JP2022515744A - Ｋｃｎｔ１関連障害の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＫＣＮＴ１関連障害を治療することを、例えば、それを必要とする対象において行うための有用な組成物及び方法を特徴とする。本発明は、例えば、配列番号３５２６に対して少なくとも９０％同一である配列を含む転写産物の少なくとも１０個の連続する核酸塩基に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列、または配列番号３５２６の連続する１５から５０個の核酸塩基部分を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む、化合物、を提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，８７７号、２０１９年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／８６２，３２８号、及び２０１９年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８８４，５６７号の権益と優先権を主張し、それぞれの開示全体は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１２月１９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＲＸ－０３９ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１，００５，５５２バイトのサイズである。
ＫＣＮＴ１は、中枢神経系で発現するナトリウム活性化カリウムチャネル（細胞内ナトリウム活性化チャネル、サブファミリーＴメンバー１）をコードする。Ｓｌａｃｋ及びＫＮａ１．１としても知られるＫＣＮＴ１は、カリウムチャネル遺伝子のＳＬＯ型ファミリーのメンバーであり、他のＳＬＯチャネルサブユニットとともに共集合することができる。これらのチャネルは、ナトリウム感受性カリウム電流（ＩＫＮａ）を媒介することができ、これはナトリウムチャネルまたは神経伝達物質受容体を介したナトリウムチャネルイオンの流入によって引き起こされるものである。この遅延した外向き電流は、ニューロンの興奮性の調節に関与していると考えられている。
ＫＣＮＴ１の変異（例えば、機能獲得型変異）は、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん（ＥＩＭＦＳ）、常染色体優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群を含む、特定の形態のてんかんに関連している。現在、これらの病気の治療法はない。したがって、これらの疾患を治療するための新しい組成物及び方法が必要である。
一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号３５２６に対して少なくとも９０％同一である配列を含む転写産物の少なくとも１０個の連続する核酸塩基に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列、または配列番号３５２６の、連続する１５から５０個の核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチドを含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む化合物である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３５２６に対して少なくとも９０％同一である配列を含む転写産物の少なくとも１０個の連続する核酸塩基に１００％相補的な核酸塩基配列、または配列番号３５２６の、連続する１５から５０個の核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチドを含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、化合物を提供する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号３５２６に対して少なくとも９０％同一である配列を含む転写産物の少なくとも１０個の連続する核酸塩基に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列、または配列番号３５２６の連続する１５から５０個の核酸塩基部分を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と１００％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と１００％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１１６のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１～１１６のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と１００％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と１００％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と１００％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを提供する。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５－１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む化合物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、ここで、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む化合物である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基配列を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、配列番号３５２６の位置３７４、６６１、７６５、８３７、１３４７、１６２９、２８７９、３００８、３１６８、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、６６５～６８０、１３４０～１３７０、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７１のうちのいずれか１つの１０個の核酸塩基の範囲内の等しい長さの部分に対して少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む化合物である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、配列番号３５２６の位置３７４、６６１、７６５、８３７、１３４７、１６２９、２８７９、３００８、３１６８、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、６６５～６８０、１３４０～１３７０、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７１のうちの１０個の核酸塩基の範囲内の等しい長さの部分に対して少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置６５５～６８０、１３４０～１３７、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７５のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号 ３５２６の位置６５５～６６５、６６０～６７０、６６５～６７５、または６７０～６８０のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置１３４０～１３５０、１３４５～１３５５、１３５０～１３６０、１３５５～１３６５、または１３６０～１３７０のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置１７４０～１７５０、１７４５～１７５５、１７５０～１７６０、１７５５～１７６５、１７６０～１７７０、１７６５～１７７５、１７７０～１７８０、１７７５～１７８５、１７８０～１７９０、１７８５～１７９５、１７９０～１８００、１７９５～１８０５、１８００～１８１０、または１８０５～１８１５のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置３１１０～３１２０、３１１５～３１２５、３１２０～３１３０、３１２５～３１３５、３１３０～３１４０、３１３５～３１４５、３１４０～３１５０、３１４５～３１５５、３１５０～３１６０、３１５５～３１６５、３１６０～３１７０、３１６５～３１７５、３１７０～３１８０のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置３７４、６６１、７６５、８３７、１３４７、１６２９、２８７９、３００８、３１６８、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、６５５～６８０、１３４０～１３７０、１７４０～１８１５、または３１１０－３１７１のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置６５５～６８０、１３４０～１３７、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７５のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基を含み、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２～４０の核酸塩基の長さである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下を含む：連結したデオキシリボヌクレオシド、２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、及びフルオロシクロヘキセン核酸（Ｆ－ＣｅＮＡ）のうちの１つ以上を含むギャップセグメント；連結したヌクレオシドを含む５’ウィングセグメント；連結したヌクレオシドを含む３’ウィングセグメント。ここで、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に配置された配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも８つの連続する核酸塩基の領域を含む。ここで、５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントはそれぞれ、少なくとも２つの連結したヌクレオシドを含む。ここで、各々のウィングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下を含む：連結したデオキシリボヌクレオシド、２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、及びフルオロシクロヘキセン核酸（Ｆ－ＣｅＮＡ）のうちの１つ以上を含むギャップセグメント；連結したヌクレオシドを含む５’ウィングセグメント；連結したヌクレオシドを含む３’ウィングセグメント。ここで、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に配置された配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも８つの連続する核酸塩基の領域を含む。ここで、５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントはそれぞれ、少なくとも２つの連結したヌクレオシドを含む。ここで、各々のウィングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドは、修飾糖を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連結したヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、２’－アルコキシ結合、アルキルリン酸エステル結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、メチルホスホネート結合、ジメチルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホルアミデート結合、ホスホロジアミデート結合、アミノアルキルホスホルアミデート結合、チオホスホルアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、及びボラノホスフェート結合からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、５’ウィングセグメントのうちの少なくとも２つの連結したヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して連結され、ここで、３’ウィングセグメントのうちの少なくとも２つの連結したヌクレオシドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して連結され、ギャップセグメントのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも１つは、修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基配列のヌクレオシド間結合のうちの少なくとも２つ、３つ、または４つは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、ギャップセグメントのヌクレオシド塩基間のヌクレオシド間結合のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基配列の少なくとも２つのヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基配列の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基配列の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、５’ウィングセグメントの少なくとも２つの連結したヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド間結合を介して連結されている。
いくつかの実施形態では、３’ウィングセグメントの少なくとも２つの連結したヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド間結合を介して連結されている。
いくつかの実施形態では、５’ウィングセグメントのうちの少なくとも２つの連結したヌクレオシドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結され、ここで、３’ウィングセグメントのうちの少なくとも２つの連結したヌクレオシドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結され、ギャップセグメントのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも１つは、修飾ヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、核酸塩基配列のヌクレオシド間結合のうちの少なくとも２つ、３つ、または４つは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、ギャップセグメントのヌクレオシド塩基間のヌクレオシド間結合のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、Ｒｐ配置またはＳｐ配置のうちの１つである。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、混合ステロ濃縮（例えば、Ｓｐ－Ｒｐ－ＳｐまたはＲｐ－Ｓｐ－Ｒｐ）ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾核酸塩基は、５’－メチルシトシン、シュードウリジン、または５－メトキシウリジンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は二環式糖である。いくつかの実施形態では、二環式糖は、４’－ＣＨ（Ｒ）－Ｏ－２’ブリッジを含み、式中、Ｒが独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
いくつかの実施形態において、修飾糖部分は、２’－ＯＭｅ修飾糖部分、二環式糖部分、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル２’－４’－架橋核酸（ｃＥｔ）、Ｓ－ｃＥｔ、ｔｃＤＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、及び三環類似体（例えば、ｔｃＤＮＡ）のうちの１つである。いくつかの実施形態では、修飾された糖部分は、拘束エチル２’－４’架橋核酸（ｃＥｔ）、例えば、Ｓ－ｃＥｔである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して結合される１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端でホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結される３つの連続するヌクレオシド塩基と、３’末端でホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結される３つの連続するヌクレオシド塩基を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結される５つの連続するヌクレオシド塩基を含む。
いくつかの実施形態では、５つの連続するヌクレオシド塩基の各々は、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド塩基の各々は、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、ギャップセグメントは、１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、ギャップセグメントは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、５’ウィングセグメントは、ホスホジエステルヌクレオシド結合を介して連結される２つの連続するヌクレオシド塩基を含み、３’ウィングセグメントは、ホスホジエステルヌクレオシド結合を介して連結される２つの連続するヌクレオシド塩基を含む。
いくつかの実施形態では、ギャップセグメントの５つの連続するヌクレオシド塩基は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結され、ここで、５’ウィングセグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、３’ウィングセグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、幾何異性体、エナンチオマー、及びジアステレオマーから選択される立体異性体として存在する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下のいずれかのパターンの糖修飾を含む：ｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅｅ、ｄ２０、ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅ、ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅ、及びｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅ。式中、ｅ＝２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド；ｄ＝２’－デオキシヌクレオシド；ｋ＝ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束メトキシエチル（ｃＭＯＥ）ヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥＴ）ヌクレオシド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下のいずれかのパターンのヌクレオシド間結合を含む：ｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、ｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、ｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ、及びｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ。式中ｓ＝ホスホロチオエート結合、及びｏ＝ホスホジエステル結合である。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ以下のいずれかのパターンの糖修飾及びヌクレオシド間結合の組み合わせを含む：ａ）ｄ２０とｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ；ｂ）ｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ；ｃ）ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ；ｄ）ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅとｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ；及びｅ）ｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅとｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾シトシンを含む。
いくつかの実施形態では、修飾シトシンは、５－メチル－デキソシトシン（５－メチル－ｄＣ）である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾及びヌクレオシド間結合の組み合わせであるｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓを含み、シトシンは、５－メチル－ｄＣとして修飾されている。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、それぞれ以下のいずれかのパターンの糖修飾及びヌクレオシド間結合の組み合わせを含む：ａ）ｄ２０とｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ；ｂ）ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ；ｃ）ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅとｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ；及びｄ）ｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅとｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ。オリゴヌクレオチド中の任意のシトシンは、非修飾のシトシンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列の標的領域の核酸塩基配列と相補的であり、標的核酸の標的領域の核酸塩基配列は、少なくとも１つの非標的核酸配列の核酸塩基配列と１～３個の異なる核酸塩基によって異なり、非標的核酸は、配列番号３５２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、１～３個の異なる核酸塩基は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、標的領域に存在するＳＮＰは、配列番号３５２６の等しい長さの部分と比較されるＳＮＰである。いくつかの実施形態では、一塩基多型は、ｒｓ３９７５１５４０３、ｒｓ３９７５１５４０２、ｒｓ５８７７７７２６４、ｒｓ３９７５１５４０４、ｒｓ８６６２４２６３１、ｒｓ８８６０４３４５５、ｒｓ３９７５１５４０７、及びｒｓ３９７５１５４０６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、一塩基多型は、配列番号３５２６に示される配列の１１１２位のＣからＧ、配列番号３５２６に示される配列の２８４５位のＣからＴ、及び配列番号３５２６に示される配列の８８５位のＧからＴからなる群から選択される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、上述の請求項のいずれか１つの化合物またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所、髄腔内、嚢内、非経口、経口、肺、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、頬側、舌下、膣、または十二指腸内投与に適している。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、上述の請求項のいずれか１つの化合物またはオリゴヌクレオチドと、脂質ナノ粒子、ポリプレックスナノ粒子、リポプレックスナノ粒子、またはリポソームとを含む組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＫＣＮＴ１関連障害を有する対象の細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる方法であって、本明細書に記載の化合物、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、または本明細書に記載の医薬組成物を、細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を下げるのに十分な量及び期間で細胞と接触させることを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、細胞は中枢神経系の細胞である。
別の態様において、本明細書で提供されるのは、神経疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、患者へ転写産物の阻害剤を投与することを含み、転写産物は、配列番号３５２６と少なくとも９０％の同一性を共有する、方法である。
いくつかの実施形態では、阻害剤は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の医薬組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に記載の化合物、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、または本明細書に記載の医薬組成物を、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させるのに十分な量及び期間で対象に投与することを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１関連障害は、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＫＣＮＴ１に機能獲得型変異を有する。
いくつかの実施形態では、機能獲得型変異は、Ｖ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ｉ、Ｇ２８８Ｓ、Ｆ３４６Ｌ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ４７４Ｈ、Ｆ５０２Ｖ、Ｍ５１６Ｖ、Ｋ６２９Ｎ、Ｉ７６０Ｍ、Ｙ７９６Ｈ、Ｅ８９３Ｋ、Ｍ８９６Ｉ、Ｍ８９６Ｋ、Ｐ９２４Ｌ、Ｒ９２８Ｃ、Ｆ９３２Ｉ、Ａ９３４Ｔ、Ａ９６６Ｔ、Ｈ２５７Ｄ、Ｒ２６２Ｑ、Ｑ２７０Ｅ、Ｖ３４０Ｍ、Ｃ３７７Ｓ、Ｐ４０９Ｓ、Ｌ４３７Ｆ、Ｒ４７４Ｃ、Ａ４７７Ｔ、Ｒ５６５Ｈ、Ｋ６２９Ｅ、Ｇ６５２Ｖ、Ｉ７６０Ｆ、Ｑ９０６Ｈ、Ｒ９３３Ｇ、Ａ９３４Ｔ、Ｒ９５０Ｑ、Ｒ９６１Ｈ、Ｒ１１０６Ｑ、Ｋ１１５４Ｑ、Ｒ４７４Ｑ、Ｙ１９０３Ｃ、Ｈ４６９Ｌ、Ｍ８９６Ｒ、Ｋ９４６Ｅ、及びＲ９５０Ｌからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、機能獲得型変異は、Ｇ２８８Ｓ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ９２８Ｃ、またはＡ９３４Ｔである。
いくつかの実施形態では、該方法は、ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状を低減させる。
いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状は、長期の発作、頻繁な発作、行動及び発達の遅延、運動及びバランスの問題、整形外科的状態、言語遅延及び発声の問題、成長及び栄養の問題、睡眠困難、慢性感染症、感覚統合障害、自律神経系の乱れ、ならびに発汗からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所的、非経口的、髄腔内、嚢内、経口、直腸、頬側、舌下、膣内、肺内、気管内、鼻腔内、経皮、または十二指腸内に投与される。
いくつかの実施形態では、患者は、ヒトである。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１転写産物の等しい長さの部分に少なくとも８５％の配列相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＫＣＮＴ１転写産物の等しい長さの部分に少なくとも８５％の配列相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及び／またはＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＫＣＮＴ１転写産物の等しい長さの部分に少なくとも８５％の配列相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４０％～７０％のＧＣ含有量を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１転写産物に対して２つ以下のミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、任意の非ＫＣＮＴ１転写産物に対する少なくとも３つのミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧの４塩基組を欠いている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５１２～３５２５のいずれでもない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５１２～３５２５のいずれでもない。
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、及び添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
アンチセンスオリゴヌクレオチド処理に応答したｈＫＣＮＴ１のノックダウンのパーセンテージを示すプロットである。
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語及び語句の意味を以下に提供する。特に明記されていない限り、または文脈から暗示されている場合を除き、以下の用語及び語句には、以下に示す意味が含まれている。定義は特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、本技術の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特許請求される技術を限定することを意図しない。別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本技術の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。当該技術分野における用語の使用法と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書内で提供される定義が優先するものとする。
本出願では、文脈から別様であることが明確でない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解することができ、（ｉｉ）「または」という用語は、「及び／または」を意味すると理解することができる、（ｉｉｉ）「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、それ自体で提示されるか、１つ以上の追加のコンポーネントまたはステップと一緒に提示されるかにかかわらず、項目化されたコンポーネントまたはステップを包含すると理解することができる。
本明細書で使用されるとき、「約」及び「およそ」という用語は、記載されている値の上下１０％以内の値を指す。例えば、「約５ｎＭ」という用語は、４．５～５．５ｎＭの範囲を示す。
数または一連の数の前の「少なくとも」という用語は、文脈から明らかなように、「少なくとも」という用語に連続する数、及び論理的に含めることができる後続の全ての数または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子のうちの少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが示された特性を有することを意味する。少なくとも一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連の数または範囲内の各数を修飾できることが理解される。
本明細書で使用されるとき、「以下」または「未満」は、語句に連続する値として理解され、論理的に低い値または整数は、文脈から論理的であるように、ゼロまでである。例えば、「標的配列に対して３つ以下のミスマッチ」を有するオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して３、２、１、または０のミスマッチを有する。一連の数字または範囲の前に「以下」が存在する場合、「以下」は、一連の数または範囲内の各数を修飾できることが理解される。
本明細書で使用されるとき、「投与」という用語は、対象または系への組成物（例えば、本明細書に記載の化合物または化合物を含む製剤）の投与を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、本明細書に記載されるものなどの任意の適切な経路によるものであり得る。
本明細書で使用されるとき、「併用療法」または「組み合わせでの投与」とは、特定の疾患または状態に対する定義された治療レジメンの一部として、２つ（またはそれ以上）の異なる薬剤または治療が対象に投与されることを意味する。治療レジメンは、対象に対する別個の薬剤の効果が重複するように、各薬剤の投与の用量及び周期性を定義する。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤の送達は同時または並行であり、薬剤が共製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤は共製剤化されておらず、処方されたレジメンの一部として逐次投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤または治療を組み合わせて投与すると、症状または障害に関連する他のパラメーターの低下が、１つの薬剤または治療が単独で、または他の非存在下で送達されるときに観察されるより大きくなる。２つの治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的より大きい（例えば、相乗的）ものであり得る。各治療薬の逐次的または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織を介した直接吸収を含むがこれらに限定されない、任意の適切な経路によって達成され得る。治療薬は、同じ経路または異なる経路で投与することができる。例えば、組み合わせの第１の治療薬は静脈内注射によって投与されてもよく、一方で組み合わせの第２の治療薬は経口投与されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「ＫＣＮＴ１」という用語は、特に明記されていない限り、ヒト、ウシ、ニワトリ、げっ歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、及びモルモットを含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物または哺乳動物の供給源由来のアミノ酸配列を有するナトリウム活性化カリウムチャネルサブファミリーＴメンバー１を指す。この用語はまた、天然ＫＣＮＴ１のインビボまたはインビトロ活性の少なくとも１つを維持する天然ＫＣＮＴ１の断片またはバリアントを指す。この用語は、ＫＣＮＴ１の全長の未処理の前駆体形態、及びシグナルペプチドの翻訳後切断から生じる成熟形態を包含する。ＫＣＮＴ１はＫＣＮＴ１遺伝子によってコードされている。例示的なＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ（ヒト）のＫＣＮＴ１遺伝子の核酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿０３３０７０．１に記載されている。例示的なＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ（ヒト）のＫＣＮＴ１転写産物の核酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０２０８２２．２及びＮＭ＿００１２７２００３．１に記載されている。「ＫＣＮＴ１」という用語はまた、野生型ＫＣＮＴ１タンパク質の天然バリアント、例えば、野生型ヒトＫＣＮＴ１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上の同一性）を有するタンパク質を指す。例示的なＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）のＫＣＮＴ１転写産物の核酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿１７５４６２．４及びＮＭ＿００１１４５４０３．２、及びＮＭ＿０１３０２３５１．１に記載されている。例示的なＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）のＫＣＮＴ１転写産物の核酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＸＭ＿０１５４３６４５６．１に記載されている。
本明細書で使用される「ＫＣＮＴ１」という用語はまた、ＫＣＮＴ１遺伝子の一塩基多型など、ＫＣＮＴ１遺伝子の天然に存在するＤＮＡ配列の変形によって細胞内で発現する特定のポリペプチドを指す。ＫＣＮＴ１転写産物内の多数のＳＮＰが同定されている（例えば、表１を参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＫＣＮＴ１遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態では、配列の標的部分は、少なくとも、ＫＣＮＴ１遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分においてまたはその近傍でのオリゴヌクレオチド指向性（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）指向性）切断のための基質として機能するのに十分な長さであろう。標的配列は、例えば、約９～３６ヌクレオチドの長さ、例えば、約１５～３０ヌクレオチドの長さ、例えば、約１８～２２ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、標的配列は、約１５～３０ヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さであり得る。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さもまた、本発明の一部であることが企図される。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、及びウラシルを塩基として含む天然に存在するヌクレオチドを表す。しかしながら、「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるように、代替ヌクレオチド、または代理置換部分を指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、他の部分によって置き換えることができることをよく認識している。例えば、非限定的に、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明で特徴づけられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドで置き換えることができる。別の例では、オリゴヌクレオチドの任意の場所のアデニン及びシトシンをそれぞれグアニン及びウラシルで置き換えて、標的ｍＲＮＡとのＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成することができる。そのような置換部分を含む配列は、本発明で特徴づけられる組成物及び方法に適している。
「核酸塩基」及び「塩基」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含む。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なっていてもよいが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である代替核酸塩基を包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、代替核酸塩基の両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＲｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５ ａｎｄ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載される。
「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基及び糖部分を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのモノマー単位を指す。ヌクレオシドは、天然に存在するもの、及び本明細書に記載されるものなどの代替ヌクレオシドを含み得る。ヌクレオシドの核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基または代替核酸塩基であり得る。同様に、ヌクレオシドの糖部分は、天然に存在する糖または代替糖であり得る。
「代替ヌクレオシド」または「修飾ヌクレオシド」という用語は、本明細書に記載されているような代替糖または代替核酸塩基を有するヌクレオシドを指す。
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、置換プリンまたは置換ピリミジンなどの修飾プリンまたはピリミジン、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウリジン、５－ブロモウリジン５－チアゾロ－ウリジン、２－チオ－ウリジン、シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、５－メトキシウリジン、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される「代替核酸塩基」に変更することによって修飾される。
核酸塩基部分は、それぞれ対応する核酸塩基、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵに対する文字コードによって示すことがで、各文字には、同等の機能の代替核酸塩基を任意選択で含めることができる。いくつかの実施形態では、例えば、ギャップマーについては、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用することができる。
「糖」または「糖部分」には、フラノース環を有する天然に存在する糖が含まれる。糖には、ヌクレオシドのフラノース環を置き換えることができる構造として定義される「代替糖」も含まれる。ある特定の実施形態では、代替糖は、非フラノース（または４’－置換フラノース）環または環系または開放系である。このような構造には、６員環などの天然のフラノース環に比べて単純な変化が含まれるか、またはペプチド核酸で使用される非環系の場合のように複雑になってもよい。代替糖はまた、フラノース環が、例えば、モルホリノまたはヘキシトール環系などの別の環系で置き換えられている糖代替物を含み得る。モチーフを有するオリゴヌクレオチドの調製に有用な糖部分には、非限定的に、β－Ｄ－リボース、β－Ｄ－２’－デオキシリボース、置換糖（２’、５’及びビス置換糖など）、４’－Ｓ－糖（４’－Ｓ－リボース、４’－Ｓ－２’－デオキシリボース、４’－Ｓ－２’－置換リボースなど）、二環式代替糖（２’－Ｏ－ＣＨ２－４’または２’－Ｏ－（ＣＨ２）２－４’架橋リボース由来の二環式糖）及び糖代替物（リボース環がモルホリノまたはヘキシトール環系に置き換えられた場合など）が含まれる。各位置で使用される複素環式塩基及びヌクレオシド間結合のタイプは可変であり、モチーフを決定する因子ではない。代替糖部分を有するほとんどのヌクレオシドでは、複素環式核酸塩基は、一般に、ハイブリダイゼーションを可能にするために維持されている。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド及びヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのモノマー単位を指す。ヌクレオシド間結合は、リン酸結合を含んでも含まなくてもよい。同様に、「連結したヌクレオシド」は、リン酸結合によって結合されていてもいなくてもよい。リン酸、ホスホロチオエート、及びボラノリン酸結合を含むがこれらに限定されない、多くの「代替ヌクレオシド間結合」が当該技術分野で知られている。代替ヌクレオシドには、本明細書に記載されているものを含む、二環式ヌクレオシド（ＢＮＡ）（例えば、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）及び拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド）、ペプチドヌクレオシド（ＰＮＡ）、ホスホトリエステル、ホスホロチオネート、ホスホルアミデート、及び天然ヌクレオシドのリン酸骨格の他のバリアントが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「代替ヌクレオチド」は、代替ヌクレオシドまたは代替糖、及び代替ヌクレオシド結合を含み得るヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドを指す。
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、当業者によって、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーと呼ばれることもある。オリゴヌクレオチドは通常、固相化学合成とそれに続く精製によって実験室で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列または順序、あるいはそれらの修飾に言及する。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり得、化学的に合成され、そして典型的には精製または単離される。オリゴヌクレオチドはまた、（ｉ）基本部分の共有結合点として使用され得るフラノース誘導体または環状もしくは非環状の任意の構造によって置換された１つ以上のフラノース部分を有する化合物、（ｉｉ）ホスホルアミデートもしくはホスホロチオエート結合の場合のように修飾されているか、またはホルムアセタールもしくはリボアセタール結合の場合のように適切な結合部分によって完全に置き換えられている１つ以上のホスホジエステル結合を有する化合物、及び／または（ｉｉｉ）塩基部分の共有結合点として使用できる、環状または非環状の任意の構造で置き換えられた１つ以上の結合したフラノース－ホスホジエステル結合部分を有する化合物を含むことを意図している。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の代替ヌクレオシドまたはヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のものを含む）を含み得る。オリゴヌクレオチドは、糖部分または核酸塩基を欠く組成物を含むが、それでも標的配列との対形成またはハイブリダイズすることができることも理解されよう。
「オリゴヌクレオチド」は、短いポリヌクレオチド（例えば、１００個以下の連結したヌクレオシド）を指す。
本発明の文脈における「キメラ」オリゴヌクレオチドまたは「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、それらの領域それぞれが少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチドの場合はヌクレオチドまたはヌクレオシドから構成されるオリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドには「ギャップマー」も含まれる。
オリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであり得、約１０～３０塩基対の長さ、例えば、約１５～３０塩基対の長さまたは約１８～２２（例えば、１８～２０）塩基対の長さ、例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対の長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さの範囲であり得る。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さもまた、本発明の一部であることが企図される。
本明細書で使用されるとき、「核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチド」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって記載されるヌクレオチドまたはヌクレオシドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「連続する核酸塩基領域」という用語は、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書では、「連続するヌクレオチド配列」または「連続する核酸塩基配列」という用語と互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続するヌクレオチドまたはヌクレオシド領域に存在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続するヌクレオチド領域を含み、任意選択で、さらなるヌクレオチド（複数可）またはヌクレオシド（複数可）、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。いくつかの実施形態では、連続するヌクレオチド領域のヌクレオチド間に存在するヌクレオシド間結合は、全てホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、連続するヌクレオチド領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用されるとき、「ギャップマー」という用語は、１つ以上の親和性増強代替ヌクレオシド（ウィングまたは隣接）を含む領域が５’及び３’に隣接するＲＮａｓｅ Ｈ動員オリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含むオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマー設計が本明細書に記載されている。ヘッドマー及びテールマーは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員できるオリゴヌクレオチドであり、ウィングの１つが欠落している、例えば、オリゴヌクレオチドの一方の末端のみが親和性増強代替ヌクレオシドを含む。ヘッドマーの場合、３’ウィングが欠落しており（例えば、５’ウィングが親和性増強代替ヌクレオシドを含む）、テールマーの場合、５’ウィングが欠落している（例えば、３’ウィングが親和性増強代替ヌクレオシドを含む）。「混合ウィングギャップマー」は、ウィング領域が、少なくとも１つの代替ヌクレオシド、例えば、ＤＮＡヌクレオシド、または少なくとも１つの２’置換代替ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシド（複数可）、または二環式ヌクレオシド（例えば、ロックドヌクレオシドまたは拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオシド）を含む、ギャップマーを指す。いくつかの実施形態では、混合ウイングギャップマーは、代替ヌクレオシド（例えば、５’または３’）を含む１つのウィングと、２’置換代替ヌクレオシド（複数可）を含む他のウィング（それぞれ３’または５’）を有する。
「リンカー」または「連結基」という用語は、１つ以上の共有結合を介して、１つの化学基または目的のセグメントを別の化学基または目的のセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分を、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分をオリゴヌクレオチド（例えば、領域ＡまたはＣの末端）に共有結合させるよう機能する。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意選択で、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に配置するリンカー領域を含み得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは、生体切断可能である。生体切断可能なリンカーを含むホスホジエステルは、国際公開番号ＷＯ２０１４／０７６１９５（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
本明細書で使用されるとき、特に明記しない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列に関連して第１のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列を説明するために使用される場合、当業者が理解するように、第１のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、ある特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であってよく、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃、または７０℃で、１２～１６時間、続いて洗浄を含んでよい（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物の内部で遭遇する可能性のある生理学的に関連する条件などの他の条件が適用されてもよい。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドまたはヌクレオシドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
本明細書で使用されるとき、「相補的」配列はまた、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン－クリック塩基対及び／または非天然及び代替ヌクレオチドもしくはヌクレオシドから形成される塩基対を含むか、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン－クリック塩基対には、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるとき、オリゴヌクレオチドと標的配列との間の相補的配列には、第１のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、一方または両方のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列の全長にわたる第２のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対形成が含まれる。そのような配列は、本明細書において互いに「完全に相補的」であると呼ぶことができる。しかしながら、第１の配列が本明細書の第２の配列に関して「実質的に相補的」と呼ばれる場合、２つの配列は完全に相補的であり得るか、またはそれらは、３０塩基対までの二重鎖についてのハイブリダイゼーション時に１つ以上、しかし一般に５、４、３、または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成することができ、一方でそれらの最終的な用途、例えば、リボヌクレアーゼＨ媒介経路を介する遺伝子発現の阻害に最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を保持する。「実質的に相補的」はまた、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＫＣＮＴ１をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指すことができる。例えば、配列がＫＣＮＴ１をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ポリヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用されるとき、「相補性の領域」という用語は、内因性遺伝子（例えば、ＫＣＮＴ１）の発現を妨害するように、遺伝子、一次転写産物、配列（例えば、標的配列、例えば、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡのヌクレオチド配列、またはＫＣＮＴ１の転写産物バリアント）、またはプロセシングされたｍＲＮＡの全てまたは一部分と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチは分子の内部または末端領域にあってもよい。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、オリゴヌクレオチドの５’及び／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内にある。
本明細書で使用されるとき、「ＫＣＮＴ１レベル及び／または活性を低下させる薬剤」は、細胞または対象におけるＫＣＮＴ１のレベルを低下させるか、またはその発現を阻害する任意のポリヌクレオチド剤（例えば、オリゴヌクレオチド、例えば、ＡＳＯ）を指す。本明細書で使用されるとき、「ＫＣＮＴ１の発現を阻害する」という語句は、いずれかのＫＣＮＴ１遺伝子（例えば、マウスＫＣＮＴ１遺伝子、ラットＫＣＮＴ１遺伝子、サルＫＣＮＴ１遺伝子、またはヒトＫＣＮＴ１遺伝子など）、ならびにＫＣＮＴ１タンパク質をコードするＫＣＮＴ１遺伝子のバリアントまたは変異体の発現の阻害を含む。したがって、ＫＣＮＴ１遺伝子は、野生型ＫＣＮＴ１遺伝子、変異体ＫＣＮＴ１遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞群、または生物との関連でのトランスジェニックＫＣＮＴ１遺伝子であり得る。
「ＫＣＮＴ１の活性を低下させる」とは、ＫＣＮＴ１に関連する活性のレベル（例えば、イオンチャネル機能）を低下させることを意味する。ＫＣＮＴ１の活性レベルは、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して（例えば、標準的な生物物理学的方法を使用して）測定することができる。
「ＫＣＮＴ１のレベルを低下させる」とは、例えば、細胞または対象にオリゴヌクレオチドを投与することによって、細胞または対象中のＫＣＮＴ１の量を低下させることを意味する。ＫＣＮＴ１のレベルは、当該分野で公知の任意の方法を用いて（例えば、細胞または対象におけるＫＣＮＴ１のｍＲＮＡのレベルまたはＫＣＮＴ１タンパク質のレベルを測定することによって）測定することができる。
本明細書で使用されるとき、「阻害剤」という用語は、タンパク質（例えば、ＫＣＮＴ１）のレベル及びまたは活性を低下させる任意の薬剤を指す。阻害剤の非限定的な例には、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド、例えば、ＡＳＯ）が含まれる。本明細書で使用される「阻害すること」という用語は、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」、及び他の同様の用語と互換的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドなどの「オリゴヌクレオチドを細胞と接触させる」という句は、任意の可能な手段によって細胞と接触させることを含む。細胞をオリゴヌクレオチドと接触させることは、インビトロでオリゴヌクレオチドを細胞と接触させること、またはインビボでオリゴヌクレオチドを細胞と接触させることを含む。接触させることは直接的または間接的に行うことができる。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドは、方法を実施する個人によって細胞と物理的に接触させることができ、代替的に、オリゴヌクレオチド剤は、その後細胞と接触することを可能にするかまたは引き起こす状況に置くことができる。
インビトロでの細胞との接触は、例えば、細胞をオリゴヌクレオチドとインキュベートすることによって行うことができる。インビボでの細胞との接触は、例えば、細胞が位置する組織の中またはその近くにオリゴヌクレオチドを注入することによって、またはオリゴヌクレオチド剤を別の領域、例えば、血流または皮下空間に注入し、その後、薬剤が接触する細胞が位置する組織に到達するようにすることによって、行うことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを目的の部位、例えば肝臓に誘導するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含み得るか、及び／または結合させることができる。インビトロ及びインビボの接触方法の組み合わせも可能である。例えば、細胞はまた、インビトロでオリゴヌクレオチドと接触させられ、その後、対象に移植され得る。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドを細胞と接触させることは、細胞への取り込みまたは吸収を促進または達成することによって「オリゴヌクレオチドを細胞に導入する」または「送達する」ことを含む。ＡＳＯの吸収または取り込みは、支援されていない拡散性もしくは能動的な細胞プロセスを通じて、または補助剤またはデバイスによって発生し得る。オリゴヌクレオチドを細胞へ導入することはインビトロ及び／またはインビボであってよい。例えば、インビボでの導入では、オリゴヌクレオチドを組織部位に注射するか、全身投与することができる。細胞へのインビトロ導入には、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの当該技術分野で知られている方法が含まれる。さらなるアプローチは、以下に説明されており、及び／または当該技術分野で知られている。
本明細書で使用されるとき、「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、核酸分子、例えばオリゴヌクレオチドなどの薬学的に活性な分子をカプセル化する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰは、安定した核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。ＬＮＰは、例えば、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２号、同第８，１５８，６０１号、及び同第８，０５８，０６９号に記載されている。
本明細書で使用されるとき、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームには、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する単層及び多層小胞が含まれる。水性部分はオリゴヌクレオチド組成物を含む。親油性材料は、水性内部を水性外部から分離し、これは典型的には、オリゴヌクレオチド組成物を含まないが、いくつかの例では含まれ得る。リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の特殊な脂質を含むリポソームであって、リポソームに組み込まれると、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して増強された循環寿命をもたらすものを指す。
「ミセル」は、本明細書では、両親媒性分子が、分子の全ての疎水性部分が内側に向けられ、親水性部分が周囲の水相と接触したままになるように球形構造に配置される特定のタイプの分子集合体として定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
本明細書で使用される「アンチセンス」という用語は、内因性遺伝子（例えば、ＫＣＮＴ１）の発現を妨害するように、遺伝子、一次転写産物、またはプロセシングされたｍＲＮＡの全部または一部に十分に相補的であるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸を指す。「相補的」ポリヌクレオチドは、標準的なワトソン－クリック相補性規則に従って塩基対形成することができるものである。具体的には、プリンはピリミジンと塩基対を形成し、グアニンとシトシンの組み合わせ（Ｇ：Ｃ）を形成し、アデニンはＤＮＡの場合、チミンと対形成する（Ａ：Ｔ）か、またはＲＮＡの場合、アデニンはウラシルと対形成する（Ａ：Ｕ）かのいずれかである。２つのポリヌクレオチドは、それらが互いに完全に相補的でなくても、それぞれが他方に実質的に相補的である少なくとも１つの領域を有するならば、互いにハイブリダイズし得ることが理解される。
本明細書で使用されるとき、（例えば、細胞または対象における）、「有効量」、「治療有効量」、及び「ＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる薬剤の「十分な量」という用語は、ヒトを含む対象に投与された場合に、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量を指し、したがって、「有効な量」またはその同義語は、それが適用されている文脈によって異なる。例えば、ＫＣＮＴ１関連障害の治療の文脈では、それは、ＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる薬剤の投与なしで得られた応答と比較して、治療応答を達成するのに十分なＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる薬剤の量である。本明細書に記載のＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる特定の薬剤の量は、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患または障害のタイプ、治療される対象または宿主のアイデンティティ（例えば、年齢、性別、及び／または体重）などの様々な因子に応じて変化するが、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定することができる。また、本明細書で使用されるとき、本開示のＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる薬剤の「治療有効量」は、対照と比較して、対象において有益なまたは所望の結果をもたらす量である。本明細書で定義されているように、本開示のＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる薬剤の治療有効量は、当業者によって、当該技術分野で知られている日常的な方法によって容易に決定することができる。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。
本明細書で使用されるとき、「予防的有効量」は、ＫＣＮＴ１関連障害を有するか、または有する素因を有する対象に投与された場合に、疾患または疾患の１つ以上の症状を予防または改善するのに十分である量のオリゴヌクレオチドを含むことを意図する。疾患を改善することには、疾患の進行を緩徐化すること、または後に発症する疾患の重症度を軽減することが含まれる。「予防的有効量」は、オリゴヌクレオチド、薬剤の投与方法、疾患のリスクの程度、及び治療される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、もしあれば先行または併用治療の種類、及び他の個別の特徴に応じて変動し得る。予防的有効量は、例えば、本明細書に記載のＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性（例えば、細胞または対象における）を低下させる薬剤の量を指し、ヒトを含む対象に投与された場合に、本明細書に記載のＫＣＮＴ１関連障害の発症を、予測された発症と比較した場合、少なくとも１２０日、例えば、少なくとも６か月、少なくとも１２か月、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、または以上遅らせるのに十分な量を指す。
「治療的有効量」または「予防的有効量」はまた、いずれかの治療に適用できる合理的な利益／リスク比で何らかの所望の局所的または全身的効果をもたらすオリゴヌクレオチドの（単回または複数回投与のいずれかで投与される）量を含む。本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、そのような治療に適用できる合理的な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与することができる。
本明細書で使用されるとき、「相補性の領域」という用語は、内因性遺伝子（例えば、ＫＣＮＴ１）の発現を妨害するように、遺伝子、一次転写産物、配列（例えば、標的配列、例えば、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡのヌクレオチド配列、またはＫＣＮＴ１の転写産物バリアント）、またはプロセシングされたｍＲＮＡの全てまたは一部分と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチは分子の内部または末端領域にあってもよい。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、オリゴヌクレオチドの５’及び／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内にある。
本明細書で使用されるとき、「ＫＣＮＴ１関連障害を有すると特定される対象」という用語は、ＫＣＮＴ１関連障害またはその症状の特定など、ＫＣＮＴ１関連障害の分子的または病理学的状態、疾患または状態、またはそれらに関連すると特定された対象、あるいは、特定の治療レジメンから利益を得る可能性のあるＫＣＮＴ１関連障害を有するまたは有すると疑われる対象の特定を指す。
本明細書で使用されるとき、「ＫＣＮＴ１関連障害」は、ＫＣＮＴ１の異常な機能を特徴とする遺伝性疾患または障害のクラスを指す。ＫＣＮＴ１関連障害には、例えば、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん（ＥＩＭＦＳ）、常染色体優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群が含まれる。
「タンパク質のレベルを決定すること」とは、直接的または間接的に当該技術分野で知られている方法による、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡの検出を意味する。「直接的に決定すること」とは、物理的実体または値を取得するためのプロセスを実行すること（例えば、試料に対してアッセイまたは試験を実行すること、または「試料を分析すること」）を意味する。「間接的に決定すること」とは、物理的実体または値を別の組織または供給源（例えば、物理的実体または値を直接取得した第三者の研究所）から受け取ることを指す。タンパク質レベルを測定する方法には、概して、ウエスタンブロッティング、イムノブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫蛍光法、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－質量分析、ミクロサイトメトリー、顕微鏡検査、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、及びフローサイトメトリー、ならびに酵素活性または他のタンパク質パートナーとの相互作用を含むがこれらに限定されないタンパク質の特性に基づくアッセイが含まれるが、これらに限定されない。ｍＲＮＡレベルを測定する方法は当該技術分野で知られている。
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における核酸またはアミノ酸と同一である候補配列における核酸またはアミノ酸のパーセンテージと定義される。核酸またはアミノ酸の配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアのような公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当該技術分野における技術の範囲内である様々な方法によって達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定することができる。例えば、配列同一性パーセント値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成され得る。実例として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂへの、またはそれによる、またはそれに対する配列同一性パーセント（あるいは、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂへの、またはそれによる、またはそれに対するある特定の配列同一性パーセントを有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一の一致としてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂ中の核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが、核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへの配列同一性パーセントは、ＢのＡへの配列同一性パーセントと等しくないことに留意されたい。
「レベル」とは、任意選択で参照と比較した、タンパク質、またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ＫＣＮＴ１）のレベルまたは活性を意味する。参照は、本明細書で定義されているように、任意の有用な参照であり得る。タンパク質の「減少したレベル」または「増加したレベル」とは、参照と比較したときの、タンパク質レベルの減少または増加（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００ ％、約５００％、もしくはそれ以上の減少もしくは増加；参照と比較したときの、約１０％、約１５％、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、もしくは約２００％を超える減少もしくは増加；約０．０１倍未満、約０．０２倍、約０．１倍、約０．３倍、約０．５倍、約０．８倍、もしくはそれ以下の減少もしくは増加；または、約１．２倍以上、約１．４倍、約１．５倍、約１．８倍、約２．０倍、約３．０倍、約３．５倍、約４．５倍、約５．０倍、約１０倍折り、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍、約１０００倍、もしくはそれ以上の減少もしくは増加）を意味する。タンパク質のレベルは、質量／体積（例えば、ｇ／ｄＬ、ｍｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ、及びｎｇ／ｍＬ）または試料中の総タンパク質もしくはｍＲＮＡに対するパーセンテージで表すことができる。
本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化され、好ましくは、哺乳動物における疾患の治療のための治療レジメンの一部として政府規制機関の承認によって製造または販売される、本明細書に記載の化合物を含有する組成物を表す。医薬組成物は、例えば、単位剤形（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、またはシロップ）での経口投与のため；（例えば、クリーム、ゲル、ローション、または軟膏としての）局所投与のため；（例えば、粒子塞栓物質を含まない滅菌溶液として、及び静脈内使用に好適な溶媒系で）静脈内投与のため；髄腔内注射用；脳室内注射用；実質内注射用；または任意の他の薬学的に許容される製剤として製剤課することができる。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書に記載の化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）を指し、対象において、実質的に無毒で非炎症性の特性を有する。賦形剤には、例えば、付着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、香料、流動促進剤（流動促進剤）、滑沢剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が含まれ得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコール酸、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物のいずれかの化合物の任意の薬学的に許容される塩を意味する。例えば、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩には、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応なしにヒト及び動物の組織との接触での使用に適しており、合理的な利益／リスク比に見合っているものが含まれる。製薬上許容される塩は当該技術分野でよく知られている。例えば、薬学的に許容される塩は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６６：１－１９，１９７７、及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，（Ｅｄｓ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に記載されている。塩は、本明細書に記載されている化合物の最終的な単離及び精製中にその場で、または遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることにより別々に調製することができる。
本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容される塩として調製することができるように、イオン化可能な基を有し得る。これらの塩は、無機酸または有機酸を含む酸付加塩であり得るか、または塩は、本明細書に記載の化合物の酸性形態の場合、無機塩基または有機塩基から調製され得る。しばしば、化合物は、薬学的に許容される酸または塩基の付加生成物として調製される薬学的に許容される塩として調製または使用される。適切な薬学的に許容される酸及び塩基ならびに適切な塩の調製方法は、当該技術分野で周知である。塩は、無機及び有機の酸及び塩基を含む、薬学的に許容される非毒性の酸及び塩基から調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸、及び吉草酸塩が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウ、ならびに無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されないアミンカチオンが含まれる。
「参照」とは、タンパク質またはｍＲＮＡのレベルまたは活性を比較するために使用される有用な参照を意味する。参照は、比較の目的で使用される任意の試料、標準、標準曲線、またはレベルであり得る。参照は、通常の参照試料または参照標準またはレベルであり得る。「参照試料」は、例えば、対照、例えば、「正常対照」などの所定の陰性対照値、または同じ対象から採取された以前の試料；正常な細胞または正常な組織などの正常な健康な対象からの試料；疾患を有さない対象からの試料（例えば、細胞または組織）；疾患と診断されているが、本明細書に記載の化合物でまだ治療されていない対象からの試料；本明細書に記載の化合物により治療された対象からの試料；または、既知の通常濃度の精製タンパク質（例えば、ここに記載されているいずれかのもの）の試料であり得る。「参照標準またはレベル」とは、参照試料に由来する値または数を意味する。「正常対照値」は、非疾患状態を示す所定の値、例えば、健康な対照対象において期待される値である。典型的には、正常対照値は、範囲（「ＸとＹの間」）、高閾値（「Ｘ以下」）、または低閾値（「Ｘ以上」）として表される。特定のバイオマーカーの正常対照値内の測定値を有する対象は、通常、そのバイオマーカーの「正常範囲内」と呼ばれる。正常な参照標準またはレベルは、疾患または障害（例えば、ＫＣＮＴ１関連障害）を有していない正常な対象；本明細書に記載の化合物で治療された対象に由来する値または数であり得る。好ましい実施形態では、参照試料、標準、またはレベルは、以下の基準：年齢、体重、性別、病期、及び全体的な健康のうちの少なくとも１つによって、試料対象の試料と一致する。正常な参照範囲内の、例えば本明細書に記載されているもののいずれかのような、精製されたタンパク質のレベルの標準曲線も参照として使用することができる。
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、例えば実験、診断、予防、及び／または治療目的で、本発明による組成物を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象としては、任意の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）が含まれる。対象は、治療を求めるかもしくは治療を必要としている、治療が必要である、治療を受けている、治療を受けようとし、または特定の疾患または状態について訓練を受けた専門家による治療を受けているヒトもしくは動物であり得る。
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療される」、または「治療すること」という用語は、治療的治療と予防的処置の両方を意味し、そこで望ましくない生理学的状態、障害、または疾患を予防または緩徐化（軽減）するか、または有益もしくは望ましい臨床結果を取得することを目的とする。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能または検出不可能かにかかわらず、症状の緩和；状態、障害、もしくは疾患の程度の減少；状態、障害、もしくは疾患の状態の安定化（すなわち、悪化していない）；状態、障害、もしくは疾患の進行の開始の遅延もしくは緩徐化；状態、障害、もしくは病状の改善もしくは寛解（部分的もしくは全体的のいずれか）；対象が認識できる必要はないが少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善；または状態、障害、もしくは疾患の強化もしくは改善が含まれるが、これには限定されない。治療には、過度のレベルの副作用なしに臨床的に顕著な応答を引き出すことが含まれる。治療にはまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「誘導体」という用語は、本明細書に記載の化合物、ペプチド、タンパク質、またはその他の物質の天然、合成、及び半合成の類似体を指す。本明細書に記載の化合物、ペプチド、タンパク質、または他の物質の誘導体は、元の材料の生物活性を保持または改善し得る。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、以下の説明に記載され
る。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
ＫＣＮＴ１関連障害
本発明者らは、細胞におけるＫＣＮＴ１レベル及び／または活性の阻害または枯渇が、ＫＣＮＴ１関連障害の治療に効果的であることを見出した。したがって、本発明は、例えば、それを必要とする対象において、ＫＣＮＴ１関連障害を治療するための有用な組成物及び方法を特徴とする。本発明は、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つの少なくとも１８個（例えば、１８、１９、２０、２１、及び２２個）の連続するヌクレオシドの領域を有する、１８～２２（例えば、１８、１９、２０、２１、及び２２）の長さの連結したヌクレオシドを含む、一本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。また、ヒトとマウス、ヒトとサル、またはヒトとマウスとサルのＫＣＮＴ１間でクロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも特徴とする。ヒトＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０２０８２２．２）の配列は、配列番号３５２６として提供される。マウスＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物の配列は、配列番号３５３３として提供される。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物の配列は、配列番号３５３４として提供されている。オリゴヌクレオチド（例えば、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド）は、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、その症状の軽減、または予防するために、ＫＣＮＴ１関連障害（例えば、てんかん）を有する対象に投与され得る。オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１（例えば、プレｍＲＮＡ及びプロセシングされたｍＲＮＡを含むＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ）の標的領域に対してアンチセンス（例えば、少なくとも部分的に相補的）である。投与後、オリゴヌクレオチドはＫＣＮＴ１（例えば、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質）のレベル、発現、及び／または活性を低下させ、それにより、ＫＣＮＴ１関連障害のある対象に治療効果を提供する。
ＫＣＮＴ１は、中枢神経系で発現する細胞内ナトリウム活性化カリウムチャネル（ナトリウム活性化カリウムチャネルサブファミリーＴメンバー１）をコードする。Ｓｌａｃｋとしても知られるＫＣＮＴ１は、カリウムチャネル遺伝子のＳＬＯ型ファミリーのメンバーであり、他のＳＬＯチャネルサブユニットとともに共集合することができる。これらのチャネルは、ナトリウム感受性カリウム電流（ＩＫＮａ）を媒介することができ、これはナトリウムチャネルまたは神経伝達物質受容体を介したナトリウムチャネルイオンの流入によって引き起こされる。遅延した外向き電流は、ニューロンの興奮性の調節に関与している可能性がある。野生型ＫＣＮＴ１（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｑ５ＪＵＫ３－３）のアミノ酸配列は、配列番号３５２７として提供される。Ｇ２８８Ｓ ＫＣＮＴ１のアミノ酸配列は、配列番号３５２８として提供される。Ｒ３９８Ｑ ＫＣＮＴ１のアミノ酸配列は、配列番号３５２９として提供される。Ｒ４２８Ｑ ＫＣＮＴ１のアミノ酸配列は、配列番号３５３０として提供される。Ｒ９２８Ｃ ＫＣＮＴ１のアミノ酸配列は、配列番号３５３１として提供される。Ａ９３４Ｔ ＫＣＮＴ１のアミノ酸配列は、配列番号３５３２として提供される。
ＫＣＮＴ１の変異（例えば、機能獲得型変異）は、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん（ＥＩＭＦＳ）、常染色体優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群を含む、特定の形態のてんかんに関連している。
ＥＩＭＦＳは、発作が１つの脳領域と半球から別の脳領域に移動するように見える、ほぼ連続的な不均一な焦点発作の早期発症（生後６か月前）を特徴とするまれで衰弱性の遺伝的状態である。ＥＩＭＦＳを有する対象は、知的障害、言葉を用いない、歩行不能である可能性がある。ＥＩＭＦＳを有する対象は、Ｖ２７１Ｆ、Ｇ２８８Ｓ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ４７４Ｑ、Ｒ４７４Ｈ、Ｒ４７４Ｃ、Ｉ７６０Ｍ、Ａ９３４Ｔ、及びＰ９２４ＬなどのＫＣＮＴ１における変異（例えば、機能獲得型変異）を有する場合がある。
ＡＤＮＦＬＥは、ＥＩＭＦＳよりも発症が遅く、一般的には小児期半ばであり、一般的にはそれほど重症ではない。ＡＤＮＦＬＥは夜間の前頭葉発作を特徴とし、その状態を有する対象に精神医学的、行動的、及び認知的障害をもたらし得る。ＡＤＮＦＬＥを有する対象は、Ｍ８９６Ｉ、Ｒ３９８Ｑ、Ｙ７９６Ｈ、及びＲ９２８ＣなどのＫＣＮＴ１における変異（例えば、機能獲得型変異）を有する場合がある。
ウェスト症候群は、対象が１つ以上の点頭てんかん、ヒプスアリスミアと呼ばれる発作間欠期脳波（ＥＥＧ）パターン、及び精神遅滞を示す重症型のてんかんである。ウェスト症候群を有する対象は、Ｇ６５２Ｖ及びＲ４７４ＨなどのＫＣＮＴ１における変異（例えば、機能獲得変異）を有する場合がある。
本明細書に記載のＫＣＮＴ１関連障害のいずれも、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つのオリゴヌクレオチド（例えば、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド）、あるいは、１８～２２のヌクレオシドの長さであり、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続するヌクレオシド、少なくとも１９個の連続するヌクレオシド、少なくとも２０個の連続するヌクレオシド、少なくとも２１個の連続するヌクレオシド、または少なくとも２２個の連続するヌクレオシドの領域を有する、オリゴヌクレオチドを投与することによって治療することができる。いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１関連障害のいずれも、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つのオリゴヌクレオチド（例えば、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド）を投与することによって治療することができる。
治療対象は、ＫＣＮＴ１に機能獲得型変異を有する可能性がある。機能獲得型変異は、Ｖ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ｉ、Ｇ２８８Ｓ、Ｆ３４６Ｌ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ４７４Ｈ、Ｆ５０２Ｖ、Ｍ５１６Ｖ、Ｋ６２９Ｎ、Ｉ７６０Ｍ、Ｙ７９６Ｈ、Ｅ８９３Ｋ、Ｍ８９６Ｉ、Ｍ８９６Ｋ、Ｐ９２４Ｌ、Ｒ９２８Ｃ、Ｆ９３２Ｉ、Ａ９３４Ｔ、Ａ９６６Ｔ、Ｈ２５７Ｄ、Ｒ２６２Ｑ、Ｑ２７０Ｅ、Ｖ３４０Ｍ、Ｃ３７７Ｓ、Ｐ４０９Ｓ、Ｌ４３７Ｆ、Ｒ４７４Ｃ、Ａ４７７Ｔ、Ｒ５６５Ｈ、Ｋ６２９Ｅ、Ｇ６５２Ｖ、Ｉ７６０Ｆ、Ｑ９０６Ｈ、Ｒ９３３Ｇ、Ｒ９５０Ｑ、Ｒ９６１Ｈ、Ｒ１１０６Ｑ、Ｋ１１５４Ｑ、Ｒ４７４Ｑ、Ｙ１９０３Ｃ、Ｈ４６９Ｌ、Ｍ８９６Ｒ、Ｋ９４６Ｅ、及びＲ９５０Ｌのうちの１つ以上であり得る。
以下の表１は、ＫＣＮＴ１転写産物における一塩基多型（ＳＮＰ）、及びＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）と比較した各ＳＮＰの位置を示している。「ＫＣＮＴ１転写産物バリアント」または「ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物バリアント」という語句は、野生型ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）と少なくとも１ヌクレオチド（例えば、２、３、４、または５ヌクレオチド）異なるＫＣＮＴ１転写産物を指す。
Figure 2022515744000002
オリゴヌクレオチド剤
細胞において、ＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる本明細書に記載の薬剤は、例えば、ポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドであり得る。これらの薬剤は、ＫＣＮＴ１に関連する活性のレベル、または関連する下流効果を低下させるか、または細胞もしくは対象のＫＣＮＴ１のレベルを低下させる。
いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる薬剤はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態ではポリヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））であり、例えば、ＲＮａｓｅＨ媒介経路を介して作用する。オリゴヌクレオチドにはＤＮＡとＤＮＡ／ＲＮＡキメラ分子が含まれ、典型的には、１０～３０ヌクレオチドの長さであり、標的配列（例えば、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物またはＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物バリアント）のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用を介してポリヌクレオチド標的配列または配列部分を認識する。オリゴヌクレオチド分子は、ＫＣＮＴ１の発現レベル（例えば、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベル）を低下させ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、全長ＫＣＮＴ１を標的とするオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド分子は、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を動員し、標的ｍＲＮＡ分解をもたらす。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６個の核酸塩基の長さであり得る。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の核酸塩基の長さであり得る。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、または少なくとも２２の核酸塩基の長さであり得る。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７～２２、１８～２１、または１９～２０個の核酸塩基の長さであり得る。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは機能の正の調節因子のレベル及び／または活性を低下させる。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは機能の正の調節因子の阻害因子のレベル及び／または活性を増加させる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは機能の負の調節因子のレベル及び／または活性を増加させる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））は、ＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性もしくは機能を低下させる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５）（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））は、ＫＣＮＴ１の発現を阻害する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））は、ＫＣＮＴ１の分解を増加させる、及び／またはＫＣＮＴ１の安定性（例えば、半減期）を低下させる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５）（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））は、化学合成され得る。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））は、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現で形成されたｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域（例えば、連続する核酸塩基領域）を有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、相補性の領域は、約３０ヌクレオチド以下の長さ（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド以下の長さ）であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えば、ＰＣＲまたは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によって、または、例えば、ウエスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によってアッセイされるとき、ＫＣＮＴ１遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、または鳥類のＫＣＮＴ１遺伝子）の発現を少なくとも約１０％阻害する。
いくつかの実施形態では、標的配列に対する相補性の領域は、１０～３０の長さの連結ヌクレオシド、例えば、１０～２９、１０～２８、１０～２７、１０～２６、１０～２５、１０～２４、１０～２３、１０～２２、１０～２１、１０～２０、１０～１９、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１０～１２、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２の長さの連結ヌクレオシドであり得る。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さもまた、本発明の一部であることが企図される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているような、自動ＤＮＡ合成装置の使用により、さらに後述するように当該技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド化合物は、液相または固相有機合成、あるいはその両方を使用して調製することができる。有機合成は、非天然または代替ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを容易に調製できるという利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、液相または固相有機合成、あるいはその両方を使用して調製することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）相補的である、少なくとも１０個の連続する核酸塩基の領域を含む。一態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの１０個の連続するヌクレオチドに対して相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基の領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、１１個の連続するヌクレオチド、１２個の連続するヌクレオチド、１３個の連続するヌクレオチド、１４個の連続するヌクレオチド、１５個の連続するヌクレオチド、１６個の連続するヌクレオチド、１７個の連続するヌクレオチド、１８個の連続するヌクレオチド、１９個の連続するヌクレオチド、または２０個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは１９～２３の連続したヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を含み、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つから選択することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド）は、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、及び２５９５のうちのいずれか１つから選択される。この態様では、配列は、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現で生成されたｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３５２５）（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つの核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちの配列は、非修飾及び／または非コンジュゲート配列として記載され、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシド、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下に詳述されるような代替ヌクレオシド及び／またはコンジュゲートされている、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）のうちのいずれか１つに記載される配列のうちのいずれか１つを含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５）に示される配列のいずれかを含むオリゴヌクレオチドは、未修飾または修飾の、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物であり得る。
当業者は、約１８～２０塩基対の構造を有するオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性分解を誘導するのに特に効果的であり得ることをよく知っている。しかしながら、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドもまた効果的であり得ることを理解することができる。上述の実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、含むことができる。上述のオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドから一端または両端のわずかな連結ヌクレオシドを差し引いたものが同様に効果的であることが合理的に期待できる。したがって、本明細書で提供される配列（例えば、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））の１つに由来する少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続する連結したヌクレオシドの配列を有し、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現を、全長配列を含むオリゴヌクレオチドから約５、１０、１５、２０、２５、または３０％を超えずに阻害するそれらの能力において異なるヌクレオチドは、本発明の範囲内であることが企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解を介して作用することができ、本発明のオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる。ヌクレアーゼ媒介メカニズムを介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも５または６個のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強代替ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマー、及びテールマーが片側または両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的なＲＮＡ分子と二本鎖になっているときにＲＮａｓｅＨを動員するその能力を指す。国際出願公開番号ＷＯ０１／２３６１３（本明細書中に参照により組み込まれる）は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、オリゴヌクレオチドは、ＷＯ０１／２３６１３（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５によって提供される方法を使用して、ｐｍｏｌ／ｌ／分として測定されるとき、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチド内の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用するときに決定される初期速度の、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、または２０％を超える初期速度を有する場合、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができるとみなされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～３５２５（例えば、配列番号１～１１６、または１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５））は、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介切断に感受性のあるＫＣＮＴ１転写産物の部位（複数可）を特定する。したがって、本発明はさらに、この部位（複数可）内を標的とするオリゴヌクレオチドを特徴とする。本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがその特定の部位内のどこかで転写産物の切断を促進する場合、ＲＮＡ転写産物の特定の部位内を標的とすると言われる。そのようなオリゴヌクレオチドは、一般に、本明細書で提供される配列の１つからの少なくとも約５～１０個の連続する連結ヌクレオシドが、ＫＣＮＴ１遺伝子内の選択された当該配列に連続する領域から取られた追加の連結ヌクレオシド配列に結合されたものを含む。
阻害性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法によって設計することができる。標的配列は一般に約１０～３０の連結ヌクレオシドの長さであるが、この範囲の特定の配列が任意の所与の標的ＲＮＡの切断を指示することについての適性には大きなばらつきがある。
任意のＲＮＡを独自に分解するために必要な配列特異性を提供するのに十分な相同性を有するオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られているプログラムを使用して設計することができる。
阻害性オリゴヌクレオチド配列の最適化のために設計されたいくつかの種の体系的な試験も、本明細書で提供される教示に従って行うことができる。干渉オリゴヌクレオチドを設計する際の考慮事項には、生物物理学的、熱力学的、及び構造的考慮事項、特定の位置での塩基選好性、及び相同性が含まれるが、これらに限定されない。非コードオリゴヌクレオチドに基づく阻害性治療薬の製造及び使用もまた、当該技術分野で知られている。
本明細書に記載の様々なソフトウェアパッケージ及びガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的に最適な標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）が、文字通りまたは比喩的に（例えば、インシリコを含む）標的ＲＮＡ配列上に配置されて、標的配列として機能し得るサイズ範囲の配列を同定する経験的アプローチを取ることもできる。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に漸進的に移動させることにより、選択された任意の所与の標的サイズについて可能な配列の完全なセットが同定されるまで、次の潜在的な標的配列を同定することができる。このプロセスは、同定された配列の体系的な合成及び試験（本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られているアッセイを使用）と組み合わせて、最適に機能する配列を同定し、オリゴヌクレオチド剤で標的化された場合に標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するそれらのＲＮＡ配列を同定することができる。したがって、本明細書で同定される配列は有効な標的配列を表すが、阻害効率のさらなる最適化は、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流を漸進的に「ウィンドウを歩く」ことによって達成され、同等以上の阻害特性を有する配列を同定できることが企図される。
さらに、本明細書で同定された任意の配列について、連結ヌクレオシドを系統的に追加または除去してより長いまたはより短い配列を生成し、より長いまたはより短いサイズのウィンドウをその点から標的ＲＮＡを上下に歩くことによって生成されたそれらの配列を試験することによって、さらなる最適化を達成できることが企図される。繰り返すが、このアプローチを組み合わせて、新しい候補標的を生成し、当該技術分野で知られている及び／または本明細書に記載されているように、阻害アッセイにおいて、それらの標的配列に基づくオリゴヌクレオチドの有効性を試験することにより、阻害の効率のさらなる改善をもたらす可能性がある。
さらに、そのような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されているか、または当該技術分野で知られている、代替ヌクレオシド、代替糖部分、及び／または代替ヌクレオシド、代替糖部分を含む、代替ヌクレオシド間結合の導入によって調整することができ、それらには、本明細書に記載されている及び／または当該技術分野で知られている、発現阻害剤として、分子をさらに最適化するための（例えば、血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通送達の増強、特定の位置または細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加）代替ヌクレオシド、代替糖部分、及び／または代替ヌクレオシド間結合が含まれる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤は、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含み得る。一実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、３つ以下のミスマッチを含む。オリゴヌクレオチドが標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。オリゴヌクレオチドが標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチは、相補性領域の５’末端または３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に制限されることが好ましい。例えば、３０個の連結ヌクレオシドのオリゴヌクレオチド剤の場合、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写産物バリアントの領域に相補的である連続する核酸塩基領域は、一般に、中央の５～１０個の連結クレオシド内にいっさいミスマッチを含まない。本明細書に記載の方法または当該技術分野で知られている方法を使用して、標的配列に対するミスマッチを含むオリゴヌクレオチドが、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。ＫＣＮＴ１遺伝子の発現を阻害することにおけるミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの有効性の検討は、特に、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ転写バリアントにおける相補性の特定の領域 が、集団内で多型配列バリエーションを有していることが知られている場合には重要である。
本発明で使用するためのポリヌクレオチドを発現するためのベクターの構築は、当業者への詳細な説明を必要としない従来の技術を使用して達成することができる。効率的な発現ベクターを生成するには、ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列を有することが必要である。これらの調節配列は、プロモーター及びエンハンサー配列を含み、これらの配列と相互作用する特定の細胞因子によって影響を受け、当該技術分野でよく知られている。
代替オリゴヌクレオシド
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合のうちの１つ以上は、天然に存在し、例えば、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている化学修飾及び／またはコンジュゲーションを含まない。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの結合ヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合のうちの１つ以上は、安定性または他の有益な特性を高めるように化学修飾される。理論に縛られることなく、ある特定の修飾がヌクレアーゼ耐性及び／または血清安定性を高め、免疫原性を低下させることができると考えられている。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡに天然に存在することが見出されているヌクレオチド（例えば、アデニン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、またはイノシン）を含み得るか、あるいは、ヌクレオチドの１つ以上の成分（例えば、核酸塩基、糖、またはホスホリンカー部分）に対する１つ以上の化学修飾を有する代替ヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するホスホジエステル結合を介して互いに連結され得るか、または代替結合を介して共有結合される（例えば、ホスホロチオエート（例えば、ＳｐホスホロチオエートまたはＲｐホスホロチオエート）、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホアミデート、２’－５’ホスホジエステル、グアニジニウム、Ｓ－メチルチオ尿素、２’－アルコキシ、アルキルホスフェート、またはペプチド結合を介して共有結合される）。
本発明のある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの実質的に全てのヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合は、代替ヌクレオシドである。本発明の他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合は、代替ヌクレオシドである。「実質的に全てのヌクレオシドが代替ヌクレオシドである」本発明のオリゴヌクレオチドは、全てではないが大部分が修飾されており、５、４、３、２、または１つ以下の天然に存在するヌクレオシドを含むことができる。本発明のさらに他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５、４、３、２、または１つ以下の代替ヌクレオシドを含むことができる。
本発明に特徴のある核酸は、当該技術分野で十分に確立されている方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡに記載されるものによって、合成、及び／または修飾することができる。
代替のヌクレオチド及びヌクレオシドには、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆結合）または３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、またはパートナーの拡張レパートリーと塩基対を形成する塩基、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、もしくは共役塩基との置換；糖の修飾（例えば、２’－位置もしくは４’－位置での）もしくは糖の置換；及び／またはホスホジエステル結合の修飾または置換を含む骨格修飾を含む修飾を有するものが含まれる。核酸塩基はまた、核酸塩基が糖部分のＣ１位置から異なる位置（例えば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５）に移動するイソヌクレオシドであり得る。本明細書に記載の実施形態に有用なオリゴヌクレオチド化合物の具体例としては、修飾された骨格または全く天然のヌクレオシド間結合を含む代替ヌクレオシドを含むが、これらに限定されない。修飾された骨格を有するヌクレオチド及びヌクレオシドには、とりわけ、骨格にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、そして当該技術分野でしばしば言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない代替ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有するであろう。
代替ヌクレオシド間結合
修飾ヌクレオシド間結合とも呼ばれる代替ヌクレオシド間結合には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、２’－アルコキシヌクレオシド間結合、アルキルホスフェートヌクレオシド間結合、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びきらるホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、モルホリノ、ＰＮＡ、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ジメチルホスホネート、チオノアルキルホスホネート、ホスホロジアミデート、チオホスホルアミデート、チオホスフェート、セレノホスフェート、及びボラノホスフェート、これらの正常な３’－５’結合、２’－５’結合類似体、ならびにヌクレオチド単位の隣接対が、３’－５’対５’－３’、または２’－５’対５’－２’に連結している反転極性を有するものが含まれる。さまざまな塩、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間結合だけでなく、リン原子を有しないヌクレオシド間結合も含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合として、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、及びホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有結合を調製する方法は、周知である。
上述のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９５号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３１６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号、同第６，０２８，１８８号、同第６，１２４，４４５号、同第６，１６０，１０９号、同第６，１６９，１７０号、同第６，１７２，２０９号、同第６，２３９，２６５号、同第６，２７７，６０３号、同第６，３２６，１９９号、同第６，３４６，６１４号、同第６，４４４，４２３号、同第６，５３１，５９０号、同第６，５３４，６３９号、同第６，６０８，０３５号、同第６，６８３，１６７号、同第６，８５８，７１５号、同第６，８６７，２９４号、同第６，８７８，８０５号、同第７，０１５，３１５号、同第７，０４１，８１６号、同第７，２７３，９３３号、同第７，３２１，０２９号、及び米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれるが、これらに限定されない。
内部にリン原子を含まない代替ヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものを有するものを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、骨格キラル中心のそのパターンによって定義され得る。例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲまたはＳエナンチオマーであり得る。したがって、各ヌクレオシド間結合は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ２０１５／１０７４２５記載されているように、骨格の全体の立体化学がキラル定義されているＲＰまたはＳｐとして定義することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオシド間結合（例えば、複数のオリゴヌクレオチド）のみがキラル中心を含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、複数のオリゴヌクレオチド）は、ステレオランダム及び立体特異的キラル中心の組み合わせを含む。
上述のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、及び同第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、適切なオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が置換されているものを含む。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイズのために維持することができる。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、１つのそのようなオリゴマー化合物、すなわち模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ヌクレオチドの糖は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格によって置き換えられる。核酸塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドに使用するのに適した追加のＰＮＡ化合物は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。
本発明で特徴とされるいくつかの実施形態には、ホスホロチオアート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチド、上で参照される米国特許第５，４８９，６７７号の、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、及び－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［天然のホスホジエステル骨格は、－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－として表される］、ならびに上で参照される米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で特徴とされるオリゴヌクレオチドは、上で参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルフォリノ骨格構造を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１９９７，７：６３－７０に記載されるような、デオキシリボース部分がモルホリン環で置き換えられ、荷電ホスホジエステルサブユニット間結合が非荷電ホスホロジアミデート結合で置き換えられているホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。
代替糖部分
代替ヌクレオシド及びヌクレオチドは、１つ以上の置換及び／または修飾糖部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）部分、２’－Ｏ－メトキシエチル部分、二環式糖部分、ＰＮＡ（例えば、糖リン酸骨格の代わりに繰り返し単位としてアミド結合またはカルボニルメチレン結合によって連結された１つ以上のＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位を含むオリゴヌクレオチド）、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）（例えば、１つ以上のロックドリボースを含み、２’－デオキシヌクレオチドまたは２’ＯＭｅヌクレオチドの混合物であり得るオリゴヌクレオチド）、ｃ－ＥＴ（例えば、１つ以上のｃＥＴ糖を含むオリゴヌクレオチド）、ｃＭＯＥ（例えば、１つ以上のｃＭＯＥ糖を含むオリゴヌクレオチド）、モルホリノオリゴマー（例えば、１つ以上のホスホロジアミデートモルホリオノオリゴマーを含む骨格を含むオリゴヌクレオチド）、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド（例えば、１つ以上の２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド）、ｔｃＤＮＡ（例えば、１つ以上のｔｃＤＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）、拘束エチル２’－４’架橋核酸（ｃＥｔ）、Ｓ－ｃＥｔ、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）（例えば、１つ以上のＥＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）（例えば、１つ以上のＨＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）、または三環式類似体（ｔｃＤＮＡ）（例えば、１つ以上のｔｃＤＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）を含む。
本明細書で特徴とされるオリゴヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含み、それらのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。例示的な修飾としては、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＯＮＨ２、及び－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が挙げられ、式中のｎとｍは、１～約１０である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’位に、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｎ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。ＭＯＥヌクレオシドは、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ耐性の増加、薬物動態特性の改善、非特異的タンパク質結合の減少、毒性の減少、免疫刺激特性の減少、及び標的親和性の増強を含むがこれらに限定されない、いくつかの有益な特性をオリゴヌクレオチドに与える。
別の例示的な代替物には、本明細書の実施例に記載されるような、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。さらなる例示的な代替物には、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これらの３つのファミリーのＲとＳ異性体の両方）、２’－アルコキシアルキル、及び２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が含まれる。
他の代替物には、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が含まれる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド及びヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位においてなされ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模擬体も有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、及び同第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されない。前述の出願の内容の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド中の糖部分は、任意選択で２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆ、２’－アミノ、２’－Ｏ－プロピル、２’－アミノプロピル、または２’－ＯＨ修飾を有するリボース分子であり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の二環式糖部分を含むことができる。「二環式糖」は、２個の原子の架橋により修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含む糖部分を有し、それにより二環式環系を形成するヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素とを接続する。いくつかの実施形態では、二環式糖は、４’－ＣＨ（Ｒ）－Ｏ－２’ブリッジを含み、式中、Ｒが独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤は、１つ以上のロックドヌクレオシドを含み得る。ロックドヌクレオシドは、リボース部分が２’炭素と４’炭素を接続する追加の架橋を含む、修飾されたリボース部分を有するヌクレオシドである。本明細書で使用されるとき、ロックド酸ヌクレオシドは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドである。この構造は、３’－エンド構造立体配座でリボースを効果的に「ロック」する。オリゴヌクレオチドへのロックドヌクレオシドの付加は、血清中のオリゴヌクレオチドの安定性を高め、オフターゲット効果を減らすことが示されている（Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドでの使用のための二環式ヌクレオシドの例には、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド剤は、４’から２’への架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。そのような４’から２’への架橋の二環式ヌクレオシドの例には、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－ＯＮ（ＣＨ３）２－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’〔式中、ＲはＨ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である〕（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照されたい）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。前述の出願の内容の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する追加の代表的な米国特許及び米国特許出願公開には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第６，９９８，４８４号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第７，０８４，１２５号、同第７，３９９，８４５号、同第７，４２７，６７２号、同第７，５６９，６８６号、同第７，７４１，４５７号、同第８，０２２，１９３号、同第８，０３０，４６７号、同第８，２７８，４２５号、同第８，２７８，４２６号、同第８，２７８，２８３号、ＵＳ２００８／００３９６１８、及びＵＳ２００９／００１２２８１が含まれるが、これらに限定されない。
例えばα－Ｌ－リボフラノース及びβ－Ｄ－リボフラノース等の１つ以上の立体化学的糖配置を有する前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれを調製することができる（内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ９９／１４２２６を参照されたい）。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の拘束エチルヌクレオシドを含むように改変され得る。本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオシド」または「ｃＥｔ」とは、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックドヌクレオシドを意味する。一実施形態では、拘束エチルヌクレオシドは、本明細書で「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配座にある。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の「立体配座的に制限されたヌクレオシド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’とＣ４’炭素、またはリボースのＣ３と－－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを持つヌクレオシド類似体である。ＣＲＮはリボース環を安定した立体配座に固定し、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション親和性を高める。リンカーは、安定性と親和性のために酸素を最適な位置に配置するのに十分な長さであり、リボース環パッカリングを少なくする。
上述のある特定のＣＲＮの調製を教示する代表的な刊行物には、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号、及びＰＣＴ刊行物ＷＯ ２０１３／０３６８６８が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＵＮＡ（ロック解除されたヌクレオシド）ヌクレオシドである１つ以上のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロックされた非環式ヌクレオシドであり、糖の結合のいずれかが除去され、アンロックされた「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素の間の共有炭素－酸素－炭素結合）が除去されているモノマーを包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素の間の共有炭素－炭素結合）が除去されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）、及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照されたい）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公開には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３１４，２２７号、ならびに米国特許出願公開２０１３／００９６２８９号、同第２０１３／００１１９２２号、及び同第２０１１／０３１３０２０号が含まれるが、これらに限定されない。
リボース分子はまた、シクロプロパン環で修飾されて、トリシクロデオキシ核酸（トリシクロＤＮＡ）を生成し得る。リボース部分は、別の糖、例えば、１，５－アンヒドロヘキシトール、トレオースと置換してトレオースヌクレオシド（ＴＮＡ）、またはアラビノースと置換してアラビノヌクレオシドを生成することができる。リボース分子は、シクロヘキセンヌクレオシドを生成するためのシクロヘキセンまたはグリコールヌクレオシドを生成するためのグリコールなどの非糖で置き換えることもできる。
ヌクレオシド分子の末端に対する潜在的に安定化する修飾には、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール）（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’‘－リン酸、逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが含まれ得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／００５８６１に見出される。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の代替の化学組成は、オリゴヌクレオチドの５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体が挙げられる。適切なホスフェート模倣体は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されている。
代替核酸塩基
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単に「塩基」と呼ばれる）代替物（例えば、修飾または置換）も含む。非修飾または天然の核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ），シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基とも呼ばれる代替核酸塩基には、５－メチルシトシン、シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、ピロロシチジン、ジデオキシシチジン、ウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシデオキシウリジン、ジヒドロウリジン、４－チオウルジン、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、デオキシウリジン、５－ヒドロキシブチン－２’－デオキシウリジン、キサンチン、ヒポキサンチン、７－デアザ－キサンチン、チエノグアニン、８－アザ－７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、７－デアザグアノシン、６－アミノメチル－７－デアザグアノシン、８－アミノグアニン、２，２，７－トリメチルグアノシン、８－メチルアデニン、８－アジドアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザアデニン、３－デアザアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、８－アミノ－アデニン、チミン、ジデオキシチミン、５－ニトロインドール、２－アミノアデニン、その他のアデニン及びグアニンの６－メチル及びアルキル誘導体、その他のアデニン及びグアニンの２－プロピル及びアルキル誘導体、２－チオウリジン、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウリジン及びシチジン、６－アゾウリジン、シチジン及びチミン、４－チオウリジン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルアナルその他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及びその他の５－置換ウリジン及びシチジン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、ならびに３－デアザグアニンなどの他の合成及び天然核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの核酸塩基のある特定のものは、本発明の特徴とするオリゴマー化合物の結合親和性を向上するのに特に有用である。これらには、５置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、及び０～６置換プリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピルウラシル、及び５－プロピニルシトシンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には例示的な塩基置換となる。５－メチルシトシン置換の例には、５－メチル－２’－デオキシシトシン（５－メチル－ｄＣ）または５－メチル－２’－シトシン（５－メチル－Ｃ）が含まれる。
上述の特定の代替核酸塩基ならびに他の代替核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第６，０１５，８８６号、同第６，１４７，２００号、同第６，１６６，１９７号、同第６，２２２，０２５号、同第６，２３５，８８７号、同第６，３８０，３６８号、同第６，５２８，６４０号、同第６，６３９，０６２号、同第６，６１７，４３８号、同第７，０４５，６１０号、同第７，４２７，６７２号、及び同第７，４９５，０８８号が含まれるが、これらに限定されない。
例示的なオリゴヌクレオチドの実施形態
本発明の例示的なオリゴヌクレオチドは、代替糖部分を有するヌクレオシドを含み、また、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、代替糖部分及びＤＮＡヌクレオシドを含むヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドへの代替ヌクレオシドの組み込みは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強し得る。その場合、代替ヌクレオシドは、親和性増強代替ヌクレオチドと呼ぶことができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の代替ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、にを含みます少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の代替ヌクレオシドを含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１～１０の代替ヌクレオシド、２～９の代替ヌクレオシド、３～８の代替ヌクレオシド、４～７の代替ヌクレオシド（例えば、６または７個の代替ヌクレオシド）を含む。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの３つのタイプの代替物（代替糖部分、代替核酸塩基、及び代替ヌクレオシド間結合）、またはそれらの組み合わせから独立して選択される代替物を含み得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の代替糖部分を含むヌクレオシド、例えば、２’糖代替ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）ヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖代替ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の代替ヌクレオシドは、ＢＮＡである。
いくつかの実施形態では、代替ヌクレオシドの少なくとも１つはＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）であり、例えば、代替ヌクレオシドの少なくとも２個、例えば、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個は、ＢＮＡである。さらに別の実施形態では、全ての代替ヌクレオシドはＢＮＡである。
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、連続するヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続する配列における全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、立体化学的に純粋なホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、Ｓｐホスホロチオエート結合である。他の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、Ｒｐホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－ＭＯＥ－ＲＮＡである少なくとも１つの代替ヌクレオシド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’－ＭＯＥ－ＲＮＡヌクレオシドユニットを含む。いくつかの実施形態では、２’－ＭＯＥ－ＲＮＡヌクレオシドユニットは、ホスホロチオエート結合によって接続されている。いくつかの実施形態では、前記代替ヌクレオシドの少なくとも１つは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシドユニットなどの２’－フルオロＤＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＢＮＡユニット及び少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドを含む。本発明のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドとＤＮＡユニットの両方を含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド領域は、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。
追加のギャップマーオリゴヌクレオチドの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、またはその連続するヌクレオチド領域は、本明細書において単に「ギャップマー」とも呼ばれるギャップマーの設計または構造を有する。ギャップマー構造において、オリゴヌクレオチドは、‘５－＞３’の向きで、少なくとも３つの別個の構造領域５’ウィング、ギャップ、及び３’ウィングを含む。この設計では、５’及び３’のウィング領域（隣接領域とも呼ばれる）は、ギャップ領域に隣接する少なくとも１つの代替ヌクレオシドを含み、いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個の代替ヌクレオシド、または、代替ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの連続するストレッチ（代替ヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む混合ウィング）を含み得る。５’－ウィング領域の長さは、少なくとも２つのヌクレオシドの長さ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のヌクレオシドの長さ）であり得る。３’－ウィング領域の長さは、少なくとも２つのヌクレオシドの長さ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のヌクレオシドの長さ）であり得る。５’及び３’ウィング領域は、それらが含むヌクレオシドの数に関して対称的または非対称的であり得る。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、それぞれが約５つのヌクレオシドを含む５’及び３’のウィング領域に隣接する約１０個のヌクレオシドを含み、５－１０－５ギャップマーとも呼ばれる。
したがって、ギャップ領域に隣接する５’ウィング領域及び３’ウィング領域のヌクレオシドは、２’代替ヌクレオシドなどの代替ヌクレオシドである。ギャップ領域は、オリゴヌクレオチドがＫＣＮＴ１標的核酸と二重鎖である場合に、ＲＮａｓｅＨを動員することができるヌクレオチドの連続するストレッチを含む。いくつかの実施形態では、ギャップセグメントは、連結したデオキシリボヌクレオシド、２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、及びフルオロシクロヘキセン核酸（Ｆ－ＣｅＮＡ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、５～１６個のＤＮＡヌクレオシドの連続するストレッチを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、６～１５、７～１４、８～１３、または９～１１個のＤＮＡヌクレオシドの連続するストレッチを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個のＤＮＡヌクレオシドの連続するストレッチを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の相補性を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基の領域を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、ギャップマーは、ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１バリアントの少なくとも１７個の連続するヌクレオチド、１９～２３個の連続するヌクレオチド、または１９個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。ギャップマーは、ＫＣＮＴ１標的核酸（ＫＣＮＴ１転写産物（例えば、配列番号３５２６）またはＫＣＮＴ１転写産物バリアント）に相補的であり、したがって、オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオシド領域であり得る。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の同一性を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基の領域を含む。
ギャップ領域の５’及び３’末端に隣接する５’及び３’ウィング領域は、１つ以上の親和性増強代替ヌクレオシドを含み得る。いくつかの実施形態では、５’及び／または３’ウィングは、少なくとも１つの２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオシド、例えば、少なくとも２つのＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’－ウィングは、少なくとも１個のＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’と３’のウィング領域の両方がＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ウィング領域の全てのヌクレオシドはＭＯＥヌクレオシドである。他の実施形態では、ウィング領域は、ＭＯＥヌクレオシドと他のヌクレオシド、例えば、ＤＮＡヌクレオシド及び／または非ＭＯＥ代替ヌクレオシド、例えば二環式ヌクレオシド（ＢＮＡ）（例えば、ＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシド）、または他の２’置換ヌクレオシドとの両方を含み得る（混合ウィング）。この場合、ギャップは、ＭＯＥヌクレオシドなどの親和性増強代替ヌクレオシドが５’及び３’末端に隣接する少なくとも５個のＲＮａｓｅＨ動員ヌクレオシド（５～１６個のＤＮＡヌクレオシドなど）の連続する配列として定義される。
他の実施形態では、５’及び／または３’ウィングは、少なくとも１個のＢＮＡ（例えば、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシド）、例えば、少なくとも２個の二環式ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’－ウィングは、少なくとも１個のＢＮＡを含む。いくつかの実施形態では、５’と３’のウィング領域の両方がＢＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ウィング領域の全てのヌクレオシドはＢＮＡである。他の実施形態では、ウィング領域は、ＢＮＡと他のヌクレオシド、例えば、ＤＮＡヌクレオシド及び／または非ＢＮＡ代替ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシドとの両方を含み得る。この場合、ギャップは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡなどの、ＬＮＡなどの、ＢＮＡなどの、親和性増強代替ヌクレオシドが５’及び３’末端に隣接する少なくとも５個のＲＮａｓｅＨ動員ヌクレオシド（５～１６個のＤＮＡヌクレオシドなど）の連続する配列として定義される。
ギャップ領域の５’末端に結合した５’フランクまたは５’ウィングは、少なくとも１つの代替糖部分（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、またはそれ以上の代替糖部分）を含むか、含有するか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ウィング領域は、１～７個の代替核酸塩基、例えば、２～６個の代替核酸塩基、２～５個の代替核酸塩基、２～４個の代替核酸塩基、または１～３個の代替核酸塩基（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの代替核酸塩基）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ウイング領域は、少なくとも１個の代替ヌクレオシド間結合（例えば、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、またはそれ以上の別のヌクレオシド間結合）を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、ギャップ領域の３’末端に結合した３’フランクまたは３’ウィングは、少なくとも１つの代替糖部分（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、またはそれ以上の代替糖部分）を含むか、含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ウィング領域は、１～７個の代替核酸塩基、例えば、２～６個の代替核酸塩基、２～５個の代替核酸塩基、２～４個の代替核酸塩基、または１～３個の代替核酸塩基（例えば、２つ、３つ、または４つの代替核酸塩基）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ウイング領域は、少なくとも１個の代替ヌクレオシド間結合（例えば、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、またはそれ以上の別のヌクレオシド間結合）を含むか、またはそれらからなる。
一実施形態では、ウィング領域の１つ以上または全ての代替糖部分は、２’代替糖部分である。
さらなる実施形態では、ウィング領域における２’代替糖部分のうちの１つ以上は、２’－Ｏ－アルキル糖部分、２’－Ｏ－メチル糖部分、２’－アミノ糖部分、２’－フルオロ糖部分、２’－アルコキシ糖部分、ＭＯＥ糖部分、ＬＮＡ糖部分、アラビノ核酸（ＡＮＡ）糖部分、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ糖部分から選択される。
本発明の一実施形態では、ウィング領域の全ての代替ヌクレオシドは二環式ヌクレオシドである。さらなる実施形態では、ウィング領域における二環式ヌクレオシドは、ベータＤまたはアルファＬ構成、あるいはそれらの組み合わせでの、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／またはＥＮＡからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、ウィング領域における１つ以上の代替ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、立体化学的に純粋なホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、Ｓｐホスホロチオエート結合である。他の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、Ｒｐホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、混合ステロ濃縮（例えば、Ｓｐ－Ｒｐ－ＳｐまたはＲｐ－Ｓｐ－Ｒｐ）ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、代替のヌクレオシド間結合は、２’－アルコキシヌクレオシド間結合である。他の実施形態では、ヌクレオシド間結合はアルキルホスフェートインターフクレオシド結合である。
ギャップ領域は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる少なくとも５～１６個の連続するＤＮＡヌクレオシドを含むか、含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、ギャップ領域の全てのヌクレオシドは、ＤＮＡ単位である。さらなる実施形態では、ギャップ領域は、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を媒介することができるＤＮＡ及び他のヌクレオシドの混合物からなり得る。いくつかの実施形態では、ギャップ領域のヌクレオシドの少なくとも５０％はＤＮＡであり、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％がＤＮＡである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的である連続する領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’及び／または３’から５’及び３’のウィング領域のいずれかに配置された追加の連結ヌクレオシドをさらに含み得る。これらの追加の連結ヌクレオシドは、それぞれ、５’ウィング領域の５’末端または３’ウィング領域の３’末端に結合することができる。追加のヌクレオシドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的である連続配列の一部を形成し得るか、または他の実施形態では、標的核酸に非相補的であり得る。
５’及び３’ウィング領域のいずれかまたは両方に追加のヌクレオシドを含めることは、独立して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のヌクレオチドを含み得、これらは、標的核酸に対して相補的または非相補的であり得る。この点で、本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、５’及び／または３’末端で追加のヌクレオチドによって隣接される標的を調節することができる連続する配列を含み得る。そのような追加のヌクレオシドは、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとして機能し得、したがって、コンジュゲート部分などの官能基を本発明のオリゴヌクレオチドに結合するために使用され得る。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／または３’末端ヌクレオシドはホスホジエステル結合で連結しており、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。別の実施形態では、追加の５’及び／または３’末端ヌクレオシドは、例えば、ヌクレアーゼの安定性を高めるために、または合成を容易にするために含まれ得る代替ヌクレオシドである。
他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、「Ａｌｔｉｍｅｒ」設計を利用し、３つのヌクレオシドごとに交互になっている交互の２’－フルオロ－ＡＮＡとＤＮＡ領域を含む。Ａｌｔｉｍｅｒオリゴヌクレオチドについては、Ｍｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，１２（１８）： ２６５１－２６５４ ａｎｄ Ｋａｌｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００６，３４（２）： ４５１－６１に詳述されている（参照により本明細書に組み込まれる）。
他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー」設計を利用し、ギャップ領域に隣接する（５’または３’側のいずれかの側に）単一の２’修飾ウィングセグメントを含む。ヘミマーオリゴヌクレオチドは、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２９６： ８９８－９０４においてより詳細に論じられる（参照により本明細書に組み込まれる）。
様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’ウィング領域、３’ウィング領域、及び５’と３’ウィング領域の間のギャップ領域を含む。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＤＮＡヌクレオシドの連続するストレッチを含む。いくつかの実施形態では、ギャップ領域は、８、１０、または１２個のＤＮＡヌクレオシドの連続するストレッチを含む。様々な実施形態では、５’及び３’ウィング領域は、１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの１つ以上の親和性増強代替ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’ウィング領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、５’ウィング領域は、２つまたは５つのいずれかの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、５’ウィング領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）を含む。特定の実施形態では、５’ウィング領域は、２つのＬＮＡを含む。いくつかの実施形態では、５’ウィング領域は、２つの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシド及び２つのＬＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、３’ウィング領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、３’ウィング領域は、３つまたは５つのいずれかのＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、３’ウィング領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）を含む。特定の実施形態では、３’ウィング領域は、２つのＬＮＡを含む。いくつかの実施形態では、３’ウィング領域は、３つのＭＯＥヌクレオシド及び２つのＬＮＡを含む。
様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、天然に存在する結合（例えば、ホスホジエステル結合）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合は、天然に存在する結合（例えば、ホスホジエステル結合）である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオシド間結合は、代替結合（例えば、ホスホロチオエート結合）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合の両方を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのギャップ領域は、ホスホジエステル結合を含み、５’ウィング領域と３’ウィング領域は、それぞれ、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非修飾シトシンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中の全てのシトシンは修飾されていない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾シトシンを含む。修飾シトシンの例は、５－メチル－２’－デオキシシトシン（５－メチル－ｄＣ）または５－メチル－２’－シトシン（５－メチル－Ｃ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのシトシンは、５－メチル－２’－デオキシシトシンである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのギャップ領域における全てのシトシンは、５－メチル－２’－デオキシシトシンであり、５’ウィング領域及び３’ウィング領域における全てのシトシンは、５－メチル－Ｃである。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｅｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅの化学的に修飾された核酸塩基配列を有する（式中、「ｅ」は２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ１０」は連続する１０個のＤＮＡ核酸塩基配列を示す）。この実施形態では、５’ウィング領域は５個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含み、ギャップ領域は１０個の連続するＤＮＡ核酸塩基を含み、３’ウィング領域は、５個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。核酸塩基を接続するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非修飾のシチジンを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾シチジン（例えば、５－メチル－ｄＣ及び／または５－メチル－Ｃ）を含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅの化学的に修飾された核酸塩基配列を有する。この実施形態では、５’ウィング領域は５個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含み、ギャップ領域は１２個の連続するＤＮＡ核酸塩基を含み、３’ウィング領域は、５個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。核酸塩基を接続するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり得る。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非修飾のシチジンを含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅの化学的に修飾された核酸塩基配列を有する。この実施形態では、５’ウィング領域は５個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含み、ギャップ領域は８個の連続するＤＮＡ核酸塩基を含み、３’ウィング領域は、５個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。核酸塩基を接続するヌクレオシド間結合は、次のようになる：ｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ（式中、「ｓ」はホスホロチオレート結合を指し、「ｏ」はホスホジエステル結合を指す）。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非修飾のシチジンを含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅの化学的に修飾された核酸塩基配列を有する（式中、「ｅ」は２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ８」は連続する８個のＤＮＡ核酸塩基配列を示し、「ｋ」は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束メトキシエチル（ｃＭＯＥ）ヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥＴ）ヌクレオシド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を示す。この実施形態では、５’ウィング領域は２個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシド及び２個のＬＮＡを含み、ギャップ領域は８個の連続するＤＮＡ核酸塩基を含み、３’ウィング領域は、２個のＬＮＡ及び３個の２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。核酸塩基を接続するヌクレオシド間結合は、次のようになる：ｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ（式中、「ｓ」はホスホロチオレート結合を指し、「ｏ」はホスホジエステル結合を指す）。オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非修飾のシチジンを含む。
リガンドにコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、活性、細胞分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞取込みを向上させる１つ以上のリガンド、部分、またはコンジュゲートに化学的に連結することができる。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６： ６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７）を含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれるオリゴヌクレオチド剤の分布、標的化、または寿命を変更する。いくつかの実施形態では、リガンドは、選択された標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、コンパートメント、例えば、細胞もしくは器官のコンパートメント、組織、臓器、または体の領域に対する親和性を、例えばそのようなリガンドが存在しない種と比較して、向上させる。
リガンドは、タンパク質、（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、もしくはヒアルロン酸）、または脂質などの天然に存在する物質を含むことができる。リガンドはまた、組み換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマーまたはオリゴマー、例えば、合成ポリアミノ酸でもよい。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン―無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル―無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー、（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体を含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）、及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドには、ホルモン及びホルモン受容体も含まれる。それらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコースを含むことができる。
リガンドは、細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みを、例えば、その細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、その細胞の微小管、微小繊維、及び／または中間径フィラメントを破壊することによって増加させることができる物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに結合したリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。ホスホロチオエート結合の数を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られ、従って、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドはまた、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）と結合するアプタマーもまた、本明細書に記載の実施形態におけるＰＫ調節リガンドとしての使用に適している。
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの連結分子の結合に由来するものなどの、ペンダント反応性機能を有するオリゴヌクレオチドを使用することによって合成することができる（以下に記載）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合する連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。
本発明のコンジュゲートで使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術を介して簡便かつ日常的に作製され得る。このような合成用の機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかのメーカーによって販売されている。当該技術分野で知られているそのような合成のための他の任意の手段を、追加的または代替的に使用することができる。同様の技術を使用して、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。
本発明の配列特異的連結ヌクレオシドを有するリガンド分子などの本発明のリガンドコンジュゲートヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、すでに連結部分を有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、またはすでにリガンド分子を有するリガンドヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを利用して適切なＤＮＡ合成装置上で組み立てられ得る。
すでに連結部分を有するコンジュゲート前駆体を使用する場合、配列特異的連結ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次いでリガンド分子が連結部分と反応してリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販され、オリゴヌクレオチド合成において日常的に使用される標準ホスホラミダイト及び非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホラミダイトを使用する自動合成装置によって合成される。
脂質コンジュゲート
一実施形態では、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することができる。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、体内の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの耐分解性を向上させること、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を向上させること、及び／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫが挙げられる。
細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えば、らせん状の細胞透過剤である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａなどのペプチドである。薬剤がペプチドの場合、それは修飾されていてもよく、ペプチド模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド結合、及びＤ－アミノ酸の使用を含む。いくつかの実施形態では、らせん状薬剤は、親油性及び疎油性相を有し得るアルファヘリックス薬剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）とは、天然のペプチドと同様の一定の三次元構造に折りたたむことが可能な分子である。オリゴヌクレオチド剤へのペプチド及びペプチド模倣体の結合は、細胞の認識及び吸収を増強することなどによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的分布に影響を及ぼす可能性がある。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。別の実施形態では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３５３５）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３５３６）もまた標的部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含めた大きな極性分子を細胞膜を横切って運ぶことができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶのＴａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号３５３７）及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号３５３８）が、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリ、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリから同定されたペプチド等のランダムなＤＮＡ配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化の目的で組み込まれたモノマーユニットを介してオリゴヌクレオチド剤に係留されたペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を向上させるか、または配座性を誘導するなどの構造修飾を有することができる。以下に記載の構造修飾のいずれかを使用することができる。
本発明の組成物及び方法で使用するためのＲＧＤペプチドは、線状でも環状でもよく、特定の組織（複数可）への標的化を促進するために修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸、及び合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドのいくつかのコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。
細胞透過性ペプチドは、細胞、例えば、細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞に浸透することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－ディフェンシン、β－デフェンシン、またはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要なアミノ酸のみを含むペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、２部からなる両親媒性ペプチド、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳ由来のＭＰＧであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物結合オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、核酸のインビボ送達、及びインビボ治療用途に適した組成物に有利である。本明細書で使用されるとき、「炭水化物」は、各炭素原子に結合した酸素、窒素、または硫黄原子を有する少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状、または環状であり得る）を有する１つ以上の単糖単位から構成される炭水化物自体、あるいは各炭素原子に結合した酸素、窒素、または硫黄原子を有する少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状、または環状であり得る）を有する１つ以上の単糖単位から構成される炭水化物をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物には、糖（約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含む単糖、二糖、三糖、及びオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロース、多糖ガムなどの多糖が含まれる。特定の単糖には、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖が含まれる。二糖及び三糖には、２つまたは３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）を有する糖が含まれる。
一実施形態では、本発明の組成物及び方法で使用するための炭水化物コンジュゲートは単糖である。
いくつかの実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、ＰＫモジュレーター及び／または細胞透過性ペプチドなどであるがこれらに限定されない、上述のような１つ以上の追加のリガンドをさらに含む。
本発明での使用に適した追加の炭水化物コンジュゲート（及びリンカー）には、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１７９６２０号及び第ＷＯ２０１４／１７９６２７号に記載されているものが含まれる。
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートまたはリガンドは、切断可能または切断不可能であり得る様々なリンカーによってオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
リンカーは典型的には、直接結合または酸素また硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、または原子の鎖、例えば、非限定的に、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの単位を含み、これらの１つ以上のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環式化合物によって中断または終端でき；式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族、または置換脂肪族である。一実施形態では、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７、または８～１６原子である。
切断可能な連結基は、細胞の外側で十分に安定しているが、標的細胞に入ると、切断されてリンカーが一緒に保持している２つの部分を放出する。好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、標的細胞において、または第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣または表すために選択することができる）下で、対象の血液中、または第２の参照条件（例えば、血液または血清に見られる条件を模倣または表すために選択することができる）よりも、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、またはそれ以上、または少なくとも１００倍以上速く切断される。
切断可能な連結基は、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解性分子の存在などの切断剤の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液よりも細胞内でより一般的であるか、より高いレベルまたは活性で見られる。このような分解剤の例としては、以下が挙げられる：例えば、細胞内に存在する還元によってレドックス切断可能な連結基を分解する可能性がある酸化酵素または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質に対して選択的であるか、または全く基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；酸性環境を作り出す可能性のあるエンドソームまたは薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸、ペプチダーゼ（基質特異的である可能性がある）、及びホスファターゼとして作用することにより、酸で切断可能な連結基を加水分解または分解することができる酵素。
ジスルフィド結合などの切断可能な連結基は、ｐＨの影響を受けやすい可能性がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、５．０付近でさらにより酸性であるｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な連結基を有し、それにより、細胞内部のリガンドから、または細胞の所望の区画にカチオン性脂質を放出する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能な連結基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝細胞はエステラーゼが豊富であるため、リンカーはエステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞でより効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型には、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が含まれる。
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞や滑膜細胞など、ペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合に使用できる。
一般に、候補の切断可能な連結基の適合性は、候補の連結基を切断する分解剤（または状態）の能力を試験することによって評価することができる。血液中または他の非標的組織と接触しているときの切断に抵抗する能力について、候補の切断可能な連結基を試験することも望ましいであろう。このように、一方が第１の条件が標的細胞における切断を示すように選択され、第２の条件が、他の組織または体液、例えば、血液または血清における切断を示すように選択されている、第１及び第２の条件間の切断への感受性を決定することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器または組織培養、または動物全体で実施できる。無細胞または培養条件で初期評価を行い、動物全体でさらに評価することによって確認することは有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または、細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞において（または、細胞条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下で）、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍速く切断される。
レドックス切断可能な連結基
一実施形態では、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断されるレドックス切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。候補の切断可能な連結基が適切な「還元的に切断可能な連結基」であるか、または例えば、特定のオリゴヌクレオチド部分及び特定の標的化剤と共に使用するのに適しているかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法を参照することができる。例えば、候補を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞、例えば標的細胞で観察されるであろう切断速度を模倣する当該技術分野で知られている試薬を使用する他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができる。候補は、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。一実施形態では、候補化合物は、血液中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または、細胞外条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞において（または、細胞条件を模倣するために選択されたインビトロ条件下で）、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準的な酵素反応速度論アッセイを使用して決定でき、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較できる。
リン酸ベースの切断可能な連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な連結基を含む。リン酸ベースの切断可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、
－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－が挙げられる。これらの候補は、上述と同様の方法を使用して評価できる。
酸で切断可能な連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸で切断可能な連結基を含む。酸で切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、またはそれ以下）のｐＨを有する酸性環境において、または一般的な酸として作用し得る酵素のような薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸で切断可能な連結基に切断環境を提供することができる。酸で切断可能な連結基の例には、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが含まれるが、これらに限定されない。酸で切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－－ＯＣ（Ｏ）を有することができる。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述と同様の方法を使用して評価できる。
エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な連結基を含む。エステルベースの切断可能な連結基は、細胞内のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な連結基の例には、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが含まれるが、これらに限定されない。エステルで切断可能な連結基は、一般式－－Ｃ（Ｏ）Ｏ－－または－－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述と同様の方法を使用して評価できる。
ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な連結基を含む。ペプチドベースの切断可能な連結基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、アミノ酸間に形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生成するペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキネレンの間で形成することができる。ペプチド結合は、ペプチドとタンパク質を生成するためにアミノ酸間に形成される特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般に、ペプチド及びタンパク質を生成するアミノ酸間に形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式
－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－－
を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２個の隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述と同様の方法を使用して評価できる。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。リンカーには、二価及び三価の分岐リンカー基が含まれる。オリゴヌクレオチド炭水化物コンジュゲートのリンカーには、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１９５１６５号の式２４～３５に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
上述のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号、同第６，２９４，６６４号、同第６，３２０，０１７号、同第６，５７６，７５２号、同第６，７８３，９３１号、同第６，９００，２９７号、同第７，０３７，６４６号、同第８，１０６，０２２号が含まれるが、これらに限定されない。
所与の化合物における全ての位置が一様に改変される必要はなく、実際には前述の修飾のうちの１つを超えたものを単一の化合物内に、またはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシド内にさえも、組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるオリゴヌクレオチド化合物を含む。キメラオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＲＮＡが、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、及び／または標的核酸に対する増加した結合親和性が付与されるように修飾されている少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの追加領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡを切断できる酵素の基質として機能することができる。例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のＤＮＡ様オリゴヌクレオチド阻害の効率を大幅に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドで同等の結果がしばしば得られ得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、及び必要に応じて、当該技術分野で知られている関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出することができる。
ある特定の例において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、非リガンド基によって修飾され得る。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンド分子がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実行するための手順が科学文献で利用可能である。そのような非リガンド部分には、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が含まれている。そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、アミノ基は、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、コンジュゲートされている分子と反応される。コンジュゲーション反応は、オリゴヌクレオチドがまだ固体支持体に結合している状態で、またはオリゴヌクレオチドの切断に続いて、溶液相で実施することができる。オリゴヌクレオチドコンジュゲートをＨＰＬＣで精製すると、典型的には、純粋なコンジュゲートが得られる。
医薬品用途
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド化合物は、本発明の方法において有用であり、理論に束縛されないが、ＫＣＮＴ１のレベル、状態、及び／または活性を調節することによって、例えば、哺乳動物のＢＡＦ複合体内の細胞中のＫＣＮＴ１の活性またはレベルを阻害することによって、それらの望ましい能力を発揮すると考えられている。
本発明の一態様は、ＫＣＮＴ１に関連する障害（例えば、てんかん）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法に関する。本発明の別の態様は、ＫＣＮＴ１関連障害を有すると特定された対象の細胞におけるＫＣＮＴ１のレベルを低下させることを含む。さらに別の態様は、対象の細胞におけるＫＣＮＴ１の発現を阻害する方法を含む。方法は、細胞におけるＫＣＮＴ１の発現を阻害するのに有効な量で、オリゴヌクレオチドを細胞と接触させ、それにより、細胞におけるＫＣＮＴ１の発現を阻害することを含み得る。
上述の方法に基づいて、本発明のさらなる態様は、治療に使用するため、または医薬として使用するため、またはＫＣＮＴ１関連障害の治療を、それを必要とする対象において行うために使用するための、またはＫＣＮＴ１関連障害を有すると特定された対象の細胞におけるＫＣＮＴ１のレベルを低下させるのに使用するため、または対象の細胞におけるＫＣＮＴ１の発現を阻害するのに使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、またはそのようなオリゴヌクレオチドを含む組成物を含む。使用は、オリゴヌクレオチドを細胞と、その細胞におけるＫＣＮＴ１の発現を阻害するのに有効な量で接触させ、それにより、細胞におけるＫＣＮＴ１の発現を阻害することを含み得る。本発明の方法に関して以下に記載する実施形態は、これらのさらなる態様にも適用可能である。
細胞とオリゴヌクレオチドとの接触は、インビトロまたはインビボで行うことができる。オリゴヌクレオチドとインビボで細胞を接触させることには、オリゴヌクレオチドを、対象内の、例えば、ヒト対象の細胞または細胞集団と接触させることが含まれる。インビトロ及びインビボの細胞を接触させる方法の組み合わせも可能である。上述したように、細胞への接触は直接的または間接的であり得る。さらに、細胞との接触は、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で知られている任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して達成され得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、または目的の部位にオリゴヌクレオチドを導く他のリガンドである。細胞には、中枢神経系または筋細胞の細胞が含まれる。
ＫＣＮＴ１遺伝子の発現を阻害することは、ＫＣＮＴ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、少なくとも約２０％での阻害などの、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。いくつかの実施形態では、阻害は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％である。
ＫＣＮＴ１遺伝子の発現は、ＫＣＮＴ１遺伝子発現に関連する任意の可変要素のレベル、例えば、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡレベルまたはＫＣＮＴ１のタンパク質レベルに基づいて評価することができる。
阻害は、対照レベルと比較して、これらの可変要素の１つ以上の絶対レベルまたは相対レベルの減少によって評価することができる。対照レベルは、当該技術分野で利用される対照レベル、例えば、投与前のベースラインレベル、または類似の対象、細胞から決定されるレベル、または、未処理または対照（例えば、緩衝液のみの対照または非活性薬剤の対照）で処理された試料である、任意のタイプの対照であり得る。
ある特定の実施形態では、代替マーカーは、ＫＣＮＴ１の阻害を検出するために使用され得る。例えば、ＫＣＮＴ１発現を減少させる薬剤による許容可能な診断及びモニタリング基準によって示されるような、ＫＣＮＴ１関連障害の効果的な治療は、ＫＣＮＴ１の臨床的に関連する減少を示すと理解することができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現は、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、またはアッセイの検出レベル以下まで、阻害される。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、ＫＣＮＴ１の発現を減少させる薬剤で対象を治療した後の臨床的に関連する結果によって示されるように、ＫＣＮＴ１の発現の臨床的に関連する阻害を含む。
ＫＣＮＴ１遺伝子の発現の阻害は、ＫＣＮＴ１遺伝子が転写され、処理するか、（例えば、細胞または複数の細胞を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることによって、または細胞が存在するかまたは存在した対象に本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによって）処理されて、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現が阻害されてた第１の細胞または細胞群（例えば、細胞は対象に由来する試料中に存在し得る）が発現するｍＲＮＡの量の、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理していないかまたはされていない（オリゴヌクレオチドで処理されていないか、目的の遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドによって処理されていない対照細胞（複数可））第２の細胞または細胞群と比較するときの、減少によって明らかになり得る。阻害の程度は、以下の観点から表すことができる。
Figure 2022515744000003
他の実施形態では、ＫＣＮＴ１遺伝子の発現の阻害は、ＫＣＮＴ１遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、ＫＣＮＴ１タンパク質発現またはＫＣＮＴ１活性の減少に関して評価され得る。ＫＣＮＴ１遺伝子サイレンシングは、発現コンストラクトからの内因性または異種のいずれかで、ＫＣＮＴ１を発現する任意の細胞において、当該技術分野で知られている任意のアッセイによって決定することができる。
ＫＣＮＴ１タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＫＣＮＴ１タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料で発現されるタンパク質のレベル）の低下によって明らかになり得る。上で説明したように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処理された細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、同様に、対照細胞または細胞群におけるタンパク質レベルのパーセンテージとして表され得る。
ＫＣＮＴ１遺伝子の発現の阻害を評価するために使用され得る対照細胞または細胞群は、本発明のオリゴヌクレオチドとまだ接触されていない細胞または細胞群を含む。例えば、対照細胞または細胞群は、オリゴヌクレオチドで対象を処理する前の、個々の対象（例えば、ヒトまたは動物の対象）に由来し得る。
細胞または細胞群によって発現されるＫＣＮＴ１のｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該技術分野で知られている任意の方法を使用して決定することができる。一実施形態では、試料中のＫＣＮＴ１の発現レベルは、転写されたポリヌクレオチド、またはその一部、例えば、ＫＣＮＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮＥＡＳＹ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することを含むＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイフォーマットには、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が含まれる。循環ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１７７９０６に記載されている方法を使用して検出することができる。いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１の発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。本明細書で使用されるとき、「プローブ」という用語は、特定のＫＣＮＴ１配列、例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドに対して、選択的に結合することのできる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができ、または適切な生物学的製剤から誘導することができる。プローブは、ラベルを付けるように特別に設計することができる。プローブとして利用できる分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が含まれるが、これらに限定されない。
単離されたｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、及びプローブアレイを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用することができる。ｍＲＮＡレベルを決定するための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、固体表面に固定化され、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、プローブと接触させる。代替の実施形態では、プローブ（複数可）は固体表面に固定化され、ｍＲＮＡは、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ遺伝子チップアレイにおいてプローブ（複数可）と接触される。当業者は、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡのレベルを決定する際に使用するために、既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
試料中のＫＣＮＴ１の発現レベルを決定するための代替方法には、例えば試料中のｍＲＮＡの核酸増幅及び／または逆転写（ｃＤＮＡを調製する）、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，、米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法、続いて当業者に周知の技術を使用する増幅された分子の検出が含まれる。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、そのような分子の検出に特に役立つ。本発明の特定の態様において、ＫＣＮＴ１の発現のレベルは、定量的蛍光発生ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮ（商標）システム）またはＤＵＡＬ－ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイによって決定される。
ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析で使用されるものなど）、またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ、もしくはファイバー（または結合した核酸を含む任意の固体担体）を使用してモニターすることができる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、及び同第５，４４５，９３４号を参照されたい。ＫＣＮＴ１発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。このＰＣＲ法の使用は、本明細書に提示される実施例に記載され、例示されている。このような方法は、ＫＣＮＴ１核酸の検出にも使用できる。
ＫＣＮＴ１タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野で知られている任意の方法を使用して決定することができる。そのような方法には、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色分析、分光光度分析、フローサイトメトリー、免疫拡散（シングルまたはダブル）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが含まれる。このようなアッセイは、ＫＣＮＴ１タンパク質の存在または複製を示すタンパク質の検出にも使用できる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが対象内の特定の部位に送達されるように、対象に投与される。ＫＣＮＴ１の発現の阻害は、対象内の特定の部位に由来する試料中のＫＣＮＴ１のｍＲＮＡまたはＫＣＮＴ１タンパク質のレベルまたはレベルの変化の測定を使用して評価することができる。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、ＫＣＮＴ１の発現を減少させる薬剤で対象を治療した後の臨床的に関連する結果によって示されるように、ＫＣＮＴ１の発現の臨床的に関連する阻害を含む。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１障害の１つ以上の症状の軽減（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の）をもたらすのに有効な量及び期間で投与される。そのような症状には、長期の発作、頻繁な発作、行動及び発達の遅延、運動及びバランスの問題、整形外科的状態、言語遅延及び発声の問題、成長及び栄養の問題、睡眠困難、慢性感染症、感覚統合障害、自律神経系の乱れ、ならびに発汗が含まれるが、これらに限定されない。
ＫＣＮＴ１関連障害を治療することは、未治療の対象の集団と比較して、本発明に従って治療された個体または対象の集団の平均生存期間の増加をもたらし得る。例えば、個体の生存期間、または集団の平均生存期間は、３０日を超えて（６０日、９０日、または１２０日を超えて）増加する。個体の生存時間または集団の平均生存時間の増加は、任意の再現可能な手段によって測定することができる。個体の生存時間の増加は、例えば、本明細書に記載の化合物による治療の開始後の生存時間の長さを個体について計算することによって測定することができる。集団の平均生存時間の増加は、例えば、本明細書に記載の化合物による治療の開始後の平均生存時間の長さを計算することによって測定することができる。個体の生存時間の増加はまた、例えば、本明細書に記載の化合物または化合物の薬学的に許容される塩による第１ラウンドの処理の完了後の個体の生存時間の長さを計算することによって測定され得る。集団の平均生存期間の増加はまた、例えば、本発明の化合物または化合物の薬学的に許容される塩による治療の第１のラウンドの完了後の集団の平均生存期間を計算することにより測定することができる。
ＫＣＮＴ１関連障害を治療することにより、未治療の集団と比較して、治療された対象の集団の死亡率が低下する可能性もある。例えば、死亡率は２％以上（例えば、５％以上、１０％、または２５％）低下する。治療された対象の集団の死亡率の低下は、再現可能な手段により、例えば、集団について、本発明の化合物または化合物の薬学的に許容される塩による治療開始後の単位時間当たりの疾患関連死亡の平均数を計算することにより測定することができる。集団の死亡率の低下はまた、例えば、本発明の化合物または化合物の薬学的に許容される塩での治療の第１のラウンドの完了後の、単位時間当たりの疾患関連死亡の平均数を計算することによっても測定することができる。
オリゴヌクレオチドの送達
細胞、例えば、対象、例えば、ヒト対象、例えば、それを必要とする対象、例えば、ＫＣＮＴ１関連障害を有する対象の細胞に対する本発明のオリゴヌクレオチドの送達は、多くの異なる方法で達成することができる。例えば、送達は、インビトロまたはインビボのいずれかで、本発明のオリゴヌクレオチドを細胞と接触させることによって行うことができる。インビボ送達はまた、オリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することによって直接実施され得る。これらの代替については、以下でさらに論じられる。
一般に、核酸分子を送達する任意の方法（インビトロまたはインビボ）は、本発明のオリゴヌクレオチドと共に使用するように適合させることができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ Ｒ Ｌ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４及びＷＯ９４／０２５９５を参照されたい）。インビボ送達の場合、オリゴヌクレオチド分子を送達するために考慮すべき要因には、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が含まれる。オリゴヌクレオチドの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注射または移植によって、または製剤を局所投与することによって最小限に抑えることができる。治療部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化し、さもなければ薬剤によって害される可能性がある、または薬剤を分解する可能性がある全身組織への薬剤の曝露を制限し、そしてより低い総用量のオリゴヌクレオチド分子の投与を可能にする。
疾患の治療のためにオリゴヌクレオチドを全身投与するために、オリゴヌクレオチドは、代替核酸塩基、代替糖部分、及び／または代替ヌクレオシド間結合を含み得るか、または代替的に薬物送達システムを使用して送達される；両方の方法は、インビボでのエンド及びエキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの急速な分解を防ぐように作用する。オリゴヌクレオチドまたは医薬担体の修飾はまた、オリゴヌクレオチド組成物の標的組織への標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することができる。オリゴヌクレオチド分子は、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾され、細胞への取り込みを促進し、分解を防ぐことができる。代替の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリプレックスナノ粒子、リポプレックスナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、オリゴヌクレオチド分子（負に帯電）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜での相互作用をも増強して、細胞によるオリゴヌクレオチドの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、オリゴヌクレオチドに結合するか、またはオリゴヌクレオチドを包むベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与された場合にオリゴヌクレオチドの分解をさらに防ぐ。一般に、当該技術分野で知られている核酸の送達の任意の方法は、本発明のオリゴヌクレオチドの送達に適応可能であり得る。カチオン性オリゴヌクレオチド複合体を作製及び投与するための方法は、当業者の能力の範囲内である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，Ｕ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，Ａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。オリゴヌクレオチドの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例には、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、前出；Ｖｅｒｍａ，Ｕ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、前出）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，Ｐ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ Ｍ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，Ｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が含まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。オリゴヌクレオチド及びシクロデキストリンの投与方法及び医薬組成物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０５号に記載されている。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ポリプレックスまたはリポプレックスナノ粒子によって送達される。オリゴヌクレオチド及びポリプレックスナノ粒子及びリポプレックスナノ粒子の投与方法及び医薬組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１７／０１２１４５４号；同第２０１６／０３６９２６９号；同第２０１６／０２７９２５６号；同第２０１６／０２５１４７８号；同第２０１６／０２３０１８９号；同第２０１５／０３３５７６４号；同第２０１５／０３０７５５４号；同第２０１５／０１７４５４９号；同第２０１４／０３４２００３号；同第２０１４／０１３５３７６号；及び同第２０１３／０３１７０８６号に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。追加の治療法の例には、キニジン及び／またはナトリウムチャネル遮断薬などの標準治療の抗てんかん薬が含まれる。さらに、本明細書に記載の化合物は、ケトン食療法などの推奨されるライフスタイルの変更と組み合わせて投与することができる。
膜分子アセンブリの送達方法
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野で知られているポリマー、生分解性微粒子、またはマイクロカプセル送達デバイスを含む様々な膜分子アセンブリ送達方法を使用して送達することができる。例えば、コロイド分散系を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤の標的化送達に使用することができる。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が挙げられる。リポソームは、インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして有用な人工膜ベシクルである。０．２～４．０μｍの範囲のサイズの大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含む水性バッファーのかなりの割合をカプセル化できることが示されている。リポソームは、有効成分の作用部位への導入及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、オリゴヌクレオチドを含む内部の水性内容物が細胞に送達され、そこでオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに特異的に結合し、ＲＮａｓｅ Ｈを介した遺伝子サイレンシングを媒介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、オリゴヌクレオチドを特定の細胞型に誘導するために、特異的に標的化される。リポソームの組成は、通常、リン脂質の組み合わせであり、通常、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価陽イオンの存在に依存する。
オリゴヌクレオチドを含むリポソームは、様々な方法で調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分を界面活性剤に溶解して、脂質成分とミセルを形成する。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有し、非イオン性であってもよい。例示的な界面活性剤には、コレート、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコレート、及びラウロイルサルコシンが含まれる。次いで、オリゴヌクレオチド製剤が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン性基はオリゴヌクレオチドと相互作用し、オリゴヌクレオチドの周りで凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって界面活性剤を除去して、オリゴヌクレオチドのリポソーム製剤を得る。
必要に応じて、凝縮反応中に、例えば、制御された添加により、凝縮を助ける担体化合物を添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であり得る。凝縮を促進するようにｐＨを調整することもできる。
送達ビヒクルの構造成分としてのポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを製造するための方法は、例えば、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／３７１９４にさらに記載されている。リポソーム形成はまた、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７；第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５： ４１９４；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７に記載される例示的な方法の１つ以上の態様を含み得る。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術には、超音波処理及び凍結融解プラス押し出しが含まれる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１を参照されたい）。マイクロ流動化は、一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が必要な場合に使用できる（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９）。これらの方法は、オリゴヌクレオチド製剤をリポソームにパッケージングするのに容易に適合される。
リポソームは大きく２つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソームに取り込まれる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９８０－９８５）。
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸と複合体を形成するのではなく、核酸を捕捉する。核酸と脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体形成ではなく反発が発生しる。それにもかかわらず、一部の核酸はこれらのリポソームの水性内部に閉じ込められる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養中の細胞単層に送達するために使用されている。外因性遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９：２６９－２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要なタイプには、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／またはホスファチジルコリン及び／またはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロ及びインビボで細胞にリポソームを導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；米国特許第５，１７１，６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Ｆｅｉｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９；Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３；及びＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含むシステムもまた、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するために調べられている。ＮＯＶＡＳＯＭＥ（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮＯＶＡＳＯＭＥ（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン－Ａをマウスの皮膚の真皮に送達した。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着を促進するのに効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，４（６）：４６６）。
リポソームはまた、立体的に安定化されたリポソームであり得、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の延長をもたらす１つ以上の特殊な脂質を含む。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されているものである。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来すると当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３：４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当該技術分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８７），５０７：６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、及びホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５：６９４９）によって、詳しく解説された。いずれのＡｌｌｅｎらに対する米国特許米国特許第４，８３７，０２８号とＷＯ８８／０４９２４は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームはＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点がある。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合することはできまないが、インビボでマクロファージに取り込まれ、オリゴヌクレオチドをマクロファージに送達するために使用できる。
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られるリポソームは生体適合性及び生分解性であること、リポソームは、広範囲の水溶性及び脂溶性薬物を組み込むことができること、リポソームは、内部区画にカプセル化されたオリゴヌクレオチドを代謝及び分解から保護することができること、が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質の表面電荷、ベシクルのサイズ、及びリポソームの水量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自発的に相互作用する小さなリポソームを形成し、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合してオリゴヌクレオチドを送達できる脂質－核酸複合体を形成することができる（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、ならびにＤＯＴＭＡ及びそのＤＮＡでの使用の説明については、米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用すると、ＤＮＡ複合体化ベシクルを形成できる。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分な正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味の電荷も正になる。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、原形質膜と融合し、機能性核酸を例えば組織培養細胞に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなくエステルによって連結されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他のカチオン性脂質化合物は、例えば、二種類の脂質のいずれかにコンジュゲートされたカルボキシスペルミンを含む種々の部分にコンジュゲートされたものを含み、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照されたい）などの化合物を含む。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８）。ある特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含むこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡを含む組成物よりも毒性が低く、より効率的なトランスフェクションを提供すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品には、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）及びリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）が含まれる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質はＷＯ９８／３９３５９及びＷＯ９６／３７１９４に記載される。
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームは他の製剤に比べていくつかの利点を示す。そのような利点としては、投与された薬物の高い全身吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、及びオリゴヌクレオチドを皮膚に投与する能力が挙げられる。いくつかの実施において、リポソームは、オリゴヌクレオチドを表皮細胞に送達するために、また、皮膚組織、例えば、皮膚へのオリゴヌクレオチドの浸透を増強するために使用される。例えば、リポソームは局所的に適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達が文書化されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｖｏｌ．２，４０５－４１０ ａｎｄ ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７－１７６；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２－５２７；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５を参照されたい）。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含むシステムもまた、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するために調べられている。ＮＯＶＡＳＯＭＥ Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮＯＶＡＳＯＭＥ ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、薬物をマウスの皮膚の真皮に送達した。オリゴヌクレオチドを含むそのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
リポソームの標的化はまた、例えば、臓器特異性、細胞特異性、及びオルガネラ特異性に基づいて可能であり、当該技術分野で知られている。リポソーム標的化送達システムの場合、リポソーム二重層との安定した会合で標的化リガンドを維持するために、脂質基をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。脂質鎖を標的リガンドに結合するために、様々な連結基を使用することができる。追加の方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願公開第２００６０５８２５５号に記載されており、その連結基は、参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドを含むリポソームは、高度に変形可能にすることができる。そのような変形能は、リポソームがリポソームの平均半径よりも小さい細孔を貫通することを可能にすることができる。例えば、トランスファーソームはさらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に変形しやすいため、液滴よりも小さい細孔を容易に貫通できる脂肪滴として記載することができる。トランスファーソームは、標準的なリポソーム組成物に通常は界面活性剤である表面エッジ活性剤を加えることによって作ることができる。オリゴヌクレオチドを含むトランスファーソームは、オリゴヌクレオチドを皮膚のケラチノサイトに送達するために、例えば、感染によって皮下に送達することができる。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するために、脂質ベシクルは、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれが直径が５０ｎｍ未満の一連の微細な細孔を通過しなければならない。さらに、脂質の特性に起因して、これらのトランスファーソームは、自己最適化（例えば皮膚において、細孔の形状に適応）、自己修復することができ、断片化することなく、しばしば自己ローディングで標的に頻繁に到達することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。トランスファーソームを介した血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同じくらい効果的であることが示されている。
本発明に適した他の製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０８８８９１号、第ＷＯ２００９／１３２１３１号、及び第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広く使用されている。天然と合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類及びランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用されるさまざまな界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に幅広く使用されており、幅広いｐＨ値で使用できる。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミド及びエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。
界面活性剤分子が水に溶解または分散したときに負電荷を帯びている場合、界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸などのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェート及びエトキシル化アルキルサルフェートなどの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、及びホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、硫酸アルキルと石鹸である。
界面活性剤分子が水に溶解または分散したときに正電荷を帯びている場合、界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されているメンバーである。
界面活性剤分子が正または負のいずれかの電荷を帯びる能力を持っている場合、界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、及びホスファチドが含まれる。
医薬品、製剤、及びエマルションにおける界面活性剤の使用が考察されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドはまた、ミセル製剤として提供され得る。ミセルは、両親媒性分子が、分子の全ての疎水性部分が内側に向けられ、親水性部分が周囲の水相と接触したままになるように球形構造に配置される特定のタイプの分子集合体である。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
脂質ナノ粒子ベースの送達方法
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、脂質製剤、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、または他の核酸－脂質粒子に完全にカプセル化され得る。ＬＮＰは、静脈内（ｉｖ）注射後に循環寿命が延長され、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与に非常に有用である。ＬＮＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれる。これには、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載されているカプセル化された縮合剤－核酸複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子中に存在するとき、ヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で耐性がある。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国公開第２０１０／０３２４１２０号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
一実施形態では、脂質対薬物比（質量／質量比）（例えば、脂質対オリゴヌクレオチドの比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲になる。上述の範囲の中間の範囲もまた、本発明の一部であることが企図される。
カチオン性脂質の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリール－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニエテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４ －（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イェエチルアザネジエジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはそれらの混合物が挙げられる。カチオン性脂質は、例えば、粒子に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％、または約４０モル％を構成することができる。
イオン化可能／非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質であり得、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。非カチオン性脂質は、例えば、コレステロールが含まれている場合、粒子に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約６０モル％であり得る。
粒子の凝集を阻害する共役脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されないポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。粒子の凝集を防ぐ共役脂質は、例えば、粒子に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％、または約２モル％であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％、または約５０モル％のコレステロールをさらに含む。
組み合わせ療法
本発明の方法は、単独で、または追加の治療剤、例えば、ＫＣＮＴ１関連障害もしくはそれに関連する症状を治療する他の薬剤と組み合わせて、またはＫＣＮＴ１関連障害を治療するための他のタイプの療法と組み合わせて使用できる。組み合わせ治療では、１つまたは複数の治療用化合物の投与量を、単独で投与する場合の標準的な投与量から減らすことができる。例えば、用量は、薬物の組み合わせ及び順列から経験的に決定されてもよく、またはアイソボログラフ分析によって推定されてもよい（例えば、Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６５：Ｓ３－Ｓ６，２００５）。この場合、組み合わせたときの化合物の投与量は、治療効果をもたらすべきである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤は、ＫＣＮＴ１関連障害を治療するために追加の治療薬と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、ＫＣＮＴ１関連障害に関連する遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）であってもよい。
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は化学療法薬（例えば、細胞傷害性薬剤またはＫＣＮＴ１関連障害の治療に有用な他の化学化合物）である。
第２の薬剤は、非薬物治療である治療剤であり得る。例えば、第２の治療薬は理学療法である。
本明細書に記載の組み合わせ実施形態のいずれにおいても、第１及び第２の治療剤は、同時にまたは逐次的に、いずれかの順序で投与され得る。第１の治療剤は、第２の治療剤の前または後から、直ぐに、最大１時間、最大２時間、最大３時間、最大４時間、最大５時間、最大６時間、最大７時間、最大８時間、最大９時間、最大１０時間、最大１１時間、最大１２時間、最大１３時間、１４時間、最大１６時間、最大１７時間、最大１８時間、最大１９時間、最大２０時間、最大２１時間、最大２２時間、最大２３時間、最大２４時間、または最大１～７、１～１４、１～２１、または１～３０日までに投与することができる。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、インビボでの投与に適した生物学的に適合性のある形態でヒト対象に投与するための医薬組成物に製剤化される。
本明細書に記載の化合物は、遊離塩基の形態で、塩、溶媒和物の形態で、及びプロドラッグとして使用することができる。全ての形態は、ここで説明する方法の範囲内である。当業者によって理解されるように、本発明の方法によると、記載される化合物、またはその塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグは、選択された投与経路に応じて様々な形態で対象に投与することができる。本明細書に記載の化合物は、例えば、経口、非経口、髄腔内、脳室内、実質内、頬側、舌下、経鼻、直腸、パッチ、ポンプ、または経皮投与、それに応じて製剤された医薬組成物によって投与され得る。非経口投与には、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経上皮投与、経鼻投与、肺内投与、髄腔内投与、脳室内、実質内、直腸投与、及び局所投与が含まれる。非経口投与は、選択された期間にわたる連続注入によるものであってもよい。
本明細書に記載の化合物は、例えば、不活性希釈剤もしくは同化可能な食用担体とともに経口投与されるか、または硬質もしくは軟質シェルゼラチンカプセル剤に封入されるか、または錠剤として圧縮されるか、または食事の食品に直接的に組み込まれる。経口治療投与の場合、本明細書に記載の化合物を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤の形態で使用することができる。本明細書に記載の化合物はまた、非経口投与してもよい。本明細書に記載の化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合された水中で調製できる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、及びアルコールを含むかまたは含まないそれらの混合物中、ならびに油中で調製できる。通常の保存及び使用条件下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含み得る。好適な製剤の選択及び調製のための従来の手順及び成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１２，２２ｎｄ ｅｄ．）、及びＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ４１ ＮＦ ３６）（２０１８年出版）に記載される。注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は、滅菌されていなければならず、かつ注射器を介して容易に投与できる程度まで流体でなければならない。好都合にも、経鼻投与のための組成物は、エアロゾル、点鼻剤、ゲル、及び散剤として製剤化され得る。エアロゾル製剤は、典型的には、生理学的に許容可能な水性または非水性溶媒中の活性物質の溶液または微細懸濁液を含み、通常、噴霧装置を伴う使用のためのカートリッジまたはリフィルの形態を取り得る、密封容器内の滅菌形態として単回または複数投与量で提供される。代替的に、密封容器は、使用後の廃棄を意図した定量弁を備える、単回用量経鼻吸入器またはエアロゾル分注器のような一体型分注装置であってよい。剤形がエアロゾル分注器を構成する場合、分中器は、圧縮空気のような圧縮ガスまたはフルオロクロロ炭化水素のような有機噴霧剤であり得る噴霧剤を含むであろう。エアロゾル剤形はポンプ噴霧器の形態をも取り得る。口腔または舌下投与に好適な組成物は、錠剤、ロゼンジ剤、及びトローチ剤を含み、活性成分は、糖、アカシア、トラガカント、またはゼラチン、及びグリセリンのような担体と共に製剤化される。直腸投与のための組成物は、好都合には、カカオバターのような従来の坐剤の基剤を含む坐剤の形態である。
本明細書に記載の化合物は、動物、例えば、ヒトに、単独で、または本明細書に記載の薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することができ、その割合は、化合物の溶解度及び化学的性質、選択された投与経路、及び標準的な薬務によって決定される。
投与量
本明細書に記載の組成物（例えば、オリゴヌクレオチドを含む組成物）の投与量は、化合物の薬力学的特性、投与様式、レシピエントの年齢、健康、及び体重、症状の性質及び程度、治療頻度、並びに、存在する場合は同時の治療の種類、及び治療を受ける動物内における化合物のクリアランス速度のような多数の要因に応じて変動し得る。本明細書に記載の組成物は、最初に好適な用量で投与され得、用量は臨床応答に応じて、必要により調節され得る。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、オリゴヌクレオチドを含む組成物）の投与量は、予防的または治療的に有効な量である。
キット
本発明はまた、（ａ）本明細書に記載の細胞または対象におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させるオリゴヌクレオチド剤を含む医薬組成物と、（ｂ）本明細書に記載の方法のいずれかを実行するための使用説明書を含む添付文書とを含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態では、キットは、本発明はまた、（ａ）本明細書に記載の細胞または対象におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させるオリゴヌクレオチド剤を含む医薬組成物と、（ｂ）追加の治療薬と、（ｃ）本明細書に記載の方法のいずれかを実行するための使用説明書を含む添付文書とを含む。
ＡＳＯの選択方法
ＡＳＯ処理での使用に適したオリゴヌクレオチドは、ババイオインフォマティクス法を使用して選択することができる。オリゴヌクレオチドは１８～２２ヌクレオチドの長さであり得る。オリゴヌクレオチドは、約４０％～約７０％（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％）のＧＣ含量を有し得る。オリゴヌクレオチドは、ヒトＫＣＮＴ１に対して３つ以下（例えば、２、１、または０）のミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マウスＫＣＮＴ１の同じ長さの標的に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マウスＫＣＮＴ１の等しい長さの標的に対して１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、カニクイザルＫＣＮＴ１の同じ長さの標的に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、カニクイザルＫＣＮＴ１の等しい長さの標的に対して１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、マウス及びカニクイザルのＫＣＮＴ１の同じ長さの標的に対して、８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マウス及びカニクイザルのＫＣＮＴ１の等しい長さの標的に対して１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、非ＫＣＮＴ１転写産物に対して少なくとも３つ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のミスマッチを含み得る。オリゴヌクレオチドは二量体を形成しなくてもよい。オリゴヌクレオチドはヘアピンを形成しなくてもよい。オリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧなどのｐｏｌｙＧランを欠いている場合がある。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置１～４７７０のうちのいずれか１つの１０個の核酸塩基範囲内の核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置１～４７７０のうちのいずれか１つの核酸塩基範囲内の核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置３７４、６６１、６５５～６８０、７６５、８３７、１３４７、１３４０～１３７０、１６２９、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、１７４０～１８１５、２８７９、３００８、３１６８、または３１１０～３１７１のうちのいずれか１つの１０個の核酸塩基範囲内の核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置３７４、６６１、６５５、６８０、７６５、８３７、１３４７、１３４０～１３７０、１６２９、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、１７４０～１８１５、２８７９、３００８、３１６８、または３１１０～３１７１のうちのいずれか１つの核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置６５５～６８０、１３４０～１３７、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７５のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置６５５～６８０、１３４０～１３７、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７５のうちのいずれか１つの核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置６５５～６６５、６６０～６７０、６６５～６７５、６７０～６８０、１３４０～１３５０、１３４５～１３５５、１３５０～１３６０、１３５５～１３６５、１３６０～１３７０、１７４０～１７５０、１７４５～１７５５、１７５０～１７６０、１７５５～１７６５、１７６０～１７７０、１７６５～１７７５、１７７０～１７８０、１７７５～１７８５、１７８０～１７９０、１７８５～１７９５、１７９０～１８００、１７９５～１８０５、１８００～１８１０、１８０５～１８１５、３１１０～３１２０、３１１５～３１２５、３１２０～３１３０、３１２５～３１３５、３１３０～３１４０、３１３５～３１４５、３１４０～３１５０、３１４５～３１５５、３１５０～３１６０、３１５５～３１６５、３１６０～３１７０、３１６５～３１７５５、または３１７０～３１８０のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号３５２６の位置６５５～６６５、６６０～６７０、６６５～６７５、６７０～６８０、１３４０～１３５０、１３４５～１３５５、１３５０～１３６０、１３５５～１３６５、１３６０～１３７０、１７４０～１７５０、１７４５～１７５５、１７５０～１７６０、１７５５～１７６５、１７６０～１７７０、１７６５～１７７５、１７７０～１７８０、１７７５～１７８５、１７８０～１７９０、１７８５～１７９５、１７９０～１８００、１７９５～１８０５、１８００～１８１０、１８０５～１８１５、３１１０～３１２０、３１１５～３１２５、３１２０～３１３０、３１２５～３１３５、３１３０～３１４０、３１３５～３１４５、３１４０～３１５０、３１４５～３１５５、３１５０～３１６０、３１５５～３１６５、３１６０～３１７０、３１６５～３１７５５、または３１７０～３１８０のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続する核酸塩基を含む。
配列番号３５２６の位置は、ＫＣＮＴ１転写産物のヌクレオチド位置を指す。例えば、ＫＣＮＴ１転写産物（配列番号３５２６）の位置１２６１のヌクレオチドはアデニンである。本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれも、ＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの任意の位置の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続する核酸塩基に結合することができる。オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの任意の位置の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の核酸塩基範囲内の核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの任意の位置の１０個の核酸塩基範囲内の核酸塩基の等しい長さの部分に少なくとも９０％相補的である、少なくとも１０個の連続する核酸塩基、少なくとも１１個の連続する核酸塩基、少なくとも１２個の連続する核酸塩基、少なくとも１３個の連続する核酸塩基、少なくとも１４個の連続する核酸塩基、少なくとも１５個の連続する核酸塩基、少なくとも１６個の連続する核酸塩基、少なくとも１７個の連続する核酸塩基、少なくとも１８個の連続する核酸塩基、少なくとも１９個の連続する核酸塩基、または少なくとも２０個の連続する核酸塩基を含む。例えば、ＫＣＮＴ１転写産物または転写産物バリアントの位置２２０～２３０の１０個の核酸塩基に少なくとも９０％相補的である２０個の核酸塩基のオリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの位置２１１～２３９の１０個の核酸塩基範囲内にある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド結合は、ＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの核酸塩基位置と重複する。例えば、ＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントの５００位に相補的である２０個のヌクレオチド塩基のオリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１転写産物またはＫＣＮＴ１転写産物バリアントのヌクレオチド位置の核酸塩基４８１～５００、４８３～５０３、４９０～５１０、４９７～５１７、または５００～５１９、またはその中の任意の範囲にハイブリダイズすることができる。
ＡＳＯの評価
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して評価及び確認することができる。例えば、ＫＣＮＴ１発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力及び／または全細胞電流をインビトロアッセイで評価して、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＫＣＮＴ１の機能獲得型変異に関連する疾患もしくは状態及び／または過度のニューロンの興奮性の治療での使用に適していることを確認できる。マウスモデルを使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＫＣＮＴ１の発現または全細胞電流を阻害する能力を評価するだけでなく、機能獲得型ＫＣＮＴ１変異及び／または過度のニューロンの興奮性に関連する症状を改善することもできる。
一例では、ＫＣＮＴ１でトランスフェクトされ、この遺伝子を発現する哺乳動物細胞などの細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もまた、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされる。典型的に、ＫＣＮＴ１には機能獲得型変異が含まれている。別の例では、天然の野生型ＫＣＮＴ１を自然に発現するヒト神経細胞株（例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）が使用される。任意選択で、この細胞のゲノムは、機能獲得型変異を含むように編集され、結果として生じるＫＣＮＴ１ が疾患の原因となるバリアントになる。ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡのレベルは、当該技術分野でよく知られているように、ｑＲＴ－ＰＣＲまたはノーザンブロットを使用して評価することができる。ＫＣＮＴ１からのタンパク質の発現レベルは、Ｒｉｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７２：５４－６３，２０１６）に記載されているように、全細胞溶解物または画分に対するウエスタンブロットによって評価できる。ＫＣＮＴ１でコードされたチャネルの残留機能は、電気生理学またはイオン流量アッセイを使用して評価することもできる。
特定の例において、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、幹細胞モデリングを使用して評価及び確認される（考察については、例えば、Ｔｉｄｂａｌｌ ａｎｄ Ｐａｒｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３４：２７－３３，２０１６；Ｐａｒｅｎｔ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８：３６０－３６６，２０１５を参照されたい）。例えば、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、ＫＣＮＴ１機能獲得型変異を有し、関連する疾患または状態（例えば、ＥＩＭＦＳ、ＡＤＮＦＬＥまたはウェスト症候群）を提示する患者に由来する体細胞（例えば、皮膚線維芽細胞または血液由来の造血細胞）から生成することができる。ＥＩＭＦＳ、ＡＤＮＦＬＥまたはウェスト症候群）。任意選択で、ゲノム編集を使用して機能獲得型変異を野生型に戻し、同質遺伝子の対照細胞株を作製することができ（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，３９７－４０５，２０１３）、これを使用してオリゴヌクレオチドのその後の評価及び比較のための望ましい野生型レベルの活性を決定することもできる。代替的に、ゲノム編集を使用して、野生型の対照ｉＰＳＣ（例えば、参照ｉＰＳＣ株）のＫＣＮＴ１遺伝子に機能獲得型変異を導入することもできる。機能獲得型変異を含むｉＰＳＣ、及び任意選択で同質遺伝子対照は、既知の技術を使用して、興奮性ニューロンを含むニューロンに分化させることができる（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８：１０９，２０１４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７，２７５－２８０，２００９参照されたい）。ＫＣＮＴ１発現（ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルによって評価される）及び／または活性（イオン流量アッセイ及び／または電気生理学、例えば全細胞パッチクランプ法、単一電極電圧クランプ法、もしくは２電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）法によって評価される）に対する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、次いで、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドへのｉＰＳＣの曝露後に評価することができる。
ＫＣＮＴ１を発現する細胞を、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露した場合に観察される、ＫＣＮＴ１発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質）のレベルまたは全細胞電流は、ＫＣＮＴ１を発現する細胞を、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露した場合に観察されるそれぞれのレベルと比較され、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドから生じる阻害のレベルを決定することとなる。典型的には、ＫＣＮＴ１の発現レベルまたは全細胞電流レベルは少なくともまたは約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上低下する。したがって、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１の機能獲得型変異に関連する疾患または状態を治療するために使用することができる。
マウスモデルを使用して、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を評価及び確認することもできる。例えば、ノックインまたはトランスジェニックマウスモデルは、ＳＣＮ１Ａ及びＳＣＮ２Ａノックイン及びトランスジェニックマウスモデルについて記載されたのと同様の方法で、機能獲得型変異を含むＫＣＮＴ１遺伝子を使用して生成できる（例えば、Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １０２，３０７－３１７，２００１；Ｏｇｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７：５９０３－５９１４，２００７；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９：１１４２－１１４９，２００６を参照されたい）。特定の例では、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド）に一致するＫＣＮＴ１遺伝子を使用して、ノックインまたはトランスジェニックマウスを作製する。機能獲得型ＫＣＮＴ１ノックインまたはトランスジェニックマウスは、例えば、神経活動の増加、自然発作、脳波（ＥＥＧ）での不均一な焦点発作活動を含む、ＥＩＭＦＳ、ＡＤＮＦＬＥ、及び／またはウェスト症候群と同様の表現型を示し得る。他の例では、ＳＣＮ１Ａ及びＳＣＮ２Ａノックイン及びトランスジェニックマウスモデルを、過剰なニューロン興奮性を示すモデルに使用することができる。次いで、これらのマウスにおけるＫＣＮＴ１の発現を阻害し、機能獲得型ＫＣＮＴ１変異に関連する症状及び／またはマウスの過剰なニューロン興奮性を改善する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を評価することができる。
例えば、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質のレベルは、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチドのマウスへの投与後に評価することができる。特定の例では、脳、特にニューロンのＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質レベルが評価される。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後のＫＣＮＴ１発現のレベルは、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドから生じる阻害のレベルを決定するために、陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチドが投与されたときに観察されるそれぞれのレベルと比較される。典型的には、マウス（例えば、マウスの脳）のＫＣＮＴ１の発現レベルは少なくともまたは約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上低下する。
別の例では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の機能的効果が評価される。例えば、発作の数、重症度、及び／または種類は視覚的に及び／またはＥＥＧにより評価することができる。ニューロンの興奮性は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは陰性対照アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与されたマウスから脳スライスを切除し、全細胞電流を評価することによって（例えば、全細胞パッチクランプ法を使用して）評価することもできる。同様のニューロン興奮性分析は、マウスから単離され、次いで培養されたニューロンを使用して実行できる。さらに、歩行特性を含むマウスの行動を評価して、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の機能的効果を決定することができる。
更なる実施形態
本明細書に開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ のＫＣＮＴ１に対して２つ以下のミスマッチを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、任意の非ＫＣＮＴ１転写産物に対する少なくとも３つのミスマッチを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧ４塩基組を欠いている。
本明細書にさらに開示されるのは、配列番号１～３４０９のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む、１８～２２個の連結ヌクレオシドの長さの一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、少なくとも１０個の核酸塩基の領域は、配列番号１～３４０９のうちのいずれか１つの等しい長さの部分に少なくとも９０％の相補性を有する。一態様では、少なくとも１０個の核酸塩基の領域は、配列番号１～３４０９のうちのいずれか１つの等しい長さの部分に少なくとも９５％の相補性を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３４０９のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１～３４０９のうちのいずれか１つからなる。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、以下を含む：（ａ）連結したデオキシリボヌクレオシドを含むギャップセグメント、（ｂ）連結したヌクレオシドを含む５’ウィングセグメント、（ｃ）連結したヌクレオシドを含む３’ウィングセグメント。ここで、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に配置された配列番号１～３４０９のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも８０％の相補性を有する少なくとも１０つの連続する核酸塩基の領域を含む。ここで、５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントはそれぞれ、少なくとも２つの連結したヌクレオシドを含む。ここで、各々のウィングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドは、代替ヌクレオシドを含む。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合を含む。一態様では、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。一態様では、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合は、２’－アルコキシヌクレオシド間結合である。一態様では、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合は、アルキルホスフェートヌクレオシド間結合である。一態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替核酸塩基を含む。一態様では、代替核酸塩基は、５’－メチルシトシン、シュードウリジン、または５－メトキシウリジンである。一態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替糖部分を含む。一態様では、代替糖部分は、２’－ＯＭｅまたは二環式核酸である。一態様では、オリゴヌクレオチドは、一価または分岐二価または三価リンカーを介してオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端にコンジュゲートされたリガンドをさらに含む。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１遺伝子の少なくとも１７個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１遺伝子の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１７及び１９～５０のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１８の少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５１～８１、８３～８６、及び８８～９６のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基配列を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８２及び８７のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号９７～１１６のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基配列を含む。
本明細書にさらに開示されるのは、オリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、請求項１～２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、脂質ナノ粒子、ポリプレックスナノ粒子、リポプレックスナノ粒子、またはリポソームとを含む組成物である。本明細書にさらに開示されるのは、オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または組成物を、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させるのに十分な量及び期間で対象に投与することによって、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させることを、それを必要とする対象において行う方法である。
本明細書にさらに開示されるのは、対象におけるＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させる方法であって、以下を含む方法である：（ａ）４０％～７０％のＧＣ含量を含む１８～２２個の連結ヌクレオシドの長さの一本鎖オリゴヌクレオチドを選択することであって、オリゴヌクレオチドが：（ｉ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さ部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、（ｉｉ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さ部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、または（ｉｉｉ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さ部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、選択することと、（ｂ）オリゴヌクレオチドを、ＫＣＮＴ１関連障害治療、予防、またはその進行を遅延させるのに十分な量及び期間、対象に投与すること。
一態様では、オリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ のＫＣＮＴ１に対して２つ以下のミスマッチを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、任意の非ＫＣＮＴ１転写産物に対する少なくとも３つのミスマッチを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧ４塩基組を欠いている。
本明細書にさらに開示されるのは、オリゴヌクレオチドが細胞内のＫＣＮＴ１遺伝子の発現を阻害する、ＫＣＮＴ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な量及び期間で、オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または組成物を、細胞と接触させることを含む、細胞内のＫＣＮＴ１の転写を阻害する方法である。
本明細書にさらに開示されるのは、オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または組成物を、細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を下げるのに十分な量及び期間で細胞と接触させることを含む、ＫＣＮＴ１関連障害を有する対象の細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる方法である。一態様では、対象はヒトである。一態様では、細胞は中枢神経系の細胞である。一態様では、ＫＣＮＴ１関連障害は、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群からなる群から選択される。一態様では、対象は、ＫＣＮＴ１に機能獲得型変異を有する。一態様では、機能獲得型変異は、Ｖ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ｉ、Ｇ２８８Ｓ、Ｆ３４６Ｌ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ４７４Ｈ、Ｆ５０２Ｖ、Ｍ５１６Ｖ、Ｋ６２９Ｎ、Ｉ７６０Ｍ、Ｙ７９６Ｈ、Ｅ８９３Ｋ、Ｍ８９６Ｉ、Ｍ８９６Ｋ、Ｐ９２４Ｌ、Ｒ９２８Ｃ、Ｆ９３２Ｉ、Ａ９３４Ｔ、Ａ９６６Ｔ、Ｈ２５７Ｄ、Ｒ２６２Ｑ、Ｑ２７０Ｅ、Ｖ３４０Ｍ、Ｃ３７７Ｓ、Ｐ４０９Ｓ、Ｌ４３７Ｆ、Ｒ４７４Ｃ、Ａ４７７Ｔ、Ｒ５６５Ｈ、Ｋ６２９Ｅ、Ｇ６５２Ｖ、Ｉ７６０Ｆ、Ｑ９０６Ｈ、Ｒ９３３Ｇ、Ｒ９５０Ｑ、Ｒ９６１Ｈ、Ｒ１１０６Ｑ、Ｋ１１５４Ｑ、Ｒ４７４Ｑ、Ｙ１９０３Ｃ、Ｈ４６９Ｌ、Ｍ８９６Ｒ、Ｋ９４６Ｅ、及びＲ９５０Ｌからなる群から選択される。一態様では、方法は、ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状を低減させる。一態様では、ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状は、長期の発作、頻繁な発作、行動及び発達の遅延、運動及びバランスの問題、整形外科的状態、言語遅延及び発声の問題、成長及び栄養の問題、睡眠困難、慢性感染症、感覚統合障害、自律神経系の乱れ、ならびに発汗からなる群から選択される。
本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書にさらに開示されるのは、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
一態様では、本発明は、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１とＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓの両方のＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。
別の態様では、本発明は、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。
別の態様では、本発明は、１８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、４０％～７０％のＧＣ含量を含み、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１に対して２つ以下のミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、任意の非ＫＣＮＴ１転写産物に対する少なくとも３つのミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧ４塩基組を欠いている。
別の態様では、本発明は、配列番号１～３４０９（例えば、配列番号１～１１６または１－３３８４）のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む、１８～２２個の連結ヌクレオシドの長さの一本鎖オリゴヌクレオチドを特徴とする。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３４０９（例えば、配列番号１～１１６または１～３３８４）のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基に対して少なくとも８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連結したデオキシリボヌクレオシドを含むギャップセグメント、連結したヌクレオシドを含む５’ウィングセグメント、及び連結したヌクレオシドを含む３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、配列番号１～３４０９（例えば、配列番号１～１１６または１～３３８４）のうちのいずれか１つの等しい長さの部分に対して少なくとも８０％の相補性を有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基の領域を含み得、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に配置される。５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントは、それぞれ、少なくとも２つの連結したヌクレオシドを含み得、各ウィングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドは、代替ヌクレオシドを含み得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１０個の核酸塩基の領域は、配列番号１～３４０９（例えば、配列番号１～１１６または１～３３８４）のうちのいずれか１つの等しい長さの部分に対して、少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の相補性を有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３４０９（例えば、配列番号１～１１６または１～３３８４）のうちのいずれか１つの核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１～３４０９（例えば、配列番号１～１１６または１～３３８４）のうちのいずれか１つからなる。
いくつかのの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合は、２’－アルコキシヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの代替ヌクレオシド間結合は、アルキルホスフェートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替核酸塩基を含む。
いくつかの実施形態では、代替核酸塩基は、５’－メチルシトシン、シュードウリジン、または５－メトキシウリジンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの代替糖部分を含む。
いくつかの実施形態において、代替糖部分は、２’－ＯＭｅまたは二環式核酸である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一価または分岐した二価または三価のリンカーを介してオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端にコンジュゲートされたリガンドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１遺伝子の少なくとも１７個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＫＣＮＴ１遺伝子の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１１６のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１７、及び１９～５０のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１８の少なくとも１８個の連続する核酸塩基の領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号５１～８１、８３～８６、及び８８～９６のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８２及び８７のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号９７～１１６のうちのいずれか１つの少なくとも１８個の連続する核酸塩基配列を含む。
別の態様では、本発明は、上述の実施形態のいずれかのオリゴヌクレオチドと薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を特徴とする。
別の態様では、本発明は、上述の態様のいずれかのオリゴヌクレオチドと、脂質ナノ粒子、ポリプレックスナノ粒子、リポプレックスナノ粒子、またはリポソームとを含む組成物を特徴とする。
別の態様では、本明細書は、上述の態様のいずれかのオリゴヌクレオチド、医薬組成物、または組成物を、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させるのに十分な量及び期間で対象に投与することによって、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させることを、それを必要とする対象において行う方法と特徴とする。
別の態様では、本発明は、以下によって、対象におけるＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させる方法を特徴とする。
（ａ）４０％～７０％のＧＣ含量を含む１８～２２個の連結ヌクレオシドの長さの一本鎖オリゴヌクレオチドを選択することであって、オリゴヌクレオチドが：
（ｉ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さ部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、
（ｉｉ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さ部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するか、または
（ｉｉｉ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及びＭ．ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓのＫＣＮＴ１の等しい長さ部分に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、選択することと、
（ｂ）オリゴヌクレオチドを、ＫＣＮＴ１関連障害治療、予防、またはその進行を遅延させるのに十分な量及び期間、対象に投与すること。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１に対して２つ以下のミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、任意の非ＫＣＮＴ１転写産物に対する少なくとも３つのミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧ４塩基組を欠いている。
別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドが細胞内のＫＣＮＴ１遺伝子の発現を阻害する、ＫＣＮＴ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得るのに十分な量及び期間で、上述の態様のいずれかのオリゴヌクレオチド、医薬組成物、または組成物を、細胞と接触させることによって、細胞内のＫＣＮＴ１の転写を阻害する方法を特徴とする。
別の態様では、本発明は、上述の態様のいずれかのオリゴヌクレオチド、医薬組成物、または組成物を、細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を下げるのに十分な量及び期間で細胞と接触させることによって、ＫＣＮＴ１関連障害を有する対象の細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる方法を特徴とする。
いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、細胞は中枢神経系の細胞である。
いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１関連障害は、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＫＣＮＴ１に機能獲得型変異を有する。
いくつかの実施形態では、機能獲得型変異は、Ｖ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ｉ、Ｇ２８８Ｓ、Ｆ３４６Ｌ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ４７４Ｈ、Ｆ５０２Ｖ、Ｍ５１６Ｖ、Ｋ６２９Ｎ、Ｉ７６０Ｍ、Ｙ７９６Ｈ、Ｅ８９３Ｋ、Ｍ８９６Ｉ、Ｍ８９６Ｋ、Ｐ９２４Ｌ、Ｒ９２８Ｃ、Ｆ９３２Ｉ、Ａ９３４Ｔ、Ａ９６６Ｔ、Ｈ２５７Ｄ、Ｒ２６２Ｑ、Ｑ２７０Ｅ、Ｖ３４０Ｍ、Ｃ３７７Ｓ、Ｐ４０９Ｓ、Ｌ４３７Ｆ、Ｒ４７４Ｃ、Ａ４７７Ｔ、Ｒ５６５Ｈ、Ｋ６２９Ｅ、Ｇ６５２Ｖ、Ｉ７６０Ｆ、Ｑ９０６Ｈ、Ｒ９３３Ｇ、Ｒ９５０Ｑ、Ｒ９６１Ｈ、Ｒ１１０６Ｑ、Ｋ１１５４Ｑ、Ｒ４７４Ｑ、Ｙ１９０３Ｃ、Ｈ４６９Ｌ、Ｍ８９６Ｒ、Ｋ９４６Ｅ、及びＲ９５０Ｌからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該方法は、ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状を低減させる。
いくつかの実施形態では、ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状は、長期の発作、頻繁な発作、行動及び発達の遅延、運動及びバランスの問題、整形外科的状態、言語遅延及び発声の問題、成長及び栄養の問題、睡眠困難、慢性感染症、感覚統合障害、自律神経系の乱れ、ならびに発汗からなる群から選択される。
実施例１．アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計、選択、及び試験
バイオインフォマティクス分析を実施して、ペアワイズ相同性を有する２０塩基対領域を有するヒト、マウス、及びサルのＫＣＮＴ１遺伝子の領域を同定した。例えば、ヒトとサルのＫＣＮＴ１、ヒトとマウスのＫＣＮＴ１、またはヒトとサルとマウスのＫＣＮＴ１の間で少なくとも１７ｂｐの重複を有する２０ｂｐの領域が同定された。ヒトＫＣＮＴ１にのみ結合する標的配列も同定された。ＡＳＯ配列、指定されたヒト転写産物の位置、及びミスマッチの数は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮出願６２／７８２，８７７の表１に示されている。さらに、ヒトＫＣＮＴ１遺伝子のイントロン標的配列が同定された。これらのＡＳＯ配列は、米国仮出願６２／７８２，８７７の表２にある。ＭＭは、それぞれ、エキソニックまたはイントロンに誘導されるＡＳＯについて、ＮＭ＿０２０８２２．２またはＮＧ＿０３３０７０．１のいずれかに対するミスマッチの数を示す。
ＡＳＯ配列について、非ＫＣＮＴ１スプライシング（二次）ｍＲＮＡ転写産物との相同性も、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｒ９２（２０１９年１月）及びＥｎｓｅｍｂｌｅ Ｒ９４（２０１８年１０月）データベースを使用して決定した。２０１９年６月１７日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願６２／８６２，３２８の表３は、０ＭＭから４ＭＭへのミスマッチ（ＭＭ）の数の増加で識別された非ＫＣＮＴ１転写産物の数を列挙する。
ＡＳＯ配列について、非ＫＣＮＴ１非スプライシング（一次）プレｍＲＮＡ転写産物との相同性も、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ Ｒ９４（２０１８年１０月）データベースを使用して決定した。２０１９年６月１７日に出願された米国仮出願６２／８６２，３２８の表４は、０ＭＭから４ＭＭへのミスマッチ（ＭＭ）の数の増加で識別された非ＫＣＮＴ１転写産物の数を列挙する。
ＡＳＯ配列について、ＡＳＯ配列内で報告された一塩基多型（ＳＮＰ）の位置も、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰビルド１５１（２０１７年１０月、２０１９年１月にダウンロード）を使用して決定した。２０１９年６月１７日に出願された米国仮出願６２／８６２，３２８の表５は、各ＳＮＰの位置と関連するＳＮＰ ＩＤを列挙する。
表２は、ＡＳＯ配列の配列番号、それらのＡＳＯ配列の特定されたヒト転写産物における位置、及びミスマッチ（ＭＭ）の数を示す。留意すべき点は、配列番号１～９６及び１１７～３５２５のミスマッチの数は、ＮＭ＿０２０８２２．２（配列番号３５２６）と比較して決定されたことである。配列番号９７～１１６のミスマッチの数は、ＮＧ＿０３３０７０．１と比較して決定された。
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選択されたＡＳＯについて、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡノックダウンの程度を、ｔａｑｍａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲアッセイ）を使用して決定した。ヒト（ＢＥ（２）－Ｍ１７）またはマウス（Ｎｅｕｒｏ２ａ）の神経細胞株を９６ウェルプレートで増殖させ、ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３０ｎＭまたは３００ｎＭのいずれかのＡＳＯでトランスフェクトした。３７℃で４８時間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ－ｔｏ－Ｃｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して各ウェルからｃＤＮＡを調製した。ＫＣＮＴ１の発現レベルを、ＫＣＮＴ１（ヒトＨｓ０１０６３０５０＿ｍ１もしくはマウスＭｍ０１３３０６３８＿ｇ１）、またはハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１（ヒトＨｓ０２８００６９５＿ｍ１もしくはマウスＭｍ００４４６９６８＿ｍ１）のいずれかに対するｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイを使用して決定した。全てのｔａｑｍａｎアッセイは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって事前に設計されている。ヒトＫＣＮＴ１及びＨＰＲＴ１の検出を、単一のウェルで多重化した。マウスＫＣＮＴ１とＨＰＲＴ１の検出は、対のウェルでシングルプレックスであった。ＫＣＮＴ１の変化倍率を、ΔΔＣｐ法を使用して計算した。これにより、ＫＣＮＴ１の発現は最初に、同一ウェルでＨＰＲＴ１に正規化され（２－（Ｃｐ＿ＫＣＮＴ１－Ｃｐ＿ＨＰＲＴ１））、ビヒクル、トランスフェクトされていない対照への二次正規化が後に続く（２－（Ｃｐ＿ＡＳＯ－Ｃｐ＿ｖｅｈｉｃｌｅ））。アッセイを、生物学的に２重及び技術的に３重で実施した。表３は、ヒト（ＢＥ（２）－Ｍ１７）またはマウス（Ｎｅｕｒｏ２ａ）の細胞で発現したＫＣＮＴ１のノックダウンパーセントを列挙する。
ヒトＫＣＮＴ１との相同性が高く、カニクイザル及びマウスＫＣＮＴ１との相同性が低い配列が同定された。ＡＳＯ配列、指定されたヒト転写産物の位置、及びミスマッチの数は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願６２／８６２，３２８の表７、及び２０１９年８月８日に出願された米国仮出願６２／８８４，５６７の表１１に示されている。ＭＭは、不一致の数を示す。
ＡＳＯ配列について、非ＫＣＮＴ１スプライシング（二次）ｍＲＮＡ転写産物との相同性も、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｒ９２（２０１９年１月）及びＥｎｓｅｍｂｌｅ Ｒ９４（２０１８年１０月）データベースを使用して決定した。米国仮出願６２／８６２，３２８の表８、及び米国仮出願６２／８８４，５６７の表１２は、０ＭＭから４ＭＭへのミスマッチの数の増加で識別された非ＫＣＮＴ１転写産物の数を列挙する。
ＡＳＯ配列について、非ＫＣＮＴ１非スプライシング（一次）プレｍＲＮＡ転写産物との相同性も、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ Ｒ９４（２０１８年１０月）データベースを使用して決定した。米国仮出願６２／８６２，３２８の表９、及び米国仮出願６２／８８４，５６７の表１３は、０ＭＭから４ＭＭへのミスマッチの数の増加で識別された非ＫＣＮＴ１転写産物の数を列挙する。
ＡＳＯ配列について、ＡＳＯ配列内で報告された一塩基多型（ＳＮＰ）の位置も、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰビルド１５１（２０１７年１０月、２０１９年１月にダウンロード）を使用して決定した。米国仮出願６２／８６２，３２８の表１０、及び米国仮出願６２／８８４，５６７の表１４は、各ＳＮＰの位置と関連するＳＮＰ ＩＤを列挙する。
ＡＳＯ配列について、ＫＣＮＴ１ノックダウンのレベルも、ヒト（ＢＥ（２）－Ｍ１７）またはマウス（Ｎｅｕｒｏ２ａ）の神経細胞株を使用して決定した。表４に、ノックダウンパーセントとして表されたデータを示す。
Figure 2022515744000032
Figure 2022515744000033
Figure 2022515744000034
実施例２．ＫＣＮＴ１のアンチセンス阻害
ＫＣＮＴ１の阻害またはノックダウンは、細胞ベースのアッセイを使用して実証できる。例えば、ｉＰＳＣ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、または別の利用可能な哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）由来のニューロンは、製造者の使用説明書に従ってｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのトランスフェクション試薬を使用して、少なくとも５つの異なる用量レベルを用いて、実施例１において上で同定されたＫＣＮＴ１を標的とするオリゴヌクレオチドで試験することができる。ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれかの分析のために、トランスフェクション後７日までの複数の時点で細胞を回収する。ｍＲＮＡ及びタンパク質のノックダウンを、前述の標準的な分子生物学技術を使用して、それぞれＲＴ－ｑＰＣＲまたはウエスタンブロット分析によって決定する（例えば、Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ９（６）： ｅ９９３４１に記載されているものを参照されたい）。異なるオリゴヌクレオチドレベルでのＫＣＮＴ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の相対レベルを、モックオリゴヌクレオチド対照と比較する。最も強力なオリゴヌクレオチド（例えば、対照と比較した場合のタンパク質レベルを少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の低下させることができるオリゴヌクレオチド）を、その後の研究のために選択する。
実施例３．修飾化学を用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計、選択、及び試験
実施例１で試験した選択されたＡＳＯを、表４及び５に示されるように、糖及び結合化学を用いて合成した。
選択されたＡＳＯについて、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡノックダウンの程度を、ｔａｑｍａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲアッセイ）を使用して決定した。ヒト（ＢＥ（２）－Ｍ１７）の神経細胞株を９６ウェルプレートで増殖させ、ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１００ｎＭのＡＳＯでトランスフェクトした。３７℃で４８時間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ－ｔｏ－Ｃｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して各ウェルからｃＤＮＡを調製した。ＫＣＮＴ１の発現レベルを、ＫＣＮＴ１（ヒトＨｓ０１０６３０５０＿ｍ１もしくはマウスＭｍ０１３３０６３８＿ｇ１）、またはハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１（ヒトＨｓ０２８００６９５＿ｍ１もしくはマウスＭｍ００４４６９６８＿ｍ１）のいずれかに対するｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイを使用して決定した。全てのｔａｑｍａｎアッセイは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって事前に設計されている。ＫＣＮＴ１及びＨＰＲＴ１の検出を、単一のウェルで多重化した。ＫＣＮＴ１の変化倍率を、ΔΔＣｐ法を使用して計算した。これにより、ＫＣＮＴ１の発現は最初に、同一ウェル（多重化反応）でＨＰＲＴ１に正規化され（２－（Ｃｐ＿ＫＣＮＴ１－Ｃｐ＿ＨＰＲＴ１））、ビヒクル、トランスフェクトされていない対照への二次正規化が後に続く（２－（Ｃｐ＿ＡＳＯ－Ｃｐ＿ｖｅｈｉｃｌｅ））。アッセイを、生物学的に２重及び技術的に３重で実施した。
表５は、オリゴヌクレオチドＡＳＯ配列、ＫＣＮＴ１転写産物（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０２０８２２．２（配列番号３５２６））における位置、及びＡＳＯを改変するために使用される化学組成を提示する。ＡＳＯギャップの列において、「ｄ」はＤＮＡであり、「ｅ」は、２’修飾（例えば、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’ＭＯＥ）修飾）リボースを含むリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、二環式糖（例えば、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）、またはｃＥＴ）を示す。ＡＳＯリンケージの列で、「ｓ」はホスホロチエート結合を示し、「ｏ」はホスホジエステル結合を示す。「ＡＳＯシトシン」の列の「なし」は、全てのシトシンが未修飾であることを示し、「修飾」は、全てのシトシンが５－メチル－２’－デオキシシトシン（５－メチル－ｄＣ）であることを示す。ＡＳＯ特異的陰性対照を作成するために、選択したＡＳＯ（配列番号３５１２～３５２５）を、位置５、９、１３、１７の操作されたミスマッチ（ＭＭ）またはスクランブル（ＳＣ）戦略のいずれかを使用して合成し、元の配列を５のブロックに再配置した。これらの陰性対照は、上の元のＮＭ＿０２０８２２．２上の結合位置によって編成される。
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Figure 2022515744000036
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表６は、オリゴヌクレオチドＡＳＯ配列、ＫＣＮＴ１転写産物（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０２０８２２．２）、ＡＳＯを変更するために使用される化学組成、及び示されたＡＳＯで処理した後のＢＥ（２）－Ｍ１７細胞におけるＫＣＮＴ１のノックダウンパーセントを提示する。ここで、異なるＡＳＯ配列に対応するデータは、最初の列に示されているように、ＫＣＮＴの位置に従って編成されている。ＡＳＯギャップ列において、「ｅ」は２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’ＭＯＥ）修飾ヌクレオシドを示し、「ｋ」は、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）を示す。ＡＳＯリンケージの列で、「ｓ」はホスホロチエート結合を示し、「ｏ」はホスホジエステル結合を示す。「ＡＳＯシトシン」の列の「なし」は、全てのシトシンが未修飾であることを示し、「修飾」は、全てのシトシンが５－メチル－２’－デオキシシトシン（５－メチル－ｄＣ）であることを示す。
全てのＡＳＯ特異的陰性対照（配列番号３５１２～３５２５）は、マッチする標的化ＡＳＯと比較して、ＢＥ（２）－Ｍ１７細胞でより少ないＫＣＮＴ１ノックダウンをもたらした。これらのデータは、アッセイの特異性を確認し、ノックダウンの配列相同性への依存性を強調している。さまざまな化学組成で得られたノックダウンの間には、一般的に良好な一致があった。しかしながら、いくつかのＡＳＯ配列は、使用された化学組成に応じて大幅に異なる活性を示した（位置１３５４：２１％ノックダウンの配列番号１２０８対５９％ノックダウンの配列番号３４５７）。さらに、シトシン修飾ＡＳＯは、試験されたＡＳＯの大部分に対して一貫してより強力であった。試験したホットスポット全体（ＮＭ＿０２０８２２．２（配列番号３５２６）：６５５～６８０、１３４０～１３７０、１７４０～１８１５、及び３１１０～３１７１）で活性が観察されたが、配列相同性によって予測されなかった、より大きな活性を有する、ある特定のＡＳＯがあった。
Figure 2022515744000054
Figure 2022515744000055
Figure 2022515744000056
Figure 2022515744000057
Figure 2022515744000058
Figure 2022515744000059
Figure 2022515744000060
以下の表７は、対応する配列番号の配列を有するＡＳＯで処理した後のＢＥ（２）－Ｍ１７細胞におけるＫＣＮＴ１のノックダウンパーセントを示す。
Figure 2022515744000061
Figure 2022515744000062
実施例４．選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの評価
選択されたＡＳＯについて、ＫＣＮＴ１のｍＲＮＡノックダウンの程度を、ｔａｑｍａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲアッセイ）を使用して決定した。ヒト（ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ）神経細胞株に、Ａｍａｘａヌクレオフェクション（プロトコールＣＡ１３７）を使用して５００ｎＭ～１０，０００ｎＭのＡＳＯをトランスフェクトした。３７℃で４８時間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ－ｔｏ－Ｃｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して各ウェルからｃＤＮＡを調製した。ＫＣＮＴ１の発現レベルを、ＫＣＮＴ１（ヒトＨｓ．ＰＴ．５８．１９４４２７６６）、またはハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１（ヒトＨｓ．ＰＴ．５８ｖ．４５６２１５７２）のいずれかに対するｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイを使用して決定した。全てのｔａｑｍａｎアッセイは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって事前に設計されている。ＫＣＮＴ１及びＨＰＲＴ１の検出を、単一のウェルで多重化した。ＫＣＮＴ１の変化倍率を、ΔΔＣｐ法を使用して計算した。これにより、ＫＣＮＴ１の発現は最初に、同一ウェル（多重化反応）でＨＰＲＴ１に正規化され（２－（Ｃｐ＿ＫＣＮＴ１－Ｃｐ＿ＨＰＲＴ１））、ビヒクル、トランスフェクトされていない対照への二次正規化が後に続く（２－（Ｃｐ＿ＡＳＯ－Ｃｐ＿ｖｅｈｉｃｌｅ））。アッセイを、生物学的に２重及び技術的に３重で実施した。
図１は、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド（具体的には、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号７５１、配列番号７５９、配列番号１２０６、及び配列番号１５４６に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド）処理に応答したｈＫＣＮＴ１のノックダウンのパーセンテージを示すプロットである。ノックダウンのパーセンテージの数値を以下の表８に示す。陽性対照は配列番号７である。陰性対照は、化学組成が同一であるがヒトゲノムにはない配列を有するＡＳＯである。
Figure 2022515744000063
試験した全てのＡＳＯが、ＫＣＮＴ１発現の用量依存的なノックダウンを示した。配列番号４及び１５４６に示されるＡＳＯは、ＫＣＮＴ１遺伝子の最も強力なノックダウンを示し、５μＭのＡＳＯオリゴヌクレオチドで処理した場合に８０％を超える遺伝子発現の低下を示した。各ＡＳＯのＩＣ５０を表９に示す。
Figure 2022515744000064
他の実施形態
本明細書で言及する全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本出願中の用語が、参照により本明細書に組み込まれる文献において異なって定義されることが見出される場合、本明細書で提供される定義が、その用語の定義としての役割を果たす。
本発明は、その具体的な実施形態と関連して記載されているが、本発明はさらなる修正が可能であり、この出願は、一般に本発明の原理に従い、既知または慣行に含まれ、本発明が関係する技術の範囲内であり、前述の本質的な特徴に適用することができ、特許請求される範囲に従う本開示からのそのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または適応を範囲に含むことを意図していることを理解されたい。

Claims (95)

  1. 配列番号３５２６に対して少なくとも９０％同一である配列を含む転写産物の少なくとも１０個の連続する核酸塩基に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列、または配列番号３５２６の連続する１５から５０個の核酸塩基部分を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
  2. 配列番号３５２６に対して少なくとも９０％同一である配列を含む転写産物の少なくとも１０個の連続する核酸塩基に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列、または配列番号３５２６の連続する１５から５０個の核酸塩基部分を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチド。
  3. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含む、請求項１もしくは３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２もしくは３に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１～１１６のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含む、請求項１もしくは３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２もしくは３に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 前記オリゴヌクレオチドが、１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである、請求項１もしくは３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２もしくは３に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１０個の核酸塩基配列を含む、請求項１もしくは３～６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～６の いずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含む、請求項１もしくは３～７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも連続する１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の核酸塩基配列を含む、請求項１もしくは３～８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３８８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む化合物。
  11. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基配列を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチド。
  12. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と９０％の同一性を共有する少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、４、５、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２８、２９、６２、６２５～６４９、１０４６、１０７１、１１９５～１２２４、１３３８、１４９６～１５６７、２５９１～２６３１、または３３９５～３５２５のうちのいずれか１つの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基を含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４、１０４６、１０７１、１３８８、１５５１、１５４６、または２５９５のうちのいずれか１つの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，または１９個の連続する核酸塩基を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
  15. 配列番号３５２６の位置３７４、６６１、６５５～６８０、７６５、８３７、１３４７、１３４０～１３７０、１６２９、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、１７４０～１８１５、２８７９、３００８、３１６８、または３１１０～３１７１のうちのいずれか１つの１０個の核酸塩基の範囲内の等しい長さの部分に対して少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドを含む化合物。
  16. 配列番号３５２６の位置３７４、６６１、６５５～６８０、７６５、８３７、１３４７、１３４０～１３７０、１６２９、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、１７４０～１８１５、２８７９、３００８、３１６８、または３１１０～３１７１のうちの１０個の核酸塩基の範囲内の等しい長さの部分に対して少なくとも９０％相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含み、前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が修飾ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチド。
  17. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置６５５～６８０、１３４０～１３７、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７５のいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さ部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  18. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置６５５～６６５、６６０～６７０、６６５～６７５、または６７０～６８０のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置１３４０～１３５０、１３４５～１３５５、１３５０～１３６０、１３５５～１３６５、または１３６０～１３７０のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置１７４０～１７５０、１７４５～１７５５、１７５０～１７６０、１７５５～１７６５、１７６０～１７７０、１７６５～１７７５、１７７０～１７８０、１７７５～１７８５、１７８０～１７９０、１７８５～１７９５、１７９０～１８００、１７９５～１８０５、１８００～１８１０、または１８０５～１８１５のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置３１１０～３１２０、３１１５～３１２５、３１２０～３１３０、３１２５～３１３５、３１３０～３１４０、３１３５～３１４５、３１４０～３１５０、３１４５～３１５５、３１５０～３１６０、３１５５～３１６５、３１６０～３１７０、３１６５～３１７５、３１７０～３１８０のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１０個の連続する核酸塩基を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置３７４、６６１、７６５、８３７、１３４７、１６２９、２８７９、３００８、３１６８、１７６０、１７５２、１７９５、１７７５、６５５～６８０、１３４０～１３７０、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７１のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基を含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  23. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３５２６の位置６５５～６８０、１３４０～１３７、１７４０～１８１５、または３１１０～３１７５のうちのいずれか１つ内の核酸塩基の等しい長さの部分に相補的である少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の連続する核酸塩基を含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  24. 前記オリゴヌクレオチドが１２～４０個の核酸塩基の長さである、請求項１もしくは３～２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２３のいずれか１項に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド。
  25. 前記オリゴヌクレオチドが、
    ａ．連結したデオキシリボヌクレオシド、２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、及びフルオロシクロヘキセン核酸（Ｆ－ＣｅＮＡ）のうちの１つ以上を含むギャップセグメント、
    ｂ．連結したヌクレオシドを含む５’ウィングセグメント、
    ｃ．連結したヌクレオシドを含む３’ウィングセグメントを含み、
    ｄ．前記ギャップセグメントが、前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に配置された配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも８つの連続する核酸塩基の領域を含み、前記５’ウィングセグメント及び前記３’ウィングセグメントがそれぞれ、少なくとも２つの連結したヌクレオシドを含み、各々のウィングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾糖を含む、請求項１、１０、または１５のいずれか１項に記載の化合物。
  26. ａ．連結したデオキシリボヌクレオシド、２’－フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、及びフルオロシクロヘキセン核酸（Ｆ－ＣｅＮＡ）のうちの１つ以上を含むギャップセグメント；
    ｂ．連結したヌクレオシドを含む５’ウィングセグメント；
    ｃ．連結したヌクレオシドを含む３’ウィングセグメントを含み、
    ｄ．前記ギャップセグメントが、配列番号１～３５２５のうちのいずれか１つの等しい長さの部分と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも８つの連続する核酸塩基の領域を含み、前記５’ウィングセグメント及び前記３’ウィングセグメントがそれぞれ、少なくとも２つの連結したヌクレオシドを含み、各々のウィングセグメントの少なくとも１つのヌクレオシドが、修飾糖を含む、請求項２、１１、または１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  27. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連結したヌクレオシドを含む、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
  28. 前記核酸塩基配列の少なくとも１つのヌクレオシド結合が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、２’－アルコキシ結合、アルキルリン酸エステル結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、メチルホスホネート結合、ジメチルホスホネート結合、アミノアルキルホスホトリエステル結合、アルキレンホスホネート結合、ホスフィネート結合、ホスホルアミデート結合、ホスホロジアミデート結合、アミノアルキルホスホルアミデート結合、チオホスホルアミデート結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、チオホスフェート結合、セレノホスフェート結合、及びボラノホスフェート結合からなる群から選択される、請求項１、もしくは３～２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  29. 前記５’ウィングセグメントの少なくとも２つの連結したヌクレオシドが、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して連結され、前記３’ウィングセグメントの少なくとも２つの連結したヌクレオシドが、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して連結され、前記ギャップセグメントのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも１つが、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項２５もしくは２７に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６もしくは２７に記載のオリゴヌクレオチド。
  30. 前記核酸塩基配列の少なくとも２つ、３つ、または４つのヌクレオシド間結合がホスホジエステルヌクレオシド間結合である、請求項２５もしくは２７～２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  31. 前記ギャップセグメントのヌクレオシド塩基間の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つヌクレオシド間結合が、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である、請求項２５もしくは２７～３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～３０のいずれか１項に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド。
  32. 前記核酸塩基配列の少なくとも２つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１、３～２５もしくは２７～３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  33. 前記核酸塩基配列の修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
  34. 前記核酸塩基配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３２もしくは３３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項３２もしくは３３に記載のオリゴヌクレオチド。
  35. 前記５’ウィングセグメントの少なくとも２つの連結したヌクレオシドが、修飾ヌクレオシド間結合を介して連結されている、請求項２５、２７～２８、もしくは３２～３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２８もしくは３２～３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  36. 前記３’ウィングセグメントの前記少なくとも２つの連結したヌクレオシドが、修飾ヌクレオシド間結合を介して連結されている、請求項２５、２７～２８、もしくは３２～３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２８もしくは３２～３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  37. 前記５’ウィングセグメントの前記少なくとも２つの連結したヌクレオシドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結され、前記３’ウィングセグメントの前記少なくとも２つの連結したヌクレオシドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結され、前記ギャップセグメントのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも１つが、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項２５、２７～２８、もしくは３２～３６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２８もしくは３２～３６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  38. 前記核酸塩基配列の少なくとも２つ、３つ、または４つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項２５、２７～２８、もしくは３２～３７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２８もしくは３２～３７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  39. 前記ギャップセグメントのヌクレオシド塩基間の少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項２５、２７～２８、もしくは３２～３８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２８もしくは３２～３８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  40. 前記ホスホロチオエートヌクレオシド間結合がＲｐ配置、ＳＰ配置、またはＲｐとＳｐ配置の任意の組み合わせである、請求項２５、２７～２８、もしくは３２～３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２６～２８もしくは３２～３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  41. 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、請求項１、３～２５もしくは２７～４０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～４０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  42. 前記少なくとも１つの修飾核酸塩基が、５’－メチルシトシン、シュードウリジン、または５－メトキシウリジンである、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド。
  43. 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項１、３～２５もしくは２７～４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  44. 前記少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
  45. 前記二環式糖が、４’－ＣＨ（Ｒ）－Ｏ－２’ブリッジを含み、式中、Ｒが独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド。
  46. Ｒがメチルである、請求項４５に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項４５に記載のオリゴヌクレオチド。
  47. ＲがＨである、請求項４５に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項４５に記載のオリゴヌクレオチド。
  48. 前記修飾糖部分が、２’－ＯＭｅ修飾糖部分、二環式糖部分、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド、２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束エチル２’－４’－架橋核酸（ｃＥｔ）、Ｓ－ｃＥｔ、ｔｃＤＮＡ、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、及び三環類似体（例えば、ｔｃＤＮＡ）のうちの１つである、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
  49. 前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結している１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドを含む、請求項１、３～２５、もしくは２７～４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～４８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  50. 前記オリゴヌクレオチドが、５’末端にホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結された３つの連続するヌクレオシド塩基を含み、３’末端にホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結された３つの連続するヌクレオシド塩基を含む、請求項１、３～２５、もしくは２７～４９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～４９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  51. 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結された５つの連続するヌクレオシド塩基を含む、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
  52. 前記５つの連続するヌクレオシド塩基のそれぞれが２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドである、請求項５０もしくは５１に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項５０もしくは５１に記載のオリゴヌクレオチド。
  53. 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド塩基のそれぞれが２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドである、請求項４３～５２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項４３～５２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  54. 前記ギャップセグメントが１つ以上の２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドを含む、請求項４３～５２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項４３～５２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  55. 前記ギャップセグメントが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、前記５’ウィングセグメントが、ホスホジエステルヌクレオシド結合を介して連結される２つの連続するヌクレオシド塩基を含み、前記３’ウィングセグメントが、ホスホジエステルヌクレオシド結合を介して連結される２つの連続するヌクレオシド塩基を含む、請求項４３～５４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項４３～５４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  56. 前記ギャップセグメントの５つの連続するヌクレオシド塩基が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を介して連結され、前記５’ウィングセグメントが、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、前記３’ウィングセグメントが、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項４３～５４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項４３～５４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  57. １つ以上のキラル中心及び／または二重結合を含む、請求項１、３～２５、もしくは２７～５６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～５７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  58. 前記オリゴヌクレオチドが、幾何異性体、エナンチオマー、及びジアステレオマーから選択される立体異性体として存在する、請求項５７に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項５７に記載のオリゴヌクレオチド。
  59. 前記オリゴヌクレオチドが、ｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅｅ、ｄ２０、ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅ、ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅ、及びｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅのパターンのうちのいずれかの糖修飾を含み、式中、ｅ＝２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド；ｄ＝２’－デオキシヌクレオシド；ｋ＝ロックド核酸（ＬＮＡ）、拘束メトキシエチル（ｃＭＯＥ）ヌクレオシド、拘束エチル（ｃＥＴ）ヌクレオシド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１、３～２５、もしくは２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～２７のいずれかのオリゴヌクレオチド。
  60. 前記オリゴヌクレオチドが、ｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、ｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、ｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ、及びｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓのうちのいずれかのヌクレオシド間結合を含み、式中、ｓ＝ホスホロチオエート結合、及びｏ＝ホスホジエステル結合である、請求項１、３～２５、２７、もしくは５９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４、２６、２７、もしくは５９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  61. 前記オリゴヌクレオチドが、それぞれ以下のパターンのうちのいずれかの糖修飾とヌクレオシド間結合の組み合わせを含む、請求項１、３～２５、２７、５９、もしくは６０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４、２６、２７、５９、もしくは６０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド：
    ａ）ｄ２０とｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、
    ｂ）ｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、
    ｃ）ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、
    ｄ）ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅとｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ、及び
    ｅ）ｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅとｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ。
  62. 前記オリゴヌクレオチドが修飾シトシンを含む、請求項１、３～２５、２７、もしくは５９～６１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４、２６、２７、もしくは５９～６１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  63. 前記修飾シトシンが５－メチル－ｄＣである、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項６２に記載のオリゴヌクレオチド。
  64. 前記オリゴヌクレオチドが、ｅｅｅｅｅ－ｄ１０－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓの糖修飾及びヌクレオシド間結合の組み合わせを含み、前記シトシンが、５－メチル－ｄＣとして修飾されている、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物または請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  65. 前記オリゴヌクレオチドが、それぞれ以下のパターンのうちのいずれかにおける糖修飾とヌクレオシド間結合の組み合わせを含み、前記オリゴヌクレオチド中のシトシンが未修飾のシトシンである、請求項６０もしくは６１に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項６０もしくは６１に記載のオリゴヌクレオチド：
    ａ）ｄ２０とｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、
    ｂ）ｅｅｅｅｅ－ｄ１２－ｅｅｅｅｅとｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓｓ、
    ｃ）ｅｅｅｅｅ－ｄ８－ｅｅｅｅｅとｓｏｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ、及び
    ｄ）ｅｅｋｋ－ｄ８－ｋｋｅｅｅ及びｓｏｏｓｓｓｓｓｓｓｓｓｏｏｓｓ。
  66. 標的核酸配列の標的領域の核酸塩基配列と相補的であり、前記標的核酸の前記標的領域の核酸塩基配列が、少なくとも１つの非標的核酸配列の核酸塩基配列と１～３個の異なる核酸塩基によって異なり、前記非標的核酸が配列番号３５２６の配列を含む、請求項１、３～２５、もしくは２７～５６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４、もしくは２６～６５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドによる、化合物またはオリゴヌクレオチド。
  67. 前記１～３個の異なる核酸塩基が一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項６６に記載の化合物またはオリゴヌクレオチド。
  68. 前記標的領域に存在するＳＮＰが、配列番号３５２６の等しい長さの部分と比較されるＳＮＰである、請求項６７に記載の化合物またはオリゴヌクレオチド。
  69. 前記一塩基多型が、ｒｓ３９７５１５４０３、ｒｓ３９７５１５４０２、ｒｓ５８７７７７２６４、ｒｓ３９７５１５４０４、ｒｓ８６６２４２６３１、ｒｓ８８６０４３４５５、ｒｓ３９７５１５４０７、及びｒｓ３９７５１５４０６からなる群から選択される、請求項６６に記載の化合物またはオリゴヌクレオチド。
  70. 前記一塩基多型が、、配列番号３５２６に示される配列の１１１２位のＣからＧ、配列番号３５２６に示される配列の２８４５位のＣからＴ、及び配列番号３５２６に示される配列の８８５位のＧからＴからなる群から選択される、請求項６６に記載の化合物またはオリゴヌクレオチド。
  71. 先行請求項のいずれか１項に記載の化合物またはオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  72. 前記医薬組成物が、局所、髄腔内、嚢内、非経口、経口、肺、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、頬側、舌下、膣、または十二指腸内投与に適している、請求項７１に記載の医薬組成物。
  73. 先行請求項のいずれか１項に記載の化合物またはオリゴヌクレオチドと、脂質ナノ粒子、ポリプレックスナノ粒子、リポプレックスナノ粒子、またはリポソームと、を含む組成物。
  74. ＫＣＮＴ１関連障害を有する対象の細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を低下させる方法であって、請求項１、３～２５、もしくは２７～７０のいずれか１項に記載の化合物、請求項２～２４、もしくは２６～７０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項７１もしくは７２に記載の医薬組成物を、細胞におけるＫＣＮＴ１のレベル及び／または活性を下げるのに十分な量及び期間で細胞と接触させることを含む、前記方法。
  75. 前記細胞が中枢神経系の細胞である、請求項７４に記載の方法。
  76. 神経疾患を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記患者へ転写産物の阻害剤を投与することを含み、前記転写産物は、配列番号３５２６と少なくとも９０％の同一性を共有する、前記方法。
  77. 前記阻害剤が、請求項１、３～２５、もしくは２７～７０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、または請求項２～２４もしくは２６～７０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項７１もしくは７２に記載の医薬組成物を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させることを、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１、３～２５、もしくは７０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む化合物、請求項２～２４もしくは２６～７０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項７１もしくは７２に記載の医薬組成物を、ＫＣＮＴ１関連障害を治療、予防、またはその進行を遅延させるのに十分な量及び期間で前記対象に投与することを含む、前記方法。
  79. 前記ＫＣＮＴ１関連障害が、移動性焦点発作を伴う乳児期てんかん、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、ウエスト症候群、点頭てんかん、てんかん性脳症、部分発作、大田原症候群、発達性てんかん性脳症、及びレノックス・ガストー症候群からなる群から選択される、請求項７４～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記対象が、ＫＣＮＴ１に機能獲得型変異を有する、請求項７４～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記機能獲得型変異が、Ｖ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ｉ、Ｇ２８８Ｓ、Ｆ３４６Ｌ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ４７４Ｈ、Ｆ５０２Ｖ、Ｍ５１６Ｖ、Ｋ６２９Ｎ、Ｉ７６０Ｍ、Ｙ７９６Ｈ、Ｅ８９３Ｋ、Ｍ８９６Ｉ、Ｍ８９６Ｋ、Ｐ９２４Ｌ、Ｒ９２８Ｃ、Ｆ９３２Ｉ、Ａ９３４Ｔ、Ａ９６６Ｔ、Ｈ２５７Ｄ、Ｒ２６２Ｑ、Ｑ２７０Ｅ、Ｖ３４０Ｍ、Ｃ３７７Ｓ、Ｐ４０９Ｓ、Ｌ４３７Ｆ、Ｒ４７４Ｃ、Ａ４７７Ｔ、Ｒ５６５Ｈ、Ｋ６２９Ｅ、Ｇ６５２Ｖ、Ｉ７６０Ｆ、Ｑ９０６Ｈ、Ｒ９３３Ｇ、Ａ９３４Ｔ、Ｒ９５０Ｑ、Ｒ９６１Ｈ、Ｒ１１０６Ｑ、Ｋ１１５４Ｑ、Ｒ４７４Ｑ、Ｙ１９０３Ｃ、Ｈ４６９Ｌ、Ｍ８９６Ｒ、Ｋ９４６Ｅ、及びＲ９５０Ｌからなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記機能獲得型変異が、Ｇ２８８Ｓ、Ｒ３９８Ｑ、Ｒ４２８Ｑ、Ｒ９２８Ｃ、またはＡ９３４Ｔである、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 前記方法が、前記ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状を軽減する、請求項７４～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記ＫＣＮＴ１関連障害の１つ以上の症状が、長期の発作、頻繁な発作、行動及び発達の遅延、運動及びバランスの問題、整形外科的状態、言語遅延及び発声の問題、成長及び栄養の問題、睡眠困難、慢性感染症、感覚統合障害、自律神経系の乱れ、ならびに発汗からなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物が、局所的、非経口的、髄腔内、嚢内、経口、直腸、頬側、舌下、膣内、肺内、気管内、鼻腔内、経皮、または十二指腸内に投与される、請求項７４～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記患者がヒトである、請求項７４～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. １８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１転写産物の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
  88. １８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１及びＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＫＣＮＴ１転写産物の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
  89. １８～２２個の連結したヌクレオシドの長さであって、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓのＫＣＮＴ１、及び／またはＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＫＣＮＴ１転写産物の等しい長さの部分に対して少なくとも８５％の配列相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
  90. 前記オリゴヌクレオチドが、４０％～７０％のＧＣ含量を含む、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の化合物。
  91. 前記オリゴヌクレオチドが、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＫＣＮＴ１転写産物に対して２つ以下のミスマッチを含む、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の化合物。
  92. 前記オリゴヌクレオチドが、任意の非ＫＣＮＴ１転写産物に対して少なくとも３つのミスマッチを含む、請求項８７～９１のいずれか１項に記載の化合物。
  93. 前記オリゴヌクレオチドがＧＧＧＧの４塩基組を欠いている、請求項８７～９２のいずれか１項に記載の化合物。
  94. 前記オリゴヌクレオチドが配列番号３５１２～３５２５のいずれでもない、請求項７４～８６のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記オリゴヌクレオチドが配列番号３５１２～３５２５のいずれでもない、請求項７１または７２に記載の医薬組成物。
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