DE69133392T2

DE69133392T2 - Verzweigungsmigration von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69133392T2
Application number: DE69133392T
Authority: DE
Inventors: James G. Wetmur; Robin S. Quartin; Dean L. Engelhardt
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1990-03-26
Filing date: 1991-03-15
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2011-03-16
Also published as: US6358685B1; DE69133392D1; EP0450370B1; EP0450370A1; US20050053926A1; CA2037349A1; CA2037349C; JPH0587A; US5958681A

Description

Diese Erfindung betrifft die Bildung von stabilen Verzweigungsmigrations-Strukturen und die verschiedenen Anwendungen dieser Strukturen.
Die Verdrängung eines Stranges einer doppelsträngigen Nucleinsäurwe durch einen anderen Einzelstrang mit einer identischen Nucleotidsequenz ist ein wohldokumentierter Aspekt der DNA- oder RNA-Replikation und der genetischen Rekombination in vivo. Verzweigungspunkte werden in Nucleinsäuren gefunden, die dieser An der Strang-Verdrängung unterworfen werden, bei der zwei Stränge um Basenpaarungs-Interaktionen mit komplementären Sequenzen eines dritten Strangs kompetitieren. Die Bewegung von Verzweigungspunkten entlang der Stränge der Nucleinsäuren, die Verzweigungsmigration bzw. Verzweigungswanderung, benötigt keine Wirkung von spezifischen Enzymen oder Proteinen.
Von dem Phänomen der Verzweigungsmigration in vitro in den renaturierten Molekülen von terminal repetitiver, zirkulär permutierter Bakteriophagen-DNA wurde zuerst durch Lee, Davis und Davidson [JMB 48: 1–22 (1970)] berichtet. Verzweigte Nucleinsäurestrukturen, die für die Untersuchung von Strang-Verdrängungen geeignet sind, können in vitro unter Verwendung von verschiedenen Hybridisierungsbedingungen konstruiert werden.
Die Verzweigungsmigration wurde verwendet, um DNA-RNA-Hybride zu bilden oder aufzulösen. In Lösungen ohne Formamid wird ein DNA-Strang RNA von einem DNA-RNA-Hybrid verdrängen. Diese Reaktion ist die Basis eines homogenen Nucleinsäure-Hybridisierungstest, der von Vary et al. von der Allied Corporation entwickelt wurde [Nuc. Acids Res. (1987) 15, 6883–6897 und US-Patent 4.795.701]. Bei diesem Test sind die RNAse-Spaltung des verdrängten RNA-Strangs, die Umwandlung von AMP in ATP und der Nachweis des Umwandlungsprodukts durch Chemilumineszenz unter Verwendung von Luciferase beteiligt. Das Verfahren nach Vary ist für die DNA-Clonierung nicht verwendbar.
In konzentrierten Formamid-Lösungen kann ein DNA-Strang durch RNA verdrängt werden, so dass eine R-Schleife gebildet wird [vgl. Thomas, M., White, R.L., & Davis, R. W. (1976) Proc. Nat. Acad. Sci., USA 73, 2294–2298]. Von der Konzeption her ist die R- Schleifenbildung der Verdrängung eines DNA-Strangs von dem Ende eines Doppelstrangs analog. Regionen doppelsträngiger DNA können komplementäre RNA-Sequenzen aufnehmen, um unter Bedingungen, bei denen RNA:DNA-Hybride stabiler sind, R-Schleifen zu bilden [Casey, J. und Davidson, N. (1977) NAR 4: 1539–1552). Die Anreicherung spezifischer DNA-Sequenzen wurde unter Verwendung von Schwimmdichte-Sedimentation zur Auswahl von R-Schleifen-Strukturen, die diese Sequenzen enthalten, ausgeführt. Das Verfahren der R-Schleifenbildung wurde nicht patentiert. Bis heute sind bei Anwendungen von R-Schleifen-Verfahren die teilweise Denaturierung der Ziel-DNA beteiligt, und dabei wurden noch keine Produkte erzielt, die direkt in Standard-Clonierungsvektoren cloniert werden können.
D-Schleifenbildung, die zur R-Schleifenbildung analog ist, kann zwischen einem DNA-Strang und einem superhelikalen DNA-Doppelstrang stattfinden [Radding, C. M., Beattie, K. L., Holloman, W. K., & Wiegand, R. C. (1977) J. Mol. Biol. 116, 825–839]. Diese Reaktion hängt von der freien Energie der Superhelix ab und wird damit nicht mit linearen DNA-Molekülen stattfinden. Es wurde kein Clonierungsverfahren, das auf dieser Beobachtung basiert, beschrieben. Die D-Schleifenbildung bei superhelikaler DNA wurde für spezifische Spaltung verwendet [Corey, D. R., Pei, D. & Schultz, P. G. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 8523–8525].
Es wurde ein Verfahren entwickelt, das RecA beschichtete Stränge zur Überwindung der Begrenzung der D-Schleifenbildung mit superhelikalen DNA-Molekülen verwendet [Rigas, B., Welcher, A.A., Ward, D.C., & Weissman, S.M. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9591–9595]. Die Markierung der einzelsträngigen Sonde mit biotinylierten Nucleotiden erleichtert die Reinigung der D-Schleifenprodukte dieser Reaktion durch Affinitätschromatographie. DNA-Hybride, die biotinylierte Nucleotide enthalten, haben geringere Schmelztemperaturen als unmodifizierte DNA-Hybride, d.h., Biotin hat eine destabilisierende Wirkung auf die Helix [Langer et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633–6637]. Bei diesem Verfahren benötigt die D-Schleifenbildung das Einführen eines Vorbehandlungsschritts zur Erleichterung der D-Schleifenbildung. Darüber hinaus ergibt das Verfahren keine Produkte, die direkt in existierende DNA-Clonierungsvektoren clonierbar sind.
Ein kurzer DNA-Strang, der mit einem längeren DNA-Strang hybridisiert, wird auch schnell von einem homologen, jedoch längeren überlappenden Strang in vitro verdrängt werden [vgl. Grenn, C. und Tibbetts, C. (1981) Nuc. Acids Res. 9, 1905–1918]. Diese Beobachtung bildet die Basis für diagnostische Tests für DNA- oder RNA-Sequenzen, die auf der Verzweigungsmigration und der DNA-Strangverschiebung, beschrieben in Collins et al. [Mol. & Cell. Probes 2: 15–30 (1988)], Vary et al. [Clin. Chem. 32: 1696–1701 (1986)], die . US-Patente 4.766.064 [Williams et al. (1988), Allied Corp.], 4.766.062 [Diamond et al. (1988), Allied Corp.] und 4.795.701 [Vary et al. (1988), Allied Corp.] sowie die Europäischen Patente 0167238 A1 [Collins et al. (1985), Allied Corp.] und 0164876 A1 [Collins et al. (1985), Allied Corp.] basieren.
Bei diesen Tests wird ein teilweise doppelsträngiger Sondenkomplex mit einer nachweisbaren Markierung auf einem der beiden Stränge hergestellt. Dieser Sondenkomplex wird dann mit einer Probe, die Zielnucleinsäuren (d.h. doppelsträngige Nucleinsäuren, die zumindest teilweise mit dem einzelsträngigen Abschnitt des Sondenkomplexes homolog sind) enthält, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Die Zielnucleinsäuren hybridisieren mit dem einzelsträngigen Abschnitt des Sondenkomplexes und durchlaufen eine Verzweigungsmigration, um den markierten Sondenstrang freizusetzen. Die Menge des markierten freigesetzten Strangs ist der Menge der Ziel-DNA in einer Probe proportional. Demnach ist bei dem Test die Verwendung eines zuvor gebildeten, teilweise doppelsträngigen Sondenkomplexes zur Förderung der Verzweigungsmigration beteiligt und der Test basiert auf der vorübergehenden Natur der Struktur mit Verzweigungsmigration und auf der totalen Freisetzung des markierten Sondenstrangs.
Bei diesen Tests könnte die Effizienz der Strang-Verdrängungsreaktion durch Zusetzen von Raum verdrängenden Reagenzien wie Polyether oder durch vorherige Behandlung des Ziels mit RecA-Proteinen verstärkt werden. Andere haben ebenfalls bemerkt, dass das RecA-Protein die Verzweigungsmigration fördert, die unidirektional in 3'→ 5'-Richtung abläuft [Cox, M. M. & Lehman, LR. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6018-6022]. Die diagnostischen Tests, die durch die Allied Corp. entwickelt wurden, verwenden vorgefertigte Doppelstränge, um eine Verdrängung zu fördern, und stehen in keiner Beziehung zu der Entwicklung von gentechnologischen Verfahren oder zur Stabilisierung der Verzweigungsmigrations-Struktur.
Demnach wurde das Phänomen der Verzweigungsmigration, eingeleitet durch die Bildung eines stabilen Hybrids, in der Literatur beschrieben. Obwohl die Bildung von verzweigten oder Schleifen-Strukturen für die Identifikation, Reinigung und die Anreicherung von DNA-Sequenzen verwendet wurde, wurde dieses Verfahren für die Entwicklung eines direkt clonierbaren Produkts nicht angewendet. Darüber hinaus würde die Stabilisierung von Verzweigungsmigrations-Strukturen die Wirksamkeit von Verfahren verstärken, bei denen die Sammlung oder Identifikation dieser Einheiten beteiligt wären. Über einfache Verfahren zur Herstellung von stabilen Verzweigungsmigrationsstrukturen wurde von anderen nicht berichtet.
Versuche, welche vor mehr als 20 Jahren beschrieben wurden, zeigten, dass die Substitution von Bromin an der Stelle C5 von Pyrimidinen zu einer erhöhten Stabilität bei Doppelsträngen führt [Michelson et al. (1967) Prog. Nuc. Acid Res. & Mol. Bio. 6: 84–141]. Radding et al. [J. Biol. Chem. 116: 2869–2876 (1962)] zeigten, dass dG-BrdC ein thermisch stabileres Basenpaar ist als dG–dC. In einer anderen Studie hatte dI:Poly-BrdC eine Schmelztemperatur, welche 26°C höher war als bei Poly-dI:Poly-dC [Inman & Baldwin (1964) J. Mol. Bio. 8: 452–469], und es wurde des Weiteren gezeigt, dass Poly-BrdC Poly-dC von einem Poly-dI:Poly-dC-Doppelstrang verdrängte, um einen neuen Doppelstrang mit PolydI zu bilden [Inman J. Mol. Bio 9: 624–637 (1964)]. Diese Beobachtungen wurden nicht bei der Stabilisierung von Verzweigungsmigationsstrukturen durch Verdrängerstränge, die modifizierte Nucleotidbasen enthalten, angewendet.
Tatsumi und Strauss [Nuc. Acids Res. 5: 331–347 (1978)] markierten DNA in vivo in menschlichen Lymphoidzellen mit Bromdesoxyuridin (BrdUrd) und beobachteten einen hohen Grad an Verzweigungsmigration nach, Isolation und Scheren der DNA. Diese Wissenschaftler stellten die These auf, dass dieser hohe Grad der Verzweigungsmigration die erhöhte Stabilität von Helices, die BrdUrd enthalten und das Abfangen der Verzweigungsmigrations-Konfiguration widerspiegelt. Ihre Ergebnisse lassen des Weiteren annehmen, dass mit Halogenatomen substituierte Verzweigungsmigrationsstrukturen relativ stabil sind, wenn sie einmal gebildet sind. Tatsumi und Strauss untersuchten das Phänomen der Verzweigungsmigration in vitro nicht und verwendeten in ihren Versuchen keine synthetischen Oligo- oder Polynucleotide, die mit halogenierten Nucleotiden, d.h., vormodifizierten Verdrängersträngen markiert waren, und konnten die Verzweigungsmigrationsstrukturen, die sich aus ihren Versuchen ergaben, zum Zweck der Clonierung oder der Mutagenese nicht verwenden.
Momentan werden spezifische DNA-Fragmente, die von genomischer DNA abstammen, normalerweise unter Verwendung von Southern-Blot-Analyse der Restriktionsenzym-Abbauprodukte dieser genomischen DNA identifiziert. Southern-Blot-Analyse von DNA ist ein mehrstufiges Verfahren, bei dem im Allgemeinen die Verwendung von Radioisotopen und Autoradiographie für die Identifikation der Fragmente nach der Elektrophorese sowie der Transfer der durch Elektrophorese aufgetrennten Produkte auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran und die Hybridisierung der überführten Produkte mit sequenzspezifischen DNA-Sonden beteiligt sind. Verfahren, die eine gleichzeitige Markierung und Identifikation spezifischer DNA-Fragmente bereitstellen, wären bedeutend einfacher, schneller und billiger als Southern-Blot-Analysen und hätten auf dem Gebiet der Gentechnologie eine bedeutende Auswirkung.
Die Markierung von DNA-Sequenzen hat zum Einschluss von modifizierten Nucleotiden an internen oder externen Positionen geführt. Dies wird oft enzymatisch unter Verwendung von Nucleotiden, die mit kleinen Verbindungen wie Biotin, Sulfhydrylgruppen, Quecksilber, Allylamin und Digoxigenin markiert sind, erreicht. Die Anreicherung oder Reinigung dieser markierten Nucleinsäuren kann unter Verwendung von Affinitätschromatographie durchgeführt werden. Zum Beispiel kann biotinylierte DNA, einschließlich D-Schleifen, selektiv an feste Matrizen, die Avidin- oder Streptavidingruppen tragen, gebunden und eluiert werden, wie von Ward und seinen Mitarbeitern berichtet wurde [Langer, op. cit.]. Auf ähnliche Weise kann DNA, welche mit Sulfhydrylen markiert ist, durch Affinitätschromatographie auf merkurierter Agarose gereinigt werden, und merkurierte DNA kann basierend auf ihrer Affinität für Sulfhydrylgruppen gereinigt werden. Die Anreicherung von mRNA aus den gesamten RNA-Populationen kann basierend auf der Affinität der PolyA-Schwänze auf den Boten-RNAs für Oligo-dT-Matrizen durchgeführt werden. Nach ihrer Reinigung werden diese angereicherten oder gereinigten Nucleinsäuresequenzen oft weiter einer Reihe von Verfahren unterzogen, die sie clonierbar machen. Markierungsverfahren, die eine Sequenzanreicherung oder Reinigung durch Affinitätschromatographie und dann das direkte Clonieren dieser angereicherten oder gereinigten Fraktionen erlauben, würden gegenüber anderen vorhandenen Verfahren bedeutende Vorteile haben.
Die Identifikation oder Anreicherung eines spezifischen Untersatzes von Nucleotidsequenzen oder von DNA-Fragmenten in isolierter genomischer DNA oder den Gesamtpopulationen an RNA, mit der bestimmten Absicht, diese Sequenzen oder Fragmente zu clonieren, wurde durch verschiedene Verfahren bewirkt, die jene umfassen, die die Auswahl von DNA-Fragmenten, die in der Lage sind, eine Verzweigungsmigration, eine R-Schleifen- oder D-Schleifenbildung zu durchlaufen, einbeziehen, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die selektive Clonierung von Fragmenten in einer Population wurde basierend auf Restriktions-Spaltstellen von Endonucleasen, vor allem von jenen, die eine einzigartige Stelle [Brown, N. L. & Smith, M. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3213–3216] und Größe [Thoma, M., Cameron, J.R. & Davis, R.W. (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 4579–4583] erkennen, erreicht. Obwohl diese Strategien umfassend und erfolgreich verwendet wurden, um eine große Vielfalt an Genen zu clonieren, sind sie nicht universal und haben eine begrenzte Spezifität.
Eine andere Anwendung von gentechnologischen Verfahren betrifft die Modifikation von genetischem Material wie dem Zusetzen oder dem Entfernen von Nucleotidbasen wie zum Beispiel für therapeutische Zwecke. Anstrengungen, genetisches Material entweder zu ersetzen, zu inaktivieren oder zu modifizieren, sind momentan in der Entwicklung. Bei höheren eukaryontischen Organismen haben die angewendeten Ansätze es bis jetzt erforderlich gemacht, dass die Mittel, die dazu verwendet wurden, dass diese Veränderungen stattfinden, in verschiedene Plasmidvektoren eingeschlossen werden, die alle oder einen Teil verschiedener viraler Genome enthalten. Ortsgerichteter Gen-Ersatz wurde bei niederen Eukaryonten wie Hefen durchgeführt. Ein ernsthaftes Abschreckungsmittel zur therapeutischen Manipulation von menschlichem genetischen Material in vivo betrifft den Mangel an einem geeigneten, gutartigen Vektorsystem. Die Fähigkeit, eine gezielte Lieferung und Inkorporation von genetischem Material in chromosomale DNA durchzuführen, ohne einen viralen Vektor zu benutzen, würde einen größeren Fortschritt auf dem Gebiet der Gentherapie darstellen.
Green und Tibbetts [op. cit.] drückten ein Interesse an der Verwendung von verzweigten DNA-Strukturen für ortsgerichtete Mutagenese in vitro aus und waren in der Tat in der Lage, stabile D-Schleifen-Strukturen in superhelikaler DNA für die Ziel-Deletions-Mutagenese zu verwenden [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 2455–2459 (1980)]. Sie waren nicht in der Lage, dieses Ziel mit linearen Ziel-DNA-Molekülen unter Verwendung der Verzweigungsmigrationsstrukturen, die sie von der in vivo-Markierung von Zellen mit Brd-Urd erhielten (vgl. Green und Tibbetts, 1981, op. cit.), auf Grund der kurzen Halbwertszeiten ihrer verzweigten Strukturen zu erreichen.
Es wurde eine ortsspezifische genetische Manipulation beschrieben [Capecchi, M. R. (1989) Science 244, 1288–1292], bei der ein kleiner Abschnitt der DNA, die in das Wirtsgenom integriert wird, durch homologe Rekombination auf die erwünschte Ziel-DNA gerichtet ist. Unglücklicherweise finden die zusätzlichen Ereignisse der Integration zufällig statt und können Gene inaktivieren oder aktivieren, was schädliche Konsequenzen zur Folge hat. Von DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, eine Dreifachhelix-Bildung zu initiieren, wurde berichtet [Francois, J. C., Saison-Behmoaras, T. Thoung, N.T. & Helene, V. (1989) Biochemistry 28, 9617–9619; Povsic, T. J. & Dervan, P. B. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 3059–3061]. Die Verwendung einer Dreifachhelix-Bildung als zusätzliches Ereignis zur ortsspezifischen genetischen Manipulation ist auf dem Fachgebiet unbekannt.
WO-A-8701730 offenbart ein Verfahren zur Stabilisierung eines Komplexes zwischen einem Strang eines doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotids und einer mindestens teilweise komplementären Verdrängersequenz, wobei die Stabilisierung durch den Einschluss von RecA-Protein in den verdrängenden Strang erreicht wird.
Loewy et al. ((1989) Gene 83, 367–370) stellen ein Verfahren zur Transkription eines DNA-Segments in hohem Ausmaß unter Verwendung von Bakteriophagen-RNA-Polymerasen zur Verfügung, wobei ein Promotor verwendet wird, der aus einem synthetischen doppelsträngigen Promotor und einer kurzen, einzelsträngigen Verlängerung für die Verknüpfung des Promotors durch Hybridisierung mit der Zielsequenz und Lieferung der Verlängerung mit ihrer komplementären einzelsträngigen Zielsequenz aufgebaut ist.
WO-A-8911548 offenbart immobilisierte Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, an einen Oligo-Doppelstrang zu binden, der eine hybridisierende Region und Pyrimidinbasen als Spacer umfasst, um die hybridisierende Region an einen festen Träger zu binden.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das nicht-stabile Verzweigungsmigrations-Nucleinsäurekomplexe stabilisiert. Diese Aufgabe wird durch die Verfahren, wie sie in den Patentansprüchen offenbart werden, erreicht.
In seinen allgemeinsten Begriffen betrifft unsere Erfindung Verfahren, die die Wahrscheinlichkeit bestimmter Reaktionstypen, die auf eine erwünschte Weise ablaufen, erhöhen. Unsere Verfahren fördern die Reaktionsspezifität und stellen

einfache Verfahren zur Herstellung von stabilen Verzweigungsmigrations-Strukturen;
Verfahren zur gleichzeitigen Markierung und Identifizierung von spezifischen DNA-Fragmenten, die bedeutend einfacher, schneller und billiger sind als Southern-Blot-Analysen;
Markierungsverfahren, die eine Sequenzanreicherung oder eine Reinigung durch Affinitätschromatographie und selektives Clonieren erlauben;
ein Verfahren zur Durchführung von zielgerichteter Lieferung und zielgerichtetem Einschluss von genetischem Material in chromosomale DNA, ohne die Verwendung eines viralen Vektors zur Verfügung.

Die Verzweigungsmigration ist das Verfahren, bei dem ein einzelner Nucleinsäurestrang inseriert wird und mindestens einen Abschnitt eines Strangs eines Nucleinsäuredoppelstrangs ersetzt. Die Verzweigungsmigration ist ein nützliches Verfahren für die sequenzabhängige Anheftung (Einfangen) eines Oligodesoxynucleotid-Doppelstrangs, das einen einzelsträngigen Schwanz enthält, an das Ende eines Desoxynucleotid-Moleküls oder für den sequenzabhängigen Einschluss eines Oligodesoxynucleotids in ein Desoxynucleotid-Molekül an einer anderen Stelle als dem Ende. Bestehende Verfahren benötigen vor der Initiierung der Verzweigungsmigration die Bildung eines stabilen Hybrids; unser Verfahren erlaubt die Initiierung und Bildung eines Verzweigungsmigrations-Komplexes ohne vorherige Stabilisierung. Wir haben dieses Ergebnis durch Stabilisierung des entstehenden Verzweigungsmigrations-Komplexes gleichzeitig mit der Bildung oder danach oder beidem erzielt.
Unser spezifisches Anheftungsverfahren kann verwendet werden, um (A) ein bestimmtes Fragment zum Nachweis zu markieren, ohne Blot-Verfahren und nachfolgende Hybridisierung, und (B), um ein bestimmtes Fragment für die Affinitätschromatographie zu markieren, (C), um die Clonierung durch Einführen eines neuen 5'- oder 3'-Überhangs, der mit einer Restriktions-Endonucleasestelle in einem Clonierungs-Vektor kompatibel ist, zu ermöglichen, oder (D) für andere Zwecke, die aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich werden.
Die verschiedenen Verfahren und Materialien unserer Erfindung benötigen eine Verdrängungs-Einheit, die zumindest teilweise mit einem Ziel komplementär ist und in der Lage ist, daran zu binden. Sowohl der Verdränger als auch das Ziel sind Oligo- oder Polynucleotidsequenzen, die entweder synthetisch sind oder natürlich vorkommen. Unser neuer Verdränger kann in bestimmten Ausführungsformen unserer Erfindung als einzelsträngige Einheit verwendet werden; in anderen Ausführungsformen wird er als teilweise doppelsträngige Einheit, die mit einem Linker-Strang hybridisiert ist, verwendet.
Eine Ausführungsform unserer Erfindung stellt einen neuen Verdränger-Linker-Doppelstrang und ein verbessertes Verfahren zur Anheftung einer Desoxynucleotid-Verdrängersequenz an einen Strang eines Ziel-Desoxynucleotid-Doppelstrangs zur Verfügung.
Das verbesserte Verfahren der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz und einer Verdrängersequenz aus einzelsträngiger DNA, wobei die Verdrängersequenz zumindest teilweise komplementär ist zu einem solchen Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz, dadurch charakterisiert, dass der Komplex durch Bildung eines DNA-Dreifachstrangs zwischen der Verdrängersequenz und dem Empfänger-Doppelstrang stabilisiert ist.
Ebenfalls eingeschlossen ist ein Verfahren zur Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz und einer Verdrängersequenz aus einzelsträngiger DNA, wobei der Verdrängerstrang zumindest teilweise komplementär ist zu einem solchen Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz und eine Nucleotidsequenz sowie eine sequenzsspezifische DNA-Bindungseinheit umfasst, die den Empfänger-DNA-Doppelstrang an der Stelle, an der sie anheftet, nicht deutlich zum Schmelzen bringt.
Das verbesserte Verfahren der Erfindung umfasst des Weiteren ein Verfahren zur Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz und einer Verdrängersequenz aus einzelsträngiger DNA, wobei die Verdrängersequenz zumindest teilweise komplementär zu einem solchen Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz ist, dadurch charakterisiert, dass der Komplex stabilisiert wird, wobei die Verdrängersequenz mit einem Linker in einem Verdränger-Linker-Doppelstrang einen Doppelstrang bildet, wobei der Verdränger-Linker-Doppelstrang zwei Stränge umfasst;

a. einen Verdrängerstrang, bei dem ein Abschnitt Nucleotide umfasst, die zu einem Strang eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs komplementär sind, und einen Abschnitt, der eine Sequenz umfasst, die zu einem Linker-Strang komplementär ist und mit ihm hybridisiert, sowie
b. einen Linker-Strang, der zu dem Verdrängerstrang komplementär ist und mit ihm hybridisiert;

Die Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger-Linker-Doppelstränge unserer Erfindung sind ein Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger-Linker-Doppelstrang, der in der Lage ist, die Verzweigungsmigration am Ende einer Empfänger-Polydesoxynucleotid-Sequenz ohne vorherige Bildung eines stabilen Hybrids mit einem solchen Empfänger- Polydesoxynucleotid-Doppelstrang zu initiieren, wobei der Verdränger-Linker-Doppelstrang zwei Stränge umfasst:

a. einen Verdränger-Strang, von dem ein Abschnitt Nucleotide umfasst, die zu einem Strang eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs komplementär sind, und einen Abschnitt, der eine Sequenz umfasst, die zu einem Linker-Strang komplementär ist und mit ihm hybridisiert, und
b. einen Linker-Strang, der zu dem Verdränger-Strang komplementär ist und mit ihm hybridisiert, worin mindestens eines der Nucleotide, die mit einem Strang des Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs komplementär sind, modifiziert ist, um die Stabilität des Hybrid-Verdränger-Empfänger-Doppelstrangs zu erhöhen oder um die Schmelztemperatur des Hybrid-Verdränger-Empfänger-Doppelstrangs zu erhöhen.

Die sequenzabhängige Anheftung (Einfangen) eines Oligodesoxynucleotid-Doppelstrangs, der einen einzelsträngigen Schwanz enthält, kann durch Verzweigungsmigration in das Ende eines DNA-Moleküls beeinflusst werden. Unser neuer Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger-Linker-Doppelstrang ist in der Lage, eine Verzweigungsmigration am Ende eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs ohne vorherige Bildung eines stabilen Hybrids mit einem solchen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang zu initiieren. Genauer, diese neuen Doppelstränge können an einer Restriktions-Endonuclease-Spaltstelle, insbesondere benachbart zu einer einzelsträngigen 3'- oder 5'-Verlängerung auf einem Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang, mit einer Verzweigungsmigration hybridisieren und sie initiieren.
Die Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden im Abschnitt des Verdrängerstrangs, der zu dem Empfänger komplementär ist, erhöht die DNA-DNA-Hybrid-Stabilität. Oligonucleotide, die das modifizierte Nucleotid enthalten, verdrängen nicht modifizierte Nucleotid enthaltende Stränge von den Enden der Doppelstränge. Im Fall von 3'- oder 5'-Überhängen liegt die Verdrängungsrate in derselben Größenordnung wie bei der Kernbildungsreaktion der erneuten DNA-Assoziierung.
Wir stellen auch einen Verdränger zur Verfügung, der nicht mit einem Linker-Strang hybridisiert und der in der Lage ist, eine Dreifach-Helixbildung zu initiieren. Dieser Typ von Verdrängern umfasst

1. eine erste Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifach-Helixbildung zu initiieren und die a) mindestens sechs aufeinanderfolgende Pyrimidinbasen oder b) mindestens sieben Basen, wobei mindestens sechs Basen Pyrimidinbasen sind und die siebte Base Guanin ist, umfasst, sowie ,
2. eine zweite Sequenz benachbart zu dieser ersten Sequenz, die a) komplementär zum zweiten Strang des Empfänger-Doppelstrangs ist und antiparallel zu ihm verläuft und b) die in der Lage ist, eine Verzweigungsmigration in der Nähe der Dreifach-Helix zu initiieren, wobei die zweite Sequenz von der ersten Sequenz durch 1 bis 5 dazwischen liegende Einheiten getrennt ist, die kovalent an einen interkalierenden Stoff gebunden sind.

Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls einen Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger, der in der Lage ist, an einen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang zu binden, wobei der Verdränger

(a) eine erste Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifach-Helixbildung zu initiieren und die (1) mindestens sechs aufeinanderfolgende Pyrimidinbasen oder (2) mindestens sieben Basen, bei welchen mindestens sechs der Basen Pyrimidinbasen sind und die siebte Base Guanin ist, umfasst, sowie
(b) eine zweite Sequenz benachbart zur ersten Sequenz, die zu dem zweiten Strang des Empfängerdoppelstrangs komplementär ist und antiparallel dazu verläuft, und die in der Lage ist, eine Verzweigungsmigration in der Nähe der Dreifachhelix zu initiieren; umfasst

Wir offenbaren des Weiteren Verdränger, die Nuclease-resistent sind sowie das Verfahren zur Modifizierung eines Empfänger-Doppelstrangs, um dem Doppelstrang eine Nuclease-Resistenz zu verleihen. Diese Verdränger enthalten mindestens eine Einheit, die an ein Ende des Oligo- oder Polynucleotids angeheftet ist, wobei die Einheit dem Ende, an das sie angeheftet ist, eine Endonucleaseresistenz verleiht.
Wie zuvor ausgeführt, fanden wir es wünschenswert, in einer Ausführungsform mindestens eines der Nucleotide in dem Verdrängerstrang, der zumindest teilweise zu einem Strang des Empfänger-Polydesoxynucleotiddoppelstrangs komplementär ist, zu modifizieren. Das Nucleotid wird auf eine Weise modifiziert, die die Stabilität des Hybrid-Verdränger-Empfänger-Doppelstrangs erhöht.
Zusätzlich zu Stabilität erhöhenden Modifikationen fanden wir es nützlich, modifizierte Nucleotide in den Verdränger oder den Linker einzuschließen, die einen Nachweis des Verdränger-Empfänger-Hybrids oder seine Isolation durch Affinitätschromatographie erlauben.
Ein anderer Aspekt unserer Erfindung ist die Hybridstruktur, die gebildet wird, wenn der Verdränger- oder der Verdränger-Empfänger-Doppelstrang an das Ziel angeheftet ist. Dort, wo das Hybrid das Ergebnis der Anheftung des Ziels an unseren neuen Verdränger-Linker-Doppelstrang ist, ist der Linker-Strang vorzugsweise kovalent an einen der Stränge des Empfänger-Doppelstrangs gebunden.
In einer Version unserer Erfindung wird die Hybrid-Struktur, die die angeheftete Verdrängersequenz von einzelsträngigem Desoxynucleotid enthält, am wünschenswertesten durch die Gegenwart von mindestens einem modifizierten Nucleotid in dem Verdrängerstrang stabilisiert, was am meisten wünschenswert ist.
Wir offenbaren ebenfalls eine markierte Hybridstruktur. Diese markierte Hybridstruktur, die unseren Verdränger-Linker einschließt, ist in vielen biochemischen Verfahren nützlich, zum Beispiel um das Einfangen der Verdränger-Empfänger-Hybride durch Affinitätschromatographie zu ermöglichen, um ein Ende einer clonierten Desoxynucleotid-Insertion in einem Vektor zu markieren, um die Kartierung einer Restriktions-Endonuclease einer Insertion zu ermöglichen, um die selektive Clonierung eines Empfänger-Polynucleotid-Doppelstrangs zu ermöglichen und um die Isolierung von Clonen aneinandergrenzender Polydesoxyribonucleotide zu ermöglichen. Das Hybrid, das den Verdränger einschließt, ist bei der Affinitätschromatographie und für die Durchführung 1] des Nachweises von spezifischen Oligo- oder Polynucleotiden und 2] der ortsspezifischen genetischen Manipulation von Nutzen.
Bei unseren Verfahren ist die Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz und einer Verdrängersequenz aus einzelsträngiger DNA beteiligt, wobei die Verdrängersequenz zumindest teilweise komplementär ist zu einem solchen Strang einer Empfänger-Polydesoxyribonucleotidsequenz. Der Komplex kann durch

a) Bildung eines DNA-Dreifachstrangs zwischen der Verdrängersequenz und Empfänger-Doppelstrang, ggf. dem durch Einschluss von mindestens einem modifizierten Nucleotid in den Verdrängerstrang zur Stabilisierung,
b) Bereitstellen eines Verdrängerstrangs, umfassend eine Nucleotidsequenz und eine sequenzspezifische DNA-Bindungseinheit, die den Empfänger-DNA-Doppelstrang an der Stelle, an der sie bindet, nicht signifikant zum Schmelzen bringt,
c) Anheften des Verdrängers an einen Linker vor oder gleichzeitig mit der Anheftung an den Ziel-Doppelstrang und danach kovalente Anheftung des Linkers an den zweiten Strang des Ziel-Doppelstrangs, ggf. durch Einschluss von mindestens einem modifizierten Nucleotid in den Verdrängerstrang zur Stabilisierung, oder
d) eine Kombination der Verfahren b) und c) stabilisiert werden.

1(A) stellt eine Restriktionskarte von pALA-D dar. R = Rsal, P = PstI. Die Fragmente A–D sind oberhalb der Zeile markiert, die Nucleotid-Längen sind darunter angezeigt. Es gibt eine einzelne Smal-Stelle in Fragment D.
1(B) zeigt eine Verzeigungsmigration von Verdränger (offenes Rechteck), der an einen Linker gebunden ist (ausgefülltes Rechteck), in einen Empfänger-Doppelstrang mit einem 3'-Überhang von vier Basen (PstI-Ende von Fragment B). Unterhalb wird die Konversion zwischen dem Doppelstrang, der nur an den 3'-Überhang gebunden ist (links) und der vollständigen Verzweigungsmigration folgt (rechts), gezeigt.
1(C) stellt die maximale Verdrängung mit spezifischen pALA-D-Fragmenten dar. m = die maximale Anzahl an Basenpaaren, die zwischen dem Verdränger und dem komplementären Empfänger-Strang gebildet werden können.
2 stellt die Einfangreaktion von P-D-BrdC plus P-L-dC dar. UV-Fluorogramm von 1 % Agarosegel. Bahn 1: durch RsaI/PstI gespaltenes pALA-D (200 mg). A, B, C und D beziehen sich auf Fragmente, die in 1 gezeigt werden. Bahnen 2–9: Produkte, die aus einer Ligierung in Gegenwart von P-D-BrdC (6 μg/ml), P-L-dC (2 μg/ml) und 5 U / ml Ligase für 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 bzw. 128 min resultieren.
3 stellt das Autoradiogramm von 2 dar. Die Bahnen 1–8 entsprechen den radiomarkierten Bahnen 2–9 aus 2.
4(A) stellt ähnlich wie in 3 ein Autoradiogramm dar, jedoch mit höherer Ligasekonzentration und P-D-dC, welches P-D-BrdC ersetzt.
4(B) stellt einen frühen Zeitpunkt in einem Autoradiogramm, welches zu dem aus 3 identisch ist, dar, wobei P-D-BrdC-E(10), welches P-D-BrdC ersetzt, verwendet wird.
4(C) stellt ein Autoradiogramm dar, welches zu dem aus 3 identisch ist, mit der Ausnahme, dass P-D-BrdC-E(24), welches P-D-BrdC ersetzt, verwendet wird.
5 stellt das Autoradiogramm eines Sequenzierungsgels dar, das die Region von eingeschlossenen Verdränger- (fett) und Linker- (unterstrichen) Sequenzen zeigt.
6 stellt BCR unter Verwendung von pALA-D-G4 dar, einem Derivat von pMS19, das ein Genomfragment von menschlicher ALA-D enthält, sowie Verdränger-Linker-Doppelstrang S-D-BrdC und S-L-dC, gefolgt von teilweiser Spaltung mit Sau3A1. Bahnen 1, 2, 3, 4, 5 und 8: teilweise Abbauprodukte, gebildet in den Minuten 1, 2, 3, 4, 5 beziehungsweise 8. Die Banden a–k sind partielle Abbau-Banden der erwarteten Größen: 300, 406, 1538, 1598, 2706, 2731, 2748, 3198 beziehungsweise mehrere große Banden, die durch Stellen innerhalb des Vektors hergestellt werden.
7 stellt ein durch einen Dreifach-Strang verstärktes, durch Verzweigungsmigration vermitteltes Einfangen eines Linkers dar. Bahnen 1–6: pMS 19, geschnitten mit NciI und SaII, mit BT-D-MedC-1, BT-L-dC-1 und T4-DNA-Ligase, wie im Text beschrieben, für 0,1, 3, 10, 30 und 120 min inkubiert. Bahn 7: Molekulargewichtsmarker von Lambda-DNA, geschnitten mit AvaII Bahnen 8–13: pMS 19, geschnitten mit NciI und SaII, mit BO-D-MedC-1, BT-L-dC-1 und T4-DNA-Ligase, wie im Text beschrieben, für 0,1, 3, 10, 30 und 120 min inkubiert.
Unser Verfahren erlaubt die Initiierung und Bildung eines Verzweigungsmigrations-Komplexes ohne vorherige Stabilisierung. Wir haben dieses Ergebnis durch Stabilisierung des entstehenden Verzweigungsmigrations-Komplexes gleichzeitig mit der Entstehung oder danach oder beidem erreicht.
In einer Ausführungsform unserer Erfindung werden ein Verdränger, ein Linker, ein Verdränger-Linker-Doppelstrang sowie ein verbessertes Verfahren zur Anheftung einer Desoxynucleotid-Verdrängersequenz an das Ende eines Strangs eines Ziel-Desoxynucleotid-Doppelstrangs unter Verwendung von Verzweigungsmigration verwendet, um Verzweigungsmigrations-Komplexe herzustellen. Für dieses Verfahren wird die Verwendung von Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger-Linker-Doppelsträngen benötigt, die aus zwei Strängen bestehen: einem Verdränger-Strang und einem Linker-Strang.
Der Verdränger-Strang des Verdränger-Linker-Doppelstrangs enthält eine Sequenz von Nucleotiden, die zumindest teilweise komplementär ist zu einem Linker-Strang. Der Verdränger-Strang ist in der Lage, mit dem Linker-Strang zu hybridisieren, und hat einen Überhang an seinen 3'- oder 5'-Ende oder an beiden Enden. Der Überhang an einem Ende des Verdränger-Strangs wird eine Desoxynucleotidsequenz enthalten, die zumindest teilweise komplementär ist zu einem Strang eines Polydesoxynucleotid-Empfänger-Doppelstrangs.
Die Gegenwart eines unkorrekten (nicht-komplementären) Nucleotids im Abschnitt des Verdrängerstrangs, der zumindest teilweise komplementär zu dem Doppelstrang ist, begrenzt die Verzweigungsmigration jenseits des Punktes der fehlenden Übereinstimmung. Demnach muss der anfängliche Abschnitt des Überhangs des Verdrängerstrangs zum Empfängerstrang komplementär sein und diese Komplementarität zu dem Empfänger muss sich über eine ausreichende Anzahl an Nucleotidbasen erstrecken, um die Bildung von mindestens einem Übergangs-Verzweigungsmigrations-Komplex mit dem Empfänger-Doppelstrang, der für die Bildung notwendig ist, zu gewährleisten. In der Übergangs-Verzweigungsmigrations-Struktur nimmt die Stabilität der Struktur in dem Maß zu, wie die Anzahl der Basen zunimmt. Es gibt keine minimale Anzahl an Basen, die für die Initiierung und Bildung der Verzweigungsmigrations-Struktur notwendig ist. Es ist wünschenswert, dass mindestens die ersten drei (3) Basen, bevorzugt mindestens die ersten fünf (5) Basen zu dem Empfänger komplementär sind.
Das entgegengesetzte Ende des Verdrängerstrangs kann im Hinblick auf den Linker-Strang nach Hybridisierung damit stumpf sein, oder entweder der Verdrängerstrang oder der Linker-Strang kann einen Überhang haben. In einer Ausführungsform wird entweder der Linker- oder der Verdrängerstrang einen Überhang haben, der zu einem Überhang komplementär ist, der aus der Spaltung durch eine Restriktions-Endonuclease entsteht.
Der Linker-Strang kann jede Größe haben, nur vorausgesetzt, er ist groß genug, um mit dem Verdränger zu hybridisieren. Es ist wünschenswert, dass der Linker im Bereich von 10–20 Basenpaaren Länge liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform unserer Erfindung ist ein Ende des Linkers mit einem Strang des Empfängers kovalent verbunden, nachdem die Verzweigungsmigration abgelaufen ist.
Der Verdrängerstrang kann vor oder nach der Reaktion des Verdrängers mit dem Empfänger an den Linker-Strang hybridisiert werden.
Wie vorstehend festgestellt, wird eine vorherige Bildung eines stabilen Hybrids zwischen unseren Verdrängern und einem Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang nicht benötigt. Jeglicher Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger-Linker-Doppelstrang, der in der Lage ist, eine Verzweigungsmigration am Ende eines Polydesoxynucleotid-Empfänger-Doppelstrangs zu initiieren, kann in unserem Verfahren verwendet werden. Ist die Verzweigungsmigration einmal initiiert, werden unsere Stabilisationsverfahren, die gleichzeitig mit oder nach der Bildung der Verzweigungsmigrationsstruktur stattfinden, den Komplex in seiner verzweigten Form aufrechterhalten.
Unsere Verdränger-Linker-Doppelstränge sind in der Lage, eine Verzweigungsmigration an jeder Art von Ende eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs wie zum Beispiel stumpfen Enden oder Enden, die durch mechanisches Scheren gebildet werden, einzurichten. In bevorzugten Ausführungsformen hybridisieren unsere neuen Doppelstränge eine Verzweigungsmigration an einer Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstelle und initiieren sie, am wirkungsvollsten neben einer einzelsträngigen 3' oder 5'-Verlängerung auf einem Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang.
Wir haben nachgewiesen, dass die Modifikation der Nucleotide in der Sequenz des Verdrängers, der zumindest teilweise komplementär zu dem Ziel ist, die Stabilität des Verzweigungsmigrationskomplexes erhöht. Diese Modifikationen, die die Assoziationskonstante mit dem komplementären Desoxynucleotid um mindestens etwa 20 Prozent erhöhen, liefern nützliche Ergebnisse. Wir ziehen jene Modifiaktionen vor, die die Assoziationskonstante um mindestens etwa 70 Prozent erhöhen.
Um den Komplex gleichzeitig mit seiner Bildung zu stabilisieren, werden eines oder mehrere, vorzugsweise mindestens etwa 10 Prozent der Nucleotide in der Sequenz des Verdrängers, der zumindest teilweise mit dem Ziel komplementär ist, modifiziert.
Spezifische Modifikationen, von denen wir herausgefunden haben, dass sie in unserer Erfindung gut wirken, umfassen jene, ausgewählt aus erten Pyrimidin-Nucleotiden, 5-Methyldesoxycytidin, Diaminopurin-Desoxynucleotid, Ribonucleotiden und 2'-alkylierten Ribonucleotiden. 5-Bromdesoxyuridin oder 5-Methyldesoxycytidin liefern die besten Ergebnisse.
Alternativ kann der Komplex stabilisiert werden, nachdem die Verzweigungsmigration stattgefunden hat. In dieser Ausführungsform ist der Linker des Verzweigungsmigrationskomplexes an einen Strang des Reagens-Doppelstrangs kovalent gebunden. Der Verzweigungsmigrationskomplex wird vorzugsweise mit einer Ligase inkubiert. Der kovalent gebundene Linker-Strang verhindert die Abkoppelung der Verzweigungsmigrationsstruktur.
In einer bevorzugten Ausführungsform unserer Erfindung wird die Verzweigungsmigrationsstruktur durch eine Kombination von gleichzeitigen und aufeinanderfolgenden Stabilisierungsverfahren unter Verwendung von modifizierten Nucleotiden und kovalenter Verbindung stabilisiert.
Unser Verdränger-Linker kann durch Einschließen einer Markierung modifiziert werden, um den Nachweis der Hybrid-Konstruktion zu gewährleisten. Jegliche Modifikation, die den Nachweis gewährleistet und die den Verzweigungsmigrationskomplex nicht unterbricht, kann verwendet werden. Herkömmliche Nachweismodifikationen sind radioaktive Markierungen, Fluoreszenz- und Chemilumineszenzmarkierungen, Enzyme und Ziele für den Nachweis, einschließlich, als nicht-einschränkende Beispiele, Biotineinheiten, Phosphorthioat-Verbindungen und Antigene. Für Einzelheiten betreffend die Verwendung von verschiedenen Markierungen und Nachweissystemen vgl. z.B., Keller, G. H., et al., DNA Probes (1989) und Piper, M.A. et al., Nucleic Acid Probes (1989).
In einer anderen Ausführungsform sind unsere einzelsträngigen Verdränger nicht mit einem Linkerstrang hybridisiert und sind in der Lage, eine Dreifachstrang-Bildung an einem anderen Punkt als dem Ende eines Empfänger-Polynucleotids zu initiieren. Diese Verdränger-Klasse umfasst

1. eine erste Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifach-Helix-Bildung zu initiieren, und die umfasst a) mindestens sechs aufeinanderfolgende Pyrimidinbasen oder b) mindestens sieben Basen, wobei mindestens sechs der Basen Pyrimidinbasen sind und die siebte Base Guanin ist, sowie
2. eine zweite Sequenz benachbart zur ersten Sequenz, die a) zu dem zweiten Strang des Empfängerdoppelstrangs komplementär ist und antiparallel dazu verläuft, und die in der Lage sind, eine Verzweigungsmigration benachbart zu der Dreifachhelix zu initiieren, wobei die zweite Sequenz von der ersten Sequenz durch 1 bis 5 dazwischen liegende Einheiten, die an einen interkalierenden Stoff kovalent gebunden sind, getrennt ist.

Dazwischen liegende Einheiten können von jeder Einheit ausgewählt werden, die, wenn sie zwischen die erste und die zweite Sequenz platziert wird, die Koordinationsfunktion der beiden Sequenzen nicht aufhebt. Beispiele sind interkalierende Stoffe und Stoffe, die so wirken, dass sie die Rigidität der Nucleotidsequenz verringern und dadurch die Hybridisierung der komplementären Sequenz an den antiparallelen Strang erleichtern. Solche Einheiten schließen Einheiten, die Zucker-Phosphat-Verbindungen enthalten, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die intervenierenden Einheiten Nucleotide. Die Nucleotide können modifizierte Nucleotide sein. Nützliche modifizierte Nucleotide umfassen jene, die einen interkalierenden Stoff haben, der kovalent gebunden ist, und modifizierte Nucleotide, die nicht fähig zur Basenpaarung sind.
Die vorliegende Erfindung stellt in einer weiteren Ausführungsform einen Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger zur Verfügung, der in der Lage ist, an einen Polydesoxynucleotid-Empfänger-Doppelstrang zu binden, wobei der Verdränger umfasst

(a) eine erste Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifach-Helix-Bildung zu initiieren, und die umfasst 1. mindestens sechs aufeinanderfolgende Pyrimidinbasen oder 2. mindestens sieben Basen, wobei mindestens sechs der Basen Pyrimidinbasen sind und die siebte Base Guanin ist, sowie
(b) eine zweite Sequenz benachbart zur ersten Sequenz, die zu dem zweiten Strang des Empfängerdoppelstrangs komplementär ist und antiparallel dazu verläuft, und die in der Lage ist, eine Verzweigungsmigration benachbart zu der Dreifachhelix zu initiieren, wobei zumindest eines der Nucleotide, die zu einem Strang des Polydesoxynucleotid-Empfänger-Doppelstrangs komplementär sind, modifiziert ist, um die Stabilität des Verdränger-Empfänger-Komplexes zu erhöhen, oder um die Schmelztemperatur des Verdränger-Empfänger-Komplexes zu erhöhen.

Sobald der Verdränger mit dem antiparallelen Strang hybridisiert, ist es wünschenswert, die Stabilität des Komplexes zu erhöhen. Wir haben herausgefunden, dass wir in der Lage sind, die Stabilität durch Modifikation von mindestens einem der Nucleotide im Verdrängerstrang vor der Hybridisierung zu erhöhen. Das Nucleotid wird auf eine Weise modifiziert, die die Stabilität des Hybrid-Verdränger-Empfänger-Doppelstrangs erhöht. Die Modifikation kann entweder in der ersten Sequenz sein, die in der Lage ist, die Bildung des Komplexes zu initiieren, oder in der zweiten Sequenz, die benachbart zu der ersten Sequenz ist und die zu dem zweiten Strang des Empfänger-Doppelstrangs komplementär ist und antiparallel dazu verläuft.
Ist die Modifikation in der ersten Sequenz, wird sie vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus modifizierten Nucleotiden ausgewählt, die die Assoziationskonstante mit dem komplementären Desoxynucleotid um mindestens etwa 20 Prozent, vorzugsweise um mindestens etwa 70 Prozent erhöhen. Repräsentative nicht-limitierende Beispiele für solche modifizierten Nucleotide umfassen 5-halogenierte Pyrimidin-Nucleotide. Am stärksten bevorzugt wird das modifizierte Nucleotid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 5-Bromdesoxyuridin und 5-Methyldesoxycytidin.
Ist die Modifikation in der zweiten Sequenz, kann sie aus der Gruppe, bestehend aus 5-halogenierten Pyrimidin-Nucleotiden, 5-Methyldesoxycytidin, Diaminopurin-Desoxynucleotid, Ribonucleotiden und 2'-alkylierten Ribonucleotiden ausgewählt werden. Das modifizierte Nucleotid ist vorzugsweise ein 5'-halogeniertes Pyrimidinnucleotid, vorzugsweise 5-Bromdesoxycytidin oder 5-Methyldesoxycytidin.
Zusätzlich zu der die Stabilität erhöhenden Modifikation fanden wir es von Nutzen, modifizierte Nucleotide in den Verdränger einzuschließen, die den Nachweis der Verdränger-Empfänger-Hybride gewährleisten. Geeignete Modifikationen können aus der Gruppe, umfassend radioaktive Markierungen, Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Markierungen, Enzyme und Ziele für den Nachweis, einschließlich, als nicht-einschränkendes Beispiel, Biotin-Einheiten, Phosphorthioat-Bindungen und Antigene, ausgewählt werden.
Wir haben ebenfalls Verdränger entwickelt, die Exonuclease-resistent sind. Diese Nuclease-resistenten Verdränger sind für die Verwendung in Zellkulturen und lebenden Organismen geeignet. Diese Verdränger enthalten mindestens eine Einheit, die eine Exonuclease-Resistenz verleiht, die am oder nahe dem terminalen Nucleotid des Verdrängers angeheftet ist.
Die Nuclease-Resistenz verleihende Einheit kann an die Desoxyriboseeinheit an der Hydroxylgruppe oder die Phosphateinheit eines terminalen Nucleotids angeheftet sein.
Die Nuclease-Resistenz verleihende Einheit kann aus der Gruppe, bestehend aus interkalierenden Stoffe, Iso-Harnstoffen, Carbodiimiden und N-Hydroxybenzotriazolen, Polypeptiden und Proteinen ausgewählt werden.
Eine bevorzugte Einheit ist ein Methylthiophosphonat, wenn die Gruppe an die Hydroxylgruppe angeheftet ist.
Für die Übertragung der Resistenz am 3'-Ende ist ein modifiziertes oder nichtmodifiziertes 2',3'-Didesoxyribose-Nucleotid, das durch eine Phosphodiesterverbindung an das 3'-terminale Desoxyribonucleotid angeheftet ist, von Nutzen.
Die Bildung von Komplexen unter Verwendung von entweder unserem einzelsträngigen Verdränger oder unserem Verdränger-Linker läuft in Übereinstimmung mit wohlbekannten Prinzipien ab. [Maniatis, et al., (1982) Molecular Cloning (New York: Cold Spring Harbor Laboratories].
Eine der bedeutendsten Verwendungsmöglichkeiten unserer Erfindung ist die ortsspezifische Addition oder Deletion von Nucleotiden in einer Polydesoxynucleotid-Empfänger-Sequenz. Dieses Verfahren läuft ab, wenn der neue Strang in den Empfänger-Doppelstrang eingeführt wird und den Original-Strang verdrängt. Die zelluläre Maschinerie, die bei der überall anwendbaren Rekombination und Gen-Umwandlung beteiligt ist, wird so wirken, dass sie die Sequenzinformation von dem Verdrängerstrang auf das Empfänger-Polydesoxynucleotid überträgt. Für einen Überblick über mögliche Mechanismen für diese Übertragung vgl. Stahl, F. W., Genetic Recombination (1979).
Die folgenden Beispiele werden gezeigt, um verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, sie sind jedoch nicht darauf ausgelegt, auf irgendeine Weise ihre Zielsetzung einzuschränken, wie genauer in den Patentansprüchen gezeigt wird.
Beispiel 1
Herstellung von markierten Verdränger- und Linker-Strängen
Die Sequenzen der in diesem Beispiel sowie in den anderen bereitgestellten Beispielen verwendeten Oligonucleotide sind in Tabelle 1 aufgelistet. Diese Oligonucleotide wurden auf einem DNA-Synthesegerät vom Modell 380B von Applied Biosystems unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie synthetisiert, jedoch würde jedes andere Standardverfahren zur Synthese von Oligonucleotiden ebenfalls für diese Erfindung arbeiten.
Die Bromdesoxycytidin (BrdC) und die Methyldesoxycytidin(MedC) enthaltenden Verdrängerstränge, die in diesen Beispielen verwendet werden, wurden durch Einschließen von 5-Bromdesoxycytidin- oder 5-Methyldesoxycytidin-Phosphoramidit-Monomeren in die Oligonucleotide während ihrer Synthese hergestellt. Reinigungsschritte wurden auf die Hydrolyse von Basen-Schutzgruppen und Spaltung von dem Träger mit NH₄OH, Evaporation, Resuspension und Ethanol-Präzipitation begrenzt. Alle Oligodesoxynucleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase am 5'-Ende mit ³²P markiert, einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf 20% Acrylamid-8M-Harnstoff-Gelen unterzogen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Routinemäßig wurde eine einzige Oligodesoxynucleotid-Spezies der korrekten Größe nachgewiesen.
Um das Einfangen an den Empfänger-Enden mit 3'- oder 5'-Überhängen zu messen, wurden Linker-, beziehungsweise Empfänger-Oligodesoxynucleotide mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase markiert. Der Reaktion der Linker, jedoch nicht der Verdränger, mit markiertem ATP, folgte eine Reaktion mit überschüssigem, unmarkiertem ATP, um zu gewährleisten, dass alle Linker-Stränge ein 5'-Phosphat enthielten. Die Oligodesoxynucleotide wurden über Spin-Säulen von Sephadex G-50 [Maniatis, et al., (1982) Molecular Cloning (New York) Cold Spring Harbor Laboratories] gereinigt.
Beispiel 2
Stabilität von BrdC enthaltenden Hybriden
Die Schmelztemperaturen für Oligodesoxynucleotide wurden, wie von Quartin & Wetmur beschrieben [Biochem. 28:1040-47 (1989)], bestimmt. Kurz, komplementäre Oligodesoxynucleotide wurden in gleichen molaren Verhältnissen gemischt, entweder in 6X SSC, pH-Wert 4,0, 6X SSC, pH-Wert 7,0, oder in 1M NaCl, 0,05 M Borat, 0,2 mM EDTA, pH-Wert 10, dann in eine Quartz-Küvette von 1 cm platziert. Die Lösungen wurden in den Küvetten bei 0,3°C/Minute in einem Spektrophotometer vom Modell 25 von Beckman, das mit einem Wasser ummantelten Zellhalter ausgerüstet war, erhitzt. Die Lösungstemperatur wurde unter Verwendung eines Thermistors, der an den Zellhalter angebracht war, überwacht. Die Hyperchromien für alle getesteten Doppelstränge lagen bei 21%. Die konzentrationsabhängigen Schmelztemperaturen (Tm=tm + 273,16) wurden gemäß dem Verfahren von Marky und Breslauer [Biopolymers 26: 1601–1620 (1987)] errechnet. Die berichteten Tm-Werte sind auf ± 1°C verlässlich.
Die tm-Werte für dC enthaltende Oligodesoxynucleotide und für ihre BrdC und MedC enhaltenden Analoga sind in Tabelle II präsentiert. Die Substitution von BrdC oder MedC gegen dC führt zu einer Zunahme der Schmelztemperatur ΔTm=Tm'–Tm, wobei Tm und Tm' die Schmelztemperaturen für dC beziehungsweise BrdC oder MedC enthaltende Oligodesoxynucleotide sind.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass Doppelstränge, die Oligonucleotide mit BrdC oder MedC enthalten, stabiler sind als jene mit lediglich dC.
An die Assoziationskonstante für das modifizierte Nucleotid BrdC oder MedC relativ zur Assoziationskonstante für dC, das mit komplementärem dG eine Basenpaarung eingeht, kann sich durch

K = e^{–ΔH° ΔTm/{RTn2Ns}}angenähert werden, wobei
ΔH° = Enthalpie für die Bildung des Oligodesoxnucleotid-Doppelstrangs
R = Gaskonstante
Tn= Mittelwert von Tm und Tm'
Ns = Anzahl an modifizierten Nucleotiden.

Basierend auf dieser Analyse erhöhte sich die Assoziationskonstante 13 um etwa 70-90% bei der BrdC- Substitution und um etwa 50–70% bei der MedC-Substitution.
Beispiel 3
Verdrängung durch BrdC
Ein Gelmigrationstest wurde verwendet, um die Verdrängung von 5'-³²P-markierten, dC enthaltenden Oligodesoxynucleotiden von unmarkierten komplementären Oligodesoxynucleotiden durch ihre BrdC enthaltenden Analoga zu überwachen.
Markierte, dC enthaltende Oligodesoxynucleotide wurden an nicht-markierte, dC enthaltende komplementäre Stränge bei Raumtemperatur in 1 M NaCl bei Konzentrationen von 1 beziehungsweise 3μg/ml angeheftet und dann auf 4°C erwärmt. BrdC enthaltende Analoga der markierten Stränge (in Konzentrationen im Bereich von 3 bis 400 μg/ml) wurden mit dC enthaltenden Doppelsträngen als eine Funktion der Zeit bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Aliquots, die zu jedem Zeitpunkt genommen wurden, wurden in Elektrophorese-Auftragungspuffer verdünnt und vor der Elektrophorese bei –70°C gelagert. Die Proben wurden auf ein 20% Acrylamidgel in 2,5% Ficoll 400 aufgetragen und die Elektrophoese wurde bei 4°C bei 400 Volt, 5–15 Milliampere in 89 mM TrisHCl, 89 mM Bor, 1 mM EDTA, pH-Wert 8 (TBE) durchgeführt. Die Gele wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen.
Die Raten, zu welchen Oligonucleotide, die BrdC enthalten, diejenigen, die dC enthalten, verdrängen, sind in Tabelle III aufgeführt. Reaktionen, die an den stumpfen Enden initiiert werden, laufen mit steigender Temperatur auf Grund von verstärkter Atmung an den stumpfen Stellen schneller ab. Verdrängungsreaktionen an Stellen, an denen eine Initiation bei vier Basenüberhängen stattfand, waren um mehr als zwei Größenordnungen schneller als Reaktionen, die an stumpfen Enden initiiert wurden. Die Stabilität eines Doppelstrangs, der zwischen dem verdrängenden Strang und dem Überhang eines gebildeten Doppelstrangs gebildet wurde, nahm mit abnehmender Temperatur zu. Somit nimmt die Verdrängungsrate im Temperaturbereich zwischen 22 und 37°C mit zunehmender Temperatur ab.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Oligonucleotide, die BrdC enthalten, die dC-Analoga in einer zeit- und temperaturabhängigen Reaktion sogar an Empfängern mit stumpfem Ende verdrängen.
Die Wirkung des Einschlusses eines Linker-Strangs in Verdrängungsreaktionen wurde sowohl an 3'- als auch an 5'-Überhängen von 4 Basen mit einem G + C-Gehalt von 0–100% untersucht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Verdrängungsraten, bei denen Verdränger-Linker-Doppelstränge verwendet werden, zumindest 8-mal schneller sind als Verdrängungsraten, bei denen nur Verdränger-Oligodesoxynucleotide verwendet werden. Basierend auf diesen Ergebnissen schließen wir, dass die Verfahren, die in den Beispielen 7–8 beschrieben werden, nicht durch die Assoziierungsrate von Verdränger-Linker-Doppelsträngen und Empfänger-Doppelsträngen beschränkt sind.
Beispiel 4
Hybridisierung des Verdrängers mit Ziel-DNA
Der BrdC oder MedC enthaltende Verdrängerstrang wird mit dem komplementären Strang einer doppelsträngigen Ziel-DNA in Abwesenheit eines Linkers hybridisiert. Linker, die zu einem Abschnitt der Ziel-DNA komplementär sind, werden nach diesem Hybridisierungsschritt zugesetzt, wenn gewünscht.
Die Ziel-DNA, die in den Beispielen 4–9 verwendet wird, war das Plasmid pALA-D, ein pUC9-Expressionsvektor, der die cDNA-Sequenz von menschlicher delta-Aminolevulinat-Dehydratase (ALA-L) enthielt [Wetmur, et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:7703–7707].
pALA-D wurde mit RsaI und PstI gespalten, so dass sieben Fragmente erhalten wurden, von denen vier ein PstI-Ende mit einem 3'-Überhang und ein stumpfes RsaI-Fragment enthielten (1A). Die Standard-Verdrängersequenz, P-D-dC, ist zu den ersten 24 Nucleotiden des 3'-überhängenden Strangs des PstI-Endes des Restriktionsfragments B komplementär. Die Initiierung der Verdränger-Hybridisierung mit dem Empfänger-Ziel- Doppelstrang beginnt mit der Basenpaarung des Verdrängers mit dem Überhang von vier Basen an der PstI-Stelle. Der Verdränger kann alle oder einen Teil des homologen Abschnitts des Empfänger-Doppelstrangs durch einzelsträngige DNA-Verzweigungsmigration ersetzen.
Die gespaltene pALA-D-DNA (20 μg/ml) wird mit der 34-meren Verdränger-DNA (6μg/ml) in einem pH reduzierten DNA-Ligasepuffer [50 mMTris-HCl, pH-Wert 7,0, 1 mM ATP, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit (DTT), 50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA)] gemischt, bei 55°C über 10 min inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
1C zeigt das Potenzial für die Verzweigungsmigration des Verdrängers in pALA-D-Fragmente mit einem Pst I- und einem stumpfen (RsaI) Ende. Für Fragment B, bei dem eine volle Komplementarität zu dem Verdränger besteht, ist die maximale Anzahl der Verdränger-Empfänger-Basenpaare (m) 24. Die maximale Anzahl der Verzweigungsmigrationsschritte ist (m-4), da vier Basenpaare zwischen dem Verdränger und dem 3'-PstI-Überhang gebildet werden. Fragment D und die kleinsten PstI-RsaI-Fragmente (71 Basenpaare) enthalten jenseits der PstI-Stelle keine Komplementarität. Demnach ist m=5, einschließlich dem vier-Basen-Überhang und einem Verzweigungsmigrationsschritt. Fragment A enthält benachbart zur PstI-Stelle vier zusätzliche Nucleotide, die zu dem Verdränger komplementär sind. Demnach ist m=9, einschließlich dem vier-Basen-Überhang und fünf Verzweigungsmigrationsschritte. Anders als Fragment B, wo die Verzweigungsmigration zur Vollständigkeit gelangen kann, enthalten alle Verzweigungsmigrationsstrukturen mit den Fragmenten A und D zwei einzelsträngige Verzweigungen.
Beispiel 5
Hybridisierung des Verdrängers mit Ziel-DNA in Gegenwart eines Linkers
In einer zweiten Ausführungsform dieser Erfindung wurde das Verzweigungsmigration vermittelte Einfangen von Linker-Oligodesoxynucleotiden gemäß dem Schema in 1B ausgeführt. In dieser Ausführungsform sind der Empfänger-Ziel-Doppelstrang, die Verdränger-Oligodesoxynucleotide und die Linker-Desoxyoligonucleotide alle während der Hybridisierungsreaktion vorhanden. Die Linker-Sequenz, 5' ³²P-markiertes P-L-dC, bildet mit dem 5'-Abschnitt der Verdrängersequenz, die keine Homologie mit dem Empfänger-Doppelstrang hat, einen Doppelstrang. Der gebildete Verdränger-Linker-Doppelstrang verdrängt den homologen Ziel-Strang durch Basenpaarung mit dem Empfänger-Zielstrang.
pALA-D wurde mit PstI und RsaI gespalten. Gespaltenes Plasmid (20 μg/ml) wurde mit einem 34-meren Verdränger-Oligodesoxynucleotid (6μg/ml) und einem 5'-³²P-markierten, 14-meren Linker-Oligodesoxynucleotid (2μg/ml) in einem pH reduzierten T4-DNA-Ligasepuffer [50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 1mM ATP, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit (DTT), 50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA)] gemischt, bei 55°C über 10 min inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Beispiel 6
Bildung des Empfänger-Linker-Doppelstrangs
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung ist bei dem anfänglichen Schritt der Verdrängungsreaktion die Bildung eines Verdränger-Linker-Doppelstrangs und das darauffolgende Zusetzen dieses Verdränger-Linker-Doppelstrangs zu einem Ziel-Doppelstrang beteiligt.
Die Bildung des Verdränger-Linker-Doppelstrangs kann auf die folgende Weise erzielt werden. Ein 34-meres Verdränger-Oligodesoxynucleotid (6μg/ml) wird mit einem 5'-³²P-markierten 14-meren Linker-Oligodesoxynucleotid (2μg/ml) in einem pH reduzierten T4-DNA-Ligasepuffer [50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 1mM ATP, 10 mM MgCl₂, 20 mM Dithiothreit (DTT), 50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA)] gemischt, bei 55°C über 10 min inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Beispiel 7
Hybridisierung des Verdränger-Linker-Doppelstrangs mit der Ziel-DNA
pALA-D wird mit PstI und RsaI gespalten, um 7 Restriktionsfragmente zu erhalten. Die gespaltene pALA-D-DNA (40 μg/ml) in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 1mM ATP, 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 50 μg/ml BSA wird mit einem gleichen Volumen des in Beispiel 6 hergestellten Verdränger-Linker-Doppelstrangs gemischt. Dieses Einheit wird bei 55°C über 10 min inkubiert, dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Beispiel 8
Ligierung des Linker-Oligodesoxynucleotids mit dem Zielstrang
Die Wirksamkeit und die Spezifität der Verzweigungs-vermittelten Linker-Ligierungsreaktion werden in den 2 und 3 gezeigt.
Die Zeitaufwendungen für die Ligierung der pALA-D-PstI-RsaI-Fragmente in Gegenwart des Verdrängers P-D-BrdC (6 μg/ml) und des Linkers P-L-dC (2μg/ml) wurden unter Verwendung von T4-Ligase (5 U/ml Ligase) und Inkubationszeiten im Bereich von 1-128 min erstellt. Die Ergebnisse sind in 3, Bahnen 2–9, veranschaulicht. Die Ligierung ergibt eine kleine, zeitabhängige Abnahme der Mobilität von Fragment B. Die Ligierung des Linkers an die Verzweigungsmigrationsstruktur ist in 32 min zu 50% vervollständigt und in etwa 1 Std. zu 100% vervollständigt. Ein ähnlicher Versuch, der unter Verwendung von 25 U/ml Ligase durchgeführt wurde, lief in 8 min zu einer Vollständigkeit von 50% ab. Demnach war die Reaktionsrate für diese Ligierungsreaktion linear abhängig von der Ligasekonzentration und von der Zeit. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verzweigungsvermittelte Ligierung eines Linker-Oligonucleotids eine effiziente Reaktion ist, die recht schnell abläuft.
3 ist ein Autoradiogramm des in 2 gezeigten Gels und veranschaulicht den Nachweis der Ligierung von 5'-³²P-markierten Linkern an die Empfänger-Fragmente. Unter Bedingungen, bei welchen die Reaktion mit Fragment B (m=24) zur Vollständigkeit ausgeführt wird, ist Fragment A (m=9) kaum sichtbar und Fragment D (m=5) ist nicht nachweisbar. Der Hauptteil der markierten Linker ist mit Fragment B assoziiert. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität des Verzweigungs-vermittelten Einfangens von Linkem.
Beispiel 9
Spezifität der Verzweigungs-Migrations-Reaktion
Die Erfordernisse von BrdC oder MedC enthaltenden Verdrängersträngen für spezifisches und wirkungsvolles Verzweigungs-Migration vermitteltes Einfangen von Linkern wird in dem folgenden Versuch veranschaulicht. 4A zeigt ein Autoradiogramm, das zu jenem, welches in 3 gezeigt wurde, analog ist, wobei der Verdrängerstrang P-D-dC und nicht P-D-BrdC ist. Unter Bedingungen, bei denen die Reaktion mit Fragment B zu 50% vollständig ausgeführt wird, wurden sowohl Fragment A als auch Fragment D leicht nachgewiesen. Tabelle IV enthält die relativen autoradiographischen Intensitäten für die Fragmente A, B und D unter Verwendung von P-D-BrdC, P-D-MedC und P-D-dC als Verdrängermoleküle. Der Intensität von Fragment D wurde der Wert 1 zugeschrieben. Da die Intensitäten für die Fragmente A und B unter Verwendung eines Tests mit einem 2-fachen zeitlichen Verlauf bestimmt wurden, sind sie zu +/– 50% verlässlich. Die Daten in Tabelle IV zeigen, dass die Verwendung von BrdC oder MedC in dem Verdränger wichtig ist, damit hochspezifisches Verzweigungsmigrations vermitteltes Einfangen erreicht werden kann.
Der Verdränger P-D-BrdC-B (10) wurde mit einem unkorrekten Nucleotid synthetisiert, so dass vor der fehlenden Übereinstimmung nur 9 Basenpaare zwischen dem Verdränger und dem komplementären Empfängerstrang gebildet werden konnten. 4B ist ein Autoradiogramm einer Verzweigungs-Migration vermittelten Einfangreaktion, die unter Bedingungen durchgeführt wurde, die zu sehr geringen Einfangmengen führen. Die Intensitätsverhältnisse sind in Tabelle V dargestellt. Das Einfangen durch Fragment B (m=24 mit fehlender Übereinstimmung bei 10) war genau dasselbe wie jenes von Fragment A (m=9). Demnach blockierte eine einzige fehlende Übereinstimmung an der Position 10 die nachfolgende Verzweigungsmigration, was anzeigt, dass die Verzweigungsmigration extrem spezifisch ist.
4C zeigt ein Autoradiogramm, das dem in 3 analog ist und bei dem der Verdränger P-D-BrdC-B (24) war. Das Endnucleotid von P-D-BrdC-B (24) unterschied sich von dem von P-D-BrdC. Die Ergebnisse waren jenen in 3 ähnlich. Demnach ist es bei der Bildung der einzeln verzweigten Endstruktur (1B, unten rechts) nicht notwendig, die hohe Spezifität zu erreichen, die bei Einfangreaktionen von BrdC enthaltenden Oligodesoxynucleotiden beobachtet wurde.
Experimentelle und theoretische Intensitätsverhältnisse werden in den Tabellen IV und V verglichen. Die theoretischen Intensitätsverhältnisse wurden unter Verwendung von:
berechnet.
Die Teilungsfunktionen, q₁ und q₂ nähern sich 1, wenn die Empfängerenden nicht mit Verdränger-Linker-Doppelsträngen gesättigt sind. Dann:
Gleichung (2) wurde für die gesamte Verzweigungsmigration verwendet (Fragment B mit dem Verdränger P-D-BrdC, P-D-MedC oder P-D-dC). Die Gleichung (3), die auf die gesamte Verzweigungsmigration angewendet wurde, endete durch eine fehlende Übereinstimmung an der Stelle M+1. Für diese Berechnungen ist Ω>2, B_k = 1,7–1,9 für BrdC und B_k = 1 für dC.
B_k ist die relative Assoziationskonstante für das Basenpaar k. B_k ist normalerweise 1. Für BrdC, B_k = 1,7–1,9, wie in Beispiel 2 bestimmt. Ähnlich für MedC, B_k = 1,5–1,7. Die außerordentliche qualitative Übereinstimmung zwischen Theorie und Versuch legt nahe, dass die Theorie für die Herstellung von Verdrängermolekülen verwendet werden kann.
Beispiel 10
Einfangen von Linkern an den 5'-Enden
Für das Einfangen an einem 5'-Überhang wurden die Richtungen der Verdränger- und der Linkerstränge umgedreht, wobei der Linker mit dem 3'-Abschnitt der Verdrängersequenz, die keine Homologie zur Empfängersequenz hat, einen Doppelstrang bildet.
Das Plasmid pALA-D-G3 ist ein pUC19-Clon, der ein Genomfragment von 3,2 kB für menschliche ALA-D enthält. Die Oligodesoxynucleotide E-D-BrdC und X-D-BrdC wurden als Verdränger für die Verzweigungsmigration an den einzigartigen EcoRI- beziehungsweise Xmal-Stellen synthetisiert. Für beide Verdränger wurde der gleiche Linker, E-L-dC (X-L-dC), verwendet.
pALA-D-G3 wurde entweder mit EcoRI oder Xmal und einer zweiten Restriktionsendonuclease gespalten, um geeignete Größen der Empfänger-Fragmente herzustellen. Dieses Produkt wurde mit PstI plus RsaI gespaltenem pALA-D (Beispiel 4) gemischt und die Einfangreaktionen wurden mit äquimolarem P-L-dC und E-L-dC und 400 nM P-D-BrdC und entweder E-D-BrdC oder X-D-BrdC durchgeführt.
Die Linker-Einfangreaktionen wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung von 25 U/ml T4-DNA-Ligase durchgeführt und unter Verwendung der Gel-Shift-Analyse, welche in 2 veranschaulicht wird, analysiert. Die Halbwertszeit für das Einfangen des Linkers war 5' bei EcoRI (0% G+C 5'-Überhang) und 20' bei Xmal (100% G+C 5'-Überhang), während die Halbwertszeit für das Einfangen des Linkers in derselben Reaktion 5' für PstI (50% G+C 3'-Überhang) betrug. Demnach kann das Linker-Einfang-Verfahren entweder auf 5'- oder auf 3'-Überhänge sowie Überhänge aller möglichen prozentualen Anteile von G+C angewendet werden.
pALA-D wurde mit SmaI, welches stumpfe Enden herstellt, sowie einem zweiten Enzym geschnitten und es wurde unter Verwendung von X-D-BrdC und Sm-L-dC eine Einfangreaktion durchgeführt. Das Einfangen des Linkers wurde beobachtet, obwohl die Rate mehr als zwei Größenordnungen langsamer war als das Einfangen des Linkers an den Empfänger-Enden mit 3'- oder 5'-Überhängen.
Beispiel 11
Selektive Clonierung von Verzweigungsmigrationsstrukturen
Das Produkt einer Verzweigungsmigrations-vermittelten Einfangreaktion ähnlich jener, welche in den vorherigen Beispielen beschrieben wurde, wurde in einen Vektor ligiert und verwendet, um E. coli unter Verwendung von Standard-Clonierungsverfahren, wie jenen, welche von Maniatis, et al., (1982) beschrieben werden, zu transformieren.
Das Plasmid pALA-D wurde mit PstI gespalten, was zu 2771- und 1037-nt-Fragmenten führt. Das pUC9 enthaltende 2771-Fragment wurde durch Spaltung mit SmaI, das zu zwei stumpf endenden Fragmenten führt, als Clonierungsvektor inaktiviert. Jedes Ende des 1037-nt-Fragments endete in einer Pst I-Stelle, wobei eine davon dieselbe war wie die Pst I-Stelle in Fragment B. Die Verzweigungsmigrations-vermittelte Einfangreaktion wurde, wie in den Beispielen 7 und 8 beschrieben, unter Verwendung von P-D-BrdC und P-L-dC durchgeführt. Die Produkte wurden in pUC 19 ligiert, das mit SphI und PstI gespalten wurde, wobei beide in der Polylinker-Region des Vektors schneiden. Das SphI-Ende enthielt einen 3'-Überhang, der zu dem Überhang, der durch das Einfangen des Verdränger-Linker-Doppelstrangs geschaffen wurde, komplementär war.
Vier unabhängige Plasmid-Clone wurden durch verschiedene Restriktions-Endonucleasen gespalten und es wurde nach der elektrophoretischen Analyse der entstandenen Restriktions-Spalt-Produkte gezeigt, dass sie die Muster haben, die für den Linker-Einschluss erwartet werden. Einer dieser Clone wurde für die weitere Analyse unter Verwendung von Standard-Sequenzierungsverfahren von doppelsträngiger DNA ausgewählt. Das Autoradiogramm des in 5 gezeigten Sequenzierungsgels bestätigt die Identität der clonierten Insertion als das Produkt, das aus dem Verzweigungsmigrations vermittelten Einfangen und der Ligierung des Linkers entsteht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass E. coli Polymerasen und Nucleasen enthält, die in der Lage sind, sowohl BrdC-Substitutionen als auch verzweigte Strukturen zu handhaben.
Demnach kann das Verzweigungsmigrationsprodukt, das gemäß den Verfahren dieser Erfindung erhalten wird, direkt unter Verwendung von Standard-Clonierungsverfahren cloniert werden. Weder die Gegenwart von BrdC noch die Gegenwart einer verzweigten Struktur störte das Clonierungsverfahren.
Beispiel 12
Verzweigungsmigrations-vermittelte Markierung und teilweise Spaltungs-Kartierung
Das Plasmid pMS 19 wurde durch Insertion von PMS-ES/PMS-SE und PMS-NH/PMS-HN in die EcoRI- bzw. HindIII-Stellen von PUC19 in der in Tabelle 1 angezeigten Reihenfolge konstruiert. Die Insertionen zerstörten die EcoRI- und HindIII-Stellen, die benachbart zu dem Plasmid lagen, und inserierten benachbarte BglII (AGATCT)-Stellen an jedem Ende der verlängerten Linker-Region. Der neue Polylinker enthält eine SfiI-Stelle, eine Verzweigungsmigrations-Zielsequenz, den gesamten Polylinker von pUC19, eine andere Verzweigungsmigrations-Zielsequenz und eine NotI-Stelle.
Unter Verwendung der BglII-Stellen wurde dieser über die gesamte Region verlängerte Polylinker in einzigartige BamHI-Stellen in anderen Vektoren, einschließlich einem Cosmid-Vektor, cloniert. Das Leseraster wurde aufrechterhalten, so dass pMS 19 blaue Kolonien herstellt, wenn es mit IPTG und X-Gal gezüchtet wird. Ein EcoRI-HindIII-Genomfragment von 3,6 kB von menschlichem ALA-D, dessen Sequenz zuvor bestimmt worden war, wurde in den Polylinker von pMS 19 cloniert, so dass das Plasmid pMS 19-G4 hergestellt wurde.
pMS 19-G4 wurde mit NotI und SfiI gespalten. Das Produkt wurde durch Verzweigungsmigration-vermitteltes Einfangen von ³²P markiertem Linker (SfiI) oder Verdränger (NotI) unter Verwendung von S-D-BrdC und S-L-dC endständig markiert, um die SfiI-Stelle zu markieren, oder von N-D-BrdC und N-L-dC, um die NotI-Stelle zu markieren. Dieses Produkt wurde verschiedene Male mit Sau3A1 gespalten und die Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Ein Autoradiogramm der Kartierung am SfiI-Ende des clonierten Fragments wird in 6 gezeigt. Die entstehende Sau3A1-Karte stimmte mit der bekannten DNA-Sequenz überein.
Da die Schmelztemperatur des Linker-Verdränger-Doppelstrangs für das Verzweigungsmigrations-Verfahren nicht entscheidend ist, ist die Markierung nicht auf radioaktive Markierungen beschränkt, sondern kann ausgeweitet werden, so dass sie eine große Vielfalt von Markierungen umfasst, die entweder einen Nachweis oder eine Affinitätsreinigung eines markierten Fragments erlauben. Demnach kann das spezifische Verzweigungsmigrations-vermittelte Markieren von Restriktionsfragmenten auf viele verschiedene Kartierungs- und Isolationsverfahren angewendet werden.
Beispiel 13
Bildung von Dreifach-Helices
Die in den Beispielen 13–14 verwendete Ziel-DNA war das Plasmid pMS19, beschrieben in Beispiel 12.
Superhelikale pMS 19-DNA wurde mit einer gleichen Menge an pMS 19 gemischt, die durch Spaltung mit EcoRI linearisiert worden war. Aliquots dieses DNA-Einheits (20 μg/ml) wurden entweder mit ³²P markiertem BT-D-MedC-1- (1μg/ml) oder ³²P markiertem BO-D-MedC-1 (1μg/ml) Oligodesoxynucleotid in 100 mM Natriumcitrat, pH 4,8, bei Raumtemperatur gemischt und man ließ es auf 4°C abkühlen. BT-D-MedC-1 und BO-D-MedC-1 enthielten beide Sequenzen, die in der Lage waren, eine Verzweigungsmigrations-Struktur zu bilden, wohingegen nur BT-D-MedC-1 die Polypyrimidinsequenz enthielt, die in der Lage war, sich bei der Dreifach-Helixbildung zu beteiligen.
Die Produkte der Inkubation wurden durch Elektrophorese bei 4°C in einem 1,2% Agarosegel in 100 mM Natriumcitrat, pH 4,8, getrennt. Das Gel wurde für die Autoradiographie getrocknet. Sowohl die superhelikalen als auch die linearen Formen von pMS 19 banden stabil an ³²P markiertes BO-D-MedC-1. Weder die superhelikale noch die lineare Form banden ³²P markiertes BO-D-MedC-1 stabil.
Demnach war die Fähigkeit, ein Verzweigungsmigrations-Produkt zu bilden, sogar bei niedrigem pH-Wert, bei dem die Verzweigungsmigration am meisten bevorzugt ist, für die Bildung eines stabilen Komplexes mit linearer oder sogar mit superhelikaler DNA nicht ausreichend. Auf der anderen Seite wurde ein stabiles dreifach-helikales Produkt sowohl mit linearer als auch mit superhelikaler DNA gebildet, wenn die Polypyrimidin-Sequenz vorhanden war.
Beispiel 14
Kopplung der Verzweigungsmigration mit der Bildung von Dreifach-Helices
Das Empfänger-Plasmid war pMS 19, welches mit NciI und SalI geschnitten wurde.
SaII ist ein Enzym, welches einen 5'-Überhang produziert. Verdränger-Moleküle waren entweder ³²P markiertes BO-D-MedC-1 oder ³²P markiertes BT-D-MedC-1. Das Linkermolekül war BT-L-dC-1. Verdränger-Linker-Doppelstränge wurden, wie in Beispiel 6 beschrieben, gebildet, wie in Beispiel 7 beschrieben, hybridisiert und, wie in Beispiel 8 beschrieben, ligiert, mit der Ausnahme, dass die Konzentration des Verdränger-Linker- Doppelstrangs 0,2 μM war, das Lösungsmittel 25 mM Tris-Acetat, pH 6,8, 10 mM NaCl, 1 mM Spermin, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 1mM ATP war. Tabelle 1: Oligodesoxynucleotide A. Thermodynamik und Kinetik
Nomenklatur: Oligodesoxynucleotid-Länge – (dC, MedC, BrdC) – (S = Sense; A = Antisense, C = 5'-Bromdesoxycytidin, C = 5'- Methyldesoxycytidin. B. Linker, Verdränger und Ziele
Nomenklatur: Oligodesoxynucleotide sind x – y – z benannt, wobei:
x = Restriktionsort (nur erster Buchstabe)
y = Funktion (Verdränger, Linker oder Ziel)
z = Zusammensetzung (BrdC, MedC, dC) oder Polarität (Verdränger- oder Linkerseite)
E (N) = Fehler an Position N (fehlende Übereinstimmung), wenn vorhanden C. Konstruktion des Plasmids pMS 19
Nomenklatur: Oligodesoxynucleotide sind x – y benannt, wobei:
x = Funktion (PMS)
y = Orientierung im Produkt (z.B. ES ist EcoRI zu SfiI) D. Triplex-Bildung (bei SalI in PMS 19)
Nomenklatur: Oligodesoxynucleotide sind x – y – z benannt, wobei: x = BT, wenn sowohl die Verzweigungsmigration als auch die Triplexbildung möglich sind. x=BO, wenn nur die Verzweigungsmigration möglich ist; y = Zusammensetzung (dC, MedC oder BrdC) in der Verzweigungsmigration-Region (1) und/oder der Triplex-Bildungsregion (2); z=Laborindex Tabelle II: Thermodynamik von Bromdesoxycytidin und Methyldesoxycytidin
Tabelle III: Temperaturabhängigkeit der Verdrängungsraten mit BrdC enthaltenden Verdrängern A. Stumpfe Enden
B. Überhänge
C. Wirkung der Linker
BEDINGUNGEN: Ligasepuffer (pH=7; 37°C; 10μl pro Reaktion. Ziel: Kinase behandelter Strang 10 ng;Unmarkierter Strang 30ng; Verdränger:150 ng; Linker (wenn vorhanden): großer molarer Überschuss. Verdrängerkonzentration= 1μM. Tabelle IV: Einfangen des Linkers
Tabelle V: Einfangen des Linkers mit fehlenden Übereinstimmungen
Die effektive Ligase-Aktivität wurde durch Vergleichen der Zirkularisierungsrate von durch EcoRI linearisiertes pMS 19 in dem vorstehenden Lösungsmittel mit der in Ligase-Puffer, bei dem 50% der Moleküle in 25 Minuten bei 100 U/ml zirkularisiert werden, bestimmt. Die bestimmte Ligase-Aktivität lag in etwa bei 0,5 U/ml.
7 zeigt ein Fluorogramm der Verzweigungsmigrationsversuche. Nach 30 Minuten haben 50% der Empfänger-Doppelstränge einen Linker in Gegenwart von BT-D-MedC-1 eingefangen. Die Rate des Linker-Einfangens mit BT-D-MedC-1 war unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 8 mehr als dreißig Mal größer als jene, die für die Ligase-Aktivität und die Konzentrationen des Verdränger-Linker-Doppelstrangs vorhergesagt wurde.
Das Gel wurde für die Autoradiographie getrocknet. Die Verzweigungsmigrations-Produkte, die in dem Fluorogramm in den Bahnen 4–6 sichtbar waren, waren in dem Autoradiogramm sichtbar und zeigten, dass die neuen Banden des Fluorogramms Verzweigungsmigrations-vermittelte Einfang-Produkte darstellen.
Nach Inkubation über Nacht konnten Verzweigungsmigrations-Produkte mit beiden Verdrängern mit einem 50%igen Ertrag an ligiertem Produkt mit BO-D-MedC-1 gesehen werden. Demnach stabilisierte der Einschluss einer bestimmten, nicht-modifizierten, Triplex bildenden Region auf dem Verdränger BT-D-MedC-1, jedoch nicht auf BO-D-MedC-1, die Verzweigungsmigrations-Zwischenprodukte um mehr als das 30-fache.

Claims

Verfahren zur Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz und einer einzelsträngigen DNA-Verdrängersequenz, wobei die Verdrängersequenz zumindest teilweise komplementär ist zu einem Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex durch die Bildung eines DNA-Dreifachstrangs zwischen der Verdrängersequenz und dem Empfängerdoppelstrang stabilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der nicht-stabile Komplex durch die Anwesenheit von mindestens einem modifizierten Nucleotid im Verdrängerstrang stabilisiert wird.
Verfahren zur Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz und einer einzelsträngigen DNA-Verdrängersequenz, wobei der Verdrängerstrang zumindest teilweise komplementär zu einem solchen Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz ist und eine Nucleotidsequenz sowie eine sequenzspezifische DNA-bindende Einheit umfasst, welche den Empfängerdoppelstrang an der Stelle, an die er bindet, nicht signifikant aufschmilzt.
Verfahren zur Stabilisierung eines nicht-stabilen Komplexes zwischen einem Strang einer doppelsträngigen Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz und einer einzelsträngigen DNA-Verdrängersequenz, wobei die Verdrängersequenz zumindest teilweise komplementär ist zu einem solchen Strang einer Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex stabilisiert wird, wobei die Verdrängersequenz einen Doppelstrang mit einem Linker in einem Verdränger-Linker-Doppelstrang bildet, wobei der Verdränger-Linker-Doppelstrang zwei Stränge umfasst; (a) einen Verdrängerstrang, wobei ein Teil Nucleotide umfasst, welche komplementär zu einem Strang eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs sind, und ein Teil eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einem Linkerstrang ist und mit diesem Strang hybridisiert, und (b) einen Linkerstrang, welcher komplementär zu dem Verdrängerstrang und damit hybridisiert ist, wobei der Linker kovalent mit einem Strang der Empfänger-Polydesoxynucleotidsequenz verbunden ist.
Oligo- oder Polydesoxynucleotid-Verdränger-Linker-Doppelstrang, welcher Verzweigungswanderung am Ende eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs initiieren kann ohne die vorherige Bildung eines stabilen Hybrides mit einem solchen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang, wobei der Verdränger-Linker-Doppelstrang zwei Stränge umfasst: (a) einen Verdrängerstrang, wobei ein Teil Nucleotide umfasst, welche komplementär zu einem Strang eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs sind, und ein Teil eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einem Linkerstrang ist und mit diesem Strang hybridisiert, und (b) einen Linkerstrang, welcher komplementär zu dem Verdrängerstrang und damit hybridisiert ist, wobei zumindest eines der Nucleotide, welche komplementär zu einem Strang des Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs sind, modifiziert ist, um die Stabilität des hybriden Verdränger-Empfänger-Doppelstrangs zu steigern oder um die Schmelztemperatur des hybriden Verdränger-Empfänger-Doppelstrangs zu erhöhen.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, welcher die Verzweigungswanderung an einer Spaltstelle für eine Restriktionsendonuclease initiieren kann.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, welcher an eine 3'- oder 5'-Einzelstrangverlängerung an dem Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang hybridisieren und in Nachbarschaft dazu Verzweigungswanderung initiieren kann.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, wobei das modifizierte Nucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus modifizierten Nucleotiden, welche die Assoziationskonstante mit dem komplementären Desoxynucleotid um mindestens etwa 20% erhöhen.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, wobei das modifizierte Nucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-halogenierten Pyrimidinnucleotiden, im besonderen 5-Bromdesoxyuridin, 5-Methyldesoxycytidin, Diaminpurin-desoxynucleotid, Ribonucleotiden und 2'-alkylierten Ribonucleotiden.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, welche eine Modifizierung enthält, die den Nachweis des Verdränger-Empfänger-Hybrids erlaubt.
Modifizierter Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 10, wobei die Modifizierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen und Zielen zum Nachweis, welche Biotingruppen, Enzyme und Phosphothioatverknüpfungen einschließen.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, welcher eine Modifizierung enthält, die das Einfangen des Verdränger-Empfänger-Hybrides durch Affinitätschromatographie erlaubt.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 10 oder 12, wobei die Modifizierung im Linker vorliegt.
Verdränger-Linker-Doppelstrang nach Anspruch 5, welcher ebenfalls eine 5'- oder 3'-Einzelstrangverlängerung umfasst, die komplementär ist zu einer 5'- oder 3'-Einzelstrangverlängerung, welche aus dem Abbau eines Polydesoxynucleotiddoppelstrangs mit einer Restriktionsendonuclease entsteht.
Künstlich konstruiertes Polydesoxynucleotidhybrid, umfassend einen natürlich vorkommenden Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang, welcher mit dem Verdränger-Linker-Doppelstrang nach einem der Ansprüche 5 bis 14 hybridisiert ist, wobei der Linkerstrang kovalent verknüpft ist mit einem der Stränge des Empfängerdoppelstrangs.
Verfahren zur Modifizierung eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs durch das Inkontaktbringen eines solchen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs mit einem Verdränger-Linker-Doppelstrang nach einem der Ansprüche 5 oder 7 bis 9 unter Bedingungen, welche die Bildung eines hybriden Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs erlauben, wobei das Hybrid nach Bildung des hybriden Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs stabilisiert wird, wobei das Hybrid durch kovalente Verknüpfung des Linkerstranges des Verdränger-Linker-Doppelstrangs mit dem Strang des Empfängerdoppelstrangs, der komplementär zum Verdrängerstrang ist, stabilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Empfängerdopppelstrang in einer 3'- oder 5'-Einzelstrangverlängerung endet, und der Verdrängerstrang eine Sequenz enthält, die komplementär zur Verlängerung ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die kovalente Verknüpfung eine Phosphodiesterbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Hybrid durch die Ligierung des Linkerstrangs des Verdränger-Linker-Doppelstrangs mit dem Strang des Empfängerdoppelstrangs, welcher komplementär zum Verdrängerstrang ist, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase stabilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei 10 % bis 80 % der Nucleotide, welche komplementär zu einem Strang des Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs sind, modifizierte Nucleotide sind.
Verfahren zur Markierung eines künstlich konstruierten Nucleinsäurehybrids eines natürlich vorkommenden Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs, welcher an einen Verdränger-Linker-Doppelstrang hybridisiert ist, nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Linkerstrang des Verdränger-Linker-Doppelstrangs kovalent verknüpft ist mit dem Strang des natürlich vorkommenden Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs, welcher komplementär zum Verdrängerstrang ist, wobei das Verfahren die Modifizierung des Verdränger-Linker-Doppelstrangs umfasst, um darin eine Modifikation einzuführen, welche den Nachweis des künstlich konstruierten Nucleinsäurehybrids erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Verdränger-Linker-Doppelstrang vor der Hybridisierung mit dem natürlich vorkommenden Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang modifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Modifizierung eine 5'- oder 3'-Einzelstrangverlängerung des Verdränger-Linker-Doppelstrangs umfasst, wobei die Verlängerung (a) durch die Bildung des Verdränger-Linker-Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang-Hybrids nicht beeinträchtigt wird, und (b) ein Ziel für die Bindung an Polydesoxynucleotiddoppelstränge ist, welche komplementäre 5'- oder 3'-Einzelstrangverlängerungen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 21, welches verwendet wird, um ein Ende einer clonierten Desoxynucleotidinsertion in einem Vektor zu markieren.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Vektor ein Plasmidvektor, ein Cosmidvektor oder ein künstlicher Hefechromosomen-Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 21 zur Verwendung bei der Markierung der Insertion in einem Verfahren zur Restriktionsendonuclease-Kartierung einer Insertion oder zur Verwendung bei der Markierung des Hybrids in einem Verfahren zum Einfangen eines künstlich konstruierten Nucleinsäurehybrids durch Affinitätschromatographie, oder zur Verwendung bei der Markierung eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs in einem Verfahren zur Anreicherung eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs in einer Population von Polydesoxynucleotid-Doppelsträngen, oder zur Verwendung bei der Markierung des entstehenden Hybrids in einem Verfahren zur kovalenten Bindung eines Restriktionsendonuclease-Linkers in einem Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang oder zur Verwendung bei der Markierung des Hybrids in einem Verfahren zur selektiven Clonierung eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs durch die kovalente Verknüpfung eines Restriktionsendonuclease-Linkers an einen solchen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang, oder zur Verwendung bei der Markierung der Clone in einem Verfahren zur Isolierung von Clonen zusammenhängender Polydesoxyribonucleotid-Doppelstränge durch die kovalente Verknüpfung eines Restriktionsendonuclease-Linkers an die Doppelstränge.
Oligo- oder Polydesoxynucleotidverdränger, welcher an einen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang binden kann, wobei der Verdränger umfasst: (a) eine erste Sequenz, welche die Bildung einer Dreifach-Helix initiieren kann, welche umfasst (1) mindestens sechs aufeinander folgende Pyrimidinbasen oder (2) mindestens sieben Basen, wobei mindestens sechs der Basen Pyrimidinbasen sind und die siebte Base Guanin ist; und (b) eine zweite Sequenz, benachbart zur ersten Sequenz, welche komplementär zum zweiten Strang des Empfängerdoppelstrangs ist und antiparallel dazu verläuft und welche Verzweigungswanderung in der Nähe der Dreifach-Helix initiieren kann; wobei die zweite Sequenz von der ersten Sequenz durch 1 bis 5 dazwischen liegende Einheiten getrennt ist, welche kovalent an einen interkalierenden Stoff gebunden sind.
Oligo- oder Polydesoxynucleotidverdränger, welcher einen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang binden kann, wobei der Verdränger umfasst: (a) eine erste Sequenz, welche die Bildung einer Dreifach-Helix initiieren kann, welche umfasst (1) mindestens sechs aufeinander folgende Pyrimidinbasen oder (2) mindestens sieben Basen, wobei mindestens sechs der Basen Pyrimidinbasen sind und die siebte Base Guanin ist; und (b) eine zweite Sequenz, benachbart zur ersten Sequenz, welche komplementär zum zweiten Strang des Empfängerdoppelstrangs ist und antiparallel dazu verläuft und welche Verzweigungswanderung in der Nähe der Dreifach-Helix initiieren kann; wobei mindestens eines der Nucleotide, welche komplementär zu einem Strang des Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs sind, modifiziert ist, um die Stabilität des Verdränger-Empfänger-Komplexes oder die Schmelztemperatur des Verdränger-Empfänger-Komplexes zu erhöhen.
Verdränger nach Anspruch 27, wobei die dazwischen liegenden Einheiten Nucleotide sind.
Verdränger nach Anspruch 29, wobei mindestens eine der Einheiten ein modifiziertes Nucleotid ist.
Verdränger nach Anspruch 28, wobei das modifizierte Nucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus modifizierten Nucleotiden, welche die Assoziationskonstante mit dem komplementären Desoxynucleotid um mindestens etwa 20% steigern.
Verdränger nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung in der ersten Sequenz ist.
Verdränger nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung in der zweiten Sequenz ist.
Verdränger nach Anspruch 32 oder 33, wobei das modifizierte Nucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-halogenierten Pyrimidinnucleotiden, im besonderen 5-Bromdesoxyuridin, 5-Methyldesoxycytidin, Diaminopurin-desoxynucleotid, Ribonucleotiden und 2'-alkylierten Ribonucleotiden.
Verdränger nach Anspruch 27 oder 28, welcher zusätzlich mindestens eine Einheit umfasst, die an das Ende des Oligo- oder Polydesoxynucleotids gebunden ist, wobei die Einheit dem Ende, an das sie gebunden ist, eine Endonucleaseresistenz verleiht.
Verdränger nach Anspruch 35, wobei die Einheit direkt oder indirekt an die Desoxyriboseeinheit eines endständigen Nucleotids gebunden ist.
Verdränger nach Anspruch 35, wobei die Einheit an die Hydroxylgruppe oder den Phosphatrest eines endständigen Nucleotids gebunden ist.
Verdränger nach Anspruch 36 oder 37, wobei die Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus interkalierenden Stoffen, Isoharnstoffen, Carbodiimiden, Hydroxybenzotriazolen, Methylthiophosphonat, Polypeptiden und Proteinen.
Verdränger nach Anspruch 35, wobei die Einheit ein gegebenenfalls modifiziertes 2',3'-Didesoxyribonucleotid ist, welches an das 3'-endständige Desoxyribonucleotid durch eine Phosphodiesterbindung gebunden ist.
Verdränger nach Anspruch 27 oder 28, welcher eine Modifizierung enthält, die den Nachweis des Verdränger-Empfänger-Hybrids erlaubt.
Modifizierter Verdränger nach Anspruch 40, wobei die Modifizierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Markierungen, Enzymen, Zielen für den Nachweis, welche Biotingruppen und Phosphothioatverknüpfungen einschließen, und einer Modifizierung, die das Einfangen des Verdränger-Empfänger-Hybrids durch Affinitätschromatographie erlaubt.
Künstlich konstruiertes Polydesoxynucleotidhybrid, umfassend einen natürlich vorkommenden Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang, welcher an den Verdränger nach einem der Ansprüche 29 bis 41 hybridisiert ist.
Verfahren zur Modifizierung eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs, umfassend das Inkontaktbringen eines solchen Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs mit dem Verdränger nach einem der Ansprüche 27, 28 oder 31 bis 39 unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes erlauben.
Verfahren zur Markierung eines Verdränger-Empfänger-Komplexes, umfassend das Inkontaktbringen eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs mit dem Verdränger nach einem der Ansprüche 27 bis 41 unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes erlauben, wobei der Verdränger eine Modifizierung enthält, welche den Nachweis des Verdränger-Empfänger-Komplexes erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Modifizierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden und chemolumineszierenden Markierungen, Enzymen, Zielen zum Nachweis, Zielen für Affinitätschromatographie, Biotingruppen und Phosphothioatverknüpfungen.
Verfahren nach Anspruch 43 zur Verwendung bei der Modifizierung des Hybrids in einem Verfahren zum Einfangen eines künstlich konstruierten Nucleinsäurehybrids durch Affinitätschromatographie, oder zur Verwendung bei der Markierung des Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs in einem Verfahren zur Anreicherung eines Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrangs in einer Population von Polydesoxynucleotidoppelsträngen, oder zur Verwendung bei der Modifizierung des Doppelstrangs in einem Verfahren zur stellenspezifischen Addition, Deletion oder Veränderung von Nucleotiden in einem Empfänger-Polydesoxynucleotid-Doppelstrang, oder zur Verwendung bei der Einführung des neuen Stranges in den natürlich vorkommenden Doppelstrang, wodurch der ursprüngliche Strang in einem Verfahren zur Reparatur einer Mutationsläsion, umfassend das Ersetzen eines natürlich vorkommenden DNA-Stranges mit einem modifizierten DNA-Strang, verdrängt wird.