KR100321416B1 - 2'-o-치환된 피리미딘 및 이들의 올리고머 화합물의 개선된 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드 및 이들 뉴클레오시드를 가지는 올리고머 화합물을 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 합성 방법은 2,2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 또는 2S,2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드를 루이스산 존재하에서 약한 친핵성 시약으로 알킬화하는 것을 특징으로 한다.
mi/50-33/PA-391.hwp

Description

2'-O-치환된 피리미딘 및 이들의 올리고머 화합물의 개선된 제조방법
관련출원
본 출원은 1995. 3. 6 출원된 미국 출원 제08/398,901호(대리인 참조번호 ISIS-0719)의 일부 계속출원인 1995. 6. 7 출원된 미국 출원 제08/475,467호(대리인 참조번호 ISIS-1965)의 일부 계속출원이다. 상기의 특허 출원은 본 명세서에 참고로 기재되어 있다.
발명의 분야
본 발명의 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오티드 및 이들 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머 화합물을 제조하기 위한 개선된 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 2,2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 또는 2S,2'-안히드로피리미딘을 약한 친핵성 시약 및 루이스 산으로 처리하는 것을 특징으로 한다. 이 방법은 현재 사용되고 있는 방법에 비하여 경제적으로 유리하고 대량 제조에 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 당의 2'-O-위치 및 피리미딘의 5 위치에서 치환체를 가지는 적어도 하나 이상의 수식된 피리미딘 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 올리고머 화합물은 핵산에 증가된 결합 친화력과 증가된 뉴클레아제 내성을 나타낸다.
발명의 배경
2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 및 관련된 화합물의 제조에 유용하다. 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드는 Glen Research(Sterling, Virginia)와 같은 회사로부터 구입가능하고 상업성 품목으로 간주되고 있다. 본 발명은 2'-O-치환된 뉴클레오시드 제조에 대한 신규하고 유용한 방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오티드 및 그들의 유사체는 프로브, 프라이머, 링커(linker), 어댑터 및 유전자 단편과 같은 용도를 비롯한 다양한 용도가 개발되고 있다. 이 과정에 사용되는 올리고뉴클레오티드에 대한 수식은 형광체, 비오틴, 다이고시게닌(digoxigenin), 알칼리 포스파타제 또는 다른 리포터 분자와 같은 비방사성 표지로 라벨화하는 것을 포함한다. 또한 유사체의 뉴클레아제 내성을 증가시키기 위해서 리보오스 포스페이트 골격에 수식이 행해질 수 있다. 이들 수식에는 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 연결자(linkage) 및 2'-O-메틸리보오스 당 단위가 사용될 수 있다. 다른 수식은 올리고뉴클레오티드 포착 및 세포 분포의 조절에 관한 것이다. 진단 및 치료 모두에 사용되는 올리고뉴클레오티드가 성공적으로 개발되어 개선된 올리고뉴클레오티드 유사체에 대한 계속적인 수요가 창출되고 있다.
대부분의 질병 상태를 포함하여 다세포 유기체에서의 대부분의 신체적 상태는 단백질에 의하여 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 직접적으로 작용하거나 효소 또는 다른 기능을 통하여 작용하는 단백질은 동물 및 인간의 많은 질병 및 조절 기능에 주요한 영향을 미친다. 질병에 대하여 고전적인 치료법은 일반적으로 질병-유발 또는 질병-강화 기능을 조절하기 위해 그러한 단백질간의 상호작용에 촛점을 맞추어 왔다. 더 신규한 치료접근법으로서 그러한 단백질의 실질적 생산조절이 요망된다. 단백질 생산을 저해함으로써 최대 치료 효과가 최소의 부작용과 함께 얻어질 수 있다. 바람직하지 않은 단백질이 생성되는 유전자 발현을 방해하거나 다른 방법으로 조절하는 것이 그러한 치료 접근법의 일반적인 목적이다.
특이적 유전자 발현을 저해하기 위한 한가지 방법은 올리고뉴클레오티드 특히 특이적인 표적 메신저 RNA(mRNA) 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다. 몇몇 올리고뉴클레오티드는 현재 그러한 용도에 사용하기 위해 임상 시험중에 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 현재 항바이러스 약제와 같은 용도를 비롯하여 다양한 질병에 대한 인체 임상 시험에서 안티센스 약제로서 사용되고 있다.
전사 인자를 전사 조절중에 이중 가닥 DNA와 상호작용한다. 올리고뉴클레오티드는 전사 인자의 작용을 조절하기 위한 전사 인자의 경쟁적인 저해 인자로 제공될 수 있다. 최근 몇몇 보고는 그러한 상호작용에 대하여 기재하고 있다(Bielinska, A., et al., Science, 1990, 250, 997-1000; and Wu, H., et al., Gene, 1990, 89, 203-209).
단백질의 간접적인 그리고 직접적인 조절과 같은 용도 외에 올리고뉴클레오티드가 생물학적 유체, 조직, 원형 세포 또는 분리된 세포성 성분을 포함한 물질의 진단 시험에서의 용도를 발견하였다. 유전자 발현 저해를 이용한 것과 마찬가지로 진단 적용법은 핵산의 상보적 가닥과 혼성화하는 올리고뉴클레오티드의 성능을 이용한다. 혼성화는 왓슨-크릭 및/또는 훅스틴 염기쌍을 통하여 RNA 또는 DNA에 올리고뉴클레오티드의 서열 특이성 수소 결합이다. 그러한 염기쌍의 염기들은 서로 상보적이라고 언급된다.
올리고뉴클레오티드는 또한 널리 연구 시약으로서 사용된다. 그것들은 특히 생물학적 분자의 제조 뿐만 아니라 생물학적 분자의 기능을 탐구하는 연구에 유용하다. 예를 들어 PCR 반응에서 프라이머로서 천연 및 합성 올리고뉴클레오티드의 사용은 상업적 산업을 확장시켰다. PCR은 상업적인 연구 실험의 주요분야이고 PCR의 적용은 다양하다. 예를 들어 PCR 기술은 법정학, 고생물학, 진화학 및 유전 카운슬링(counseling)의 분야에서 유용성이 나타난다. 상업화는 PCR을 적용하는 데 있어서 비-분자생물학-수련된 연구원을 보조하는 키트(kit)의 개발이 이루어졌다.
올리고뉴클레오티드는 또한 다른 실험과정에서도 사용된다. 이들 용도중 몇몇은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed., J. Sambrook, et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; and Current Protocols In Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al., Eds., Current Publications, 1993과 같은 실험 입문서에 기재되어 있다. 그러한 용도의 대표적인 것으로는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체 및 올리고뉴클레오티드를 이용한 발현 라이브러리의 검색, DNA 시퀀성, 중합효소 연쇄반응 및 클론된 DNA의 부위-특이성 돌연변이를 이용한 시험관내 DNA 중폭(Book 2 of Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Supra 참조) 및 DNA-단백질 상호작용 및 중합효소 연쇄 반응(Vol. 2 of Current Protocols In Molecular Biology, supra 참조)과 같은 것이 있다.
올리고뉴클레오티드는 바람직한 용도로 만들어진 일반적인 특성을 가지도록합성되어질 수 있다. 이와 같이 많은 화학적 수식이 연구 시약 및 치료 물질과 같은 진단에 있어서의 유용성을 증가시키기 위해 올리고뉴클레오티드에 도입되어 왔다. 그러한 수식에는 표적 가닥에 결합력을 증가시키고 (즉 용융점(Tm)을 증가시킴) 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드-표적 복합체의 동정을 돕고 세포 투과를 증가시키고 뉴클레아제 또는 올리고 뉴클레오티드의 구조 또는 활성을 감소시키거나 방해하는 다른 효소에 대하여 안정화시키고 표적에 서열-특이적으로 결합되기만 하면 파괴방법(종말현상)을 제공하고 올리고뉴클레오티드의 약력동력학적 특성을 증가시키도록 디자인되는 것을 포함한다.
Gibson, K.J., and Benkovic, S.J., Nucleic Acids Research, 1987, 15, 6467는 올리고뉴클레오티드에 통합된 프탈이미드-보호된 5-(3-아미노프로필)-2'-디옥시우리딘 뉴클레오시드를 기록하고 있다.
Haralambidis, J., et. al., Nucleic Acids Research, 1987, 15, 4857-4876는 올리고뉴클레오티드에 통합된 C-5 치환된 디옥시우리딘을 기록하고 있다. 그 치환체는 다양한 기로 더 치환가능한 차단된 1차 지방족 아미노기를 가진다.
1993. 1. 22 출원되고 1994. 8. 4 공개된 PCT 출원 WO 94/17094는 5-치환체가 C3-14n-알킬, C2-8(E)-n-1-알케닐, 에티닐 또는 C4-12n-1-알킬 그룹인 5-치환된 피리미딘(시토신 또는 우라실) 및 하나 또는 그 이상의 수식된 5-치환된 피리미딘 염기를 가지는 올리고뉴클레오티드의 합성에 대하여 개시하고 있다.
1992. 11. 24 출원되고 1993. 6. 10 공개된 PCT 출원 WO 93/10820은 5-(1-프로피닐) 우라실 및 5-(1-프로피닐) 시토신 또는 관련된 유사체 및 하나 또는 그 이상의 수식된 5-치환된 피리미딘 염기를 가지는 올리고뉴클레오티드의 합성을 기재하고 있다.
1992. 11. 24 출원된 PCT 출원 WO 93/10820은 염기의 5' 위치에 부착된 탄소 원자를 연결시키는 pi 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드에 통합되는 2'- 및 5-치환된 피리미딘 뉴클레오티드를 기재하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 핵산에 대한 증가된 친화력을 가지고 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위 구조식 I을 가지는 올리고머 화합물을 제공한다:
Figure pct00001
상기에서 X는 히드록실 또는 아미노이고;
R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
L은 산소 또는 황이고;
Z는 플루오로 또는 OR1X1이고 R1은 C1-C6알킬, C6-C10아릴 또는 C7-C18알카릴이고 X1은 H, NH2또는 이미다졸이고; 그리고
Q1및 Q2중 하나는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오시드에 공유 결합에 의하여 부착되어 있고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고형 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 L은 산소이다. 또 다른 구체예에서 Z는 F이다.
본 발명의 다른 구체예에서 올리고머 화합물은 약 5 내지 200 하부-단위의 길이를 가진다. 더 바람직하게는 올리고머 화합물이 약 5 내지 50 하부-단위 길이를 가진다. 더욱 더 바람직하게는 올리고머 화합물이 약 10 내지 20 하부-단위 길이를 가지는 것이다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 단량체 하부-단위 및 올리고머 화합물의 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드 사이의 공유 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬 포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 포스포라미데이트에서 선택된다.
본 발명의 더 바람직한 구체예에서 구조식 I의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 제조된다. 바람직한 구체예에서 미리 선정된 위치에 있는 단량체 하부-단위를 가지는 구조식 I의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 제조된다.
구조식 II의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 본 발명의 특정 구체예에 포함된다:
Figure pct00002
상기에서 X는 히드록실 또는 아미노이고;
R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
L은 산소 또는 황이고;
Q1및 Q2중 하나는 연결 성분에 의하여 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 부착되고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고형 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 L은 O이다.
다른 구체예에서 본 발명의 올리고머 화합물은 약 5 내지 50 하부-단위의 길이를 가진다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 단량체 하부-단위 및 올리고머 화합물내의 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드 사이의 공유 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구체예에서 구조식 II의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 제조된다. 바람직한 구체예에서 구조식 II의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 미리 선정된 위치에 있는 단량체 하부-단위를 가지도록 제조된다. 적어도 하나 이상의 구조식 III의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 본 발명의 특정 구체예에 포함된다:
Figure pct00003
상기에서 X는 히드록실 또는 아미노이고;
R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
L은 산소 또는 황이고;
R1은 C1-C6알킬, C6-C10아릴, C7-C18알카릴이고 X1은 H, NH2또는 이미다졸이고; 그리고
Q1및 Q2중 하나는 연결 성분에 의하여 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 부착되고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고형 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 L은 O이다.
다른 구체예에서 본 발명의 올리고머 화합물은 약 5 내지 50 하부-단위의 길이를 가진다.
또 다른 구체예에서 본 발명의 단량체 하부-단위 및 올리고머 화합물내의 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드 사이의 공유 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구체예에서 구조식 III의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는올리고머 화합물이 제조된다. 바람직한 구체예에서 구조식 III의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 미리 선정된 위치에 있는 단량체 하부-단위를 가지도록 제조된다.
본 발명에 있어서 하기 구조식의 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드의 합성에 대한 개선된 방법을 제공한다:
Figure pct00004
상기에서 Q는 피리미딘 염기 또는 2-S 피리미딘 염기이고;
R1은 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30알킬, C1-C30알케닐, C1-C30알키닐, C6-C14아릴 또는 C7-C30아랄킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
R2와 R3는 독립적으로 수소 또는 히드록실 보호기임;
2-2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드를 제공하고;
화학식 R1-OH의 알코올을 선택하고;
상기 2-2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 및 상기 알코올을 상기 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드를 생성시키기에 효과적인 시간, 온도 및 압력의 조건하에서 루이스 염기로 처리하는 단계로 이루어진다.
본 발명에 의하면 하기 구조식의 2'-O-치환된 시티딘 뉴클레오시드의 합성을 위한 개선된 방법을 제공한다:
Figure pct00005
상기에서 X'는 O 또는 S이고;
R1은 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30알킬, C1-C30알케닐, C1-C30알키닐, C6-C14아릴, 또는 C7-C30아랄킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
R2및 R3는 독립적으로 수소 또는 히드록실 보호기이고;
R5및 R6는 독립적으로 H, C1-C30히드로카르빌 또는 치환된 C1-C30히드로카르빌임;
하기 구조식의 2-2'-안히드로우리딘 뉴클레오시드를 제공하고;
Figure pct00006
구조식 R1-OH의 알콜올을 선택하고;
상기 2-2'-안히드로우리딘 뉴클레오시드 및 상기 알코올을 2'-O-치환된 우리딘 뉴클레오시드를 생성시키기에 효과적인 시간, 온도, 압력의 조건하에서 루이스산으로 처리하고; 그리고
상기 2'-O-치환된 우리딘 뉴클레오시드를 상기 2'-O-치환된 시티딘 뉴클레오시드에 아민화하는 단계로 구성된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 2-2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 및 구조식 R1-OH의 알코올은 반응 용기, 예를 들어 압력 봄(bomb)과 같은 가압 봉합된 용기내에서 처리된다. 바람직하게는 반응 용기는 약 120℃ 내지 약 200℃까지 가열된다.
본 발명의 다른 구체예에서 루이스 염기는 보레이트, 특히 트리알킬 보레이트이다. 바람직하게는 트리알킬 보레이트의 알킬 그룹은 알코올의 R기와 동일하므로 보레이트의 구조식은 B(OR1)3이다. 바람직하게는 트리알킬 보레이트는 보레이트를 알코올로 처리하여 제조된다. 2,2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드의 처리에 사용되는 알코올은 또한 트리알킬 보레이트, 바람직하게는 구조식 OH-R1의 알코올을 제조하는데 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서 R1은 C1-C30알킬, 더 바람직하게는 C1-C10알킬이다. 다른 바람직한 구체예에서 R1은 C6-C14아릴이다.
본 발명의 바람직한 한 구체예에서 상기 방법에 의해서 제조된 피리미딘 뉴클레오시드는 우리딘 또는 5-메틸우리딘이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서 상기 방법에 의해서 제조된 2'-O-치환된 시티딘 뉴클레오시드는 우리딘 또는 2'-O-메틸-5-메틸시티딘이다.
본 발명에 따르면 구조식 IV의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위로 구성된 올리고머 화합물을 제공하고;
Figure pct00007
상기 A는 히드록실 또는 아미노이고;
R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
L은 산소 또는 황이고;
Z'는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30알킬, C1-C30알케닐, C1-C30알키닐, C6-C14아릴, 또는 C7-C30아랄킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
Q1및 Q2중 하나는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 연결 성분에 의하여 부착되고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록시, 활성화된 고형 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트, 또는 포스파이트이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 올리고머 화합물이 L이 O인 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위를 가지도록 제공된다. 더 바람직한 구체예에서 올리고머 화합물이 Z'가 치환된 알킬이 적어도 하나 이상의 하부-단위를 가지도록 제공된다. 더욱더 바람직한 구체예에서 Z'는 메톡시에틸(CH3OCH2CH2-) 이다.
하나의 구체예에서 본 발명의 올리고머 화합물은 5 내지 200 단량체 하부-단위로 구성된다. 더 바람직한 구체예에서 본 발명의 올리고머 화합물은 5 내지 50 단량체 하부-단위로 구성된다. 더욱 더 바람직한 구체예에서 본 발명의 올리고머 화합물은 10 내지 20 하부-단위로 구성된다.
다른 구체예에서 Q1및 Q2중 하나는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 연결 성분에 의해서 부착되고 상기 연결 성분은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 포스포로아미데이트로 구성된다.
본 발명의 구체예에서 상기 구조식의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 제공된다. 더 바람직한 구체예에서 미리 선정된 위치에 있는 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물이 제공된다.
발명의 구체예에 대한 상세한 설명
본 발명의 바람직한 올리고머 화합물이 구조식 I의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위를 가진다. 구조식 I은 2' 위치에서 치환된 β-D-에리쓰로-펜토푸란노실 당이고 글리코실 연결기를 통하여 5'-치환된 피리미딘에 1'가 1에 연결되어 있다. 단량체 하부-단위의 5' 및 3' 말단은 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 또는 혼합된 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드에 연결될 수 있거나 올리고머 화합물의 3' 또는 5' 말단이 될 수 있다.
본 발명의 화합물을 제조하기 위해 사용되는 단량체 하부-단위는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오티드는 인 연결 성분인 반면에 뉴클레오시드는 비 인산 연결 성분을 가지고 각각은 뉴클레오염기에 글리코실 결합을 통하여 부착된 리보푸란노스 성분을 가진다.
본 발명의 단량체 하부-단위는 연결 성분을 사용하여 연결된다. 연결 성분은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트, 케톤, 술폰, 카보네이트 및 티오아미데이트를 포함한다. 알킬포스포로티오에이트 연결기는 WO94/02499에 개시되어 있다. 다른 성분이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서는 2'-F-5-알킬-우리딘(및 5-할로 유사체) 단량체 하부-단위들은 뉴클레오시드의 5-위치에서 적당한 알킬기를 맨처음 치환시킴으로써 제조된다. 5-할로기의 경우에 5-F, Cl, Br 및 I 우라실은 Aldrich Chemical Company에서 구입가능하다. 우라실의 C-5에서 알킬, 알케닐 및 알카닐기의 치환체는 1992. 11. 24 출원된 PCT 출원 PCT/US 92/10115에 개시되어 있으며 알킬 치환체의 예는 Manoharan. M., Antisense Research and Applications, Crooke and Lebleu. eds., CRC Press, Boca Raton, 1993에 더 개시되어 있다.
5-알킬화된 우리딘은 DMF 내에서 디페닐카보네이트 및 소듐 바이카보네이트로 처리하고 정제시킴으로써 2, 2'-안히드로[1-(β-D-아라비노푸란노실)-5-알킬우리딘]으로 변형된다. 2, 2'-안히드로[1-β-D-아라비노푸란노실)-5-알킬우리딘]은 적당한 용매, 예를 들어 디옥산 내에서 HF/피리딘으로 더 처리하여 1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-알킬우리딘을 제공한다. 이 화합물은 표준 방법 및 기술로 처리한 뒤 DMF/아미다이트로 전환되어 1-(5-O-디메톡시트리틸-2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노-에틸포스파이트-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-알킬우리딘을 제공한다. 1-(5-O-디메톡시트리틸-2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필-아미노-2-시아노에틸포스파이트-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-알킬우리딘은 올리고머 화합물 합성에서 단량체 하부-단위 전구체로 사용된다.
5-알킬화-2'-F-우리딘의 5-알킬화-2'-F-4-N-보호된(예를 들어 벤조일)시티딘으로의 전환은 1, 2, 4-트리아졸을 이용하여 공지된 방법과 기술에 의해 수행된다. 5-O-알킬화 우리딘은 첫 번째로 3' 및 5' 위치에서 보호된다. 이 보호는 아세틱 안히드라이드를 사용하여 효과를 얻을 수 있다. 존재하는 염기(예를 들어 트리에틸아민)를 포함하는 적당한 용매(예를 들어 아세토니트릴)내의 1,2,4-트리아졸은 저온에서 POCl3로 처리된다. 보호된 5-O-알킬화-2'-F-우리딘은 적당한 용매내에 용해되고 트리아졸/POCl3를 포함하는 용액에 첨가된다. 충분한 시간이 지나고집성(workup) 및 정제 후에 트리아진-1-(3',5'-디-O-아세틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-알킬우리딘이 얻어진다. 이 화합물은 암모니아로 처리함으로써 5-알킬-1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신으로 전환된다. 엑소시클로아미노기는 직당한 용매인 피리미딘 내에 벤조익 안히드라이드로 처리함으로써 보호된다.
이 화합물은 표준 방법과 기술에 따라 DMT/아미다이트로 전환되어 4-N-보호된-5-알킬-1-(2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신을 제공한다. 4-N-보호된-5-알킬-1-(2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신이 올리고머 화합물 합성에서 단량체 하부-단위 전구체로서 사용된다.
5-위치의 치환체에 대한 알킬보다 더 복합한 그룹(예를 들어 할로 또는 치환된 C1-C6알킬, 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르)을 사용하여 5-치환된-2'-F-피리미딘의 제조는 적당한 보호 그룹을 사용하여 안히드로 화합물을 제조하기 전에 상기 그룹이 보호된다. 5 위치에서 보호기를 가지는 화합물의 전체 합성은 포화 알킬기 대신에 이들 치환된 알킬기중 하나의 통합을 위한 상기 기재된 것과 일치된다.
본 발명의 다른 구체예에서는 2'-O-치환된-5-치환된 우리딘 단량체 하부-단위가 안히드로를 열기 위하여(Open) 알코올 즉, 페닐 치환체에 대하여 페놀 또는O-프로필 치환체에 대하여 프로판올이 사용되는 것 이외에는 상기 기재된 2,2'-안히드로[1-(β-D-아라비노푸란노실)-5-알킬우리딘 절차를 이용하여 제조된다.
그 결과 생성된 화합물은 표준 방법 및 기술에 따라 DMT/아미다이트로 전환되어 1-(2-O-치환된-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로 펜토푸란노실)-5-치환된 우리딘을 제공한다. DMT/아미다이트는 올리고머 화합물 합성에서 단량체 하부-단위 전구체로서 사용된다.
1-(2-O-치환된-5-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-치환된 우리딘은 1,2,4-트리아졸을 사용하여 공지된 방법 및 기술에 의하여 시토신 유사체로 전환된다. 5-치환된-2'-O-치환된 우리딘은 적당한 보호기 예를 들어 아세틱 안히드라이드를 사용하여 3' 위치에서 처음으로 보호된다. 상기 물질은 집성후에 정제된다. 존재하는 염기(예를 들어 트리에틸아민)를 포함하는 적당한 용매(예를 들어 아세토니트릴)내의 1,2,4-트리아졸은 저온에서 POCl3로 처리된다. 보호된 5-치환된-2'-O-치환된-3'-O-보호된 우리딘은 적당한 용매내에 용해되고 트리아졸 POCl3를 포함하는 용액에 첨가된다. 충분한 시간이 지나고 그 위에 집성 및 정제한 후에 암모니아로 처리됨으로써 시티딘 유사체로 전환된 1-(2-O-치환된-3-O-아세틸-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4-트리아졸-5-치환된 피리미딘이 얻어진다. 엑소시클로아미노기(N-4)는 피리딘 또는 DMF와 같은 적당한 용매내에 벤조익 안히드라이드로 처리함으로써 보호되고 상기 설명된 바와 같이 DMT/아미다이트로 더 전환된다. 그 결과 생성된 1-(2-O-치환된-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4-N-벤조일-5-치환된 시토신이 올리고머 화합물 합성에서 단량체 하부-단위 전구체로서 사용된다.
본 발명의 다른 구체예에서 2'-치환된-5-치환된 피리미딘의 2-S 유사체가 제조된다. 2,3,5-트리-O-벤조일 리보오스 당으로 시작하여 2-티오-5-치환된 피리미딘에 글라이코실화 단계를 통하여 연결됨으로써 한가지 방법으로 2'-O-치환된-2-티오-5-치환된 우리딘이 제조된다. 다양한 2-티오-5-치환된 피리미딘의 합성은 Vorbruggen, P., et. al., Angew. Chem. Int, Ed., 1969, 8, 976-977, and in Vorbruggen, P., et. al., Chem. Ber., 1973, 106, 3039-3061에 공개되어 있다. 2,3,5-트리-O-벤조일 리보오스 당 및 5-치환된-2-티오우라실을 적당한 용매에 용해시키고 N-O-비스(트리메틸 실릴)아세트아미드 및 트리메틸 실릴 트리플레이트(triflate)로 처리한다. 그 결과 생성된 2,3,5-트리-O-벤조일-2-티오-5-치환된 우리딘은 적당한 용매내에 소듐 메톡사이드를 사용하여 탈보호하여 2-티오-5-치환된 우리딘을 생성시킨다. 2-티오-5-치환된 우리딘은 적당한 용매에 용해시키고 산화 디부틸주석 및 요오드화 테트라부틸 암모늄으로 처리하고 알킬 할라이드 예를 들어 요오드화메틸로 처리하여 2'-O-치환된-2-티오-5-치환된 우리딘이 생성된다.
2'-O-치환된-2-티오-5-치환된 우리딘은 표준 방법 및 기술에 따라 DMT/아미 다이트로 전환시켜 1-(2-O-치환된-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-2-티오-5-치환된 우리딘을 제공한다. DMT/아미다이트는 올리고머 화합물 합성에서 단량체 하부-단위 전구체로서 사용된다.
본 발명의 다른 구체예에서 2'-F-5-치환된 피리미딘의 2-S 유사체가 제조된다. 2'-F-2-치환된-5-치환된 피리미딘을 제조하는 한가지 방법은 2'-F-2-치환된-5-치환된 피리미딘의 제조에 사용되는 것과 유사한 방법을 이용하는 것이다. 이것은 관능기의 선택적 보호 및 O-2 및 2' 사이에서 상기 형성된 안히드로에 유사한 S-2 및 2' 사이에서 안히드로 결합을 형성시키는 것을 포함한다.
2,3,5-트리-O-벤조일-2-티오-5-메틸-우리딘은 2,3,5-트리-O-벤조일 리보오스 및 5-치환된-2-티오우리딘 사이의 글라이코실화에 의하여 형성된다. 적당한 용매내에서 소듐 메톡사이드로 탈보호 및 정제시킨 후 그 결과 생성된 5-메틸-2-티오우리딘이 표준 방법 및 기술을 사용하여 5'-위치에서 DMT로 보호된다. 그런 다음 2'-위치는 적당한 용매내에서 1-부틸디메틸실릴 클로라이드로 처리함으로써 t-부틸-디메틸실릴기로 보호된다.
그 결과 생성되는 5'-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸-디메틸실릴-5-치환된-2-티오우리딘은 적당한 용매에 용해되고 메탄설포닐 클로라이드로 처리하여 5'-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸-디메틸실릴-2'-메탄설포닐-5-치환된-2-티오우리딘이 생성된다. 5'-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸-디메틸실릴-2'-메탄설포닐-5-치환된-2-티오우리딘은 적당한 용매내에서 소듐 메톡사이드로 더 처리하여 5'-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸-디메틸실릴-2-2'-티오 안히드로-5-치환된-2-티오우리딘을 제공한다. 이 화합물은 디옥산내에서 HF/피리딘으로 더 처리하여 2'-플루오로-3'-t-부틸-디메틸실릴-5'-O-디메톡시트리틸-5-치환된-2-티오우리딘을 생성시킨다.
2'-플루오로-3'-t-부틸-디메틸실릴-5'-O-디메톡시트리틸-5-치환된-2-티오우리딘은 표준 방법 및 기술을 이용하여 아미다이트로 전환되어 1-(2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-2-티오-5-치환된 우리딘을 제공한다. DMT/아미다이트는 올리고머 화합물 합성에서 단량체 하부-단위 전구체로써 사용된다.
2'-플루오로-3'-t-부틸-디메틸실릴-5'-O-디메톡시트리틸-5-치환된-2-티오우리딘의 시티딘 유사체로의 전환은 1,2,4-트리아졸 절차를 사용하여 1-(2-O-치환된-5-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-치환된 우리딘의 시티딘 유사체로의 전환을 위한 상기 절차를 사용하여 수행한다. 2-S 화합물의 전환을 위해 이 그룹이 적당한 보호그룹 예를 들어 톨루오일을 이용하여 보호되어야만 한다.
1995. 7. 9 출원된 "단백질 카이나제 C의 올리고뉴클레오티드 조절"이란 제목의 미국 특허 출원번호 제08/089,996호(대리인 참조번호 ISIS-1154, 본 출원과 함께 양도되고 이 출원의 내용은 여기에 참고로 언급됨)에서는 갭된(gapped) 올리고뉴클레오티드(Dean, et al., J. Biol. Chem., 1994, 23, 16416)이 합성되었고 그것들의 성능을 결정하기 위해 단백질 카이나제 C 분석법으로 시험된다. 우수한 성능을 가진 하나의 예시적인 올리고뉴클레오티드는 20mer 디옥시포스포로티오에이트인 SEQ ID NO: 27 올리고뉴클레오티드이다. 이 올리고뉴클레오티드는 상기 기재된 분석법에서 더 작은 전사체의 약 80% 축소되었고 더 큰 전사체의 90% 이상 축소되었다.
본 발명의 하나의 구체예에서 구조식 I의 적어도 하나 이상의 단량체 단위를 가지는 올리고머 화합물이 합성되고 PKC-α 단백질의 합성을 저해하는 데 사용된다. SEQ ID NO: 27에 유사한 서열을 가지는 두 개의 올리고 누클레오티드는 1-6 및 15-20 위치에서 2'-플루오로를 가지고 2, 3, 5 및 16-18 위치에 티민 대신에 우라실을 가지는 완전히 수식된 포스포로티오에이트인 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 28로서 합성되었고 2, 3, 5 및 16-18 위치에서 티미딘 대신에 2'-플루오로-5-메틸-우리딘을 가지고 1, 4, 6, 15, 19 및 20 위치에 2'-플루오로는 더 가지는 완전히 수식된 포스포로티오에이트인 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 29로서 합성되었다. 이들 두 개의 올리고뉴클레오티(SEQ ID NO; 28, SEQ ID NO: 29)는 상기 분석법에 의해서 평가 되었고 그 결과는 SEQ ID NO: 27의 것과 비교되었다.
SEQ ID NO: 28 및 SEQ ID NO: 29는 SEQ ID NO: 27에 비하여 성능이 약 10배 증가되었음을 나타내었다. SEQ ID NO: 29는 또한 SEQ ID NO: 28에 비하여 성능면에서 측정가능한 증가를 보여주었다.
상기 결과로부터 예측할 수 있듯이 이들 세 개의 올리고뉴클레오티드의 Tm은 SEQ ID NO: 29 > SEQ ID NO: 28 > SEQ ID NO: 27의 순서이다.
Figure pct00008
본 발명의 하나의 구체예에서 올리고머 화합물은 구조식 IV의 다수의 단량체하부-단위를 가진다.
Figure pct00009
변수 A, R, L, Q1, Q2및 Z'는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 다른 구체예에서 구조식 I-IV의 다수의 단량체 하부-단위를 가지는 올리고머 화합물은 사전에 결정된 서열을 가진다. 본 발명의 단량체 하부-단위는 올리고머 화합물의 활성을 증가시키기 위해 미리 결정된 서열의 올리고머 화합물내에 미리 결정된 위치에 존재할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 뉴클레오시드 다이머가 본 발명의 화합물에 통합된다. 혼합된 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드를 본 발명의 화합물내로 통합시키기 위한 하나의 절차는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 다이머 및 구조식 I-IV의 단량체 하부-단위를 표준 뉴클레오티드 합성법을 이용하여 미리 예정된 순서로 올리고머 화합물에 통합시키는 것이다. 본 발명의 한 구체예에서 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 및 뉴클레오시드 다이머는 1993. 12. 28 출원된 "히드라진-기저 및 히드록실아민-기저 올리고뉴클레오티드 연결자 및 그것들의 양방향 합성법"이란 제목의미국 특허출원 제08/174,379호(대리인 참조번호 ISIS-0716); 1993. 3. 31 출원된 "골격 수식된 올리고뉴클레오티드 유사체 및 이들의 라디칼 커플링 제조법"이란 제목의 미국 특허출원 제 08/040,933호(대리인 참조번호 ISIS-0717); 1993. 3. 31 출원된 "골격 수식된 올리고뉴클레오티드 유사체 및 환원 커플링을 이용한 이들의 제조법"이란 제목의 미국 특허출원 제08/040,903호(대리인 참조번호 ISIS-0718)에서 공개된 방법에 따라 제조되며 본 출원과 함께 양도되었으며 이들 특허출원 공개 내용은 참고로 언급되어 있다.
본 발명의 목적에 적합한 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드는 비-인산 연결자에 의해서 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오시드를 가지고 상기 설명된 바와 같이 단량체 하부-단위와 인 함유 공유 결합을 형성하는 혼합된 골격 올리고머이다. 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드는 인 함유 및 비-인 원자 함유 연결자를 통하여 연결된 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드의 합성에 유용하다. 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 및 관련된 화합물의 합성에 통상 사용되는 중요한 화합물이다. 상업적으로 사용가능한 대표적인 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드는 2'-O-메틸 우리딘 및 2'-O-메틸 시티딘을 포함한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 피리미딘 뉴클레오시드는 2S 유사체 및 5- 및 6-치환된 우리딘 및 시티딘과 같은 비-자연적으로 형성되는 피리미딘 뿐만 아니라 자연적으로 형성되는 피리미딘을 포함한다. 또한 N3 치환된 피리미딘 또는 위치 4 및/또는 5에서 부착된 헤테로시클릭 고리 구조를 가지는 피리미딘도 포함된다. 본 발명에 적당한 많은 수식된 피리민딘은 이 분야에 공지되어 있다(Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Volume 1 Plenum Press, N.Y. 1988 참조). 본 명세서에 정의된 바와 같이 2S 피리미딘 염기는 이들의 2-위치에 결합된 황 원자를 가지는 피리미딘 염기이다.
본 발명에 따른 뉴클레오염기는 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(의사(psendo) 우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로 메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 뿐만 아니라 아데닌, 구아닌, 시토신, 우리딘, 및 티민과 같은 푸린 및 피리미딘을 포함한다. 이외의 푸린과 피리미딘은 미국 특허 제3,687,808호에 공개된 것, Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, Pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것, Englisch, et al., Angewandte Chemie, International Edition 1991, 30, 613에 개시된 것을 포함한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 뉴클레오시드 당의 2'-산소에 피리미딘의 2-위치를 연결시키는 단일 결합을 가지는 피리미딘 뉴클레오시드이다. 여기에 정의된 바와 같이 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 피리미딘 고리의 2-위치가 삽입된 황원자를 통하여 뉴클레오시드 당의 2'-위치에 연결된 피리미딘 뉴클레오시드이다.
몇몇 바람직한 구체예에서 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 또는 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 하기의 일반적인 구조식을 가진다:
Figure pct00010
상기에서 X'는 0 또는 S이고;
R2및 R3는 독립적으로 수소 또는 히드록실 보호기이고;
R5및 R6는 독립적으로 H, C1-C30히드로카르빌 또는 치환된 C1-C30히드로카르빌이고;
2S, 2'- 안히드로피리미딘 뉴클레오시드 및 본 발명의 방법에 사용되기에 적당한 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 피리미딘 고리에서 치환체를 가지는 것뿐만 아니라 비치환된 것도 포함한다.
다양한 치환된 피리미딘 치환체가 이 분야에 알려져 있으며 예를 들어 5-위치에서의 알킬화가 있다. Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Volume 1 supra 참조, 그러한 치환된 2,2' 및 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 2,2' 또는 2S,2' 결합의 형성 전 또는 후에 수식가능한 자연적으로 형성된 뉴클레오시드에서 제조될 수 있다. 이와 같이 본 발명의 한 구체예에서 치환체가 2,2' 또는 2S, 2' 결합의 형성 후에 2,2' 또는 2S,2'-안히드로피리미딘에 부착되고 본 발명의 다른 구체예에서는 피리미딘 뉴클레오시드의 피리미딘 고리에 치환체의 부착이 2,2' 또는 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드의 형성에 선행한다.
본 발명의 방법은 2'-O-치환된 피리미딘의 형성에 있어서 상당한 경제적 이점을 제공한다. 예를 들어 수식된 올리고뉴클레오티드 및 상당한 화합물의 합성에서 중요한 중간체인 화합물 2'-O-메틸 우리딘이 본 발명의 방법을 사용하여 상업적으로 이용가능한 물질의 비용의 약 10분의 1로 제조가능하다. 수식된 올리고뉴클레오티드 및 관련된 화합물의 합성에 유용한 또 다른 유용한 중간체, 2'-O-메틸-시티딘은 본 발명의 방법을 사용하여 상업적으로 이용가능한 물질의 비용의 약 5분의 1로 제조될 수 있다. 이들 비용은 대규모 합성, 출발 물질의 가격 및 필요한 노동시간에 대하여 이전에 얻어진 생산량에 기초한다.
2, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 DMF내에서 디페닐-카보네이트 및 소듐 바이카보네이트 또는 다른 종래의 용매로 처리하고 정제하여 피리미딘 뉴클레오시드로부터 제조될 수 있다. Townsend, Leroy B., Chemistry of Nucleosides and Nucleotides 1, Plenum Press, New York, 1988 참조. 그 결과 생성된 2,2'-안히드로 피리미딘 뉴클레오시드는 약한 친핵성 시약(예를 들어 알코올) 및 루이스산(예를 들어 트리알킬 보레이트)으로 처리하고 가열하여 그에 대응하는 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드를 생성시킨다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 2S, 2', 또는2, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드를 약한 친핵성 시약의 존재하에서 구조식 R1-OH의 알코올로 처리하여 각각 2'-O-R1-피리미딘 뉴클레오시드 또는 2S 유사체를 생성시킨다. 상기 방법은 소규모 및 대규모의 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드의 합성에 적당하다.
2S,2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 Townsend, Leory b., supra의 절차에 따라 피리미딘 뉴클레오시드에서 만들어질 수 있다. Ueda, T., Tanaka, H., Chem. Pharm, Bull.(Toykgo), 1970, 18, 14p 참조. 2S, 2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 본 발명의 방법에 따라 약한 친핵성 시약(예를 들어 알코올) 및 루이스산(예를 들어 트리알킬 보레이트)로 처리하여 그에 대응하는 2'-O-치환된 2S-피리미딘 뉴클레오시드를 제조한다.
2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드 및 2'-O-치환된 2S-피리미딘 뉴클레오시드는 표준 방법 및 기술에 따라 그것들 각각의 DMT/아미다이트로 전환되어 1-[5-O-디메톡시트리틸-2-O-치환된-(3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸-포스파이트)]피리미딘 뉴클레오시드 또는 1-[5-O-디메톡시트리틸-2-O-치환된-(3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸-포스파이트)]-2S-피리미딘 뉴클레오시드를 생성시키며 이들 각각은 올리고머 화합물의 합성에서 단량체 하부 단위 전구체로서 사용될 수 있다.
특정 이론에 구속되는 것은 아니지만 안히드로피리미딘 뉴클레오시드 고리를 여는 기작은 약한 친핵성 시약에 의해서 2'-탄소에서 친핵성 공격이 관여하는 것으로 여겨진다. 상기 친핵성 공격은 루이스 산을 가교하는 산소에 착화시킴으로써 용이하게 행하여질 수 있다. 그 결과 생성되는 착물은 약한 친핵성 시약에 의해서 친핵성 공격에 대하여 2'-탄소를 활성화시키는 것으로 여겨진다. 적용가능한 또다른 이론은 루이스산은 5' 및 3' 히드록실기에 착화되어 분자내에 형태 변화를 초래하고 약한 친핵성 시약에 의해서 공격을 가능하게 하여 생성물을 제공한다는 것이다.
본 발명의 한 구체에에서 사용된 루이스산은 트리알킬 보레이트이다. 트리알킬 보레이트는 구입가능하기도 하고 보레이트 알킬기가 친핵성 시약의 알킬기와 동일하도록 제조될 수 있다. 예를 들어 2'-O-메틸우리딘이 제조될 때 트리메틸 보레이트는 바람직하게는 루이스산이며 메탄올이 친핵성 시약이 될 수 있다. 트리메틸, 트리에틸, 및 트리프로필 보레이트는 Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin에서 상업적으로 구입가능하다.
택일적으로 트리알킬 보레이트가 상기 설명된 바와 같이 2'-위치에 대하여 바람직한 치환체에 대응하는 붕소 및 알코올로부터 제조될 수 있다. 일반적으로 THF내의 1.0M 용액으로서 구입가능한 붕소는 3당량의 각각의 알코올과 반응된다. 수소의 방출이 완성되었을 때 그 용액은 THF를 제거하기 위해 농축된다. 바람직한 알코올내에 바람직한 트리알킬 붕소를 포함하는 결과적으로 생성된 용액이 상기 설명된 바와 같이 안히드로 고리를 열기 위하여 본 발명의 방법에 사용되어 질 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 피리미딘이 우리딘 또는 치환된 우리딘인 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드는 1,2,4-트리아졸을 사용하여 공지된 방법 및 기술에의하여 그에 대응하는 시티딘 유사체로 전환되어(아민화되어)질 수 있다. 일반적으로 2'-O-치환된 우리딘 뉴클레오시드는 아세틱 안히드라이드와 같은 일반적인 보호기로 3'-O 및 5'-O 위치에서 맨처음 보호된다. 일반적인 용매(예를 들어 아세토니트릴) 내의 1,2,4-트리아졸은 저온에서 염기(예를 들어 트리에틸아민)의 존재하에서 POCl3로 처리한다. 그 보호된 2'-O-치환된 우리딘 뉴클레오시드는 일반적인 용매에 용해되어 트리아졸/POCl3를 포함하는 용액에 첨가된다. 충분한 시간이 지난후 이후에 집성 및 정제하여 트리아진-1-(3,5-디-O-보호된-2-치환된)피리미딘 뉴클레오시드를 생산한다. 상기 화합물은 암모니아로 처리함으로써 시토신으로 전환될 수 있다. 엑소시클로 아미노기는 피리딘과 같은 종래의 용매내에서 벤조익 안히드라이드로 처리함으로써 보호될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서 피리미딘이 우리딘 또는 치환된 우리딘인 2'-O-치환된-2S-피리미딘 뉴클레오시드는 1,2,4-트리아졸을 이용하여 공지된 방법 및 기술에 의하여 그에 대응하는 시티딘 유사체로 전환될 수 있다. 트리아졸로 처리하기 전에 2S 그룹이 적당한 보호기 즉, 톨루오일로 보호되는 것만 제외하고 상기에 제시된 절차를 따른다.
그 결과 생성되는 2'-O-치환된-우리딘 또는 2'-O-치환된-2S-우리딘은 표준 방법 및 기술에 따라 각각의 DMT/아미다이트로 전환되어 4-N-보호된-1-(2-O-치환된-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸)시티딘 또는 2S 유사체를 생산한다. 4-N-보호된-1-(2-O-치환된-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸)시티딘 또는 2S 유사체는 올리고머 화합물의 합성에 있어서 단량체 하부-단위 전구체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 2'-O-치환된-5-치환된 우리딘 단량체 하부-단위는 5-치환된 우리딘으로 시작하여 제조되고 상기 제시된 바와 같이 합성된다. 이 화합물은 적당한 용매 즉 메탄올 내에서 산화 디부틸주석으로 처리하여 정제된다. 그 결과 생성되는 1-(2',3'-디-O-부틸주석-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-치환된 우리딘은 적당한 용매내에서 할로알킬, 보호된 할로 알킬아미노, 또는 할로알킬이미다조 화합물(예를 들어 이도프로판)로 처리하여 각각의 2'-O-치환체를 생산한다. 아랄킬 및 아릴기가 알킬기 대신에 사용될 수 있다.
다수의 치환체를 포함하는 피리미딘(즉, 치환기를 포함하는 피리미딘)은 이 분야에 알려져 있다. 본 발명의 방법에 친숙한 치환기의 대표적인 예로는 알킬 또는 치환된 알킬, 알케닐 또는 치환된 알케닐, 알키닐 또는 치환된 알키닐, 카르보실로(carbocylo) 알킬, 카르보실로 알케닐, 카르보실로 아랄킬, 아릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬과 같은 히드로카르빌기가 있다. 바람직하게는 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환기는 1 내지 약 30 탄소를 가지며 1 내지 약 10 탄소가 특히 바람직하다. 아릴기는 6 내지 약 14 탄소를 가지는 것이 바람직하며 아랄킬기는 7 내지 약 30 탄소를 가지는 것이 바람직하다. 상기에서 열거된 치환기는 그 자체가 알콕시, 알코올, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티올알콕시, 할로겐, 또는 알킬, 아릴, 알케닐 또는 알키닐기 및 에테르기와 같은 치환기를 포함할 수 있다.
우라실의 C-5에서 알킬, 알케닐 및 알키닐기의 치환은 1992. 11. 24 출원된 PCT/US92/10115에 보고되어 있고 알킬치환체의 예는 Manoharan, M., Antisense Research and Applications, Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, boca Raton, 1993에 더 개시되어 있다. 그 외의 치환체는 Townsend, L.B. ibid에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에서 2S, 2' 또는 2,2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 구조식 R1-OH의 알코올로 처리된다. 대표적인 R1기는 알킬 또는 치환된 알킬, 알케닐 또는 치환된 알케닐, 알키닐 또는 치환된 알키닐, 카르보실로 알킬, 카르보실로 알키닐, 카르보실로 아랄킬, 아릴, 아랄킬 또는 치환된 아랄킬을 포함한다. 바람직하게는 알킬, 알케닐 및 알키닐 R기는 1 내지 약 30 탄소를 가지며 1 내지 약 10 탄소를 가지는 것이 바람직하다. 아릴기는 6 내지 약 14 탄소를 가지고 아랄킬기는 7 내지 약 30 탄소를 가지는 것이 바람직하다. 상기에서 열거된 R1기는 그 자체가 알콕시, 알콜, 아미노, 벤질, 폐닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 히드록시, 에테르 또는 나아가 알킬, 아릴, 알케닐 또는 알키닐기와 같은 치환기를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드 및 2'-O-치환된 2S-피리미딘 뉴클레오시드(치환된 피리미딘 뉴클레오시드)는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 혼합된 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드 및 이 분야에서 공지된 관련된 화합물을 포함하는 다양한 화합물을 제조하는 데 사용될 수있다.
본 발명의 명세서에서 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 두 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 하부단위를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 뉴클레오티드는 유사한 기능을 수행하는 비천연적으로 생성되는 부분 뿐만 아니라 천연적으로 생성되는 당, 뉴클레오염기, 및 당간(골격) 연결자를 포함한다. 화학적으로 수식되거나 치환된 올리고뉴클레오티드는 증가된 세포 흡착 또는 뉴클레아제의 존재하에서 증가된 안정성과 같은 특성으로 인하여 자연 형태보다 더 바람직하다.
본 발명에 따른 몇몇 바람직한 올리고뉴클레오티드의 특정예에는 포스포디에스테르 당간 연결자(골격)외에도 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 사슬 알킬 또는 시클로알킬 당간 연결자 또는 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 연결자와 같은 수식된 당간 연결자를 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이 올리고뉴클레오티드란 용어는 비-인 원자 연결성분을 가지는 두 개 또는 그 이상의 뉴클레오시드 하부 단위를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 글리고실 결합에 의하여 뉴클레오염기에 부착된 리보푸란노스 성분을 가진다. 본 발명의 목적에 적합한 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드는 비-인산 연결자에 의하여 공유 결합된 적어도 두 개 이상의 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드와의 적어도 하나 이상의 인 함유 공유결합을 가지는 혼합된 골격 올리고머이며 적어도 하나 이상의 단량체 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단위는 본 발명의 방법을 이용하여 제조되는 2'-O-치환된 화합물이다. 올리고 뉴클레오티드/뉴클레오시드는 인 함유 및/또는 인을 함유하지 않은 연결자를 통하여 연결된 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드를 가진다.
본 발명의 방법을 이용하여 제조된 2'-O-치환된 화합물을 연결시키는 방법은 포스포라미다이트로 전환시킨 다음 용액상 또는 고체상 화학법을 포함한다. 대표적인 용액상 기술은 1993. 5. 11 특허되고 본 발명과 함께 양도된 미국 특허 제5,210,264호에 기재되어 있다. 대표적인 용액상 기술은 표준 포스포라미다이트 화학법을 이용하여 DNA 및 RNA 합성에 일반적으로 사용되는 것이다. (e.g., Protocols For Oligonucleotides And Analogs, Agrawal, S., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1993. 참조) 바람직한 용액상 합성은 활성화된 인산과 같은 포스포라미다이트를 이용한다. 포스포라미다이트는 Pm화학법을 이용한다. 그 후에 중간체인 포스파이트 화합물은 공지된 방법을 이용하여 Pv상태로 산화된다. 이것은 선택된 산화 조건에 따라 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 포스페이트 연결자를 포함하는 연결자가 합성되도록 한다. 다른 포스페이트 연결자가 또한 생성될 수 있다. 적당한 연결자의 대표적인 예로는 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬 포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미다이트, 케톤, 술폰, 카보네이트, 티오아미데이트 및 이 분야에 공지된 바와 같은 다른 성분이 있다. 알킬포스포로티오에이트 연결자는 WO 94/02499에 개시되어 있다.
올리고뉴클레오티드 합성의 연결 효과를 증가시키는 데 사용되는 표준 방법 및 기술은 3' 및 5' 기능기의 활성화를 포함한다. 몇몇 공통적으로 활성화된 기는 대응되는 활성화된 포스페이트 및 활성화된 포스파이트를 생성시키는 포스페이트 및 포스파이트이다(e.g., Nucleic Acids in Chemistry and Biology; Blackburn, G. M., Gait M. J., Eds. Chemical Synthesis; IL: New York, 1990, Chapter 3, p. 98 참조). 그 밖의 다른 것이 공지되어 있으며 여기에 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 에이코실 및 다른 고급 탄소 알킬기를 비롯한 치환된 직쇄 및 치환되지 않은 직쇄, 분지쇄 및 지방족 고리 히드로카본을 예로 들 수 있으며 이에 한정되지는 않는다. 그 외의 예로는 2-메틸-프로필, 2-메틸-4-에틸부틸, 2,4-디에틸프로필, 3-프로필-부틸, 2,8-디부틸데실, 6,6-디메틸옥틸, 6-프로필-6-부틸옥틸, 2-메틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-에틸헥실 및 다른 분지된 사슬 그룹을 포함한다.
본 발명에 유용한 알케닐기는 비닐, 알릴 및 크로틸와 같은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 상기 알킬기로부터 유도된 성분을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 유용한 알키닐기는 프로파르길(propargyl)과 같은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중결합을 포함하는 상기 알킬기에서 유도된 성분을 포함하며 이에 한정되지 않는다.
아릴이란 용어는 페닐, 나프틸, 크실일, 피롤 및 푸릴기를 비롯한 모노시클릭 및 폴리시클릭 방향족 그룹을 의미한다. 아릴기(예를 들어 이미다조기)는 3개의 탄소원자와 같이 적은 탄소원자를 포함하며 바람직하게는 아릴기가 6 내지 약 14 탄소원자를 가지며 더 바람직하게는 6 내지 약 10 탄소원자를 가진다.
아랄킬이란 용어는 그러한 그룹의 부착 지점이 그것의 알킬 부분을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 알킬 및 아릴 부분 양자를 포함하는 그룹을 의미한다. 벤질기는 아랄킬기의 한가지 예를 제공한다.
다수의 치환기가 보호된(차단된) 형태 및 최종의 바람직한 화합물을 형성하기 위해 뒤이어 탈보호된 본 발명의 화합물에 도입될 수 있다. 치환기는 피리미딘 고리에 공유적으로 부착된 그룹 및 상기 기재된 알코올 R1-OH 의 R1그룹을 포함한다. 일반적으로 보호기는 특정 반응 조건에 화학적 관능성이 불활성이 되도록하며 분자의 나머지 부분에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 부착되어 분자내의 그러한 관능성을 제거할 수 있다. e.g., Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991 참조. 예를 들어 아미노기는 프탈이미도기 또는 9-플루오레닐-메톡시카르보닐(FMOC)기로서 보호될 수 있으며 카르복실기는 플루오레닐메틸기로서 보호될 수 있다. 대표적인 히드록실 보호기는 Beaucage, et al., Tetrahedron 1992. 48, 2223에 기재되어 있다. 바람직한 히드록실 보호기는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 및 트리메톡시트리틸기와 같이 산에 불안정하다.
본 발명에 따라 고체 담체는 조절된 세공 유리(CPG), 옥살릴-조절된 세공 유리를 포함한다(e.g., Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 1527 참조).
TentaGel 담체--아미노폴리에틸렌글리콜 유도된 담체(e.g., Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373) 또는 Poros --폴리스티렌/디비닐벤젠 공중합체. 많은 다른 고형 담체는 상업적으로 구입가능하고 본 발명에 적합하다.
본 발명의 명세서에서의 활성화된 고형 담체는 기능기로 유도되거나 결과적으로 활성화된 고형 담체가 본 발명의 단량체 하부단위 또는 뉴클레오시드 다이머와의 반응에 화학적으로 활성이 되도록 반응성 성분으로 처리된 고형담체이다.
몇몇 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법은 2'-O-치환된-5-할로 피리미딘 뉴클레오시드를 제조하는 데 사용된다. 2'-O-치환된-5-할로 우리딘은 5-F, -Cl, -Br, 및 -I 우라실로부터 제조될 수 있으며 Aldrich Chemical Company로부터 구입가능하다. 2'-O-치환된 5-할로 우리딘은 하기에 기재된 바에 따라 시티딘으로 전환될 수 있다.
본 발명의 방법에서 알코올, 루이스산 및 안히드로 피리미딘 뉴클레오시드는 반응 용기에서 처리된다. 반응 용기는 반응물이 가열되는 반응에 적당한 이 분야에서 공지된 어떠한 용기도 될 수 있다. 바람직하게는 반응 용기가 가압 봉합된 용기이고 더욱 바람직하게는 압력 봄이다.
바람직한 구체예에서 알코올, 루이스산 및 안히드로피리미딘 뉴클레오시드는 디옥산과 같은 적당한 용매에서 약 120℃ 내지 약 200℃에서 가열시킴으로써 처리된다. 특히 바람직한 구체예에서 알코올, 루이스산, 안히드로 피리미딘 뉴클레오시드 및 용매는 가압 봉합된 용기내에서 가열된다. 압력 봄은 특히 바람직하다.
여기에서 사용된 루이스 산은 제2의 분자 및 이온으로부터의 두 개의 전자로 공유 결합을 형성시킴으로써 다른 분자나 이온과 결합할 수 있는 분자나 이온으로서의 통상의 의미를 가진다.
본 발명의 방법에 사용되기 위해 루이스 산은 1쌍의 전자를 수용할 수 있는 전자 결핍 종( species)으로 여겨진다. 이가 및 삼가 강산이 특히 바람직하다. 이가 및 삼가 금속의 이가 및 삼가 양이온 및 마그네슘, 칼슘 알루미늄, 아연, 크롬, 구리, 붕소, 주석, 수은, 철, 망간, 카드뮴, 갈륨 및 바륨을 포함하는 착체가 더 바람직하다. 그것들의 착체는 히도록사이드, 알킬, 알콕사이드, 디 및 트리할라이드 특히 트리클로라이드 및 트리플루오라이드 및 아세테이트와 같은 유기산 리간드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 유용한 루이스산의 특히 바람직한 예는 보레이트, 특히 알킬 보레이트이다.
2'-O-메틸 피리미딘 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 상보성 RNA에 혼성화 친화력 뿐만 아니라 유전자 발현의 저해에 있어서 효과를 평가하기 위한 연구에서 평가되었다. 2'-디옥시 갭을 포함하는 2'-수식된 올리고뉴클레오티드 및 균일하게 수식된 2'-수식된 올리고뉴클레오티드를 사용한 하나의 연구(Monia, B.P., et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514-14522)는 2'-수식된 올리고뉴클레오티드는 그에 대응하는 수식되지 않은 2'-디옥시올리고뉴클레오티드 보다 상보적인 RNA에 대한 더 큰 친화력을 가진다는 것을 보여준다. 2'-디옥시 갭을 포함하는 2'-O-수식된 올리고 뉴클레오티드는 또한 세포에서 Ha-ras 종양 유전자의 발현을 저해하는 활성을 나타낸다.
균일하게 수식된 2'-O-치환된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 또 다른 연구에서 뉴클레아제 안정성 및 용융점(Tm)이 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-프로필, 및 2'-O-펜틸 뉴클레오티드를 포함하는 완전히 수식된 올리고 뉴클레오티드 서열에 비교하였다. 2'-O-펜틸을 제외한 수식이 상보적 RNA와 형성된 이중가닥의 Tm을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 수식된 동형이중가닥은 상당히 더 높은 Tm을 나타내었고 Tm순서는 2'-플루오로: 2'-플루오로>2'-O프로필:2'-O-프로필>2'-O-메틸:2'-O-메틸>RNA:RNA>DNA:DNA이다. 2'-수식된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 안정성은 뱀 독성(snake venom) 포스포디에스티라제(SVPD) 및 뉴클리아제 Sl을 사용하여 시험하였다. 2'-수식에 의해서 부여된 안정성은 수식의 크기와 상관관계에 있는 것으로 관찰되었다. 뉴클레아제 안정성의 수준은 2차 구조를 형성하기 위한 능력을 가지는 올리고뉴클레오티드에 존재하나 2'-수식된 올리고뉴클레오티드에 대해서만 나타나며 2'-디옥시올리고뉴클레오티드에 대해서는 그러하지 아니하다.
본 발명의 다른 목적, 이점, 및 새로운 특성은 하기에 제공된 실시예를 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백하여 질 것이다.
실시예 1
2,2'-안히드로[1-(β-D-안히드로푸란노실)-5-메틸우리딘]
5-메틸우리딘(리보실티민, 야마사, 코시, 일본에서 구입가능) (72.0g,0.279mol), 디페닐카보네이트(90.0g, 0.420 mol) 및 소듐 바이카보네이트(2.0g, 0.024 mol)을 디메틸포름아미드(300mL)에 첨가시켰다. 이 혼합물은 결과적으로 생성된 이산화탄소 기체가 조절된 방법으로 이탈되도록 교반시키면서 환류시키기 위하여 가열시켰다. 1시간 후에 약간 검게 된 용액을 감압하에서 농축시켰다. 그 결과 생성된 시럽을 교반된 디에틸 에테르(2.5L)로 쏟아 부었다. 생성물은 검(gum)을 형성하였다. 에테르를 가만히 따르고 잔여물을 최소량의 메탄올(ca 400Ml)에 용해시켰다. 용액을 상기에서와 같은(2.5L) 새로운 에테르에 쏟아 부었고 경직된 검을 생산하였다. 에테르를 천천히 따르고 검을 진공 오븐(24시간동안 1 mm Hg에서 60℃)에서 건조하였고 가벼운 황갈색의 분말(57g, 85% 조생성량)로 압착되었다. NMR은 구조 및 페놀과 그것의 나트륨 염에 의한 불순도(ca 5%)와 일치하였다. 그것은 에틸 아세테이트(10-25%) 내에서 메탄올 구배(gradient)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 더 정제되어 흰고체(mp 222-4℃)를 생성시켰다.
실시예 2
1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
2.2'-안히드로[1-(β-D-아라비노푸란노실)-5-메틸우리딘](71g, 0.32 mmol) 및 디옥산(700 mL)을 2리터 스테인레스 스틸 봄내에 두었고 HF/피리딘(100g, 70%)을 첨가시켰다. 혼합물을 16시간동안 120-125℃에서 가열시킨 다음 얼음조에서 냉각시켰다. 봄을 열어서 혼합물을 3리터의 얼음위에 쏟아 부었다. 이 혼합물에 탄산 수소 나트륨 용액(400mL) 및 포화된 중탄산나트륨용액(400mL)을 조심스럽게 첨가하였다. 혼합물을 여과하였고 필터 케이크를 물(2x100mL)과 메탄올(2x500mL)로 세척하였다. 물과 메탄올을 바쿠오(vacuo)에서 농축시켜 건조시켰다. 메탄올(200mL) 및 거친 실리카 겔(80g)을 잔여물에 첨가시키고 혼합물을 바쿠오에서 농축시켜 건조시켰다. 그 결과 생성된 물질을 실리카 겔 상에 농축시켜 에틸 아세테이트 및 메탄올(100:0 내지 85:15)의 구배를 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 분획을 수집(pooling) 및 농축하여 36.9g(51%, 2단계 생성량)의 상기 표제의 화합물을 얻었다.
또한 1-(2-페닐-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(10.3g)이 이 반응에서 분리되었다. 이 물질은 봄 반응이 불순물질에서 수행될 때 상기 안히드로 반응으로부터 페놀 및 그것의 나트륨 염으로부터 형성된다. 안히드로 물질이 정제될 때 이 생성물이 형성되지 않는다. 형성된 1-(2-페닐-2-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘은 2'-플루오로 물질과 같은 반응 조건을 이용하여 그것의 DMT/포스포라미다이트로 전환되었다.
실시예 3
1-(5-O-디메톡시트리틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(31.15g, 0.12mol)이 피리딘(150 mL)내에 현탁시켰고 디메톡시트리틸 클로라이드(44.62g, 0.12 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 밀폐된 플라스크에서 2시간동안 교반시켰고 메탄올(30mL)을 첨가하였다. 혼합물을 바쿠오에서 농축시키고 그 결과 생성된 잔여물을 포화된 중탄산염 용액(500mL) 및 에틸 아세테이트(3×500mL) 사이에 분배시켰다. 에틸 아세테이트 분획이 모아졌고 황산 마그네슘 위에서 건조되었고 여과되고 바쿠오에서 밀도가 높은 오일로 농축되었다. 상기 오일을 디클로로메탄(10mL)에 용해시키고 실리카 겔 컬럼에 적용시키고 에틸 아세테이트:헥산:트리에틸아민, 60/39/1에서 75/24/1로 증가시키면서 용출시켰다. 생성물 분획을 모아서 포움 형태인 59.9g(89%)의 표제 화합물을 얻었다.
실시예 4
1-(5-O-디메톡시트리틸-2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
1-(5-O-디메톡시트리틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(59.8g, 0.106 mol)을 디클로로메탄에 용해시키고 2-시아노에틸 N,N,N'N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(46.9mL, 0.148 mol) 및 디이소프로필아민 테트라졸(5.46g, 0.3 eq.)을 첨가하였다. 혼합물을 16시간동안 교반시켰다. 혼합물을 포화된 중탄산나트륨(1L)으로 세척하였고 중탄산나트륨 용액을 디클로로메탄(500mL)으로 역추출하였다. 결합된 유기층을 소금물(brine; 1L)로 세척하였고 소금물은 디클로로메탄(100mL)으로 역추출하였다. 결합된 유기층을 황산 나트륨위에서 건조시켰고 여과하여 약 200mL의 부피로 농축시켰다. 그 결과 생성된 물질을 헥산/에틸 아세테이트/ 트리에틸 아민 60/40/1을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 생성물 분획을 바쿠오에서 농축시키고 아세토니트릴(500ml)에 용해시키고 여과시키고 바쿠오에서 농축시켰고 포움으로 건조시켰다. 포움은 절단되었고 24시간동안 일정 중량이 되도록 건조시켜 68.2g(84%)의 표제 화합물을 생성시켰다. 1H NMR: (CDCl3) δ 0.9-1.4(m, 14H, 4xCH3, 2xCH), 2.3-2,4(t, 1H, CH2CN), 2.6-2,7(T, 1H, CH2CN), 3.3-3.8(m, 13H, 2xCH3OAr, 5' CH2, CH2OP, C-5 CH3), 4.2-4.3(m, 1H, 4'), 4.35-5.0(M, 1H, 3'), 4.9-5.2(M, 1H, 2'), 6.0-6.1(dd, 1H, 1'), 6.8-7.4(m, 13H, DMT), 7.5-7.6(d, 1H, C-6), 8.8(bs, 1H, NH).31P NMR (CDCl3) ; 151.468, 151.609, 151.790, 151,904.
실시예 5
1-(3',5'-디-O-아세틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
실시예 2의 절차에 따라 제조된 1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(22.4 g, 92 mmol, 85% 순도)을 피리딘으로 공비(共沸)시키고 피리딘(250mL)에 용해시켰다. 아세틱 안히드라이드(55 mL, 58 mol)를 첨가시켰고 혼합물을 16시간동안 교반시켰다. 메탄올(50mL)을 첨가하였고 교반은 30분동안 계속하였다. 혼합물을 시럽 형태로 증발시켰다. 시럽을 최소량의 메탄올에 용해시켰고 실리카 겔 컬럼 상에 부하시켰다. 헥산/에틸 아세테이트, 1:1을 생성물 분획을 용출시키는 데 사용하였다. 정제하여 19.0g(74%)의 표제 화합물을 얻었다.
실시예 6
4-트리아진-1-(3',5'-디-O-아세틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸시티딘
1,2,4-트리아졸(106g, 1.53mol)을 아세토니트릴(150mL)에 용해시킨 후 트리에틸 아민(257mL, 1.84 mol)에 용해시켰다. 혼합물을 얼음조를 사용하여 0과 10℃ 사이의 온도로 냉각시켰다. POCl3(34.5mL, 375 mol)을 천천히 첨가 깔대기에 의하여 천천히 첨가하였고 혼합물을 부가적으로 45분간 교반시켰다. 분별 플라스크에서 1-(3',5'-디-O-아세틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(56.9g, 144 mol)을 아세토니트릴(150mL)에 용해시켰다. 1-(3',5'-디-O-아세틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘을 카눌라(cannula)를 통하여 트리아졸 용액에 천천히 첨가시켰다. 얼음조를 제거하고 반응 혼합물이 1시간 동안 실온까지 가온되도록 하였다. 아세토니트릴을 바쿠오에서 제거하였고 잔여물이 포화된 중탄산 나트륨 용액(400mL) 및 디클로로메탄(4×400mL) 사이에서 분배되었다. 유기층이 모아졌고 바쿠오에서 농축되었다. 그 결과 생성된 잔여물을 에틸 아세테이트(200mL)에 용해시켰고 고체로 침전되기 시작하였다. 헥산(300mL)을 첨가하였고 부가적인 고체는 침전되었다. 상기 고체는 여과에 의해서 모아졌고 헥산(2×200mL)으로 세척되었고 바쿠오에서 건조하여 더 정제하지 않은 상태로서 사용되는 63.5g을 얻었다.
실시예 7
5-메틸-1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신
4-트리아진-1-(3',5'-디-O-아세틸-2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-티민(75.5g, .198 mol)을 스테인레스 스틸 봄에서 암모니아(400mL)내에 용해시켰고 하룻밤 동안 밀봉시켰다. 봄을 냉각시키고 개봉하여 암모니아를 증발시켰다. 메탄올을 첨가하여 그 물질을 플라스크로 옮겨지도록 하고 약 10 부피의 에틸 에테르를 첨가하였다. 혼합물을 10분간 교반시켰고 그런다음 여과하였다. 고체를 에틸 에테르로 세척하였고 건조하여 51.7g(86%)의 표제 화합물을 얻었다.
실시예 8
4-N-벤조일-5-메틸-1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신
5-메틸-1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실-시토신(54.6g, 0.21 mol)을 피리미딘(700mL)내에 현탁시키고 벤조익 안히드라이드(70g, .309mol)를 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 48시간 동안 교반하였다. 피리미딘은 증발시켜 제거하고 메탄올(800mL)을 첨가하였고 혼합물을 첨가하였다. 형성된 침전물을 여과하고 메탄올(4×50mL)로 세척하고 에테르(3x100mL)로 세척하고 45℃에서 진공 오븐에서 건조시켜 40.5g의 표제 화합물을 생성시켰다. 여과물을 바쿠오에서 농축시켰으며 상온에서 하룻밤동안 봄내에서 포화된 메탄올성 암모니아로 처리하였다. 혼합물은 바쿠오에서 농축되었으며 그 결과 생성된 오일은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되었다. 재순환된 초기 물질은 다시 상기한 바와 같이 처리되어 부가적으로 4.9g의 표제 화합물을 생성시켜 결합된(combined) 45.4g(61%)의 표제 화합물을 생성시켰다.
실시예 9
4-N-벤조일-5-메틸-1-(2-플루오로-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신
4-N-벤조일-5-메틸-1-(2-플루오로-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신(45.3g, .124mol)을 250mℓ의 건조 피리미딘에 용해시키고 디메톡시트리틸 클로라이드(46.4g, .137mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 90분동안 교반되었고 메탄올(20mL)을 첨가하였다. 혼합물은 바쿠오에서 농축되었고 에틸 아세테이트(2x1L) 및 포화된 중탄산 나트륨(1L) 사이에 분배시켰다. 에틸 아세테이트 층을 결합시켰고 황산 마그네슘 위에 건조시켰고 바쿠오에서 증발시켰다. 그 결과 생성된 오일을 디클로로메탄(200mL)내에 용해시키고 에틸 아세테이트/헥산/트리에틸 아민 50:50:1을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 분획을 건조된 바쿠오에서 농축시켜 집성하여 63.6g(76.6%)의 표제 화합물을 생성시켰다.
실시예 10
4-N-벤조일-5-메틸-1-(2-플루오로-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신
4-N-벤조일-5-메틸-1-(2-플루오로-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-시토신(61.8g, 92.8mmol)을 디클로로메탄(300mL), 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트(40.9mL, .130mol) 및 디이소프로필아민 테트라졸리드(4.76g, 0.3eg.)와 함께 상온에서 17시간 동안 교반시켰다. 혼합물은 포화된 중탄산나트륨(1L)으로 세척하였고 중탄산염 용액은 디클로로메탄(500mL)으로 역추출하였다. 결합된 유기층은 소금물(1L)로 세척하였고소금물은 디클로로메탄(100mL)으로 역추출하였다. 결합된 유기층을 황산 나트륨위에서 건조시켰고 여과시켰고 약 200mL의 부피까지 농축시켰다. 그 결과 생성된 물질을 헥산/에틸 아세테이트/트리에틸아민 60/40/1을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 생성물 분획을 바쿠오에서 농축되었고 아세토니트릴(500mℓ)내에 용해시키고 여과하여 바쿠오에서 농축시켰고 포움으로 건조시켰다. 포움을 절단시키고 24시간동안 일정 중량까지 건조시켜 72.4g(90%)의 표제 화합물을 생성시켰다. 1H NMR: (CDCl3) δ 1.17-1.3 (m, 12 H, 4xCH3), 1.5-1.6 (m, 2 H, 2xCH), 2.3-2.4 (t, 1 H, CH2CN), 2.6-2.7 (t, 1 H, CH2CN), 3.3-3.9 (m, 13 H, 2xCH3OAr, 5' CH2, CH2OP, C-5 CH3), 4.2-4.3 (m, 1 H, 4'), 4.3-4.7 (m, 1 H, 3'), 5.0-5.2 (m, 1 H, 2'), 6.0-6.2 (dd, 1 H, 1'), 6.8-6.9 (m, 4 H, DMT), 7.2-7.6 (m, 13 H, DMT, Bz), 7.82-7.86 (d, 1 H, C-6), 8.2-8.3 (d, 2 H, Bz),31P NMR (CDCl3); bs, 151.706; bs, 151.941.
실시예 11
1-(2,3-디-O-부틸주석-β-D-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
5-메틸우리딘(7.8g, 30.2mmol) 및 산화 디부틸주석 (7.7g, 30.9mmol)을 메탄올(150mL)내에 현탁시키고 16시간동안 환류되도록 가열시켰다. 반응 혼합물을 상온까지 냉각시키고, 여과시키고 고체를 메탄올(2x150mL)로 세척하였다. 그 결과 생성된 고체를 건조시켜 12.2g(80.3%)의 표제 화합물을 생성시켰다. 이 물질은 잇따른반응에서 더 정제하지 않고 사용되었다. NMR은 구조와 일치하였다.
실시예 12
1-(2-O-프로필-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
1-(2,3-디-O-부틸주석-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(5.0g, 10.2mmol) 및 이도프로판(14.7g, 72.3mmol)은 2일동안 100℃에서 DMF내에서 교반시켰다. 반응 혼합물은 상온까지 냉각시키고 여과시키고 농축시켰다. 잔여의 DMF는 아세트니트릴과 함께 증발시켰다. 잔여물을 건조시킨 후에 조혼합물로서 2.40g(78%)의 표제 화합물 및 3'-O-프로필 이소머를 얻었다. 이 물질은 뒤에 반응에서 더 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 13
1-(2-O-프로필-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
1-(2-O-프로필-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘 및 3'-O-프로필 이소머를 조혼합물(2.4g, 8.4mmol)로서 피리딘(2×40mL)와 함께 증발되었고 피리딘(60mL)내에 용해되었다. 용액을 상온에서 아르곤하에서 15분간 교반시키고 디메톡시트리틸 클로라이드(4.27g, 12.6mmol)를 첨가시켰다. 혼합물을 탈크에 의하여 주기적으로 점검하였고 3시간내에 완성되었다. 메탄올(10mL)을 첨가하였고 혼합물을 10분동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 바쿠오에서 농축시켰고 계속 사용된 1% 트리에틸아민과 함께 60:40의 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 결과적으로 생성된 잔여물을 정제하였다. 수집 및 적당한분획의 농축은 1.32g(26%)의 표제 화합물을 생성하였다.
실시예 14
1-(2-O-프로필-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
1-(2-O-프로필-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(50.0g, 86mmol), 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라-이소프로필포스포로디아미다이트(38mL, 120mmol) 및 디이소프로필아민 테트라졸리드(4.45g, 25.8mmol)은 디클로로 메탄(500mL)내에 용해되었고 40시간동안 상온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화된 중탄산 나트륨 용액(2×400mL) 및 소금물(1x400mL)로 세척하였다. 수성층을 디클로로메탄으로 역추출하였다. 디클로로메탄 층은 결합되었고 황산 나트륨 위에서 건조되었고, 여과되었고 바쿠오에서 농축되었다. 그 결과 생성된 잔여물은 에틸 아세테이트/헥산 40:60 및 1%의 트리에틸아민을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 적당한 분획물은 수집되어 농축되었고 고 진공하에서 건조시켜 43g(67%)를 생성시켰다.
실시예 15
1-(2-O-프로필-3-O-아세틸-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘
1-(2-O-프로필-5-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(10.0g, 16.6mmol)은 피리딘(50mL)내에서 용해시키고 아세틱 안히드라이트(4.7mL, 52.7mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 바쿠오에서 농축되었고 그 결과 생성된 잔여물을 에틸 아세테이트(150mL)내에 용해시켰다. 에틸 아세테이트는 포화된 NaHCO3(150mL)로 세척되었고 포화된 NaHCO3세척액은 에틸 아세테이트(50mL)를 이용하여 역추출하였다. 에틸 아세테이트 층은 결합시켰고 바쿠오에서 농축시켜 흰색 포움 11.3g을 생성시켰다. 조 생성량은 100%보다 더 컸으며 NMR은 표제 화합물의 예상된 구조와 일치하였다. 이 물질은 이후에 반응에서 더 정제시키지 않고 사용되었다.
실시예 16
1-(2-O-프로필-3-O-아세틸-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4-트리아졸로-5-메틸피리미딘
트리아졸((10.5g, 152mmol)을 무수 조건하에서 교반시키면서 아세토니트릴(120mℓ) 및 트리에틸아민(23mL)에 용해시켰다. 그 결과 생성되는 용액을 건조 얼음 아세톤 조(bath)에서 냉각시켰고 인 옥시클로라이드(3.9mL, 41mmol)을 천천히 5분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 얇은 슬러리 형태의 생성물 형상이 되도록하면서 10분간 더 교반시켰다. 1-(2-O-프로필-3-O-아세틸-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘(11.2g, 165mmol)을 아세트니트릴(150mL)내에 용해시켰고 건조 얼음 아세톤 조 온도를 유지하면서 상기 슬러리에 첨가시켰다. 반응 혼합물을 30분간 교반시켰고 그런 다음 상온까지 승온되도록 하고 2시간 동안 더 교반시켰다. 혼합물을 0℃에서 18시간동안 냉동기내에 둔 다음 제거하여 상온까지 승온되도록 하였다. 혼합물내의 에틸 아세테이트/헥산 1:1내의 탈크는 출발 물질의 완전한 전환을 보여주었다. 반응 혼합물은 바쿠오에서 농축되었으며 에틸 아세테이트 (300mL)에 다시 용해시켰으며 포화된 중탄산 나트륨 용액(2x400mL) 및 소금물(400mL)로 추출하였다. 수성층은 에틸 아세테이트(200mL)로 역추출되었다. 에틸 아세테이트는 결합되었고 황산 나트륨위에서 건조되었고 바쿠오에서 농축되었다. 조생성량은 11.3g(95%)이었다. NMR은 표제 화합물의 예상된 구조와 일치하였다. 이 물질은 이후의 반응에서 더 정제되지 않고 사용되었다.
실시예 17
1-(2-O-프로필-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸시티딘
1-(2-O-프로필-3-O-아세틸-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4-트리아졸로-5-메틸피리미딘(11.2g, 16.1mmol)을 건조 얼음 아세톤 온도에서 100mL 봄내에서 액상의 암모니아(50mL)내에 용해시켰다. 봄은 18시간동안 상온까지 승온되도록 한 다음 건조 얼음 아세톤 온도까지 재 냉각되었다. 봄의 내용물은 비이커로 옮기고 메탄올(50mL)을 첨가시켰다. 혼합물을 건조할 때까지 증발되도록 하였다. 에틸 아세테이트(300mL)를 첨가하였고 얼마간의 고체를 포화된 중탄산 나트륨(2×250mL)으로 세척하기 전에 여과하여 제거하였다. 에틸 아세테이트 층은 황산 나트륨위에서 건조시켰고 여과하였고, 전에 여과하여 제거된 고체와 함께 결합되었고 바쿠오에서 농축시켜 10.1g의 물질을 생성시켰다. 조생성량은 100%이상이었고 NMR은 표제 화합물의 예상된 구조와 일치하였다. 이 물질은 이후의 반응에서 더 정제되지 않고 사용되었다.
실시예 18
1-(2-O-프로필-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4-N-벤조일-5-메틸시티딘
1-(2-O-프로필-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸시티딘(7.28g, 10.1mmol) 및 벤조익 안히드라이드(4.5g, 20mmol) DMF(60mL)내에 용해시키고 18시간동안 상온에서 교반시켰다. 반응 혼합물은 바쿠오에서 농축되었으며 에틸 아세테이트(300mL)에 재용해되었다. 에틸 아세테이트 용액을 포화된 중탄산나트륨 용액(2×400mL)으로 세척하였으며 황산 나트륨위에서 건조시켜 여과시켰고 바쿠오에서 농축시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트/헥산 1:2 및 1% 트리에틸아민을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제시켰다. 적당한 분획들을 모아서 농축시켰고 1-(2-O-프로필-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-5-메틸우리딘으로 시작하여 4단계동안 고 진공하에서 건조시켜 5.1g(59%)을 생성시켰다.
실시예 19
1-(2-O-프로필-3-O-N,N-디이소프로필아미노-2-시아노에틸포스파이트-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4-N-벤조일-5-메틸 시티딘
1-(2-O-프로필-5-O-디메톡시트리틸-β-D-에리쓰로-펜토푸란노실)-4 N-벤조일-5-메틸시티딘(5.0g, 7mmol), 2-시이노에틸-N,N,N',N'-테트라-이소프로필포스포로디아미다이트(3.6mL, 11.3mmol) 및 디이소프로필아미노테트라졸리드(0.42g, 2.4mmol)을 디클로로메탄(80mL)에 용해시키고 40시간동안 상온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화된 중탄산 나트륨용액(2×40mL) 및 소금물(1x40mL)로 세척하였다. 수성층은 디클로로메탄으로 역추출하였다. 디클로로메탄 층을 결합시키고 황산 나트륨위에서 건조시켰으며 여과하여 바쿠오에서 농축시켰다. 그 결과 생성된 잔여물을 에틸 아세테이트/헥산 40:60 및 1% 트리에틸아민을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 적당한 분획들을 수집하여 농축시키고 고 진공하에서 건조하여 7.3g(98%)을 얻었다.
실시예 20
2'-O-메틸-5-메틸우리딘
절차 1:
조생성된 2,2'-안히드로-5-메틸우리딘(10.0g, 0.0416mol)을 스테인레스 스틸 봄(100mL 용량)에서 메탄올(80mL)에 용해시켰다. 트리메틸 보레이트(5.6mL, 0.049mol)을 첨가하였다(주석1). 봄을 봉합시키고 약 5 atm의 압력을 생성시키는 150℃의 오일조에 위치시켰다. 40시간후에 봄을 얼음에서 냉각시키고 얼려서 내용물을 감압하에서 황갈색의 포움, 12g까지 농축시켰다. 조생성물의 NMR은 출발 물질내에 불순물로 오염된 생성물 및 미량의 티민 및 출발 물질과 일치하였다(주석2). 조생성물은 다음 단계에서와 같이 사용되었다.
트리알킬 보레이트는 바람직한 알코올에 붕소 용액(THF내의 1M)을 첨가시키고 그 결과 생성된 수소 기체가 증발되도록 함으로써 손쉽게 생성될 수 있음을 유의하여야 한다. 또한 뉴클레오시드는 에틸 아세테이트(0-10%)내의 메탄올 구배를 이용하고 무수 에탄올로부터 생성물을 결정화시켜 흰색의 침상 결정체 mp 192-193° (mp 197-198°)를 생성시켜 컬럼 크로마토그래피에 의하여 이 지점에서 정제될 수 있다. 이 화합물의 용융점에 대한 관련 문헌은 E. Ootsuka, H. Inoue, Japanese Patent 89-85456, 4 April 1989에 포함되어 있다.
절차 2:
순수한 2,2'-안히드로-5-메틸우리딘(1.0g, 4.16mmol) 및 트리메틸 보레이트(0.56mL, 4.9mmol)을 스테인레스 스틸 봄(100mL)내에 메탄올(20mL)에 용해시켰다. 봄을 150℃의 오일조에 위치시켰다. 8시간 후에 반응을 나타내는 TLC가 거의 완료되었다. 용매를 제거하여 흰색의 포움을 생성시켰다. NMR은 언급된 다른 불순물을 가지지 않은 93:7의 생성물 대 출발 물질의 비를 나타내었다. 잔여물을 에틸 아세테이트(0-10%)내에 메탄올 구배를 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 850mg(75%)의 순수한 생성물 및 250mg의 여전히 불순한 생성물을 생성시켰다. 분석학적으로 순수한 샘플이 NMR 분석을 위하여 제조되었다. 1H NMR (DMSO-d6): δ 1.79 (S, 3H, 5-CH3), 3.35 (s, 3H, OCH3), 3.5-3.7 (m, 2H, H-5'), 3.7-3.9(m, 2H, H-3',4'), 4.15 (m, 1H, H-2'), 5.17 (m, 2H, 3',5'-OH), 5.87 (d, J=5Hz, 1H, H-1'), 7.80 (s, 1H, H-6), 11.37 (br s, 1H, N-H). Anal. Calcd for C11H16N2O6(272.26) : C, 48.52; H, 5.92; N, 10.29. Found: C, 48.56; H, 5.88; N, 10.22.
절차 3:
순수한 2,2'-안히드로-5-메틸우리딘(10.0g, 41.6mmol) 트리메틸보레이트(10.0mL, 85mmol), NaHCO3(30mg), 및 MeOH(70mL)를 약 175℃에서 60시간동안 압력 봄에서 가열하였다. 압력 봄을 상온까지 냉각시키고 내용물을 바쿠오에서 증발시켜 흰색의 포움이 되도록 하였다. 생성된 포움을 에테르(100mL)와 함께 분쇄시키고 결과적으로 생성된 흰색의 고체를 여과하여 수집하였고 바쿠오에서 4시간동안 50℃에서 건조시켜 10.7g(100%)의 표제 화합물을 생성시켰다. NMR 분석은 출발물질인 티민 및 아라-5-메틸-우리딘으로 여겨지는 약 3%의 불순물을 나타내었다.
실시예 21
5'-O-디메톡시트리페닐메틸-2'-O-메틸-5-메틸우리딘
조생성된 2'-O-메틸-5-메틸우리딘(12g)을 피리딘(2×50mL)에 공증발시키고 건조 피리딘(50mL)에 용해시켰다. 디메톡시트리페닐메틸 클로라이드(18.1g, 0.054mol)를 첨가하였다. 플라스크의 마개를 막고 상온에서 45분간 유지되도록 하였다. 메탄올(10mL)를 첨가하여 반응이 억제되도록 하였고 용액을 감압하에서 농축하여 오일로 농축시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트(2x400mL) 및 포화된 중탄산 나트륨 용액(500mL)사이에 분배시켰다. 유기층이 결합되고 건조되고(황산 나트륨), 여과되고 노란색의 포움이 되도록 농축되었다. 포움을 메틸 클로라이드(60mL)에 용해시키고 실리카 겔 컬럼상에 두고 에틸아세테이트-헥산-트리에틸아민 60:40:1로 용출시켰다. 생성물을 포함하는 분획을 결함시키고 농축하였고 건조 아세트니트릴(2×50mL)와 함께 증발되도록 하였다. 그 결과 생성된 잔여물을 24시간동안 1mmHg에서 건조시켜 부서지기 쉬운 흰색의 포움 17g(5-메틸우리딘으로부터세단계에서 60.4%)을 건조시켰다.
실시예 22
2,3,5-트리-O-벤조일-2-티오-5-메틸우리딘
250mℓ의 3 넥 둥근 바닥의 플라스크에서 1-O-아세틸-2,3,5-트리-O-벤조일 리보오스(0.500g, 1mmol) 및 5-메틸-2-티오-우라실(0.156g, 1.1mmol)을 하룻밤동안 진공하에서 건조시켰다. 이들 성분들은 10mL의 건조 아세트니트릴에 용해시키고 80℃로 가열하였다. 이 다뜻한 용액에 N-O-비스(트리메틸 실린)아세트아미드(0.509g, 2.5mmol)을 첨가하였고 반응물은 80℃에서 1시간동안 교반시켰다. 반응 혼합물은 열원(heat)에서 제거되고 상온에서 냉각되도록 하고 트리메틸실릴 트리플레이트(0.334g, 1.5mmol)을 한 방울씩 첨가하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 50℃까지 가열하였고 4시간동안 교반하였다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트/헥산, 1:1을 사용하여 TLC에 의하여 점검하였고, 이것은 반응이 완료되었다는 것을 나타내주었다. 이 용액을 상온까지 냉각시키고 50mL의 디클로로메탄 및 50mL의 포화된 중탄산 나트륨 용액 사이에 분배시켰다. 수성 상은 디클로로메탄으로 두배로 추출되었고 유기층은 결합되고 황산 마그네슘으로 건조시키고 담황색의 포움으로 농축되었다. 이 포움은 더 정제되지 않고 사용되었다.
실시예 23
2-티오-5-메틸우리딘
조생성된 2,3,5-트리-O-벤조일-2-티오-5-메틸우리딘(20g, 37mmol)을 500mL의 메탄올에 용해시켰다. 이 용액에 소듐 메톡사이드(2.0g, 37mmol)을 첨가하였고 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 반응은 에틸 아세테이트/헥산 1:1 및 에틸 아세테이트/메탄올 9:1을 사용하여 TLC에 의하여 점검하였으며 이것은 반응이 완료되었음을 나타내주었다. Dowex 50 H+수지를 용액이 pH 페이퍼에 의해 중성이 되고 수지가 여과될 때까지 첨가시켰다. 그런 다음 수지를 100mL의 부가적 메탄올로 세척한 다음 결합된 여과물을 농축시켜 담황색 포움 형태의 8.5g(84%)의 표제 화합물을 생성시켰다.
실시예 24
2'-O-메틸-5-메틸-2-티오우리딘
DMF(10mℓ)내에 5-메틸-2-티오우리딘(0.500g, 1.8mmol)의 교반된 용액에 산화 디부틸주석(0.500g, 2.0mmol), 요오드화 테트라부틸 암모늄(0.738g, 2mmol) 및 요오드화 메틸(1.022g, 7.2mmol)을 첨가하였다. 반응 플라스크를 봉합하고 50℃에서 16시간동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고 요오드화 메틸(1.022g, 7.2mmol)을 더 첨가시키고 반응물을 16시간 동안 더 가열하였다. 이 가열 시간의 끝에서 반응 혼합물을 상온까지 냉각시키고 메틸렌 클로라이드로 희석화시키고 메틸렌 클로라이드/메탄올 구배를 사용하여 크로마토그래피하였다. 적당한 분획을 수집하여 농축시키고 2'-O-메틸-5-메틸-2-티오우리딘을 생성시켰다.
실시예 25
2'-O-프로필-5-메틸-2-티오우리딘
표제의 화합물은 요오드와 메틸 대신에 요오드화 프로필(1.22g, 7.2mmol)로대치시킴으로써 실시예 24와 같이 제조되었다.
실시예 26
2'-O-프탈이미도프로필-5-메틸-2-티오우리딘
표제의 화합물을 두 번째 날에 부가물(0.300g)을 첨가시키고 요오드화메틸 대신에 브로모-프로필-프탈이미드(0.67g, 2.5mmol)로 대치시킴으로써 실시예 24에서와 같이 제조하였다.
실시예 27
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-프로필아민-5-메틸-2-티오우리딘
2'-O-프탈이미도프로필-5-메틸-2-티오우리딘(2.6g, 3.6mmol)을 건조 피리딘내에 용해시키고 두번 공증발시켰다. 결과적으로 생성된 포움을 25mL의 건조 피리딘에 용해시키고 디메톡시-트리틸 클로라이드(1.8g, 5.5mmol)를 첨가시키고 4,4-디메틸아미노피리딘(0.050g, 0.4mmol) 반응물은 상온에서 하룻밤 동안 교반되도록 하였다. 반응 혼합물에 1mL의 메탄올을 첨가하였다. 용액을 75mL의 포화된 중탄산나트륨 및 50mL의 클로로포름에 분배시켰다. 수성층은 두 개의 부가적 클로로포름으로 추출되었고 유기층은 결합되었고 황산 마그네슘으로 건조되었다. 건조제를 여과에 의하여 제거한 후에 여과물을 오렌지색 오일로 농축시키고 실리카겔을 중성화하기 위해 첨가된 0.5% 피리딘으로 메탄올/클로로포름 구배를 이용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
실시예 28
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-프로필아민-5-메틸-2S-톨루오일-2-티오우리딘
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-프로필아민-5-메틸-2-티오우리딘(1g, 1.6mmol)을 DMF에 용해시키고 0℃까지 냉각시켰다. 이 용액에 트리에틸아민(0.300g, 3mmol)을 첨가하고 5분에 걸쳐 한 방울씩 톨루오일 클로라이드(0.300g, 1.92mmol)를 첨가하였다. 그런 다음 반응물이 상온까지 승온되도록 하였고 하룻밤 동안 교반하였다. 완료되었을 때 반응을 메탄올을 이용하여 정지시키고 오일로 농축시켰다. 그런 다음 오일을 250mL의 포화된 중탄산나트륨/클로로포름 1:1의 용액 사이에 분배시켰다. 수성층은 두 번의 부가적인 75mL의 클로로포름으로 추출하였고 유기층을 건조하여 오일로 농축시켰다. 보호된 뉴클레오시드는 헥산/에틸아세테이트 구배를 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제시켰다. 바람직한 생성물은 N-3 톨루오일 및 S-2 톨루오일 화합물의 혼합물로서 수집되었다. 이 혼합물은 포스피틸화(phosphytilation) 단계에 사용된다.
실시예 29
5-O-디메톡시트리틸-2'-O-프로필아민-3'-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-2-시아노에톡시포스파이트]-5-메틸-2-S-톨루오일-2-티오우리딘
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-프로필아민-5-메틸-2-S-톨루오일-2-티오우리딘(16.01g, 22mmol) 및 0℃ THF(200ml) 내의 디이소프로필에틸아민(10ml)의 용액에 클로로-β-시아노에톡시-N,N-디이소프로필아미노포스핀(5.6ml, 25mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20시간 동안 상온에서 교반시켰다. 반응물을 농축시켰고 잔여물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 1% 트리에틸아민을 유지시키는 동안 에틸 아세테이트/헥산 구배를 이용하여 용출하고 적당한 분획을 수집하고증발시켜 표제의 화합물을 얻었다.
실시예 30
2'-O-아미노프로필-5-메틸-2-티오우리딘
2'-O-프탈이미도프로필-5-메틸-2-티오우리딘(5.0g, 15.8mmol)을 500ml 플라스크내에서 100ml 메틴올에 용해시켰다. 히드라진(2.02g, 63.2mmol)을 첨가하였고 혼합물을 14시간 동안 교반시키면서 환류하도록 가열하였다(60∼65℃), 용매는 바쿠오에서 증발되었고 잔여물은 디클로로메탄(150mL)에 용해시키고 동일한 부피의 NH4OH는 두 번 추출하였다. 유기층은 증발되어 조생성물을 생성시켰다. NMR은 생성물의 순도를 분석하는 데 사용되었다. 생성물을 더 정제시키지 않고 이 후의 반응에 사용하였다.
실시예 31
2'-O-트리플루오로아세틸아미노프로필-5-메틸-2-티오우리딘
2'-O-아미노프로필-5-메틸-2-티오우리딘을 MeOH에 용해시키고 5당량의 트리에틸아민을 첨가시키고 10당량의 에틸 트리플루오로아세테이트를 첨가하였다. 정제 후 표제의 화합물이 분리되었다.
실시예 32
2'-O-트리플루오로아세틸아미노프로필-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-2-티오우리딘
2'-O-트리플루오로아세틸아미노프로필-5-메틸-2-티오우리딘(2.5g, 3.6mmol)을 건조 피리딘에 용해시키고 두번 공증발시켰다. 그 결과 생성된 노란색 포움은 25mL의 건조 피리딘에 용해시키고 디메톡시트리틸 클로라이드(1.8g, 5.5mmol)를 첨가하고 4,4-디메틸아미노피리딘(0.050g, 0.4mmol)을 첨가하였다. 반응물이 하룻밤 동안 상온에서 교반되도록 하였다. 용액을 75mL의 포화된 중탄산 나트륨과 50mL의 클로로포름에 분배시켰다. 수성층을 두 번의 부가적인 부분의 클로로포름으로 추출하였고 유기층을 결합시키고 황산 마그네슘을 이용하여 건조시켰다. 여과에 의하여 건조제를 제거시킨 후에 여과물을 오일로 농축시키고 실리카 겔을 중화시키기 위하여 첨가된 0.5% 피리딘을 포함하는 메탄올/클로로포름 구배를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 표제의 화합물을 생성하였다.
실시예 33
2'-O-트리플루오로아세틸아미노프로필-3'-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-2-시아노에톡시포스파이트]-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-2-티오우리딘
표제의 화합물을 실시예 32에서의 화합물을 사용하여 실시예 29의 절차에 따라 제조하였다.
실시예 34
5'-O-디메톡시트리틸-2-티오-5-메틸우리딘
2-티오-5-메틸우리딘(1g, 3.6mmol)을 건조 피리딘에 용해시키고 두번 공증발시켰다. 그 결과 생성된 노란색 포움을 25mL의 건조 피리딘에 용해시키고 디메톡시트리틸 클로라이드(1.8g, 5.5mmol)를 첨가하고 4,4-디메틸아미노피리딘(0.050g, 0.4mmol)을 첨가하였다. 반응물이 상온에서 하룻밤 동안 교반되도록 하였다. 반응혼합물에 1mL의 에탄올을 첨가하였다. 용액을 75mL의 포화된 중탄산 나트륨 및 50mL의 클로로포름에 분배시켰다. 수성층은 두 번의 부가적 부분의 클로로포름으로 추출하였고 유기층은 결합되고 황산 마그네슘으로 건조되었다. 여과에 의하여 건조제를 제거한 후에 여과물을 오렌지색 오일로 농축시키고 실리카 겔을 중화시키기 위하여 첨가된 0.5% 피리딘을 포함하는 메탄올/클로로포름 구배를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
실시예 35
5'-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸디메틸실릴-5-메틸-2-티오우리딘
5'-O-디메톡시트리틸-2-티오-5-메틸우리딘(1g, 1.73mmol)을 건조 DMF로 두번 공증발시킨 다음 건조 DMF에 용해시키고 이미다졸(0.141g, 2.08mmol)을 첨가하고 t-부틸-디메틸실릴 클로라이드(0.313g, 2.08mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트/헥산 1:1을 사용하여 TLC에 의해 점검하였으며 이것은 반응이 완료되었다는 것을 보여주었다. 그런 다음 반응 혼합물을 5% 중탄산 나트륨에 쏟아부었고 클로로포름으로 3번 추출하였다. 결합된 유기 용액을 황산 마그네슘으로 건조하였고 오일로 농축시켰다. 그 결과 생성된 오일을 2' 및 3' 실릴 보호된 뉴클레오시드를 분리시키는 메탄올/클로로포름 구배를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
실시예 36
5-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸디메틸실릴-2'-메탄설포닐-5-메틸-2-티오우리딘
5'-O-디메톡시트리틸-3'-t-부틸디메틸실릴-5-메틸-2-티오우리딘(1.0g, 1.45mmol)을 피리딘에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 메탄설포닐 클로라이드(0.183g, 1.6mmol)를 한방울씩 첨가하였다. 그런 다음 반응물을 TLC에 의해서 완료될 때까지 교반되도록 하였다. 반응 혼합물은 메탄올로 중화되었고 오일로 농축되었다. 표제 화합물이 이후의 반응을 위해 사용된다.
실시예 37
5'-DMT-3'-t-부틸디메틸실릴-2,2'-티오안히드로-5-메틸-2-티오우리딘
실시예 36에서의 메틸화된 뉴클레오시드를 5당량의 소듐 메톡사이드로 상온에서 처리하였고 티오안히드로 생성물이 완전히 형성될 때까지 교반하였다. 그런 다음 용액을 Dowex 50W(H+형태)로 중화시키고 수지를 여과하여 제거하고 그 결과 생성된 용액을 농축시켜 표제의 화합물을 생성시킨다.
실시예 38
2'-플루오로-3'-t-부틸 디메틸실릴-5'-DMT-5-메틸-2-티오우리딘
실시예 37의 티오안히드로뉴클레오시드를 무수 디옥산에 용해시켰다. 이 용액에 6당량의 HF/피리딘 복합체를 첨가하였고 TLC에 의하여 완료시까지 반응물을 교반하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 동일 부피의 얼음위에 쏟아부었고 탄산 칼슘을 중성이 될 때까지 첨가하였다. 고체를 여과하여 제거하고 여과물을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 생성하였다.
실시예 39
2'-플루오로-3'-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-2-시아노에톡시포스파이트]-5'-DMT-5-메틸-2-티오우리딘
2'-플루오로-3'-t-부틸 디메틸실릴-5'-DMT-5-메틸-2-티오우리딘을 실시예 29에 따라 처리하여 표제의 화합물을 생성시켰다.
실시예 40
2,2'-안히드로[1-(β-D-아라비노푸란노실)-5-메틸우리딘]
5-메틸우리딘(리보실티민, 야마사(코시, 일본)로부터 구입 가능)(72.0g, 0.279M), 디페닐카보네이트(90.0g, 0.420M) 및 중탄산 나트륨(2.0g, 0.024M)을 DMF(300mL)에 첨가하였다. 혼합물을 환류되도록 가열하고 교반하고 증발된 이산화탄소 기체가 조절된 방법으로 방출되도록 하였다. 1시간 후에 약간 어두운 용액을 감압하에서 농축시켰다. 결과적으로 생성된 시럽은 교반시키면서 디에틸에테르(2.5L)에 쏟아부었다. 에테르를 천천히 따르고 잔여물을 최소량의 메탄올(ca, 400mL)에 용해시켰다. 용액을 새로운 에테르(2.5L) 내로 쏟아부어 경직된 검을 생성시켰다. 에테르를 천천히 따르고 검을 진공 오븐(24시간 동안 1mmHg에서 60℃)에서 건조하여 밝은 황갈색의 분말(57g, 85% 조생성량)로 분쇄시킨 고체를 생성시켰다. 그 물질을 이후의 반응에 사용하였다.
실시예 41
2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘
2,2'-안히드로-5-메틸우리딘(195g, 0.81M),트리스(2-메톡시에틸)보레이트(231g, 0.98M) 및 2-메톡시에탄올(1.2L)을 2L 스테인레스 스틸 압력 용기에 첨가시키고 160℃에서 예열된 오일조에 놓아두었다. 155∼160℃에서 48시간 동안 가열한 후 용기를 열고 용액을 증발시켜 건조시키고 MeOH(200mL)로 분쇄시켰다. 잔여물을 뜨거운 아세톤(1L)에 현탁시켰다. 불용성 염을 여과시키고 아세톤(150mL)으로 세척하였고 여과물을 증발시켰다. 잔여물(280g)을 CH3CN(600mL)에 용해시키고 증발시켰다. 실리카 겔 컬럼(3kg)을 0.5% Et3NH를 포함하는 CH2Cl2/아세톤/MeOH(20:5:3)으로 채웠다. 잔여물을 CH2Cl2(250mL)에 용해시키고 컬럼 상에 부하하기 전에 실리카(150g) 위로 흡착되었다. 생성물을 충진 용매와 함께 용출시키고 160g(63%)의 생성물을 생성하였다.
실시예 42
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘
2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(160g, 0.506M)을 피리딘(250mL) 및 피리딘(1.3L)에 용해된 건조된 잔여물과 함께 공증발시켰다. 첫번째 등분된 분량(aliquot)의 디메톡시트리틸 클로라이드(94.3g, 0.278M)를 첨가시키고 혼합물을 한시간 동안 상온에서 교반시켰다. 두번째 등분된 분량의 디메톡시트리틸 클로라이드(94.3g, 0.278M)를 첨가시키고 1시간 더 반응물을 교반시켰다. 그런 다음 메탄올(170mL)을 첨가시켜 반응이 중단되도록 하였다. HPLC는 약 70% 생성물의 존재를 나타내었다. 용매를 증발시키고 CH3CN(200mL)와 함께 분쇄하였다. 잔여물을 CHCl3(1.5L)에 용해시키고 2x500mL의 포화 NaHCO3및 2x500mL의 포화 염화나트륨으로 추출하였다. 유기상은 Na2SO4위에서 건조시켰고 여과시킨 후 증발시켰다. 275g의 잔여물을 얻었다. 잔여물을 3.5kg 실리카 겔 컬럼상에 정제하였고 충진시키고 0.5%의 Et3NH를 포함하는 EtOAc/헥산/아세톤(5:5:1)으로 용출시켰다. 순수한 분획을 164g의 생성물이 생성되도록 증발시켰다. 대략 20g이 불순한 분획에서 얻어져 183g(57%)의 전체 생산량을 얻었다.
실시예 43
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘(106g, 0.167M), DMF/피리딘(562mL의 DMF 및 188mL의 피리딘으로부터 제조된 750mL의 3:1 혼합물) 및 아세틱 안히드라이드(24.38mL, 0.258M)를 결합시키고 24시간 동안 상온에서 교반하였다. MeOH를 부가시키고 탈크 샘플을 첫번째 압착시킴으로써 탈크에 의해 반응을 조사하였다. 반응 종결시에 탈크에 의해 판단된 바와 같이 MeOH(50mL)를 첨가하였고 혼합물을 35℃에서 증발시켰다. 잔여물을 CHCl3(800mL)에 용해시키고 2×200mL의 포화된 중탄산나트륨 및 2x200mL의 포화 NaCl로 추출하였다. 수(水)층은 200mL의 CHCl3로 역추출하였다. 결합된 유기물은 황산 나트륨으로 건조시키고 증발시켜 122g의 잔여물(약 99%의 생성물)을 생성시켰다. 잔여물을 3.5kg 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하였고 EtOAc/헥산(4:1)을 사용하여 용출시켰다. 순수한 생성물 분획은 증발시켜 96g(84%)을 생성시켰다.
실시예 44
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘
처음의 용액을 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘(96g, 0.144M)을 CH3CN(700mL)에 용해시킴으로써 제조하여 방치시켰다. 트리에틸아민(189mL, 1.44M)을 CH3CN(1L) 내의 트리아졸 용액(90g, 1.3M)에 첨가하고 -5℃까지 냉각시키고 위층의 교반기를 사용하여 0.5시간 동안 교반하였다. POCl3를 30분간에 걸쳐 한방울씩 첨가시켜 교반된 용액이 0∼10℃ 유지되도록 하였으며 결과적으로 생성된 혼합물을 2시간 동안 더 교반시켰다. 처음의 용액을 45분에 걸쳐 한방울씩 뒤의 용액에 첨가하였다. 그 결과 생성된 반응 혼합물은 냉각소에 하룻밤 동안 저장하였다. 염은 반응 혼합물에서 여과되었으며 용액은 증발되었다. 잔여물을 EtOAc(1L)에 용해시키고 불용성 고체를 여과하여 제거하였다. 여과물을 1x300mL의 NaHCO3및 2×300mL의 포화 NaCl로 세척하였고 황산 나트륨 위에서 건조시켰고 증발시켰다. 잔여물을 EtOAc와 함께 분쇄시켜 표제의 화합물을 생성시켰다.
실시예 45
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디에톡시트리틸-5-메틸시티딘
디옥산(500mL) 내에 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘(103g, 0.141M) 및 NH4OH(30mL)를 상온에서 2시간 동안 교반시켰다. 디옥산 용액을 증발시켰고 잔여물을 MeOH(2x200mL)로 공비(共沸)되도록 하였다. 잔여물을 MeOH(300mL)에 용해시키고 2L의 스테인레스 스틸 용기로 옮겼다. NH3기체로 포화된 MeOH(400mL)를 첨가하고 2시간 동안 100℃까지 용기를 가열하였다(탈크는 완전 전환을 나타내었다). 용기의 내용물은 증발시켜 건조하였으며 잔여물은 EtOAc(500mL)에 용해시켰으며 포화 NaCl(200mL)로 한번 세척하였다. 유기물을 황산 나트륨 위에서 건조시켰으며 용매를 증발시켜 85g(95%)의 표제 화합물을 생성시켰다.
실시예 46
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(85g, 0.314M)을 DMF(800mL)에 용해시키고 벤조익 안히드라이드(37.2g, 0.165M)를 교반시키면서 첨가하였다. 3시간 교반한 후에 탈크가 대략 95% 정도 완전한 반응을 나타내었다. 용매를 증발시키고 잔여물을 MeOH(200mL)와 공비시켰다. 잔여물을 CH3Cl3(700mL)에 용해시키고 포화 NaHCO3(2×300mL) 및 포화 NaCl(2×300mL)로 추출하였고 MgSO4위에서 건조시키고 증발시켜 잔여물(96g)을 생성시켰다. 잔여물은 용리 용매로서 0.5% Et3NH를 포함하는 EtOAc/헥산(1:1)을 사용하여 1.5kg 실리카 칼럼 상에 크로마토그래프하였다. 순수 생성물 분획이 증발되어 90g(90%)의 표제 화합물을 생성시켰다.
실시예 47
N4-벤조일-2'-O-메톡시트리틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘-3'-아미다이트
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(74g, 0.10M)을 CH2Cl2(1L)에 용해시켰다. 테트라졸 디이소프로필아민(7.1g) 및 2-시아노에톡시-테트라(이소프로필)포스파이트(40.5mL, 0.123M)를 질소 분위기 하에서 교반시키면서 첨가하였다. 그 결과 생성된 혼합물을 상온에서 20시간 동안 교반하였다(탈크는 반응이 95% 완성되었음을 보여주었다). 반응 혼합물은 포화 NaHCO3(1x300mL) 및 포화 NaCl(3×300mL)로 추출하였다. 수성 세척물은 CH2Cl2(300mL)로 역추출하였고 추출물을 결합시키고 MgSO4위에서 건조시키고 농축시켰다. 얻어진 잔여물을 용리 용매로서 EtOAc/헥산(3:1)을 사용하여 1.5kg 실리카 컬럼상에 크로마토그래프하였다. 순수한 분획을 결합하여 90.6g(87%)의 표제 화합물을 생성시켰다.
평가
절차 1
2'-O-치환된 올리고뉴클레오티드
뉴클레아제 안정성
2'-O-메틸 포스포라미다이트는 Glen Research(Sterling, VA)에서 구입하였다. 2'-O-프로필 및 2'-O-펜틸 포스포라미다이트를 Lesnik, E.A., et.al., Biochemistry, 1993, 32, 7832-7838; Guinosso, et.al., Nucleosides and Nucleotides, 1991, 10, 259-262에 기재된 바에 따라 제조하였다. CPG 유도된 2'-O-치환된 뉴클레오시드는 Damha, M.J., Giannaris, P.A. and Zabarylo, S.V.,Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3813-3821에 기재된 바에 따라 제조되었다. 고체상 DNA 합성을 위한 다른 시약은 상업회사에서 구입하였다. 올리고머는 ABI 모델 380B DNA 합성기 상에서 고체상 화학법을 이용하여 합성하였다. 올리고머를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 정제하고 Poly-pak 카트리지(Glen Research, Sterling, VA)로 염을 제거하였다. 올리고리보뉴클레오티드는[g-32P]ATP 및 T4 폴리머라제 카이나제를 사용하여 5' 말단이 표지되었다. 표지화 반응 후에 T4 폴리머라제 카이나제는 3시간 동안 95℃에서 열 비활성화되었으며 올리고머는 더 정제하지 않고 사용하였다.
뉴클레아제 내성 연구하기 위해 합성된 올리고뉴클레오티드 서열은 표 1에 나타나 있다. 12-mer 계열에 서로 다른 2'-O-알킬 성분의 통합은 전자분사(electrospray) 질량 분광기에 의해서 증명되었으며 계산치와 측정된 질량이 0.01% 내로 일치하였다.
뱀 독성 포스포디에스터라제(㎍SB, Cleveland, OH) 분석은 5x10-2㎍/ml 또는 5x10-3㎍/ml의 효소농도에서 50mM Tris-HCl, pH8.5, 72mM NaCl, and 14mM MgCl2의 완충액 내의 37℃에서의 1μM 올리고머를 사용하여 수행하였다. 효소는 적어도 24시간 동안 이 조건하에서 그것의 활성을 유지한다고 보여진다. 뉴클레아제 S1(Gibco BRL, Gaithersberg, MD) 분석법은 30mM NaOAc pH 4.5, 50mM NaCl, 및 1mM ZnCl2에서 37℃에서 1μM 올리고머를 사용하여 수행하였다. 뉴클레아제 S1은 1.9㎍/mℓ 또는1.9x106㎍/mℓ 중 하나로 사용되었다. 뉴클레아제 활성 반응의 등분된 양은 지정된 시간에 제거되고 또한 추적 염료(tracking dye)를 포함하는 동일 부피의 80% 포름아미드 겔 부하 완충액으로 감축되고 95℃에서 2분간 가열된 다음 변성 폴리아크릴아미드 전기영동에 의한 분석시까지 -20℃에서 저장하였다. 정량은 Molecular Dynamics PhosphorImager(Molecular dynamics, Sunnyvale, CA)에서 수행하였다.
표 1
Figure pct00011
17-mer 종의 뉴클레아제 안정성은 뱀 독성 포스포디에스터라제를 사용하여실험하였다. 전체 길이의 물질의 양이 초기 치의 50%까지 감소시키는데 필요한 시간(t1/2)은 표 4에 기재되어 있다. 상대적인 뉴클레아제 활성은 측정된 t1/2수치를 수식되지 않은 화합물의 t1/2시간을 나눔으로써 계산된다. 5x10-3㎍/mℓ의 효소농도에서 17-mer 종에서 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 유사체 양자는 수식되지 않은 대조부보다 74배 더 안정하다. 이들 계열에서 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 유사체 사이의 뉴클레아제 안정성의 차이를 결정하려는 시도로 효소농도를 증가시켰다. 5x10-2㎍/mℓ의 효소농도에서 SVPD 분석을 행하여 약 2.5분이 지나서 전체-길이가 50% 감소된 2'-디옥시 포스포디에스테르 올리고머가 된다. 동일한 반응조건에서 2'-O-메틸 포스포디에스테르, 2'-O-프로필 포스포디에스테르, 및 2'디옥시 포스포로티오에이트 유사체는 2'-디옥시 포스포디에스테르 대조부(표 2)보다 120-, 160-, 및 350-배 더 안정하다. 이들 유사체의 변성 폴리아크릴아미드 겔 분석은 전체적으로 수식된 올리고리보뉴클레오티드의 분해가 첫번째 3'-뉴클레오티드보다 상당히 초과하여 진행되지 않는 반면 수식되지 않은 올리고머는 분해 생성물의 래더(ladder)를 나타내었다. 정성적으로 분석결과는 2'-O-펜틸 유사체가 2'-O-메틸 또는 2'-O-프로필 올리고머보다 더욱 더 엑소뉴클레아제 분해에 내성을 나타냈다는 사실을 제시한다(데이타는 나타내지 않음). 2'-O-펜틸 유사체의 정량 분석은 두가지 이유로 어렵다. 첫번째 2'-O-펜틸 올리고머는 폴리뉴클레오티드 카이나제에 대하여 열등한 기질이어서 효과적인 표지화가 되지 못한다. 두 번째로 매우 종종 다수의 표시된 2'-O-펜틸올리고머가 겔의 윗부분에서 잡혀진다. 이런 종의 17-mer에 대하여 안정성의 순서는 2'-디옥시포스포로티오에이트≥2'-O-펜틸 포스포디에스테르>2'-O-프로필 포스포디에스테르>2'-O-프로필 포스포디에스테르>2'-디옥시 포스포디에스테르이다.
12-mer 종의 상대적 뉴클레아제 안정성은 또한 뱀 독성 포스포디에스터라제를 이용하여 결정하였다. 이 12-mer 종은 3'말단 잔기를 포함하여 모든 위치에서 2'-O-알킬 당 수식을 포함한다. 2'-O-메틸 포스포디에스테르, 2'-O-프로필 포스포디에스테르, 및 2'-디옥시 포스포로티오에이트 유사체는 수식되지 않은 대조부(표 2)보다 7-, 10- 및 89-배 더 안정하다. 완전히 수식된 2'-O-펜틸 유사체와 정성적으로 동일하다. 안정성의 순서는 17-mer 종과 동일하다. 그러나 17-mer 2'-O-알킬 유사체의 단축된 분해 형태에 비하여 12-mer 종은 분해 생성물의 래더(ladder)를 나타내고 있다(데이타는 나타내지 않음). 12-mer의 안정성 순서는 17-mer와 동일하나 정량적인 상대적인 안정성은 두 종간에 다르다. 12-mer 종에서 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 유사체는 수식되지 않은 대조부보다 뱀 독성 포스포디에스터라제에 대하여 3- 내지 10-배 더 내성이 있으며 17-mer 종에서는 이들 유사체가 수식되지 않은 대조부에 비하여 70- 내지 160-배 증가된 안정성을 나타내었다. 2'-O-수식된 올리고머의 12-mer 종의 안정성은 또한 S1 뉴클레아제, 단일-가닥 엔도뉴클레아제를 사용하여 조사하였다. 1.9㎍/mℓ의 효소농도에서 2'-O-메틸 포스포디에스테르 또한 2'-O-프로필 포스포디에스테르 12-mer의 분해는 관할되지 않았다. 동일한 조건하에서 2'디옥시 포스포디에스테르 및 2' 디옥시 포스포로티오에이트 유사체는 각각 2및 13분의 t1/2을 가진다. 2'-O-메틸 대 2'-O-프로필 수식의 안정성에서의 차이는 105배 높은 S1 뉴클레아제 농도에서 관찰되었다. 1.9x105㎍/mℓ의 효소농도에서 2'-O-메틸 유사체의 t1/2은 90분인 반면에 2'-O-프로필 올리고머의 분해는 관찰되지 않았다.
표 2
S1 뉴클레아제 및 뱀 독성 포스포디에스터라제를 이용한 2'-O-수식된 올리고뉴클레오티드 반감기
뱀 독성 포스포디에스터라제 (12-mer 종)
Figure pct00012
뱀 독성 포스포디에스터라제(17-mer종)
Figure pct00013
1서열 및 수식은 표1과 같다.
2이 올리고머는 5' 잔기가 2'-디옥시 C 인 것을 제외하고 전체적으로 수식된 2'-O-펜틸 12-mer이다.
ND3=결정되지 않음
절차 2
혼성화 안정성의 결정
이중가닥의 흡광도 대 온도를 Monia, B.P., et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 19954-19962에 기재된 바와 같이 100mM Na+, 10mM 포스페이트, 0.1mM EDTA, pH 7에서 6mM 표준농도(이중가닥) 또는 6mM 가닥 농도(단일 가닥 연구)에서 측정하였다. 용융온도(Tm) 및 이중 가닥 형성의 자유에너지를 선형 경사 베이스라인을 가진 두 상태의 모델에 데이터를 적합하게 하여 얻었다. (Freier, S.M., Albergo, D.D., and Turner, D.H., Biopolymers, 1983, 22, 1107-1131), 이중 가닥 형성의 자유 에너지는 Freier, S. M., et.al., Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA, C.F. Fox, Editor, Raven Press, New York, 1, 1992, pp. 95-107에 나타난 바와 같이 Tm보다 더 가치있는 수치의 열역학적 안정성이다. 그러나 실험상 오차는 Tm보다 DG'37이 더 크다. 그러므로 여기에서는 Tm수치를 표3에 기재하였다.
표 3
균일한 2'-O-치환체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 Tm
Figure pct00014
1Tm은 ℃로 나타내며 100mM Na+, 10mM 포스페이트, 0.1mM EDTA, pH 7.0, 4mM의 가닥 농도에서 RNA 완성도에 대하여 측정되었다.
2ND=결정되지 못함
3Tm은 100mM Na+, 10mM 포스페이트, 0.1 mM EDTA, pH 7.0, 4mM 가 닥농도에서 상보 가닥 없이 측정되었다.
Figure pct00015
밑줄친 부분=2' 수식된 잔기; o=포스포디에스테르 연결자;
s=포스포로티오에이트 연결자
절차 3
ras RNA의 RNase ONE 풋프린팅
ras 47-mer 스템/룹 RNA를 표적상의 바람직한 혼성화 자리에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 3-30 pM의 농도에서 숙성시켰다. 이를 올리고뉴클레오티드는 50mM NaCl 및 5mM MgCl2로 이루어진 10mM 트리스 완충액(pH 8)애서 10μM의 농도에서 상업적으로 구입가능한(Glen Research)2'-O-메틸 아미다이트를 사용하여 합성하였다. 혼성화는 37℃에서 적어도 16시간동안 수행하였다. RNase ONE (10㎍/μL, Promega)을 1:2000 내지 1:100,000으로 희석하여 첨가하고 25℃에서 5분간 숙성시키고 스냅 냉동에 의하여 억제시켰다. RNase T1, 50mM Na2CO3완충액(pH 9)을 사용한 염기 래더를 이용하여 "G" 맵(map)을 제조하였다. 분해 생성물을 10μM에서 RNase ONE 풋프린트를 나타내는 적어도 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 동정하기 위하여 시퀀싱 PAGE에 의하여 분석하였다. 관심있는 올리고뉴클레오티드의 Kd는 RNase ONE으로 100pM에서 10μM 범위의 농도에서 그 올리고뉴클레오티드를 적정함으로써 결정하였다. 분해 생성물을 시퀀싱 PAGE로 분리하였으며 올리고뉴클레오티드에 의해 부여된 보호 백분율은 올리고뉴클레오티드 농도의 기능으로서 도시되었다. 50% 보호율을 나타낸 올리고뉴클레오티드의 농도는 관심있는 올리고뉴클레오티드에 대한 Kd이다. 이 방법을 이용하여 증가된 친화력 및 표적 ras RNA에 대한 특이성을 가지는 올리고뉴클레오티드가 동정되었다.
절차 4
라스-루시페아제 리포터 유전자 어셈블리
이 연구에 기재된 라스-루시페라제 리포터 유전자는 PCR 기술을 사용하여 어셈블되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 돌연변이체(코돈12) 및 비돌연변이체(야생형) 인간 H-ras 유전자의 엑손 1의 5'-구역의 PCR 클로닝에 대한 프라이머로서 사용하기 위해 합성하였다. c-H-ras 1 활성화된 종양 유전자(코돈12, GGC→GTC)를 포함하는 플라스미드 pT24-C3은 American Type Culture Collection(Bethesda, MD)에서 구입하였다. 1.9kb 개똥벌레 루시페라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pT3/T7 luc는 Clontech Laboratories (Palo Alto, CA)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 주형(template)로서 돌연변이 및 비-돌연변이 H-ras 유전자를 이용하여 표준 PCR 반응에 사용하였다. 이들 프라이머는 Nhe I 와 Hind III 제한효소자리에 의해서 둘러싸인 정상 및 돌연변이 H-ras의 서열 -53 내지 +65(번역 개시 자리에 상당함)에 해당하는 145 염기쌍의 DNA 생성물을 생산한다. PCR 생성물을 겔 정제하고 침전시키고 세척하고 표준 절차를 이용하여 물에 재현탁시켰다. P. pyralis (개똥벌레) 루시페라제 유전자의 클로닝을 위한 PCR 프라이머는 PCR 생성물이 아미노-말단 메치오닌 잔기를 제외하고 전체 길이의 루시페라제 단백질을 암호화하도록 디자인되었으며 이것은 두개의 아미노산 즉 아미노 말단 리신 잔기와 그 뒤에 오는 루이신 잔기로 대치되도록 하였다. 루시페라제 유전자의 클로닝에 사용되는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 주형으로서 루시페라제 리포터 유전자를 포함하는 상업적으로 구입가능한 플라스미드(pT3/T7-Luc)(Clontech)를 사용하여 표준 PCR 반응에 사용되었다. 이들 프라이머는 단일의 Hind III 및 BssH II 제한효소 자리에 의하여 둘러싸인 루시페라제 유전자에 해당하는 약 1.9Kb의 생성물을 생산시킨다. 이 단편은 겔 정제되고 침전되고 세척된 다음 표준 절차를 이용하여 물에 재현탁되었다.
라스-루시페라제 융합 리포터 유전자의 어셈블리를 완성하기 위하여 라스 및 루시페라제 PCR 생성물을 적당한 제한 효소로 절단하고 제한효소 Nhe I, Hind III 및 BssH II를 사용하여 스테로이드-유도가능한 마우스 포유 종양 바이러스를 포함하는 발현 벡터에 세부분의 연결에 의하여 클론시켰다. 그 결과로 만들어진 클론은 개똥벌레 루시페라제 유전자를 가지는 구조에 융합된 H-ras 5' 서열(-53 내지 +65)를 삽입시킨 것이 된다. 그 발현 벡터는 스테로이드-유도가능한 MMTV 프로모터의 조절하에서 발현되는 라스-루시페라제 융합 생성물을 암호화한다. 이들 플라스미드 구조는 개똥벌레 루시페라제를 암호화하는 서열 구조에 융합된 활성화된(RA2) 또는 정상의(RA4) H-ras 단백질의 아미노산 1-22를 암호화하는 서열을 포함한다. ras-루시페라제 융합 mRNA의 번역 개시는 천연의 H-ras AUG 코돈에 의존한다. 돌연변이 및 정상의 H-ras 루시페라제 융합 구조들과 표준 절차를 사용하여 DNA 서열 분석에 의하여 확인되었다.
절차 5
플라스미드 DNA를 이용한 세포의 트렌스펙션
트렌스펙션은 하기의 수식과 함께 Greenberg, M.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.), John Wiley and Sons, NY에 기재된 바에 따라 수행하였다. 헬라 세포는 접시당 5x105세포가 되도록 60mm 접시에 플레이트하였다. 전체 10㎍ 또는 12㎍의 DNA를 각 접시에 첨가시키고 이것중 1㎍은 항상적 라우스 종양 바이러스(RSV) 프로모터의 조절하에 있는 랫(rat) 글루코코르티코이드 수용체를 발현시키는 벡터이며 나머지는 ras-루시페라제 리포터 플라스미드(실시예 43)이었다. 칼슘 포스페이트-DNA 공침전물은 3mM EGTA를 포함하는 트리스-완충된 염수 [50mM 트리스-Cl(pH7.5), 150mM NaCl]로 세척시킴으로써 16-20시간 후에 제거하였다. 10% 소태아 혈청을 보충시킨 새로운 배지를 세포에 첨가시켰다. 이때 덱사메타손에 의하여 리포터 유전자 발현을 활성화시키기 전에 세포를 올리고뉴클레오티드로 전처리하였다.
절차 6
세포의 올리고뉴클레오티드 처리
플라스미드 트렌스펙션후에(실시예 44), 세포를 37℃까지 미리 승온시킨 포스페이트 완충된 염수로 세척시켰고 5㎍/μL의 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)를 각 플레이트에 첨가하였다(웰당 1.0mℓ). 올리고뉴클레오티드는 각 플레이트에 50μM 스톡(stock)으로부터 첨가시키고 37℃에서 4시간동안 숙성시켰다. 배지를 제거하고 10%소 태아 혈청 및 지정된 농도에서의 적당한 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배지로 대치시키고 세포를 리포터 유전자 발현이 덱사메타손이 0.2μM의 최종 농도가 되도록 처리하여 활성화되기 전에 37℃에서 2시간동안 더 숙성시켰다. 세포를 회수하고 덱사메타손 자극시킨 후에 루시페라제 활성을 15 시간동안 분석하였다.
절차 7
루시페라제 분석
루시페라제는 Greenberg, M.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.), John Wiley and Sons, NY 에 기재된 바와 같이 세정제 트리톤 X-100을 이용하여 용균에 의하여 세포로부터 추출하였다. Dynatech ML1000 루미노미터(luminometer)는 루시페린(시그마)을 625μM까지 첨가시 피크 루미네선스를 측정하는 데 사용된다. 각각의 추출물에 대하여 루시페라제 분석은 데이터가 선형 범위의 분석치에 모아지도록 하기 위하여 서로 다른 추출물의 양을 사용하여 다수에 걸쳐 수행하였다.
절차 8
용융곡선
흡광도 대 온도곡선은 IBM PC 컴퓨터에 인터페이스된 Gilford 260 스펙트로포토미터 및 Gilford ResponseII 스펙트로포토미터를 사용하여 260nm에서 측정하였다. 완충액은 100mM Na+, 10mM의 포스페이트, 및 0.1mM EDTA, pH 7을 포함하였다. 올리고뉴클레오티드 농도는 85℃에서의 흡광도 및 Puglisi and Tinoco, Methods in Enzymol. 1989, 180, 304-325에 따라 계산된 흡광계수로부터 결정된 4μM의 각각의 가닥이다. 이중가닥 형성의 자유에너지 및 결합 상수는 선형 경사 베이스라인으로 두 상태 모델에 데이타를 적합하게 하여 얻었다. Petersheim, M. and Turner, D.H., Biochemistry 1983, 22, 256-263. 변수는 적어도 3 이상의 실험에서의 평균치이다. 몇몇 올리고뉴클레오티드에 대하여 이중가닥 형성의 자유에너지는 Tm-1대 log10(농도)의 도시로부터 얻어졌다. Borer, P.N., Dengler, B., Tinoco, I., Jr., and Uhlenbeck,O.C., J. Mol. Biol., 1974, 86, 843-853.
절차 9
2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드를 가지는 올리고뉴클레오티드의 활성
절차 5-8을 이용하여 올리고 화합물을 상보적 RNA에 대한 혼성화 친화력 및 세포 내에서의 Ha-ras 종양유전자에 저항하는 활성에 대하여 시험하였다. 균일하게 2'-O-수식된 올리고머 및 2'-O-수식되고 2'-디옥시 구역 모두를 가지는 키메라 올리고머가 실험되었다. 2'-O-메틸, 2'-O-프로필, 및 2'-O-펜틸을 포함하는 균일하게 2'-O-수식된 올리고머는 수식되지 않은 2'-디옥시 올리고뉴클레오티드보다 RNA에 대하여 더 큰 친화력을 나타내었다. 2'-O-수식되고 2'-디옥시 구역을 가지는 키메라 올리고머는 수식되지 않은 2'-디옥시 올리고뉴클레오티드보다 RNA에 대하여 더 큰 친화력을 보였으며 수식되지 않은 균일한 디옥시 포스포로티오에이트에 비하여 Ha-ras 유전자 발현을 상당히 저해하는 것으로 나타났다(Monia, B.P., et.al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514-14522 참조).
실시예 48
PKC-α mRNA 발현의 올리고뉴클레오티드 저해분석
A549 세포를 T-75 플라스크(Falcon Labware, Lincoln Park, NJ)에 플레이트하였고 24∼48시간 이후에(80∼90% 융합됨) 하기의 조성의 3개의 올리고뉴클레오티드로 처리하였다.
Figure pct00016
SEQ ID NO: 27은 전체적으로 수식된 디옥시포스포로티오에이트이고, SEQ ID NO: 28은 위치 1-6 및 15-20에서 2'-플루오로를 가지는 전체적으로 수식된 포스포로티오에이트이고, SEQ ID NO: 29는 위치 2, 3, 5 및 16-18에서 2'-플루오로-5-메틸우리딘을 가지고 위치 1, 4, 6, 15, 19 및 20에서 2'-플루오로를 가지는 전체적으로 수식된 포스포로티오에이트이다.
세포는 10mℓ의 DMEM으로 두 번 세척하였고 20㎍/mℓ DOTMA/DOPE 용액(리포펙틴)(베세스다 실험 연구소)을 포함하는 5mℓ의 DMEM을 첨가하였다. 그런 다음 올리고머 화합물을 10μM 스톡 용액으로부터 필요한 농도까지 첨가시키고 용액은 접시를 돌림으로써 혼합시켰다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 숙성시키고 DOTMA/DOPE 용액을 제거하기 위해 DMEM+10% FCS로 한 번 세척시킨 다음 20mℓ의 DMEM+10% FCS를 더 첨가하여 세포가 20시간 지난 후에 회수되도록 하였다.
A549 세포를 25, 50, 100, 200 및 400nM 농도에서 올리고머 화합물로 처리하였고 전체 세포의 RNA를 염화 세슘 구배 후에 4M 구아니디늄 이소티오시아네이트에서 용출에 의하여 분리하였다. 전체 RNA(15∼30㎍)를 1.1% 포름알데히드를 포함하는 1.2% 아가로스 겔 상에서 분석하여 나일론 막에 옮겼다. 그 블롯을 ATCC(베세스다 MD)(Coussens et al., 1986)로부터 구해진 소의 PKC-α cDNA와 혼성화시켰다. cDNA 프로브를 상업적으로 구입가능한 키트(Promega)를 제조자의 지시에 따라 사용하여32P-방사표시하였다. 여과지를 68℃에서 Quikhyb 용액(Stratagene) 내에서 60분 동안 혼성화하였다. 그런 다음 저온에서 두번의 낮은 엄격성을 가진세척(2xSSC/0.1% SDS) 및 60℃에서 두번의 높은 엄격성을 가진 세척(0.1xSSC/0.1% SDS)을 수행하였다. 혼성화 밴드는 가시화되었으며 Phosphor Imager를 사용하여 정량하였다. 그런 다음 블롯을 끓임으로써 방사성을 제거하고 동일한 RNA 존재를 확인하기 위하여32P-표지된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 프로브(Clontech)로 재탐지하였다.
SEQ ID NO: 29 올리고머 화합물을 포함하는 2'-플루오로-5-메틸-우리딘은 동일한 위치에서 티민을 가지는 올리고머 화합물인 SEQ ID NO: 27에 비하여 10배 증가된 성능을 보여주었다. SEQ ID NO: 29는 또한 SEQ ID NO: 28에 비하여 측정가능한 정도의 증가된 성능을 나타내었다.
실시예 49
시험관내 HIV 저해분석
시험관내 트렌스펙션 분석은 HIV rev 단백질의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드를 동정하는 데 사용된다. 이 분석의 시간 경과는 4일이었다. 마우스 배 섬유아세포주(3T3)를 10% 소태아 혈청, 글루타민 및 항생제로 보충된 DMEM(글루코오스 높음)에서 지수적으로 증가된 상에서 유지되었다.
플라스미드 제조
pHIV env-luc는 하기와 같이 제조되었다. 인체 면역결핍 바이러스 타입1 외피 유전자(BH10으로 분리)(뉴클레오티드 5150-8260)를 포함하는 pBH10(20)에 3.1Kb Sall/Xhol은 pMAMHIVenv를 얻기 위하여 pMAMBam 풀라스미드의 Xhol 자리에 연결되었다. pMAMBam 벡터는 8.3Kb pMAMneo 플라스미드(Clontech)의 BamHI 분해 생성물을 겔 정제함으로써 얻었다. BamHI 자리는 4개의 dNTP의 존재하에서 클레노우 폴리머라제로 말단을 채우고 연결시킴으로써 제거되었다. pMAMHIV-env를 단일의 BamHI 자리에서 자르고 말단을 4개의 NTP의 존재하에서 클레노우 폴리머라제로 채워서 다시 연결하였다. 이 절차는 env 유전자의 Rev-암호화 부분을 불활성화시키는 자리옮김 돌연변이를 도입하였다. 최종적으로 Sal I/Sal I 루시페라제-암호화하는 리포터 유전자를 단일의 Sal I 자리에서 HIV 서열의 상류위치에서 클론되어 돌연변이된 rev 유전자를 함유하는 최종 구조 pHIV env-luc를 얻었다.
T7 RNA 폴리머라제를 함유하는 시험관내 포유류 세포에서 rev 단백질을 발현시키는 pSG5-rev 플라스미드를 만들기 위해 EcoRI/BglII rev cDNA를 pCV1으로부터 PCR에 의하여 제조하였다. PCR 단편은 EcoRI 및 BglII로 잘려지고 벡터 pSG5(Stratagene)의 Eco/RI/BglII 자리에 서브클론되었다. PCR 프라이머는 다음과 같다.
5'-GCT CGG GAA TTC ATG GCA GGA AGA AGC GGA
5'-CTG GGA GAT CTC TAT TCT TTA GCT CCT GAC TC
Rep 6는 Miesfeld, R., et al., Cell, 1986, 46, 389-399에 따라 제조되었으며 항상적 RSV LTR의 조절하에서 전체 길이의 글루코코르티코이드 수용체를 발현시키는 플라스미드이다.
첫번째날: 3T3 세포를 세척하였고 트리판(trypan) 블루우 배제(exclusion)에의하여 계수하였고 웰당 8.5x104세포에서 6-웰 마이크로티터플레이트 중 각 웰에 접종하였다.
두번째날: 세 개의 재조합 플라스미드 pSG5, pHIV env-luc 및 Rep06을 표준 CaPO4침전법(Graham, F. L. and van der Eb, A. J. Virology, 1973, 52, 456-467)을 사용하여 침전시켰다. CaPO4침전된 DNA를 마우스 배아 섬유아세포에 첨가하였고 세포를 37℃에서 7시간 동안 숙성시켰다. 세포를 포스페이트 완충된 염수로 세척하였고 10% 소태아 혈청, 글루타민, 항생제 및 정해진 농도의 올리고뉴클레오티드 및 계열화된 반정도 로그 희석으로 보충된 DMEM에서 37℃에서 하룻밤 동안 숙성시켰다.
세번째날: 세포를 OPTimen 배양액으로 두 번 세척한 다음 OPTimen 배양액내의 웰당 2.5mg/mℓ 리포펙틴 및 37℃에서 4시간 동안 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 리포펙틴/올리고뉴클레오티드 용액을 완전한 배지로 대치시키고 37℃에서 2시간 동안 회수되도록 하였다. 그런 다음 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포를 덱사메타손으로 처리하였다.
네번째날: 24시간 덱사메타손 처리 후에 세포를 용균시키고 루시페라제 분석을 행하였다(Sigma Chemical Technical). 용균된 샘플의 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석법(Bradford, M. Anal. Biochem., 1976, 72, 248)을 이용하여 결정하였다.
실시예 50
올리고뉴클레오티드 8469의 생체내 활성
s.c. 이식된 인체 폐 아데노카시노마 A549를 가진 암컷 Balb/c 누드 마이스를 올리고뉴클레오티드 8469-3, SEQ ID NO: 3 및 전달자(염수)로 처리하였다. 이 처리는 9일로서 개시되었고 33일 동안 매일 한 번씩 계속되었다. 두 개의 투여량 요법이 연구되었으며 한 번은 6.0mg/kg i.v.이고 한 번은 0.6mg/kg i.v.이었다.
계열적으로 통과된(3번) s.c. 종양의 생존가능한 단편(25∼50mg)을 재주입하여 투관침에 의하여 한 측면에서의 동물 s.c.를 연구하였다. 단편이 약 100mg(5∼15일 후)에 이르렀을 때 처리를 시작하였다. 동물을 대조부 종양의 크기가 1그램을 초과할 때까지(즉 2∼4주 동안) 주마다 3 내지 7번 처리하였다. 종양 크기는 주마다 한 번 또는 두번 캘리퍼스(Calipers)로 측정하였다.
결과적으로 종양 성장이 상당히 감소되었으며 6.0mg/kg을 포함하는 두개의 투여량 요법이 0.6mg/kg보다 더 늦은 성장률을 보였다.
실시예 51
PKC-α mRNA 수준에 대한 올리고머 화합물의 영향
A549 세포를 상기 기재된 바에 따라 양이온성 지질 DOTMA/DOPE의 존재하에서 4시간 동안 100 내지 400Nm의 투여량으로 올리고머 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 및 SEQ ID NO: 3으로 처리하였고 세척한 다음 20시간 동안 더 회수하였다. 전체 RNA는 추출되었고 20㎍ 각각은 1.2% 겔상에서 분석되었고 나일론 막에 옮겨졌다. 이들 블롯을32P 방사표지된 PKC-α cDNA로 탐지한 다음 제거하고 동일한 RNA가 존재하는지를 확인하기 위하여 방사표지된 G3PDH 프로브로 재탐지하였다. PKC-α 전사체를 PhosphorImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)로 정량하였다. PKC-α에 대하여 활성이 있는 것으로 알려진 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 표준법은 약 175nM의 분석에서 IC50을 가졌다. 증가된 활성을 나타내는 화합물은 175nM보다 더 낮은 IC50을 가지는 시험 표준보다 더 튼 활성을 가질 것이다. PKC-α 서열에 대하여 시험 화합물의 높은 특이적 결합은 또한 베타, 감마 및 델타 이소자임과 같은 다른 PKC 이소자임의 다른 mRNA과 PKC-α mRNA를 구별시키는 데 사용될 수 있다.
실시예 52
생체내에서 라스 발현의 노던 블롯 분석
세포를 상기 기재된 바에 따라 올리고머 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 및 SEQ ID NO: 3로 2.5μL DOTMA를 포함하는 Opti-MEM 환원된-혈청 배지로 처리하였다. 그런 다음 바람직한 농도까지 올리고머를 첨가하였다. 4시간의 처리 후에 배지를 올리고뉴클레오티드가 없는 배지로 대치시켰다. 세포를 올리고머 처리후 48시간에 회수하였고 RNA를 표준 CsCl 정제법을 이용하여 분리하였다. Kingston, R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.), John Wiley and Sons, NY.
RNA는 10㎍의 각각의 RNA를 이용하여 노던 혼성화 분석에 의하여 분석하였다. RNA는 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔 상에서 전기영동하고 표준방법을 사용하여 GeneBind 45 나일론 막(Pharmacia LKB, Piscataway, NJ)에 하룻밤 동안 옮겨놓았다. Kingston, R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.), John Wiley and Sons, NY.
RNA는 막에 UV-교차결합되었다. 이중 가닥의32P-표지된 프로브를 Prime a Gene labeling kit(Promega, Madison WI)을 이용하여 합성하였다. 라스 프로브는 코돈 12에서 GGC→GTC 돌연변이를 가지는 활성화된(돌연변이된) H-ras mRNA의 cDNA 클론의 Sai I -Nhe I 단편이다. 대조부 프로브는 G3PDH이다. 블롯을 QuickHyb 혼성화 용액(Stratagene, La Jolla, CA)과 함께 15분 동안 68℃에서 예비혼성화하였다. 100μL의 10mg/mℓ 연어정충 DNA와 혼합된 열-변성된 방사활성화된 프로브(2.5x106카운트/2mℓ 혼성화 용액)를 첨가하였고 막을 68℃에서 1시간 동안 혼성화하였다. 블롯을 2xSSC/0.1% SDS에서 15분 동안 상온에서 두번 세척하였고 0.1xSSC/0.1% SDS로 60℃에서 30분 동안 한번 세척하였다. 블롯을 자동방사선화하고 신호의 강도를 ImageQuant PhosphorImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 정량하였다. 노던 블롯은 처음에 라스 프로브로 혼성화한 다음 0.1xSSC/0.1% SDS에서 15분간 끓임으로써 제거하고 올바른 샘플의 존재를 검색하기 위해 대조부 G3PDH로 재혼성화하였다.
본 명세서에 기재된 공개된 출원은 각각 참고로 언급되어 있다.
이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 많은 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 구체예가 될 수 있으며 그러한 변화 및 변형은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다는 것을 인식할 수 있다. 그러므로 첨부된 특허청구범위 또한 본 발명의 사상및 범위에 모두 포함된다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022

Claims (40)

  1. 하기 구조식 I의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물:
    Figure pct00023
    상기에서
    X는 히드록실 또는 아미노이고:
    R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
    L은 산소 또는 황이고;
    Z는 플루오로 또는 O-R1X1이고 R1은 C1-C6알킬, C6-C10아릴 또는 C7-C18아릴킬이고 X1은 H, NH2또는 이미다졸이고; 그리고
    Q1및 Q2중 하나는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 연결 성분에 의하여 부착되고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고체 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트임.
  2. 제1항에 있어서, 5 내지 200 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 연결 성분이 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 구조식 I의 단량체 하부-단위를 다수 가지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단량체 하부-단위가 미리예정된 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  6. 하기 구조식 II의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위로 이루어지는 것을특징으로 하는 올리고머 화합물.
    Figure pct00024
    상기에서
    X는 히드록실 또는 아미노이고;
    R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
    L은 산소 또는 황이고; 그리고
    Q1및 Q2중 하나는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 연결 성분에 의하여 부착되고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고체 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트임.
  7. 제6항에 있어서, 5 내지 50 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 연결 성분이 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 구조식 II의 단량체 하부-단위를 다수 가지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단량체 하부-단위가 미리 예정된 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  11. 하기 구조식 III의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
    Figure pct00025
    상기에서
    X는 히드록실 또는 아미노이고;
    R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
    L은 산소 또는 황이고,
    R1은 C1-C6알킬, C6-C10아릴 또는 C7-C18알카릴이고 X1은 H, NH2또는 이미다졸이고; 그리고
    Q1및 Q2중 하나는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 올리고뉴클레오시드에 연결 성분에 의하여 부착되고 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고체 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고-뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트임.
  12. 제11항에 있어서, 5 내지 50 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 연결 성분이 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트로이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 구조식 III의 단량체 하부-단위를 다수 가지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단량체 하부-단위가 미리예정된 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  16. 2-2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드를 제공하고;
    R'-OH의 구조식을 가지는 알코올을 선택하고; 그리고
    2-2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 및 상기 알코올을 상기 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드가 효과적으로 생성되도록 하는 시간, 온도, 압력의 조건하에서 루이스 산으로 처리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 하기 구조식의 2'-O-치환된 피리미딘 뉴클레오시드의 합성방법:
    Figure pct00026
    상기에서
    Q는 피리미딘 염기 또는 2-S 피리미딘 염기이고;
    R1은 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30알킬, C1-C30알케닐, C1-C30알키닐, C6-C14아릴 또는 C7-C30아랄킬이고, 상기 치환체가 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고; 그리고
    R2및 R3는 독립적으로 수소 또는 히드록실 보호된 기임.
  17. 제16항에 있어서, 상기 2-2'-안히드로피리미딘 뉴클레오시드 및 상기 알코올을 압력 봉합된 용기에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 루이스산이 보레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 보레이트가 트리알킬 보레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 트리알킬 보레이트의 일반식이 B(OR1)3인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 트리알킬 보레이트가 붕소를 알코올로 처리하는 것으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 트리알킬 보레이트가 붕소를 일반식 HO-R1의 알코올로 처리하는 것으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 처리가 약 120℃ 내지 약 200℃에서 가열시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제16항에 있어서, 상기 피리미딘 뉴클레오시드가 우리딘 또는 5-메틸우리딘인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 하기 구조식의 2-2'-안히드로우리딘 뉴클레오시드를 제공하고:
    Figure pct00027
    일반식 R1-OH의 알코올을 선택하고;
    2'-O-치환된 우리딘 뉴클레오시드를 형성하기에 효과적인 시간, 온도 및 압력의 조건하에서 상기 2-2'-안히드로우리딘 뉴클레오시드 및 상기 알코올을 루이스산으로 처리하고; 그리고
    상기 2'-O-치환된 우리딘 뉴클레오시드를 2'-O-치환된 시티딘 뉴클레오시드로 아민화하는;
    단계로 구성되는 하기 구조식의 2'-O-치환된 시티딘 뉴클레오시드의 합성 방법:
    Figure pct00028
    상기에서
    X'는 O 또는 S이고;
    R1은 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30알킬, C1-C30알케닐, C1-C30알키닐, C6-C14아릴 또는 C7-C30아랄킬이고 상기 치환체는 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
    R2및 R3는 독립적으로 수소 또는 히드록실 보호기이고;
    R5또는 R6는 독립적으로 H, C1-C30히드로카르빌 또는 치환된 C1-C30히드로카르빌임.
  26. 제25항에 있어서, 상기 2-2'-안히드로우리딘 뉴클레오시드 및 상기 알코올을 압력 봉합된 용기에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 루이스산이 보레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 보레이트가 트리알킬 보레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 트리알킬 보레이트의 일반식이 B(OR1)3것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 트리알킬 보레이트가 붕소를 알코올로 처리하는 것으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 트리알킬 보레이트가 붕소를 일반식 HO-R1으로 처리하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 처리가 약 120℃ 내지 약 200℃로 가열되는 단계를포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제25항에 있어서, 상기 2'-O-치환된 시티딘 뉴클레오시드가 2'-O-메틸-5-메틸시티딘인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 하기 구조식의 적어도 하나 이상의 단량체 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물:
    Figure pct00029
    상기에서
    A는 히드록실 또는 아미노이고
    R은 할로 또는 C1-C6알킬 또는 치환된 C1-C6알킬이고 상기 치환체가 할로, 아미노, 히드록실, 티올, 에테르 또는 티오에테르이고;
    L은 산소 또는 황이고;
    Z'는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30알킬, C1-C30알케닐, C1-C30알키닐, C6-C14아릴 또는 C7-C30아랄킬이고 상기 치환체가 할로, 아미노, 히드록실, 티올,에테르 또는 티오에테르이고; 그리고
    Q1및 Q2중 하나는 연결성분에 의하여 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오시드에 부착되고, 상기 Q1및 Q2중 다른 하나는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성화된 고체 담체, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드/뉴클레오시드, 활성화된 포스페이트, 활성화된 포스파이트 또는 포스파이트임.
  35. 제34항에 있어서, 상기 Z'가 -(CH2)n-O-(CH2)m-CH3인 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  36. 제35항에 있어서, n이 2이고 m이 0인 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  37. 제34항에 있어서, 5 내지 200 하부-단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  38. 제34항에 있어서, 상기 연결성분이 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포로티오에이트, 아릴포스포로티오에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트인 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  39. 제34항에 있어서, 상기 구조식의 단량체 하부-단위를 다수 가지는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 단량체 하부-단위가 미리 예정된 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 올리고머 화합물.
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