DE69732419T2 - Die verwendung von modularen oligonukleotiden als sonden oder primern in auf nukleinsaure basierenden tests - Google Patents

Die verwendung von modularen oligonukleotiden als sonden oder primern in auf nukleinsaure basierenden tests Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Bindung einer Serie aufeinander folgender Nukleotidbasen an ein komplementäres Nuklein säuremolekül, insbesondere zur Verwendung bei der Verbesserung der Bindung von Einfangoligonukleotiden, modulare Oligonukleotide, und Kits zur Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren.
  • Die gegenseitige Bindung komplementärer Nukleotidbasen stellt eine der bedeutendsten und grundlegendsten wissenschaftlichen Erkenntnisse dieses Jahrhunderts dar und kündigte die schnelle Entwicklung auf dem Gebiet der Biochemie an. Während diese Entdeckung ein Verständnis der Mechanismen ermöglichte, die der Fortsetzung des Lebens zugrunde liegen, schuf sie auch die Grundlage für die Entwicklung wertvoller molekularbiologischer Hilfsmittel.
  • Die Isolierung und Sequenzierung natürlich vorkommender Nukleinsäuremoleküle ist ein gemeinsames Ziel von Molekularbiologen. Die Verwendung komplementärer Oligonukleotide für die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen ist allgemein verbreitet. In ähnlicher Weise werden komplementäre Oligonukleotide oft verwendet, um einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle zu binden und als Primer für Extensionsreaktionen zu fungieren, wodurch zu dem Template komplementäre Stränge erzeugt werden, und bilden die Grundlage experimenteller Verfahren, wie beispielsweise der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und von Sequenzierungsreaktionen.
  • Die Spezifität der Bindung von Oligonukleotiden an Template- oder Ziel-DNA hängt jedoch von einer Anzahl von Parametern ab, von denen jeder zu niedriger Bindungseffizienz und folglich schlechten experimentellen Ergebnissen führen kann. Die Spezifität der Wechselwirkung kann praktischerweise durch die Bestimmung von Tm ermittelt werden, der Temperatur, bei der Duplexe dissoziieren. Diese hängt jedoch auch von anderen Parametern ab, beispielsweise dem Puffer, in dem die Reaktion durchgeführt wird. Für ein bestimmtes experimentelles System wird Tm von verschiedenen Faktoren beeinflusst, einschließlich des Grads der Komplementarität, der Sequenz des Ziels und/oder Oligonukleotids, der Derivatisierung und der Länge des Oligonukleotids. Wie aus einer erhöhten Tm hervorgeht, kann die Bindung von Oligonukleotiden unter denselben experimentellen Bedingungen durch Veränderung dieser Parameter daher verbessert werden. Jedoch ist die Variation, die durch Veränderung dieser Parameter erreicht werden kann, beschränkt. Somit besteht ein Bedarf an weiteren Verfahren, welche die Bindung von Oligonukleotiden an Ziel-DNA verbessern.
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass modulare Sonden oder Primer, die aufgebaut sind aus wenigstens zwei Modulen (Oligonukleotiden), die an angrenzende Regionen der Ziel-DNA binden, gegenüber einem einzelnen Oligonukleotid, das die gleiche Länge wie die getrennten Module überspannt, eine verbesserte Bindung aufweisen. Beispielsweise wurde gefunden, dass zwei angrenzende 18-mer Oligonukleotide effizienter an Ziel-DNA binden, als das zusammengesetzte 36-mer Oligonukleotid.
  • Die Tosoh Corp. (Datenbank WPI Woche 9218 Derwent Publications Ltd., London; AN 92-145512 XP 002054939 und JP 04084 899 A , 18. März 1992) beschrieb die Behandlung von Zielnukleinsäuremolekülen mit Ultraschallwellen, um die Nukleinsäure für schnellere Hybridisierung in große Fragmente zu fragmentieren. Die WO 92/14442 offenbarte mehrfache, aber räumlich getrennte Nukleinsäuresonden zur Detektion von Neisseria gonorrhoeae.
  • Die Verwendung von aus angrenzenden Modulen zusammengesetzten Primern für Sequenzierungszwecke wurde früher beschrieben (Kotler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, S. 4241–4245; Kieleczawa et al., 1992, Science, 258, S. 1787–1791 und Szybalski, 1990, Gene, 90, S. 177–178, US 5,547,843 und Beskin et al., 1995, Nucl. Acids Res., 23(15), S. 2881–2885). In diesen Fällen wurden die modularen Primer jedoch verwendet, um längere Primer zu ersetzen, so dass Bibliotheken aller Sequenzen der kürzeren Primer realistischerweise vorsynthetisiert werden konnten, da sie weniger mögliche Sequenzpermutationen aufwiesen als längere Primer. In Sequenzierungsreaktionen unter den gleichen Bedingungen wurde in allen Fällen nur gezeigt, dass die modularen Primer eine Effizienz aufwiesen, die der Effizienz der längeren Primer entsprach. Im Gegensatz dazu wird überraschenderweise in der vorliegenden Erfindung sogar eine bessere Bindung erreicht, wenn ein einzelnes Oligonukleotid in getrennte Bestandteile aufgeteilt wird. Die vorangegangenen Studien zeigen weiterhin, dass der Effekt der modularen Primer nur dann erzielt werden kann, wenn keine einzelne (oder mehrere) Base(n) bei Bindung an das Template zwischen den Modulen vorliegt (vorliegen). Für die hier beschriebene verbesserte Bindung ist keine derartige Einschränkung gegeben, obwohl eine sogar noch bessere Bindung zu beobachten ist, wenn keine Lücken zwischen den Modulen vorliegen.
  • Lin et al. (Lin et al., 1989, Biochemistry, 28, S. 1054–1061) beschreiben, dass ein kooperativer Effekt, möglicherweise aufgrund von Basenstapelung, zwischen angrenzend gebundenen Oligonukleotiden auftritt, der die Tm erhöht. Dies wird jedoch nur mit der Bindung eines der Module des modularen Primers und nicht mit einem zusammengesetzten Primer mit der vollen Länge des modularen Primers verglichen. Die hier gezeigten Ergebnisse stellen somit einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar und weisen viele Anwendungsmöglichkeiten auf, beispielsweise solche, bei denen eine verbesserte Bindung eines Oligonukleotids an ein Zielnukleinsäuremolekül erforderlich ist.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Verbesserung der Bindung einer Serie aufeinander folgender Nukleotidbasen an ein komplementäres Zielnukleinsäuremolekül in einer Probe dar, wobei das Verfahren wenigstens den Schritt oder Schritte der Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids aus wenigstens zwei Teilen einschließlich der Nukleotidbasen an angrenzende Abschnitte des Zielnukleinsäuremoleküls in der Probe umfasst, wobei das modulare Oligonukleotid eine verbesserte Bindung gegenüber einem einzelnen Oligonukleotid aufweist, das zu der Region des Zielmoleküls komplementär ist, die von dem modularen Oligonukleotid überspannt wird.
  • In einer alternativen Betrachtungsweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bindung einer Serie aufeinander folgender Nukleotidbasen an ein komplementäres Zielnukleinsäuremolekül in einer Probe dar, wobei das Verfahren wenigstens den Schritt oder die Schritte der Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids mit wenigstens drei Teilen einschließlich der Nukleotidbasen an angrenzende Abschnitte des Zielnukleinsäuremoleküls in der Probe umfasst.
  • Der Begriff „verbessern" soll hier hinsichtlich der Bindung eine gesteigerte Spezifität, Stabilität oder Fähigkeit zur Bindung von Zielnukleinsäuremolekülen anzeigen. Das „Binden" kann über jedes dem Fachmann bekannte Verfahren ermittelt werden (wie beispielsweise hier beschrieben) und ist, wie dem Fachmann klar ist, von der Einstellung geeigneter Puffer-, Temperatur- und anderer Bedingungen abhängig. Die Bindung des modularen Oligonukleotids kann durch gleichzeitige Bindung aller Teile davon oder alternativ über aufeinander folgende Schritte durchgeführt werden, welche die Bindung eines oder mehrerer Module bei jedem Schritt beinhalten. „Komplementär" soll hier, je nach Zusammenhang, jede beliebige Serie aufeinander folgender Nukleotidbasen, jedes Oligonukleotid oder jede Ziel-/Template-Nukleinsäure umfassen, die zu der Nukleotidsequenz des fraglichen Nukleinsäuremoleküls oder dessen entsprechender/entsprechendem RNA, DNA, oder Nukleinsäure-Analogon, Peptidnukleinsäure (PNA) komplementär ist. Module des modularen Oligonukleotids können aus den verschiedenen Nukleinsäuremolekülen zusammengesetzt gebildet werden, z.B. DNA und PNA. Alternativ können einzelne Module ausschließlich aus RNA, DNA oder PNA zusammengesetzt sein, aber verschiedene Module innerhalb der modularen Sonde können aus einer unterschiedlichen Nukleinsäure bestehen. Beispielsweise kann ein PNA-Modul als Einfangsonde verwendet werden, während angrenzende Module aus DNA bestehen können, so dass Extensionsverfahren (z.B. RT-PCR, DNA-Sequenzierung, usw.) unter Verwendung des DNA-Moduls durchgeführt werden können. Der Bereich der Komplementarität der Nukleinsäuremoleküle umfasst nicht-absolute Komplementarität, bei der einige Fehlpaarungen auftreten können, obwohl die „komplementären" Nukleinsäuren, oder Oligonukleotide oder Serien von Nukleotiden, je nach vorliegendem Fall, unter Bedingungen hoher Stringenz aneinander binden. Derartige Oligonukleotide sind solche, die unter nicht-stringenten Bedingungen (z.B. 6 × SSC/50% Formamid bei Raumtemperatur) und bei Waschen unter Bedingungen hoher Stringenz (z.B. 2 × SSC, 65°C), wobei SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2, ist, binden.
  • Der Begriff „Nukleinsäuremolekül" soll unter anderem RNA, mRNA, DNA, cDNA, beispielsweise aus retroviraler RNA, genomische DNA, mitochondriale DNA usw., und PNA umfassen. Die DNA kann einzel- oder doppelsträngig sein. Wenn doppelsträngige DNA verwendet wird, können geeignete Verfahren erforderlich sein, um eine Bindung der modularen Oligonukleotide zu ermöglichen, beispielsweise Erhitzen zum Aufbrechen der Struktur in die einzelsträngige Form. Der Begriff „Ziel"-Nukleinsäure umfasst Moleküle, die mit erfindungsgemäßen Verfahren detektiert oder isoliert werden, und zusätzlich Moleküle, die als Template für bestimmte molekulare Reaktionen dienen, beispielsweise Amplifizierung, Sequenzierung oder Transkription zur Herstellung weiterer bestimmter Moleküle. Nukleotidbasen oder Oligonukleotide, welche an das Zielnukleinsäuremolekül binden, können modifiziert oder derivatisiert werden, sofern sie die Fähigkeit zur Erfüllung der oben beschriebenen Komplementaritätserfordernisse beibehalten. Beispielsweise können methylierte, ethylierte oder carboxylierte Basen oder weitere solcher modifizierter oder ungewöhnlicher Basen verwendet werden. Alternativ kann das Nukleinsäurerückgrat modifiziert werden, z.B. PNA-Einheiten. Alternativ kann die Base eine Markierung tragen, beispielsweise ein Hapten wie Biotin oder einen Farbstoff. „Oligonukleotide" umfassen jedes Teilstück von DNA (oder RNA nach reverser Transkription), RNA oder PNA und erstrecken sich auch auf die Verwendung von Chimären von RNA, DNA und/oder PNA.
  • Der Begriff „modulares Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Primer-/Sondenoligonukleotid, das aus mehr als einem Teil aufgebaut ist. Jeder Teil ist ein Oligonukleotid, das als ein Modul des Ganzen bezeichnet wird. „Angrenzend" soll hier nicht-überlappende Regionen des Nukleinsäuremoleküls bezeichnen, die nahe beieinander liegen, beispielsweise weniger als 100 oder 50 Nukleotidbasen voneinander entfernt sind, vorzugsweise 10 Basen voneinander entfernt sind, besonders bevorzugt weniger als 2 Basen voneinander entfernt sind und am meisten bevorzugt keine dazwischen liegenden Basen aufweisen, d.h. direkt angrenzend sind. Das „einzelne Oligonukleotid", auf das oben Bezug genommen wurde und welches das modulare Oligonukleotid umfasst, kann somit mehr Nukleotide umfassen als die Summe der Nukleotidbasen in allen Teilen des modularen Oligonukleotids, da die Basen, die zu der Region zwischen der Bindungsstelle jedes Moduls des modularen Oligonukleotids komplementär sind, in Fällen, bei denen die Module nach Bindung nicht direkt aneinander grenzen, ebenfalls miteinbezogen sind.
  • Das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren kann für jede Anwendung verwendet werden, bei der verbesserte Bindung von Nukleotidbasen, vorzugsweise in der Form eines Oligonukleotids, an ein Zielnukleinsäuremolekül erforderlich ist. Obwohl keine Festlegung auf eine Theorie beabsichtigt ist, scheint es, dass die Verwendung modularer Oligonukleotide das Aufbrechen von Tertiärstrukturen von Nukleinsäuremolekülen ermöglicht, die nicht nur in tRNA, sondern auch in anderen Nukleinsäuremolekülen vorliegen. Unter Verwendung längerer Oligonukleotide, bei denen die Teile des modularen Oligonukleotids als ein einzelnes Molekül zusammen synthetisiert werden, scheint das Aufbrechen solcher Tertiärstrukturen nicht gleichermaßen effektiv zu erfolgen. Von der vorliegenden Erfindung werden somit Anwendungen profitieren, die eine verbesserte Bindung an Bereiche von Nukleinsäuremolekülen mit einer Tertiärstruktur erfordern, welche die Bindung eines Oligonukleotids an diese Region verhindern oder beeinträchtigen würden. Ohne darauf beschränkt zu sein, umfasst die vorliegende Erfindung daher auch Anwendungen, bei denen das modulare Oligonukleotid als Primer bei Verfahren dient, welche Replikation, Amplifizierung, Transkription, reverse Transkription und/oder Sequenzierung umfassen, oder bei denen das modulare Oligonukleotid als Sonde für die Detektion und/oder den Einfang oder die Isolierung von Zielnukleinsäuremolekülen dient. Es ist ersichtlich, das unter geeigneten Umständen modulare Oligonukleotide beide der vorgenannten Funktionen erfüllen können, z.B. indem sie sowohl als Primer als auch als Einfang-/Detektionssonde für die dadurch hergestellten Nukleinsäureprodukte, z.B. amplifizierte DNA, dienen.
  • Im Falle von Sequenzierungsreaktionen kann es vorkommen, dass ein Primer unabhängig von seiner Länge die erforderlichen Reaktionsprodukte nicht zu liefern vermag. Ein solches Problem kann durch Verwendung eines modularen Primers als Alternative zu einem zusammengesetzten Primer überwunden werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass zusätzlich zu dem ersten Primer einfach ein zweiter Primer in die Sequenzierungsreaktion einbezogen wird, der in geeigneter Weise am Anfang oder Ende des ersten (Sequenzierungs-) Primers bindet und eine verbesserte Bindung des ersten Primers an das Template ermöglicht, wodurch eine geeignete Sequenzierungsreaktion herbeigeführt wird oder verbessert wird. Eine solche verbesserte Bindung im Sinne der Definition der Erfindung wäre nicht zu beobachten, wenn der zweiten Primer einfach an das Ende des ersten Sequenzierungsprimers ligiert wäre. Wenn der Sequenzierungsprimer, der zu einem schlechten Ergebnis führt, ausreichend lang ist, kann alternativ ein modularer Primer verwendet werden, bei dem der Sequenzierungsprimer in wenigstens zwei Teile aufgeteilt ist. Wenn eines der Module des Primers auf einem festen Träger immobilisiert ist, können Sequenzierungsreaktionen direkt auf dem Träger durchgeführt werden (Sanger T7 DNA-Polymerase-Sequenzierung) oder für zyklische Sequenzierung (Taq DNA-Polymerase) verwendet werden.
  • Auf ähnliche Weise kann die Verwendung eines modularen Primers eine Replikation, Amplifizierung, reverse Transkription oder Transkription eines Template-Nukleinsäuremoleküls in einer Weise verbessern oder herbeiführen, die der Verwendung eines einzelnen, aus den getrennten Modulen aufgebauten Primers überlegen ist.
  • Die Einführung von Modulen, die in solchen Reaktionen angrenzend an den Primer binden, können die Reaktionen verstärken und somit die Gesamtsensitivität erhöhen. Wie vorstehend angegeben, kann die vorliegende Erfindung auf der Aufbrechung von Tertiärstrukturen in Nukleinsäuremolekülen beruhen. Tertiärstrukturen wurden als kritisch für die Q-Beta Replikase-Reaktion beschrieben (Kramer und Lizardi, 1989, Nature, 339, S. 401–402). Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Replikation, Amplifizierung, Transkription, reversen Transkription und/oder Sequenzierung eines Zielnukleinsäuremoleküls in einer Probe bereit, worin das Verfahren die Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids in der hier angegebenen Bedeutung als Primer in dem Verfahren umfasst.
  • Bevorzugte Anwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Detektion und/oder den Einfang von Zielnukleinsäuremolekülen, wobei die Bindung einer Sonde an eine Zielnukleinsäure durch die Verwendung einer modularen Sonde mit wenigstens zwei Teilen verbessert wird. Eine solche Anwendung kann beispielsweise bei Southern Blot-Analysen zur Detektion von Zielnukleinsäuremolekülen vorliegen, an welche eine zusammengesetzte Sonde nicht effektiv bindet. „Zusammengesetzt" bezieht sich hier auf das Oligonukleotid, das aus der Synthese geeigneter Module als ein kontinuierliches Oligonukleotid resultieren würde, einschließlich der Insertion jeder erforderlicher Nukleotidbasen, die zu den Basen der Zielnukleinsäure zwischen den nicht direkt angrenzenden Modulen komplementär sind. Eine Verbesserung kann durch die Verwendung einer modularen Sonde erfolgen. Wenn somit beispielsweise ein 10-mer Oligonukleotid nicht effektiv an ein Zielmolekül bindet, kann es durch zwei 5-mer Oligonukleotide ersetzt werden, oder ein 5-mer Oligonukleotid kann zugefügt werden. Auf diese Weise wird die Bindung der modularen Sonden (die in diesem Beispiel insgesamt 10 oder 15 Nukleotide umfassen) im Vergleich mit einer zusammengesetzten Sonde der 10 bzw. 15 Nukleotide (oder mehr, falls die Teife der Sonde nicht direkt angrenzend sind, sobald sie an das Ziel gebunden sind) verbessert.
  • Dieses Verfahren hat sich als hocheffektiv für die Detektion und die Isolierung oder den Einfang von Ziel-DNA in Lösung erwiesen. Bei diesem Verfahren wird eine aus wenigstens zwei Modulen bestehende modulare Sonde verwendet. Ein Modul der modularen Sonde ist das Einfang- oder Detektionsmodul (oder -Oligonukleotid). Die weiteren Module (Modulatoren) wirken unterstützend, indem sie die Bindung des Einfangmoduls an das Zielmolekül verbessern.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Detektion und/oder Isolierung eines Zielnukleinsäuremoleküls in einer Probe bereit, wobei das Verfahren wenigstens den Schritt oder Schritte der Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids aus wenigstens zwei Teilen an angrenzende Abschnitte des Zielnukleinsäuremoleküls in der Probe umfasst.
  • Wenn das Einfang- oder Detektionsmodul und das (die) Modulatormodul(e) eine einzelne Oligonukleotidsonde bilden würden, würde bei diesem Verfahren vorzugsweise die Bindungseffizienz im Vergleich mit der Bindung des Einfang- oder Detektionsmoduls an das Ziel in Gegenwart der freien Modulatormodule verringert sein.
  • Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Detektion und/oder zur Isolierung eines Zielnukleinsäuremoleküls in einer Probe bereit, wobei das Verfahren wenigstens den Schritt oder Schritte der Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids aus wenigstens zwei Teilen an angrenzende Abschnitte des Zielnukleinsäuremoleküls in der Probe umfasst, wobei das modulare Oligonukleotid im Vergleich mit einem einzelnen Oligonukleotid, das zu der von dem modularen Oligonukleotid überspannten Region des Zielmoleküls komplementär ist, eine verbesserte Bindung aufweist.
  • „Isolieren" umfasst hier den Einfang von Zielnukleinsäure, selbst wenn diese nicht aus der Probe entfernt wird, in der sie vorliegt, d.h. eine physikalische Trennung oder Aufreinigung wird nicht notwendigerweise durchgeführt. Solche Ver fahren umfassen den „Einfang" der Zielnukleinsäure aus der Probe, in der sie enthalten ist, indem ein Oligonukleotid daran gebunden wird, so dass sie effektiv von anderen DNA-Molekülen isoliert wird, die in der Probe vorliegen. Bei Isolationsverfahren fungiert das Einfangmodul auch als Isolationsmodul, wodurch eine Isolierung der daran gebundenen Zielmoleküle ermöglicht wird.
  • Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Replikation, Amplifizierung, Transkription und/oder reversen Transkription eines Zielnukleinsäuremoleküls in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren wenigstens den Schritt oder Schritte der Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids aus wenigstens zwei Teilen an angrenzende Abschnitte des Zielnukleinsäuremoleküls in der Probe umfasst.
  • Für eine Isolierung oder einen Einfang ist das Einfangmodul vorzugsweise immobilisiert oder weist Mittel zur Immobilisierung auf. Während modulierende Module immobilisiert sein können oder Mittel für die Immobilisierung aufweisen können, ist es ersichtlich, dass diese dann effektiv als Einfangmodul fungieren können.
  • Das Mittel für die Immobilisierung kann ein inhärenter Teil der Nukleinsäuresequenz des Einfangmoduls sein, beispielsweise kann ein Poly-T-Schwanz für die Bindung an einen festen Träger bereitgestellt werden, der eine komplementäre Oligo-dA-Sequenz trägt. Es ist ersichtlich, dass es nicht ratsam ist, ein Einfangmodul mit einem Poly-A-Schwanz für die Bindung an einen Träger zu verwenden, der eine Oligo-dT-Sequenz trägt, da ein solches Vorgehen zum Einfang von mRNA führen kann, die in der Probe vorliegen kann. Weitere spezifische Sequenzen, die komplementär sind zu Sequenzen, die direkt oder indirekt an einen immobilisierenden Träger angelagert werden können, können zum Zwecke der Immobilisierung ebenfalls Teil des Einfangmoduls sein.
  • Die oben genannten Verfahren umfassen das Hinzufügen weiterer Nukleotide zum Einfangmodul über diejenigen hinaus, die für die Bindung an die Zielnukleinsäure erforderlich sind. Verlängerungen auf diese Weise sind nicht immer erforderlich, und die Mittel für die Immobilisierung können während oder nach der Oligonukleotidsynthese in Nukleotide des Einfangmoduls eingeführt werden, um eine direkte oder indirekte Anlagerung an einen immobilisierenden Träger durch einen Bindungspartner zu ermöglichen. Praktischerweise können derivatisierte Nukleotide während der Synthese verwendet werden um den geeigneten ersten Partner des Bindungspaares bereitzustellen. Der zweite Partner des Bindungspaares wird dann vom Träger getragen. Geeignet derivatisierte Einfangoligonukleotide umfassen somit solche, die Biotin für die Bindung an Avidin oder Streptavidin tragen, Epitope oder Haptene (z.B. Dioxigenin) für die Bindung an Antikörper (die mono- oder polyklonal sein können) oder Antikörperfragmente tragen, oder DNA-Sequenzen für die Bindung an DNA- oder PNA-bindende Proteine (z.B. das lac I-Repressorprotein, das an eine lac Operatorsequenz bindet, welche an das Oligonukleotid angelagert ist) tragen. Andere geeignete Paarungen umfassen Protein A-Antikörper, Protein G-menschliches Serumalbumin (HSA) und funktionale Teile davon. Es ist einsichtlich, dass jeder der Partner der oben angeführten Bindungspaare oder funktionale Teile davon an das Nukleotid binden können. Das Bindungssystem aus Streptavidin/Biotin wird in der Molekularbiologie aufgrund der relativ leichten Einbaubarkeit von Biotin in Nukleotidsequenzen, und tatsächlich auch der kommerziellen Verfügbarkeit Biotinmarkierter Nukleotide, in der Molekularbiologie sehr häufig verwendet, und stellt somit ein bevorzugtes Verfahren zur Anlagerung des Einfangmoduls an den Träger dar.
  • Zahlreiche geeignete Träger für die Immobilisierung von Oligonukleotiden und Verfahren zur Anlagerung von Nukleotiden an diese Träger sind dem Fachmann allgemein bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben. Somit können beispielsweise Träger in Form von Blättern, Gelen, Filtern, Membranen, Mikrofaserstreifen, Platten, Mikrotiter-Wells, Röhren, Dipsticks, Partikeln, Fasern oder Kapillaren verwendet werden, die aus einem polymeren Material bestehen, beispielsweise Agarose, Cellulose, Alginat, Teflon, Latex oder Polystyrol. Partikuläre Materialien, insbesondere Beads, werden im Allgemeinen bevorzugt. Beispielsweise können Sepharose- oder Polystyrol-Beads verwendet werden. Der Träger kann in vorteilhafter Weise magnetische Partikel umfassen, beispielsweise die superparamagnetischen Beads, die von Dynal AS (Oslo, Norwegen) hergestellt und unter der Marke DYNABEADS verkauft werden. Chips können als feste Träger für die Bereitstellung von miniaturisierten experimentellen Systemen verwendet werden, wie beispielsweise in Nilsson et al. (1995, Anal. Biochem., 224, S. 400–408) beschrieben.
  • Der feste Träger kann funktionale Gruppen, wie beispielsweise Hydroxyl-, Carboxyl-, Aldehyd- oder Aminogruppen für die Anlagerung des Einfangmoduls tragen. Diese können im Allgemeinen bereitgestellt werden, indem der Träger so behandelt wird, dass er eine Oberflächenbeschichtung eines Polymers bereitstellt, das eine dieser funktionalen Gruppen trägt, z.B. Polyurethan zusammen mit einem Polyglykol für die Bereitstellung von Hydroxylgruppen, oder ein Cellulosederivat für die Bereitstellung von Hydroxylgruppen, ein Polymer eines Copolymers aus Acrylsäure oder Methacrylsäure für die Bereitstellung von Carboxylgruppen, oder ein aminoalkyliertes Polymer für die Bereitstellung von Aminogruppen. Das US-Patent Nr. 4,654,267 beschreibt die Einführung vieler solcher Oberflächenbeschichtungen.
  • Alternativ kann der Träger andere Reste für die Anlagerung tragen, beispielsweise Avidin oder Streptavidin, DNA-bindende Proteine oder Antikörper oder Antikörperfragmente. Streptavidin-beschichtete DYNABEADS sind von Dynal AS kommerziell erhältlich. Vorzugsweise werden immobilisierende Oligonukleotide hergestellt, die einen Biotin-Rest tragen, der für die Anlagerung an Streptavidin auf einem festen Träger verwendet werden kann.
  • Für die Detektion der Zielnukleinsäure, der ein erfindungsgemäßes Isolierungs- oder Einfangverfahren vorausgehen kann oder auch nicht, kann wenigstens eines der Module der modularen Oligonukleotide markiert sein.
  • Der Begriff „Markierung" bedeutet hier jede Markierung, die qualitativ oder quantitativ, direkt oder indirekt bestimmt werden kann, z.B. aufgrund ihrer enzymatischen Eigenschaften, Strahlungsemission, Streuungs- oder Absorptionseigenschaften, oder ihrer Befähigung zum Zusammenwirken mit oder Bindung an ein komplementäres Agens unter Erzeugung eines detektierbaren Effekts, z.B. der Wechselwirkung mit einem Enzym, wodurch ein Signal erzeugt wird, Gasbildung, Lichtemission, Farbänderung, Trübung, Niederschläge, usw. Solche Markierungen oder Markierungsmittel sind allgemein bekannt, insbesondere auf dem Gebiet der Diagnoseassays, und umfassen beispielsweise Enzyme, Chromophore oder Fluorophore (z.B. Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin), Radiomarkierungen, chemilumineszente Verbindungen oder Reagenzien hoher Elektronendichte, wie Ferritin, Hämocyanin oder kolloidales Gold. Eine Markierung, die eine Enzymaktivität zur Erzeugung einer Farbe für spektrophotometrische Bestimmung verwendet, kann eingesetzt werden, beispielsweise β-Galactosidase, Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, die nach Zugabe eines geeigneten Substrats ein für die Detektion geeignetes Signal erzeugen können.
  • Markierungen werden praktischerweise während oder nach der Synthese in Teile des modularen Oligonukleotids eingeführt. Dies kann auf eine ähnliche Weise wie bei der Bereitstellung von Mitteln für die Immobilisierung erfolgen, beispielsweise durch Bereitstellung des Oligonukleotids mit einem Partner eines Bindungspaars (vor oder nach der Synthese) und anschließende Anlagerung eines zweiten Bindungspartners, der mit einer Markierung versehen ist. Der erste Partner kann aus einem üblichen Bindungspaar stammen, beispielsweise Biotin:Streptavidin, oder kann Teil der Oligonukleotidsequenz selbst sein, an die ein zweites Molekül spezifisch bindet. Alternativ kann ein derivatisiertes Nukleotid, das eine Markierung trägt, beispielsweise ein radiomarkiertes Nukleotid, bei der Synthese des Oligonukleotids verwendet werden oder nach der Synthese derivatisiert werden. Alternativ kann ein Modul mit einem zur Zielnukleinsäure nicht komplementären Teil synthetisiert werden, der inhärent eine Markierung tragen kann, z.B. eine Radiomarkierung, oder für die Anlagerung einer Markierung geeignet ist. Unter Zugrundelegung der Definition der Erfindung werden solche Erweiterungen an einem Modul nicht als Teil des Moduls angesehen, wenn bestimmt wird, ob für ein modulares Oligonukleotid im Vergleich mit einem einzelnen Oligonukleotid, das diese Module überspannt, eine verbesserte Bindung auftritt.
  • Während eine Detektion dadurch erfolgen kann, dass ein oder mehrere markierte Module des modularen Oligonukleotids für die Anzeige einer Bindung verwendet werden, weist ein solches Verfahren den Nachteil auf, dass die an die Zielnukleinsäure gebundenen markierten Module notwendigerweise von dem Bindungsreaktionsgemisch abgetrennt werden müssen, damit eine Detektion über dem Hintergrundniveau möglich ist. Obwohl diese Abtrennung in den meisten Fällen einfach zu bewerkstelligen ist, umfasst ein alternatives Verfahren die Verwendung von Markierungen auf Modulen, die an angrenzende Abschnitte des Ziels binden, und die durch ihre Nähe ein Signal (negativ oder positiv) erzeugen, das detektiert werden kann. Eine solche Markierung weist nicht nur den Vorteil auf, dass für eine Detektion keine Abtrennung erfolgen muss, obwohl diese erforderlichenfalls zusätzlich durchgeführt werden kann, sondern auch den Vorteil, dass das Signal nur erzeugt wird, wenn die Module aneinander angrenzend binden, wodurch das Hintergrundrauschen verringert wird. Beispielsweise können Module mit unterschiedlichen Markierungen verwendet werden, bei denen die Markierungen in ausreichender Nähe vorliegen und von geeigneter Art sind, so dass sie die mögliche Fluoreszenz der anderen Markierung quenchen, wenn die Module an die Zielnukleinsäure gebunden sind. Dementsprechend können beispielsweise zwei Module mit unterschiedlichen Markierungen verwendet werden, von denen eine ein quenchender Farbstoff und die andere ein fluoreszierender Farbstoff ist. Wenn die Farbstoffe nicht aneinander angrenzend gebunden sind, tritt Fluoreszenz auf, wogegen eine messbare Abnahme der Fluoreszenz auftreten kann, wenn angrenzende Bindung vorliegt. Gegebenenfalls kann die Zielnukleinsäure mit gebundenen quenchenden Modulen von ungebundenen Modulen in dem Gemisch abgetrennt werden. Die gebundenen Moleküle können dann freigesetzt werden, z.B. durch Erwärmen zum Aufbrechen der Bindung, wodurch eine Fluoreszenz hervorgerufen wird, wenn die Markierungen auf den Modulen sich trennen, was eine detektierbare Fluoreszenz ermöglicht, die mit der Menge des gebundenen Moduls und somit der Menge der Ziel-DNA korreliert werden kann. Solche Markierungen werden in dem TaqMan-Assay verwendet (Perkin Elmer).
  • Es ist jedoch einsichtig, dass eine Detektion nicht immer auf einer Markierung der Module beruht. Beispielsweise kann Chip-Technologie wie hier beschrieben verwendet werden, bei der das Einfangmodul der modularen Sonde an die Oberfläche des Chips gebunden ist (siehe beispielsweise Nilsson et al., 1995 supra). Wenn das Einfangmodul (in Gegenwart der modulierenden Module) an die Ziel-DNA bindet, erfolgt eine Änderung des Brechungsindex an der Sensoroberfläche. Diese Änderung korreliert mit der Menge der an den Chip gebundenen Ziel-DNA und kann daher als Verfahren zur Detektion und/oder Isolation oder zum Einfang verwendet werden. Dieses Verfahren stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
  • Bei der Ausführung der Erfindung kann in Fällen, bei denen das Modul mit einem Immobilisierungsmittel versehen ist, das Verfahren zusätzlich den weiteren Schritt der Anlagerung eines Einfangmoduls an einen festen Träger umfassen, wobei vor oder nach der Bindung des Einfangoligonukleotids an eine Zielnukleinsäure die Probe, die das Zielmolekül enthält, mit dem immobilisierten Einfangoligonukleotid in Kontakt gebracht wird. Sobald eine Bindung an einen festen Träger erfolgt ist, können Waschschritte auf praktische Weise durchgeführt werden, insbesondere für Aufreinigungszwecke oder zur Entfernung von Hintergrund in Detektionsschritten. Das Einfangoligonukleotid wird vorzugsweise vor der Zugabe der Zielnukleinsäuremoleküle enthaltenden Probe an einen festen Träger gebunden.
  • Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden modulierende Module vorzugsweise vor der Zugabe des freien oder immobilisierten Einfangmoduls zu einer die Zielnukleinsäuremoleküle enthaltenden Probe zugegeben oder mit dieser in Kontakt gebracht, beispielsweise durch 45-minütiges Mischen bei 54°C und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur, um eine Hybridisierung zu ermöglichen.
  • Bei Verfahren, die erfindungsgemäße Verfahren verwenden, insbesondere Assay-Verfahren, können je nach Bedarf zusätzliche Schritte der Isolierung, Abtrennung, Aufreinigung, Bestimmung und/oder des Vergleichens durchgeführt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann somit wenigstens einen der folgenden zusätzlichen Schritte umfassen:
    • a) Anlagerung des Einfangmoduls des modularen Oligonukleotids an einen festen Träger in solchen Fällen, bei denen das Einfangmodul mit einem Immobilisierungsmittel versehen ist;
    • b) Inkontaktbringen der die Zielnukleinsäure enthaltenden Probe mit dem modularen Oligonukleotid;
    • c) Inkontaktbringen der die Zielnukleinsäure enthaltenden Probe mit den modulierenden Modulen des modularen Oligonukleotids;
    • d) Inkontaktbringen der die Zielnukleinsäure enthaltenden Probe mit dem immobilisierten Einfangoligonukleotid, wodurch eine Bindung des Oligonukleotids an Zielnukleinsäure ermöglicht wird;
    • e) Abtrennen der an das Einfangmodul gebundenen Zielnukleinsäure von der Probe;
    • f) Waschen der im obigen Schritt (e) abgetrennten Zielnukleinsäure;
    • g) Bestimmung des Vorliegens oder der Menge an Markierung, die mit der Zielnukleinsäure assoziiert ist, wenn markierte Module verwendet werden, oder Bestimmung des Vorliegens oder der Menge an Zielnukleinsäure, die an das Einfangmodul gebunden ist, wenn keine Markierung verwendet wird; und
    • h) Vergleich der Menge an Markierung oder an gebundener Zielnukleinsäure aus Schritt (g) mit Kontrollmengen.
  • Es ist ersichtlich, dass nicht alle der obigen Schritte in ein beliebiges Verfahren eingebaut werden können, da beispielsweise die Schritte (c) und (d) im Wesentlichen den Schritt (b) in zwei Teilen durchführen. Beim Schritt (g) kann die Bestimmung der Markierung oder der gebundenen Zielmoleküle alternativ über die Bestimmung der nicht mit Zielmolekülen assoziierten Markierung oder über die Bestimmung nicht-gebundener Nukleinsäure durchgeführt werden, wobei diese Werte dann von den Gesamtwerten verwendeter Markierung oder Nukleinsäure subtrahiert werden, wodurch sich der benötigte Wert für Markierung oder gebundene Zielnukleinsäure ergibt. Obgleich diese Werte mit geeigneten Standardkurven korreliert werden können, um absolute Werte zu erhalten, ist dies nicht unbedingt erforderlich, und der Begriff „Bestimmung" umfasst hier sowohl die Quantifizierung im Sinne des Erhaltens eines absoluten Werts für die Menge der Zielnukleinsäure in einer Probe als auch eine semi-quantitative oder qualitative Bestimmung, beispielsweise um lediglich das Vorliegen einer Zielnukleinsäure in der untersuchten Probe zu zeigen. Die Bestimmung kann auch die Erzeugung weiterer Moleküle für die Detektion umfassen, beispielsweise über Sequenzierungs- und/oder Amplifizierungsreaktionen. Geeignete Kontrollmengen hinsichtlich Schritt (h) sind solche, die unter Verwendung der gleichen experimentellen Verfahren für Nicht-Test- oder normale Proben erstellt werden. Es ist einsichtig, dass verschiedene aufeinander folgende Schritte verwendet werden können, um eine Bindung des modularen Oligonukleotids zu erreichen. Beispielsweise kann ein Teil des modularen Oligonukleotids mit der Probe in Kontakt gebracht und dann gebunden werden, worauf weitere Teile des modularen Oligonukleotids in Kontakt gebracht und gebunden werden. Alternativ können die Schritte des Inkontaktbringens gleichzeitig durchgeführt werden.
  • In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung kann das Verfahren folgende Schritte umfassen:
    • 1) Inkontaktbringen der die Zielnukleinsäure enthaltenden Probe mit allen Modulen des modularen Oligonukleotids;
    • 2) Bindung der Module über Hybridisierung;
    • 3) Zugabe eines festen Trägers und Anlagerung von wenigstens einem der mit einem Immobilisierungsmittel versehenen Module an den festen Träger;
    • 4) Abtrennung der an den festen Träger gebundenen Zielnukleinsäure;
    • 5) Waschen des festen Trägers;
    • 6) Amplifizierung der Zielnukleinsäure; und
    • 7) Bestimmung des Vorliegens oder der Menge der amplifizierten Nukleinsäure.
  • Es ist ersichtlich, dass erfindungsgemäß brauchbare modulare Oligonukleotide aus 2–3 Modulen aufgebaut sein können, wobei keine Zwischenräume zwischen ihnen vorliegen, wenn sie an Zielnukleinsäuremoleküle gebunden sind, wobei jedes dieser Module eine unterschiedliche Größe aufweisen kann. Während diese Erfindung sich bei Testen an verschiedenen Ziel-DNA-Stellen als brauchbar erwies, können einige geeignete Modifizierungen der Anzahl und/oder Größe von Modulen für eine optimale Bindung an einer gegebenen Stelle unter besonderen experimentellen Bedingungen angebracht sein. Eine solche Optimierung liegt im Können des Fachmanns, wobei „Versuch und Irrtum"-Experimente der hier dargestellten Art durchgeführt werden können. Das modulare Oligonukleotid enthält vorzugsweise insgesamt mehr als 10 Nukleotide, vorzugsweise wenigstens 18, beispielsweise 18, 24, 27, 29, 31, 33 oder 36 Nukleotide. Bei Bindung an Zielnukleinsäure liegen keine Basen zwischen den Modulen vor.
  • Die modularen Oligonukleotide zur erfindungsgemäßen Verwendung sind solche mit 2 oder 3 Modulen, wobei jedes Modul > 5 Nukleotide, vorzugsweise ≥ 9 ≤ 13, z.B. 9, 11 oder 13 Nukleotide, aufweist. Wenn drei Module verwendet werden, können geringfügig kürzere Module verwendet werden als bei Verwendung von zwei Modulen. Die Gesamtzahl von Nukleotiden in 3-teiligen modularen Oligonukleotiden beträgt vorzugsweise > 23, vorzugsweise > 27 Nukleotide, z.B. 27, 31, 33 oder 36 Nukleotide.
  • Die Module der modularen Oligonukleotide können über chemische oder eine andere geeignete Synthesen hergestellt werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Mehrere brauchbare Oligonukleotide mit einem gebundenen Biotin-Molekül für die Immobilisierung sind kommerziell erhältlich (z.B. KEBO, Stockholm, Schweden).
  • Das Verfahren ist insbesondere mit Hinblick auf virale Zielnukleinsäure brauchbar, beispielsweise für den Hepatitis C-Virus (HCV), und kann für die Überwachung und Diagnose viraler oder anderer Infektionen verwendet werden. Geeignete modulare Oligonukleotide zur Anwendung bei erfindungsgemäßen Verfahren umfassen modulare Oligonukleotide mit einer der folgenden Sequenzen:
  • Für die Detektion, die Isolierung oder den Einfang von HCV an den Positionen 291–341:
    H1-13 + H4 + C2 (13 + 9 + 9) 3'-CACGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'
    H1-11 + H4 + C2 (11 + 9 + 9) 3'-CGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'
    H1-9 + H4 + C2 (9 + 9 + 9) 3'-GGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5
    H3 + H5 + C2 (9 + 9 + 9) 3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-CAGAGCATC-5' + 3'-GGCACGTGG-5'
    H3 + H4 + C2 (9 + 9 + 9) 3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'
  • In den obigen modularen Oligonukleotiden ist das zuletzt angeführte Modul vorzugsweise das Einfangmodul (d.h. C1, C2 oder OMD2) und kann einen Rest für die Immobilisierung tragen, vorzugsweise ein Biotin-Molekül am 5'-Ende. Diese modularen Oligonukleotide zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren stellen weitere Aspekte der Erfindung dar. Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion und/oder Isolierung von HCV bereit, wobei die Oligonukleotide eine der folgenden Nukleotidsequenzen umfassen:
    3'-CACGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-CGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-GGGCCCTCC-5' + 3'AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-CAGAGCATC-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5';
    oder Analoga oder Derivate davon, bei denen Nukfeotidbasen modifiziert oder derivatisiert sind.
  • Die Erfindung ist auch brauchbar für die Identifizierung und/oder Isolierung von Ziel-HIV-Nukleinsäure. Diesbezüglich wurden modulare Sonden entworfen, die gegen die Polymerase-Region von HIV-1 gerichtet sind, um einen Einfang und/oder eine Isolierung des HIV RNA-Genoms für Diagnosezwecke zu ermöglichen. Obwohl HIV-RNA Poly A enthält, welches eine Aufreinigung über Bindung an einen festen, Oligo-dT-tragenden Träger ermöglicht, wobei praktischerweise das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, wird ein Einfangoligonukleotid verwendet, das angrenzend an die Stelle bindet, an der sich RT-PCR-Primer befinden würden, so dass die Effekte von RNAsen minimiert werden.
  • Die Erfindung ist auch brauchbar für die Identifizierung und/oder Isolierung von Sequenzierungsprodukten, die durch Primerextension erzeugt wurden, beispielsweise durch den universellen Sequenzierungsprimer (USP). Solche Produkte müssen nach der Synthese aufgereinigt und/oder angereichert werden, bevor sie auf ein Elektrophoresesystem aufgetragen werden. Obwohl Alkoholfällung routinemäßig verwendet wird, kann diese nicht leicht automatisiert werden. Die Verwendung modularer Sonden erlaubt den Einfang solcher Produkte, die beispielsweise durch herkömmliche T7 DNA-Polymerasesequenzierung oder zyklische Sequenzierungsprotokolle erzeugt wurden. Es ist einsichtig, dass bei der Verwendung eine Anpassung hinsichtlich der verschiedenen, für die Synthese der Extensionsprodukte verwendeten Primer erfolgen kann. Für den Einfang von Produkten universeller Primerextensionsreaktionen umfassen geeignete modulare Oligonukleotide zur Verwendung bei erfindungsgemäßen Verfahren modulare Oligonukleotide mit einer der folgenden Sequenzen:
    JL-H1/USP + JL-C2/USP (9 + 9) 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'
    JL-H2/USP + JL-H1/USP + JL-C2/USP (13 + 9 + 9) 3'-GTTCGAACGTACG-5' + 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'
  • Bei den obigen modularen Oligonukleotiden ist vorzugsweise das letzte angeführte Modul das Einfangmodul (d.h. JL-C1/USP, JL-C2/USP) und kann einen Rest für die Immobilisierung tragen, vorzugsweise ein Biotinmolekül am 5'-Ende. Diese modularen Oligonukleotide zur Verwendung bei erfindungsgemäßen Verfahren stellen weitere Aspekte der Erfindung dar. Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion und/oder zur Isolierung von Primerextensionsprodukten, insbesondere des Primers USP, bereit, wobei die Oligonukleotide eine der folgenden Nukleotidsequenzen umfassen:
    3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'; oder
    3'-GTTCGAACGTACG-5' + 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5',
    oder Analoga oder Derivate davon, bei denen Nukleotidbasen modifiziert oder derivatisiert sind.
  • Solche Analoga und Derivate umfassen modifizierte oder derivatisierte Nukleotidbasen oder Oligonukleotide, wie vorstehend erwähnt, welche ihre Fähigkeit zur Erfüllung der hier beschriebenen Komplementaritätserfordernisse beibehalten und welche beispielsweise Nukleotide mit Markierungen oder Mitteln zur Immobilisierung umfassen. Alternativ können bestimmte oben beschriebene Basen durch andere nicht-komplementäre Basen oder derivatisierte Basen ersetzt werden, welche die Bindung an die Zielnukleinsäure nicht in einem solchen Maße verhindern, dass diese nicht mehr unter die hier beschriebene Definition für Komplementarität fällt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt auch modulare Oligonukleotide wie hier beschrieben und deren Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren bereit. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren, die wenigstens Folgendes umfassen:
    eines der folgenden modularen Oligonukleotide
    3'-CACGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-CGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG5'; oder
    3'-GGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-CAGAGCATC-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder
    3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'; oder
    3'-GTTCGAACGTACG-5' + 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5',
    oder Analoga oder Derivate davon, bei denen Nukleotidbasen modifiziert oder derivatisiert sind.
  • Vorzugsweise ist wenigstens eines der Module auf einem festen Träger immobilisiert oder weist Mittel für eine Immobilisierung auf. Wenigstens eines der Module kann markiert sein, um eine Detektion der Zielnukleinsäure zu ermöglichen. Zusätzlich können geeignete Puffer und/oder ein fester Träger bereitgestellt werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren, bei denen:
  • 1 ein typisches Sensorgramm zeigt;
  • 2A eine schematische Darstellung eines viralen Einfangs mit einem Oligonukleotidmodul (= hybridisierende Sonde) (18-5-mer) zeigt, das über ein immobilisiertes 18-mer Einfangoligonukleotid (= immobilisierte Sonde) auf der Chipoberfläche injiziert wurde;
  • 2B die Ergebnisse des Einfangs unter Verwendung des 18-mer Einfangoligonukleotids zeigt (* bezeichnet die Einfangdaten, wenn eine Lücke von 18 Nukleotiden zwischen dem Einfangoligonukleotid und dem Oligonukleotidmodul vorlag – Säule 11);
  • 3A eine schematische Darstellung eines viralen Einfangs mit zwei Oligonukleotidmodulen der modularen Sonde (9-mer und 18-5-mer) zeigt, die über ein immobilisiertes 9-mer Einfangoligonukleotid injiziert wurden (* bezeichnet Einfangdaten bei Fehlen des Oligonukleotidmoduls H4 – Säule 1; Säule 12 zeigt Einfangdaten, wenn eine Lücke aus 18 Nukleotiden zwischen den Oligonukleotidmodulen vorlag);
  • 3B die Ergebnisse eines Einfangs unter Verwendung des 9-mer Einfangoligonukleotids zeigt;
  • 4A der 3A entspricht, wobei jedoch eine Lücke aus einem Nukleotid zwischen dem Einfangoligonukleotid und dem ersten angrenzenden Oligonukleotid der modularen Sonde oder zwischen den beiden Nicht-Einfangoligonukleotidmodulen der modularen Sonde vorliegt;
  • 4B die Ergebnisse des Einfangs unter Verwendung einer modularen Sonde mit Lücken zwischen den Modulen zeigt;
  • 5A und B den Effekt verschiedener Modulanzahlen der modularen Sonde zeigen;
  • 6 den modularen Effekt an der Stelle 2 des HCV-Genoms zeigt;
  • 7 eine schematische Darstellung der Verwendung modularer Oligonukleotide zum Einfang von HCV-DNA oder -RNA zeigt;
  • 8 die Ergebnisse des Einfangs von HCV-DNA auf magnetische Beads bei Fehlen oder in Gegenwart eines Oligonukleotidmoduls zeigt;
  • 9 die Ergebnisse der BIAcore-Analyse des Einfangs von HCV-RNA auf die Chipoberfläche bei Fehlen oder in Gegenwart eines Oligonukleotidmoduls zeigt;
  • 10 die Ergebnisse des Einfangs von HCV-RNA auf magnetische Beads bei Fehlen oder in Gegenwart eines Oligonukleotidmoduls nach einer einzelnen PCR zeigt;
  • 11 die Ergebnisse des Einfangs von HCV-RNA auf magnetische Beads bei Fehlen oder in Gegenwart eines Oligonukleotidmoduls nach verschachtelter PCR zeigt;
  • 12 die Ergebnisse des Einfangs von HCV-RNA aus klinischen Proben von Hepatitis C auf magnetische Beads bei Fehlen oder in Gegenwart eines Oligonukleotidmoduls nach einzelner PCR zeigt, und
  • 13 die Ergebnisse der BIAcore-Analyse des Einfangs von ss-DNA von HIV-1 bei Fehlen oder in Gegenwart eines Oligonukleotidmoduls auf die Chipoberfläche zeigt.
  • BEISPIEL 1: Einfang von ssDNA unter Verwendung eines Einfangoligonukleotids und wenigstens eines zusätzlichen Oligonukleotids als modulare Sonde.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die vielfache Steigerung des Einfangs von ssDNA durch ein immobilisiertes Einfangoligonukleotid, wenn spezifische Oligonukleotidmodule zuvor mit der DNA hybridisiert wurden. Das Einfangoligonukleotid (das in diesem Beispiel als Einfangoligonukleotid oder immobilisiertes Oligonukleotid bezeichnet wird) und das mit der DNA hybridisierte Oligonukleotid (worauf in diesem Beispiel mit Oligonukleotidmodule Bezug genommen wird) zusammen sind die Module der modularen Sonde.
  • Es wurden verschiedene Kombinationen von Einfangoligonukleotiden und Nukleotidmodulen für die Bindung an die DNA verwendet. Dementsprechend wurden 18-mer Einfangoligonukleotide in Verbindung mit entweder einem 18-, 15-, 13-, 11-, 9- oder 5-mer Oligonukleotidmodul verwendet (2B), 9-mer Einfangoligonukleotide mit einem 9-mer Oligonukleotidmodul mit oder ohne ein zweites Oligonukleotidmodul (18-, 15-, 13-, 11-, 9- oder 5-mer) (3B). Es wurden ebenfalls modulare Sonden mit einer Lücke von 1 Nukleotid zwischen den Annealing-Stellen der Module getestet (4B und 5A). Um den modularen Effekt weiter zu untersuchen, wurde ein biotinyliertes 36-mer Oligonukleotid (welches das 18-mer Einfangoligonukleotid C1 und dem 18-mer Oligonukleotidmodul H1-18 umfasste) entworfen und auf seine Effizienz beim Einfang von HCV getestet (5B).
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PCR-Amplifizierung (Template-Erzeugung)
  • Klone, welche die 5'-nicht-translatierte Region (NTR) zweier Genotypen (2b und 3a) des Hepatitis C-Virus (HCV) in den pGEM®-T Vektoren (Promega, Madison, WI, USA) enthielten, wurden als Template bei der PCR für die Erzeugung eines 324 bp-Fragments für die Biosensor-Analyse verwendet. Die PCR-Amplifizierung wurde mit jeweils 0,2 μM jedes Primers OU49 und OD66 durchgeführt;
    OU49 5'-GGCGACACTCCACCATGAATC-3'
    OD66 5'-Biotin-GGTGCACGGTCTACGAGACC-3'
  • Die Amplifizierung wurde in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, das 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1% Tween® 20, 0,2 mM dNTP's und 0,5 U AmpliTaq® DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA) enthielt, wobei ein Perkin-Elmer 9600 Thermocycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) verwendet wurde. Das Temperaturprofil bestand aus 5 Minuten bei 94°C und anschließend 30 Zyklen von (15 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 62°C, 60 Sekunden bei 72°C) und einer Endphase von 10 Minuten bei 72°C.
  • Herstellung von Einzelsträngen
  • Die biotinylierten PCR-Produkte wurden auf Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Beads (Dynabeads® M-280 Streptavidin; Dynal, Oslo, Norwegen) immobilisiert und ein reines Template für die Hybridisierung durch strangspezifische Elution erhalten (Hultman et al., 1989, Nucl. Acids Res., 17, S. 4937–4946). 50 Mikroliter des PCR-Produkts wurden durch 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit 5 mg/ml Beads in 50 μl Bindungs-/Waschpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1% Tween® 20) eingefangen. Nach Waschen und Entfernen des Überstands wurden die Stränge durch fünfminütige Inkubation mit 10 μl 0,1 M NaOH getrennt. Der alkalische Überstand mit dem nicht-biotinylierten Strang wurde mit 6 μl 0,1667 mM HCl und 1 μl 280 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, neutralisiert. Um eine Wechselwirkung irgendwelcher co-eluierter biotinylierter Stränge mit dem Streptavidin auf dem Sensorchip zu verhindern, erfolgte in einer zweiten Runde ein Vermischen mit sedimentierten Streptavidin-Beads (250 μg) und ein Sammeln des Überstands. Um die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben innerhalb eines Experiments zu verringern, wurde die eluierte einzelsträngige DNA chargiert. Die hergestellte einzelsträngige DNA wurde dann qualitativ und quantitativ auf einem 10–15% PAGE mit PhastSystemTM und PhastGel®-DNA-Pufferstreifen und dem DNA Silver Staining-Kit (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) analysiert.
  • Oligonukleotide
  • Biotinylierte Oligonukleotide zur Immobilisierung auf der Sensoroberfläche und Oligonukleotide für die Hybridisierung mit dem ss-HCV-PCR-Produkt wurden von KEBO, Stockholm, Schweden, bezogen. Die Oligonukleotidsequenzen sind für Stelle 1 in Tabelle 1 und für Stelle 2 in Tabelle 2 gezeigt.
  • Biosensoranalyse
  • In allen Experimenten wurde ein Instrument vom Typ BIAcore® 2000 (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Schweden) verwendet. Es wurden Sensorchips SA (Pharmacia Biosensor) verwendet, die mit etwa 4000 RU Streptavidin (1000 RU entspricht etwa 1 ng/mm2 Streptavidin) vorbeschichtet waren. Die Experimente wurden bei 25°C mit 6 × SSPE (0,9 M NaCl (pH 7,4), 60 mM NaH2PO4, 7,5 mM EDTA und 0,005% (v/v) Surfactant P20 (Pharmacia Biosensor)) als Injektions- und Laufpuffer durchgeführt. Die biotinylierten Oligonukleotide für den Einfang auf dem Sensorchip wurden mit einer Konzentration von etwa 500–1000 RU (1000 RU entspricht etwa 1 ng/mm2 (Stenberg et al., 1991, J. Colloid Interface Sci., 143, S. 513–526) durch Injektion von 50 μl 6 × SSPE, das 1 μM biotinyliertes Oligonukleotid enthielt, mit einer Flussrate von 30 μl/Minute immobilisiert. Vor und nach der Verwendung in Hybridisierungsexperimenten wurden die Sensorchips mit drei Schüben 50 mM NaOH (5 μl, 5 μl/min) behandelt, um die Oberfläche zu regenerieren (R). Eine Flusszelle ohne immobilisiertes Oligonukleotid wurde als Referenz verwendet.
  • Hybridisierung und Einzelstrangeinfang
  • Oligonukleotidmodule wurden an die ss-Ziel-DNA durch 45-minütige Inkubation bei 54°C in einem Hybridisierungsofen unter konstanter Rotation hybridisiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Hybridisierung wurde in 100 μl 6 × SSPE durchgeführt, das etwa 200 nM ssDNA und 500 nM Oligonukleotide enthielt.
  • 40 μl des Hybridisierungsgemisches wurden bei einer Flussrate von 5 μl/min über das immobilisierte Einfangoligonukleotid injiziert. Kontrollproben ohne hybridisierende Sonden wurden auf genau die gleiche Weise behandelt. Die Oligonukleotidoberfläche wurde mit 50 mM NaOH (5 μl, 5 μl/min) regeneriert.
  • ERGEBNISSE
  • Ein Fragment von 324 Basenpaaren (bp) der nicht-translatierten Region (NTR) von HCV wurde über PCR erzeugt. Die dsDNA wurde über Trennung mit magnetischen Beads auseinander geschmolzen, um ssDNA zu erhalten, die für den Einfang durch Oligonukleotide geeignet war, die auf einem Sensorchip in dem Biosensor immobilisiert waren. Diese ssDNA wurde vor der Injektion über den Sensorchip mit Oligonukleotidmodulen hybridisiert, was zu einem hocheffizienten Einfang der HCV-DNA führt.
  • Bei diesem Beispiel wurde die Biosensor-Technologie verwendet, die eine Überwachung biologischer Vorgänge in Echtzeit ermöglicht (Jönsson et al., 1991, BioTechniques, 11, 620–672). Diese Methode verwendet einen Sensorchip als festen Träger für die Immobilisierung. Die Detektion basiert auf Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) zur Überwachung von Änderungen des Brechungsindex auf der Sensoroberfläche über die Zeit. Die Änderungen sind proportional zur Masse der an die Oberfläche gebundenen Moleküle und werden in einem sogenannten Sensorgramm als Resonanzeinheiten (RU) über die Zeit gezeigt. Ein repräsentatives Sensorgramm, das die Injektion (A) des biotinylierten C1 (18-mer Einfangoligonukleotid) zeigt, ist in 1 dargestellt. Die Immobilisierung verläuft schnell und die Menge an gebundenem Oligonukleotid wird mit 700 RU durch Vergleich der Antworteinheiten vor und nach dem Injektionsschub bestimmt. Nach der Regenerierung (R) der Sensoroberfläche mit 50 mM NaOH wurde das immobilisierte Einfangoligonukleotid zum Einfang der einzelsträngigen Ziel-DNA durch Hybridisierung verwendet. Wie in 1(B) gezeigt, hybridisieren nur vernachlässigbare Mengen (< 20 RU), wenn nur einzelsträngige Ziel-DNA über den Sensorchip injiziert werden. Wenn die einzelsträngige Ziel-DNA nach Vor-Annealing des Oligonukleotidmoduls H1 (18-mer), das so entworfen war, dass es an das Einfangoligonukleotid angrenzte, über den Sensorchip (C) geleitet wurde, wurden im Gegensatz dazu signifikante Mengen zurückgehalten (250 RU).
  • Untersuchung des modularen Effekts unter Verwendung eines 18-mer Oligonukleotids als Einfangsonde an Stelle 1.
  • Ein biotinyliertes 18-mer Einfangoligonukleotid (C1) wurde auf einem Streptavidin-Sensorchip immobilisiert. Einzelsträngige HCV-DNA mit und ohne zuvor hybridisierten Oligonukleotidmodulen wurde, wie im Methodenabschnitt beschrieben, über den Sensorchip injiziert. Das experimentelle Protokoll ist schematisch in 2A und die Ergebnisse sind in 2B gezeigt. Die Ergebnisse stellen normalisierte Werte aus unabhängigen Experimenten als Folge der Variation absoluter Antworten zwischen unterschiedlichen Sensorchips dar, in Abhängigkeit von der auf der Chipoberfläche beschichteten Menge an Streptavidin, wodurch die Menge des immobilisierten Einfangoligonukleotids und die Einfangeffizienz beeinflusst werden. Die geringe Einfangeffizienz mit ssDNA, die über ein immobilisiertes 18-mer Einfangoligonukleotid (C1) injiziert wurde, ist in 2B, Säule 1, gezeigt. Ein ähnlich niedriger Einfang wurde auch erzielt, selbst wenn ein 5'-Spacer von 10 Adeninen mit dem 18-mer verwendet wurde (C1x10A, Tabelle 1) (Daten nicht gezeigt). In den nachfolgenden Einfangexperimenten wurde ein prähhybridisierter Komplex verwendet, der ss-Ziel-DNA und Oligonukleotidmodule umfasste. Die Länge der Oligonukleotidmodule variierte von 18 bis 5 Nukleotiden, aber alle waren so entworfen, dass ein Annealing angrenzend an das 3'-Ende des immobilisierten Einfangoligonukleotids erfolgte (Tabelle 1). Unter Verwendung der spezifischen Oligonukleotidmodule (H1-18, 15, 13, 11; 18- bis 11-mere war im Vergleich mit dem Experiment ohne ein Oligonukleotidmodul (Säule 1) eine signifikante Steigerung des Einfangs (230 bis 320 RUs) zu beobachten (2B, Säulen 2–5). Eine deutlich verringerte oder manchmal fehlende Einfangeffizienz lag jedoch vor, wenn die Länge von H1 weniger als 9 Nukleotide betrug (2B, Säule 6 und 7). Die verschiedenen Kontrollen zeigen klar die Spezifität der Hybridisierung zwischen dem immobilisierten Einfangoligonukleotid und dem Komplex aus einzelsträngiger DNA/Oligonukleotidmodul, da die Antwort aus Wechselwirkungen von Oligonukleotiden oder nicht-spezifischer DNA vernachlässigbar waren (2B, Säulen 8 bis 11). Säule 11 zeigt, dass kein Einfang auftritt, wenn eine Lücke von 18 Nukleotiden zwischen den verschiedenen Modulen vorliegt.
  • Untersuchung des modularen Effekts unter Verwendung eines 9-mer Oligonukleotids als Einfangsonde.
  • Ein biotinyliertes 9-mer Einfangoligonukleotid (C2) wurde auf einem SA-Sensorchip immobilisiert und die Oligonukleotidmodule wurden in kleinere Module fraktioniert. Das experimentelle Protokoll ist schematisch in 3A und die Ergebnisse sind in 3B gezeigt. Erwartungsgemäß war kein Einfang von DNA zu beobachten, wenn ein immobilisiertes Einfangnonamer (C2) alleine verwendet wurde (3B, Säule 1). Wenn das Nonamer-Oligonukleotidmodul (H4) und das Oligonukleotidmodul (H1-18, 15, 13, 11, 9) verwendet wurden, wurde ssDNA erfolgreich eingefangen (3B, Säulen 3–7). Wie in 2B gezeigt, blieben jedoch modulunterstützter Einfang mit dem kurzen Pentamer-Modul (H1-5)(Säule 8) ebenso wie die Verwendung eines einzelnen Nonamer-Oligonukleotidmoduls (H4) (Säule 2) erfolglos. Zusammen mit den Daten aus den 5A und 5B legen diese Ergebnisse nahe, dass nicht die Länge des Einfangoligonukleotids der wichtigste Parameter ist, sondern dass es vielmehr auf die Anzahl und Länge der verwendeten Oligonukleotidmodule ankommt. Um das Konzept zu verifizieren, wurden Kontrollexperimente für sowohl die immobilisierten 18-mer Einfangoligonukleotide als auch die immobilisierten 9-mer Einfangoligonukleotide durchgeführt. Zuerst wurden nicht-spezifische Wechselwirkungen untersucht, indem nicht-spezifische DNA ähnlicher Größe über das Einfangoligonukleotid (2B, Säule 8, und 3B, Säule 10) injiziert wurde und indem das Oligonukleotidmodul alleine (2B, Säule 9 und 3B, Säule 11) injiziert wurde. Dabei wurde kein Anstieg der Antwort beobachtet. In einem zweiten Schritt wurde nicht-spezifische DNA mit der Ziel-DNA und dem Oligonukleotidmodul co-inkubiert. Der Einfang war noch spezifisch, und Interferenz durch nicht-spezifische DNA wurde nicht beobachtet (2B, Säule 10; 3B, Säule 9). Der modulare Ansatz vermag somit ein spezifisches Ziel ohne Reduktion des Signals einzufangen, wenn Konkurrenz durch nicht-verwandte DNA vorliegt. Säule 12 zeigt, dass kein Einfang auftritt, wenn eine Lücke von 18 Nukleotiden zwischen den Nicht-Einfangoligonukleotidmodulen vorliegt.
  • Der Effekt von Lücken zwischen Oligonukleotidmodulen
  • Aus den vorangegangenen Experimenten ergaben sich klar nachteilige Effekte von Lücken aus 18 Nukleotiden zwischen den Oligonukleotidmodulen (3B, Säule 12) und/oder der immobilisierten Einfangprobe (2B, Säule 11) auf die Einfangeffizienz. Um weitere Einschränkungen hinsichtlich des durch Oligonukleotidmodule unterstützten Einfangansatzes zu analysieren, wurden Lücken aus einzelnen Nukleotiden zwischen den Modulen der modularen Sonde eingeführt. Das H1-11-mer Einfangoligonukleotid und die beiden Nonamer-Oligonukleotidmodule (H4 und H1-9) wurden umgestaltet und deren Annealing-Stellen ein Nukleotid zum 5'- Ende der Ziel-DNA verschoben und in H2, H5 bzw. H3 umbenannt (Tabelle 1). Ein Vergleich zeigte, dass nicht-kontinuierliche Sonden einzelsträngige Zielmoleküle einzufangen vermochten, jedoch mit geringerer Effizienz (4A, B).
  • Fragmentierung langer Oligonukleotide in kürzere Module Dieses Experiment wurde durchgeführt, um weiter zu untersuchen, ob die Effizienz durch Fragmentierung ausgedehnter Einfangoligonukleotide in kürzere modulare Einheiten verbessert werden könnte. Wie in 5A (Säulen 1, 2 und 3) gezeigt, kam es zu einem geringen Einfang von DNA, wenn ein immobilisiertes 27-mer Oligonukleotid für den Einfang oder wenn zwei Oligonukleotide mit einer Gesamt-Annealing-Länge von 27 Nukleotiden verwendet wurden. Wenn dieser Abschnitt aus 27 Nukleotiden in drei Nonamere fragmentiert wurde, wurde jedoch ein hocheffizienter Einfang beobachtet (5A, Säule 4). Dieses Ergebnis wurde weiter untermauert durch ein Einfangoligonukleotid aus 36 Nukleotiden (C4) (Tabelle 1), das einzelsträngige Ziel-DNA nicht effizient einfängt (5B, Säule 1), während die Verwendung von Oligonukleotidmodulen und einer kürzeren, immobilisierten Einfangsonde den Einfang signifikant verbessert (5B, Säulen 2, 3 und 4).
  • Um zu untersuchen, ob dieser Effekt in anderen Positionen des HCV-Genoms (Stelle 2) zu beobachten ist, wurde ein zweites 18-mer Einfangoligonukleotid zusammen mit einem 18-mer Oligonukleotidmodul entworfen. Die Oligonukleotidsequenzen sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Untersuchung des modularen Effekts an Stelle 2 des HCV-Genoms Ein biotinylisiertes 18-mer Einfangoligonukleotid (OMD2) wurde wie oben beschrieben auf einem SA-Sensorchip immobilisiert. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die Injektion von ssDNA mit einem 18-mer Oligonukleotidmodul (OMD6) führte zu einem Anstieg von 400 RU (Säule 2), während ssHCV alleine nicht eingefangen wurde (Säule 1).
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Dieses Beispiel zeigt, dass ssHCV von dem auf dem Chip immobilisierten 18-mer Oligonukleotid schlecht oder gar nicht eingefangen wird (2B, Säule 1, 4B, Säule 3 und 5B, Säule 5). Wenn ssHCV mit einem Oligonukleotidmodul aus 18, 15, 13 oder 11 Nukleotiden inkubiert wurde, war ein signifikant gesteigerter Einfang zu beobachten (2B, Säulen 2–5). Die Inkubation von ssHCV-DNA mit einem 9-mer oder einem 5-mer Oligonukleotidmodul führte jedoch nicht zu einem gesteigerten Einfang (2B, Säulen 6–7). Wenn ein 36-mer Einfangoligonukleotid anstelle des 18-mer Einfangoligonukleotids und des 18-mer Oligonukleotidmoduls verwendet wurde, wurde ein geringer Einfang von HCV beobachtet (5B, Säule 1). Diese Ergebnisse stellen einen weiteren Beleg für den modularen Effekt dar. Nicht-spezifische Hybridisierung der HCV-DNA wurde durch Injektion eines Nicht-HCV-ss-PCR-Produkts ähnlicher Größe (das auf die gleiche Weise behandelt wurde) über das Einfangoligonukleotid untersucht (2B, Säule 8). Die nicht-spezifische Hybridisierung der Oligonukleotidmodule wurde untersucht und ebenfalls ausgeschlossen (2B, Säule 9).
  • Ein Einfang von DNA wurde nicht beobachtet, wenn ein immobilisiertes 9-mer Einfangoligonukleotid für den Einfang alleine (3B, Säule 1) oder zusammen mit einem einzelnen 9-mer Oligonukleotidmodul (3B, Säule 2) verwendet wurde. Wenn jedoch zwei 9-mer Oligonukleotidmodule mit der DNA inkubiert wurden, wurde ein hocheffizienter Einfang durch das immobilisierte 9-mer beobachtet (3B, Säule 7). Das Annealing dieser Oligonukleotide erfolgt an der gleichen Position auf der DNA wie das des 18-mer Einfangoligonukleotids mit dem 9-mer Oligonukleotidmodul (2B, Säule 6), aber eine Hybridisierung ist nur dann zu beobachten, wenn zwei Oligonukleotidmodule statt einem Oligonukleotidmodul verwendet werden. Der modulare Effekt verschwand, wenn eine Lücke von 18 und 9 Nukleotiden zwischen den zweiten und dritten Oligonukleotiden der modularen Sonden eingeführt wurde (3B, Säule 12, Daten für die Lücke aus 9 Nukleotiden nicht gezeigt). Um den Effekt des Einführens einer Lücke zwischen den Modulen weiter zu untersuchen, wurden drei 9-mer Oligonukleotide mit einer Lücke aus einem Nukleotid dazwischen entworfen. Diese Lücken aus einem Nukleotid scheinen zu einem geringfügig schwächeren Einfang von HCV-DNA zu führen, aber trotzdem wurden gute Hybridisierungssignale von etwa 50 bis 100 RU erhalten (4B, Säulen 5 und 6). Die Lücke zwischen dem Einfangoligonukleotid und dem ersten Oligonukleotidmodul (Säule 5) führte zu einem geringfügig effizienteren Einfang als die Lücke zwischen den zweiten und dritten Modulen (Säule 6). Eine einzelne Lücke zwischen den Modulen einer modularen Sonde mit zwei Modulen führte gegenüber der nicht-modularen Sonde ebenfalls zu einem verbesserten Einfang, war aber im Vergleich mit einer 2-Modul modularen Sonde ohne eine Lücke zwischen den Modulen schlechter (4B, Säulen 1 und 2).
  • Die Ergebnisse bei Experimenten unter Verwendung modularer Sonden, die komplementär zur Stelle 2 waren, unterstützen ebenfalls die modulare Theorie, da eine 200-fache Verstärkung des Signals beobachtet wurde, wenn das 18-mer Oligonukleotidmodul vor dem Einfang durch das immobilisierte Oligonukleotid mit der DNA hybridisiert wurde (6).
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • BEISPIEL 2 Einfang von ssDNA von HIV unter Verwendung eines Einfangoligonukleotids und wenigstens eines zusätzlichen Oligonukleotids als die modulare Sonde
  • Verfahren für die Identifizierung und/oder den Einfang von Zielnukleinsäure von HIV werden analog den in Beispiel 1 für HCV beschriebenen durchgeführt, wobei die folgenden modularen Sonden verwendet werden:
    OMD82x13 + OMD83 (13 + 18) 3'-TTAATTTCGGTCC-5' + 3'-TTACCTACCGGGTTTTCA-5'-Biotin, oder
    OMD81 + OMD82 (18 + 18) 3'-AGGATAACTTTGACATGG-5' + 3'-TCATTTTAATTTCGGTCC-5'-Biotin
    wobei OMD83 und OMD82 Einfangoligonukleotide sind.
  • BEISPIEL 3: Einfang von durch den USP-Primer erzeugten Sequenzierungsprodukten unter Verwendung eines Einfangoligonukleotids und wenigstens eines zusätzlichen Oligonukleotids als modulare Sonde.
  • Verfahren für die Identifizierung und/oder den Einfang von Sequenzierungsprodukten, die durch Extension des universellen Sequenzierungsprimers (USP) erzeugt wurden, werden analog dem in Beispiel 1 für HCV beschriebenen durchgeführt, wobei die folgenden modularen Sonden verwendet werden:
    JL-H1/USP + JL-C2/USP (9 + 9) 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'-Biotin, oder
    JL-H2/USP + JL-C1/USP (13 + 18) 3'-GTTCGAACGTACG-5' + 3'-GACGTCCAGCTGAGATCT-5'-Biotin, oder
    JL-H2/USP + JL-H1/USP + JL-C2/USP (13 + 9 + 9) 3'-GTTCGAACGTACG-5' + 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'-Biotin
    wobei JL-C1/USP + JL-C2/USP Einfangoligonukleotide sind.
  • BEISPIEL 4 Verwendung modularer Oligonukleotide für den Einfang von HCV-DNA oder -RNA
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Einfangoligonukleotid C1 tragende magnetische Beads
  • Ein für den Hepatitis C-Virus spezifisches Einfangoligonukleotid C1 (Tabelle 1) wurde kovalent an paramagnetische Beads gebunden (Dynal, AS). Die magnetischen Beads (10 mg/ml) wurden durch zweimaliges Waschen in Bindungs-/Waschpuffer (B/W) (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM HCl, 2 M NaCl, 1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1% Tween 20) konditioniert. Zur Verringerung der nicht-spezifischen Adsorption von Nukleinsäuren wurde 1 μg E.coli-tRNA (Boehringer Mannheim, Deutschland) zu den Beads gegeben, die dann in 6 × SSPE (0,9 M NaCl (pH 7,4), 60 mM NaH2PO4 und 7,5 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml resuspendiert wurden.
  • Konstruktion des rekombinanten Hepatitis C-Ziels
  • RNA von Hepatitis C wurde aus Serumproben infizierter Individuen extrahiert und RT-PCR wie von Yun et al, 1993 (J. Med. Virol., 39, S. 57–61) beschrieben unter Verwendung der Primer OU49 und OD66 (siehe Beispiel 1) durchgeführt. Dadurch wurde ein die 5'-nicht-translatierte Region (NTR) von HCV (Nukleotide 18-341 des HCV-Genoms, GenBank-Datenbank, Zugangsnummer: M62321) enthaltendes 324 bp-Fragment erzeugt, das zunächst in den Vektor pGEM®-T (Promega, Madison, WI, USA) subkloniert und dann zwischen die SphI- und SalI-Restriktionsschnittstellen in dem Polylinker des Plasmids pGEM®-4Z (Promega, Madison, WI, USA) inseriert und kloniert wurde.
  • Herstellung rekombinanter einzelsträngiger DNA von Hepatitis C
  • Einzelsträngige DNA-Ziele wurden unter Verwendung der Primer OU49 und OD66 durch PCR-Amplifizierung der in pGEM®-4Z klonierten 5'-NTR von HCV, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
  • Festphasen- (Bead)-Hybridisierung einzelsträngiger DNA
  • Einzelsträngige Ziel-DNA wurde seriell in Zehnerpotenzen (von 1013 bis 104 Kopien/ml HCV-DNA) in einem Puffer verdünnt, der 0,2 μg/μl E.coli tRNA enthielt. Prähybridisierung erfolgte durch 15-minütige Inkubation von 30 μl s/s-DNA bei 54°C in 100 μl 6 × SSPE, das 1 μg E.coli tRNA und 0,5 μM Oligonukleotidmodul H1-18 (Tabelle 1) enthielt. Parallel dazu wurden Kontrollproben ohne dieses prähybridisierende Oligonukleotid hergestellt. DNA-Proben (mit und ohne das prähybridisierende Oligonukleotid) wurden dann mit den zuvor hergestellten magnetischen Beads (gebundenes C1) durch 1,5-stündige Inkubation des Hybridisierungsgemisches mit 250 μg Beads bei Raumtemperatur unter konstanter Rotation hybridisiert. Nach dem Hybridisierungsschritt wurden die Beads sechsmal in B/W-Puffer gewaschen (und vor dem letzten Waschschritt in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt) und in 100 μl H2O resuspendiert. Die DNA-gebundene Bead-Suspension wurde entweder sofort für die PCR verwendet oder bei 4°C gelagert. Die PCR-Amplifizierung wurde mit 0,2 μM des prähybridisierenden Oligonukleotidmoduls (H1-18) und des Stromaufwärts-Primers (OU49) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, das 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 0,2 mM dNTP's und 0,5 U von AmpliTag® DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA) enthielt. Das Gemisch wurde mit 50 μl leichtem Mineralöl überschichtet (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) und 5 μl resuspendierte Beads wurden durch diese Schicht aus Mineralöl zugegeben. Die PCR wurde auf einem Thermocycler vom Modell Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung eines Temperaturprofils von 5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von 15 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 62°C, 1 Minute bei 72°C und abschließenden 10 Minuten bei 72°C durchgeführt. Semi-verschachtelte PCR wurde mit H1-18 und IU50 (5'-GGA ACT ACT GTC TTC ACG CAG A-3') mit 5 μl des äußeren PCR-Produkts unter Verwendung derselben Zyklus-Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch eine Annealing-Temperatur von 55°C verwendet wurde.
  • Die PCR-Produkte wurden in einem 1% Agarosegel elektrophoretisch getrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die PCR umfasste mehrere negative Kontrollen ohne Template-DNA. Zur Vermeidung von Kontaminationen wurden für das Mischen der Reagenzien, die Zugabe von Probe und die PCR-Analyse getrennte Räume verwendet.
  • Herstellung rekombinanter RNA von Hepatitis C
  • Aufgereinigtes Plasmid in einem pGEM®-4Z-Klon, das die 5'-NTR von HCV enthielt, wurde stromabwärts von der Insertionssequenz durch 6-stündigen Verdau von 5 μg DNA mit NarI bei 37°C linearisiert. Danach erfolgte eine Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Das erhaltene DNA-Pellet wurde in 50 μl H2O, das mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) (Sigma Chemical Co., St. Lous, Mo.) behandelt worden war, gelöst. Eine Transkription vom T7-Promotor wurde 1 Stunde bei 37°C mit 1,5 μg der linearisierten DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, das 30 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 30 mM MgCl2, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,4 mM dNTP's, 5 μg BSA (RNAse- und DNAse-frei, Boehringer Mannheim, Deutschland), 10 mM DTT und etwa 40 Einheiten RNAguard Ribonuclease Inhibitor (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) enthielt, wodurch ein Transkript mit einer Länge von 649 nt erzeugt wurde. Nach der Transkription wurde die Template-DNA durch Restriktionsverdau (mit Aval) und Behandlung mit 8 Einheiten RNase-freier DNAse I (Boehringer Mannheim, Deutschland) bei 37 °C über einen Zeitraum von 45 Minuten fragmentiert. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wurde das erhaltene Pellet in 50 μl DEPC-behandeltem H2O resuspendiert. Die in vitro transkribierte RNA wurde dann über Gelanalyse analysiert und durch Messung der OD260 quantifiziert. Das Verhältnis aus OD260/OD280 der erhaltenen RNA-Präparation betrug 1,87 ± 0,1. Eine Verdünnungsreihe der DNA in Fünfer- und Zehnerschritten wurde dann in 10 ng/μl Escherichia coli-tRNA durchgeführt.
  • Biosensoranalyse rekombinanter Hepatitis C-RNA
  • Biosensor-Experimente wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung eines Instruments vom Typ BIAcore 2000 unter Verwendung von C1 (Tabelle 1) als Einfangmodul durchgeführt, wobei das Injektionsvolumen jedoch auf 60 μl erhöht wurde, welches mit einer Flussrate von 30 μl/Minute injiziert wurde. Sechs Mikroliter RNA-Transkript wurden an 0,5 μM Oligonukleotidmodul (H1-18) in 100 μl 6 × SSPE durch 15-minütige Inkubation bei 54 °C und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur prähybridisiert. 40 Mikroliter dieses Hybridisierungsgemisches wurden bei einer Flussrate von 2 μl/Minute über das immobilisierte Einfangoligonukleotid (C1) injiziert. Proben ohne prähybridisierendes Oligonukleotid wurden auf genau die gleiche Weise behandelt.
  • Festphasen- (Beads)-Hybridisierung und Detektion rekombinanter Hepatitis C-RNA
  • Das Verfahren für den Einfang von RNA auf Beads ist dasselbe wie für den Einfang von DNA beschrieben, nämlich 15-minütige Prähybridisierung des Oligonukleotidmoduls an 30 μl RNA bei 54°C und anschließend Einfang auf magnetischen Beads (die mit der HCV-spezifischen Einfangsonde C1 verbunden sind) durch 1,5-stündige Rotation bei Raumtemperatur. Die RNA wurde seriell in Fünferschritten (von 5 × 107 auf 1,6 × 104 Kopien/ml) in 0,2 μg/μl E.coli-RNA verdünnt. Die Beads mit der eingefangenen mRNA wurden viermal in B/W-Puffer und zweimal in kaltem RT-PCR-Puffer gewaschen (und vor dem letzten Waschschritt in eine neues Eppendorf-Röhrchen überführt) und vor der Verwendung für die RT-PCR in 100 μl DEPC-behandeltem H2O resuspendiert. Wenn die Bead-Suspension nicht sofort für die RT-PCR verwendet wurde, wurde sie bei –70°C gelagert. Für die Transkription und den RNA-Einfang wurden alle Glasgeräte und Lösungen (mit Ausnahme der Tris-Puffer) mit DEPC behandelt, um eine mögliche Kontaminierung mit RNase zu vermeiden. Reverse Transkription und äußere PCR wurden in einem Ein-Röhrchen-Assay durchgeführt. Reverse Transkription wurde 1 Stunde mit 5 μl resuspendierter Beads bei 37°C (unter kontinuierlicher Rotation) unter Verwendung von 0,5 Einheiten MMLV Reverse Transkriptase und anschließend PCR-Amplifizierung mit 2 Einheiten Ampli Taq Gold® (Perkin-Elmer, Foster City, CA) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren dieselben wie oben für die äußere PCR beschrieben, wobei ein 12-minütiger Vorerhitzungsschritt bei 94°C zur Aktivierung von Ampli Taq Gold® hinzugefügt wurde. Um eine Inhibierung von Taq Polymerase-Aktivität durch reverse Transkriptase [Sellner et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20, S. 1487–1490] zu verhindern, wurden 4 Mikrogramm E.coli-tRNA ebenfalls zugefügt. Positive und negative Kontrollen wurden ebenso wie eine Kontrolle ohne reverse Transkriptase einbezogen. Fünf Mikroliter des Gemisches für die äußere PCR wurde in der semiverschachtelten inneren PCR mit dem prähybridisierenden Oligonukleotidmodul (H1-18) und dem Stromaufwärts-Primer IU50 verwendet.
  • Modul-unterstützter Einfang von Hepatitis C in klinischen Proben unter Verwendung von Beads als fester Phase
  • Es wurden bei –20°C gelagerte Serumproben aus HCV-infizierten Patienten verwendet. Der Genotyp der Proben wurde bestimmt (Yun et al, 1993, supra) und die Proben unter Verwendung des Amplicor HCV Monitor Tests (Roche Molecular Systems) quantifiziert. Zu Beginn wurden 0,5 μM Oligonukleotidmodul mit 100 μl Serumprobe in 1 ml 6 × SSPE, das 1 μg E.coli-tRNA und 500 μl Lösung D (4 M Guanidiniumthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat pH 7, 0,5% Sarcosyl, 0,1 M β-Mercaptoethanol) enthielt, durch 10-minütiges Erhitzen auf 60°C prähybridisiert, gefolgt von 45-minütiger Inkubation unter Rotieren bei Raumtemperatur. Jede sechste Probe war eine Nicht-HCV-Serumnegativkontrolle. Kovalent an C1 gebundene Beads (250 μg), die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden dann zu diesem Hybridisierungsgemisch gegeben und 1 Stunde unter Rotation inkubiert, um den Einfang zu erleichtern. Die Beads wurden dann viermal in 100 μl B/W-Puffer und zweimal in 100 μl PCR-Puffer gewaschen. Die Beads wurden in 20 μl H2O resuspendiert, 3 Minuten bei 70 °C erhitzt und sofort auf Eis gestellt. RT-PCR wurde unter Verwendung von 10 μl der Bead-Suspension, wie von Yun et al., (1993, supra) beschrieben, durchgeführt.
  • ERGEBNISSE
  • Hybridisierung auf magnetische Beads einzelsträngiger DNA
  • Um die Verwendung modularer Sonden bei der durch magnetische Beads vermittelten Probenherstellung von Hepatitis C-Virus zu untersuchen, wurde ein Modellsystem erstellt, das schematisch in 7 dargestellt ist. Beads mit einer kovalent gebundenen 18-mer Sonde (C1), die zur Virus-Ziel-DNA komplementär war, stellten den festen Träger für diese Experimente dar. Ein 18-mer Oligonukleotidmodul (H1-18) wurde für ein an die immobilisierte Einfangsonde angrenzendes Annealing entworfen und synthetisiert. Einzelstrang-DNA, die der 5'- nicht-translatierten Region (NTR) von Hepatitis C entsprach, wurde durch in vitro Amplifizierung und alkalische Strangtrennung nach dem Verfahren für Festphasensequenzierung hergestellt. Quantifizierte einzelsträngige DNA-Templates wurden in Zehnerschritten seriell verdünnt. Ein 15-minütiger Prähybridisierungsschritt bei 54°C unter Verwendung des Oligonukleotidmoduls und seriell verdünnter Templates wurde durchgeführt. Die Hybridisierungsgemische wurden anschließend für Festphaseneinfang 90 Minuten bei Raumtemperatur mit magnetischen Beads inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads gewaschen und in PCR-Röhrchen überführt, die Reagenzien und Primer für eine einzelne Amplifizierung der Zielregion von Hepatitis C enthielten. Eine Inkubation von Kontrollproben ohne das Oligonukleotidmodul in dem Prähybridisierungsschritt wurde parallel durchgeführt. Bei erfolgreicher Amplifizierung war ein Fragment von etwa 320 bp zu erwarten. Die Ergebnisse nach der Amplifizierung sind in 8 gezeigt. In dem oberen Feld, das mit einem Oligonukleotidmodul hergestellten Proben entspricht, ist ein amplifiziertes Fragment bis hinunter zu einem Verdünnungsschritt zu sehen, der etwa 104 Ausgangsmoleküle enthält, während ohne das Oligonukleotidmodul eine etwa zehnfach niedrigere Sensitivität erreicht wird (ein schwaches Fragment ist bei dem Verdünnungsschritt zu sehen, der 105 Ausgangsmolekülen entspricht). Dies zeigt den Nutzen der Verwendung einer modularen Sonde beim Bead-unterstützten Einfang an.
  • BIAcore-analysierte Hybridisierung von RNA
  • Die vorangegangene Gruppe von Experimenten befasste sich mit der Verwendung von DNA-Zielen, die dem positiven Strang des RNA-Genoms des Hepatitis C-Virus entsprachen. Daher wurden in vitro transkribierte RNA-Proben erzeugt, um einen direkteren Vergleich mit echten Proben zu ermöglichen. Nach in vitro Transkription eines die Zielregion enthaltenden linearisierten Plasmidkonstrukts wurde das 649 nt lange Transkript extrahiert und quantifiziert. Die hergestellte RNA wurde als Zielnukleinsäure in einem Ansatz verwendet, welcher der vorangegangenen BIAcore-Analyse einzelsträngiger DNA ähnelte. Die RNA wurde dementsprechend mit einem Oligonukleotidmodul (500 nmol) wie oben verwendet (H1-18, 18-mer) prähybridisiert und dann über das immobilisierte Einfangoligonukleotid (C1, biotinyliertes 18-mer) auf der Chipoberfläche geleitet. Eine Kontrollprobe ohne das Oligonukleotidmodul wurde parallel dazu eingesetzt. Als Leerkontrolle wurden diese beiden Proben auch über eine Chipoberfläche ohne irgendein immobilisiertes Einfangoligonukleotid geleitet. Die erhaltenen Daten sind als Plot für die beiden subtrahierten Proben in 9 übereinander gelegt. Die Daten zeigen deutlich, dass bei Verwendung einer modularen Sonde signifikant mehr Ziel-RNA eingefangen wird. Es ist auch wichtig festzuhalten, dass die Reaktionen während des Injektionsschubs (20 min) noch keine Sättigung erreicht haben und deshalb die absoluten Differenzen wahrscheinlich sogar höher sind.
  • Hybridisierung und Detektion von RNA auf magnetischen Beads
  • Als Ergebnis der erfolgreichen BIAcore-Analyse wurde das Modellsystem auch mit magnetischen Beads mit einem kovalent gebundenen Einfangoligonukleotid (C1) untersucht. Um einen Vergleich zu erleichtern, wurde die Template-RNA, wie zuvor für DNA-Templates beschrieben, in Zehnerschritten seriell verdünnt. Die Verdünnungen wurden dann 15 Minuten bei 54°C mit der 18-mer Oligonukleotidmodul-Sonde (H1-18) und anschließend weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur mit magnetischen Beads inkubiert. Kontrollproben ohne H1-18 wurden parallel dazu eingesetzt. Nach einem Waschschritt wurde eine Ein-Röhrchen-RT-PCR mit den Proben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt und zeigen ein schwaches Fragment bei der Verdünnung, die etwa 104 Ausgangs-RNA-Molekülen entspricht, während ohne das Oligonukleotidmodul eine etwa zehnfach niedrigere Sensitivität erreicht wird. Zur weiteren Untersuchung der quantitativen Unterschiede wurde eine engere Verdünnungsreihe (fünffach) in einem RT-verschachtelten PCR-Experiment verwendet. Verschachtelte PCR ermöglicht einen Vergleich bei dem PCR-Plateaugrad, bei dem alle Verdünnungen unabhängig von der Anzahl der Ausgangskopien eine Sättigung erreicht haben. 11 zeigt, dass mit eine Oligonukleotidmodulsonde 140 RNA Ausgangskopien detektiert werden können, während ohne die Oligonukleotidmodulsonde 700 Kopien für eine Detektion erforderlich sind. Diese Ergebnisse stehen in völligem Einklang mit den für einzelsträngige DNA-Templates erhaltenen Ergebnissen.
  • Detektion von Hepatitis C in klinischen Proben unter Verwendung von modulunterstütztem Einfang
  • Die ermutigenden Ergebnisse mit den beiden entweder auf DNA- oder RNA-Zielen basierenden Modellsystemen der Erfinder zeigten, dass modulare Sonden den Einfang entweder auf einer Chipoberfläche oder einem festen Partikel verbesserten. Dies veranlasste die Erfinder dazu, den Ansatz mit klinischen, Hepatitis C-Virus enthaltenden Proben zu untersuchen. Zunächst wurden zwei HCV-positive Proben (unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes wie oben dargestellt) durch serielle fünffache Verdünnung der Proben und anschließende 10-minütige Inkubation in einer 500 nmol des Oligonukleotidmoduls enthaltenden denaturierenden Lösung bei 60°C analysiert. Diese wurden dann vor Zugabe von Beads mit kovalent gebundener Einfangsonde 45 Minuten bei Raumtemperatur und in einer weiteren Inkubation 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die Beads, wie oben beschrieben, direkt in RT-PCR-Röhrchen überführt. 12 zeigt eine der beiden Proben mit und ohne ein Oligonukleotidmodul und bestätigt den zuvor gezeigten Trend, d.h. die Verbesserung der Einfangleistung durch Einbeziehung eines Oligonukleotidmoduls. Nach weiterer Amplifizierung dieser beiden seriell verdünnten Proben mit inneren Primern wird auch ein ungefährer absoluter Wert erhalten, der eine bis zu 25-fach höhere Sensitivität mit dem Oligonukleotidmodul anzeigt (Daten nicht gezeigt).
  • Abschließend wurden dann insgesamt 19 klinische Proben unter Verwendung des beschriebenen Ansatzes analysiert. Alle davon waren zuvor mit einem kommerziellen Test (Amplicor HCV Monitor Test, Roche) quantifiziert worden. In fünf dieser 14 Proben war ein Vergleich mit und ohne Oligonukleotidmodul ebenfalls möglich. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt und weisen bei allen Virustitern eine gute Korrelation zwischen dem kommerziellen Test und dem modulunterstützten Einfang auf. Interessanterweise war bei einer der fünf verglichenen Proben kein viraler Einfang möglich, wenn das Oligonukleotidmodul weggelassen wurde.
  • Dies bestätigt den bei den Modellsystemen beobachteten Trend und zeigt wirklich, dass der Prähybridisierungsschritt auch die Sensitivität der Detektion klinischer Proben erhöht.
  • DISKUSSION
  • Die vorliegende Untersuchung zeigt die Brauchbarkeit modularer Oligonukleotide beim Einfang einzelsträngiger Templates. Interessanterweise ist diese nicht nur auf kurze Fragmente, wie in unserem Modellsystem verwendet, beschränkt, sondern auch vollständige Genome von Hepatitis C werden effizienter eingefangen. Unterschiede zwischen DNA- und RNA-Zielen, die aufgrund von deren unterschiedlicher chemischer Strukturen erwartet werden könnten, sind nicht zu beobachten. Im Gegensatz dazu waren bei Tests mit und ohne Oligonukleotidmodul identische Einfangmuster zu sehen.
  • Vorläufige Studien zeigen auch, dass das Verfahren für den viralen Einfang durch Kombination der Prähybridisierung, der Lyse der Proben (in Guanidiumthiocyanat) und des Bead-Einfangs in einem einzelnen Schritt verkürzt werden könnte. Dadurch ist vor der RT-PCR nur ein einfacher Waschschritt erforderlich, was das System für automatisierte Ansätze sehr attraktiv macht.
  • Tabelle 3 – Zusammenfassung der Ergebnisse mit klinischen Proben
    Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • BEISPIEL 5 Oligonukleotidmodul-unterstützter Einfang von HIV-1-Virus
  • Es werden Experimente mit einem Modellsystem beschrieben, das aus einem klonierten Fragment des Genoms von HIV-1, der pol-Region (Tabelle 4), besteht. Die pol-Region stellt ein häufig benutztes Ziel bei verschiedenen diagnostischen Systemen zur Detektion und Quantifizierung des HIV-1-Virus dar.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Konstruktion eines rekombinanten HIV-Ziels und die Herstellung einzelsträngiger HIV-DNA
  • Unter Verwendung der POL-spezifischen Primer JA 79 und TV 84 (Tabelle 4) wurde eine PCR mit dem proviralen HIV-1MN-Stamm (Myers et al, 1991, Human Retrovirus and AIDS 1991, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico) durchgeführt. Dadurch wurde ein Fragment mit 378 bp erzeugt, das in den pGEM®-T-Vektor kloniert wurde. Durch PCR-Amplifizierung dieses klonierten POL-Gens unter Verwendung der vektorspezifischen Primer RIT 28 und RIT 29 wurde einzelsträngige DNA hergestellt. Das erhaltene biotinylierte Fragment mit 800 bp wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, strangspezifisch eluiert.
  • Biosensoranalyse rekombinanter HIV-DNA
  • Ein HIV-spezifisches biotinyliertes Oligonukleotid (OMD82, siehe Beispiel 2) wurde auf dem Sensorchip immobilisiert, worauf sich eine Injektion von 40 μl einzelsträngiger HIV-DNA anschloss, die an OMD 81 prähybridisiert war (wie für das HCV-Ziel beschrieben). Eine Kontrollprobe ohne Oligonukleotidmodul wurde parallel verarbeitet. Die Zielsequenz, die die Nukleotide 473–509 des Genoms von HIV-1 darstellt in diesem Fall ist 5'-TCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGG-3'.
  • Tabelle 4 – PCR-Primer
    • JA79 (pol) 5'-ACAGGAGCAGATGATACAGTATTAG-3'
    • TV 84 (pol) 5'-GACATTCGAATTCCCTTCCTTTTCCATTTCTGTAC-3'
    • RIT 28 (Vektor) 5'-AAAGGGGGATGTGTGCTGCAAGGCG-3'
    • RIT 29 (Vektor) 5'-Biotin-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3'
  • ERGEBNISSE
  • Einzelsträngige DNA-pol-Ziele wurden auf ähnliche Weise wie im Fall von Hepatitis C erzeugt; d.h. strangspezifische Elution biotinylierter PCR-Amplicons unter Verwendung Streptavidin-beschichteter magnetischer Beads. Die erhaltenen einzelsträngigen DNA-Ziele wurden über eine Sensorchipoberfläche injiziert, die eine komplementäre Sondensequenz enthielt, und die Wechselwirkung in Echtzeit über das Biosensorsystem gemessen. Die Experimente wurden mit und ohne ein Oligonukleotidmodul durchgeführt. Durch Übereinanderlegen der Plots aus dem Biosensor-Experiment zeigen die Ergebnisse (13) erneut, dass modulare Sonden tatsächlich den Einfang verstärken.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Detektion und/oder Isolierung eines Zielnukleinsäuremoleküls in einer Probe, wobei das Verfahren wenigstens den Schritt der Bindung eines komplementären modularen Oligonukleotids in zwei oder drei Teilen (Modulen) an direkt angrenzende Abschnitte des Zielnukleinsäuremoleküls in der Probe, und den Schritt der Detektion und/oder Isolation des an das Oligonukleotid gebundenden Zielnukleinsäuremoleküls umfasst, wobei jedes Modul > 5 ≤ 13 Nukleotide aufweist, das modulare Oligonukleotid gegenüber einem einzelnen zusammengesetzten Oligonukleotid, das komplementär ist zu der von dem modularen Oligonukleotid überspannten Region des Zielmoleküls, eine verbesserte Bindung aufweist, wenigstens ein Modul (Einfangmodul) immobilisiert ist oder Mittel zur Immobilisierung aufweist, und das Einfangmodul über Isolationsverfahren die Isolation ermöglicht.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes Modul ≥ 9 ≤ 13 Nukleotide aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes Modul ≥ 5 ≤ 9 Nukleotide aufweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei jedes Modul 9, 11 oder 13 Nukleotide aufweist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das modulare Oligonukleotid insgesamt aus wenigstens 18 Nukleotiden besteht.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das modulare Oligonukleotid aus dem Einfangmodul und modulierenden Modulen besteht und die modulierenden Module einer die Zielnukleinsäuremoleküle enthaltenden Probe zugegeben oder damit in Kontakt gebracht werden, bevor das freie oder immobilisierte Einfangmodul zugegeben wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Immobilisierung über das Streptavidin:Biotin-Bindungssystem erfolgt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei mindestens ein Modul markiert ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei man: 1) die Probe, welche die Zielnukleinsäure enthält, mit allen Modulen des modularen Oligonukleotids in Kontakt bringt; 2) die Module über Hybridisierung bindet; 3) einen festen Träger zugibt und wenigstens eines der mit einem Mittel zur Immobilisierung ausgestatteten Module an den festen Träger anlagert; 4) an den festen Träger gebundene Zielnukleinsäute abtrennt; 5) den festen Träger wäscht; 6) die Zielnukleinsäure amplifiziert; und 7) das Vorliegen oder die Menge der amplifizierten Nukleinsäure bestimmt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Ausmaß der Bindung durch eine Änderung des Brechungsindex an eine Sensoroberfläche bestimmt wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Detektion und/oder Isolierung einer HCV-Nukleinsäure, wobei das modulare Oligonukleotid eine der folgenden Nukleotidsequenzen umfasst: 3'-CACGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder 3'-CGGGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder 3'-GGGCCCTCC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder 3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-CAGAGCATC-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder 3'-GGGGCCCTC-5' + 3'-AGAGCATCT-5' + 3'-GGCACGTGG-5'; oder Analoga oder Derivate davon, bei denen Nukleotidbasen modifiziert oder derivatisiert sind.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Detektion und/oder Isolierung von Primerextensionsprodukten.
  13. Verfahren nach Anspruch 12 zur Detektion und/oder Isolierung von Sequenzierungsprodukten.
  14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das modulare Oligonukleotid eine der folgenden Nukleotidsequenzen umfasst: 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5'; oder 3'-GTTCGAACGTACG-5' + 3'-GACGTCCAG-5' + 3'-CTGAGATCT-5', oder Analoga oder Derivate davon, bei denen Nukleotidbasen modifiziert oder derivatisiert sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 14, wobei das zuletzt genannte Modul des modularen Oligonukleotids das Einfangmodul ist.
  16. Modulares Oligonukleotid nach Anspruch 11 oder 14.
  17. Verwendung eines molekularen Oligonukleotids nach Anspruch 16 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
  18. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Kit wenigstens umfasst: ein modulares Oligionukleotid nach Anspruch 11 oder 14, wobei vorzugsweise wenigstens eines der Module markiert ist, um die Detektion der Zielnukleinsäure zu ermöglichen.
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