PT98169B - Processo para a preparacao de analogos de oligonucleotidos com ligacoes internucleotido 3'-3' ou 5'-5' terminais - Google Patents
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Description
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 98 169
REQUERENTE: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DE OLIGONUCLEÔTIDOS COM LIGAÇÕES INTERNUCLEÕTIDO 3'-3' ou 5'-5' TERMINAIS
INVENTORES: Hannelore Rõsch, Anja Fròhlich, Jose Flavio
Ramalho-Ortigão, Prof. Dr. Matthias Montenarh e Prof. Dr. Hartmut Seliger
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. República Federal da Alemanha em 2 de Julho de 1990, sob o nQ P 40 21 019.7.
INPI. MOD. 113 RF 18732 ϊ
Descrição referente â patente de invenção de HOECHST AKTIEN GESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores-: Hannelore Rosch, Anja Fróhlich, Jose Flavio Ra malho-Ortigão, Prof. Dr. Matthias Montenarhe Prof. Dr. Hartmut'..Seliger, residentes na República Federal Alemã), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DE OLIGONUCLEÕTIDOS COM LIGAÇÕES INTERNUCLEÔTIDO 3'-3' ou 5'-5' TERMINAIS .
DESCRIÇÃO
Como oligonucleótidos de sentido inverso enten dem-se fragmentos de ácidos nucleiCosocuja sequência é ( complementar ã sequência codificante ou de sentido directo de um RNA mensageiro ou â cadeia codogénica do DNA. Tais oligonucleótidos são cada vez mais utilizados para a inibição da expressão de ge nes in vitro ou em sistemas de cultura celular. O emprego destas substâncias na área medico-terapêutica, p.ex. como fármacos antivirais, constitui o objectivo de numerosas investigações.
Em biologia conhecem-se já desde há muito sequências de RNA de sentido inverso como reguladores naturais da expressão de genes • em células procarióticas (T. Mizuno, Μ. Y. Chou e M. Inouye,
N.
Proc. Natl. Sei. USA 81, 1966-1970 (1984)) e ainda em células eucarióticas (S. M. Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772 (1986)). Têm um efeito inibitório da translacção por hibridação com um RNA mensageiro correspondente. Em numerosas experiências mostrou-se entretanto que as referidas sequências RNA de sentido inverso, quando introduzidas em bactérias (A. Hirashima, S. Sawaki, Ϋ. Inokuchi e M. Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)) ou em células eucarióticas (J. G. Izant e H- Xeintraub, Cell 36, 1007-1015 (1984)), podem também aí impedir a expressão de genes e possuem um efeito antiviral (L.-J. Chang e C. M.Stol tzfus, J. Virology 61, 921-924 (1987)) e aindà um efeito antioncogénico (J. T. Holt, Τ. V. Gopal, A. D. Moutton e A. W. Nien huis, PNAS USA 83, 4794-4798 (1986)). Em tais experiências os oligonucleótidos sintéticos têm, em relação ao RNA de sentido inverso biológico, a vantagem de uma maior estabilidade e de uma mais fácil acessibilidade. Isto baseia-se nas técnicas de sínte se recentemente melhoradas que tornam possível a obtenção de oli gómeros mais curtos (E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14, 274-325 (1986); Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Expression, J. S. Cohen, ed., Macmillan Press, 1989, p. 7ff.).
Verificou-se que esses oligómeros curtos são activos como modeladores de expressão. Além disso, esses oligonucleótidos podem ainda actuar.vpor ligação ã cadeia dupla de DNA formando uma hélice tripla. De modo a que tanto os oligonucleótidos de sentido inverso como os oligonucleótidos que formam a hélice tripla possam ser introduzidos em sistemas biológicos, de vem preencher-se as. condições seguintes (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J. S. Cohen ed. Macmil lian Press, 1989, p. lff:).:
1. devem por um lado ser facilmente solúveis em água mas por í outro passarem facilmente a membrana celular lipófila,
2. devem ser, no interior da célula, resistentes â degradação, isto é, estáveis contra nucleases,
3. devem formar híbridos estáveis com ácidos nucleícos intrace lulares, a temperaturas fisiológicas,
4. a hibridação deve ser selectiva; a diferença de temperatura de dissociação para um oligonueleotido que origine um erro de emparelhamento deve ser suficientemente grande para que ele possa ser removido especificamente.
Em 1978 Zamecznik e Sfephenson, PNAS USA 75,
280-284 e 285-288 demonstraram pela primeira vez que os oligonu cleótidos não modificados podem impedir a multiplicação de virus de sarcoma Rous. Os oligonucleótidos empregaram-se aliás em concentrações muitos elevadas, efectuando-se a maior parte das experiências em meios pré-aquecidos para inactivar as nucleases. A necessidade destas medidas resulta da rápida degradação enzimática à qual estão sujeitos os ácidos nucleicos estranhos no soro e nas células.
Tinham-se feito anteriormente experiências com o objectivo de modificar estruturalmente os nucleótidos, de modo a preencherem melhor as condições acima mencionadas, em particular de os proteger melhor contra a degradação pelas nucleases. Estas experiências concentraram-se principalmente na modificação da ligação internucleõtido, uma vez que estes extremos constituem pontos de ataque das nucleases. Pode-se fundamentalmente dividir as ligações internucle+otido modificadas em:
a) ligações nueleótido com fósforo com o átomo central.
Estas podem ainda ser:
iónicas/quirais, iónicas/aquirais e neutras/quirais,
b) ligações nueleótido neutras/aquirais isentas de fósforo.
Entre as ligações internucleõsido iónica.s modificadas estruturalmente encontram-se as ligações tiofosfato e ditiofosfato. Os oligonucleótidos modificados tiofosfato (Oligo deoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen ed. Mcmillan Press, 1989, p. 97ff) apresentam actualmente os melhores efeitos inibitórios da expressão de genes em culturas celulares, mostrando aliás esta inibição não estar ligada a uma sequência específica, uma vez que estes oligonucleótidos
tiofosfato modificados apresentam efeitos inibitórios constitui dos apenas por uma unidade de ácido nucleico, p. ex. análogos tiofosfato do oligocitidilato. Uma limitação ao emprego de oligonucleótidos tiofosfato modificados é ainda a sua quiralidade.
Uma vez que na preparação de um oligonucleótido de n bases se obtêm 2n 1 diastereómeros, apenas uma pequena parte de um preparado contendo ligações tiofosfato tem boas pro priedades de hibridação.
No caso de oligonucleótidos com ligações inter nucleósido ditiofosfato (A. Grandas, William S. Marshall, John Nielsen e Martin M. Carathers, Tetrahedron Lett. 20, 543-546 (1989); G. M. Porritt, C.B. Reese, Tetrahedron Lett. 30, 4713-4716 (1989)), evita-se o problema da quiralidade. Contudo, até agora, tais compostos só se têm podido obter por meio de sínteses complicadas, com vários passos e baixos rendimentos. Por is so não se puderam até agora efectuar experiências importantes sobre o comportamento de hibridação, principalmente em culturas celulares.
Uma outra classe de oligonucleótidos quimicamente modificados é a dos que possuem ligações internucleósido não iónicas, isto é, neutras. A este tipo de estrutura modifica da pertencem os oligonucleótidos com ligações internucleósido fosfotriéster ou metilfosfonato (Oligodeoxinucleótides, Antisen se Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillian Press, 1989, pág. 79ff).
As duas classes de compostos têm em comum o fa cto de o grupo fosfato ionizãvel estar substituído por um grupo não carregado. Através da introdução de uma tal ligação estes análogos de oligonucleõtido tornam-se resistentes a nucleases, mas têm a desvantagem de possuírem uma pior solubilidade em meio aquoso.
Até agora os oligonucleótidos com ligação internucleósido neutra/aquiral só se podiam obter substituindo o
átomo de fósforo da ligação internucleósido por um outro átomo central. Uma ligação siloxano é análoga à ligação de éster - de ãcido fosfórico. Sintetizaram-se oligonucleótidos com ligações internucleósido siloxano (K.K.Ogilvie, J.F.Cormier, Tetrahedron Lett. 26,4159 (1985); H.Seliger, G.Feger, Nucl. Nucl.. 6(182), 483-484 (1987)) que são estáveis contra nucleases.
Conhecem-se ainda oligonucleases com ligações internucleósido carbonato, acetal ou carboxamida (M.Matteucci, Tetrahedron Lett. 31,2385-2388 (1990); J.R.Tittensor, J.Chem. Soc. C. 1971, p. 2656 e J. Coull et al., Tetrahedron Lett. 28, 745 (1987)).
Puderam também preparar-se análogos de oligonu cleótidos resistentes a nucleases, sem alteração da ligação internucleótido fosfodiéster, introduzindo substituintes açúcar de configuração alterada. Foi o caso da síntese de análogos de oligonucleótidos em que as nucleases se encontram ligadas na con figuração &-glicosídica (Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.S. Cohen, ed. Macmillan Press, 1989 S.119ff). Tais análogos de oligonucleótidos são contudo difíceis de obter â escala preparativa, uma vez que têm de ser construídos a partir do açúcar e da base. Além disso, no que respeita j ao sentido de orientação da hibridação, apresentam em parte um comportamento anormal.
O objectivo da invenção são nucleótidos de fór mula I ou II
nas quais
R1 significa hidrogénio ou um grupo de fórmula III ,°K r o - p = w' I z1 •OH (III)
R significa hidrogénio ou um grupo de fórmula IV
(IV) sendo contudo, pelo menos um dos grupos R ou R um grupo de for mula III ou IV;
B representa uma base, como por exemplo bases naturais como adenina, limina, citosina, guanina, ou bases não naturais co mo por exemplo purina, 2,6-diamino-furina, 7-desaza-adenina, 4
7-desaza-guanina, N -etanocitosina, bem como as respectivas
formas pró-droga;
W e W', independentemente um do outro, significam oxigénio ou enxofre;
Z e Z' independentemente um do outro, significam 0 , S , alcooxilo-C^-C^g, de preferência alcooxilo-C^-Cg, em especial alcooxilo-C^-C^g, de preferência alquilo-C^-Cg, em especial aL quilo-C^-Cg, em particular metilo; NHR3, com R3=. ide preferên cia alquilo-C^-C^g, em especial alquilo-C^-C^g, em particular alquilo-C^-C^, ou alcooxi-C^-C^-alquilo-C^-Cg, de prefe rência metoxietilo; NRjr\ em que RJ se define como acima e 4 R e de preferencia alquilo-C.,-C-, o, em especial alquilo-C, i lb 34 1
-Cg, em particular alquilo-C^-C^, ou em que R e R formam conjuntamente com o átomo de azoto que contêm um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, que pode conter adicionalmente um heteroãtomo de 0,5 ou N, como por exemplo morfolina;
Y significa um grupo O-Si(R)2, OCH2, C(O)NR ou O-CH2-C(O), em que R é alquilo-C^-Cg, arilo ou cicloalquilo-C^-Cg; e n é um número inteiro de 5-60, de preferência 10-40 e em especial 15-25, bem como os respectivos sais fisiologicamente assimiláveis.
Neste contexto deve entender-se por arilo, p. ex. fenilo e fenilo substituído (1 a 3 vezes) por alquilo-C^—Cg, alcooxilo-C^-Cg e/ou halogéneo.
Preferem-se os oligonucleotidos de fórmula I.
Preferem-se ainda os oligonucleotidos de fórmu
- - 1 7 la I, em que R e um grupo de formula IV e R significa hidroge
- 2 mo; R ou R representam um grupo de formula III ou IV; ou R significa hidrogénio e R^ é um grupo de fórmula III, em que ou W ou Z no último caso não significam oxigénio.
Em especial referem-se ainda oligonucleotidos em que W é oxigénio ou Z e W são ambos oxigénio.
Preferem-se muito em especial os oligonucleõ2 - - 1 tidos de formula I, em que R e um grupo de formula IV e R significa hidrogénio.
Prefere-se ainda nucleótidos de fórmula I e II, adicionalmente substituidos por grupos que facilitam a assimila ção intracelular, que servem como grupos repórter in vivo ou in vitro, e/ou por grupos que, na hibridação do oligonucleótido ao DNA ou RNA biológico, atacam estas moléculas de DNA ou RNA por ligação ou cisão.
Exemplos de grupos que facilitam a assimilação intracelular são grupos lipófilos como grupos alquilo, p^_ex.com até 18 átomos de carbono, ou colesterilo, ou conjugados que uti lizam os sistemas de transporte naturais, como p. ex. ácido gálico ou péptidos para os receptores correspondentes (p. ex. endozitoso mediada por receptor). Rxemplo de grupos repórter são grupos fluorescentes (P. ex. acridinilo, danoilo, fluoresceneilo) ou grupos quimiluminescentes como p. ex. grupos éster de acridínio.
Os conjugados de oligonucleótido que ligam e/ou cindem ácidos nucleicos, contêm acridina (N. Thuong et al., Tetrahedron Lett. 29, p. 5905, 1988), Psorales (U.Piles et al., Nucleic Acid·Res. Vol. 17, p. 285, 1989) ou conjugados de cloro etilaminoarilo (Oligodeoxynucleótides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, J.J.Cohen, ed. Mc Millan Press, 1989, p. 173ff)
A modificação estrutural característica dos oligonucleótidos de acordo com a invenção consiste em as ligações internucleõtido nos dois extremos da cadeia serem modifica das, isto é, em vez das ligações biológicas 3'-5' serem iliga-< ções 3'-3' ou 5’-5'- Descobriu-se surpreendentemente que estas modificações estruturais mínimas bastam para estabilizar estes compostos contra a degradação por nucleases.
Como se descreve a seguir, esta pequena modificação estrutural provoca um comportamento de hibridação que quã se iguala o dos oligonucleótidos biológicos. Daqui resulta a aplicabilidade geral destes compostos como inibidores da expres são de genes em culturas de células.
Na literatura não são até agora conhecidos pro cessos de preparação de análogos de oligonucleótidos com 1ligações internucleõtido 31-31 e 51-51 em ambos os extremos da cadeia, bem como a sua utilização como oligonucleótidos de sentido inverso. Análogos de fosfatos de dinucleótido, que contêm li gações 3'-3' ou 5'-5', têm sido preparados e investigados desde há vários anos como produtos principais (A. Hyles, W. Hutzenlaub, G. Reits e W. Pfleiderer, Chem. Ber. 108, 2857-2871 (1975); H. Rokos, Á.Myles, W.Huntzenlaub e W.Pfleiderer, Chem. Ber. 10.8, 2872-2877 (1975); J.Tomasz, Nucl. Nucl. 2(11, 51-61(1983); M. nemer, N. Theriault, A.Schifmann e K.K.Ogilvie, Vith Internatio nal Round Table, Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications, La Grande Mohe, ed. J.L.Imbach, 94-96 (1984)) ou como produtos secundários (R.Letsinger, K,K, Ogilvie, J-Amer. Chem. Soc. 89,4801-4802 (1967)) das correspondentes reacções de condensação. Esses dímeros não são contudo, devido ao seu baixo ponto de fusão, capazes de fazer uma hibridação estável com ãci dos nucleicos celulares. Construiram-se oligonucleótidos com li gação 5'-5' apenas num dos extremos de modo a introduzir uma po sição de ligação por grupos repórter em sondas genéticas (S. Agravai, C. Christodoulon, M.J.Gait, Nucl. Acids Res. 14,6227-6245 (1986)). Não foram contudo até agora investigados no que respeita ao seu comportamento de hibridação. Para ensaios biofísicos prepararam-se oligonucleótidos autocomplementares, que possuem no interior da molécula uma única ligação 3'-3' ou 5'-5' (J.H. van de Sande. N.B.Ramsin, M.W.German, W. Elhorst, B.W.Kalisch, E.V.Kitzing, R.T.Pon, R.C.Clegg, T.M.Jovin, Science 241, 551-557 (1988)).
A preparação de oligonucleótidos com ligação . 3'-3' e.5'-5' terminal invertida efectua-se de modo análogo ao da síntese de oligonucleótidos biológicos, em solução ou, de preferência, em fase sólida, utilizando eventualmente um sintetizador automático.
Deste modo, é ainda um objectivo da invenção um processo para a preparação de oligonucleótidos de fórmula I, caracterizado por
a) se fazer reagir uma unidade de nucleótido com grupos fósforo (III) ou fósforo (V) terminais 3' ou 5' ou um seu derivado activado, com uma outra unidade de nucleótido com grupos hidroxilo livres terminais 3'-5', ou
b) se construir de modo análogo o oligonucleótido, fragmento a fragmento, removendo eventualmente nos oligonucleótidos obti dos do modo (a) ou (b) um ou mais grupos protectores temporã riamente introduzidos para proteger outras funções, e · sé transformar os oligonucleótidos assim obtidos, de fórmula I, conforme o caso, nos respectivos sais fisiologicamente assi...mi laveis.
Como materialde partida para a preparação de oligonucleótidos com ligação 3'-3' invertida terminal utiliza-se na síntese em fase sólida uma resina de suporte, â qual se acopla o primeiro monómero de nucleósido através do grupo 5’-OH. Para a preparação deste material utiliza-se uma resina de supor te preparada de acordo com métodos conhecidos da literatura (T. Atkinson, M.Smith em Oligonucleótido Synthesis, M.J.Geit ed., 35-43 (1984)), de preferência sílica gel ou vidro de porosidade controlada, funcionalizados com grupos amino. Faz-se reagir com um derivado de nucleósido protegido na nucleobase e no grupo 3'-0H, previamente transformado no 5’-p-nitrofenilsuccinato. Como grupos protectores da base utilizam-se de preferência grupos acilo, p.ex. benzoilo, isobutirilo ou fenoxiacetilo. Protege-se de preferência a posição 31 por meio do grupo protector dimetoxitritilo, que se pode introduzir de acordo com M.D.Matteucci, M.M.Caruthers, Tetrahedron Letters 21 (1980), p. 3243-3246. A construção subsequente da cadeia de oligonucleótido até ao pe10
núltimo membro da cadeia, efectua-se de acordo com métodos conhecidos da literatura, de preferência utilizando amidas de éster de ácido fosfórico-3-nucleósido ou fosfonatos de 3'-H-nucle( ósido protegidos por grupos dimetoxitritilo no grupo 5'-OH. Como último membro da cadeia introduz-se de novo uma amida de éster de ácido fosfõrico-5’-nucleósido ou um fosfonato de H-nucle ósido, protegidotdeipreferência com dimetoxitritilo no grupo 3'-OH. A preparação de uma tal cadeia de oligonucleótido com li gações internuc.leótido invertidas terminais, encontra-se esquematizada em seguida (ciclo de fosfoamidite para a preparação de oligonucleótidos com ligações 3'-3' e 5'-5’ nos extremos). A preparação de oligonucleótidos com ligações 3'-3' ou 5'-5' apre senta-se em seguida.
-ο-
ι V |4 .Oxidação | 1
-/ον
0R
'G7- ο—]
|Destritilagão após as condensaçóes|
HN,
0·°’ ο
CH -C-0 •3 II ο
I
PC-P—0 +
DMTrO
O-ι 0
B
-0-1 n ι
P0-^=0
2.Activação e adição
.Oxidação
CR
Β Ο-Ρ-Οη. B s 02^
DMTrO
CPQ-O
i
ΡΟ-γ=Ο (çpg)— ο-Γ^
A análise sequencial e estrutural efectua-se marcando terminalmente, em primeiro lugar, o oligonueleotido construido com extremos 3'-3' e 5'-5'. Tal conseguiu-se por mar nucleotidoquinase. Esta marcação radioactiva ocorre no grupo 5'-0H livre, isto é, em frente de um oligonueleotido apenas ι com ligação 3'-5' biológicas no extremo contrário da cadeia de nucleõtido. A análise sequencial subsequente efectua-se então de acordo com processos conhecidos da literatura, de preferência por cisão estatística específica de bàses, como descrito por Ma xam e Gilbert (A.M.Maxam e W. Gilbert, Methodis in Enzymology, 65, 499-560 (1980)).
Devido à marcação radioactiva nos extremos trocados da molécula, efectua-se então a leitura das sequên^l cias, comparada com um oligonueleotido com ligação 3'-5' biológica, nó sentido inverso. Uma forma executável deste teste encontra-se descrita no exemplo 6.
Os oligonucleótidos de fórmulas I e II encontram aplicação em processos de hibridação química, relacionados com ácidos nucleicos de cadeia simples ou dupla, da regulação ou inibição das funções biológicas de ácidos nucleicos, bem como para a inibição selectiva da expressão de funções genómicas virais e para a profilaxia e terapia de funções virais, para aini bição da função oncogénióáce para a terapia de doenças cancerosas .
Como medida para a estabilidade in vivo pode tomar-se o comportamento de um oligonueleotido de fórmula I ou II construido de acordo com a invenção e dissolvido no soro san guíneo. O teste geral encontra-se descrito no exemplo 7 e? um tes te in vitro adequado com uma solução de fosfodiesterase de veneno de cobra, no exemplo 8. Os oligonucleótidos de acordo com a invenção degradam-se muito mais lentamente do que os oligonucleõtidos 3'-5'.
O exemplo 1 demonstra a estabilidade no soro de
oligonucleótidos com ligação 3'-3* invertida terminal.
comportamento de hibridação pode observar-se em ensaios modelo, como descrito no exemplo 9, em que uma série de sequências específicas SV40, preparadas de acordo com a invenção com extremos 3'-3' e 5'-5', apresentam um ponto de fusão na hibridação com a cadeia complementar correspondente de DNA de SV40, que é apenas ligeiramente mais baixo que o ponto de fusão medido na hibridação com uma sequência correspondente construida não de acordo com a invenção, isto é sem extremos 3'-3’ e 5'-5'.
A eficácia dos oligonucleótidos de acordo com a invenção, combinações terminais 3'-3' ou 5’-5', como inibidores da expressão de genes, pode medir-se pela inibição do crescimento do vírus SV40 (exemplo 10), bem como pela inibição in vitro da expressão do produto oncogénico p53 (exemplo 12).
Exemplo 1
Síntese da amida do éster do ácido 3'-O-DMTr-desoxirribonucleótido-5'-(N,N-bis-diisopropilamino-^-cianoetoxi)-fosfórico
O esquema racional - a partir de nucleótidos protegidos na base - apresenta-se a seguir:
a: B=Timina g
b: B=N -benzoilademina 4 c: B=N -benzoilcitosina 2 d; B=N -isobutirilguanina
DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo
A) preparação do 3',51-O-bis-DMTr-desoxirribonucleósido 2
Mistura reacionai:
mMol 14,4 mMol 14,9 mMol ,_bz ,„ibu dT, dA ou dG de DMTr-Cl de TEA absoluto
Dissolve-se o desoxirribonucleõsido 1 em 50 ml de piridina absoluta e adiciona-se, a 0°C, trietilamina e clore to de dimetoxitritilo. Em seguida deixa-se em agitação durante 24 horas à temperatura ambiente, seguindo-se a reacção por cromatografia em camada fina (eluente: CH2Cl2/MeOH 9:1). Interrompe-se a reacção por adição de metanol, evapora-se o solvente e toma-se o resíduo em cloreto de metileno. Lava-se a fase orgâni ca vãrias vezes com uma solução IM de (NH^JHCO^ e com ãgua, seca-se sobre Na2SO^ e evapora-se.
O produto 2 3’}5’-ditritilado pode purificar-se por cromatografia em coluna do tritanol ou do 5'-DMTr-dN em excesso (enchimento da coluna: sílica gel 60H; eluente:CH2C12 com teores crescentes em metanol, sendo o desoxinucleósido ditritilado eluido a 1-1,5% de MeOH).
Rendimento: 73-85% do teórico.
B) Remoção específica do grupo 5'-dimetoxitritilo
Literatura: M.D.Matteucci e M.H.Caruthers, Tetrahedron Lett., 21,3243-3246 (1980) mMOl de 3’,5'-O-bis-DMTr-dN2 15 mMol de ZnBr2
200 ml de nitrometano absoluto
Mistura racional:
Adiciona-se a solução de 3',5’-O-bis-DMTr-d^ em 100 ml de nitrometano, a 0°C, à suspensão de brometo de zinco em mais de 100 ml de nitrometano. No caso da desoxiadenosina protegida continuou-se a reacção sob arrefecimento para efectuar a despurinação. A cisão neste nucleósido estã completa após 60 minutos, como se pode comparar por cromatografia em camada fina. No caso da timidina e da desoxiguanosina a reacção também está completa após 60 minutos à temperatura ambiente, enquanto que a 51-destritilação da bis-DMTr-desoxicitidina apenas se consegue incompletamente. Neste caso interrompeu-se a reacção após 3 horas, para evitar também uma cisão do grupo 3'-dimetoxitritilo.
A interrupção da reacção efectua-se por adição de 200 ml de uma solução 1M de NH^Ac, extrai-se o produto 3 vezes com 200 ml de CB^C^, lava-se a fase orgânica de novo com uma solução saturada de NaCl e com E^O, seca-se sobre Na2SO^ e destila-se o solvente em vácuo.
A quantidade principal de tritanol pode separar-se por precipitação do produto bruto em cerca de 500 ml de n-hexano, a -15°C. A purificação efectua-se depois por cromatografia numa coluna de sílica gel 60H utilizando cloreto de meti leno com um teor crescente em metanol como eluente.
Os valores de Rf dos 3'-DMTr-desoxirribonucleó tidos distinguem-se dos monómeros correspondentes 51-tritilados do seguinte modo (eluente: C^C^/MeOH 24:1):
3'-DMTr-dN | 5'-DMTr-dN | |
dT | 0,282 | 0,21 |
Dabz | 0,55 | 0,29 |
dCbz | 0,53 | 0,31 |
dGÍbU | 0,32 | 0,14 |
Rendimentos: 48-65% dos teóricos.
C) Preparação da amida do éstèr do ácido 31-O-DMTr-desoxirribonucleósido-51-O-(N,N-diisopropilamino-$-cianoetoxi)-fosfórico, 4.
Literatura: H. Koster, Nucleic Acids Res. 12, .4539-4557 (1984)
Mistura reaccional: 1 mMol de 3'-O-DMTr-desoxirribonucleósido 3
1,5 mMol de cloro-N,N-diisopropilamino-$-cianoetoxifosfina mMol de. diisopropilamina
Efectuaram-se as reacções de fosfitilação de modo análogo ao método descrito por Koster et al., para a prepa ração da amida do éster do ãcido 5’-O-DMTr-desoxirribonucleósido-3'-O-fosfórico. Ã solução dos nucleótidos protegidos em CH2C12 absolutos adicionou-se diisopropilamina. sob árgon, e em seguida o agente de fosforilação. Após 30 minutos interrompeu-se a reacção por adição de 30 ml de acetato de etilo, extraiu-se a solução 3 vezes com uma solução saturada de NaCl, secou-se a fase orgânica sobre Na2SO^ e destilou-se o solvente em vã cuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia em coluna (fase fixa: sílica gel 60M, eluente: éter de petróleo/cloreto de metileno/trietilamina 45:45:10).
Rendimento no composto 4a: 93% do teórico.
Exemplo 2
Preparação de timidililtimidina com uma ligação 3',3'-fosfodiéter
Apresenta-se em seguida um esquema reaccional para a preparação do bloco dimêrico:
^'rlliSSZJaoxi.wrjíi!
T
AcO-1 η ι
OH
T ΐ
/P\ /
NCCH^O N—\ +
Η0_ύ°^
1. NH3 9 • O=P-OH
2. HAc 1
A) Preparação de 5'-O-dimetoxitritiltimidina, 5
Mistura reaccional: 20 | mMol | de |
24 | mMol | de |
(8,2 | g) | |
1 | mMOl | de |
28 | mMol | de |
timidina (4,84 g) cloreto de 4,4'-dimetoxitritilo dimetilaminopiridina (122 mg) tritilamina absoluta (3,8 ml)
Efectuou-se a preparação do composto 5 de acor do com o método de R.A.Jones (G.S.Ti, B.L.Goffney e R.A.Jones, D.Amer. Chem. Soc. 104, 1316-1319 (1982)). Secou-se a timidina por 3 vezes por coevaporação com 50 ml de piridina absoluta de cada vez, tomou-se em 100 ml de piridina e adicionou-se, sob ar refecimento em gelo, 4,4’-DMTr-Cl e DMAC como catalizador. Con18 trolou-se a reacção por cromatografia em camada fina (eluente: CI^C^/MeOH 9:1), e após 4 horas interrompeu-se a reacção por adição de 100 ml de ãgua. Estraiu-se a solução 3 vezes com éte^ secou-se a fase orgânica e evaporou-se no evaporador rotativo e purificou-se o resíduo por reoristalização em benzeno. Rendimento: .9,68 g de DMTr-dT (89%).
B) Preparação do amida do éster do ácido 5'-0-dimetoxitritiltimidina-3'-0-CN,N-diidopropilamino-$-cianoetoxi) fosfórico, 6
A preparação e purificação do composto 6 efectuaram-se de modo análogo ao da síntese do composto 4 (exemplo 1, C) .
C) Preparação de 5'-O-acetiltimidina, 8
Mistura reaccional: 2,0 mMol de 3'-O-DMTr-dT 3a (1,1 g)
0,2 mMol de dimetilaminopiridina (12,2 mg) 4 ml de anidrido acético
Literatura: A.M.Michelson e A.R.Todd, J.Org.Chem. 1955, 2632-2638 (modificada)
A solução de 3'-Ο-DMTr-dT e DMAP em 20 ml de; piridina absoluta adicionou-se Ac2O, gota a gota e sob arrefeci mento em gelo. Apõs 3 horas de reacção a transformação estava completa (controle poeCCF; eluente: CH^C^/MeOH 24:1). Precipitou-se o produro 7 em 400 ml de ãgua gelada, filtrou-se o preci pitado branco, lavou-se com ãgua gelada e sècou-se.
Rendimento: 1,02 g de 31-O-DMTr-51-O-Ac-dT (88%).
Para a remoção do grupo 4,4·-dimetoxitritilo agitou-se o composto 7 em 10 ml de ãcido acético a 80%, à tempe ratura ambiente. Interrompeu-se a reacção após 3 horas por adição de 100 ml de ãgua gelada, obtendo-se o 41,4'-dimetoxitritanol na forma de um precipitado branco. Filtrou-se e evaporou-se no evaporador rotativo o filtrado aquoso. Tomou-se o resíduo oleoso nim pouco de CH2C12 e precipitou-se 200 ml de n-hexano a -15° C.
Rendimento: 455 mg de 51-O-acetiltimidina (94%)
D) Preparação de timidil-(3',
Mistura reaccional: 1,0 mMol
0,9 mMOl 2,6 mMol 9,0 mMol
')timidina, 10 de amida do éster do ácido 5' -0-DMTr-timidina-31-O-(N,N-diisopro pilamino-/?-cianoetoxi) fosfórico, (705,8 mg) de 5'-O-acetiltimidina, 8 (253mg) de tetrazole (182 mg) de I2 (1,14 g)
Efectuou-se a síntese do bloco dimérico 10 de acordo com o método descrito por Kòster (H.Kòster, Nucleic Acids Res. 12, 4539-4557 (1984)) para a preparação de dímeros de 3',
51-dinucleósido. Dissolveu-se a mistura de 5’-O-acetiltimidina e tetrazole em 30 ml de CH^CN absoluto e adicionou-se, sob árgon, ã amida do éster do ácido fosfórico. Adicionou-se uma mistura de 9 mMol de em 30 ml de acetonitrilo/piridina/água (24:5:1) e, após mais 15 minutos, reduziu-se o iodo em excesso com 5 ml de uma solução de H2SO3 a 40%. Concentrou-se então a solução, tomou-se o resíduo em CE^C^z lavou-se 2 vezes com uma solução saturada de NaHCO3 e destilou-se o solvente. Purificou-se o produto bruto por cromatografia em coluna (fase fixa:síli ca gel 60 H; eluente: acetato de etilo/cloreto de metileno .50: :50).
Rendimento: 665 mg (75%).
Para a remoção do grupo acetilo e ú-cianoetilo tratou-se o dímero durante 1 hora com 5 ml de NH^ concentrado, â temperatura ambiente; o grupo 4,4'-dimetoxitritilo removeu-se com ácido acético a 80%.
Exemplo 3
Preparação de timidiltimidina com ligação 51-5'-fosfodiéster, 14 esquema seguinte mostra a preparação do com-i
ncch2ch2ox
Ηι °/
1.Tetrazol -T
OCH„CH„CN
DMTrO
OAc
4a
DMTrO
Os passos reaccionais individuais para a síntese dos compostos intermediários efectuaram-se de acordo com os métodos descritos no exemplo 2.
A estrutura dos dois blocos diméricos confirmou-se por espectrometria de massa FAB e espectroscopia de ressonância nuclear de ^H.
Exemplo 4
Carga do material de suporte CPG 10-1400 com 5'-O-succinato de 3'-O-dimetoxitritildesoxirribonucleósido
A funcionalização do suporte CPG com cadeias * 3-aminopropito efectuou-se de acordo com o processo de Atkinson • e Smith (T. Atkinson, M. Smith em Oligonucleotide Synthesis, M.
J. Gait ed., 35-49 (1984)).
A) Preparação de 5'-0-succinato de 3'-0-DMTr-desoxirribonucleósido, 15
Mistura reaccional: 1,0 mMol de 31-O-DMTr-dN 3
0,8 mMol de anidrido succínico (80 mg)
0,5 mMol de dimetilaminopiridina (61 mg)
A reacção do anidrido succínico com o grupo 51
-OH do desoxirribonucleosido efectuou-se em 5 ml de piridina ab soluta com DMAP como catalisador, durante a noite, à temperatura ambiente. Após completa a reacção concentrou-se a solução e removeu-se a piridina por 3 destilações azeotrópicas com tolueno. Tomou-se o resíduo em cloreto de metileno, lavou-se com uma solução gelada de ácido cítrico e ^0 e evaporou-se a fase orgânica em vácuo. Dissolveu-se o produto bruto em cerca de 3 ml de tolueno e precipitou-se em 200 ml de n-hexano.
Rendimento: 79-84%.
B) preparação do 51-O_succinil-p-nitrofeniléster de 3'-O-DMTr-desoxirribonucleosido, 16 e carga do suporte (ver esquema seguinte)
»·' *
7\
ri | |
EH | 1 |
g | (ti |
Q | Lf) |
O | rH |
ο
ri
I (ti o
pq
DMTrO
Mistura reaccional: 0,8 mMol de 51-O-succinato de 3 '-O-DMTr-dN,15 0,8 mMol de p-nitrofenol (112 mg)
2,0 mMol de diciclohexilcarbodiimida (412mg) 3 g de CGP 10-1400 funcionalizado
Adicionou-se o desoxirribonucleosido succinila doprotegido a uma solução de p-nitrofenol em 5 ml de dioxano ab soluto e 0,2 ml de piridina e em seguida juntou-se DCCe como agente de condensação. Logo passado pouco tempo começou a preci pitar diciclo-hexilureia e após 3 horas verificou-se por CCF (CH^C^/MeOH 9:1) que a reacção estava completa. Filtrou-se o precipitado sob argon e adicionou-se o filtrado directamente a uma suspensão do suporte funcionalizado em 15 ml de dMF absoluta. Adicionou-se 0,8 ml de trietilamina e agitou-se a mistura durante a noite. Filtrou-se então o suporte carregado, lavou-se com metanol e éter e secou-se num excicador.
Determinou-se espectroscopicamente a carga do suporte. Por tratamento de uma amostra do suporte (cerca (ide 2 mg) com 10 ml de uma solução de ácido p-toluenossulfónico 0,1 N em acetonitrilo cinde-se o catião 4,4’ -dime.toxitritilo e pode carcular-se a carga do suporte em ;MMol/g por medição da absorpção da solução a 498 nm através da equação
C^gg/mlxlOmlxM, 3 (const.) mg de suporte
Resultados: Suporte Suporte Suporte Suporte
3'-DMTr-dT: 23 3'-DMTr-dGlbU: 21 3'-DMTr-dAb2 : 21 3'-DMTr-dCb2 : 15 jtiMol/g jiMol/g jiMol/g ^tiMol/g
Para bloquear os grupos amino não transformados agitou-se o suporte carregado com uma solução de 1 ml·de ani drido acético e 50 mg de dimetilaminopiridina em 15 ml de piri-‘ dina absoluta, durante 1 hora ã temperatura ambiente, filtrou-se em seguida, lavou-se com metanol e éter e secou-se.
Exemplo 5
a) Síntese de oligonucleótidos com ligação 3’,5’-e 5'-5'-terminal
As sínteses efectuaram-se num sintetizador > deJ1 DNA da firma Applied Biosystems, Forster City, USA, modelo 381A, utilizando o programa padrão de 0,2 jiMol para todos os passos de condensação. O ciclo de síntese é o que se apresentou acima (pãg. 11, do original). Como material de suporte empregou-se CPG 10-1400 descrito no Exemplo 4. Efectuaram-se as condensações com os 3'-fosfatos de nucleósido usuais, utilizando-se simplesmente no último ciclo da reacção as amidas do éster do ácido 3’-O-DMTr -nucleõsido-5'-O-(N,N-diidopropilamino-^-cianoetoxi)fosfórico descritas no exemplo 1. Após remoção do oligonucleósido do suporte com NH^ concentrado e remoção de todos os grupos protecto res de fosfato e de base pór aquecimento da solução amoniacal a 60°C durante a noite, dessalinizou-se a amostra por precipitação em etanol e purificou-se a sequência pretendida removendo os fragmentos mais curtos por electroforese de gel de poliacril arnida.
Para os ensaios da presente invenção sintetizou -se um. eicosatimidilato apenas com ligações 3',5' e um outro com ligações 3',3' e 5',5’. Além disso, escolheram-se sequências do genoma de SV40. Sintetizaram-se os oligonucleótidos seguintes:
dT20? dT20(3'-3',5'-5');
SV40TS17: 17 unidades, sequência directa do genoma de SV40 nas posições 5159-5176;
51-AGC TTT GCA AAG ATG GA-3'
SV40TAS17: 17 unidades, sequência invertida emlrelação aSV40TS17 5'-TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'
SV40TAS17(31-3',5'-51): 17 unidades, sequência invertida em relação a SV40TS17 com uma ligação 3',3'
ou 5',5' nos extremos ’-T (5 '-5 ' ) CC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5'
SV40TS35: 35 unidades, sequência directa do genoma de SV40 nas posições 5142-5176;
51-AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGA AG-3'
SV40TAS35; 35 unidades, sequência invertida em relação a SV40TS35;
5'-TCT CTG TTT AAA ACT TTA TCC ATC TTT GCA AAG CT-3'
SV40TAS35(3'-3',51-51): 35 unidades, sequência invertida em relação a SV40TS35 com uma ligação 3',3' ou 51-51 nos extremos ' -T (5 ' -5 ' ) CT CTG. TTT ' AAA ACT TTA TCC ATC -TTT GCA. AAGC (3 ' -3' )T-5
- <
b) Síntese de oligonucleótidos com ligação 3',31-terminal
Como material de suporte utilizou-se CPG 10-1400 descrito no exemplo 4. Efectuaram-se as condensações com os 3’-fosfatos de nucleósido habituais. Após cisão do oligonui-l cleótido do suporte com NH^ concentrado e remoção de todos os grupos protectores de fosfato e de base por aquecimento da solu ção amoniacal a 60°C durante a noite, dessalinizou-se a amostra por precipitação em etanol e purificou-se a sequência pretendida removendo os fragmentos mais curtos por electroforese de gel de poliacrilamida.
SV40TAS17(31-31): 17 unidades, sequência invertida em relação a SV40TS17 com uma ligação 3’,3’ na extremida de;
3’-TCC ATC TTT GCA AAG C(3'-3')T-5'
c) Síntese de oligonucleótidos com ligação 5'-terminal e 2 grupos tiofosfato terminais.
Como material de suporte utilizou-se CPG comercial, que se liga à 51-O-dimetoxitritiltimidina através do grupo 3'-hidroxilo. As condensações efectuaram-se com os 3'-fos fatos de nucleósido usuais, utilizando-se somplesmente no último ciclo de reacção a amida do éster do ãcido 3'-O-DMTr-nucleósido-5'-0-(N,N-diisopropilamino-^-cianoetoxi)fosfórico descrita no exemplo 1.
Nos dois primeiros ciclos de reacção, em vez da habitual oxidação com iodo, efectua-se uma oxidação com enxo fre elementar (W.Stec. et al., J.A.C.S. 106, p. 6077, 1984),
Após cisão do oligonucleótido da resina com NH^ concentrado e remoção de todos os grupos protectores de fos fato e de base por aquecimento da solução amoniacal a 60uC durante a noite, dessalinizou-se a amostra por precipitação em etanol e purificou-se a sequência desejada libertendo-a dos fra gmentos mais curtos por electroforese de gel de poliacrilamida.
Sintetizou-se o oligonucleótido seguinte:
SV40TAS17(5'-5'): 17 unidades, sequência invertida em relação a SV40TS17 com uma ligação 5',5' no extremo 5' e duas ligações internucleõtido tiofosfato no extremo 3 3'-T(5'-5')CC ATC TTT GCA AAG(Ps)T-3'
Exemplo 6
Anãlise da estrutura e da sequência de um oligonucleótido com ligação 3',3'- 3 51,51-terminal
A sequenciação dos oligonucleótidos efectuou-se de acordo com o método de Maxam e Gilbert (A.M.Maxam e W.Gilbert
Methods in Enzymology 65, 499-560 (1980)). Marcaram-se radioaç
2 tivamente no grupo 5'-OH 100 pMol da amostra com (j7- p)-ATP/T4-polinucleotidoquinase e efectuaram-se em seguida as seguintes reacções específicas das bases:
Reacçâo (A+G) Reacçâo G: Reacçâo (T+C) Reacçâo C:
protonação das bases pelo ácido fórmico reacçâo com sulfato dimetílico hidrazinólise reacçâo com hidrazina na presença de NaC15M
Por tratamento com piperidina 1M, a 95°C, cin diram-se as cadeias de oligonúcleótido nas posições modificadas; os fragmentos separaram-se por electroforese de gel de poliacril amida (20% de acrilamida, 7M ureia) e detectaram-se por autorra diografia. A figura 1 mostra o autorradiograma da sequenciação de SV40TS17, SV40TAS17 e SV40TAS17(3’-3’, 5'-5') (para a descri ção dos oligonucleõtidos ver exemplo 5). Uma vez que as cadeias foram marcadas no grupo 5'-OH, a sequência de bases só; se pode ler em ligações 3*-5' na direcçâo 3'-5'. A seguir aoextremo 3'-3’ o oligonúcleótido SV40TAS17(3'-3', 5'-5') tem contudo o gru po 5'-OH marcado radioactivamente no seu terminal 3'; o sentido de leitura da sequência é assim invertido (Fig. 1). Isto também é uma prova da ligação fosfodiéster 5'-5' no terminal 5’ da cadeia com um grupo 3'-OH livre, que não pode ser fosfotilado pe+ lo enzima polinucleótidoquinase.
Exemplo 7
Ensaio da estabilidade de um oligonúcleótido com extremos 3'-3' e 5'-5' num teste de soro de sangue
A) Quinasação de um eicosatimidilato com extremos 3’-3’ e 5’-5’
Literatura: T. Mizuno, M.-Y. Chou e M. Inouya, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 1966-1970 (1984)
Mistura reaccional: 1 ^u.1 de oligonúcleótido (0,01 θ°260^ pl de lOxtampão de quinase ul de T4-polinucleotidoquinase pl de J- p-dATP (actividade específica:
6000 Ci/mMol) jil de ^0
Incuba-se a mistura durante 30 minutos a 37°C, interrompe-se em seguida por adição de 90 ul de Ho0 e fracciona - (ϊδ / z ~
-se através de uma coluna de ^Sephadex G 50. Reunem-se as fracções contendo o produto e liofilizam-se.
B) Teste de soro de sangue
Literatura: S.M.Heywood, Nucleic Acids Res. 14, 6771-6772(1986)
Mistura reaccional: oligonucleótido fosforilado radioactivo 0,01 OD2gQ, como referência
0,01 ODn,nTnn, 0,01 OD_rnTnn com extremos 260 20 260 20 ligados 31-31 e 51-51, para a experiência 50 pl de soro humano fresco
Adiciona-se o soro a cada uma das amostras e agita-se levemente à mão. Pipetam-se então imediatamente 3 jtil para o valor 0 (zero) e adicionam-se a 3 jul de tampão de carga de formamida para parar a actividade enzimãtica. Em seguida incubam-se as amostras a 37°C.
para o estudo cinético recolhem-se amostras de 3 μΐ a intervalos de tempo determinados e interrompe-se a reacção como descrito acima.
Referência: 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min.
Experiência: 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min., 90 min.
Aplicam-se as amostras sobre gel de poliacrilamida a 20% e separam-se por electroforese de gel e autorradiografam-se em seguida.
Autorradiograma da cisão com soro humano fresco, a partir da es querda (ver Fig. 3).
Referência: valor 0, 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min Experiência: valor 0, 5 min., 8 min., 11 min., 15 min., 30 min min.
Logo após 5 minutos se verificou que a degrada ção do oligonucleõtido natural já tinha começado. A cisão aumen ta com o tempo. 0 oligonucleõtido modificado continua, após 90 minutos de incubação, prãticamente inalterado. As bandas fracas que se véem em quase todos os valores da cinética resultam de actividade das endonucleases presentes no soro. Esta cisão é im portante para um emprego terapêutico destes oligonucleótidos e é mesmo desejável, uma vez que garantem a degradação lenta do ingrediente activo, não ocorrendo assim uma acumulação destas substâncias no corpo.
Exemplo 8
Teste do comportamento de oligonucleótidos com ligação 3'-3' e 5'-5' terminal em relação a fosfodiesterase de veneno de cobra
A) Quinasação de um eicosatimidilato com extremos 3’-3’ e 5'-5'
Como descrito no exemplo 7
B) Hidrólise de um eicosatimidilato com extremos 3'-3' e 5'-5' por meio de fosfodiesterase de veneno de cobra
Literatura: A.Hirashima, S. Sawaki, Y. Inokuchi e M. Inouye, PNAS USA 83, 7726-7730 (1986)
Mistura reaccional: 5 cju.1 de suporte de RNA 50 jjl! de tampão SQ pl de SUpdE (1,5 u/jUl)
Liofiliza-se a amostra fosforilada radioaetiva (referência: Τ2θ com ligação terminal 3 1 —3 1 e 51 —5*), adicionan do-se para isso o suporte de RNA e o tampão SQ. Desta mistura pipeta-se 5 pl para o valor 0 (zero) , e adiciona-se enzima ao resto da solução e incuba-se a 37°C. Para a cinética da referên cia recolhem-se 5 pl após 5, 15 e 30 minutos e para a cinética do eicosatimidilato com extremos 3'-3' e 5'-5' recolhem-se 5 yUl após 5, 30, 45, 60 e 90 minutos. Para a desactivação do enzima
aquecem-se as amostras, directamente após as recolhas, emibànho-maria a 95°C durante 2 minutos. Liofilizam-se as amostras e aplicam-se sobre um gel analítico de poliacrilamida a 20%. Após a separação no gel procede-se à autorradiografia.
Autorradiograma da cisão de SVpdE (ver Fig.3) a partir da esquerda: Τ2θ (referência), T^icom ligações terminais 31-3' e 5'-51,
Cinética da experiência: após 5, 15, 30, ã5> 60 e 90 minutos, mistura de 0/15 min., 0/30.,
Cinética da referência: após 5, 15, 30 e 45 minutos.
A ligação 5'-5' cinde-se imediatamente, ι como já descrito. O facto de a outra cisão, em comparação com a refe rência só ocorrer por si muito lentamente<, é uma clara indicação estrutural. Após cisão da ligação fosfodiéster 5’-5' obtém-se uma molécula que contém uma função 5'-hidroxilo na posição se cisão. No outro extremo a molécula está 51-fosforilada. Ambos os extremos são inatingíveis para a fosfodiesterase de vene no de cobra. A degradação posterior, lenta mas evidente, é de atribuir provavelmente à presença simultânea de um endonuclease específica de cadeia simples que transforma DNA PM2 super-helicoidal em formas abertas, como descrito pelo fabricante (J.G. Izant e H. Weintraub, Cell 36, 1007-1015 (1984)). Já se consegue assim ler o comprimento da sequência. Só se conseguem contui do ler 19 bandas, uma vez que no primeiro valor da cinética, após 5 minutos, a ligação fosfodiéster 5'-5' já está cindida.
Exemplo 9
Ensaios de comportamento de hibridação de oligonucleótidos com extremos 3'-3' e 5'-5' terminais
Para o teste do comportamento de fusão traçam-se curvas de fusão. Dissolveram-se quantidades equimolares (5,23 nMol) de SV40TS17 e SV40TAS17 (3'-3' e 5'-5') (para a descrição dos oligonucleótidos ver exemplo 5) em 1 ml de um tampão de ca31
codilato de sódio 10 nM/NaCl 100 mM, pH 7,0, aqueceu-se a 70°C e seguiu-se o decurso da renaturação com arrefecimento lento (1 grau/min.) por medição da absorção da solução. Para o traçado da curva de refefêncianutilizaram-se iguais quantidades de SV40TAS17. De modo anãlogo, misturaram-se ao tampão 4,75 nmol de SV40TS35 e SV40TAS35 ou SV40TS35 e SV40TAS35 (3'-3', 5'-5'), aqueceu-se a 90°C e mediu-se a absorção durante o arrefecimento. Traçaram-se curvas de fusão de que resultaram os valores Tm seguintes :
SV40TS17 | • | SV49TAS17 | 54,1 | °C |
SV40TS17 | • | SV40TAS17(3'-3’,5'-5’) | 53,3 | °C |
SV40TS35 | • | SV40TAS35 | 65,5 | °C |
SV40TS35 | • | SV40TAS35(3'-3',5'-5') | 64,2 | °C |
As temperaturas de fusão baixaram apenas devido às ligações não biológicas de 0,6°C na unidade 17 e de 1,3°C na unidade 35.
Exemplo 10
Inibição da biossíntese do antigene T de SV40 por oligonucleóti dos com ligação 3'-3' e 5’-5’ terminal
A) Cultura celular
Desenvolveram-se células COS-1 em meio Eagle de Dulbecco modificado (DMEM) com 10% de soro de vitela fetal. Incubaram-se os flocos de cultura a 37°C e 7,5% de CO^..
B) Marcação radioactiva e abertura das células
Cultivaram-se cerca de 4x10 celulàs como monocamada em placas de cultura. As raças de células confluentes lavaram-se 3 vezes com DMEM isentos de metionina e marcaram-se em seguida com 100 jiCí de °S-metionina. Para as experiências de modulação do sentido inverso incubaram-se as células simultânea mente com o oligonucleótido SV40TAS17 <3*—3' , 51 —5') e com nimfe32
tionina radioactiva, durante 30 min. a 37°C. Lavaram-se em ser guida as células duas vezes com DMEM, contendo 10% de soro de vitela fetal e metionina não marcada e deixaram-se mais 30 minu tos neste meio. Para abertura trataram-se as células com soro fisiológico tamponizado com fosfato (PBS) gelado, removeram-se as membranas celulares e centrifugou-se durante 2 min. a 400 g. Lizou-se então o peletizado celular com 0,4 ml de tampão de aber tura (0,5% de Nohidet P40, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1 M NaCl) por 3x10θ células, durante 45 min. em gelo. Para evitar a proteólise, adicionou-se ao tampão de abertura 1% de trasilole flu oreto de fenilmetilsulfonilo até â concentração final íidei’· 0,25 mg/ml. Centrifugou-se então o lisado durante 30 min. a 4°C numa ultracentrifugadora (105 000 g) até se obter uma solução clara. Retirou-se uma aliquota de 10 jal è determinou-se o teor em proteína de acordo com o método de Lowry. Para a precipitação imunol+ogica utilizaram-se quantidades iguais de proteína total.
C) Precipitação imunológica
Para a imunoprecipitação tanto do antigene T de SV40 do tipo nativo como do antigene T mutante localizado no citoplasma, utilizou-se o anticorpo monoclonal PAb 108. Purificou-se o anticorpo por cromatografia em proteína A-Sepharose, removendo o sobrenadante de hebridona.
Pré-precipitou-se o extracto celular com 100 jal de uma suspensão a 10% de bactérias da estirpe Staphylokokkus aureus térmica mente inactivadas e fixadas com formaldeido (Cowan 1), durante a noite a 4°C. Removeram-se então as bactérias por centrifugação, incubou-se o sobrenadante pelo menos durante 2 horas a 4° C com o anticorpo monoclonal e formou-se o complexo'imunolõgico altamente específico por adição de S. aureus. Repetiu-se este processo até 3 vezes de modo a garantir uma precipitação comple ta.
Em seguida lavaram-se os imunoprecipitados: 3 vezes com 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% Trasilol; 2 vezes com 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5m M EDTA, 1% Nonidet P40 e uma vez com 50 mM NH^HCO^. Eluíram-se então duran
te 45 min. a 4°C com 200 jul de tampão de eluição (50 mM NH^HCO^, 1% SDS, 1% /^-mercaptoctanol) , liofilizaram-se, dissolveram -se por ebulição durante 10 min. em 20 p.1 de tampão de amostra (65 mM Tris-HCl, pH 6,8, 5% β-mercaptoctanol, 1% glicerina, 0,01% azul de bromofenol) e aplicaram-se a um gel de poliacrila mida a 3% (10% SDS). Separaram-se as proteínas por electroforese de gel descontínua. As bandas localizaram-se por fluorografia em filmes de raios X (Kodak X-AR). Com oligonucleótidos, pre parados de acordo com a invenção de modo a cobrirem o início de translação para o antigene T, atingiu-se uma inibição de 70% do crescimento do virus, utilizando-os numa concentração extracelu lar de 30 jimolar. Isto está em contradição com a eficácia das sequências correspondentes construídas não de acordo com a invenção, isto é, sem ligações 3'-3' e 5'-51. Neste caso, aplican do uma concentração igual não se verificou qualquer inibição.
A figura 4 mostra uma inibição assinalável da diossíntese de· Ag-T por tratamento das células com 30 juM SV40TAS17 (3'-3', 51—5') .
Exemplo 11
Comparação da estabilidade no soro de oligonucleótidos apenas modificados no extremo 3' ou 5' por ligações fosfodiéster inver tidas.
Por meio de nuclease, libertaram-se de preferência os oligonucleótidos dos seus terminais 3' (J.P.Shaw, K. Kent, J.Bird, J.Fishback, B.Froehler, Nucleic Acids Res. 19, 747-750 (1991)). Teve por isso de investigar-se se bastava ape nas uma ligação fosfodiéster 3'-3' terminal para a estabilização do oligonucleótido no soro sanguíneo. Uma vez que o grupo fosfato marcado com P, em especial num tratamento longo da amostra com soro, se cinde por acção das fosfatases, utilizou-se fluorescência para a detecçâo dos oligonucleótidos.
Sintetizaram-se as seguintes sequências a partir do genoma de Xeropus levis:
Xelev 1: 3’-A(5'-5’)GC CTC AAA C*AT GTG TGA CG-3'
Xelev 2: 5'-AGC CTC AAA C*AT GTG TGA C(3'-3')G-5'
As sínteses efectuaram-se como descrito no exem pio 5, utilizando-se para a 10& condensação uma amida de éster de ãcido fosfórico de citidina modificada na base C*, que possi bilita uma ligação covalente adicional com a fluorescência. A introdução da fluorescência efectuou-se de acordo com uma técni TM ca da firma Pharmacia (Pharmacia LBK Biotechology Auto Primer Synthesis Kit Instructions (ΧΥ-Ώ23-00-01). Purificaram-se o© oli gonucleótidos modificados por electroforese de gel de poliacril amida.
Teste de soro: 10 pMol de oligonucleõtido
140 ^il de soro humano fresco
Incubaram-se as amostras a 37°C. Retiraram-se 20 após 15, 30, 45, 60 min., 8 e 72 horas, extraíram-se 2 vèzes com fenol/clorofórmio/ãlcool isoamílico 25:24:1 e precipi taram-se os oligonucleõtidos com etanol. Separaram-se e detactaram-se os produtos de cisão num gel de poliacrilamida a 16% num sequenciador automático A.L.F. (Pharmacia, Freiburg). Como a figura 5 mostra, a sequência que tem apenas uma ligação inter nucleõtido invertida no extremo 5', logo após 15 min. de tratamento com soro apresenta produtos de degradação e após 60 min. estã já quase completamente degradada. 0 oligonucleõtido prote gido no extremo 3' por uma ligação 3'-3', pelo contrário, após 72 horas só está parcialmente degradado.
Exemplo 12
Inibição da expressão de genes num sistema cfeexpressão in vitro
De modo a quantificar a inibição ddiexpressão de genes através de oligonucleõtido INV (invertidos), investigou-se o efeito de oligonucleõtidos invertidos adequados sobre a expres . são de p 53 num sistema in vitro, contendo mRNA de p53 (E. Rei. hsans, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5,
137-144 (1990)).
Sintetizou-se a sequenciação de sentido inverso
NH (CH2)6pTAA TCA GTC GTT GGT CCA CAC CTT(3'-3')T e como amostra para comparação sintetizou-se a sequência corres pondente de sentido directo
NH2(CH2) pAAA GGT GTG GAC CAA CGA CTG ATT(3'-3')A
O Oligonucleótido de sentido inverso estã diri gido contra o início de translação da oncoproteína p53
Investigou-se a expressão da proteína:
1.
2.
3.
4.
sem adição do com adição de com adição de com adição de oligonucleótido pM de sequência de sentido directo 1 pM de sequência de sentido inverso 10 pM de sequência de sentido inverso.
Para a quantificação determinou-se por densitometria o escureci mento das bandas de proteína (E. Reihaus, M. Kohler, S. Kraiss, M. Oren, M. Montenarli, Oncogene 5, 137-144 (1990)).
A figura 6 mostra que a adição de 10 pM de oli gonucleõtido de sentido inverso ao sistema de expressão provoca uma inibição de cerca de 70%. Diminuindo a copeentração a 1 pM jã não se verifica qualquer inibição, o mesmo acontecendo com a adição da sequência de sentido directo e que não íseliliga ao mRNA.
Claims (3)
- - lã Processo para a preparação de oligonucleotidos de fórmula I ou IIR1 - (I) onas quaisR·*· significa hidrogénio ou um grupo de fórmula IIIB—, ,0< /— 0 - P = W'IZ' (III) '-CHR significa hidrogénio ou um grupo de fórmula IVHoZ' - p = W1 (IV)1
- 2 sendo contudo, pelo menos um dos grupos R ou R , de fórmula III ou IV;um grupoB representa uma base, como por exemplo bases naturais como adenina, timina, citosina, guanina, ou bases não naturais co mo por exemplo purina, 2,6-diaminopurina, 7-desaza-adenina,7-desaza-guamna, N -etanocitosina, bem como as respectívas formas prõ-droga;W e W' independentemente um do outro, significam oxigénio ou en xofre;Z e Z’ independentemente um do outro, significam θ' alcooxilo-C^-C^g, de preferência alcooxilo-C^-Cg, em especial al cooxilo C^-Cg, em particular metoxi, alquilo-C^-C^g, de preferência alquilo-C^-Cg, em especial alquilo-C^-Cg, em particular metilo; NHR^, com R^= de preferência alquilo-C., -Co, em particular alquilo-C.. -C ., ou alcooxi-C.-C.-alquilo-C.-C., — 1 4 3 4 1 34 l b de preferência metoxietilo; NR R , em que R se define como . 4 acima e R e depreferencia alquilo-C^j^-C^^g, em especial alqui lo-C^-Cg, em particular alquilo-C^-C^, ou em que e R^ for mam juntamente com o átomo de azoto que contém um anel heterocíclico de 5 ou 6 membros, que pode conter adicionalmente um outro heteroãtomo de 0, S ou N, como por exemplo morfolina;Y significa um grupo O-Si(R)2, OCH2, C(O)NR ou O-OCH2-C(O), em que R é alquilo-C^-Cg, arilo ou cicloalquilo-C^-Cg; e n é um número inteiro de 5-60, de preferência 10-40 e em especial 15-25, bem como dos respectivos sais fisiologicamente assimiláveis, ca racterizado por se efectuar a síntese dos oligonucleótidos em solução ou em fase sólida, de acordo com métodos conhecidos da literatura, e se substituírem estes oligonucmeótidos adicionalmente por grupos que facilitam a sua integração intracelular, que funcionaram como grupos repórter in vitro ou in vivo e/ou por grupos que, durante a hibridação do oligonucleótido com DNA ou RNA biológico, ataquem estas moléculas de DNA ou RNA por ligação ou cisão.- 2â Processo para a preparação de oligonucleótidos de fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por , , 2 se preparar um oligonucleotido de formula I em que R e um gru- 1 -12 po de formula IV e R significa hidrogénio; R ou R represen2 tam um grupo de formula m..ou IV; ou R significa hidrogénio e 1 ,R e um grupo de formula III, nao significando, contudo, W ou 2, no último caso, oxigénio.- 3â Processo para a preparação de oligonucleótidos de fórmula I, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracteri zado por se preparar um oligonucleótido de fórmula I tem · que W representa oxigénio, ou Z e W representam ambos oxigénio.- 4â Processo para a preparação de oligonucleótidos de fórmula I, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracteri2 zado por se prepararem oligonucleótidos de fórmula I, em que R 1 e um grupo de formula IV e R significa hidrogénio.- 5ã Processo para a preparação de oligonucleótidos de fórmula I e II, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por se prepararem oligonucleótidos adicionalmente sub stituidos por grupos que permitem a integração intracelular, que actuam como grupos repórter in vitro ou in vivo, e/ou por grupos que na hibridação do oligonucleótido com DNA ou RNA biológico atacam estas moléculas de DNA ou de RNA por lugação ou cisão.- 6ã -Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se integrar como ingrediente ac tivo um ou mais compostos, quando preparados de acordo com qual quer das reivindicações 1 a 5, juntamente com veículos e/ou adi tivos fisiologicamente assimiláveis, de modo a obterem-se formas de administração adequadas, de preferência para aplicação intravenosa ou tópica.A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 2 de Julho de 1990, sob o NQ P 40 21 019.7.Lisboa, 1 de Julho de 1991ÀffiffiE ©ETCIÁL ©A ©MEIElíABE E® :2.RESUMOPROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DE OLIGONUCLEÓTIDOS COM LIGAÇÕES INTERNUCLEÓTIDO 3'-3' OU 5'-5' TERMINAISA invenção refere-se a um processo para a preparação de oligonucleótidos de fórmulas I ou II (I) (II) bem como dos respectivos sais fisiologicamente assimiláveis,que compreende efectuar-se a síntese dos oligonucleótidos em solução ou em fase sólida, de acordo com métodos conhecidos da literatura, e substituirem-se estes oligonucleótidos adicionalmen te por grupos que facilitam a sua integração intracelular, que funcionam como grupos repórter in vitro ou in vivo e/ou por grupos que, durante a libertação do oligonucleótido com DNA ou RNA biológico, ataquem estas moléculas de DNA ou RNA por iligação ou cisão.Aufcorradiograma da sequenciaçao deSV40TS17, SV40TASI7 e SV40TÁ17 (3’3’-5’5’)SV40TS17SV40TAS17SV40TAS17 (3’3’-5’5’)G AIG CJT C e. e*5’G AIG CIT C G AIG CIT C5’
- 3' hiu; 2:Autorradiograma da cisão de dTgo ou dT20 (3*— 3',5'-5’ com soro humanoA partir da esquerda:dT20: Reacção após 0,5,8,11»15 e 30 minutos dT2Q(3’-3’,5’-5'): Reacção após 0,5,8,11,25 30 e 90 minutos dT, <&}3-3’, 6-5’ há * ιJEig.aAutorradiograma da cisão de SVpdE:A partir/da esquerda: dT2o(3’3',5'-5’)/ cisão de dT2o(3'-3·,5»-5·) após 5,15,30,45, 60 e 90 minutos; mistura de 0/15 e 0/30 minu tos; cisão de dT2(j após 5,15,30 e 45 minutos.tf *£Modulação da expressão de T-AG por meio de oligonucleótidos de sentido inverso. Linha 1: Lisado celular após inibição com 30 jiM SV40TAS17 (3'3' -5’ 5’)Linha 2: Lisado celular sem inibição M: Marcador de comprimento ·01' jtnr.sEstabilidade no soro dos oligonucleotidos Xelev 1 (clonos 6 e 7) e Xelev 2 (clonos 8 e 10)Clonos 6 e 8: Duraçao da incubaçao com soro: verde 0 min. azul 15 min. amarelo 30 min. vermelho 45 min.Clonos 7 e 10: Duração da incubação com soro: verde 60 min, azul 8 horas, amarelo 72 horas, vermelho faixa não utilizada.
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