FI115400B - Menetelmä oligoribonukleotidi- ja ribotsyymianalogien valmistamiseksi, joissa on terminaaliset 3 '-3'- tai 5'-5'-sidokset - Google Patents

Description

115400

Menetelmä oligoribonukleotidi- ja ribotsyymianalogien valmistamiseksi, joissa on terminaaliset 3'-3'- tai 5'-5'-sidokset 5 Keksintö koskee menetelmää oligoribonukleotidiana- logien valmistamiseksi, joilla on nukleotidien väliset, terminaaliset 3'-3'- tai 5'5'-sidokset. Tämä muunnelma stabiloi näin muunnettuja molekyylejä, mm. myös ribotsyymejä, muuttamatta haitallisesti niiden ominaisuuksia, mm. mahdol-10 lisesti katalyyttisiä toimintoja.

Antisense-oligonukleotideiksi kutsutaan nukleiini-happofragmentteja, joiden sekvenssi täydentää lähetti-RNA:n koodattavaa sekvenssiä tai "sense"-sekvenssiä tai DNA:n ko-dogeenistä DNA-juostetta. Tällaisilla oligonukleotideillä 15 on lisääntyvässä määrin käyttöä geenin ekspressoitumisen estämiseksi, useimmiten lääketieteellisen hoidon näkökulmasta, in vitro, soluviljelmäjärjestelmissä ja in vivo [1.

E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90, (1990), 543 - 584; 2.

J. Goodchild, Bioconjugate Chem., 1, (1990), 165 - 187; 3.

20 L. Whitesell, A. Rosolen, L. Neckers, Antisense Research , and Development 1 (1991), 343].

*· Antisense-periaatteen muunnelmat ovat: • * » ··! ** I. Kolmoiskierteen muodostavat oligonukleotidit: » • » * * * ‘ Nukleiinihappofragmentit, jotka muodostavat kolmoiskierteen 2 5 DNA-kaksoisjuosteeseen ja muuntavat geenin ekspressoitumis- j : ta estämällä transkriptiota [J. Chubb ja M. Hogan, TIBTECH, 10, (1992) , 132 - 136] .

II. Ribotsyymit: Ribonukleiinihappofragmentteja, joilla on entsymaattista aktiivisuutta, joka perustuu sii-, 30 hen, että ribotsyymi hajottaa kohteena olevan RNA:n, esi merkiksi m-RNA:n, sitouduttuaan siihen spesifisesti [T. R.

* : Cech, J. Am. Med. Assoc., 260, (1988), 3030).

s » ' * 2 115400

Jotta antisense-oligonukleotidejä, kolmoiskierteen muodostavia oligonukleotidejä ja ribotsyymejä voidaan käyttää biologisissa järjestelmissä, niiden täytyy kuitenkin täyttää seuraavat edellytykset [E. Uhlmann, A. Peyman, 5 Chem. Rev., 90, (1990), 543 - 584].

1. Niiden täytyy olla toisaalta hyvin veteen liukenevia, mutta toisaalta niiden täytyy läpäistä helposti li-pofiilinen solumembraani.

2. Niiden täytyy olla solun sisällä riittävän kes- 10 täviä hajotusta vastaan, so. niiden täytyy olla stabiileja nukleaaseja vastaan.

3. Niiden täytyy muodostaa stabiileja hybridejä so-lunsisäisten nukleiinihappojen kanssa fysiologisissa lämpötiloissa .

15 4. Hybridisaation täytyy olla selektiivistä; dis- sosioitumislämpötilan eron oligonukleotidiin nähden, joka tuottaa väärän pariksi yhtymisen, täytyy olla riittävän suuri siten, että jälkimmäinen voidaan vielä huuhtoa pois spesifisesti.

20 5. Katalyyttisen aktiivisuuden täytyy säilyä ribot- syymeillä.

Muuntamattomat oligonukleotidit ja erityisesti ··· * muuntamattomat oligoribonukleotidit ovat suuressa määrin « · . > * ’ alttiina nukleolyyttiselle hajotukselle. Sen vuoksi jo var- 25 hain toteutettiin tutkimuksia oligonukleotidien muuntami- • ’/ seksi rakenteellisesti siten, että ne täyttävät paremmin : : : edellä mainitut vaatimukset, erityisesti että ne ovat pa remmin suojattuja nukleaasihajotusta vastaan. Tätä tarkoi- . . tusta varten valmistettiin suuri määrä oligonukleoti- • * * .

30 dianalogeja, synteesikustannusten ollessa osittain suunnat- • » • · · • ( toman suuria [1. E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 90, ’· ! (1990), 543 - 584; 2. J. Goodchild, Bioconjugate Chem., 1 t : (1990) , 165 - 187) .

» * » • i » 1 « • * \

• »I

• * 3 115400

Hiljattain osoitettiin, että terminaalisesti 3 '-3'-tai 5 ’-51-sitoutuneilla oligodesoksinukleotideillä tai niiden analogeilla on selvästi lisääntynyt stabiilisuus nuk-leolyyttistä hajotusta vastaan [1. H. Seelinger, A. Fröh-5 lich, M. Montenarh: Nucleosides & Nucleotides, 10 (1991), 469 - 477; 2. H. Rösch, A. Fröhlich, J. Ramalho-Ortigao, J. Flavio, M. Montenarh, H. Seelinger: EP 0 464 638 A2) . Nyt havaittiin yllättäen, että samanlainen, synteettisesti helposti saatavissa oleva, terminaalinen sitoutumistyyppi 10 a) kykeni stabiloimaan myös vielä paljon labiilim- mat oligoribonukleotidit nukleaaseja vastaan, b) kykeni stabiloimaan ribotsyymit (oligoribonukleotidit, joilla on erityinen sekvenssivaatimus) nukleaaseja vastaan rajoittamatta katalyyttistä aktiivisuutta, 15 c) kykeni lisäksi stabiloimaan oligoribonukleotidit tai ribotsyymit, jotka oli suojattu muuntamalla kemiallisesti nukleaaseja vastaan.

Siten keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisten oligoribonukleotidien valmistamiseksi,

20 joilla on kaava I

r1~°^\o /B O R3 : V I | l z—p=w : \_/ (I)

• * I

I_2_£_I n • : i; • I · • · 4 115400 jossa R1 tarkoittaa vetyä tai jäännöstä, jolla on

kaava II

o /—0—p=w \ 7^ z' R3 X <n>

5 R2 jäännöstä, jolla on kaava III

Ύ B

O R3 z '—P=w ' () B tarkoittaa emästä, kuten esimerkiksi luonnollisia .10 emäksiä, kuten adeniinia, tymiiniä, sytosiiniä, guaniinia, ; , , tai ei-luonnollisia emäksiä, kuten esimerkiksi puriinia, ’’’ * 2,6-diaminopuriinia, 7-deatsa-adeniinia, 7-deatsaguaniinia, N4,N4-etanosytosiinia tai sen esilääkemuotoa; jolloin emäk-set urasiili tai sytosiini sisältyvät oligoribonukleotii-: ·' 15 din; *·' * R3 on toisistaan riippumatta OH, vety, tai F, kor keintaan yksi R3-jäännös on H, ja joko kaikissa U-nukleo-sideissa tai sekä kaikissa U- että C-nukleosideissa R3 on > F'· . 20 W ja W tarkoittavat toisistaan riippumatta happea ! tai rikkiä; » Z ja Z1 ovat toisistaan riippumatta O"; S'; Ci-is- / alkoksi, edullisesti Ci-8-alkoksi Ci-ie-alkyyli, edullisesti

Ci-s-alkyyli; NHR4, jossa R4 = Ci-ie-alkyyli tai Ci-4-alkoksi- 25 Ci-6-alkyyli, edullisesti metoksietyyli; NR4R5, jossa R4 on i 5 115400 kuten edellä on määritelty ja R5 on Ci-ia-alkyyli, edullisesti Ci-e-alkyyli, jossa R4 ja R5 tarkoittavat yhdessä niitä kantavan typpiatomin kanssa 5-6 -jäsenistä heterosyk-listä rengasta, joka voi sisältää lisäksi muun heteroatomin 5 sarjasta O, S, N, kuten esim. morfoliinia; jolloin X on OH, H, F, Cl, Br, NH2, N3, O-C(O)- (Ci-ie)-alkyyli, O-C (O) - (C2-is) -alkenyyli, O-C (O) - (C2-i8) -alky-nyyli, O-C (O) - (C6-is)-aryyli, O- (Ci-i8)-alkyyli, O-(C2-i8)-alkenyyli, O- (C2-i8) -alkynyyli, O- (Cg-is) -aryyli, P(0)YY', jol-10 loin Y ja Y’ ovat kuten on määritelty Z ja Z', jolloin kaavassa II R3 ja X voivat muodostaa yhdessä syklisen fosfori-happodiesterin, edullisesti X on OH, H, F; n on kokonaisluku 5 - 60, edullisesti 15 - 25; niiden fysiologisesti siedettävienä suolojen val-15 alistamiseksi.

Aryyli tarkoittaa tässä yhteydessä esimerkiksi fe-nyyliä tai fenyyliä, joka on substituoitu (1-3 -kertaisesti) Ci-6-alkyylillä, Ci-6-alkoksilla ja/tai halogeenilla.

Edullisia ovat kaavan I mukaiset oligoribonukleoti-20 dit. Lisäksi edullisia ovat oligoribonukleotidit, joilla on kaava I, jossa R2 tarkoittaa kaavan III mukaista jäännöstä ;*·; ja R1 tarkoittaa vetyä; R1 tai R2 tarkoittaa kaavan II tai ’·! : III mukaista jäännöstä.

i * * Erityisesti mainittakoon lisäksi oligoribonukleoti- 25 dit, joilla on kaava I, jossa W tarkoittaa happea tai Z ja j ' W tarkoittavat molemmat happea.

Erityisesti mainittakoon kaavan I mukaiset oligoribonukleot idit, joiden emäsjärjestys B1, B2, ..... Bn vastaa ribotsyymien sekvenssivaatimuksia.

.···, 30 Tällöin tulee korostaa "hammerhead-ribotsyymejä" • · "·’ [esimerkiksi Uhlenbeck, Nature, 328 (1987), 596; Haseloff, *. ", Gerlach, Nature, 334 (1988) , 585] , "hairpin-ribotsyymejä" '·“* (esimerkiksi Hampel et ai., Nucl. Acids. Res., 18, (1990), 299] , "human hepatitis a-virus-ribotsyymiä" (ihmisen hepa- ,·, : 35 tiitti-a-virusribotsyymiä) [esimerkiksi Branch, Robertson, • · »

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88 (1991), 10163] ja "RNAasi 6 115400 P:n ulkoista opassekvenssiä" ("external guide sequence fiir RNase P") [esimerkiksi Forster, Altman, Science, 249 (1990)], aivan erityisesti kuitenkin "hammerhead-ribot-syymejä".

5 Aivan erityisen edullisia ovat oligoribonukleoti- dit, joilla on kaava I, jossa R2 tarkoittaa kaavan III mukaista jäännöstä ja R1 tarkoittaa vetyä. Lisäksi mainittakoon kaavan I mukaiset oligoribonukleotidit, jotka on lisäksi substituoitu ryhmillä, jotka edistävät solunsisäistä 10 ottoa ja jotka toimivat in vitro tai in vivo reportteriryh-minä ja/tai ryhminä, jotka biologiseen DNA:hän tai RNA:han liittyvän oligoribonukleotidin hybridisaatiossa tarttuvat näihin DNA- tai RNA-molekyyleihin sitoutuen tai hajottaen.

Esimerkkejä ryhmistä, jotka edistävät solunsisäistä 15 ottoa, ovat lipofiiliset jäännökset, kuten alkyylijäännökset, joissa on enintään 18 C-atomia, tai kolesteryyli tai tiokolesteryyli [E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev., 90, (1990), 543 - 584; J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1, (1990), 165 - 187; B. Oberhauser, E. Wagner, Nucl. Acids 20 Res., 20, (1992), 533; C. MacKellar et ai., Nucl. Acids

Res., 20 (1992), 3411] tai konjugaatit, jotka käyttävät hy- ·** väkseen luonnollisia kantajajärjestelmiä, kuten esimerkiksi » ! ; sappihappoa tai vastaavan reseptorin peptidejä (esim. re- ’· ’ septorivälitteinen endosytoosi). Esimerkkejä reportteriryh- 25 mistä ovat fluoroivat ryhmät (esimerkiksi akridinyyli, dan- • · · j syyli, fluoreskeinyyli) tai kemiluminoivat ryhmät, kuten :T: esimerkiksi akridiniumesteriryhmät.

Esimerkkejä oligonukleotidikonjugaateista, jotka sitoutuvat nukleiinihappoihin ja/tai hajottavat niitä, löy- ,···, 30 tyy seuraavista sitaateista. [E. Uhlmann, A. Peyman, Chem.

• » ’·* Rev., 90 (1990), 543 - 584; J. Goodchild, Bioconjugate *. G Chem. 1., (1990), 165 - 187; Helene, Toulme, Biochim. Bio- phys, Acta 1049, (1990) , 99] . Konjugaattipartnereita ovat mm. akridiini, psoraleeni, kloorietyyliaminoaryyli, fenan- ; 35 tridiini, atsidofenatsyyli, atsidoproflaviini, fenatsiini, • · 7 115400 fenantroliini/Cu, porfyriini/Fe, bentso [e]pyridoindoli, EDTA/Fe [Mergny et ai., Science, 256, (1992), 1681].

Keksinnön mukaisesti valmistettujen oligoribonukle-otidien tunnusomainen rakenteellinen muunnelma perustuu 5 siihen, että nukleotidien väliset sidokset molemmissa ketjun päissä on muutettu, so. biologisten 3'-5'-sidosten sijalla ovat 3'-3'- tai 5 1-51-sidokset. Yllättäen havaittiin, että tämä minimaalinen rakennemuunnelma riittää stabiloimaan tällaiset yhdisteet nukleaasihajotusta vastaan muutta-10 matta haitallisesti muita ominaisuuksia, esimerkiksi entsy-maattisia toimintoja.

Kuten jäljempänä kuvataan, vain vähäinen rakenne-muunnelma saa aikaan hybridisaatiokäyttäymiseen, joka on melkein samanlaista kuin biologisilla oligoribonukleoti-15 deillä. Tästä on tuloksena myös näiden yhdisteiden yleinen käyttökelpoisuus geenin ekspressoitumisen estäjinä.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistus tapahtuu samalla tavalla kuin biologisten oligonukleotidien synteesi liuoksessa tai edullisesti kiinteässä faasissa, mahdolli-20 sesti käyttäen apuna automaattista synteesilaitetta. Keksinnön aihe on siten menetelmä kaavan I mukaisten oligori-bonukleotidien valmistamiseksi, menetelmän ollessa tunnettu ·,· · siitä, että : a) nukleotidiyksikkö, jolla on 3'- tai 5'-termi- ·,· 25 naaliset fosfori (III) - tai fosfori (V) -ryhmittymät, tai sen ]*·'. aktivoitu johdannainen saatetaan reagoimaan muun nukleoti- • t diyksikön kanssa, jolla on 3'- tai 5'-terminaalinen, vapaa • · * hydroksiryhmä tai b) muodostetaan oligonukleotidi fragmenttien avulla 30 samalla tavalla, *·;' kohdan (a) tai (b) mukaisesti saaduista oligonukle- :\j otideistä lohkaistaan pois mahdollisesti yksi tai useampi *;··: muiden toimintojen suojaksi väliaikaisesti lisätty suoja- ryhmä ja näin saadut, kaavan I mukaiset oligonukleotidit I 35 muutetaan mahdollisesti fysiologisesti siedettäväksi suo-• > * '· * läksi.

8 115400 Lähtökomponentitina terminaalisesti käännetyn 3 ' 3 1 -sidoksen omaavien oligoribonukleotidien valmistamiseksi käytetään kiinteäfaasisynteesiä varten kantajahartsia, johon ensimmäinen nukleosidimonomeeri on liittynyt 5'-OH-5 ryhmän kautta. Tämän komponentin valmistamiseksi käytetään kirjallisuudesta [T. Atkinson, M. Smith, teoksessa Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (toim.), 35 - 49 (1984)] tunnettujen menetelmien mukaisesti valmistettua kantaja-hartsia, esimerkiksi piihappogeeliä tai "kontrolloitua huo-10 koista lasia" ("controlled pore glass"), joka on funktiona-lisoitu aminoryhmillä. Se saatetaan reagoimaan nukleoemäk-sen ja 3'-OH-ryhmän osalta suojatun nukleosidijohdannaisen kanssa, joka on ensin muutettu 5'-p-nitrofenyyli-sukkinaatiksi. Emäksen suojaryhminä käytetään edullisesti 15 asyyliryhmiä, esimerkiksi bentsoyyliä, isobutyryyliä tai fenoksiasetyyliä. 3'-asema suojataan edullisesti dimetok- sitrityylisuojaryhmällä, joka voidaan lisätä menetelmän mukaan, joka on kuvattu julkaisussa M. D. Matteucci, M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21 (1980), sivut 3243 - 20 3246.

Oligoribonukleotidiketjun rakentaminen edelleen ta-·< pahtuu viimeistä edeltävään ketjunjäseneen saakka kirjalli- ; suudesta tunnettujen menetelmien mukaan [Beaucage, Iyer, > Tetrahedron 48, (1992), 2223], edullisesti käyttäen nukleo- 25 sidi-3'- fosforihappoesteriamideja tai nukleosidi-3'-H-fos- ·'* ; fonaatteja, joiden 5'-OH-ryhmä on suojattu dimetoksitrityy- liryhmillä. 2 ' -hydroksiryhmä suojataan edullisesti tert-butyylidimetyylisilyyliryhmällä. [M. Lyttle et ai., J. Org.

Chem., 56, (1991), 4608; Scaringe et ai., Nucl. Acids Res., 30 18, (1990), 5433]. 2'-aminoryhmä (yhdisteiden synteesi, kun *" yhdisteissä R3 = NH2) suojataan edullisesti trifluori- ·.*·; asetyyliryhmällä [Benseler et ai., Nucleosides & Nucleoti- des, 11, (1992) , 1333] . Viimeisenä ket j un jäsenenä käytetään jälleen nukleosidi-5'- fosforihappoesteriamidia tai nukleo- « i i ! *. 35 sidi-H-fosfonaattia, joiden 3'-OH-ryhmä on suojattu edulli-

» I

* ‘ sesti dimetoksitrityylillä. Terminaalisesti käännetyt nuk- 9 115400 leotidien väliset sidokset omaavan oligoribonukleotidiket-jun valmistus esitetään seuraavassa kaavamaisesti. (Fosfo-ramidiittisykli oligonukleotidien valmistamiseksi, joilla on päätteissä 3'-3'- ja 5'-51-sidokset). Oligoribonukleoti-5 dit, joilla on 3'-3'- tai 5'-5'-sidokset, valmistetaan vastaavalla tavalla.

• * > * • · >

• · I

• · · » i · I i > ♦ » * « · * • ♦ i • ·

III » · I

• · « • i I t » t > I I » ‘ t » i t 1 10 115400

Oxf Θ-w - -χ C· + H 5 (Sh-w , Vi- \Λ-< ι C *·· Tritytoiminen \f Α 7 \ /Ν jTCA 2. Aktivoiminen I ja lisää- \ niinen OUTfO—. θ / f*Cap_raker|teen Λ kiittäminen 10 V-/, OMTrO-^ B >»W\ <**0.

? ft. \ 7 / \n“' o=p-cn \—/ \ ° R* 4. Hapet- ° R1 (^V-°-| o ? ,r \y 0^o>o^8 W ?*" os-e-iti / rv Oi ° / (craV— O—' “ β

15 / VT

I 1. D^tritytoiminen n \ kondensaation jälkeen

\. ®Ί of fD

" -W ;= * VV

ro—P=0 / 2‘ Aktivoiminen ··,. L B l 2a lisääminen VN r I_Hi 3. Cap- 1^0\|0"»~°Χ-ΟΠ 25 ? H " rakenteen \ / ° \ / ro—P=0 inttäminen —f ]—f • ό ” otmo 1 o ^3 1 ·*·’; Il 4‘ Opettaminen «J—P=0 k1* 0_ojOb °'v°-j •—Vv- ·;· 30 ro-p=o ;:::. · ° * V; 0-.-1¾ • * • i 11 115400

Samaten kirjallisuudesta tunnettujen menetelmien mukaisesti tapahtuvat 2'-muunnettujen ribonukleotidiyksi-köiden, kuten esimerkiksi 2'-O-alkyyli-2'-deoksiribonuk-leotidien, muodostus [Iribarren et ai., Proc. Natl. Acad.

5 Sei. USA 87, (1990), 7747; Sproat, Lamond, teoksessa Oligonucleotides and Analogues; F. Eckstein, toim., IRL Press, Ocford 1991]; 2'-F- ja 2 '-NH2-2'-deoksiribonukleoti-dien muodostus [Benseler et ai., Nucleosides & Nucleotides, 11, (1992), 1333; Pieken et ai., Science, 253, 10 (1991), 314; Olsen et ai., Biochemistry, 30, (1991), 9735].

Rakenne- ja sekvenssianalyysejä varten oligoribo-nukleotidit merkitään terminaalisesti, kuten jäljempänä esimerkissä 4 kuvataan. Tämä tapahtuu radioaktiivisen mer-15 kinnän avulla, edullisesti 5'-y3ZP-ATP/polynukleotidikinaa-sin avulla. Tämä radioaktiivinen merkitseminen tapahtuu vapaaseen 5'-OH-ryhmään liittyen, so. vastapäätä oligonuk-leotidiä, jolla on vain biologiset 3’-5’-sidokset nukleo-tidiketjun vastakkaisessa päässä.

20 Sekvensseillä, joilla on 3'-3'-invertointi (Inver- tierung), on molemmin puolin 5'-OH-ryhmä ja sen vuoksi ne .·“· fosforyloituvat osittain kummaltakin puolelta.

: Kaavan I mukaisilla oligonukleotideillä on käyttöä hybridisaatiokemiallisessa, kaksoisjuosteen tai yksinker-. 25 täisen juosteen omaaviin nukleiinihappoihin liittymiseen ‘.I", tai niiden hajottamiseen perustuvassa, nukleiinihappojen I t biologisen toiminnan säätely- tai ehkäisymenetelmässä sekä • · · *·' * virusten genomitoimintojen ekspressoitumisen valikoivassa ehkäisyssä ja virustoimintojen ennaltaehkäisyssä ja hoi-30 dossa, onkogeenitoiminnan ehkäisyssä ja syöpätautien hoi-: dossa.

,·, ; Stabiilisuuden mittana voidaan pitää in vivo kaavan ! I mukaisen, keksinnön mukaisesti muodostetun, veriseeru- , miin liuotetun oligoribonukleotidin käyttäytymistä. Ylei- v.: 35 nen testi on kuvattu esimerkissä 4. Keksinnön mukaiset 12 115400 oligoribonukleotidit hajoavat vastakohtana 3'-5'-oligori-bonukleotideihin niitä paljon hitaammin.

Esimerkissä 5 osoitetaan, että keksinnön mukaiset oligoribonukleotidit, jotka täyttävät hammerhead-ribotsyy-5 mien sekvenssivaatimukset, eivät poikkea entsymaattiselta aktiivisuudeltaan muuntamattomista ribotsyymeistä. Kuvioiden selitys:

Kuvio 1: Ribotsyymin p53-INV stabiilisuus seerumissa.

10 Kuvio 2: Muunnettujen ribotsyymien aiheuttaman sub straatin hajoamisen kinetiikka.

Kuvio 3: Ribotsyymien p53-l ja p53-lNV nukleolyyt-tinen hajoaminen.

Kuvio 4: Ribotsyymien Fp 53-INV ja p53-F(U,C),INV 15 nukleolyyttinen hajoaminen.

Esimerkki 1 2'-fluori-2'desoksinukleosidiyksiköiden synteesi (liite 1) 5 ' -O- (dimetoksitrityyli) -2 ' -f luori-2 ' -desoksiuri- 20 diini

Haihduteaan 50 ml:n kolvissa 0,5 g (noin 2 mmol) 2'-fluori-2'-desoksiuridiinia kahdesti 10 ml:n kanssa ab-: soluuttista pyridiinia. Kuivattu nukleosidi otetaan • I 4 * · 25 ml:aan absoluuttista pyridiinia ja saatuun seokseen 25 sekoitetaan huoneenlämpötilassa 0,66 g (noin 2,2 mmol) dimetoksitrityylikloridia ja 10 mg 4-dimetyyliaminopyri- • diinia. Kolmen tunnin kuluttua reaktioseokseen lisätään *·* 1 ml metanolia ja sen jälkeen seos haihdutetaan tyhjössä kuiviin. Jäljelle jäävä öljy otetaan 50 mitään metyleeni-,. i * ‘ 30 kloridia (neutraloitu alumiinioksidilla) ja saatu seos : ^ uutetaan kolme kertaa 50 ml:11a vettä. Orgaaninen faasi ,·] : kuivataan natriumsulfaatilla. Metyleenikloridin poistami- ! sen jälkeen raaka tuote jää jäljelle kiinteänä vaahtona.

, Suureksi osaksi trityloituneiden aineosien ja tritanolin v,: 35 poistamiseksi raaka tuote uutettiin 40 - 50 °C:n lämpöti- 13 115400 lassa 30 ml:11a absoluuttista bentseeniä. Saatiin 0,75 g valkoista kiinteätä ainetta vastaten 67 % teoreettisesta saannosta.

4-N-asetyyli-2’-fluori-2'-desoksisytidiini 5 Haihdutetaan 100 ml:n kolvissa 1 g (noin 4 mmol) 2'-fluori-2'-desoksisytidiinihydrokloridia kahdesti 20 ml:n kanssa absoluuttista pyridiinia ja kahdesti kulloinkin 10 ml:n kanssa absoluuttista asetonitriiliä. Kuivattu nukleosidinen aine suspendoidaan 40 ml:aan DMF:a ja 10 suspensioon lisätään 0,6 ml (noin 4,4 mmol) asetanhydri-diä. Päivän kuluessa reaktioseokseen lisätään tipoittain 0,5 ml (4,4 mmol) absoluuttista trietyyliamiinia. Liuotin poistetaan sen jälkeen öljypumpputyhjössä. Raaka tuote pestään 50 ml:11a dietyylieetteriä ja kuivataan sen jäl-15 keen. Puhdistus tapahtuu pylväskromatografiän avulla (Kieselgel 60H, pylväs 4 x 10 cm, eluentti: metyleeni- kloridi, jossa 0,1 % pyridiinia, gradientti metanoli); tuote eluoidaan 8 %:ssa metanolia. Liuottimen poistamisen jälkeen jäljelle jää 0,83 g (71 % teoreettisesta saannos-20 ta) tuotetta.

5 ' -0- (dimetoksi tri tyyli) -4-N-asetyyli-2 ’ -fluori-2 ’ -desoksisytidiini : Otetaan 100 ml:n kolvissa 4 mmol 4-N-asetyyli-2'- fluori-2 '-desoksisytidiiniä 25 ml:aan absoluuttista pyri-, 25 diinia ja saatuun seokseen sekoitetaan huoneenlämpötilassa 1,3 g (noin 4,4 mmol)dimetoksitrityylikloridia ja 20 mg * t · • *’ 4-dimetyyliaminopyridiinia. Kolmen tunnin kuluttua reak- *·* * tioseokseen lisätään 1 ml metanolia ja sen jälkeen seos haihdutetaan kuiviin tyhjössä. Jäljelle jäävä öljy otetaan 30 50 ml:aan metyleenikloridia (neutraloitu alumiinioksidil- : ·' la) ja saatu seos uutetaan kolme kertaa 50 ml:11a vettä.

,·' ; Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla. Metyleeni- ! kloridin poistamisen jälkeen raaka tuote jää jäljelle , kiinteänä vaahtona. Raa'an tuotteen puhdistamiseksi se v,: 35 kromatografoidaan käyttäen piihappogeeliä (Kieselgel 60H) 14 115400 (pylväs 2 x 20 cm, eluentti metyleenikloridi, jossa 0,1 % pyridiinia, gradientti metanoli). Tuote eluoitiin käyttäen 3 % metanolia metyleenikloridissa. Liuottimen poistamisen jälkeen jäljelle jäi 1,39 g (59 % teoreettisesta saannos-5 ta) valkoista, vaahtomaista kiinteätä ainetta.

2'-fluori-2'-desoksinukleosidin fosforihappoeste-riamidit

Liuotetaan 1 mmol suojattua monomeeria 5 ml:aan absoluuttista metyleenikloridia ja 1 ml:aan absoluuttista 10 di-isopropyyliamiinia. Argonin alla lisätään tipoittain yksitieruiskulla 1,2 mmol kloori-N,N-di-isopropyyliamino-β-syaanietoksifosfiinia. Tunnin kuluttua reaktio on lähes kvantitatiivinen ja se voidaan pysäyttää 0,1 ml:11a metanolia. Reaktioseos otetaan 20 ml:aan etikkahappoetyylies-15 teriä ja uutetaan kolme kertaa kulloinkin 20 ml:11a kyllästettyä NaCl-liuosta. Orgaaninen faasi kuivataan nat-riumsulfaatilla ja liuotin poistetaan. Raaka tuote otetaan 5 ml:aan metyleenikloridia ja saostetaan 400 ml:sta absoluuttista petrolieetteriä huoneenlämpötilassa. Sakan puh-20 distamisen (abfritten) jälkeen se kuivataan öljypumpussa ja varastoidaan -20 °C:n lämpötilaan.

•: · 5 ' -0-( dimetoksi tri tyyli )-4-N-asetyyli-2 ' -fluori-2 ' - : desoksisytidiinidi-isopropyyliamino-B-syaanietoksifosfii- • · >

• * · I

ni: . 25 Annos: 0,59 g (1 mmol) 5'-O-(dimetoksitrityyli)-4- ”** N-asetyyli-2'-fluori-2'-desoksisytidiiniä • ; Saanto: 0,60 g (0,78 mmol, 78 % teoreettisesta *·* * saannosta).

5 ' -0- (dimetoksitrityyli)-2'-fluori-2'-desoksiuri-..]·* 30 diinidi-isopropyyliamino-B-syaanietoksifosf iini:

Annos: 0,55 g (1 mmol) 5' -0-(dimetoksitrityyli)-2’- ; fluori-2 '-desoksiuridiinia • * * * ! Saanto: 0,61 g (0,83 mmol, 83 % teoreettisesta . saannosta).

• » t 15 115400

Esimerkki 2 CPG 10-1400-kantaja-aineen kuormittaminen 3'-0-di-metoksitrityylidesoksiribonukleosidiyksiköillä (liite 2) 3-0-DMTr-desoksiribonukleosidi-5'-O-sukkinaatti 5 Annos: 1.0 mmol 3'-0-DMTr-dN:ä 0,8 mmol meripihkahappoanhydridiä (80 mg) 0,5 mmol dimetyyliaminopyridiinia (61 mg) Meripihkahappoanhydridin reaktio desoksiribonukle-10 osidien 5'-OH-ryhmän kanssa toteutettiin kulloinkin 5 ml:ssa absoluuttista pyridiinia DMAP:n toimiessa katalyyttinä yön aikana huoneenlämpötilassa. Kun reaktio oli saatu täydellisesti päätökseen, liuotin haihdutettiin ja pyridiini poistettiin tislaamalla kolme kertaa aseotroop-15 pisesti toluolin kanssa. Jäännös otettiin dikloorimetaa-niin, pestiin 10-%:isella jääkylmällä sitruunahappoliuok-sella ja H20:lla ja orgaanista faasia pyöritettiin tyhjössä. Raaka tuote liuotettiin noin 3 ml:aan toluolia ja saostetiin 200 mlrssa n-heksaania.

20 Kantajakuormitus

Annos: . . 0,8 mmol 3-0-DMTr-dN-5'-O-sukkinaattia : ,·. 0,8 mmol p-nitrofenolia (112 mg) 2.0 mmol disykloheksyylikarbodi-imidiä • < 25 3 g aminopropyloitua CPG 10-1400:aa

Suojattu sukkinyloitu desoksitribonukleosidi lisät- * I1 tiin liuokseen, jossa oli p-nitrofenoli 5 ml:ssa absoluut- *·" ’ tista dioksaania ja 0,2 ml: ssa pyridiinia ja sen jälkeen seokseen lisättiin DCCI kondensaatioaineena. Kolmen tunnin 30 kuluttua reaktio oli tapahtunut täydellisesti. Saostunut : : disykloheksyyliurea poistettiin imemällä argonin alla ja : suodos lisättiin suoraan funktionalisoidun kantaja-aineen • 1 1 ! suspensioon 15 ml:ssa absoluuttista DMF:a. Reaktioseokseen . lisättiin 0,8 ml trietyyliamiinia ja sitä ravisteltiin yön v\· 35 yli· Kuormattu kantaja poistettiin imemällä, pestiin meta- 16 1 15400 nolilla ja eetterillä ja kuivattiin eksikkaattorissa. Reagoimattomien aminoryhmien salpaamiseksi kuormitettua kantajaa ravisteltiin liuoksen kanssa, jossa oli 1 ml etikka-happoanhydridiä ja 50 mg dimetyyliaminopyridiinia 15 5 ml:ssa absoluuttista pyridiinia, yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, sen jälkeen imusuodatettiin, sakka pestiin metanolilla ja eetterillä ja kuivattiin.

Esimerkki 3 2'-fluori-2'-desoksiuridiiniyksiköt ja 3'-3'-fosfo-10 riesterisidoksen 3’-päätteessä omaavien oligoribonukleoti-dien synteesi

Muunnetun "hammerhead"-ribotsyymin (taulukko 1) synteesi toteutettiin 0,2 ymoolin mitta-asteikolla käyttäen Pharmacia-yhtiön synteesilaitetta DNA-Synthesizer 15 Gene Assember Puis. Kantaja-aine synteesiä varten oli funktionalisoitu 5'-hydroksyyliryhmän kautta riippuvan desoksiadenosiinirakenneosan avulla; synteesissä siitä on tuloksena käänteinen rakenne oligonukleotidin 3'-päätteessä. Valmistus tapahtui oligoribonukleotidisynteesien stan-20 dardipöytäkirjan mukaan fosforihappoesteriamidimenetelmäs-sä.

: .·. p53-INV: 5 ' -r(AAAGA UCUGA UGAGG CCGUU AGGCC GAAAC

♦ i AGGG)-3 ' -3 ' -dA-5 '

. 25 Fp53-INV: 5'-rArArArGrA fUrCfUrGrA fUrGrArGrG

rCrCrGfUfU rArGrGrCrC rGrArArArC rArGrGrG-3 ' -3 ' -dA-5 ' 1

Taulukko 1: fN: 2'-fluori-2-desoksinukleosidi 30 rN: ribonukleosidit : 2'-fluori-2'-desoksinukleosidien fosforihappoeste- .·. ; riamideja käytettiin konsentraation ollessa 0,12 M aseto- ! nitriilissä. Ketjunpidennysvaiheessa saatetaan reagoimaan 0,1 ml amidofosfiittia 0,37 ml:n kanssa tetratsoliliuosta v.» 35 (0,5 m) kantajaan sitoutuneiden oligonukleotidin 5'-hyd- 17 115400 roksyyliryhmien kanssa. Kytkentä kestää 12 minuutin ajan, minkä jälkeen tuote paloitellaan, hapetetaan ja detrity-loidaan seuraavaa kytkentävaihetta varten standardinomai-sesti. Kytkentäsaannot olivat keskimäärin 99 %.

5 Emäslabiilien suojaryhmien lohkaisemiseksi pois ja kantajaan kiinnittyneiden aineiden erottamiseksi kantaja siirrettiin synteesin jälkeen ruuveilla kiinnitettävään Eppendorf-reaktioastiaan. Sitä inkuboitiin 55 °C:n lämpötilassa 12 tunnin ajan 2 ml:n kanssa 32-%:isen ammoniakin 10 ja etanolin 3 : 1 -seosta. Jäljelle jäänyt liuos erotettiin pois, jäähdytettiin -20 °C:n lämpötilaan ja pakaste-kuivattiin varovaisesti. Kuiva jäännös suspendoitiin 0,4 ml:aan 1,1 M TBAF-liuosta THF:ssa ja suspensiota inkuboitiin edelleen 16 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktio 15 pysäytettiin lisäämällä sama tilavuus trietyyliammonium-asetaattipuskuria (TEAA-puskuria). Liuos jäähdytettiin -70 °C:n lämpötilaan ja haihdutettiin varovaisesti 0,4 ml:n tilavuuteen. Lisättiin 40 μΐ natriumasetaattia, 1,4 ml etanolia ja 5μ1 etikkahappoa, minkä jälkeen tuote 20 saostui yön kuluessa -20 °C:n lämpötilassa. Näyte sentri-fugoitiin ja sakan päälle noussut neste kaadettiin pois. Kuiva oligonukleotidi otettiin formamidisinimerkitsijän ja ; , veden 1 : 1 -seokseen ja kaadettiin akryyliamidigeelille ! (20-%:inen, 7 M urea). Tuotenauhojen (Produktbande) iden- 25 tifioimiseksi ja leikkaamiseksi erilleen geeli peitettiin ;*; sellofaanifoliolla. Eluointi tapahtui 40 °C:n lämpötilassa • 1 » : ·' ammoniumasetaattiliuoksella. Viiden tunnin kuluttua liuos v ’ saostettiin, kuten edellä on kuvattu. Oligonukleotidi pes tiin 70-%:isella etanolilla, suspendoitiin uudelleen ‘ 30 70-%:iseen etanoliin ja varastoitiin -70 °C:n lämpötilaan.

; : Esimerkki 4 . . Muunnettujen ribotsyymien stabiilisuuden tutkiminen veriseerumitestissä

Ribotsyymi p53 sekä muunnetut oligoribonukleotidit : : 35 p53-INV ja Fp53-INV merkittiin radioaktiivisesti entsy- 18 115400 maattisesti T4-polynukleotidikinaasilla (-32p)-dATP:n läsnä ollessa (spesifinen aktiivisuus: 4 500 Ci(mmol)). Sekvensseillä, joilla on 3'-3'-invertointi, on molemmin puolin 5'-hydroksiryhmä ja sen vuoksi ne fosforyloituvat 5 osittain molemmista päistä.

Merkityt ribotsyymit käsiteltiin tuoreella ihmisen seerumilla.

Annos: 1 pmol fosforyloitua ribotsyymiä 10 20 μΐ seerumia Näytteitä inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa. Seuraa-vassa esitettyjen aikojen kuluttua otettiin kulloinkin 2 μ1:η näyte ja fenoloitiin: p53: 0, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 min 15 p53-INV ja Fp53-INV: 0, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240 min.

Fenoloidut näytteet pakastekuivattiin, otettiin 95-%:iseen formamidi-kuormituspuskuriin ja erotettiin 20-%:iselta polyakryyliamidigeeliltä 8 M urean avulla 20 55 °C:n lämpötilassa elektroforeettisesti.

Nauhojen intensiteetti röntgenfilmillä mitattiin laserdensitometrin avulla (katso kuva 1). Tutkittujen • * * * : ribotsyymien puoliintumisajat (t% = 30 min Fp53-INV:n ta- # · t ' \ pauksessa, 1 min P53-INV:n tapauksessa ja << 1 min biolo- • · . 25 gisen oligoribonukleotidin p-53 tapauksessa, katso esi- • » * *"] merkki 5) osoittavat selvästi terminaalisen invertoinnin • · • *' suojaavan vaikutuksen.

• » * V * Esimerkki 5 20-meerinen substraatti-oligoribonukleotidi, SB-1 t 30 5 ' -r(GC CCC UGU CAU CUU UUG UCC)-3' merkittiin radioaktii- ; : visesti entsymaattisesti T4-polynukleotidikinaasin avulla . 32P-ATP:n läsnä ollessa (spesifinen aktiivisuus: 4 500 » - > ' I Ci/mmol) 5'-päähän liittyen. SB-1:n hajoamisreaktio eri laisten ribotsyymien vaikutuksesta toteutettiin seuraavas-’ : 35 ti: Reaktio-olosuhteet olivat: 50 mM Tris HC1, pH-arvo * 7,5, 20 mM MgC2 50 °C:n lämpötilassa.

19 115400

Substraattikonservtraatio SB-1 oli 0,025 μΜ (vaihtelu 0,05, 0,1 ja 0,25 μΜ), ribotsyymikonsentraatio oli 0,02 μΜ. Sitten 30 minuutin kuluessa näytteet otettiin seuraavina ajankohtina: 1 min, 5 min, 10 min, 15 min ja 5 30 min, ja näytteisiinn sekoitettiin kuormituspuskuri.

Näytteet erotettiin elektroforeettisesti 20-%:iselta po-lyakryyliamidigeeliltä (8 M urea) 55 °C:n lämpötilassa. SB-l-nauhojen intensiteetin väheneminen määritettiin rönt-genfilmillä laserdensitometrin avulla.

10 Ribotsyymeinä käytettiin:

P53-INV, Fp53-INV (katso edellä), p53 ja Fp53 p53: 5'-r(AAGA UCUGA UGAGG CCGUU AGGCC GAAAC

AGGGA)-3'

Fp53 : 5'-r(AAAGA fUCfUGA fUGAGG CCGfUfU AGGCC GAAAC 15 AGGGA)-3'.

SB-l:n hajoamisnopeus ei eroa käytettäessä ribot-syymejä p53 ja p53-INV. Myös ribotsyymeillä Fp53 ja Fp53-INV on sama aktiivisuus, joka on kuitenkin noin tekijä 5:ttä pienempi kuin ribotsyymillä p53.

20 Esimerkki 6

Substraatin hajoaminen ja kineettiset mittaukset ,·. Reaktion edellä esitettyjen alkunopeuksien mittaa- • · i »

: minen toteutettiin käyttäen 40 nM substraattia ja 4 nM

• · * entsyymiä 50 nM tris-Cl:ssa (pH-arvo 7,5). Reaktio aloi-, 25 tettiin lisäämällä 10 nM MgCl2:a. Hajoamistuotteen määrä I l # mitattiin 55 °C:n lämpötilassa 1, 2, 5, 10 ja 15 minuutin ·’ *’ kuluttua. Tästä kokeesta määritettiin Km-arvo likimäärin.

v * Alkureaktionopeuksien tarkemmat mittaukset toteutettiin menetelmän mukaan, jonka on kuvannut C. H. Suelter (1985) ’ ' 30 teoksessa "A practical Guide Enzymology", J. Wiley, New ,* : York, 231. Tällöin kuudessa eri reaktiossa käytettiin , 40 nM entsyymiä kulloinkin 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, ' ’ 500 nM ja 1 000 nM substraatin kanssa. Määrättyjen aikavä lien jälkeen otettiin 2 μ1:η näyte ja reaktio pysäytettiin ; : 35 lisäämällä fenolia. Sen jälkeen näytteet erotettiin dena- 20 115400 turoidulta geeliltä (20-%:inen PAGE, 7 M urea) ja analysoitiin.

Substraatti: SB-1 (esimerkki 5)

Ribotsyymit: p53-INV (esimerkki 3)

5 p53-F(U,C,),INV:5'-rArArArGrA fUfCfUrG

rAfUrGrArGrGfCfCrGfUfUrArGrGfC fCrGrArArAfCrArGrGrG-3'-3’-dA-5’ p53-l: 5'-5 (AAA GAU CUG AUG AGG CCG UUA GGC CGA AAC AGG G)-3' 10 Kineettisten parametrien määritys

Alkureaktionopeus mitattiin käyttäen viittä erilaista substraattikonsentraatiota progressiokäyrän varhaista vaihetta varten siihen ajan kohtaan saakka, kun tuotteen muodostumisnopeus oli lineaarinen (4 minuutin 15 kuluttua). Näiden kineettisten mittausten tyypilliset tulokset osoittaa kuva 2. Koska kokeissamme reaktiot aloitettiin lisäämällä reaktioseokseen kaksiarvoisia kationeja eikä siten sallittu entsyymikonformaation muodostumista, reaktion alun jälkeen havaittiin lepovaihe tavallisesti 20 5-10 minuutin kuluttua. Seuraavat entsymaattiset para metrit määritettiin Eadie-Hofstee-päällysteestä (-Auf-trag).

Taulukko 2 25 li Γ ....... ' ” ·;· Ribosyymi Km ^max ^eat ^cat/^m (nM) (min'1) (min'1) ((/M'1 min'1) : P53-1 24 8,6 0,21 8,75 P53-INV 230 52,3 1,30 5.65 30 ·;;; p53-F(U,C),INV 180 40,9 1,02 5,56 * » , · l · s » ; ( 21 115400

Esimerkki 7

Merkitseminen

Substraatti ja entsyymit merkittiin radioaktiivisesta [γ-32Ρ]ATP:llä ja polynukleotidikinaasilla. Ei-kiin-5 nittyneet (nicht-eingebaute) nukleotidit poistettiin uuttamalla fenolilla ja sen jälkeen saostamalla etanolilla.

Testi hajoamisen määrittämiseksi

Hajoamisen kinetiikka käyttäen muunnettuja ribot-syymejä määritettiin siten, että radioaktiivisesti merki-10 tyt oligoribonukleotidit liuotettiin yhdistettyyn, tuoreeseen ja laimentamattomaan ihmisen seerumiin loppukonsen-traation ollessa 20 000 cpm/pl. Sen jälkeen kun alkunäyt-teet oli otettu, reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa. Määrätyin aikavälein otetiin 1 pm:n näytteet ja 15 reaktio pysäytettiin fenolin avulla. Näytteet uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla, minkä jälkeen ne sus-pendoitiin 80-%:iseen formamidiin, joka oli 20 nM EDTA:n suhteen, 0,01-%:inen bromifenolisinisen suhteen ja 0,01-%:inen hyleenisyanotin suhteen. Hajoamistuotteet ero-20 tettiin 20-%:iselta polyakryyliamidigeeliltä (PAGE) 7 M urean avulla.

Ribotsyymien p53-l ja p53-INV inkuboinnin tulokset esitetään kuvassa 3. Kuvasta nähdään, että käännetty ra- » · * **’ ; kenne 3'-päätteessä saa jo yksin aikaan ribotsyymien sta- i · * f 25 biilisuuden paranemisen seerumin läsnä ollessa alle 10 se-··· kunnista useampiin minuutteihin.

i · : Kokeet toteutettiin käyttäen 1 pmolaarista muunta- V * matonta (p53-l) ja muunnettua (p53-INV) ribotsyymiä 10 pm:ssa laimentamatonta ihmisen seerumia 37 °C:n lämpö-30 tilassa. Geelireunan lukemat vastaavat vastaavien pituus-• ; standardien asemia.

', Ribotsyymien Fp53 ja p53-(U,C),INV inkuboinnin tu- \ lokset esitetään kuvassa 4. Niistä on oletettavissa, että ribotsyymissä p53-F(U,C),INV ei havaittu hajoamista 4 tun-; 35 nin inkuboinnin jälkeen laimentamattomassa seerumissa. 48 22 115400 tunnin kuluttua havaittiin, että hajoaminen oli vähemmän kuin 10 %. Kokeet toteutettiin käyttäen 1 pmolaarisia muunnettuja ribotsyymejä, jolloin ribotsyymillä Fp53 oli käännetty rakenne 3-päätteessä ja se oli fluorattu asemiin 5 U6, U8, Un, U19 ja U20 liittyen. Ribotsyymi p53-F(U,C9, INV on lisäksi fluorattu sytosiinijäännöksiin C7 ja C30 liittyen.

* f * »

I I S

• · « e t t * * I I · > » 23 115400

Liite 1: 2’-fluori-2'-desoksisytidiini- (A) ja 2’-fluori-2’-desoksiuridiinifosforihappoesteriamidin (B) synteesi 5 »

A NHK

Tj xS »X

HOcry 5. Trity- O^s*^6· F°sfi- J

loiminen ty loiminen®*0*0 ]-f OifTr-α / Pyridiini \ / ~ , . . , " \ / 10 OH f I W /£tN ]-f 0 f NC(CHj)j—0*^ 'V—^ /k 15 20 "VN ^V^16·ros£1- \ f - _____ \ / tyloiminen JT1 OUTr-a / Pyridiini ^ („ , V/ ...: o r i

..... nc(chj)*—0^ 'V—S

25 V

!.·. 0)! a

· I

NC(CH2)r—0-^· Ni-<^

30 A

24 115400

Liite 2 3'-O-DMTr-desoksiribonukleosidi-5'-O-sukkinyyli-p-nitrofenyyliesterin synteesi ja kontrolloidun huokoslasi-kantajan (controlled-pore-glass) kuormittaminen 5

•"l^· °"£c'° J-'-w "O"* <'°>S

I o = c I o=c I * DM TO t OOMTt I OOUTf

OM O

10 B - Tyrniini φ.

N^-Bentsoyyliadeniini H,N O SIO

N2-Bentsoyylisytosiini N -Isobutyryyliguaniini S'

O

DMTr = 4,4'-Dimetoksitrityyli ι λ λ I λ .o-i „ B

&0Γ0 ° 15 ι οομτγ OOMTr 20

Claims (7)

1. 25 115400
2. 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oli-goribonukleotidien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 R1-0—v B Yy O R3 z—P=W °~γ°γΒ \_/ (I) I_9 R3 In R2 jossa R1 tarkoittaa vetyä tai jäännöstä, jolla on 10 kaava II B\ o /—0—P=W' \ / Z' R3 X (,l) • * .· R2 jäännöstä, jolla on kaava III y ’ · is • I 1 t t 26 115400 χ__ Λ Β Ύγ O R3 2'—P=W' (***) Β tarkoittaa emästä, kuten esimerkiksi luonnollisia emäksiä, kuten adeniinia, tymiiniä, sytosiiniä, guaniinia, tai ei-luonnollisia emäksiä, kuten esimerkiksi puriinia, 5 2,6-diaminopuriinia, 7-deatsa-adeniinia, 7-deatsaguaniinia, N4,N4-etanosytosiinia tai niiden esilääkemuotoja; jolloin emäkset urasiili tai sytosiini sisältyvät oligoribonukleotidiin; R3 on toisistaan riippumatta OH, vety tai F, kor-10 keintaan yksi R3-jäännös on H, ja; joko kaikissa U-nukleosideissa tai sekä kaikissa tiettä C-nukleosideissä R3 on F; W ja W tarkoittavat toisistaan riippumatta happea ··· tai rikkiä; • 1 2 3 1 » 15. ja Z' ovat toisistaan riippumatta O'; S'; Ci_ie- 2 • 1 · » alkoksi, edullisesti Ci-8-alkoksi, Ci-i8-alkyyli, edullisesti Ci-8-alkyyli, NHR4, jossa R4 = Ci_i8-alkyyli tai Ci_4-alkoksi-Ci-6-alkyyli, edullisesti metoksietyyli; NR4R5, jossa R4 on kuten edellä on määritelty ja R5 on Ci_i8-alkyyli, edulli- • tl 3 ’ 20 sesti Cj-e-alkyyli, jossa R4 ja R5 tarkoittavat yhdessä nii tä kantavan typpiatomin kanssa 5-6 -jäsenistä heterosyk-listä rengasta, joka voi sisältää lisäksi muun heteroatomin sarjasta O, S, N, kuten esim. morfoliinia; : jolloin X on OH, H, F, Cl, Br, NH2, N3, 0-C(0)-(Ci- 25 i8) -alkyyli, O-C (O) - (C2-ie) -alkenyyli, O-C (O) - (C2-ie) -alky- nyyli, O-C (O) - (Ce-is) -aryyli, O- (Ci-i8) -alkyyli, 0-(C2_i8)-alkenyyli, O- (C2-i8) -alkynyyli, O- (Ce-is) -aryyli, P(0)YY', ’/·[ jolloin Y ja Y' ovat kuten on määritelty ryhmille Z ja Z', jolloin kaavassa II R3 ja X voivat muodostaa yhdessä sykli- 27 115400 sen fosforihappodiesterin, edullisesti X on OH, H, F; n on kokonaisluku 5 - 60, edullisesti 15 - 25, sekä niiden fysiologisesti siedettävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 a) nukleotidiyksikkö, jolla on 3'- tai 5'- terminaaliset fosfori(III)- tai fosfori(V)-ryhmittymät, tai sen aktivoitu johdannainen saatetaan reagoimaan muun nuk-leotidiyksikön kanssa, jolla on 3'- tai 5'-terminaalinen, vapaa hydroksiryhmä, tai 10 b) muodostetaan oligonukleotidi fragmenttien avulla samalla tavalla; kohdan (a) tai (b) mukaisesti saaduista oligonukleotideistä lohkaistaan pois mahdollisesti yksi tai useampi muiden toimintojen suojaksi väliaikaisesti lisätty suojaryhmä ja näin saadut, kaavan I mukaiset oligonukleoti- 15 dit muutetaan mahdollisesti fysiologisesti siedettäväksi suolaksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mentelmä, tunnettu siitä, että R3 on kaikissa U- ja C-nukleo-sideissa F.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R2 tarkoittaa kaavan III mukaista jäännöstä ja R1 tarkoittaa vetyä; R1 tai R2 tarkoit-; taa kaavan II tai III mukaista jäännöstä; tai R2 tarkoittaa vetyä ja R1 tarkoittaa kaavan II mukaista jäännöstä, jol-·;· 25 loin viimeksi mainitussa tapauksessa joko W tai Z ei tar- koita happea ja X on OH tai H.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että W tarkoittaa happea . tai Z ja W tarkoittavat molemmat happea.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene- ·;* telmä, tunnettu siitä, että R2 tarkoittaa kaavan III mukaista jäännöstä ja R1 tarkoittaa vetyä. *:··: 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen mene- telmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukaiset oli-’ 35 goribonukleotidit on lisäksi substituoitu ryhmillä, jotka "· edistävät solunsisäistä ottoa ja jotka toimivat in vitro 1 1 5400 28 tai in vivo reportteriryhminä ja/tai ryhminä, jotka biologiseen DNA:hän tai RNA:han liittyvän oligonukleotidin hyb-ridisaatiossa tarttuvat näihin DNA- tai RNA-molekyyleihin sitoutuen niihin tai hajottaen niitä.
7. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan oligoribonukle-otidi, joka on ribotsyymi, jolla on synteettinen 5'- ja/tai 3'-pää. • I » * 1 1 » • « » • » < · I • · 1 • · » » 1 tl» I » i 1 · 29 115400