KR20230033651A - Serpina1의 adar-매개 편집을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Serpina1의 adar-매개 편집을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20230033651A
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스티븐 로비네트
앤드류 프랄리
말리카주나 레디 푸타
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코로 바이오, 인크.
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Abstract

본 발명은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

SERPINA1의 ADAR-매개 편집을 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/705,838 및 2020년 5월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/704,793의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 어떤 목적으로든 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
SERPINA1 유전자는 세린 프로테아제 억제제 알파-1 항트립신 (A1AT)을 인코딩한다. A1AT는 호중구 엘라스타제를 포함한 특정 염증 효소로부터 조직을 보호한다. A1AT 결핍 (알파 1 항트립신 결핍, A1AD)은 폐에서 호중구 엘라스타제에 의한 엘라스틴의 과도한 분해를 초래할 수 있다. 이것은 폐의 탄성 감소 및 폐기종 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함한 후속 호흡기 합병증으로 이어질 수 있다. 돌연변이 A1AT는 또한 간에 축적되어 간경변과 간부전을 유발할 수 있다.
A1AD는 SNP rs28929474(A)와 관련된 E342K 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 간부전 및/또는 폐기종을 유발할 수 있는 알파 1 항트립신 결핍 (A1AD)을 치료하기 위해 SERPINA1 유전자를 선택적이고 효율적으로 편집하고 유전자의 임의의 병원성 돌연변이를 교정하는 방법에 대한 지속적인 필요성이 존재한다.
본 발명은 표적 유전자에서 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드를 사용하여 대상체에서 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하기 위한 방법 및 조성물, 및 SERPINA1 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자에서 병원성 돌연변이를 교정하는 탈아민화는 E342K 돌연변이를 야생형으로 다시 역전시키고, SERPINA1-관련 질환 및 환자가 경험하는 임의의 관련 증상을 역전시키거나 서행시킨다.
실시양태 1. 간부전 또는 폐기종을 초래할 수 있는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법으로서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜, SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 세포에서 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 것인, 방법.
실시양태 3. 실시양태 2에 있어서, 세포가 ADAR을 내인성으로 발현하는, 방법.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, ADAR이 인간 ADAR인, 방법.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, ADAR이 인간 ADAR1인, 방법.
실시양태 6. 실시양태 4에 있어서, ADAR이 인간 ADAR2인, 방법.
실시양태 7. 실시양태 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 세포가 진핵 세포, 포유동물 세포, 및 인간 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
실시양태 8. 실시양태 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 세포가 생체내에 있는 것인, 방법.
실시양태 9. 실시양태 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 세포가 생체외에 있는 것인, 방법.
실시양태 10. 이를 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
a) SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
b) 대상체의 세포에서 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 11. 이를 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
a) SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
b) 세포 내에서 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및
c) 대상체에게 세포를 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가, 동종, 또는 이종인, 방법.
실시양태 13. 실시양태 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간 대상체인, 방법.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 모집 도메인을 하나 이상 추가로 포함하는 것인, 방법.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 SNP로부터 생성된 위치 342에 리신을 포함하는 병원성 아미노산을 포함하는 SERPINA1 단백질을 인코딩하는, 방법.
실시양태 17. 실시양태 16에 있어서, 아데노신에서 이노신으로의 변경이 병원성 아미노산을 야생형 아미노산으로 치환하는 것인, 방법.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 위치 342에서 야생형 아미노산이 글루탐산을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 하기 구조를 포함하고:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 대체 뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 하기 구조를 포함하고:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖고:
Figure pct00001
여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
R1은 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R2는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R3은 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R4는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R5는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시인, 방법.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, R4가 수소이고 R5가 수소 또는 하이드록시가 아니거나, R5가 수소이고 R4가 수소가 아니거나, 또는 R5가 하이드록시이고 R4가 수소가 아닌, 방법.
실시양태 22. 실시양태 20 또는 실시양태 21에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 23. 실시양태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, R1이 하이드록시, 할로겐, 또는 OCH3인, 방법.
실시양태 24. 실시양태 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, R2가 수소인, 방법.
실시양태 25. 실시양태 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 V의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 IV 또는 화학식 III의 구조를 갖지 않는, 방법.
실시양태 26. 실시양태 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 III, 화학식 IV, 또는 화학식 V의 구조를 갖지 않는, 방법.
실시양태 27. 실시양태 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 방법.
실시양태 28. 실시양태 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 30. 실시양태 28 또는 29에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 31. 실시양태 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 32. 실시양태 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 33. 실시양태 32에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1이 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 34. 실시양태 32 또는 33에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 35. 실시양태 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 36. 실시양태 20 내지 27중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 37. 실시양태 36에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기이고; X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 38. 실시양태 36 또는 37에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 39. 실시양태 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 40. 실시양태 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, X2가 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 42. 실시양태 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, X1 및 X2 중 적어도 하나는 화학식 V의 구조를 갖는, 방법.
실시양태 43. 실시양태 42에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 방법.
실시양태 44. 실시양태 42에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 방법.
실시양태 45. 실시양태 42에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 방법.
실시양태 46. 실시양태 42에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 방법.
실시양태 47. 실시양태 42에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 메톡시인, 방법.
실시양태 48. 실시양태 20 내지 47 중 어느 하나에 있어서, X1이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, X1이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, X1이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 51. 실시양태 20 내지 40 및 42 내지 50 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1이 사이토신 핵염기인, 방법.
실시양태 53. 실시양태 20 내지 44 및 47 내지 52 중 어느 하나에 있어서, X1이 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 54. 실시양태 53에 있어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 55. 20 내지 44 및 47 내지 52 중 어느 하나에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 56. 실시양태 20 내지 44 및 47 내지 52 중 어느 하나에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 57. 실시양태 20 내지 56 중 어느 하나에 있어서, X3이 구아닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 58. 실시양태 20 내지 56 중 어느 하나에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 59. 실시양태 20 내지 56 중 어느 하나에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 60. 실시양태 20 내지 42, 46, 47, 및 48 내지 59 중 어느 하나에 있어서, X2가 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 62. 실시양태 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 방법.
실시양태 63. 실시양태 20 내지 62 중 어느 하나에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
실시양태 65. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하고:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 갖고:
Figure pct00002
여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
R12는 수소, 하이드록시, 플루오로, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 헤테로알킬, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R13은 수소 또는 C1-C6 알킬이고,
여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI 내지 IX 중 어느 하나의 구조를 갖는, 방법.
실시양태 66. 실시양태 65에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 67. 실시양태 65 또는 66에 있어서, R12가 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 헤테로알킬인, 방법.
실시양태 68. 실시양태 65 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 방법.
실시양태 69. 실시양태 65 내지 68 중 어느 하나에 있어서, R12가 수소 또는 C1-C6 알킬인, 방법.
실시양태 70. 실시양태 65 내지 69 중 어느 하나에 있어서, R12가 수소인, 방법.
실시양태 71. 실시양태 65 내지 70 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 72. 실시양태 71에 있어서, X1은 화학식 VI의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 73. 실시양태 71 또는 72에 있어서, X2는 화학식 VI의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 74. 실시양태 65 내지 70 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 75. 실시양태 74에 있어서, X1은 화학식 VII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 76. 실시양태 74 또는 75 중 어느 하나에 있어서, X2는 화학식 VII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 77. 실시양태 65 내지 70 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 IX의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 78. 실시양태 77에 있어서, X1은 화학식 IX의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 79. 실시양태 77 또는 78에 있어서, X2는 화학식 IX의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 80. 실시양태 65 내지 70 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VIII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 81. 실시양태 80에 있어서, X1은 화학식 VIII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 82. 실시양태 80 또는 81에 있어서, X2는 화학식 VIII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
실시양태 83. 실시양태 65 내지 72 및 74 내지 82 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 VI의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
실시양태 84. 실시양태 65 내지 83 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 VI의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
실시양태 85. 실시양태 65 내지 75 및 77 내지 84 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 VII의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
실시양태 86. 실시양태 65 내지 85 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 VII의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
실시양태 87. 실시양태 65 내지 78 및 80 내지 86 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 IX의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
실시양태 88. 실시양태 65 내지 70 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 VI 또는 화학식 VII의 구조를 갖는 것인, 방법.
실시양태 89. 실시양태 65 내지 88 중 어느 하나에 있어서, X1이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 90. 실시양태 89에 있어서, X1이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 91. 실시양태 90에 있어서, X1이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 92. 실시양태 65 내지 91 중 어느 하나에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 93. 실시양태 65 내지 91 중 어느 하나에 있어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 94. 실시양태 65 내지 91 중 어느 하나에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 95. 실시양태 65 내지 94 중 어느 하나에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 96. 실시양태 65 내지 94중 어느 하나에 있어서, X3이 구아닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 97. 실시양태 65 내지 94 중 어느 하나에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 98. 실시양태 65 내지 97 중 어느 하나에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 99. 실시양태 65 내지 97 중 어느 하나에 있어서, X2가 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 100. 실시양태 65 내지 97 중 어느 하나에 있어서, X2가 핵염기를 포함하지 않는 것인, 방법.
실시양태 101. 실시양태 65 내지 100 중 어느 하나에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
실시양태 102. 실시양태 65 내지 101 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
실시양태 103. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하고:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 갖고:
Figure pct00003
여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
R6은 수소, 하이드록시, 또는 할로겐이고;
R7은 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R8은 수소 또는 할로겐이고;
R9는 수소 또는 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R10은 수소 또는 할로겐이고;
R11이 수소 또는 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시인, 방법.
실시양태 104. 실시양태 103에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 105. 실시양태 103 또는 104에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 방법.
실시양태 106. 실시양태 103 내지 105 중 어느 하나에 있어서, C1-C6 알콕시가 OCH3인, 방법.
실시양태 107. 실시양태 103 내지 106중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소인, 방법.
실시양태 108. 실시양태 107에 있어서, X1이 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소인, 방법.
실시양태 109. 실시양태 107 또는 108에 있어서, X2가 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소인, 방법.
실시양태 110. 실시양태 103 내지 106 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 방법.
실시양태 111. 실시양태 103 내지 110 중 어느 하나에 있어서, X1이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3 가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 112. 실시양태 111에 있어서, X1이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3 가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3은 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 113. 실시양태 112에 있어서, X1이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 114. 실시양태 103 내지 113 중 어느 하나에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 115. 실시양태 103 내지 113 중 어느 하나에 있어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 116. 실시양태 103 내지 113 중 어느 하나에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 117. 실시양태 103 내지 116 중 어느 하나에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 118. 실시양태 103 내지 116 중 어느 하나에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 119. 실시양태 103내지 118 중 어느 하나에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 120. 실시양태 103내지 118 중 어느 하나에 있어서, X2가 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 121. 실시양태 103내지 118 중 어느 하나에 있어서, X2가 핵염기를 포함하지 않는 것인, 방법.
실시양태 122. 실시양태 103 내지 121 중 어느 하나에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
실시양태 123. 실시양태 103 내지 122 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
실시양태 124. 실시양태 19 내지 123 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 125. 실시양태 19 내지 124 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 구속된 에틸 (cEt)-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 126. 실시양태 125에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 127. 실시양태 20 내지 126 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 128. 실시양태 20 내지 127 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 129. 실시양태 20 내지 128 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 130. 실시양태 128 또는 129에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 방법.
실시양태 131. 실시양태 20 내지 130 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 132. 실시양태 20 내지 131 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 133. 실시양태 132에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 134. 실시양태 20 내지 132 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 135. 실시양태 20 내지 134 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 136. 실시양태 20 내지 135 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
실시양태 137. 실시양태 135 또는 실시양태 136에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 방법.
실시양태 138. 실시양태 20 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 139. 실시양태 20 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 추가로 5'-캡 구조를 포함하는, 방법.
실시양태 140. 실시양태 20 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
실시양태 141. 실시양태 20 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 5'-말단 뉴클레오티드가 2'-아미노-뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 142. 실시양태 20 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 조합된 A 및 B가 18 내지 80개의 뉴클레오티드로 구성된 것인, 방법.
실시양태 143. 실시양태 20 내지 142 중 어느 하나에 있어서, m이 5 내지 40인, 방법.
실시양태 144. 실시양태 20 내지 143 중 어느 하나에 있어서, n이 5 내지 40인, 방법.
실시양태 145. 실시양태 20에 있어서, m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로, 하이드록시, 또는 메톡시이고 N1은 핵염기, 또는 화학식 V의 구조이고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소이고; 화학식 I 또는 화학식 V의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]은 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 146. 실시양태 65에 있어서, m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 또는 화학식 IX의 구조를 갖고, 여기서 N1은 핵염기이고, 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 또는 화학식 IX의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]는 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 147. 실시양태 103에 있어서, m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3은 적어도 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소이고, 화학식 XII의 구조를 갖지 않는 X1, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]은 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
실시양태 148. 실시양태 19 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 SERPINA1 mRNA에 혼성화될 때, X2는 SNP rs28929474에서 A와 정렬된 것인, 방법.
실시양태 149. 실시양태 1 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드는 SNP rs28929474에서 A의 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 것인, 방법.
실시양태 150. 실시양태 10 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 치료가 간 손상, 간부전, 간경변, 황달, 폐에서 엘라스틴의 과도한 분해, 폐기종 및 COPD로부터 선택되는 A1AD의 적어도 하나의 증상을 예방, 역전, 또는 서행시키는 것을 포함하는, 방법.
실시양태 151. 실시양태 1 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 표 5 내지 19로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 것인, 방법.
실시양태 152. RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경 또는 표적 RNA에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하고:
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드이고 X4는 2'-플루오로뉴클레오티드이고, 여기서 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 혼성화될 때, X2는 이노신으로 탈아민화될 아데노신의 반대편에 있는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 153. 다음 구조를 포함하는 올리고뉴클레오티드로서:
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, X4는 2'-O-메틸뉴클레오티드 및 2'-플루오로뉴클레오티드로부터 선택되고;
여기서X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖고:
Figure pct00004
여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
R1은 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R2는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R3은 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R4는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
R5는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 154. 실시양태 153에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경 또는 표적 RNA에 영향을 미칠 수 있는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 155. 실시양태 153 또는 154에 있어서, X2가 이노신으로 탈아민화될 아데노신의 반대편에 있는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 156. 실시양태 153 내지 155 중 어느 하나에 있어서, R4는 수소이고 R5는 수소 또는 하이드록시가 아니거나, R5는 수소이고 R4는 수소가 아니거나, 또는 R5는 하이드록시이고 R4는 수소가 아닌, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 157. 실시양태 153 내지 156 중 어느 하나에 있어서, R1이 하이드록시, 할로겐, 또는 OCH3인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 158. 실시양태 153 내지 157 중 어느 하나에 있어서, R2가 수소인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 159. 실시양태 153 내지 158중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 V의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 IV 또는 화학식 III의 구조를 갖지 않는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 160. 실시양태 153 내지 159 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 III, 화학식 IV, 또는 화학식 V의 구조를 갖지 않는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 161. 실시양태 153 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 162. 실시양태 153 내지 161 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 163. 실시양태 162에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 164. 실시양태 162 또는 163에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 165. 실시양태 162 내지 164 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 166. 실시양태 153 내지 161 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 167. 실시양태 166에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 168. 실시양태 166 또는 167에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 169. 실시양태 166 내지 168 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 170. 실시양태 153 내지 161 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 171. 실시양태 170에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기이고; X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 172. 실시양태 170 또는 171에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 173. 실시양태 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 174. 실시양태 153 내지 161 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 175. 실시양태 174에 있어서, X2가 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 176. 실시양태 153 내지 159 중 어느 하나에 있어서, X1 및 X2 중 적어도 하나는 화학식 V의 구조를 갖는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 177. 실시양태 176에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 178. 실시양태 176에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 179. 실시양태 176에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 180. 실시양태 176에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 181. 실시양태 176에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 메톡시인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 182. 실시양태 153 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 또는 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 183. 실시양태 153 내지 173 및 176 내지 182 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 184. 실시양태 183에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 사이토신 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 185. 실시양태 153 내지 178 및 181 내지 184 중 어느 하나에 있어서, X1이 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 186. 실시양태 185에 있어서, X1이 우라실 핵염기을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 187. 153 내지 178 및 181 내지 184 중 어느 하나에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 188. 실시양태 153 내지 178 및 181 내지 184 중 어느 하나에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 189. 실시양태 153 내지 188 중 어느 하나에 있어서, X3이 구아닌 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 190. 실시양태 153 내지 188 중 어느 하나에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 191. 실시양태 153 내지 188 중 어느 하나에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 192. 실시양태 153 내지 176, 179, 180, 및 182 내지 191 중 어느 하나에 있어서, X2가 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 193. 실시양태 192에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 194. 실시양태 153 내지 158 중 어느 하나에 있어서, X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 195. 실시양태 153 내지 194 중 어느 하나에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 196. 실시양태 196에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 197. 실시양태 152 내지 196 중 어느 하나에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 198. 실시양태 152 내지 197 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 199. 실시양태 152 내지 198 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 구속된 에틸 (cEt)-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 200. 실시양태 199에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 201. 실시양태 152 내지 200 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 202. 실시양태 152 내지 201 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 203. 실시양태 152 내지 202 중 어느 하나에 있어서, [Am]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 204. 실시양태 202 또는 실시양태 203에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 205. 실시양태 152 내지 204 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 206. 실시양태 152 내지 205 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 207. 실시양태 206에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 208. 실시양태 152 내지 207 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 209. 실시양태 152 내지 208 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 210. 실시양태 152 내지 209 중 어느 하나에 있어서, [Bn]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 211. 실시양태 209 또는 실시양태 210에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 212. 실시양태 152 내지 208 중 어느 하나에 있어서, 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 213. 실시양태 152 내지 212 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5'-캡 구조를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 214. 실시양태 152 내지 213 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 215. 실시양태 152 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 5'-말단 뉴클레오티드가 2'-아미노-뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 216. 실시양태 152 내지 215 중 어느 하나에 있어서, 결합된 A 및 B가 18 내지 80의 뉴클레오티드로 구성된 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 217. 실시양태 152 내지 216 중 어느 하나에 있어서, m이 5 내지 40인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 218. 실시양태 152 내지 217 중 어느 하나에 있어서, n이 5 내지 40인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 219. 실시양태 152 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-모집 도메인을 하나 이상 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 220. 실시양태 152 내지 219 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경 에 영향을 미칠 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 221. 실시양태 220에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드
실시양태 222. 실시양태 221에 있어서, SNP가 rs28929474(A)인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 223. 실시양태 222에 있어서, SERPINA1 mRNA가 SNP로부터 생성된 위치 342에 리신을 포함하는 병원성 아미노산을 포함하는 SERPINA1 단백질을 인코딩하는, 올리고뉴클레오티드
실시양태 224. 실시양태 222 또는 실시양태 223에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 SERPINA1 mRNA에 혼성화될 때, X2는 SNP rs28929474에서 A와 정렬된 것인, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 225. 실시양태 220 내지 224중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 SNP rs28929474에서 A의 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
실시양태 226. 표적화 모이어티에 접합된 실시양태 152 내지 225 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체.
실시양태 227. 실시양태 226에 있어서, 표적화 모이어티가 지질, 스테롤, 탄수화물 및/또는 펩티드인, 접합체.
실시양태 228. 실시양태 152 내지 225 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 227의 접합체; 및
mRNA를 포함하는 복합체로서,
여기서 올리고뉴클레오티드 또는 접합체 및 mRNA는 서로 혼성화되고 복합체는 mRNA의 아데노신에서 제1 미스매치를 포함하는, 복합체.
실시양태 229. 실시양태 228에 있어서, 복합체가 제1 미스매치에 4개의 뉴클레오티드 5'인 제2 미스매치를 포함하는, 복합체.
실시양태 230. 실시양태 228 또는 229에 있어서, 복합체가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 미스매치를 포함하는, 복합체.
실시양태 231. 실시양태 228 내지 230 중 어느 하나에 있어서, mRNA가 치료 결과를 생성하기 위해 탈아민화될 수 있는 아데노신을 포함하는 것인, 복합체.
실시양태 232. 실시양태 228 내지 230 중 어느 하나에 있어서, mRNA가 상응하는 천연 mRNA와 비교하여 구아노신에서 아데노신으로의 돌연변이를 포함하는 것인, 복합체.
실시양태 233. 실시양태 232에 있어서, 구아노신에서 아데노신으로의 돌연변이가 미스센스 또는 넌센스 돌연변이인, 복합체.
실시양태 234. 실시양태 228 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 제1 미스매치가 mRNA의 시작 코돈 내의 아데노신에 있는 것인, 복합체
실시양태 235. 실시양태 228 내지 233 중 어느 하나에 있어서, 제1 미스매치가 mRNA의 정지 코돈 내의 아데노신에 있는 것인, 복합체
실시양태 236. 실시양태 235에 있어서, 정지 코돈이 조기 정지 코돈인, 복합체.
실시양태 237. 실시양태 228 내지 236 중 어느 하나의 복합체를 생성하는 방법으로서, 세포를 실시양태 152 내지 225중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 227의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 238. mRNA 내 아데노신의 탈아민화 방법으로서, 세포를 실시양태 152 내지 225중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 227의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 239. 이를 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법으로서, 실시양태 152 내지 226 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 227의 접합체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 240. 간부전 또는 폐기종을 초래하는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법으로서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 실시양태 220 내지 225중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 실시양태 227의 접합체와 접촉시켜 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 241. 실시양태 240에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 세포에서 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉되는 것인, 방법.
실시양태 242. 실시양태 241에 있어서, 세포가 ADAR을 내인성으로 발현하는, 방법.
실시양태 243. 실시양태 242에 있어서, ADAR이 인간 ADAR인, 방법.
실시양태 244. 실시양태 243에 있어서, ADAR이 인간 ADAR1인, 방법.
실시양태 245. 실시양태 243에 있어서, ADAR이 인간 ADAR2인, 방법.
실시양태 246. 실시양태 241 내지 245 중 어느 하나에 있어서, 세포가 진핵 세포, 포유동물 세포, 및 인간 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
실시양태 247. 실시양태 241 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 세포가 생체내에 있는 것인, 방법.
실시양태 248. 실시양태 241 내지 246중 어느 하나에 있어서, 세포가 생체외에 있는 것인, 방법.
실시양태 249. 이를 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
대상체의 세포 내 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 실시양태 220 내지 225 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 실시양태 227의 접합체와 접촉시켜 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 250. 이를 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
세포의 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 실시양태 220 내지 225 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 실시양태 226 또는 실시양태 227의 접합체와 접촉시키는 단계, 및
대상체에게 세포를 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
실시양태 251. 실시양태 250에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가, 동종, 또는 이종인, 방법.
실시양태 252. 실시양태 249 내지 251 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간 대상체인, 방법.
실시양태 253. 실시양태 240 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 방법.
실시양태 254. 실시양태 240 내지 253 중 어느 하나에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-모집 도메인을 하나 이상 추가로 포함하는, 방법.
실시양태 255. 실시양태 240 내지 254 중 어느 하나에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 SNP로부터 생성된 위치 342에 리신을 포함하는 병원성 아미노산을 포함하는 SERPINA1 단백질을 인코딩하는, 방법.
실시양태 256. 실시양태 255에 있어서, 아데노신에서 이노신으로의 변경이 병원성 아미노산을 야생형 아미노산으로 치환하는 것인, 방법.
실시양태 257. 실시양태 256에 있어서, 위치 342의 야생형 아미노산이 글루탐산을 포함하는, 방법.
도 1은 +2 및 -2 위치에서 다양한 뉴클레오티드 변형을 포함하는 가이드 올리고뉴클레오티드의 두 상이한 농도에서의 표적 mRNA 편집의 민감도를 보여준다. 각 막대 세트에 대해 상단 막대는 100 nM 가이드 올리고뉴클레오티드이고 하단 막대는 10 nM 가이드 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법, 및 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 표적 유전자의 이노신으로의 변경, 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드를 사용하여 대상체에서 SERPINA1-관련 질환 및 이의 증상, 예를 들어, 알파 1 항트립신 결핍을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자에서 병원성 돌연변이를 교정하는 탈아민화는 E342K 돌연변이를 역전시키고, 글루탐산을 회복시키고 알파 1 항트립신 결핍에 의해 유발된 간 및/또는 폐 증상을 역전시키고/시키거나 늦추게 한다.
하기 상세한 설명은 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드를 사용하여 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법, ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라 SERPINA1 유전자의 서열을 편집함으로써 이익을 얻을 SERPINA1 관련 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물, 용도 및 방법을 개시한다.
I. 정의.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 언급될 때마다 인용된 값의 중간 값 및 범위도 본 발명의 일부가 되도록 의도된다는 점에 유의해야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 여기에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들어 복수의 요소를 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 본원에서 "포함하지만 이에 제한되지 않는"이라는 어구를 의미하고 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 본원에서 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 "및/또는"이라는 용어를 의미하고 상호교환적으로 사용된다.
용어 "약"은 본원에서 당업계의 전형적인 허용 범위 내, 예를 들어 용량 사이의 시간의 허용 가능한 변화, 용량 단위 양의 허용 가능한 변화를 의미하는 데 사용된다. 예를 들어, "약"은 평균으로부터 약 2 표준 편차 이내로 이해될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약은 +10%를 의미한다. 특정 실시양태에서, 약은 +5%를 의미한다. 일련의 숫자 또는 범위 앞에 약(about)이 있는 경우 "약"은 일련 또는 범위의 각 숫자를 교정할 수 있음을 이해한다.
숫자 또는 일련의 숫자 앞의 "적어도"라는 용어는 "적어도"라는 용어에 인접한 숫자 및 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해되며, 이는 문맥에서 명백하다. 예를 들어, 핵산 분자의 뉴클레오티드 수는 정수여야 한다. 예를 들어, "21-뉴클레오티드 핵산 분자의 적어도 18개 뉴클레오티드"는 18, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드가 표시된 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 있는 경우 "적어도"는 일련의 숫자 또는 범위의 각 숫자를 교정할 수 있음을 이해한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이하" 또는 "~보다 적은"는 어구에 인접한 값 및 논리적으로 낮은 값 또는 정수에서, 문맥상 논리적으로, 0까지로 이해된다. 예를 들어, "5개 이하의 비변형 뉴클레오티드"를 갖는 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 비변형 뉴클레오티드를 갖는다. 일련의 숫자나 범위 앞에 "이하"가 있는 경우 "이하"가 일련의 숫자 또는 범위의 각 숫자를 변형할 수 있음을 이해한다.
본원에서 사용되는 "SERPINA1" 또는 "세르핀 패밀리 A 구성원 1"은 잘 알려진 유전자 및 단백질을 지칭한다. SERPINA1은 PI, A1A, AAT, PI1, A1AT, nNIF, PRO2275 및 알파1AT로도 알려져 있다. 가장 흔한 병원성 AAT 변이체는 Z (Glu342Lys)로, 이는 AAT를 잘못 접히고 간세포 및 기타 AAT 생성 세포 내에서 중합도록 한다. 인간 SERPINA1 mRNA 전사체의 서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) RefSeq 수탁 번호 NM_000295.5에서 찾을 수 있으며, A1AT 전구체에 대한 인코딩된 단백질 서열은 NP_000286.3에서 찾을 수 있다. SERPINA1 mRNA 서열의 추가 예는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스, 예를 들어 GenBank, UniProt 및 OMIM을 사용하여 쉽게 이용할 수 있다.
본원에서 사용되는 "SERPINA1 관련 질환"은 SERPINA1 유전자 또는 단백질과 관련된 모든 질환을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 질환은 예를 들어 SERPINA1 유전자 돌연변이, SERPINA1 단백질의 과잉 생산, SERPINA1 단백질의 비정상적 절단, SERPINA1 테트라머의 불안정성, SERPINA1과 다른 단백질 또는 다른 내인성 또는 외인성 물질 사이의 비정상적인 상호작용에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시양태에서, "SERPINA1 관련 질환"은 알파 1 항트립신 결핍 (A1AD)이다. A1AD의 비제한적인 예시적인 증상은 간경변, 간성 뇌병증, 복수, 황달, COPD, 폐기종, 기관지확장증, 천식, 신체 활동 후 숨가쁨, 체중 감소, 시력 변화, 피로, 반복되는 호흡기 감염, 기립 시 빠른 심장박동, 및/또는 통 모양의 가슴을 포함한다. 일부 실시양태에서, A1AD는 간부전 및/또는 폐기종 및/또는 COPD를 유발한다.
본원에서 사용되는 용어 "단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)"은 개체 간의 DNA 서열에서 단일 위치에서의 변이를 의미한다. 모집단의 1% 초과가 DNA 서열의 특정 위치에서 동일한 뉴클레오티드를 가지고 있지 않으면 이 변이는 SNP로 분류될 수 있다. SNP가 유전자 내에서 발생하면 유전자는 하나 초과의 대립 유전자를 갖는 것으로 설명된다. 이러한 경우 SNP는 아미노산 서열의 변형을 유발할 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈의 특정 염기 위치에서 C 뉴클레오티드는 대부분의 개체에게 나타날 수 있지만 소수의 개체에서는 A가 그 위치를 차지한다. 이것은 이 특정 위치에 SNP가 있음을 의미하고, 두 가지 가능한 뉴클레오티드 변이인 C 또는 A는 이 위치에 대한 두 개의 대립 유전자이다.
SNP는 유전자의 코딩 영역, 유전자의 비코딩 영역, 또는 유전자간 영역 (유전자 사이의 영역)에 속할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열 내의 SNP는 유전자 코드의 축퇴로 인해, 생성되는 단백질의 아미노산 서열을 반드시 변경하지는 않는다. 코딩 영역의 SNP는 동의어 및 비동의어 SNP의 두 가지 유형이다. 동의어 SNP는 단백질 서열에 영향을 미치지 않는 반면, 비동의어 SNP는 단백질의 아미노산 서열을 변경한다. 비동의어 SNP는 미스센스와 넌센스의 두 가지 유형이다. 단백질 코딩 영역에 없는 SNP는 여전히 유전자 스플라이싱, 전사 인자 결합, 메신저 RNA 분해, 또는 비코딩 RNA의 서열에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 유형의 SNP에 의해 영향을 받는 유전자 발현을 eSNP (발현 SNP)라고 하며 유전자의 업스트림 또는 다운스트림일 수 있다. 단일 뉴클레오티드 변이체는 빈도의 제한이 없는 단일 뉴클레오티드에서의 변이이며 체세포에서 발생할 수 있다. 체세포 단일 뉴클레오티드 변이는 단일 뉴클레오티드 변경이라고도 한다.
특정 SNP가 장애를 일으키지 않을 수 있지만 일부 SNP는 특정 질환과 관련이 있다. 이러한 연관성을 통해 특정 SNP를 사용하여 질환에 걸릴 개인의 유전적 소인을 평가할 수 있다. 또한 특정 SNP가 특성과 관련이 있는 것으로 알려진 경우 이러한 SNP 근처의 특정 DNA 스트레치를 검사하면 특성을 담당하는 유전자 또는 유전자를 식별하는 데 도움이 된다.
본원에서 사용되는 "알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP"라는 어구는 알파 1 항트립신 결핍의 개시 또는 발달과 관련된 임의의 SNP를 지칭한다. 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 예시적인 SNP는 SERPINA1 단백질의 위치 342에서 병원성 아미노산을 초래하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드의 임의의 단일 뉴클레오티드 변화를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP는 rs28929474이며, 이는 때때로 "Pi-Z" 대립유전자로 지칭된다. SNP rs28929474(A)는 A1AD를 유발하는 Glu342Lys 병리학적 변이체와 관련이 있다.
용어 "병원성 아미노산"은 단백질에서 야생형 아미노산이 아니고 병원성을 유발하는 임의의 아미노산을 지칭한다.
"병원성 돌연변이", "병원성 변이체", "질환 유발 돌연변이", "질환 유발 변이체" 또는 "해로운 돌연변이"라는 용어는 특정 질환 또는 장애에 대한 개별의 감수성 또는 소인을 증가시키는 유전적 변경 또는 돌연변이를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 병원성 돌연변이는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에서 적어도 하나의 병원성 아미노산으로 치환된 적어도 하나의 야생형 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "아데노신 데아미나제"는 아데닌 또는 아데노신의 가수분해적 탈아민화를 촉매할 수 있는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 아데노신의 이노신으로 또는 데옥시 아데노신에서 데옥시이노신으로의 가수분해 탈아민화를 촉매하는 아데노신 데아미나제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 데옥시리보핵산 (DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해 탈아민화를 촉매한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 리보핵산 (RNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해 탈아민화를 촉매한다. 아데노신 데아미나제는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스와 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나제는 대장균, S. 아우레우스, S. 티피, S. 푸트레파시엔스, H. 인플루엔자, 또는 C. 크레센투스와 같은 박테리아로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스와 같은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나제의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 데아미나제 또는 데아미나제 도메인은 자연적으로 발생하는 데아미나제와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 동일하다. 예를 들어, 데아미나제 도메인은 국제 PCT 출원 번호 PCT/2017/045381 (WO 2018/027078) 및 PCT/US2016/058344 (WO 2017/070632)에 기술되어 있으며, 이들 각각은 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 또한 Komor, A.C., 등, Nature 533, 420-424 (2016); Gaudelli, N.M., 등, Nature 551, 464-471 (2017); Komor, A.C., 등, Science Advances 3:eaao4774 (2017), 및 Rees, H.A., 등, Nat Rev Genet. 2018;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1를 참조하며, 이들 전체 내용은 참조로 여기에 포함된다.
본 발명에서 용어 "RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)"는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 특정 구조적 모티프를 인식하여 dsRNA에 결합하여 탈아민화를 통해 아데노신을 이노신으로 전환시켜, 그 결과 인코딩된 단백질과 그 기능에 변화를 일으킬 수 있는 아미노산 코돈의 재암호화시키는 편집 효소를 지칭한다. 편집 부위를 둘러싼 핵염기, 특히 편집 부위와 함께 삼중항으로 불리는, 편집 부위의 바로 5'에 있는 핵염기 및 편집 부위의 바로 3'에 있는 핵염기는 아데노신의 탈아민화에 중요한 역할을 한다. 과발현된 인간 ADAR2 및 ADAR1에 의해 효율적으로 편집된 효모 RNA의 분석에서, 편집 부위에 비해 5' 위치의 U 및 3' 위치의 G에 대한 선호도가 밝혀졌다. (Wang 등, (2018) Biochemistry, 57: 1640-1651; Eifler 등, (2013) Biochemistry, 52: 7857-7869, 및 Eggington 등, (2011) Nat. Commun., 319: 1-9 참조) ADAR1, ADAR2 및 ADAR3의 세 가지 알려진 ADAR 단백질이 인간에서 발현된다. ADAR1과 ADAR2는 몸 전체에서 발현되는 반면 ADAR3는 뇌에서만 발현된다. ADAR1 및 ADAR2는 촉매적으로 활성인 반면 ADAR3는 비활성인 것으로 생각된다. 선택된 전사체의 특정 부위로의 ADAR의 모집 및 인접한 염기에 관계없이 아데노신의 탈아민화는 질환 치료에 큰 가능성을 가지고 있다.
본원에서 사용되는 용어 "ADAR-모집 도메인"은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 일부일 수 있고 ADAR 효소를 모집할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 모집 도메인은 ADAR 효소에 대한 모집 및 결합 영역으로 작용하는 스템-루프 구조를 형성할 수 있다. 이러한 ADAR 모집 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 "액시머 AON" 또는 "자가 루프 AON"으로 지칭될 수 있다. ADAR 모집 도메인 부분은 세포에 존재하는 내인성 ADAR 효소를 모집하도록 작용할 수 있다. 이러한 ADAR 모집 도메인은 접합된 개체 또는 변형된 재조합 ADAR 효소의 존재를 필요로 하지 않는다. 대안적으로, ADAR 모집 부분은 ADAR 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 작제물을 통해 세포 또는 대상체에게 전달된 재조합 ADAR 융합 단백질을 모집하도록 작용할 수 있다. 이러한 ADAR-융합 단백질은 다른 단백질, 예를 들어 MS2 박테리오파지 코트 단백질에 융합된 ADAR1 또는 ADAR2 효소의 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. ADAR 모집 도메인은 천연 기질 (예를 들어, GluR2 수용체 pre-mRNA; 예컨대 GluR2 ADAR 모집 도메인), Z-DNA 구조, 또는 ADAR 융합 단백질, 예를 들어 ADAR의 dsRNA 결합 영역에 의해 인식되는 것으로 알려진 MS2 ADAR-모집 도메인의 일부인, 다른 단백질을 모집하는 것으로 알려진 도메인을 기반으로 하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. ADAR 모집 도메인의 스템-루프 구조는 두 개의 개별 핵산 가닥에 의해 형성된 분자간 스템-루프 구조 또는 단일 핵산 가닥 내에 형성된 분자내 스템 루프 구조일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Z-DNA"라는 용어는 DNA 이중 나선 또는 RNA 스템 루프 구조의 왼손잡이 형태를 지칭한다. 이러한 DNA 또는 dsRNA 나선은 지그재그 패턴으로 왼쪽으로 (더 일반적으로 발견되는 B-DNA 형태와 같이 오른쪽과 반대로) 감는다. Z-DNA는 알려진 고친화성 ADAR 결합 기질이며 인간 ADAR1 효소에 결합하는 것으로 나타났다.
"G", "C", "A", "T" 및 "U" 각각은 일반적으로 각각 구아닌, 사이토신, 아데닌, 티미딘, 및 우라실을 염기로 함유하는 천연 발생 뉴클레오티드를 나타낸다. 그러나, 용어 "뉴클레오티드"는 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 대체 뉴클레오티드 또는 대리 대체 모이어티를 지칭할 수도 있음을 이해할 것이다. 당업자는 구아닌, 사이토신, 아데닌, 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 교체될 수 있음을 잘 알고 있다. 예를 들어, 제한 없이, 그의 염기로서 하이포잔틴을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 사이토신, 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는 예를 들어 하이포잔틴을 함유하는 뉴클레오티드에 의해 본 발명에서 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에서 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드의 어느 위치에서든 아데닌 및 사이토신은 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 발명에서 특징으로 하는 조성물 및 방법에 적합하다.
용어 "핵염기" 및 "염기"는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예를 들어, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어, 우라실, 티민, 및 사이토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 핵염기라는 용어는 또한 천연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 기능적인 대체 핵염기를 포함한다. 이 맥락에서 "핵염기"는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴, 및 하이포잔틴과 같은 천연 발생 핵염기뿐만 아니라 대체 핵염기 모두를 지칭한다. 이러한 변이체는 예를 들어 Hirao 등 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45, page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 Chapter 1, unit 4.1에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-메틸사이토신, 5-티오졸로-사이토신, 5-프로피닐-사이토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 5-메톡시우라실, 2'-티오-티민, 하이포잔틴, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로 변환시킴으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 여기서 각 문자는 선택적으로 동등한 기능의 대체 핵염기를 포함할 수 있다.
"당" 또는 "당 모이어티"는 푸라노스 고리를 갖는 천연 발생 당을 포함한다. 당은 또한 뉴클레오시드의 푸라노스 고리를 대체할 수 있는 구조로 정의되는 "대체 당"을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대체 당은 비-푸라노스 (또는 4'-치환된 푸라노스) 고리 또는 고리 시스템 또는 개방 시스템이다. 이러한 구조는 6원 고리와 같은 천연 푸라노스 고리에 비해 단순한 변화를 포함하거나, 펩티드 핵산에 사용되는 비고리 시스템의 경우와 같이 더 복잡할 수 있다. 대체 당은 또한 푸라노스 고리가 예를 들어 모르폴리노 또는 헥시톨 고리 시스템과 같은 또 다른 고리 시스템으로 대체된 당 대체물을 포함할 수 있다. 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 당 모이어티는 β-D-리보스, β-D-2'-데옥시리보스, 치환된 당 (예컨대 2', 5' 및 비스 치환된 당), 4'-S-당 (예를 들어, 4'-S-리보스, 4'-S-2'-데옥시리보스 및 4'-S-2'-치환된 리보스), 바이사이클릭 대체 당 (예를 들어, 2'-O-CH2-4' 또는 2'-O-(CH2)2-4' 가교된 리보스 유래 바이시클릭 당) 및 당 대체물 (예를 들어, 리보스 고리가 모르폴리노 또는 헥시톨 고리 시스템으로 대체된 경우)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 각 위치에서 사용되는 헤테로사이클릭 염기 및 뉴클레오시드간 결합의 유형은 가변적이며 모티프를 결정하는 요인은 아니다. 대안적인 당 모이어티를 갖는 대부분의 뉴클레오시드에서, 헤테로사이클릭 핵염기는 일반적으로 혼성화를 허용하도록 유지된다.
본원에서 사용되는 "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 단량체 단위를 지칭한다. 뉴클레오시드간 연결은 포스페이트 연결을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 유사하게, "연결된 뉴클레오시드"는 포스페이트 연결에 의해 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 포스포로티오에이트 및 보로노포스페이트 연결을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 "대체 뉴클레오시드간 연결"이 당업계에 공지되어 있다. 대체 뉴클레오시드는 바이사이클릭 뉴클레오시드 (BNA) (예를 들어, 잠긴 뉴클레오시드 (LNA) 및 구속된 에틸 (cEt) 뉴클레오시드), 펩티드 뉴클레오시드 (PNA), 포스포트리에스테르, 포스포로티오네이트, 포스포라미데이트, 및 본원에 설명된 것을 포함하여, 천연 뉴클레오시드의 포스페이트 백본의 기타 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 "대체 뉴클레오티드"는 대체 핵염기 또는 대체 당, 및 대체 뉴클레오시드 연결을 포함할 수 있는 뉴클레오시드간 연결을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "뉴클레오시드"는 핵염기 및 당 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 단량체 단위를 지칭한다. 뉴클레오시드는 본원에 기술된 것과 같은 대체 뉴클레오시드뿐만 아니라 천연 발생인 것들을 포함할 수 있다. 뉴클레오시드의 핵염기는 천연 발생 핵염기 또는 대체 핵염기일 수 있다. 유사하게, 뉴클레오시드의 당 모이어티는 자연적으로 발생하는 당 또는 대체 당일 수 있다.
용어 "대체 뉴클레오시드"는 본원에 기재된 것과 같은 대체 당 또는 대체 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분해를 제한하는 뉴클레오티드를 의미한다. 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 빈약한 기질이 됨으로써 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시킨다. 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 2'-플루오로-뉴클레오티드는 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 2개 이상의 공유 결합된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유 결합된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 고체상 화학 합성에 이어 정제하여 실험실에서 만들어진다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급할 때, 공유적으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 또는 순서를 언급한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적일 수 있고, 화학적으로 합성되며, 전형적으로 정제되거나 단리된다. 올리고뉴클레오티드는 또한 (i) 푸라노스 유도체로, 또는 염기 모이어티에 대한 공유 부착 지점으로 사용될 수 있는 임의의 구조, 사이클릭 또는 비-사이클릭으로 대체된 하나 이상의 푸라노스 모이어티를 갖는 화합물, (ii) 포스포라미데이트 또는 포스포로티오에이트 연결의 경우와 같이 변형되거나, 포름아세탈 또는 리보아세탈 연결의 경우와 같이 적절한 연결 모이어티로 완전히 대체된 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 갖는 화합물, 및/또는 (iii) 염기 모이어티에 대한 공유 부착 지점으로 사용될 수 있는 임의의 구조, 사이클릭, 또는 비-사이클릭 구조로 대체된 하나 이상의 연결된 푸라노스-포스포디에스테르 연결 모이어티를 갖는 화합물을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 대체 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 것을 포함)를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 당 모이어티 또는 핵염기가 결여된 조성물을 포함하지만 여전히 표적 서열과 짝을 이루거나 이에 혼성화할 수 있는 것으로 이해된다.
"올리고뉴클레오티드"는 짧은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 100개 이하의 연결된 뉴클레오시드)를 지칭한다.
"RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드" 또는 "ADAR-매개된 아데노신에서 이노신 변경으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드"라는 문구는 표적 서열에 특이적이고 ADAR-매개 경로를 통해 표적 서열에서 특정 아데노신의 탈아민화 반응에 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 표적 서열, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 미스매치를 제외하고 표적 mRNA에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 표적 아데노신과 반대되는 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 다른 유전자 편집 기술, 예를 들어 CRISPR에 의해 사용되는 것을 포함하지 않는다.
올리고뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있고, 약 10 내지 100개의 염기 길이, 예를 들어 약 15 내지 100개 염기 길이 또는 약 18 내지 100개의 염기 길이 길이, 예를 들어 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 염기 길이, 예컨대 약 15 내지 50개, 15 내지 49개, 15 내지 48개, 15 내지 47개, 15 내지 46개, 15 내지 45개, 15 내지 44개, 15 내지 43개, 15 내지 42개, 15 내지 41개, 15 내지 40개, 15 내지 39개, 15 내지 38개, 15 내지 37개, 15 내지 36개, 15 내지 35개, 15 내지 34개, 15 내지 33개, 15 내지 32개, 15 내지 31개, 15 내지 31개, 15 내지 30개, 18 내지 50개, 18 내지 49개, 18 내지 48개, 18 내지 47개, 18 내지 46개, 18 내지 45개, 18 내지 44개, 18 내지 43개, 18 내지 42개, 18 내지 41개, 18 내지 40개, 18 내지 39개, 18 내지 38개, 18 내지 37개, 18 내지 36개, 18 내지 35개, 18 내지 34개, 18 내지 33개, 18 내지 32개, 18 내지 31개, 18 내지 31개, 18 내지 30개, 19 내지 50개, 19 내지 49개, 19 내지 48개, 19 내지 47개, 19 내지 46개, 19 내지 45개, 19 내지 44개, 19 내지 43개, 19 내지 42개, 19 내지 41개, 19 내지 40개, 19 내지 39개, 19 내지 38개, 19 내지 37개, 19 내지 36개, 19 내지 35개, 19 내지 34개, 19 내지 33개, 19 내지 32개, 19 내지 31개, 19 내지 31개, 19 내지 30개, 20 내지 50개, 20 내지 49개, 20 내지 48개, 20 내지 47개, 20 내지 46개, 20 내지 45개, 20 내지 44,20 내지 43개, 20 내지 42개, 20 내지 41개, 20 내지 40개, 20 내지 39개, 20 내지 38개, 20 내지 37개, 20 내지 36개, 20 내지 35개, 20 내지 34개, 20 내지 33개, 20 내지 32개, 20 내지 31개, 20 내지 31개, 20 내지 30개, 21 내지 50개, 21 내지 49개, 21 내지 48개, 21 내지 47개, 21 내지 46개, 21 내지 45개, 21 내지 44개, 21 내지 43개, 21 내지 42개, 21 내지 41개, 21 내지 40개, 21 내지 39개, 21 내지 38개, 21 내지 37개, 21 내지 36개, 21 내지 35개, 21 내지 34개, 21 내지 33개, 21 내지 32개, 21 내지 31개, 21 내지 31개, 또는 21 내지 30개의 염기 길이 범위일 수 있다. 상기 인용된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 발명의 일부인 것으로 고려된다.
용어 "링커" 또는 "연결기"는 하나 이상의 공유 결합을 통해 하나의 화학기 또는 관심 세그먼트를 다른 화학기 또는 관심 세그먼트에 연결하는 2개의 원자 사이의 연결이다. 접합체 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 직접 또는 연결 모이어티 (예를 들어, 링커 또는 테더)를 통해 부착될 수 있다. 링커는 제3 영역을 공유적으로 연결, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 대한 접합체 모이어티 (예를 들어, 영역 A 또는 C의 말단)의 역할을 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 선택적으로 올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 위치한 링커 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합체와 올리고뉴클레오티드 사이의 링커는 생체절단가능하다. 포스포디에스터 함유 생분해성 링커는 WO 2014/076195 (본원에 참조로 포함됨)에 더 자세히 설명되어 있다.
"상보적" 폴리뉴클레오티드는 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드다. 구체적으로 퓨린은 피리미딘과 염기쌍을 이루어, DNA의 경우 구아닌과 사이토신의 짝 (G:C) 및 아데닌과 티민의 짝 (A:T), 또는 RNA의 경우 아데닌과 우라실의 짝 (A:U)의 조합을 형성한다. 2개의 폴리뉴클레오티드는 서로에 대해 완전히 상보적이지 않더라도 서로에 대해 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 영역을 갖는다면 서로 혼성화할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이의 상보적 서열은 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전히 상보적인" 것으로 언급될 수 있다. 그러나, 본원에서 제1 서열이 제2 서열과 관련하여 "실질적으로 상보적"이라고 언급되는 경우, 두 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 최대 30개 염기쌍의 듀플렉스에 대한 혼성화 시 하나 이상, 그러나 일반적으로는 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매치된 염기쌍을 형성하는 동시에 궁극적인 적용, 예를 들어, 아데노신의 탈아민화와 가장 관련이 있는 조건 하에서 혼성화하는 능력을 유지할 수 있다. "실질적으로 상보적인"은 또한 관심 mRNA (예를 들어, 표적 아데노신을 갖는 mRNA)의 인접 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 서열이 관심 mRNA의 중단되지 않은 부분에 실질적으로 상보적인 경우, 관심 mRNA의 적어도 일부에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 일부는 참조 (예를 들어, 표적) 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이다. 이러한 실시양태에서, 상보성 백분율은 올리고뉴클레오티드 또는 이의 부분의 길이에 대해 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, "상보적"이라는 용어는 제2 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 서열을 설명하기 위해 사용될 때, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 특정 조건 하에서 혼성화하고 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 지칭한다. 이러한 조건은 예를 들어 엄격한 조건일 수 있으며, 여기서 엄격한 조건은 다음을 포함할 수 있다: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃, 12 내지 16시간 후 세척 (예를 들어, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, 등 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조). 유기체 내부에서 접할 수 있는 생리학적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 궁극적인 적용에 따라 두 서열의 상보성 테스트에 가장 적합한 조건 세트를 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변이체" 및 "유도체"는 상호교환적으로 사용되며 본원에 기술된 화합물, 펩티드, 단백질 또는 기타 물질의 천연 발생, 합성 및 반합성 유사체를 지칭한다. 본원에 기술된 화합물, 펩티드, 단백질 또는 기타 물질의 변이체 또는 유도체는 원래 물질의 생물학적 활성을 유지하거나 개선할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 하나 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 일반적으로 원래의 잔기 다음에 서열 내의 잔기의 위치를 확인하고 새로 치환된 잔기의 정체를 확인함으로써 본원에 기술된다. 본원에서 제공되는 아미노산 치환 (돌연변이)을 만드는 다양한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))에 제공된다. 일부 실시양태에서, 현재 개시된 조성물은 유의미한 수의 의도하지 않은 돌연변이, 예컨대 의도하지 않은 점 돌연변이를 생성하지 않고 핵산 (예를 들어, 대상체의 게놈 내의 핵산)에서 점 돌연변이와 같은 "의도된 돌연변이"를 효율적으로 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 의도된 돌연변이는 의도된 돌연변이를 생성하도록 특별히 설계된 특정 가이드 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 돌연변이이다. 일반적으로, 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열)에서 이루어지거나 확인된 돌연변이는 참조 (또는 야생형) 서열, 즉 돌연변이를 함유하지 않는 서열과 관련하여 번호가 매겨진다. 당업자는 참조 서열에 비해 아미노산 및 핵산 서열에서 돌연변이의 위치를 결정하는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉하는"은 임의의 수단에 의해 표적 유전자, 예를 들어 SERPINA1과 접촉하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 세포에서 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉된다. 세포 내 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것은 시험관 내에서 세포 내 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것 또는 생체 내에서 세포 내 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함한다.
시험관 내 세포를 접촉시키는 것은 예를 들어 가이드 올리고뉴클레오티드와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 생체 내 세포를 접촉시키는 것은 예를 들어 가이드 올리고뉴클레오티드를 세포가 위치한 조직 내로 또는 그 근처에 주입함으로써, 또는 가이드 올리고뉴클레오티드 작용제를 또 다른 영역, 예를 들어 혈류 또는 피하 공간으로 주입하여, 이어서 접촉할 세포가 있는 조직에 작용제가 도달하도록 함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 가이드 올리고뉴클레오티드는 관심 부위로 올리고뉴클레오티드를 안내하는 리간드를 함유하고/하거나 이에 결합될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 가이드 올리고뉴클레오티드와 시험관 내에서 접촉될 수 있고 이어서 대상체에 이식될 수 있다.
한 실시양태에서, 가이드 올리고뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 것은 세포로의 흡수(uptake) 또는 흡수(absorption)를 촉진하거나 수행함으로써 "올리고뉴클레오티드를 세포로 도입" 또는 "전달"하는 것을 포함한다. 가이드 올리고뉴클레오티드의 흡수(absorption) 또는 흡수(uptake)는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해 또는 보조제 또는 장치에 의해 발생할 수 있다. 가이드 올리고뉴클레오티드를 세포로 도입하는 것은 시험관내 및/또는 생체내일 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입의 경우, 올리고뉴클레오티드를 조직 부위에 주사하거나 전신 투여할 수 있다. 세포로의 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가 접근법이 아래에 기재되어 있고/있거나 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 약제학적 활성 분자, 예를 들어 핵산 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 캡슐화하는 지질층을 포함하는 소포이다. LNP는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 전형적으로 양이온성, 이온화가능 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 방지하는 지질 (예를 들어, PEG-지질 접합체)을 함유한다. LNP는 예를 들어 미국 특허 번호 6,858,225; 6,815,432; 8,158,601; 및 8,058,069에 기재되어 있고, 이들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "리포솜"은 적어도 하나의 이중층, 예를 들어 하나의 이중층 또는 복수의 이중층으로 배열된 양친매성 지질로 구성된 소포를 지칭한다. 리포좀은 친유성 물질 및 수성 내부로부터 형성된 막을 갖는 단일층 및 다중층 소포를 포함한다. 수성 부분은 올리고뉴클레오티드 조성물을 함유한다. 친유성 물질은 수성 외부로부터 수성 내부를 단리하는데, 이는 전형적으로 올리고뉴클레오티드 조성물을 포함하지 않지만 일부 예에서는 포함할 수 있다. 리포솜은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포솜을 포함하며, 본원에서 사용되는 이 용어는 리포솜에 혼입될 때 이러한 특수 지질이 결여된 리포솜에 비해 향상된 순환 수명을 초래하는 하나 이상의 특수 지질을 포함하는 리포솜을 지칭한다.
"미셀"은 본원에서 분자의 모든 소수성 부분이 내부를 향하고 친수성 부분이 주변 수성 상과 접촉하도록 남겨두도록 양친매성 분자가 구형 구조로 배열되는 특정 유형의 분자 조립체로서 정의된다. 환경이 소수성인 경우 반대 배열이 존재한다.
"단백질의 수준을 결정하는 것"은 직접적 또는 간접적으로 당업계에 공지된 방법에 의해 단백질 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA의 검출을 의미한다. "직접적으로 결정한다"는 것은 물리적 개체 또는 값을 얻기 위해 프로세스를 수행하는 것 (예를 들어, 샘플에 대한 검정 또는 테스트 수행 또는 본원에 정의된 용어인 "샘플 분석")을 의미한다. "간접적으로 결정한다"는 것은 물리적 실체 또는 값을 다른 당사자 또는 출처 (예를 들어, 물리적 실체 또는 값을 직접 획득한 제3자 연구소)로부터 받는 것을 지칭한다. 단백질 수준을 측정하는 방법에는 일반적으로 웨스턴 블롯팅, 면역블롯팅, 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사성면역검정법 (RIA), 면역침전법, 면역형광법, 표면 플라즈몬 공명법, 화학발광법, 형광 편광법, 인광법, 면역조직화학적 분석법, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석법, 액체 크로마토그래피 (LC)-질량 분석법, 마이크로세포 분석법, 현미경 검사, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 유동 세포 분석법뿐만 아니라 분석 효소 활성 또는 다른 단백질 파트너와의 상호 작용을 포함하되 이에 국한되지 않는 단백질의 특성을 기반으로 한 검정법이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율 (%) 서열 동일성"은 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 필요하다면 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산의 백분율로 정의된다. 핵산 또는 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은 당업자의 능력 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2 또는 Megalign 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예를 들어, 백분율 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한, 이와의, 또는 이에 대한 (to, with, or against) 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A의 서열 동일성 백분율 (대안적으로 주어진 핵산 또는 아미노산 B에 대해, 이와, 또는 이에 대해 (to, with, or against) 특정 백분율 서열 동일성을 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 (분수 X/Y)
여기서 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 (예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 일치로 기록된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B에 있는 핵산의 총 수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 서열 동일성 백분율은 A에 대한 B의 서열 동일성 백분율과 같지 않을 것임을 이해할 것이다.
"수준"은 참조와 비교하여 단백질, 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA의 수준 또는 활성을 의미한다. 참조는 본원에 정의된 바와 같이 임의의 유용한 참조일 수 있다. 단백질의 "감소된 수준" 또는 "증가된 수준"은 참조에 비해 단백질 수준의 감소 또는 증가를 의미한다 (예를 들어, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500%, 또는 그 이상만큼의 감소 또는 증가; 기준에 비해 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 또는 약 200% 초과의 감소 또는 증가; 약 0.01배 미만, 약 0.02배, 약 0.1배, 약 0.3배, 약 0.5배, 약 0.8배, 또는 그 이하의 감소 또는 증가; 또는 약 1.2배 초과, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.8배, 약 2배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4.5배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 100배, 약 1000배, 또는 그 이상의 증가). 단백질 수준은 질량/부피 (예를 들어, g/dL, mg/mL, μg/mL, ng/mL) 또는 샘플의 총 단백질 또는 mRNA에 대한 백분율로 표시될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "제약 조성물"은 약제학적으로 허용되는 부형제로 제형화된 본원에 기재된 화합물을 함유하고, 바람직하게는 포유류의 질환 치료를 위한 치료 요법의 일부로서 정부 규제 기관의 승인으로 제조 또는 판매되는 조성물을 나타낸다. 제약 조성물은 예를 들어 단위 투여 형태 (예를 들어, 정제, 캡슐, 당의정, 젤캡 또는 시럽); 국소 투여용 (예를 들어, 크림, 젤, 로션, 또는 연고); 정맥내 투여용 (예를 들어, 미립자 색전이 없는 멸균 용액으로서 및 정맥내 사용에 적합한 용매 시스템으로); 경막내 주사용; 뇌실내 주사; 실질내 주사용; 또는 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화될 수 있다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 본원에 기재된 화합물 이외의 임의의 성분 (예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)으로 환자에서 실질적으로 비독성 및 비염증 특성을 갖는 것을 의미한다. 부형제는 예를 들어 부착 방지제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료 (색소), 연화제, 유화제, 충전제 (희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 향료, 방향제, 활택제 (흐름 향상제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미료 및 수화수를 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 탄산칼슘, 인산칼슘 (이염기성), 스테아르산칼슘, 크로스카르멜로스, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 락토스, 스테아린산마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로오스, 메틸파라벤, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 전호화전분, 프로필파라벤, 레티닐팔미테이트, 셸락, 이산화규소, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 구연산나트륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분 (옥수수), 스테아르산, 수크로스, 활석, 이산화티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 자일리톨을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본원에 기재된 임의의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 염을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 건전한 의학적 판단의 범위 내에 있고 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염은 Berge 등, J. Pharmaceutical Sciences 66:1-19, 1977 및 Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (Eds. P.H. Stahl and C.G. Wermuth), Wiley-VCH, 2008에 기재되어 있다. 염은 본원에 기술된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 제자리에서 또는 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시켜 별도로 제조할 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 약제학적으로 허용되는 염으로서 제조될 수 있도록 이온화가능한 기를 가질 수 있다. 이들 염은 무기산 또는 유기산을 포함하는 산부가염일 수 있거나, 본원에 기술된 화합물의 산성 형태의 경우 염은 무기 또는 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 종종, 화합물은 약제학적으로 허용되는 산 또는 염기의 부가 생성물로서 제조된 약제학적으로 허용되는 염으로서 제조되거나 사용된다. 적합한 약제학적으로 허용되는 산 및 염기 및 적절한 염의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 염은 무기 및 유기 산 및 염기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 무독성 산 및 염기로부터 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 및 발레레이트 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 및 마그네슘뿐만 아니라 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 및 에틸아민을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 아민 양이온을 포함한다.
"참조"는 단백질 또는 mRNA 수준 또는 활성을 비교하기 위해 사용되는 임의의 유용한 참조를 의미한다. 참조는 비교 목적으로 사용되는 모든 샘플, 표준, 표준 곡선, 또는 수준이 될 수 있다. 참조는 일반 참조 샘플이거나 참조 표준 또는 수준일 수 있다. "참조 샘플"은 예를 들어 대조군, 예를 들어 "정상 대조군" 또는 동일한 대상체로부터 채취한 이전 샘플과 같은 사전 결정된 음성 대조군 값; 정상 세포 또는 정상 조직과 같은 정상적인 건강한 대상체로부터의 샘플; 질환이 없는 대상체의 샘플 (예를 들어, 세포 또는 조직); 질환을 갖고 있는 것으로 진단되었지만 아직 본원에 기재된 화합물로 치료되지 않은 대상체로부터의 샘플; 본원에 기재된 화합물에 의해 치료된 대상체로부터의 샘플; 또는 알려진 정상 농도의 정제된 단백질 샘플 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 것)일 수 있다. "참조 표준 또는 수준"은 참조 샘플에서 유래된 값 또는 숫자를 의미한다. "정상 대조군 값"은 비질환 상태를 나타내는 미리 결정된 값, 예를 들어 건강한 대조군 대상체에서 예상되는 값이다. 일반적으로 정상 대조군 값은 범위 ("X 내지 Y"), 높은 임계값 ("X보다 높지 않음") 또는 낮은 임계값 ("X보다 낮지 않음")으로 표현된다. 특정 바이오마커에 대한 정상 대조군 값 내에서 측정된 값을 갖는 대상체는 일반적으로 해당 바이오마커에 대해 "정상 한계 내"라고 한다. 정상 참조 표준 또는 수준은 질환 또는 장애가 없는 정상 대상체; 본원에 기재된 화합물로 치료받은 대상체로부터 파생된 값 또는 숫자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 참조 샘플, 표준, 또는 수준은 다음 기준 중 적어도 하나에 의해 샘플 대상 샘플과 일치한다: 연령, 체중, 성별, 질환 단계 및 전반적인 건강. 정상 참조 범위 내에서 정제된 단백질, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 수준의 표준 곡선이 또한 참조로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "대상체"는 예를 들어 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적을 위해 본 발명에 따른 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 임의의 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류, 및 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 대상체는 특정 질환 또는 병태에 대해 치료를 원하거나 필요로 하거나, 치료를 요청하거나, 치료를 받고 있거나, 미래에 치료를 받을 수 있거나, 또는 훈련된 전문가의 관리를 받고 있는 인간 또는 동물일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "투여"는 대상체 또는 시스템에 조성물 (예를 들어, 화합물 또는 본원에 기술된 화합물을 포함하는 제제)을 투여하는 것을 지칭한다. 동물 대상체 (예를 들어, 인간)에 대한 투여는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 적절한 경로에 의한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 "병용 요법" 또는 "조합하여 투여되는"은 2개 (또는 그 이상)의 상이한 제제 또는 치료법이 특정 질환 또는 병태에 대해 정의된 치료 요법의 일부로서 대상체에게 투여됨을 의미한다. 치료 요법은 대상체에 대한 별도의 제제의 효과가 중첩되도록 각 제제의 용량 및 투여 주기를 정의한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 제제의 전달은 동시적(simultaneous)이거나 동시적(concurrent)이며 제제는 공동 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 제제는 공동 제형화되지 않고 처방 요법의 일부로서 순차적인 방식으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합된 2개 이상의 제제 또는 치료 요법의 투여는 장애와 관련된 증상 또는 다른 매개변수의 감소가 단독으로 또는 다른 약물의 부재하에 전달되는 하나의 제제 또는 치료 요법으로 관찰되는 것보다 더 크도록 한다. 두 치료 요법의 효과는 부분적으로 부가적이거나 완전히 부가적이거나 부가적보다 클 수 있다 (예를 들어, 상승 효과). 각각의 치료제의 순차적 또는 실질적 동시 투여는 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합의 제1 치료제는 정맥 주사에 의해 투여될 수 있는 반면, 조합의 제2 치료제는 경구로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하다", "치료되는" 또는 "치료하는"이라는 용어는 치료적 처치 및 예방적(prophylactic) 또는 예방적 (preventative) 조치를 모두 의미하며, 여기서 그 목적은 바람직하지 않은 생리적 병태, 장애 또는 질환을 예방하거나 서행시키거나 (감소시키거나), 또는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻는 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 증상 완화; 병태, 장애 또는 질환 정도의 감소; 병태, 장애 또는 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태; 병태, 장애 또는 질환 진행의 개시 지연 또는 둔화; 검출 가능 여부에 상관 없이, 병태, 장애, 또는 질환 상태의 개선 또는 완화 (부분적이든 전체적이든); 환자가 반드시 식별할 수 있는 것은 아니지만 적어도 하나의 측정 가능한 물리적 매개변수의 개선; 또는 병태, 장애 또는 질환의 향상 또는 개선이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 치료에는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의미한 반응을 유도하는 것이 포함된다. 치료에는 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것도 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은, 본원에 기재된 치료 효과 (예를 들어, 세포 또는 대상체에서)를 초래하는 제제의 "유효량", "치료 유효량" 및 "충분한 양"이라는 용어는 인간을 포함하는 대상체에게 투여될 때 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 가져오기에 충분한 양을 지칭하고, 따라서 "유효량" 또는 그 동의어는 적용되는 상황에 따라 다르다. 예를 들어, 장애 치료의 맥락에서 투여 없이 얻은 반응과 비교하여 치료 반응을 달성하기에 충분한 제제의 양이다. 주어진 제제의 양은 주어진 제제, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 대상체의 신원 (예를 들어, 연령, 성별 및/또는 체중) 또는 치료되는 숙주 등과 같은 다양한 요소에 따라 달라지지만, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 제제의 "치료적 유효량"은 대조군과 비교하여 대상체에서 유익하거나 원하는 결과를 초래하는 양이다. 본원에 정의된 바와 같이, 제제의 치료적 유효량은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "예방적 유효량"은 장애를 갖거나 가질 경향이 있는 대상체에게 투여될 때 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 완화시키기에 충분한 올리고뉴클레오티드의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 질환을 개선하는 것은 질환의 경과를 늦추거나 나중에 발병하는 질환의 중증도를 줄이는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 올리고뉴클레오티드, 제제의 투여 방법, 질환의 위험 정도, 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 해당되는 경우 선행 또는 병용 치료의 종류, 및 치료될 환자의 기타 개별 특성에 따라 달라질 수 있다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 또한 임의의 치료에 적용 가능한 합당한 이익/위험 비율로 일부 원하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 올리고뉴클레오티드의 양 (단일 또는 다중 용량으로 투여됨)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 그러한 치료에 적용 가능한 합당한 이익/위험 비율을 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
예방적 유효량은 또한 예를 들어, 인간을 포함하는 대상체에게 투여될 때 본원에 기술된 장애 중 하나 이상의 개시를 적어도 120일, 예를 들어, 예측된 개시와 비교할 때 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 적어도 5년, 적어도 10년 또는 그 이상까지 지연시키기에 충분한 양을 지칭할 수 있다.
임의의 다음 화학적 정의에 대해, 원자 기호 다음에 오는 숫자는 특정 화학적 모이어티에 존재하는 해당 원소의 총 원자 수를 나타낸다. 이해하게 되는 바와 같이, H 원자와 같은 다른 원자, 또는 본원에 기술된 치환기는 원자가를 만족시키기도록 필요에 따라 존재할 수 있다. 예를 들어, 비치환된 C2 알킬기는 화학식 -CH2CH3를 갖는다. 본원에 정의된 기와 함께 사용되는 경우, 탄소 원자 수에 대한 언급은 아세탈 및 케탈 기의 2가 탄소를 포함하지만 아실, 에스테르, 카보네이트 또는 카르바메이트 기의 카르보닐 탄소는 포함하지 않는다. 헤테로아릴 기의 산소, 질소 또는 황 원자의 수에 대한 언급은 헤테로사이클 고리의 일부를 형성하는 원자만을 포함한다
특정 치환기가 동일한 구조에 여러 번 존재할 수 있는 경우, 치환기의 각 경우는 해당 치환기에 대한 가능한 정의 목록에서 독립적으로 선택될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자 (예를 들어, 1 내지 16개의 탄소 원자, 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자)의 분지쇄 또는 직쇄 1가 포화 지방족 탄화수소 라디칼을 지칭한다.
알킬렌은 2가 알킬기이다. 본원에서 단독으로 또는 다른 기와 함께 사용되는 용어 "알케닐"은 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 2 내지 20개의 탄소 원자 (예를 들어, 2 내지 16개의 탄소 원자, 2 내지 10개의 탄소 원자, 2 내지 6개의 탄소 원자, 또는 2개의 탄소 원자)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "할로겐"은 불소 (플루오로), 염소 (클로로), 브롬 (브로모) 또는 요오드 (요오도) 라디칼을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로알킬"은 구성 탄소 원자 중 하나 이상이 질소, 산소 또는 황으로 대체된 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 헤테로알킬기는 알킬기에 대해 본원에 기재된 바와 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 헤테로알킬 기의 예는 본원에서 사용되는 바와 같이 알킬-O- (예를 들어, 메톡시 및 에톡시)를 지칭하는 "알콕시"이다. 헤테로알킬렌은 2가 헤테로알킬 기이다. 본원에 사용된 용어 "헤테로알케닐"은 구성 탄소 원자 중 하나 이상이 질소, 산소 또는 황으로 대체된 본원에 정의된 바와 같은 알케닐 기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 알케닐 기에 대해 본원에 기재된 바와 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 헤테로알케닐 기의 예는 본원에서 알케닐-O-를 지칭하는 "알케녹시"이다. 헤테로알케닐렌은 2가 헤테로알케닐 기이다. 본원에 사용된 용어 "헤테로알키닐"은 구성 탄소 원자 중 하나 이상이 질소, 산소 또는 황으로 대체된 본원에 정의된 바와 같은 알키닐 기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 알키닐 기에 대해 본원에 기재된 바와 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 헤테로알키닐 기의 예는 본원에서 알키닐-O-를 지칭하는 "알키녹시"이다. 헤테로알키닐렌은 2가 헤테로알키닐 기이다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드록시"는 -OH 기를 나타낸다.
알킬, 헤테로알킬 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 치환될 때 일반적으로 1 내지 4개의 치환기가 존재할 것이다. 치환기는 예를 들어 알킬 (예를 들어, 비치환 및 치환, 여기서 치환기는 본원에 기재된 임의의 기, 예를 들어, 아릴, 할로, 하이드록시를 포함함), 아릴 (예를 들어, 치환 및 비치환 페닐), 카르보사이클릴 (예를 들어, 치환 및 비치환 사이클로알킬), 할로 (예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 헤테로알킬 (예를 들어, 치환 및 비치환된 메톡시, 에톡시 또는 티오알콕시), 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 아미노(예를 들어, NH2또는 모노- 또는 디알킬 아미노), 아지도, 시아노, 니트로, 또는 티올을 포함한다. 아릴, 카르보사이클릴 (예를 들어, 사이클로알킬), 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴 기는 또한 알킬 (아릴알킬(예를 들어, 치환 및 비치환된 벤질)과 같은 치환 및 비치환)로 치환될 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있고 광학적으로 순수한 거울상이성질체, 거울상이성질체의 혼합물, 예를 들어 라세미체, 광학적으로 순수한 부분입체이성질체, 부분입체이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체 라세미체, 또는 부분입체이성질체 라세미체의 혼합물의 형태로 존재할 수 있다. 광학 활성 형태는 예를 들어 라세미체의 분해, 비대칭 합성 또는 비대칭 크로마토그래피 (키랄 흡착제 또는 용리액을 사용한 크로마토그래피)에 의해 얻을 수 있다. 즉, 개시된 특정 화합물은 다양한 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 입체이성질체는 공간 배열만 다른 화합물이다. 거울상이성질체는 거울상이 중첩되지 않는 입체이성질체 쌍으로, 키랄 중심으로 작용하는 비대칭적으로 치환된 특정 탄소 원자를 포함하기 때문에 가장 일반적이다. "거울상이성질체"는 서로 거울상이고 포개지지 않는 한 쌍의 분자 중 하나를 의미한다. 부분입체이성질체는 거울상과 관련이 없는 입체이성질체이며, 가장 일반적으로 두 개 이상의 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하고 하나 이상의 키랄 탄소 원자 주위에 치환기의 배열을 나타내기 때문이다. 화합물의 거울상이성질체는 예를 들어 하나 이상의 잘 알려진 기술 및 방법, 예를 들어 키랄 크로마토그래피 및 이에 기초한 분리 방법을 사용하여 라세미체로부터 거울상이성질체를 분리함으로써 제조될 수 있다. 라세미 혼합물로부터 본원에 기재된 화합물의 거울상이성질체를 분리하기 위한 적절한 기술 및/또는 방법은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. "라세미체" 또는 "라세미 혼합물"은 2개의 거울상이성질체를 함유하는 화합물을 의미하며, 여기서 이러한 혼합물은 광학 활성을 나타내지 않는다; 즉, 편광면을 회전시키지 않는다. "기하 이성질체"는 탄소-탄소 이중 결합, 사이클로알킬 고리 또는 가교된 바이사이클릭 시스템과 관련하여 치환체 원자의 방향이 다른 이성질체를 의미한다. 탄소-탄소 이중 결합의 각 면에 있는 원자 (H 제외)은 E (치환기가 탄소-탄소 이중 결합의 25개의 반대쪽에 있음) 또는 Z (치환기가 같은 쪽에 있음) 배열일 수 있다. "R," "S," "S*," "R *," "E", "Z", "시스" 및 "트랜스"는 코어 분자에 대한 배열을 나타낸다. 개시된 특정 화합물은 아트로프이성질체 형태로 존재할 수 있다. 아트로프이성질체는 단일 결합에 대한 회전 방해로 인해 생성되는 입체이성질체이며, 여기서 회전에 대한 입체 변형 장벽은 컨포머의 단리를 가능하게 하기에 충분히 높다. 본 발명의 화합물은 이성질체 특이적 합성에 의해 개별 이성질체로서 제조되거나 이성질체 혼합물로부터 분해될 수 있다. 통상적인 분해 기술은 광학 활성 산을 사용하여 이성질체 쌍의 각 이성질체의 유리 염기의 염 형성 (이후 유리 염기의 분별 결정화 및 재생), 광학 활성 아민을 사용하여 이성질체 쌍의 각 이성질체의 산 형태의 염 형성 (이후 유리 산의 분별 결정화 및 재생), 광학적으로 순수한 산, 아민 또는 알코올을 사용하여 이성질체 쌍의 각 이성질체의 에스테르 또는 아미드 35를 형성 (이후 크로마토그래피 분리 및 키랄 보조제의 제거), 또는 잘 알려진 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 출발 물질 또는 최종 생성물의 이성질체 혼합물의 분해를 포함한다. 개시된 화합물의 입체화학이 명명되거나 구조에 의해 묘사될 때, 명명되거나 묘사된 입체이성질체는 다른 입체이성질체에 비해 적어도 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 90 중량%, 99 중량% 또는 99.9 중량%이다. 단일 거울상이성질체가 명명되거나 구조에 의해 묘사될 때, 묘사되거나 명명된 거울상이성질체는 광학적으로 적어도 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 90 중량%, 99 중량% 또는 99.9 중량% 순수하다. 단일 부분입체이성체가 명명되거나 구조에 의해 묘사될 때, 묘사되거나 명명된 부분입체이성체는 적어도 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 90 중량%, 99 중량% 또는 99.9 중량% 순수하다. 백분율 광학 순도는 거울상이성질체의 중량 또는 광학 이성질체의 중량을 더한 거울상이성질체의 중량에 대한 비율이다. 중량에 의한 부분입체이성체 순도는 하나의 부분입체이성체의 중량 또는 모든 부분입체이성체의 중량에 대한 비율이다. 개시된 화합물의 입체화학이 명명되거나 구조에 의해 묘사될 때, 명명되거나 묘사된 입체이성질체는 다른 입체이성질체에 비해 몰 분율로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 99.9% 순수하다. 단일 거울상이성질체가 명명되거나 구조에 의해 묘사될 때, 묘사되거나 명명된 거울상이성질체는 몰 분율로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 99.9% 순수하다. 단일 부분입체이성체가 명명되거나 구조에 의해 묘사될 때, 묘사되거나 명명된 부분입체이성체는 몰분율로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 99.9% 순수하다. 몰 분율에 의한 백분율 순도는 거울상이성질체의 몰수 또는 광학 이성질체의 몰수를 더한 거울상이성질체의 몰수에 대한 비율이다. 유사하게, 몰분율에 의한 백분율 순도는 부분입체이성질체의 몰수 또는 이성질체의 몰수를 더한 부분입체이성질체의 몰수에 대한 비율이다. 개시된 화합물이 입체화학을 나타내지 않고 구조로 명명되거나 묘사되고 화합물이 적어도 하나의 키랄 중심을 갖는 경우, 그 이름 또는 구조는 상응하는 광학 이성체가 없는 화합물의 거울상이성질체, 화합물의 라세미 혼합물, 또는 상응하는 광학 이성질체에 비해 하나의 거울상이성질체가 풍부한 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 개시된 화합물이 입체화학을 나타내지 않고 구조에 의해 명명되거나 묘사되고 2개 이상의 키랄 중심을 갖는 경우, 그 이름 또는 구조는 다른 부분입체이성질체가 없는 부분입체이성질체, 다른 부분입체이성질체 쌍이 없는 다수의 부분입체이성질체, 부분입체이성질체의 혼합물, 부분입체이성질체 쌍의 혼합물, 하나의 부분입체이성질체가 다른 부분입체이성질체(들)에 비해 풍부한 부분입체이성질체의 혼합물, 또는 하나 이상의 부분입체이성질체가 다른 부분입체이성질체에 비해 풍부한 부분입체이성질체의 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 이러한 모든 형태를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 개시내용에서 사용하기 위해 본원에 기재되어 있으며; 당업계에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 아래 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
II. 본 발명의 방법.
본 발명은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍 (예를 들어, 간부전 및/또는 폐기종)과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법, 및 대상체에서 SERPINA1 관련 질환, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사용을 통한 뉴클레오티드의 부위 지정 편집에 의해 세포 또는 개체에서 표적 서열, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 원하는 변화를 만드는 데 사용된다. 그 결과, ADAR에 의해 매개되는 아데노신 탈아민화 반응을 통해 표적 서열이 편집되어 아데노신을 이노신으로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, I가 G로 인식되기 때문에, 유전자에서 병원성 돌연변이를 교정하는 탈아민화는 E342K 돌연변이를 다시 야생형으로 역전시키고, 환자가 경험하는 A1AD와 관련된 증상을 역전시키거나 서행시킨다.
변화는 표적 RNA의 5' 또는 3' 비번역 영역, 스플라이스 부위, 엑손 (표적 RNA로부터 번역된 단백질의 아미노산 변화, 엑소닉 스플라이싱 사일런서 또는 인핸서의 변화에 의한 코돈 사용 또는 스플라이싱 거동의 변화, 및/또는 시작 또는 정지 코돈의 도입 또는 제거), 인트론 (인트론 스플라이싱 사일런서 또는 인트론 스플라이싱 인핸서, 분기점의 변경에 의한 스플라이싱 변화) 및 일반적으로 RNA 안정성, 구조 또는 기능에 영향을 미치는 모든 영역에서 있을 수 있다. 표적 RNA 서열은 전이(transition) 또는 전이(transversion)와 같이 교정하거나 변경하고자 할 수 있는 돌연변이를 포함할 수 있다.
RNA 편집 효소는 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, RNA 편집 효소는 인간 또는 인간 세포에서 hADARI 및 hADAR2와 같이 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)이다.
RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)는 이중 가닥 (ds) 구조를 갖는 RNA의 아데노신 (A)에서 이노신 (I)으로의 편집으로 촉매한다. A-to-I RNA 편집은 리보솜과 RNA 중합효소 모두에서 I가 A 대신 G로 인식되기 때문에 뉴클레오티드 치환을 초래한다. A-to-I 치환은 I:U 미스매치 염기쌍이 A:U 염기쌍보다 덜 안정적이기 때문에 dsRNA 불안정화를 유발할 수도 있다. A-to-I 편집은 바이러스 및 세포 RNA 모두에서 발생하며 광범위한 생물학적 과정에 영향을 미친다. 여기에는 바이러스 성장 및 지속성, 세포 사멸 및 배아 발생, 신경 전달 물질 수용체 및 이온 채널 기능, 췌장 세포 기능, 및 마이크로RNA에 의한 전사 후 유전자 조절이 포함된다. ADAR-촉매된 A-to-I (= G) 편집 이벤트에 따른 생리학적 변화를 이해하기 위한 프레임워크를 제공하는 생화학적 과정에는 코돈을 변경하여 단백질의 아미노산 서열을 변경하는 mRNA 번역; 스플라이스 부위 인식 서열 변화에 의한 전-mRNA 스플라이싱; 뉴클레아제 인식에 관여하는 서열 변화에 의한 RNA 안정성; 바이러스 RNA 복제 동안 서열 변화에 의한 RNA 바이러스 게놈의 경우의 유전적 안정성; 및 마이크로RNA 생성 또는 표적화 또는 단백질-RNA 상호작용과 같은 RNA-구조-의존적 활동이 포함된다.
3개의 인간 ADAR 유전자가 알려져 있으며, 그 중 2개는 활성 데아미나제 (ADAR1 및 ADAR2)를 인코딩한다. 인간 ADAR3 (hADAR3)은 선행 기술에 기재되어 있지만 데아미나제 활성이 없는 것으로 보고되었다. 대안적 스플라이싱과 함께 대안적 프로모터는 ADAR1의 두 가지 단백질 크기 형태, 즉 dsRNA 및 Z-DNA에 결합하는 인터페론 유도성 ADAR1-p150 데아미나제 및 구성적으로 발현되는 ADAR1-p110 데아미나제를 생성한다. ADAR1-p110과 마찬가지로 ADAR2는 구성적으로 발현되며 dsRNA에 결합한다. ADAR1의 더 긴 이소형만이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 작제물의 모집 부분에 포함될 수 있는 Z-DNA 구조에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 결과적으로, 세포에 존재하는 150 kDa 이소형의 수준은 인터페론, 특히 인터페론-감마 (IFN-감마)에 의해 영향을 받을 수 있다. hADARI는 또한 TNF-알파에 의해 유도될 수 있다. 이것은 조합 요법을 개발할 수 있는 기회를 제공하는데, 인터페론-감마 또는 TNF-알파 및 본 발명에 따른 모집 부분으로서 Z-DNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드 작제물이 병용 제품으로서 또는 별도의 제품으로서 동시에 또는 어떤 순서로든 순차적으로 환자에게 투여된다. 특정 질환 상태는 환자의 특정 조직에서 증가된 IFN-감마 또는 TNF-알파 수준과 이미 일치할 수 있으므로 질환이 있는 조직에 대해 편집을 보다 구체적으로 만들 수 있는 추가 기회를 만든다.
선택된 전사체의 특정 부위에 대한 ADAR의 모집 및 인접 염기에 관계없이 아데노신의 탈아민화는 질환 치료에 대한 큰 가능성을 갖는다. 일부 실시양태에서, SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 가이드 올리고뉴클레오티드는 ADAR-모집 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 본 발명의 방법에 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드에 공유 결합될 수 있고 ADAR 효소에 대한 모집 및 결합 영역으로 작용하는 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 ADAR 모집 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 "액시머 AON" 또는 "자가 루프 AON"으로 지칭될 수 있다. ADAR 모집 도메인 부분은 세포에 존재하는 내인성 ADAR 효소를 모집하는 역할을 할 수 있다. 이러한 ADAR 모집 도메인은 접합된 개체 또는 변형된 재조합 ADAR 효소의 존재를 필요로 하지 않는다. 대안적으로, ADAR-모집 부분은 ADAR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 작제물을 통해 세포 또는 대상체에게 전달된 재조합 ADAR 융합 단백질을 모집하도록 작용할 수 있다. 이러한 ADAR-융합 단백질은 다른 단백질, 예를 들어 MS2 박테리오파지 코트 단백질에 융합된 ADAR1 또는 ADAR2 효소의 데아미나제 도메인을 포함할 수 있다. ADAR 모집 도메인은 천연 기질 (예를 들어, GluR2 수용체 pre-mRNA; GluR2 ADAR 모집 도메인과 같은), Z-DNA 구조, 또는 ADAR 융합 단백질, 예를 들어 ADAR의 dsRNA 결합 영역에 의해 인식되는 것으로 알려진 MS2 ADAR-모집 도메인의 일부인 다른 단백질을 모집하는 것으로 알려진 도메인을 기반으로 하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. ADAR 모집 도메인의 스템-루프 구조는 두 개의 개별 핵산 가닥에 의해 형성된 분자간 스템-루프 구조 또는 단일 핵산 가닥 내에 형성된 분자내 스템 루프 구조일 수 있다.
일부 실시양태에서, ADAR은 세포에서 내인성으로 발현된다. 세포는 박테리아 세포, 진핵 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포로 구성된 군에서 선택된다. 원칙적으로 본 발명은 임의의 포유동물 종으로부터의 세포와 함께 사용될 수 있지만, 바람직하게는 인간 세포와 함께 사용된다.
SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 가이드 올리고뉴클레오티드는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 암호화하는 SERPINA1 mRNA에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 미스매치를 제외하고 표적 mRNA에 대해 상보적이다. 올리고뉴클레오티드는 표적 아데노신과 반대되는 미스매치를 포함한다.
올리고뉴클레오티드가 표적 mRNA 서열에 혼성화되면, 이는 ADAR에 의해 인식될 수 있는 이중 가닥 RNA 구조를 형성하고 표적 서열에 대한 ADAR의 모집을 촉진한다. 결과적으로 ADAR은 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 특정 아데노신에서 이노신으로의 탈아민화 반응을 촉매할 수 있다.
본 발명의 방법에 의한 성공적인 편집 시, rs28929474 (A) 대립유전자는 탈아민화되고 ADAR에 의해 rs28929474(G) 대립유전자로 전환되며, 이 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경은 병원성 아미노산인 세린을 SERPINA1 단백질의 342번 위치에 야생형 아미노산인 글리신으로 치환하여 SERPINA1 단백질의 병원성 또는 질환 유발 돌연변이를 제거한다.
본 발명의 방법은 임의의 기관, 예를 들어 피부, 폐, 심장, 신장, 간, 췌장, 창자, 근육, 선, 눈, 뇌, 혈액 등으로부터의 세포와 함께 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 (인간) 대상체의 질환 상태에 연루된 세포, 조직 또는 기관의 서열을 변형시키는데 적합하다. 그러한 세포는 간세포, 간세포 유사 세포 및/또는 폐포 II형 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 또한 유기체에 자연적으로 존재하지 않는 포유동물 세포, 예를 들어, 세포주 또는 배아 줄기 (ES) 세포와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 등을 비롯하여 다양한 유형의 줄기 세포와 함께 사용될 수 있다.
세포는 시험관내 또는 생체내 위치할 수 있다. 본 발명의 한 가지 장점은 살아있는 유기체의 제자리에서 세포와 함께 사용될 수 있지만 배양 중인 세포와 함께 사용될 수도 있다는 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외 처리된 후 살아있는 유기체로 도입된다 (예를 들어, 세포가 원래 유래된 유기체로 재도입됨). 일부 실시양태에서, 세포는 생체내에서 접촉된다. 다른 실시양태에서, 세포는 생체외에 있다.
본 발명의 방법은 또한 소위 오가노이드 내의 세포에서 표적 RNA 서열을 편집하기 위해 사용될 수 있다. 오가노이드는 줄기 세포에서 유래된 자가 조직화된 3차원 조직 구조이다. 이러한 배양은 기관의 복잡성을 많이 복제하거나 특정 유형의 세포만 생산하는 것과 같이 기관의 선택된 측면을 발현하도록 제작될 수 있다 (Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125). 치료 환경에서 그들은 환자의 세포로부터 시험관내에서 파생될 수 있고 오가노이드는 일반 이식보다 거부 가능성이 적은 자가 재료로서 환자에게 다시 도입될 수 있기 때문에 유용하다. 따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명은 환자로부터 채취한 조직 샘플 (예를 들어, 그들의 위장관; Sala 등 J Surg Res. 2009; 156(2):205-12, 및 Sato 등 Gastroenterology 201 1 ;141 : 1762-72 참조)로부터 성장한 오가노이드 상에서 실행될 수 있다. 본 발명에 따른 RNA 편집시, 오가노이드, 또는 오가노이드 내에 상주하는 줄기 세포는 기관 기능을 개선하기 위해 환자에게 다시 이식하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료될 세포는 유전적 돌연변이를 갖는다. 돌연변이는 이형접합 또는 동형접합일 수 있다. 본 발명은 예를 들어 G에서 A로의 돌연변이를 교정하기 위해 점 돌연변이를 변형시키는데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료될 세포는 유전적 돌연변이를 갖지 않는다. 본 발명은 예를 들어 A에서 G로의 돌연변이를 생성하기 위해 점 돌연변이를 생성하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 돌연변이 교정에 제한되지 않으며, 대신에 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 적용함으로써 야생형 서열을 돌연변이 서열로 변경하는 것이 유용할 수 있다. 야생형 아데노신을 변형하는 것이 유리할 수 있는 한 가지 예는 예를 들어 상기 엑손의 스플라이싱에 필요한 분지 부위인 아데노신을 변형함으로써 엑손의 스키핑을 일으키는 것이다. 또 다른 예는 아데노신이 단백질 결합에 대한 인식 서열을 정의하거나 그 일부이거나 mRNA의 안정성을 정의하는 2차 구조에 관여하는 경우이다. 그러나 일부 실시양태에서, 본 발명은 문제의 질환에 대한 유용한 연구 도구를 제공하기 위해 질환 관련 돌연변이를 세포주 또는 동물에 도입함으로써 반대 방식으로 사용된다. 연구 목적을 위한 질환 모델 생성의 예로서, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 서열은 SERPINA1에서 돌연변이, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍의 발병의 기초를 형성하는 SERPINA1 돌연변이를 생성하기 위해 인간 세포에서 편집 활성의 모집을 제공한다. 그 결과, 본 발명은 기존 돌연변이보다 덜 해로운 새로운 돌연변이를 도입하기 위해 질환에 대한 연구 도구를 제공하는 데 사용될 수 있다.
RNA 편집을 통해 역전되는 돌연변이는 pre-mRNA, 리보솜 RNA 또는 미토콘드리아 RNA를 포함하는 미토콘드리아 DNA, 또는 RNA와 같은 DNA의 일부 다른 형태 또는 염색체 수준에서 발생할 수 있다. 세포 또는 대상체가 감염된 진균, 효모, 기생충, 키네토플라스미드, 박테리아, 파지, 바이러스 등을 포함하는 병원체의 표적 RNA에 변화가 이루어질 수 있다. 이어서 편집은 이러한 세포, 대상체 또는 병원체 내부의 표적 서열에 대한 RNA 수준에서 발생할 수 있다. 바이러스와 같은 특정 병원체는 핵산, DNA 또는 RNA를 감염된 숙주 (세포)의 세포로 방출한다. 다른 병원체는 감염된 숙주에 상주하거나 순환한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 작제물은, 편집이 일어나야 하는 세포가 거기에 투여된 올리고뉴클레오티드 작제물과 양립할 수 있는 편집 실체를 포함하는 한, 감염된 진핵 숙주의 세포에 상주하는 표적 RNA 서열을 편집하거나 진핵 숙주에 상주하거나 순환하는 병원체의 세포 내부에 있는 RNA 서열을 편집하는데 사용될 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, ADAR1 및 ADAR2를 통한 RNA 편집은 전사 또는 스플라이싱 동안 핵의 pre-mRNA에서 발생하는 것으로 생각된다. 성숙한 mRNA에서 미토콘드리아 RNA 코돈 또는 비암호화 서열의 편집이 배제되지 않는다.
본원에 개시된 올리고뉴클레오티드를 사용한 아데노신의 탈아민화는 임의의 수준의 아데노신 탈아민화, 예를 들어 표적 서열 내의 적어도 1개의 탈아민화된 아데노신 (예를 들어, 표적 서열 내의 적어도 1, 2, 3개 또는 그 이상의 탈아민화된 아데노신)을 포함한다.
아데노신 탈아민화는 대조군 수준과 비교하여 표적 서열 내의 아데노신의 절대적 또는 상대적 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에서 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 투여 전 기준선 수준, 또는 대조군 (예컨대, 예를 들어 완충액 전용 대조군 또는 비활성 제제 대조군)으로 처리되거나 처리되지 않은 유사한 대상체, 세포 또는 샘플로부터 결정된 수준일 수 있다.
ADAR의 효소 활성이 아데노신을 이노신으로 전환시키기 때문에, 아데노신 탈아민화는 대안적으로 대조군 수준과 비교하여 표적 서열 내의 이노신의 절대적 또는 상대적 수준의 증가에 의해 평가될 수 있다. 유사하게, 대조군 수준은 당업계에서 이용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 투여 전 기준선 수준, 또는 대조군 (예컨대, 예를 들어 완충액 전용 대조군 또는 비활성 제제 대조군)으로 처리되거나 처리되지 않은 유사한 대상체, 세포 또는 샘플로부터 결정된 수준일 수 있다.
표적 서열 내의 아데노신 및/또는 이노신의 수준은 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 조성을 결정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열 내의 아데노신 또는 이노신의 상대 또는 절대 수준은 Sanger 시퀀싱 방법, 시판되는 플랫폼 (예를 들어, Illumina, Qiagen, Pacific Biosciences, Thermo Fisher, Roche 및 Oxford Nanopore Technologies)에서 제공되는 것과 같은 차세대 시퀀싱 (NGS; 예를 들어 파이로시퀀싱, 가역적 터미네이터 화학에 의한 시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱, 및 실시간 시퀀싱)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 핵산 시퀀싱 기술을 사용하여 평가될 수 있다. NGS에 대한 표적 서열의 클론 증폭은 Applied Biosystems, Roche, Stratagene, Cepheid, Eppendorf, 또는 Bio-Rad Laboratories의 시판 플랫폼에서 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR로도 알려짐)을 사용하여 수행할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로 에멀젼 PCR 방법은 Bio-Rad Laboratories의 Droplet Digital PCR과 같은 상업적으로 이용 가능한 플랫폼을 사용하여 표적 서열을 증폭하는 데 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 표적 서열 내의 아데노신 탈아민화를 검출하기 위해 대체 마커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 허용되는 진단 및 모니터링 기준에 의해 입증된 바와 같이, G-to-A 돌연변이를 포함하는 유전적 장애를 갖는 대상체를 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 효과적으로 치료하는 것은 임상적으로 관련된 아데노신 탈아민화를 입증하는 것으로 이해될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 예를 들어, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드로 대상체를 치료한 후 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 바와 같이 임상적으로 관련된 아데노신 탈아민화를 포함한다.
관심 있는 유전자의 아데노신 탈아민화는 제1 세포 또는 세포군과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포군 (올리고뉴클레오티드로 처리되지 않거나 관심 유전자에 표적화된 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 대조군 세포(들))과 비교하여 관심 유전자의 발현이 증가하거나 감소하도록 관심 있는 유전자가 전사되고 (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써, 또는 세포가 있거나 있었던 대상체에게 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써) 처리된 제1 세포 또는 세포군 (이러한 세포는 예를 들어 대상체에서 파생된 샘플에 존재할 수 있음)에 의해 발현되는 mRNA 수준의 증가 또는 감소에 의해 나타날 수 있다. 관심 유전자의 mRNA 수준의 증가 또는 감소 정도는 다음과 같이 표현될 수 있다.
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다른 실시양태에서, 유전자 수준의 변화는 관심 유전자의 발현과 기능적으로 연결된 매개변수, 예를 들어 관심 유전자의 단백질 발현 또는 단백질의 신호 하류의 감소 측면에서 평가될 수 있다. 관심 유전자 수준의 변화는 관심 유전자를 발현하는 임의의 세포에서, 발현 작제물로부터 내인성 또는 이종성으로, 그리고 당업계에 공지된 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다.
관심 유전자의 발현 수준의 변화는 세포 또는 세포군에 의해 발현되는 관심 유전자에 의해 생성된 단백질 수준 (예를 들어, 대상체에서 유래된 샘플에서 발현된 단백질의 수준)의 증가 또는 감소에 의해 명백해질 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, mRNA 억제의 평가를 위해, 처리된 세포 또는 세포군에서 단백질 발현 수준의 변화는 유사하게 대조군 세포 또는 세포군에서 단백질 수준의 백분율로 표현될 수 있다.
관심 유전자의 발현 변화를 평가하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포군은 아직 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드와 접촉하지 않은 세포 또는 세포군을 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포 또는 세포군은 대상체를 올리고뉴클레오티드로 치료하기 전에 개별 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물 대상체)로부터 유도될 수 있다.
세포 또는 세포군에 의해 발현되는 관심 유전자의 mRNA 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플 중 관심 유전자의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부, 예를 들어 관심 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는 예를 들어 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출 (RNAzol B; Biogenesis), RNEASYTM RNA 준비 키트 (Qiagen) 또는 PAXgene (PreAnalytix, 스위스)을 사용하는 것을 포함하는 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 이용하는 일반적인 검정 형식에는 핵 런온(run-on) 검정, RT-PCR, RNase 보호 검정, 노던 블롯팅, 제자리 혼성화 및 마이크로어레이 분석이 포함된다. 관심 유전자의 순환 mRNA는 PCT 공개 WO2012/177906에 기술된 방법을 사용하여 검출할 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자의 발현 수준은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본원에서 사용되는 "프로브"라는 용어는 특정 서열, 예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나 적절한 생물학적 제제로부터 유도될 수 있다. 프로브는 레이블을 지정하도록 특별히 설계될 수 있다. 프로브로 활용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
단리된 mRNA는 서던(Southern) 또는 노던(Northern) 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석 및 프로브 어레이를 포함하나 이에 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 검정에 사용될 수 있다. mRNA 수준을 결정하는 한 가지 방법은 단리된 mRNA를 관심 유전자의 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, mRNA는 고체 표면 상에 고정되고, 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 작동시키고 mRNA를 겔로부터 막, 예컨대 니트로셀룰로오스로 전달함으로써 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 실시양태에서, 프로브(들)는 고체 표면 상에 고정되고 mRNA는 예를 들어 AFFYMETRIX 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)와 접촉된다. 숙련된 기술자는 관심 유전자의 mRNA 수준을 결정하는 데 사용하기 위해 알려진 mRNA 검출 방법을 쉽게 채택할 수 있다.
샘플에서 관심 유전자의 발현 수준을 결정하기 위한 대안적 방법은 예를 들어 RT-PCR (Mullis, 1987, 미국 특허 번호 4,683,202에 제시된 실험적 실시양태), 리가아제 연쇄 반응 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자체 지속 서열 복제 (Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제 (Lizardi 등 (1988) Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제 (Lizardi 등, 미국 특허 번호 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서, 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 증폭된 분자를 검출함으로써 핵산 증폭 및/또는 샘플에서 예를 들어 mRNA의 역전사효소 (cDNA를 제조하기 위해)의 과정이 관여한다. 이러한 검출 체계는 그러한 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 특정 측면에서, 관심 유전자의 발현 수준은 정량적 형광 발생 RT-PCR (즉, TAQMANTM 시스템) 또는 DUAL-GLO® 루시퍼라제 검정에 의해 결정된다.
관심 유전자의 mRNA 발현 수준은 멤브레인 블롯 (노던, 서던, 도트 등과 같은 혼성화 분석에 사용됨) 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유 (또는 결합된 핵산을 포함한 모든 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 번호 5,770,722; 5,874,219; 5,744,305; 5,677,195; 및 5,445,934를 참조한다. 유전자 발현 수준의 결정은 또한 용액에서 핵산 프로브를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, mRNA 발현 수준은 분지형 DNA (bDNA) 검정 또는 실시간 PCR (qPCR)을 사용하여 평가된다. 이 PCR 방법의 사용은 본원에 제시된 실시예에 기술되고 예시된다. 이러한 방법은 관심 유전자의 핵산 검출에도 사용할 수 있다.
관심 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 수준은 단백질 수준의 측정을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 검정, 분광광도 검정, 유세포 분석, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정 (RIA), 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 면역형광 검정, 전기화학발광 검정 등이 포함된다. 그러한 검정은 또한 관심 유전자에 의해 생성된 단백질의 존재 또는 복제를 나타내는 단백질의 검출을 위해 사용될 수 있다. 추가로, 상기 검정은 단백질 기능의 회복 또는 변화를 초래하여 대상체에게 치료 효과 및 이점을 제공하고, 대상체에서 장애를 치료하고/하거나 대상체의 장애 증상을 감소시키는 관심 mRNA 서열의 변화를 보고하는 데 사용될 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 SERPINA1 관련 질환 또는 장애, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍을 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 구아노신에서 아데노신으로의 돌연변이, 미성숙 정지 코돈의 도입, 또는 원하지 않은 단백질의 발현에 의해 유발될 수 있는 임의의 SERPINA1 관련 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 세포 또는 대상체에 도입될 때 구아노신에서 아데노신으로의 돌연변이를 교정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 원하는 단백질이 발현되도록 미성숙 정지 코돈을 중단시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 원하지 않는 단백질의 발현을 억제할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 가진 대상체를 확인하는 단계; 및 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 대상체의 세포 내의 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 접촉시켜 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 가진 대상체를 확인하는 단계; 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 세포 내의 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 접촉시키는 단계, 및 대상체에게 세포를 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 간에서 돌연변이 A1AT의 축적을 방지, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD와 관련된 간 손상을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 간부전을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 간경변증의 진행을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 황달의 발생을 예방, 역전 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 복수 (즉, 복강 내 체액의 비정상적 축적)의 발달을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 간성 뇌병증의 발병을 예방, 역전, 또는 서행시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체의 폐에서 엘라스틴의 과도한 분해를 예방, 역전 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 폐기종의 발달을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 COPD의 발병을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 A1AD를 가진 대상체에서 호흡기 감염의 수를 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 천식의 발병을 예방, 역전, 또는 서행시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 기관지확장증의 발달을 예방, 역전, 또는 서행시킨다.
일부 실시양태에서, 대상은 인간 대상체이다.
따라서 본 발명의 방법은 SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 가진 대상체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 표적 RNA 서열에서 원하는 뉴클레오티드 변화 또는 SNP의 존재를 확인하여 이에 의해 표적 RNA 서열이 교정 또는 편집될 돌연변이를 유발하는 질환을 가지고 있음을 확인하는 단계를 포함한다. 이 단계는 일반적으로 표적 RNA 서열의 관련 부분, 또는 이의 cDNA 사본 (또는 표적 RNA가 pre-mRNA인 경우 이의 스플라이싱 산물의 cDNA 사본)의 시퀀싱을 수반할 것이며, 따라서 서열 변화는 쉽게 확인할 수 있다. 대안적으로, 변형은 단백질 수준 (길이, 글리코실화, 기능 등) 또는 일부 기능적 판독에 의해 평가될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 또한 본원에 설명된 바와 같이 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드를 사용하여 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 대상체 (이러한 치료가 필요한 것으로 확인된 대상체 또는 질환의 위험이 의심되고 이러한 치료가 필요한 대상체 포함)에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 가이드 올리고뉴클레오티드는 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)의 SERPINA1 유전자를 특이적으로 표적화하도록 설계되고, SERPINA1 유전자의 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP에서 ADAR 매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 올리고뉴클레오티드는 ADAR을 표적 mRNA로 모집할 수 있으며, 이는 표적 mRNA에서 표적 아데노신의 탈아민화를 촉매한다. 그러한 치료는 알파 1 항트립신 결핍을 앓고 있거나, 갖거나, 걸리기 쉽거나, 발병할 위험이 있는 대상체, 특히 인간 대상체에게 적절하게 도입될 것이다. 일부 실시양태에서, 유전자에서 병원성 돌연변이를 교정하는 이러한 탈아민화는 E342K 돌연변이를 다시 야생형으로 역전시키고, 알파 1 항트립신 결핍을 감소시키고, 간 및/또는 폐기종 관련 증상을 역전시키거나 서행시킨다. 본원에 개시된 조성물은 또한 알파 1 항트립신 결핍이 연루될 수 있는 임의의 다른 장애의 치료에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 치료 과정을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 질환 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 본원에 개시된 조성물의 치료량을 대상체가 투여받은, 알파 1 항트립신 결핍, 또는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 증상을 앓고 있거나 발병하기 쉬운 대상체에서 진단 마커 (마커) (예를 들어, 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP) 또는 진단 측정 (예를 들어, 스크리닝, 검정)의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서 결정된 마커의 수준은 대상체의 질환 상태를 확립하기 위해 건강한 정상 대조군 또는 다른 병에 걸린 환자에서 알려진 마커 수준과 비교될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 대상체에서 마커의 제2 수준은 제1 수준의 결정보다 늦은 시점에서 결정되고 두 수준은 질환의 과정 또는 치료의 효능을 모니터링하기 위해 비교된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 대상체에서 마커의 전처리 수준은 본 발명에 따른 치료를 시작하기 전에 결정된다; 이 전처리 마커 수준은 치료의 효능을 결정하기 위해 치료가 시작된 후 대상체의 마커 수준과 비교될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 얻어지고 본원에 제공된 바와 같은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 대해 자가, 동종 또는 이종 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 제거되고 생체외에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉된 세포는 임의로 원하는 게놈 변형이 세포에서 실행되거나 검출된 후에 개체에 재도입된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 대상체 내의 특정 부위로 전달되도록 대상체에게 도입된다. 관심 유전자 발현의 변화는 대상체 내의 특정 부위로부터 유래된 샘플에서 관심 유전자에 의해 생성된 mRNA 또는 단백질 수준의 변화 또는 수준의 측정을 사용하여 평가될 수 있다.
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 다음 중 하나 (또는 그 이상, 예를 들어 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상을 초래하는 데 효과적인 양 및 시간 동안 세포 또는 대상체에 도입된다: (a) 관심 유전자의 표적 서열 내 아데노신의 수 감소, (b) 표적 단백질, 예를 들어, SERPINA1에서 병원성 돌연변이의 수 감소, (c) 알파 1 항트립신 결핍의 지연 개시, (d) 대상체의 생존 증가, (e) 단백질 기능의 회복 또는 변화, 및 (f) 폐기종 또는 간부전과 같은 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 하나 이상의 증상의 감소.
G-to-A 돌연변이와 관련된 장애를 치료하면 치료되지 않은 집단과 비교하여 치료된 대상체 집단의 사망률이 감소할 수도 있다. 예를 들어, 사망률은 2% 초과 (예를 들어, 5%, 10% 또는 25% 초과) 감소한다. 치료된 대상체 집단의 사망률 감소는 임의의 재현 가능한 수단, 예를 들어 집단에 대해 화합물 또는 본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염으로 치료를 시작한 후 단위 시간당 평균 질환 관련 사망 수를 계산함으로써 측정할 수 있다. 집단의 사망률 감소는 예를 들어 집단에 대해 화합물 또는 본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염으로 1차 치료를 완료한 후 단위 시간당 평균 질환 관련 사망 수를 계산하여 측정할 수 있다.
A. 투여 방법
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 세포, 예를 들어 인간 대상체와 같은 대상체 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍을 갖는 대상체) 내의 세포로의 전달은 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 세포를 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 전달을 수행할 수 있다. 생체내 전달은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달은 올리고뉴클레오티드의 발현을 암호화하고 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 세포를 접촉시키는 시험관내 및 생체내 방법의 조합도 가능하다. 세포와의 접촉은 직접적일 수도 있고 간접적일 수도 있다. 또한, 세포와의 접촉은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들어 GalNAc3 리간드, 또는 올리고뉴클레오티드를 관심 부위, 예를 들어 간 및/또는 폐로 유도하는 임의의 다른 리간드이다.
올리고뉴클레오티드와 세포의 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 공지된 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하기 위해 개조될 수 있다 (예를 들어, Akhtar S. and Julian R L., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 및 WO94/02595를 참조하고, 이들은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 생체내 전달을 위해 올리고뉴클레오티드 분자를 전달하기 위해 고려해야 할 요소는 예를 들어 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비특이적 효과의 방지, 및 전달된 분자가 표적 조직에 축적되는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 비특이적 효과는 국소 투여, 예를 들어 직접 주사 또는 조직으로의 이식 또는 제제의 국소 투여에 의해 최소화될 수 있다. 치료 부위에 대한 국소 투여는 작용제의 국소 농도를 최대화하고, 그렇지 않으면 작용제에 의해 손상될 수 있거나 작용제를 분해할 수 있는 전신 조직에 대한 작용제의 노출을 제한하고, 올리고뉴클레오티드 분자를 더 낮은 총 용량으로 투여할 수 있도록 한다.
질환 치료를 위해 올리고뉴클레오티드를 전신적으로 투여하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 대체 핵염기, 대체 당 모이어티 및/또는 대체 뉴클레오시드간 연결을 포함하거나, 대안적으로 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있으며; 두 방법 모두 생체내에서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오티드의 급속한 분해를 방지하는 역할을 한다. 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 담체의 변형은 또한 표적 조직에 대한 올리고뉴클레오티드 조성물의 표적화를 허용하고 바람직하지 않은 표적외 효과를 피할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 분자는 콜레스테롤과 같은 친유성 기에 대한 화학적 접합에 의해 변형되어 세포 흡수를 향상시키고 분해를 방지할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 나노입자, 지질 나노입자, 폴리플렉스 나노입자, 리포플렉스 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포좀, 또는 양이온 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온 전달 시스템은 올리고뉴클레오티드 분자 (음으로 하전된)의 결합을 촉진하고 또한 음으로 하전된 세포막에서의 상호작용을 강화하여 세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 효율적인 흡수를 허용한다. 양이온성 지질, 덴드리머, 또는 중합체는 올리고뉴클레오티드에 결합되거나 올리고뉴클레오티드를 둘러싸는 소낭 또는 미셀을 형성하도록 유도될 수 있다. 소낭 또는 미셀의 형성은 전신적으로 투여될 때 올리고뉴클레오티드의 분해를 추가로 방지한다. 일반적으로, 당업계에 공지된 임의의 핵산 전달 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 전달에 적합할 수 있다. 양이온성 올리고뉴클레오티드 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 당업자의 능력 범위 내에 있다 (예를 들어, Sorensen, D R., 등 (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, U N. 등, (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, A S 등, (2007) J. Hypertens. 25:197-205 참고, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 올리고뉴클레오티드의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적인 예는 DOTAP (Sorensen, D R., 등 (2003), supra; Verma, U N. 등, (2003), supra), 올리고펙탄민, "고체 핵산 지질 입자" (Zimmermann, T S. 등, (2006) Nature 441:111-114), 카디오리핀 (Chien, P Y. 등, (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. 등, (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민 (Bonnet M E. 등, (2008) Pharm. Res. Aug 16 인쇄 전 전자발행; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩티드 (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), 및 폴리아미도아민 (Tomalia, D A. 등, (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. 등, (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. 올리고뉴클레오티드 및 사이클로덱스트린의 투여 방법 및 제약 조성물은 미국 특허 번호 7,427,605에서 찾아볼 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 폴리플렉스 또는 리포플렉스 나노입자에 의해 전달된다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리플렉스 나노입자 및 리포플렉스 나노입자의 투여 방법 및 제약 조성물은 미국 특허 출원 번호 2017/0121454; 2016/0369269; 2016/0279256; 2016/0251478; 2016/0230189; 2015/0335764; 2015/0307554; 2015/0174549; 2014/0342003; 2014/0135376; 및 2013/0317086에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
i. 막 분자 어셈블리 전달 방법
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 또한 당업계에 공지된 중합체, 생분해성 마이크로입자, 또는 마이크로캡슐 전달 장치를 포함하는 다양한 막 분자 어셈블리 전달 방법을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 콜로이드 분산 시스템은 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드 제제의 표적 전달에 사용될 수 있다. 콜로이드 분산 시스템에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 비롯한 지질 기반 시스템이 포함된다. 리포솜은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로 유용한 인공 막 소포이다. 크기가 0.2 내지 4.0 μm인 대형 단층 소포 (LUV)는 대형 거대분자를 함유하는 수성 완충액의 상당 부분을 캡슐화할 수 있는 것으로 나타났다. 리포좀은 활성 성분을 작용 부위로 전달(transfer) 및 전달(delivery)하는 데 유용하다. 리포솜 막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에 리포솜을 조직에 적용하면 리포솜 이중층이 세포막의 이중층과 융합된다. 리포솜과 세포의 병합이 진행됨에 따라 올리고뉴클레오티드를 포함하는 내부 수성 내용물이 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있고 ADAR-매개된 RNA 편집을 매개할 수 있는 세포로 전달된다. 일부 경우에, 리포좀은 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 특정 세포 유형으로 유도하기 위해 또한 특이적으로 표적화된다. 리포좀의 구성은 일반적으로 인지질과의 조합, 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 사용할 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
올리고뉴클레오티드를 함유하는 리포좀은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 리포좀의 지질 성분은 세제에 용해되어 지질 성분과 미셀이 형성된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 임계 미셀 농도가 높을 수 있고 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트, 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 그런 다음 지질 성분을 포함하는 미셀에 올리고뉴클레오티드 제제를 첨가한다. 지질의 양이온성 기는 올리고뉴클레오티드와 상호작용하고 올리고뉴클레오티드 주위에 축합되어 리포솜을 형성한다. 축합 후 세제는 예를 들어 투석에 의해 제거되어 올리고뉴클레오티드의 리포솜 제제를 생성한다.
필요하다면, 축합을 돕는 담체 화합물을 축합 반응 동안, 예를 들어 제어된 첨가에 의해 첨가할 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체 (예를 들어, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. 축합을 선호하도록 pH를 조정할 수도 있다.
전달 비히클의 구조적 성분으로서 폴리뉴클레오티드/양이온성 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오티드 전달 비히클을 생산하는 방법은 예를 들어 WO 96/37194에 추가로 기재되어 있으며, 이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 리포솜 형성은 또한 Feigner, P. L. 등, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417; U.S. Pat. No. 4,897,355; U.S. Pat. No. 5,171,678; Bangham 등, (1965) M. Mol. Biol. 23:238; Olson 등, (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9; Szoka 등, (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew 등, (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169; Kim 등, (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339; 및 Fukunaga 등, (1984) Endocrinol. 115:757에 기재되어 있다. 전달 비히클로 사용하기 위해 적절한 크기의 지질 응집체를 제조하기 위해 일반적으로 사용되는 기술에는 초음파 처리 및 동결-해동 및 압출이 포함된다 (예를 들어, Mayer 등, (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161 참조). 미세유동화는 지속적으로 작고 (50 내지 200 nm) 비교적 균일한 응집체가 바람직한 경우에 사용할 수 있다 (Mayhew 등, (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169). 이러한 방법은 올리고뉴클레오티드 제제를 리포좀으로 패키징하는 데 쉽게 적용된다.
리포좀은 2개의 넓은 부류로 분류된다. 양이온성 리포솜은 음으로 하전된 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양으로 하전된 리포솜이다. 양으로 하전된 핵산/리포좀 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하고 엔도솜에 내재화된다. 엔도좀 내의 산성 pH로 인해 리포좀이 파열되어 그 내용물을 세포질로 방출한다 (Wang 등 (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985).
pH에 민감하거나 음으로 하전된 리포솜은 핵산과 복합체를 형성하기보다는 핵산을 포획한다. 핵산과 지질 모두 유사하게 하전되기 때문에 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고 일부 핵산은 이러한 리포솜의 수성 내부에 포획된다. pH 민감성 리포솜은 티미딘 키나아제 유전자를 암호화하는 핵산을 배양 중인 세포 단층에 전달하는 데 사용되었다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 검출되었다 (Zhou 등 (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274).
리포솜 조성물의 한 가지 주요 유형은 천연 유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질을 포함한다. 예를 들어, 중성 리포좀 조성물은 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합생성 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)으로부터 형성된다. 다른 유형의 리포좀 조성물은 예를 들어 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린 (PC)으로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로 형성된다.
시험관내 및 생체내에서 리포솜을 세포에 도입하는 다른 방법의 예는 미국 특허 번호 5,283,185; 미국 특허 번호 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Feigner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) 인간 Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143; 및 Strauss, (1992) EMBO J. 11:417를 포함한다.
비이온성 리포좀 시스템은 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템에서 피부로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해서도 조사되었다. NOVASOMETM I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NOVASOMETM II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 사용하여 사이클로스포린-A를 마우스 피부의 진피로 전달했다. 결과는 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 사이클로스포린 A의 피부의 상이한 층으로의 침착을 촉진하는데 효과적이라는 것을 나타냈다 (Hu 등, (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).
리포솜은 또한 입체적으로 안정화된 리포솜일 수 있으며, 이러한 특수 지질이 결여된 리포솜에 비해 향상된 순환 수명을 초래하는 하나 이상의 특수 지질을 포함한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소포-형성 지질 부분의 일부가 (A) 하나 이상의 당지질, 예컨대 모노시알로강글리오시드 GM1를 포함하거나 (B) 하나 이상의 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도체화된다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린, 또는 PEG-유도체화된 지질을 함유하는 입체적으로 안정화된 리포좀에 대해, 이러한 입체적으로 안정화된 리포좀의 향상된 순환 반감기는 세망내피계 (RES)의 세포로의 흡수 감소로부터 유래한다 (Allen 등, (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu 등, (1993) Cancer Research, 53:3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포솜이 당업계에 공지되어 있다. Papahadjopoulos 등 (Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64)는 리포좀의 혈액 반감기를 개선하는 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트, 및 포스파티딜이노시톨의 능력을 보고했다. 이러한 발견은 Gabizon 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85:6949)에 의해 상세히 설명되었다. 모두 Allen 등에 의한 것인 미국 특허 번호 4,837,028 및 WO 88/04924에는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 5,543,152 (Webb 등)는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포솜은 WO 97/13499 (Lim 등)에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포솜은 세포막에 융합할 수 있다는 장점이 있다. 비양이온성 리포솜은 원형질막과 효율적으로 융합할 수는 없지만 생체 내에서 대식세포에 의해 흡수되고 대식세포에 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 사용될 수 있다.
리포솜의 추가 장점은 천연 인지질로부터 얻은 리포솜이 생체적합성 및 생분해성이며; 리포솜은 광범위한 수용성 및 지용성 약물을 통합할 수 있고; 리포좀은 내부 구획에서 캡슐화된 올리고뉴클레오티드를 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다는 점이다 (Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). 리포솜 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포솜의 수성 부피이다.
양으로 하전된 합성 양이온 지질, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)는 핵산과 자발적으로 상호작용하는 작은 리포솜을 형성하여 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 하전된 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하여 올리고뉴클레오티드를 전달한다 (예를 들어, DOTMA에 대한 설명 및 DNA와 함께 사용하는 것에 대해 Feigner, P. L. 등, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417, 및 미국 특허 번호 4,897,355 참조).
DOTMA 유사체, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판 (DOTAP)을 인지질과 함께 사용하여 DNA-복합 소낭을 형성할 수 있다. LIPOFECTINTM Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)는 복합체를 형성하기 위해 음으로 하전된 폴리뉴클레오티드와 자발적으로 상호작용하는 양으로 하전된 DOTMA 리포솜을 포함하는 살아있는 조직 배양 세포로 고도의 음이온성 핵산을 전달하기 위한 효과적인 제제이다. 충분히 양으로 하전된 리포솜이 사용되면 결과 복합체의 순전하도 양전하가 된다. 이러한 방식으로 제조된 양전하 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 자발적으로 부착하고, 원형질막과 융합하며, 예를 들어 조직 배양 세포에 기능성 핵산을 효율적으로 전달한다. 상업적으로 입수가능한 또 다른 양이온성 지질, 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판 ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)은 올레오일 모이어티가 에테르 연결보다는 에스테르에 의해 연결된다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
다른 보고된 양이온성 지질 화합물은 예를 들어 2가지 유형의 지질 중 하나에 접합된 카르복시스페르민을 비롯한 다양한 모이어티에 접합된 것들을 포함하고 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드 ("DOGS") (TRANSFECTAMTM, Promega, Madison, WI) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드 ("DPPES")와 같은 화합물을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,171,678 참조).
또 다른 양이온성 지질 접합체는 DOPE와 조합하여 리포솜으로 제형화된 콜레스테롤 ("DC-Chol")을 사용한 지질의 유도체화를 포함한다 (Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280 참조). 폴리리신을 DOPE에 접합시켜 만든 리포폴리리신은 혈청의 존재 하에서 형질감염에 효과적인 것으로 보고되었다 (Zhou, X. 등, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8). 특정 세포주의 경우, 접합된 양이온성 지질을 함유하는 이러한 리포솜은 DOTMA 함유 조성물보다 더 낮은 독성을 나타내고 더 효율적인 형질감염을 제공한다고 한다. 다른 상업적으로 입수가능한 양이온성 지질 제품은 DMRIE 및 DMRIE-HP (Vical, La Jolla, CA) 및 리포펙탄민 (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, MD)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 전달에 적합한 다른 양이온성 지질은 WO 98/39359 및 WO 96/37194에 기재되어 있다.
리포좀 제형은 국소 투여에 특히 적합하며, 리포좀은 다른 제형에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 이러한 이점에는 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 원하는 표적에서 투여된 약물의 축적 증가, 및 피부에 올리고뉴클레오티드를 투여하는 능력이 포함된다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 표피 세포에 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위해 그리고 또한 진피 조직, 예를 들어 피부로의 올리고뉴클레오티드의 침투를 향상시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 리포솜은 국소적으로 적용될 수 있다. 리포솜으로 제형화된 약물의 피부로의 국소 전달이 문서화되었다 (예를 들어, Weiner 등, (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 and du Plessis 등, (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. 등, (1987) Gene 56:267-276; Nicolau, C. 등 (1987) Meth. Enzymol. 149:157-176; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527; Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855 참조).
비이온성 리포좀 시스템은, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템에서 피부로의 약물 전달에서의 유용성을 결정하기 위해서도 조사되었다. Novasome I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 사용하여 약물을 마우스 피부의 진피로 전달했다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이러한 제형은 피부 장애를 치료하는데 유용하다.
리포좀의 표적화는 또한 예를 들어 기관-특이성, 세포-특이성, 및 소기관-특이성을 기반으로 가능하며 당업계에 공지되어 있다. 리포좀 표적 전달 시스템의 경우, 표적화 리간드를 리포좀 이중층과 안정적으로 회합시키기 위해 지질 기를 리포좀의 지질 이중층에 혼입시킬 수 있다. 지질 사슬을 표적화 리간드에 결합시키기 위해 다양한 연결기가 사용될 수 있다. 추가 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20060058255에 기재되어 있으며, 그의 연결기는 본원에 참고로 포함된다.
올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포좀은 고도로 변형가능하게 만들어질 수 있다. 이러한 변형성은 리포좀이 리포좀의 평균 반경보다 작은 기공을 통해 침투할 수 있게 한다. 예를 들어, 트랜스퍼솜은 리포솜의 또 다른 유형이며 약물 전달 비히클에 대한 매력적인 후보인 고도로 변형 가능한 지질 응집체이다. 트랜스퍼솜은 변형이 매우 커서 액적보다 작은 기공을 통해 쉽게 침투할 수 있는 지질 액적으로 설명될 수 있다. 트랜스퍼솜은 표준 리포솜 조성물에 표면 가장자리 활성제, 일반적으로 계면활성제를 첨가하여 만들 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 트랜스퍼좀은 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 피부의 케라티노사이트에 전달하기 위해 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 손상되지 않은 포유류 피부를 통과하기 위해 지질 소포는 적합한 경피 구배의 영향 하에 직경이 각각 50 nm 미만인 일련의 미세 기공을 통과해야 한다. 또한, 지질 특성으로 인해 이러한 트랜스퍼솜은 자가 최적화 (예를 들어, 피부의 모공 모양에 적응), 자가 복구가 가능하고 파편화 없이 자주 목표에 도달할 수 있으며 종종 자가 로딩이 가능하다. 트랜스퍼솜은 피부에 혈청 알부민을 전달하는 데 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 다른 제제는 2008년 1월 2일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/018,616; 2008년 1월 2일 출원된 61/018,611; 2008년 3월 26일 출원된 61/039,748; 2008년 4월 22일에 출원된 61/047,087 및 2008년 5월 8일에 출원된 61/051,528에 기재되어 있다. 2007년 10월 3일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2007/080331 또한 본 발명에 적합한 제형을 기술한다.
계면활성제는 에멀젼 (마이크로에멀젼 포함) 및 리포좀과 같은 제형에서 광범위하게 적용된다. 천연 및 합성 계면활성제의 다양한 유형의 특성을 분류하고 등급을 매기는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 균형 (HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 기 ("헤드"라고도 함)의 특성은 제형에 사용되는 다양한 계면활성제를 분류하는 가장 유용한 수단을 제공한다 (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 제약 및 화장품에 광범위하게 적용되며 광범위한 pH 값에서 사용할 수 있다. 일반적으로 HLB 값의 범위는 구조에 따라 2에서 약 18이다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르 및 에톡실화 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화 알코올, 및 에톡실화/프로폭실화 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 이 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 부류의 가장 대중적인 구성원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠는 경우, 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카복실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 알킬 설페이트 및 에톡실화 알킬 설페이트와 같은 황산의 에스테르, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트와 같은 설포네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 부류의 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠는 경우, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 염 및 에톡실화 아민을 포함한다. 4차 암모늄 염은 이 부류에서 가장 많이 사용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력이 있는 경우, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인, 및 포스파티드를 포함한다.
약물 제품, 제형 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용이 검토되었다 (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 또한 미셀 제형으로 제공될 수 있다. 미셀은 양친매성 분자가 구형 구조로 배열되어 분자의 모든 소수성 부분이 안쪽으로 향하고 친수성 부분이 주변 수성상과 접촉하도록 하는 특정 유형의 분자 어셈블리이다. 환경이 소수성인 경우 반대 배열이 존재한다.
ii. 지질 나노입자 기반 전달 방법
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 지질 제형, 예를 들어 지질 나노입자 (LNP) 또는 다른 핵산-지질 입자에 완전히 캡슐화될 수 있다. LNP는 정맥 (i.v.) 주사 후 확장된 순환 수명을 나타내고 원위 부위 (예를 들어, 투여 부위에서 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 응용에 매우 유용하다. LNP는 PCT 공개 번호 WO 00/03683에 기재된 바와 같이 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 발명의 입자는 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 전형적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 무독성이다. 또한, 본 발명의 핵산-지질 입자에 존재할 때 핵산은 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어 미국특허 번호5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; 미국 공개 번호 2010/0324120 및 PCT 공개 번호 WO 96/40964에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 지질 대 약물 비 (질량/질량 비) (예를 들어, 지질 대 올리고뉴클레오티드 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위에 있을 것이다. 상기 언급된 범위의 중간 범위도 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.
양이온성 지질의 비제한적 예는 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N--(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), N--(I-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 (DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에니예테트라하이드로-- 3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민 (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노)부타노에이트 (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-예에틸아잔디예디도데칸-2-올 (Tech G1), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 양이온성 지질은 예를 들어 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 50 mol% 또는 약 40 mol%를 포함할 수 있다.
이온성/비양이온성 지질은 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있으며, 예를 들어 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 콜레스테롤, 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비양이온성 지질은 예를 들어 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 90 mol%, 약 10 mol%이거나, 또는 콜레스테롤이 포함되는 경우 약 58 mol%일 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 공액 지질은 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질일 수 있으며, 예를 들어 PEG-디아실글리세롤 (DAG), PEG-디알킬옥시프로필 (DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드 (Cer), 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. PEG-DAA 접합체는 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필 (Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필 (Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(Ci6) 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필 (C]8)일 수 있다. 입자의 응집을 방지하는 공액 지질은 예를 들어 입자에 존재하는 전체 지질의 0 mol% 내지 약 20 mol% 또는 약 2 mol%일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 예를 들어 입자에 존재하는 총 지질의 약 10 mol% 내지 약 60 mol% 또는 약 50 mol%의 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
B. 병용 요법
본 발명의 방법은 단독으로 또는 추가 치료제, 예를 들어 동일한 장애, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍 또는 이와 관련된 증상을 치료하는 다른 제제와 조합하여, 또는 장애에 대한 다른 유형의 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 병용 치료에서, 하나 이상의 치료 화합물의 투여량은 단독으로 투여될 때 표준 투여량에서 감소될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 약물 조합 및 순열로부터 경험적으로 결정될 수 있거나 이소볼로그래픽 분석에 의해 추론될 수 있다. 조합 시 화합물의 용량은 치료 효과를 제공해야 한다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 간 손상을 늦추거나 역전시키는 약물이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 설파살라진이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아세틸시스테인이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 간이 치유되는 시간을 제공하는 관련 합병증을 제어하는 제제이다.
일부 실시양태에서, 제2 치료제는 폐기종 및/또는 COPD를 예방하거나, 늦추거나, 역전시키기 위한 약물이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항생제, 기관지확장제, 기침약, 독감 백신 및/또는 폐렴구균 백신이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 세푸록심, 세프포독심, 세프디니르, 텔리트로마이신, 독시사이클린, 또는 트리메토프림/설파메톡사졸이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 알부테롤, 레발부테롤, 또는 이프라트로피움이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 아클리디늄, 아르포르모테로, 포르모테롤, 글리코피롤레이트, 인다카테롤, 올로다테롤, 레베페나신, 살메테롤, 티오트로피움 또는 우메클리디늄이다.
제2 제제는 또한 간 손상을 예방, 서행 또는 역전시키기 위한 비약물 치료인 치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 간 기능 회복을 돕기 위해 처방된 식이 교정 및 운동 증가이다. 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 간 이식이다.
제2 제제는 또한 폐기종 및/또는 COPD를 예방, 서행 또는 역전시키기 위한 비약물 치료인 치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 생활 환경에서 폐 자극물을 제거해야 하는 생활 방식 변화이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 호흡 근육을 강화하기 위한 호흡 운동이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 산소 요법이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 일반적으로 신체를 강화하기 위해 처방된 식이 교정 및 운동 증가이다. 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 손상된 폐 조직을 제거하거나 폐 이식을 제공하기 위한 수술이다.
본원에 기재된 조합 실시양태 중 임의의 것에서, 제1 및 제2 치료제는 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 투여된다. 제1 치료제는 제2 치료제 전후 즉시, 최대 1시간, 최대 2시간, 최대 3시간, 최대 4시간, 최대 5시간, 최대 6시간, 최대 7시간, 최대 8시간, 최대 9시간, 최대 10시간, 최대 11시간, 최대 12시간, 최대 13시간, 최대 14시간, 최대 16시간, 최대 17시간, 최대 18시간, 최대 19시간 최대 20시간, 최대 21시간, 최대 22시간, 최대 23시간 최대 24시간 또는 최대 1 내지 7일, 1 내지 14일, 1 내지 21일 또는 1 내지 30일에 투여될 수 있다.
III. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물
본 발명의 방법, 즉 SERPINA1 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍 (간부전 또는 폐기종을 유발할 수 있음)과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법, 및 대상체에서 SERPINA1 관련 질환, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍을 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물은 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 또는 가이드 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA 상의 표적 아데노신, 예를 들어 이를 필요로 하는 대상체에서 치료 결과를 생성하기 위해 탈아민화될 수 있는, 예를 들어 아데노신을 탈아민화하는데 이용될 수 있다.
표적 코돈 내의 표적 아데노신의 탈아민화로 인한 변형의 예는 하기 표 1 및 2에 제공된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
아데노신에서 이노신으로의 탈아민화는 표적 위치에서 돌연변이된 A를 더 이상 겪지 않는 단백질을 초래할 수 있기 때문에, 이노신으로의 탈아민화의 확인은 기능적 판독, 예를 들어 기능성 단백질의 존재 여부 또는 아데노신의 존재로 인해 발생하는 질환이 (부분적으로) 역전되었다는 평가일 수 있다. 본원에 언급된 각각의 질환에 대한 기능적 평가는 일반적으로 당업자에게 공지된 방법에 따를 것이다. 표적 아데노신의 존재가 이상 스플라이싱을 야기할 때, 판독은 이상 스플라이싱이 여전히 발생하는지 여부 또는 적게 발생하는 지에 대한 평가일 수 있다. 다른 한편으로, 표적 아데노신의 탈아민화가 스플라이싱 부위를 도입하기를 원하는 경우, 필요한 유형의 스플라이싱이 실제로 발생하는지 여부를 확인하기 위해 유사한 접근법을 사용할 수 있다. 표적 아데노신의 탈아민화 후 이노신의 존재를 확인하는 매우 적합한 방식은 물론 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하는 RT-PCR 및 시퀀싱이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 작제물을 사용하여 역전될 수 있는 임의의 표적 RNA에서의 돌연변이는 G-to-A 돌연변이이고, 그에 따라 올리고뉴클레오티드 작제물이 설계될 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 작제물을 사용하여 표적화될 수 있는 돌연변이는 또한 아데노신 데아미나제를 동원하는 경우에 C에서 A로, U에서 A로 (DNA 수준에서 T에서 A로)를 포함한다. 후자의 상황에서 RNA 편집이 반드시 돌연변이를 야생형으로 되돌릴 수는 없지만 편집된 뉴클레오티드는 원래 돌연변이보다 개선될 수 있다. 예를 들어, 인 프레임 정지 코돈-번역 시 잘린 단백질을 발생시키는-을 유발하는 돌연변이는 해당 위치에서 원래 아미노산이 아닐 수 있지만 적어도 일부 기능성이 있는, 적어도 절단된 단백질보다 더 많은 기능성이 있는 (전체 길이) 단백질을 생성하는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변경될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 작용제
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 질환, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍 (간부전 또는 폐기종을 초래할 수 있음)과 관련된 SNP를 포함하는 표적 mRNA 서열, 예를 들어 SERPINA1에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 가이드 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 미스매치를 제외하고 표적 mRNA에 대해 상보적이다. 올리고뉴클레오티드는 표적 아데노신과 반대되는 미스매치를 포함한다.
가이드 올리고뉴클레오티드는 또한 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR) 효소를 모집하여 표적 mRNA 상의 선택된 아데노신을 탈아민화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 ADAR-모집 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단지 하나의 아데노신이 탈아민화된다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 또는 3개의 아데노신이 탈아민화된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고/시키거나 탈아민화 효율을 증가시키기 위한 변형 (예를 들어, 대체 뉴클레오티드)을 추가로 포함할 수 있다.
A. 올리고뉴클레오티드
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 자연 발생적이며, 예를 들어 당업계에 공지되고 본원에 기술된 화학적 변형 및/또는 접합을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 유익한 특성 (예를 들어, 대체 뉴클레오티드)을 향상시킨다. 임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 특정 변형이 뉴클레아제 저항성 및/또는 혈청 안정성을 증가시키거나 면역원성을 감소시킬 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA에서 자연적으로 발생하는 것으로 밝혀진 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데닌, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 또는 이노신)를 함유할 수 있거나 뉴클레오티드의 하나 이상의 성분에 대해 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드 (예를 들어, 핵염기, 당 또는 인산화 링커 모이어티)를 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포디에스테르 결합을 통해 서로 연결될 수 있거나, 포스포로티오레이트, 3'-메틸렌포스포네이트, 5'-메틸렌포스포네이트, 3'-포스포아미데이트, 2'-5' 포스포디에스테르, 구아니디늄, S-메틸티오우레아 또는 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결되도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 하기 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖는다:
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 I 중 어느 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 II 중 어느 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00011
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 III 중 어느 하나의 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 IV 중 임의의 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 V 중 어느 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00013
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 대체 뉴클레오티드인" 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전체적으로는 아니지만 대부분 변형되며 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 대체 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 포함한다:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고; m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로, 하이드록시, 또는 메톡시이고 N1은 핵염기, 또는 화학식 V의 구조이고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소이고; 화학식 I의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]은 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%는 2'-O-메틸-뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다음 구조를 포함한다:
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고, m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고; X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, X4는 2'-O-메틸뉴클레오티드 및 2'-플루오로뉴클레오티드로부터 선택되고; 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 상기 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖고, 여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고, R1은 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고, R2는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고, R3은 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고, R4는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고, R5는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이다.
일부 실시양태에서, X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; 또는 X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 하기 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 갖는다:
Figure pct00014
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 VI 중 어느 하나의 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 VII 중 어느 하나의 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 VIII 중 어느 하나의 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 IX 중 임의의 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 X 중 임의의 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 XI 중 어느 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00017
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 대체 뉴클레오티드인" 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전체적으로는 아니지만 대부분 변형되며 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 대체 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 포함한다:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고; m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 또는 화학식 IX의 구조를 갖고, 여기서 N1은 핵염기이고, 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 또는 화학식 IX의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]은 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%는 2'-O-메틸-뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기; 또는 X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 하기 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 갖는다:
Figure pct00018
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 XII 중 어느 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00019
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 화학식 XIII 중 어느 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00020
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 XIV 중 임의의 하나의 구조를 갖고, 예를 들어 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00021
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학식 XV 중 어느 하나의 구조를 갖는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 대체 뉴클레오티드인" 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전체적으로는 아니지만 대부분 변형되며 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 대체 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 포함한다:
[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고; m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소이고, 화학식 XIII의 구조를 갖지 않는 X1, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]는 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%는 2'-O-메틸-뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 아데닌 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고; X1은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 아데닌 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 구아닌 또는 하이포잔틴 핵염기를 포함하고; X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하거나; 또는 X1은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하고, X2는 사이토신, 5-메틸사이토신, 우라실, 또는 티민 핵염기를 포함하거나 핵염기를 포함하지 않고, X3은 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경 또는 표적 RNA에 영향을 미칠 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 포함한다:
[Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고, m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고; X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드이고 X4는 2'-플루오로뉴클레오티드이고; 여기서 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 혼성화될 때, X2는 이노신으로 탈아민화될 아데노신의 반대편에 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 ADAR 효소에 대한 모집 도메인 (예를 들어, ADAR 모집 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 스템-루프 구조이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 "액시머 AON" 또는 "자가 루프형 AON"으로 지칭될 수 있다. 모집 부분은 표적 서열과 표적 부분의 혼성화에 의해 형성된 dsRNA에 세포에 존재하는 천연 ADAR 효소를 모집하는 작용을 한다. 모집 부분은 천연 기질 (예를 들어, GluR2 ADAR-모집 도메인과 같은 글루타메이트 전리성 수용체 AMPA 유형 서브유닛 2 (GluR2) 수용체) 또는 ADAR 효소의 dsRNA 결합 영역 (예를 들어, Z-DNA ADAR 모집 도메인)에 인식되는 것으로 알려진 Z-DNA 구조를 모방한 스템-루프 구조일 수 있다. GluR2 및 Z-DNA ADAR 모집 도메인은 ADAR에 대한 고친화성 결합 파트너이므로 접합된 개체 또는 변형된 재조합 ADAR 효소의 존재가 필요하지 않다. 스템-루프 구조는 두 개의 분리된 핵산 가닥에 의해 형성된 분자간 스템-루프 구조 또는 단일 핵산 가닥 내에 형성된 분자내 스템 루프 구조일 수 있다. 모집 부분의 스템-루프 구조는 WO 2016/097212, US 2018/0208924, Merkle 등 Nature Biotechnology, 37: 133-8 (2019), Katrekar 등 Nature Methods, 16(3): 239-42 (2019), Fukuda 등 Scientific Reports, 7: 41478 (2017)에 기재된 스템 루프 구조일 수 있고, 이들의 ADAR 동원 부분의 스템-루프 구조는 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 ADAR-모집 도메인 (예를 들어, 1 또는 2개의 ADAR-모집 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있다. 다른 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 상기 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 ADAR-모집 도메인 및 제2 ADAR-모집 도메인을 포함한다. 제1 ADAR-모집 도메인은 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있고, 제2 ADAR-모집 도메인은 상기 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학식 XVI의 구조를 포함한다:
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
화학식 XVI,
여기서 [Am]-X1-X2-X3-[Bn]은 화학식 I 내지 XV 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드이고; C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L1은 루프 영역이고; D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L2는 선택적 링커이고; 여기서 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함하고, 여기서 듀플렉스 구조는 C의 뉴클레오티드와 D의 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 미스매치를 포함하고, 여기서 C 또는 D는 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, C 및 D는 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함한다. 다른 실시양태에서, L1은 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, L1은 연결된 뉴클레오시드로 구성된다. 일부 실시양태에서, L1은 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 또는 D는 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및 D는 각각 독립적으로 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학식 XVII의 구조를 포함한다:
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
화학식 XVII,
여기서 [Am]-X1-X2-X3-[Bn]은 화학식 I 내지 XV 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드이고; C는 길이가 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L1은 연결된 뉴클레오시드로 구성되지 않은 루프 영역이고; D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L2는 선택적 링커이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함하고, 듀플렉스 구조는 C의 뉴클레오티드와 D의 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 미스매치를 포함한다.
일부 실시양태에서, L1은 화학식 XVIII의 구조를 갖는다:
F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2
화학식 XVIII,
여기서 F1은 루프 영역과 C 사이의 결합이고; F2는 D와 [Am] 사이 또는 D와 선택적으로 링커 사이의 결합이고; G1, G2, G3 및 G4는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-C2 알킬, 임의로 치환된 C1-C3 헤테로알킬, O, S 및 NRN으로부터 선택되고; RN은 수소, 임의로 치환된 C1-4 알킬, 임의로 치환된 C2-4 알케닐, 임의로 치환된 C2-4 알키닐, 임의로 치환된 C2-6 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 C6-12 아릴, 또는임의로 치환된 C1-7 헤테로알킬이고; C1 및 C2는 각각 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 설포닐, 또는 포스포릴로부터 선택되고; j, k, m, n, p 및 q는 각각 독립적으로 0 또는 1이고; I는 임의로 치환된 C1-10 알킬, 임의로 치환된 C2-10 알케닐, 임의로 치환된 C2-10 알키닐, 임의로 치환된 C2-6 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 C6-12 아릴, 임의로 치환된 C2-C10 폴리에틸렌 글리콜, 또는 임의로 치환된 C1-10 헤테로알킬, 또는 F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q- F2를 연결하는 화학 결합이다.
일부 실시양태에서, L1은 탄수화물 함유 연결 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, C 또는 D는 각각 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및 D는 각각 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학식 XIX의 구조를 포함한다:
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
화학식 XIX,
여기서 [Am]-X1-X2-X3-[Bn]은 화학식 I 내지 XV 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드이고; C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L1은 적어도 하나의 대체 핵염기 또는 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 루프 영역이고; D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L2는 선택적 링커이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함하고, 듀플렉스 구조는 C의 뉴클레오티드와 D의 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 미스매치를 포함한다.
일부 실시양태에서, L1은 적어도 하나의 대체 핵염기 및 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화학식 XX의 구조를 포함한다:
C-L1-D-L2-[Am]-X1-X2-X3-[Bn]
화학식 XX,
여기서 [Am]-X1-X2-X3-[Bn]은 화학식 I 내지 XV 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드이고; C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L1은 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함하는 루프 영역이고, 여기서 대체 당 모이어티는 2'-O-C1-C6 알킬-당 모이어티, 2'-아미노-당 모이어티, 2'-플루오로-당 모이어티, 2'-O-MOE 당 모이어티, 아라비노 핵산 (ANA) 당 모이어티, 데옥시리보스 당 모이어티, 및 바이사이클릭 핵산으로 이루어진 군에서 선택되고; D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고; L2는 선택적 링커이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함하고, 듀플렉스 구조는 C의 뉴클레오티드와 D의 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 미스매치를 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이사이클릭 당 모이어티는 옥시-LNA 당 모이어티 ("LNA 당 모이어티"라고도 함), 티오-LNA 당 모이어티, 아미노-LNA 당 모이어티, cEt 당 모이어티, 및 에틸렌 가교 (ENA) 당 모이어티로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, ANA 당 모이어티는 2'-플루오로-ANA 당 모이어티이다.
일부 실시양태에서, C 또는 D는 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및 D는 각각 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, C는 D의 적어도 5개의 인접 핵염기에 상보적이다. 일부 실시양태에서, C의 핵염기의 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%)는 D의 핵염기에 상보적이다.
일부 실시양태에서, C는 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 및 34 중 어느 하나에 기재된 핵염기 서열에 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵염기 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, D는 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 및 35 중 어느 하나에 기재된 핵염기 서열에 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵염기 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, C-L1-D는 서열 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 및 36 중 어느 하나에 기재된 핵염기 서열에 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵염기 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 대체 핵염기는 5-메틸사이토신, 5-하이드록시사이토신, 5-메톡시사이토신, N4-메틸사이토신, N3-메틸사이토신, N4-에틸사이토신, 슈도이소사이토신, 5-플루오로사이토신, 5-브로모사이토신, 5-요오도사이토신, 5-아미노사이토신, 5-에티닐사이토신, 5-프로피닐사이토신, 피롤로사이토신, 5-아미노메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, 나프티리딘, 5-메톡시우라실, 슈도우라실, 디하이드로우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 2-티오티민, 4-티오티민, 5,6-디하이드로티민, 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 하이포잔틴, 7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자구아닌, 7-아자-2,6-디아미노퓨린, 티에노구아닌, N1-메틸구아닌, N2-메틸구아닌, 6-티오구아닌, 8-메톡시구아닌, 8-알릴옥시구아닌, 7-아미노메틸-7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 이미다조피리도피리미딘, 7-데아자아데닌, 3-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자아데닌, N1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, 7-메틸아데닌, 8-메틸아데닌, 또는 8-아지도아데닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 대체 핵염기는 2-아미노-퓨린, 2,6-디아미노-퓨린, 3-데아자-아데닌, 7-데아자-아데닌, 7-메틸-아데닌, 8-아지도-아데닌, 8-메틸-아데닌, 5-하이드록시메틸-사이토신, 5-메틸-사이토신, 피롤로-사이토신, 7-아미노메틸-7-데아자-구아닌, 7-데아자-구아닌, 7-메틸-구아닌, 8-아자-7-데아자-구아닌, 티에노-구아닌, 하이포잔틴, 4-티오-우라실, 5-메톡시-우라실, 디하이드로-우라실, 또는 슈도우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결, 2'-알콕시 뉴클레오시드간 연결, 및 알킬 포스페이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 대체 당 모이어티는 2'-O-알킬-당 모이어티, 2'-O-메틸-당 모이어티, 2'-아미노-당 모이어티, 2'-플루오로-당 모이어티, 2'-O-MOE 당 모이어티, ANA 당 모이어티 데옥시리보스 당 모이어티, 및 바이사이클릭 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이사이클릭 당 모이어티는 옥시-LNA 당 모이어티, 티오-LNA 당 모이어티, 아미노-LNA 당 모이어티, cEt 당 모이어티, 및 에틸렌-가교 (ENA) 당 모이어티로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, ANA 당 모이어티는 2'-플루오로-ANA 당 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 대체 당 모이어티는 2'-O-메틸-당 모이어티, 2'-플루오로-당 모이어티, 또는 2'-O-MOE 당 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 미스매치는 A에서 C로의 미스매치, G에서 G로의 미스매치, 또는 C에서 A로의 미스매치이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 C의 뉴클레오티드와 D의 뉴클레오티드 사이에 적어도 2개의 미스매치를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 2개의 미스매치는 적어도 3개의 연결된 뉴클레오시드에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 미스매치는 3개의 연결된 뉴클레오시드에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 미스매치는 대체 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대체 핵염기는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00022
여기서 R1은 수소, 트리플루오로메틸, 임의로 치환된 아미노, 하이드록실, 또는 임의로 치환된 C1-C6 알콕시이고; R2는 수소, 임의로 치환된 아미노, 또는 임의로 치환된 C1-C6 알킬이고; R3 및 R4는 독립적으로 수소, 할로겐, 또는 임의로 치환된 C1-C6 알킬 또는 이의 염이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 ADAR-모집 도메인을 포함하는 것들을 포함한다:
C-L1-D,
화학식 XXXIV,
여기서 C는 약 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이 (예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이)의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고, L1은 루프 영역이고, D는 약 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이 (예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이)의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, C는 2개의 가닥이 혼성화되어 적합한 조건 하에 듀플렉스를 형성하도록 D에 상보적인 영역을 포함한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 5 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이, 예를 들어, 5 내지 49개, 5 내지 45개, 5 내지 40개, 5 내지 35개, 5 내지 30개, 5 내지 25개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 5 내지 10개, 5 내지 6개, 8 내지 50개, 8 내지 45개, 8 내지 40개, 8 내지 35개, 8 내지 30개, 8 내지 25개, 8 내지 20개, 8 내지 15개, 8 내지 10개, 15 내지 50개, 15 내지 45개, 15 내지 40개, 15 내지 35개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 15 내지 20개, 15 내지 16개, 20 내지 50개, 20 내지 45개, 20 내지 40개, 20 내지 35개, 20 내지 30개, 20 내지 25개, 25 내지 50개, 25 내지 45개, 25 내지 40개, 25 내지 35개, 또는 25 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드 길이이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 발명의 일부인 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, C는 D의 적어도 5개의 연속 핵염기 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30개, 또는 그 이상의 연속 핵염기)에 상보적이며, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이 (예를 들어, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이)의 듀플렉스 구조를 형성한다.
일부 실시양태에서, 듀플렉스 구조는 C의 뉴클레오티드와 D의 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 미스매치를 포함한다 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 미스매치). 일부 실시양태에서, 미스매치는 쌍을 이룬 A에서 C로의 미스매치이다. 일부 실시양태에서, A에서 C로의 미스매치의 A 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있고 A에서 C로의 미스매치의 C 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, A에서 C로의 미스매치의 A 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있고 A에서 C로의 미스매치의 C 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있다. 다른 실시양태에서, 미스매치는 쌍을 이룬 G에서 G로의 미스매치이다. 또 다른 실시양태에서, 미스매치는 쌍을 이룬 C에서 A로의 미스매치이다. 일부 실시양태에서, C에서 A로의 미스매치의 C 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있고 C에서 A로의 미스매치의 A 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, C에서 A로의 미스매치의 C 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있고 C에서 A로의 미스매치의 A 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 쌍을 이룬 I에서 I로의 미스매치이다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 쌍을 이룬 I에서 G로의 미스매치이다. 일부 실시양태에서, I에서 G로의 미스매치의 I 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있고 I에서 G로의 미스매치의 G 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, I에서 G로의 미스매치의 I 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있고 I에서 G로의 미스매치의 G 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 쌍을 이룬 G에서 I로의 미스매치이다. 일부 실시양태에서, G에서 I로의 미스매치의 G 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있고 G에서 I로의 미스매치의 I 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, G에서 I로의 미스매치의 G 뉴클레오시드는 D 가닥 상에 있고 G에서 I로의 미스매치의 I 뉴클레오시드는 C 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 대체 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대체 핵염기는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00023
여기서 R1은 수소, 트리플루오로메틸, 임의로 치환된 아미노, 하이드록실, 또는 임의로 치환된 C1-C6 알콕시이고; R2는 수소, 임의로 치환된 아미노, 또는 임의로 치환된 C1-C6 알킬이고; R3 및 R4는 독립적으로 수소, 할로겐, 또는 임의로 치환된 C1-C6 알킬 또는 이의 염이다. 일부 실시양태에서, R1은 수소 결합 공여기 (예를 들어, 하이드록실기, 아미노기)이다. 일부 실시양태에서, R1은 수소 결합 수용기 (예를 들어, 알콕시기)이다.
일부 실시양태에서, 듀플렉스 구조는 2개의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 적어도 3개의 연결된 뉴클레오시드 떨어져 있다. 예를 들어, 미스매치가 "3개의 뉴클레오티드에 의해 분리된" 경우, 올리고뉴클레오티드는 구조 M1-N1-N2-N3-M2를 포함하며, 여기서 M1은 첫 번째 미스매치이고, N1, N2 및 N3은 쌍을 이룬 핵염기이고, M2는 두 번째 미스매치이다. 일부 실시양태에서 M1은 쌍을 이룬 A에서 C로의 미스매치이고 M2는 쌍을 이룬 G에서 G로의 미스매치이다.
일부 실시양태에서, 루프 영역 L1은 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, L1은 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
다른 실시양태에서, 루프 영역은 화학식 XVIII의 구조를 갖는다:
F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2
화학식 XVIII,
여기서 F1은 루프 영역과 C 사이의 결합이고; F2는 D와 뉴클레오티드 사이의 결합 또는 D와 임의로 링커 사이의 결합이고; G1, G2, G3 및 G4는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-C2 알킬, 임의로 치환된 C1-C3 헤테로알킬, O, S 및 NRN으로부터 선택되고; RN은 수소, 임의로 치환된 C1-4 알킬, 임의로 치환된 C2-4 알케닐, 임의로 치환된 C2-4 알키닐, 임의로 치환된 C2-6 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 C6-12 아릴, 또는 임의로 치환된 C1-7 헤테로알킬이고; C1 및 C2는 각각 독립적으로 카르보닐, 티오카르보닐, 설포닐 또는 포스포릴로부터 선택되고; j, k, m, n, p 및 q는 각각 독립적으로 0 또는 1이고; I는 임의로 치환된 C1-10 알킬, 임의로 치환된 C2-10 알케닐, 임의로 치환된 C2-10 알키닐, 임의로 치환된 C2-6 헤테로사이클릴, 임의로 치환된 C6-12 아릴, 선택적으로 치환된 C2-C10 폴리에틸렌 글리콜, 또는임의로 치환된 C1-10 헤테로알킬, 또는 F1-(G1)j-(H1)k-(G2)m-(I)-(G3)n-(H2)p-(G4)q-F2를 연결하는 화학 결합이다. 일부 실시양태에서, 링커는 선택적이다.
일부 실시양태에서, 루프 영역 L1은 탄수화물 함유 연결 모이어티를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 자연 발생적이며, 예를 들어 당업계에 공지되고 본원에 기술된 화학적 변형 및/또는 접합을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 유익한 특성 (예를 들어, 대체 뉴클레오티드)을 향상시킨다. 이론에 얽매이지 않고, 특정 변형은 뉴클레아제 저항성 및/또는 혈청 안정성을 증가시키거나 면역원성을 감소시킬 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA에서 자연적으로 발생하는 것으로 밝혀진 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데닌, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘 또는 이노신)를 함유할 수 있거나 뉴클레오티드의 하나 이상의 성분에 대해 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드 (예를 들어, 핵염기, 당 또는 포스포 링커 모이어티)를 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포디에스테르 결합을 통해 서로 연결될 수 있거나, 포스포로티오레이트, 3'-메틸렌포스포네이트, 5'-메틸렌포스포네이트, 3'-포스포아미데이트, 2'-5' 포스포디에스테르, 구아니디늄, S-메틸티오우레아 또는 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결되도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, C는 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다. 다른 실시양태에서, D는 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티. 일부 실시양태에서, C 및 D는 각각 모두 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 대체 뉴클레오티드이다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 대체 뉴클레오티드인" 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전체적으로는 아니지만 대부분 변형되며 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 대체 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 ADAR-모집 도메인을 포함하며, 여기서 C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고, L1은 루프 영역이고, D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, C는 D의 적어도 5개의 인접 핵염기에 상보적이며, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 구조는 적어도 하나의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 또는 D는 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및 D는 각각 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및/또는 D는 독립적으로 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서 L1은 연결된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, L1은 연결된 뉴클레오시드로 구성된다. 일부 실시양태에서, L1은 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 ADAR-모집 도메인을 포함하며, 여기서 C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고, L1은 연결된 뉴클레오시드로 구성되지 않은 루프 영역이고, D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, C는 D의 적어도 5개의 인접 핵염기에 상보적이며, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 구조는 적어도 하나의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, L1은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 VIII의 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, L1은 탄수화물 함유 연결 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및/또는 D는 독립적으로 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 ADAR-모집 도메인을 포함하며, 여기서 C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고, L1은 적어도 하나의 대체 핵염기 또는 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결을 포함한 루프 영역이고, D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, C는 D의 적어도 5개의 인접 핵염기에 상보적이며, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 구조는 적어도 하나의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, L1은 적어도 하나의 대체 핵염기 및 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XXXIV의 구조를 갖는 ADAR-모집 도메인을 포함하며, 여기서 C는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고, L1은 2'-O-메틸 당 모이어티가 아닌 적어도 하나의 대체 당 모이어티 (예를 들어, 대체 당 모이어티는 2'-O-C1-C6 알킬-당 모이어티, 2'-아미노-당 모이어티, 2'-플루오로-당 모이어티, 2'-O-MOE 당 모이어티, LNA 당 모이어티, 아라비노 핵산 (ANA) 당 모이어티, 2'-플루오로-ANA 당 모이어티, 데옥시리보스 당 모이어티, 및 바이사이클릭 핵산)을 포함하는 루프 영역이고, D는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, C는 D의 적어도 5개의 인접 핵염기에 상보적이며, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 50개의 연결된 뉴클레오시드 길이의 C와 D에 의해 형성된 듀플렉스 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 구조는 적어도 하나의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, C 및/또는 D는 독립적으로 적어도 하나의 대체 핵염기, 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결, 및/또는 적어도 하나의 대체 당 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, C는 서열 번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 및 34 중 어느 하나에 기재된 핵염기 서열에 대해 적어도 50%의 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%)을 갖는 핵염기 서열을 포함하고, D는 C의 핵염기 서열에 상보적인 핵염기 서열을 포함하고, 여기서 서열은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 미스매치를 포함한다. 다른 실시양태에서, D는 서열 번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 및 35 중 어느 하나에 기재된 핵염기 서열에 대해 적어도 50% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 핵염기 서열을 포함하고, C는 C의 핵염기 서열에 상보적인 핵염기 서열을 포함하고, 여기서 서열은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 미스매치를 포함한다. 일부 실시양태에서, C-L1-D는 서열 번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 및 36중 어느 하나에 기재된 핵염기 서열에 대해 적어도 50%의 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 핵염기 서열을 포함하고, 여기서 서열은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 미스매치를 포함한다.
서열 번호 1 내지 36의 핵염기 서열이 표 3에 제공된다:
Figure pct00024
Figure pct00025
서열 번호 1 내지 36의 서열이 변형되지 않고/거나 접합되지 않은 서열로 기재되어 있지만, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 RNA는 대체 뉴클레오시드 및/또는 하기에 상세히 기술된 바와 같이 접합된 서열 번호 1 내지 36에 제시된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5' 캡 구조를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' 캡 구조는 2,2,7-트리메틸구아노신 캡이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 Biosearch, Applied Biosystems, Inc.에서 상업적으로 시판되는 것과 같이, 예를 들어 자동화된 DNA 합성기를 사용함으로써 하기에 추가로 논의하는 바와 같이 당업계에 알려진 표준 방법에 의해 합성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 화합물은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 대체 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 쉽게 제조할 수 있다는 이점을 제공한다. 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조될 수 있다.
또한, 본원에서 확인된 임의의 서열에 대해, 더 길거나 더 짧은 서열을 생성하기 위해 연결된 뉴클레오시드를 체계적으로 추가하거나 제거함으로써 추가 최적화가 달성될 수 있음이 고려된다. 또한, 이러한 최적화된 서열은 예를 들어, 분자를 추가로 최적화 (예를 들어, 혈청 안정성 또는 순환 반감기 증가, 열 안정성 증가, 막횡단 전달 향상, 특정 위치 또는 세포 유형에 대한 표적화, 및/또는 RNA 편집 효소 (예를 들어, ADAR)와의 상호작용 증가)하기 위해 당업계에 공지되고/되거나 본원에서 논의되는 대체 뉴클레오시드, 대체 당 모이어티, 및/또는 대체 뉴클레오시드간 연결 및/또는 을 포함한, 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 대체 뉴클레오시드, 대체 당 모이어티, 및/또는 대체 뉴클레오시드간 연결의 도입에 의해 조절될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 ADAR-모집 도메인은 GluR2 ADAR-모집 도메인이다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 37의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGUGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCACC
(서열 번호 37)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXI의 구조를 포함한다:
Figure pct00026
화학식 XXI,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 38의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGUGAAGAGGAGAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUCUCGUCUCCACC
(서열 번호 38)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXII의 구조를 포함한다:
Figure pct00027
화학식 XXII,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 39의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGUGUCGAGAAGAGGAGAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUCUCGUCUCCUCGACACC
(서열 번호 39)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXIII의 구조를 포함한다:
Figure pct00028
화학식 XXIII,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 40의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
*s*s*G**GAGAAGAGGAGAA*AA*A*G**AAA*G**G*****G*******GA*A** (서열 번호 40)
여기서 *는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이고 s는 2개의 연결된 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXIV의 구조를 포함한다:
Figure pct00029
화학식 XXIV,
여기서 [ASO]는 본원에 제시된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 하나를 포함하고, 여기서 *는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이고, 여기서 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, 여기서 m은 미스매치 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-O-메틸 뉴클레오티드)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결)을 포함한다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 41의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGGUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCACCU
(서열 번호 41)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXV의 구조를 포함한다:
Figure pct00030
화학식 XXV,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 42의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCAC
(서열 번호 42)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXVI의 구조를 포함한다:
Figure pct00031
화학식 XXVI,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 43의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGUGUCGAGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCUCGACACC
(서열 번호 43)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXVII의 구조를 포함한다:
Figure pct00032
화학식 XVII,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 44의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGGUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCACCU
(서열 번호 44)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXVIII의 구조를 포함한다:
Figure pct00033
화학식 XXVIII,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 45의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGGUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCACCU (서열 번호 45)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXIX의 구조를 포함한다:
Figure pct00034
화학식 XXIX,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 46의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GUGGGUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCACCUAC
(서열 번호 46)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXX의 구조를 포함한다:
Figure pct00035
화학식 XXX,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 47의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
UGGGUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCACCUA
(서열 번호 47)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXXI의 구조를 포함한다:
Figure pct00036
화학식 XXXI,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 48의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GGUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCACC
(서열 번호 48)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXXII의 구조를 포함한다:
Figure pct00037
화학식 XXXII,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, GluR2 ADAR-모집 도메인은 5'에서 3' 방향으로 아래에 나타낸 바와 같이 서열 번호 49의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
GUGGAAUAGUAUACCAUUCGUGGUAUAGUAUCCCAC (서열 번호 49)
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같은 화학식 XXXIII의 구조를 포함한다:
Figure pct00038
화학식 XXXIII,
여기서 [ASO]는 본 발명의 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 m은 미스매치된 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 Z-DNA ADAR-모집 도메인이다. 일부 실시양태에서, ADAR-모집 도메인은 MS2 ADAR-모집 도메인이다. 일부 실시양태에서, MS2 박테리오파지 스템-루프 구조는 ADAR-모집 도메인 (예를 들어, 및 MS2 ADAR-모집 도메인)으로 사용될 수 있다. MS2 스템 루프는 ADAR의 데아미나제 도메인 (예를 들어, ADAR 융합 단백질)에 융합될 때 표적 특이적 탈아민화에 사용될 수 있는 MS2 박테리오파지 코트 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 일부 실시양태에서, MS2 ADAR-모집 도메인은 아래와 같이 5'에서 3' 방향으로 서열 번호 50의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
ACATGAGGATCACCCATGT (서열 번호 50)
일부 실시양태에서, ADAR 융합 단백질은 ADAR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 작제물을 사용하여 세포 또는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, ADAR 융합 단백질은 MS2 박테리오파지 코트 단백질에 융합된 ADAR의 데아미나제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADAR의 데아미나제 도메인은 ADAR1의 데아미나제 도메인이다. 일부 실시양태에서, ADAR의 데아미나제 도메인은 ADAR2의 데아미나제 도메인이다. ADAR 융합 단백질은 Katrekar 등 Nature Methods, 16(3): 239-42 (2019)에 기재된 융합 단백질일 수 있으며, 이의 ADAR 융합 단백질은 본원에 참조로 포함된다
본 발명에서 특징으로 하는 핵산은 "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S. L. 등 (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA, 에 기재된 것들과 같이 당업계에 잘 확립된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 대체 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 예를 들어 말단 변형, 예를 들어 5'-말단 변형 (인산화, 접합, 역 연결) 또는 3'-말단 변형 (접합, DNA 뉴클레오티드, 역 연결 등); 염기 변형, 예를 들어 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 이루는 염기로의 교체, 염기의 제거 (무염기성 뉴클레오티드), 또는 접합된 염기; 당 변형 (예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 및/또는 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 대체를 포함하는 백본 변형을 포함한 변형을 갖는 것들을 포함한다. 핵염기는 또한 핵염기가 당 모이어티의 C1 위치에서 다른 위치 (예를 들어, C2, C3, C4 또는 C5)로 이동되는 이소뉴클레오시드일 수 있다. 본원에 기술된 실시양태에서 유용한 올리고뉴클레오티드 화합물의 특정 예는 변형된 백본을 함유하거나 천연 뉴클레오시드간 연결을 포함하지 않는 대체 뉴클레오시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 백본을 갖는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드는 무엇보다도 백본에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 당업계에서 때때로 언급되는 바와 같이, 그들의 뉴클레오시드 백본에 인 원자를 갖지 않는 대체 RNA 또한 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 백본에 인 원자를 가질 것이다.
대체 뉴클레오시드간 연결은 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보로노포스페이트, 이들의 2'-5'-연결 유사체, 및 인접한 뉴클레오시드 단위 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전 극성을 갖는 것을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염, 및 유리산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6,239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; 및 미국 특허 RE39464를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 대안적인 뉴클레오시드간 연결은 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성되는 백본을 갖는다. 여기에는 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분에서 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 기타를 갖는 것들이 포함된다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및, 5,677,439을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시양태에서, 적합한 올리고뉴클레오티드는 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉 뉴클레오티드 단위의 백본 둘 다 대체된 것을 포함한다. 기본 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 모방체인 이러한 올리고머 화합물 중 하나는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서 뉴클레오시드의 당은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 유지되고 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 사용하기에 적합한 추가적인 PNA 화합물은 예를 들어 Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497-1500에 기술되어 있다.
본 발명에서 특정된 일부 실시양태는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드, 특히상기 참조된 미국 특허 5,489,677의 -CH2-NH-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려짐], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -N(CH3)-CH2-CH2- [여기서 천연 포스포디에스테르 골격은 -O-P-O-CH2-로 표현] 및 상기 참조된 미국 특허 번호 5,602,240의 아미드 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드는 상기 참조된 미국 특허 번호 5,034,506의 모르폴리노 백본 구조를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보스 모이어티가 모르폴린 고리로 대체되고, Summerton, 등, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997, 7:63-70에 기재된 바와 같이 하전된 포스포다이에스테르 서브유닛 간 연결이 하전되지 않은 포포로디아미데이트 연결로 대체된, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다.
대체 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본원에서 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 2'-위치에서 다음 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 -O[(CH2)nO]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)n-ONH2, 및 -O(CH2)n-ON[(CH2)nCH3]2를 포함하고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터칼레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기. 일부 실시양태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-O-MOE로도 알려진 2'-O-CH2CH2OCH3), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다 (Martin 등, Helv. Chin. Acta, 1995, 78:486-504). 2'-O-MOE 뉴클레오시드는 비변형 올리고뉴클레오티드에 비해 증가된 뉴클레아제 저항성, 개선된 약동학 특성, 감소된 비특이적 단백질 결합, 감소된 독성, 감소된 면역자극 특성, 및 향상된 표적 친화성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 올리고뉴클레오티드에 몇 가지 유익한 특성을 부여한다.
또 다른 예시적인 대안은 하기 실시예에 기재된 바와 같은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진 -O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에서는 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE 로도 알려짐), 즉 2'-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N(CH3)2를 함유한다. 추가의 예시적인 대안은 다음을 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오티드 (이 세 패밀리의 R 및 S 이성질체 모두); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA (N-메틸아세트아미드).
다른 대안은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'- OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서도 유사한 변형이 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 그러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 전술한 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (종종 당업계에서 간단히 "염기"라고 함) 대체 (예를 들어, 변형 또는 치환)를 포함할 수 있다. 비변형 또는 천연 핵염기에는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 사이토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 대체 핵염기는 5-메틸사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, 5-포르밀사이토신, 5-카르복시사이토신, 피롤로사이토신, 디데옥시사이토신, 우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시데옥시우라실, 디하이드로우라실, 4-티오우라실, 슈도우라실, 1-메틸 슈도우라실, 데옥시우라실, 5-하이드록시부티닐-2'-데옥시우라실, 잔틴, 하이포잔틴, 7-데아자-잔틴, 티에노구아닌, 8-아자-7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 7-데아자구아닌, 6-아미노메틸-7-데아자구아닌, 8-아미노구아닌, 2,2,7-트리메틸구아닌, 8-메틸아데닌, 8-아지도아데닌, 7-메틸아데닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자 -아데닌, 8-아미노-아데닌, 티민, 디데옥시티민, 5-니트로인돌, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2 -티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실아날 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5 -치환된 우라실 및 사이토신, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 및 3-데아자구아닌을 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808에 개시된 것, Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008에 개시된 것; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것, Englisch 등, (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613에 의해 개시된 것, 및Sanghvi, Y S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993에 개시된 것들을 포함한다. 이들 핵염기 중 특정의 것은 본 발명에서 특징으로 하는 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 여기에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린이 포함된다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 나타났으며 (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때 예시적인 염기 치환이다.
상기 언급된 특정 대체 핵염기 뿐만 아니라 다른 대체 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 상기 언급된 미국 특허 번호 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시양태에서, 뉴클레오티드의 당 모이어티는 임의로 2'-O-메틸, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-아미노, 2'-O -프로필, 2'-아미노프로필 또는 2'-OH 변형을 가진 리보스 분자일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바이사이클릭 당 모이어티를 포함할 수 있다. "바이사이클릭 당"은 두 원자의 가교에 의해 변형된 푸라노실 고리이다. "바이사이클릭 뉴클레오시드" ("BNA")는 당 고리의 2개의 탄소 원자를 연결하는 다리를 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드로서, 바이사이클릭 고리 시스템을 형성한다. 특정 실시양태에서, 다리는 당 고리의 4'-탄소와 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명의 작용제는 하나 이상의 잠긴 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 잠긴 뉴클레오시드는 리보스 모이어티가 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 다리를 포함하는 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오시드이다. 즉, 잠긴 뉴클레오시드는 4'-CH2-O-2' 다리를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드이다. 이 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 "잠근다". 올리고뉴클레오티드에 잠긴 뉴클레오시드의 첨가는 혈청에서 올리고뉴클레오티드 안정성을 증가시키고 비표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다 (Grunweller, A. 등, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이의 다리를 포함하는 뉴클레오시드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작용제는 4'에서 2' 다리를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 4'에서 2'로 가교된 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' ("구속된 에틸" 또는 "cEt"라고도 함) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 번호 7,399,845 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 번호 8,278,283 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 번호 8,278,425 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)2-2' (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0171570 참조); 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기서 R은 H, C1-C12 알킬 또는 보호기임 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,427,672 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (예를 들어, Chattopadhyaya 등, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참조); 및4'-CH2-C(=CH2)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어 미국 특허 번호 8,278,426 참조)를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 전술한 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
잠긴 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공보에는 다음이 포함되나 이에 제한되지 않는다: 미국 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133; 7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; 및 US 2009/0012281, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스 (WO 99/14226 참조)를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 구성을 갖는 임의의 전술한 바이사이클릭 뉴클레오시드를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 구속된 에틸 뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "구속된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 잠긴 핵산이다. 한 실시양태에서, 구속된 에틸 뉴클레오티드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 "형태적으로 제한된 뉴클레오티드" ("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 -C5' 탄소를 연결하는 링커가 있는 뉴클레오티드 유사체이다. CRN은 리보스 고리를 안정적인 형태로 고정하고 mRNA에 대한 혼성화 친화도를 증가시킨다. 링커는 안정성과 친화력을 위한 최적의 위치에 산소를 배치하기에 충분한 길이이므로 리보스 링 주름이 덜 생긴다.
상기 언급된 특정 CRN의 제조를 교시하는 대표적인 간행물은 미국 특허 공개 번호 2013/0190383; 및 PCT 공개 WO 2013/036868을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 UNA (잠금 해제된 핵산) 뉴클레오티드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 잠금 해제된 비-사이클릭 핵산으로, 임의의 당 결합이 제거되어 잠금 해제된 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합이 제거된 (즉, C1' 및 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합) 단량체를 포함한다. 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합 (즉, C2' 및 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다 (본원에 참조로 포함되는 Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) 및 Fluiter 등, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참조).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 간행물에는 미국 특허 번호 8,314,227; 및 미국 특허 공개 번호 2013/0096289; 2013/0011922; 및 2011/0313020를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
리보스 분자는 또한 사이클로프로판 고리로 변형되어 트리사이클로데옥시핵산 (트리사이클로 DNA)을 생성할 수 있다. 리보스 모이어티는 1,5-안하이드로헥시톨, 트레오스 뉴클레오시드 (TNA)를 생성하는 트레오스, 또는 아라비노 뉴클레오시드를 생성하는 아라비노스와 같은 다른 당으로 대체될 수 있다. 리보스 분자는 또한 사이클로헥센 뉴클레오시드를 생성하는 사이클로헥센 또는 글리콜 뉴클레오시드를 생성하는 글리콜과 같은 비-당으로 대체될 수 있다.
리보스 분자는 또한 사이클로헥센 핵산 (CeNA)을 생성하는 사이클로헥센 또는 글리콜 핵산 (GNA)을 생성하는 글리콜과 같은 비-당으로 대체될 수 있다. 뉴클레오티드 분자의 말단에 대한 잠재적인 안정화 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘 (에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3''-포스페이트, 반전 염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 이 변경의 개시는 PCT 공개 번호 WO 2011/005861에서 찾을 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 대체 화학은 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모방체는 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2012/0157511에 개시되어 있으며, 이는 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드는 당 변형 뉴클레오시드를 포함하고 또한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당 변형 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 대체 뉴클레오시드를 혼입하면 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 향상시킬 수 있다. 그러한 경우에, 대체 뉴클레오시드는 친화도 향상 대체 뉴클레오티드로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 대체 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개 또는 적어도 16개의 대체 뉴클레오시드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10개의 대체 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 9개의 대체 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 8개의 대체 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 7개의 대체 뉴클레오시드, 예컨대 6 또는 7개의 대체 뉴클레오시드를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이들 3가지 유형의 대체 (대체 당 모이어티, 대체 핵염기 및 대체 뉴클레오시드간 연결) 또는 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택되는 대체물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 대체 당 모이어티, 예를 들어 2' 당 대체 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, ANA, 2'-플루오로-ANA, 및 BNA (예를 들어, LNA) 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 2' 당 대체 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 대체 뉴클레오시드는 BNA이다.
일부 실시양태에서, 대체 뉴클레오시드 중 적어도 1개는 BNA (예를 들어, LNA), 예를 들어 대체 뉴클레오시드 중 적어도 2개, 예를 들어 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개는 BNA이다. 또 다른 실시양태에서, 모든 대체 뉴클레오시드는 BNA이다.
추가 실시양태에서 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연속 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 또는 보로노포스페이트 뉴클레오시드간 연결이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 연속 서열 내의 모든 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서 포스포로티오에이트 연결은 입체화학적으로 순수한 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 연결은 Sp 포스포로티오에이트 연결이다. 다른 실시양태에서, 포스포로티오에이트 연결은 Rp 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 2'-O-MOE-RNA 뉴클레오시드 단위와 같은 2'-O-MOE-RNA인 적어도 하나의 대체 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-O-MOE-RNA 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 대체 뉴클레오시드 중 적어도 하나는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 2'-플루오로-DNA 뉴클레오시드 단위와 같은 2'-플루오로 DNA이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 BNA 단위 및 적어도 하나의 2' 치환된 대체 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 단위 모두를 포함한다.
B. 리간드에 접합된 올리고뉴클레오티드
본 발명의 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 모이어티에는 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger 등, (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6553-6556), 콜산 (Manoharan 등, (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어 베릴-S-트리틸티올 (Manoharan 등, (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309; Manoharan 등, (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3:2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser 등, (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras 등, (1991) EMBO J, 10:1111-1118; Kabanov 등, (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk 등, (1993) Biochimie, 75:49-54), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트 (Manoharan 등, (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea 등, (1990) Nucl. Acids Res., 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan 등, (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan 등, (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티 (Mishra 등, (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke 등, (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937)와 같은 지질 모이어티가 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다.
한 실시양태에서, 리간드는 그것이 혼입되는 올리고뉴클레오티드 작용제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 예를 들어, 그러한 리간드가 없는 종에 비해, 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 증가된 친화도를 제공한다.
리간드는 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지단백질 (LDL), 또는 글로불린); 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 또는 히알루론산); 또는 지질과 같은 자연 발생 물질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리아미노산이 폴리리신 (PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜화) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리리신 (PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온 이온화 지질, 양이온 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선형 펩티드를 포함한다.
리간드는 또한 표적화 기, 예를 들어 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어 항체를 포함할 수 있다. 표적화 기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-굴루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 엽산, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴, 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘), 가교제 (예를 들어, 솔라렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 (예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1, 3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩티드 접합체 (예를 들어, 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지 마커, 효소, 합텐 (예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들어 공동 리간드에 대해 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어 간 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-굴루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스와 같은 비-펩티드 종을 포함할 수 있다.
리간드는 물질, 예를 들어 세포의 세포골격을 파괴함으로써, 예를 들어 세포의 미세소관, 미세필라멘트, 및/또는 중간 필라멘트를 파괴함으로써 올리고뉴클레오티드 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은 예를 들어 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀라이드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀라이드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드에 부착된 리간드는 약동학적 조절자 (PK 조절자)로서 작용한다. PK 조절제는 친유성 물질, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함한다. 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으므로, 백본에서 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는, 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오티드는 또한 리간드 (예를 들어, PK 조절 리간드)로서 본 발명에 적합하다. 또한, 혈청 성분 (예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머는 또한 본원에 기술된 실시양태에서 PK 조정 리간드로서 사용하기에 적합하다.
본 발명의 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 대한 연결 분자의 부착으로부터 유도된 것과 같은 펜던트 반응성 작용기를 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 합성될 수 있다 (하기 기술됨). 이 반응성 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 이용 가능한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 보유하는 합성된 리간드, 또는 연결 모이어티가 부착된 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고상 합성 기술을 통해 편리하고 일상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들어 Applied Biosystems (Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇 판매자에 의해 판매된다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것 또한 알려져 있다.
본 발명의 리간드-접합된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 서열-특이적 연결된 뉴클레오시드를 보유하는 리간드-분자에서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체, 또는 이미 연결 모이어티를 보유하고 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 접합체 전구체, 리간드 분자를 이미 보유하고 있는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-접합체 전구체, 또는 비-뉴클레오시드 리간드 보유 빌딩 블록을 이용하여 적합한 DNA 합성기에서 조립될 수 있다.
이미 연결 모이어티를 보유하고 있는 뉴클레오티드-접합 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 연결된 뉴클레오시드의 합성이 일반적으로 완료되고, 리간드 분자가 연결 모이어티와 반응하여 리간드-접합 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 연결된 뉴클레오시드는 시판되고 올리고뉴클레오티드 합성에 일상적으로 사용되는 표준 포스포르아미다이트 및 비표준 포스포르아미다이트에 더하여 리간드-뉴클레오시드 접합체로부터 유래된 포스포르아미다이트를 사용하여 자동 합성기에 의해 합성된다.
i. 지질 접합체
한 실시양태에서, 리간드 또는 접합체는 지질 또는 지질계 분자이다. 이러한 지질 또는 지질계 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어 신체의 비-신장 표적 조직에 대한 접합체의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자도 리간드로 사용할 수 있다. 예를 들어, 네프록신 또는 아스피린을 사용할 수 있다. 지질 또는 지질계 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 저항성을 증가시킬 수 있고, (b) 표적화 또는 표적 세포 또는 세포막으로의 수송을 증가시킬 수 있고/있거나 (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 대한 결합을 조정하는 데 사용될 수 있다.
지질계 리간드는 표적 조직에 대한 접합체의 결합을 억제, 예를 들어 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장을 표적으로 삼을 가능성이 적고 따라서 신체에서 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강력하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드를 사용하여 접합체를 신장에 표적화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 리간드는 표적 세포, 예를 들어 증식 세포에 의해 흡수되는 모이어티, 예를 들어 비타민이다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다.
ii. 세포 투과제
또 다른 측면에서, 리간드는 세포 투과제, 바람직하게는 나선형 세포 투과제이다. 바람직하게는 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 타트 또는 안테노페디아와 같은 펩티드이다. 제제가 펩티드인 경우, 펩티딜 모방체, 반전체, 비-펩티드 또는 슈도펩티드 연결, 및 D-아미노산 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 나선형 제제는 바람직하게는 친유성 및 소유성 상을 갖는 알파-나선형 제제인 것이 바람직하다.
리간드는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 펩티도미메틱 (본원에서 올리고펩티도미메틱이라고도 함)는 천연 펩티드와 유사한 정의된 3차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. 올리고뉴클레오티드 제제에 대한 펩티드 및 펩티도미메틱의 부착은 예를 들어 세포 인식 및 흡수를 향상시킴으로써 올리고뉴클레오티드의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티도 모방 모이어티는 약 5 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다.
펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어 세포 투과 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드 또는 소수성 펩티드 (예를 들어, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속된 펩티드 또는 가교결합 펩티드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열 (MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP (서열 번호 87)을 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체 (예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP (서열 번호 88)는 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩티드 모이어티는 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 세포막을 가로지르는 단백질을 포함한 거대 극성 분자를 수송할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질 (GRKKRRQRRRPPQ; 서열 번호 89) 및 Drosophila Antennapedia 단백질 (RQIKIWFQNRRMKWKK; 서열 번호 90)의 서열은 전달 펩티드로 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 파지 디스플레이 라이브러리 또는 OBOC (one-bead-one-compound) 조합 라이브러리 (Lam 등, Nature, 354:82-84, 1991)에서 식별된 펩티드와 같은 DNA의 무작위 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 세포 표적화 목적을 위해 통합된 단량체 단위를 통해 올리고뉴클레오티드 작용제에 속박된 펩티드 또는 펩티도미메틱의 예는 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD)-펩티드 또는 RGD 모방체이다. 펩티드 모이어티의 길이는 약 5개의 아미노 아미노산 내지 약 40개의 아미노산의 범위일 수 있다. 펩티드 모이어티는 안정성을 증가시키거나 구조적 특성을 지시하는 것과 같은 구조적 변형을 가질 수 있다. 아래에 설명된 모든 구조적 변형을 활용할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RGD 펩티드는 선형 또는 고리형일 수 있고, 특정 조직(들)에 대한 표적화를 용이하게 하기 위해 변형, 예를 들어 글리코실화 또는 메틸화될 수 있다. RGD 함유 펩티드 및 펩티도미메틱은 합성 RGD 모방체뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD 외에도 인테그린 리간드를 표적으로 하는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 이 리간드의 일부 접합체는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적으로 한다.
세포 침투 펩티드는 세포, 예를 들어 박테리아 또는 진균 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포에 침투할 수 있다. 미생물 세포 투과 펩티드는 예를 들어 α-나선형 선형 펩티드 (예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1), 이황화 결합 함유 펩티드 (예를 들어, α-데펜신, β-데펜신, 또는 박테네신), 또는 1개 또는 2개의 지배적인 아미노산 (예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)만 포함하는 펩티드일 수 있다. 세포 투과 펩티드는 또한 핵 위치 신호 (NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩티드는 HIV-1 gp41의 융합 펩티드 도메인과 SV40 거대 T 항원의 NLS로부터 유도된 MPG와 같은 이분 양친매성 펩티드일 수 있다 (Simeoni 등, Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
iii. 탄수화물 접합체
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 탄수화물을 추가로 포함한다. 탄수화물 접합된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 핵산의 생체내 전달 뿐만 아니라 생체내 치료 용도에 적합한 조성물에 유리하다. 본원에 사용된 바와 같이, "탄수화물"은 각 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자 (선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 그 자체인 화합물; 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자 (선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있음)를 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 모이어티를 그의 일부로서 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물은 당 (약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 단위를 함유하는 단당류, 이당류, 삼당류, 및 올리고당류), 및 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검과 같은 다당류를 포함한다. 특정 단당류는 C5 이상 (예를 들어, C5, C6, C7 또는 C8) 당을 포함하고; 이당류 및 삼당류는 2개 또는 3개의 단당류 단위 (예를 들어, C5, C6, C7 또는 C8)를 갖는 당을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 접합체는 단당류이다.
일부 실시양태에서, 탄수화물 접합체는 PK 조절제 및/또는 세포 투과 펩티드와 같으나 이에 제한되지 않는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 리간드를 추가로 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가적인 탄수화물 접합체 (및 링커)는 PCT 공개 번호 WO 2014/179620 및 WO 2014/179627에 기술된 것을 포함하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
iv. 링커
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 접합체 또는 리간드는 절단가능하거나 절단 불가능할 수 있는 다양한 링커로 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
링커는 전형적으로 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH와 같은 단위, 또는 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤레로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤레로아릴과 같으나 이에 제한되지 않는 원자 사슬을 포함하고, 이들 중 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭; 여기서 R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 한 실시양태에서, 링커는 약 1 내지 24개 원자, 2 내지 24개, 3 내지 24개, 4 내지 24개, 5 내지 24개, 6 내지 24개, 6 내지 18개, 7 내지 18개, 8 내지 18개 원자, 7 내지 17개, 8 내지 17개, 6 내지 16개, 7 내지 17개, 또는 8 내지 16개 원자 사이에 있다.
절단가능 연결기는 세포 외부에서 충분히 안정하지만 표적 세포에 들어갈 때 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 두 부분을 해제하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 절단가능 연결기는 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건 (예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음)에서 보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건 하 (예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음)에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상, 또는 적어도 약 100배 빠르게 절단된다.
절단가능 연결기는 절단제, 예를 들어 pH, 산화환원 전위, 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로 절단제는 혈청이나 혈액보다 세포 내부에서 더 널리 퍼져 있거나 더 높은 수준이나 활동에서 발견된다. 그러한 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택적이거나 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제, 예를 들어 산화 또는 환원 효소 또는 세포에 존재하며, 산화환원 절단가능 연결기를 환원에 의해 분해할 수 있는 환원제, 예컨대 머캅탄; 에스테라아제; 산성 환경을 생성할 수 있는 엔도좀 또는 작용제, 예를 들어 pH가 5 이하가 되는 것들; 일반적인 산, 펩티다아제 (기질 특이적일 수 있음) 및 포스파타제로 작용하여 산 절단가능 연결기를 가수분해하거나 분해할 수 있는 효소.
디설파이드 결합과 같은 절단가능 연결기는 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면 평균 세포내 pH는 약 7.1 내지 7.3 범위로 약간 더 낮다. 엔도좀은 5.5 내지 6.0 범위의 보다 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 훨씬 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단가능 연결기를 가지므로 세포 내부의 리간드에서, 또는 세포의 원하는 구획으로 양이온성 지질을 방출한다.
링커는 특정 효소에 의해 절단가능한 절단가능 연결기를 포함할 수 있다. 링커에 혼입된 절단가능 연결기의 유형은 표적이 되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 간-표적화 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라제가 풍부하므로 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형보다 간 세포에서 더 효율적으로 절단된다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형에는 폐, 신장 피질, 및 고환의 세포가 포함된다.
펩티드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 윤활막 세포와 같은 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적화할 때 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능 연결기의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해제 (또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단가능 연결기를 테스트하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 제1 조건과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적 민감성을 결정할 수 있는데, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서의 절단을 나타내도록 선택되고 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액 또는 혈청에서의 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양, 장기 또는 조직 배양, 또는 전체 동물에서 수행할 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가 평가를 통해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)과 비교하여 세포 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 빠르게 절단된다.
a. 산화 환원 절단가능 연결기
한 실시양태에서, 절단가능 연결기는 환원 또는 산화시 절단되는 산화환원 절단가능 연결기이다. 환원적으로 절단가능 연결기의 예는 디설파이드 연결기 (--S--S--)이다. 후보 절단가능 연결기가 적합한 "환원적으로 절단가능 연결기"인지, 또는 예를 들어 특정 올리고뉴클레오티드 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지를 결정하기 위해 본원에 기재된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보물은 디티오트레이톨 (DTT), 또는 세포, 예를 들어 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당업계에 공지된 시약을 사용하는 다른 환원제와의 배양에 의해 평가될 수 있다. 후보물은 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 약 10%까지 절단된다. 다른 실시양태에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)과 비교하여 세포 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 빠르게 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 매질을 모방하도록 선택된 조건 하에서 그리고 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
b. 포스페이트계 절단가능 연결기
다른 실시양태에서, 절단가능한 링커는 포스페이트계 절단가능 연결기를 포함한다. 포스페이트계 절단가능 연결기는 포스페이트기를 분해하거나 가수분해하는 작용제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트기를 절단하는 작용제의 예는 세포에서 포스파타아제와 같은 효소이다. 포스페이트계 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-이다. 이러한 후보물은 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
c. 산성 절단가능 연결기
다른 실시양태에서, 절단가능한 링커는 산성 절단가능 연결기를 포함한다. 산성 절단가능 연결기는 산성 조건에서 절단되는 연결기이다. 바람직한 실시양태에서, 산성 절단가능 연결기는 pH가 약 6.5 이하 (예를 들어, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)인 산성 환경에서, 또는 일반 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의해 절단된다. 세포에서 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 소기관은 산성 절단가능 연결기를 위한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산성 절단가능 연결기의 예는 히드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산성 절단가능한 기는 일반 화학식 -C=NN--, C(O)O 또는 --OC(O)를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태는 에스테르 (알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기, 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 3차 알킬기인 경우이다. 이러한 후보물은 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
d. 에스테르계 연결기
또 다른 실시양태에서, 절단가능한 링커는 에스테르계 절단가능 연결기를 포함한다. 에스테르계 절단가능 연결기는 세포에서 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르계 절단가능 연결기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단가능 연결기는 일반 화학식 --C(O)O-- 또는 --OC(O)--를 갖는다. 이러한 후보물은 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
e. 펩티드계 절단 기
또 다른 실시양태에서, 절단가능한 링커는 펩티드계 절단가능 연결기를 포함한다. 펩티드계 절단가능 연결기는 세포에서 펩티다아제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩티드계 절단가능 연결기는 올리고펩티드 (예를 들어, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 산출하기 위해 아미노산 사이에 형성된 펩티드 결합이다. 펩티드계 절단가능한 기는 아미드기 (--C(O)NH--)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 펩티드와 단백질을 생성하기 위해 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이다. 펩티드계 절단기는 일반적으로 펩티드와 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩티드 결합 (즉, 아미드 결합)으로 제한되며 모든 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩티드계 절단가능 연결기는 일반 화학식 -- NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)--를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R기이다. 이러한 후보물은 위에서 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 링커를 통해 탄수화물에 접합된다. 링커에는 2가 및 3가 분지형 링커기가 포함된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커를 갖는 예시적인 올리고뉴클레오티드 탄수화물 접합체는 PCT 공개 번호 WO 2018/195165의 화학식 24 내지 35에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
특정 예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드는 비-리간드기에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자가 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 올리고뉴클레오티드에 접합되었으며, 이러한 접합을 수행하는 절차는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 콜레스테롤 (Kubo, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm, 2007, 365(1):54-61; Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산 (Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티 (Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)와 같은 지질 모이어티를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 위에 나열되어 있다. 전형적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에 아미노 링커를 보유하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함한다. 그런 다음 아미노기는 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 접합되는 분자와 반응한다. 접합 반응은 여전히 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드와 함께 또는 용액상으로 올리고뉴클레오티드의 절단 후에 수행될 수 있다. HPLC에 의한 올리고뉴클레오티드 접합체의 정제는 전형적으로 순수한 접합체를 제공한다.
IV. 제약 조성물
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물 및 제형을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 가이드 올리고뉴클레오티드 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 제약 조성물은 표적 유전자, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 갖는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집함으로써 이익을 얻을 대상체를 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 여부 및 치료될 영역에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 경구, 비경구, 국소 (예를 들어, 경피 패치), 비강내, 기관내, 표피 및 경피일 수 있다.
비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 예를 들어, 이식된 장치를 통해 피하; 또는 두개내, 예를 들어 뇌실질내, 척수강내 또는 심실내 투여를 포함한다. 비경구 투여는 선택된 기간 동안 연속 주입에 의해 이루어질 수 있다.
국소 투여를 위한 제약 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본 개시내용에서 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소 전달제와 혼합된 것들을 포함한다. 적합한 지질 및 리포솜은 중성 (예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜 콜린) 음성 (예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성 (예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 개시내용에서 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 특히 양이온성 리포좀에 대한 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히 양이온성 지질에 착화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C1-20 알킬 에스테르 (예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 국소 제형은 US 6,747,014에 상세히 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
비경구, 뇌실질내, 척수강내, 심실내 또는 간내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 침투 증강제, 담체 화합물 및 기타 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
경구 또는 비경구 투여를 위한 유용한 용액은 예를 들어, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 동봉할 수 있다. 제형은 또한 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일 및 수소화된 나프탈렌을 포함할 수 있다. 이러한 약물에 대해 잠재적으로 유용한 다른 비경구 담체에는 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식형 주입 시스템, 및 리포솜이 포함된다.
경구 투여에 적합한 본 개시내용의 제형은 다음의 형태일 수 있다: 각각 미리 결정된 양의 약물을 함유하는 캡슐, 젤라틴 캡슐, 샤세, 정제, 트로키, 또는 로젠지와 같은 개별 단위; 분말 또는 과립 조성물: 수성 액체 또는 비수성 액체의 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼. 약물은 또한 볼루스, 연약제 또는 페이스트의 형태로 투여될 수 있다. 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 약물을 압축하거나 성형하여 정제를 만들 수 있다. 압축 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유 유동성 형태의 약물을 적합한 기계에서 압축하고, 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성제, 또는 분산제로 혼합하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 적절한 기계에서; 불활성 액체 희석제로 적신 분말 약물과 적절한 담체의 혼합물을 성형하여 만들 수 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여를 위해 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의 것을 함유할 수 있다: 미세결정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제; 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료와 같은 향미제.
주사용에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올 및/또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 위에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 필터 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질과 위에서 열거한 성분 중 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입하여 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우; 제조 방법은 진공 건조 및 이전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가 목적 성분을 생성하는 동결 건조를 포함한다.
관절내 투여에 적합한 제형은 미세결정질 형태, 예를 들어 수성 미세결정 현탁액 형태일 수 있는 약물의 멸균 수성 제제의 형태일 수 있다. 리포좀 제형 또는 생분해성 중합체 시스템은 또한 관절내 및 안구 투여를 위한 약물을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투하고자 하는 장벽에 적합한 침투제를 제형에 사용한다. 그러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 경점막 투여용 세제 및 담즙산염을 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 달성할 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 전형적으로 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 신체로부터의 급속한 제거로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체 적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 리포좀 현탁액은 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
경구 또는 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다. 투여량 단위 형태는 치료 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체를 치료하기 위한 이러한 활성 화합물의 배합 기술에 내재된 제한에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다. 또한, 투여는 볼루스의 주기적인 주사에 의한 것일 수 있거나, 외부 저장소 (예를 들어, 정맥내 백)로부터의 정맥내, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 보다 연속적으로 이루어질 수 있다.
활성 화합물이 이식 절차의 일부로 사용되는 경우, 기증자로부터 조직 또는 기관을 제거하기 전에 이식할 살아있는 조직 또는 기관에 활성 화합물을 제공할 수 있다. 화합물은 기증자 숙주에 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로 일단 기증자로부터 제거되면 장기 또는 살아있는 조직을 활성 화합물을 함유하는 보존 용액에 넣을 수 있다. 모든 경우에, 활성 화합물은 조직에 주사하는 것과 같이 원하는 조직에 직접 투여될 수 있거나, 또는 본원에 기술되고/되거나 당업계에 공지된 임의의 방법 및 제형을 사용하여 경구 또는 비경구 투여에 의해 전신적으로 제공될 수 있다. 약물이 조직 또는 장기 보존 용액의 일부를 포함하는 경우, 시중에서 판매되는 모든 보존 용액을 유리하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 유용한 용액은 콜린스 용액, 위스콘신 용액, 벨저 용액, 유로콜린스 용액 및 젖산 링거 용액을 포함한다.
단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있는 본 개시내용의 제약 제형은 제약 산업에서 잘 알려진 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 회합시킨 다음, 필요한 경우 제품을 성형함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액상 시럽, 연질 젤, 좌약, 및 관장제와 같으나 이에 제한되지 않는 임의의 많은 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 매질 중의 현탁액으로 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 비롯한 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 또한 에멀젼 또는 마이크로에멀젼과 같은 추가 제형으로 제조 및 제형화될 수 있거나, 입자, 예를 들어 분무 건조, 또는 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이러한 기술의 조합으로 생성될 수 있는 미립자로 혼입될 수 있다. 침투 증진제, 예를 들어 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제, 및 비킬레이트 비계면활성제는 본 발명의 조성물의 대상체로의 효율적인 전달, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 전달을 달성하기 위해 첨가될 수 있다. 세포 수준에서 올리고뉴클레타이드 작용제의 흡수를 향상시키는 작용제는 또한 양이온성 지질, 예를 들어 리포펙틴, 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다가양이온성 분자, 예를 들어 폴리리신과 같은 본 개시내용의 제약 조성물 및 다른 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 약제학적 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 담체 또는 부형제는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁화제 또는 기타 약리학적으로 불활성인 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고, 핵산 및 주어진 제약 조성물의 다른 성분과 조합될 때 원하는 벌크, 일관성 등을 제공하도록 염두에 두고 계획된 투여 방식으로 선택된다. 전형적인 약제학적 담체는 결합제 (예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충전제 (예를 들어, 락토스 및 기타 당류, 미세결정질 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 인산수소칼슘 등); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 경화 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 등); 붕해제 (예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제 (예를 들어, 라우릴 황산나트륨 등)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산의 국소 투여용 제형은 멸균 및 비멸균 수용액, 알코올과 같은 일반적인 용매 중의 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스 중의 핵산 용액을 포함할 수 있다. 용액은 또한 완충제, 희석제 및 기타 적절한 첨가제를 포함할 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조성물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에게 사용할 복용량 범위를 공식화하는 데 사용할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물)의 투여량은 화합물의 약력학적 특성; 투여 방식; 수혜자의 나이, 건강 및 체중; 증상의 성격과 정도; 치료 빈도 및 동시 치료 유형, 있는 경우; 및 치료될 동물에서 화합물의 청소율에 따라 다르다. 당업자는 조성물을 투여할지 여부를 결정할 수 있고 상기 인자에 기초하여 조성물을 사용한 치료의 적절한 투여량 및/또는 치료 요법을 조정할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 초기에 임상 반응에 따라 필요에 따라 조정될 수 있는 적합한 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물)의 투여량은 예방적 또는 치료적 유효량이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 조성물로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 투여되는 초기 투여량은 원하는 혈액 수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위해 상기 상한 수준 이상으로 증가될 수 있거나, 초기 투여량은 최적보다 적을 수 있고 일일 투여량이 특정 상황에 따라 치료 과정에서 점진적으로 증가한다. 원하는 경우, 1일 투여량은 예를 들어 하루에 2회 내지 4회와 같은 다중 투여량으로 나누어 투여할 수도 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 표적 유전자, 예를 들어 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하고/하거나 알파 1 항트립신 결핍을 치료하기에 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료, 예방 또는 퇴치하기 위한 치료적 사용에서, 화합물 또는 이의 제약 조성물은 농도, 즉 양, 또는 효과적일 치료를 받고 있는 동물의 활성 성분의 혈중 수준 또는 조직 수준을 얻고 유지하는 투여량으로 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 것이다. 용어 "유효량"은 본 개시내용의 화합물이 생물학적 활성을 유도하기에 충분한 양으로 수혜자에 또는 수혜자 상에 존재함을 의미하는 것으로 이해된다. 일반적으로 활성 성분의 유효 투여량은 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 약 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 100 μg/kg 내지 약 1 mg/kg 체중의 범위일 것이다.
V. 키트
특정 측면에서, 본 개시내용은 질환, 예를 들어 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레티드 작용제를 포함한 제약 제형, 및 본원에 설명된 방법 중 하나를 수행하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하고 알파 1 항트립신 결핍을 치료하기 위해 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함한다. 설명서에는 일반적으로 핵산 분자를 편집하기 위한 키트 사용에 대한 정보가 포함된다. 다른 실시양태에서, 지침서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 주의사항; 경고; 임상 연구; 및/또는 참조. 지침은 용기 (있는 경우)에 직접 인쇄하거나 용기에 부착된 라벨로 또는 용기와 함께 제공되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로 인쇄할 수 있다. 추가 실시양태에서, 키트는 적합한 작동 매개변수에 대한 라벨 또는 별도의 삽입물 (패키지 삽입물) 형태의 지침서를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 질환, 예를 들어, 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드 제형, 추가 치료제, 및 본원에 설명된 방법 중 하나를 수행하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함한다.
키트는 단일 상자에 하나 이상의 용기와 같은 다양한 구성으로 포장될 수 있다. 예를 들어 키트와 함께 제공된 지침에 따라 다양한 구성 요소를 조합할 수 있다. 구성요소는 본원에 기재된 방법에 따라, 예를 들어 제약 조성물을 제조하고 투여하기 위해 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 검출, 보정 또는 정규화를 위한 표준(들)으로 사용되는 적절한 양성 및 음성 대조군 또는 대조군 샘플이 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
키트는 (멸균) 포스페이트 완충 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기; 및 본원에 기재된 바와 같은, 침투 증강제, 담체 화합물 및 기타 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 같은 기타 적합한 첨가제를 포함한다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 바와 같이 리포좀, 미셀, 나노입자 및 미소구체와 같은 약물 전달 시스템을 포함할 수 있다. 키트는 바늘, 주사기, 펌프, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물과 같은 [중추 신경계]로 전달하기 위한 전달 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 도면 및 서열 목록뿐만 아니라 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1. 알파 1 항트립신 결핍의 치료를 위한 표적 A에서 I로의 편집에 의한 SERPINA1 전사체 내의 아미노산 치환 돌연변이 E342K 역전
BamHI 및 XbaI 제한 부위 (Quintara Bio, Berkeley, CA)를 사용하여 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 ADAR2 서열 (NM_001112.4), 인간 ADAR1p110 (NM_001111.5) 및 돌연변이 SERPINA1 서열 (ORF만)을 pcDNA3.1 플라스미드로 클로닝하고 올바른 삽입물을 서열 확인하였다. 플라스미드는 ADAR2/pcDNA3.1, ADAR1p110/pcDNA3.1 또는 SERPINA1/pcDNA3.1이라고 지칭한다. 편집 실험을 위해 2 μg의 ADAR2/pcDNA3.1 또는 ADAR1p110/pcDNA3.1 플라스미드와 10ug의 SERPINA1/pcDNA3.1 플라스미드를 10 cm 접시당 25 μL의 Lipofectamine 3000과 24 μL의 P3000 (Life Technologies)을 사용하여 5x106 HEK293T 세포(ATCC)에 형질감염시켰다. 4시간 후, 배양 배지를 신선하게 데운 배지 (DMEM High Glucose; Life Technologies)로 보충했다. 형질감염 12 내지 16시간 후, 형질감염된 HEK293T 세포를 각 웰의 최종 농도가 100 nM이 되도록 가이드 올리고뉴클레오티드로 형질감염시켰다. 모든 형질감염은 Lipofectamine 3000 (웰당 0.4 μL)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 96-웰 형식으로 수행되었다. 2차 형질감염 12 내지 16시간 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 1회 세척하고 KingFisher Flex Purification (Life Technologies)에 적합한 Dyna Beads mRNA Direct Kit (Life Technologies)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 총 mRNA 단리를 수행했다. 샘플은 용출 전에 TURBO DNase (Life Technologies)로 처리되었다. 생성된 단리된 mRNA는 제조업체의 지침 (Life Technologies)에 따라 SuperScript IV Vilo를 사용하여 cDNA 합성에 사용되었다. 1 μl의 cDNA를 PCR (Platinum II Hot-Start PCR Master Mix; Life Technologies)의 주형으로 사용하고 Sanger 시퀀싱을 위한 앰플리콘을 생성하기 위해 유전자 특이적 프라이머를 사용했다 (표 4). Sanger 시퀀싱은 Quintara Biosciences (Berkeley, CA)에서 수행했다. 아데노신에서 이노신으로의 편집 수율은 아데노신 및 구아노신의 피크 높이를 측정하고 구아노신 피크 높이를 합한 아데노신 및 구아노신의 총 피크 높이 측정값으로 나눔으로써 정량화되었다.
Figure pct00039
시험된 가이드 올리고뉴클레오티드 서열은 표 5 내지 19에 제시되어 있다. 이 표는 또한 ADAR1 또는 ADAR2 또는 둘 다로 공동 형질감염된 특정 가이드 올리고뉴클레오티드에 대한 편집 결과를 보여준다.
다음 약어가 올리고뉴클레오티드 서열의 변형을 나타내는 데 사용된다.
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실시예 2. 가이드 올리고뉴클레오티드의 +2 위치는 특정 뉴클레오티드 변형에 민감하다
실시예 1의 데이터에 기초하여, 가이드 올리고뉴클레오티드의 삼중항의 +2 위치 (즉, [Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn] 구조에서 X4로 표시되는 전통적인 삼중항의 첫 번째 위치 3', 여기서 X2는 편집 부위임)는 표적의 편집 속도에 영향을 미칠 수 있다. 화합물 KB-018-001, KB-018-724, KB-018-697, KB-018-725, KB-018-440, 및 KB-018-486은 각각 +2 위치 (각각 2'-OMe, DNA, FANA, SGNA, 2'-F, 및 MOE)에서 상이한 변형된 뉴클레오티드를 갖는다.
도 1에 도시된 바와 같이, +2 위치에서 DNA, FANA, S-GNA 또는 MOE 뉴클레오티드 (각각 본원에서 정의된 바와 같음)의 존재는 2'-OMe 뉴클레오티드와 비교하여 더 낮은 편집 속도를 초래하였다. 또한, 2'-OMe 뉴클레오티드와 비교하여 2'-플루오로 뉴클레오티드에서 개선된 편집이 관찰되었다.
대조적으로, 가이드 올리고뉴클레오티드의 -2 위치 (즉, 전통적인 삼중항의 첫 번째 위치 5')는 동일한 뉴클레오티드 변형에 특별히 민감한 것으로 보이지 않는다. 도 1에 도시된 바와 같이, -2 위치에서 DNA, FANA, S-GNA, 2'-F 또는 MOE 뉴클레오티드 (각각 본 명세서에서 정의됨)의 존재는 2'-OMe와 비교하여 편집 속도에 상당한 영향을 미치지 않았다. -2 위치에 2'-OMe, DNA, FANA, SGNA, 2'-F 및 MOE가 있는 가이드 올리고뉴클레오티드는 각각 KB-018-001, KB-018-726, KB-018-698, KB-018-728, KB-018-436, 및 KB-018-485이다.
등가물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 특정 실시예 및 방법에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> KORRO BIO, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE ADAR-MEDIATED EDITING OF SERPINA1 <130> 01249-0002-00PCT <140> PCT/US2021/034521 <141> 2021-05-27 <150> US 62/705,838 <151> 2020-07-17 <160> 572 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: nucleobase sequence <400> 1 ggugaauagu auaacaauau 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: nucleobase sequence <400> 2 auguuguuau aguauccacc 20 <210> 3 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: nucleobase sequence <400> 3 ggugaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau ccacc 45 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: nucleobase sequence <400> 4 ggugaagagg agaacaauau 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: nucleobase sequence <400> 5 auguuguucu cgucuccacc 20 <210> 6 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 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gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 68 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-015 <400> 68 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 69 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-016 <400> 69 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 70 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-017 <400> 70 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 71 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-093 <400> 71 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 72 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-018 <400> 72 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 73 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-019 <400> 73 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 74 <211> 50 <212> DNA <213> 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cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 81 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-026 <400> 81 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 82 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-027 <400> 82 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 83 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-028 <400> 83 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 84 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-029 <400> 84 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 85 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-030 <400> 85 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: MTS-containing peptide <400> 87 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RFGF analogue <400> 88 Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Human Immunodeficiency Virus <220> <221> misc_feature <223> HIV Tat protein <400> 89 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <220> <221> misc_feature <223> Drosophila Antennapedia protein <400> 90 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 91 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-031 <400> 91 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 92 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-032 <400> 92 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 93 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-033 <400> 93 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 94 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-203 <400> 94 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 95 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-204 <400> 95 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 96 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-697 <400> 96 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 97 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-698 <400> 97 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 98 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-699 <400> 98 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucucguc gauggucagc 50 <210> 99 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-704 <400> 99 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucgcguc gauggucagc 50 <210> 100 <211> 50 <212> RNA <213> 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(38)..(38) <223> n is inosine <400> 105 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucncnuc gauggucagc 50 <210> 106 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-711 <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is inosine <400> 106 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucncguc gauggucagc 50 <210> 107 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-712 <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is inosine <400> 107 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucncguc gauggucagc 50 <210> 108 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-713 <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is inosine <400> 108 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuucncguc gauggucagc 50 <210> 109 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-714 <400> 109 cuaaaaacau ggccccagca gcuucagucc cuuuctcguc gauggucagc 50 <210> 110 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-715 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agaggagaac aauaugcuaa auguuguucu cgucuccucg acaccccuuu 60 ctcgucgaug guc 73 <210> 521 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-125 <400> 521 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 guc 63 <210> 522 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-140 <400> 522 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 guc 63 <210> 523 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-141 <400> 523 ggugaagagg agaacaauau gcuaaauguu guucucgucu ccaccccuuu ctcgucgaug 60 guc 63 <210> 524 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-142 <400> 524 ggugucgaga agaggagaac aauaugcuaa auguuguucu cgucuccucg acaccccuuu 60 ctcgucgaug guc 73 <210> 525 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-125 <400> 525 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 guc 63 <210> 526 <211> 63 <212> RNA <213> 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guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 538 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-157 <400> 538 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 guc 63 <210> 539 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-158 <400> 539 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 540 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-159 <400> 540 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 541 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-160 <400> 541 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 542 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-161 <400> 542 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 543 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial 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63 <210> 549 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-167 <400> 549 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 550 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-168 <400> 550 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 guc 63 <210> 551 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-169 <400> 551 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 552 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-170 <400> 552 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 guc 63 <210> 553 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-171 <400> 553 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctgcgucgau 60 gguc 64 <210> 554 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-128 <400> 554 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 gucagc 66 <210> 555 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-610 <400> 555 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 gucagc 66 <210> 556 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-611 <400> 556 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 gucagc 66 <210> 557 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-612 <400> 557 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 gucagc 66 <210> 558 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-613 <400> 558 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu cucgucgaug 60 gucagc 66 <210> 559 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-614 <400> 559 guggaauagu auaacaauau gcuaaauguu guuauaguau cccacccuuu ctcgucgaug 60 gucagc 66 <210> 560 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial 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KB-018-401 <400> 571 ucagucccuu uctcgucgau gcacccuaug auauuguugu aaaucguaua acaauaugau 60 aaggug 66 <210> 572 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: KB-018-402 <400> 572 ucagucccuu uctcgucgau gguggaauag uauaacaaua ugcuaaaugu uguuauagua 60 ucccac 66

Claims (257)

  1. 간부전 또는 폐기종을 초래할 수 있는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법으로서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 세포에서 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세포가 ADAR을 내인성으로 발현하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, ADAR이 인간 ADAR인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, ADAR이 인간 ADAR1인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, ADAR이 인간 ADAR2인, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 진핵 세포, 포유동물 세포, 및 인간 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체내에 있는 것인, 방법.
  9. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체외에 있는 것인, 방법.
  10. 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
    SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
    대상체의 세포에서 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
    SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
    세포 내에서 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의, RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 및
    대상체에게 세포를 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가, 동종, 또는 이종인, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-모집 도메인을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 SNP로부터 생성된 위치 342에 리신을 포함하는 병원성 아미노산을 포함하는 SERPINA1 단백질을 인코딩하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 아데노신에서 이노신으로의 변경이 병원성 아미노산을 야생형 아미노산으로 치환하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 위치 342에서 야생형 아미노산이 글루탐산을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 하기 구조를 포함하며,
    [Am]-X1-X2-X3-[Bn]
    여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
    m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
    X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 대체 뉴클레오티드인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하며,
    [Am]-X1-X2-X3-[Bn]
    여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
    m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
    X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 하기 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖고,
    Figure pct00146

    여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
    R1은 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R2는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R3는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R4는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고; 그리고
    R5는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, R4가 수소이고 R5가 수소 또는하이드록시가 아니거나, R5가 수소이고 R4가 수소가 아니거나, 또는 R5가 하이드록시이고 R4가 수소가 아닌, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 하이드록시, 할로겐, 또는 OCH3인, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 수소인, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 V의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 IV 또는 화학식 III의 구조를 갖지 않는, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 III, 화학식 IV, 또는 화학식 V의 구조를 갖지 않는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 방법.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 방법.
  32. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  36. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기이고; X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 방법.
  40. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, X2가 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 방법.
  42. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, X1 및 X2 중 적어도 하나는 화학식 V의 구조를 갖는 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 방법.
  45. 제42항에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 방법.
  46. 제42항에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 방법.
  47. 제42항에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 메톡시인, 방법.
  48. 제20항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, X1이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드이고, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, X1이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
  51. 제20항 내지 제40항 및 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 핵염기인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 사이토신 핵염기인, 방법.
  53. 제20항 내지 제44항 및 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  55. 제20항 내지 제44항 및 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  56. 제20항 내지 제44항 및 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  57. 제20항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 구아닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  58. 제20항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  59. 제20항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  60. 제20항 내지 제42항, 제46항, 제47항, 및 제48 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  62. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 방법.
  63. 제20항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
  64. 제63항에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
  65. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하며,
    [Am]-X1-X2-X3-[Bn]
    여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
    m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
    X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 갖고,
    Figure pct00147

    여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
    R12는 수소, 하이드록시, 플루오로, 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 헤테로알킬, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R13은 수소 또는 C1-C6 알킬이고,
    여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI 내지 IX 중 어느 하나의 구조를 갖는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, R12가 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 헤테로알킬인, 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 수소 또는 C1-C6 알킬인, 방법;
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, R12가 수소인, 방법.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, X1은 화학식 VI의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, X2는 화학식 VI의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  74. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, X1은 화학식 VII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, X2는 화학식 VII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  77. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 IX의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, X1은 화학식 IX의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  79. 제77항 내지 제78항에 있어서, X2는 화학식 IX의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  80. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VIII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  81. 제80항에 있어서, X1은 화학식 VIII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, X2는 화학식 VIII의 구조를 갖고, N1은 핵염기인, 방법.
  83. 제65항 내지 제72항 및 제74항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 VI의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
  84. 제65항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 VI의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
  85. 제65항 내지 제75항 및 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 VII의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
  86. 제65항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 VII의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
  87. 제65항 내지 제78항 및 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 IX의 구조를 갖지 않는 것인, 방법.
  88. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 VI 또는 화학식 VII의 구조를 갖는 것인, 방법.
  89. 제65항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, X1이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, X1이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 VI 내지 XI 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
  92. 제65항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  93. 제65항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  94. 제65항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  95. 제65항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  96. 제65항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 구아닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  97. 제65항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  98. 제65항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  99. 제65항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  100. 제65항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 핵염기를 포함하지 않는 것인, 방법.
  101. 제65항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
  102. 제65항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
  103. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하며,
    [Am]-X1-X2-X3-[Bn]
    여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
    m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
    X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, 여기서 X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 갖고;
    Figure pct00148

    여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
    R6은 수소, 하이드록시, 또는 할로겐이고;
    R7은 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R8은 수소 또는 할로겐이고;
    R9는 수소 또는 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R10은 수소 또는 할로겐이고;
    R11은 수소 또는 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시인, 방법.
  104. 제103항에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 방법.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 방법.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, C1-C6 알콕시가 OCH3인, 방법.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소인, 방법.
  108. 제107항에 있어서, X1이 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소인, 방법.
  109. 제107항 또는 제108에 있어서, X2가 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소인, 방법.
  110. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 방법.
  111. 제103항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 2'-아미노-뉴클레오티드, 아라비노핵산-뉴클레오티드, 바이사이클릭-뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 구속된 에틸-뉴클레오티드, LNA-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
  112. 제111항에 있어서, X1이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각, 독립적으로, 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2가 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 리보뉴클레오티드, 2'-F-뉴클레오티드, 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, X1이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2가 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X3이 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1 및 X2는 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X2가 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X3은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X1 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X2는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; X2 및 X3이 각각 화학식 XII 내지 XV 중 어느 하나의 구조를 가질 때, X1은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 방법.
  114. 제103항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  115. 제103항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  116. 제103항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  117. 제103항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  118. 제103항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  119. 제103항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  120. 제103항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
  121. 제103항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 핵염기를 포함하지 않는 것인, 방법.
  122. 제103항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
  123. 제103항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 방법.
  124. 제19항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  125. 제19항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 구속된 에틸 (cEt)-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  126. 제125항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  127. 제20항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  128. 제20항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
  129. 제20항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
  130. 제128항 또는 제129항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 방법.
  131. 제20항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  132. 제20항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  133. 제132항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  134. 제20항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  135. 제20항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
  136. 제20항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 방법.
  137. 제135항 또는 제136항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 방법.
  138. 제20항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  139. 제20항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5'-캡 구조를 추가로 포함하는, 방법.
  140. 제20항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함하는, 방법.
  141. 제20항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-말단 뉴클레오티드가 2'-아미노-뉴클레오티드인, 방법.
  142. 제20항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 A 및 B가 18 내지 80개의 뉴클레오티드로 구성된 것인, 방법.
  143. 제20항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, m이 5 내지 40인, 방법.
  144. 제20항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, n이 5 내지 40인, 방법.
  145. 제20항에 있어서, m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로, 하이드록시, 또는 메톡시이고 N1은 핵염기, 또는 화학식 V의 구조이고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소이고; 화학식 I 또는 화학식 V의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]은 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
  146. 제65항에 있어서, m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 또는 화학식 IX의 구조를 갖고, 여기서 N1은 핵염기이고, 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 또는 화학식 IX의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]는 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
  147. 제103항에 있어서, m 및 n은 각각, 독립적으로, 5 내지 40의 정수이고; X1, X2, 및 X3의 적어도 하나는 화학식 XIII의 구조를 갖고, 여기서 R8 및 R9는 각각 수소이고, 화학식 XII의 구조를 갖지 않는 X1, X2 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고; [Am] 및 [Bn]는 각각 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드 및 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 방법.
  148. 19항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 SERPINA1 mRNA에 혼성화될 때, X2는 SNP rs28929474에서 A와 정렬된 것인, 방법.
  149. 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 SNP rs28929474에서 A의 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는 것인, 방법.
  150. 제10항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 간 손상, 간부전, 간경변, 황달, 폐에서 엘라스틴의 과도한 분해, 폐기종 및 COPD로부터 선택되는 A1AD의 적어도 하나의 증상을 예방, 역전, 또는 서행시키는 것을 포함하는, 방법.
  151. 제1항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 표 5 내지 19로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 것인, 방법.
  152. RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경 또는 표적 RNA에 영향을 미칠 수 있는 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드가 다음 구조를 포함하며,
    [Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
    여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
    m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
    X1, X2, 및 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드이고 X4는 2'-플루오로뉴클레오티드이고, 여기서 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 혼성화될 때, X2는 이노신으로 탈아민화될 아데노신의 반대편에 있는, 올리고뉴클레오티드.
  153. 다음 구조를 포함하는 올리고뉴클레오티드:
    [Am]-X1-X2-X3-X4-[Bn]
    여기서 A 및 B는 각각 뉴클레오티드이고;
    m 및 n은 각각, 독립적으로, 1 내지 50의 정수이고;
    X1, X2, 및 X3은 각각, 독립적으로, 뉴클레오티드이고, X4는 2'-O-메틸뉴클레오티드 및 2'-플루오로뉴클레오티드로부터 선택되고;
    여기서 X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖고,
    Figure pct00149

    여기서 N1은 수소 또는 핵염기이고;
    R1은 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R2는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R3은 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R4는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시이고;
    R5는 수소, 하이드록시, 할로겐, 또는 C1-C6 알콕시임.
  154. 제153항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경 또는 표적 RNA에 영향을 미칠 수 있는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  155. 제153항 또는 제154항에 있어서, X2가 이노신으로 탈아민화될 아데노신의 반대편에 있는, 올리고뉴클레오티드.
  156. 제153항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 수소이고 R5는 수소 또는 하이드록시가 아니거나, R5는 수소이고 R4는 수소가 아니거나, 또는 R5는 하이드록시이고 R4는 수소가 아닌, 올리고뉴클레오티드.
  157. 제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 하이드록시, 할로겐, 또는 OCH3인, 올리고뉴클레오티드.
  158. 제153항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 수소인, 올리고뉴클레오티드.
  159. 제153항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I, 화학식 II, 또는 화학식 V의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 IV 또는 화학식 III의 구조를 갖지 않는, 올리고뉴클레오티드.
  160. 제153항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 또는 X3 중 적어도 하나는 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 갖고; X1, X2, 또는 X3 중 어느 것도 화학식 III, 화학식 IV, 또는 화학식 V의 구조를 갖지 않는, 올리고뉴클레오티드.
  161. 제153항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 할로겐이 플루오로인, 올리고뉴클레오티드.
  162. 제153항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  163. 제162항에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  165. 제162항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 플루오로이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  166. 제153항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  167. 제166항에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  168. 제166항 또는 제167항에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  169. 제166 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 하이드록시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  170. 제153항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  171. 제170항에 있어서, X1이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기이고; X2 및 X3이 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  172. 제170항 또는 제171항에 있어서, X2가 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  173. 제170항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 화학식 I의 구조를 갖고, 여기서 R1은 메톡시이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  174. 제153항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  175. 제174항에 있어서, X2가 화학식 II의 구조를 갖고, 여기서 R2는 수소이고 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  176. 제153항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, X1 및 X2 중 적어도 하나는 화학식 V의 구조를 갖는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  177. 제176항에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 올리고뉴클레오티드.
  178. 제176항에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 올리고뉴클레오티드.
  179. 제176항에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 수소인, 올리고뉴클레오티드.
  180. 제176항에 있어서, X1이 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 하이드록시인, 올리고뉴클레오티드.
  181. 제176항에 있어서, X2가 화학식 V의 구조를 갖고, 여기서 R4는 수소이고 R5는 메톡시인, 올리고뉴클레오티드.
  182. 제153항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖지 않는 X1, X2, 또는 X3은 각각 데옥시리보뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  183. 제153항 내지 제173항 및 제176항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  184. 제183항에 있어서, X1, X2, 및 X3 중 어느 것도 화학식 II의 구조를 갖지 않고, 여기서 N1은 사이토신 핵염기인, 올리고뉴클레오티드.
  185. 제153항 내지 제178항 및 제181항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 우라실 또는 티민 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  186. 제185항에 이어서, X1이 우라실 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  187. 제153항 내지 제178항 및 제181항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  188. 제153항 내지 제178항 및 제181항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  189. 제153항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 구아닌 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  190. 제153항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 하이포잔틴 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  191. 제153항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 아데닌 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  192. 제153항 내지 제176항, 제179항, 제180항, 및 제182항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 사이토신 또는 5-메틸사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  193. 제192항에 있어서, X2가 사이토신 핵염기를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  194. 제153항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 화학식 I 내지 V 중 어느 하나의 구조를 갖는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  195. 제153항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 올리고뉴클레오티드.
  196. 제196항에 있어서, X1, X2, 및 X3이 2'-O-메틸-뉴클레오티드가 아닌, 올리고뉴클레오티드.
  197. 제152항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, [Am] 및/또는 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 80%가 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  198. 제152항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  199. 제152항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 구속된 에틸 (cEt)-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  200. 제199항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  201. 제152항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  202. 제152항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  203. 제152항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, [Am]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  204. 제202항 또는 제203항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 올리고뉴클레오티드.
  205. 제152항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  206. 제152항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 2'-O-C1-C6 알킬-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-아미노-뉴클레오티드, 적어도 하나의 아라비노 핵산-뉴클레오티드, 적어도 하나의 바이사이클릭-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  207. 제206항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 2'-O-메틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-F-뉴클레오티드, 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸-뉴클레오티드, 적어도 하나의 cEt-뉴클레오티드, 적어도 하나의 LNA-뉴클레오티드, 및/또는 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  208. 제152항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 5개의 말단 2'-O-메틸-뉴클레오티드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  209. 제152항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  210. 제152항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, [Bn]이 적어도 4개의 말단 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인, 올리고뉴클레오티드.
  211. 제209항 또는 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결이 입체순수한 것인, 올리고뉴클레오티드.
  212. 제152항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 [Am] 및 [Bn]의 뉴클레오티드의 적어도 20%가 2'-O-메틸-뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  213. 제152항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5'-캡 구조를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  214. 제152항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 대체 핵염기를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  215. 제152항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-말단 뉴클레오티드가 2'-아미노-뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
  216. 제152항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 조합된 A 및 B가 18 내지 80개의 뉴클레오티드로 구성된 것인, 올리고뉴클레오티드.
  217. 제152항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, m이 5 내지 40인, 올리고뉴클레오티드.
  218. 제152항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, n이 5 내지 40인, 올리고뉴클레오티드.
  219. 제152항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-모집 도메인을 하나 이상 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  220. 제152항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP의 RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제 (ADAR)-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
  221. 제220항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
  222. 제221항에 있어서, SNP가 rs28929474(A)인, 올리고뉴클레오티드.
  223. 제222항에 있어서, SERPINA1 mRNA가 SNP로부터 생성된 위치 342에 리신을 포함하는 병원성 아미노산을 포함하는 SERPINA1 단백질을 인코딩하는, 올리고뉴클레오티드.
  224. 제222항 또는 제223항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 SERPINA1 mRNA에 혼성화될 때, X2는 SNP rs28929474에서 A와 정렬된 것인, 올리고뉴클레오티드.
  225. 제220항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 SNP rs28929474에서 A의 ADAR-매개된 아데노신에서 이노신으로의 변경에 영향을 미칠 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
  226. 표적화 모이어티에 접합된 제152항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체.
  227. 제226항에 있어서, 표적화 모이어티가 지질, 스테롤, 탄수화물 및/또는 펩티드인, 접합체.
  228. 제152항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체; 및
    mRNA를 포함하는 복합체로서,
    여기서 올리고뉴클레오티드 또는 접합체 및 mRNA는 서로 혼성화되고, 복합체는 mRNA의 아데노신에서 제1 미스매치를 포함하는, 복합체.
  229. 제228항에 있어서, 복합체가 제1 미스매치로에 대해 4개의 뉴클레오티드 5'인 제2 미스매치를 포함하는, 복합체.
  230. 제228항 또는 제229항에 있어서, 복합체가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 미스매치를 포함하는 것인, 복합체.
  231. 제228항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 치료 결과를 생성하기 위해 탈아민화될 수 있는 아데노신을 포함하는 것인, 복합체.
  232. 제228항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA가 상응하는 천연 mRNA와 비교하여 구아노신에서 아데노신으로의 돌연변이를 포함하는 것인, 복합체.
  233. 제232항에 있어서, 구아노신에서 아데노신으로의 돌연변이가 미스센스 또는 넌센스 돌연변이인, 복합체.
  234. 제228항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 미스매치가 mRNA의 시작 코돈 내의 아데노신에 있는 것인, 복합체.
  235. 제228항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 미스매치가 mRNA의 정지 코돈 내의 아데노신에 있는 것인, 복합체.
  236. 제235항에 있어서, 정지 코돈이 조기 정지 코돈인, 복합체.
  237. 제228항 내지 제236항 중 어느 한 항의 복합체를 생성하는 방법으로서, 세포를 제152항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  238. mRNA 내 아데노신의 탈아민화 방법으로서, 세포를 제152항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  239. 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 제152항 내지 제226항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  240. 간부전 또는 폐기종을 초래할 수 있는 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 방법으로서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 제220항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체와 접촉시켜 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
  241. 제240항에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드가 세포에서 가이드 올리고뉴클레오티드와 접촉되는 것인, 방법.
  242. 제241항에 있어서, 세포가 ADAR을 내인성으로 발현하는, 방법.
  243. 제242항에 있어서, ADAR이 인간 ADAR인, 방법.
  244. 제243항에 있어서, ADAR이 인간 ADAR1인, 방법.
  245. 제243항에 있어서, ADAR이 인간 ADAR2인, 방법.
  246. 제241항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 진핵 세포, 포유동물 세포, 및 인간 세포로부터 선택되는 것인, 방법.
  247. 제241항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체내에 있는 것인, 방법.
  248. 제241항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체외에 있는 것인, 방법.
  249. 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
    SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
    대상체의 세포 내 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 제220항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체와 접촉시켜 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  250. 필요로 하는 대상체에서 알파 1 항트립신 결핍을 치료하는 방법으로서,
    SERPINA1 폴리뉴클레오티드에서 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 갖는 대상체를 확인하는 단계;
    세포 내 SERPINA1 폴리뉴클레오티드를 제220항 내지 제225항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 또는 제226항 또는 제227항의 접합체와 접촉시키는 단계, 및
    대상체에게 세포를 투여하여 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  251. 제250항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가, 동종, 또는 이종인, 방법.
  252. 제249항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인, 방법.
  253. 제240항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 올리고뉴클레오티드가 알파 1 항트립신 결핍과 관련된 SNP를 포함하는 SERPINA1 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  254. 제240항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA에 작용하는 하나 이상의 아데노신 데아미나제 (ADAR)-모집 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  255. 제240항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, SERPINA1 폴리뉴클레오티드 가 SNP로부터 생성된 위치 342에 리신을 포함하는 병원성 아미노산을 포함하는 SERPINA1 단백질을 인코딩하는, 방법.
  256. 제255항에 있어서, 아데노신에서 이노신으로의 변경이 병원성 아미노산을 야생형 아미노산으로 치환하는 것인, 방법.
  257. 제256항에 있어서, 위치 342에서 야생형 아미노산이 글루탐산을 포함하는 것인, 방법.
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