DE3785343T2 - Alpha-oligonukleotide. - Google Patents

Alpha-oligonukleotide.

Info

Publication number
DE3785343T2
DE3785343T2 DE8888900022T DE3785343T DE3785343T2 DE 3785343 T2 DE3785343 T2 DE 3785343T2 DE 8888900022 T DE8888900022 T DE 8888900022T DE 3785343 T DE3785343 T DE 3785343T DE 3785343 T2 DE3785343 T2 DE 3785343T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
group
radical
oligonucleotide
derivatives
derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE8888900022T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3785343D1 (de
Inventor
Claude Helene
Jean-Louis Imbach
Thuong Nguyen
Claude Paoletti
G Rayner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR8616797A external-priority patent/FR2607507B1/fr
Priority claimed from FR8704339A external-priority patent/FR2612930B1/fr
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of DE3785343D1 publication Critical patent/DE3785343D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3785343T2 publication Critical patent/DE3785343T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue chemische Verbindungen sowie ihre Verwendung insbesondere als Sonden, die den Nachweis einer definierten DNA- oder RNA-Sequenz erlauben.
  • Die erfindungsgemäßen chemischen Verbindungen bestehen aus einem Oligonucleotid oder einem Oligodesoxynucleotid, das eine Kettenverknüpfung von Nucleotiden umfaßt, die eine nicht-natürliche α-anomere Konfiguration aufweisen im Gegensatz zur natürlichen β-anomeren Konfiguration.
  • Wenn man die α- und β-Nucleoside jeweils durch die Formeln (a) und (b) darstellt,
  • wobei (a) und (b) Nucleoside darstellen, muß in 5'-Stellung ein Phosphat eingeführt werden, um Nucleotide zu erhalten.
  • Die Verwendung von natürlichen β-Oligonucleotiden als Sonde, d.h. bei allen Verwendungszwecken, bei denen ihre paarige Anordnung mit einer komplementären Sequenz von Oligonucleotiden zu pharmakologischen Zwecken eine Rolle spielt, ist bekannt. Die Verwendung von natürlichen β- Oligonucleotiden stößt jedoch auf bestimmte Schwierigkeiten.
  • Eine erste Schwierigkeit beruht auf der Tatsache, daß ausreichend lange Sequenzen vorgesehen sein müssen, damit diese Sequenzen sich mit ihrer komplementären Zielsequenz auf ausreichend stabile Weise hybridisieren.
  • Um diese Länge herabzusetzen, muß dem Oligonucleotid eine Kette hinzugefügt werden, die ein Interkalationsmittel wie Acridin trägt, wie zum ersten Mal von C. Helene und Mitarbeitern beschrieben. Diese Moleküle werden an ihre komplementären Sequenzen fester gebunden dank der überschüssigen Energie, die durch die Interkalation des kovalenten Kopfes in dem gebildeten Hybrid entsteht.
  • Eine zweite Hauptschwierigkeit der Verwendung von natürlichen β-Oligonucleotiden besteht darin, daß zahlreiche Oligonucleotid-Sequenzen gegenüber bestimmten Enzymen stoffwechselempfindlich sind. Man weiß, daß alle lebenden Organismen zahlreiche Nucleasen enthalten, die häufig sehr aktiv sind.
  • In dem Artikel in "Nucleic Acids Research", Band 14, Nr. 12, 1986, ist die Synthese und Charakterisierung des Hexaribonucleotids αd(CpCpTpTpCpCp) beschrieben.
  • Wie nachstehend gezeigt, enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen Sequenzen von α-Oligonucleotiden, welche die Überwindung dieser Schwierigkeiten erlauben. Sie haben nämlich die interessante Eigenschaft, sich paarweise parallel zusammenzulegen mit einer komplementären Sequenz von natürlichen β-Oligonucleotiden, während zwei komplementäre α-Sequenzen oder zwei komplementäre β-Sequenzen sich antiparallel paarweise zusammenlegen und dieses parallele paarweise Zusammenlegen ist viel stabiler.
  • Außerdem weisen diese α-Oligonucleotide eine sehr hohe Beständigkeit gegenüber Enzymen, insbesondere gegenüber Nucleasen, auf.
  • Unter diesen Bedingungen können vielfache Anwendungen zu biologischen Zwecken und sogar zu pharmakologischen Zwecken, wie sie für die β-Oligomeren bereits bekannt sind, in Betracht gezogen werden und dies mit größerer Wirksamkeit.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere chemische Verbindungen, die aus einem Oligonucleotid oder einem Oligodesoxynucleotid bestehen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine Kettenverknüpfung von Nucleotiden oder Desoxynucleotiden mit nicht-natürlicher α-anomerer Konfiguration umfassen, wobei die Kettenverknüpfung gebunden ist an ein Effektoragens, insbesondere einen einem Interkalationsmittel entsprechenden Rest (Radikal) oder einen chemischen Rest (Radikal) oder einen photoaktivierbaren Rest (Radikal), wie z.B. einen Rest (Radikal), der Träger einer Funktion ist, die direkt oder indirekt mit den Nucleotid-Ketten reagiert, oder an einen Rest (Radikal), dessen Anwesenheit einen leichten und empfindlichen Nachweis erlaubt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem Verbindungen nach Anspruch 2, die nicht an ein Effektoragens gebunden sind.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere neue α-Oligonucleotid-Derivate, ihre Herstellung und ihre Verwendung insbesondere als Sonden, welche den Nachweis einer definierten Sequenz von Nucleinsäuren erlauben, als künstliche Nucleasen, die spezifisch sind für DNA- oder RNA-Sequenzen oder auch als selektive Blockierungsmittel der Expression eines Gens, sei es nun endogen (wie z.B. ein onkogenes Gen) oder exogen (wie z.B. die DNA oder RNA von Viren, Parasiten oder Bakterien).
  • In den französischen Patentanmeldungen FR 83 01 223 (2 540 122) und FR 84 11 795 (2 568 254) sind chemische Verbindungen beschrieben, die aus einem Oligonucleotid oder einem Oligodesoxynucleotid bestehen, das eine Kettenverknüpfung von natürlichen oder modifizierten Nucleotiden, d.h. β-Nucleotiden aufweist, an denen über eine kovalente Bindung mindestens eine Interkalations-Gruppe fixiert ist, welche die Eigenschaft haben, die Expression eines Gens selektiv zu blockieren und die aufgrund dieser Tatsache besonders nützlich sind in der Therapie als antivirale, antibiotische, antiparasitäre oder antitumorale Substanzen.
  • In der internationalen PCT-Anmeldung WO 83/01 451 ist ein Verfahren zum Blockieren der Translation der Messenger-RNA (mRNA) zu einem Protein durch Hybridisierung der mRNA mit einem Oligonucleotid, das die komplementäre Sequenz zur mRNA aufweist, beschrieben, wobei das Oligonucleotid in Form eines Phosphotriesters stabilisiert wird.
  • Es wurde gefunden und dies ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß α-Nucleotid-Derivate mit den komplementären RNA-Sequenzen Hybridisierungskomplexe bilden, die viel stabiler sind als diejenigen, die mit DNA gebildet werden, und daß gegenüber RNA die α-Nucleotid-Derivate viel stabilere Hybridisierungskomplexe bilden als die Derivate von natürlichen β-Nucleotiden.
  • Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere die α-oligomeren Verbindungen der Formel genannt werden
  • worin:
  • die Reste B identisch oder verschieden sein können und jeweils darstellen eine Nucleinsäurebase, die gegebenenfalls modifiziert ist, aktivierbar ist und/oder eine Interkalations-Gruppierung trägt und an den Glycosid-Ring gebunden ist in einer nicht-natürlichen α-anomeren Konfiguration;
  • die Reste X identisch oder verschieden sein können und jeweils darstellen ein Oxoanion O , ein Thioanion S , eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine Aminoalkylgruppe, eine Aminoalkoxygruppe, eine Thioalkylgruppe, einen Alkyl- oder Alkoxyrest, der substituiert ist durch einen stickstoffhaltigen Heterocyclus oder eine -Y- Z-Gruppe;
  • R und R', die identisch oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -Y-Z oder Y'-Z' darstellen;
  • n eine ganze Zahl einschließlich 0 ist;
  • L ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine -NH- Gruppe darstellt;
  • Y und Y', die identisch oder verschieden sind, jeweils darstellen einen geraden (unverzweigten) oder verzweigten Alkylenrest -alk- oder einen Rest, der ausgewählt wird aus
  • mit U = O, S oder N;
  • E die gleichen Bedeutungen wie Y mit Ausnahme von Y-Z haben kann;
  • J ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe darstellt;
  • Z und Z', die identisch oder verschieden sind, jeweils einen Rest darstellen, der einem Effektoragens entspricht, insbesondere einen Rest, der einem Interkalationsmittel entspricht, oder einen Rest, der eine Funktion trägt, die direkt oder indirekt mit den Nucleotid-Ketten reagiert, oder einen Rest, dessen Anwesenheit einen leichten und empfindlichen Nachweis erlaubt.
  • In dieser Formel I wird die kondensierte Darstellung der folgenden Nucleoside angewendet:
  • die der ausführlichen Formel entspricht:
  • in der die (3')- und (5')-Enden angegeben sind.
  • Es sei darauf ngewiesen, daß die Formel I eine Kettenverknüpfung von Nucleotiden darstellt, die identisch oder verschieden sein können, wobei n einfach die Anzahl der in dem Molekül enthaltenen Nucleotide angibt, wobei n vorzugsweise eine Zahl zwischen 1 und 50, insbesondere zwischen 1 und 25, ist.
  • Die erfindungsgemäßen neuen Derivate können aus einem Oligonucleotid- oder Oligodesoxynucleotid-Analogon bestehen, das eine Kettenverknüpfung von α-Anomeren von Nucleotiden umfaßt, die gegebenenfalls über eine kovalente Bindung an einen Interkalationsmittelrest und/oder einen chemischen Rest gebunden sind, der eine Funktion trägt, die direkt oder indirekt mit den Nucleotid-Ketten reagiert ("reaktionsfähiger chemischer Rest") und/oder einen Marker trägt, dessen Anwesenheit einen leichten Nachweis erlaubt, wobei der chemische Rest auch den Interkalationsmittelrest darstellen kann.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere auch die Verbindungen der Ansprüche 4 bis 12.
  • Unter diesen können insbesondere die erfindungsgemäßen neuen Derivate von α-Oligonucleotiden der allgemeinen Formel I entsprechen, in der bedeuten:
  • - dann, wenn L ein Schwefelatom oder eine -NH-Gruppe darstellt, die Reste R und R', die identisch oder verschieden sind, jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -Y-Z oder Y'-Z', in der darstellen:
  • Y und Y', die identisch oder verschieden sind, jeweils einen geraden (unverzweigten) oder verzweigten Alkylenrest (-alk-) oder einen Rest
  • oder einen Rest
  • oder einen Rest -alk-O-alk- oder einen Rest -alk- CONH-alk- oder einen Rest
  • oder einen Rest
  • worin E die gleichen Bedeutungen wie X mit Ausnahme von Y-Z hat;
  • Z und Z', die identisch oder verschieden sind, jeweils einen Rest, der einem Interkalationsmittel entspricht oder einen Rest, der eine Funktion trägt, die direkt oder indirekt mit den Nucleotid-Ketten regiert, oder einen Rest, dessen Anwesenheit einen leichten und empfindlichen Nachweis erlaubt,
  • - dann, wenn L ein Sauerstoffatom darstellt, die Reste R und R', die identisch oder verschieden sind, jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -Y-Z- oder Y'-Z', worin Y, Y', Z und Z' wie oben definiert sind, wobei gilt, daß mindestens einer der Reste R und R' einen Interkalationsmittelrest oder einen reaktionsfähigen chemischen Rest enthält;
  • - dann, wenn L ein Wasserstoffatom darstellt, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine aktivierbare und/oder eine Interkalationsmittelgruppe tragende modifizierte Nucleinbase.
  • Die Interkalationsmittel sind Produkte, die in der Technik der Nucleinsäuren bekannt sind; dabei handelt es sich um Verbindungen, die sich in die Struktur der DNA oder RNA "einschieben" können, d.h. die in der Lage sind, sich zwischen den Basenplateaus der Nucleinsäuren einzuschieben.
  • Die Interkalationsmittel können ausgewählt werden aus den polycyclischen Verbindungen, die eine ebene Konfiguration haben, wie z.B. Acridin und seine Derivate, Furocumarin und seine Derivate, Daunomycin und die anderen Derivate von Anthracyclin, 1,10-Phenanthrolin, Phenanthridin und seine Derivate, Proflavin, die Porphyrine, die Derivate des Dipyrido[1,2-a; 3',2'-d]imidazols, Ellipticin oder Ellipticinium und seine Derivate und das Diazapyren und seine Derivate.
  • Die reaktionsfähigen chemischen Reste (Radikale) können Reste sein, die direkt oder indirekt mit einer Kette von Nucleotiden reagieren können zur Bildung einer kovalenten Bindung oder um sie chemisch zu modifizieren oder um sie zu schneiden. Vorzugsweise sind diese reaktionsfähigen chemischen Reste (Radikale) aktivierbar, beispielsweise auf chemischem, biochemischem oder photochemischem Wege.
  • Die aktivierbaren reaktionsfähigen Reste können ausgewählt werden unter der Ethylendiamintetraessigsäure, der Diethylentriaminpentaessigsäure, den Porphyrinen, dem 1,10-Phenanthrolin, dem 4-Azido-acetophenon, dem Ethylenimin, dem β-Chloroethylamin, dem Psoralen und seinen Derivaten und den aromatischen Verbindungen, die Strahlung im nahen UV-Bereich oder im sichtbaren Bereich absorbieren oder mit den Nucleinsäurebestandteilen chemisch reagieren können.
  • Insbesondere induzieren die aktivierbaren chemischen Reste in Gegenwart von Metallionen, von Sauerstoff und eines Reduktionsmittels (Ethylendiamintetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Porphyrin, Phenanthrolin) das Einschneiden in Nucleinsäuresequenzen, die in ihrer Nachbarschaft angeordnet sind.
  • Durch Bestrahlung mit Licht in dem sichtbaren Bereich oder im nahen UV-Bereich ist es möglich, die Derivate zu aktivieren, die diese Strahlungen absorbieren, und Brückenbildungsreaktionen oder photoinduzierte Reaktionen (Schneiden und Modifizieren der Nucleinbasen) der Nucleinsäuren durchzuführen, an denen das α-Oligonucleotid fixiert ist, das eine aktivierbare Gruppe trägt.
  • Unter den Resten Z und Z' können insbesondere genannt werden:
  • - die Reste, die abgeleitet sind von der Ethylendiamintetraessigsäure der Formel:
  • - die Reste, die abgeleitet sind von der Diethylentriaminpentaessigsäure,
  • - die Reste, die abgeleitet sind von dem Methylpyrroporphyrin der Formel
  • - die Reste, die abgeleitet sind von dem Phenanthrolin der Formel:
  • - die Reste, die abgeleitet sind von dem Acridin
  • - die Reste, die abgeleitet sind von dem Proflavin
  • worin R eine Aminogruppe (NH&sub2;) oder Azidogruppe (N&sub3;) darstellt,
  • - die Reste, die abgeleitet sind von dem Biotin
  • - die Reste, die abgeleitet sind von dem 4-Azido-acetophenon der Formel:
  • Der Rest B kann vorzugsweise ausgewählt werden unter den natürlichen Nucleinbasen (Thymin, Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil), es ist aber auch möglich, modifizierte Nucleinbasen zu verwenden. Es können hier genannt werden das 2-Aminoadenin und seine Derivate, die beispielsweise an dem Stickstoffatom N&sup6; substituiert sind durch einen Aminoalkylenrest oder durch einen Azidophenylalkylenrest, das Guanin, das an dem Sauerstoffatom O&sup6; substituiert ist beispielsweise durch eine (ω-Alkylen)-9-acridin-Gruppierung, das (ω-Aminoalkyl)-amino-8-adenin und seine Derivate, die substituiert sind an dem Aminorest inω-Stellung durch eine Acridingruppe, oder die halogenierten oder azidierten Derivate, wie z.B. das 5-Bromouracil, das 8-Azidoadenin, das 7-Deazaadenin, das 7-Deazaguanin. Es ist auch möglich, Derivate von Nucleinbasen zu verwenden, die eine Interkalationsmittelgruppe oder eine chemisch oder photochemisch aktivierbare Gruppe enthalten.
  • Die Funktionalisierung von C oder T durch eine Aziridin-Gruppe in der 4-Position führt zur Bildung von kovalenten CH&sub2;-CH&sub2;-Brücken zwischen den beiden Strängen, die jeweils zu G und A komplementär sind.
  • Der Rest B wird insbesondere ausgewählt unter dem 4- Azido-cytosin und dem 4-Azido-thymin.
  • Vorzugsweise stellt der Rest X ein Oxoanion dar. Der Rest X kann auch darstellen einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen (Methyl, Ethyl, Propyl), einen Alkoxyrest, dessen Alkylteil 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält (Methoxy, Ethoxy, 2,2-Dimethyl-propyloxy), einen Aminoalkyl- oder Aminoalkoxyrest der allgemeinen Formel R&sub1;R&sub2;N- alk-A-, in der A steht für eine Bindung oder ein Sauerstoffatom, -alk- steht für einen Alkylenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und R&sub1; und R&sub2;, die identisch oder verschieden sind, stehen für ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder die zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten 5- oder 6-gliedrigen stickstoffhaltigen Heterocyclus bilden, wobei selbstverständlich die Gruppierung R&sub1;R&sub2;N- quaternisiert sein kann, oder für einen Alkylthiorest, dessen Alkylteil 1 bis 7 Kohlenstoffatome enthält.
  • In der Formel (I) steht der Rest -alk- vorzugsweise für einen geraden (unverzweigten) oder verzweigten Alkylenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen.
  • Insbesondere kann, wenn man von 3'- oder 5'-terminalen Alkoholfunktionen des α-Oligomers ausgeht, der Effektor Z über eine (CH&sub2;)n-Kette, die an eine Funktionalisierung Z'&sub1; unterschiedlicher Natur gebunden ist, in den Oxid-Abschnitt des Oligomers eingeführt werden.
  • Ausgehend von der folgenden Formel:
  • erhält man je nach Bedeutung von Z'&sub1; beispielsweise
  • - ein Phosphat oder Methylphosphonat der Formel
  • U = O, N oder S
  • - einen Äther der allgemeinen Formel
  • - einen Ester der allgemeinen Formel
  • -O(CO NH)(CH&sub2;) Z
  • oder auch
  • - ein Carbamat der allgemeinen Formel
  • -O(CO)(CH&sub2;) Z
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die obengenannten Verbindungen der Formel (I) in Form ihres Salzes mit Basen oder Säuren und die Verbindungen in racemischer Form oder in Form der gereinigten optischen R- oder S-Isomeren oder in Form einer Mischung davon.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise die obengenannten Verbindungen der Formel (I) in der D-Reihe.
  • Unter den besonders interessanten (vorteilhaften) Produkten der allgemeinen Formel (I) können genannt werden: α-[(TP)nT](Y&sub1;)Z&sub1; ;
  • Z&sub2;(Y&sub2;)α-[(TP)nT] ; Z&sub2;(Y&sub2;)α-[(TP)nT](Y&sub1;)Z&sub1; ; Z&sub2;(Y&sub2;)α-d(CpCpTpTpApTp-ApTpT)
  • worin bedeuten A einen α-D-Desoxyadenosin-Rest, C einen α- D-Desoxycytidin-Rest, T den α-D-Thymidin-Rest, n eine ganze Zahl zwischen 1 und 25 und Y&sub1; und Y&sub2; einen Alkylenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und Z&sub1; und Z&sub2; jeweils ein Acridin-Derivat oder ein Proflavin-Derivat oder ein 1, 10-Phenanthrolin-Derivat oder ein 4-Azido-acetophenon- Derivat oder ein EDTA-Derivat oder ein Biotin-Derivat.
  • Die neuen Produkte der allgemeinen Formel (I) können auf chemischem Wege nach bekannten Verfahren, insbesondere solchen, wie sie in den französischen Patentanmeldungen FR 83 01 223 (2 540 122) und FR 84 11 795 (2 568 254) beschrieben sind, hergestellt werden.
  • Die Verbindungen der Formel (I) können auf chemischem Wege nach Verfahren hergestellt werden, bei denen man zur Herstellung der β-Anomeren klassische Synthesen für Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphoamidid oder Hydrogenphosphonat anwendet. Für das Phosphotriester-Verfahren werden die α-Nucleotid-Derivate von Guanin gegebenenfalls in der O&sup6;-Position durch eine zusätzliche Gruppe, vorzugsweise durch eine N,N-Diphenylcarbamoyl-Gruppe, geschützt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit die Verfahren nach den Ansprüchen 13 bis 26.
  • Bei diesen Verfahren stellt man zunächst die Nucleotid-Kette her, wobei die verschiedenen nicht-eingesetzten Gruppen geschützt werden, dann eliminiert man die Schutzgruppen zur Herstellung der gesuchten Produkte. Nach diesem Verfahren ist es zum ersten Mal möglich, α-Oligonucleotide herzustellen, die alle üblichen Basen enthalten. Dieses Verfahren erlaubt die Herstellung von α-Oligonucleotiden mit den gewünschten Längen.
  • Die Verbindungen der Formel (I) können auch hergestellt werden nach halbsynthetischen Verfahren, insbesondere unter Verwendung von DNA- oder RNA-Fragmenten, die nach chemisch-technischen Verfahren hergestellt werden können, an denen anschließend Effektoragentien fixiert werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann man somit die vollständig geschützten Derivate herstellen und die Schutzgruppen eliminieren. Die Produkte der allgemeinen Formel (I) können auch erhalten werden, indem man in einer ersten Stufe die nicht-geschützten Derivate herstellt, die beispielsweise eine Thiophosphat-Gruppe an einem der 3'- oder 5'-Enden oder an beiden 3'- und 5'-Enden der α-Oligonucleotid-Kette enthalten, wobei man dann die Thiophosphatgruppe(n) mit den Z- und/oder Z'-Derivaten, die eine Halogenalkyl-Gruppe oder eine Alkylestergruppe einer Sulfonsäure tragen, kondensiert.
  • Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen, die aus einer Kette von α-Oligonucleotiden aufgebaut sind, besteht darin, daß sie unabhängig von Effektoragentien, insbesondere von Interkalationsmitteln, verwendet werden können, weil diese neuen Oligonucleotid-Substanzen das Erkennen der komplementären Nucleinsäuresequenz mit einer erhöhten Stabilität gewährleisten; wobei die Funktion des Interkalationsmittels darin besteht, die Stabilität eines Hybridisierungskomplexes zu erhöhen, so daß seine Anwesenheit nicht mehr obligatorisch ist.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aufgrund ihrer großen spezifischen Affinität gegenüber den komplementären Nucleinsäuresequenzen den üblichen Oligonucleotiden überlegen, deren Affinität für die komplementären Sequenzen viel geringer ist.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher auf wirksamere Weise verwendbar als Hybridisierungssonden, aber auch als Reinigungsbestandteile für bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen.
  • Diese Verbindungen können auch verwendet werden zum wirksameren Nachweis von Mutationen im Bereich einer DNA oder RNA.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Anwendung dieser Verbindungen zur Durchführung der spezifischen Blockierung von zellulären Genen oder pathogenen Agentien, die vorher ausgewählt worden sind (Viren, Bakterien, Parasiten).
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aufgrund ihrer Eigenschaft, sich fest an die komplementäre Nucleinsäuresequenz zu binden und dann das Schneiden der Nucleinsäurekette an dieser Stelle zu induzieren, verwendbar als sequenzspezifische künstliche Nucleasen. Sie können als Reagentien in der Molekularbiologie oder in der Gentechnik verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch als Arzneimittel verwendbar.
  • Die erfindungsgemäßen Produkte können bestehen aus einer Kette von α-Oligonucleotiden, die kovalent an ein Interkalationsmittel oder an eine reaktionsfähige chemische Gruppe oder an ein Interkalationsmittel und eine reaktionsfähige chemische Gruppe gebunden ist. In diesen neuen Produkten gewährleistet das α-Oligonucleotid das Erkennen der komplementären Nucleinsäure-Sequenz, das Interkalationsmittel erhöht stark die Stabilität des Hybridisierungskomplexes und die reaktionsfähige chemische Gruppe fürt durch Aktivierung zu einer Brückenbildungsreaktion oder zu einer chemischen Modifizierung oder zu einem Schneiden der Kette von komplementären Nucleinsäuren. Diese neuen Produkte erlauben demnach die Einleitung von Brückenbildungsreaktionen, die Modifizierung oder das Schneiden mit einer großen Wirksamkeit einer Kette von Nucleinsäuren an einer vorher ausgewählten bestimmten Stelle.
  • Die erfindungsgemäßen neuen Produkte der allgemeinen Formel (I) und die Produkte der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, bilden mit den komplementären RNA-Sequenzen viel stabilere Hybridisierungskomplexe als sie mit DNA gebildet werden. Die Stabilität kann durch die Temperatur der Halbzersetzung der Komplexe (T 1/2) bei einer Temperaturerhöhung gemessen werden. Die T 1/2-Werte werden bestimmt bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M an einem α-Oligonucleotid in einem Puffer mit pH = 7, der Natriumkakodylat (10&supmin;² M) und Natriumchlorid (0,1 M) enthält. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengefaßt.
  • Dieser Unterschied in bezug auf die Stabilität der Hybridisierungskomplexe (Tabelle I) erlaubt eine bevorzugte Inhibierung der Messenger-RNA und der Viren-RNA, ohne daß die Gefahr besteht, daß unerwünschte Effekte im Bereich der DNA des Genoms hervorgerufen werden.
  • Darüber hinaus bilden die erfindungsgemäßen Produkte gegenüber den RNA im allgemeinen stabilere Komplexe als diejenigen, die erhalten werden, wenn man von Derivaten der natürlichen β-Nucleoside ausgeht.
  • In den durch die erfindungsgemäßen α-Oligonucleotid- Derivate mit den komplementären Nucleinsäuresequenzen gebildeten Hybriden haben die beiden Stränge im allgemeinen die gleiche Orientierung. So bildet beispielsweise das α- D-Oligonucleotid Acr(CH&sub2;)&sub5;-α-d5' [pCpCpTpTpApTpApTpT]3' einen stabilen Komplex mit der Sequenz β-d5' [ApCpGpGpApApTpApTpApGpC]3' dessen Halbdissoziations-Temperatur (T 1/2) 35ºC beträgt in einem Puffer von 10 mM Natriumkakodylat/0,1 M NaCl bei pH = 7 bei einer Konzentration von 10 um. Unter den gleichen Bedingungen beträgt die Halbdissoziations-Temperatur (T 1/2) 27ºC für den durch Ahr(CH&sub2;)&sub5; α-d5' [TCTAAACTC]3' mit β-d5'[AGATTTGAG]3' gebildeten Komplex. Mit dem β-D- Oligonucleotid, dessen Sequenz antiparallel ist [β-d5'[GAGTTTAGA]3']. wurde kein Komplex oberhalb 0ºC nachgewiesen.
  • Die Sequenzen der α-Oligonucleotide, die gekuppelt sind oder nicht gekuppelt sind an ein Interkalationsmittel oder an eine chemisch oder photochemisch aktivierbare Gruppe, die eine Kettenverknüpfung von Pyrimidin-Nucleosiden umfassen, können an einer DNA- oder RNA-Doppelhelix, die eine Sequenz von benachbarten Purinbasen aufweist, die durch Wasserstoffbindungen miteinander verbunden sind, an der komplementären Sequenz der Pyrimidinbasen fixiert werden. Diese Fixierung bedingt die lokale Bildung einer Tripel-Helix, in der die Pyrimidinbasen des α-Oligonucleotids mit den Purinbasen der Doppelhelix Wasserstoffbindungen (vom Hoogsteen- oder umgekehrten Hoogsteen-Typ) bilden. In diesem Zusammenhang bilden die α-Oligonucleotide stabilere Komplexe als die entsprechenden β-Oligonucleotide und sie erlauben die Initiierung von irreversiblen Reaktionen (Brückenbildungs-, Modifizierungs- oder Schneidereaktionen) an einer RNA- oder DNA-Doppelhelix.
  • Die aus den erfindungsgemäßen α-Oligonucleotid-Derivaten und den Nucleinsäuresequenzen gebildeten Hybride, die eine Anordnung von komplementären Basen aufweisen, sind viel stabiler, wenn die beiden Stränge die gleiche Orientierung aufweisen als wenn sie antiparallel sind. unter Nucleinsäuresequenzen, die komplementär sind zu den erfindungsgemäßen α-Oligonucleotid-Derivaten, versteht man Nucleinsäure-Abschnitte, die komplementäre Basen-Sequenzen aufweisen und in der gleichen Richtung orientiert sind wie die α-Oligonucleotide.
  • Die erfindungsgemäßen neuen Produkte der allgemeinen Formel (I) und die Produkte der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, welche die Eigenschaft haben, sich fest an die komplementäre Nucleinsäuresequenz zu binden, können als Sonden zum Nachweis der Anwesenheit einer Kette von komplementären Nucleotiden verwendet werden. Dieser Nachweis wird durch die Anwesenheit einer fluoreszierenden Gruppe oder einer Biotin-Gruppe in diesen Molekülen erleichtert.
  • Die nicht-natürliche Struktur der α-Oligonucleotide und die Struktur aus parallelen Ketten der Doppel-Helices, die sie mit einer komplementären Kette bilden, verleihen Antigen-Eigenschaften, wodurch es möglich ist, Antikörper herzustellen, die spezifisch gerichtet sind gegen α-Oligonucleotide, die gegebenenfalls an ein Interkalationsmittel gekoppelt sind, oder gegen ihre Komplexe mit einer natürlichen DNA oder RNA.
  • Für diagnostische oder prognostische Zwecke können die α-Oligonucleotide, die gegebenenfalls an ein Interkalationsmittel gekoppelt sind, kovalent an einen festen Träger gebunden sein. Die Kopplung an einen lumineszierenden Marker oder an ein Agens, das eine Farbreaktion, eine Lumineszenz- oder eine Fluoreszenz-Reaktion erzeugt, erlaubt ihre Verwendung als Sonden für DNA- oder RNA-Sequenzen für diagnostische oder prognostische Zwecke.
  • Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Produkte der allgemeinen Formel (I) und der Produkte der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, für die spezifische Blockierung von zellulären Genen oder pathogenen Agentien, die vorher ausgewählt worden sind (Viren, Bakterien, Parasiten). Aufgrund ihrer Konfiguration sind die erfindungsgemäßen α-Oligonucleotide viel beständiger gegenüber Nucleasen als die Derivate von natürlichen β-Nucleosiden. Diese Stabilität gegenüber der enzymatischen Hydrolyse erlaubt die Verwendung der Produkte der allgemeinen Formel (I) in in vivo- oder in vitro-Experimenten in Gegenwart von Nucleasen. Deshalb weisen die erfindungsgemäßen α-Oligonucleotide unbestreitbare Vorteile gegenüber den bereits bekannten Derivaten von β- Nucleosiden auf.
  • Die erfindungsgemäßen neuen Produkte der allgemeinen Formel (I) und die Produkte der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, sind besonders geeignet als Arzneimittel, welche die Blockierung der unerwünschten exogenen Gene (Viren, Bakterien, Parasiten) oder der endogenen Gene (zelluläre Gene, Onkogene) erlauben. Die Expression dieser Gene kann blockiert werden, indem man direkt auf die DNA oder die RNA einwirkt, welche die genetische Information trägt, oder indem man auf die Messenger-RNA, eine Kopie des Gens, einwirkt, wobei man dann jede Transduktion blockiert durch Hybridisierung oder durch Hybridisierung und anschließende Brückenbildung oder Modifizierung oder Zerschneiden der Messenger-RNA oder Virus-RNA, die als Ziel ausgewählt worden ist.
  • Diese Blockierung kann durchgeführt werden unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Produkts der allgemeinen Formel (I) oder eines Produkts der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase bedeuten, deren Sequenz komplementär zu derjenigen eines nicht-komplex gebundenen Bereiches einer RNA oder einer DNA und insbesondere einer Messenger-RNA ist. Die Hybridisierung, gegebenenfalls gefolgt von einer Brückenbindung (Ligation), einer Modifizierung oder einem Schneiden der Messenger-RNA oder der Virus-RNA verhindert die Synthese der RNA oder des entsprechenden Proteins oder die Expression der viralen oder parasitären Funktionen.
  • Wenn diese RNA oder dieses Protein vital für das Virus, das Bakterium oder den Parasiten ist, stellen die erfindungsgemäßen Produkte der allgemeinen Formel (I) und die Produkte der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, Medikamente mit einer Antivirus-, Antibakterien- oder Antiparasiten-Aktivität dar.
  • Wenn diese RNA oder dieses Protein nicht vital für den Organismus ist, ist es möglich, deren Effekte selektiv zu unterdrücken. In diesem Falle stellen die erfindungsgemäßen Produkte der allgemeinen Formel (I) und die Produkte der allgemeinen Formel (I) , in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, entweder Arzneimittel mit einer Antitumor-Aktivität, wenn das betrachtete Gen oder seine Messenger-RNA für ein Protein codiert, das an der zellulären Transformation beteiligt ist, oder Arzneimittel dar, welche den Resistenzcharakter gegen Antivirenmittel, Antibiotika oder Antiparasitenmittel unterdrücken können, wenn das codierte Protein für die Inaktivierung der Antibiotika, Antiviren und Antiparasitenmittel verantwortlich ist.
  • Spezifische cytotoxische Effekte können erhalten werden durch Einwirkung eines erfindungsgemäßen Produkts oder eines Produkts der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Base darstellen, auf eine Zellenfunktion, die für die Ziel-Zelle unerläßlich ist.
  • Die erfindungsgemäßen Produkte und die Produkte der allgemeinen Formel (I), in der L ein Sauerstoffatom, R und R' jeweils ein Wasserstoffatom und B eine natürliche Nucleinbase darstellen, können auch dazu verwendet werden, die Synthese einer RNA oder eines Proteins zu fördern, indem sie auf ein Gen zur Regulierung des für die RNA oder für das Protein codierenden Gens einwirken.
  • Die erfindungsgemäßen Produkte, welche die Eigenschaft haben, sich fest an die komplementäre Nucleinsäuresequenz zu binden in Form eines Einfachstranges oder an eine Doppelhelix, dann gegebenenfalls eine Brückenbindung (Ligation), Modifizierung oder ein Schneiden der Kette von Nucleinsäuren an einer vorher festgelegten Stelle zu induzieren, sind verwendbar als sequenzspezifische Reagentien und insbesondere als künstliche Nucleasen. Sie können als Reagentien in der Molekularbiologie oder in der Gentechnik verwendet werden. Sie können auch verwendet werden zur Herstellung von Nucleinsäurefragmenten, insbesondere von RNA-Fraginenten, für die keine sequenzspezifische Nuclease existiert. Tabelle I Komplementärsequenz Halbdissoziations-Temperaturen (T 1/2) der zwischen den Derivaten (I) und den (β-anomeren) komplementären Nucleinsäuresequenzen gebildeten Komplexe, bestimmt bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M an α-D-Oligonucleotid und mit einem Verhältnis [Thymin/Adenin] = 1 in einem Puffer von 10 mM Natriumkakodylat/0,1 M NaCl bei pH = 7.
  • Andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung von Beispielen hervor.
  • Das Beispiel V wird durch die Figuren 1 und 2 erläutert. Darin sind die Beständigkeiten gegenüber den Enzymen Nuclease S&sub1; und Phosphodiesterease für die α- und β-Anomeren dargestellt.
    • Beispiel I Synthese von α-[d(CATGCG)] und α-[d(CGCATG)] nach einem verbesserten Lösungs-Phosphotriester-Verfahren (vgl. die nachfolgenden Schemata I und II)
  • Die beiden nicht nicht-natürlichen Hexadesoxyribonucleotide α-[d(CATGCG)] und α-[d(CGCATG)], die nur Nucleotid- Einheiten mit einer α-anomeren Konfiguration enthalten, wurden erhalten nach einem verbesserten Lösungs-Phosphotriester-Verfahren. Die Ausgangsprodukte waren die 4-Desoxyribonucleoside 3a-d (vgl. das nachfolgende Schema I). Die α-Desoxynucleoside 3a und 3b (Pyrimidin) wurden hergestellt unter Anwendung von Autoanomerisationsreaktionen, gefolgt von Reaktionen zum selektiven Schützen der Hydroxylgruppen, während die beiden Desoxynucleotide 3c und 3d (Purin) unter Anwendung von Transglycosylierungsreaktionen hergestellt wurden. Im Falle der α-Nucleosid-Derivate von Guanin wurde eine zusätzliche Schutzgruppe für die Base in die Position O&sup6; eingeführt mit dem Ziel, Sekundärreaktionen während des Oligonucleotid-Aufbaus zu vermeiden. Diese Gruppe war die N,N-Diphenylcarbamoylgruppe.
  • Das 4-N-Benzoyl-3',5'-di-O-acetyl-2'-desoxy-cytidin wurde als Zucker-Donor ausgewählt und mit Adenin, das an N geschützt war, und mit Guanin, das an N geschützt war, in Gegenwart einer Lewis-Säure, dem Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat, in Acetonitril bei 70ºC umgesetzt. Nach dem Reagierenlassen des Zucker-Donors mit dem 6-N-Benzoyladenin wurde das α-Anomere 1c nicht von dem entsprechenden β-Anomeren abgetrennt, trotz der Tatsache, daß es das hauptsächliche Nucleosid-Produkt war.
  • Infolgedessen wurde dieses Anomeren-Gemisch mit methanolischem Ammoniak behandelt und das α-2'-Desoxy-adenosin (2c) wurde in einer Ausbeute von 27 % erhalten nach der chromatographischen Reinigung an einer Dowex 1-Säule. Anschließend wurde das α-2'-Desoxy-adenosin-Derivat (2c) in einer Ausbeute von 70 % in das 6-N-Benzoyl-Derivat (3c) umgewandelt.
  • Auf die gleiche Weise wurde die Transglycosylierungsreaktion mit dem 2-N-Acetyl-guanin versucht. Es wurden jedoch sehr geringe Ausbeuten an Nucleosidderivaten des 2-N- Acetyl-guanins erhalten, wahrscheinlich wegen der geringen Löslichkeit dieser Derivate in organischen Lösungsmitteln. Eine bessere Ausbeute an 1d wurde erhalten, wenn man bei der Transglycosylierungsreaktion die Verbindung 2-N-Palmitoyl-guanin verwendete, die lipophiler ist.
  • Nach 50-minütiger Reaktion bei 70ºC zeigte eine TLC- Analyse des Reaktionsgemisches die Bildung von N-7-Isomeren als Hauptprodukten an. Das Erwärmen wurde fortgesetzt und nach 6-stündigem Erwärmen wurde eine milde Umwandlung der 7-N-Isomeren in 9-N-Isomere festgestellt.
  • Das gesuchte α-Desoxy-guanosin-Derivat 1d wurde nach einer Chromatographie an einer Silicagel-Säule und nach der fraktionierten Kristallisation in einer Ausbeute von 26,6 % isoliert.
  • Die enolisierbare Lactam-Funktion der Guanidinreste stört die Oligodesoxynucleotid-Synthese nach dem Phosphotriester-Verfahren wegen der Sekundärreaktionen der Guaninfragmente, die eine Abnahme der Ausbeute bei der Verlängerung der das Guanin enthaltenden Ketten mit sich bringen. Es ist daher erforderlich, die Lactam-Funktion des Guanins zu schützen. Als Schutzgruppe für die Position O&sup6; wurde die N,N-Diphenylcarbamoylgruppe ausgewählt. Sie kann leicht in einer Stufe in das Ausgangsderivat 1d eingeführt werden und kann am Ende der Phosphotriester-Synthese ohne eine zusätzliche Schutzgruppenentfernungsstufe wieder eliminiert werden.
  • Die Reaktion zwischen dem Diphenylcarbamoylchlorid und dem Diisopropylethylamin und dem Produkt 1d in dem Pyridin , gefolgt von de Zugabe von wäßrigem Natriumhydroxid, liefert nach der Reinigung durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule das 2-N-Palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-α-desoxy-guanosin (3d) in Form einer kristallinen Verbindung in einer Ausbeute von 77 %.
  • Anschließend erforderte die Umwandlung der Produkte 3c und 3d, bei denen nur die Base geschützt war, in die entsprechenden, vollständig geschützten α-Nucleotide 4c und 4d (vgl. das nachfolgnede Schema II) einer Arbeitsweise in zwei Stufen, umfassend eine selektive Tritylierung der 5'-Hydroxy-Verbindung durch das 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,5 Moläquivalente) und eine Phosphorylierung der 3'-Hydroxylverbindung mit dem Triethylammonium- (2-chloro-4-trityl-phenyl)(2-cyanoethyl)phosphat (1,1 Moläquivalente), dem Mesitylensulfonylchlorid (2,2 Moläquivalente) und dem 1-Methylimidazol. Diese zuletzt genannte Stufe erlaubt die Einführung der 2-Chloro-4-trityl-phenylgruppe als Phosphat-Schutzgruppe. Diese Schutzgruppe wurde wegen ihrer lipophilen Eigenschaften ausgewählt, um die Reinigung und die Erhöhung der Ausbeuten der vollständig geschützten Zwischenprodukte während der Oligonucleotid- Synthese nach dem Phosphotriester-Verfahren in Lösung zu erleichtern. Nach der Reinigung durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule wurden die beiden α-Nucleotid-Derivate 4c und 4d in Form der jeweiligen Diastereoisomerengemische in Ausbeuten von 92 % und 53 % isoliert. Da die beiden angestrebten Hexameren in der 3'-Stellung in ihrer Grundsequenz ein endständiges Guanin aufweisen, ist die einzige terminale Einheit in 3'-Stellung für ihre Synthesen das 3'-O-Benzoyl-α-desoxy-guanosin 5d. Die selektive Dimethoxytritylierung von 3d, gefolgt von einer Benzoylierung und einer Detritylierung, liefert das 5'-OH-Derivat 5d in einer Gesamtausbeute von 81 %.
  • Die Synthese der vollständig geschützten α-Oligodesoxynucleotide α-[d(CATGCG)] und α-[d(CGCATG)] wurde vervollständigt durch die Wiederholung eines Synthesezyklus, der im wesentlichen aus drei Hauptstufen besteht. Die Stufe (a) ist eine Entfernung der Schutzgruppe von der 5'- Hydroxylgruppe durch Behandlung eines vollständig geschützten Nucleotids oder Zwischenprodukt-Oligonucleotids mit 2 %iger Benzolsulfonsäure in einem Gemisch aus Methylenchlorid und Methanol (7/3) bei 0ºC für einen Zeitraum von 15 bis 40 min. Die Stufe (b) ist die Entfernung der Schutzgruppe von der 3'-Phosphodiestergruppe durch Eliminierung der Cyanoethylgruppe, wobei man von einem vollständig geschützten Nucleotid oder Oligonucleotid ausgeht, mit 10 %igem tert-Butylamin in wasserfreiem Pyridin über einen Zeitraum von 15 bis 25 min. Die Stufe (c) ist die Kondensation zwischen den Produkten der Stufe (a) und der Stufe (b) (10 bis 15 % in einem molaren Überschuß) in Gegenwart des Kupplungsmittels 1-(Mesitylen-2-sulfonyl)-3- nitro-1,2,4-triazol, gefolgt von der Reinigung der Produkte durch Chromatographie an einer Silicagelsäule. Die Bedingungen und Ergebnisse der Kupplungsreaktionen sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II 3'-Phosphodiester-Komponente (mmol) 5'-Hydroxy-Komponente (mmol) Dauer (min) Produkt Ausbeute B) α-d(CGCATG) 3'-Phosphodiester-Komponente (mmol) 5'-Hydroxy-Komponente (mmol) Dauer (min) Produkt Ausbeute a) Abkürzungen: Dmtr = 4 4'-Dimethoxy-trityl; C* = 4-N-Benzoyl-α-2'-desoxy-adenosin; T* = α-Thymidin; A* = 6-N-Benzoyl-α-2'-desoxy-adenosin G* = 2-N-Palmitoyl-6-O-diphenyl-carbamoyl-α-2'-desoxy-guanosin; = 2-Chloro-4-trityl-phenylphosphat; MSNT = 1-(Mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol; Cne = 2-Cyanoethyl; Bz = Benzoyl
  • Im Verlaufe des Verfahrens der Verlängerung der vollständig geschützten α-Oligonucleotide wurde kein ausgeprägter-Unterschied (Reaktionsdauer, Bildung von Nebenprodukten und dgl.) entdeckt im Verhältnis zu demjenigen der natürlichen β-Oligonucleotide.
  • Das heißt mit anderen Worten, es ist kein bemerkenswerter Anomeren-Effekt bei dem Phosphotriester-Verfahren aufgetreten.
  • Die gesamte Schutzgruppenentfernung aus den geschützten α-Hexameren wurde wie folgt durchgeführt: Behandlung der vollständig geschützten α-Hexameren mit 1M N¹,N¹,N³,N³-Tetramethylguanidinium-2-pyridin-carboxaldoximat in einem Dioxan/Wasser (7/1, Vol./Vol.)-Gemisch bei 70ºC während 24 h, dann mit wäßrigem konzentriertem Ammoniak. Diese Behandlung führte zur gleichzeitigen Eliminierung der Diphenylcarbamoyl- und 2-Chloro-4-trityl-phenyl- Gruppen und der Benzoyl- und Palmitoyl-Gruppen. Die resultierenden 5'-Dimethoxytrityl-oligonucleotide wurden anschließend mit Essigsäure 15 min lang bei Umgebungstemperatur behandelt. Danach wurde eine Reinigung durch Chromatographie an einer Ionenaustauschersäule durchgeführt. Die beiden geschützten α-Oligonucleotide α- [d(CATGCG)] und α-[d(CGCATG)] wurden in den jeweiligen Ausbeuten von 59 % und 52 % erhalten.
  • Das Phosphotriester-Verfahren in Lösung konnte somit mit Erfolg auf die Synthese von vier übliche Basen enthaltenden α-Oligonucleotiden angewendet werden.
  • Das nachfolgende Reaktionsschema I gibt die Synthese der vier 2'-Desoxy-α-nucleoside an, deren Base geschützt ist (mit Ausnahme von T).
  • Die Reaktionsbedingungen waren für die verschiedenen Stufen (a) bis (h) die folgenden.
    • Synthese von geschützten α-Nucleosiden: Reaktionsbedingungen
  • a) Trifluoromethansulfonat von Trimethylsilyl, N,O- Bis(trimethylsilyl)acetamid/Acetonitril;
  • b) Natriummethylat/Methanol oder wäßriges Natriumhydroxid/Wasser/Tetrahydrofuran/Methanol;
  • c) Trifluoromethansulfonat von Trimethylsilyl, N,O- Bis(trimethylsilyl)acetamid, 6-N-Benzoyladenin/Acetonitril;
  • d) methanolisches Ammoniak;
  • e) Trimethylsilylchlorid/Pyridin, Benzoylchlorid, konzentrierte Ammoniaklösung;
  • f) Trifluoromethansulfonat von Trimethylsilyl, N,O- Bis(trimethylsilyl)acetamid, 2-N-Palmitoyl-guanin/Acetonitril;
  • g) Diphenylcarbamoylchlorid/Pyridin;
  • h) wäßriges Natriumhydroxid/Ethanol. Reaktionsschema I R : Acetyl oder Toluyl β-Anomer T: Thymin Cbz: 4-M-Benzoylcytosin Abz: 6-M-Benzoyladenin Gpal,dpc: 2-M-Palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoylguanin
  • Das nachfolgende Reaktionsschema II gibt die Synthese von vier 2'-Desoxy-α-nucleosiden an, in denen ihre Base geschützt ist (mit Ausnahme von T).
  • Die Reaktionsbedingungen in den Stufen (e) bis (d) waren die folgenden:
  • a) 4,4'-Dimethoxy-tritylchlorid/Pyridin;
  • b) Triethylammonium-(4-trityl-2-chloro-phenyl)(2-cyanoethyl) phosphat/Mesitylen-2-sulfonylchlorid;
  • c) Benzoylchlorid/Pyridin;
  • d) 2 %ige Benzolsulfonsäure/Methylenchlorid-Methanol (7:3, Vol./Vol.). Reaktionsschema II Abz: 6-N-Benzoyladenin Gpal,dpc: 2-N-Palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoylguanin Tr: Triphenylmethyl
    • 1) Herstellung von α-2'-Desoxy-adenosin (2c) (Reaktionsschema I)
  • Diese Verbindung wurde hergestellt wie von T. Yamaguchi et Cal. in "Chem. Pharm. Bull." 32, 1441 (1984), beschrieben. Diese Verbindung wurde in einer Ausbeute von 27,3 % erhalten mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 213ºC.
    • 2) Herstellung von 6-N-Benzoyl-α-2'-desoxy-adenosin (3c) (Reaktionsschema II)
  • Unter Anwendung eines dreistufigen Verfahrens ähnlich demjenigen, wie es beispielsweise im "Journal Amer. Chem. Soc.", 104, 1316 (1982), für die entsprechenden β-Anomeren beschrieben ist, wurde dieses Produkt hergestellt aus der Verbindung (2c) (2,01 g, 8 mmol). Am Ende der dritten Stufe, d.h. nach der Behandlung mit wäßrigem Ammoniak für 30 min und der anschließenden Eindampfung wurde der Rückstand in Wasser (200 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit Diethyläther (2 x 70 ml) gewaschen und bis zur Trockne eingedampft. Der zurückbleibende Rückstand wurde mit Methanol (50 ml) gemischt, dann filtriert und das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Silicagelsäule (100 g) gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden miteinander vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethanol/Aceton kristallisiert. Das Filtrat ergab 1,99 g (70 %) der Verbindung (2). Der Schmelzpunkt betrug 163 bis 164ºC. Die Analysenergebnisse waren die folgenden:
  • Analyse berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub7;O&sub4;N&sub5;: C 57,46; H 4,82; N 19,71
  • gefunden C 57,30; H 4,86; N 19,75
  • Die NMR-Spektren des Protons wurden mittels einer Bruker-Apparatur WBUM 360 erhalten.
    • 3) Herstellung von 3',5'-Di-O-acetyl-2-N-palmitoyl-α-2'- desoxy-guanosin (1d) (Reaktionsschema I)
  • Bis-trimethylsilylacetamid (7,4 ml, 300 mmol) wurden zu einer Lösung von 3',5'-Di-O-acetyl-4-N-benzoyl-2'-desoxy-cytidin (15 g, 36 mmol) und 2-N-Palmitoyl-guanin (37,4 g, 96 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (220 ml) zugegeben. Die Mischung wurde 1 h lang auf 70ºC erwärmt und es wurde Trimethylsilyltriflate (8 ml, 47 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde 6 h lang bei 70ºC gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Methylenchlorid (750 ml) gelöst. Es wurde kaltes wäßriges Natriumhydrogencarbonat (70 ml) zugegeben und nach starkem Rühren wurde die Mischung durch Absaugen filtriert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand (Rf 0,44 und 0,57, TLC Silicagel, CH&sub2;Cl&sub2;/CH&sub3;OH 9:1, Vol./Vol.) wurde an einer Silicagel- Säule (250 g) chromatographiert unter Verwendung von steigenden Mengenanteilen (0 bis 5 %) Methanol in Chloroform als Eluierungsmittel. Die das Material mit einem Rf-Wert von 0,44 (α- und β-9-N-Isomere) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in warmem Ethanol gelöst und abgekühlt, das α-Anomere 1d wurde kristallisiert, wobei man 5,655 g (26,6 %) farblose Kristalle erhielt; Schmelzpunkt 129 bis 130ºC.
    • 4) Herstellung von 2-N-Palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoyl- α-2'desoxy-guanosin (3d) (Reaktionsschema I)
  • Diphenylcarbamoylchlorid (2,192 g, 9,46 mmol) und Diisopropylethylamin (1,23 ml, 7,1 mmol) wurden zu einer Lösung von 1d (2,536 g, 4,3 mmol) in wasserfreiem Pyridin (11 ml) zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 2,75 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und es wurden Pyridin (41 ml) und Ethanol (21,5 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 10 min lang bei 0ºC gerührt. Es wurde eine wäßrige 2 N Natriumhydroxidlösung (21,5 ml) zugegeben und nach weiterem 10-minütigem Rühren bei 0ºC wurde die Reaktionsmischung mit Essigsäure (2,65 ml) neutralisiert. Anschließend wurde die Reaktionsmischung in Wasser (150 ml) gegossen und die Produkte wurden mit Methylenchlorid (4 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule (50 g) fraktioniert. Die das 3d enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (2,323 g, 77 %) kristallisiert, Schmelzpunkt 134 bis 135ºC.
  • Anal. ber. für
    • 5) Herstellung von 2-N-Palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoyl- 3'-O-benzoyl-α-2'-desoxy-guanosin (5d) (Reaktionsschema II)
  • 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,39 g, 1,15 mmol) wurden zu einer Lösung von 3d (0,7 g, 1 mmol) in trockenem Pyridin (3,5 ml) zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 2 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und es wurde Benzoylchlorid (0,152 ml, 1,3 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde weitere 4,4 h lang gerührt und es wurde 1 ml Wasser zugegeben. Nach 5-minütigem Rühren wurde die Reaktionsmischung in gesättigtes wäßriges Natriumhydrogencarbonat (40 ml) gegossen und die Produkte wurden mit Methylenchlorid (4 x 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid/Methanol (7/3, Vol./Vol., 20 ml) gelöst. Zu der resultierenden gekühlten Lösung (0ºC) wurde eine gekühlte Lösung von 10 %iger (Gew./Vol.) Benzolsulfonsäure in dem gleichen Gemisch (5 ml) zugegeben. Nach 14-minütigem Rühren bei 0ºC wurde die Reaktionsmischung mit wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (20 ml) neutralisiert und zwischen gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat (40 ml) und Methylenchlorid (4 x 30 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Schichten wurden bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule (30 g) fraktioniert. Die das reine Produkt 5d enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol kristallisiert, wobei man farblose Kristalle (0,65 g, 81 %) erhielt, Schmelzpunkt 144 bis 146ºC.
  • Anal. ber. für
    • 6) Allgemeines Verfahren zur Herstellung von 5'-O-Dimethoxytrityl-α-desoxyribonucleosid-3'-O-[(1-chloro- 4-tritylphenyl)(2-cyanoethyl) phosphaten]
  • 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,091 g, 3,22 mmol) wurden zu einer Lösung von α-Desoxyribonucleosid, dessen Base geschützt war (2,8 mmol) in trockenem Pyridin (7 ml) zugegeben und die Mischung wurde bei Umgebungstemperatur gerührt bis zum vollständigen Verschwinden des nucleosidischen Ausgangsmaterials (2 bis 2,5 h). Anschließend wurden Triethylammonium-(2-chloro-4-trityl-phenyl)(2-cyanoethyl)phosphat (2,06 g, 3,5 mmol), Mesitylen-2-sulfonylchlorid (1,531 g, 7 mmol) und N-Methylimidazol (0,56 ml, 7 mmol) nacheinander zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und es wurde ein Gemisch aus Wasser (2 ml) und Pyridin (5 ml) zugegeben. Nach weiterem 15-minütigem Rühren wurde die Reaktionsmischung in wäßriges 0,2 M Natriumdihydrogenphosphat (150 ml) gegossen und mit Methylenchlorid (3 x 60 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden nacheinander mit wäßrigem 0,2 M Natriumdihydrogenphosphat (75 ml) und wäßrigem 0,6 M Ammoniumhydrogencarbonat (1 %, bezogen auf das Natriumchlorid, 75 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule (60 g) fraktioniert. Die geeigneten Fraktionen wurden miteinander vereinigt und bis zur Trockne eingedampft und in Benzol lyophilisiert.
  • Für das 5'-O-Dimethoxytrityl-6-N-benzoyl-α-2'-desoxyadenosin-3'-[(2-chloro-4-trityl-phenyl)(2-cyanoethyl)]phosphat (4c) betrug die Ausbeute an Diastereoisomerengemisch 92 %.Anal. ber. für
  • Für das 5'-O-Dimethoxytrityl-2-N-palmitoyl-6-O-diphenylcarbamoyl-α-2'-desoxy-guanosin-3'-[(2-chloro-4-tritylphenyl)(2-cyanoethyl)]phosphat (4d) betrug die Ausbeute an dem Diastereoisomerengemisch 53 %
  • Anal. ber. für
    • 7) Allgemeines Verfahren zum Aufbau von α-Oligodesoxyribonucleotiden
  • Die vollständig geschützten α-Oligonucleotide wurden durch Wiederholung eines Zyklus von selektiven Reaktionen, umfassend eine Detritylierung, eine Decyanoethylierung und eine Kondensation, d.h. klassischen Stufen, aufgebaut.
    • 8) Allgemeines Verfahren zur Schutzgruppenentfernung aus den geschützten Reste G enthaltenden α-Oligodesoxyribonucleotiden
  • Eine Lösung, enthaltend ein vollständig geschütztes α-Oligonucleotid (0,058 mmol), 2-Pyridinaldoxim (1,117 g, 9,15 mmol) und N¹,N¹,N³,N³-Tetramethylguanidin (1,15 ml, 9,15 mmol) in einem Dioxan/Wasser-Gemisch (7:1, Vol./Vol., Endvolumen eingestellt auf 9,15 ml) wurde 24 h lang auf 70ºC erwärmt. Die Lösung wurde eingedampft und der Rückstand wurde 5 h lang bei 50ºC in wäßrigem Ammoniak gelöst. Danach wurde die Lösung eingedampft und der Rückstand wurde in 80 %iger Essigsäure (16 ml) gelöst. Nach einer 15-minütigen Säurebehandlung wurde die Lösung mit Methylenchlorid (5 x 20 ml) gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde bis zur Trockne eingedampft und die Produkte wurden an einer Säule (2,25 cm) von DEAE-Sephadex A25 (HCO&sub3;&supmin;) chromatographiert unter Verwendung eines Triethylammoniumhydrogencarbonatpuffers (pH 7,5, linearer Gradient von 0,001 M bis 1 M auf 1000 ml) als Eluierungsmittel. Es wurden 9 ml- Fraktionen gesammelt und die geeigneten Fraktionen wurden miteinander vereinigt und eingedampft. Der verbliebene Rückstand wurde mit Dowex 50W (Na&spplus;) behandelt, wobei man das gesuchte α-Oligonucleotid in Form des Natriumsalzes erhielt. Die beiden α-Oligonucleotide α-[d(CATGCG)] und α- [d(CGCATG)] wurden jeweils in Ausbeuten von 59 % und 52 % erhalten. Die HPLC-Analyse an einer C&sub1;&sub8;-Säule zeigte Reinheiten von mehr als 98 % an.
    • Beispiel II Synthese des Hexaribonuleotids α-CpUpCpCpCpU nach dem Phosphotriester-Verfahren (vgl. die nachfolgenden Reaktionsschemata III und IV) Literaturstellen:
  • 1. S.S. JONES, B. RAYNER, C.B. REESE, A. UBASAWA und M. UBASAWA, Tetrahedron, 36, 3075 (1980).
  • 2. R.A. SANCHEZ und L.E. ORCEL, J. Mol. Biol., 47, 531 (1970).
  • 3. W.T. MARKIEWICZ, J. Chem. Res., Synop. 24 (1979) et J. Chem. Res. Miniprint, 181 (1979).
  • 4. J.B. CHATTOPADHYAYA und C.B. REESE, Tet. Letters, 5059 (1979).
  • Die nachstehend beschriebene Synthese des Hexaribonucleotids α-CpUpCpCpCpU wurde nach dem Phosphotriester- Verfahren in Lösung durchgeführt. Sie ähnelt derjenigen, die von C.B. REESE et al. in (1) für die natürliche β- Reihe beschrieben worden ist. Sie erfordert die Herstellung des Nucleosid-Synthons 6a, welches das 3'-Ende des Oligonucleotids darstellt, der Synthone 5a und 5b für die Verlängerung der-Oligonucleotid-Kette und des Synthons 7b, welches das 3'-Ende des Oligonucleotids darstellt. Die beiden teilweise geschützten Triribonucleotide 12 und 16 wurden nach dem Reaktionsschema IV hergestellt, dann miteinander vereinigt zur Herstellung des vollständig geschützten Hexaribonucleotids 17. Nach der Schutzgruppenentf ernung wurde das Hexaribonucleotid α-CpUpCpCpCpU gereinigt und charakterisiert. Reaktionsschema III B : CYTOSIN B : URACIL a B' : N-BENZOYL-4 CYTOSIN (CBz) b B' : URACIL (U) THP : 2-Tetrahydropyranyl Dmtr : 4,4'-Dimethoxy-trityl Ar : 2-Chloro-phenyl Bz : BENZOYL Reaktionsschema IV THP : 2-Tetrahydropyranyl Dmtr : 4m4'-Dimethoxy-trityl Bz : BENZOYL Ar : 2-Chlorophenyl Et : ETHYL
  • i) o-Chlorophenyl-phosphorodi-(1,2,4-triazolid)/Acetonitril/Pyridin dann Wasser/Triethylamin/Pyridin
  • ii) 1-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT)/Pyridin
  • iii) 0,5 %ige Trifluoroessigsäure/Dichlormethan bei 0ºC oder 2 %ige Benzolsulfonsäure/Dichlormethan/Methanol bei 0ºC.
    • 1) Herstellung der Nucleosid-Synthone 5a, 5b, 6a und 7b
  • Sie werden hergestellt aus den α-Ribonucleosiden 1a und 1b, die nach den in der Literatur (2) beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Die selektive Einführung der säurelabilen 2-Tetrahydropyranyl (THP)-Schutzgruppe erfolgte nach dem folgenden Verfahren (3) (vgl. Reaktionsschema 3). Nach der Behandlung der Verbindung 1b mit 1,1,3,3-Tetraisopropyl-1,3-dichlorodisiloxan in einem Dimethylformamid/Pyridin-Gemisch wird das erhaltene Derivat 2b mit Tetrahydropyran in Gegenwart von Trifluoressigsäure behandelt, wobei man 3b erhält. Nach der Reinigung wird die zuletzt genannte Verbindung einer Behandlung mit einer 1 M Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung in Tetrahydrofuran unterworfen. Die 1,1,3,3-Tetraisopropyl-disilyl-Schutzgruppe wird auf diese Weise selektiv entfernt und man erhält die Verbindung 5b.
  • Das α-Cytidin wird analog zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren behandelt, jedoch mit der folgenden Modifikation, welche die Einführung einer Benzoyl-Schutzgruppe in die 4-Position der Base Cytosin erlaubt. Nach der Einführung der Tetrahydropyranyl-Gruppe wird die Verbindung 3a mit Benzoylchlorid in einer Pyridinlösung behandelt und die resultierende Verbindung 4a wird mit einer 1M Tetrabutylammoniumfluoridlösung in Tetrahyddrofuran behandelt, wobei man nach der Reinigung die gewünschte Verbindung 5a erhält. Das Nucleosid-Derivat 6a wurde erhalten durch Trithylierung von 5a mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in einem Pyridin-Medium.
  • Schließlich wurde das Nucleosid-Synthon 7b, welches das 3'-Ende des Oligonucleotids darstellt, in drei Stufen aus dem α-Cytosin hergestellt. Diese drei Stufen sind folgende: a) selektive Tritylierung der 5'-Hydroxylverbindung mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid, dann b) Benzoylierung der 2'- und 3'-Positionen mit Benzoylchlorid und schließlich c) selektive Schutzgruppenentfernung aus der 5'-Hydroxylverbindung durch eine Behandlung mit 2 %iger Benzolsulfonsäure in einem Dichlormethan/Methanol (7/3, Vol./Vol.)-Gemisch. Die Gesamtausbeute dieser drei Stufen beträgt 67 %.
    • 2) Aufbau des vollständig geschützten Hexaribonucleotids α-CpUpCpCpCpU
  • Das Triribonucleosiddiphosphat 16 und das Triribonucleosidtriphosphat 12 wurden nach dem Reaktionsschema III hergestellt. Jeder Aufbauzyklus umfaßt eine Phosphorylierungsstufe, welche die Einführung einer Phosphodiestergruppe in die 3'-Position eines teilweise geschützten Nucleosid- oder Nucleotid-Derivats erlaubt, und eine Kupplungsstufe zwischen der in der vorhergehenden Stufe erhaltenen 3'-Phosphodiester-Verbindung und einem Nucleosid- oder Nucleotid-Derivat, dessen 5'-OH-Funktion frei ist. In bestimmten Fällen (vgl. Schema II) ist eine zusätzliche Detritylierungsstufe erforderlich, um diese 5'-OH-Funktion von der Schutzgruppe zu befreien.
  • Die Phosphorylierungsstufen in der 3'-Position wurden durchgeführt durch Behandlung mit dem O-Chlorophenylphosphorodi-(1,2,4-triazol-id) (4) eines 3'-OH-Derivats, gelöst in einem wasserfreien Acetonitril/Pyridin-Gemisch, woran sich eine Hydrolyse in Gegenwart von Triethylamin anschließt. Auf diese Weise erhält man die 3'-O-Arylphosphat-Derivate 8a, 10 und 12 in Ausbeuten von höher als 90 %.
  • Die Kupplungsstufen zwischen einem 3'-O-Arylphosphat- Derivat und einem 5'-OH-Nucleosid- oder -Nucleotid-Derivat wurden durchgeführt in Lösung in wasserfreiem Pyridin in Gegenwart des Kupplungsmittels Mesitylen-1-sulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT) (1).
  • So gibt man beispielsweise MSNT (1,67 mmol) zu einer Lösung des Triribonucleosidtriphosphats 12 (0,334 mmol) und des Triribonucleosiddiphosphats 16 (6,278 mmol) in wasserfreiem Pyridin (2 ml). Die Mischung wird 55 min lang bei Umgebungstemperatur gerührt, dann wird sie auf eine Natriumhydrogencarbonatlösung (50 ml) gegossen. Die erhaltene Mischung wird mit Dichlormethan (3 x 30 ml) extrahiert. Die organischen Phasen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie an einer Silicagel-Säule gereinigt (Eluierungsmittel: Dichlormethan/Methanol). Die das gewünschte Produkt 17 enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wird mit Petroläther ausgefällt (Ausbeute 58 %).
    • 3) Schutzgruppenentfernung, Reinigung und Charakterisierung des Hexaribonucleotids αCpUpCpCpCpU
  • Das vollständig geschützte Hexaribonucleotid 17 wurde den folgenden Behandlungen unterworfen:
  • - 1M Tetramethylguanidinium-4-nitro-benzaldoximat in einem Dioxan/Wasser (1/1, Vol./Vol.)-Gemisch während 18 h;
  • - konzentriertes Ammoniak während 5 h bei 50ºC;
  • - Chlorwasserstoffsäure (pH 2) während 4 Tagen bei Umgebungstemperatur.
  • Am Ende dieser Behandlungen wird das von Schutzgruppen befreite Oligonucleotid αCpUpCpCpCpU durch Chromatographie an einer Anionen-Austauscher-Säule DEAE-Sephadex (HCO&sub3;&supmin;-Form) gereinigt unter Verwendung einer Triethylammoniumhydrogencarbonatlösung (mit linearem Gradienten von 0,01 M -> 1M auf 1000 ml) als Eluierungsmittel. Die Ausbeute der Schutzgruppenentfernung beträgt 56 %.
  • Eine Fraktion (etwa 5 Einheiten von DO 260) des Oligoribonucleotids αCpUpCpCpCpU wurde einem enzymatischen Abbau durch Schlangengift-Phosphodiesterase und alkalisches Phosphat unterworfen. Die Analyse der Abbauprodukte durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie zeigte einen vollständigen Abbau zu α-Uridin und α-Cytidin in einem Verhältnis 1/2,1 an.
    • Beispiel III Synthese von α-Oligodesoxyribonucleotiden auf einem Träger
  • Die Synthese von α-Oligodesoxyribonucleotiden auf einem Träger, die nachstehend beschrieben wird, läuft nach dem Phosphoroamidit-Verfahren ab. Sie ähnelt derjenigen, wie sie für die natürliche β-Reihe von Caruthers et al. beschrieben worden ist (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981) und L.J. McBride und M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 24, 245-248 (1983)). Sie erfordert die Herstellung (1) der den vier Basen T, C, A und G entsprechenden α-Desoxynucleosid-Phosphoramidit-Synthone 2a-d nach dem folgenden Reaktionsschema:
  • Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
  • a B= T = Thymin
  • b B= CBZ = 4-N-Benzoyl-cytosin
  • c B= ABZ = 6-N-Benzoyl-adenin
  • d B= GPal= 2-N-Palmitoylguanin
  • Dmtr = 4,4'-Dimethoxy-trityl; iPr = Isopropyl;
  • Bz = Benzoyl
  • Diese Synthese erfordert auch die Funktionalisierung eines festen Trägers (2), dem ein α-Desoxyribonucleosid- Derivat einverleibt wird.
  • In einer zweiten Stufe wurde die Verlängerung der Oligonucleotid-Kette (3) mit Hilfe eines manuellen oder automatischen Synthetisators durchgeführt. Schließlich wurde nach Beendigung der zahlreichen erforderlichen Synthesezyklen das Oligonucleotid von dem Träger befreit, von Schutzgruppen befreit und gereinigt.
    • 1) Herstellung der α-Desoxyribonucleosid-phosphoramidite 2a-d
  • Die vier N-geschützten α-Desoxyribonucleosidphosphoramidite 2a-d wurden erhalten aus den entsprechenden N-geschützten 5'-O-Dimethoxytrityl-α-desoxyribonucleosiden 1a-d. Das Nucleosid-Derivat 1 wurde mit Methylchloro-N,N-diisopropylamino-phosphoramidit (2,5 Moläquivalente) in Gegenwart von N,N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) in Dichlormethan unter einer inerten Atmosphäre behandelt. Das erhaltene Phosphoramidit-Derivat 2 wurde durch Chromatographie an Silicagel gereinigt und isoliert mit Ausbeuten, die zwischen 79 % und 95 % variierten. Die Analyse der vier Phosphoramidit-Derivate 2a-d durch ³¹P-NMR gibt eine Reinheit von mehr als 97 % an.
  • Das allgemeine Verfahren zur Herstellung der α-Desoxy-2'-nucleosid-N,N-diisopropylamino-3'-phosphoramidit- Derivate 2a-d war das folgende.
  • Zu einer Lösung des N-geschützten 5'-O-Dimethoxytrityl-α-desoxynucleosids 1 (1 mmol) und von N,N,N-Diisopropylethylamin (4 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (3 ml) gibt man unter Argon und mittels einer Spritze Methylchloro-N,N-diisopropylaminophosphoramidit (2,5 mmol) zu. Die Reaktionsmischung wird 10 min lang bei Umgebungstemperatur gerührt, dann wird sie in eine Dekantier-Ampulle überführt, die Ethylacetat (35 ml) enthält. die Mischung wird mit einer Salzlösung (4 x 80 ml) extrahiert und die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird durch Chromatographie an Silicagel (10 g) gereinigt unter Verwendung eines Hexan/Dichlormethan-Gemisches, das 1 % Triethylamin enthält, als Eluierungsmittel. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in kaltem (-78ºC) n- Hexan (50 ml) ausgefällt oder lyophilisiert, wobei man von einer Lösung in Benzol (15 ml) ausgeht. Es werden die Verbindungen 2a-d in Form von weißen Pulvern erhalten und unter Argon bei -20ºC aufbewahrt.
  • Die Ergebnisse der Analysen der vier Phosphoramidit- Derivate 2a-d durch ³¹P-NMR sind die folgenden: a :Ausbeute 88% . ³¹P-RMN δ 150,9 b : Ausbeute 79% . ³¹P-RMN δ 150,42 und 151,7 c : Ausbeute 95% . ³¹P-RMN δ 150,81 und 150,91 d : Ausbeute 87% . ³¹P-RMN δ 150,76 und 150,97
    • 2) Funktionalisierung des festen Trägers
  • Sie wurde durchgeführt durch Einführen eines Succinyl-Verbindungsglieds zwischen die 3'-Hydroxyl-Gruppe des 5'-N-Acyl-O-dimethoxytrityl-α-desoxynucleosid-Derivats und die Aminogruppe des festen Trägers nach dem folgenden Reaktionsschema: DCC : Dicyclohexylcarbodiimid DMAP : Dimethylaminopyridin (Katalysator)
  • Die Verbindung wurde vorher in ein Pentachlorophenyl-3'-succinat-Derivat umgewandelt und anschließend mit der Aminogruppe der langen Alkylamin-Kette, die auf porösen Glaskugeln fixiert war (LCA-CPG) umgesetzt
  • (S.P. Adams, K.S. Kavka, E.J. Wykes, S.B. Holder und G.R. Galluppi, J. Am. Chem. Soc., 105, 661 (1983)).
  • Die Menge des an dem festen Träger fixierten Nucleosids wurde durch spektrophotometrische Analyse des Dimethoxytrityl-Kations bestimmt, das durch eine Behandlung mit einer 10 %igen Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan freigesetzt wurde. Der Grad der Funktionalisierung variiert von 25 bis 38 uMol pro Gramm je nach Art der Nucleosid-Base.
    • 3) Synthese von α-d(TACGGCCAGT)
  • Das Decanucleotid α-d(TACGGCCAGT) wurde manuell synthetisiert. Das 5'-O-Dimethoxytrityl-α-tymidin, das kovalent mit dem Träger LCA-CPG verbunden war (etwa 1 uMol), wurde in einen kleinen Reaktor eingeführt. Die Verlängerung dieses Oligonucleotids wurde mittels einer Stufenfolge von 9 Synthesezyklen durchgeführt (vgl. die nachstehende Tabelle III).
  • Außer den Waschungen umfaßt jeder Zyklus eine Detritylierung (Stufe 4), eine Kondensation (Stufe 12), eine Acetylierung (Stufe 13) und eine Oxidation (Stufe 15). Am Ende der Anzahl der erforderlichen Zyklen wurde der Träger mit einem Thiophenol/Triethylamin/Dioxan (1/2/3, Vol./Vol./Vol.)-Gemisch 1 h lang behandelt, um die Methylgruppe der Phosphate zu entfernen. Dann wurde der Träger mit konzentriertem Ammoniak bei 60ºC 12 h lang behandelt, um die Schutzgruppen der heterocyclischen Amine zu entfernen und die Nucleotid-produkte von dem festen Träger abzulösen. Das gewünschte Oligonucleotid, das noch die Dimethoxytrityl-Gruppe an seinem 5'-Ende trug, wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie an einer Säule mit einer C&sub1;&sub8;-Pfropfphase gereinigt unter Erzielung einer Ausbeute von 20 %. Durch Behandlung mit 80 %iger Essigsäure ist es möglich, sein 5'-Ende von der Schutzgruppe zu befreien.
  • Anschließend wurde das gereinigte Decanucleotid einem enzymatischen Abbau durch die Phosphodiesterase von Schlangengift und alkalische Phosphatase unterworfen. Die Analyse der Abbauprodukte durch Hochleistungs- Flüssigchromatographie zeigte einen vollständigen Abbau zu α-Thymidin, α-Desoxy-2'-cytidin, α-Desoxy-2'-adenosin und α-Desoxy-2'-guanosin in einem Verhältnis 2,1/3,2/1,8/3,3 (theoretisches Verhältnis 2/3/2/3) an.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß Oligodesoxyribonucleotide, die nur Nucleotid-Einheiten mit α-anomerer Konfiguration enthalten, schnell synthetisiert werden können nach dem Phosphoramidit-Verfahren auf einem festen Träger.
  • Der Versuchsablauf für die manuelle Synthese der α- Oligonucleotide auf porösen Glaskugeln (CPG) war der folgende.
  • Der Reaktor wurde mit 30 mg funktionalisiertem Träger beschickt (25-38 uMol/g). Das jeder Stufe entsprechende Volumen beträgt 1 ml, außer wenn etwas anderes angegeben ist. Tabelle III Stufe Reagens oder Lösungsmittel Zeit 0,1M Phosphoramidit * (0,2 ml) und 0,4M Tetrazol (0,2 ml) in Acetonitril DMAP/THF/Lutidin (6/90/10, p/v/v), dann 0,1 ml Essigsäureanhydrid pro Stufe * Im Falle von G und aus Löslichkeitsgründen wird eine Lösung von 0,05 M Phosphoramid verwendet. In diesem Falle wird die Stufe 12 ein zweites Mal durchgeführt vor dem Übergang zur Stufe 13.
    • Beispiel IV Automatische Synthese von α-Oligodesoxyribonucleotiden
  • Es wurde ein Gen-Synthetisator, Modell 380, der Firma Applied Biosystems verwendet. Wegen der geringen Löslichkeit des Phosphoramidit-Derivats von G in Acetonitril wurde eine 0,05 M Lösung dieses Phosphoamidits, die ständig bei 37ºC gehalten wurde, verwendet. Das Standard-Syntheseprogramm wurde modifiziert zur Wiederholung der entsprechenden Stufen bei der Einarbeitung von G und um eine hohe Kupplungsausbeute (mehr als 98 %) zu gewährleisten.
  • Auf diese Weise wurde das Oligonucleotid
  • α-d (TAAAAGGGTGGGCAATC)
  • erhalten (62 Einheiten von DO&sub2;&sub6;&sub0;). Seine Reinheit und seine Größe (Gestalt) wurden durch Elektrophorese an einem Gel unter denaturierenden Bedingungen bestimmt.
    • Beispiel V Enzymatische Stabilität der Oligonucleotide α- und β- [d(CATGCG)] gegenüber bestimmten Nucleasen
  • Es wurden drei Nucleasen verwendet: eine Endonuclease, die Nuclease S1, die für DNA-Einfachstränge spezifisch ist; eine 5'-Exonuclease, die Kalbsmilz-Phosphodiesterase; und eine 3'-Exonuclease, die Schlangengift- Phosphodiesterase. Um die enzymatische Hydrolyse zu verfolgen, wurden die Hyperchromizität bei 260 mm und die HPLC angewendet. Innerhalb von 20 min war keine signifikante Änderung der Extinktion aufgetreten, wenn das α- Oligomere mit der Nuclease S1 inkubiert wurde, während das β-Oligomere eine Zunahme der Extinktion in diesem Zeitraum ergab.
  • Die UV-Absorption erlaubt keinen quantitativen Vergleich zwischen den β- und α-Oligomeren, was ihren Abbau angeht. Diese Ergebnisse wurden durch eine HPLC-Analyse bestätigt. Das Verschwinden des dem Hexanucleotid entsprechenden Peaks wurde während der Inkubationen mit der Nuclease S1 bei 37ºC festgestellt. Nach 10-minütiger Inkubation gab es keine β-Hexameren mehr, während nur 7 % des α-Hexameren abgebaut worden waren (Tabelle IV).
  • Die vergleichende Stabilität der beiden α- und β-Hexameren in bezug auf die Hydrolyse durch die Kalbsmilz- Phosphodiesterase ist in der nachstehenden Tabelle IV erläutert. Der Unterschied zwischen den beiden anomeren Oligomeren ist auffallend: jede Änderung des α-Oligomers trat innerhalb von 10 min auf, während in der gleichen Zeit 89 % des β-Oligomers hydrolysiert waren. Tabelle IV
  • Hydrolyse von α- oder β-d(CATGCT)] (jeweils 166 mMol) als Funktion der Zeit durch die Nuclease S1 (93 Einheiten/ml) und die Kalbsmilz-Phosphodiesterase (0,013 Einheiten/ml) bei 37ºC. Restlicher Hexamer-Anteil nach 1 oder 10 min. Nuclease S1 Dauer (min) Phosphodiesterase der Kalbsmilz Dauer (min)
  • Die Stabilität der beiden anomeren Hexameren gegenüber der Hydrolyse durch die Schlangengift-Phosphodiesterase wurde untersucht, indem die UV-Extinktion bei 260 nm verfolgt wurde. Bei geringen Enzym-Konzentrationen wurde das α-Olignucleotid langsam hydrolysiert, während der Abbau des entsprechenden β-Oligonucleotids sehr deutlich war.
    • 1) Vergleich der Substrate α- und β-[d(CATGCG)] in bezug auf unterschiedliche Nucleasen HPLC-Analyse:
  • Die HPLC-Apparatur war eine solche der Firma Waters Associates und sie war ausgestattet mit einer C 18 Bondapak-Säule. Die isokratische Elution wurde mit dem folgenden System durchgeführt: 27 % Acetonitril in 20 mM Ammoniumacetat (pH 6,5) und Nachweisverfahren bei 260 nm.
    • a) Nuclease S1
  • Diese Nuclease war eine solche der Marke GIBCO BRL. Eine Einheit solsubilisiert innerhalb von 1 min bei 37ºC 1 ug denaturierte DNA.
  • Eine Lösung eines α-Oligonucleotids oder eines β-Oligonucleotids (50 nmol) in Wasser (30 ul) wurde mit dem folgenden Puffer (30 ul) gemischt: 0,5 M Natriumacetat (pH 4,7), 3 M Natriumchlorid, 0,1 M Zinkacetat. Dieses Volumen wurde mit 300 ul Wasser vervollständigt. Die Nuclease S1 (28 Einheiten, 3 ul) wurde anschließend zugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC inkubiert und die aliquoten Anteile (20 ul) wurden innerhalb eines beliebigen Zeitraums entnommen und mit dem Blockierungs-Puffer gemischt: 20 mM Kaliumphosphat (pH 6,5, 180 ul), vor dem Erwärmen auf 100ºC innerhalb von 5 min. Eine ähnliche Behandlung wurde zu Vergleichszwecken durchgeführt. Es wurden Volumina von 50 ul injiziert.
    • b) Phosphodiesterase der Kalbsmilz
  • Es wurde ein ähnliches Verfahren wie das vorstehend beschriebene durchgeführt, wobei diesmal jedoch die genannte Phosphodiesterase (4 x 10&supmin;³ Einheiten, 1 ul) anstelle der Nuclease S1 in 0,1 M Ammoniumacetat (pH 6,5) zugegeben wurde. Die Kalbsmilz-Phosphodiesterase wurde von der Firma Boehringer (Mannheim) bezogen. Eine Einheit hydrolysiert 1 min bei 25ºC. Die Reaktion wurde in Wasser anstelle einer Kaliumphosphatlösung gestoppt.
    • UV-Spektrophotometrie
  • Es wurde ein Uvikon-Spektrophotometer 810, ausgestattet mit einem bei 37ºC arbeitenden Thermostat-System verwendet. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 1 ml. Die Oligonucleotide (60 nMol) wurden zugegeben und es wurde die Extinktion bei 260 nm auf 0 eingestellt. Es wurde die Nuclease S1 (1 ul, 9,3 Einheiten) zugegeben und es wurde die Extinktion bei 260 nm als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Es wurde ein analoges Verfahren angewendet unter Verwendung von Schlangengift-Phosphodiesterase, die ebenfalls von der Firma Boehringer bezogen wurde (1 ul, 3 x 10&supmin;&sup6; Einheiten).
  • Die Fig. 1 zeigt die UV-Extinktionskurven bei 260 nm als Funktion der Zeit jeweils für die Oligonucleotide β- und α-[d(CATGCG)]. Eine Pufferlösung bestand aus 0,05 M Natriumacetat (pH 4,7), 0,3 M Natriumchlorid und 0,01 M Zinkacetat. Zum Zeitpunkt t = 0 wurde die Nuclease S1 (0,3 Einheiten/ml) zu 60 uM α- oder β-Hexamer zugegeben.
  • Die Fig. 2 zeigt die UV-Extinktion bei 260 nm als Funktion der Zeit. Die Pufferlösung bestand aus 0,1 M Tris-HCl (pH 9) und 0,01 M Magnesiumchlorid. Zum Zeitpunkt t = 0 min wurde die Schlangengift-Phosphodiesterase (3 x 10&supmin;&sup6; Einheiten/ml) bei 37ºC zu 66 um α- oder β-Hexamer zugegeben.
    • Beispiel VI Parallele paarige Anordnung der beiden α- und β-Stränge
  • Ausgehend von den synthetisierten α-Sequenzen, welche die vier Basen umfassen, zeigen die nachstehenden Ergebnisse, daß die α- und β-Sequenzen parallel paarig angeordnet sind, während zwei komplementäre α-Sequenzen sich antiparallel paarig anordnen. Andererseits ist die paarige α,β-Anordnung viel stabiler als die paarige β,β-Anordnung.
  • Das NMR-Spketrum der Imino-Protonen bei 4ºC dieser Lösungen in D&sub2;O-H&sub2;O zeigt nämlich, daß
  • a) die Sequenez α-[d(CATGCG)] zwei gut definierte Peaks bei 12,57 und 14,17 ppm einer Stärke von ≈ 1:1 aufweist, die aus der antiparallelen paarigen Anordnung stammen:
  • b) Die Sequenz β-[d(GTACGC)] weist zwei breitere Peaks bei 13,65 und 12,58 ppm auf. Auch hier lassen die relative Intensität und Symmetriebetrachtungen vermuten, daß sie auf die antiparallele paarige Anordnung zurückzuführen sind:
  • c) Das Gemisch der Sequenzen α-[d(CATGCG)] und β- [d(GTACGC)] (1:1) weist sechs Imino-Peaks bei 14,22, 13,83, 13,23, 13,02, 12,73 und 12,57 ppm und einen breiten Peak bei 13,66 ppm auf. Da die chemischen Verschiebungen der ersten Ansammlung von sechs Signalen alle verschieden sind von denjenigen, die bei (a) und (b) beobachtet wurden (mit Ausnahme von δ = 12,57, das gleichzeitig bei den α- und β-Sequenzen vorhanden ist) scheint es vernünftig, diese sechs Peaks denjenigen der Imino-Protonen zuzuordnen, die aus der paarigen Anordnung von α-[d(CATGCG)] - β- [d(GTACGC)]stammen. Die Anzahl der beobachteten Signale von Imino-Protonen stimmt besser überein mit einer parallelen paarigen Anordnung (A) als mit einer antiparallelen paarigen Anordnung (B):
    • Beispiel VII Vereinigung eines Tetramers von α-Thymidin mit einem Interkalationsmittel
  • Ein Tetramer von α-Thymidin, das über eine Pentamethylen-Kette kovalent an ein Derivat von 2-N-Methyl-9-hydroxyellipticiniumacetat gebunden ist, wurde in drei Stufen nach dem folgenden Reaktionsschema synthetisiert: Stufe Peroxidase
    • - Stufe 1:
  • Bindung des Pentamethylen-Arms an das Tetramere von α-Thymidin.
  • Die endständige 3'-OH-Gruppe des in 5'-Stellung durch eine Dimethoxytrityl-Gruppe (Dmtr) geschützten Tetramers ist mit einer Aminocapronsäure verestert, deren terminaler Rest mit Dmtr blockiert wird. Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur in Pyridin mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) als Kupplungsmittel und mit Dimethylaminopyridin (DMAP) als Katalysator durchgeführt. Die Reaktion ist nach 3 Stunden beendet.
    • -Stufe 2:
  • Schutzgruppenentfernung
  • Die Dmtr-Gruppen werden mit 80 %iger Essigsäure entfernt. Das so erhaltene resultierende Produkt
  • α[(Tp)&sub3;T]-3'O- -(CH&sub2;)&sub5;-NH&sub2;,
  • wird an einer Säule in der Umkehrphase gereinigt. Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Ausbeute der Reaktionen (1 + 2) 65 %.
    • - Stufe 3:
  • Bindung des Ellipticin-Derivats an das modifizierte Tetramere.
  • In dieser Stufe wurde ein enzymatisches System verwendet: Peroxide von Raifort-H&sub2;O&sub2;. Das Ellipticinderivat 2-N-Methyl-9-hydroxy-ellipticinium (NMHE) wird durch diese enzymatische Reaktion oxidiert, was zu einem O-Chinonderivat von NMHE führt. Dieses elektrophile Zwischenprodukt erleidet anschließend einen Angriff an der Aminofunktion, die das modifizierte Tetramere trägt. Auf diese Weise entsteht ein Oxazol-Kern, was zu der fluoreszierenden Verbindung
  • α [(Tp)&sub3;T]-3'O- -(CH&sub2;)&sub4;-OPC α-T&sub4;-C&sub5;-OPC
  • mit der folgenden Formel führt
  • Die Reaktion wird in einem Phosphat-Puffer bei pH 7 durchgeführt und das Endprodukt wird an einer C 18-Säule in der Umkehrphase und durch HPLC gereinigt.
    • 1) Herstellung von 3'-O-Benzoyl-α-thymidin
  • 389,7 mg (1,15 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid wurden zu einer Lösung von 2'-α-Thymidin (1 mmol und 242,2 mg) in wasserfreiem Pyridin (2,5 ml) zugegeben. Die resul-20 tierende Mischung wurde 3 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und es wurde Methanol (1 ml) zugegeben. Nach weiterem 15-minütigem Rühren wurde die Mischung in 40 ml gesättigtes wäßriges Natriumhydrogencarbonat gegossen und mit Methylenchlorid (3 x 20 ml) extrahiert. Die gemischten organischen Schichten wurden bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie fraktioniert unter Verwendung eines Aceton/Methylenchlorid-Gemisches (0 bis 40 %) als Eluierungsmittel. Die das reine 5'-O-Dimethoxytrityl-α-thymidin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äther (unterhalb 40ºC) ausgefällt (514,6 mg, 94,5 %).
  • 42,2 mg (0,30 mmol) Benzoylchlorid wurden zu einer Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-α-thymidin (0,25 mmol, 0,136 g) in wasserfreiem Pyridin (1 ml) zugegeben. Die Lösung wurde 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und es wurden 0,5 ml Wasser zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren wurde die Reaktionsmischung in 20 ml gesättigtes wäßriges Natriumhydrogencarbonat gegossen und mit Methylenchlorid (3 x 10 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid/Methanol (7/3 Vol./Vol.; 5 ml) gelöst und außerdem wurde 10 %ige (Vol./Vol.) Benzolsulfonsäure in Methylenchlorid zugegeben. Nach 17-minütigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 2 ml gesättigten wäßrigem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und zwischen 20 ml gesättigtem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Methylenchlorid (3 x 15 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Phasen wurden bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie (10 g) fraktioniert. Die das 3'-O-Benzoyl-α-thymidin-Derivat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äther (unterhalb 40ºC) ausgefällt, wobei man ein farbloses amorphes Pulver erhielt (0,075 g, 87 %).
    • 2) Herstellung von 5'-O-Dimethoxytrityl-α-[(Tp), T]
  • Zu 0,393 g (0,15 mmol) einer Lösung von geschütztem Dmtr-α-(Tp)&sub3;T-Bz in Wasser/Dioxan (1/7, Vol./Vol., 5 ml) wurden zugegeben 0,6106 g (5 mmol) Pyridin-2-aldoxim und 0,627 ml(5 mmol) N¹,N¹,N³,N³-Tetramethylguanidin. Die resultierende Lösung wurde 9,5 h lang auf 70ºC erwärmt, dann abgekühlt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Tetrylammoniumhydrogencarbonat (TEAB, 50 ml, 50 mmol) aufgelöst und mit Diethyläther (2 x 25 ml) gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde an einer C&sub1;&sub8;-Säule von Silicagel in der Umkehrphase (1,2 x 10 cm) chromatographiert unter Verwendung eines Methanol-Gradienten (von 0 bis 50 %) in Wasser (0,1 M, bezogen auf TEAB). Die geeigneten Fraktionen wurden miteinander vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Die Lyophilisierung des Rückstandes ergab die gewünschte Verbindung in Form eines farblosen Pulvers (0,223 g) in einer Ausbeute von 84 %.
    • 3) Herstellung der Verbindung α-(Tp)&sub3;T-3'-O-ε-aminohexanoat
  • Zu einer Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-α-(Tp)&sub3;T (0,223 mg, 0,13 mmol) und N-Dimethoxytrityl-ω-aminohexansäure (0,281 g, 0,65 mmol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml) wurden zugegeben 0,2678 g (1,3 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 0,0793 mg (0,65 mmol) N,N-Dimethylamino-4-pyridin. Die resultierende Lösung wurde 3 1/2 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Anschließend wurde 1 ml Wasser zugegeben und die Mischung wurde filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde aus Diethyläther ausgefällt (dieser zuletzt genannte Vorgang wurde dreimal wiederholt). Der Niederschlag wurde in 80 %iger Essigsäure (5 ml) aufgelöst und die Lösung wurde 20 min lang bei Umgebungstemperatur aufbewahrt. Die Mischung wurde mit Diethyläther extrahiert und bis zur Trockne eingedampft. Zu dem Rückstand wurde Toluol zugegeben und die resultierende Mischung wurde erneut bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an einer C&sub1;&sub8;-Silicagel-Säule in der Umkehrphase (1,2 x 10 cm) chromatographiert unter Verwendung eines abgestuften Methanol- Gradienten (0 bis 40 %) in Wasser. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Es wurde die gesuchte Verbindung in Form eines farblosen Pulvers (0,130 g) in einer Ausbeute von 65 % erhalten.
    • 4) Herstellung vonα-T&sub4;-O- -(CH&sub2;)&sub4;-OPC
  • Die eingesetzten Reagensmengen waren die folgenden.
  • Auf 130 mg (0,082 mmol) α-(Tp)&sub3;T-3'-O-ε-Aminohexanoat wurden 11 mg (0,032 mmol) 2-Methyl-9-hydroxyellipticiniumacetat in 50 ml eines 0,02 M Phosphatpuffers von pH 7 gelöst. Die Lösung wurde bei Umgebungstemepratur ständig gerührt. Zu der Mischung wurden 0,8 mg Peroxidase (Raifort) zugegeben. Nach dem Auflösen des Enzyms wurden 1,5 ml einer 20 mM H&sub2;O&sub2;-Lösung zugetropft. Die Lösung wurde filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend durch Chromatographie an einer Lighrosorbe RP 18-Säule in der Umkehrphase (0 bis 60 %) in Wasser vorgereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Die Reinigung des Produkts wurde durch HPLC vervollständigt. Das Produkt wurde über eine Dowex 50 W (NH&sub4;&spplus;-Form)-Säule laufen gelassen. Nach der Lyophilisierung war die erhaltene Endverbindung ein gelbes Pulver (2,7 mg) in einer Ausbeute von 5 %.
    • Beispiel VIII Paarige Anordnung von α-T&sub4;-C&sub5;-OPC mit einem Poly(rA)
  • Die Wechselwirkung zwischen α-T&sub4;-C&sub5;-OPC und Poly(rA) wurde untersucht unter Anwendung der UV-Absorption und der Fluoreszenz. Das UV-Spektrum von α-T&sub4;-C&sub5;-OPC weist zwei Maxima bei 271 nm und 317 nm auf. Außerdem ist diese Verbindung fluoreszierend mit einem jeweiligen bei Erregungs- und Emissionsmaximum bei 318 nm bzw. 525 nm.
  • In Gegenwart von zunehmenden Mengen an Poly(rA) wird das Spektrum von α-T&sub4;-C&sub5;-OPC (0,05 mM in 10 mM Natriumkakodylat, 100 mM NaCl, pH 7) modifiziert. Eine Hygrochromizität erscheint zwischen 260 nm und 320 nm und entspricht der Vereinigung von α-T&sub4;-C&sub5;-OPC mit der Poly(rA)-Sequenz. Bei 270 nm kann man die Bildung des Duplex zwischen der Tetra-α-thymidilat-Kette und Poly(rA) verfolgen, während man bei 310 nm die Wechselwirkung des Oxazolopyridocarboxazol-Fragments verfolgt. Aus dem Verhältnis zwischen der Extinktion des freien α-T&sub4;-C&sub5;-OPC und der Anfangs- Extinktion des α-T&sub4;-C&sub5;-OPC kann man als Funktion des Verhältnisses zwischen der Poly-(rA)-Konzentration, ausgedrückt in Nucleotiden, und der Konzentration des Oxazolopyridocarboxazol-Derivats die Stöchiometrie der Wechselwirkung ableiten, die entspricht einem Molekül α- T&sub4;-C&sub5;-OPC, das an vier Adenin-Reste gebunden ist. Unter den gleichen Bedingungen wurde keine Vereinigung zwischen α-T&sub4; und Poly(rA) nachgewiesen.
  • Man kann auch die Vereinigung von α-T&sub4;-C&sub5;-OPC mit Poly(rA) als Funktion der Temperatur untersuchen. Wenn einmal der Komplex bei 8ºC gebildet worden ist, wurde das UV-Spektrum des freien α-T&sub4;-C&sub5;-OPC bei Erhöhung der Temperatur zunehmend wiedergefunden. Bei 347 nm und 324 nm treten zwei isobestische Punkte auf. Bei Temperaturen von über 26ºC ist die Extinktion bei 317 nm größer als diejenige, die dem freien α-T&sub4;-C&sub5;-OPC bei 8ºC entspricht. Dies zeigt an, daß eine Ablösung des Moleküls α-T&sub4;-C&sub5;-OPC auftritt, wenn die Temperatur erhöht wird. Die Temperatur, die einer 50 %igen Dissoziation des Komplexes entspricht, beträgt 24,5ºC bei 270 nm und 26ºC bei 310 nm. Dieses Ergebnis kann verglichen werden mit demjenigen, das bei den Komplexen zu beobachten ist, die zwischen β-T&sub4;-C&sub5;-OPC und Poly(rA) gebildet werden. Im letzteren Falle betrug die Dissoziationstemperatur des Komplexes unter den gleichen Bedingungen 16ºC.
  • Die Fluoreszenz des OPC-Fragments des Moleküls β-T&sub4;- C&sub5;-OPC änderte sich nach der Bildung des Komplexes mit Poly(rA) nicht. Dies läßt vermuten, daß dieses Fragment wahrscheinlich nicht eingeschoben worden ist zwischen die neue gebildeten Basenpaare. Dies stellt einen weiteren Unterschied zwischen α- und β-T&sub4;-C&sub5;-OPC dar in dem Maße, in dem im letztgenannten Fall die Wechselwirkung zwischen der Substanz und dem Poly(rA) eine Erhöhung der Fluoreszenz hervorruft.
  • Außerdem wurden unter Variieren der Konzentration an α-T&sub4;-C&sub5;-OPC und unter Messung der entsprechenden Temperatur Tm (Tm repräsentiert die Temperatur einer 50 %igen Dissoziation des Komplexes) die thermodynamischen Parameter seiner Wechselwirkung mit Poly(rA) bestimmt. Diese Parameter leiten sich von der folgenden Gleichung ab:
  • 1/Tm = S/ H + 2,3R/ H logCm
  • in der Tm die Temperatur der Halbdissoziation des Komplexes darstellt, Cm die Konzentration an freiem α-T&sub4;-C&sub5;-OPC darstellt und t = Tm und r = 2 Kalorien/Mol/K.
  • Tm wurde bei 270 nm und 310 nm gemessen und es wurden die folgenden Werte erhalten:
  • bei 270 nm: ΔH = - 38,7 kcal/mol , ΔS = 105,3 cal/mol und ΔG bei 298ºK = - 7,2 kcal/mol .
  • bei 310 nm: ΔH = - 36,8 kcal/mol ΔS = 98,8 cal/mol und ΔG bei 298ºK = - 7,4 kcal/mol .
  • Zusammenfassend war es möglich, ein neues Molekül α- T&sub4;-C&sub5;-OPC zu synthetisieren, in dem ein potentielles Interkalationsmittel mit einer Oxazolopyridocarboxazol- Struktur über einen Pentamethylen-Arm, kovalent an ein nicht-natürliches Tetrathymidylat gebunden ist, das ausschließlich aus α-anomeren Nucleotid-Einheiten besteht. Die UV-Absorption und die Fluoreszenz zeigen an, daß das Oligonucleotid-Fragment die Erkennungs-Elemente liefert, die erforderlich sind für die selektive Bindung an die komplementäre Sequenz durch paarige Anordnung (Paarung) der Base. Im Vergleich mit dem β-Anomeren stellt man zwei signifikante Unterschiede fest:
  • a) die α-anomere Konfiguration führt zu einem zusätzlichen Stabilisierungseffekt bei der Bildung des Komplexes mit Poly(rA);
  • b) der Oxazolopyridocarboxazol-Rest scheint sich nicht in das Duplex einzuschieben, das durch Basenpaarung (paarige Anordnung) zwischen dem α-Oligonucleotid und Poly(rA) gebildet worden ist.
    • Beispiel IX Beständigkeit der Substrate α-T&sub4;-C&sub5;-OPC gegenüber einer Nuclease S1
  • Der Abbau durch die Endonuclease S1 wurde vergleichend untersucht mittels HPLC bei α- und β-T&sub4;-C&sub5;-OPC. Die Stärke des Peaks wurde verfolgt als Funktion der Reaktionszeit mit Nuclease S&sub1; bei 37ºC. Nach 20-minütiger Reaktion war die Verbindung vollständig verschwunden, wenn die anomere Konfiguration der Olinucleotidkette die β-Form ist, während sie noch nach 30 Minuten intakt war, wenn die anomere Konfiguration die α-Form ist.
  • Die HPLC-Analyse wurde an einer C&sub1;&sub8; u-Bondepak-Säule durchgeführt. Die isokratische Elution wurde mit dem folgenden System durchgeführt: 31 % Acetonitril in 20 mM Ammoniumacetat (pH 6,5; 5 mM, bezogen auf das Tetrabutylammoniumchlorid). Der UV-Nachweis wurde bei 270 nm durchgeführt.
  • Analysenbedingungen: eine Lösung von α- und β-T&sub4;-C&sub5;-OPC (33 nmol) in Wasser (8 ul) wurde mit dem folgenden Puffer gemischt: 0,5 M Natriumacetat (pH 4,7), 3 M Natriumchlorid und 0,1 M Zinkacetat. Das Volumen der Reaktionsmischung wurde mit Wasser auf 300 ml vervollständigt und anschließend wurde die Nuclease S1 (Gibco BRL, 28 Einheiten, 3 ul) zugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC inkubiert und es wurden aliquote Anteile (20 ul) zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und sofort mit einem blockierenden Puffer gemischt: 20 mM Natriumphosphat (pH 6,5, 180 ul) und 5 min lang auf 100ºC erwärmt. Ähnliche Behandlungen wurden für jeden Kontrollversuch durchgeführt. Für jede HPLC-Analyse wurde ein Volumen von 50 ul injiziert.
  • In den nachstehenden Beispielen X bis XXII werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
  • In der Beschreibung und in den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
  • α-dA : α-D-2'-Desoxyadenosin
  • α-dbzA : N-Benzoyl-α-D-2'-desoxyadenosin
  • α-dC : α-D-2'-Desoxycytidin
  • α-dbzC : N-Benzoyl-α-D-2'-desoxycytidin
  • α-dG : α-D-2'-Desoxyguanosin
  • α-pal : N-Palmitoyl-α-D-2'-desoxyguanosin
  • α-T : α-D-Thymidin
  • α-Tbz : α-D-Thymidin-3'-benzoyl
  • α-[(sp)T] :α-D-Thymidin-5'-thiophosphat
  • α-T(ps) : α-D-Thymidin-3'-thiophosphat
  • ABH : Benzohydroxaminsäure
  • Cnet : β-Cyanoethyl
  • DBU : Diaza-1,8 bicyclo[5,4,0] undecen -7
  • Et : Ethyl
  • Me : Methyl
  • MST : Mesitylen-sulfonyltetrazolid
  • p : Phosphoester
  • : p-Chlorophenylphosphoester
  • CCM: Dünnschichtchromatographie an Silicagel
  • System A: CH&sub2;Cl&sub2;, MeOH (90-10, Vol./Vol.)
  • System B: CH&sub2;Cl&sub2;, MeOH (85-15, Vol./Vol.)
    • Beispiel X :α-(TpTpTpTpTpTpTpTp)(CH&sub2;)&sub5;Acr 1) 5'-O-(Dimethoxytrityl)α-thymidin
  • Zu einer Lösung von α-Thymidin (3,6 g) in wasserfreiem Pyridin (15 cm³) gibt man unter Rühren 5,35 g Dimethoxytritylchlorid zu. Nach 4-stündiger Reaktion bei Umgebungstemperatur zerstört man das überschüssige Dimethoxytritylchlorid durch Zugabe von Methanol (3 cm³). Man dampft das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ein; der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, dann getrocknet und eingeengt. Das Produkt wird durch Silicagel-Chromatographie gereinigt. Ausbeute 80 %.
    • 2) Pyridinium-5'-O-(dimethoxytrityl)-α-thymidin-3'- (p-chlorophenylphosphat)
  • Unter Rühren gibt man bei -20ºC 3 Äquivalent6e Methyl-p-chlorophenyl-chlorophosphat zu einer Lösung von 9 Äquivalenten Dimethyl-1,5-tetrazol in wasserfreiem Pyridin zu; nach Beendigung der Zugabe setzt man das Rühren 1 h lang bei Umgebungstemperatur fort, dann gibt man eine Lösung von 1 Äquivalent 5'-O-(Dimethoxytrityl)-α-thymidin in Pyridin zu. Nach mehrstündiger Reaktion bei Umgebungstemperatur gibt man dann Eiswasser zu und extrahiert den Diester mit Chloroform. Die Chloroformlösung wird getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der in Form einer Lösung in Pyridin erhaltene Diester ist praktisch rein und kann in den folgenden Stufen verwendet werden. CCM (System B): Rf = 0,18.
    • 3) α-Thymidin-3'-(p-chlorophenyl-β-cyanoethylphosphat)
  • Zu einer Lösung von (Dmtr)-α-T (1 mmol) und Trimethylammonium-p-chlorophenyl-β-cyanoethylphosphat (2 mmol) in wasserfreiem Pyridin (10 cm³) gibt man bei Umgebungstemperatur und unter Rühren Mesitylensulfonylchlorid (3 mmol) und Tetrazol (6 mmol) zu. Die Entwicklung der Reaktion wird durch CCN (System A) verfolgt. Wenn die Reaktion beendet ist, wird der Überschuß an Mesitylensulfonylchlorid durch Zugabe von Eiswasser zerstört. Der Triester wird mit Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird anschließend 15 min lang bei 0ºC mit 15 cm³) Benzolsulfonsäure (2 %ige Lösung in CHCl&sub3;/MeOH (7/7, Vol./Vol.)) behandelt, dann wird die Lösung mit einer Natriumbicarbonatlösung neutralisiert. Das Produkt wird mit Chloroform extrahiert, die organische Phase wird mit Eiswasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird an einer Silicagel-Säule gereinigt (Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH). CCM (System A) Rf≈ 0,27; Ausbeute 70 %.
    • 4) (Dmtr)α-(T T )Cnet
  • Unter 2-stündigem Rühren bei Umgebunstemperatur läßt man eine Lösung von 0,6 mMol (Dmtr)-α-Tp (Beispiel I-2), 0,5 mMol αTp-Cnet (Beispiel I-3) und 1,5 mMol Mesitylensulfonyltetrazolid (MST) in 4,5 cm³ wasserfreiem Pyridin reagieren; man gibt anschließend 0,5 cm³ Eiswasser zu und setzt das Rühren 30 min lang fort. Man engt die Lösung unter vermindertem Druck ein. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen; die organische Phase wird mit einer 5 %igen wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, dann getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt wird an einer Silicagel-Säule gereinigt (Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH). CCM (System A): Rf = 0,50 und 0,52; Ausbeute 72 %.
    • 5) (Dmtr)α-(T T )
  • Man läßt 2 h lang bei Umgebungstemperatur eine Lösung von (Dmtr)α-(T T )Cnet (0,3 mmol) (Beispiel I- 4) mit 1 cm³ Triethylamin in Pyridin (2 cm3) reagieren. Man treibt die flüchtigen Produkte unter vermindertem Druck ab, dann fällt man den Diester durch Rühren in Äther aus. CCM (System B): Rf = 0,19.
    • 6) (Dmtr)α-(T )&sub4;Cnet
  • Die Verbindung (Dmtr)α-(T )&sub2;Cnet (0,2 mmol) wird 15 min lang bei 0ºC mit Benzolsulfonsäure behandelt. Die Mischung wird in 40 cm³ Chloroform aufgenommen. Die organische Phase wird mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Zu dem erhaltenen Rückstand gibt man 0,25 mmol (Dmtr)-α-(T T ) zu. Nach dem Trocknen der Mischung durch gemeinsame Verdampfung mit dem wasserfreien Pyridin gibt man 3 cm³ wasserfreies Pyridin, dann 0,6 mmol MST zu und läßt die Reaktionsmischung 2 h lang bei Umgebungstemperatur stehen. Man zerstört den Überschuß an Kupplungs-Reagens durch Zugabe von Eiswasser, dann beendet man die Herstellung wie in Beispiel I-4.
    • 7) (Dmtr)α-(T )&sub8;Cnet
  • Man ersetzt das Dinucleotid (Dmtr)α-(T )&sub2;Cnet durch das Tetrannucleotid (Dmtr)α-(T )&sub4;Cnet und arbeitet wie im Beispiel I-5 und I-6, wobei man das vollständig geschützte Octanucleotid erhält.
    • 8) (Dmtr)α-(T )&sub8; (CH&sub2;)&sub5;
  • (Dmtr)α-(T )&sub8;Cnet (0,01 mmol) wird 2 h lang bei Umgebungstemperatur mit 0,3 cm³ einer Pyridin/Triethylamin (2/1, Vol./Vol.)-Lösung behandelt. Man treibt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab und wäscht den in Form eines Feststoffes erhaltenen Diester mit Äther, dann trocknet man ihn unter vermindertem Druck. Der Diester wird anschließend mit 0,02 mmol 2-Methoxy-6-chloro-9-(ω- hydroxypentylamino)acridin in Gegenwart von MST (0,04 mmol) in wasserfreiem Pyridin gekuppelt; man beendet die Herstellung anschließend wie in Beispiel I-4.
    • 9) α-(Tp)&sub8;(CH&sub2;)&sub5;Acr
  • Das Octanucleotid (Dmtr)α-(T )&sub8;(CH&sub2;)&sub5;Acr wird 24 h lang bei Umgebungstemperatur mit einer molaren Lösung an Benzohydroxaminsäure (ABH) und an 1,8-Diaza- (5,4,0)bicyclo-7-endecen (DBU) in wasserfreiem Pyridin behandelt (unter Verwendung von 10 Äquivalenten ABH-DBU pro Äquivalent aryliertem Phosphotriester der von Schutzgruppen zu befreien ist). Das Reaktionsmedium wird mit Dowex 50 (Pyridinium-Form) neutralisiert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird anschließend mit 80 %iger Essigsäure einige Stunden lang bei Umgebungstemperatur behandelt, dann wird die Essigsäure mehrmals durch gemeinsame Verdampfung mit Ethanol entfernt. Man nimmt den Rückstand in Wasser auf, wäscht die wäßrige Phase mit Äther, dann reinigt man das Produkt durch HPLC. Die Retentionszeit des gereinigten Produkts ist in der Tabelle III angegeben.
    • Beispiel XI : [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-(pT)&sub8; 1) α-Thymidin-3'-benzoyl-,α-Tb
  • Zu einer Lösung von (Dmtr)-α-T (1 mmol) in wasserfreiem Pyridin gibt man unter Rühren bei Umgebungstemperatur Benzoylchlorid (1,5 mmol) zu, dann läßt man die Reaktionsmischung 48 h lang bei Umgebungstemperatur stehen. Man zerstört das überschüssige Benzoylchlorid durch Zugabe von Eiswasser, dann beendet man die Herstellung wie in Beispiel X-3. CCM (System A): Rf ≈ 0,36; Ausbeute ≈75 %.
    • 2) (Dmtr)α-(T T)bz
  • Man arbeitet wie in Beispiel X-4, wobei man das α-T - Cnet durch die Verbindung α-Tbz ersetzt. Man erhält das geschützte Dinucleosid-monophosphat.
    • 3) (Dmtr)α-[(T )&sub3;T]bz
  • Man ersetzt das Dinucleotid (Dmtr)α-(T )&sub2;Cnet durch die Verbindung (Dmtr)α-(T T)bz und arbeitet wie in Beispiel X-6, wobei man das geschützte Tetranucleosid-triphosphat erhält.
    • 4) (Dmtr)α-[(T )&sub7;T]bz
  • Die Verbindung (Dmtr)α-(T )&sub3;T]bz (1 Äquivalent) wird mittels Benzolsulfonsäure detrityliert; die Mischung wird in Chloroform aufgenommen und mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, dann getrocknet und eingeengt. Zu diesem Rückstand gibt man 1,2 Äquivalente (Dmtr)-α-(T )&sub4; zu (hergestellt durch Decyanoethylierung der Verbindung (Dmtr)-α-(T )&sub4;Cnet nach Beispiel I-5). Nach dem Trocknen der Mischung durch gemeinsames Verdampfen mit Pyridin gibt man zu der Pyridinlösung 3 Äquivalente MST zu und läßt die Reaktionsmischung 2 h lang unter Rühren bei Umgebungstemperatur stehen. Man beendet die Herstellung wie im Beispiel X-6.
    • 5) α-[(T )&sub7;T]bz
  • Die Verbindung des Beispiels XI-4 wird 15 min lang bei 0ºC mit Benzolsulfonsäure (2 %ige Lösung in Chloroform/Methanol (7/3, Vol./Vol.)) behandelt. Die Mischung wird in Chloroform aufgenommen. Die Chloroformlösung wird mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, dann getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in der folgenden Stufe verwendet.
    • 6) α-[ (T )&sub7;T]bz
  • Unter Rühren gibt man bei -20ºC 6 Äquivalente Methyl- p-chlorophenyl-chlorophosphat in wasserfreies Pyridin zu. Nach Beendigung der Zugabe setzt man das Rühren 1 h lang bei Umgebungstemperatur fort, dann gibt man eine Lösung von 1 Äquivalent α-[(T )&sub7;T]bz zu. Nach 2-stündiger Reaktion bei Umgebungstemperatur gibt man Eiswasser zu, dann extrahiert man das Produkt mit Chloroform.
    • 7) [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-[ (T )&sub7;T]bz
  • Man läßt eine Lösung von 2-Methoxy-6-chloro-9( -hydroxypentylamino)acridin (2 Äquivalente), α-[β(Tβ)&sub7;T]bz (1 Äquivalent) und MST (3 Äquivalente) 2 h lang bei Umgebungstemperatur reagieren, dann beendet man die Herstellung wie in Beispiel X-4.
    • 8) [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-(pT)&sub8;
  • Das geschützte Oligonucleotid (Beispiel XI-7) wird 48 h lang unter Rühren bei Umgebungstemperatur mit einer molaren Lösung an ABH-DBU in wasserfreiem Pyridin behandelt (10 Äquivalente ABH-DBU pro Äquivalent Arylphosphorester mit zu entfernender Schutzgruppe). Zu dieser Mischung gibt man 2 Vol.-Teile einer 0,4 M Sodalösung zu, dann setzt man das Rühren 1 h lang bei Umgebungstemperatur fort. Nach dem Neutralisieren des Reaktionsmediums mit Chlorwasserstoffsäure wäscht man die wäßrige Phase mit Äther, dann reinigt man das von der Schutzgruppe befreite Oligonucleotid mittels HPLC (die Retentionszeit ist in der Tabelle III angegeben).
    • Beispiel XII [Acr(CH&sub2;)&sub3; (CH&sub2;)&sub2;]α-[(sp)(Tp)&sub7;T] 1) Bis-(β-cyanoethyl)-diisopropylamino-phosphit
  • Zu einer Lösung von β-Cyanoethanbol (15 cm³) und Trimethylamin (20 g) in einem Gemisch aus Äther (100 cm³) und Benzol (50 cm³) tropft man bei -5ºC und unter Rühren eine Lösung von 20 g Dichloro-diisopropylaminophosphit in 40 cm³ Benzol zu. Nach Beendigung der Zugabe setzt man das Rühren 1 h lang bei Umgebungstempeatur fort, dann eliminiert man das Trimethylammoniumhydrochlorid durch Filtration. Man entfernt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und reinigt das Produkt durch Verdampfen auf einer dünnen Schicht (molekulare Destillation).
    • 2) α-[(Cnet)&sub2;((s)p)(T )&sub7;T]bz
  • Zu einer wasserfreien Lösung von α-[(T )&sub7;T]bz (1 Äquivalent) und Tetrazol (10 Äquivalenten) in einem Lösungsmittelgemisch CH&sub3;CN/DMF (50/50, Vol./Vol.) gibt man unter einer Argonatmosphäre und unter Rühren eine Lösung von Bis-(β-cyanoethyl)diisopropylaminophosphit (5 Äquivalente) in Acetonitril zu. Nach 30 min bei Umgebungstemperatur gibt man zu der Reaktionsmischung eine Suspension von Schwefel (50 Äquivalente) in Pyridin zu, dann setzt man das Rühren 90 min lang bei 30ºC fort. Man entfernt den überschüssigen Schwefel durch Filtration, treibt die Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab, dann nimmt man den Rückstand in Toluol wieder auf; die organische Phase wird mit einer wäßrigen NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, dann getrocknet und eingeengt. Das Produkt wird durch Chromatographie an Silicagel gereinigt.
    • 3) α-[(sp)(Tp)&sub7;T]
  • Das gemäß Beispiel XII-2 hergestellte Octanucleotid wird 48 h lang bei Umgebungstemperatur mit einer molaren Lösung an ABH und DBU (10 Äquivalente ABH-DBU pro Äquivalent Phosphotriester) und dann 24 h lang mit 2 Volumina einer wäßrigen 0,6 M Sodalösung behandelt. Man neutralisiert das Reaktionsmedium mit Chlorwasserstoffsäure, wäscht die wäßrige Phase mit Äther und reinigt das Produkt der HPLC. Die Retentionszeit des Produkts ist in der Tabelle III angegeben.
    • 4) (Acr(CH&sub2;)&sub3; (CH&sub2;)&sub2;]α-[(sp)(Tp)&sub7;T]
  • Eine Lösung von α-[(sp)(Tp)&sub7;T] (1 Äquivalent) und 2-Methoxy-6-chloro-9-[3-N-(β-chloroethyl-ethylamino)-propylamino]acridin (4 Äquivalente) in einem Gemisch aus DMS, H&sub2;O und 5 %igem NaHCO&sub3; in Wasser (2/2/1, Vol./Vol.) läßt man 5 h lang bei Umgebungstemperatur reagieren, dann reinigt man das gebildete Produkt durch HPLC. In der Tabelle III ist die Retentionszeit des gebildeten Produkts angegeben.
    • Beispiel XIII: [Prof(CH&sub2;)&sub3;]α-[(sp)(Tp)&sub7;T]
  • Eine Lösung von α-[(sp)(Tp)&sub7;T] (1 Äquivalent) und N-(ω-Bromopropyl)proflavin (5 Äquivalente) in einem Gemisch aus DMSO, H&sub2;O und 5 %igem NaHCO&sub3; in Wasser (2/2/1, Vol./Vol.) läßt man unter Rühren 20 h lang bei Umgebungstemperatur stehen, das gebildete Produkt wird durch HPLC gereinigt. (Die Retentionszeit des erhaltenen Produkts ist in der Tabelle III angegeben).
    • Beispiel XIV: (Phe-CH&sub2;)α-[(sp)(Tp)&sub7;T]
  • Man arbeitet wie im Beispiel XII-4, wobei man das Acridinderivat durch 5-(N-Jodoacetylamino)-1,10-phenantholin ersetzt. Die Retentionszeit des erhaltenen Produkts ist in der Tabelle III angegeben.
    • Beispiel XV: [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-(pT)&sub8;(ps)
  • 1) α-Thymidin-3'-(bis-cyanoethylthiophosphat) Man geht aus von (Dmtr)-α-T (1 Äquivalent), Tetrazol (4 Äquivalente), Bis-(β-cyanoethyl)-diisopropylaminophosphit (2 Äquivalente) und Schwefel (30 Äquivalente) und man arbeitet nach dem Beispiel XII-2, wobei man die Verbindung (Dmtr)-α-T(p(s))(Cnet)&sub2; erhält, die anschließend durch Benzolsulfonsäure gemäß Beispiel XI-5 detrityliert wird. Die Ausbeute beträgt 55 %.
    • 2) (Dmtr)α-[T T](p(s))(Cnet)&sub2;
  • Man arbeitet wie in Beispiel X-4, wobei man die Verbindung α-T Cnet durch die Verbindung α-T(p(s))(Cnet)&sub2; ersetzt. Man erhält so das Dinucleotid, das durch Chromatographie an Siliciumdioxid gereinigt wird. [Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/H&sub2;O/Aceton (31/1/68, Vol./Vol.)]. Die Ausbeute beträgt etwa 84 %.
    • 3) (Dmtr)α-(T )&sub6;Cnet
  • Man arbeitet wie im Beispiel X-6, wobei man das Dinucleotid (Dmtr)-α-(T )&sub2;Cnet durch das Tetranucleotid (Dmtr)-α-(T )&sub4;Cnet ersetzt. Man erhält so das Hexanucleotid mit einer Ausbeute von 75 %. CCM (System A): Rf = 0,31.
    • 4) (Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-( T)&sub6;
  • Ausgehend von der Verbindung und unter Anwendung der Arbeitsweise gemäß Beispiel XI-5, XI-6 und XI-7 erhält man die Verbindung[Acr (CH&sub2;)&sub5;]α-( T)&sub6; Cnet die anschließend mit Triethylamin gemäß Beispiel 1-5 behandelt wird. CCM (System B): Rf = 0,44.
    • 5) [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-( T)&sub8;(p(s))(Cnet)&sub2;
  • Das Octanuleotid wird hergestellt durch Kuppeln des Hexanucleotids [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-( T)&sub6; (1 Äquivalent) mit dem Dinucleotid α-(T T)(p(s))(Cnet)&sub2; (1 Äquivalent) (hergestellt durch Detritylierung der Verbindung des Beispiels XV-2) in Gegenwart von MST (3 Äquivalente) nach dem Beispiel XI-4. Das Produkt wird an Silicagel gereinigt [Eluierungsmittel: CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (96/4 bis 96/14, Vol./Vol.)].
    • 6) [Acr(CH&sub2;)&sub5;α-(pT)&sub8;(ps)
  • Man geht aus von der in Beispiel XV-5 hergestellten Verbindung und arbeitet nach Beispiel XII-3, wobei man das von der Schutzgruppe befreite Octanucleotid erhält, dessen Retentionszeit in der Tabelle III angegeben ist. Beispiel XVI:
  • Eine Lösung von [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-(pT)&sub8;(ps) (1 Äquivalent) und 4-Azidophenacylbromid (4 Äquivalente) in einem Gemisch aus DMS, H&sub2;O und 5 %igem NaHCO&sub3; in Wasser (2/2/1, Vol./Vol.) läßt man unter Rühren 1 h lang bei Umebungstemperatur stehen. Das Kupplunsprodukt wird anschließend durch HPLC gereinigt. Die Retentionszeit des erhaltenen Produkts ist in der Tabelle III angegeben.
    • Beispiel XVII: [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-(pT)&sub8;(ps)CH&sub2;CO&sub2;&supmin;
  • Bromessigsäure (6 Äquivalente) läßt man 3 h lang bei Umgebungstemepratur mit dem Oligonucleotid [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-(pT)&sub8;(ps) (1 Äquivalent) gemäß Beispiel XVI reagieren, dann reinigt man das gebildete Produkt durch HPLC. Die Retentionszeit des erhaltenen Produkts ist in der Tabelle III angegeben.
    • Beispiel XVIII: α-(T )&sub2;(CH&sub2;)&sub6;EDTAMe&sub3;
  • Eine Lösung von (Dmtr)α-(T )&sub2; (l Äquivalent), Me&sub3;EDTA (-CH&sub2;)&sub6;-OH (3 Äquivalente) und MST (3 Äquivalente) läßt man 1 h lang bei Umgebungstemperatur reagieren. Man zerstört das überschüssige Kupplungsreagens durch Zugabe von Eiswasser, dann beendet man die Herstellung wie im Beispiel X-3. CCM (System A): Rf ≈ 0,4.
    • Beispiel XIX: [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-d(pCpCpTpTpApTpApTpT) 1) (Dmtr)α-d(bzA )
  • a) Eine Mischung von 3',5'-Di-(p-nitrobenzoyl)-β-D- thymidin (3,6 mmol) und N-Benzoyladenin (12 mMol) in Acetonitril (22 cm³) wird mit Bis-trimethylsilylacetamid (15 mmol) und dann mit Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat (4,7 mmol) nach T. Yamaguchi und M. Saneyoshi (Chem. Pharm. Bull. 1984, 32, 1441 bis 1450) behandelt. Die Verbindung 3',5'-Di-(p-nitrobenzoyl)-β-D-d-(N-benzoyladenosin) [CCM (System A): Rf = 0,55] wird von dem Derivat 3',5'-Di-(p-nitrobenzoyl)-α-D-d-(N-benzoyladenosin) [CCM (System A): Rf = 0,63] durch Chromatographie auf einer präparativen Silicagel-Platte getrennt.
  • b) Das 3',5'-Di-(p-nitrobenzoyl)-α-D-d-(N-benzoyladenosin) (1 g) in einem Lösungsmittelgemisch Dioxan/MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;/H&sub2;O] (50 cm³) wird bei 0ºC mit 5 cm³ molarer Soda behandelt. Wenn das gesamte Ausgangsprodukt in α-d-N-Benzoyladenosin [CCM(CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH) (80/20, Vol./Vol.): Rf = 0,38] umgewandelt worden ist, wird das Reaktionsmedium durch Zugabe des Harzes Amberlite IR 120 (Pyridinium-Form) neutralisiert, dann wird das α-d-bzA durch Chromatogaphie an Silicagel gereinigt.
  • c) Eine Lösung von α-d-bzA (1 Äquivalent) in wasserfreiem Pyridin wird 4 h lang bei Umgebungstemperatur mit Dimethoxytritylchlorid (1,1 Äquivalente) behandelt, dann beendet man die Herstellung wie in Beispiel X-1 und X-2. CCM (System B): Rf = 0,32.
    • 2) (Dmtr)α-d(bzA T )Cnet
  • Man arbeitet wie in Beispiel X-4, wobei man das (Dmtr)α-Tβ durch das (Dmtr)α-d(bzAβ) ersetzt, wobei man das vollständig geschützte Dinucleotid erhält.
    • 3) (Dmtr)α-d(bzA T )
  • Der Diester wird erhalten durch Decyanoethylierung der Verbindung X-2 gemäß Beispiel X-5.
    • 4) (Dmtr)α-d(bzA T bzA T )Cnet
  • Man arbeitet wie in Beispiel X-6, wobei man die Verbindungen (Dmtr)α(T T )Cnet und (Dmtr)α(T T ) jeweils durch die Verbindungen der Beispiele XIX-2 und XIX-3 ersetzt. Man erhält das geschützte Tetranucleotid.
    • 5) (Dmtr)α-d(bzA T bzA T T)bz
  • Der Diester (Dmtr)α-d(bzA T bzA T T) (1 Äquivalent) (hergestellt durch Decyanoethylierung der Verbindung XIX-4 gemäß Beispiel X-5) wird mit α-Thymidin-3'-benzuyl (1 Äquivalent) nach Beispiel X-4 gekuppelt, wobei man das geschützte Pentanucleosidtetraphosphat erhält.
    • 6) (Dmtr)α-d(bzC )
  • Ausgehend von dem 3',5'-Diacetyl-β-D-d(N-benzoylcytidin) (Chem. Pharm. Bull. 1984, 32, 1441-1450) und unter Anwendung der Arbeitsweise wie in Beispiel XIX-1-b und XIX-1-c erhält man den Diester. CCM (System B): Rf = 0,32.
    • 7) (Dmtr)α-d(bzC bzC T T )Cnet
  • Das Dinucleotid α-(T )&sub2;Cnet (1 Äquivalent) (hergestellt durch Detritylierung von (Dmtr)α-(T )&sub2;Cnet (gemäß Beispiel XI-5) wird mit dem Mononucleotid
  • (Dmtr)α-dbzC (1 Äquivalent) in Gegenwart von MST (3 Äquivalente) gemäß Beispiel X-4 gekuppelt, wobei man das geschützte Trinucleotid (Dmtr)α-d(bzC T T )Cnet erhält, das seinerseits detrityliert und dann mit dem Diester (Dmtr)α-dbzC wie oben gekuppelt wird.
    • 8) (Dmtr)α-d(bzC bzC T T bzA T bzA T T)bz
  • Der Tetranucleotid-3'-phosphodiester (Dmtr)α-d(bzC bz-C T T ) (1,2 Äquivalente) (hergestellt durch Decyanoethylierung der Verbindung XIX-7 gemäß Beispiel XI-5) wird mit dem Pentanucleotid α-d(bzA T bza T T)bz (1 Äquivalent) (erhalten durch Detritylierung der Verbindung XIX-5 gemäß Beispiel XI-5) in Gegenwart von MST (3 Äquivalente) gemäß Beispiel X-4 gekuppelt, wobei man das geschützte Nonanucleotid erhält. CCM (ystem A): Rf = 0,55.
    • 9) [Acr(CH&sub2;)&sub5;]α-d(pCpCpTpTpApTpApTpT)
  • Ausgehend von der Verbindung XIX-8 und unter Anwendung der Arbeitsweise wie in den Beispielen XI-5, XI-6, XI-7 und XII-3, erhält man das von der Schutzgruppe befreite Produkt, dessen Retentionszeit in der Tabelle V angegeben ist. Tabelle V Verbindungen Lösungsmittelsystem (A-B,linearer Gradient Retentionszeit HPLC-Säule Polyanion HR5/5 (Pharmacia), Durchflußmenge 1 cm³/min A: 10&supmin;³ M Kaliumphosphat (pH = 6) B: M Kaliumphosphat (pH = 6)
    • Beispiel XX: Stabilität der mit dem Acridinderivat gekuppelten α-D-Oligonucleotide gegenüber Nucleasen
  • In der nachstehenden Tabelle VI sind die Hydrolysegeschwindigkeiten von zwei α-D-Oligonucleotiden, die in 3'- Stellung oder in 5'-Stellung durch Acridin substituiert sind, durch vier verschiedene Nucleasen angegeben im Vergleich zu denjenigen der entsprechenden β-D-Oligonucleotide. Sowohl die beiden Endonucleasen (P1 und S1) als auch die beiden Exonucleasen (5'-Exo: Kalbsmilz-Phosphodiesterase; 3'-Exo: Schlangengift-Phosphodiesterase) sind 300 bis 500 mal weniger aktiv gegenüber den α: -D-Oligonucleotiden als gegenüber den β-D-Oligonucleotiden. Die in der Tabelle angegebenen Werte sind die Hydrolysegeschwindigkeitsverhältnisse für das α-D-Oligonucleotid im Vergleich zu dem β-D-Oligonucleotid der gleichen Sequenz. Tabelle VI Nucleasen
    • Beispiel XXI: Spezifisches Schneiden einer DNA durch ein mit Phenanthrolin gekuppeltes α-D-Oligonucleotid
  • Das im Beispiel XIV beschriebene α-D-Oligonucleotid (5 um) wird in einem Puffer bei pH 7 gelöst, der 10 mM Natriumkakodylat und 0,1 M Nacl enthält. Es wird zu einem Einfachstrang-DNA-Fragment (10 nM) mit der Sequenz
  • d(5'T G A G T G A G T A A A A A A A A T G A G T G C C A A3')
  • die in 5'-Position durch ein radioaktives Phosphoratom markiert ist, zugegeben. Bei 0ºC werden Kupfersulfat (1 um) und β-Mercaptopropionsäure (1 mM) zugegeben und die Mischung wird 3 h lang bei 0ºC inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wird Bathocuproin zugegeben. Die Mischung wird auf ein 18 %iges Polyacrylamid-Gel aufgegeben und einer Elektrophorese unterworfen. Nach der Autoradiographie zeigen sich die Schnittstellen durch Auftreten von Banden, deren Lokalisierung anzeigt, daß das α-D-Oligonucleotid parallel zur Sequenz A&sub8; ausgerichtet ist.
  • Das gleiche Oligonucleotid, das in Gegenwart eines Doppelstang-DNA-Fragments
  • inkubiert worden ist, induziert Schnitte an den beiden Strängen der Doppelhelix in Gegenwart von 1 mM Spermin. Die Position der Schnittstellen an dem Doppelstang zeigt an, daß das α-D-Oligothymidylat X parallel zu dem die Sequenz A&sub8; enthaltenden Strang ausgerichtet ist.
    • Beispiel XXII: Kovalente Brückenbildung (Ligation) und Schneiden mit einem photoaktivierbaren α-D- Oligonucleotidderivat
  • Das in Beispiel XVI beschriebene Molekül wird bei 0ºC in Gegenwart des Einfachstrang-DNA-Fragments und des in der 5'-Position radioaktiv markierten Doppelstrang-DNA- Fragments unter den in Beispiel XXI beschriebenen Bedingungen inkubiert.
  • Nach der Bestrahlung der Mischung bei 0ºC mit Wellenlängen von mehr als 300 nm und der anschließenden Behandlung der bestrahlten Mischung mit 1 M Piperidin bei 90ºC während 20 min werden die Proben auf ein 18 %iges Polyacrylamid-Gel aufgebracht und einer Elektrophorese unterworfen. Nach der Autoradiographie zeigen Banden, die Schnitten der Ziel-DNA in genauen Positionen entsprechen, an, daß das α-D-Oligothymidylat XVI parallel zur Sequenz A&sub8; fixiert ist sowohl bei der Einfachstrang-DNA als auch bei der Doppelstrang-DNA. Im zuletzt genannten Falle sind Schnitte an den beiden Strängen zu beobachten.
  • Wenn die Elektrophorese vor der Behandlung der Proben mit Piperidin durchgeführt wird, ist kein Schnitt zu erkennen. Es werden Moleküle festgestellt, die weniger schnell wandern als das Ausgangs-DNA-Fragment. Sie entsprechen den Produkten der kovalenten Brückenbildung (Ligation) zwischen dem α-D-Oligothymidylat XVI und den Basen der als Ziel verwendeten DNA.

Claims (39)

1. Chemische Verbindungen, bestehend aus einem Oligonukleotid oder einem Oligodesoxynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verkettung von Nukleotiden oder Desoxynukleotiden mit anomerischer nicht natürlicher α-Konfiguration umfassen, wobei die Verkettung in kovalenter Weise mit einem Effektor-Mittel verbunden ist, insbesondere mit einem Radikal, das einem Intercalations-Mittel oder einem chemischen oder photoaktivierbaren Radikal entspricht, wie einem Radikal, das eine Funktion trägt, die direkt oder indirekt mit den Nukleotid-Ketten reagiert, oder einem Radikal, dessen Anwesenheit einen einfachen und empfindlichen Nachweis ermöglicht.
2. Chemische Verbindungen, bestehend aus einem Oligonukleotid oder einem Oligodesoxynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verkettung von Nukleotiden oder Desoxynukleotiden mit anomerischer, nicht natürlicher α-Konfiguration umfassen, die nicht mit einem Effektor-Radikal verbunden sind, wobei die genannten Nukleotide oder Desoxynukleotide nicht nur Thymin- oder Cytosin-Basen umfassen.
3. Chemische Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die allgemeine Formel I
aufweisen, in der
die Radikale B gleich oder verschieden sein können und jeweils die Basis einer gegebenenfalls modifizierten Nukleinsäure darstellen, aktivierbar und/oder umfassend eine Intercalations-Gruppe und verbunden mit einem Glycosid-Ring gemäß einer anomerischen, nicht natürlichen α-Konfiguration;
die Radikale X gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Oxoanion O&supmin;, ein Thioanion S&supmin;, eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine Aminoalkylgruppe, eine Aminoalkoxygruppe, eine Thioalkylgruppe, ein Alkylradikal oder ein Alkoxyradikal darstellen, substituiert durch einen Stickstoff-Heterozyklus oder eine Gruppe -Y-Z;
R und R' gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -Y-Z oder Y'-Z' darstellen;
Y und Y' gleich oder verschieden sein können und jeweils ein lineares oder verzweigtes Alkoylen-Radikal -alk- oder ein unter den folgenden Radikalen ausgewähltes Radikal darstellen: mit U = O, S oder N
E die gleichen Bedeutungen wie X besitzen kann, mit Ausnahme von Y-Z,
J ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe bedeutet,
Z und Z' gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Radikal darstellen, das einem Effektor-Mittel entspricht, insbesondere einem Radikal, das einem Intercalations-Mittel oder einem Radikal entspricht, das eine Funktion trägt, die ihrerseits direkt oder indirekt mit den Nukleotid-Ketten oder einem Radikal reagiert, dessen Anwesenheit einen einfachen und empfindlichen Nachweis ermöglicht;
n eine ganze Zahl ist, die auch 0 umfaßt;
L ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine Gruppe -NH- bedeutet.
4. Verbindungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y und Y' ein Radikal darstellen, ausgewählt unter mit U = O, S oder N
5. Verbindungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel I
- wenn L ein Schwefelatom oder eine Gruppe -NH- darstellt, die Radikale R und R', gleich oder verschieden, jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -Y-Z oder -Y'-Z' bedeuten, in der
Y und Y', gleich oder verschieden, jeweils ein gerades oder verzweigtes Alkoylen-Radikal (-alk-) darstellen oder ein Radikal
Z und Z', gleich oder verschieden, jeweils ein Radikal darstellen, das einem Intercalations-Mittel oder einem Radikal entspricht, das eine Funktion trägt, die ihrerseits direkt oder indirekt mit den Nukleotid-Ketten oder einem Radikal reagiert, dessen Anwesenheit einen einfachen und empfindlichen Nachweis ermöglicht;
- wenn L ein Sauerstoffatom darstellt, die Radikale R und R', gleich oder verschieden, jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -Y-Z- oder Y'-Z' bedeuten, worin Y, Y', Z und Z' wie vorstehend definiert sind, mit der Maßgabe, daß mindestens eines der Radikale R und R' ein Intercalations-Radikal oder ein chemisch reaktives Radikal ist,
- wenn L ein Sauerstoffatom darstellt, die Radikale R und R' jeweils ein Wasserstoffatom bedeuten und B eine Nuklein-Basis ist, aktivierbar und/oder eine Intercalations-Gruppe enthaltend.
6. Neue Derivate nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Intercalations-Mittel Z oder Z' unter den polyzyklischen Verbindungen mit einer ebenen Konfiguration ausgewählt wird.
7. Neue Derivate nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Intercalations-Mittel Z oder Z' ausgewählt wird unter Acridin und seinen Derivaten, Furocumarin und seinen Derivaten, Daunomycin und den anderen Derivaten von Anthracyclin, 1,10-Phenanthrolin, Phenanthridin und seinen Derivaten, Proflavin, den Porphyrinen, den Derivaten von Dipyrido[1,2-a:3',2'-d]-imidazol, Ellipticin oder Ellipticinium und seinen Derivaten und Diazapyren und seinen Derivaten.
8. Neue Derivate nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven, chemischen Gruppen Z oder Z' ausgewählt werden unter Ethylendiamin-tetra-essigsäure, Diethylen-triamin-pentaessigsäure, den Porphyrinen, 1,10- Phenanthrolin, 4-Azido-acetophenon, Ethylenimin, β-Chlorethylamin und Psoralen und seinen Derivaten.
9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem α-Oligonukleotid bestehen, verbunden in kovalenter Weise, insbesondere unter Zwischenschaltung einer Pentamethylen-Kette, mit einem 2-N-Methyl- 9-hydroxy-ellipticiniumacetat-Derivat.
10. Neue Derivate nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Radikal B ein Radikal ist, das entspricht: Thymin, Adenin, 2-Aminoadenin und seinen substituierten Derivaten, Cytosin, Guanin und seinen substituierten Derivaten, Uracil, 5-Brom-uracil, Azido-8-adenin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 4- Azido-cytosin, 4-Azido-thymin und den Derivaten dieser Basen, die eine Intercalations-Gruppe und/oder eine chemische oder photochemisch aktivierbare Gruppe umfassen.
11. Neue Derivate nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt werden unter: α-[(TP)nT](Y&sub1;)Z&sub1;; Z&sub2;(Y&sub2;)α-[(Tp)nT]; Z&sub2;(Y&sub2;)α-[(Tp)nT](Y&sub1;)Z&sub1;; Z&sub2;(Y&sub2;)α-d(CpCpTpTpApTpApTpT), worin A ein α-D-Desoxyadenosin-Radikal, C ein α-D-Desoxycytidin-Radikal und T ein α-D-Thymidin-Radikal darstellen, n eine ganze Zahl zwischen 1 und 25 ist; Y&sub1; und Y&sub2;, ein Alkoylen-Radikal mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten und Z&sub1; und Z&sub2; jeweils ein Acridin- Derivat, ein Proflavin-Derivat, ein 1,10-Phenanthrolin-Derivat, ein 4-Azido- Acetophenon-Derivat, ein EDTA-Derivat oder ein Biotin-Derivat darstellen.
12. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um α-D-Oligonukleotid-Verbindungen handelt.
13. Verfahren zur Herstellung von α-Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man Synthesen für Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphoramidit oder Hydrogenphosphonat ausgehend von α-Nukleosiden anwendet, daß man die vollständig geschützten Derivate herstellt und daß man die Schutzgruppen wieder entfernt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen geschützten α-D-Oligonukleotid-3'-phosphodiester mit dem Hydroxyl des Intercalations- Mittels oder der chemisch reaktiven Gruppe kuppelt, oder mit dem 5'-Hydroxyl eines geschützten α-D-Oligonukleotides, das bereits das Intercalations-Mittel oder die chemisch reaktive Gruppe besitzt.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder einen geschützten α-Nukleotid-5'-phosphodiester mit dem Hydroxyl des Intercalations- Mittels oder der chemisch reaktiven Gruppe kuppelt, oder einen Diester, der das Intercalations-Mittel oder die chemisch reaktive Gruppe trägt, mit dem 5'-Hydroxyl eines geschützten α-D-Oligonukleotides.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hydroxyl des Intercalations-Mittels oder der chemisch reaktiven Gruppe mit einem geschützten α-D-Oligonukleotid-3'-5'-bis-(phosphodiester) kuppelt.
17. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Diester, der das Intercalations-Mittel oder die chemisch reaktive Gruppe trägt, mit dem 5'-Hydroxyl eines geschützten α-D-Oligonukleotides, das bereits das Intercalations-Mittel oder die chemisch reaktive Gruppe besitzt, kuppelt.
18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abspaltung der arylierten Phosphoester-Gruppen im wasserfreien Medium mit Hilfe von Benzohydroxamin-Säure und in Anwesenheit einer nicht nukleophilen tertiären Base durchführt.
19. Verfahren zur Herstellung eines neuen Derivates nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die nicht geschützten α-D-Oligonukleotide herstellt, die eine Thiophosphat-Gruppe an einem der Enden 3' oder 5' oder an zwei Enden 3' und 5' der Nukleotid-Kette umfassen.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nicht geschütztes α-D-Oligonukleotid-3'-thiophosphat mit einem Halogenalkyl kuppelt, das das Intercalations-Mittel oder eine chemisch reaktive Gruppe trägt.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nicht geschütztes α-D-Oligonukleotid-5'-thiophosphat mit einem Halogenalkyl kuppelt, das das Intercalations-Mittel oder eine chemisch reaktive Gruppe trägt.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nicht geschütztes α-D-Oligonukleotid-3',5'-bisthiophosphat mit einem Halogenalkyl kuppelt, das das Intercalations-Mittel oder eine chemisch reaktive Gruppe trägt.
23. Verfahren zur Herstellung von α-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die klassische Phosphotriester-Synthese für die β-Anomeren anwendet, wobei in ihnen jedoch die α-Nukleotid-Derivate des Guanins in Position O&sup6; durch eine zusätzliche Gruppe, vorzugsweise N,N-Diphenylcarbamoyl, geschützt sind.
24. Verfahren zur Synthese der Verbindungen ohne Effektor-Mittel nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine zusätzliche Synthese nach der Phosphoramidit-Methode durchführt, die umfaßt
- einen Schutz in 3' und 5' des Ausgangs-Nukleotides oder -Oligonukleotides mit beispielsweise Dimethoxytrityl in 5' und Methyl-Diisopropylaminphosphoramidit in 3',
- die Funktionalisierung eines festen Trägers, der ein α-Nukleosid-Derivat durch beispielsweise Succinyl-Bindung zwischen der 3'-Hydroxyl-Gruppe des α- Nukleosid-Derivates und einer Amino-Gruppe des festen Trägers einführt,
- die Verlängerung der Oligonukleotid-Kette in einem Synthese-Reaktor,
- schließlich die Abkupplung, Abspaltung der Schutzgruppen und die Reinigung der verlängerten Oligonukleotide.
25. Verfahren zur Synthese von Verbindungen, die ein Effektor-Mittel einführen, nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem in 5' geschützten Oligonukleotid ohne Effektor-Mittel ausgeht, bei dem man das OH- Ende in 3' mit einer nicht geschützten Funktion eines difunktionellen Zweiges, dessen zweite Funktion geschützt ist, zur Reaktion bringt, und man nach der Abspaltung der Schutzgruppe von dem resultierenden Produkt dieses durch die zweite, freie Funktion des difunktionellen Zweiges mit dem Effektor-Mittel verbindet.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das OH-Ende 3' des geschützten Oligomeren in 5' mit einer Aminohexansäure verestert wird, deren Aminofunktion geschützt ist.
27. Anwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich paarweise parallel zu einer zusätzlichen β-Oligosequenz zusammenlegen.
28. Anwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Verbindungen als Hybridations-Sonden oder als Reinigungsbestandteile für Bestimmungs-Sequenzen von DNA oder RNA in einfachem Strang oder in Doppel-Helix mit diagnostischem oder prognostischem Ziel verwendet werden.
29. Anwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen zum Nachweis von Mutationen im Bereich einer DNA oder RNA verwendet werden.
30. Anwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß diese Verbindungen zur Realisierung der spezifischen Blockierung von Zell-Genen oder von zuvor ausgewählten pathogenen Mitteln, wie Viren, Bakterien oder Parasiten, verwendet werden.
31. Anwendung eines Derivates nach einem der Ansprüche 3 bis 12 zur selektiven Blockierung der Expression eines Gens, entweder durch Hybridation, durch selektive Abtrennung oder durch chemische Modifizierung des Gens oder seiner Messenger-RNA zellulären, viralen, bakteriellen oder parasitären Ursprungs.
32. Anwendung eines Derivates nach einem der Ansprüche 3 bis 12 zur selektiven Blockierung der Expression einer viralen RNA, entweder durch Hybridation, durch Abtrennung oder durch chemische Modifizierung der viralen RNA oder seiner Messenger-RNA.
33. Anwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie als spezifische künstliche Nukleasen von Sequenzen verwendet werden.
34. Als Medikamente, Verbindungen nach einem der Ansprüche 3 bis 12, verwendbar als antivirale Mittel, antikanzerogene Mittel, Antibiotika oder antiparasitäre Mittel, oder bei jeder Erkrankung, wo ein Gen entweder durch Mutation oder durch Verunordnung anormal exprimiert wurde.
35. Anwendung eines α-D-Oligonukleotides der allgemeinen Formel:
in der J und X wie in Anspruch 3 definiert sind und B eine natürliche Nuklein- Basis darstellt, als Sonde für den Nachweis einer Bestimmungs-Sequenz von DNA oder RNA in einfachem Strang oder in Doppel-Helix mit diagnostischem oder prognostischem Ziel.
36. Verwendung eines wie in Anspruch 35 definierten Derivates, zur Reinigung einer Bestimmungs-Sequenz von DNA oder RNA in einfachem Strang oder in Doppel- Helix.
37. Verwendung eines wie in Anspruch 35 definierten Derivates, zur selektiven Blockierung der Expression eines Gens durch selektive Hybridation des Gens oder seiner Messenger-RNA zellulären, viralen, bakteriellen oder parasitären Ursprungs.
38. Verwendung eines wie in Anspruch 35 definierten Derivates, zur selektiven Blockierung der Expression einer viralen RNA oder seiner Messenger-RNA.
39. Als neues Medikament, ein wie in Anspruch 35 definiertes Derivat, verwendbar als antivirales Mittel, antikanzerogenes Mittel, Antibiotikum oder antiparasitäres Mittel, oder bei jeder Erkrankung, wo ein Gen entweder durch Mutation oder durch Verunordnung anormal exprimiert wurde.
DE8888900022T 1986-12-02 1987-12-02 Alpha-oligonukleotide. Expired - Lifetime DE3785343T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8616797A FR2607507B1 (fr) 1986-12-02 1986-12-02 Nouveaux derives a-d-oligonucleotides, leur preparation et leur emploi
FR8704339A FR2612930B1 (fr) 1987-03-27 1987-03-27 Sondes oligonucleotidiques a
PCT/FR1987/000481 WO1988004301A1 (fr) 1986-12-02 1987-12-02 OLIGONUCLEOTIDES alpha

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3785343D1 DE3785343D1 (de) 1993-05-13
DE3785343T2 true DE3785343T2 (de) 1993-07-22

Family

ID=26225619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8888900022T Expired - Lifetime DE3785343T2 (de) 1986-12-02 1987-12-02 Alpha-oligonukleotide.

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0290583B1 (de)
JP (1) JPH01502187A (de)
AT (1) ATE87932T1 (de)
DE (1) DE3785343T2 (de)
WO (1) WO1988004301A1 (de)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789155A (en) 1987-10-30 1998-08-04 California Institute Of Technology Process for identifying nucleic acids and triple helices formed thereby
US5874555A (en) * 1987-10-30 1999-02-23 California Institute Of Technology Triple helices and processes for making same
FR2636633A1 (fr) * 1988-09-20 1990-03-23 Centre Nat Rech Scient Procede de synthese d'oligoribonucleotides alpha et composes utiles dans le procede
IT1229477B (it) * 1989-03-13 1991-09-03 Bioresearch Spa Impiego di 5' deossi - 5' metiltioadenosina, s adenosilmetionina e dei loro sali per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte a ridurre la seborrea e composizioni farmaceutiche relative
DE3916871A1 (de) * 1989-05-24 1990-11-29 Boehringer Mannheim Gmbh Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren
FR2648045B1 (fr) * 1989-06-13 1991-09-27 Centre Nat Rech Scient Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
FR2663040B1 (fr) * 1990-06-11 1995-09-15 Bio Merieux Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich.
US5177196A (en) * 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
FR2687679B1 (fr) * 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US6403302B1 (en) 1992-09-17 2002-06-11 California Institute Of Technology Methods and compositions for triple helix formation
CA2114355A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 Hidehiko Furukawa Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use
FR2706618B1 (fr) * 1993-06-11 1995-09-01 Bio Merieux Dispositif pour le dosage d'haptènes et son utilisation.
DE4418691A1 (de) * 1994-05-28 1996-02-22 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer
JP4207258B2 (ja) * 1998-08-31 2009-01-14 東ソー株式会社 特定核酸配列の切断方法
WO2007125429A2 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 Centre National De La Recherche Scientifique Method for the synthesis of triazole- containing oligonucleotide derivatives
FR2906532B1 (fr) * 2006-09-28 2008-12-12 Biomerieux Sa Nouvel oligonucleotide marque
FR2933410B1 (fr) 2008-07-04 2010-08-20 Biomerieux Sa Nouvelle sonde de detection
CN116333006A (zh) * 2023-04-07 2023-06-27 苏州欧利生物医药科技有限公司 一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1081497A (en) * 1976-06-02 1980-07-15 Robert J. Anderson System for rate immunonephelometric analysis
US4204837A (en) * 1978-03-14 1980-05-27 Beckman Instruments, Inc. Method of rate immunonephelometric analysis
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
FR2568254B1 (fr) * 1984-07-25 1988-04-29 Centre Nat Rech Scient Application d'oligonucleotides lies a un agent intercalant, notamment a titre de medicament

Also Published As

Publication number Publication date
JPH01502187A (ja) 1989-08-03
EP0290583A1 (de) 1988-11-17
WO1988004301A1 (fr) 1988-06-16
ATE87932T1 (de) 1993-04-15
DE3785343D1 (de) 1993-05-13
EP0290583B1 (de) 1993-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3785343T2 (de) Alpha-oligonukleotide.
DE69307495T2 (de) Oligothionukleotide
DE69829760T2 (de) Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
DE69109100T2 (de) Oligonukleotid-analoge.
DE69027443T2 (de) Oligonukleotidanaloga mit neuartigen bindungen
EP0524997B1 (de) 2'-o-alkylnukleotide sowie polymere, die solche nukleotide enthalten
EP0626387B1 (de) Nukleoside und Oligonukleotide mit 2'-Ethergruppen
DE69033986T2 (de) Ungeladene, auf Morpholin basierende Polymere mit Chiralen, Phosphor enthaltenden Brücken zwischen den Untereinheiten
EP0552766B1 (de) Oligonucleotidanaloga, deren Herstellung und Verwendung
DE3856326T2 (de) 2'-5'-Phosphorothioat-Oligoadenylate und deren antivirale Verwendungen
DE69503129T2 (de) Pteridin-nukleotidderivate als fluoreszierende sonden
EP0710667B1 (de) Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
EP0679657B1 (de) Nukleoside und Oligonukleotide mit 2'-Ethergruppen
EP0624161B1 (de) 2'-desoxy-isoguanosine, isostere analoge und isoguanosinderivate sowie deren anwendung
DE69724218T2 (de) Universale feste träger und verfahren zu ihrer verwendung
DE4110085A1 (de) 2'-o-alkyl-oligoribonukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als antisense-oligonukleotide
EP0552767B1 (de) 3'-Derivatisierte Oligonucleotidanaloga mit nichtnucleotidischen Gruppierungen, deren Herstellung und Verwendung
DE69828080T2 (de) Pyrimidinderivate als markierte bindungspartner
EP0818460B1 (de) Festphasensynthese von Oligonucleotiden
DE69724768T2 (de) Oligonukleotid-analoge
DE69400807T2 (de) Bausteine mit carbamate luternukleosidverbindungen und oligonukleotide abgeleitet davon
DE68906890T2 (de) Nukleoside derivate, nützlich für die synthese von markierten oligonukleotiden, mit diesen derivaten hergestellte oligonukleotide und ihre synthese.
DE19815901A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Pentopyranosyl-Nucleosiden
DE3928900A1 (de) Neue nucleotidderivate, ihre herstellung und ihre verwendung
DE19837387A1 (de) 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleinsäure, ihre Herstellung und Verwendung