. zv. 17, str. 285, 1989) alebo chlóretylaminoarylové konjugáty (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989, str. 173ff).

Charakteristická štruktúrna modifikácia oligonukleotidov podľa vynálezu spočíva vtom, že intemukleotidové väzby na obidvoch koncoch reťazca sú zmenené, t. j. sú miesto biologických 3'-5 -väzieb väzby 3'-3'-, prípadne 5'-5'-. Prekvapujúco sa zistilo, že táto minimálna štruktúrna modifikácia stačí, aby sa tieto zlúčeniny stabilizovali proti nukleázovému odbúraniu.

Ako sa opisuje ďalej, spôsobuje táto 'ha malá štruktúrna modifikácia hybridizačné správanie, ktoré sa takmer rovná správaniu biologických oligonukleotidov. Z toho tiež vyplýva všeobecná použiteľnosť týchto zlúčenín ako expresie génov v bunkových kultúrach.

Z literatúry nie je doteraz známa žiadna zmienka o výrobe analógov oligonukleotidov s 3'-3'- a 5'-5' intemukleozidovými väzbami na obidvoch koncoch reťazca a ich nasadenie ako antisenzné oligonukleotidy. Analógy dinukleo

SK 279544 Β6 zidfosfátov, ktoré obsahujú 3'-3 - alebo 5'-5 - väzby, boli získané a skúšané už pred mnohými rokmi ako hlavné produkty (A. Myles, W. Hutzenlaub, G. Reits a W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2857 - 2871 (1975); H. Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub a W. Pfleiderer, Chem. Ber. 2872 - 2877 (1975)), J. Tomasz, Nucl. Nucl. 2(1), 51 - 61 (1983); M. Nemer, N. Theriault, A Schifmann a K. K. Ogilvie, VI th Intemational Round Table, Nucleosides, Nucleotides and their biological Applications, La Grande Motte, ed. J. L. Imbach, 94 - 96 (1984)), prípadne ako vedľajšie produkty (R. Letsinger, K. k. Ogilvie, J. Amer. Soc. 89, 4801 - 4802 (1967)). Tieto diméry však na základe príliš nízkej teploty topenia zásadne nie sú spôsobilé na stabilnú hybridizáciu bunkovými nukleovými kyselinami. Oligonukleotidy, ktoré majú 5'-5-väzbu iba na jednom konci, boli pripravené, aby sa zaviedlo príchytné miesto pre značiace skupiny pri genetických sondách (S. Agrawal, C. Christodoulou, M. J. Gait, Nucleic Acids Res. 14, 6227 - 6245 (1986)). Doteraz sa však neskúšali na svoje hybridizačné správanie. Na biofyzikálne skúšky sa pripravili samokomplementáme oligonukleotidy, ktoré uprostred molekuly majú jednotlivú 3'-3'-, prípadne 5'-5'- väzbu (J. H. van de Sande, N. B. Ramsin, M. W. Germán, W. Elhorst, B. W. Kalisch, E. V. Kitzing, R. T. Pon, R. C. Clegg, T. M: Jovin, Science 241, 551 -557(1988)).

Príprava oligonukleotidov s terminálne invertovanou 3'-3'- a 5'-5'-väzbou sa vykonáva rovnakým spôsobom ako syntéza biologických oligonukleotidov v roztoku alebo v pevnej fáze, prípadne s pomocou automatického syntézneho prístroja.

Predmetom vynálezu je teda ďalej spôsob výroby oligonukleotidov vzorca (I), ktorý spočíva v tom, že sa

a) nukleotidová jednotka s 3'- , prípadne 5'-terminálnymi skupinami fosforu (111) alebo fosforu (V), alebo jej aktivovaný derivát nechá reagovať s ďalšou nukleotidovou jednotkou s 3'-, prípadne 5'- terminálne voľnou hydroxyskupinou, alebo

b) oligonukleotid pripraví z fragmentov rovnakým spôsobom, v oligonukleotidoch získaných podľa (a) alebo (b), sa prípadne jedna alebo niekoľko ochranných skupín zavedených dočasne na ochranu ostatných funkcii odštiepi a takto získané oligonukleotidy vzorca (I) sa prípadne prevedú na svoju fyziologicky znášanlivú soľ.

Ako východiskový komponent na výrobu oligonukleotidov s terminálne invertovanou 3'-3'-väzbou sa na syntézu pevnej fázy nasadí nosná živica, na ktorej je cez 5-OH skupinu viazaný prvý nukleozidový monomér. Na výrobu tohto komponentu sa použije nosná živica vyrobená metódami známymi z literatúry (T. Atkinson, M. Smith v Oligonucleotide Synthesis, M. J. Geit (ed.), 35 - 49 (1984)), hlavne silikagél alebo regulované pórovité sklo, ktoré je funkcionalizované aminoskupinami. Nechá sa reagovať s nukleozidovým derivátom chráneným na nukleobáze a na 3-OH skupine, ktorý bol najprv premenený na 5'-p-nitro-fenylsukcinát. Ako bázické ochranné skupiny sa používajú hlavne acylové skupiny, napríklad benzoyl, izobutyryl alebo fenoxyacetyl. Poloha 3' sa výhodne chráni dimetoxytritylovou ochrannou skupinou, ktorá sa môže zavádzať podľa M. D. Matteucci, M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 21 (1980), str. 3243 - 3246. Ďalšia skladba oligonukleotidového reťazca až k predposlednému reťazcovému členu sa vykonáva metódami známymi z literatúry, výhodne s použitím na 5'-OH skupine dimetoxytritylovými skupinami chránených esteramidov kyseliny nukleozid-3-fosforitej alebo nukleozid-3'-H-fosfonátov. Ako posledný člen reťazca sa opäť nasadí na 3'-OH skupine výhodne dimetoxytritylom chránený esteramid kyseliny nukleozid-5'-fosforitej, prípadne nukleozid-H-fosfonát. Príprava takéhoto oligonukleotidového reťazca s terminálne prevrátenými internukleotidovými väzbami je ďalej znázornená schematicky (fosforamidicyklus na prípravu oligonukleotidov s 3'-3'- a 5'-5'-väzbami na koncoch). Príprava oligonukleotidov s 3'-3’- alebo 5'-5-väzbami sa vykonáva zodpovedajúcim spôsobom.

Štruktúrna a reťazcová analýza sa vykonáva tým spôsobom, že sa oligonukleotid s 3 '-3a 5 '-5 '-koncami najprv terminálne označí. To sa vykoná rádioaktívnym značkovaním, výhodne pomocou 5'-T-³²P-ATP/polynukleotidkinázy. Toto rádioaktívne značkovanie sa vykoná na voľnej 5'-OH-skupine, t, j. proti oligonukleotidu s iba biologickou 3-5'-väzbou na opačnom konci nukleotidového reťazca. Reťazcová analýza sa potom vykoná postupom známym z literatúry, výhodne pre bázu špecifickým, štatistickým štiepením, ako je opísané (A. M. Maxam a W. Gilbert, Methods in Enzymology 65, 499 - 560 (1980)).

Na základe rádioaktívneho značkovania na „opačnom“ konci molekuly sa teraz vykoná tiež odpočítanie reťazca, porovnaním s oligonukleotidom s biologickou 3'-5-väzbou v opačnom smere. Opis vykonania testu je uvedený v príklade 6.

Oligonukleotidy vzorcov (I) a (II) sa používajú pre hybridizačno - chemické, na adíciu pri nukleových kyselinách s dvojitým alebo jedným reťazcom spočívajúce postupy regulácie alebo potlačenie biologickej funkcie nukleových kyselín, na selektívne potláčanie expresie virálnych funkcií genómu a na profylaxiu a terapiu vírusových funkcií, na potláčanie nádorových funkcií a na terapiu rakovinových ochorení.

Ako miera stability in vivo sa môže pokladať správanie v krvnom sére rozpusteného, podľa vynálezu stavaného oligonukleotidu vzorca (f) alebo (II). Všeobecný test je opísaný v príklade 7; zodpovedajúci test in vitro s roztokom fosfodiesterázy hadieho jedu v príklade 8. Oligonukleotidy

SK 279544 Β6 podľa vynálezu sa v protiklade k 3'-5'-oligonukleotidom odbúravajú oveľa pomalšie.

Príklad 11 demonštruje sérovú stabilitu oligonukleotidov s terminálne invertovanou 3'-3'-väzbou.

Hybridizačné správanie vyplýva z modelových pokusov, ako je opísané v príklade 9,v ktorých rad SV-40-špecifických reťazcov, ktoré podľa vynálezu boli pripravené vždy s 3'-3'- a 5 -5 -kočom, v hybridizácii so zodpovedajúcim reťazcom oproti zmyslu kódu SV40-DNA ukazujú teplotu topenia, ktorá je nepodstatne nižšia ako teplota topenia, ktorá sa meria pri hybridizácii so zodpovedajúcim reťazcom, ktorý· nebol stavaný podľa vynálezu, t. j. bez 3'-3'- a 5'-5-koncov.

Účinnosť oligonukleotidov opatrených podľa vynálezu terminálnymi 3'-3', prípadne 5'-5'-väzbami, ako inhibítory expresie génov, vyplýva z potláčania rastu vírusu SV40 (príklad 10) ako i z inhibície in vitro expresie nádorového produktu p53 (príklad 12).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Syntéza esteramidu kyseliny 3'-O-DMTr-dezoxyribonukleozid-5'-(N,N-bis-diizopropyl-amino-P-kyanoetoxy)-fosforitej

Reakčná schéma vychádzajúca z bázami chránených nukleozidov je znázornená takto.

DíJTrO

OH la-d acro- a (N

WtlrO

ZnBr, ------²----> nltrooetán

3a-d

2a-d

Prehľad obrázkov na výkresoch

P-0p/

A

Obr. 1 - Autorádiogram analýzy reťazca SV40TS17, SV40TAS17 a SV40TAS17 ( 3-3,5 -5')

Obr. 2 - Autorádiogram štiepenia dľ_2[), prípadne dT₂₀ ( 3'-3',5 -5'), ľudským sérom zľava :

dT₂₀ : reakcie po 0, 5, 8, 11, 15 a 30 min. dľ₂₀ ( 3'-3',5 -5') : reakcie po 0, 5, 8, 11, 25, 30 a 90 min.

Obr. 3 - Autorádiogram SVpdE - štiepenia: zľava : dT₂₀, dT₂₀ ( 3'-3',5 -5'), štiepenie dľ₂₀ (3'-3',5 -5') po 5, 15, 30, 45, 60 a 90 min.

mix z 0 min./ 15 min. , mix z 0 min./30 min., štiepenie dT₂₀ po 5, 15, 30 a 45 min.

Obr. 4 - Modulácia expresie T-AG oligonukleotidom s reťazcom proti zmyslu kódu

Línia 1 : celyzát po inhibícii s 30μΜ SV40TAS17 (3'-3',5 -5'),

Línia 2 : celyzát bez inhibície

Obr. 5 - Sérová stabilita oligonukleotidu Xelev 1 (Kloň 6 a 7) a Xelev 2 (Kloň 8 a 10)

Čas inkubácie so sérom

Kloň 6 a 8 : ......—..... 0 minút minút

------- 30 minút ............. 45 minút

Kloň 7 a 10 : 60 minút hodín

------- 72 hodín

............. nepoužitý pruh

Obr. 6 - Zastavenie biosyntézy onkoproteínu p53

TNV - oligonukleotidom s reťazcom proti zmyslu kódu a----------- : bez oligonukleotidu b .................. : 30 μΜ s reťazcom v zmysle kódu mer c .............................................. : 1 μΜ s reťazcom proti zmyslu kódu mer d : 10 μΜ s reťazcom proti zmyslu kódu mer

4e-d a: B = tymín b: B = N^s-benzoyladenín c: B = N⁴-benzoylcytozín d: B = N²-izobutyrylguanin DMTr = 4,4'-dimetoxytrityl

A. Príprava 3'-5'-0-bis-DMTr-dezoxyribonukleozidu 2 Násada:

mmól dT, dA^bz, dC^bz alebo dG^lb“

14,4 mmól DMTr-Cl

14,9 mmól TEA aba.

Dezoxyribonukleozid 1 sa rozpustí v 50 ml absolútneho pyridínu a pri 0 °C sa pridá trietylamín a dimetoxytritylchlorid. Potom sa 24 hodín mieša pri teplote miestnosti, pričom sa reakcia sleduje chromatografiou na tenkej vrstve (rozpúšťadlo: CH₂Cl₂/MeOH 9 : 1). Reakcia sa skončí pridaním metanolu, rozpúšťadlo sa odtiahne a zvyšok sa vyberie do dichlórmetánu. Organická fáza sa niekoľkokrát premyje 1 M roztokom (NH4)HCO₃ a vodou, suší sa Na₂SO₄ a odstredí sa.

3'-5'-ditritylovaný produkt 2 sa môže čistiť od prebytočného tritanolu, prípadne 5'-DMTr-dN stĺpcovou chromatografiou (stĺpcový materiál: silikagél 60H, eluačný prostriedok: CH₂C1₂ so stúpajúcim obsahom metanolu, pričom sa pri 1 - 1,5 % MeOH eluujú ditritylované dezoxynukleozidy.

Výťažok: 73 - 85 % teórie.

B. Špecifické odštiepenie 5'-dimetoxytritylovej skupiny Literatúra: M. D. Mateucci a M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 3243 - 3246 (1980)

Násada:

mmól 3'5'-O-bis-DMTr-dN 2 mmól ZnBr₂

200 ml absolútneho nitrometánu

Roztok 3'-5'-O-bis-DMTr-dN 2 v 100 ml nitrometánu sa pri 0 °C dá k suspenzii bromidu zinočnatého v ďalších 100 ml nitrometánu. V prípade chráneného dezoxyadenozínu bola reakcia ďalej vedená za chladenia, aby sa zamedzilo depurinizácii. Napriek tomu je pri tomto nukleozide odštiepenie úplné už po 60 minútach, ako je možné zistiť chromatografiou na tenkej vrstve. Pri tymidíne a dezoxyguanozíne je rovnako reakcia skončená pri teplote miestnosti po 60 minútach, zatiaľ čo 5'-detritylácia bis-DMTr-dezoxycytidínu prebieha len neúplne. Tu sa reakcia prerušila po 3 hodinách, aby sa zabránilo odštiepeniu tiež 3'-dimetoxy-tritylovej skupiny.

Prerušenie reakcie sa vykoná pridaním 200 ml 1 M roztoku NH₄Ac; produkt 3 sa extrahuje 200 ml CH₂C1₂, organická fáza sa ešte premyje nasýteným roztokom NaCl a vodou, suší sa Na,SO_{4 a} rozpúšťadlo sa oddestiluje vo vákuu.

Hlavné množstvo tritanolu sa môže oddeliť vyzrážaním surového produktu v cca 500 ml n-hexánu pri -15 °C. Či^s_tenie sa vykoná chromatograficky cez stĺpec silikagélu 60H dichlórmetánom so stúpajúcim obsahom metanolu ako eluačným prostriedkom.

Hodnoty R_f 3'-MDTr-dezoxyribonukleozidov sa odlišujú od zodpovedajúcich 5'-tritylovaných monomérov takto (rozpúšťadlo: CH’CUMeOH 24 : 1).

	3’-DMTr-dN	'5’-ĽíMTr-dN “
dT		TJ71
Da^b2	0,55
		Ten
ΊΚΓ™		TR

Výťažky: 48 - 65 % teórie.

C. Príprava esteramidu kyseliny 3 -O-DMTr-dezoxytribonuklcozid 5 '-0-(N,N-diizopropylamino-P-kyanoetoxy)-fosforitej 4.

Literatúra: H. Koster, Nucleic Acids Res. 12, 4539 - 4557 (1984) Násada:

mmól 3 '-O-DMTr-dezoxyribonukleozidu 3

1,5 mmól chloro-N,N-diizopropylamino-B-kyanoetoxyfosfínu mmól diizopropylamínu

Fosfrtylačné reakcie boli vykonané analogicky metóde opísanej Kosterom et al. na výrobu esteramidu kyseliny 5'-Ó-DMTr-dezoxytribonukleozid-3'-0-fosforitej. Na rozpustenie chránených nukleozidov v absolútnom CH₂C1₂ bol pod argónom pridaný diizopropylamín, potom fosforylačný prostriedok. Po 30 minútach bola reakcia skončená prid^a ním 30 ml etylacetátu, roztok 3x extrahovaný nasýteným roztokom NaCl, organická fáza sušená Na₂SO₄ a rozpúšťadlo oddestilované vo vákuu. Surový produkt bol čistený stĺpcovou chromatografiou (stĺpcový materiál: silikagél 60H, eluačný prostriedok: petroleter/dichlórmetán/trietylamín 45 : 45 : 10).

Výťažok 4a: 93 % teórie.

Príklad 2

Príprava tymidilyl-tymidínu a 3'-3'-fosfodiesterovou väzbou

Ďalej je uvedený priebeh reakcie na prípravu dimémeho bloku

UCCBjCHjO^ x MftO— J f ^°\Ι \ / * ΓΟΗ

A) Príprava 5 '-O-dimetoxytrityltymidínu 5

Násada:

mmól tymidínu (4,84 g) mmól 4,4'-dimctoxytritylchloridu (8,2 g) mmól dimetylaminopyridinu (122 mg) mmól abs. trietylamínu (3,8 ml)

Príprava sa vykoná metódou R. A. Jonesa (G. S. Ti, B. L. Gaffney and R. A. Jones, H. Amer. Chem. Soc. 104, 1316 - 1319 (1982)). Tymidín sa suší 3-násobným odparením vždy s 50 ml absolútneho pyridínu, vyberie sa do 100 ml nyridínu a za chladenia ľadom sa pridá 4,4'-DMTr-C1 a DMAP ako katalyzátor. Reakcia sa kontroluje chromatografiou na tenkej vrstve (rozpúšťadlo CHÁ-VMeOH 9 : 1). Po 4 hodinách je možné reakciu prerušiť pridaním 100 ml vody. Roztok sa 3x extrahuje éterom, organická fáza sa suší a odstredí, a zvyšok sa čistí prekryštalizovaním z benzénu.

Výťažok: 9,68 g DMTr-dT (89 %)

B) Príprava esteramidu kyseliny 5'-O-dimetoxytrityltymidin-3 '-0-(N,N-diizopropylamino-3-kyanoetoxy)-fosforitej 6

Príprava a čistenie 6 sa vykonáva primerane syntéze esteru Kyseliny 3'-0-DMTr-5'-0-fosforitej 4 (príklad 1, C).

C) Príprava 5 '-O-acetyltymidínu 8 Násada:

2,0 mmól 3 '-Ο-DMTr-dT 3a (1,1 g)

0,2 mmól dimetylaminopyridinu (12,2 mg) ml acetanhydridu

Literatúra: A. M. Michelson a A. R. Todd, J. Org. Chem. 1955, 2632 - 2638 (modifikované)

K roztoku 3'-O-DMTr-dT a DMAP v 20 ml absolútneho pyridínu sa za chladenia ľadom prikvapká Ac₂O. Po 3 hodinách reakčnej doby je reakcia úplná (kontrola chromatograficky, rozpúšťadlo CH₂Cl₂/MeOH 24 : 1). Produkt sa vyzráža 400 ml ľadovej vody, biela zrazenina sa odsaje, premyje ľadovou vodou a suší sa.

Výťažok: 1,02 g 3 '-O-DMTr-5'-O-Ac-dT (88 %)

Na odštiepenie 4,4'-dimetoxytritylovej skupiny sa 7 pri teplote miestnosti mieša v 10 ml 80 % kyseliny octovej. Pridaním 100 ml ľadovej vody sa reakcia po 3 hodinách skončí; pritom 4,4'-dimetoxytritanol vypadne ako biela zrazenina. Odsaje sa a vodný filtrát sa odstredí. Olejovitý zvyšok sa vyberie do malého množstva CH₂C1₂ a pri -15 °C sa vyzráža v 200 ml n-hexánu.

Výťažok: 455 mg 5'-O-acetyltymidínu (94 %).

D) Príprava tymidilyl-(3'-3')-tymidínu 10

Násada:

1,0 mmól esteramidu kyseliny 5'-O-DMTr-tymidín-3’-0(N,N-diizopropylamino-p-kyanoetoxy)-fosforitej 6 (705,8 mg)

0,9 mmól 5'-O-acetyltymidínu 8 (253 mg)

2,6 mmól tetrazolu (182 mg)

9,0 mmól J₂(l,14g)

Syntéza dimérového bloku 10 sa môže vykonať metódou opísanou Kôsterom (H. Kóster, Nucleic Acids Res. 12, 4539 - 4557 (1984)) na výrobu 3'-5'-nukleoziddimé-rov. Zmes 5 -O-acetyltymidínu a tetrazolu sa rozpustí v 30 ml absolútneho CH₃CN a pod argónom sa dá k esteramidu kyseliny fosforitej. Pridá sa 9 mmól J₂ v 30 ml zmesi acetonitril/pyridín/voda (24 : 5 : 1) a po ďalších 15 minútach sa prebytočný jód redukuje 5 ml 40 % roztoku H₂SO₄. Roztok sa potom zahustí, zvyšok sa vyberie do CH₂C1₂, 2x sa premyje nasýteným roztokom NaHCO₃ a rozpúšťadlo sa oddestiluje. Surový produkt sa môže čistiť na stĺpcovej chromatografii (stĺpcový materiál: silikagél 60H, eluačný prostriedok: etylacetát/dichlórmetán 50 : 50).

Výťažok: 665 mg (75 %).

Na odštiepenie acetylovej a B-kyanoetylovej skupiny sa na dimér 1 hodinu pôsobí 5 ml koncentrovaného NH₃ pri teplote miestnosti, 4-4'-dimetoxytritylová skupina sa môže odstrániť 80 % kyselinou octovou.

Príklad 3

Príprava tymidilyl-tymidinu a 5 '-5-fosfodiesterovou väzbou 14

Nasledujúca schéma ukazuje prípravu 14

OH

MCC^CHjO^ >-n' λ

M

DiffrO

4«

OCHjCH^CN * Γ-Ο-Ρ-Ο-, T

L· M I ψθχ.1 \_J ⁰ \_/

0ΛΟ DKfrO

1. tetrasol

OH

OH OH

Jednotlivé reakčné kroky k syntéze medzistupftov sa vykonávajú metódami zodpovedajúcimi metódam opísaným v príklade 2.

Štruktúra obidvoch dimérových blokov sa môže vykonávať FAB-hmotovou spektrometriou a spektroskopiou lH-jadrovej rezonancie.

Príklad 4

Prichytenie 3 -O-dimetoxytrityl-dezoxyribonukleozid-5 -O-sukcinátu na nosnom materiáli CPG 10-1400

Funkcionalizácia CPG-nosiča 3-aminopropylovými reťazcami sa vykonáva podľa predpisu Atkinsona a Smitha (T. Atkinson, M. Smith v Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (ed.), 35-49(1984)):

A) Príprava 3'-0-DMTr-dezoxyribonukleozid-5'-0-sukcinátu 15

Násada:

1,0 mmól 3'-O-DMTr-dN 3

0,8 mmól anhydridu kyseliny jantárovej (80 mg)

0,5 mmól dimetylaminopyridínu (61 mg)

Reakcia anhydridu kyseliny jantárovej s 5 '-OH skupinou dezoxyribonukleozidu sa vykonáva cez noc pri teplote miestnosti vždy v 5 ml absolútneho pyridínu s DMAP ako katalyzátorom. Po skončení reakcie sa roztok zahustí a pyridín sa odstráni 3-násobnou azeotropnou destiláciou s toluénom. Zvyšok sa vyberie do dichlórmetánu, premyje sa ľadovo studeným roztokom kyseliny citrónovej (10 %) a H₂O a organická fáza sa odstredí vo vákuu. Surový produkt sa rozpustí v cca 3 ml toluénu a vyzráža sa v 200 ml hexánu.

Výťažok: 79-84%.

B) Príprava 3'-O-DMTr-dezoxyribonukleozid-5'-O-sukcinyl-P-nitrofenylesteru a zachytenie na nosiči (pozri nasledujúcu schému)

i o-sio

-©-°-V0x?

DMTxO

Násada:

0,8 mmól 3 -O-DMTr-dN-5 '-O-sukcinátu 15

0,8 mmól p-nitrofenolu (112 mg)

2,0 mmól dicyklohexylkarbodiimidu (412 mg) g funkcionalizovaného CPG 10-1400

Chránený sukcinylovaný dezoxytribonukleozid sa dá k roztoku p-nitrofenolu v 5 ml absolútneho dioxánu a, 0,2 ml pyridínu, a potom sa pridá DCC1 ako kondenzačný prostriedok. Po krátkom čase vypadáva dicyklohexylmočovina a po 3 hodinách ukazuje chromatografia na tenkej vrstve (CH₂Cl₂/MeOH 9:1) úplné zreagovanie. Zrazenina sa pod argónom odsaje a filtrát sa priamo dá k suspenzii

SK 279544 Β6 funkcionalizovaného nosného materiálu v 15 ml absolútneho DMF. Pridá sa 0,8 ml trietylamínu a násada sa trepe cez noc. Zaťažený nosič sa potom odsaje, premyje metanolom a éterom a v exikátore sa suší.

Zaťaženie nosiča sa stanoví spektrometricky. Pôsobením 10 ml 0,1 N roztoku kyseliny p-toluénsulfónovej v acetonitrile na vzorku nosiča (cca 2 mg) sa 4-4'-dimetoxytritylkatión odštiepi a meraním absorpcie roztoku pri 498 nm sa podľa vzorca

OD_4M/ml x 10 ml x 14,3 (konšt) mg nosiča nechá vypočítať zaťaženie nosiča v pmól/g.

Výsledky: 3'-DMTr-dT-nosič: 23 pmól/g

3'-DMTr-dG^lbu-nosič: 21 pmól/g 3'-DMTr-dA^bz-nosič: 21 pmól/g

3'-DMTr-dC^bz-nosič: 15 pmól/g

Na blokovanie nezreagovaných aminoskupín sa zaťažený nosič 1 hodinu pri teplote miestnosti trepe s roztokom 1 ml anhydridu kyseliny octovej a 50 mg dimetylaminopyridínu v 15 ml absolútneho pyridínu, potom sa odsaje, premyje metanolom a éterom a suší sa.

Príklad 5

a) Syntéza oligonukleotidov s terminálnou 3'-3'- a 5'-5'- väzbou

Syntézy sa vykonávajú v DNA-syntetizéri firmy Applied Biosystems, Forster City, USA, Modeli 381 A, s použitím 0,2 pmól štandardného programu pre kondenzačné kroky. Syntézny cyklus je ukázaný skôr (str. 11). Ako nosný materiál slúži CPG 10-1400 opísaný v príklade 4. Kondenzácie sa vykonávajú s bežnými estermi kyseliny nukleozid-3'-fosforitej, iba v poslednom reakčnom cykle sa nasadia v príklade 1 opísané esteramidy kyseliny 3-O-DMTr-nukleozid-5'-O-(N,N-diizopropylamino-B-kyanoetoxy)-fosforitej. Po odštiepení oligonukleotidu z nosiča kone. NHj a odstránenia všetkých fosfátových a bázických ochranných skupín zahrievaním amoniakálneho roztoku na 60 °C cez noc sa vzorka odsoli vyzrážaním v etanole a cieľový reťazec sa elektroforézou na polyakrylamidovom géli čistí od kratších fragmentov.

Pre pokusy sa syntetizoval eikosatymidylat s iba 3 -5 '-väzbami ako i terminálnymi 3'-3'- a 5'-5'-väzbami. Okrem toho sa zvolili reťazce zo SV40-genómu. Boli syntetizované nasledujúce oligonukleotidy: dT₂₀; dT₂₀(3'-3',5'-5');

SV40TS17: 17-mér, reťazec v zmysle kódu zo SV40-genómu na polohách 5159 - 5176;

5'-AGC TTT GCA AAG ATG GA-3'

SV40TAS17: 17-mér, reťazec proti zmyslu kódu k SV40TS17;

5'-TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'

SV40TAS17 (3'-3'-, 5'-5'): 17-mér, reťazec proti zmyslu kódu k SV40TS17 s 3'-3'-, prípadne 5'-5'-väzbou na koncoch;

3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG C (3 -3 )T-5' SV40TS35: 35-mér, reťazec v zmysle kódu zo SV40-genómu na polohách 5142 - 5176;

5'-AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGAAG-3'

SV40AS35: 35-mér, reťazec proti zmyslu kódu k SV40TS35;

5'-TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'

SV40TAS35 (3'-3', 5'-5'): 35-mér, reťazec proti zmyslu kódu k SV40TS35 s 3'-3'-, prípadne 5'-5'-väzbou na koncoch;

3'-T(5'-5')CT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAGC(3'-3')T-5'

b) Syntéza oligonukleotidov s terminálnou 3'-3'-väzbou Ako nosný materiál slúži CPG 10-1400 opísaný v príklade

4. Kondenzácia sa vykoná s bežnými estermi kyseliny nukleozid-3 ’-fosforitej.

Po odštiepení oligonukleotidu z nosiča kone. NH₃ a odstránení všetkých fosfátových a bázických ochranných skupín zahrievaním amoniakálneho roztoku na 60 °C cez noc sa vzorka odsoli vyzrážaním v etanole a cieľový reťazec sa elektroforézou na polyakrylamidovom géli čistí od krátkych fragmentov.

SV40TAS17(3’-3'): 17-mér, reťazec proti zmyslu kódu k SV40TS17 s 3'-3'-väzbou na konci

3'-TCC ATC TTT GCA AAG C(3 -3')T-5'

c) Syntéza oligonukleotidov s terminálnou 5'-väzbou a 2 terminálnymi tiofosfátovými zvyškami

Ako nosný materiál slúži komerčný CPG-materiál s 5 '-O-dimetoxytrityltymidínom viazaným cez 3'-hydroxyskupinu. Kondenzácia sa vykoná s bežnými estermi kyseliny nukleozid-3’-fosforitej; iba v poslednom reakčnom cykle sa nasadia esteramidy kyseliny 3'-O-DMTr-nukleozid-5'-O-(N,N-diizopropylamino-P-kyanoetoxy)-fosforitej opísané v príklade 1.

Pri prvých dvoch reakčných cykloch sa namiesto bežnej oxidácie jódom vykoná oxidácia elementárnou sírou (W. Steč et al. J. A. C. S. 106, str. 6077, 1984).

Po odštiepení oligonukleotidu od nosiča kone. NH₃ a odstránení všetkých fosfátových a bázických ochranných skupín zahrievaním amoniakálneho roztoku na 60 °C cez noc sa vzorka odsoli vyzrážaním v etanole a cieľový reťazec sa čistí od kratších fragmentov elektroforézou na polyakrylamidovom géli.

Syntetizuje sa nasledujúci oligonukleotid: SV40TAS17(5’-5'): 17-mér, reťazec proti zmyslu kódu k SV40TS17 s 5'-5'-väzbou na 5 '-konci a dvoma tiofosfátintemukleotidovými väzbami na 3 '-konci

3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG (P_s) C(P_s)T-3'

Príklad 6

Analýza štruktúry a reťazca oligonukleotidu s terminálnou 3'-3'-a 5'-5'-väzbou

Analýza reťazca oligonukleotidu sa vykonáva metódou Maxama a Gilberta (A. M. Maxam a W. Gilbert, Methods in Enzymology 65, 499 - 560 (1980)). Vždy 100 pmól vzorky sa v prítomnosti (y-^J2P)-ATP/T4-polynukleotidkinázy na 5'-OH-skupine rádioaktívne značí, a potom sa vykonajú nasledujúce bázický špecifické reakcie: (A+G)-reakcia: protonácia báz kyselinou mravčou

G-reakcia: reakcia s dimetylsulfátom (T+C)-reakcia: hydrazinolýza

C-reakcia: reakcia s hydrazínom v prítomnosti 5 M

NaCl

Pôsobením IM piperidínu pri 95 °C sa oligonukleotidové reťazce štiepia na modifikovaných miestach; zlomky sa môžu elektroforézou na polyakrylamidovom géli oddeliť (20 % akrylamidu, 7 M močoviny) a autorádiografiou detekovať. Obr. 1 ukazuje autorádiogram analýzy reťazca SV40TS17, SV40TAS17 a SV40TAS17(3'-3', 5-5') (opis oligonukleotidov pozri príklad 5). Pretože sú reťazce na 5'-OH skupine značené, môže sa sled báz iba pri 3'-5'-väbách odpočítať v smere 3'-5’-smere. V dôsledku 3'-3'-konca má však oligonukleotid SV40TAS17 (3'-3 ', 5 '-5') rádioaktívne značenú 5'-OH skupinu na svojej koncovej časti; smer odpočítania reťazca sa tým otáča (obr. 1). To je tiež dôkaz pre 5'-5'-fosfodiesterovú väzbu na 5-koncovej časti reťazca s voľnou 3 ’-OH skupinou, ktorá sa enzýmom polynukleotidkinázy nemôže fosforylovať.

Príklad 7

Skúška stability oligonukleotidu s 3'-3' a 5-5-koncami v teste krvného séra

A) Kinazácia eikosatymidylatu s 3'-3'- a 5'-5'-koncami Literatúra: T. Mizuno, M. Y. Chou a M. Inouye, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1966 - 1970 (1984)

Násada:

μΐ oligonukleotid (0,01 OD₂₆₀) μΐ 10 x kináza - pufor μΐ T4-polynukleotidkináza μΐ γ-³²Ρ-άΑΤΡ (špec. aktivita: 6000 Ci/mmól) μΐ H₂O

Násada sa 30 minút inkubuje pri 37 °C, potom sa pridaním 90 μΐ H₂O skončí a frakcionuje sa cez stĺpec ®Sephadex G 50. Produkčné frakcie sa spoja a lyofilizujú sa.

B) Test krvného séra

Literatúra. S M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771 6772 (1986)

Násada:

0,01 OD₂₆₀ rádioaktívne fosforylovaného oligonukleotidu pre kontrolnú vzorku, 0,01 OD_2ô0 T₂₀ pre skúšku

0,01 OD₂6oT₂o s 3 -3 - a 5 -5 -koncovými väzbami μΐ čerstvého ľudského séra

Sérum sa dá k vzorke a krátko sa ručne trepe. Potom sa hneď kvôli O-hodnote odpipetujú 3 μΐ a dajú sa do 3 μΐ pufra s formamidom, aby sa prerušila aktivita enzýmu. Potom sa vzorka inkubuje pri 37 °C.

Pre kinetiku sa po určitých časových úsekoch odoberú 3 μΐ a preruší sa, ako je opísané.

Kontrolná vzorka: 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min.,

Skúška: 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min., 90 min.

Vzorky sa dajú na 20 % polyakrylamidový gél, delia sa elektroforézou na géli a potom sa autorádiografujú. Autorádiogram štiepenia s čerstvým ľudským sérom zľava (pozri obr. 2):

Kontrolná vzorka: O - hodnota, 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min.

Skúška: : O - hodnota, 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min., 90 min.

Už po 5 minútach sa ukazuje, že začalo odbúravanie prírodného oligonukleotidu. Štiepenie sa zvyšuje s pribúdajúcim časom. Modifikovaný oligonukleotid zostáva i po 90 minútach inkubácie prakticky nezmenený. Slabé pásy, ktoré vidieť pri všetkých hodnotách kinetiky, rezultujú z aktivity endonukleáz, ktoré sú prítomné v sére. Toto štiepenie je dôležité na terapeutické použitie týchto oligonukleotidov, pretože zaručuje pomalé odbúravanie účinnej substancie, a nemôže tým dôjsť k akumulácii týchto substancií v tele.

Príklad 8

Skúška správania oligonukleotidov s terminálnou 3'-3 - a 5 '-5 '-väzbou proti fosfodiesteráze z hadieho jedu

A) Kinazácia eikosatymidylatu s 3 '-3'- a 5 '-5 '-koncami Ako je opísané v príklade 7.

B) Hydrolýza eikosatymidylatu s 3'-3'- a 5'-5-koncami pomocou fosfodiesterázy z hadieho jedu

Literatúra. A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi a M. Inouye, PNAS USA 83, 7726 - 7730 (1986).

Násada:

μΐ RNA-nosiča μΐ SQ-pufra μΐ SVpdE (1,5 μ/μΐ)

Rádioaktívne fosforylovaná vzorka (štandard: T_20>skúška: T₂₀ s terminálnou 3'-3'- a 5'-5'-väzbou) sa lyofilizuje, na to sa dá RNA-nosič a SQ-pufor. Od tejto zmesi sa pre O-hodnotu odpipetuje 5 μΐ, k zvyšku roztoku sa pridá enzým a pri 37 °C sa inkubuje. Pre kinetiku štandardu sa odoberie po 5 min., po 15 min. a po 30 min. po 5 μΐ, pre kinetiku eikosatymidylatu s 3'-3'- a 5'-5'-koncami sa po 5 min., 30 min., 45 min., 60 min. a 90 min. odoberie po 5 μΐ. K dezaktivácii enzýmu sa vzorky priamo po odbere zahrievajú na vodnom kúpeli 2 min. na 95 °C. Vzorky sa lyofilizujú a nanesú sa na analytický 20 % polyakrylamidový gél. Po gelelektrolytickom delení sa autorádiografujú. Autorádiogram SVpdE - štiepenie (pozri obr. 3).

Zľava: T₂o (štandard), T₂o s terminálnymi 3'-3'-a 5'-5'-väzbami,

Kinetika skúšky: po 5 min., 15 min., 30 min., 45 min., 60 min., 90 min., mix. z 0 min./15 min., mix z 0 min./30 min., kinetika štandardu: po 5 min., 15 min., 30 min., 45 min.

Väzba 5'-5' sa, ako je už opísané, ihneď štiepi. Že ďalšie štiepenie v porovnaní so štandardom pokračuje ešte len veľmi pomaly, je značný štruktúrny dôkaz. Po štiepení 5'5'-fosfordiesterovej väzby vznikne molekula, ktorá na mieste štiepenia nesie 5'-hydroxylovú funkciu. Na druhej koncovej časti je molekula 5'-fosforylovaná. Obidve koncové časti sú pre fosfodiesterázu z hadieho jedu nenapadnuteľné. Pomalé, ale veľmi značné ďalšie odbúravanie je pravdepodobne, podľa výrobcu opísaných prísad (J. G. Izant a H. Weintraub, Celí 36, 1007 - 1015 (1984)), možné odvodzovať od jednoreťazcovej špecifickej endonukleázy, ktorá PM2 DNA mení na otvorené formy. Ľahko možno odpočítať dĺžku reťazca. Je však možné odpočítať iba 19 pásov, pretože pri prvej hodnote kinetiky, po 5 min., je 5'-5'-fosfodiesterová väzba už odštiepená.

Príklad 9

Skúšky hybridizačného správania oligonukleotidov opatrených terminálnymi 3 '-3'- a 5 '-5 '-koncami

Kvôli skúškam hybridizačného správania sa zaznamenávajú krivky topenia vždy ekvimolámeho množstva (5,23 mmól) SV40TS17 a SV40TAS17 (3'-3'-, 5'-5'-) (opis oligonukleotidov pozri príklad 5), rozpustia sa v 1 ml 10 nM Na-kakodylátu/100 mM NaCl-pufra, pH 7,0, zahreje sa na 70 °C a priebeh renaturácie sa zisťuje pri pomalom ochladzovaní (1 stupeň/min.) meraním absorpcie roztoku. Na záznam krivky štandardu sa použijú rovnaké množstvá SV40TAS17. Analogicky sa v pufri mieša vždy 4,75 nmól SV40TS35 a SV40TAS35, prípadne SV40TS35 a SV40TAS35(3'-3'-, 5'-5'-), zahreje sa na 90 °C a absorpcia sa meria pri ochladzovaní. Zistili sa krivky tavenia, ktoré poskytujú nasledujúce hodnoty T_m:

SV40TS17 . SV40TAS17 54,1 °C

SV40TS17 . SV40TAS17(3'-3',5'-5') 53,3°C

SV40TS35 . SV40TAS35 65,5°C

SV40TS35 . SV40TAS35(3'-3',5'-5) 64,2°C

Teploty tavenia sa teda abiologickými väzbami znižujú len o 0,6 °C pri 17-méri, prípadne pri 1,3 °C u 35-mériu.

Príklad 10

Inhibícia biosyntézy SV40 T-antigénu oligonukleotidmi s terminálnou 3 ’-3' a 5 '-5-väzbou

A) Bunková kultúra

Bunky ČOSI sa v Eaglovom prostredí v Dulbeccovej modifikácii (DMEM) kultivujú s 10 % fetálneho teľacieho sé ra. Misky na tkanivové kultúry sa inkubujú pri 37 °C a 7,5 °C CO₂.

B) Rádioaktívne značenie a rozrušenie buniek

Asi 4 x 10⁴ buniek sa ako monolayer dá do misiek na tkanivové kultúry. Bunky sa trikrát premyjú DMEM bez metionínu, a potom sa značia 100 pCr'³-S-metioninu. Na skúšky modulácie proti zmyslu kódu sa bunky súčasne 30 min. pri 37 °C inkubujú s oligonuklcotidom SV40TAS17 (3'-3',5'-5) a rádioaktívnym metionínom. Potom sa bunky dvakrát premyjú DMEM obsahujúcim 10 % fetálneho teľacieho séra a neznačený metionín a v tomto prostredí sa nechajú ďalších 30 minút. Kvôli rozrušeniu sa na bunky pôsobí ľadovo studeným fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom NaCl (PBS); od misiek sa odškrabnú a 2 minúty sa pri 400 g odstreďujú. Usadenina buniek sa potom 45 minút na ľade lyžuje 0,4 ml rozrušovacieho pufra (0,5 % nonidetu P40, 100 mM tris-HCl, pH 9,0, 0,1 M NaCl) pre 3 x 10⁶ buniek. Na zamedzenie proteolýzy sa k rozrušovaciemu pufru pridá 1 % trazylolu a fenylmetylsulfonylfluorid až do konečnej koncentrácie 0,25 mg/ml. Lyzát sa potom 30 minút pri 4 °C v ultraodstredivke (105 000 g) odstrcďujc do číra. Podiel 10 μΐ sa odoberie a meria sa obsah proteínu metódou Lowryho. Na imunoprecipitáciu sa nasadí rovnaké množstvo celkového proteínu.

C) Imunoprecipitácia

Tak na imunoprecipitáciu SV40 T-antigénu, ako aj mutantov antigénu lokalizovaných v cytoplazme sa použije monoklonálna protilátka Pabl08. Protilátka sa chromatografiou na proteíne A-sefaróze čistí od prebytku hybridómu. Bunkový extrakt sa predbežne cez noc pri 4 °C zráža 100 μΐ 10 % suspenzie teplom inaktivovaných a formaldehydom fixovaných baktérií kmeňa Staphylococcus aureus (Cowan 1). Baktérie sa potom odstredia, zvyšok sa aspoň 2 hodiny pri 4 °C inkubuje s monoklonálnou protilátkou a pridaním S. aureus sa tvoria vysokošpecifické imunokomplexy. Tento postup sa 3x opakuje, aby sa zaistila úplná precipitácia.

Potom sa imunoprecipitáty premývajú: trikrát 50 mM tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 % trazylolu; dvakrát 50 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 % nonidetu P40 a raz 50 mM NH₄HCO₃. Potom sa 45 minút pri 4 °C eluuje 200 μΐ eluačného pufra (50 mM NH₄HCO₃, 1 % SDS, 1 % β-merkaptoetanolu), lyofilizuje sa, 10 minútovým varom sa rozpustí v 20 μΐ pufra (65 mM tris-HCl, pH 6,8, 5 1 β-merkaptoetanolu, 1 % glycerínu, 0,01 % brómfenolovej modrej) a uloží sa na 3 % polyakrylamidový gél (10 % SDS). Proteíny sa rozdelia diskontinuálnou elektroforézou na géli; pásy sa môžu lokalizovať fluorografiou na rontgenovom filme (Kodak X-AR).

S oligonukleotidmi pripravenými podľa vynálezu tak, že predĺžia začiatok translácie pre T-antigén bola pri použití extrabunkovej koncentrácie 30 μ-moláme registrovaná 70 % inhibícia vírusového rastu. To je protiklad k účinnosti zodpovedajúcich reťazcov, ktoré neboli stavané podľa vynálezu, t.j. reťazcov bez 3'-3'- a 5'-5'-väzieb. Tu pri použití rovnakej koncentrácie nebola zistená žiadna inhibícia. Obr. 4 ukazuje zjavnú inhibíciu T-Ag-biosyntézy pri ošetrení buniek 30 μΜ SV40TAS17 (3 -3'- a 5'-5').

Príklad 11

Porovnanie sérovej stability oligonukleotidov, ktoré sú modifikované iba na 3'-konci, pripadne iba na 5'-konci invertovanými fosfodiesterovými väzbami

Oligonukleotidy sanukleázou odbúravajú od svojej 3

-koncovej časti (J. P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fishback, B. Froehler, Nucleid Acids Res., 19, 747 - 750 (1991)). Malo by sa preto skúšať, či samotná terminálna 3'-3'fosfodiesterová väzba stačí na stabilizáciu oligonukleotidu v krvnom sére. Pretože s 32p značený fosfátový zvyšok, hlavne pri dlhšom pôsobení sérom na vzorku, sa fosfotázami odštepuje, bol na detekciu oligonukleotidov použitý fluoresceín.

Syntetizované boli nasledujúce reťazce z genómu Xenopus levis.

Xelev 1: 3'-A(5'-5')GC CTC AAA C*AT GTG TGA CG-3'

Xelev 2: 5'-AGC CTC AAA C*AT GTG TGA C (3'-3')-G-5'

Syntézy sa vykonávajú, ako je opísané v príklade 5, pričom sa pre 10. kondenzáciu nasadí esteramid kyseliny cytidín-fosforitej C*, ktorý umožňuje dodatočnú kovalentnú väzbu s fluoresceínom. Vostavba fluoresceinu sa vykonáva podľa návodu firmy Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology Auto Primer^l<m) Synthesis Kit Instructions (XY-023-00-01). Modifikované oligonukleotidy sa čistia elektroforézou na polyakrylamidovom géli.

Sérový test: lOpmól oligonukleotidu 140 μΐ čerstvého ľudského séra

Vzorky sa inkubujú pri 37 °C. Po 15 min., 30 min., 45 min., 60 min., 8 hodinách a 72 hodinách sa odoberie vždy 20 μΐ, 2x sa extrahuje zmesou fenol/chloroform/ izoamylalkohol 25 : 24 : 1 a oligonukleotidy sa zrazia etanolom. Produkty štiepenia sa delia a detekujú na 16 % polyakrylamidovom géli v automatickom sekvenceri A.L.F. (Pharmacia, Freiburg). Ako ukazuje obr. 5, iba reťazec opatrený na 5'- konci má invertovanú intemukleotidovú väzbu už po 15 min. pôsobenia séra produkty odbúrania a po 60 min. je už takmer úplne odbúraný. Oligonukleotid „chránený“ na 3'-konci 3'-3'-väzbou je sám oproti tomu po 72 hodinách len čiastočne odbúraný.

Príklad 12

Inhibícia expresie génov v in vitro-expresnom systéme

Aby sa kvantifikovala expresia génov INVoligonukleotidmi, skúšal sa účinok zodpovedajúcich oligonukleotidov s reťazcom proti zmyslu kódu na expresiu p53 v systéme in vitro, aby p53 obsahoval mRNA (E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144(1990)).

Syntetizovali sa reťazce proti zmyslu kódu NH₂(CH,)₆ pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT (3'-3')T a ako porovnávacia vzorka zodpovedajúci reťazec v zmysle kódu

NH₂(CH₂)₆ pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT (3'-3')A

Oligonukleotid s reťazcom proti zmyslu kódu je riadený proti začiatku translácie onkoproteínu p53

Skúšali sa expresie proteínu

1. bez pridania oligonukleotidu

2. pri pridaní 30 μΜ reťazca v zmysle kódu

3. pri pridaní 1 μΜ reťazca proti zmyslu kódu

4. pri pridaní 10 μΜ reťazca proti zmyslu kódu

Na kvantifikáciu sa stanovilo čierne sfarbenie proteínových pásov denzitometricky (E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137 — 144 (1990)).

Obr. 6 ukazuje, že prídavkom 10 μΜ oligonukleotidu s reťazcom proti zmyslu kódu k systému expresie spôsobí cca 70 % inhibíciu. Pri znížení koncentrácie na 1 μΜ nie je

SK 279544 Β6 viac možné zistiť takmer žiadnu inhibiciu, rovnako pri prídavku reťazca v zmysle kódu, ktorý neviaže na mRNA.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY (I)

1. Analógy oligonukleotidov všeobecného vzorca (I) alebo (II),

B¹ . O V o

—I—, z - p * r<

i ⁰ —v , o B

Y7

I

--------1------B² kde

R¹ znamená vodík alebo zvyšok vzorca (III) <III)

R² znamená vodík alebo zvyšok vzorca (IV), o

I z* - p - w*

I pričom však aspoň jeden zo zvyškov R¹ alebo R² predstavuje zvyšok vzorca (III) alebo (IV),

B predstavuje bázu, vybranú zo skupiny zahrňujúcej adenín, cytozín, guanín alebo neprírodné bázy, purín, 2,6-diaminopurín, 7-deazaadenín, 7-deazaguanín, N⁴-etanocytozín, prípadne ich prekurzorové formy,

W a W' nezávisle od seba znamenajú kyslík alebo síru, Z a Z' nezávisle od seba znamenajú O; S; alkoxyskupinu s 1 až 18 atómami uhlíka, výhodne alkoxyskupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, obzvlášť výhodne alkoxyskupinu s 1 až 3 atómami uhlíka, hlavne metoxyskupinu; alkyl s 1 až 18 atómami uhlíka, výhodne alkyl s 1 až 8 atómami uhlíka, najmä výhodne alkyl s 1 až 3 atómami uhlíka, hlavne metyl; NHR³ s R³ znamenajú výhodne alkyl s 1 až 18 atómami uhlíka, obzvlášť výhodne alkyl s 1 až 8 atómami uhlíka, hlavne alkyl s 1 až 4 atómami uhlíka alebo alkoxy-alkyl s 1 až 4 atómami uhlíka v alkoxyzvyšku a s 1 až 6 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku, výhodne metoxyetyl; NR³R⁴, kde R³ má uvedený význam a R⁴ znamená výhodne alkyl s 1 až 18 atómami uhlíka, najmä výhodne alkyl s 1 až 8 atómami uhlíka, hlavne alkyl s 1 až 4 atómami uhlíka, alebo kde R³ a R⁴ spolu s nosným atómom dusíka znamenajú 5až 6-členný heterocyklický kruh, ktorý môže navyše obsahovať ďalší heteroatóm z radu O, S, N, ako napríklad morfolín,

Y znamená zvyšok z radu -O-Si(R)₂, OCH₂, C(O)NR alebo OCH₂-C(O), kde R predstavuje alkyl s 1 až 6 atómami uhlíka, aryl alebo cykloalkyl s 5, prípadne 6 atómami uhlíka, a n znamená celé číslo 5 až 60, výhodne 10 až 40 a hlavne 15 až 25, ako i ich fyziologicky znášanlivé soli.
2. Oligonukleotidy vzorca (I) podľa nároku 1, kde R²predstavuje zvyšok vzorca (IV) a R¹ znamená vodík; R¹, prípadne R², predstavujú zvyšok vzorcov (III), prípadne (IV); alebo R² znamená vodík a R¹ znamená zvyšok vzorca (III), pričom buď W alebo Z v poslednom prípade neznamenajú kyslík.
3. Oligonukleotidy vzorca (I) podľa nárokov 1 alebo 2, kde W predstavuje kyslík alebo Z a W obidva znamenajú kyslík.
4. Oligonukleotidy vzorca (I) podľa nárokov 1 až 3, kde R² predstavuje zvyšok vzorca (IV) a R¹ znamená vodík.
5. Oligonukleotidy vzorcov (I) a (II) podľa nárokov 1 až 4, obsahujúce skupiny, ktoré podporujú intrabunkový príjem, ktoré slúžia ako značiace skupiny in vitro alebo in vivo a/alebo skupiny, ktoré pri hybridizácii oligonukleotidu na biologické DNA alebo RNA tieto DNA- alebo RNA-molekuly za viazania alebo štiepenia napádajú.
6. Spôsob výroby oligonukleotidov vzorca (I) podľa nárokov laž 5, vyznačujúci sa tým, že sa

a) nukleotidová jednotka s 3'-, prípadne 5'-terminálnymi skupinami fosforu (III) alebo fosforu (V), alebo jej aktivovaný derivát nechá reagovať s ďalšou nukleotidovou jednotkou s 3'-, prípadne 5'-terminálne voľnou hydroxyskupinou, alebo

b) oligonukleotid pripraví z fragmentov rovnakým spôsobom, v oligonukleotidoch získaných podľa (a) alebo (b) sa prípadne jedna alebo niekoľko ochranných skupín zavedených dočasne kvôli ochrane ostatných funkcií odštiepi a takto získané oligonukleotidy vzorca (I) sa prípadne prevedú na svoju fyziologicky znášanlivú soľ.
7. Analógy oligonukleotidov vzorca (I) a (II) podľa nárokov 1 až 5, na výrobu liekov pre hybridizačno - chemický postup regulácie alebo na potláčanie biologických funkcií nukleových kyselín spočívajúci na adícii na nukleové kyseliny s dvojitým alebo jednoduchým reťazcom, ako i na selektívne potláčanie expresie funkcií vírusového genómu a na profylaxiu a terapiu vírusových funkcií, na potláčanie nádorovej funkcie a na terapiu rakovinových ochorení.
8. Farmaceutické prostriedky, potláčajúce funkciu nukleových kyselín, vyznačujúce sa t ý m , že ako účinnú látku obsahujú jeden alebo niekoľko analógov oligonukleotidov podľa nárokov 1 až 6, prípadne spolu s fyziologicky znášanlivými pomocnými a/alebo nosnými látkami, hlavne na intravenóznu alebo topickú aplikáciu.