DE69918010T2 - Methode zum Spalten von spezifischen Nucleinsäuresequenzen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur sequenzspezifischen Spaltung von Nucleinsäuren als der Gene bildenden Verbindung und ist auf den Gebieten der klinischen Diagnose, der Clonierung von nützlichen Genen und der Erforschung unbekannter Gene anwendbar.
  • Es ist in der Molekularbiologie und ihrer Anwendung üblich, Nucleinsäuren an spezifischen Sequenzen zu spalten. Wenn zum Beispiel ein Vektor, der ein Gen trägt, das ein gewünschtes Protein codiert, zur Produktion des gewünschten Proteins in Mikroorganismen wie Escherichia coli, menschlichen Zellen oder anderen tierischen Zellen konstruiert wird, ist es erforderlich, eine Nucleinsäure als das Gen an einer spezifischen Sequenz mit einem Restriktionsenzym zu spalten.
  • Für eine solche sequenzspezifische Spaltung von Nucleinsäuren werden üblicherweise Restriktionsenzyme verwendet, die in Nucleinsäuren Basensequenzen erkennen und Internucleotidbindungen spalten, und es sind bereits Hunderte von Restriktionsenzymen bekannt.
  • Wenn Restriktionsenzyme verwendet werden, ist es erforderlich, ein Restriktionsenzym auszuwählen, das die spezifische, zu spaltende Sequenz erkennt. Es sind jedoch sogar Hunderte von bekannten Restriktionsenzymen nicht ausreichend, um Nucleinsäuren an jeder Sequenz zu spalten. Zum Beispiel erfordert eine vielversprechende Krebsbehandlung durch spezifische Spaltung eines Zielkrebsgens mit dem Ziel der Verhinderung der Entwicklung des Krebsgens ein Restriktionsenzym, welches eine spezifische Sequenz in dem zu spaltenden Krebsgen spezifisch spaltet, um das Ziel zu erreichen, es ist aber möglich, daß es kein Restriktionsenzym gibt, das die spezifische Sequenz erkennt und spaltet.
  • Demnach ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur spezifischen Spaltung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in einer doppelsträngigen DNA (hier nachstehend als Zielnucleinsäure bezeichnet), welches die Spaltung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz ohne Verwendung eines Restriktionsenzyms ermöglicht.
  • Um die vorstehend erwähnte Aufgabe zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur spezifischen Spaltung einer doppelsträngigen DNA (einer Zielnucleinsäure) an einer spezifischen Nucleinsäuresequenz bereit, welches die Bestrahlung einer Lösung, die mindestens die Zielnucleinsäure, eine Nucleinsäuresonde (ein einzelsträngiges Oligonucleotid), die an einen Interkalator gebunden ist, und 0,1 bis 1,0 mM Spermin enthält, mit Licht einer Absorptionswellenlänge des Interkalators umfaßt, wobei der besagte Interkalator ein fluoreszierender, interkalierender Farbstoff ist.
  • 1 ist ein Schema, das die Herstellung von YO-PY-1 erklärt.
  • 2 zeigt die Zunahme der Fluoreszenz von YO-PU-1 bei der Bildung eines Doppelstrangs mit einem komplementären Strang DS-1.
  • 3 zeigt die Zunahme der Fluoreszenz von YO-PY-1 bei der Bildung eines Dreifachstrangs mit einem Doppelstrang aus TH-1 und TH-2 in der Gegenwart von Spermin (A) und bei Abwesenheit von Spermin (B).
  • 4 zeigt ein Spaltmuster von markiertem TH-4, welches durch Elektrophorese der doppelsträngigen DNA erhalten wurde, die durch TH-3 und TH-4 gebildet wird, nach Spaltung mit YO-PY-1.
  • 5 zeigt ein Spaltmuster von markiertem TH-3, welches durch Elektrophorese der doppelsträngigen DNA erhalten wurde, die durch TH-3 und TH-4 gebildet wird, nach Spaltung mit YO-PY-1.
  • In 6 zeigen die Pfeile die Spaltstellen durch YO-PY-1 in der doppelsträngigen DNA, die durch TH-3 und TH-4 gebildet wird.
  • Im folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Es ist möglich, eine Nucleinsäuresonde zu entwerfen (eine einzelsträngige DNA), die an eine spezifische Nucleinsäuresequenz in doppelsträngiger DNA bindet, um einen Dreifachstrang zu bilden, und die Regeln der Auswahl der Basen für den Entwurf sind schon wohlbekannt (Takahashi Ito, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd. 38, Nr. 3, S. 541-550, 1993).
  • Beal und Dervan (Science, Bd. 251, Seite 1360-13633; 1991) beschreiben unter Verwendung der Affinitätsspaltung die Bestimmung der relativen Orientierung der DNA-Stränge in einer Purin – Purin – Pyrimidin-Dreifach-Helix. Die Konzentration von mehrwertigen Kationen wie Mg+ oder Spermin beeinflußte die Bindung eines Purin-reichen Oligonucleotids in der großen Furche von helikaler DNA antiparallel zum Watson-Crick-Purinstrang.
  • Andererseits berichtete die vorliegende Erfindung über eine fluoreszierende, interkalierende, an einen Farbstoff gebundene Sonde, die durch Bindung des fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffs an ein einzelsträngiges Oligonucleotid erhalten wird, welches eine Nucleinsäuresequenz hat, die mit einer spezifischen Sequenz in einer einzelsträngigen Zielnucleinsäure hybridisieren kann, so daß der fluoreszierende Farbstoff in den Doppelstrang interkaliert, der durch die Hybridisierung der spezifischen Nucleinsäuresequenz gebildet wird, und seine Fluoreszenzcharakteristika verändert (Japanische Patentanmeldung JP7-185599, EP-A-714986, Nucleic Acids Research, 24(24), S. 4992-4997, 1996). Hier wird das Hybrid der an den Interkalator gebundenen Nucleinsäuresonde mit der Zielnucleinsäure manchmal als Spaltsonde bezeichnet, und das einzelsträngige Oligonucleotid in der Spaltsonde wird manchmal einfach als Nucleinsäuresonde bezeichnet.
  • Die WO88/04301 beschreibt die Photospaltung von DNA unter Verwendung von mit Acridin markierten Oligonucleotiden. Das offenbarte Verfahren erfordert die Behandlung mit heißem Piperidin nach Bestrahlung bei 300 nm. Alternativ wurde die doppelsträngige DNA in der Gegenwart von Spermin und Acridin gespalten.
  • WO96/40253 beschreibt die Photospaltung von RNA unter Verwendung von Texaphyrinen und heißem Piperidin. Die Hybridisierung der Oligonucleotid-Texaphyrin-Konjugate an ihre komplementäre RNA- oder DNA-Sequenz verursacht stellenspezifische Photomodifikation an Guaninresten. Das resultiert in stellenspezifischer Photospaltung.
  • Doan et al. (Antisense Research and Development, 1 (i), S. 43 – 54 (1991) beschreiben die Verwendung von Oligopyrimidinen, die kovalent an Ellipticinderivate gebunden sind, um mit einzelsträngigen Oligopurinzielsequenzen eine Duplex- oder Triplexstruktur zu bilden. Die Oligopyrimidine können auch an Homopurin-Homopyrimidinsequenzen in Duplex-DNA binden, wo sie lokale Triplexstrukturen bilden. Die Bestrahlung von solchen Komplexen mit Wellenlängen von mehr als 300 nm induzierte die Spaltung der Zielbasen in enger Nachbarschaft zum Farbstoff und eine Verknüpfung der Zielsequenz mit dem derivatisierten Oligonucleotid. In einigen Beispielen wurden die bestrahlten Proben mit heißem Piperidin behandelt, das 50% des verknüpften Materials abbaute.
  • Die Photospaltung von dsDNA mit den Fluoreszenzfarbstoffen Oxazolgelb (YO), seinem Dimer (YOYO) und dem Dimer TOTO von Triazolorange (TO) als Funktion des Bindungsverhältnisses wird beschrieben von Akerman et al. (Nucleic Acids Research 24(6), S. 1080-1090; 1996).
  • Als Ergebnis ihrer umfangreichen Forschung mit Hinblick auf das Erreichen der zuvor erwähnten Aufgabe haben die hier genannten Erfinder kürzlich gefunden, daß, wenn eine Zielnucleinsäure in der Gegenwart von Spermin nach der Zugabe einer mit einem Interkalator verknüpften Nucleinsäuresonde, die eine Nucleinsäuresequenz hat, die mit einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in der doppelsträngigen DNA hybridisieren kann, als Spaltsonde mit Licht mit einer spezifischen Wellenlänge bestrahlt wird, der Interkalator in die Zielnucleinsäure interkaliert und das Licht der spezifischen Wellenlänge absorbiert, um die Zielnucleinsäure dort zu spalten, wo die Spaltsonde bindet, nämlich an der spezifischen Nucleinsäuresequenz.
  • In der vorliegenden Erfindung kann jede Verbindung, die in eine doppelsträngige DNA interkaliert, ohne besondere Einschränkungen als Interkalator verwendet werden. Zum Beispiel können fluoreszierende, interkalierende Farbstoffe wie Thiazolorange und Oxazolgelb erwähnt werden. Der Interkalator kann kovalent mit der Nucleinsäuresonde verknüpft sein, ggf. über einen Linker von geeigneter Länge. Obwohl ohne besondere Einschränkungen jedes Linkermolekül verwendet werden kann, das den Interkalator nicht daran hindert, in die Zielnucleinsäure zu interkalieren, ist ein besonders bevorzugter Linker ein bifunktioneller Kohlenwasserstoff, der zur leichten Bindung zwischen den beiden an beiden Enden funktionelle Gruppen hat. Alternativ kann ein kommerzielles Reagens (C6-ThiolModifier, Clontech) verwendet werden.
  • Der Interkalator kann an alle Stellen der Nucleinsäuresonde gebunden sein, einschließlich des 5'-Endes, des 3'-Endes und der Mitte der Nucleinsäuresonde ohne besondere Einschränkungen, so lange die Bindung weder die Spaltsonde an der Bindung an die spezifische Nucleinsäuresequenz in der Zielnucleinsäure hindert noch den gebundenen Interkalator an der Interkalation in die Zielnucleinsäure hindert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Zielnucleinsäure an der Stelle gespalten, wo die Spaltsonde spezifisch bindet, nämlich an der spezifischen Nucleinsäuresequenz. Somit ist die Länge des Linkers und die Lage des gebundenen Interkalators in der Spaltsonde entscheidend für die Kontrolle der Spaltstelle in der Zielnucleinsäure. Wenn nämlich zum Beispiel die Spaltsonde einen Interkalator am Ende hat, dann wird die Zielnucleinsäure mehrere Basen bis zu mehreren zehn Basen weg vom Ende der spezifischen Nucleinsäuresequenz in der Zielnucleinsäure gespalten, in Abhängigkeit von der Länge des Linkers.
  • Die Nucleinsäuresonde als ein Bestandteil der Spaltsonde ist vorzugsweise ein einzelsträngiges Oligonucleotid von 6 bis 100 Nucleotiden Länge, vorzugsweise 10 bis 30 Nucleotiden Länge, um die Spezifität für die spezifische Nucleinsäuresequenz in der Zielnucleinsäure sicherzustellen. Die spezifische Nucleinsäuresequenz in der Zielnucleinsäure ist eine Basensequenz, die die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu spaltende Sequenz in der Zielnucleinsäure enthält, und kann willkürlich bestimmt werden. Wenn zum Beispiel eine doppelsträngige Nucleinsäure, die nicht gespalten werden soll, zusammen mit der zu spaltenden Zielnucleinsäure vorliegt, wird vorzugsweise eine Basensequenz als spezifische Nucleinsäuresequenz ausgewählt, die nur in der Zielnucleinsäure vorkommt (mit anderen Worten, in der anderen Nucleinsäure abwesend ist). Bezüglich der Basensequenz der Nucleinsäuresonde erlaubt die Auswahl von T und C oder 5-Methylcytosin als Basen, die in A-T- bzw. G-C-Paaren in der Zielnucleinsäure (doppelsträngige DNA) vorkommen, die Bildung eines stabilen Dreifachstrangs des Pyr-Pur-Pyr-Typs.
  • Die Zielnucleinsäure wird an der spezifischen Nucleinsäuresequenz gespalten, wenn sie nach der Zugabe der Spaltsonde in der Gegenwart von Spermin mit Licht einer spezifischen Wellenlänge bestrahlt wird. Bezüglich der Menge der Spaltsonde, die parallel mit der Zielnucleinsäure existiert, ist zu sagen, daß, obwohl die Spaltsonde gut arbeitet, wenn die Menge an Spaltsonde im Wesentlichen dieselbe ist wie die geschätzte Menge an Zielnucleinsäure, die Zielnucleinsäure effizient gespalten wird, wenn 10 bis 100-mal so viel an Spaltsonde verwendet werden. Die Menge (Endkonzentration) an Spermin, die man verwenden sollte, ist etwa 0,1 mM bis 1,0 mM, vorzugsweise etwa 0,5 mM.
  • Das Bestrahlungslicht ist nicht besonders eingeschränkt, so lange es Licht der spezifischen Absorptionswellenlänge des Interkalators enthält. Wenn zum Beispiel der Interkalator Oxazolgelb ist, kann Licht von 490 nm als das Licht der spezifischen Wellenlänge erwähnt werden.
  • Jetzt wird die Erfindung weiter im Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.
  • BEISPIEL 1 Herstellung von Oligonucleotiden
  • Die Oligonucleotide DS-1, TH-1, TH-2, TH-3 und TH-4 wurden mit einem kommerziellen DNA-Synthesegeräts hergestellt. Die Basensequenzen der entsprechenden Oligonucleotide sind nachstehend gezeigt.
  • Figure 00060001
  • Die Thiol modifizierten Oligonucleotide PU-1 und PY-1 (Nucleinsäuresonden) wurden mit einem DNA-Synthesegerät unter Verwendung eines kommerziellen Reagens (C6-ThiolModifier, Handelsname, Clontech) mit einem herkömmlichen Verfahren hergestellt. Die Tritylgruppe des kommerziellen Reagens (C6-ThiolModifier) wurde mit einem herkömmlichen Verfahren eliminiert. Die Basensequenzen von PU-1 und PY-1 sind nachstehend gezeigt.
  • Die Basensequenzen der entsprechenden Oligonucleinsäuren sind nachstehend gezeigt (* zeigt 5-Methylcytosin).
    PU-1: 5' -HS(CH2)6-OPO3-AGAGGGAGRGGAAAA-3'
    PY-1: 5' -HS(CH2)6-OPO3-TTTTC*C*TC*TG*C*C*TC*T-3'
  • BEISPIEL 2 Herstellung von Spaltnucleinsäuresonden
  • Das in Beispiel 1 hergestellte PU-1 wurde mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie mit einem herkömmlichen Verfahren gereinigt. Dithiothreit (10 μM, 20 μl) wurde zu der Fraktion zugegeben, die PU-1 enthielt, um Lösung A zu ergeben. Oxazolgelb (YO(CH2)3I), hergestellt, wie in der Literatur (Japanische Patentanmeldung JP7-185599, EP-A-713986, Nucleic Acids Research, 24(24), S. 4992-4997, 1996) offenbart, wurde zu einem flüssigen Gemisch von DMA (200 μl), 1,0 M Phosphatpuffer (pH 10,0, 300 μl) zugegeben und Wasser (500 μl) bis zur Sättigung zugemischt, um Lösung B zu ergeben.
  • Die Lösung A und die Lösung B wurden in einem Verhältnis von 3:1 gemischt, in der Anwesenheit von Argon 2 Stunden reagieren gelassen und für die Reinigung unter Verwendung von TEAA-Puffer, pH 7,0, der 5 % Acetonitril enthielt, als Elutionsmittel der Flüssigchromatographie durch eine Gelfiltrationssäule (Sephadex G-25, Pharmacia) unterworfen.
  • Das in Fraktionen isolierte YO-PY-1 wurde konzentriert, in destilliertem Wasser gelöst, und mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie auf herkömmliche Weise erneut gereinigt, und das YO-PU-1 in Fraktionen wurde unter reduziertem Druck zur Trockenheit evaporiert. Die Konzentration an YO-PU-1 wurde bei einer Absorption von 260 nm bestimmt.
  • Das in Beispiel 1 hergestellte PY-1 wurde einem ähnlichen Verfahren unterworfen, um YO-PY-1 zu ergeben. Die Basensequenzen der entsprechenden Nucleinsäuresonden sind nachstehend gezeigt (* zeigt 5-Methylcytosin). 1 ist ein Schema, das die Herstellung dieser Spaltnucleinsäuresonden (Interkalator verknüpfte Nucleinsäuresonden).
  • Figure 00070001
  • BEISPIEL 3 Bildung eines Doppelstrangs und Fluoreszenzmessung
  • Das in Beispiel 1 hergestellte DS-1 wurde zu Tris-HCl-Puffer (20 mM, pH 7,5, 50 μl) zugegeben, der YO-PU-1 (30 pMol) enthielt, und das resultierende flüssige Gemisch wurde für die Anlagerung auf 90°C erhitzt und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Dann wurde derselbe Tris-HCl-Puffer (500 ml), wie vorstehend erwähnt, zugegeben und die Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm gemessen. Die Resultate sind in 2 gezeigt.
  • Die 2 zeigt die spezifische Bindung der Spaltsonde an DS-1.
  • BEISPIEL 4 Bildung eines Dreifachstrangs und Fluoreszenzmessung
  • Das in Beispiel 1 hergestellte TH-1 und TH-2 wurde zu Tris-HCl-Puffer (20 mM, pH 7,5, 50 μl) zugegeben, und das resultierende flüssige Gemisch wurde für die Anlagerung auf 90°C erhitzt und auf Raumtemperatur abkühlen lassen, um eine doppelsträngige DNA zu bilden (eine Zielnucleinsäure). Die resultierende Zielnucleinsäure und YO-PY-1 wurden zu Tris-Acetatpuffer (25 mM, pH 5,1, 100 μl) zugegeben, der NaCl (50 mM), MgCl2 (20 mM) und Spermin (0,5 mM) enthielt, und bei 25°C 30 Minuten inkubiert. Dann wurde derselbe Tris-HCl-Puffer (500 ml), wie vorstehend erwähnt, zugegeben und die Fluoreszenz wurde bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm gemessen. Zum Vergleich wurde dasselbe Verfahren mit Spermin-freiem Puffer durchgeführt. Die Resultate sind in 3 gezeigt.
  • Von 3 ist offensichtlich, daß die Spaltsonde mit der Zielnucleinsäure spezifisch einen Dreifachstrang bildete und daß die Anwesenheit von Spermin bei seiner Bildung hilfreich war. Es wurde auch bestätigt, daß der fluoreszierende, interkalierende Farbstoff als Interkalator in der Spaltsonde bei Bildung des Dreifachstrangs die Fluoreszenz verstärkte.
  • BEISPIEL 5 Spaltung der Zielnucleinsäure
  • Das 5'-Ende von TH-3 oder TH-4, hergestellt in Beispiel 1, wurde unter Verwendung von T4 Polynucleotid-Kinase und [γ-32P]-ATP (mit 32P markiertes ATP) markiert. Der markierte Strang wurde mit dem unmarkierten, komplementären Strang gemischt, und das Gemisch wurde für die Anlagerung auf 90°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen, um eine doppelsträngige DNA (eine Zielnucleinsäure) zu bilden.
  • Die resultierende Zielnucleinsäure (4 mM, die etwa 100K CpM des markierten Strangs enthielt) wurde zu Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 5,8, 1 ml) zugegeben, der NaCl (50 mM), MgCl2 (20 mM), Spermin (0,5 mM) und 10 Äquivalente oder 100 Äquivalente an YO-PY-1 enthielt, dann bei 20°C 30 Minuten inkubiert und bei derselben Temperatur mit sichtbarem Licht bestrahlt.
  • Die DNA wurde aus dem flüssigen Gemisch durch Zugabe von Ethanol ausgefällt und unter reduziertem Druck getrocknet. Ein Teil der Probe, die 20K CpM des markierten Strangs enthielt, wurde auf einem 12 %-igen denaturierten Polyacrylamidgel bei 2000 V 3 Stunden der Elektrophorese unterworfen und dann auf einem Röntgenfilm der Autoradiographie unterworfen. Die Resultate sind in 4 bis 6 gezeigt.
  • Die Pfeile in den Figuren zeigen die Lage der Spaltstellen in der Zielnucleinsäure. Man kann sehen, daß die Spaltsonde die Zielnucleinsäure stellenspezifisch spaltete und daß die Zielnucleinsäure durch Auswahl der Basensequenz der Nucleinsäuresonde an einer willkürlichen Stelle (spezifische Nucleinsäuresequenz) gespalten werden kann.
  • Wie aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich ist, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren der spezifischen Spaltung einer doppelsträngigen DNA an einer spezifischen Nucleinsäuresequenz (einer willkürlichen Sequenz) bereit. Wegen ihrer Anwendbarkeit bei Sequenzen, die herkömmlichen Spaltverfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen nicht zugänglich sind, ist das Verfahren nicht nur auf solchen Gebieten wie der Clonierung von nützlichen Genen oder der Erforschung von unbekannten Genen von Nutzen, sondern auch in vielversprechenden Gebieten wie der Gendiagnose und Gentherapie.
  • Weil die doppelsträngige Ziel-DNA allein durch Zugabe der Spaltsonde zu der Probe und anschließende Belichtung von etwa 1 Stunde mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in der Gegenwart von Spermin gespalten werden kann, ist es gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere möglich, dem allgemeinen Bedarf an Geschwindigkeit und Einfachheit gerecht zu werden, und weil es keiner Durchführung, die eine Ausführung erfordert, bedarf, besteht keine Möglichkeit, daß verschiedene Durchführende verschiedene Resultate erhalten. Weil die DNA-Doppelstränge bis zur Bestrahlung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge nicht gespalten werden, ist es in der vorliegenden Erfindung außerdem möglich, willkürlich den Zeitpunkt der Spaltung auszuwählen, sogar wenn die Zielnucleinsäure neben der Spaltsonde vorliegt. Wenn zum Beispiel die Bestrahlung mit Licht nach der Bestätigung der Wanderung der Spaltsonde zu den Zellen erfolgt, die die Zielnucleinsäure enthalten, ist es möglich, die Zielnucleinsäure wirkungsvoll zu spalten, und die Anwendung in der Gentherapie ist zu erwarten. Weil es darüber hinaus möglich ist, willkürlich den Zeitpunkt der Spaltung auszuwählen, kann das Verfahren so geplant werden, daß ein Schaden für doppelsträngige DNA vermieden wird, die eine spezifische Nucleinsäuresequenz hat oder eine ähnliche Sequenz hat, die nicht gespalten werden soll.
  • Weil die mit dem Interkalator verknüpfte Nucleinsäuresonde, die bei der vorliegenden Erfindung als Spaltsonde verwendet wird, die Charakteristik hat, daß der Interkalator bei Hybridisierung der Sonde mit der Zielnucleinsäure die Fluoreszenzintensität erhöht, ist es zum Beispiel möglich, die Spaltsonde in Zellen in einem Gewebe einzubringen, das die Zielnucleinsäure enthält, und dann die Spaltsonde mit Licht einer spezifischen Wellenlänge, bevorzugt für die Spaltung in der vorliegenden Erfindung, zu bestrahlen, nachdem, basierend auf der Fluoreszenz von den Zellen, die Bindung der Spaltsonde an die Zielnucleinsäure bestätigt wurde.

Claims (1)

  1. Verfahren zum spezifischen Spalten einer doppelsträngigen DNA (einer Zielnucleinsäure) an einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, wobei das Verfahren das Bestrahlen einer Lösung, die mindestens die Zielnucleinsäure, eine Nucleinsäuresonde (ein einzelsträngiges Oligonucleotid), verbunden mit einem Interkalator, und 0,1 bis 1,0 mM Spermin enthält, mit Licht mit einer Absorptionswellenlänge des Interkalators umfasst, wobei der Interkalator ein fluoreszierender interkalierender Farbstoff ist.
DE69918010T 1998-08-31 1999-08-26 Methode zum Spalten von spezifischen Nucleinsäuresequenzen Expired - Lifetime DE69918010T2 (de)

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