본 발명은 DNA 및 RNA의 활성을 조절하는 아미노옥시를 함유하는 조성물을 제공한다. 바람직한 조성물은 하기 구조식의 화합물을 포함한다:
(상기에서, X가 1인 경우에, Q는 2', 3' 혹은 5' 부위에서 상기 L기로 치환된 뉴클레오시드; 2' 혹은 5' 부위에서 상기 L기로 치환된 3'-포스피틸화된 뉴클레오시드(3'-phosphitylated nucleoside); 3' 혹은 5' 부위에서 상기 L기로 치환된 2'-포스피틸화된 뉴클레오시드; 또는 2', 3' 혹은 5' 부위에서 상기 L기로 치환된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이거나; 또는 X가 0인 경우에, Q는 하기 구조식을 갖는 화합물임:
바람직하게, p는 1이고 n은 4이다.
바람직한 화합물의 기(group)에 있어서, y는 1 내지 4이다. 더욱 바람직한 y는 1이다.
바람직한 화합물의 기에 있어서, m은 1 내지 6이다. 더욱 바람직한 m은 2이다.
바람직한 화합물의 기에 있어서, Q는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 혹은 올리고뉴클레오티드내에 있는 뉴클레오시드이다. 더욱 바람직한 화합물의 기에 있어서, Q는 올리고뉴클레오티드내에 있는 2' 혹은 3' 치환된 뉴클레오시드이다.
상기 Pg 및 Z는 위에서 언급한 바와 같다. 또한 바람직한 화합물의 기에 있어서, Z는 고체상 지지체이다. 더욱 바람직한 Z는 보호되고 활성된 포스포러스 원자이다. 보다 더욱 바람직한 Z는 보호된 포스포아미디트(phosphoramidite) 부분이다.
본 발명의 바람직한 조성물은 하나 이상의 상기 Q - L 화합물을 갖도록 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같이 상기 조성물은 본 발명의 하나 이상의 아미노옥시 변형된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드, 혹은 Q가 상기 구조식 Ⅰ인 구조식 Q - L의 하나 이상의 뉴클레오시드 서러게이트(surrogate)를 포함하도록 변형된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 혹은 이중 가닥 표적 DNA 혹은 RNA의 미리 선택된 뉴클레오티드 염기서열과 특이적으로 잡종화될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 DNA 및 RNA와 함께 이중가닥을 형성한다.
본 발명의 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 결합기를 통해서 서로 결합된 핵산 염기의 단일 가닥으로 구성된다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 50개의 핵산 염기의 길이를 가질 수 있다. 그러나 본 발명의 바람직한 구체예에 의해서, 약 12 내지 25개의 염기서열 길이를 갖는 것은 더욱 적절하다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드의 바람직한 각각의 뉴클레오티드들은 포스포러스 결합을 통해 결합될 수 있다. 바람직한 포스포러스 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 결합이며, 더욱 바람직한 결합은 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합이다.
본 발명의 바람직한 뉴클레오염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 크잔틴, 하이포크잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 우라실, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 유사 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올알킬 아데닌, 8-하이드록실 아데닌 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌, 8-하이드록실 구아닌 및 다른 8-치환된 구아닌, 다른 아자 및 데아자 우라실, 시토신, 다른 아자 및 데아자 티민, 다른 아자 및 데아자 시토신, 다른 아자 및 데아자 아데닌, 다른 아자 및 데아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실, 및 5-트리플루오로 시토신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 구체예에 의해서, 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오시드는 변형된다. 상기 뉴클레오시드 구성요소가 변형되는 적절한 부위는 상기 뉴클레오시드의 2', 3' 혹은 5' 부위이다. 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오시드에아미노옥시 부분을 삽입하는 것으로 이루어진다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에 의해서, 아미노옥시 부분을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오시드 서러게이트는상기 올리고뉴클레오티드를 변형하는 데에 이용된다. 상기 아미노옥시 변형된 뉴클레오시드 혹은 뉴클레오시드 서러게이트는 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 표준 합성 방법을 이용하여 상기 올리고뉴클레오티드에 아미노옥시 부분이 결합된다.
바람직한 변형은 2', 3' 혹은 5'-O-아미노옥시알킬, 2', 3' 혹은 5'-O-알킬아미노알킬, 또는 2', 3' 혹은 5'-O-디알킬아미노옥시알킬 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 더욱 바람직한 변형은 올리고뉴클레오티드내에 결합하는 제1 및 제2 하이드록시 기능기를 갖고, 그리고 아미노옥시 부분에서 컨쥬게이션을 통하여 상기 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트기를 결합하는 데에 이용되는 아미노옥시 부분이 있는 측쇄를 갖는 알킬 단위체를 포함하는 뉴클레오시드 서러게이트로 이루어진다. 상기 컨쥬게이션은 상기 아미노옥시 부분의 질소 원자의 적절한 알킬화 혹은 아실화에 의해서 이루어진다. 상기 화합물의 비타민 A족은 다양한 족의 성분들에서 발견되는 산 혹은 알코올 기능기들을 통해 올리고뉴클레오티드에 접촉될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 매달린 링커의 아민 기능기에 레티노익 산의 산 성분의 N-하이드록시 수시니미드(N-hydroxy succinimide) 에스테르의 컨쥬게이션은 아미드 결합을 통해 상기 올리고뉴클레오티드에 비타민 A 화합물을 결합시킨다. 또한 레티놀은 그것의 포스포아미디트로 전환되었으며, 5'-컨쥬게이션에 이용된다.
컨쥬게이트기 혹은 리간드로써 바람직한 것은 스테로이드 분자, 수용체 분자, 리포필릭 분자, 수용체 효소, 펩타이드, 단백질(즉, 본질적으로 같은 것을 이루게 하는 치환체), 혹은 글리콜 또는 링커와 같은 글리콜이다. 본 발명의 목적에부합하는 상기 "수용체 분자" 및 "수용체 효소"란 젤, 유체, 완전한 세포계, 깨진 세포계(broken cellular systems), 및 분광기, 방사능, 색체계 검정법, 플루어레신 및 특이 결합과 같은 물리적 방법을 이용하는 것으로 동정되는 것으로, 물리적 혹은 화학적 특성을 갖는 분자 혹은 효소를 포함한 것이다. 스테로이드는 퍼하이드로-1,2-시클로펜타노펜난트렌 링 구조를 갖고 있는 화학적 화합물을 포함한다. 단백질 및 펩타이드는 아미노산의 중합체로서 상기의 일반적인 센스에 이용된다. 정상적인 펩타이드는 단백질보다 더 작은 수의 단일 분자당 아미노산을 포함하는 상기 중합체로 이루어진다. 리포필릭 분자는 자연적으로 발생되는 것과 지방산, 에스테르, 알콜 및 또 다른 지방성 분자와 같은 합성적인 방향성 부분과 비방향성 부분, 디니트로페닐기와 같은 치환된 방향기, 아다맨탄 및 버크미니스터풀레렌(buckministerfullerenes)과 같은 케이지(cage) 구조, 그리고 벤젠, 페릴렌, 펜난트렌, 안트라센, 나프탈렌, 피렌(pyrene), 치리센(chrysene) 및 나프타센과 같은 방향성 탄화수소를 포함한다.
스테로이드 분자로써 특히 유용한 것은 콜릭산, 데옥시콜릭산 및 디하이드로콜릭산을 포함한 담즙산; 코르티손, 디고자이제닌(digoxigenin), 테스토스테론 및 콜레스테롤을 포함한 스테로이드; 및 코르테손 링의 3 부위에 이중 결합을 통해 접합된 트리메틸아미노메틸 하이드라지드기를 갖는 코르티손과 같은 양이온성 스테로이드이다. 수용체 분자로써 특히 유용한 것은 바이오틴, 디니트로페닐 및 플루어레신 염료이다. 리포필릭 분자로써 특히 유용한 것은 알리시클릭 탄화수소, 포화 및 불포화 지방산, 왁스, 터펜 및 아다맨탄 및 벅크미니스터풀레렌을 포함한 폴리알리시클릭 탄화수소이다. 수용체 효소로써 특히 유용한 것은 알칼린 포스파타아제 및 호세라디쉬 페록시다아제이다. 펩타이드와 단백질로써 특히 유용한 것은 포스포디에스테라아제, 페록시다아제, 포스파타아제 및 뉴클레아제 단백질을 포함한 서열-특이적 펩타이드 및 단백질이다. 상기 펩타이드 및 단백질은 SV40 펩타이드, RNase A, RNase H 및 스태필로코칼 뉴클레아제(Staphylococcal nuclease)를 포함한다. 터페노이드(terpenoid)로써 특히 유용한 것은 비타민 A, 레티노익 산, 레티날 및 디하이드로레티놀이다. 다른 컨쥬게이트 리간드는 미국특허 제5,578,718호에서 개시된 바와 같다.
본 발명은 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실-β-뉴클레오시드를 포함한 복수의 결합된 뉴클레오시드로부터 형성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 뉴클레오시드는 상보적으로 표적된 핵산과 특이적으로 잡종화될 수 있는 서열 내에서 하전된 포스포러스 결합에 의해 연결된다. 상기 결합된 뉴클레오시드의 서열은 적어도 두 개의 하위염기서열로 나뉜다. 제1 하위염기서열은 2'-아미노옥시알킬 치환제를 갖고, 하전된 3'-5' 포스포러스 결합에 의해서 결합된 뉴클레오시드를 포함한다. 제2 하위염기서열은 생리적 pH에서 음전하를 갖는 하전된 3'-5' 포스포러스 결합에 의해서 결합된 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실-β-뉴클레오시드로 이루어진다. 더 나은 바람직한 구체예에서는 뉴클레오시드의 제3 하위염기서열이 존재하며, 제1 하위염기서열로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 제2 하위염기서열은 제1 과 제3 하위염기서열사이에 위치한다. 또한 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 "키메릭" 또는 "갭된" 올리고뉴클레오티드, 혹은 "키메라"로인용된다.
본 발명에서 합성되는 신규의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 증가시킬 것이며, 야생형의 DNA-DNA 및 RNA-DNA 이중 구조와 메틸포스포네이트, 포스포아미디트 및 포스페이트 트리에스테르를 함유한 포스포러스-변형된 올리고뉴클레오티드 이중 구조에 관련한 고품질의 잡종화 특성을 나타낼 것이며, 또는 상기 신규의 올리고뉴클레오티드는 아미노옥시 부분을 거쳐 상기 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이드기를 결합시키기 위해서 서러게이트 단위체위에 상기 아미노옥시 부위가 있는 뉴클레오시드 서러게이트 단위체를 포함할 것이다.
또한 본 발명은 유기체와 위에서 언급한 조성물을 접촉시켜 상기 유기체에 의해서 단백질 생성이 조절되는 방법에 관한 것이다. 상기 RNA 혹은 DNA 부위는 상기 단백질 형성의 조절을 암호화하는 것으로 이루어지도록 미리 선택되는 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 DNA 혹은 RNA의 미리 선택된 부분과 특이적으로 잡종화될 수 있도록 고안된다.
또한 본 발명은 바람직하지 않은 단백질의 생성으로 야기되는 질병을 가진 유기체의 치료방법에 관한 것이다. 상기 방법은 위에서 언급한 조성물을 유기체에 접촉시키는 것으로 이루어진다. 상기 조성물은 상기 단백질 생성의 저해를 암호화하는 mRNA와 특이적으로 결합될 수 있도록 고안되는 것이 바람직하다.
더 나아가 본 발명은 유기체나 세포 내 비정상적인 RNA 분자의 존재 혹은 결여, 또는 정상적인 RNA 분자의 비정상적이거나 부적절한 발현을 검출하는 진단방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 연구 시약 혹은 진단제로서 사용되기 위한 RNA의 선택적인 결합 방법에 관한 것이다. 상기 선택적이고 강한 결합은 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 상기 DNA 혹은 RNA간의 상호작용에 의해 이루어지며 향상된 잡종화를 보여준다.
일 반
시약과 용매는 다른 언급이 없다면 모두 Aldrich Chemical에서 구입하였다. NMR 스펙트럼은 하기의 기구들로 측정되었다:1H-NMR: Varian Gemini-200(199.975 MHZ) 혹은 Varian Unity 400(399.952 MHZ).13C-NMR: Varian Gemini-200(50.289 MHZ).31P-NMR: Varian Gemini-200(79.990 MHZ) 혹은 Varian Unity 400(159.981 MHZ). NMR 스펙트럼은 용매(테트라메틸실란 혹은 포스포릭산 내부 표준)로써 데우테리오클로로포름(deuteriochloroform) 혹은 디메틸술폭시드-d6을 이용하여 기록되었다. 상기 약어는 다양한 각각의 신호(signal)들을 나타낸 것이다: s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, m = multilet, dd = doublet of doublet,br s = broad singlet. 대부분의 스펙트럼은 VG 70-SEQ 기구에서 쾌속 원자 포격 전리(fast atom bombardment ionization)(7 kV Xe atoms)를 이용하여 얻어졌다. 컬럼 크로마토그래피의 용매 비율은 부피/부피로 주어진다. 용매의 증발은 특별히 언급하지 않는 한, 35℃에서 진공 상태(60 torr)로 행해진다.
실시예 1
메틸-2-O-(2-에틸아세틸)-3,5-비스-O-(2,4-디클로로벤제닐)-α-D-리보푸라노시드 (제1도의 화합물 3)
화합물 2(제1도)(Martin, P.Helv. Chem. Acta, 1995,78, 486-504에서 개시된 절차를 통해 화합물 1로부터 다량으로 제조된)는 DMF(86mL)에 5℃로 냉각시키면서 용해되었고, NaH(60% 분산(dispersion), 1.38g, 34.38mmol)가 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 5℃에서 5분 동안 교반된 후에 상온으로 데워지고 상기 반응 혼합물이 5℃에서 냉각된 후 20분 동안 교반시켰으며, 에틸브로모아세테이트(3.81mL, 34.4mmol)를 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가시켜 가스가 분출되도록 하였다. 상기 반응 혼합물은 상온으로 데워지며 5℃로 상기 혼합물이 냉각된 후 3시간 동안 교반하였고, pH는 NH4Cl 포화 수용액의 첨가로 pH 3에 근접시켰다. 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어 시럽을 생성하였으며, 상기 시럽은 EtOAc(200mL)에서 용해되어, 증류수 및 소금물로 세척되었다. 생성된 유기층은 분리되어 MgSO4로 건조되었고, 상기 용매는 증발되어 오일(oil)을 생성하였다. 상기 오일은 hexanes-EtOAc(60:40)를 이용하여 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(3)은 오일 상태(15.52g, 95%)로 생성되었다.1H NMR(CDCl3): δ 7.58-7.18(m, 6H), 5.05(d, J = 3.8Hz, 1H), 4.79(q, JAB= 13.7Hz, 2H), 4.57(d, J = 2.8Hz, 2H), 4.31-4.16(m, 5H), 4.03(m, 2H), 3.62(d, 2H), 3.50(s, 3H), 1.28(t, 3H).13C NMR(CDCl3): δ170.0, 134.2, 133.6, 133.5, 130.3, 129.8, 129.1, 128.8, 127.1, 102.1, 81.4, 78.9, 76.6, 70.6, 70.0, 69.3, 67.6, 61.0, 55.6, 14.2. C24H26Cl4O7·H2O에 대한 Anal. Calcd: C, 49.17; H, 4.81. Found: C, 49.33; H, 4.31.
실시예 2
1-[2'-O-(2-에틸아세틸)-3',5'-비스-O-(2,4-디클로로벤질)-β-D-리보푸라노실]티민 (제1도의 화합물 4)
티민(6.90g, 54.6mmol)을 안하이드러스 디클로로에탄(136mL)에 현탁시키고, 비스-트리메틸실릴아세타미드(40.5mL, 164mmol)를 첨가시켰다. 상기 반응 혼합물은 10분 동안 환류(reflux) 온도로 데워져서 용해되었다. 상온으로 냉각시킨 후에, 상기 용액을 화합물 3에 교반하면서 첨가시켰다. 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트(6.86mL, 35.5mmol)가 첨가되었으며, 상기 반응 혼합물은 6시간 동안 환류 온도로 데워졌다. 상기 혼합물은 5℃로 냉각되었고 상기 혼합물의 pH는포화된 NaHCO3를 천천히 첨가시켜 pH 7에 근접시켰다. 상기 혼합물은 CH2Cl2(3×150mL)로 추출되었으며, 상기 유기 추출물은 결합되어 소금물로 세정되었고, 그리고 진공 상태를 만들어 상기 용액을 증발시켜 오일을 생성하였다. 상기 오일은 CH2Cl2로 용해되었고 hexanes-EtOAc(45:55)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(4)은 오일 상태(7.92g, 44%)로 생성되었다(상기 α-아노머는 마지막 부분에 포함되었다).1H NMR(400 MHZ, CDCl3): δ 8.25(s, 1H), 7.67(s, 1H), 7.46-7.21(m, 6H), 5.94(d, J = 1.6Hz, 1H), 4.80(q, JAB= 12.4Hz, 2H), 4.70-4.18(m, 9H), 4.02(d, 1H), 3.75(d, 1H), 1.58(s, 3H), 1.26(t, 3H).13C NMR(CDCl3): δ 170.1, 164.3, 150.3, 135.5, 134.5, 134.2, 134.1, 133.8, 133.5, 130.7, 130.2, 129.4, 129.0, 127.1, 110.3, 88.4, 80.8, 80.5, 74.7, 70.1, 68.9, 68.0, 66.2, 60.9, 14.1, 12.1. C28H28Cl4N2O8·H2O에 대한 Anal. Calcd: C, 49.43; H, 4.44; N, 4.12. Found: C, 49.25; H, 4.10; N, 3.94.
실시예 3
1-[2'-O-(2-하이드록시에틸)-3'.5'-비스-O-(2,4-디클로로벤질)-β-D-리보푸라노실]티민 (제1도의 화합물 5)
화합물 4(9.92g, 15.0mmol)를 뜨거운 EtOH(150mL)로 용해시켰고, 상기 용액을 워터 배스(water bath)에서 상온으로 냉각시켰다. 상기 용액에는 10분에 걸쳐 조심스럽게 NaBH4(1.13g, 30.0mmol)가 첨가되었다. 3시간 후에 NaBH4(282mg, 7.45mmol)가 상기 혼합물에 더 첨가되고, 상기 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 8시간 동안 그대로 두었다. 포화된 NH4Cl(25mL)를 첨가시켜 pH 4에 근접시켜 고무질을 생성시켰다. 상기 용액을 가만히 부어 진공 상태에서 증발시켜 하얀 고체를 생성하였고 CH2Cl2(250mL)에서 용해되었다. 상기 유기층은 분리되었고, 상기 수용액 층은 CH2Cl2(2×20mL)로 다시 추출하였다. 상기 유기층이 결합된 후에, 상기 용액은 MgSO4로 건조되었고, 진공 상태에서 증발되어 하얀 거품이 생성되었다. 상기 거품은 CH2Cl2에 용해되었으며, hexanes-EtOAc(20:80)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(5)은 하얀 거품 상태(8.39g, 90%)로 제조되었다.1H NMR(CDCl3): δ 10.18(s, 1H), 7.66(s, 1H), 7.39-7.20(m, 6H), 5.96(s, 1H), 4.76-3.62(m, 14H), 1.58(s, 3H).13C NMR(CDCl3): δ 164.0, 150.8, 135.2, 134.6, 134.2, 134.1, 133.5, 133.4, 130.2, 129.4, 129.0, 127.1, 110.6, 88.6, 81.0, 80.7, 75.2, 72.2, 72.0, 70.1, 68.9, 68.1, 69.9, 12.1.
실시예 4
1-[2'-O-(2-프탈리미도-N-하이드록시에틸)-3',5'-비스-O-(2,4-디클로로벤질)-β-D-리보푸라노실]티민 (제1도의 화합물 6)
화합물 5를 안하이드러스 아세토니트릴로 증발시켜 건조시켜 12시간 동안 상온으로 진공 상태(0.1 torr)에서 건조시켰다. 상기 건조된 물질(8.39g, 13.53mmol)을 갓 만들어 놓은 THF(97mL), PPh3(3.90g, 14.9mmol) 및 N-하이드록시프탈리미도(2.43g, 14.9mmol)를 첨가하여 용해시켰다. 상기 반응 혼합물은 -78℃로 냉각시켰고, 디에틸 아조디카르복실레이트(2.34mL, 14.9mmol)를 첨가시켰다. 상기 반응 혼합물을 상온으로 데웠고, 상기 용액은 진공 상태를 만들어 증발시켜 거품으로 생성되었다. 상기 거품은 EtOAc(100mL)로 용해되었으며, NaHCO3포화 수용액(3×30mL)으로 세척되었다. 유기층이 분리되었고 소금물로 세척되었으며, MgSO4로 건조되었다. 그리고 상기 용액은 증발되었으며 거품을 생성시켰다. 상기 거품은 CH2Cl2-아세톤(85:15)을 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(6)은 하얀 거품 형태(3.22g, 31%)로 생성되었다. 두 번째 크로마토그래피 정제는 화합물(6)을 하얀 거품 형태(5.18g, 50%)로 제공하였다.1H NMR(400 MHZ, CDCl3): δ 9.0(s, 1H), 7.8(m, 11H), 5.95(s, 1H), 4.84-3.70(m, 13H), 1.60(s, 3H).13C NMR(100 MHZ, CDCl3): δ 163.7, 163.5, 150.2, 138.0, 135.6, 134.5, 134.1, 134.0, 133.9, 133.7, 133.6, 130.6, 130.4, 130.1, 129.8, 129.4, 129.1, 129.0, 128.8, 127.2, 123.5, 110.4, 88.2, 81.0, 80.9, 77.6, 75.4, 70.2,68.9, 68.4, 68.1, 12.1. LRMS(FAB+)m/z: 766(M+H). LRMS(FAB-)m/z: 764(M-H).
실시예 5
1-[2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-3',5'-비스-O-(2,4-디클로로벤질)-β-D-리보푸라노실]티민 (제2도의 화합물 7)
화합물 6(1.79g, 2.34mmol)은 CH2Cl2(12mL)에 용해되었으며, 상기 용액은 -78℃로 냉각되었고, 그리고 CH2Cl2내의 1.0M 보란 트리클로라이드(5.15mL, 5.15mmol)룰 첨가하여 상기 반응 혼합물을 1시간 반 동안 5℃에서 방치하였다. CH2Cl2내의 1.0M 보란 트리클로라이드(5.15mL, 5.15mmol)를 더 첨가하였고, 상기 용액을 1시간 반 동안 5℃에서 교반하였다. 상기 pH는 NaHCO3포화 수용액(30mL)이 첨가되어 pH 7이 되었다. CH2Cl2(100mL)로 희석시킨 후에, 상기 유기층은 분리되었고, 상기 수용액 층은 CHCl3(5×25mL)로 추출된 후에, EtOAc(3×25mL)로 추출되었다. 상기 유기층은 결합되었으며 Na2SO4로 건조되었고, 그리고 진공 상태를 만들어 증발시켜 오일이 생성되었다. 상기 오일은 CH2Cl2-아세톤(45:55)을 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(7)은 하얀 거품 형태(619mg, 59%)로 생성되었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.8(br, 1H), 7.88-7.75(m, 4H), 7.50(s, 1H), 5.70(d, J = 4Hz, 1H), 4.45-3.75(m, 11H), 2.95(br, 1H),1.90(s, 3H).13C NMR(100 MHZ, CDCl3): δ 164.3, 163.7, 150.6, 137.4, 134.7, 128.5, 123.6, 110.5, 89.7, 84.7, 81.9, 77.6, 68.5, 68.4, 61.0, 12.3. LRMS(FAB+)m/z: 448(M+H). LRMS(FAB-)m/z: 446(M-H).
실시예 6
1-[2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]티민 (제2도의 화학식 8)
화합물 7은 안하이드러스 아세토니트릴로 증발시켜 건조시켜 12시간 동안 상온으로 진공 상태(0.1 torr)에서 더 건조시켰다. 상기 건조된 물질(619mg, 1.38mmol)은 안하이드러스 피리딘(7mL)에 용해되었으며 4,4'-디메톡시트리딜 클로라이드(514mg, 1.52mmol)이 첨가되었다. 2시간 후에 4,4'-디메톡시트리딜 클로라이드(257mg, 0.76mmol)가 더 첨가되었다. 상기 용액을 2시간 동안 교반시켰으며, 4,4'-디메톡시트리딜 클로라이드(257mg, 0.76mmol)를 마지막으로 더 첨가시켰다. 12시간 후에, MeOH(10mL)가 상기 반응 혼합물에 첨가되었으며, 10분 동안 교반시켰고 상기 용매는 진공 상태에서 톨루엔과 함께 증발되어 오일을 생성시켰다. 상기 오일은 CH2Cl2-아세톤-피리딘(80:20:1)과 함께 실리카로 전처리한 후 CH2Cl2-아세톤(80:20)을 이용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(8)이 황색 고체(704mg, 68%)를 제공하였다.1H NMR(CDCl3): δ 7.8-6.8(m,18H), 5.94(d, J = 2.2Hz, 1H), 4.57-4.12(m, 7H), 3.78(s, 6H), 3.53(m, 2H), 1.34(s, 3H).13C NMR(CDCl3): δ 164.3, 163.8, 158.6, 150.6, 144.4, 135.5, 135.4, 134.7, 130.1, 128.7, 128.2, 128.0, 127.1, 123.7, 113.3, 110.9, 8.9, 86.7, 83.2, 68.7, 68.5, 61.7, 55.2, 11.9. LRMS(FAB+)m/z: 750(M+H). LRMS(FAB-)m/z: 748(M-H). C41H39N3O11·H2O에 대한 Anal. Calcd: C, 65.14; H, 5.38; H, 5.47. Found: C, 63.85; H, 5.16; N, 5.14. C41H39N3O11에 대한 Anal. Calcd: C, 65.68; H, 5.24; N, 5.60. Found: C, 65.23; H, 5.27; N, 5.45.
실시예 7
1-[2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]티민-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필-포스포아미디트] (제2도의 화학식 9)
화합물 8은 안하이드러스 피리딘(2×20mL)와 함께 증발되어 건조된 후, 12시간 동안 상온의 진공 상태(0.1 torr)에서 더 건조되었다. 상기 건조된 물질(704mg, 0.939mmol)을 CH2Cl2(9mL), 디이소프로필라민 테트라졸리드(80.4mg, 0.47mmol) 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미디트 (0.33mL, 1.03mmol)에 교반시키면서 용해시켰다. 상온에서 2시간이 지난 후에, 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미디트(0.33mL, 1.03mmol)을더 첨가하였고 상기 용액을 20시간 동안 교반시켰다. 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어, CH2Cl2-아세톤-피리딘(85:15:1)과 함께 실리카로 전처리한 후 CH2Cl2-아세톤(85:15)을 이용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 그 결과 본 실시예의 화합물(9)은 오일 형태(704mg, 68%)로 생성되었다. 상기 생성물은 안하이드러스 아세토니트릴(2×30mL) 및 CH2Cl2(2×30mL)로 증발되어 황색의 거품이 생성되었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.6(br, 1H), 7.78-6.82(m, 18H), 6.06(m, 1H), 4.6-3.3(m, 14H), 3.75(s, 6H), 2.66(m, 1H), 2.37(m, 1H), 1.36(s, 3H), 1.16(m, 12H).13P NMR(CDCl3): δ 150.5, 151.2. LRMS(FAB+)m/z: 950(M+H). LRMS(FAB-)m/z: 948(M-H). C50H56N5O12P·H2O에 대한 Anal. Calcd: C, 62.04; H, 6.04; H, 7.24. Found: C, 62.20; H, 5.94; N, 7.34.
실시예 8
2'-O-(2-에틸아세틸)-3',5'-O-(1,1,3,3,-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 (제3도의 화합물 11)
아데노신(30.00g, 112mmol)은 뜨거운 안하이드러스 DMF(600mL)에 용해되어 상온으로 냉각되었다. NaH(60% 분산 오일, 4.94g, 124mmol)가 첨가되었고 상기 혼합물은 1시간 동안 기계적인 교반을 통해서 교반되었다. 상기 현탁액은 5℃로 냉각되었고 에틸브로모아세테이트(13.7mL, 124mmol)가 첨가되었다. 상기 생성된 용액을 상온에서 12시간 동안 교반시켰고, 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어 2'-O-(2-에틸아세틸)아데노신 (화합물 10) 및 추정적인 3'-O-이소머를 함유하는 잔여물을 생성하였다. 상기 물질은 피리딘과 함께 증발되었으며 안하이드러스 피리딘(400mL)에 용해되어 있는 거품이 생성되었다. 1,3-디클로로-1,1,3,3,-테트라이소프로필디실록산(39.52mL, 124mmol)이 첨가되었고 상기 용액은 상온에서 24시간 동안 교반되었다. 상기 용매를 진공 상태에서 증발시켜 오일을 생성하도록 하였으며, 상기 오일을 EtOAc(500mL)에 용해시키고 3번 정도 소금물로 세척하였다. 상기 유기층은 분리되어 MgSO4로 건조되었고, 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어 오일이 생성되었다. 상기 오일은 hexanes-EtOAc(80:20)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(11)은 오일 상태(14.63g, 22%)로 생성되었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.26(s, 1H), 8.07(s, 1H), 6.20(br s, 2H), 4.91(dd, J1',2'= 4.7Hz, J2', 3'=9.3Hz, 1H), 4.64-3.97(m, 8H), 1.22(t, 3H), 1.05(m, 28H).13C NMR(CDCl3): δ 170.0, 155.5, 152.8, 149.0, 139.3, 120.2, 88.6, 82.2, 81.1, 69.9, 68.3, 60.8, 60.0, 17.2, 14.0, 12.7. C26H45N5O7Si2에 대한 Anal. Calcd: C, 52.41; H, 7.61. Found: C, 51.41; H, 7.61; N, 11.75; Si, 9.43. Found: C, 52.23; H, 7.34; N, 11.69.
실시예 9
2'-O-(2-하이드록시에틸)-3',5'-O-(1,1,3,3,-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 (제3도의 화합물 12)
화합물 11(4.175g, 7.01mmol)을 에탄올(95%, 40mL)에 용해시켰고 상기 생성된 용액을 5℃로 냉각시켰다. NaBH4(60% 오일 분산, 0.64g, 16.8mmol)를 첨가시켰고 상기 혼합물을 상온에서 따뜻하게 되도록 방치하였다. 12시간 동안 교반을 거친 후에 CH2Cl2(200mL)를 첨가시켰고 상기 용액을 소금물로 두 번 세척한 후 상기 유기층은 분리되었다. 상기 유기층은 MgSO4로 건조되었고, 상기 용매가 진공 상태에서 증발되어 오일이 생성되었다. 상기 오일은 EtOAc-MeOH(95:5)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(12)은 오일 상태(0.368g, 9.5%)로 제공되었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.31(s, 1H), 8.14(s, 1H), 6.18(br s, 2H), 6.07(s, 1H), 4.62(dd, J1',2'= 4.6Hz, J2', 3'=9.4Hz, 1H), 4.3-3.5(m, 8H), 1.03(m, 28H).13C NMR(CDCl3): δ 155.5, 153.0, 148.7, 138.3, 120.3, 89.2, 82.7, 81.4, 73.5, 69.3, 61.8, 59.7, 17.2, 17.0, 16.8, 13.4, 12.9, 12.8, 12.6. LRMS(FAB+)m/z: 554(M+H). LRMS(FAB-)m/z: 686(M-H).
실시예 10
2'-O-(2-프탈리미도-N-하이드록시에틸)-3',5'-O-(1,1,3,3,-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 (제4도의 화합물 13)
안하이드러스 THF(10mL)에 용해된 화합물 12 용액(0.330g, 0.596mmol)에 트리페닐포스핀(0.180g, 0.685mmol) 및 N-하이드록시프탈리미드(0.112mL, 0.685mmol)를 첨가하였다. 상기의 혼합물에 디에틸 아조디카르복실레이트(0.11mL, 685mmol)를 5℃에서 한 방울씩 첨가하였다. 상온에서 3시간 동안의 교반 후에, 상기 용매는 증발되었고 오일이 생성되었다. 상기 오일은 EtOAc에 용해되었고 포화 수성NaHCO3(×3) 및 소금물로 세척되었다. 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어 오일이 생성되었다. 상기 오일은 EtOAc-MeOH(95:5)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(13)은 오일 상태(0.285g, 68%)로 제공되었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.21(s, 1H), 8.05(s, 1H), 7.8-7.45(m, 4H), 6.00(s, 1H), 5.88(br s, 2H), 4.92(dd, J1',2'= 4.6Hz, J2', 3'=9.0Hz, 1H), 4.5-3.9(m, 8H), 1.0(m, 28H).13C NMR(CDCl3): δ 163, 155.3, 152.8, 149, 139.6, 134.3, 123.4, 120, 88.7, 82.7, 81.1, 77.4, 70.2, 69.5, 60.1, 17.4, 17.2, 17.0, 16.9, 13.3, 12.9, 12.7, 12.6. LRMS(FAB+)m/z: 699(M+H).
실시예 11
N6-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도-N-하이드록시에틸)-3',5'-O-(1,1,3,3,-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 (제4도의 화합물 14)
5℃로 냉각된 안하이드러스 피리딘(19mL)에 용해된 화합물 13 용액(1.09g, 1.97mmol)에 벤조일 클로라이드(1.14mL, 9.8mmol)를 첨가하였고 상기 생성된 혼합물을 12시간 동안 상온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 5℃로 냉각시킨 후에, 냉각수(3.8mL)를 첨가하였고, 상기 혼합물을 15분 동안 교반하였으며, 그리고 농축된 NH4OH(3.8mL)를 첨가하였다. 30분 동안 5℃에서 교반한 후에, 상기 용매는 증발되어 잔여물이 생성되었고 상기 잔여물은 증류수로 용해되어 CH2Cl2로 세 번 추출되었다. 상기 유기 추출물은 결합되었으며 MgSO4로 건조되었고, 진공 상태에서 증발되어 오일을 생성시켰다. 상기 오일은 hexanes-EtOAc(50:50)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(14)은 오일 상태(0.618g, 48%)로 제공되었다.1H NMR(CDCl3): δ 9.2(br s, 1H), 8.69(s, 1H), 8.27(s, 1H), 8.0-7.4(m, 9H), 6.12(s, 1H), 4.95(dd, J1',2'= 4.7Hz, J2', 3'= 9.1Hz, 1H), 4.5-4.0(m, 8H), 1.06(m, 28H).13C NMR(CDCl3): δ 164.4, 163.3, 152.5, 150.8, 149.3. 142.1. 134.4. 133.7. 132.6. 132.1. 128.7. 128.2. 127.7. 123.4. 88.9. 82.7. 81.3. 77.5. 70.1. 69.6. 60.0. 17.2. 17.0. 16.8. 13.3. 12.8. 12.7. 12.6. LRMS(FAB+)m/z: 803(M+H).
실시예 12
N6-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도-N-하이드록시에틸)아데노신 (제4도의 화합물 15)
5℃의 폴리에틸렌 반응기에 용해된 화합물 14 용액(0.680g, 0.847mmol)에 HF-피리딘(70%, 0.48mL, 16.9mmol)을 첨가하였고 상기 생성된 혼합물을 상온에서 따뜻하게 되도록 방치하였다. 12시간 동안 교반한 후에, 상기 용매는 진공 상태에서 증발되었고 EtOAc를 첨가시켜 상기 용액을 증류수로 세정하였고, 그리고 상기 유기층을 분리하여 EtOAc로 추출하였다. 상기 유기층은 결합되었으며 MgSO4로 건조되었고, 그리고 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어 본 실시예의 화합물(15)이 고체(408g, 86%)로 제공되었다.1H NMR(DMSO-d6): δ 11.2(br s, 1H), 8.71(s, 1H), 8.67(s, 1H), 8.0-7.5(m, 9H), 6.11(d, J1',2'= 5.7Hz), 5.23(d, 1H), 5.14(t, 1H), 4.66(t, 1H), 4.35(m, 3H), 3.90(m, 3H), 3.6(m, 2H).13C NMR(DMSO-d6): δ 163.5, 152.0, 143.2, 135.0, 132.6, 131.9, 131.7, 129.3, 128.7, 128.5, 123.4, 86.3, 85.8, 81.3, 76.8, 69.0, 68.7, 61.3. LRMS(FAB+)m/z: 561(M+H), 583(M+Na+).
실시예 13
N6-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)아데노신 (제4도의 화합물 16)
안하이드러스 피리딘(5mL)에 용해된 화합물 15 용액(0.258g, 0.46mmol)에 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(0.179g, 0.53mmol)를 첨가하였고, 상기 용액을 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 증류수를 첨가시켰고 상기 혼합물은 세 번 EtOAc로 추출되었다. 상기 유기 추출물은 결합되었고 진공 상태에서 증발되었으며, 그리고 MgSO4로 건조되어 오일이 생성되었다. 상기 생성된 오일은 hexanes-EtOAc(90:10)를 이용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며, 본 실시예의 화합물(16)은 오일 상태(0.249g, 63%)로 제공되었다.1H NMR(CDCl3): δ 9.16(br s, 1H), 8.68(s, 1H), 8.28(s, 1H), 8.1-6.8(m, 22H), 6.26(d, J1',2'= 4.0Hz, 1H), 4.76(m, 1H), 4.60(m, 1H), 4.4-4.3(m, 3H), 4.13-4.0(m, 3H), 3.77(s, 6H), 3.48(m, 2H).13C NMR(CDCl3): δ 164.5, 163.6, 158.5, 152.6, 151.4, 149.5, 144.5, 141.9, 135.7, 134,7, 132.7, 130.1, 128.8, 128.2, 127.8, 126.9, 123.7, 113.2, 87.2, 84.1, 82.6, 69.9, 63.0, 60.3, 55.2. C48H42N6O10에 대한 calcd HRMS(FAB+)m/z: 995.2017(M+Cs+). Found: 995.2053(M+Cs+).
실시예 14
N6-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)아데노신-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트] (제4도의 화합물 17)
CH2Cl2(10mL)에 용해된 화합물 16 용액 (0.300g, 0.348mmol)에 디이소프로필아민 테트라졸리드(0.030g, 0.174mmol) 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필-포스포로디아미디트(0.13mL, 0.418mmol)을 첨가하였다. 상온에서 12시간 동안 교반한 후에, 디이소프로필아민 테트라졸리드(0.060g, 0.348mmol) 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필-포스포로디아미디트(0,26mL, 0.832mmol)를 24시간 이상에 걸쳐 두 부분으로 나누어 더 첨가하였다. 24시간 후에 CH2Cl2-NEt3(100:1)를 첨가하였고, 상기 혼합물을 NaHCO3포화 수용액 및 소금물로 세척하였다. 상기 유기층은 분리되었으며 MgSO4로 건조되었고, 그리고 상기 용매는 진공 상태에서 증발되어 오일이 생성되었다. 상기 생성된 오일은 hexanes-EtOAc-NEt3(40:60:1)로 실리카를 전처리에 의하며 그 후 상기와 같은 용매계를 이용한, 플래쉬 크로마토그래피에 의해서 정제되었으며 본 실시예의 화합물(17)은 오일(203g, 55%)로 제공되었다.1H NMR(CDCl3): δ 6.27(m, 1H).13P NMR(CDCl3): δ 151.0, 150.5. C57H59N8O11P에 대한 calcd HRMS(FAB+)m/z: 1195.3095(M+Cs+). Found: 1195.3046(M+Cs+).
실시예 15
2'-O-(2-아미노옥시에틸)-3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3,-디일)아데노신 (제5도의 화합물 18)
5℃의 CH2Cl2(5mL)에 용해된 화합물 13 용액(0.228g, 0.326mmol)에 메틸하이드라진(0.017mL, 0.326mmol)을 첨가시켰다. 상기 혼합물을 여과시켜 침전물을 제거하였고 상기 여과물은 증류수와 소금물로 세척되었다. 상기 유기층은 분리되어 MgSO4로 건조되었으며, 진공 상태에서 증발되어 본 실시예의 화합물(18)은 오일(186mg)로 제공되었다. 상기 오일은 다음의 반응들을 위해 충분한 순도를 갖는 것이었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.31(s, 1H), 8.15(s, 1H), 6.07(s, 1H), 5.78(br s, 2H), 4.70(dd, J1',2'= 4.4Hz, J2', 3'=9.0Hz, 1H), 4.3-3.9(m, 8H), 1.9(br, 2H), 1.0(m, 28H). LRMS(FAB+)m/z: 569(M+H), 702(M+Cs+).
실시예 16
2'-O-(2-O-포름알독시밀에틸)-3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3,-디일)아데노신 (제5도의 화합물 19)
EtOAc(2mL) 및 MeOH(2mL)에 용해된 화합물 18 용액(0.186g, 0.326mmol)에 포름알데하이드(수성 37%, 0.028mL, 0.342mmol)를 상온에서 3분 동안 교반시키면서 첨가하였다. 상기 용매는 진공 상태에서 증발되었고 본 실시예 화합물(19)은 오일(189mg)로 제공되었다. 상기 오일은 다음의 반응들을 위해 충분한 순도를 갖는 것이었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.31(s, 1H), 8.09(s, 1H), 6.97(d, J = 8.3Hz, 1H), 6.38(d, J = 8.3Hz, 1H), 6.01(s, 1H), 5.66(br s, 2H), 4.77(dd, J1',2'= 4.7Hz, J2', 3'=9.3Hz, 1H), 4.3-4.0(m, 8H), 1.0(m, 28H). LRMS(FAB+)m/z: 581(M+H+), 713(M+Cs+).
실시예 17
N6-벤조일-2'-O-(2-O-포름알독시밀에틸)-3',5'-O-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3,-디일)아데노신 (제5도의 화합물 20)
5℃에서 피리딘(5mL)에 용해된 화합물 19의 용액(0.189g, 0.326mmol)에 벤조일 클로라이드(0.19mL, 1.63mmol)를 첨가시켰고 상기 생성된 용액을 상온에서 3분 동안 교반시켰다. 상기 용액은 5℃로 냉각되었고 농축된 NH4OH(1.5mL)를 1시간 동안 교반하면서 첨가되었다. 상기 용매는 진공 상태에서 증발되었고 CH2Cl2로 용해된 오일이 생성되었다. 상기 용액은 증류수로 세정되었으며 유기층이 분리되어 MgSO4로 건조되었고, 상기 용매는 증발되어 본 실시예의 화합물(20)을 오일 상태(223mg)로 생성시켰다. 상기 오일은 다음의 반응들을 위해 충분한 순도를 갖는 것이었다.1H NMR(CDCl3): δ 9.30(br, 1H), 8.79(s, 1H), 8.31(s, 1H), 8.1-7.2(m, 5H), 7.00(d, 1H), 6.39(d, 1H), 6.09(s, 1H), 4.77(dd, 1H), 4.4-3.9(m, 8H), 1.1(m, 28H).
실시예 18
N6-벤조일-2'-O-(2-O-포름알독시밀에틸)아데노신 (제5도의 화합물 21)
5℃의 폴리에틸렌 반응기 안에서 THF(10mL)에 용해된 화합물 20 용액(223mg, 0.326mmol)에 HF-피리딘(70%, 0.19mL, 6.5mmol)을 첨가시켰고 상기 혼합물을 상온에서 따뜻하게 되도록 방치하였다. 48시간 동안 교반한 후에 상기 용매는 진공 상태에서 증발되었고 그로 인해 생성된 잔여물은 EtOAc로 용해되었으며 증류수로 세척되었다. 상기 유기층은 분리되었으며 수성층은 EtOAc로 추출되었고, 그리고 상기 유기층은 결합되어 MgSO4로 건조되었고 진공 상태에서 증발되었다. 상기 생성된 잔여물은 EtOAc-MeOH(95:5)를 이용하여 플래쉬 크로마토그래피로 정제되었으며, 본 실시예 화합물(21)은 고체(24mg, 13 내지 17%)로 생성되었다.1H NMR(CDCl3): δ 9.05(br s, 1H), 8.77(s, 1H), 8.13(s, 1H), 7.9-7.2(m), 6.26(d, J = 10.7Hz, 1H), 6.03(d, J1',2'= 7.8Hz), 4.88(dd, J = 4.6Hz, J = 7.9Hz, 1H), 4.6-3.7(m, 10H). LRMS(FAB+)m/z: 443(M+M). LRMS(FAB-)m/z: 441(M-H).
실시예 17
N6-벤조일-2'-O-(2-O-포름알독시밀에틸)-5'-O-(디메톡시트리틸)아데노신(제5도의 화합물 21A)
피리딘(7mL)에 용해된 화합물 21 용액(0.34g, 0.768mmol)에 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(0.312g, 0.922mmol)를 첨가시켰고, 상기 반응 혼합물을 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 4,4'-디메톡시-트리틸 클로라이드(520mg, 1.54mmol 및 340mg, 0.768mmol)가 더 24 시간 이상에 걸쳐서 더 첨가되었다. 상기 용매는 증발되었고, 상기 생성물은 EtOAc로 용해되었으며 증류수로 세척되었다. 상기 유기층은 분리되어 MgSO4로 건조되었고, 상기 용매는 진공 상태에서 증발되었다. 상기에서 생성된 물질은 EtOAc-NEt3(부피의 비는 100:0.5임)을 처리한 후 EtOAc- hexane-NEt3(부피의 비는 80:20:0.5임)을 용매로 이용하는 컬럼 클로마토그래피로 정제하여, 본 실시예 화합물(21A)이 오일(0.269g, 47%)로 제공되었다.1H NMR(CDCl3): δ 8.99(br s, 1H), 8.74(s, 1H), 8.1-6.8(m, 18H), 7.00(d, 1H), 6.43(d, 1H), 6.19(d, 1H), 4.72(m, 1H), 4.48(m, 1H), 4.23(m, 3H), 4.1(m, 1H), 3.9(m, 1H), 3.78(s, 6H), 3.45(m, 2H), 3.15(d, 1H). C41H40N6O8에 대한 calcd HRMS(FAB+)m/z: 877.1962(M+Cs+). Found: 877.1988(M+Cs+).
실시예 20
2'-O-알릴-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘
100mL 스테인레스 스틸 압력 반응기에서, 알릴 알코올(20mL)을 테트라하이드로퓨란에 용해되어 있는 보란(borane) 용액(1M, 10mL, 10mmol)에 교반하면서 첨가하였다. 수소 가스는 빠르게 분출되었다. 끓는 속도가 가라앉자마자, 2,2'-안하이드로-5-메틸루리딘(1.0g, 0.42mmol) 및 소듐 바이카보네이트(6mg)를 첨가하였고, 상기 반응기를 밀폐시켰다. 상기 반응기를 오일 배스(oil bath)에 두고 18시간 동안 내부 온도가 170℃가 되도록 가열하였다. Tlc는 상기 출발물질이 모두 제거되었음을 나타내었다(실리카 젤 상에서 에틸 아세테이트/메탄올(4:1)에서 출발물질 및 생성물질의 Rf는 각각 0.25와 0.06임). 상기 생성된 용액은 농축되어 메탄올(50mL), 끊는 증류수(15mL), 순수한 에탄올(2×25mL)과 함께 증발되었고, 상기의 잔여물은 1.4g의 황갈색 거품으로 건조되었다(1mmHg, 25℃, 2시간). 상기에서 생성된 뉴클레오시드의 일부분(1.2g)은 다른 정제 없이 다음 반응에 이용되었다. 상기 잔여물을 피리딘(30mL)과 함께 증발시켰고 피리딘(30mL)에 다시 용해시켰다. 디메톡시트리틸 클로라이드(1.7g, 5.0mmol)는 상온에서 한 부분에 첨가되었다. 2시간 후에 상기 용액을 메탄올(5mL)과 급냉시켜 진공 상태에서 농축시켰고, 그리고 포화 소듐 바이카보네이트 및 에틸 아세테이트(각각 150mL)를 분리시켰다. 상기 유기층은 분리되었으며 농축되었고, 상기 잔여물에 헥산-에틸 아세테이트-트리에틸아민(50:49:1 내지 60:39:1)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. 분획(fraction)을 함유하는 상기 생성물은 결합되어 농축되었으며 아세토니트릴(30mL)과 함께 증발되었고, 그리고 건조되어(1mmHg, 25℃, 24시간) 하얀 거품의 고체 840mg(34%의 2 단계 수율)를 생성시켰다. NMR은 종래 기술에 알려진 대로 메틸화되지 않은 우리딘(uridine) 유사체와 같이 행하였다.
실시예 21
2'-O-(2-하이드록시에틸)-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘
2'-O-알릴-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘(1.0g, 1.6mmol), 오스뮴 테트록사이드 수용액(0.15M, 0.36mL, 0.0056mmol, 0.35eq) 및 4-메틸모폴린 N-옥사이드(0.41g, 3.5mmol, 2.15eq)를 다이옥산(20mL)에 용해시키고 4시간 동안 25℃에서 교반하였다. Tlc는 디올에 대한 반응이 완벽하고 분명하게 이루어졌다는 것을 나타냈다(실리카 상의 디클로로메탄/메탄올(97:3)내에서 디올의 개시 Rf가 0.40 내지 0.15로 나타남). 포타슘 페리오데이트(0.81g, 3.56mmol, 2.2eq)를 증류수(10mL)에 용해시켜 상기 반응에 첨가하였다. 17시간 후에 상기 Tlc는 90%로 반응이 완벽하게 이루어졌다는 것을 나타냈다(위에 언급된 시스템에 있어서 알데하이드 Rf는 0.35로 나타남). 상기 용액을 여과시켜 5% 소듐 바이설페이트 수용액(200mL)로 급냉시켰고, 그리고 상기 생성물 알데하이드를 에틸 아세테이트(2×200mL)로 추출하였다. 상기 유기층은 결합되었으며, 소금물(2×100mL)로 세척되었고, 그리고 오일로 농축되었다. 상기 오일을 순수한 에탄올(15mL)에 용해시켰으며, 소듐 보로하이드라이드(1g)를 첨가하였다. 25℃에서 2시간 후에, 상기 Tlc는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 증류수(5mL)는 보로하이드라이드를 소실시키기 위해 첨가되었다. 2시간 후, 상기 반응을 제거하였고 상기 잔여물이 에틸아세테이트와 포화 소듐 바이카보네이트 용액(각각 50mL)로 분리되었다. 상기 유기층은 진공 상태에서 농축되었으며 상기 잔여물을 컬럼 그로마토그래피하였다(실리카 젤30g, 디클로로메탄:메탄올 = 97:3). 분획을 함유한 상기 생성물은 결합되어 제거되었으며, 0.50g(50%)의 하얀 거품으로 건조되었다. 상기 NMR은 상기 글리코실레이션 루트에 의해 제조된 물질로 행해졌다.
실시예 22
2'-O-(2-하이드록시에틸)-5-메틸루리딘
100mL의 스테인레스 스틸 압력 반응기 내에서, 에틸렌 글리콜(20mL)을 테트라하이드로퓨란 용액(1M, 10mL, 10mmol)에 교반하면서 천천히 첨가했다. 수소 가스가 빠르게 방출되었다. 끓는 속도가 가라앉자마자, 2,2'-안하이드로-5-메틸루리딘(1.0g, 0.42mmol) 및 소듐 바이카보네이트(3mg)를 첨가하였고, 상기 반응기를 밀폐하였다. 상기 반응기를 오일 배스 내에 두고 72 시간 동안 내부 온도가 150℃가 되도록 열을 가했다. 상기 봄베(bomb)를 상온에서 냉각시켜 개방하였다. Tlc는 출발물질의 65%가 소실되었음을 나타내었다(실리카 젤 상의 에틸 아세테이트/메탄올(4:1) 내에서 출발물질과 생성물의 Rf는 각각 0.25 및 0.40임). 상기 반응은 완벽하게 이루어지지 않았다. 상기 생성된 용액은 농축되었으며(100℃에서 1mmHg) 메탄올(50mL), 끓는 물(15mL) 및 순수한 에탄올(2×25mL)과 함께 증발되었고, 그리고 상기의 잔여물은 1.3g의 회색 거품(1mmHg, 25℃, 2시간 동안)으로 건조되었다. 상기 생성물의 NMR은 65%의 바람직한 생성물과 35%의 출발물질로 실시되었다. 상기 디메톡시트리틸 크로라이드와 함께 상기 생성물 샘플을 처리하여 생성된 스팟(spot)들 중 하나의 Rf가 종래의 DMT 유도체와 매치되는 것과 같이,Tlc Rf는 메탄올에 용해되어 있는 희석 하이드로클로릭 산과 함께 상기 DMT 유도체를 처리하여 생성된 상기 생성물을 (코스팟(cospot) 상에서) 매치시켰다(다른 스팟들은 측쇄 상의 DMT였으며 비스 치환된 생성물임).
실시예 23
N4-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트] (제6도의 화합물 25)
상기 2'-O-아미노옥시에틸 시티딘 및 구아닌 유사체는 종래의 절차와 유사 캐미스트리를 결부시켜 제조될 수 있다. 상기 합성 루트에 있어서 가장 중요한 부분은 비보호된 뉴클레오시드를 선택적으로 2'-O-알킬화 하는 것이다(Guinisso, C. J., Hoke, G. D., Frier, S., Martin, J. F., Ecker, D. J., Mirabelli, C. K., Crooke, S. T., Cook, P. D.,Nucleosides Nucleotides, 1991,10, 259; Manoharan, M., Guinosso, C. J., Cook, P. D.,Tetrahedron Lett., 1991,32, 7171; Izatt, R. M., Hansen, L. D., Rytting, J. H.; Christensen, J. J.,J. Am. Chem. Soc., 1965,87, 2760; Christensen, L. F., Broom, A. D.,J. Org. Chem., 1972, 37, 3398; Yano, J., Kan, L. S., Ts'o, P.O.P,Biochim. Biophys. Acta, 1980,629, 178; 및 Takaku, H., Kamaike, K.,Chemistry Lett. 1982, 189). 이와 같이, 시티딘은 중간물(화합물 22)인 2'-O-(2-에틸아세틸)시티딘을 생성하기 위해 선택적으로 알킬화 될 수 있다. 화합물 22의 3'-이소머는 매우 소량이 존재하며크로마토그래피 혹은 결정화에 의해서 분석될 수 있다. 화합물 22는 2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘 (화합물 23)이 제공되도록 보호될 수 있다. 상기 에스테르(화합물 23)의 환원은 N-4-벤졸화 될 수 있는 2'-O-(2-하이드록시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘 (화합물 24)을 생성하며, 상기 첫 번째 하이드록실기는 Mitsunobu 반응에 의해 N-하이도록시프탈리미도로 치환될 수 있고, 그리고 상기 보호된 뉴클레오시드는 N4-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트 (화합물 25)가 생성되도록 일반적으로 포스피틸화 될 수 있다.
실시예 24
N2-이소부티릴-6-O-디페닐카르바모일-2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트] (화합물 31)
상기 2'-O-아미노옥시에틸 구아노신 유사체는 선택적인 디아미노퓨린 리보시드의 2'-O-알킬화로 얻어지며(대부분의 디아미노퓨린 리보시드는 Schering AG(Berlin)으로부터 구입됨), 미소량의 3'-O-이소머와 함께 2'-O-(2-에틸아세틸)디아미노퓨린 리보시드 (화합물 26)가 생성되었다. 화합물 26은 분석될 수 있으며, 아데노신 데아미나아제로 처리하여 2'-O-(2-에틸아세틸)구아노신 (화합물 27)으로전환될 수 있다(McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J.,PCT Int. Appl., 85pp.; PIXXD2; 및 WO 94/02501 Al 940203). 표준 보호 절차는 2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 (화합물 28) 및 2N-이소부티릴-6-O-디페닐카르바모일-2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 (화합물 29)을 생성하였으며, 상기 화합물이 환원되어 2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카르바모일-2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 (화합물 30)이 생성되었다. 앞에서 언급한 바와 같이 상기 하이드록실기는 Mitsunobu 반응을 통해 N-하이드록시프탈리미드에 의해 치환되며, 상기 보호된 뉴클레오시드는 일반적인 방법으로 포스피틸화되어 2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카르바모일-2'-O-(2-에틸아세틸) -5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트] (화합물 31)를 생성하였다.
실시예 24
N-(1-하이드록시프탈리미도)-5-헥센 (제9도의 화합물 32)
THF(500mL)에 용해되어 교반된 5-헥산-1-올 용액(20g, 0.2mol)에 트리페닐포스핀(80g, 0.3mol) 및 N-하이드록시프탈리미드(49g, 0.3mol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃로 냉각시켜, 디에틸라지도 카르복실레이트(48mL, 0.3mol)를 1시간 이상에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 상온에서 따뜻한 상태가 되도록 방치하며, 상기 생성된 황색의 용액을 밤새 교반하였다. 그 후 상기 용매는 증발되었고 황색의 오일이 생성되었다. 상기 오일은 CH2Cl2로 용해되었으며 증류수, NaHCO3포화 용액, 그리고 NaCl 포화 용액 순서로 세척되었다. 유기층은 진공 상태에서 농축되어 상기 생성된 오일은 CH2Cl2/에테르 용액에 용해되었고, 될 수 있는 한 많이 Ph3P=O를 결정화하도록 하였다. 정제의 3단계를 거친 후에 본 실시예 화합물은 황색의 윤기있는 고체로 분리되었다(93%의 수율).13NMR: δ 21.94, 24.83, 27.58, 33.26., 78.26, 114.91, 123.41, 128.40, 128.54, 128.63, 134.45 및 163.8 ppm.
실시예 25
N-(1-하이드록시프탈리미도-5,6-헥산-디올) (제9도의 화합물 33)
화합물 32(2.59g, 10mmol), 오스뮴 테트록사이드 수용액(0.15M, 3.6mL, 0.056mmol) 및 N-메틸모폴린-N-옥사이드(2.46g, 21mmol)를 THF(100mL)에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 알루미늄 호일로 싸서 4시간 동안 25℃에서 교반하였다. Tlc는 디올이 형성되었음을 나타내었다. 상기 용매는 증발되었고 그 잔여물은 물과 CH2Cl2로 분리되었다. 상기 유기층은 NaCl 포화용액으로 세척되었고 안하이드러스 MgSO4로 건조되었다. 상기 유기층을 농축시켜 갈색 오일이 생성되었으며,13C NMR에 의해서 분석되었고, 그리고 또 다른 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다.13C NMR : δ 21.92, 28.08, 32.62, 66.76, 71.96, 78.33, 123.43, 128.47, 128.71, 131.93, 132.13, 134.49 및 163.89.
실시예 27
N-1-하이드록시프탈리미도-6-O-디메톡시트리틸-5,6-헥산-디올 (제9도의 화합물 34)
앞 단계를 거친 상기 생성물(3.0g)은 피리딘(2×20mL)과 함께 증발되었고, 피리딘(100mL)에 용해되었다. 디메톡시트리틸 클로라이드(3.5g, 10mmol)을 피리딘(30mL)에 용해시켰고, 30분 이상에 걸쳐 디올에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 4시간 후에, 상기 반응은 메탄올(10mL)로 급냉되었다. 상기 용매는 증발되어, 남은 생성물은 소듐 바이카보네이트 포화 용액과 CH2Cl2(각각 100mL)로 분리되었다. 상기 유기 상(organic phase)은 안하이드러스 MgSO4로 건조되어 농축되었고, 그리고 상기 잔여물은 헥산-에틸 아세테이트-트리에틸 아민(60:39:1)을 이용한 실리카 젤 플래쉬 크로마토그래피 하였다. 분획이 함유된 상기 생성물은 결합되어 진공 상태에서 농축되었고, 그리고 건조되어 황색 거품의 고체가 생성되었다. NMR 분석은 본 발명의 화합물이 순수하고 균일한 디메톡시트리틸화된 고체(5.05g, 83%의 수율)라는 것을 나타내었다.
실시예 28
제9도의 화합물 35
CH2Cl2용매(20mL)에 디이소프로필아민 테트라졸리드(214mg, 1.25mmol) 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미디트(1.3mL, 4.0mmol)을 첨가하여 화합물 34가 포스피틸화되도록 하였다. 상기 용액을 밤새 교반시킨 후에, 상기 용매를 증발시켜, 그 잔여물을 실리카 컬럼에 부착시켰으며 헥산-에틸 아세테이트-트리에틸아민(50:491)로 용출하였다. 상기 적절한 부분이 농축되어 상기 포스피틸화된 화합물 1.61g이 황색의 거품(81%)으로 생성되었다.
실시예 29
CPG에 대한 O-N 링커의 부착 (제10도의 화합물 36)
수시닐화된, 그리고 갭된 CPG는 P. D. Cook 외(미국특허 제5,541,307호)에 의해 개시된 방법에 의해 제조되었다. 화합물 34(0.8mmol), 디메틸아미노피리딘(0.2mmol), 수시닐화되고 갭된 CPG 트리에틸아민 2.0g(160μL) 및 DEC(4.0mmol)을 24시간 동안 함께 흔들어 주었다. 그 후, 펜타클로로페닐 (1.0mmol)이 첨가되었고 상기 생성된 혼합물을 24시간 동안 흔들어 주었다. 상기 CPG 비드는 여과되어, 피리딘(30mL), 디클로로메탄(2×30mL) 및 CH3OH(30mL)로 완전히 세척되었다. 상기 CPG 고체상 지지체는 P2O5로 건조되었고, 그것의 로딩(loading)은 28μmols/g으로 측정되었다.
실시예 30
ON 링커를 이용한 올리고뉴클레오티드의 합성
화합물 35를 이용하여 하기 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
서열 번호 : 1 |
5' XTTTTTTTTTT 3' |
서열 번호 : 2 |
5' X TGC ATC CCC CAG GCC ACC ATT TTT T 3' |
상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트로 합성되었다. 화합물 35는 CH3CN에 용해된 0.1M 용액으로 이용되었다. 상기 ON-링커의 짝지음 효율은 트리틸 색에 의하여 나타난 것에 의하면 95% 이상이었다. 상기 올리고뉴클레오티드는 고체상 컨쥬게이션을 위한 고체상 지지체로 존재하였다.
실시예 31
ON-링커를 이용한 올리고뉴클레오티드에 대한 피리딘의 컨쥬게이션
CPG 내의 올리고뉴클레오티드 서열 번호 : 1(1μmol)을 유리 깔대기 반응기(glass funnel reactor)에 넣고, CH2Cl2/CH3OH(9:1) 내에 5% 메틸하이드라진(5mL)을 첨가하였다. 상기 반응기를 30분 동안 흔들어주었다. 상기 메틸 하이드라진을 유출시킨 후에 CH2Cl2로 세척하고, 상기 메틸 하이드라진 반응을 반복하였다. 비드들을 CH2Cl2와 에테르로 세척한 후 건조시켰다. DMF(5mL)에 용해되어 있는 피렌 부틸산-N-하이드록시 수시미니미드(110mg)을 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후에, 상기 피렌 부틸레이트 용액을 유출시켰고, 상기 올리고뉴클레오티드는 NH4OH 내에서 30분 동안 상온에서 디프로텍션(deprotection) 하였다. 상기 수용액을 여과시킨 후 HPLC 분석을 행하였다. 상기 생성물의 피크(peak)는 34.85분 동안의 보유시간을 가졌고, 다이오드-어레이(diode-array) 분광측정기는 피렌이 흡수되었음을 나타내었다.
실시예 32
올리고뉴클레오티드에 대한 피렌 부틸알데하이드의 컨쥬게이션(서열 번호 : 2)
피렌 부틸알데하이드는 MeNHNH2처리 후에 서열 번호 : 2에 첨가되었다. MeOH에 용해된 NaCNBH3를 그 후에 첨가하였다. CPG의 디프로텍션(deprotection)과 그 후 CPG의 NH4OH 절단에 의해 올리고뉴클레오티드에 대한 피렌의 컨쥬게이션이 이루어졌다.
실시예 33
아르곤이 존재하는 상태하에서 5℃에서 1시간 이상에 걸쳐 안하이드러스 THF(100mL)에 용해된 1,6-헥산-디올 N-하이드록시-프탈리미드(6.525g, 0.039mol) 및 트리페닐포스핀(10.2g, 0.039mol)에 디에틸아지도카르복실레이트(DEAD, 7.83g, 0.045mol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 상기 밝은 황색의 용액은 진공의 상태에서 농축되었으며, 상기 THF는 제거되었고, 그리고 CH2Cl2및 물로 분리되었다. 상기 유기층은 포화 NaHCO3로 세척하였고 포화 NaCl로 세척하였다. 그 후에 안하이드러스 MgSO4로 건조시켰으며 실리카 컬럼에 부착시켰고, EtOAc/헥산(1:1)로 용출시켜 9.8g이 제공되었다. 상기 물질은 Ph3P=O로 오염(contamination)시켜 CH2Cl2/에테르로 재결정화하였다.
실시예 34
제11도 및 제12도
1-헥센-1-올은 CH2Cl2에 용해된 이미다졸/TBDPS-Cl을 이용하여 실릴화(sylylate)하였다. 그 후 화합물 37은 화합물 38이 제조되도록 (화합물 33을 위한 실시예 25와 같이) OSO4/NMMO로 디하이드록실화 되었다. 화합물 38은 제1 알콜 기능기가 디메톡시트리틸화되어 화합물 39가 제조되었다. N-하이드록시-프탈리미드와 함께 Mitsunobu 반응을 이용하여 화합물 40이 제조되었다. 화합물 40은 TBAF(테트라부틸 암모늄 플루오라이드, THF내의 1M)로 디실릴화(desylylate)가 이루어졌다.
실시예 35
2,6,9-(β-D-리보푸라노실)퓨린(5.64g, 20mmol)을 아르곤이 존재하는 상태하에서 DMF 100mL에 용해되어 있는 헥산으로 미리 세척한 오일 내의 60% 소듐 하이드라이드 800mg의 현탁액에 첨가시켰다. 1시간 동안 상온에서 교반시킨 후에, 알릴브로마이드(2mL, 1.1eq)를 상기 용액에 첨가시켜 밤새 상온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물은 증발되었고 실리카 젤 컬럼에 부착되었으며 1% 트리에틸아민을 함유한 CH2Cl2/CH3OH(20:1)로 용출되었다. 2' 및 3' O-알릴 화합물의 전체 수율은 5.05g(77%)이었다. 2' 및 3' 이소머의 혼합물은 많은 양의 수율을 갖는 MeOH에 용해된 DMF DMA의 처리에 의해서 엑소시클릭 아민 보호되었다. 그 후 상기 물질은 5'-O-디메톡시트리틸화 되어 5'-O-디메톡시트리틸-N-2-포름아미딘-2'-O- (2-하이드록시 에틸)-구아노신 및 5'-O-디메톡시트리틸-N-2-포름아미딘-3'-O-(2-하이드록시에틸)구아노신이 각각 2:1의 비율을 갖는 혼합물이 생성되었다. 상기 최종 화합물은 실리카 젤 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
실시예 36
2,6 디아미노-9-(β-D-리보푸라노실)퓨린(282mg, 1mmol)을 안하이드러스 DMF 5mL에 용해되어 있는 헥산으로 미리 세척한 오일 내의 60%의 소듐 하이드라이드 현탁액 40mg에 첨가하였다. 상기 용액에 2-(브로모에톡시)-t-부틸-디메틸 실란(220mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 밤새 상온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물은 증발되어 오일이 생성되었으며, 상기 오일은 물과 에틸아세테이트로 분리되었다. 상기 유기층은 Na2SO4로 건조되었다. 상기 반응 혼합물은 정제되어 실리카 젤 상에서 2' 및 3' 이소머가 생성되었다. 상기 2'-물질은 DMF DMA로 아민이 보호되고 5'-디메톡시트리틸화 되어서, 5'-O-디메톡시트리틸-N-2-포름아미딘-2'-O-(2-TBDMS-하이드록시에틸)구아닌이 생성되었다.
실시예 37
올리고뉴클레오티드 합성
비치환된, 그리고 치환된 올리고뉴클레오티드들은 요오드에 의해 산화되는 표준 포스포아미디트 캐미스트리를 이용한 DNA 자동 합성기(Applied Biosystems model 380B)에서 합성되었다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표준 산화 용기는 포스파이트 결합의 티에이션 과정을 위하여 아세토니트릴에 용해되어 있는 3H-1,2-벤조디티올-3-원-1,1-디옥사이드 0.2M 용액으로 채워졌다. 상기 티에이션 대기 과정은 68초까지 계속되었으며, 캡핑 과정이 뒤이어졌다. CPG 컬럼을 통해, 그리고 55℃에서 (18시간 동안) 농축된 암모니움 하이드록시드에서 디블러킹(deblocking)된 후에, 상기 올리고뉴클레오티드는 0.5M NaCl 용액으로부터 에탄올 2.5 volume으로 두 번 침전되어 정제되었다. 분석 젤 전기영동을 20% 아크릴아마이드, 8M 우레아 및 454mM 트리스-보레이트 완충액으로 pH 7에서 행하였다. 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트는 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 통해 80% 이상의 전장(full-length) 물질임이 분석되었다.
실시예 38
CPG 지지체에 결합된 뉴클레오시드의 5'-하이드록실에 2'-데옥시-2'-치환된 5'-디메톡시트리페닐메틸 리보뉴클레오시드가 부착하는 일반 절차
상기 올리고뉴클레오티드의 말단 3'-위치에 있을 상기 2'-데옥시-2'-치환된 뉴클레오시드는 5'-DMT기로 보호되었으며(시토신 및 아데닌 엑소시클릭 아미노 기는 벤졸화 되었으며, 구아닌 아미노는 이소부틸화 되었다), 5시간 동안 50℃에서 피리딘 및 디메틸아미노피리딘에 용해되어 있는 트리플루오로아세트산/브로모아세트산혼합된 안하이드라이드로 처리되었다. 상기 용액은 감소된 압력 하에서 증발되었으며, 에틸 아세테이트에 용해되었고, 그리고 실리카 젤 컬럼에 통과시킨 결과 묽은 시럽으로 생성되었다. 균일한 분획이 수집되었고, 증발되어 건조되었다. 아세토니트릴 10mL 용액, 3'-O-브로모에틸에스테르-변형된 뉴클레오시드 10μM 및 피리딘/디메틸아미노피리딘(1:1) 1mL를 자유 5'-하이드록시기를 제공하는 표준 조건에 따라 전처리된 CPG 티미딘(Applied Biosystems, Inc) 1μM로 천천히(60 내지 90초 동안) 세척하였다. 다른 뉴클레오시드-결합된 CPG 컬럼들도 이용될 수 있다. 상기 용출물을 수집하여 상기 컬럼을 통해 다시 세척하였다. 상기 과정을 세 번 반복하였다. 상기 CPG 컬럼은 아세토니트릴 10mL로 천천히 세척되었고, 그 후 ABI 380B 핵산 합성기에 부착되었다. 이렇게 올리고뉴클레오시드 합성이 개시되었다. CPG 지지체로부터 티미딘 에스테르 결합을 절단하는 농축된 암모니움 하이드록시드 디프로텍션의 표준 조건은 CPG 뉴클레오시드에 초기에 결합된 티미딘에 피리미딘 변형된 뉴클레오시드를 연결시키는 3',5' 에스테르 결합을 절단하는 것이다. 이러한 방법으로, 헤테로사이클(heterocycle) 및/혹은 당 내의 변형을 갖는 모든 2'-치환된 뉴클레오시드 혹은 일반적인 모든 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 부착시킬 수 있다.
실시예 39
2'-치환된 뉴클레오티드를 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 합성
A. ABI 합성기
1-[2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-β-D-리보푸라노실]티민을 갖는 올리고뉴클레오티드 염기서열은 이중-짝지음(duoble-coupling)과 함께 포스포아미디트 캐미스트리를 이용한 ABI 380B에서 합성되었다. 2'-O-아미노옥시에톡시 포스포아미디트는 0.08M 농도로 개시되었으며, 아세토니트릴에 용해된 10% tert-부틸 페록사이드가 옥시다이저(oxidizer)로 이용되었다. 데옥시 포스포아미디트는 0.2M로 이용되었다. 2'-O-아미노옥시에톡시 및 데옥시 아미디트의 최종 농도는 각각 0.04M 및 0.1M이었다. 상기 올리고뉴클레오티드는 CPG 지지체로부터 절단되었으며, 상기 염기 보호기는 6시간 동안 55℃에서 농축된 암모니아를 이용하여 제거되었다. 상기 올리고뉴클레오티드는 Sephadex G25의 사이즈 익스클루젼 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 정제되었다. 데옥시 포스포아미디트는 Perseptive Biosystems GmbH에서 구입하였다.
서열 번호 : 6 |
CCT GTA CCt TTC CGG TCCLRMS(ES-)m/z: calcd : 5453.2; found: 5453.5 |
서열 번호 : 8 |
CTC GTA Ctt ttC CGG TCCLRMS(ES-)m/z: calcd : 5693.2; found: 5692.9 |
서열 번호 : 12 |
GCG ttt ttt ttt tGC GLRMS(ES-)m/z: calcd : 5625.7; found: 5625.9 |
B. Expedite 합성기
1-[2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-β-D-리보푸라노실)-6-N-벤조일-티민을 갖는 올리고뉴클레오티드는 Expedite 8690 합성기를 통해 합성되었다. 아미디트 130mg을 건조한 CH3CN(1.3mL, 약 0.08M)에서 용해시켰다. CH3CN에 용해된 10% t-BuOOH를 산화제로 사용하였다. 증가된 짝지음 및 대기 시간은 10분이었으며, 산화가 이루어졌다. 우수한 짝지음 효율(98% 이상)을 가지며 상기 올리고뉴클레오티가 합성되었다. 올리고뉴클레오티드는 정제되었고, 상기의 염기서열이 밝혀졌다.
올리고뉴클레오티드 |
염기 서열 |
서열 번호 |
Ⅴ |
CTC GTA CCa TTC CGG TCC |
13 |
Ⅵ |
GGa CCG Gaa GGT aCG aG |
14 |
Ⅶ |
aCC GaG GaT CaT GTC GTa CGC |
15 |
상기 a는 1-[2'-O-(2-아미노옥시에틸)-β-D-리보푸라노실]아데노신을 의미한다.
실시예 40
중심 2'-데옥시 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 영역 측면에 접하는 2'-치환된 올리고뉴클레오티드 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드
상기 서열 5'GCGTTTTTTTTTTGCG3'(서열 번호 : 3)의 15량체 RNA 표적은 RNA 프로토콜을 이용하여 DNA 상에서 일반적인 방법으로 제조하였다. 2'-데옥시 영역 측면에 위치한 2'-O-치환된 뉴클레오티드를 갖는 일련의 상보적인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들은 이미 잘 알려진 제조 방법 또는 국제출원공개 제WO92/03568호(1992. 3. 5 공개)에서 개시하고 있는 방법에 의해 제조된 2'-O-치환된 뉴클레오티드 전구물질(즉, 2'-O-메틸)을 이용하여 제조되었다. 상기 2'-O-치환된 뉴클레오티드는 상기 DNA 합성기 상에서 보통의 방법으로 5'-O-디메톡시트리틸-3'-포스포아미디트와 같이 첨가되었다. 상기 상보적인 올리고뉴클레오티드는 5'CGCAAAAAAAAAAAAACGC3'(서열 번호 : 4)의 서열을 갖는다. 상기 2'-O-치환체는 상기의 올리고뉴클레오티드의 CGC 및 CG 영역에 위치한다. 여기에서 사용된 상기 2'-O-치환체는 2'-아미노옥시에틸, 2'-O-에틸아미노옥시에틸 및 2'-디메틸아미노옥시에틸이었다.
실시예 41
잡종화 분석
A. 2'-변형된 올리고뉴클레오티드의 잡종화에 대한 열역학 측정
상보적인 RNA 혹은 DNA 서열에 잡종화되는 상기 2'-변형된 올리고뉴클레오티드의 능력은 열 용융 분석에 의해 측정되었다. 상기 RNA 상보체는 T7 RNA 폴리머라아제로부터 합성되었으며, DNA 주형-프로모터는 Applied Biosystems, Inc. 380B로 합성되었으며, RNA 종들은 FPLC(LKB Pharmacia, Inc)를 이용한 이온 교환에 의해 정제되었다. 자연적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 혹은 특이한 위치에서 2'-변형을 포함하는 상기의 것은 화학양론적인 농도에서 RNA 혹은 DNA 상보체에 첨가되며, 랜덤 코일 전위(random coil transition)를 위해 이중 구조 상에서의 흡광(20nm) 감소성(absorbance hyperchromicity)은 Gilford Response Ⅱ 분광 광도계를 이용하여 측정되었다. 상기 측정은 10mM Na-포스페이트 완충액, pH 7.4 및 NaCl을 이용하여 행해졌으며, 0.1M 혹은 1.0M의 이온강도 10으로 측정되었다. 데이터는 1/Tm에 대한 ln(Ct)의 도식 표현으로 분석되었고, 여기에서 (Ct)는 전체 올리고뉴클레오티드 농도이다. 형성된 이종이중 구조의 안정성과 관련된 정보에 근거하여, 올리고뉴클레오티드 내로 변형된 피리미딘이 배치되는 것은 나선구조의 안정성에 영향을 미치는 것으로 평가된다. 상기 잡종의 안정성을 극적으로 변화시킨 변형은 자유 에너지(델타 G)에 있어서의 감소를 나타내었으며, 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 유용성이 있는 것으로 결정되었다.
하기 표 1과 같이, 올리고뉴클레오티드 내에 결합되는 본 발명의 2'-치환된 뉴클레오시드는 변형된 올리고뉴클레오티드 가닥(안티센스 가닥) 및 상기의 것에 상보적인 RNA 가닥(센스 가닥)의 이중 구조 안정성을 상당히 증가시키는 결과를 가져올 수 있다. 상기 이중 구조의 안정성은 증가된 안티센스 가닥 내의 2'-치환된 뉴클레오시드의 수를 증가시켰다. 표 1에서 증명되는 바와 같이, 2'-치환된 뉴클레오시드의 첨가는 상기 올리고뉴클레오티드 서열 내의 각각의 올리고뉴클레오시드의 위치 혹은 뉴클레오시드에 관계 없이, 이중 구조의 안정성을 증가시켰다.
표 1에서는, 드문 경우에 뉴클레오시드는 본 발명의 치환체를 포함하는 뉴클레오시드를 나타낸다.
서열 번호 |
염기 서열 |
5 |
CTC GTA CCT TTC CGG TCC |
6 |
CTC GTA CCt TTC CGG TCC |
7 |
CTC GTA CTT TTC CGG TCC |
8 |
CTC GTA Ctt ttC CGG TCC |
9 |
GCG TTT TTT TTT TGC G |
10 |
GCG ttt ttt ttt tGC G |
11 |
GCG TTT TTT TTT TGC G* |
12 |
GCG ttt ttt ttt tGC G* |
13 |
CTC GTA CCa TTC CGG TCC |
14 |
GGa CCG Gaa GGT aCG aG |
15 |
aCC GaG GaT CaT GTC GTa CGC |
t = 1-[2'-O-(2-아미노옥시에틸)-β-D-리보푸라노실]티민
a = 1-[2'-O-(2-아미노옥시에틸)-β-D-리보푸라노실]아데노신
*= 센스 가닥으로 DNA에 대해 잡종화된 것
서열 번호 |
subs. |
Tm(℃) |
ΔTm(℃) |
ΔTm(℃)/sub. |
5 |
0 |
65.2±0.0 |
|
|
6 |
1 |
64.8±0.1 |
-0.5±0.1 |
-0.5±0.1 |
7 |
0 |
61.5±0.0 |
|
|
8 |
4 |
65.6±0.4 |
4.1±0.4 |
1.0±0.1 |
9 |
0 |
48.2±0.6 |
|
|
10 |
10 |
60.0±0.0 |
11.9±0.7 |
1.19±0.07 |
11 |
0 |
53.5±0.1 † |
|
|
12 |
10 |
44.0±0.2 † |
-9.4±0.3 † |
-0.94±0.03 † |
표 1이 증명하는 바와 같이, 본 발명의 2'-치환체를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 RNA로 형성된 상기 이중 구조는 열역학적 안정성을 갖으며 잡종화되는 것으로 측정된 것으로 결합 안정성이 증가되는 것을 볼 수 있다. 이론에 부합되기를 원치는 않지만, 결과적으로 본 발명의 2'-치환체의 존재로 인하여 상기 2'-치환된 뉴클레오시드의 당 부분에 3'-엔도 구조가 존재함이 실질적으로 가정될 수 있으며, 상기 올리고뉴클레오티드-RNA 구조도 A-타입 나선 구조라는 것을 가정할 수 있다.
실시예 42
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-O2-2'-안하이드로-5-메틸루리딘 (화합물 101)
O2-2'-안하이드로-5-메틸루리딘(Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0g, 0.416mmol), 및 디메틸아미노피리딘(0.66g, 0.013eq, 0.0054mmol)을 상온에서 아르곤이 존재하는 상태하에서 기계적인 교반작용과 함께 건조한 피리딘(500ml)에 용해시켰다. tert-부틸디페닐클로로실란(125.8g, 119.0mL, 1.1eq, 0.458mmol)이 한 부분에 첨가되었다. 상기 반응은 상온에서 16시간 동안 교반작용과 함께 이루어졌다. Tlc(Rf 0.22, 에틸 아세테이트)는 완벽하게 반응되었음을 나타내었다. 상기 용액은 감소된 압력 하에서 농축되었고, 진한 오일을 형성하였다. 상기 오일은 디클로로메탄(1L), 포화된 소듐 바이카보네이트(2×1L) 및 소금물(1L)로 분리되었다. 상기 유기층은 소듐 설페이트로 건조되었으며, 감소된 압력 하에서 농축되어 진한 오일이 생성되었다. 상기 오일을 에틸 아세테이트 및 에틸 에테르(600mL)의 1:1 혼합물에 용해시켰고 상기 용액을 -10℃에서 냉각시켰다. 합성된 결정성 생성물(crystalline product)은 여과되어 수집되어 에틸 에테르(3×200mL)로 세척되었고, 그리고 건조되어서(40℃, 1mmHg, 24시간) 149g(74.8%)의 하얀 고체로 생성되었다. 순순한 화합물로 Tlc 및 NMR을 행하였다.
실시예 43
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-(2-하이드록시에틸)-5-메틸루리딘 (화합물 102)
2L 스테인레스 스틸 비-교반 압력 반응기 내에 테트라하이드로퓨란(1.0M, 2.0eq, 622mL)에 용해되어 있는 보란을 첨가하였다. 연기 후드 내에서 수동 교반 작용과 함께, 에틸렌 글리콜(350mL를 초과하는 양)이 수소 가스의 분출이 가라앉을 때까지 초기에 조심스럽게 첨가되었다. 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-O2-2'-안하이드로-5-메틸루리딘(149g, 0.311mol) 및 소듐 바이카보네이트(0.074g, 0.003eq)를 수동으로 교반하면서 첨가하였다. 상기 반응기는 봉합되었고 오일 배스 안에서 상기 배스 내부의 온도가 160℃에 다다를 때까지 가열되었으며, 16시간 동안(100psig 이하로) 계속되었다. Tlc(바람직한 생성물의 Rf는 0.69이며 ara-T 부산물(side product)의 Rf는 0.82임, 에틸 아세테이트)는 상기 생성물로 70% 전환된 것을 나타내었다. 추가적인 부산물의 형성을 방지하기 위하여, 상기 반응을 정지하였으며, 에틸렌 글리콜을 제거하기 위해 이용된 더욱 극한 조건과 함께 워터 배스(40 내지 100℃) 내에서 감소된 압력(10 내지 1mmHg)으로 농축되었다. (선택적으로, 낮은 온도에서 끓는 용매가 제거되자마자, 상기 잔류 용액은 에틸 아세테이트 및 물로 분리될 수 있다. 상기 생성물은 유기상으로 존재한다.) 상기 잔여물은 컬럼 클로마토그래피(2kg 실리카 젤, 에틸 아세테이트-헥산 구배(1:1 내지 4:1))에 의해 정제되었다. 상기 바람직한 분획들은 화합된 후 분해되고, 그리고 건조되어 하얗고 파삭파삭한 거품(84g, 50%), 오염된 출발물질(17.4g) 및 순수하여 재사용이 가능한 출발물질 20g을 생성하였다. 덜 순수하게 재생된 출발물질의 수율은 58%이었다. 99% 순수한 생성물로 Tlc 및 NMR을 행하였다. NMR(DMSO-d6) d 1.05(s, 9H, t-부틸), 1.45(s, 3H, CH3), 3.5-4.1(m, 8H, CH2CH2, 3'-H, 4'-H, 5'-H, 5''-H), 4.25(m, 1H, 2'-H), 4.80(t, 1H, CH2O-H), 5.18(d, 2H, 3'-OH), 5.95(d, 1H, 1'-H), 7.35-7.75(m, 11H, Ph 및 C6-H), 11.42(s, 1H, N-H).
실시예 44
2'-O-[(2-프탈리미독시)에틸]-5'-t-부틸디페닐실릴-5-메틸루리딘 (화합물 103)
뉴클레오시드 102(20g, 36.98mmol)는 트리페닐포스핀(11.63g, 44.36mmol) 및 N-하이드록시프탈리미드(7.24g, 44.36mmol)로 혼합되었다. 40℃에서 이틀 동안 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조하였다. 상기 반응은 아르곤으로 상승되었고, 건조한 THF(369.8mL, 확실히 봉합된 용기에 들어 있는 상태로 Aldrich로부터 구입하였음)가 첨가되어 투명한 용액이 되었다. 디에틸-아조디카르복실레이트(6.98mL, 44.36mmol)를 상기 반응 혼합물에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 상기 첨가로 인하여 매우 빨간 색깔이 다음 방울을 첨가하기 바로 전에 변색될 때까지 계속된다. 상기 첨가가 완결된 후에, 상기 반응은 4시간 동안 교반작용과 함께 이루어졌다. Tlc는 상기 반응이 완결됨을 보여주었다(에틸아세테이트:헥산 = 60:40). 상기 용매는 진공 상태에서 증발되었다. 생성된 잔여물은 플래쉬 컬럼에 부착되어 에틸 아세테이트:헥산(60:40)으로 용출되었으며, 하얀 거품의 화합물 103(21.819, 86%)을 제공하였다. Rf 0.56(에틸 아세테이트:헥산 = 60:40). MS(FAB-)m/e684(M-H+).
실시예 45
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-[(2-포름아독시미노옥시)에틸]-5-메틸루리딘 (화합물 104)
화합물 103(3.1g, 4.5mmol)을 건조한 CH2Cl2(4.5mL)에 첨가하였고, 메틸하이드라진(300mL, 4.64mmol)을 -10 내지 0℃에서 한 방울씩 첨가하였다. 1시간 후에 상기 혼합물이 여과되었으며, 상기 여과물은 차가운 얼음 상태의 CH2Cl2로 세척되었고, 그리고 결합된 유기상은 물과 소금물로 세척되었으며 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었다. 상기 용액이 농축되었고 2'-O-(아미노옥시에틸)티미딘이 생성되었으며, 상기 생성물은 그 후 MeOH(67.5mL)에 용해되었다. 포름알데하이드(20% 수용액, w/w, 1.1eq)는 1시간 동안 상기 반응물에 첨가되었다. 용매는 진공 상태에서 제거되었으며, 잔여물은 크로마토그래피되어 화합물 104는 하얀 거품(1.95, 78%)으로 생성되었다. Rf 0.32(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). MS(Electrospray-)m/e566 (M-H+).
실시예 46
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-[N,N-디메틸아미노옥시에틸]-5-메틸루리딘 (화합물 105)
화합물 104(1.77g, 3.12mmol)을 건조한 MeOH(30.6mL)에 용해되어 있는 1M 피리디늄 p-톨루엔설포네이트(PPTS) 용액에 용해시켰다. 소듐시아노보로하이드라이드(0.39g, 6.13mmol)을 10℃의 불활성 상태하에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 10℃에서 10분 동안 교반하되었다. 상기 반응 용기는 아이스 배스(ice bath)로부터 제거되었으며 2시간 동안 상온에서 교반되었고, 그리고 상기 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)에 점검되었다. NaHCO3수용액(5%, 10mL)을 첨가하였고 에틸 아세테이트(2×20mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 상은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 증발되었다. 잔여물은 MeOH(30.6mL)에 용해된 1M PPTS의 용액에 용해되었다. 포름알데하이드(20% w/w, 30mL, 3.37mmol)를 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 10분 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물은 아이스 배스에서 10℃로 냉각되었으며, 소듐시아노보로하이드라이드(0.39g, 6.13mmol)를 첨가하였고 상기 혼합물은 10분 동안 10℃에서 교반되었다. 10분 후에, 상기 반응 혼합물은 아이스 배스에서 제거되었고 2시간 동안 상온에서 교반되었다. 상기 반응 혼합물에 5% NaHCO3(25mL) 용액을 첨가하였고, 에틸 아세테이트(2×25mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고, 건조한 상태가 되도록 증발되었다. 상기 생성된 잔여물은 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH로 용출되었고, 그리고 하얀 거품 상태의 화합물105(14.6g, 80%)이 생성되었다. Rf 0.35(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). Ms(FAB+)m/e584 (M+H+).
실시예 47
2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸루리딘 (화합물 106)
트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(3.91mL, 24.0mmol)를 건조한 THF 및 트리에틸아민(1.67mL, 12mmol, KOH로 건조하게 보관된)에 용해시켰다. 트리에틸아민-2HF의 혼합물은 화합물 105(1.40g, 2.4mmol)에 첨가되었고, 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)에 의해 점검되었다. 용매는 진공 상태하에서 제거되었고, 잔여물을 플래쉬 컬럼에 부착시켜 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출시켜 화합물 106(766mg, 92.5%)을 생성하였다. Rf 0.27(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). Ms(FAB+)m/e346 (M+H+).
실시예 48
5'-O-DMT-2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸루리딘 (화합물 107)
화합물 106(750mg, 2.17mmol)을 40℃에서 밤새 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조시켰다. 그 후, 안하이드러스 피리딘(20mL)과 함께 증발시켰다. 상기에서 생성된 잔여물은 아르곤이 존재하는 상태하에서 피리딘 (11mL)에 용해되었다. 4-디메틸아미노피리딘(26.5mg, 2.60mmol) 및 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(880mg, 2.60mmol)를 상기 혼합물에 첨가시키고 상기 반응 혼합물을 출발물질이 모두 제거될 때까지 상온에서 교반시켰다. 피리딘은 진공상태에서 제거되었으며, 상기 잔여물은 크로마토그래피로 정제되었고, 그리고 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출시켜 화합물 107(1.13g, 80%)을 생성하였다. Rf 0.44(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH). Ms(FAB+)m/e648 (M+H+).
실시예 49
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸루리딘-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트] (화합물 108)
화합물 107(1.08g, 1.67mmol)은 톨루엔(20mL)과 함께 증발되었으며, 상기 잔여물에 N,N-디이소프로필아민 테트라조니드(0.29g, 1.67mmol)를 첨가하였으며 40℃의 높은 진공 상태에서 밤새 P2O5로 건조시켰다. 그 후, 안히이드러스 아세토니트릴(8.4mL)에 용해되었으며, 2-시아노에틸-N,N,N1,N1-테트라이소프로필포스포아미디트(2.12mL, 6.08mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 불활성 상태하에서 4시간 동안 상온에서 교반되었다. Tlc(헥산: 에틸 아세테이트 = 1:1)로 상기 반응이 점검되었다. 상기 용매는 증발되었으며 그 후 상기 잔여물은 에틸 아세테이트(70mL)에 용해되었고, NaHCO3(40mL) 5% 수용액으로 세척되었다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었으며 농축되었다. 생성된 잔여물에 크로마토그래피(에틸 아세테이트로 용출된)를 행하였고, 그리고 화합물 108(1.04g, 74.9%)을 생성하였다. Rf 0.25(에틸 아세테이트:헥산 = 1:1).32P NMR(CDCl3) δ 150.8ppm; MS(FAB+)m/e848 (M+H+).
실시예 50
2'/3'-O-알릴 아데노신 (화합물 109)
아데노신(20g, 74.84mmol)을 이틀 동안 40℃의 진공 상태하에서 밤새 P2O5로 건조시켰다. 그 후 불활성 상태하에서 DMF에 현탁시켰다. 소듐 하이드라이드(2.5g, 74.84mmol, 미네랄 오일의 60% 분산)를 10분 동안 상온에서 교반시켰다. 그 후 알릴 브로마이드(7.14mL, 82.45mmol)을 한 방울씩 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 밤새 상온에서 교반하였다. DMF를 진공 상태하에서 제거하고 잔여물은 에틸 아세테이트(100mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층을 가만히 따라냈다. 여기에서 얻어진 여과물은 생성물을 포함하였다. 그 후 플래쉬 컬럼에 부착시켰으며, 그리고 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출시켜 화합물 109(15.19g, 66%)를 생성하였다. Rf 0.4, 0.4a(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH).
실시예 51
2'/3'-O-알릴-N6-벤조일 아데노신 (화합물 110)
화합물 109(15.19g, 51.1mmol)을 40℃에서 밤새 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조시켰다. 그 후, 불활성 상태하에서 안하이드러스 피리딘(504.6mL)에 용해시켰다. 트리메틸클로로실란(32.02mL, 252.3mmol)을 0℃에서 첨가하였고, 상기 반응 혼합물을 불활성 상태하에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음 벤졸 클로라이드(29.4mL, 252.3mmol)를 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 상기 벤졸 클로라이드를 첨가시킨 후, 상기 반응 혼합물은 상온에서 4시간 동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물을 0℃의 아이스 배스 내에 두었다. 증류수(100.9mL)를 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 30분 동안 교반시켰다. 그 다음 NH4OH(100.0mL, 30% 수용액, w/w)를 첨가하였고, 상기 반응 혼합물이 0℃에서 유지되도록 하였으며 1시간 더 교반시켰다. 용매는 증발되었으며, 잔여물은 물과 에테르로 분리되었다. 생성물이 오일로 침전되었으며, 상기의 것은 그 후 크로마토그래피(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)로 정제되어 화합물 13의 하얀 거품(12.67g, 62%)으로 생성되었다.
실시예 52
3'-O-알릴-5'-tert-부틸디페닐실릴-N6-벤조일-아데노신 (화합물 111)
화합물 110(11.17g, 27.84mmol)을 40℃에서 밤새 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조시킨 후 건조한 CH2Cl2(56mL, Aldrich로부터 구입한 완전히 밀봉된)에 용해시켰다. 4-디메틸아미노피리딘(0.34g, 2.8mmol), 트리에틸아민(23.82mL, 167mmol)및 t-부틸디페닐실릴 클로라이드를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 12시간 동안 매우 격렬하게 교반하였다. 반응은 Tlc(에틸 아세테이트:헥산 = 1:1)에 의해서 점검되었다. 그 후 CH2Cl2(50mL)로 희석되었으며 증류수(3×30mL)로 세척되었다. 디클로로메탄 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었으며 증발되었다. 잔여물은 플래쉬 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산 = 1:1)에 의해 정제되어 화합물 111을 하얀 거품(8.85g, 49%)으로 생성하였다. Rf 0.35 (에틸 아세테이트:헥산 = 1:1).
실시예 53
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-N6-벤조일-2'-O-(2,3-디하이드록시프로필)-아데노신 (화합물 112)
화합물 111(5.5g, 8.46mmol) 및 4-메틸모폴린 N-옥사이드(1.43g, 12.18mmol)을 다이옥산(45.42mL)에 용해시켰다. OSO44% 수용액(1.99mL, 0.31mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 광선으로부터 보호되어 3시간 동안 교반되었다. 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)에 의해서 점검되었다. 에틸 아세테이트(100mL)를 첨가하였으며 상기 반응 혼합물을 증류수(1×50mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었으며 증발되었고 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. Rf 0.17 (CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH).
실시예 54
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-N6-벤조일-2'-O-(포르밀메틸)-아데노신 (화합물 113)
화합물 112(5.59g, 8.17mmol)을 건조한 CH2Cl2(40.42mL)에 용해시켰다. 상기의 것에 실리카 젤에 흡착된 NaIO4(Ref. J. Org. Chem. 1997, 62, 2622-2624)(16.34g, 2g/mol)을 첨가하였고, 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)에 의해서 점검되었다. 반응 혼합물은 여과되었고, 상기 여과물은 CH2Cl2로 완전하게 세척되었다. 디클로로메탄 층은 증발되어 알데하이드 화합물 113(5.60g)이 생성되었고, 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다. Rf 0.3 (CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH).
실시예 55
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-N6-2'-O-(2-하이드록시에틸)아데노신 (화합물 114)
화합물 113(5.59g, 8.50mmol)을 안하이드러스 MeOH(85mL)에 용해되어 있는 1M 피리디늄 p-톨루엔설포네이트 용액에 용해시켰다. 반응 혼합물은 수분으로부터 보호되었다. 소듐시아노보로하이드라이드(1.08g, 17.27mmol)을 첨가하였고 반응혼합물을 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)에 의해서 점검되었다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트(150mL)로 희석되었으며, NaHCO3(75mL) 및 소금물(75mL)로 세척되었다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 NaSO4로 건조되어 증발되었다. 여과물은 플래쉬 크로마토그래피(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)에 의해 정제되었으며 화합물 114(4.31g, 77.8%)가 제조되었다. Ms(FAB+)m/e655 (M+H+), 677 (M+Na+).
실시예 56
5'-tert-부틸디페닐실릴-N6-벤조일-2'-O-(2-프탈리미도옥시에틸)아데노신 (화합물 115)
화합물 114(3.22g, 4.92mmol)를 트리페닐포스핀(1.55g, 5.90mmol) 및 N-하이드록시프탈리미드(0.96g, 5.90mmol)로 혼합하였다. 40℃에서 이틀 동안 진공 상태하에서 P2O5로 건조시켰다. 불활성 상태하에서 안하이드러스 THF(49.2mL)에 건조된 혼합물을 용해시켰다. 디에틸 아조디카르복실레이트(0.93mL, 5.90mmol)를 한 방울씩 첨가하였다. 상기 첨가로 인하여 매우 빨간 색깔이 다음 방울을 첨가하기 바로 전에 변색될 때까지 계속된다. 상기 첨가가 완결된 후에, 상기 반응은 4시간 동안 교반작용과 함께 이루어졌다. Tlc는 상기 반응이 완결됨을 보여주었다(에틸아세테이트:헥산 = 70:30). 상기 용매는 진공 상태에서 제거되었고 상기 잔여물은 에틸아세테이트(75mL)에 용해되었다. 상기 에틸 아세테이트 층은 증류수(75mL)로 세척된 후, Na2SO4로 건조되었으며 농축되어, 크로마토그래피(에틸아세테이트:헥산 = 70:30)를 통하여 정제하였고, 그 결과 화합물 115(3.60, 91.5%)가 생성되었다. Rf 0.27(에틸 아세테이트:헥산 = 7:3). MS(FAB+)m/e799 (M+H+), 821 (M+Na+)
실시예 57
5'-O-tert-부틸디페닐실릴-N6-벤조일-2'-O-(2-포름알독시아미노옥시에틸)아데노신 (화합물 116)
화합물 115(3.5g, 4.28mmol)를 CH2Cl2(43.8mL)에 용해시켰다. N-메틸하이드라진(0.28mL, 5.27mmol)을 -10℃에서 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 -10℃ 내지 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)에 의해서 점검되었다. 형성된 하얀 침전물은 여과되었고, 상기 여과물은 매우 차가운 상태의 CH2Cl2로 완전하게 세척되었다. 디클로로메탄 층은 25℃ 이하에서 로타베이퍼(rotavapor)의 워터 배스 온도를 유지하면서 로타베이퍼 상에서 증발되었다. 잔여물은 MeOH(65.7mL)에 용해되었다. 포름알데하이드(710mL, 4.8mmol, 증류수에 용해된 20% 수용액)를 첨가하였고 상기 반응 혼합물은 1시간 동안 상온에서 교반되었다. 반응 혼합물은1H NMR에 의해 점검되었다. 반응 혼합물은 농축되었고크로마토그래피(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)로 정제하여, 하얀 거품 상태의 화합물 116(2.47g, 83%)을 생성하였다. Rf 0.37(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). Ms(FAB+)m/e681 (M+H+).
실시예 58
5'-tert-부틸디페닐실릴-N6-벤조일-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)아데노신 (화합물 117)
화합물 116(2.2g, 3.23mmol)을 MeOH(32mL)에 용해되어 있는 1M 피리디늄 p-톨루엔설포네이트(PPTS) 용액에 용해시켰다. 반응은 수분으로부터 보호되었다. 소듐 시아노보로하이드라이드(0.31g)을 10℃에서 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 10℃에서 10분 동안 교반시켰다. 그 다음 상온에서 보관한 후, 2시간 동안 교반하였고, 상기 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)에 점검되었다. 소듐바이카보네이트 5% 수용액(100mL)을 첨가하였고 에틸 아세테이트(3×50mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 증발되었다. 잔여물은 MeOH에 용해되어 있는 1M PPTS 용액(32mL)에 용해되었다. 포름알데하이드(0.54mL, 3.55mmol, 20% 수용액)를 첨가하였고 상기 반응 혼합물은 10분 동안 상온에서 교반되었다. 소듐 시아노보로하이드라이드(0.31g)를 10℃에서 첨가하였고 10℃에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음 상기 반응 혼합물을 아이스 배스로부터 제거하였고2시간 동안 상온에서 교반시켜, Tlc(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)에 의해서 점검하였다. 반응 혼합물은 NaHCO35% 수용액(100mL)으로 희석되었고 에틸 아세테이트(3×50mL)로 추출되었다. 에틸 아세테이트 층은 건조되어 증발되었고, 크로마토그래피(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)로 정제하였으며, 그 결과 화합물 117(1.9g, 81.8%)이 생성되었다. Rf 0.29(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). Ms(FAB+)m/e697 (M+H+), 719 (M+Na+).
실시예 59
N6-벤조일-2'-O-(N,N-디메틸아미노옥시에틸)아데노신 (화합물 118)
안하이드러스 THF(10mL)에 용해된 Et3N-3HF(1.6g, 10mmol) 용액에 트리에틸아민(0.71mL, 5.12mmol)을 첨가하였다. 그 후, 상기 혼합물을 화합물 117(0.72g, 1mmol)에 첨가하였고 24시간 동안 상온의 불활성 상태하에서 교반하였다. 반응은 Tlc(CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH)에 의해서 점검되었다. 용매는 진공 상태하에서 제거되었고 상기 잔여물에 크로마토그래피(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH)를 하여, 화합물 118(0.409g, 89%)을 생성하였다. Rf 0.40(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH). Ms(FAB+)m/e459 (M+H+).
실시예 60
5'-O-디메톡시트리틸-N6-벤조일-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)아데노신 (화합물 119)
화합물 118(0.4g, 0.87mmol)을 40℃에서 밤새 진공 상태하에서 P2O5로 건조시켰다. 4-디메틸아미노피리딘(0.022g, 0.17mmol)을 첨가하였다. 그 다음 안하이드러스 피리딘(9mL)과 함께 증발시켰다. 잔여물은 불활성 상태하에서 안하이드러스 피리딘(2mL)에 용해되었고, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(0.58g, 1.72mmol)를 첨가하여 상온에서 4시간 동안 교반하였다. Tlc(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 피리딘은 진공 상태하에서 제거되었고, 잔여물은 CH2Cl2(50mL)에 용해되었으며 NaHCO3(30mL) 수용액에 뒤이어 소금물(30mL)로 세척되었다. CH2Cl2층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었으며 증발되었다. 잔여물은 크로마토그래피(소량의 피리딘을 함유하는 CH2Cl2에 용해되어 있는 5% MeOH) 로 정제되어, 화합물 119(0.5g, 75%)로 생성되었다. MS(Electrospray-)m/e759 (M+H+).
실시예 61
N6-벤조일-5'-O-DMT-2'-O-(N,N-디메틸아미노옥시에틸)아데노신-3'-O-포스포아미디트 (화합물 120)
화합물 119(0.47g, 0.62mmol)를 톨루엔(5mL)과 함께 증발시켰다. 잔여물을 N,N-디이소프로필아민 테트라졸리드(0.106g, 0.62mmol)와 함께 혼합하였고, 밤새 진공 상태하에서 P2O5로 건조시켰다. 그 후, 상기 혼합물은 불활성 상태하에서 안하이드러스 CH3CN(3.2mL)에 용해되었다. 2-시아노에틸-테트라이소프로필-포스포디아미디트(0.79mL, 2.48mmol)를 한 방울씩 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 불활성 상태하의 상온에서 6시간 동안 교반하였다. Tlc(소량의 피리딘을 함유하는 에틸 아세테이트)에 의해서 반응이 점검되었다. 용매는 제거되었고, 잔여물은 에틸 아세테이트(50mL)에 용해되었으며, 또한 NaHCO35% 수용액(2×25mL)으로 세척되었다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었으며 증발되었다. 잔여물을 크로마토그래피(소량의 피리딘을 함유하는 에틸 아세테이트)로 정제하여, 화합물 120(0.45g, 76%)이 생성되었다. MS(Electrospray-)m/e959 (M+H+).31P NMR (CDCl3) δ 151.36, 150.77ppm.
실시예 62
2'/3'-O-알릴-2,6-디아미노퓨린 리보시드 (화합물 121 및 122)
2,6-디아미노퓨린 리보시드(30g, 106.4mmol)를 안하이드러스 DMF(540mL)에 현탁시켰다. 반응은 아르곤과 함께 상승되었다. 소듐 하이드라이드(3.6g, 106.4mmol, 미네랄 오일의 60% 분산)가 첨가되었고 상기 혼합물을 10분 동안 교반시켰다. 알릴 브로마이드(14.14mL, 117.22mmol)를 20분 동안 한 방울씩 첨가하였다. 상기 생성된 반응 혼합물을 20시간 동안 상온에서 교반시켰다. Tlc(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH)는 출발물질이 완전히 소실되었음을 보여주었다. DMF는 진공 상태하에서 제거되었고, 상기 잔여물은 플래쉬 컬럼 상에 배치된 실리카 젤에 흡착되어 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출되었다. 2' 및 3' 알릴화된 화합물이 포함된 분획들은 함께 배출되었고 농축되어 건조되었으며, 화합물 121 및 122(26.38g, 77%)의 혼합물을 생성하였다. Rf 0.26, 0.4(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH).
실시예 63
2'-O-알릴-구아노신 (화합물 123)
121 및 122의 혼합물(20g, 62.12mmol)을 100mm 소듐 포스페이트 완충액에 현탁시키고 아데노신 데아미나아제(1g)를 첨가하였다. 상기 반응 용기를 대기 중에 개방시킨 상태로 상기 생성된 용액이 60시간 동안 천천히 교반되었으며, 반응 혼합물을 아이스 배스에서 1시간 동안 냉각시켰고 여기에서 얻어진 침전물을 여과하여 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조시켜, 하얀 분말의 화합물 123(13.92g, 69.6% 수율)을 생성하였다. Rf 0.19(CH2Cl2에 용해된 20% MeOH).
실시예 64
2'-O-알릴-3',5'-비스(tert-부틸디페닐실릴) 구아노신 (화합물 124)
2'-O-알릴-구아노신(6g, 18.69mmol)을 이미다졸(10g, 14.952mmol)과 함께 혼합하였고 밤새 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조하였다. 아르곤과 함께 반응은 더욱 상승되었다. 안하이드러스 DMF(50mL)를 첨가하여 10분 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 상기 혼합물에 tert-부틸디페틸실릴 클로라이드(19.44mL, 74.76mmol)를 첨가하였고, 아르곤이 존재하는 상태하에서 밤새 상기 반응 혼합물을 교반하였다. DMF를 진공 상태하에서 제거하였고, 상기 잔여물을 에틸 아세테이트(100mL)에 용해시켜 증류수(2×75mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 증발되었다. 잔여물은 플래쉬 컬럼에 걸어 CH2Cl2에 용해된 5% MeOH로 용출되었다. 상기 생성물을 포함하는 분획들은 함께 배출되었고 농축되어 건조되었으며, 하얀 거품의 형태의 화합물 124(10.84g, 72%의 수율)가 생성되었다. Rf = ?, Ms(FAB+)m/e800 (M+H+), 822(M+Na+).
실시예 65
2'-O-(2-하이드록시에틸)-3',5'-비스(tert-부틸디페닐실릴)구아노신 (화합물 125)
화합물 124(9g, 11.23mmol)를 CH2Cl2(80mL)에 용해시켰다. 상기 투명한 용액에 아세톤(50mL) 및 4-메틸모폴린-N-옥사이드(1.89g, 16.17mmol)를 첨가하였다.상기 반응 플라스크는 광선으로부터 보호되었다. 그 후, 오스뮴 테트록사이드 4% 수용액을 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 6시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응물의 부피는 농축되어 반으로 줄었으며 에틸 아세테이트(50mL)를 첨가하였다. 그 후, 증류수(30mL) 및 소금물(30mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되어 증발되었다. 잔여물은 그 후 CH2Cl2에 용해되었으며, 실리카 젤에 흡착된 NaIO4(21.17g, 2g/mmol)가 첨가되었으며, 30분 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 상기 반응 혼합물은 여과되었으며 실리카도 CH2Cl2로 완전하게 세척되었다. 화합된 CH2Cl2층은 증발되어 건조되었다. 잔여물은 불활성 상태하에서 건조한 MeOH(99.5mL)에 용해된 1M 피리디늄-p-톨루엔 설포네이트(PPTS)에 용해되었다. 상기 투명한 용액에 소듐 시아노보로하이드라이드(1.14g, 18.2mmol)를 첨가하였고 4시간 동안 상온에서 교반하였다. 바이카보네이트 5% 수용액(50mL)은 상기 반응 혼합물에 천천히 첨가되었고 에틸 아세테이트(2×50mL)로 추출되었다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 증발되었다. 잔여물을 플래쉬 컬럼에 걸어 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출시켜서 화합물 125(6.46g, 72% 수율)를 생성하였다. MS(Electrospray-)m/e802 (M-H+).
실시예 66
2'-O-[(2-프탈리미독시)-에틸)-3',5'-비스(tert-부틸디페닐실릴)구아노신 (화합물 126)
화합물 125(3.7g, 4.61mmol)을 Ph3P(1.40g, 5.35mmol) 및 하이드록시 프탈리미드(0.87g, 5.35mmol)로 혼합하였다. 40℃에서 이틀 동안 높은 진공 상태하에서 P2O5로 건조되었다. 상기 안하이드러스 THF(46.1mmol)를 불활성 상태하에서 투명한 용액이 되도록 첨가하였다. 디에틸아지도카르복실레이트(0.73mL, 4.61mmol)를 빨간 색이 사라질 때까지 한 방울씩 첨가하는 방식으로 첨가하였다. 생성된 용액을 4시간 동안 상온에서 교반하였다. THF를 진공 상태하에서 제거하였으며, 상기 잔여물을 에틸 아세테이트(75mL)에 용해시켰고, 그리고 증류수(2×50mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었으며 농축되었다. 잔여물은 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되었고 에틸 아세테이트에 용해되어 있는 7% MeOH로 용출되어서, 화합물 126(2.62g, 60% 수율)이 생성되었다. Rf 0.48(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH). MS(FAB-)m/e947 (M-H+).
실시예 67
2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-3',5'-O-비스-tert-부틸디페닐실릴-N2-이소부티릴구아노신 (화합물 127)
2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-3',5'-O-비스-tert-부틸디페닐실릴 구아노신(3.66g, 3.86mmol)을 안하이드러스 피리딘(40mL)에 용해시켰고 상기 용액을 5℃에서 냉각시켰다. 이소부티릴 클로라이드(0.808mL, 7.72mmol)를 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 25℃에서 되도록 따뜻하게 방치해 둔 다음 2시간 후에, 25℃에서 이소부티릴 클로라이드(0.40mL, 3.35mmol)를 더 첨가하였다. 1시간 후에, 상기 용매를 진공 상태로 만들어 증발시켜 거품이 형성되었으며, 상기 거품은 에틸 아세테이트(150mL)로 용해하여 묽은 현탁액이 되도록 하였다. 상기 현탁액은 증류수(2×15mL) 및 소금물(4mL)로 세척되었으며, 여기에서 생성된 유기층은 MgSO4로 건조되었다. 상기 용매는 진공 상태로 증발되어 거품이 생성되었으며, 상기 거품은 CH2Cl2-MeOH(94:6, v/v)을 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 본 실시예의 화합물 127은 하얀 거품 형태(2.57g, 65%)로 형성되었다.1H NMR(CDCl3): δ 11.97(br, s, 1H), 8.73(s, 1H), 7.8-7.2(m, 25H), 5.93(d, 1H, J1'21'= 3.3Hz), 4.46(m, 1H), 4.24(m, 2H), 3.83(m, 2H), 3.60(m, 2H), 3.32(m, 1H), 2.67(m, 1H), 1.30(d, 3H, J = 3.2Hz), 1.26(d, 3H, J = 3.1Hz), 1.05(s, 9H), 1.02(s, 9H).
상기 화합물은 A 및 T 유사체에 대해 앞에서 기술한 바와 같은 캐미스트리를 이용한 대응 포스포아미디트로 유도되어 화합물 128을 제공하였다.
실시예 68
3'-O-아세틸-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5'-O-tert-부틸디페닐실릴 티미딘 (화합물 129)
화합물 105(3.04g, 5.21mmol)를 클로로포름(11.4mL)에 용해시켰다. 상기 혼합물에 디메틸아미노피리딘(0.99g, 8.10mmol)을 첨가시켰고 상기 반응 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 아세틱 안하이드라이드(0.701g, 6.87mmol)를 첨가하였고, 상기 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물은 CH2Cl2(40mL)로 희석되어 포화 NaHCO3(30mL) 및 소금물(30mL)로 세척되었다. CH2Cl2층은 증발되어 건조되었다. 잔여물을 플래쉬 컬럼에 걸었고 에틸 아세테이트:헥산(80:20)으로 용출시켜 화합물 129를 생성하였다. Rf 0.43(에틸 아세테이트:헥산 = 80:20). MS(Electrospray-)m/e624 (M-H+).
실시예 69
2'-O-(2-N,N-디메틸아미노에틸)-5'-O-tert-부틸디페닐실릴 5-메틸 시티딘 (화합물 130)
안하이드러스 CH3CN(49mL)에 용해된 1,2,4-트리아졸(5.86g, 84.83mmol) 현택액을 아르곤이 존재하는 상태하에서 5 내지 10분 동안 아이스 배스 내에서 냉각시켰다. 상기 차가운 현탁액에 POCl3(1.87mL, 20mmol)을 10분 이상 천천히 첨가시켰고 추가적으로 5분 동안 교반하였다. 트리에틸아민(13.91mL, 99.8mmol)을 0 내지 2℃ 정도로 배스 온도를 유지하면서 30분 이상에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 상기첨가가 완료된 후에, 상기 반응 혼합물을 화합물 35(3.12g, 4.99mmol)가 안하이드러스 아세토니트릴(3mL)에 한 부분으로 첨가되는 추가적으로 30분 동안 상기 온도에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 10분 동안 0 내지 2℃ 정도로 교반하였다. 그 다음 아이스 배스는 제거되었고 상기 반응 혼합물을 1시간 반 동안 상온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시켜 작은 양으로 농축시켰으며, 에틸 아세테이트(100mL)로 용해시켰고, 그리고 증류수(2×30mL) 및 소금물(30mL)로 세척하였다. 유기층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되어 농축되었다. 생성된 잔여물은 다이옥산에 용해된 NH3포화 용액(25mL)에 용해되었고 밤새 상온에서 교반하였다. 용매는 진공 상태하에서 제거되었다. 상기 잔여물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었고 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출되어 화합물 130이 생성되었다.
실시예 70
2'-O-(2,N,N-디메틸아미노옥시에틸)-N4-벤조일-5'-O-tert-부틸디페닐실릴시티딘 (화합물 131)
화합물 130(2.8g, 4.81mmol)을 안하이드러스 DMF(12.33mL)에 용해시켰다. 벤조익 안하이드라이드(1.4g, 6.17mmol)를 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 밤새 상온에서 교반시켰다. 메탄올을 1mL 첨가하였으며 용매는 증발시켜 건조시켰다. 잔여물은 디클로로메탄(50mL)에 용해시키고 포화된 NaHCO3(2×30mL)으로 세척한 후 소금물(30mL)로 세척하였다. 디클로로메탄 층은 안하이드러스 NaSO4로 건조되어 농축되었다. 여기에서 생성된 잔여물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었으며 CH2Cl2에 용해된 5% MeOH로 용출되어 거품 형태의 화합물 131이 생성되었다.
실시예 71
N4-벤조일-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸 시티딘 (화합물 132)
높은 진공 상태를 만들어 화합물 131(2.5g, 3.9mmol)을 P2O5로 건조하였다. 100mL 둥근 바닥 플라스크 내에서, 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (6.36mL, 39mmol)를 안하이드러스 THF(39mL)에 용해시켰다. 상기 혼합물에 트리에틸아민(2.72mL, 19.5mmol)을 첨가하였고, 상기 혼합물을 화합물 131에 재빨리 붓고 밤새 상온에서 교반하였다. 진공 상태를 만들어 용매를 제거하였으며, 상기 잔여물을 플래쉬 컬럼에 걸었고 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출시켜, 화합물 132를 제조하였다.
실시예 72
N4-벤조일-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-O'-디메톡시트리틸-5-메틸 시티딘 (화합물 133)
높은 진공 상태를 만들어 화합물 132(1.3g, 2.98mmol)를 P2O5로 건조하였다.안하이드러스 피리딘(10mL)과 함께 증발시켰다. 잔여물을 안하이드러스 피리딘(15mL)에 용해시켰으며 4-디메틸아미노 피리딘(10.9mg, 0.3mmol)을 첨가하였고, 그리고 상기 용액을 4시간 동안 상온의 아르곤이 존재하는 상태하에서 교반하였다. 진공 상태를 만들어 피리딘을 제거하였고, 상기 잔여물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 5% NaHCO3(20mL) 및 소금물(20mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 농축되었다. 잔여물을 플래쉬 컬럼에 걸어 소량의 피리딘을 함유하는 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출시켰고, 그 결과 화합물 133이 생성되었다.
실시예 73
N4-벤조일-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-디메톡시트리틸-5-메틸 시티딘-3'-O-포스포아미디트 (화합물 134)
화합물 133(1.54g, 2.09mmol)을 톨루엔(10mL)과 함께 증발시켰다. 디이소프로필아민 테트라졸리드(0.36g, 2.09mmol)와 함께 혼합하였고, 40℃이상으로 밤새 높은 진공 상태하에서 P2O5를 이용하여 건조하였다. 그 후에 안하이드러스 아세토니트릴(11mL)에 용해시키고 2-시아노에틸-테트라이소프로필포스포아미디트(2.66mL, 8.36mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 불활성 상태의 상온에서 교반하였다. 에틸 아세테이트(50mL)를 상기 잔여물에 첨가하였고 5% NaHCO3(30mL)및 소금물(30mL)로 세척하였다. 유기상은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 농축되었다. 잔여물은 플래쉬 컬럼에 걸어 소량의 피리딘을 함유한 에틸아세테이트:헥산(60:40)으로 용출하였고, 그 결과 화합물 134가 생성되었다.
실시예 74
2'-O-디메틸아미노옥시에틸-2,6-디아미노퓨린 리보시드 포스포아미디트 (화합물 135)
올리고뉴클레오티드 내에 2'-O-디메틸아미노옥시에틸-2,6-디아미노퓨린 리보시드를 결합시키기 위하여, 보호된 6-아미노-2-플루오로퓨린 리보시드 135의 포스포아미디트를 이용하였다. 다음 올리고 합성은 올리고뉴클레오티드 보호기를 디프로텍션하는 것과 동시에 상기 2-플루오로기를 암모니아로 치환하였고 2,6-디아미노퓨린 리보시드 유사체를 제공하였다. 이와 같이, 2,6-디아미노퓨린 리보시드는 디메틸아미노옥시에틸브로마이드 136과 함께 알킬화되어, 2'-O-디메틸아미노옥시에틸 -2,6-디아미노퓨린 리보시드 137 및 3'-이소머 138의 혼합물을 제공하였다. 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-디메틸아미노옥시에틸-2,6-디아미노퓨린 리보시드 139를 제공하기 위해 DMT로 5'-하이드록실을 일반적으로 기능화 시킨 후에, 상기 2'-이소머가 크로마토그래피로 분석될 수 있었다. Schiemann 반응(Krolikiewicz, K.; Vorburuggen, H. Nucleosides Nucleotides, 1994, 13, 673-678)을 거친 화합물 139의 플루오르화는 2'-O-디메틸아미노옥시에틸-6-아미노-2-플루오로-퓨린 리보시드 140을 제공하였고 표준 보호 프로토콜은 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-디메틸아미노옥시에틸-6-디메티포름아미딘-2-플루오로퓨린 리보시드 140을 제공하였다.140의 포스피틸화(phosphitylation)는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-디메틸아미노옥시에틸-6-디메티포름아미딘-2-플루오로퓨린 리보시드-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트] 138을 제공했다.
화합물 139가 3'-이소머로부터 크로마토그래피에 의해 분석될 수 없는 경우, 상기 화합물 137 및 138의 혼합물은 3'-O-이소머보다 우선하여 2'-O-치환된 아데노신 유사체를 선택적으로 탈 아미노하는 것으로 알려진 아데노신 데아미나아제로 처리될 수 있었고, 2'-O-디메틸아미노옥시에틸구아노신 142를 제공할 수 있었다. 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-디메틸아미노옥시에틸구아노신 140은 6-옥소기의 아미노화에 의해 상기 2,6-디아미노퓨린 리보시드 유사체 139로 전환될 수 있었다(Gryaznov, S.; Schultz, R. G. Tetrahedron Lett. 1994, 2489-2492). 그 후 표준 보호 방법 및 포스피틸화를 위한 프로토콜에 의해서 대응 아미디트 144로 전환하였다.
실시예 75
2'/3'-O-[2-(tert-부틸디메틸실릴하이드록시)에틸]-2,6-디아미노퓨린 리보시드 (화합물 145 및 146)
2,6-디아미노퓨린 리보시드(10g, 35.46mmol)를 높은 진공 상태하에서 P2O5를이용하여 건조하였다. 안하이드러스 DMF(180mL)에 현탁되었고, NaH(1.2g, 35.4mmol, 미네랄 오일의 60% 분산)가 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 30분 동안 불활성 상태의 상온에서 교반되었다. 상기 혼합물에 (2-브로모에톡시)-tert-부틸디메틸실란(12.73g, 53.2mmol)을 한 방울씩 첨가하였고 상기 생성된 용액은 밤새 상온에서 교반되었다. 진공 상태를 만들어 DMF를 제거하였으며, 잔여물은 에틸 아세테이트(100mL)에 용해되었고 증류수(2×70mL)로 세척되었다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 MgSO4로 건조되었고 농축되었다. 잔여물을 플래쉬 컬럼에 걸어 CH2Cl2에 용해된 5% MeOH로 용출시켜, 혼합 생성물(6.0711g, 31% 수율)이 제공되었다. Rf 0.49, 0.59, 0.68(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH).
실시예 76
2'-O-아미노옥시 유사체
뉴클레오시드의 다양한 2'-O-아미노옥시 유사체(예를 들어, 2,6-디아미노퓨린 리보시드)는 화합물 154와 같이 제조될 수 있다. 그러므로 2,6-디아미노퓨린을 (2-브로모에톡시)-tert-부틸디메틸실란과 함께 알킬화하여, 2'-O-tert-부틸디메틸실릴옥시에틸-2,6-디아미노퓨린 리보시드 145 및 3'-이소머 146이 제공되었다. 바람직한 2'-O-이소머는 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-tert-부틸디메틸실릴옥시에틸-2,6-디아미노퓨린 리보시드 147의 제조에 의해서 결정되며, 상기 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제된다. 실릴기의 디프로텍션으로 인해 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-하이드록시에틸-2,6-디아미노퓨린 리보시드 148이 제공되었으며, Mitsunobu 반응을 계속하여 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-2,6-디아미노퓨린 리보시드 149가 제공되었다. Schiemann 조건하에서 149를 처리하여 DMT기의 플루오로화 및 디프로텍션에 영향을 주어 2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-6-아미노-2-플루오로퓨린 리보시드 150이 생성되었다. 표준 보호 조건은 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-프탈리미도-N-옥시에틸)-6-디메티포름아미딘-2-플루오로퓨린 리보시드 151을 제공하였으며, 상기 프탈리미도 기능의 디프로텍션은 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-아미노옥시에틸-6-디메티포름아미딘-2-플루오로퓨린 리보시드 152를 제공하였다.
알데하이드 혹은 디알데하이드로 152를 환원적으로 아미노화하는 것은 시클릭 혹은 아시클릭(acyclic) 비치환된 2'-O-아미노옥시에틸 유사체 153을 생성하였다. 153의 포스피틸화는 포스포아미디트로서 시클릭 혹은 아시클릭(acyclic) 비치환된 2'-O-아미노옥시에틸 유사체 154를 제공하였다.
실시예 77
2'/3'-O-(2-tert-부틸디메틸실릴하이드록시에틸)아데노신 (화합물 155 및 156)
아데노신(10g, 37.42mmol)이 높은 진공 상태에서 P2O5에 의해 건조되었다. 안하이드러스 DMF(150mL)에 현탁시키고, NaH(1.35g, 56.13mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 30분 동안 상온의 불활성 상태하에서 교반하였다. 그 다음 (2-브로모 에틸)-tert-부틸디메틸실란(9.68mL, 4.90mmol)을 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였고 상기 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. DMF를 진공 상태를 만들어 건조하였고 생성된 잔여물에 디클로로메탄(100mL)을 첨가했으며 증류수(2×80mL)로 세척하였다. 디클로로메탄 층은 안하이드러스 Na2SO4를 이용하여 건조했고 증발시켰다. 잔여물은 컬럼으로 정제되어 혼합 생성물(4.30g)을 제공하였다. Rf 0.49, 0.57(CH2Cl2에 용해된 10% MeOH).
실시예 78
2'-O-(2-메틸렌이미노옥시에틸) 티미딘 (화합물 157)
높은 진공 상태에서 P2O5를 이용하여 화합물 104(3.10g, 5.48mmol)를 건조시켰다. 둥근 바닥 플라스크 내에서, 트리에틸아민-트리하이드로플루오라이드 (8.93mL, 54.8mmol)를 안하이드러스 THF에 용해시켰고, 트리에틸아민(3.82mL, 27.4mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 용액을 즉시 화합물 104에 첨가시켜서 상기 반응 혼합물을 밤새 상온에서 교반하였다. 용매는 진공 상태를 만들어서 제거되었다. 여기에서 얻어진 잔여물은 플래쉬 컬럼에 부착되었고 CH2Cl2에 용해된 10% MeOH로 용출되어서, 그 결과 하얀 거품의 화합물 157(1.35g, 75% 수율). Rf 0.45(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). MS(FAB+)m/e330 (M+H+), 352(M+Na+).
실시예 79
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(2-메틸렌이미노옥시에틸)티미딘 (화합물 158)
높은 진공 상태에서 P2O5를 이용하여 화합물 157(0.64g, 1.95mmol)을 건조시켰다. 그리고 안하이드러스 피리딘(5mL)과 함께 증발시켰다. 잔여물은 안하이드러스 피리딘(4.43mL)에 용해되었고, 디메톡시트리틸 클로라이드(0.79g, 2.34mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(23.8mg, 0.2mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 4시간 동안 상온의 불활성 상태하에서 교반되었다. 용매는 진공 상태하에서 제거되었으며, 상기 잔여물은 컬럼에 의해 정제되었으며 피리딘을 소량 함유하는 CH2Cl2에 용해된 5% MeOH으로 용출되어, 그 결과 거품 형태의 화합물 158(1.09g, 88% 수율). Rf 0.4(CH2Cl2에 용해된 5% MeOH). MS(Spectrospray-)m/e630 (M-H+).
실시예 80
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(2-메틸렌이미노옥시에틸)티미딘-3'-O-포스포로아미디트 (화합물 159)
화합물 158(0.87g, 1.34mmol)을 톨루엔(10mL)과 함께 증발되었다. 잔여물은 디이소프로필아민 테트라졸리드(0.23g, 1.34mmol)로 혼합되었고 높은 진공 상태로 밤새 P2O5를 이용하여 건조되었다. 반응은 아르곤과 함께 상승되었다. 안하이드러스 아세토니트릴(6.7mL)을 첨가하여 투명한 용액을 얻었다. 상기 용액에 2-시아노에틸테트라이소프로필포스포로디아미디트(1.7mL, 5.36mmol)가 첨가되었고 상기 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 불활성 상태하에서 교반하였다. 용매는 진공 상태로 제거되었으며, 상기 잔여물은 에틸 아세테이트(40mL)로 희석되었고 5% NaHCO3(20mL) 및 소금물(20mL)로 세척되었다. 에틸 아세테이트 층은 안하이드러스 Na2SO4로 건조되었고 농축되었다. 잔여물을 플래쉬 컬럼에 걸고 에틸 아세테이트:헥산(60:40)으로 용출시켜, 화합물 159(1.92g, 80% 수율)를 제조하였다. Rf 0.34(에틸 아세테이트:헥산 = 60:40).31P NMR(CDCl3) δ 150.76ppm. MS(Electrosptray-)m/e830 (M-H+).
실시예 81
고체상 지지체에 올리고뉴클레오티드를 접착시키는 일반적인 절차
화합물 107(200mg, 0.31mmol)을 DMAP(19mg, 16mmol), 수시닉 안하이드라이드(47mg, 0.47mmol), 트리에틸아민(86mL, 0.62mmol) 및 디클로로메탄(0.8mL)과 하께 혼합하였고 4시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 CH2Cl2(50mL)로 희석하였고 상기 CH2Cl2층은 차가운 얼음과 함께 시트릭 산 10% 수용액으로 제일 먼저 세척되었고 그 다음 증류수로 세척되었다. 상기 유기상은 농축되어 건조되어 화합물 161이 제조되었다. 잔여물(화합물 161)은 안하이드러스아세토니트릴(23mL)에 용해되었다. 상기 반응물에 DMAP(37mg, 0.3mmol) 및 2',2'-디티오비스(5-니트로피리딘)(103mg, 0.33mmol)를 첨가하였다. 상기 용액은 5분 동안 교반되었다. 상기 용액에는 안하이드러스 아세토니트릴(3mL)에 용해된 트리페닐포스핀(78.69mg, 0.3mmol)이 첨가되었다. 상기 용액은 10분 동안 교반되었고, 그리고 CPG를 거기에 첨가하였다. 그 후 생성된 슬러리를 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 여과하였고 아세토니트릴과 CH2Cl2로 세척하였다. 상기 기능화된 CPG는 건조되었고 캡핑(capping) 용액으로 캡이 씌워졌으며, 화합물 161이 생성되었다. 로딩 용량(loaging capacity)은 58.3μmol/g으로 측정되었다.
실시예 82
아미노옥시 유도체의 합성 : 선택적 절차
디올 162는 표준 정밀 검사로 인하여 p-톨루엔설포닐 클로라이드-피리딘 1 당량으로 처리되어서 토실레이트 유도체로 전환되었다. 그 다음 상기 토실레이트는 토실레이트를 치환하는 뉴클레오필과 같은 작용을 하는 여러 가지 아미노-하이드록시 화합물로 처리되어서 일련의 옥시-아미노 화합물을 생성하였다. 상기 반응은 안하이드러스 상태에서 소듐 하이드라이드를 사용함으로 인해 아미노 알코올 혹은 하이드록실아민 유도체로부터 음이온을 재형성함으로써 촉진되었다.
절 차 1
뉴클레아제 내성
A. 혈청 및 세포질 뉴클레아제에 대한 변형된 올리고뉴클레오티드의 내성 측정
본 발명의 상기 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 우 태아 혈청(fetal calf serum) 혹은 성인 혈청의 다양한 농도를 갖는 배지에서 상기 올리고뉴클레오티드를 배양하여 혈청 뉴클레아제에 대한 내성을 갖을 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 여러 시간 동안 배양되어, 프로테아제 K로 처리되고, 그리고 20% 폴리아크릴아마이드-우레아 디네이츄링 젤(denaturing gel) 전기영동과 자동방사선 사진 촬영법으로 측정된다. 오토라디오그램(autoradiogram)은 레이저 농도계로 측량된다. 상기 변형의 위치와 상기 올리고뉴클레오티드의 서열이 알려진 길이에 기초하여, 특수한 변형이 뉴클레아제 분해에 대해 어떠한 효과가 있는지 결정할 수 있다. 상기 세포질 뉴클레아제에는 HL60 세포주가 사용되었다. 미토콘드리아 다음 상층액(post-mitochondrial supernatent)은 차별적인 원심분리에 의해 마련되었고 상기 표지된 올리고뉴클레오티드는 여러 시간대에 걸쳐서 상기 상층액 내에서 배양되었다. 배양 후에 올리고뉴클레오티드는 위에서 언급한 바와 같은 혈청 뉴클레오리틱 분해에 대해 측정되었다. 자동방사선 사진 촬영 결과 비변형된 그리고 변형된 올리고뉴클레오티드가 대조적으로 측량되었다. 그러한 조절로 인하여, 비치환된 포스포로디에스테르 올리고뉴클레오티드는 1시간 내에 50% 분해되었고, 20시간 내에 100% 분해됨이 밝혀졌다.
B. 특이한 엔도- 및 엑소뉴클레아제에 대한 변형된 올리고뉴클레오티드의 내성 측정
특이한 뉴클레아제(즉, 엔도뉴클레아제, 3',5'-엑소뉴클레아제 및 5',3'-엑소뉴클레아제)에 대한 자연적인 그리고 변형된 올리고뉴클레오티드의 내성 측정으로 인하여 변형이 내성의 감소에 있어서 분명하게 영향을 끼친다는 것이 밝혀졌다. 변형된 올리고뉴클레오티드는 다양하게 선택된 뉴클레아제를 위하여 규정된 반응기의 특별한 완충액 내에서 배양되었다. 프로테아제 K로 상기 배양된 생성물을 처리한 후, 우레아가 첨가되었고 우레아를 함유한 20% 폴라아크릴아마이드 젤 상에서 분석이 행해졌다. 젤 생성물은 Stains All(Sigma Chemical Co.)을 이용해 염색하여 가시화되었다. 레이져 농도계는 분해량을 측량하는 데에 이용되었다. 상기 변형의 효과는 특이한 뉴클레아제로 측정되었고 상기 혈청 및 세포질 시스템으로부터 얻어진 결과와 비교된다.
신규의 2'-변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성
Series I |
5' TTT TTT TTT TTT TTT*T*T*T*T 3' |
서열번호 : 20 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2'-aminooxyethoxy |
2' AOE |
서열번호 : 21 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2' -dimethylaminooxyethoxy |
2' DMAOE |
T19 디에스테르 및 티오에이트 조절과 함께, 상기 젤 정제된 올리고들은 5' 말단에32P로 표지되었고, 그리고 표준 뉴클레아제 검정 프로토콜을 통해 러닝되었다.
PAGE/Phosphorimaging은 % 인택트(Intact) 및 % (인택트+(N-1))에 대해 측량된 영상을 제공하였다. 상기 %는 반감기가 생기는 것으로 구상되었으며 하기 표에 열거되었다. 표에는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 유사체(서열 번호 : 22)의 반감기가 포함되어 있다. 이 결과는 2'-디메틸아미노옥시에틸(DMAOE)이 강한 뉴클레아제 내성을 갖도록 변형되었음을 나타낸다(도 14 및 15).
|
2' - 변형 |
|
AOE |
DMAOE |
MOE |
N의 T1/2(분) |
18 |
60 |
100 |
N+(N-1)의 T1/2 (분) |
200 |
24시간에서 85%로 유지 |
300 |
2'-DMAOE 변형으로 캡된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성에 대한 초기 분석은 2'-O-메톡시에틸 변형과의 상호-검정 비교에 있어서 상기 비교 대상 보다 나은 내성을 나타내었다(도 13). 상기에 대한 연구는 두 가지 모티프(motif)를 갖는 여러 변형들을 상호-분석 비교한다. 첫 번째 모티프는 3'-맨 바깥쪽의 뉴클레오티드에서 시작되는 네 개의 변형된 뉴클레오티드를 갖는 완전한 포스포디에스테르 골격이다. 두 번째 모티프는 유사하지만 3'-가장 끝부분의 상호 뉴클레오티드 결합에서 하나의 포스포로티오에이트를 함유하는 것이다.
Series Ⅱ |
5' TTT TTT TTT TTT TTT T*T*T*T*3' |
서열번호 : 23 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2' -dimethylaminooxyethyl |
서열번호 : 24 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2' -O-methoxyethyl |
서열번호 : 25 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2' -O-propyl |
Series Ⅲ |
5' TTT TTT TTT TTT TTT TTT*T 3' |
서열번호 : 26 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2' -dimethylaminooxyethyl |
서열번호 : 27 |
상기에서, T*= 5 methyl, 2' -O-methoxyethyl |
T19 포스포로티오에이트 조절과 함께, 상기 올리고들은 젤 정제되었고 상기 표준 뉴클레아제 프로토콜로 계속되었다. 상기를 분석한 결과 서열 번호 : 23이 가장 내성이 강한 올리고뉴클레오티드라는 것이 증명되었다. 서열 번호 : 24는 더욱 쉽게 분해되었고 서열 번호 : 25는 그 보다 더 빠르게 분해되었다. 상기 젤 바닥에는 얼마간의 반응 생성물이 존재하였으나, 상기 내성 올리고뉴클레오티드의 약 n-1 및 n-3이었다. 상기 생성물에는 SVPD에 의해 엔도뉴클레오리틱 절단이 이루어진다. 상기 활성 형태는 항상 기본 비율로 나타나지만, 상기 활성 형태는 대부분의 올리고뉴클레오티드에 있어서 3' 엑소뉴클레아제 활성의 압도적 우수성에 항상 기여를 하는 것으로 보여지진 않는다. 그러나 상기 올리고뉴클레오티드들은 3' 엑소뉴클레아제에 대한 상당한 내성을 갖기 때문에 오히려 상기 엔도뉴클레아제 활성이 전장 올리고에 절단이 일어나도록 대부분의 원인을 제공한다. 상기 엔도뉴클레아제 반응의 2'-데옥시-포스포디에스테르 생성물들은 그 후 단량체로 급속도로 절단된다. 상기 반응에 대한 두 가지 측량을 행하였다. 하나는 3'-엑소뉴클레아제만을 계산하였고 다른 하나는 모든 반응 생산물들을 계산하였다. 어느 경우에서나 서열 번호 : 23의 반감기는 24시간보다 더 길었다. 서열 번호 : 24에서는 엑소뉴클레아제 활성의 반감기가 24시간 이상이었으나, 나머지 경우 반감기는 약 100분 정도였다. 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드(서열 번호 : 26 및 서열 번호 : 27)는 상기 언급한 엔도뉴클레아제 활성에 대한 기질이며, 그러나 3' 엑소뉴클레아제 활성 생성물은 분석 시간대 내에서 그 어떤 것도 검출되지 않았다.
2' 디메틸아미노옥시에틸 티민으로 합성된 올리고뉴클레오티드(T-2'-DMAOE)
서열번호 |
염기서열 |
Mass |
|
|
Exp.
|
Obs.
|
28 |
5' - CTCGTACCT*TTCCGGTCC-3' |
5784.20 |
5784.09 |
29 |
5' -T*CCAGGT*GT*CCGCAT*C-3' |
5548.74 |
5549.05 |
30 |
5' -GCGT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*GCG-3' |
6208.74 |
6210.52 |
31 |
5' -TTTTTTTTTTTTTTT*T*T*T*T-3' |
6433.45 |
6433.79 |
32 |
5' -T*T*T*T*-3' |
1869.96 |
1869.5 |
33 |
5' -TTTTTTTTTTTTTTTT*T*T*T*-3' |
6449.45 |
6449.15 |
34 |
TTTTTTTTTTTTTTTT*T*T*T*-3' |
6433.51 |
6433.19 |
35 |
5' T*T*-3' |
648.49 |
648.4 |
2'-디메틸아미노옥시에틸 아데노신으로 합성된 올리고뉴클레오티드(A-2'-DMAOE)
|
서열번호 |
염기서열 |
Mass |
|
|
|
Exp.
|
Obs.
|
1 |
36 |
5' - CTCGTACCA*TTCCGGTCC-3' |
5490.21 |
5490.86 |
2 |
37 |
5' -GGA*CCGGA*A*GGTA*CGA*G-3' |
5824.96 |
5826.61 |
3 |
38 |
5' -A*CCGA*GGA*GGA*TCA*TGTCGTA*CGC-3' |
6947.9 |
6947.28 |
2' -O- 메틸렌이미노옥시에틸 아데노신으로 합성된 올리고뉴클레오티드
|
서열번호 |
염기서열 |
Mass |
|
|
|
Ex.
|
Obs.
|
|
39 |
5' -CTCGTACCA*TTCCGGTCC-3' |
5470.20 |
5472.50 |
|
40 |
5' -A*CCGA*GGA*TCA*TGTCGTA*CGC -3' |
6866.42 |
6865.88 |
|
41 |
5' -GGA*CCGGA*A*GGTA*CGA*G -3' |
5743.12 |
5743.82 |
2' -O- 메틸렌이미노옥시에틸 티미딘으로 합성된 올리고 뉴클레오티드
|
서열번호 |
염기서열 |
Mass |
|
|
|
Exp.
|
Obs.
|
1 |
42 |
5' -CTCGTACCT*TTCCGGTCC -3' |
5466.21 |
5462.25 |
2 |
43 |
5' -T*CCAGGT*GT*CCGCAT*C -3' |
5179.44 |
5178.96 |
3 |
44 |
5' -TTTTTTTTTTTTTTT*T*T*T*T -3' |
6369.45 |
6367.79 |
2' 데옥시 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트의 2'-DMAOE 변형의 이익
|
서열번호 |
염기서열 |
Tm |
비변형된 DNA와 비교된 RNA에 대한 ΔTm/mod |
비변형된 데옥시포스포로티오에이트와 비교된 RNA에 대한 ΔTm/mod |
|
45 |
5'-CTCGTAC-CT*T- TCCGGTCC -3' |
65.44 |
0.24 |
1.04 |
|
46 |
5'-T*CCAGGT*GT*C -CGCAT*C-3' |
67.90 |
1.12 |
2.20 |
|
47 |
5'-GCGT*T*T*T*TT*T*T*T*T*GCG-3' |
62.90 |
1.46 |
2.36 |
ΔTm은 DNA 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 대해 발표된 연구 수치에 기초한 것임.
절 차 2
ras-루시페라아제 수용체 유전자의 조립(assembly)
본 발명의 ras-루시페라아제 수용체 유전자는 PCR 기술을 이용하여 조립되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 사1람 H-ras 유전자 돌연변이(코돈 12)와 비-돌연변이(야생형)의 엑손 1의 5'-영역을 PCR 클로닝하기 위해 프라이머로 이용되도록 합성되었다. H-ras 유전자 주형은 American Type Culture Collection(ATCC 수탁번호 41000 및 41001)(Bethesda, MD)으로부터 구입하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머 5'-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-TTT- GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3'(센스, 서열 번호 : 16) 및 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3'(안티센스, 서열 번호 17)은 주형으로써 돌연변이 및 비돌연변이 H-ras 유전자를 이용한 표준 PCR 반응에서 사용되었다. 상기 프라이머들은 NheⅠ 및 HindⅢ 제한 엔도뉴클레아제 위치의 측면에 있는, 정상 및 돌연변이 H-ras의 -53 내지 +65 염기서열(번역 개시 부위에 대한)에 대응되는 145 염기 쌍의 DNA 생성물을 생성하는 것이 바람직하다. 상기 PCR 생성물은 표준 절차를 이용하여 젤 정제되어 침전되었으며, 세척된 후 증류수에 재현탁되었다.
P. pyralis(개똥벌레) 루시페라아제 유전자 클로닝을 위한 PCR 프라이머는 상기 PCR 생성물이 아미노-말단 메티오닌 잔기만 제외하고 전장 루시페라아제 단백질을 암호화하도록 고안되었으며, 아미노-말단 리신(lysine) 잔기 및 그 뒤 로이신(leucine) 잔기의 두 가지 아미노산이 치환되도록 고안되었다. 상기 루시페라아제 유전자 클로닝에 이용되는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3'(센스, 서열 번호 : 18) 및 5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA-CCT- CGA-3'(안티센스, 서열 번호 : 19)이었으며, 주형으로서 루시페라아제 수용체 유전자를 포함하고, 상업적으로 입수 가능한플라스미드(pT3/T7-Luc)(Clontech)를 이용하여 표준 PCR 반응에 이용되었다. 상기 프라이머들은 HindⅢ 및 BssHⅡ 제한 엔도뉴클레아제 부위의 측면에 있는, 루시페라아제 유전자에 대응되는 약 1.9kb의 생성물을 생성하는 것이 바람직하다. 상기 절편은 표준 절차를 이용하여 젤 정제되어 침전되었고 세척된 후에 증류수에 재현탁되었다.
상기 ras-루시페라아제 융합 수용체 유전자 조립을 완료하기 위하여, 상기 ras 및 루시페라아제 PCR 생성물들은 적절한 제한 엔도뉴클레아제와 함께 고안되었으며, 스테로이드-유도가능한 쥐의 유방암 바이러스 프로모토 MMTV를 포함하는 발현 벡터 내로, 상기 제한 엔도뉴클레아제인 NheⅠ, HindⅢ 및 BssHⅡ가 이용되어 세 부분이 라이게이션됨으로써 클론되었다. 생성된 클론은 개똥벌레 루시페라아제 유전자와 함께 프래임(frame)에 융합된 H-ras 5' 서열(-53 내지 +65)로 삽입되었다. 상기에서 생성된 발현 벡터는 스테로이드-유도가능한 MMTV 프로모터가 조절하여 발현되는 ras-루시페라아제 융합 생성물을 암호화하였다.
절 차 3
플라스미드 DNA와 세포의 형질감염
형질감염은Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 외, Eds., John Wiley and Sons, New York에 의해 개시된 방법으로 하기의 변형과 함께 이루어졌다: HeLa 세포를 5×105cells/dish에 60mm 디쉬에 평평하게 깔았다. 10μg DNA 전체를 각각의 디쉬에 첨가하였으며, 여기에서 9μg는 ras-루시페라아제 수용체 플라스미드이고 1μg은 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 조절 하에서 상기 쥐(rat)의 글루코코르티코이드 수용체를 발현하는 벡터이다. 칼슘 포스페이트-DNA 침전물은 3mM EGTA가 함유된 트리스-완충된 살린(50mL Tris-Cl(pH 7.5), 150mM NaCl)으로 세척되어 16 내지 20시간 후에 제거되었다. 10% 우 태아 혈청(fetal bovine serum)으로 보충된 신선한 배지가 세포에 첨가되었다. 이 때, 세포들은 덱사메타손에 의한 수용체 유전자 발현이 활성되기 전에 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전처리되었다.
절 차 4
세포에 대한 올리고뉴클레오티드의 처리
플라스미드가 형질감염 되자마자, 세포들을 OptiMEM(GIBCO)로 세 번 세척하며 37℃로 미리 데운다. 10μg/ml N-[1-(2,3-디올에틸옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA)(Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD)를 함유하는 2mL OptiMEM을 각 디쉬에 첨가하였고, 올리고뉴클레오티드를 직접 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후 OptiMEM은 제거되었고 올리고뉴클레오티드를 포함하는 적절한 세포 성장 배지로 대치시켰다. 이 때, 수용체 유전자 발현은 최종 농도가 0.2μM이 되도록 덱사메타손으로 세포를 처리함으로써 활성되었다. 세포들은 스테로이드 처리를 하여 12 내지 16시간 동안 추출되었다.
절 차 5
루시페라아제 분석
루시페라아제는Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 외, Eds., John Wiley and Sons, New York에서 Greenberg에 의해 기재된 바와 같이 Triton X-100 세정제로 세포들을 용해(lysis)하여 추출되었다. Dynatech ML1000 루미노메터(luminometer)는 루시페린(Sigma) 첨가에 있어서 625μM까지 피크 발광을 측정하는 데에 이용된다. 각각의 추출물에 있어서 루시페라아제는 여러 번 분석되었으며, 선형 범위의 분석 데이터를 얻을 수 있도록 다양한 양의 추출물이 수집되도록 하였다.
절 차 6
ras-루시페라아제 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 저해
활성된 H-ras의 12번째 코돈 지점 돌연변이가 표적된 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 유사체들은 상기 실시예들에서 기재된 ras-루시페라아제 수용체 유전자 시스템을 이용하여 검출되었다. 상기 일련의 것들은 기본 염기서열 및 기본 염기서열의 유사체를 포함하였다. 상기 기본 염기서열은 상기에서 언급한 국제출원공개 제WO 92/22651호에서 개시된 바와 같이 잘 알려진 활성을 갖는 것이다. 기본 염기서열과 그 유사체에 있어서, 상기 뉴클레오티드 하부단위들 각각을 포스포로티오에이트 결합으로 연결시켜 뉴클레아제 내성이 제공되도록 하였다. 각각의 유사체들에는 2'-O-치환 및 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실당을 포함하는 뉴클레오티드 하부단위가 결합되었다. 상기 유사체에 있어서, 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당을 포함하는 하부단위의 염기서열은 2'-O-치환된 하부단위의 염기서열에 의하여 양쪽 말단의 측면에 존재한다. 상기 유사체들은 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오티드의 서열 길이가 다른 것들과 차이가 있다. 이러한 하부염기서열의 길이는 1개 및 9개의 전체 뉴클레오티드들 중에 2개의 뉴클레오티드에 의해 변화된다. 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오티드 하부염기서열은 활성된 ras의 상기 12번째 코돈 위치에서 돌연변이가 일어나는 그 지점에 집중되었다.
절 차 7
mRNA 과발현 검출의 진단적 분석
올리고뉴클레오티드들의 5' 말단에32P 표지를 한 것을 폴리뉴클레오티드 키나아제와 함께 합성시켜 방사선 표지하였다. Sambrook 외("Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 2, pp. 11.31-11.32)가 개시한 방법대로 행하였다. 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 환자로부터 얻은 샘플과 같이 mRNA 과발현이 의심되는 조직 혹은 세포의 샘플에 특이하게 잡종화가 이루어지는 상태하에서 접촉되었고, 상기 샘플은 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위하여 세척되었다. 상기와 유사한 방법으로 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드를 특이적 잡종화가 가능한 상태하에서 정상 세포 혹은 조직 샘플에 접촉되었고, 상기 샘플은 세척되어 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드가 제거되었다. 상기 샘플에 남아있는 방사능성은 올리고뉴클레오티드가 결합되었는지를 제시해 주었고 섬광 계수기 혹은 다른 일상적인 방법에 의하여 측량되었다. 상기 정상 및 질병 상태의 세포의 샘플에 남아 있는 방사능성을 비교하여 mRNA의 과발현 여부를 알 수 있다.
본 발명의 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 자동방사선 사진촬영법에 이용되었다. 조직의 절편은 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드로 처리하였고 상기에서 기재한 바와 같이 세척되며, 그 후 표준 자동방사선 사진촬영 절차에 따라서 사진 유제(emulsion)에 노출되었다. 정상 세포 혹은 조직 샘플에도 같은 방법을 행한다. 현상되었을 때 상기 유제는 mRNA가 과발현되는 지역 위로 은색의 결들이 나타났고 측량되었다. mRNA가 과발현되는 범위는 정상 및 병든 세포를 이용하여 은색의 결들을 관찰하여 비교해 봄으로써 측정되었다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 플루어레신 혹은 다른 형광 테그로 표지하여 mRNA 발현에 있어서 플루어레신을 검출하는 분석은 상기와 유사하게 실시되었다. 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드들은 DNA 자동합성기(Applied Biosystems model 380B)에서 요오드를 산화제로 하여 표준 포스포아미디트 캐미스트리를 이용하여 합성되었다. β-시아노에틸디이소프로필 포스포아미디트는 Applied Biosystems(Foster City, CA)에서 구입하였다. 플루어레신-표지된 아미디트는 Glen Research(Sterling, VA)에서 구입한다. 올리고뉴클레오티드 및 생물학적 샘플의 배양은 섬광 계수기 대신 플루어레신 현미경이 플루어레신 검출에 이용되는것만 제외하고는 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드에서 기재된 바와 같이 실시하였다. 정상 혹은 병든 세포들의 샘플에서 발견되는 플루어레신을 비교하여 mRNA 과발현을 검출할 수 있었다.
절 차 8
비정상적인 mRNA 발현의 검출
비정상적 mRNA를 발현하는 것으로 의심되는 조직 혹은 세포 샘플을, 야생형(정상) mRNA에 표적되는32P 혹은 플루어레신으로 표지된 올리고뉴클레오티드와 함께 첫 번째로 배양하였다. 동일한 세포 혹은 조직 샘플을 특이적 잡종화가 이루어질 수 있는 상태 하에서, 비정상적인 mRNA을 표적하는 표지된 올리고뉴클레오티드와 함께 두 번째로 배양하고, 상기 샘플을 세척하여 비결합된 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 상기 샘플에 남아있는 표지는 올리고뉴클레오티드의 결합을 의미하는 것이며, 섬광 계수기, 형광 측정기(fluorimeter) 혹은 다른 일반적인 방법들로 측량될 수 있었다. 만약 결합이 첫 번째 샘플이 아니라 두 번째 샘플에서 발견된다면, 이는 비정상적인 mRNA가 존재하는 것을 의미하는 것이다.
이중 표지는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 그 방법에 이용될 수 있으며 비정상적인 mRNA의 발현을 특이적으로 검출할 수 있다. 단 하나의 조직 샘플은 특이적으로 잡종화될 수 있는 상태하에서, 야생형 mRNA를 표적하는32P로 첫 번째 표지된 올리고뉴클레오티드와 함께, 그리고 비정상적인 mRNA를 표적하는 플루어레신으로 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드와 함께 배양된다. 상기 샘플을 비결합된 올리고뉴클레오티드가 제거되도록 세척하여, 상기 표지를 섬광 계수기 혹은 형광 측정기에 의하여 검출한다. 상기 샘플이32P-표지된 올리고뉴클레오티드에 결합되지 않으나(즉, 방사능성이 없는) 상기 형광 표지를 갖고 있다면, 이는 비정상적 mRNA가 존재하는 것을 의미하는 것이다.