JP2000125869A - 特定核酸配列の切断方法 - Google Patents
特定核酸配列の切断方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列を特異的に切断す
る方法を提供し、これにより制限酵素を使用せずに、し
かも、任意に選択された特定核酸配列の切断を可能とす
ること。 【解決手段】２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定核酸配列
部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的
核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ（１
本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含む溶液に
前記インターカレーターの吸収波長の光を照射すること
を特徴とする特定核酸配列の切断方法。
る方法を提供し、これにより制限酵素を使用せずに、し
かも、任意に選択された特定核酸配列の切断を可能とす
ること。 【解決手段】２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定核酸配列
部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的
核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ（１
本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含む溶液に
前記インターカレーターの吸収波長の光を照射すること
を特徴とする特定核酸配列の切断方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子本体である
核酸の配列特異的な切断方法に関するものであり、遺伝
子診断、有用遺伝子のクローニング、そして未知遺伝子
の探索等の分野で利用され得るものである。
核酸の配列特異的な切断方法に関するものであり、遺伝
子診断、有用遺伝子のクローニング、そして未知遺伝子
の探索等の分野で利用され得るものである。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学又はその応用分野において
は、核酸を特定配列部位で切断することが頻繁に行われ
る。例えば、大腸菌等の微生物やヒト細胞や他の動物細
胞等で目的のタンパクを生産するには、目的タンパクを
コードする遺伝子を挿入したベクターが必要になるが、
このベクターの調製にあたっては、制限酵素を用いて遺
伝子たる核酸を特定配列部位で特異的に切断することが
必要である。
は、核酸を特定配列部位で切断することが頻繁に行われ
る。例えば、大腸菌等の微生物やヒト細胞や他の動物細
胞等で目的のタンパクを生産するには、目的タンパクを
コードする遺伝子を挿入したベクターが必要になるが、
このベクターの調製にあたっては、制限酵素を用いて遺
伝子たる核酸を特定配列部位で特異的に切断することが
必要である。
【０００３】このような、核酸の特定配列部位での特異
的な切断には、核酸中の塩基配列を認識して塩基間の結
合を切断する活性を発揮する制限酵素が用いられるのが
一般的であり、既に数百種類の制限酵素が知られてい
る。
的な切断には、核酸中の塩基配列を認識して塩基間の結
合を切断する活性を発揮する制限酵素が用いられるのが
一般的であり、既に数百種類の制限酵素が知られてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】制限酵素を用いる場合
は、切断しようとする特定配列部位を認識する酵素を選
択して使用する必要がある。しかしながら、任意の配列
で核酸を切断しようとすると、既に知られた数百種類の
制限酵素をもってしても十分ではない。例えば、ガンの
治療法の一つとして、ガン遺伝子の発現を阻止する目的
でゲノム中の目的ガン遺伝子のみを特異的に切断する方
法が有望視されているが、この目的を達成するには切断
されるべきガン遺伝子中の特定配列部位を特異的に切断
する制限酵素が必要となるが、かかる特定配列部位を認
識し切断する制限酵素が存在するとは必ずしも言えな
い。
は、切断しようとする特定配列部位を認識する酵素を選
択して使用する必要がある。しかしながら、任意の配列
で核酸を切断しようとすると、既に知られた数百種類の
制限酵素をもってしても十分ではない。例えば、ガンの
治療法の一つとして、ガン遺伝子の発現を阻止する目的
でゲノム中の目的ガン遺伝子のみを特異的に切断する方
法が有望視されているが、この目的を達成するには切断
されるべきガン遺伝子中の特定配列部位を特異的に切断
する制限酵素が必要となるが、かかる特定配列部位を認
識し切断する制限酵素が存在するとは必ずしも言えな
い。
【０００５】そこで本発明の目的は、２本鎖ＤＮＡ（以
下、標的核酸という）の特定核酸配列を特異的に切断す
る方法を提供し、これにより制限酵素を使用せずに、任
意に選択された特定核酸配列の切断を可能とすることを
目的とするものである。
下、標的核酸という）の特定核酸配列を特異的に切断す
る方法を提供し、これにより制限酵素を使用せずに、任
意に選択された特定核酸配列の切断を可能とすることを
目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に成された本発明は、２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定
核酸配列部位を特異的に切断する方法において、少なく
とも標的核酸、インターカレーターを結合した核酸プロ
ーブ（１本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含
む溶液に前記インターカレーターの吸収波長の光を照射
することを特徴とする特定核酸配列の切断方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
に成された本発明は、２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定
核酸配列部位を特異的に切断する方法において、少なく
とも標的核酸、インターカレーターを結合した核酸プロ
ーブ（１本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含
む溶液に前記インターカレーターの吸収波長の光を照射
することを特徴とする特定核酸配列の切断方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】２本鎖ＤＮＡに対しては、その特定の核酸
配列部位に結合し３本鎖を形成し得る核酸プローブ（１
本鎖ＤＮＡ）を設計することが可能であり、設計のため
の塩基の選択規則も既によく知られている（伊藤隆司、
蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．３、５４１〜５
５０頁、１９９３年）。一方、本出願人により、１本鎖
の標的核酸の特定配列部位に特異的に結合し得る核酸配
列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレー
ター性蛍光色素を結合し、特定核酸との相補結合により
形成される２本鎖核酸部分に該蛍光色素がインターカレ
ーションしてその蛍光特性を変化するように設計され
た、インターカレーター性蛍光色素結合プローブを報告
している（特願平７−１８５５９９号公報、ＥＰ公開第
７１４９８６号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７
頁、１９９６年参照）。なお、本明細書においては、標
的核酸とインターカレーターを結合した核酸プローブを
時として切断用プローブと、切断用プローブ中の１本鎖
オリゴヌクレオチド部分を単に核酸プローブと称するこ
とがある。
配列部位に結合し３本鎖を形成し得る核酸プローブ（１
本鎖ＤＮＡ）を設計することが可能であり、設計のため
の塩基の選択規則も既によく知られている（伊藤隆司、
蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．３、５４１〜５
５０頁、１９９３年）。一方、本出願人により、１本鎖
の標的核酸の特定配列部位に特異的に結合し得る核酸配
列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドにインターカレー
ター性蛍光色素を結合し、特定核酸との相補結合により
形成される２本鎖核酸部分に該蛍光色素がインターカレ
ーションしてその蛍光特性を変化するように設計され
た、インターカレーター性蛍光色素結合プローブを報告
している（特願平７−１８５５９９号公報、ＥＰ公開第
７１４９８６号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７
頁、１９９６年参照）。なお、本明細書においては、標
的核酸とインターカレーターを結合した核酸プローブを
時として切断用プローブと、切断用プローブ中の１本鎖
オリゴヌクレオチド部分を単に核酸プローブと称するこ
とがある。
【０００８】今回、本発明者らは、前記目的を達成すべ
く鋭意研究を行う中で、２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列部
位に特異的に結合し得る核酸配列を有する核酸プローブ
にインターカレーターを結合した切断用プローブを標的
核酸に添加し、スペルミン共存下で特定波長光を照射す
ると、インターカレーターが標的核酸中にインターカレ
ーションし、前記特定波長光を吸収して切断用プローブ
の結合部位、即ち標的核酸の前記特定核酸配列部位を切
断することを見出したのである。
く鋭意研究を行う中で、２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列部
位に特異的に結合し得る核酸配列を有する核酸プローブ
にインターカレーターを結合した切断用プローブを標的
核酸に添加し、スペルミン共存下で特定波長光を照射す
ると、インターカレーターが標的核酸中にインターカレ
ーションし、前記特定波長光を吸収して切断用プローブ
の結合部位、即ち標的核酸の前記特定核酸配列部位を切
断することを見出したのである。
【０００９】本発明で用いられるインターカレーターと
しては、２本鎖ＤＮＡにインターカレーションする物質
であれば特に制限はない。例えば、チアゾールオレンジ
やオキサゾールイエロー等のインターカレーター性蛍光
色素を例示することができる。インターカレーターは、
共有結合によって核酸プローブと結合すれば良いが、こ
の際、適当な分子長のリンカーを介して結合しても良
い。リンカーは、インターカレーターが標的核酸中にイ
ンターカレーションすることを妨害しない分子であれば
特に制限はないが、例えば両末端に官能基を有する二官
能性炭化水素等は両者を容易に結合するうえで特に好ま
しいリンカーである。また例えば、市販の試薬（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ）等
を使用することもできる。
しては、２本鎖ＤＮＡにインターカレーションする物質
であれば特に制限はない。例えば、チアゾールオレンジ
やオキサゾールイエロー等のインターカレーター性蛍光
色素を例示することができる。インターカレーターは、
共有結合によって核酸プローブと結合すれば良いが、こ
の際、適当な分子長のリンカーを介して結合しても良
い。リンカーは、インターカレーターが標的核酸中にイ
ンターカレーションすることを妨害しない分子であれば
特に制限はないが、例えば両末端に官能基を有する二官
能性炭化水素等は両者を容易に結合するうえで特に好ま
しいリンカーである。また例えば、市販の試薬（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ社製Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ）等
を使用することもできる。
【００１０】インターカレーターの核酸プローブへの結
合部位は、核酸プローブの５’末端、３’末端又は中央
部分のいずれであっても、この結合により切断用プロー
ブの標的核酸の特定核酸配列部位への結合が妨害され
ず、かつ、結合されたインターカレーターが標的核酸中
にインターカレーション可能であれば特に制限はない。
合部位は、核酸プローブの５’末端、３’末端又は中央
部分のいずれであっても、この結合により切断用プロー
ブの標的核酸の特定核酸配列部位への結合が妨害され
ず、かつ、結合されたインターカレーターが標的核酸中
にインターカレーション可能であれば特に制限はない。
【００１１】本発明により、標的核酸は切断用プローブ
が特異的に結合した部位、即ち特定核酸配列部位で切断
される。このように、前記リンカーの分子長及び切断用
プローブにおけるインターカレーターの結合部位は、標
的核酸の切断部位を制御するうえで重要である。即ち、
例えば切断用プローブの末端にインターカレーターが結
合されている場合、標的核酸の特定核酸配列部位の末端
からリンカーの分子長に依存して数塩基〜数十塩基の範
囲内で標的核酸は切断される。
が特異的に結合した部位、即ち特定核酸配列部位で切断
される。このように、前記リンカーの分子長及び切断用
プローブにおけるインターカレーターの結合部位は、標
的核酸の切断部位を制御するうえで重要である。即ち、
例えば切断用プローブの末端にインターカレーターが結
合されている場合、標的核酸の特定核酸配列部位の末端
からリンカーの分子長に依存して数塩基〜数十塩基の範
囲内で標的核酸は切断される。
【００１２】切断用プローブを構成する核酸プローブ
は、標的核酸の特定核酸配列部位に対する特異性を担保
するため、６〜１００ヌクレオチド、特に１０〜３０ヌ
クレオチドの１本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好
ましい。ここで標的核酸の特定核酸配列部位とは、標的
核酸中に見出される、本発明の方法により切断されるべ
き部位を含む塩基配列部分であり、任意に設定すること
ができる。例えば切断されるべき標的核酸が切断される
べきではない２本鎖ＤＮＡと共存している場合には、特
定核酸配列部位として標的核酸に特異的に見出される
（言い換えれば他の核酸中には見出されない）塩基配列
部部位を選択することが好ましい。核酸プローブの塩基
配列は、標的核酸（２本鎖ＤＮＡ）中のＡ−Ｔ結合部分
に対応する塩基としてＴを、Ｇ−Ｃ結合部分に対応する
塩基としてＣ又は５−メチルシトシンを選択すること
で、安定なＰｙｒ−Ｐｕｒ−Ｐｙｒ型３本鎖を形成する
ことができる。
は、標的核酸の特定核酸配列部位に対する特異性を担保
するため、６〜１００ヌクレオチド、特に１０〜３０ヌ
クレオチドの１本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好
ましい。ここで標的核酸の特定核酸配列部位とは、標的
核酸中に見出される、本発明の方法により切断されるべ
き部位を含む塩基配列部分であり、任意に設定すること
ができる。例えば切断されるべき標的核酸が切断される
べきではない２本鎖ＤＮＡと共存している場合には、特
定核酸配列部位として標的核酸に特異的に見出される
（言い換えれば他の核酸中には見出されない）塩基配列
部部位を選択することが好ましい。核酸プローブの塩基
配列は、標的核酸（２本鎖ＤＮＡ）中のＡ−Ｔ結合部分
に対応する塩基としてＴを、Ｇ−Ｃ結合部分に対応する
塩基としてＣ又は５−メチルシトシンを選択すること
で、安定なＰｙｒ−Ｐｕｒ−Ｐｙｒ型３本鎖を形成する
ことができる。
【００１３】標的核酸に切断用プローブを添加し、スペ
ルミン共存下で特定波長光を照射することにより、標的
核酸を特定核酸配列部位で切断することができる。標的
核酸と共存させる切断用プローブの量は、予想される標
的核酸の存在料と同程度とすれば十分であるが、その１
０〜１００倍を使用することで、標的核酸を効率的に切
断することができる。スペルミンの使用量（最終濃度）
は、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ程度、特に好ましくは０．
５ｍＭ程度である。
ルミン共存下で特定波長光を照射することにより、標的
核酸を特定核酸配列部位で切断することができる。標的
核酸と共存させる切断用プローブの量は、予想される標
的核酸の存在料と同程度とすれば十分であるが、その１
０〜１００倍を使用することで、標的核酸を効率的に切
断することができる。スペルミンの使用量（最終濃度）
は、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ程度、特に好ましくは０．
５ｍＭ程度である。
【００１４】照射する光は、切断用プローブ中のインタ
ーカレーターが吸収する特定波長の光を含んでいれば特
に制限はない。例えばインターカレーターがオキサゾー
ルイエローである場合には、特定波長の光として４９０
ｎｍの光を例示することができる。
ーカレーターが吸収する特定波長の光を含んでいれば特
に制限はない。例えばインターカレーターがオキサゾー
ルイエローである場合には、特定波長の光として４９０
ｎｍの光を例示することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例に基づいて
更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一例で
あって本発明を限定するものではない。
更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一例で
あって本発明を限定するものではない。
【００１６】実施例１ オリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチドＤＳ−１、ＴＨ−１、ＴＨ−２ＴＨ
−３及びＴＨ−４を市販のＤＮＡ合成装置により合成し
た。各オリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りであ
る。
−３及びＴＨ−４を市販のＤＮＡ合成装置により合成し
た。各オリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りであ
る。
【００１７】ＤＳ−１：５’−ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣ
ＣＴＣＴ−３’ ＴＨ−１：５’−ＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴ
ＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＧＣ−３’ ＴＨ−２：５’−ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡ
ＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣ−３’ ＴＨ−３：５’−ＣＧＡＴＣＧＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣ
ＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ
ＣＣＴＡＧ−３’ ＴＨ−４：５’−ＣＴＡＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧ
ＧＡＴＣＧ−３’ チオール修飾オリゴヌクレオチドＰＵ−１及びＰＹ−１
（核酸プローブ）は、市販の試薬（Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭ
ｏｄｉｆｉｅｒ、商品名、クロンテック社製）を用い、
ＤＮＡ合成装置により常法に従って合成した。また市販
の試薬（Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ）部分から
のトリチル基の除去は常法に従った。ＰＵ−１及びＰＹ
−１の塩基配列は以下の通りである。
ＣＴＣＴ−３’ ＴＨ−１：５’−ＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＴ
ＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＧＣ−３’ ＴＨ−２：５’−ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡ
ＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣ−３’ ＴＨ−３：５’−ＣＧＡＴＣＧＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣ
ＴＴＴＴＡＣＣＴＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ
ＣＣＴＡＧ−３’ ＴＨ−４：５’−ＣＴＡＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴ
ＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧ
ＧＡＴＣＧ−３’ チオール修飾オリゴヌクレオチドＰＵ−１及びＰＹ−１
（核酸プローブ）は、市販の試薬（Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭ
ｏｄｉｆｉｅｒ、商品名、クロンテック社製）を用い、
ＤＮＡ合成装置により常法に従って合成した。また市販
の試薬（Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ）部分から
のトリチル基の除去は常法に従った。ＰＵ−１及びＰＹ
−１の塩基配列は以下の通りである。
【００１８】尚、各オリゴ核酸の塩基配列は、以下の通
りである（＊は、５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅを
示す）。
りである（＊は、５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅを
示す）。
【００１９】ＰＵ−１：５’−ＨＳ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ
3−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’ ＰＹ−１：５’−ＨＳ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＴＴＴＴ
Ｃ＊Ｃ＊ＴＣ＊ＴＣ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣ＊Ｔ−３’ 実施例２ 切断用核酸プローブの調製 実施例１で調製したＰＵ−１を、常法に従って高速液体
クロマトグラフィーで精製した。得られたＰＵ−１含有
画分にジチオスレイトール（１０μＭ、２０μＬ）を加
えて溶液Ａとした。ＤＭＦ（２００μｌ）、１．０Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ１０．０、３００μｌ）及び水（５０
０μｌ）の混合液に、文献（特願平７−１８５５９９号
公報、ＥＰ公開第７１４９８６号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９
９２−４９９７頁、１９９６年参照）に開示したように
して調製したオキサゾールイエロー（ＹＯ（ＣＨ2）
3Ｉ）を添加し、飽和させて溶液Ｂとした。
3−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡ−３’ ＰＹ−１：５’−ＨＳ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＴＴＴＴ
Ｃ＊Ｃ＊ＴＣ＊ＴＣ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＣ＊Ｔ−３’ 実施例２ 切断用核酸プローブの調製 実施例１で調製したＰＵ−１を、常法に従って高速液体
クロマトグラフィーで精製した。得られたＰＵ−１含有
画分にジチオスレイトール（１０μＭ、２０μＬ）を加
えて溶液Ａとした。ＤＭＦ（２００μｌ）、１．０Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ１０．０、３００μｌ）及び水（５０
０μｌ）の混合液に、文献（特願平７−１８５５９９号
公報、ＥＰ公開第７１４９８６号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９
９２−４９９７頁、１９９６年参照）に開示したように
して調製したオキサゾールイエロー（ＹＯ（ＣＨ2）
3Ｉ）を添加し、飽和させて溶液Ｂとした。
【００２０】溶液Ａと溶液Ｂを３：１の比率で混合し、
アルゴン存在下で２時間反応させた後、ゲルろ過用カラ
ム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、ファルマシア社製）
を用いた液体クロマトグラフィーで精製した。なお溶出
液としては５％アセトニトリルを含むｐＨ７．０のＴＥ
ＡＡ緩衝液を使用した。
アルゴン存在下で２時間反応させた後、ゲルろ過用カラ
ム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、ファルマシア社製）
を用いた液体クロマトグラフィーで精製した。なお溶出
液としては５％アセトニトリルを含むｐＨ７．０のＴＥ
ＡＡ緩衝液を使用した。
【００２１】精製した画分を濃縮し、蒸留水に溶解し、
常法に従い高速液体クロマトグラフィーで更に精製した
後、得られた画分を減圧下で乾固しＹＯ−ＰＵ−１を得
た。得られたＹＯ−ＰＵ−１の濃度は、２６０ｎｍの吸
光度から決定した。
常法に従い高速液体クロマトグラフィーで更に精製した
後、得られた画分を減圧下で乾固しＹＯ−ＰＵ−１を得
た。得られたＹＯ−ＰＵ−１の濃度は、２６０ｎｍの吸
光度から決定した。
【００２２】実施例１で調製したＰＹ−１についても上
記同様の操作を行い、ＹＯ−ＰＹ−１を得た。各核酸プ
ローブの塩基配列は、以下の通りである（＊は、５−ｍ
ｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅを示す）。またこれら切断
用核酸プローブ（インターカレーターを結合した核酸プ
ローブ）の調製の様子を図１に示す。
記同様の操作を行い、ＹＯ−ＰＹ−１を得た。各核酸プ
ローブの塩基配列は、以下の通りである（＊は、５−ｍ
ｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅを示す）。またこれら切断
用核酸プローブ（インターカレーターを結合した核酸プ
ローブ）の調製の様子を図１に示す。
【００２３】ＹＯ−ＰＵ−１：５’−ＹＯ−（ＣＨ2）3
−Ｓ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
ＡＡＡ−３’ ＹＯ−ＰＹ−１：５’−ＹＯ−（ＣＨ2）3−Ｓ（Ｃ
Ｈ2）6−ＯＰＯ3−ＴＴＴＴＣ＊Ｃ＊ＴＣ＊ＴＣ＊Ｃ＊
Ｃ＊ＴＣ＊Ｔ−３’ 実施例３ ２本鎖形成と蛍光の測定 ＹＯ−ＰＵ−１（３０ｐｍｏｌ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０μｌ）に実施例
１で調製したＤＳ−１を添加し、混合液を９０℃に加熱
してアニーリングさせ、室温にまで放冷した。前記と同
じＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５００ｍｌ）を更に添加
し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光測
定した。結果を図２に示す。
−Ｓ（ＣＨ2）6−ＯＰＯ3−ＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡ
ＡＡＡ−３’ ＹＯ−ＰＹ−１：５’−ＹＯ−（ＣＨ2）3−Ｓ（Ｃ
Ｈ2）6−ＯＰＯ3−ＴＴＴＴＣ＊Ｃ＊ＴＣ＊ＴＣ＊Ｃ＊
Ｃ＊ＴＣ＊Ｔ−３’ 実施例３ ２本鎖形成と蛍光の測定 ＹＯ−ＰＵ−１（３０ｐｍｏｌ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０μｌ）に実施例
１で調製したＤＳ−１を添加し、混合液を９０℃に加熱
してアニーリングさせ、室温にまで放冷した。前記と同
じＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５００ｍｌ）を更に添加
し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光測
定した。結果を図２に示す。
【００２４】図２から、切断用プローブがＤＳ−１と特
異的に結合することが分かる。
異的に結合することが分かる。
【００２５】実施例４ ３本鎖形成と蛍光の測定 実施例１で調製したＴＨ−１及びＴＨ−２をＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０μｌ）に添
加し、混合液を９０℃に加熱してアニーリングさせ、室
温にまで放冷して２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）を形成させ
た。形成させた標的核酸とＹＯ−ＰＹ−１を、Ｔｒｉｓ
−Ａｃｅｔａｔｅ（２５ｍＭ、ｐＨ５．１）、ＮａＣｌ
（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（２０ｍＭ）及びスペルミン
（０．５ｍＭ）を含む緩衝液（１００μｌ）に添加し、
２５℃で３０分間インキュベートした。前記と同じＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５００ｍｌ）を更に添加し、励起
波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光測定した。
比較のため、スペルミンを含まない緩衝液を用いて前記
同様の操作を行った。結果を図３に示す。
ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０μｌ）に添
加し、混合液を９０℃に加熱してアニーリングさせ、室
温にまで放冷して２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）を形成させ
た。形成させた標的核酸とＹＯ−ＰＹ−１を、Ｔｒｉｓ
−Ａｃｅｔａｔｅ（２５ｍＭ、ｐＨ５．１）、ＮａＣｌ
（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（２０ｍＭ）及びスペルミン
（０．５ｍＭ）を含む緩衝液（１００μｌ）に添加し、
２５℃で３０分間インキュベートした。前記と同じＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５００ｍｌ）を更に添加し、励起
波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光測定した。
比較のため、スペルミンを含まない緩衝液を用いて前記
同様の操作を行った。結果を図３に示す。
【００２６】図３から、切断用プローブが標的核酸と特
異的に３本鎖を形成し、スペルミンの共存がその形成に
効果的であることが分かる。また、切断用プローブのイ
ンターカレーターとして、インターカレーター性蛍光色
素を用いた場合は、３本鎖の形成により蛍光増感を示す
ことも確認された。
異的に３本鎖を形成し、スペルミンの共存がその形成に
効果的であることが分かる。また、切断用プローブのイ
ンターカレーターとして、インターカレーター性蛍光色
素を用いた場合は、３本鎖の形成により蛍光増感を示す
ことも確認された。
【００２７】実施例５ 標的核酸の切断 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−３２Ｐ］−ＡＴ
Ｐ（３２Ｐで標識したＡＴＰ）を用いて、実施例１で調
製したＴＨ−３又はＴＨ−４の５’末端を標識した。標
識した鎖と未標識の相補鎖を混合後、混合液を９０℃に
加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷して２本鎖
ＤＮＡ（標的核酸）を形成した。
Ｐ（３２Ｐで標識したＡＴＰ）を用いて、実施例１で調
製したＴＨ−３又はＴＨ−４の５’末端を標識した。標
識した鎖と未標識の相補鎖を混合後、混合液を９０℃に
加熱してアニーリングさせ、室温にまで放冷して２本鎖
ＤＮＡ（標的核酸）を形成した。
【００２８】形成した標的核酸（４ｍＭ、約１００Ｋ
ｃｐｍの標識した鎖を含む）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５
０ｍＭ、ｐＨ５．８）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣ
ｌ2（２０ｍＭ）及びスペルミン（０．５ｍＭ）及び１
０当量又は１００当量のＹＯ−ＰＹ−１を含む緩衝液
（１ｍｌ）に添加し、２０℃で３０分間インキュベート
し、同温度で可視光を１時間照射した。
ｃｐｍの標識した鎖を含む）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５
０ｍＭ、ｐＨ５．８）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣ
ｌ2（２０ｍＭ）及びスペルミン（０．５ｍＭ）及び１
０当量又は１００当量のＹＯ−ＰＹ−１を含む緩衝液
（１ｍｌ）に添加し、２０℃で３０分間インキュベート
し、同温度で可視光を１時間照射した。
【００２９】混合液にエタノールを加えてＤＮＡを沈殿
させ、減圧して乾燥した。２０Ｋｃｐｍの標識鎖を含む
サンプルを１２％の変性ポリアクリルアミドゲルを用い
２０００Ｖにて３時間電気泳動し、泳動後、Ｘ線フィル
ムを用いてオートラジオグラフィーを行なった。結果を
図４〜６に示す。
させ、減圧して乾燥した。２０Ｋｃｐｍの標識鎖を含む
サンプルを１２％の変性ポリアクリルアミドゲルを用い
２０００Ｖにて３時間電気泳動し、泳動後、Ｘ線フィル
ムを用いてオートラジオグラフィーを行なった。結果を
図４〜６に示す。
【００３０】図中の矢印は、標的核酸の切断部位を示す
ものである。このように、切断用プローブを用いた標的
核酸の切断は部位特異的であり、核酸プローブの塩基配
列を選択することで標的核酸中の任意の部位（特定核酸
配列部位）を切断可能であることが分かる。
ものである。このように、切断用プローブを用いた標的
核酸の切断は部位特異的であり、核酸プローブの塩基配
列を選択することで標的核酸中の任意の部位（特定核酸
配列部位）を切断可能であることが分かる。
【００３１】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列部位（任意の配
列からなる部位）を特異的に切断する方法が提供され
る。この方法は、従来の制限酵素を用いる切断法では対
応し得なかった配列部位に対しても適用可能であるた
め、有用遺伝子のクローニングへの利用、未知遺伝子の
探索等の分野での利用はもとより、今後期待されている
遺伝子診断や遺伝子治療の分野においても有効な方法で
ある。
によれば、２本鎖ＤＮＡの特定核酸配列部位（任意の配
列からなる部位）を特異的に切断する方法が提供され
る。この方法は、従来の制限酵素を用いる切断法では対
応し得なかった配列部位に対しても適用可能であるた
め、有用遺伝子のクローニングへの利用、未知遺伝子の
探索等の分野での利用はもとより、今後期待されている
遺伝子診断や遺伝子治療の分野においても有効な方法で
ある。
【００３２】特に本発明では、標的となる２本鎖ＤＮＡ
を含む試料に切断用プローブを添加し、スペルミンの共
存下で特定波長の光を例えば１時間程度照射するだけで
切断が可能であるから、迅速性と簡便性に対する一般的
な要求に応えることが可能であり、熟練を要する操作が
存在しないために操作者の相違により異なる結果が得ら
れるということもない。加えて、本発明では特定波長の
光を照射することによってはじめて２本鎖ＤＮＡを切断
し得るものであるから、標的核酸と切断用プローブとが
共存する状況のもとであっても切断の時期を自由に選択
することが可能である。例えば、切断用プローブが標的
核酸の存在する細胞等に移動するのを確認したうえで光
を照射すれば、標的核酸を効率的に切断することが可能
となるため、遺伝子治療での利用も期待できる。しか
も、このように切断の時期を自由に選択することができ
れば、切断されるべきではないが、特定核酸配列部位又
はそれと類似した配列部位を有する２本鎖ＤＮＡがダメ
ージを受けることを避けるための工夫も可能となる。
を含む試料に切断用プローブを添加し、スペルミンの共
存下で特定波長の光を例えば１時間程度照射するだけで
切断が可能であるから、迅速性と簡便性に対する一般的
な要求に応えることが可能であり、熟練を要する操作が
存在しないために操作者の相違により異なる結果が得ら
れるということもない。加えて、本発明では特定波長の
光を照射することによってはじめて２本鎖ＤＮＡを切断
し得るものであるから、標的核酸と切断用プローブとが
共存する状況のもとであっても切断の時期を自由に選択
することが可能である。例えば、切断用プローブが標的
核酸の存在する細胞等に移動するのを確認したうえで光
を照射すれば、標的核酸を効率的に切断することが可能
となるため、遺伝子治療での利用も期待できる。しか
も、このように切断の時期を自由に選択することができ
れば、切断されるべきではないが、特定核酸配列部位又
はそれと類似した配列部位を有する２本鎖ＤＮＡがダメ
ージを受けることを避けるための工夫も可能となる。
【００３３】本発明で切断用プローブとして用いるイン
ターカレーターを結合した核酸プローブは、標的核酸と
相補結合を形成するとインターカレーターの蛍光強度が
増加等するという特質をも有していることから、例え
ば、まず切断用プローブを標的核酸が存在する組織の細
胞等に導入し、該細胞からの蛍光の有無をもとに切断プ
ローブと標的核酸の結合を確認し、そのうえで本発明に
おける切断に好適な特定波長の光を照射する、等の操作
を行うことも可能である。
ターカレーターを結合した核酸プローブは、標的核酸と
相補結合を形成するとインターカレーターの蛍光強度が
増加等するという特質をも有していることから、例え
ば、まず切断用プローブを標的核酸が存在する組織の細
胞等に導入し、該細胞からの蛍光の有無をもとに切断プ
ローブと標的核酸の結合を確認し、そのうえで本発明に
おける切断に好適な特定波長の光を照射する、等の操作
を行うことも可能である。
【図１】図１は、ＹＯ−ＰＹ−１の調製操作を説明する
ための図である。
ための図である。
【図２】図２は、相補鎖ＤＳ−１と２本鎖を形成した場
合のＹＯ−ＰＵ−１の蛍光の増大を示すための図であ
る。
合のＹＯ−ＰＵ−１の蛍光の増大を示すための図であ
る。
【図３】図３は、ＴＨ−１及びＴＨ−２により形成され
る２本鎖ＤＮＡと３本鎖を形成した場合のＹＯ−ＰＹ−
１の蛍光の増大を示すための図である。図中、Ａはスペ
ルミンが存在するとき、Ｂスペルミンが存在しないとき
の結果である。
る２本鎖ＤＮＡと３本鎖を形成した場合のＹＯ−ＰＹ−
１の蛍光の増大を示すための図である。図中、Ａはスペ
ルミンが存在するとき、Ｂスペルミンが存在しないとき
の結果である。
【図４】図４は、ＹＯ−ＰＹ−１による、ＴＨ−３及び
ＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す電気泳動
パターンであり、標識されたＴＨ−４を含む２本鎖ＤＮ
Ａの切断を示すものである。
ＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す電気泳動
パターンであり、標識されたＴＨ−４を含む２本鎖ＤＮ
Ａの切断を示すものである。
【図５】図５は、ＹＯ−ＰＹ−１による、ＴＨ−３及び
ＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す電気泳動
パターンであり、標識されたＴＨ−３を含む２本鎖ＤＮ
Ａの切断を示すものである。
ＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す電気泳動
パターンであり、標識されたＴＨ−３を含む２本鎖ＤＮ
Ａの切断を示すものである。
【図６】図６は、ＹＯ−ＰＹ−１による、ＴＨ−３及び
ＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す図であ
り、切断箇所を示すヒストグラムを示すものである。
ＴＨ−４が形成した２本鎖ＤＮＡの切断を示す図であ
り、切断箇所を示すヒストグラムを示すものである。
フロントページの続き (72)発明者 杉浦 幸雄 京都府京都市西京区大原野西境谷町４−４ −４ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 HA13 HA14
Claims (2)
- 【請求項１】２本鎖ＤＮＡ（標的核酸）の特定核酸配列
部位を特異的に切断する方法において、少なくとも標的
核酸、インターカレーターを結合した核酸プローブ（１
本鎖オリゴヌクレオチド）及びスペルミンを含む溶液に
前記インターカレーターの吸収波長の光を照射すること
を特徴とする特定核酸配列の切断方法。 - 【請求項２】前記インターカレーターがインターカレー
ター性蛍光色素であることを特徴とする請求項１に記載
の切断方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24545398A JP4207258B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 特定核酸配列の切断方法 |
| DE69918010T DE69918010T2 (de) | 1998-08-31 | 1999-08-26 | Methode zum Spalten von spezifischen Nucleinsäuresequenzen |
| EP99306806A EP0989185B1 (en) | 1998-08-31 | 1999-08-26 | Method of cleaving specific nucleic acid sequence |
| US09/385,377 US6228656B1 (en) | 1998-08-31 | 1999-08-30 | Method of cleaving specific nucleic acid sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24545398A JP4207258B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 特定核酸配列の切断方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000125869A true JP2000125869A (ja) | 2000-05-09 |
| JP4207258B2 JP4207258B2 (ja) | 2009-01-14 |
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ID=17133898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24545398A Expired - Fee Related JP4207258B2 (ja) | 1998-08-31 | 1998-08-31 | 特定核酸配列の切断方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6228656B1 (ja) |
| EP (1) | EP0989185B1 (ja) |
| JP (1) | JP4207258B2 (ja) |
| DE (1) | DE69918010T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| EP1356086A2 (de) * | 2000-12-13 | 2003-10-29 | Institut Für Physikalische Hochtechnologie E.V. | Verfahren zum simultanen positionsspezifischen schneiden von fadenförmigen organischen molekülketten, insbesonere dna |
| US7313660B2 (en) * | 2003-09-04 | 2007-12-25 | Lsi Corporation | Data stream frequency reduction and/or phase shift |
| US9410172B2 (en) | 2013-09-16 | 2016-08-09 | General Electric Company | Isothermal amplification using oligocation-conjugated primer sequences |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2586704B1 (fr) * | 1985-09-04 | 1987-12-18 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation et a un groupe chimique activable, leur synthese et leurs applications a titre de nucleases artificielles specifiques de sequences. centre national de la recherche scientifique (cnrs) |
| ATE87932T1 (de) * | 1986-12-02 | 1993-04-15 | Centre Nat Rech Scient | Alpha-oligonukleotide. |
| JP3189000B2 (ja) * | 1994-12-01 | 2001-07-16 | 東ソー株式会社 | 特定核酸配列の検出方法 |
| US5714328A (en) * | 1995-06-07 | 1998-02-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | RNA photocleavage using texaphyrins |
-
1998
- 1998-08-31 JP JP24545398A patent/JP4207258B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-08-26 EP EP99306806A patent/EP0989185B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-26 DE DE69918010T patent/DE69918010T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-30 US US09/385,377 patent/US6228656B1/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0989185B1 (en) | 2004-06-16 |
| DE69918010D1 (de) | 2004-07-22 |
| JP4207258B2 (ja) | 2009-01-14 |
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