JP4207258B2 - 特定核酸配列の切断方法 - Google Patents
特定核酸配列の切断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4207258B2 JP4207258B2 JP24545398A JP24545398A JP4207258B2 JP 4207258 B2 JP4207258 B2 JP 4207258B2 JP 24545398 A JP24545398 A JP 24545398A JP 24545398 A JP24545398 A JP 24545398A JP 4207258 B2 JP4207258 B2 JP 4207258B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- probe
- cleavage
- specific
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0042—Photocleavage of drugs in vivo, e.g. cleavage of photolabile linkers in vivo by UV radiation for releasing the pharmacologically-active agent from the administered agent; photothrombosis or photoocclusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3511—Conjugate intercalating or cleaving agent
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子本体である核酸の配列特異的な切断方法に関するものであり、遺伝子診断、有用遺伝子のクローニング、そして未知遺伝子の探索等の分野で利用され得るものである。
【0002】
【従来の技術】
分子生物学又はその応用分野においては、核酸を特定配列部位で切断することが頻繁に行われる。例えば、大腸菌等の微生物やヒト細胞や他の動物細胞等で目的のタンパクを生産するには、目的タンパクをコードする遺伝子を挿入したベクターが必要になるが、このベクターの調製にあたっては、制限酵素を用いて遺伝子たる核酸を特定配列部位で特異的に切断することが必要である。
【0003】
このような、核酸の特定配列部位での特異的な切断には、核酸中の塩基配列を認識して塩基間の結合を切断する活性を発揮する制限酵素が用いられるのが一般的であり、既に数百種類の制限酵素が知られている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
制限酵素を用いる場合は、切断しようとする特定配列部位を認識する酵素を選択して使用する必要がある。しかしながら、任意の配列で核酸を切断しようとすると、既に知られた数百種類の制限酵素をもってしても十分ではない。例えば、ガンの治療法の一つとして、ガン遺伝子の発現を阻止する目的でゲノム中の目的ガン遺伝子のみを特異的に切断する方法が有望視されているが、この目的を達成するには切断されるべきガン遺伝子中の特定配列部位を特異的に切断する制限酵素が必要となるが、かかる特定配列部位を認識し切断する制限酵素が存在するとは必ずしも言えない。
【0005】
そこで本発明の目的は、2本鎖DNA(以下、標的核酸という)の特定核酸配列を特異的に切断する方法を提供し、これにより制限酵素を使用せずに、任意に選択された特定核酸配列の切断を可能とすることを目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために成された本発明は、2本鎖DNA(標的核酸)の特定核酸配列部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ(1本鎖オリゴヌクレオチド)及びスペルミンを含む溶液に前記インターカレーターの吸収波長の光を照射することを特徴とする特定核酸配列の切断方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【0007】
2本鎖DNAに対しては、その特定の核酸配列部位に結合し3本鎖を形成し得る核酸プローブ(1本鎖DNA)を設計することが可能であり、設計のための塩基の選択規則も既によく知られている(伊藤隆司、蛋白質核酸酵素、Vol.38、No.3、541〜550頁、1993年)。一方、本出願人により、1本鎖の標的核酸の特定配列部位に特異的に結合し得る核酸配列を有する1本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を結合し、特定核酸との相補結合により形成される2本鎖核酸部分に該蛍光色素がインターカレーションしてその蛍光特性を変化するように設計された、インターカレーター性蛍光色素結合プローブを報告している(特願平7−185599号公報、EP公開第714986号公報、Nucleic Acids Research、24(24)、4992−4997頁、1996年参照)。なお、本明細書においては、標的核酸とインターカレーターを結合した核酸プローブを時として切断用プローブと、切断用プローブ中の1本鎖オリゴヌクレオチド部分を単に核酸プローブと称することがある。
【0008】
今回、本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を行う中で、2本鎖DNAの特定核酸配列部位に特異的に結合し得る核酸配列を有する核酸プローブにインターカレーターを結合した切断用プローブを標的核酸に添加し、スペルミン共存下で特定波長光を照射すると、インターカレーターが標的核酸中にインターカレーションし、前記特定波長光を吸収して切断用プローブの結合部位、即ち標的核酸の前記特定核酸配列部位を切断することを見出したのである。
【0009】
本発明で用いられるインターカレーターとしては、2本鎖DNAにインターカレーションする物質であれば特に制限はない。例えば、チアゾールオレンジやオキサゾールイエロー等のインターカレーター性蛍光色素を例示することができる。インターカレーターは、共有結合によって核酸プローブと結合すれば良いが、この際、適当な分子長のリンカーを介して結合しても良い。リンカーは、インターカレーターが標的核酸中にインターカレーションすることを妨害しない分子であれば特に制限はないが、例えば両末端に官能基を有する二官能性炭化水素等は両者を容易に結合するうえで特に好ましいリンカーである。また例えば、市販の試薬(Clontech社製C6−Thiolmodifier)等を使用することもできる。
【0010】
インターカレーターの核酸プローブへの結合部位は、核酸プローブの5’末端、3’末端又は中央部分のいずれであっても、この結合により切断用プローブの標的核酸の特定核酸配列部位への結合が妨害されず、かつ、結合されたインターカレーターが標的核酸中にインターカレーション可能であれば特に制限はない。
【0011】
本発明により、標的核酸は切断用プローブが特異的に結合した部位、即ち特定核酸配列部位で切断される。このように、前記リンカーの分子長及び切断用プローブにおけるインターカレーターの結合部位は、標的核酸の切断部位を制御するうえで重要である。即ち、例えば切断用プローブの末端にインターカレーターが結合されている場合、標的核酸の特定核酸配列部位の末端からリンカーの分子長に依存して数塩基〜数十塩基の範囲内で標的核酸は切断される。
【0012】
切断用プローブを構成する核酸プローブは、標的核酸の特定核酸配列部位に対する特異性を担保するため、6〜100ヌクレオチド、特に10〜30ヌクレオチドの1本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好ましい。ここで標的核酸の特定核酸配列部位とは、標的核酸中に見出される、本発明の方法により切断されるべき部位を含む塩基配列部分であり、任意に設定することができる。例えば切断されるべき標的核酸が切断されるべきではない2本鎖DNAと共存している場合には、特定核酸配列部位として標的核酸に特異的に見出される(言い換えれば他の核酸中には見出されない)塩基配列部部位を選択することが好ましい。核酸プローブの塩基配列は、標的核酸(2本鎖DNA)中のA−T結合部分に対応する塩基としてTを、G−C結合部分に対応する塩基としてC又は5−メチルシトシンを選択することで、安定なPyr−Pur−Pyr型3本鎖を形成することができる。
【0013】
標的核酸に切断用プローブを添加し、スペルミン共存下で特定波長光を照射することにより、標的核酸を特定核酸配列部位で切断することができる。標的核酸と共存させる切断用プローブの量は、予想される標的核酸の存在料と同程度とすれば十分であるが、その10〜100倍を使用することで、標的核酸を効率的に切断することができる。スペルミンの使用量(最終濃度)は、0.1mM〜1.0mM程度、特に好ましくは0.5mM程度である。
【0014】
照射する光は、切断用プローブ中のインターカレーターが吸収する特定波長の光を含んでいれば特に制限はない。例えばインターカレーターがオキサゾールイエローである場合には、特定波長の光として490nmの光を例示することができる。
【0015】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一例であって本発明を限定するものではない。
【0016】
実施例1 オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドDS−1、TH−1、TH−2TH−3及びTH−4を市販のDNA合成装置により合成した。各オリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りである。
【0017】
DS−1:5’−TTTTCCTCTCCCTCT−3’
TH−1:5’−GATCGGCAGGGGAATCTCCCTCTCCTTTTATGGGC−3’
TH−2:5’−TCGAGCCCATAAAAGGAGAGGGAGATTCCCCTGCC−3’
TH−3:5’−CGATCGTCTCCCTCTCCTTTTACCTAAGGGAAAGAGGAAAGGCCTAG−3’
TH−4:5’−CTAGGCCTTTCCTCTTTCCCTTAGGTAAAAGGAGAGGGAGAGGATCG−3’
チオール修飾オリゴヌクレオチドPU−1及びPY−1(核酸プローブ)は、市販の試薬(C6−ThiolModifier、商品名、クロンテック社製)を用い、DNA合成装置により常法に従って合成した。また市販の試薬(C6−ThiolModifier)部分からのトリチル基の除去は常法に従った。PU−1及びPY−1の塩基配列は以下の通りである。
【0018】
尚、各オリゴ核酸の塩基配列は、以下の通りである(*は、5−methylcytosineを示す)。
【0019】
PU−1:5’−HS(CH2)6−OPO3−AGAGGGAGAGGAAAA−3’
PY−1:5’−HS(CH2)6−OPO3−TTTTC*C*TC*TC*C*C*TC*T−3’
実施例2 切断用核酸プローブの調製
実施例1で調製したPU−1を、常法に従って高速液体クロマトグラフィーで精製した。得られたPU−1含有画分にジチオスレイトール(10μM、20μL)を加えて溶液Aとした。DMF(200μl)、1.0Mリン酸緩衝液(pH10.0、300μl)及び水(500μl)の混合液に、文献(特願平7−185599号公報、EP公開第714986号公報、Nucleic Acids Research、24(24)、4992−4997頁、1996年参照)に開示したようにして調製したオキサゾールイエロー(YO(CH2)3I)を添加し、飽和させて溶液Bとした。
【0020】
溶液Aと溶液Bを3:1の比率で混合し、アルゴン存在下で2時間反応させた後、ゲルろ過用カラム(Sephadex G−25、ファルマシア社製)を用いた液体クロマトグラフィーで精製した。なお溶出液としては5%アセトニトリルを含むpH7.0のTEAA緩衝液を使用した。
【0021】
精製した画分を濃縮し、蒸留水に溶解し、常法に従い高速液体クロマトグラフィーで更に精製した後、得られた画分を減圧下で乾固しYO−PU−1を得た。得られたYO−PU−1の濃度は、260nmの吸光度から決定した。
【0022】
実施例1で調製したPY−1についても上記同様の操作を行い、YO−PY−1を得た。各核酸プローブの塩基配列は、以下の通りである(*は、5−methylcytosineを示す)。またこれら切断用核酸プローブ(インターカレーターを結合した核酸プローブ)の調製の様子を図1に示す。
【0023】
YO−PU−1:5’−YO−(CH2)3−S(CH2)6−OPO3−AGAGGGAGAGGAAAA−3’
YO−PY−1:5’−YO−(CH2)3−S(CH2)6−OPO3−TTTTC*C*TC*TC*C*C*TC*T−3’
実施例3 2本鎖形成と蛍光の測定
YO−PU−1(30pmol)を含むTris−HCl緩衝液(20mM、pH7.5、50μl)に実施例1で調製したDS−1を添加し、混合液を90℃に加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷した。前記と同じTris−HCl緩衝液(500ml)を更に添加し、励起波長490nm、蛍光波長510nmで蛍光測定した。結果を図2に示す。
【0024】
図2から、切断用プローブがDS−1と特異的に結合することが分かる。
【0025】
実施例4 3本鎖形成と蛍光の測定
実施例1で調製したTH−1及びTH−2をTris−HCl緩衝液(20mM、pH7.5、50μl)に添加し、混合液を90℃に加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷して2本鎖DNA(標的核酸)を形成させた。形成させた標的核酸とYO−PY−1を、Tris−Acetate(25mM、pH5.1)、NaCl(50mM)、MgCl2(20mM)及びスペルミン(0.5mM)を含む緩衝液(100μl)に添加し、25℃で30分間インキュベートした。前記と同じTris−HCl緩衝液(500ml)を更に添加し、励起波長490nm、蛍光波長510nmで蛍光測定した。比較のため、スペルミンを含まない緩衝液を用いて前記同様の操作を行った。結果を図3に示す。
【0026】
図3から、切断用プローブが標的核酸と特異的に3本鎖を形成し、スペルミンの共存がその形成に効果的であることが分かる。また、切断用プローブのインターカレーターとして、インターカレーター性蛍光色素を用いた場合は、3本鎖の形成により蛍光増感を示すことも確認された。
【0027】
実施例5 標的核酸の切断
T4ポリヌクレオチドキナーゼと[γ−32P]−ATP(32Pで標識したATP)を用いて、実施例1で調製したTH−3又はTH−4の5’末端を標識した。標識した鎖と未標識の相補鎖を混合後、混合液を90℃に加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷して2本鎖DNA(標的核酸)を形成した。
【0028】
形成した標的核酸(4mM、約100K cpmの標識した鎖を含む)を、Tris−HCl(50mM、pH5.8)、NaCl(50mM)、MgCl2(20mM)及びスペルミン(0.5mM)及び10当量又は100当量のYO−PY−1を含む緩衝液(1ml)に添加し、20℃で30分間インキュベートし、同温度で可視光を1時間照射した。
【0029】
混合液にエタノールを加えてDNAを沈殿させ、減圧して乾燥した。20K
cpmの標識鎖を含むサンプルを12%の変性ポリアクリルアミドゲルを用い2000Vにて3時間電気泳動し、泳動後、X線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行なった。結果を図4〜6に示す。
【0030】
図中の矢印は、標的核酸の切断部位を示すものである。このように、切断用プローブを用いた標的核酸の切断は部位特異的であり、核酸プローブの塩基配列を選択することで標的核酸中の任意の部位(特定核酸配列部位)を切断可能であることが分かる。
【0031】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、2本鎖DNAの特定核酸配列部位(任意の配列からなる部位)を特異的に切断する方法が提供される。この方法は、従来の制限酵素を用いる切断法では対応し得なかった配列部位に対しても適用可能であるため、有用遺伝子のクローニングへの利用、未知遺伝子の探索等の分野での利用はもとより、今後期待されている遺伝子診断や遺伝子治療の分野においても有効な方法である。
【0032】
特に本発明では、標的となる2本鎖DNAを含む試料に切断用プローブを添加し、スペルミンの共存下で特定波長の光を例えば1時間程度照射するだけで切断が可能であるから、迅速性と簡便性に対する一般的な要求に応えることが可能であり、熟練を要する操作が存在しないために操作者の相違により異なる結果が得られるということもない。加えて、本発明では特定波長の光を照射することによってはじめて2本鎖DNAを切断し得るものであるから、標的核酸と切断用プローブとが共存する状況のもとであっても切断の時期を自由に選択することが可能である。例えば、切断用プローブが標的核酸の存在する細胞等に移動するのを確認したうえで光を照射すれば、標的核酸を効率的に切断することが可能となるため、遺伝子治療での利用も期待できる。しかも、このように切断の時期を自由に選択することができれば、切断されるべきではないが、特定核酸配列部位又はそれと類似した配列部位を有する2本鎖DNAがダメージを受けることを避けるための工夫も可能となる。
【0033】
本発明で切断用プローブとして用いるインターカレーターを結合した核酸プローブは、標的核酸と相補結合を形成するとインターカレーターの蛍光強度が増加等するという特質をも有していることから、例えば、まず切断用プローブを標的核酸が存在する組織の細胞等に導入し、該細胞からの蛍光の有無をもとに切断プローブと標的核酸の結合を確認し、そのうえで本発明における切断に好適な特定波長の光を照射する、等の操作を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、YO−PY−1の調製操作を説明するための図である。
【図2】図2は、相補鎖DS−1と2本鎖を形成した場合のYO−PU−1の蛍光の増大を示すための図である。
【図3】図3は、TH−1及びTH−2により形成される2本鎖DNAと3本鎖を形成した場合のYO−PY−1の蛍光の増大を示すための図である。図中、Aはスペルミンが存在するとき、Bスペルミンが存在しないときの結果である。
【図4】図4は、YO−PY−1による、TH−3及びTH−4が形成した2本鎖DNAの切断を示す電気泳動パターンであり、標識されたTH−4を含む2本鎖DNAの切断を示すものである。
【図5】図5は、YO−PY−1による、TH−3及びTH−4が形成した2本鎖DNAの切断を示す電気泳動パターンであり、標識されたTH−3を含む2本鎖DNAの切断を示すものである。
【図6】図6は、YO−PY−1による、TH−3及びTH−4が形成した2本鎖DNAの切断を示す図であり、切断箇所を示すヒストグラムを示すものである。
Claims (1)
- 2本鎖DNA(標的核酸)の特定核酸配列部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ(1本鎖オリゴヌクレオチド)及びスペルミンを含む溶液に前記インターカレーターの吸収波長の光を照射することを特徴とする特定核酸配列の切断方法であって、前記インターカレーターがオキサゾールイエローである、前記切断方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24545398A JP4207258B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 特定核酸配列の切断方法 |
DE69918010T DE69918010T2 (de) | 1998-08-31 | 1999-08-26 | Methode zum Spalten von spezifischen Nucleinsäuresequenzen |
EP99306806A EP0989185B1 (en) | 1998-08-31 | 1999-08-26 | Method of cleaving specific nucleic acid sequence |
US09/385,377 US6228656B1 (en) | 1998-08-31 | 1999-08-30 | Method of cleaving specific nucleic acid sequence |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24545398A JP4207258B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 特定核酸配列の切断方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000125869A JP2000125869A (ja) | 2000-05-09 |
JP4207258B2 true JP4207258B2 (ja) | 2009-01-14 |
Family
ID=17133898
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24545398A Expired - Fee Related JP4207258B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 特定核酸配列の切断方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6228656B1 (ja) |
EP (1) | EP0989185B1 (ja) |
JP (1) | JP4207258B2 (ja) |
DE (1) | DE69918010T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1356086A2 (de) * | 2000-12-13 | 2003-10-29 | Institut Für Physikalische Hochtechnologie E.V. | Verfahren zum simultanen positionsspezifischen schneiden von fadenförmigen organischen molekülketten, insbesonere dna |
US7313660B2 (en) * | 2003-09-04 | 2007-12-25 | Lsi Corporation | Data stream frequency reduction and/or phase shift |
US9410172B2 (en) | 2013-09-16 | 2016-08-09 | General Electric Company | Isothermal amplification using oligocation-conjugated primer sequences |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2586704B1 (fr) * | 1985-09-04 | 1987-12-18 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation et a un groupe chimique activable, leur synthese et leurs applications a titre de nucleases artificielles specifiques de sequences. centre national de la recherche scientifique (cnrs) |
ATE87932T1 (de) * | 1986-12-02 | 1993-04-15 | Centre Nat Rech Scient | Alpha-oligonukleotide. |
JP3189000B2 (ja) * | 1994-12-01 | 2001-07-16 | 東ソー株式会社 | 特定核酸配列の検出方法 |
US5714328A (en) * | 1995-06-07 | 1998-02-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | RNA photocleavage using texaphyrins |
-
1998
- 1998-08-31 JP JP24545398A patent/JP4207258B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-08-26 EP EP99306806A patent/EP0989185B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-26 DE DE69918010T patent/DE69918010T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-30 US US09/385,377 patent/US6228656B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0989185B1 (en) | 2004-06-16 |
DE69918010D1 (de) | 2004-07-22 |
DE69918010T2 (de) | 2005-07-07 |
JP2000125869A (ja) | 2000-05-09 |
EP0989185A1 (en) | 2000-03-29 |
US6228656B1 (en) | 2001-05-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0695305B1 (en) | Method of forming oligonucleotides | |
US5573906A (en) | Detection of nucleic acids using a hairpin forming oligonucleotide primer and an energy transfer detection system | |
ES2270467T3 (es) | Metodos para detectar y amplificar secuencias de acido nucleico utilizando oligonucleotidos modificados que tienen una tm especifica de la diana mas elevada. | |
JP5307206B2 (ja) | 複数のフルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチド | |
US5789155A (en) | Process for identifying nucleic acids and triple helices formed thereby | |
ES2323561T3 (es) | Metodos para amplificar y secuenciar adn. | |
Astakhova et al. | Scaffolding along nucleic acid duplexes using 2′-amino-locked nucleic acids | |
Davies et al. | Synthesis of fluorescently labelled oligonucleotides and nucleic acids | |
JPH09506510A (ja) | 核酸が媒介する電子伝達 | |
Tian et al. | DNAzyme amplification of molecular beacon signal | |
JP2000511904A (ja) | 核酸による電子移動 | |
Mücke et al. | DNA cleavage by type III restriction-modification enzyme EcoP15I is independent of spacer distance between two head to head oriented recognition sites | |
Fukui et al. | Synthesis and properties of an oligonucleotide modified with an acridine derivative at the artificial abasic site | |
Wang et al. | Duplex featured polymerase-driven concurrent strategy for detecting of ATP based on endonuclease-fueled feedback amplification | |
JP3194969B2 (ja) | ポリヌクレオチド検出用プローブ及び検出方法 | |
Berti et al. | Energy transfer cassettes for facile labeling of sequencing and PCR primers | |
JPH10500572A (ja) | 標的核酸を検出する方法 | |
Zuo et al. | Antibody-powered lighting-up fluorescence immunosensor based on hemin/G-quadruplex-quenched DNA-hosted dual silver nanoclusters as emitters | |
JP4207258B2 (ja) | 特定核酸配列の切断方法 | |
Wang et al. | A bicyclo-hairpin probe mediated strand displacement amplification strategy for label-free and sensitive detection of bleomycin | |
WO1990008838A1 (en) | Labeling of nucleic acids with fluorescent markers | |
US20030022853A1 (en) | Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes | |
Duval-Valentin et al. | Triple helix-directed psoralen crosslinks are recognized by Uvr (A) BC excinuclease | |
Lebedeva et al. | Photoaffinity labeling of proteins in bovine testis nuclear extract | |
Kuznetsova et al. | Use of crosslinking for revealing the DNA phosphate groups forming specific contacts with the E. coli Fpg protein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050630 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080527 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080701 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080930 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081013 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111031 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111031 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121031 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131031 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |