FI104177B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI104177B FI104177B FI913169A FI913169A FI104177B FI 104177 B FI104177 B FI 104177B FI 913169 A FI913169 A FI 913169A FI 913169 A FI913169 A FI 913169A FI 104177 B FI104177 B FI 104177B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- group
- oligonucleotides
- alkyl group
- advantageously
- groups
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
- G01R15/00—Details of measuring arrangements of the types provided for in groups G01R17/00 - G01R29/00, G01R33/00 - G01R33/26 or G01R35/00
- G01R15/14—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks
- G01R15/18—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers
- G01R15/186—Adaptations providing voltage or current isolation, e.g. for high-voltage or high-current networks using inductive devices, e.g. transformers using current transformers with a core consisting of two or more parts, e.g. clamp-on type
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
Description
, 104177
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleoti-dien valmistamiseksi
Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisten oligonukleotidien tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joilla oligonuk-leotideilla on kaava I tai II, R.1 - O _ .0. a „1 ,__ _ _ 10 vy 1 ί 1 ° Z - ? a W (-1--ί (II) is ° ~λ^°ν^b (i) β o o . * . 1-I-1 2 n O2
R R
20 joissa R1 on vetyatomi tai ryhmä, jolla on kaava III,
0 _ 1 I/°y o - P = W
25 \_I J. dll)
CH
R2 on ryhmä, jolla on kaava IV, 30 HO —^ 0 3 ; X7 0
35 V - ? = W
2 104177 B on emäs, kuten esimerkiksi luonnossa esiintyvä emäs, kuten adeniini, tyrniini, sytosiini, guaniini, tai luonnossa esiintymätön emäs, kuten esimerkiksi puriini, 2,6-diaminopuriini, 7-deatsa-adeniini, 7-deatsaguaniini, 5 N4-etanosytosiini tai jokin niiden esiastemuodoista; kumpikin ryhmistä W ja W on toisesta riippumatta happi-tai rikkiatomi; kumpikin ryhmistä Z ja Z' on toisesta riippumatta O'; S"; Ci.ie-alkoksyyliryhmä, edullisesti C^-alkoksyyliryh-10 mä, erityisen edullisesti C^-alkoksyyliryhmä, erityisesti metoksyyliryhmä; C^g-alkyyliryhmä, edullisesti C^g-alkyy-liryhmä, erityisen edullisesti C^-alkyyliryhmä, erityisesti metyyliryhmä; ryhmä NHR3, jossa R3 on edullisesti alkyyliryhmä, erityisen edullisesti C1.8-alkyyliryhmä, eri-15 tyisesti Cx_4-alkyyliryhmä, tai C^-alkoksi-C^g-alkyyliryh-mä, edullisesti metoksietyyliryhmä; ryhmä NR3R4, jossa R3 merkitsee samaa kuin edellä ja R4 on edullisesti C1.18-al-kyyliryhmä, erityisen edullisesti C^-alkyyliryhmä, erityisesti Ci.4 — alkyyliryhmä, tai ryhmät R3 ja R4 muodostavat yh-20 dessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosyklisen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisen heteroatomin, joka on O, S tai N, kuten esimerkiksi mor f oi Uniryhmä ; Y on ryhmä 0-Si(R)2, 0CH2, C(0)NR tai 0CH2-C(0), 25 joissa R on C^-alkyyli-, aryyli- tai C5- tai C6-sykloal-kyyliryhmä; ja n on kokonaisluku 5-60, edullisesti 10 - 40 ja erityisen edullisesti 15 - 25.
Antisense-nukleotideilla tarkoitetaan nukleiinihap- 30 pofragmentteja, joiden sekvenssi on komplementaarinen lä- .· hetti-RNA:n koodittavalle eli "sense"-sekvenssille tai * DNA:n koodittavalle säikeelle. Tällaisia oligonukleotideja käytetään yhä enemmän geenien ilmentymisen estämiseen in vitro tai soluviljelmäjärjestelmissä. Mainitunlaisten ai-35 neiden käyttö lääketieteellis-terapeuttisella alueella, 104177 esimerkiksi antiviraalisina lääkeaineina, on laajojen tutkimusten kohteena. Biologiassa on jo pitkään tunnettu an-tisense-RNA-sekvenssit luonnossa esiintyvinä geenien ilmentymisen säätelijöinä prokaryooteissa [T. Mizuno, M.-Y.
5 Chou ja M. Inoye, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 1 966 - 1 970] ja myös eukaryooteissa [S. M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 6 771 - 6 772]. Ne saavat aikaan translaation inhibition hybridisoitumalla vastaavaan lä-hetti-RNA:han. Lukuisissa kokeissa on myös pystytty osoit-10 tamaan, että mainitunlaiset antisense-sekvenssit voivat vietyinä bakteereihin [A.Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi ja M. Inoye, PNAS USA 83 (1986) 7 726 - 7 730] tai eukary-oottisoluihin [J. G. Izant ja H. Weintraub, Cell 36 (1984) 1 007 - 1 015] estää myös niissä geenien ilmentymisen ja 15 vaikuttavat myös sekä antiviraalisesti [L.-J. Chang ja C.
M. Stoltzfus, J. Virology 61 (1987) 921 - 924] että anti-onkogeenisesti [J. T. Holt, T. V. Gopal, A. D. Moutton ja A. W. Nienhuis, PNAS USA 83 (1986) 4 794 - 4 598] . Täl laisten tutkimusten yhteydessä on synteettisten oligonu-20 kleotidien etuna biologiseen antisense-RNArhan nähden parempi stabilisuus ja helpompi saatavuus. Viimeksi mainittu liittyy viime aikoina voimakkaasti parantuneisiin synteesimenetelmiin, jotka tekevät lyhyehköistä oligomeerei-sta (esimerkiksi 12 - 30 emästä) nykyisin suhteellisen 25 helposti saatavia [E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274 - 325; Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, toim. J. S. Cohen, Macmillan Press, 1989, s. 7 -) .
On osoittautunut, että jo tällaiset lyhyetkin oli-30 gomeerit ovat tehokkaita ilmentymisen säätelijöinä. Lisäk-= si mainitunlaiset oligonukleotidit voivat vaikuttaa myös sitoutumalla DNA-kaksoissäikeeseen, jolloin muodostuu kol-moiskierre. Jotta näitä molempia, antisense-oligonukleoti-deja ja kolmoissäikeitä muodostavia oligonukleotideja, 35 voitaisiin käyttää biologisissa järjestelmissä, täytyy 4 104177 kuitenkin täyttää seuraavat edellytykset (Oligodeoxynuc-leotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, toim. J. S. Cohen, Macmillan Press, 1989, s. 1 -): 1. Niiden täytyy olla toisaalta hyvin veteen liu-5 kenevia ja toisaalta läpäistä helposti lipofiilinen solukalvo, 2. niiden tulee solun sisällä olla riittävän stabiileja hajoamista, ts. nukleaaseja, vastaan, 3. niiden tulee muodostaa solunsisäisten nukleiini-10 happojen kanssa fysiologisissa lämpötiloissa stabiileja hybridejä, 4. hybridisäätiön tulee olla selektiivinen; disso-siaatiolämpötilan tulee erota riittävästi virheellisen pariutumisen aikaansaavan oligonukleotidin vastaavasta 15 arvosta, niin että viimeksi mainittu voidaan vielä pestä pois spesifisesti.
Vuonna 1978 pystyivät Zamencznik ja Stephenson [PNAS USA 75 (1978) 280 - 284 ja 285 - 288] osoittamaan ensimmäisen kerran, että muuntamattomat oligonukleotidit 20 voivat estää Rous sarkooma-virusten lisääntymistä. Oligo-nukleotideja käytettiin kuitenkin sangen suurina pitoisuuksina ja lisäksi kokeet tehtiin useimmiten ennalta kuumennetuissa väliaineissa nukleaasien inaktivoimiseksi. Näiden toimenpiteiden välttämättömyyden selittää nopea 25 entsymaattinen hajotus, jonka kohteiksi vieraat nukleiinihapot joutuvat seerumissa ja soluissa.
Siten jo varhain on tehty tutkimuksia, joiden päämääränä on ollut oligonukleotidien muuntaminen rakenteellisesti sillä tavalla, että ne täyttävät paremmin edellä 30 mainitut vaatimukset ja ovat erityisesti paremmin suojat-. tuja nukleaasien aiheuttamalta hajoamiselta. Nämä tutki- mukset keskittyvät ennen kaikkea nukleotidien välisen fos-fodiesterisidoksen muuntamiseen, koska se on loppujen lopuksi kaikkien nukleaasien tarttumiskohta. Rakenteellises- 104177 ti muunnetut nukleotidien väliset sidokset voidaan jakaa seuraaviin perusryhmiin: a) nukleosidisidokset, joissa keskusatomina on fosfori, nämä voivat puolestaan olla: 5 ionisia/kiraalisia ionisia/ei-kiraalisia neutraaleja/kiraalisia.
b) neutraalit/ei-kiraaliset fosforittomat nukleosidisidokset .
10 Rakenteellisesti muunnettuihin, edelleen kuitenkin ionisiin nukleosidien välisiin sidoksiin kuuluvat tiofos-faatti- ja ditiofosfaattisidokset. Tiofosfaattimuunnetuil-la oligonukleotideilla (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, toim. J. S. Cohen, Macmil-15 lan Press, 1989, s. 97 -) on tällä hetkellä parhain geenien ilmentymistä estävä vaikutus soluviljelmissä, mutta tämä inhibitio ei näytä liittyvän spesifiseen sekvenssiin, koska myös sellaisilla tiofosfaattimuunnetuilla oligonukleotideilla, jotka koostuvat vain yhdestä nukleiinihappo-20 rakenneosasta, esimerkiksi oligosytidylaatin tiofosfaatti-analogeilla, on inhibitiovaikutuksia. Tiofosfaattimuunnet-tujen oligonukleotidien käyttöä rajoittaa lisäksi niiden kiraalisuus.
Koska valmistettaessa n emästä sisältävä oligonuk-25 leotidi muodostuu 2η_1 diastereomeeria, on kuitenkin vain hyvin pienellä osalla tiofosfaattisidoksia sisältävästä valmisteesta hyvät hybridisaatio-ominaisuudet.
Nukleosidien välisiä ditiofosfaattisidoksia sisältävien oligonukleotidien ollessa kyseessä [A. Grandas, 30 William S. Marshall, John Nielsen ja Martin H. Caruthers, * .· Tetrahedron Lett. 20 (1989) 543 - 546,- G. M. Pörrit ja C.
« B. Reese, Tetrahedron Lett. 30 (1989) 4 713 - 4 716] vältetään kiraalisuusongelma. Mainitunlaisia yhdisteitä on kuitenkin nykyisin saatavissa vain monimutkaisten ja suu-35 riin häviöihin johtavien monivaiheisten synteesien kautta.
t β 104177
Siksi tähän mennessä ei myöskään ole vielä voitu tehdä mitään laajempia hybridisaatiokäyttäytymistä koskevia tutkimuksia, varsinkaan soluviljelmissä.
Eräs toinen ryhmä kemiallisesti muunnettuja oligo-5 nukleotideja ovat sellaiset, joissa on ionittomia, ts. neutraaleja nukleosidien välisiä sidoksia. Tällä tavalla muunnettuihin rakenteisiin kuuluvat oligonukleotidit, joissa on nukleosidien välisiä fosfotriesteri- tai metyy-lifosfonaattisidoksia (Oligodeoxynucleotides, Antisense 10 Inhibitors of Gene Expression, toim. J. S. Cohen, Macmillan Press, 1989, s. 79 -).
Näille kahdelle yhdisteryhmälle on yhteistä, että ionisoitavissa oleva fosfaattiryhmä on korvautunut varauksettomalla ryhmällä. Tuomalla molekyyliin mainitunlainen 15 sidos saadaan näistä oligonukleotidianalogeista resistenttejä nukleaasien suhteen, mutta niiden haittana on kuitenkin heikko liukenevuus vesiväliaineeseen.
Oligonukleotideja, joissa on neutraali/ei-kiraali-nen nukleosidien välinen sidos, on tähän mennessä voitu 20 valmistaa ainoastaan korvaamalla nukleosidien välisen sidoksen fosforiatomi toisella keskusatomilla. Siloksaani-sidos on samankaltainen kuin fosforihappoesterisidos. Oligonukleotideja, joissa on nukleosidien välisiä siloksaani-sidoksia [K. K. Ogilvie ja J. F. Cormier, Tetrahedron 25 Lett. 26 (1985) 4159, H. Selinger ja G. Feger, Nucl. Nucl.
6(1982) (1987) 483 - 484], on syntetisoitu, ja ne ovat stabiileja nukleaaseja vastaan.
Oligonukleotideja, joissa on nukleosidien välisiä karbonaatti-, asetaali- tai karboksiamidisidoksia, kuva-30 taan seuraavissa julkaisuissa: M. Matteucci, Tetrahedron Lett. 31 (1990) 2 385 - 2 388; J. R. Tittensor, J. Chem.
Soc. C. 1971, s. 2 656; J. Coull et ai., Tetrahedron Lett. 28 (1987) 745.
Nukleaasiresistenttejä oligonukleotidianalogeja on 35 pystytty saamaan aikaan myös muuttamatta nukleotidien vä- t 7 104177 lista fosfodiesterisidosta käyttämällä konfiguraatioltaan muutettuja sokeriryhmiä. Tämä on tehty syntetisoimalla oligonukleotidianalogeja, joissa nukleotidin emäkset on liitetty a-glykosidisidoksin (Oligodeoxynucleotides, Anti-5 sense Inhibitors of Gene Expression, toim. J. S. Cohen, Macmillan Press, 1989, s. 119 -) . Tällaisia oligonukleotidianalogeja on kuitenkin vaikea valmistaa, koska ne täytyy rakentaa sokereista ja emäksistä lähtien. Lisäksi ne käyttäytyvät osittain epänormaalisti hybridisoitumissuunnan 10 suhteen.
Keksintö koskee menetelmää uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi, joilla oligonukleotideilla on kaava I tai II, 15 R ~ B Rl-o^oyfl 1 ΓΊ 1 ° . Z “ P a W ( 1-Ϊ (II) 20 I y-
Xr Πρ· o o I_1_j 1-1-1 : 25 Ji n a2 joissa R1 on vetyatomi tai ryhmä, jolla on kaava III, B _ 1 30 ry0" fs w’ ' . \_/ Z’ (III)
CH
R2 on ryhmä, jolla on kaava IV, 104177 8 -γ °y \_/ <iv) 0
5 I
2’ - ? = W' B on emäs, kuten esimerkiksi luonnossa esiintyvä emäs, kuten adeniini, tyrniini, sytosiini, guaniini, tai 10 luonnossa esiintymätön emäs, kuten esimerkiksi puriini, 2,6-diaminopuriini, 7-deatsa-adeniini, 7-deatsaguaniini, N4-etanosytosiini tai jokin niiden esiastemuodoista; kumpikin ryhmistä W ja W on toisesta riippumatta happi-tai rikkiatomi; 15 kumpikin ryhmistä Z ja Z' on toisesta riippumatta O'; S”; Cj^g-alkoksyyliryhmä, edullisesti C1.8-alkoksyyliryh-mä, erityisen edullisesti C^-alkoksyyliryhmä, erityisesti metoksyyliryhmä; Cj.18-alkyyliryhmä, edullisesti Cx.8-alkyy-liryhmä, erityisen edullisesti C^-alkyyliryhmä, erityises-20 ti me tyyli ryhmä; ryhmä NHR3, jossa R3 on edullisesti alkyyliryhmä, erityisen edullisesti C^.g-alkyyliryhmä, erityisesti C-^-alkyyliryhmä, tai C1.4-alkoksi-C1.6-alkyyliryh-mä, edullisesti metoksietyyliryhmä; ryhmä NR3R4, jossa R3 merkitsee samaa kuin edellä ja R4 on edullisesti Cj.^-al-. 25 kyyliryhmä, erityisen edullisesti C^-alkyyliryhmä, erityi sesti C1_i-alkyyliryhmä, tai ryhmät R3 ja R4 muodostavat yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosyklisen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisen heteroatomin, joka on O, S tai N, kuten esi-30 merkiksi morfoliiniryhmä; Y on ryhmä 0-Si(R)2, OCH2, C(0)NR tai 0CH2-C(0), joissa R on C^-alkyyli-, aryyli- tai C5- tai C6-sykloal-kyyliryhmä; ja n on kokonaisluku 5-60, edullisesti 10-40 ja 35 erityisen edullisesti 15 - 25.
r 9 104177
Aryyliryhmäksi tulee tässä yhteydessä ymmärtää esimerkiksi fenyyliryhmä ja fenyyliryhmä, joka on substitu-oitu (1 - 3) C1.6-alkyyli- tai C^g-alkoksyyliryhmällä ja/tai halogeeniatomilla.
5 Edullisia ovat kaavan I mukaiset oligonukleotidit.
Lisäksi ovat edullisia kaavan I mukaiset oligonukleotidit, joissa R2 on kaavan IV mukainen ryhmä ja R1 on vetyatomi, tai R1 on kaavan III mukainen ryhmä.
Erityisesti mainittakoon lisäksi kaavan I mukaiset 10 oligonukleotidit, joissa W on happiatomi tai sekä Z että W ovat happiatomeja.
Aivan erityisen edullisia ovat kaavan I mukaiset oligonukleotidit, joissa R2 on kaavan IV mukainen ryhmä ja R1 on vetyatomi.
15 Lisäksi mainittakoon kaavojen I ja II mukaiset oli gonukleotidit, jotka ovat lisäksi substituoituja ryhmillä, jotka edistävät soluunottoa, toimivat merkkiaineryhminä in vitro tai in vivo ja/tai oligonukleotidin hybridisoituessa biologisen DNA:n tai RNA:n kanssa vaikuttavat näihin DNA-20 tai RNA-molekyyleihin sitoutumiseen tai pilkkoutumiseen johtavalla tavalla.
Esimerkkejä ryhmistä, jotka edistävät soluunottoa, ovat lipofiiliset ryhmät, kuten esimerkiksi korkeintaan 18 C-atomia sisältävät alkyyliryhmät tai koiesteryyliryhmä ; 25 tai konjugaatit, jotka hyödyntävät luontaisia kuljetusjär jestelmiä, kuten esimerkiksi gallushappo tai asianomaisia reseptoreja vastaavat peptidit (esimerkiksi reseptorivä-litteinen endosytoosi). Esimerkkejä merkkiaineryhmistä ovat fluoresoivat ryhmät (esimerkiksi akridinyyli-, dan-30 syyli- ja fluoreseinyyliryhmä) tai kerniluminesoivat ryh-' , mät, kuten esimerkiksi akridiniumesteriryhmät.
Oligonukleotidikonjugaatit, jotka sitoutuvat nuk-leiinihappohin ja/tai pilkkovat niitä, sisältävät akridii-niä [N. Thuong et ai., Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5 905), 35 psoraleenia (U. Peiles et ai., Nucleic Acid Res. 17 10 104177 (1989) 285) tai kloorietyyliaminoaryylikonjugaatteja (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, toim. J. S. Cohen, Macmillan Press, 1989, s. 173 -) .
5 Keksinnön mukaisesti saatavien oligonukleotidien karakteristinen rakenteellinen muutos on siinä, että muutetaan nukleotidien välisiä sidoksia ketjun kummassakin päässä, ts. ne ovat biologisten 3'-5'-sidosten sijasta 3 ' -3 ' - tai 5'-5'-sidoksia. Olemme yllättävästi havainneet, 10 että tämän hyvin pieni rakennemuutos riittää stabiloimaan mainitunlaiset yhdisteet nukleaasien aiheuttamaa hajoamista vastaan.
Kuten jäljempänä kuvataan, saa tämä vain vähäinen rakennemuutos aikaan hybridisaatiokäyttäytymisen, joka on 15 lähes biologisten nukleotidien käyttäytymisen kaltainen. Tästä seuraa myös näiden yhdisteiden yleinen käyttökelpoisuus geenien ilmentymisen estäjinä soluviljelmissä.
Kirjallisuudessa ei tähän mennessä ole esitetty viittauksia oligonukleotidianalogien valmistamiseen, jois-20 sa on ketjun kummassakin päässä nukleosidien välisiä 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksia, eikä niiden käyttöön antisense-oligonukleotideina. Dinukleosidifosfaattien analogeja, jotka sisältävät joko 3'-3'— tai 5'-51-sidoksia, on jo useita vuosia sitten valmistettu ja tutkittu vastaavan 25 kondensaation päätuotteina [A. Myles, W. Hutzenlaub, G.
Reits ja W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108 (1975) 2 857 - 1 871; H. Rokos, A. Myles, W. Hutzenlaub ja W. Pfleiderer, Chem Ber. 108 (1975) 2872 - 2877; J. Tomasz, Nucl. Nucl.
2(1) (1983) 51 - 61; M. Nemer, N. Theriault, A. Schifmann 30 ja K. K. Ogilvie, VIth International Round Table,
Nucleosides, Nucleotides and their biological Applications, toim. J. L. Imbach, La Grande Motte 1984, s. 94 - 96] tai sivutuotteina [R. Letsinger ja K. K. Ogilvie, J. Amer. Chem. Soc. 89 (1967) 4 801 - 4 802] . Tällaiset 35 dimeerit eivät kuitenkaan kykene liian alhaisen sulamis- il 104177 pisteensä vuoksi periaatteessa hybridisoitumaan stabiilis-ti solujen nukleiinihappojen kanssa. Oligonukleotideja, joissa on vain toisessa päässä 5'-5'-sidos, on muodostettu tarttumiskohdan saamiseksi merkkiaineryhmille geenikoet-5 timien yhteydessä [S. Agrawal, C. Christodoulou ja M. J. Gait, Nucleic Acid Res. 14 (1986) 6 227 - 6 245] . Niiden hybrisidaatiokäyttäytymistä ei ole kuitenkaan vielä tutkittu. Biofysikaalisia tutkimuksia varten on valmistettu itsekomplementaarisia oligonukleotideja, joissa on mole-10 kyylin keskellä yksi 3'-3'- tai 5'-5'-sidos [J. H. van de Sande, N. B. Rams in, M. W. German, W. Elhorst, B. W. Lakisch, E. V. Kitzing, R. T. Pon, R. C. Clegg ja T. M. Jovin, Science 241 (1988) 551 - 5 557].
Käännetyllä terminaalisella 3'-3'- ja 5'-5'-sidok-15 sella varustettujen oligonukleotidien valmistus tapahtuu samalla tavalla kuin biologisten oligonukleotidien synteesi liuoksessa tai edullisesti kiinteällä faasilla, mahdollisesti automaattisen syntetisointilaitteen avulla.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I tai II 20 mukaisten oligonukleotidien valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) nukleotidiyksikkö, jossa on 3'- tai 5'-terminaaliset fosfori (III)- tai fosfori(V)-ryhmittymät, tai sen aktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan toisen nuk- . 25 leotidiyksikön kanssa, jossa on 3'- tai 5'-terminaalinen vapaa hydroksyyliryhmä, tai b) muodostetaan oligonukleotidi samalla tavalla fragmenttien kautta, lohkaistaan kohdan (a) tai (b) mukaisesti saaduista oligonukleotideista muiden funktionaalis- 30 ten ryhmien suojaamiseksi mahdollisesti tilapäisesti lii-• tetty yksi tai useampi suojausryhmä ja muutetaan siten saadut kaavan I mukaiset oligonukleotidit mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttäväksi suolakseen.
Lähtöainekomponenttina terminaalisen käännetyn 35 3'-3'-sidoksen sisältävien oligonukleotidien valmistami- 12 104177 seksi käytetään kiinteäfaasisynteesien yhteydessä kantaja-hartsia, johon ensimmäinen nukleosidimonomeeri kytketään 5'-OH-ryhmän kautta. Tämän komponentin valmistukseen käytetään kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä (T. Atkin-5 son ja M. Smith teoksessa Oligonucleotide Synthesis, toim. M. J. Geit, 1984, s. 35 - 49) valmistettua kantajahartsiä, edullisesti silikageeliä tai kontrolloitua huokoslasia, johon on lisätty funktionaalisia aminoryhmiä. Se saatetaan reagoimaan nukleosidijohdannaisen kanssa, jonka nukleo-10 sidiemäs ja 31-OH-ryhmä on suojattu ja joka on ennalta muutettu 5'-p-nitrofenyylisukkinaatiksi. Emäksen suojaus-ryhminä käytetään edullisesti asyyliryhmiä, esimerkiksi bentsoyyli-, isobutyryyli- tai fenoksiasetyyliryhmiä. 3'-asema suojataan edullisesti dimetoksitrityylisuojaus-15 ryhmällä, joka voidaan liittää molekyyliin M. D. Matteuc-cin ja M. H. Caruthersin menetelmällä [Tetrahedron Letters 21 (1980) 3 243 - 3 246]. Oligonukleotidiketjun rakentaminen edelleen toiseksi viimeiseen ketjun jäseneen asti tapahtuu kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin, edullisesti 20 käyttämällä nukleosidi-3-fosfonihappoesteriamideja tai nukleosidi-3'-H-fosfonaatteja, joiden 5'-OH-ryhmä on suojattu. Viimeisenä ketjun jäsenenä käytetään nukleosidi-5'-fosfonihappoesteriamidia tai nukleosidi-H-fosfonaattia, jonka 31-OH-ryhmä on jälleen suojattu, edullisesti dime-. 25 toksitrityyliryhmällä. Mainitunlaisen käännetyillä termi naalisilla nukleotidien välisillä sidoksilla varustetun oligonukleotidiketjun valmistus esitetään seuraavassa kaavion avulla (fosforiamidiittisykli terminaalisilla 3 ' -3 ' — ja 51-5'-sidoksilla varustettujen oligonukleotidien val-30 mistamiseksi). 3'-3'- tai 5'-5'-sidoksilla varustettujen oligonukleotidien valmistus tapahtuu vastaavasti.
13 104177 ""Is·'} " "C2 + ? yf V ·Λζ< 0“*» V' 7l. DETRITYLOINTI \
P® 2. AKTIVOINTI I
\ JA ADDITIOj
Dine-, 0 · / K* 7 /1 3. PÄIDEN SUOJAUS · r """v's y \b°· O-P-CW ix. /—v ό 1. HAPETUS O ^ °'V°'si A*""=*>-;-» / 0_ο>=Ί
V DETRITYLOINTI n KONDENSAATION JÄLKEEN
-"W -Ö * >ί~Υ?
1-O I / A
I / 2. AKTIVOINTI
re-p=o ,,
I 1 JA
V! ADDITIO w ··- ,_ re-^O SUOJAUS ,__Π—--- I ouno Γ o I 4. HAPETUS w-r«e ro-p=o
: I
o
0-JM
14
Rakenne- ja sekvenssianalyysi tapahtuu merkitsemällä ensin 3'-3'- ja 5'-5'-päät sisältäväksi muodostetun oligonukleotidin päät. Tämä tapahtuu radionuklidileimauk-sella, edullisesti 5'-γ-32Ρ-ΑΤΡ:n/polynukleotidikinaasin 5 avulla. Tämä radionuklidileimaus tapahtuu vapaalle 5'-0H-ryhmälle, ts. nukleotidiketjun vastakkaiseen päässä verrattuna oligonukleotidiin, joka sisältää vain biologisia 3'-5'-sidoksia. Sekvenssianalyysi tapahtuu muuten kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin, edullisesti emäspesifisen, 10 tilastollisen pilkkomisen kautta, Maxamin ja Gilbertin kuvaamalla tavalla [A. M. Maxam ja W. Gilbert, Methods in Enzymology 65 (1980) 499 - 560],
Koska radioaktiivinen leimaus on tehty molekyylin "käänteisessä" päässä, tapahtuu sekvenssin luenta biologi -15 sen 3'-5'-sidoksen sisältävään oligonukleotidiin verrattuna käänteisessä suunnassa. Yhtä koetta kuvataan perusteellisesti esimerkissä 6.
Kaavojen I ja II mukaisilla oligonukleotideilla on käyttöä hybrisaatiokemiallisissa, yksi- ja kaksisäikeisiin 20 nukleiinihappoihin tapahtuvaan sitoutumiseen perustuvissa menetelmissä nukleiinihappojen biologisen toiminnan säätelemiseksi tai estämiseksi samoin kuin virusgenomivaikutus-ten ilmenemisen estämiseksi ja virusten vaikutusten ennaltaehkäisemiseksi ja hoitamiseksi, onkogeenien toiminnan 25 estämiseksi ja syöpäsairauksien hoitamiseksi.
In vivo -stabilisuuden mittana voidaan pitää veriseerumiin liuotetun, keksinnön mukaisesti muodostetun, kaavan I tai II mukaisen oligonukleotidin käyttäytymistä. Esimerkissä 7 kuvataan yleistestiä ja esimerkissä 8 vas-30 taavaa in vitro -testiä, jossa käytetään käärmeenmyrkky- . fosfodiesteraasiliuosta. Keksinnön mukaisesti saatavat « oligonukleotidit hajoavat paljon hitaammin kuin 3'-5'-oli-gonukleotidit.
is 104177
Esimerkissä 11 osoitetaan terminaalisen käännetyn 3'-3'-sidoksen sisältävien oligonukleotidien stabilisuus seerumissa.
Hybridisaatiokäyttäytyminen käy ilmi mallikokeista, 5 jollaisia kuvataan esimerkissä 9 ja joissa joukolla SV40-spesifisiä sekvenssejä, jotka on valmistettu keksinnön mukaisesti kulloinkin 3'-3'- ja 5'-5'-pään sisältäviksi, on hybridisoitaessa vastaavan SV40-DNA:n vastinsäikeen kanssa sulamispiste, joka on vain epäolennaisesti alempi 10 kuin sulamispiste, joka mitataan tehtäessä hybridisointi käyttämällä vastaavaa sekvenssiä, jota ei ole muodostettu keksinnön mukaisesti, ts. on ilman 3'-3'- ja 5'-5'-päätä.
Keksinnön mukaisesti terminaalisilla 3'-3'- tai 5'-5'-sidoksilla varustettujen oligonukleotidien teho gee- 15 nien ilmentymisen inhibiittoreina ilmenee SV40-viruksen kasvun hidastumisena (esimerkki 10) samoin kuin onkogeenin ilmentymistuotteen p53 inhibitiona in vitro (esimerkki 12) .
Esimerkki 1 20 3'-0-DMTr-deoksiribonukleosidi-5'-(N,N-bis-di-iso- propyyliamino-JJ-syaanietoksi)fosfonihappoesteriami- din synteesi
Reaktiokaavio jossa lähdetään emässuojatuista nuk-leosideista, esitetään seuraavassa: : 25 MO—| 0 B DUTrO—i β B HO—i „ · Ίο \y \y— i- Γ-' NITROMETAANI ΟΟΗιΟΗ,ΟΗ OH DUTrO DUTrO α Fx / U-d 2a-d 3a-d 30 ' . NCCH|CH|0
DMTJO
35 4"d 16 104177 a: B = tyrniini b: B = N5-bentsoyyliadeniini c: B = l^-bentsoyylisytosiini d: B = N2-isobutyryyliguaniini 5 DMTr = 4,4'-dimetoksitrityyli A) 3',5'-O-bis-DMTr-deoksiribonukleosidin 2 valmistus
Aineet: 6 mmol dT:tä, dAbz:ää, dCbz:ää tai dGibu:a 10 14,4 mmol DMTr-Cl:a 14,9 mmol TEA:a (absoluuttista)
Deoksiribonukleosidi 1 liuotetaan absoluuttiseen pyridiiniin (50 ml) ja lisätään lämpötilassa 0 °C trietyy-liamiini ja dimetoksitrityylikloridi. Sitten seosta sekoi-15 tetaan 24 tuntia huoneenlämpötilassa seuraten reaktiota ohutkerroskromatografisesti (eluentti: CH2Cl2/MeOH 9:1).
Reaktio keskeytetään lisäämällä metanolia, liuotin haihdutetaan pois alipaineessa ja jäännös siirretään dikloorime-taaniin. Orgaaninen faasi pestään useaan kertaan NH4HC03-20 liuoksella ja vedellä, kuivataan Na2S04:lla ja väkevöidään pyöröhaihduttamalla.
31,5'-ditrityloitu tuote 2 voidaan puhdistaa ylimääräisestä tritanolista tai 5'-DMTr-dN:sta pylväskromato-grafiällä (pylväsmateriaali: silikageeli 60H, eluentti: : 25 CH2C12, jossa metanolipitoisuus kasvaa, jolloin ditrityloi- dut deoksinukleosidit eluoituvat MeOH-pitoisuuden ollessa 1 - 1,5 %). Saanto 73 - 85 % teoreettisesta.
B) 5'-dimetoksitrityyliryhmän spesifinen lohkaisu
Kirjallisuus: M. D. Matteucci ja M. H. Caruthers, 30 Tetrahedron Lett. 21 (1980) 3 243 - 3 246
Aineet: i 3 mmol 3',5'-O-bis-DMTr-dN:a 2 15 mmol ZnBr2:a 200 mmol absoluuttista nitrometaania 104177 17 3', -51-O-bis-DMTr-dN:n 2 liuos nitrometaanissa (100 ml) lisätään lämpötilassa 0 °C sinkkibromidin suspensioon nitrometaanissa (100 ml) . Suojatun deoksiadenosiinin ollessa kyseessä reaktio tehtiin jäähdyttäen depurinoitu-5 misen välttämiseksi. Lohkeaminen on tämän nukleosidin kohdalla kuitenkin mennyt loppuun jo 60 min:n kuluttua, kuten on todettavissa ohutkerroskromatografisesti. Tymidiinin ja deoksiguanosiinin kohdalla reaktio on samoin mennyt loppuun 60 min:n kuluttua huoneenlämpötilassa, kun taas bis-10 DMTr-deoksisytidiinin 5'-detritylointi tapahtuu vain epätäydellisestä. Tässä tapauksessa reaktio keskeytettiin 3 tunnin kuluttua, jotta vältettiin myös 31-dimetoksitrityy-liryhmän lohkeaminen.
Reaktio keskeytetään lisäämällä 200 ml NH4Ac-liuosta 15 (1 mol/1) ; tuote 3 uutetaan CH2Cl2:lla (200 ml), orgaaninen faasi pestään vielä kyllästetyllä NaCl-liuoksella ja vedellä, kuivataan Na2S04:lla ja poistetaan liuotin ali-painetislauksella.
Pääosa tritanolista voidaan erottaa saostamalla 20 raakatuote n-heksaanista (noin 500 ml) lämpötilassa -15 °C. Puhdistus tehdään sitten kromatografisesti silikageeli 60H -pylväässä käyttämällä eluenttina dikloor-imetaania, jonka metanolipitoisuus kasvaa.
3'-DMTr-deoksiribonukleosidien Rf-arvot eroavat vas-; 25 taavien 5' -trityloitujen monomeerien Rf-arvoista seuraavas ti (eluentti CH2Cl2(MeOH 24:1): 3'-DMTr-dN 5'-DMTr-dN dT 0,28 0,21 3 0 dAbz 0,55 0,29 ' , dCbz 0,53 0,31 dGibu 0,32 0,14
Saanto: 48 - 65 % teoreettisesta.
is 104177 C) 3'-O-DMTr-deoksiribonukleosidi-5'-O-(N,N-di-iso-propyyliamino-B-syanoetoksi)fosfonihappoesteriami-din 4 valmistus
Kirjallisuus: H. Köstner, Nucleic Acid Res. 12 5 (1984) 4 539 - 4 557
Aineet: 1 mmol 3'-O-DMTr-deoksiribonukleosidia 3 1,5 mmol kloori-N,N-di-isopropyyliamino-S-syanoe-toksifosfiinia 10 4 mmol di-isopropyyliamiinia
Fosfitylointireaktiot toteutettiin noudattamalla Kösterin et ai. kuvaamia menetelmiä 5'-O-DMTr-deoksiribo-nukleosidi-3'-O-fosfonihappoesteriaminin valmistamiseksi. Suojatun nukleosidin liuokseen absoluuttisessa CH2Cl2:ssa 15 lisättiin argonin alla di-isopropyyliamiini ja sen jälkeen fosforylointiaine. Reaktio keskeytettiin 30 min:n kuluttua lisäämällä 30 ml etyyliasetaattia, uutettiin liuos kolmesti kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kuivattiin orgaaninen faasi Na2S04:lla ja tislattiin liuotin pois alipaineessa.
20 Raakatuote puhdistettiin pylväskromatografisesti (pylväs-materiaali: silikageeli 60H, eluentti; petrolieetteri/di-kloorimetaani/trietyyliamiini 45:45:10).
Saanto (4a): 93 % teoreettisesta.
Esimerkki 2 . 2 5 3 '-3 '-fosfodiesterisidoksella varustetun tymidyyli- tymidiinin valmistus
Seuraavassa esitetään reaktiotie dimeeriyksikön valmistamiseksi: 104177 19 0 NCCH,CH|0 X X v/'a
HO-. 0VH^O OVTlO-i 0 T OUTiO-, „ T
VN DMTr-Ct A | 5 OH OH Pe ia S MCCH|CH|0'^JI-< *°-\0 *°10/ jo»*,
0MT<O DWTrO OH
10 7 * o^-^t """lp? HO-\^y o + ATO-. T _1-XEIB^SOLI 0=?-οοη,οη,ο. oJ-oh Λ , K 7 2. J, ’ 2. HAe · HCCHjCHjO N-^ 'j—^ 1 ? ?
” ·. >A .A
9 fO
A) 5'-0-dimetoksi.trityylitymidiinin 5 valmistus 20 Aineet: 20 mmol tymidiiniä (4,84 g) 24 mmol 4,4'-dimetoksitrityylikloridia (8,2 g) 1 mmol dimetyyliaminopyridiiniä (122 mg) 28 mmol absoluuttista trietyyliamiinia (3,8 ml) : 25 Yhdiste 5 valmistettiin R. A. Jonesin menetelmällä [G. S. Ti, B. L. Gaffney ja R. A. Jones, J. Amer. Chem. Soc. 104 (1982) 1 316 - 1 319] . Tymidiini kuivattiin haihduttamalla se kolmesti yhdessä absoluuttisen pyridiinin kanssa (50 ml kerralla), sekoitettiin pyridiiniin (100 ml) 30 ja lisättiin jäillä jäähdyttäen 4,4'-DMTr-Cl ja DMAP kata-. lysaattoriksi. Reaktio seurattiin ohutkerroskromatogra- fiällä (eluentti CH2Cl2/MeOH 9:1) : reaktio voitiin 4 tunnin • kuluttua keskeyttää lisäämällä 100 ml vettä. Liuos uutet tiin kolmesti eetterillä, orgaaninen faasi kuivattiin ja 35 väkevöitiin pyöröhaihduttimessa ja jäännös puhdistettiin 104177 20 tekemällä uudelleenkiteytys bentseenistä. Saanto 9,68 g DMTr-dT:ä (89 %).
B) 5'-O-dimetoksitrityylitymidiini-3'-O-(N,N-di-isopropyyliamino-B-syanoetoksi)fosfonihappoesteri- 5 amidin 6 valmistus
Yhdiste 6 valmistettiin ja puhdistettiin 3'-O-DMTr-5'-O-fosfonihappoesterin 4 synteesiä (esimerkki 1, C) vastaavalla tavalla.
C) 5'-O-asetyylitymidiinin 8 valmistus 10 Aineet: 2,0 mmol 3'-Ο-DMTr-dT:ä 3a (1,1 g) 0,2 mmol dimetyyliaminopyridiiniä (12,2 mg) 4 ml etikkahappoanhydridiä 15 Kirjallisuus: A. M. Michelson ja A. R. Todd, J.
Org. Chem. 1955, 2 632 - 2 638 (muunnettuna)
Liuokseen, joka sisälsi 31-Ο-DMTr-dT:n ja DMAP:n absoluuttisessa pyridiinissä (20 ml), lisättiin pisaroittaan ja jäillä jäähdyttäen Ac20. Reaktio oli mennyt loppuun
20 3 tunnin kuluttua (seuranta TLC:llä; eluentti CH2Cl2/MeOH
24:1). Tuote 7 saostettiin jäävedestä (400 ml), valkea sakka erotettiin imusuodatuksella, pestiin jäävedellä ja kuivattiin. Saanto: 1,02 g 3'-O-DMTr-51-0-Ac-dT:ä (88 %).
4,4' -dimetoksitrityyliryhmän lohkaisemiseksi yhdis-: 25 tettä 7 sekoitettiin 80-%:isessa etikkahapossa (10 ml) huoneenlämpötilassa. Reaktio keskeytettiin 3 tunnin kuluttua lisäämällä 100 ml jäävettä; tällöin 4,4'-dimetoksitri-tanoli erottui valkeana sakkana. Se erotettiin imusuodatuksella ja vesisuodos väkevöitiin pyöröhaihduttimessa.
30 Öljymäinen jäännös sekoitettiin pieneen määrään CH2Cl2:a ja saostettiin n-heksaanista (200 ml) (200 ml). Saanto 455 mg 5 1-O-asetyylitymidiiniä (94 %).
D) Tymidilyyli-(3'-3')tymidiinin 10 valmistus Aineet: 35 1,0 mmol 5'-0-DMTr-tymidiini-31-0-(N,N-di-isopro- 104177 21 pyyliamino-E-syanoetoksi)fosfonihappoesteriamidia 6 (795,8 mg) 0,9 mmol 5'-O-asetyylitymidiiniä 8 (253 mg) 2,6 mmol tetratsolia (182 mg) 5 9,0 mmol I2:a (1,14 g)
Dimeeriyksikön 10 synteesi voitiin tehdä Kösterin [H. Köster, Nucleic Acid Res. 12 (1984) 4 539 - 4 557) kuvaamin menetelmin valmistamalla 3 '-5 '-nukleosididimeerejä. 5'-O-asetyylitymidiinin ja tetratsolin seos liuotettiin 10 absoluuttiseen CH3CN:iin (30 ml) ja lisättiin seos argonin alla fosfonihappoesteriamidiin. Lisättiin 9 mmol I2: a ase-tonitriilin, pyridiinin ja veden seoksessa (24:5:1, 30 ml) ja pelkistettiin 15 min:n kuluttua ylimääräinen jodi 40-%:isella H2S03-liuoksella (5 ml). Liuos väkevöitiin, 15 jäännös siirrettiin CH2Cl2:iin, pestiin kahdesti kyllästetyllä NaHC03-liuoksella ja poistettiin liuotin tislaamalla. Raakatuote voitiin puhdistaa pylväskromatografisesti (pyl-väsmateriaali: silikageeli 60H; eluentti etyyliasetaat- ti/dikloorimetaani 50:50). Saanto 665 mg (75 %).
20 Asetyyli- ja β-syanoetyyliryhmien lohkaisemiseksi käsiteltiin dimeeriä 1 tunti väkevällä NH3:lla (5 ml) huoneenlämpötilassa; 4,4'-dimetoksitrityyliryhmät voitiin poistaa 80-%:isella etikkahapolla.
Esimerkki 3 ; 25 5-5'-fosfodiesterisidoksella varustetun tymidilyy- li-tymidiinin 14 valmistus
Seuraava kaavio esittää yhdisteen 14 valmistusta: » 22 104177
«yj - , "°~W
m ST »“ 5 5 11 12
OCHjCHjCN
MCCH,CH,o, TETRAT- T „ ro-^-o-, „ T
- * >1'· V ^ ^ 5 V
o* eWT,° f3 f2 ** / -/tJIH,
/ tHta OH X
OH βΗ 14
Yksittäiset reaktiovaiheet välivaiheyhdisteiden syntetisoimiseksi tehtiin esimerkissä 2 kuvatuilla mene- 20 telmillä.
Kyseisten kahden dimeeriyksikön rakenne voitiin varmistaa FAB-massaspektrometrialla ja 1H-NMR-spektrosko-pialla.
Esimerkki 4 : 25 3'-O-dimetoksitrityylideoksiribonukleosidi-5' -O- sukkinaatin lisääminen CPG 10-1400 -kantaja-materiaalille CPG-kantajan funktionalisointi 3-aminopropyyliket-juilla tehtiin Atkinsonin ja Smithin mukaisesti (T. Atkin-30 son ja M. Smith teoksessa Oligonucleotide Synthesis, toim.
: M. J. Gait, 1984, s. 35 - 49).
A) 3'-O-DMTr-deoksiribonukleosidi-5'-O-sukkinaatin 15 valmistus Aineet: 35 1,0 mmol 31-O-DMTr-dN:A 3 23 1 04 1 77 0,8 mmol meripihkahappoanhydridiä (80 mg) 0,5 mmol dimetyyliaminopyridiiniä (61 mg) Meripihkahappoanhydridin reaktio deoksiribonukleo-sidin 5'-0H-ryhmän kanssa tehtiin kussakin tapauksessa 5 absoluuttisessa pyridiinissä käyttämällä DMAP:ä kataly saattorina ja antamalla seoksen reagoida yön yli huoneenlämpötilassa. Kun reaktio oli mennyt loppuun, liuos väke-vöitiin ja poistettiin pyridiini tekemällä kolmesti atseo-trooppinen tislaus tolueenin kanssa. Jäännös siirrettiin 10 dikloorimetaaniin, pestiin jääkylmällä 10-%:isella sitruu-nahappoliuoksella ja vedellä ja poistettiin orgaaninen faasi alipaineessa pyöröhaihduttimessa. Raakatuote liuotettiin tolueeniin (noin 3 ml) ja saostettiin n-heksaanis-ta (200 ml). Saannot: 79 - 84 %.
15 B) 3'-O-DMTr-deoksiribonukleosidi-5'-O-sukkinyyli- p-nitrofenyyliesterin 16 valmistus ja lisääminen kantajalle (katso seuraava kaavio) 20 "vy f°\°y
DhTTiO β OH OOMTr Ö 0WTt 3t-d 1SM-d A) ie*‘d H|N/N/S0-«I-0 N HOi 2 5 Η,Ν^ο-ί,-ο 0/
| DMTiO
30 = ®-°-w
DM7rO
9 24 104177
Aineet : 0,8 mmol 3'-O-DMTr-dN-5'-O-sukkinaattia 15 0,8 mmol p-nitrofenolia (112 mg) 2,0 mmol disyklokarbodi-imidiä (412 mg) 5 3 g funktionalisoitua CPG 10-1400:aa
Suojattu sukkinyloitu deoksiribonukleosidi lisättiin p-nitrofenolin liuokseen absoluuttisessa dioksaanissa (5 ml) ja pyridiinissä (0,2 ml) ja lisättiin sitten DCCI:ä kondensointlaineeksi. Jo lyhyen ajan kuluttua disyklohek-10 syyliurea saostui ja 3 tunnin kuluttua TLC (CH2Cl2/MeOH 9:1) osoitti reaktion menneen loppuun. Sakka erotettiin imusuodattamalla argonin alla ja suodos lisättiin suoraan funktionalisoidun kantajamateriaalin suspensioon absoluuttisessa DMF:ssä (15 ml). Lisättiin 0,8 ml trietyyliamiinia 15 ja seosta ravisteltiin yön yli. Kuormitettu kantaja erotettiin sitten imusuodatuksella, pestiin metanolilla ja eetterillä ja kuivattiin eksikkaattorissa. Kantajan kuormittuminen määritettiin spektrometrisesti. Käsittelemällä kantajanäyte (noin 2 mg) p-tolueenisulfonihappoliuoksella 20 (0,1 ekv/1, 10 ml) asetonitriilissä lohkaistaan 4,4'-dime- toksitrityylikationi ja mittaamalla liuoksen absorptio aallonpituudella 498 nm voidaan kantajan kuormittuminen (μτηοΐ/g) laskea seuraavasta yhtälöstä: 25 OD4g8/ml x 10 ml x 14,3 (vakio) mg kantajaa
Tulokset: 3 ' -DMTr-dT-kantaja : 23 μταοΐ/g 3 1-DMTr-dGibu-kantaja : 21 μιηοΐ/g 30 3 '-DMTr-dAbz-kantaja: 21 μτηοΐ/g 3 '-DMTr-dCbz-kantaja: 15 μτηοΐ/g
Reagoimattomien aminoryhmien suojaamiseksi kuormitettua kantajaa ravisteltiin 1 tunti huoneenlämpötilassa liuoksen kanssa, joka sisälsi 1 ml etikkahappoanhydridiä 35 ja 50 mg dimetyyliaminopyridiiniä absoluuttisessa pyridii- 25 104177 nissä (15 ml), erotettiin kantaja siten imusuodatuksella, pestiin metanolilla ja eetterillä ja kuivattiin.
Esimerkki 5 a) Terminaalisella 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksella va-5 raastettujen oligonukleotidien synteesi
Synteesit toteutettiin DNA-syntetisointilaitteella (Applied Biosystems, Forster City, USA; malli 381A) käyttämällä 0,2 μτποί -standardiohjelmaa kaikissa kondensaatio-vaiheissa.
10 Synteesisykli on esitetty edellä (s.12) Kantajama- teriaalina käytettiin esimerkissä 4 kuvattua CPG 10 -1 400:aa. Kondensoinnit tehtiin käyttämällä tavanomaisia nukleosidi-3-fosfonihappoestereitä; vain viimeisessä reak-tiosyklissä käytettiin esimerkissä 1 kuvattuja 3'-O-DMTr- 15 nukleosidi-5'-0-(N,N-di-isopropyyliamino-S-syanoetok-si)fosfonihappoesteriamideja. Kun oligonukleotidi oli irrotettu kantajalta väkevällä NH3:lla ja kaikki fosfaatti-ja emässuojausryhmät poistettu pitämällä ammoniakkiliuosta lämpötilassa 60 °C yön yli, poistettiin näytteestä suolat 20 saostamalla se etanolista ja puhdistettiin päämääränä oleva sekvenssi lyhyemmistä fragmenteista polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla.
Tutkimuksia varten syntetisoitiin pelkästään 3'-5'-sidoksia sisältävä eikosatymidylaatti samoin kuin termi-: 25 naalisilla 3'-3'- ja 5'-51-sidoksilla varustettu vastaava yhdiste. Lisäksi valittiin SV40-genomista peräisin olevia sekvenssejä. Syntetisoitiin seuraavat sekvenssit: dT20; dT20 (3'-3',5'-5') ; 30 SV40TS17: 17-meerinen koodittava sekvenssi SV40- * : genomin asemien 5159 - 5176 alueelta; 5'-ACG TTT GCA AAG ATG GA-3' SV40TAS17: 17-meerinen SV40TS17:ää vastaava anti- sense-sekvenssi; 35 51-TCC ATC TTT GCA AAG CT-3' „ 104177 2 6 SV40TAS17(3'-3',5'-5'): 17-meerinen SV40TS17:ää vastaava antisense-sekvenssi, jonka päissä on 3'-3’- tai 5'-5'-sidos; 3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG C(3,-3')T-5' 5 SV40TS35: 35-meerinen koodittava sekvenssi SV40- genomin asemien 5142 - 5176 alueelta;
51 -AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGA
AG-3 ' SV40TAS35: 35-meerinen SV40TS35:ä vastaava anti- 10 sense sekvenssi:
5' -TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG
CT-3 ' SV40TAS35(3'-3',5'-5'): 35-meerinen, SV40TS35:ä vastaava antisense-sekvenssi, jonka päissä on 3'-3'- tai 15 51 - 5'-sidos; 3 ' -T (5 ' -5 ' ) CT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAGC(3'-3')T-51 b) Terminaalisella 3'-3'-sidoksella varustettujen oligonukleotidien valmistus
20 Kantajamateriaalina toimi esimerkissä 4 kuvattu CPG
10-1 400. Kondensoinnit tehtiin käyttämällä tavanomaisia nukleosidi-3'- fosfonihappoestereitä. Kun oligonukleotidi oli irrotettu kantajasta väkevällä NH3:lla ja poistettu kaikki fosfaatti- ja emässuojausryhmät pitämällä ammoniak-: 25 kiliuos yön yli lämpötilassa 60 °C, näytteestä poistettiin suolat saostamalla etanolista ja puhdistettiin päämääränä oleva sekvenssi lyhyemmistä fragmenteista polyakryyliami-digeelielektroforeesilla.
SV40TAS17(3'-3'): 17-meerinen SV40TS17:ää vastaava 30 antisense-sekvenssi, jonka päässä on 3'-3'-sidos; ; 3'-TCC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5' r 27 1 04 1 77 c) Terminaalisella 5'-sidoksella ja 2 terminaalisella tiofosfaattiryhmällä varustettujen oligonuk-leotidien synteesi
Kantajamateriaalina toimi kaupallisesti saatavissa 5 oleva CPG-materiaali, joka sisältää 5'-O-dimetoksitrityy-litymidiiniä sidottuna 3'-hydroksyyliryhmän kautta. Kon-densoinnit tehtiin käyttämällä tavanomaisia nukleosidi-3-fosfonihappoestereitä; vain viimeisessä reaktiosyklissä käytettiin esimerkissä 1 kuvattuja 31-O-DMTr-nukleosidi- 10 5'-O-(N,N-di-isopropyyliamino-E-syanoetoksi)fosfonihappo- esteriamideja. Kaksi ensimmäistä reaktiosykliä toteutetaan käyttämällä tavanomaisen jodihapetuksen sijasta hapetusta alkuainerikillä [W. Stec et ai., J.A.C.S. 106 (1984) 6 077] .
15 Kun oligonukleotidi oli irrotettu kantajasta väke vällä NH3:lla ja poistettu kaikki fosfaatti- ja emässuo-jausryhmät pitämällä ammoniakkiliuos yön yli lämpötilassa 60 °C, näytteestä poistettiin suolat saostamalla etanolista ja puhdistettiin päämääränä oleva sekvenssi lyhyemmistä 20 fragmenteista polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.
Syntetisoitiin seuraava oligonukleotidi: SV40TAS17(5'-5'): 17-meerinen SV40TS17:ää vastaava antisense-sekvenssi, jonka 5'-päässä on 5'-5'-sidos ja 3' -päässä kaksi nukleotidien välistä tiofosfaattisidosta : ' 25 3 '-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG(PS)C(P.) -3 ' .
Esimerkki 6
Terminaalisella 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksella varustetun oligonukleotidin rakenteen ja sekvenssin analysointi 30 Oligonukleotidit sekvensoitiin Maxamin ja Gilbertin * : menetelmällä [A. M. Maxam ja W. Gilbert, Methods in Enzy- mology 65 (1980) 499 - 560]. Kussakin tapauksessa leimat- • tiin näytteen (100 pmol) 5'-0H-ryhmä radioaktiivisesti (γ-32P)-ATP/T4-polynukleotidikinaasin läsnä ollessa ja tehtiin 35 sitten seuraavat emäspesifiset reaktiot: 104177 28 (A+G) -reaktio: emästen protonointi muurahaishapolla G-reaktio: reaktio dimetyylisulfaatin kanssa (T+C)-reaktio: hydratsinolyysi C-reaktio: reaktio hydratsiinin kanssa NaCl:n 5 (5 mol/1) läsnä ollessa.
Käsittelemällä piperidiinillä (1 mol/1) lämpötilassa 95 °C pilkottiin oligonukleotidiketjut muunnetuista kohdista; kappaleet voitiin erottaa polyakryyliamidigee-lielektroforeesilla (20 % akryyliamidia, 7 mol/1 ureaa) ja 10 detektoida autoradiografiällä. Kuvio 1 esittää SV40TS17:n, SV40TAS17:n ja SV40TAS17(3'-3',5'-5'):n sekvensoinnista saatua autoradiogrammia (oligonukleotideja kuvataan esimerkissä 5). Koska ketjujen 5'-OH-ryhmä on leimattu, voidaan emäsjärjestys lukea vain 3'-5'-sidosten ollessa ky-15 seessä 3'-5'-suuntaan. 3'-3'-pään vuoksi on oligonukleoti-dissa SV40TAS(3'-3',5'-51) kuitenkin radionuklidileimattu 5'-OH-ryhmä 3'-päässään; sekvenssin luentasuunta on siksi päinvastainen (kuvio 1).Tämä osoittaa myös 51-5'-fosfodi-, esterisidoksen läsnäolon ketjun 5'-päässä, jossa on vapaa 20 3'-OH-ryhmä, jota polynukleotidikinaasientsyymi ei pysty fosforyloimaan.
Esimerkki 7 3'-3'- ja 5'-5'-pälliä varustetun oligonukleotidin stabilisuuden tutkiminen veriseerumitestillä 25 A) 3'-3'- ja S^S^päillä varustetun eikosatymidy- laatin kinaasikäsittely
Kirjallisuus: T. Mizuno, M.-Y. Chou ja M. Inouya, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 1966 - 1970 Aineet: 30 1 μΐ oligonukleotidia (OD260 0,01) t 1 μΐ kinaasipuskuria (väkevyys lOx) 1 μΐ T4-polynukleotidikinaasia 1 μΐ Y-32P-dATP:a (ominaisaktiivisuus 6000 Ci/mmol) 6 μΐ H20 : ä 29 1 04 1 77
Aineseosta inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 °C, sitten reaktio keskeytetään lisäämällä 90 μΐ vettä ja seos fraktioidaan SephadexR G50 -pylväällä. Tuotefraktiot yhdistetään ja kylmäkuivataan, 5 b) Veriseerumitesti
Kirjallisuus: S. M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 6 771 - 6 772
Aineet:
Radioaktiivista fosforyloitua oligonukleotidia 10 referenssiaineeksi, OD260 0,01 T20:ä, OD260 0,01, kokeeseen T20:ä, jolla on 3'-3'-ja 5 '-5 '-sidoksin varustetut päät, OD260 0,01 50 μΐ tuoretta ihmisseerumia
Lisätään seerumia kuhunkin näytteeseen ja ravistel-15 laan hetki käsin. Siten pipetoidaan heti 3 μΐ näytettä 0-arvon määrittämistä varten ja lisätään se Formamid Loading Buffer -liuokseen (3 μΐ) entsyymiaktiivisuuden tuhoamiseksi. Sitten näytteitä inkuboidaan lämpötilassa 37 °C.
Kinetiikan tutkimiseksi otetaan tietyin aikavälein 20 3 μ1:η näytteitä ja keskeytetään reaktio edellä kuvatulla tavalla.
Referenssi: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min Koe: 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min, 90 min Näytteet laitetaan 20-%:iselle polyakryyliamidigee-: 25 lille ja tehdään geelielektroforeettinen erotus ja sitten autoradiograf ia.
Tuoreella ihmisseerumilla tehtyä pilkkomista kuvaava autoradiogrammi vasemmalta lukien (katso kuvio 2):
Referenssi: 0-arvo, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 30 min
Koe: 0-arvo, 5 min, 8 min, 11 min, 15 min, 30 min, 90 min
Jo 5 min:n kuluttua käy ilmi, että luonnossa esiintyvän oligonukleotidin pilkkoutuminen on alkanut. Hajoami-35 nen lisääntyy ajan kuluessa. Muunnettu oligonukleotidi on 30 104177 käytännöllisesti katsoen muuttumaton myös 90 min:n inku-boinnin jälkeen. Heikot vyöhykkeet, joita on nähtävissä kaikilla kinetiikkakokeen arvoilla, ovat tulosta seerumissa esiintyvien endonukleaasien aktiivisuudesta. Tämä pilk-5 koutuminen on tärkeää näiden oligonukleotidien terapeuttisen käytön kannalta ja toivottavaa, koska se takaa vaikuttavan aineen hitaan hajoamisen eikä siten näiden aineiden kerääntymistä elimistöön pääse tapahtumaan.
Esimerkki 8 10 Terminaalisen 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksen sisältävien oligonukleotidien käyttäytymisen tutkiminen käär-meenmyrkkyfosfodiesteraasin suhteen A) 3'-3'- ja 5'-5’-päillä varustetun eikosatymidy-laatin kinaasikäsittely 15 Tehtiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.
B) 3'-3'- ja 5'-5'-päillä varustetun exkosatymidy-laatin hydrolysointi käärmeenmyrkkyfosfodxesteraa-sin avulla
Kirjallisuus: A. Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi 20 ja M. Inouye, PNAS USA 83 (1986) 7 726 - 7 730 Aineet: 5 μΐ RNA-kantajaa 50 Ml SQ-puskuria 1 μΐ SVpdE:tä (1,5 yksikköä/μΐ) 25 Radioaktiivisesti fosforyloitu näyte (referenssi: T20, koe: terminaalisen 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksen sisältävä T20) kylmäkuivataan ja siihen lisätään RNA-kantaja ja SQ-puskuri. Kustakin seoksesta pipetoidaan 5 μΐ 0-arvon määrittämistä varten ja loppuosaan liuoksesta lisätään ent-30 syymiä ja inkuboidaan sitä lämpötilassa 37 °C. Referenssi-. näytteen kinetiikan määrittämiseksi otetaan 5 μ1:η näyte 5, 15 ja 30 min:n kuluttua, 3 ’ - 3'- ja 5'-5'-päillä varustetun eikosatymidylaatin kinetiikan määrittämiseksi otetaan 5 μ1:η näyte 5, 30, 45, 60 ja 90 min:n kuluttua. Ent-35 syymin inaktivoimiseksi näytteitä kuumennetaan heti otta- 31 104177 misen jälkeen 2 min vesihauteessa lämpötilassa 95 °C. Näytteet kylmäkuivataan ja ne laitetaan analyyttiselle 20-% : iselle polyakryyliamidigeelille . Geelielektroforeesi-erotuksen jälkeen näytteille tehdään autoradiografia.
5 SVpdE-hajotuksesta saatu autoradiogrammi (katso kuvio 3) vasemmalta lukien: T20 (referenssi), terminaalisilla 3 '-3 ' - ja 5 '-5 '-sidoksilla varustettu T20( koenäyt-teen kinetiikka: 5, 15, 30, 45, 60, 90 min:n kuluttua, seos 0+15 min, seos 0+30 min, referenssinäytteen kine-10 tilkka: 5, 15, 30, 45 min:n kuluttua.
5'-5'-sidos hajoaa heti, kuten edellä kuvattiin. Se, että jatkohajoaminen etenee referenssiin verrattuna vain hyvin hitaasti, on selvä viite rakenteesta. 5 ' -5 ' -fosfodiesterisidoksen katkettua jää jäljelle molekyyli, 15 jonka pilkkoutumiskohdassa on funktionaalinen 5'-hydrok-syyliryhmä. Molekyyli on toisesta päästään 5'-fosforyloi-tunut. Käärmeenmyrkkyfosfodiesteraasi ei pysty vaikuttamaan kumpaankaan päähän. Hidas - mutta sangen selvästi havaittava - hajoaminen edelleen johtuu todennäköisesti 20 valmistajan [J. G. Izant ja H. Weintraub, Cell 36 (1984) 1 007 - 1 015] kuvauksen mukaisesti lisätystä yk- sisäikeiselle muodolle spesifisestä endonukleaasista, joka muuttaa superkiertyneen PM2-DNA:n avoimiin muotoihin. Sekvenssin pituus on helposti määritettävissä. Nähtävissä on 25 kuitenkin vain 19 vyöhykettä, koska ensimmäisen kinetiikka-arvon kohdalla, 5 min:n kuluttua, 5'-5'-fosfodiesteri-sidos on jo katkennut.
Esimerkki 9 3'-3'- ja 5'-5'-pälliä varustettujen oligonukleoti-30 dien hybridisoitumiskäyttäytyrnistä koskevia tutki- ' . muksia
Hybridisoitumiskäyttäytymisen tutkimiseksi mitattiin sulamiskäyrät. Liuotettiin kussakin tapauksessa yhtä suuret moolimäärät (5,23 nmol) SV40TS17:ää ja 35 SV40TAS17(3'-3',5'-5'):ä (oligonukleotideja kuvataan esi- 104177 32 merkissä 5) puskuriliuokseen (1 ml) , joka sisälsi 10 nmol/1 Na-kakodylaattia ja 100 mmol/1 NaCl:a, pH 7,0, kuumennettiin liuos lämpötilaan 70 °C ja määritettiin re-naturoitumisen eteneminen hitaasti jäähdytettäessä 5 (1 °C/min) mittaamalla liuoksen absorptio. Vertailukäyrää varten käytettiin samanlaiset määrät SV40TAS17:ää. Vastaavasti liuotettiin kulloinkin 4,75 nmol SV40TS35:ä ja SV40TAS35:ä tai SV40TS35:ä ja SV40TAS35(3'-3',5'-5'):ä puskuriin, kuumennettiin lämpötilaan 90 °C ja mitattiin 10 absorptiota jäähdytyksen aikana. Määritettiin sulamis-käyrät, joista saatiin seuraavat sp-arvot:
SV40TS17 - SV40TAS17 54,1 °C
SV40TS17 * SV40TAS17(3'-3',5'-5') 53,3 °C
SV40TS35 * SV40TAS35 65,5 °C
15 SV40TS35 - SV40TAS35(3'-3',5'-5') 64,2 °C
Epäbiologiset sidokset alensivat siten sulamisläm-pötiloja vain 0,6 °C 17-meerin ja 1,3 °C 35-meerin yhteydessä .
Esimerkki 10 2 0 SV40-T-antigeenin biosynteesin inhibointi terminaa lisella 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksella varustetuilla oligonukleotideilla A) Soluviljelmä COSl-soluja kasvatettiin Dulbeccon muunnetussa Eag-25 le-alustassa (DMEM), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseeru-mia. Kudosviljelymaljoja inkuboitiin lämpötilassa 37 °C atmosfäärissä, joka sisälsi 7,5 % C02:a.
B) Radionuklidileimaus ja solujen rikkominen Siirrostettiin noin 4 x 104 solua yksisolukerroksek- 30 si kudosviljelymaljoihin. Yhtenäiset solukasvustot pestiin . kolmesti metioniinittomalla DMEM:llä ja leimattiin sitten 35S-metioniinilla (100 μΟϊ). Antisense-modulaatiokokeita varten soluja inkuboitiin samanaikaisesti oligonukleotidin Sv40TAS17(3'-3',5'-5') ja radioaktiivisen metioniinin 35 kanssa 30 min lämpötilassa 37 °C. Sitten solut pestiin 104177 33 kahdesti DMEM:llä, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia eikä sisältänyt leimattua metioniinia, ja jätettiin vielä 30 minrksi tähän alustaan. Rikkomisen aikaansaamiseksi solut käsiteltiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla fy-5 siologisella suolaliuoksella (PBS), kaavittiin maljoilta ja sentrifugoitiin 2 min kiihtyvyydellä 400 x g. Solupel-letille tehtiin sitten 45 min kestävä hajotus jäähauteessa käyttämällä 0,4 ml hajotuspuskuria (0,5 % Nonidet P40:ä, 100 mmol/1 Tris-HCl: a, pH 9,0, 0,1 mol/1 NaCl:a) 3 x 106 10 solua kohden. Proteolyysin välttämiseksi hajotuspuskuriin lisättiin 1 % Trasylolia ja fenyylimetyylisulfonyylifluo-ridia loppupitoisuudeksi 0,25 mg/ml. Lysaatti sentrifugoitiin sitten kirkkaaksi ultrasentrifugissa (30 min lämpötilassa 4 °C kiihtyvyydellä 105 000 x g). Otettiin 10 μ1:η 15 näyte ja mitattiin sen proteiinisisältö Lowryn menetelmällä. Immuunisaostukseen käytettiin yhtä suuret kokonaispro-teiinimäärät.
C) Immuunisaostus
Sekä villin tyypin SV40-T-antigeenin että sytoplas-20 massa sijaitsevan mutantti-T-antigeenin immuunisaostukseen käytettiin monoklonaalista vasta-ainetta PAbl08. Vasta-aine puhdistettiin kromatografisesti proteiini A -Sepharo-sella hybridoomasupernatantista. Solu-uute esisaostettiin yön yli lämpötilassa 4 °C käyttämällä 100 μΐ suspensiota, 25 joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoituja ja formaldehydillä kiinnitettyjä kannan Staphylococcus aureus (Cowan 1) bakteereja. Bakteerit erotettiin sitten sentrifugoimalla, inkuboitiin supernatanttia vähintään 2 tuntia lämpötilassa 4 °C monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja muodostettiin 30 voimakkaasti spesifisiä immuunikomplekseja lisäämällä S.
. aureus -bakteereja. Tämä toimenpide toistettiin jopa kol mesti täydellisen saostumisen takaamiseksi. Sitten immuu-nisaostumat pestiin kolmesti liuoksella, joka sisälsi 50 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,0, 500 mmol/1 LiCl:a, 1 mmol/1 35 DTT:tä, 1 mmol/1 EDTA:a ja 1 % Trasylolia; kahdesti liuok- 34 1 04 1 77 sella, joka sisälsi 50 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 7,4, 0,15 mol/1 NaCl:a, 5 mmol/1 EDTAra ja 1 % Nonidet P40:ä, ja kerran liuoksella, joka sisälsi 50 mmol/1 NH4HC03:a. Sitten niitä eluoitiin 45 min lämpötilassa 4 °C käyttä-5 mällä 200 μΐ eluutiopuskuria (50 mmol/1 NH4HC03:a, 1 % SDS:ää ja 1 % β-merkaptoetanolia), kylmäkuivattiin, liuotettiin keittämällä 10 min näytepuskurissa (20 μΐ; 60 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 6,8, 5 % β-merkaptoetanolia, 1 % glyseriiniä ja 0,01 % bromifenolisinistä) ja laitettiin 10 3-%:iselle polyakryyliamidigeelille (10 % SDS:ää). Proteiinit erotettiin epäjatkuvalla geelielektroforeesilla; vyöhykkeet voitiin paikallistaa tekemällä fluorografia röntgenfilmille (Kodak X-AR).
Oligonukleotideilla, jotka oli keksinnön mukaisesti 15 valmistettu sillä tavalla, että ne kattoivat T-antigeenia vastaavan translaation aloituskohdan, rekisteröitiin käytettäessä solun ulkopuolista pitoisuutta 30 μπιο1/1 virusten kasvun 70-%:inen inhibitio. Tilanne on vaikutuksen suhteen toisenlainen vastaavilla sekvensseillä, joita ei 20 ole muodostettu keksinnön mukaisesti, ts. jotka eivät sisällä 3'-3'- ja 5'-5'-sidoksia. Käytettäessä niitä samana pitoisuutena ei ollut havaittavissa minkäänlaista inhibi-tiota. Kuvio 4 osoittaa T-Ag-biosynteesin selvän inhibition käsiteltäessä solut SV40TAS17(3'-3',5'-5'):llä 25 (30 μπιοΐ/ΐ) .
Esimerkki 11
Seerumistabilisuuden vertailu oligonukleotidien välillä, jotka on muunnettu käännetyillä fosfodieste-risidoksilla vain 3'-päästä tai vain 5'-päästä 30 Oligonukleotideja muodostetaan nukleaasin avulla . edullisesti 3'-päästään lähtien [J. P. Shaw, K. Kent, J.
Bird, J. Fishback ja B. Froehler, Nucleic Acid Res. 19 (1991) 747 - 750]. Siksi oli syytä tutkia, riittääkö terminaalinen 3'-3'-fosfodiesterisidos yksinään oligonukleo-35 tidin stabiloimiseen veriseerumissa. Koska 32P-leimattu f 35 1 04 1 77 fosfaattiryhmä - erityisesti käsiteltäessä näytettä pitkähkö aika seerumilla - lohkeaa fosfataasien vaikutuksesta, käytettiin oligonukleotidin detektointiin fluoreseii-nia.
5 Syntetisoitiin seuraavat sekvenssit Xenopus le- vis -genomista:
Xelev 1: 3'A(5'-5')GC CTC AAA C*AT GTG TGA CG-3' Xelev 2: 5'-AGC CTC AAA C*AT GTG TGA C(3'-3')G-5' Synteesit toteutettiin esimerkissä 5 kuvatulla talo valla käyttämällä 10. kondensointiin emäksen suhteen muunnettua sytidiinifosfonihappoesteriamidia C*, joka mahdollisti myöhemmin tehtävän kovalenttisen liittämisen fluore-seiinin kanssa. Fluoreseiinin liittäminen tehtiin Pharma-cian ohjeen mukaisesti (Pharmacia LKB Biotechnology Auto 15 Primer™ Synthesis Kit Instructions XY-023-00-01). Muunnetut oligonukleotidit puhdistettiin polyakryyliamidigeeli-elektroforeettisesti.
Seerumitesti: 10 pmol oligonukleotidia 20 140 μΐ tuoretta ihmisseerumia Näytteitä inkuboitiin lämpötilassa 37 °C. Otettiin aina 20 μ1:η näyte 15, 30, 45 ja 60 min ja 8 ja 72 tunnin kuluttua, uutettiin se kahdesti fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin seoksella suhteessa 25:24:1 ja saostet-25 tiin oligonukleotidit etanolilla. Pilkkoutumistuotteet erotettiin 16-%:isella polyakryyliamidigeelillä automaattisessa sekvensointilaitteessa A. L . F (Pharmacia, Freiburg) ja detektoitiin. Kuten kuvio 5 osoittaa, esiintyy vain 5'-päästään käännetyllä nukleotidien välisellä sidoksella 30 varustetun sekvenssin kohdalla jo 15 min kestäneen seeru-' . mikäsittelyn jälkeen hajoamistuotteita ja se on hajonnut lähes täydellisesti jo 60 min:n kuluttua. 3'-päästään 3'-3'-sidoksella "suojattu" oligonukleotidi on sitä vastoin hajonnut vasta osittain vielä 72 tunnin kuluttua.
35 36 104177
Esimerkki 12
Geenien ilmentymisen estäminen in vitro -iImentyrni s j ärjes telmäs sä INV-oligonukleotidien aikaansaaman geenien ilmenty-5 misen eston määrittämiseksi kvantitatiivisesti tutkittiin vastaavien antisense-oligonukleotidien vaikutusta p53-il-mentymiseen in vitro -järjestelmässä, joka sisälsi p53-mRNA:ta [E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren ja M. Montenarli, Oncogene 5 (1990) 137 - 144].
10 Syntetisoitiin antisense-sekvenssi NH2(CH2) 6pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT(3'-3')T ja vertailunäytteeksi vastaava koodittava sekvenssi NH2(CH2) spAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3’-3’)A. Antisense-oligonukleotidi suuntautuu kohden onko-15 proteiinin p53 translaation aloituskohtaa.
Tutkittiin proteiini-ilmentymistä 1. ilman oligonukleotidin lisäämistä 2. lisättäessä 30 μπκ>1/1 koodittavaa (sense-) sek venssiä 20 3. lisättäessä 1 μιηοΐ/ΐ antisense-sekvenssiä 4. lisättäessä 10 μπιοΐ/ΐ antisense-sekvenssiä.
Kvantitatiivisen analyysin tekemiseksi määritettiin proteiinivyöhykkeiden tummuminen densitometrisesti [E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren ja M. Montenarli, 25 Oncogene 5 (1990) 137 - 144].
Kuvio 6 osoittaa, että lisättäessä 10 μιηοΐ/ΐ anti-sense-oligonukleotidia ilmentymisjärjestelmään saadaan aikaan noin 70-%:inen inhibitio. Alennettaessa pitoisuus arvoon 1 μτηοΐ/ΐ ei ole enää havaittavissa lähes ollenkaan 30 inhibitiota, samoin kuin lisättäessä koodittavaa sekvenssiä, joka ei sitoudu mRNA:n.
i
Claims (4)
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oli-gonukleotidien tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien 5 suolojen valmistamiseksi, joilla oligonukleotideilla on kaava I tai II, r1 ~ B R1 - Ο-γΟ^Β
10. I 1-1-1 \ z-p.w .-1-—di) '°\y " o o μ-.n n R 20 joissa R1 on vetyatomi tai ryhmä, jolla on kaava III, B 1 aO - P = W Z’ (III) /0 CH R2 on ryhmä, jolla on kaava IV,
30. Y V 'l-/ (IV) O 2' - ? = w 35 104177 B on emäs, kuten esimerkiksi luonnossa esiintyvä emäs, kuten adeniini, tyrniini, sytosiini, guaniini, tai luonnossa esiintymätön emäs, kuten esimerkiksi puriini, 2,6-diaminopuriini, 7-deatsa-adeniini, 7-deatsaguaniini, 5 N4-etanosytosiini tai jokin niiden esiastemuodoista; kumpikin ryhmistä W ja W on toisesta riippumatta happi-tai rikkiatomi; kumpikin ryhmistä Z ja Z' on toisesta riippumatta CT; S*; C^g-alkoksyyliryhmä, edullisesti C^g-alkoksyyliryh-10 mä, erityisen edullisesti Cj.j-alkoksyyliryhmä, erityisesti metoksyyliryhmä; C1.18-alkyyliryhmä, edullisesti C^g-alkyy-liryhmä, erityisen edullisesti C1_3-alkyyliryhmä, erityisesti metyyliryhmä; ryhmä NHR3, jossa R3 on edullisesti alkyyliryhmä, erityisen edullisesti Ch.g-alkyyliryhmä, eri-15 tyisesti C^-alkyyliryhmä, tai C^-alkoksi-C^g-alkyyliryh- mä, edullisesti metoksietyyliryhmä; ryhmä NR3R4, jossa R3 merkitsee samaa kuin edellä ja R4 on edullisesti Cj.jg-al-kyyliryhmä, erityisen edullisesti Ci.g-alkyyliryhmä, erityisesti C^-alkyyliryhmä, tai ryhmät R3 ja R4 muodostavat yh-20 dessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, 5- tai 6-jäsenisen heterosyklisen renkaan, joka voi lisäksi sisältää toisen heteroatomin, joka on O, S tai N, kuten esimerkiksi morfoliiniryhmä; Y on ryhmä O—Si (R) 2, 0CH2, C(0)NR tai 0CH;-C(0), 25 joissa R on C^-alkyyli-, aryyli- tai C5- tai C6-sykloal-kyyliryhmä; ja n on kokonaisluku 5 - 60, edullisesti 10 - 40 ja erityisen edullisesti 15 - 25, tunnettu siitä, että 30 a) nukleotidiyksikkö, jossa on 3'- tai 5'-terminaa- : liset fosfori(III)- tai fosfori(V)-ryhmittymät, tai sen aktiivinen johdannainen saatetaan reagoimaan toisen nuk-leotidiyksikön kanssa, jossa on 3'- tai 5'-terminaalinen vapaa hydroksyyliryhmä, tai 39 104177 b) muodostetaan oligonukleotidi vastaavalla tavalla fragmenttien kautta, lohkaistaan kohdan (a) tai (b) mukaisesti saaduista oligonukleotideista muiden funktionaalisten ryhmien suojaamiseksi mahdollisesti tilapäisesti lii-5 tetty yksi tai useampi suojausryhmä ja muutetaan siten saadut kaavan I mukaiset oligonukleotidit mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttäväksi suolakseen.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä oligo-nukleotidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, 10 että W on happiatomi tai sekä Z että W ovat happiatomeja.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä oligonukleotidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että R2 on kaavan IV mukainen ryhmä ja R1 on vetyatomi .
4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä oligonukleotidien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että nämä oligonukleotidit substituoidaan lisäksi ryhmillä, jotka edistävät ottoa solun sisään, toimivat merk-kiaineryhminä in vitro tai in vivo ja/tai oligonukleotidin 20 hybridisoituessa biologisen DNA:n tai RNA:n kanssa vaikuttavat näihin DNA- tai RNA-molekyyleihin sitoutumiseen tai pilkkoutumiseen johtavalla tavalla. Ψ · « 104177
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4021019 | 1990-07-02 | ||
DE4021019 | 1990-07-02 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI913169A0 FI913169A0 (fi) | 1991-06-28 |
FI913169A FI913169A (fi) | 1992-01-03 |
FI104177B1 FI104177B1 (fi) | 1999-11-30 |
FI104177B true FI104177B (fi) | 1999-11-30 |
Family
ID=6409497
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI913169A FI104177B (fi) | 1990-07-02 | 1991-06-28 | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5750669A (fi) |
EP (1) | EP0464638B1 (fi) |
JP (1) | JP3186795B2 (fi) |
KR (1) | KR100200400B1 (fi) |
AT (1) | ATE151076T1 (fi) |
AU (1) | AU647143B2 (fi) |
CA (1) | CA2045891C (fi) |
CZ (1) | CZ285408B6 (fi) |
DE (1) | DE59108644D1 (fi) |
DK (1) | DK0464638T3 (fi) |
ES (1) | ES2099718T3 (fi) |
FI (1) | FI104177B (fi) |
GR (1) | GR3023432T3 (fi) |
HU (1) | HU215147B (fi) |
IE (1) | IE912309A1 (fi) |
IL (1) | IL98672A (fi) |
NO (1) | NO303018B1 (fi) |
NZ (1) | NZ238769A (fi) |
PT (1) | PT98169B (fi) |
SK (1) | SK279544B6 (fi) |
TW (1) | TW206232B (fi) |
ZA (1) | ZA915056B (fi) |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223618A (en) * | 1990-08-13 | 1993-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
EP0593901B2 (de) * | 1992-09-24 | 2008-04-09 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Oligoribonucleotid- und Ribozym-Analoga mit terminalen 3'-3'-bzw.5'-5'-Verknüpfungen |
AU6412794A (en) * | 1993-03-31 | 1994-10-24 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
US6015886A (en) * | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
US6605708B1 (en) | 1993-07-28 | 2003-08-12 | Hybridon, Inc. | Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom |
US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
US9096636B2 (en) * | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US7309692B1 (en) * | 1996-07-08 | 2007-12-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1 |
US6977244B2 (en) | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
CN1060177C (zh) * | 1997-06-28 | 2001-01-03 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 3′-单磷酸化寡核苷酸 |
US7285288B1 (en) | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US7704962B1 (en) | 1997-10-03 | 2010-04-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Small oligonucleotides with anti-tumor activity |
US20030180789A1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-09-25 | Dale Roderic M.K. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
DE19935756A1 (de) * | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
DE19935303A1 (de) | 1999-07-28 | 2001-02-08 | Aventis Pharma Gmbh | Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5 |
US6271360B1 (en) | 1999-08-27 | 2001-08-07 | Valigen (Us), Inc. | Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors |
EP1702983A3 (en) | 2000-04-13 | 2007-01-10 | Medical University of South Carolina | Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, DNAzymes and antisense oligonucleotides and methods of use thereof |
JP2004503560A (ja) * | 2000-06-13 | 2004-02-05 | プロリゴ・エルエルシー | 固相オリゴ合成の普遍固形支持体とその製造及び使用の方法 |
AU9475001A (en) * | 2000-09-26 | 2002-04-08 | Hybridon Inc | Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes |
GB0114007D0 (en) * | 2001-06-08 | 2001-08-01 | Isis Innovation | Oilgonucleotides |
US7070933B2 (en) * | 2001-09-28 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Inversion probes |
US20040043950A1 (en) * | 2002-01-03 | 2004-03-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | WT1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer |
WO2003066649A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Biomira Inc. | Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides |
CA2504720C (en) | 2002-11-05 | 2013-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
EP1560840B1 (en) | 2002-11-05 | 2015-05-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation |
US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
WO2005121372A2 (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation |
US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
CA2679750A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-23 | Nexus Dx, Inc. | Methods for detecting nucleic acids in a sample |
EP2781523A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-24 | Miltenyi Biotec GmbH | Lipophilic oligonucleotide analogs |
KR101323476B1 (ko) * | 2013-06-12 | 2013-10-31 | 조선미 | 건물용 층간소음 방지재와 이를 이용한 층간소음 방지구조 및 그 시공 방법 |
LU92821B1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-20 | Mologen Ag | Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides |
GB2542425A (en) | 2015-09-21 | 2017-03-22 | Mologen Ag | Means for the treatment of HIV |
EP3825400A1 (en) * | 2016-04-08 | 2021-05-26 | Translate Bio Ma, Inc. | Multimeric coding nucleic acid and uses thereof |
US11603532B2 (en) | 2017-06-02 | 2023-03-14 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
CA3094598A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Tsinghua University | Methods of sequencing and producing nucleic acid sequences |
IL277889B1 (en) * | 2018-04-12 | 2024-09-01 | Wave Life Sciences Ltd | Preparations of oligonucleotides and methods of using them |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4123610A (en) * | 1977-03-09 | 1978-10-31 | The United States Government | Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith |
US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
DE3332068A1 (de) * | 1983-09-06 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von nukleosidalkyl-, aralkyl- und arylphosphoniten und -phosphonaten |
US4795700A (en) * | 1985-01-25 | 1989-01-03 | California Institute Of Technology | Nucleic acid probes and methods of using same |
US5276019A (en) * | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
WO1989009221A1 (en) * | 1988-03-25 | 1989-10-05 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
WO1990012022A1 (en) * | 1989-03-31 | 1990-10-18 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections |
-
1991
- 1991-06-26 AT AT91110570T patent/ATE151076T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-26 DK DK91110570.8T patent/DK0464638T3/da active
- 1991-06-26 EP EP91110570A patent/EP0464638B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 DE DE59108644T patent/DE59108644D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-26 ES ES91110570T patent/ES2099718T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-28 NZ NZ238769A patent/NZ238769A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 FI FI913169A patent/FI104177B/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 CA CA002045891A patent/CA2045891C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-30 IL IL9867291A patent/IL98672A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 IE IE230991A patent/IE912309A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 HU HU215/91A patent/HU215147B/hu unknown
- 1991-07-01 PT PT98169A patent/PT98169B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 CZ CS912014A patent/CZ285408B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 NO NO912585A patent/NO303018B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 AU AU79475/91A patent/AU647143B2/en not_active Expired
- 1991-07-01 KR KR1019910011064A patent/KR100200400B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 SK SK2014-91A patent/SK279544B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-07-01 ZA ZA915056A patent/ZA915056B/xx unknown
- 1991-07-02 JP JP18820291A patent/JP3186795B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-27 TW TW080105851A patent/TW206232B/zh not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-01 US US08/282,503 patent/US5750669A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-15 GR GR970401081T patent/GR3023432T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI104177B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi | |
JP3787265B2 (ja) | 2’−o−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法 | |
EP1015469B2 (en) | Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues | |
US7034133B2 (en) | Oligonucleotide analogues | |
KR100321416B1 (ko) | 2'-o-치환된 피리미딘 및 이들의 올리고머 화합물의 개선된 제조방법 | |
US7321029B2 (en) | 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use | |
US7572582B2 (en) | Oligonucleotide analogues | |
FI115400B (fi) | Menetelmä oligoribonukleotidi- ja ribotsyymianalogien valmistamiseksi, joissa on terminaaliset 3 '-3'- tai 5'-5'-sidokset | |
EP1214331B1 (en) | 2-azapurine compounds and their use | |
JPWO2010021344A1 (ja) | 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法 | |
RU2088588C1 (ru) | Олигонуклеотиды и способ их получения | |
RU2243231C2 (ru) | Бициклические аналоги нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов | |
AU2002325599B2 (en) | Oligonucleotide analogues |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH Free format text: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH |
|
MA | Patent expired |