JPH0587A

JPH0587A - ヌクレオチドの分枝移動

Info

Publication number: JPH0587A
Application number: JP3080564A
Authority: JP
Inventors: James G Wetmur; ジーウエツトマージエームズ; Robin S Quartin; エスクオーテインロビン; Dean L Engelhardt; エルエンゲルハートデイーン
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1990-03-26
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 1993-01-08
Also published as: DE69133392D1; CA2037349A1; EP0450370A1; US6358685B1; CA2037349C; US5958681A; EP0450370B1; US20050053926A1; DE69133392T2

Abstract

(57)【要約】【目的】一本鎖または部分的二本鎖であってリンカー鎖
にハイブリダイズするディスプレーサを利用し、不安定
分枝移動オリゴおよびポリデオキシヌクレオチドを形成
して安定化する手順および組成物（ディスプレーサは１
以上の修飾ヌクレオチドを含有し得る）を提供する。【構成】受容体ポリデオキシヌクレオチド配列の１本の
鎖と一本鎖ＤＮＡのディスプレーサ配列との不安定複合
体を形成するに際し、ディスプレーサ配列を受容体ポリ
デオキシヌクレオチド配列のこの種の鎖に対して少なく
とも部分的に相補的とし、この複合体を安定化させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、安定な分枝移動構造
およびこれらの構造の種々の応用に関する。

【０００２】

【従来の技術】同一のヌクレオチド配列を有する他の一
本鎖による二本鎖核酸の１つの鎖の置換は、生体内にお
けるＤＮＡまたはＲＮＡの複製および遺伝子組換えに関
する文献によく記載された観点である。分枝点は、この
種の鎖置換を行う核酸中に認められ、そこでは、２つの
鎖が塩基対合相互作用について第３の鎖の相補的な配列
と競合する。核酸の鎖に沿った分枝点の移動、分枝移動
は、特定の酵素または蛋白質の作用を必要としない。

【０００３】末端反復性、環状置換バクテリオファージ
ＤＮＡの再生分子における分枝移動の生体内現象は、リ
ー・デービスとデビッドソンによって最初に報告された
［ＪＭＢ４８：１−２２（１９７０）］。鎖転位の研究
に適した分枝核酸構造は、種々のハイブリダイゼーショ
ン条件を使用して試験管内で構成することができる。

【０００４】分枝移動は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
の形成または解析に利用された。ホルムアミドを含まな
い溶液中で、ＤＮＡ鎖はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドか
らＲＮＡを置換し得る。この反応は、アライド社のバリ
ーらにより開発された均一核酸ハイブリダイゼーション
アッセイの基礎である［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．
（１９８７）１５，６８８３−６８９７および米国特許
第４，７９５，７０１号］。このアッセイには、転位し
たＲＮＡ鎖のＲＮａｓｅ消化、ＡＭＰのＡＴＰへの変換
並びにルシフェラーゼを使用する化学発光による変換生
成物の検出が含まれる。バリーの方法は、ＤＮＡクロー
ン化には適用することができない。

【０００５】濃縮されたホルムアミド溶液中では、ＤＮ
Ａ鎖はＲＮＡによって置換され、Ｒ−ループが形成され
得る［トーマス・エム・ホワイト・アール・エルとデー
ビス・アール・ダブリュ（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７３，２２９４−２２
９８参照］。概念的には、Ｒ−ループ形成は、デュープ
レックスの端部からの１つのＤＮＡ鎖の転位に類似す
る。二本鎖ＤＮＡの領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッ
ドがより安定な条件下で相補的ＲＮＡ配列を捕捉し、Ｒ
−ループが形成され得る［キャセイ・ジェイとダビッド
ソン・エヌ（１９７７）ＮＡＲ４：１５３９−１５５
２］。特定のＤＮＡ配列の集積は、これらの配列を含む
Ｒ−ループを選択する浮遊密度沈降を使用して達成され
た。これらのＲ−ループ形成の技術は未だ特許化されて
いない。今日まで、Ｒ−ループ手順の応用は標的ＤＮＡ
の部分的変性を含み、標準的クローン化ベクタに直接ク
ローン化し得る生成物を与えていない。

【０００６】Ｒ−ループ形成に類似するＤ−ループ形成
は、ＤＮＡ鎖とスーパーヘリックスＤＮＡデュープレッ
クスとの間で生起し得る［ラディング・シー・エム、ビ
アッティ・ケー・エル、ホロマン・ダブリュ・ケー、ウ
イーガンド・アール・シー（１９７７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１１６，８２５−８３９］。この反応はスーパ
ーヘリックス自由エネルギーに依存し、したがって線状
ＤＮＡ分子では起こり得ない。この観察を基礎とするク
ローン化技術はこれまで記載されていない。スーパーヘ
リックスＤＮＡにおけるＤ−ループ形成は、特定の開裂
に使用されている［コーレイ・ディ・アール、ペイ・デ
ィ並びにシュルツ・ピー・ジー（１９８９）Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，８５２３−８５２５］。

【０００７】スーパーヘリックスＤＮＡ分子に対するＤ
−ループ形成の限界を克服すべく、ＲｅｃＡ被覆鎖を使
用する方法が開発された［リガス・ビー、ウェルチャー
・エー・エー、ワード・ディ・シー並びにワイスマン・
エス・エム（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８３，９５９１−９５９５］。ビ
オチニル化ヌクレオチドを用いる一本鎖プローブのラベ
ルにより、アフィニティクロマトグラフィによるこの反
応のＤ−ループ生成物の精製が促進される。ビオチニル
化ヌクレオチドを含有するＤＮＡハイブリッドは、未修
飾ＤＮＡハイブリッドより低い融解温度を有する。すな
わち、ビオチンはヘリックスに対する脱安定化効果を有
する［ランガーら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６６３３−６６３７］。
この方法では、Ｄ−ループ形成には、Ｄ−ループ形成を
促進する予備処理工程の実行が必要である。更に、この
手順では、存在するＤＮＡクローン化ベクタに直接クロ
ーン化し得る生成物を結果的に得ることはできない。

【０００８】より長いＤＮＡ鎖にハイブリダイズした短
いＤＮＡ鎖も、試験管内で均一ではあるがより長い重複
鎖によって迅速に置換され得る［グリーン・シーとチベ
ット・シー（１９８１）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
９，１９０５−１９１８参照］。この観察は、分岐移動
およびＤＮＡ鎖置換に基くＤＮＡまたはＲＮＡ配列につ
いての診断的アッセイの基礎を形成する。コリンら［Ｍ
ｏｌ＆Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ２：１５−３０（１９８
８）］、バリーら［Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２：１６９
６−１７０１（１９８６）］、米国特許第４，７６６，
０６４号［ウイリアムスら（１９８８）、アライド
社］、第４，７６６，０６２号［ダイアモンドら（１９
８８）、アライド社］、第４，７５９，７０１号［バリ
ーら（１９８８）、アライド社］並びにヨーロッパ特許
第０１６７２３８Ａｌ［コリンズら（１９８５）、アラ
イド社］および第０１６４８７６Ａｌ［コリンズら（１
９８５），アライド社］に記載されている。

【０００９】これらのアッセイにおいて、部分的二本鎖
プローブ複合体を、２本の鎖の１つの上で検出し得るラ
ベルを用いて調製する。その後このプローブ複合体を、
適切なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸を含
有するサンプル（すなわち、プローブ複合体の一本鎖部
分に少なくとも部分的に相同の二本鎖核酸）とインキュ
ベートする。標的核酸はプローブ複合体の一本鎖部分に
ハイブリダイズし、分岐移動してラベルされたプローブ
鎖を放出する。放出されるラベルされた鎖の量は、サン
プル中の標的ＤＮＡの量に比例する。よって、このアッ
セイは、予備形成部分的二本鎖プローブ複合体を使用し
て分岐移動を行うことを含み、分岐移動構造およびラベ
ルしたプローブ鎖の全放出の遷移的性質に基く。

【００１０】これらのアッセイにおいて、鎖置換反応の
効率は、容積排除剤、例えばポリエーテルの添加によ
り、またはＲｅｃＡ蛋白質による標的の予備処理により
増強され得る。他のものには、ＲｅｃＡ蛋白質は、３′
→５′方向の一方向に進行する分岐移動を促進すること
も記載されている［コックス・エム・エムとレーマン・
アイ・アール（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６０１８−６０２２］。アラ
イド社により開発された診断アッセイでは予備形成デュ
ープレックスを使用して置換を促進するが、遺伝子工学
技術の開発または分岐移動構造の安定化には関係しな
い。

【００１１】よって、安定なハイブリッドの形成により
開始される分岐移動の現象が文献に記載されている。Ｄ
ＮＡ配列の同定，精製並びに集積に分岐またはループ構
造が使用されているにも拘らず、この技術は未だ直接ク
ローン化し得る生成物の開発に応用されていない。更
に、分岐移動構造の安定化により、これらの実体の収集
および同定を含む手順の効率が増強され得る。安定な分
岐移動構造を調製する単純な方法は、他のものによって
は報告されていない。

【００１２】２０年以上前に記載された実験に、ピリミ
ジンのＣ５位置の臭素の置換により増加したデュープレ
ックス安定性が与えられることが示されている［ミカエ
ルソンらＰｒｏｇ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．＆Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏ．６：８４−１４１］。ラディングら［Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１１６：２８６９−２８７６（１
９６２）］は、ｄＧ−ＢｒｄＣはｄＧ−ｄＣより熱的に
より安定な塩基であることを示した。他の研究によれ
ば、ポリｄｌ：ポリＢｒｄＣはポリｄＩ：ポリｄＣより
高い融解温度２６°Ｃを有し［インマンとバルドウィン
（１９６４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．８：４５２−４６
９］、ポリＢｒｄＣはポリｄＩ：ポリｄＣデュープレッ
クスからポリｄＣを置換してポリｄＩを有する新しいデ
ュープレックスを形成することが更に示されている［イ
ンマン・ジェイ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９：６２４−６
３７（１９６４）］。これらの観察は、修飾ヌクレオチ
ド塩基を含むディスプレーサ鎖による分岐移動構造の安
定化に未だ応用されていない。

【００１３】タツミとストラウス［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．５：３３１−３４７（１９７８）は、ヒトリ
ンパ球細胞中で生体内でブロモデオキシウリジン（Ｂｒ
ｄＵｒｄ）によりＤＮＡをラベルし、ＤＮＡの単離およ
び剪断後に高度の分岐移動を認めた。これらの研究者
は、この高いレベルの分岐移動は、ＢｒｄＵｒｄを含む
ヘリックスの増加した安定性および分岐移動構造の捕獲
を反映することを示唆した。その結果は更に、一旦形成
された場合、ハロゲン置換分岐移動構造は相対的に安定
であることを示唆する。タツミとストラウスは試験管内
で分岐移動の現象を検討しなかったし、その実験ではハ
ロゲン化ヌクレオチドによる合成オリゴまたはポリヌク
レオチド、すなわち予備修飾されたディスプレーサ鎖を
使用せず、クローン化または変異誘発の目的でその実験
に起因する分岐移動構造を使用できなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】最近では、染色体ＤＮ
Ａから誘導された特定のＤＮＡは、通常はその染色体Ｄ
ＮＡの制限酵素消化生成物のサザンブロット解析を使用
して同定されている。ＤＮＡのサザンブロット解析は、
一般に断片の同定のためにラジオアイソトープおよびオ
ートラジオグラフィを含み、その後電気泳動、電気泳動
生成物のニトロセルロースまたはナイロン膜への移行、
並びに移行した生成物と配列特異的ＤＮＡプローブとの
ハイブリダイゼーションを行う多段階の手順である。特
異的ＤＮＡ断片の同時ラベルおよび同定を提供する手順
の方が、サザンブロット解析より有意に簡単、迅速かつ
安価であり、遺伝子工学の分野に有意義な衝撃を与え得
る。

【００１５】ＤＮＡ配列のラベル化は、開始または末端
位置で修飾ヌクレオチドの組み込みを含むようになっ
た。これは、ビオチン、スルフヒドリル基、水銀、アリ
ールアミン並びにジゴキシゲニンのような小さな化合物
によりラベルしたヌクレオチドを使用して酵素的に行わ
れる。これらのラベルされた核酸の集積または精製は、
アフィニティクロマトグラフィによって行うことができ
る。例えば、Ｄループを含むビオチニル化ＤＮＡは、ワ
ードとその協同研究者によって報告されたように［ラン
ガー、前記文献］、アビジンまたはストレプトアビジン
基を担持する固体マトリックスに選択的に結合し溶離さ
れ得る。同様に、スルフヒドリルによってラベルされた
ＤＮＡは水銀塩処理したアガロース上でアフィニティク
ロマトグラフィにより精製することができ、水銀塩処理
したＤＮＡはスルフヒドリル基に対する親和力に基いて
精製することができる。全ＲＮＡ集団からのｍＲＮＡの
集積は、メッセンジャー上のポリＡ尾部のオリゴ−ｄＴ
マトリックスに対する親和力に基いて行うことができ
る。その精製の後に、これら集積または精製した核酸配
列は、これらをクローン化し得るものとする一連の手順
にしばしば更に供せられる。アフィニティクロマトグラ
フィにより配列集積または精製を可能とするラベル手順
およびその後のこれら集積または精製された画分の直接
クローン化は、既存の技術を越える有意義な利点を有す
る。

【００１６】単離された染色体ＤＮＡまたはＲＮＡの全
集団におけるこれらの配列または断片のクローン化の発
現を目的とするヌクレオチド配列またはＤＮＡ断片の特
定の組み合わせの同定または集積は、Ｒ−ループまたは
Ｄ−ループ形成を含む（ただし分岐移動を行い得るＤＮ
Ａ断片の選択を包含するものに限定されない）種々の方
法によって達成された。集団中の断片の選択的クローン
化は、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位、特に特有の部
位［ブラウン・エヌ・エルとスミス・エム（１９７７）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
７４，３２１３−３２１６］および大きさ［トマス・エ
ム・カメロン・ジェイ・アールとデービス・アール・ダ
ブリュ（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７１，４５７９−４５８３］を認識
するものに基づいて行われた。これらの戦略は広範な種
類の遺伝子をクローン化するために広く成功裡に使用さ
れたが、これらは普遍的なものではなく特定のものに制
限されている。

【００１７】遺伝子工学技術の他の応用は、例えば治療
目的のためにヌクレオチド塩基を付加または欠失させる
ための遺伝物質の修飾に関する。置換、不活性化または
遺伝物質の修飾を行う努力は現在も進行中である。高等
な真核生物では道程は遠く、これらの変化をもたらす試
薬を、種々のウイルス染色体の全部または一部を含む種
々のプラスミドベクタに組み込むことが求められてい
る。酵母のような下等真核生物における部位指向性遺伝
子置換が達成された。生体内におけるヒト遺伝物質の治
療処置を強く抑止するものは、適切で優れたベクタ系の
欠如に関連する。標的分配を行い遺伝物質を染色体ＤＮ
Ａにウイルスベクタを使用することなく組み込む能力
は、遺伝子治療の分野における主要な進展を代表し得
る。

【００１８】グリーンとチベット［前記文献］は、試験
管内部位指向性変異誘発に分岐ＤＮＡ構造を使用する意
図を示したが、実際、標的欠損変異誘発についてスーパ
ーヘリックスＤＮＡ中の安定なＤ−ループ構造の使用は
可能であった［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ７７：２４５５−２４５９（１９８０）］。
ＢｒｄＵｒｄを用いた細胞の生体内ラベルから得た分岐
移動構造を使用して線状標的ＤＮＡ分子によりこのゴー
ルを達成することはできなかった［グリーンとチベッ
ト、１９８１、前記文献を参照するとよい］。その分岐
構造の半減期が短かったためである。

【００１９】部位特異的遺伝子操作が記載されているが
［キャペッチ・エム・アール（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２４４，１２８８−１２９２］、宿主染色体に組み込
まれるに至ったＤＮＡの小部分に向けられたものであ
り、所望の標的ＤＮＡに対して同種組換えによってい
る。残念ながら、付加的な組み込みに関する事項は無作
為に起こっており、遺伝子を不活性化または活性化し
得、有害な結果に至り得る。トリプルヘリックス形成を
開始し得るＤＮＡの配列が報告されている［フランコイ
ス・ジェイ・シー、サイソン−ベーモアラス・ティ・ソ
ウングとヘレン・ブイ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ２８，９６１７−９６１９；ポブシク・ティ・ジ
ェイとダーバン・ピー・ビー（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，３０５９−３０６１］。部位
特異的変異操作に随伴するものとしてのトリプルヘリッ
クス形成の利用は、当業界で知られていない。

【００２０】

【課題を解決するための手段】最も一般的な意味におい
て、本発明は、所望の様式で進行する所定の種類の反応
の可能性を増加させる技術に関する。本発明の技術によ
り反応の特異性が向上すると共に、安定な分岐移動構造
を調製する単純な方法、サザンブロット解析より顕著に
単純、迅速かつ安価な、特定のＤＮＡ断片の同時ラベル
および同定手順、アフィニティクロマトグラフィおよび
選択的クローン化による配列集積または精製を可能とす
るラベル手順、ウイルスベクタを使用することなく、染
色体ＤＮＡへの遺伝物質の標的分配および組み込みを行
う方法が提供される。

【００２１】分岐移動は、これによって核酸の一本鎖が
挿入され、核酸デュープレックスの１本の鎖の少なくと
も一部を置換するプロセスである。分岐移動は、一本鎖
尾部を含むオリゴデオキシヌクレオチドデュープレック
スのデオキシヌクレオチド分子中への配列依存性付着
（捕捉）、またはオリゴデオキシヌクレオチドの端部以
外の位置におけるデオキシヌクレオチド分子中への配列
依存性組み込みに有用な技術である。既存の方法は、分
岐移動の開始の前に安定なハイブリッドの形成を必要と
するのに対し、本方法は、先行する安定化がなくても分
岐移動複合体の開始および形成を可能とする。形成と同
時に、もしくはその後または両方の場合において得られ
る分岐移動複合体を安定化することによりこの結果を得
た。

【００２２】本発明の特定の付着手順は、（Ａ）ブロッ
ティングおよびその後のハイブリダイゼーションを行わ
ずに、検出のために特定の断片をラベルし、（Ｂ）アフ
ィニティクロマトグラフィのため特定の断片をマーク
し、（Ｃ）クローン化ベクタ中の制限エンドヌクレアー
ゼ部位に和合性の５′または３′オーバーハングを導入
することによりクローン化を促進するため、または
（Ｄ）本開示から明らかとなろう他の目的のために使用
することができる。

【００２３】本発明の種々の方法および物質にはディス
プレーサ実体が必要であり、これは標的に対して少なく
とも相補的でありこれと結合し得る。ディスプレーサお
よび標的の両者はオリゴまたはポリヌクレオチド配列で
あり、合成品または天然に存在するものいずれでもよ
い。本発明の新規なディスプレーサは、本発明の所定の
態様における一本鎖実体として使用することができ、他
の態様では、これをリンカー鎖にハイブリダイズする部
分的二本鎖実体として利用する。

【００２４】本発明の１つの態様によれば、新規なディ
スプレーサ−リンカーデュープレックス、およびデオキ
シヌクレオチドディスプレーサ配列を標的デオキシヌク
レオチドデュープレックスの鎖に付着させる改良方法が
提供される。本発明のオリゴまたはポリデオキシヌクレ
オチドディスプレーサ−リンカーデュープレックスは、
２つの鎖、ディスプレーサ鎖とリンカー鎖とよりなる。
ディスプレーサ鎖は、リンカー鎖に少なくとも部分的に
相補的なヌクレオチドの配列と、受容体ポリデオキシヌ
クレオチドデュープレックスの１つの鎖に少なくとも部
分的に相補的な配列とを含む。

【００２５】一本鎖尾部を含むオリゴデオキシヌクレオ
チドデュープレックスの配列依存性付着（捕捉）は、Ｄ
ＮＡ分子の端部への分岐移動によって影響され得る。本
発明による新規なオリゴまたはポリデオキシヌクレオチ
ドディスプレーサ−リンカーデュープレックスは、この
種の受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレックス
と安定なハイブリッドを先行して形成することなく、受
容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレックスの末端
において分岐移動を開始することができる。更に詳しく
は、これらの新規なデュープレックスは、制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位において、特に受容体ポリデオキシ
ヌクレオチドデュープレックス上の３′または５′一本
鎖延長部に隣接して、ハイブリダイズして分岐移動を開
始することができる。

【００２６】受容体に相補的なディスプレーサ鎖の部分
における１以上のヌクレオチドの置換により、ＤＮＡ−
ＤＮＡハイブリッド安定性が増加する。修飾ヌクレオチ
ドを含むオリゴヌクレオチドは、デュープレックスの端
部からの鎖を含む未修飾ヌクレオチドを転位（ディスプ
レース）する。３′または５′オーバーハングの場合、
置換の速度はＤＮＡ再会合の核形成反応の大きさと同じ
程度である。

【００２７】本発明によれば、リンカー鎖にハイブリダ
イズせず、トリプルヘリックス形成を開始し得るディス
プレーサが更に提供される。この種のディスプレーサ
は、１．トリプルヘリックス形成を開始し得る第１配列であ
って、ａ）少なくとも６つの連続するピリミジン塩基またはｂ）少なくとも７つの塩基（この場合、少なくとも塩基
の６つはピリミジン塩基であり、７つ目の塩基はグアニ
ンである）からなるものと２．この種の第１配列に近似する第２配列であって、ａ）受容体デュープレックスの第２鎖に相補的で逆平行
に走り、ｂ）トリプルヘリックスに近似する分岐移動を開始し得
るものからなる。

【００２８】更に本発明によれば、ヌクレアーゼ耐性で
あるディスプレーサ、およびデュープレックスにヌクレ
アーゼ耐性を与える受容体デュープレックスの修飾方法
が開示される。これらのディスプレーサはオリゴまたは
ポリヌクレオチドの末端に付着した少なくとも１つの部
分を含み、この部分は、付着する末端にエンドヌクレア
ーゼ耐性を与える。

【００２９】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープ
レックスの１つの鎖に少なくとも部分的に相補的なディ
スプレーサ鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドを修飾
するのが望ましいことを突き止めた。このヌクレオチド
は、ハイブリッドディスプレーサ−受容体デュープレッ
クスの安定性を増加させる様式で修飾される。

【００３０】安定性を増加させる修飾に加えて、アフィ
ニティクロマトグラフィによりディスプレーサ−受容体
ハイブリッドの検出またはその単離を可能とするディス
プレーサまたはリンカー中に修飾ヌクレオチドを組み込
むことが有用であることを突き止めた。

【００３１】本発明の他の観点は、ディスプレーサまた
はディスプレーサ−リンカーデュープレックスが標的に
付着される際に形成されるハイブリッド構造である。こ
のハイブリッドが、本発明の新規なディスプレーサ−リ
ンカーデュープレックスに対する標的の付着の結果であ
る場合、リンカー鎖は、受容体デュープレックスの１つ
の鎖に好ましくは共有結合する。

【００３２】本発明の好適な態様では、一本鎖デオキシ
ヌクレオチドの付着ディスプレーサ配列を含むハイブリ
ッド構造は安定化され、最も望ましくはディスプレーサ
鎖中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの存在によ
る。

【００３３】また本発明によれば、ラベルしたハイブリ
ッド構造が開示される。本発明によるディスプレーサ−
リンカーを組み込んだラベルしたハイブリッド構造は、
多くの生化学的手順に有用である。これには例えば、ア
フィニティクロマトグラフィによるディスプレーサ−受
容体ハイブリッドの捕捉の促進、ベクタ中のクローン化
デオキシヌクレオチド挿入物の１つの端部のラベル、挿
入物のエンドヌクレアーゼマッピングの促進、受容体ポ
リヌクレオチドデュープレックスの選択的クローン化の
促進、並びに接触するポリデオキシリボヌクレオチドの
クローンの単離の促進がある。ディスプレーサを組み入
れるハイブリッドはアフィニティクロマトグラフィにお
いて有用であり、１］特定のオリゴまたはポリヌクレオ
チドの検出および２］部位特異的遺伝操作を促進する。

【００３４】本発明の方法は、受容体ポリデオキシヌク
レオチド配列の１つの鎖と一本鎖ＤＮＡのディスプレー
サ配列との間の不安定複合体の安定化を含み、この場合
ディスプレーサ配列は、受容体ポリデオキシヌクレオチ
ド配列のこの種の鎖に少なくとも部分的に相補的であ
る。この複合体は、ａ）ディスプレーサ鎖中の少なくとも１つの修飾ヌクレ
オチドの存在、ｂ）ディスプレーサ配列と受容体デュープレックスとの
間のＤＮＡトリプレックスの形成ｃ）ヌクレオチド配列および配列特異的ＤＮＡ結合部分
（これは付着する部位において受容体ＤＮＡデュープレ
ックスを顕著に融解させない）からなるディスプレーサ
鎖の提供、ｄ）標的デュープレックスへの付着の前または同時のデ
ィスプレーサのリンカーへの付着、およびその後の標的
デュープレックスの第２鎖に対するリンカーの共有付
着、またはｅ）ａ）とｄ）またはｃ）とｄ）の手順の組合せによっ
て安定化され得る。

【００３５】本発明の方法により、先行する安定化を行
うことなく分岐移動複合体の開始および形成が可能とな
る。形成と同時にもしくはその後に、または両者の場合
において得られる分岐移動複合体を安定化することによ
りこの結果を得た。

【００３６】本発明の１つの態様では、ディスプレー
サ、リンカー、ディスプレーサ−リンカーデュープレッ
クス、並びに側鎖移動を利用して標的デオキシヌクレオ
チドデュープレックスの鎖の末端にデオキシヌクレオチ
ドディスプレーサ配列を付着させる改良方法を利用し
て、分岐移動複合体を調製する。この手順は、２本の
鎖：ディスプレーサ鎖およびリンカー鎖よりなるオリゴ
またはポリデオキシヌクレオチドディスプレーサ−リン
カーデュープレックスの使用を必要とする。

【００３７】ディスプレーサ−リンカーデュープレック
スのディスプレーサ鎖は、リンカー鎖に少なくとも部分
的に相補的なヌクレオチドの配列を含む。このディスプ
レーサ鎖はリンカー鎖にハイブリダイズすることがで
き、その３′、５′または両者の端部にオーバーハング
を有する。ディスプレーサ鎖の一端のオーバーハング
は、受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレックス
の１つの鎖に少なくとも部分的に相補的なデオキシヌク
レオチド配列からなり得る。

【００３８】デュープレックスに少なくとも部分的に相
補的なディスプレーサ鎖の部分における不正確な（相補
的でない）ヌクレオチドの存在により、不整合の地点を
越える分枝移動が制限される。よって、ディスプレーサ
鎖のオーバーハングの初発部分は受容体鎖に相補的でな
ければならず、この受容体に対する相補性は十分な数の
ヌクレオチド塩基に渡って延在する必要があり、これに
より少なくとも形成に必要な受容体デュープレックスと
の遷移的分枝移動複合体の形成が可能となる。遷移的分
枝移動構造中では、塩基の数が増加するにつれ構造の安
定性が増加する。分枝移動構造の開始および形成につい
て要求される塩基の最小の数はない。受容体に相補的な
少なくとも最初の３つの塩基があれば望ましく、相補的
な少なくとも最初の５つの塩基があれば好ましい。

【００３９】ディスプレーサ鎖の対向端部は、これに対
するハイブリダイゼーションの後のリンカー鎖に関して
平滑とすることができ、またはディスプレーサ鎖または
リンカー鎖がオーバーハングを有するものとすることが
できる。１つの態様では、リンカーまたはディスプレー
サ鎖の１つは、制限エンドヌクレアーゼによる開裂に起
因するオーバーハングに対して相補的なオーバーハング
を有し得る。

【００４０】リンカー鎖は、ディスプレーサにハイブリ
ダイズするのに十分な大きさでさえあればどのような大
きさでもよい。リンカーが１０〜２０塩基の長さの範囲
であることが望ましい。本発明の好適な態様では、リン
カーの一端は、分枝移動が起こった後に受容体の１つの
鎖に共有結合する。

【００４１】ディスプレーサ鎖は、ディスプレーサと受
容体との反応の前後にリンカー鎖にハイブリダイズし得
る。

【００４２】前記したように、本発明のディスプレーサ
と受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレックスと
の間の安定なハイブリッドの事前の形成は必要ではな
い。受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレックス
の端部において分枝移動を開始し得る全ゆるオリゴまた
はポリデオキシヌクレオチドディスプレーサ−リンカー
デュープレックスを本発明の方法で使用することができ
る。一旦分枝移動が開始されたならば、分枝移動構造の
形成と同時の、またはこれに続く本発明による安定化の
技術により、複合体を分枝形態で維持し得る。

【００４３】本発明によるディスプレーサ−リンカーデ
ュープレックスは、平滑末端または機械的剪断により形
成された末端のような受容体ポリデオキシヌクレオチド
デュープレックスの全ゆる種類の末端で分枝移動を開始
することができる。好適な態様では、本発明による新規
なデュープレックスは、制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位、最も有効には受容体ポリデオキシヌクレオチドデュ
ープレックス上の３′または５′一本鎖延長部に隣接し
てハイブリダイズし分枝移動を開始する。

【００４４】標的に少なくとも部分的に相補的なディス
プレーサの配列中でヌクレオチドを修飾することによ
り、分枝移動複合体の安定性が増加することを突き止め
た。相補的デオキシヌクレオチドとの会合定数を少なく
とも約２０％増加させるこのような修飾は有用な結果を
与える。会合定数を少なくとも約７０％増加させるよう
な修飾が好適である。

【００４５】形成と同時に複合体を安定化させるため、
標的に少なくとも部分的に相補的なディスプレーサの配
列中の１以上、好ましくは少なくとも約１０％のヌクレ
オチドを修飾する。

【００４６】本発明で良好に機能すると認められた特定
の修飾には、５−ハロゲン化ピリミジンヌクレオチド、
５−メチルデオキシシチジン、ジアミノプリンデオキシ
ヌクレオチド、リボヌクレオチド並びに２′−アルキル
化リボヌクレオチドが包含される。５−ブロモデオキシ
ウリジンまたは５−メチルデオキシシチジンが最良の結
果を与える。

【００４７】また、複合体を分枝移動が起こった後に安
定化することもできる。この態様では、分枝移動複合体
のリンカーは、試薬デュープレックスの１つの鎖に共有
付着される。好ましくは分枝移動複合体をリガーゼと共
にインキュベートする。共有結合リンカー鎖は分枝移動
構造の非共役を防止する。

【００４８】本発明の好適な態様では、分枝移動構造
は、修飾ヌクレオチドおよび共有結合を利用して、同時
および後続する安定化技術の組合せにより安定化する。

【００４９】ラベルを組み入れてハイブリッド構成物の
検出を可能とすることにより本発明のディスプレーサ−
リンカーを修飾することができる。検出を可能とし分枝
移動した複合体を破壊しない全ゆる修飾体を使用するこ
とができる。一般的な検出修飾体は放射能ラベル、蛍光
および化学発光ラベル、酵素および検出のための標的で
あり、非限定的な例として、ビオチン部分、ホスホロチ
オエート結合並びに抗原が包含される。種々のラベルお
よび検出系の使用の詳細については、例えばケラー・ジ
ー・エッチら、ＤＮＡプローブ（１９８９）およびピパ
ー・エム・エーら、核酸プローブ（１９８９）を参照す
ることができる。

【００５０】他の態様では、本発明による一本鎖ディス
プレーサはリンカー鎖にハイブリダイズせず、受容体ポ
リヌクレオチドの端部以外の地点でトリプレックス形成
を開始することができる。この種のディスプレーサは、１．トリプルヘリックス形成を開始し得る第１配列であ
って、ａ）少なくとも６つの連続するピリミジン塩基またはｂ）少なくとも７つの塩基（この場合，塩基の少なくと
も６つはピリミジン塩基であり，第７の塩基はグアニン
である）からなるものと２．この種の第１配列に近似する第２配列であって、ａ）受容体デュープレックスの第２鎖に相補的で逆平行
に走るものとからなり、トリプルヘリックスに近似する
分枝移動を開始することができる。

【００５１】本発明の１つの態様では、第２配列は第１
配列に隣接する。他の態様では、第２配列は介在部分に
よって第１配列から離間する。この態様では、１〜５の
介在部分による離間が好適である。

【００５２】介在部分は、第１および第２配列の間に挿
入されるに際して、２つの配列の共働作用を妨害しない
ものであれば全ゆる部分を選択することができる。例と
して内位添加剤およびヌクレオチド配列の剛性を低減す
るよう機能することにより相補的配列の逆平行鎖に対す
るハイブリダイゼーションを促進する試薬がある。この
種の部分には、糖リン酸結合を含む部分が包含される。
好適な態様では、この介在部分はヌクレオチドとする。
ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドとすることができる。
有用な修飾ヌクレオチドには、共有付着した内位添加剤
を有するものおよび塩基対合し得ない修飾ヌクレオチド
が包含される。

【００５３】一旦ディスプレーサが逆平行鎖とハイブリ
ダイズしたならば、複合体の安定性を増加させるのが望
ましい。ハイブリダイゼーションの前にディスプレーサ
鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドを修飾することに
より安定性を増加させ得ることを突き止めた。ヌクレオ
チドは、ハイブリッドディスプレーサ−受容体デュープ
レックスの安定性を増加させる様式で修飾する。修飾
は、複合体の形成を開始し得る第１配列中、またはこの
種の第１配列に近似し受容体デュープレックスの第２鎖
に相補的で逆平行に走る第２配列中のいずれでもよい。

【００５４】修飾が第１配列中にある場合、これを好ま
しくは、相補的デオキシヌクレオチドとの会合定数を約
２０％、好ましくは約７０％増加させる修飾ヌクレオチ
ドよりなる群から選択する。この種の修飾ヌクレオチド
の非限定的な例の代表的なものには５−ハロゲン化ピリ
ミジンヌクレオチドが包含される。最も好ましくは、修
飾ヌクレオチドは５−ブロモデオキシウリジンおよび５
−メチルデオキシシチジンよりなる群から選択する。

【００５５】修飾が第２配列にある場合、これを５−ハ
ロゲン化ピリミジンヌクレオチド、５−メチルデオキシ
シチジン、ジアミノプリンデオキシヌクレオチド、リボ
ヌクレオチド並びに２′−アルキル化リボヌクレオチド
よりなる群から選択する。好ましくは、修飾ヌクレオチ
ドは５−ハロゲン化ピリミジンヌクレオチド、特に５−
ブロモデオキシシチジンまたは５−メチルデオキシシチ
ジンとする。

【００５６】安定性を増加させる修飾に加えて、ディス
プレーサ−受容体ハイブリッドの検出を可能とするディ
スプレーサ中に修飾ヌクレオチドを組み入れることが有
用であることを突き止めた。適切な修飾体は、放射能ラ
ベル、蛍光および化学発光ラベル、検出のための酵素お
よび標的からなる群から選択され、非限定的な例とし
て、ビオチン部分、ホスホロチオエート結合並びに抗原
が包含される。

【００５７】また、エキソヌクレアーゼ耐性のディスプ
レーサを開発した。これらのヌクレアーゼ耐性ディスプ
レーサは、細胞培養物および生体に使用するのに適切で
ある。これらのディスプレーサは、ディスプレーサの末
端ヌクレオチドまたはその近傍に付着したエキソヌクレ
アーゼ耐性を与える少なくとも１つの部分を含む。

【００５８】ヌクレアーゼ耐性を与える部分は、末端ヌ
クレオチドの水酸基またはリン酸部分にてデオキシリボ
ース部分に付着し得る。

【００５９】ヌクレアーゼ耐性を与える部分は、内位添
加剤、イソウレア、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール、ポリペプチドおよび蛋白質より
なる群から選択することができる。

【００６０】基が水酸基に付着した場合の好適な部分は
メチルチオホスホネートである。

【００６１】ホスホジエステル結合を介して３′−末端
デオキシリボヌクレオチドに付着した修飾または未修飾
２′，３′ジデオキシリボースヌクレオチドは、３′末
端にて耐性を与えるのに有用である。

【００６２】本発明による一本鎖ディスプレーサまたは
本発明によるディスプレーサ−リンカーを利用する複合
体の形成は、周知の原則に従って進行する［マニアティ
スら（１９８２）分子クローン化（ニューヨーク：コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイス］。

【００６３】本発明の有意義な用途の１つは、受容体ポ
リデオキシヌクレオチド配列中のヌクレオチドの部位特
異的付加または欠失である。このプロセスは、新しい鎖
が受容体デュープレックス中に導入され、元の鎖を置換
する場合に生起する。一般化された組換えおよび遺伝子
変換に関する細胞機構が作用し、ディスプレーサ鎖から
受容体ポリデオキシヌクレオチドへ配列情報を移転し得
る。この移転の可能な機構については、スタール・エフ
・ダブリュ、遺伝子組換え（１９７９）を参照すること
ができる。

【００６４】

【実施例】本発明の種々の観点を説明すべく以下の実施
例を記載するが、請求の範囲により詳細に記載したその
範囲を如何なる様式においても限定することを意図する
ものではない。

【００６５】図１Ａは（Ａ）ｐＡＬＡ−Ｄの制限マップ
を示す。Ｒ＝Ｒｓａｌ、Ｐ＝ＰｓｔＩ。断片Ａ〜Ｄはラ
イン上でラベルし、下に示すヌクレオチド長さを有す
る。断片Ｄに唯一のＳｍａＩ部位がある。また（Ｂ）デ
ィスプレーサ（白四角）の分枝移動につき、４塩基の
３′−オーバーハング（断片のＰｓｔＩ末端）を有する
受容体デュープレックス内におけるリンカー（黒四角）
への結合を示す。

【００６６】図１Ｂは、３′オーバーハングのみ（左）
に結合したデュープレックスとその後完結した分枝移動
（右）との間の変換を示す。

【００６７】図１Ｃは、特異的ｐＡＬＡ−Ｄ断片による
最大置換を示す。ｍ＝ディスプレーサと相補的受容体鎖
との間に形成され得る塩基対の最大数。

【００６８】図２はＰ−Ｄ−ＢｒｄＣプラスＰ−Ｌ−ｄ
Ｃの捕捉反応を示す。１％アガロースゲルのＵＶ螢光写
真。レーン１：ＲｓａＩ／ＰｓｔＩ消化ｐＡＬＡ−Ｄ
（２００ｍｇ）。Ａ、Ｂ、Ｃ並びにＤは図１に示した断
片を示す。レーン２〜９：それぞれ１、２、４、８、１
６、３２、６４並びに１２８分におけるＰ−Ｄ−Ｂｒｄ
Ｃ（６μｇ／ｍｌ）、Ｐ−Ｌ−ｄＣ（２μｇ／ｍｌ）並
びに５Ｕ／ｍｌリガーゼ存在下での連結後の生成物。

【００６９】図３は図２のオートラジオグラムを示す。
レーン１〜８は、図２の放射能ラベルしたレーン２〜９
に対応する。

【００７０】図４Ａは、図３と同様のオートラジオグラ
ムを示すが、より高いリガーゼ濃度およびＰ−Ｄ−Ｂｒ
ｄＣを置換するＰ−Ｄ−ｄＣを用いる。

【００７１】図４Ｂは、Ｐ−Ｄ−ＢｒｄＣを置換するＰ
−Ｄ−ＢｒｄＣ−Ｅ（１０）を使用する以外は、図３と
同一のオートラジオグラムにおける初期の時間点を示
す。

【００７２】図４Ｃは、Ｐ−Ｄ−ＢｒｄＣを置換するＰ
−Ｄ−ＢｒｄＣ（２４）を使用する以外は図３と同様の
オートラジオグラムを示す。

【００７３】図５は、組み込まれたディスプレーサ（ボ
ールド）およびリンカー（下線）配列の領域を示す配列
決定ゲルのオートラジオグラムを示す。

【００７４】図６は、ｐＡＬＡＤ−Ｇ４、ヒトＡＬＡＤ
の染色体断片を含むｐＭＳ１９の誘導体並びにディスプ
レーサリンカーデュープレックスＳ−Ｄ−ＢｒｄＣを使
用するＢＣＲを示し、Ｓ−Ｌ−ｄＣは続いてＳａｕ３Ａ
１による部分消化を受ける。レーン１、２、３、４、５
並びに８：それぞれ１、２、３、４、５並びに８分に形
成された部分消化生成物。バンドａ〜ｋは、それぞれ３
００、４０６、１５３８、１５９８、２７０６、２７３
１、２７４８、３１９８と予想される大きさの部分消化
バンド並びにベクタ内の部位により生成した複数の大き
なバンドである。

【００７５】図７は、トリプレックス集積分枝移動媒介
リンカー捕捉を示す。レーン１〜６：ＮｃｉＩおよびＳ
ａｌＩにより切断し、ＢＴ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１、ＢＴ−
Ｌ−ｄＣ−１並びにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ここ
に記載したようにして０、１、３、１０、３０並びに１
２０分インキュベートしたｐＭＳ１９。レーン７：Ａｖ
ａＩＩにより切断したラムダＤＮＡの分子量マーカー。
レーン８〜１３：ＮｃｉＩおよびＳａｌＩにより切断
し、ＢＯ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１、ＢＴ−Ｌ−ｄＣ−１並び
にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ここに記載したように
して０、１、３、１０、３０並びに１２０分インキュベ
ートしたｐＭＳ１９。

【００７６】実施例１ラベルしたディスプレーサおよびリンカー鎖の調製この例並びに記載する他の例で使用するオリゴヌクレオ
チドの配列を表１〜表３に列挙する。これらのオリゴヌ
クレオチドは、標準的ホスホルアミダイト化学を使用し
てアプライド・バイオケミカルス・モデル３８０ＢＤＮ
Ａ合成装置上で合成したが、オリゴヌクレオチドを合成
する他のいずれかの標準的方法も、この発明のために実
施し得る。

【００７７】これらの例で使用したブロモデオキシシチ
ジン（ＢｒｄＣ）およびメチルデオキシシチジン（Ｍｅ
ｄＣ）含有ディスプレーサ鎖は、その合成の際にオリゴ
ヌクレオチドに５−ブロモデオキシシチジンまたは５−
メチルデオキシシチジンホスホルアミダイトモノマーを
組み入れることにより調製した。精製工程は、塩基保護
基の加水分解およびＮＨ_４ＯＨによる支持体からの開
裂、蒸発、再懸濁並びにエタノール沈殿に限定される。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して^３２Ｐにより
全てのオリゴヌクレオチドを５′−ラベルし、２０％ア
クリルアミド−８Ｍ尿素ゲル上でポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供し、オートラジオグラフィにより視覚化
した。正しい大きさの単一オリゴデオキシヌクレオチド
分子種を常法により検出した。

【００７８】３′または５′オーバーハングによる受容
体端部における捕捉を測定するため、リンカーまたはデ
ィスプレーサオリゴデオキシヌクレオチドをＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを使用して^３２Ｐによりそれぞれラ
ベルした。ラベルしたＡＴＰによる（ディスプレーサと
ではない）リンカーとの反応の後に過剰の非ラベルＡＴ
Ｐとの反応を行い、全てのリンカー鎖が５′−リン酸を
含有することを確実にした。セファデックスＧ−５０の
スパンカラムによりオリゴデオキシヌクレオチドを精製
した［マニアティスら（１９８２）分子クローン化（ニ
ューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリイス］。

【００７９】実施例２ＢｒｄＣ含有ハイブリッドの安定性オリゴデオキシヌクレオチドの融解温度は、クアルチン
とウェットムル［Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：１０４０−４
７（１９８９）］により記載されたようにして決定し
た。すなわち、６×ＳＳＣ、ｐＨ４．０、６×ＳＳＣ、
ｐＨ７．０中または１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍホウ酸、
０．２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ１０中で相補的オリゴデオキ
シヌクレオチドを等モル比で混合した後、１ｃｍの石英
キュベット中に入れた。ウォータージャケットセルホル
ダを備えたベックマンモデル２５分光光度計中でキュベ
ット中にて０．３°Ｃ／分で溶液を加熱した。セルホル
ダに取り付けたサーミスタを使用して溶液温度をモニタ
した。試験した全てのデュープレックスについての高色
素度は２１％であった。濃度依存性融解温度（Ｔｍ＝ｔ
ｍ＋２７３．１６）は、マーキーとブレスラウエル［Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２６：１６０１−１６２０（１９
８７）］の方法に従って計算した。報告されたＴｍ値は
±１°Ｃの信頼性である。

【００８０】ｄＣ含有オリゴデオキシヌクレオチドにつ
いての、およびそのＢｒｄＣおよびＭｅｄＣ含有アナロ
グについてのｔｍ値を表４に示す。ｄＣについてのＢｒ
ｄＣまたはＭｅｄＣの置換により融解温度ΔＴｍ＝Ｔ
ｍ′−Ｔｍの増加が起こった（ここで、ＴｍおよびＴ
ｍ′はそれぞれｄＣおよびＢｒｄＣまたはＭｅｄＣ含有
オリゴデオキシヌクレオチドの融解温度である）。

【００８１】これらの結果は、ＢｒｄＣまたはＭｅｄＣ
と共にオリゴヌクレオチドを含有するデュープレックス
は、ｄＣのみを有するものより安定であることを示す。

【００８２】ｄＣについての会合定数に関する修飾ヌク
レオチド、ＢｒｄＣまたはＭｅｄＣについての会合定
数、相補的ｄＧとの塩基対合は次により近似される：Ｋ＝ｅ^{−ΔＨ°ΔＴｍ／Ａ}、ただし式中Ａ＝ＲＴｎ^２Ｎｓ ΔＨ°＝オリゴデオキシヌクレオチドデュープレックス
の形成のエンタルピーＲ＝気体定数Ｔｎ＝ＴｍとＴｍ′との平均Ｎｓ＝修飾ヌクレオチドの数である。

【００８３】この解析に基づき、会合定数ｌ３はＢｒｄ
Ｃ置換について約７０〜９０％、ＭｅｄＣ置換について
約５０〜７０％増加した。

【００８４】実施例３ＢｒｄＣによる置換非ラベル相補的オリゴデオキシヌクレオチドからの５′
−^３２Ｐ−ラベルｄＣ含有オリゴデオキシヌクレオチド
の置換を、ゲル移動アッセイを使用してＢｒｄＣ含有ア
ナログによりモニタした。

【００８５】室温でそれぞれ１および３μｇ／ｍｌの濃
度にて１ＭＮａＣｌ中で非ラベルｄＣ含有相補的鎖にラ
ベルしたｄＣ含有オリゴデオキシヌクレオチドをアニー
ルさせた後、４°Ｃとした。ラベルした鎖のＢｒｄＣ含
有アナログ（３〜４００μｇ／ｍｌの範囲の濃度）を、
時間の関数として種々の温度でｄＣ含有デュープレック
スと共にインキュベートした。それぞれの時間点で取得
した分画を電気泳動装填緩衝液中に希釈し、電気泳動す
るまで−７０°Ｃで保存した。２．５％フィコール４０
０中の２０％アクリルアミドゲルにサンプルを装填し、
８９ｍＭトリスＨＣｌ、８９ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８（ＴＢＥ）中にて４°Ｃ、４００ボルト、５
〜１５ミリアンペアで電気泳動を行った。ゲルを乾燥し
てオートラジオグラフィに供した。

【００８６】オリゴヌクレオチド含有ＢｒｄＣがｄＣを
含有するものを置換する速度を表５にまとめた。平滑末
端で開始した反応は温度上昇と共に速く進行した。平滑
末端における増加した活性のためである。４塩基オーバ
ーハングにて開始が生起した置換反応は、平滑末端で開
始した反応より２桁大きかった。置換鎖と形成されたデ
ュープレックスとの間に形成されたデュープレックスの
安定性は温度低下と共に増加した。よって、２２〜３７
°Ｃの温度範囲において、置換の速度は温度上昇と共に
減少する。

【００８７】これらの結果は、ＢｒｄＣを含むオリゴヌ
クレオチドは、平滑末端受容体においても、時間および
温度に依存する反応でｄＣアナログを置換することを示
す。

【００８８】置換反応においてリンカー鎖を含む効果
は、０〜１００％のＧ＋Ｃ含量を用いて３′および５′
両者の４塩基オーバーハングで検討した。

【００８９】これらの結果は、ディスプレーサ−リンカ
ーデュープレックスを使用する置換速度は、ディスプレ
ーサオリゴデオキシヌクレオチドのみを使用する置換速
度より少なくとも８倍速いことを示す。これらの結果に
基づき、実施例７〜８に記載した方法は、ディスプレー
サ−リンカーデュープレックスおよび受容体デュープレ
ックスの会合の速度によって制限されないと結論され
る。

【００９０】実施例４標的ＤＮＡに対するディスプレーサのハイブリダイゼー
ションＢｒｄＣまたはＭｅｄＣ含有ディスプレーサ鎖を、リン
カーの非存在下に二本鎖標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブ
リダイズさせた。標的ＤＮＡの部分に相補的なリンカー
は、所望に応じてこのハイブリダイゼーション工程に続
いて添加する。

【００９１】実施例４〜９で使用する標的ＤＮＡはプラ
スミドｐＡＬＡ−Ｄ、ヒトデルタ−アミノレブリネート
デヒドロゲナーゼ（ＡＬＡ−Ｄ）のｃＤＮＡ配列を含有
するｐＵＣ９発現ベクタとした［ウェットムルら（１９
８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８３：７７０３−７７０７］。

【００９２】ＲｓａＩおよびＰｓｔＩによりｐＡＬＡ−
Ｄを消化して７つの断片を生成したが、この内４つは
３′オーバーハングを有する１つのＰｓｔ１末端および
１つの平滑ＲｓａＩ断片を含む（図１Ａ）。標準ディス
プレーサ配列、Ｐ−Ｄ−ｄＣは、制限断片ＢのＰｓｔＩ
末端の３′−オーバーハング鎖の最初の２４ヌクレオチ
ドに相補的である。受容体標的デュープレックスに対す
るディスプレーサハイブリダイゼーションの開始は、Ｐ
ｓｔＩ部位の４塩基オーバーハングとのディスプレーサ
の塩基対合により開始する。一本鎖ＤＮＡ分枝移動によ
り、ディスプレーサは受容体デュープレックス鎖の相同
部分の全部または一部を置換し得る。

【００９３】ｐＨを低減したＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１ｍＭＡＴ
Ｐ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）］中で、消化したｐＡＬＡ−ＤＤＮＡ（２０μｇ／
ｍｌ）を３４マーのディスプレーサＤＮＡ（６μｇ／ｍ
ｌ）と混合し、５５°Ｃで１０分間インキュベートした
後、室温に冷却した。

【００９４】図１Ｃは、１つのＰｓｔＩおよび１つの平
滑（ＲｓａＩ）末端によりディスプレーサがｐＡＬＡ−
Ｄ断片中に分枝移動する能力を示す。断片Ｂについて、
ディスプレーサに対する十分な相補性があるが、ディス
プレーサ−受容体塩基対（ｍ）の最大数は２４である。
ディスプレーサと３′ＰｓｔＩオーバーハングとの間に
４塩基対が形成されるため、分枝移動工程の最大数は
（ｍ−４）である。断片Ｄおよび最小（７１塩基対）の
ＰｓｔＩ−ＲｓａＩ断片は、ＰａｔＩ部位を越える相補
性を含まない。よって、４塩基オーバーハングおよび１
つの分枝移動工程を含みｍ＝５である。断片Ａは、ディ
スプレーサに相補的なＰｓｔＩ部位に隣接する４つの更
なるヌクレオチドを含む。よって、４つのオーバーハン
グおよび５つの分枝移動工程を含みｍ＝９である。断片
Ｂと異なり（この場合は分枝移動は完結し得る）、断片
ＡおよびＤによる全ての分枝移動構造は２つの一本鎖分
枝を含む。

【００９５】実施例５リンカーの存在下における標的ＤＮＡへのディスプレー
サのハイブリダイゼーションこの発明の第２の態様では、リンカーオリゴデオキシヌ
クレオチドの分枝移動媒介捕捉は、図１Ｂの図式に従っ
て行った。この態様では、受容体標的デュープレック
ス、ディスプレーサオリゴデオキシヌクレオチド、並び
にリンカーデオキシオリゴヌクレオチドは、全てハイブ
リダイゼーション反応の際に存在する。リンカー配列、
５′−^３２Ｐ−ラベルしたＰ−Ｌ−ｄＣは、受容体デュ
ープレックスに対する相同性を欠如するディスプレーサ
配列の５′部分と共にデュープレックスを形成する。形
成されたディスプレーサ−リンカーデュープレックス
は、受容体標的鎖との塩基対合により相同の標的鎖を置
換する。

【００９６】ＰｓｔＩおよびＲｓａＩを用いてｐＡＬＡ
−Ｄを消化した。ｐＨ低減Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液
［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１ｍＭＡＴ
Ｐ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）］中で、消化したプラスミド（２０μｇ／ｍｌ）
を、３４マーディスプレーサオリゴデオキシヌクレオチ
ド（６μｇ／ｍｌ）および５′−^３２Ｐ−ラベルした１
４マーリンカーオリゴデオキシヌクレオチド（２μｇ／
ｍｌ）と混合し、５５°Ｃで１０分間インキュベートし
た後、室温に冷却した。

【００９７】実施例６ディスプレーサ−リンカーデュープレックスの形成この発明の他の態様では、置換反応の最初の工程はディ
スプレーサ−リンカーデュープレックスの形成を含み、
標的デュープレックスに対するこのディスプレーサ−リ
ンカーデュープレックスの付加が続く。

【００９８】ディスプレーサ−リンカーデュープレック
スの形成は次のようにして行うことができる。ｐＨ低減
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．０、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２０
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）］中で、３４マーのディス
プレーサオリゴデオキシヌクレオチド（６μｇ／ｍｌ）
を５′−^３２Ｐラベルした１４マーリンカーオリゴデオ
キシヌクレオチド（２μｇ／ｍｌ）と混合し、５５°Ｃ
で１０分間インキュベートした後、室温に冷却した。

【００９９】実施例７標的ＤＮＡに対するディスプレーサ−リンカーデュープ
レックスのハイブリダイゼーションＰｓｔＩおよびＲｓａＩを用いてｐＡＬＡ−Ｄを消化
し、７つの制限断片を得た。消化したｐＡＬＡ−ＤＤＮ
Ａ（４０μｇ／ｍｌ）を、実施例６で調製した等容量の
ディスプレーサ−リンカーデュープレックスと、５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍ
ＭＭｇＣｌ_２、２０ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ
中で混合した。この混合物を５５°Ｃで１０分間インキ
ュベートした後、室温に冷却した。

【０１００】実施例８標的鎖に対するリンカーオリゴデオキシヌクレオチドの
連結分枝媒介リンカー連結反応の効率および特異性を図２お
よび図３に示す。

【０１０１】ディスプレーサＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ（６μｇ
／ｍｌ）およびリンカーＰ−Ｌ−ｄＣ（２μｇ／ｍｌ）
の存在下におけるｐＡＬＡ−ＤＰｓｔＩ−ＲｓａＩ断片
の連結についての時間要求を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（５
Ｕ／ｍｌリガーゼ）および１〜１２８分の範囲のインキ
ュベーション時間を使用して設定した。結果を図３、レ
ーン２〜９に示す。連結の結果は、断片Ｂの移動性につ
いての僅かな時間依存性増加である。分枝移動構造に対
するリンカーの連結は、３２分で５０％完結し、約１時
間以内で１００％完結した。２５Ｕ／ｍｌリガーゼを使
用して同様の実験を行い、８分で５０％完結した。よっ
て、この連結反応についての反応速度は、リガーゼ濃度
および時間に直線的に依存する。これらの結果は、リン
カーオリゴヌクレオチドの分枝媒介連結は、かなり迅速
に生起する効率的な反応であることを示す。

【０１０２】図３は図２に示すゲルのオートラジオグラ
ムであり、受容体断片に対する５′−^３２Ｐラベルした
リンカーの連結の検出を示す。断片Ｂ（ｍ＝２４）を用
いる反応を行って完結する条件下で、断片Ａ（ｍ＝９）
は僅かに見ることができ、断片Ｄ（ｍ＝５）は検出不能
である。ラベルしたリンカーの多数は断片Ｂと会合す
る。これらの結果は、分枝媒介リンカー捕捉の特異性を
示す。

【０１０３】実施例９分枝移動反応の特異性特異的で効率的な分枝移動媒介リンカー捕捉のためにＢ
ｒｄＣまたはＭｅｄＣ含有ディスプレーサ鎖が要求され
ることを次の実験で示す。図４Ａは、図３に示したもの
と類似するオートラジオグラムを示すものであり、ディ
スプレーサ鎖はＰ−Ｄ−ＢｒｄＣではなくＰ−Ｄ−ｄＣ
である。断片Ｂとの反応を行って５０％完結する条件下
で、断片Ａおよび断片Ｄの両者は容易に検出された。表
６では、ディスプレーサ分子としてＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ、
Ｐ−Ｄ−ＭｅｄＣ並びにＰ−Ｄ−ｄＣを使用し、断片
Ａ、Ｂ並びにＤについての相対的なオートラジオグラフ
強度が含まれる。断片Ｄの強度を１の値とする。断片Ａ
およびＢの強度は２倍時間経過アッセイを使用して測定
したため、これらの信頼性は＋／−５０％である。表６
のデータは、ディスプレーサ中でＢｒｄＣまたはＭｅｄ
Ｃを使用することが、高度に特異的な分枝移動媒介捕捉
を得るためには重要であることを示す。

【０１０４】１つの正しくないヌクレオチドを用いてデ
ィスプレーサＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ−Ｂ（１０）を合成し
た。すなわち、９塩基のみが不整合の前にディスプレー
サと相補的受容体鎖との間に認められ得るようにした。
図４Ｂは、痕跡レベルの捕捉に至る条件下で行った分枝
移動媒介捕捉反応のオートラジオグラムである。強度比
率を表７に示す。断片Ｂ（ｍ＝２４、１０における不整
合）による捕捉は、断片Ａ（ｍ＝９）のものと全く同一
であった。よって、位置１０における唯一の不整合が後
続する分枝移動を遮断し、分枝移動反応は非常に特異的
であることを示す。

【０１０５】図４Ｃは図３のものと類似するオートラジ
オグラムを示し、ディスプレーサはＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ−
Ｂ（２４）とした。Ｐ−Ｄ−ＢｒｄＣ−Ｂ（２４）の最
後のヌクレオチドはＰ−Ｄ−ＢｒｄＣのものと異なる。
結果は図３のものと類似していた。よって、最後の単一
分枝構造（図１Ｂ、右下）の形成は、ＢｒｄＣ含有オリ
ゴデオキシヌクレオチドの捕捉反応について認められた
高い特異性を達成するには不必要である。

【０１０６】表６および表７において、実験的および理
論的強度比率を比較する。理論強度比は次の式を使用し
て計算した：

【０１０７】

【数１】

【０１０８】受容体末端がディスプレーサ−リンカーデ
ュープレックスにより飽和されていない場合、分割関数
ｑ_ｉおよびｑ_ｊは１に近い。そして、

【０１０９】

【数２】

【０１１０】

【数３】

【０１１１】式（２）は、完全な分枝移動について使用
した（ディスプレーサＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ、Ｐ−Ｄ、Ｍｅ
ｄＣまたはＰ−Ｄ−ｄＣによる断片Ｂ）。式（３）は、
位置Ｍ＋１における不整合により終止された全ての分枝
移動に適用した。これらの計算において、ＢｒｄＣにつ
いてΩ＞２、Ｂ_ｋ＝１．７−１．９およびｄＣについて
Ｂ_ｋ＝１である。

【０１１２】Ｂ_ｋは塩基対ｋについての相対的な会合定
数である。Ｂ_ｋは通常は１である。実施例２で決定され
たように、ＢｒｄＣについてＢ_ｋ＝１．７−１．９であ
る。同様にＭｅｄＣについてＢ_ｋ＝１．５−１．７であ
る。理論と実験との間に優れた定量的一致が認められ、
これは理論を使用してディスプレーサ分子を設計し得る
ことを示唆する。

【０１１３】実施例１０５′末端におけるリンカー捕捉５′オーバーハングにおける捕捉のため、ディスプレー
サおよびリンカー鎖の方向を逆転させ、リンカーは、受
容体デュープレックスに対する相同性を欠損するディス
プレーサ配列の３′部分とデュープレックスを形成する
ものとした。

【０１１４】プラスミドｐＡＬＡ−Ｄ−Ｇ３は、ヒトＡ
ＬＡ−Ｄの３．２ｋｂ染色体断片を含むｐＵＣ１９クロ
ーンである。オリゴデオキシヌクレオチドＥ−Ｄ−Ｂｒ
ｄＣおよびＸ−Ｄ−ＢｒｄＣは、それぞれ特有のＥｃｏ
ＲＩおよびＸｍａＩでの分枝移動についてのディスプレ
ーサとして合成した。同一のリンカー、Ｅ−Ｌ−ｄＣ
（Ｘ−Ｌ−ｄＣ）を両者のディスプレーサに用いた。

【０１１５】ＥｃｏＲＩまたはＸｍａＩおよび第２の制
限エンドヌクレアーゼを用いてｐＡＬＡ−Ｄ−Ｇ３を消
化し、便利な大きさの受容体断片を作成した。この生成
物をＰａｔＩプラスＲｓａＩ消化ｐＡＬＡ−Ｄ（実施例
４）と混合し、等モルのＰ−Ｌ−ｄＣおよびＥ−Ｌ−ｄ
Ｃおよび４００ｎＭＰ−Ｄ−ＢｒｄＣおよびＥ−Ｄ−Ｂ
ｒｄＣまたはＸ−Ｄ−ＢｒｄＣにより捕捉反応を行っ
た。

【０１１６】２５Ｕ／ｍｌＴ４ＤＮＡリガーゼを使用
し、実施例８に記載したようにリンカー捕捉反応を行
い、図２に示すゲルシフト分析を使用して分析した。リ
ンカー捕捉のための半分の時間は、ＰｓｔＩ（５０％Ｇ
＋Ｃ３′オーバーハング）について同一の反応のリンカ
ー捕捉についての半分の時間５′の場合、ＥｃｏＲＩ
（０％Ｇ＋Ｃ５′オービーハング）にて５′およびＸｍ
ａＩ（１００％Ｇ＋Ｃ５′オーバーハング）にて２０′
であった。よって、リンカー捕捉方法を５′または３′
オーバーハングおよび全ての可能なＧ＋Ｃ％のオーバー
ハングに適用し得る。

【０１１７】ＳｍａＩによりｐＡＬＡ−Ｄを切断し、こ
れにより平滑末端を与え、第２の酵素を用い、更にＸ−
Ｄ−ＢｒｄＣおよびＳｍ−Ｌ−ｄＣを使用して捕捉反応
を行った。３′または５′オーバーハングによる受容体
末端におけるリンカー捕捉より２桁遅い速度であった
が、リンカー捕捉が認められた。

【０１１８】実施例１１分枝移動構造の選択的クローン化先の例に記載したものと同様の分枝移動媒介捕捉反応の
生成物をベクタに連結し、例えばマニアティスら（１９
８２）により記載されたようにして、標準的クローン化
技術を使用してイー・コリを形質転換するのに使用し
た。

【０１１９】プラスミドｐＡＬＡ−ＤをＰｓｔＩにより
消化し、２７７１および１０３７ｎｔ断片を得た。２７
７１ｐＵＣ９含有断片をＳｍａＩによる消化によりクロ
ーン化ベクタとして不活性化し、これにより２つの平滑
末端断片を得た。１０３７ｎｔ断片のそれぞれの末端は
ＰｓｔＩ部位で終止し、その１つは断片Ｂ中のＰｓｔＩ
部位と同一である。分枝移動媒介捕捉反応は、Ｐ−Ｄ−
ＢｒｄＣおよびＰ−Ｌ−ｄＣを使用し、実施例７および
８に記載したようにして行った。ＳｐｈＩおよびＰｓｔ
Ｉにより消化したｐＵＣ１９に生成物を連結し、その両
者をベクタのポリリンカー領域にて切断した。ＳｐｈＩ
末端は、ディスプレーサ−リンカーデュープレックスの
捕捉により生成したオーバーハングに相補的な３′オー
バーハングを含んでいた。

【０１２０】４つの独立のプラスミドクローンを種々の
制限エンドヌクレアーゼにより消化し、得られる制限消
化生成物の電気泳動分析の後、リンカーの組み込みのた
め期待されるパターンを有することが示された。これら
のクローンの１つを、標準的な二本鎖ＤＮＡ配列決定技
術を使用して更なる解析のために選択した。図５に示す
配列決定ゲルのオートラジオグラムにより、クローン化
挿入物が分枝移動媒介捕捉およびリンカー連結に起因す
る生成物であるとの同一性が確認された。これらの結果
は、イー・コリは、ＢｒｄＣ置換体および分枝構造の両
者を処理し得るポリメラーゼおよびヌクレアーゼを含む
ことを示唆する。

【０１２１】よって、この発明の方法により得られる分
枝移動生成物は、標準的クローン化技術を使用して直接
クローン化することができる。ＢｒｄＣの存在、または
分枝移動構造の存在はいずれもクローン化プロセスを妨
害しない。

【０１２２】実施例１２分枝移動媒介ラベルおよび部分消化マッピングＰＭＳ−ＥＳ／ＰＭＳ−ＳＥおよびＰＭＳ−ＮＨ／ＰＭ
Ｓ−ＨＮをそれぞれ表１に示す順序でｐＵＣ１９のＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより
プラスミドｐＭＳ１９を作製した。この挿入によりプラ
スミドに隣接するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位
が破壊され、延長リンカー領域のそれぞれの末端にてＢ
ｇｌＩＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）部位に隣接して挿入した。
新しいポリリンカーは、ＳｆｉＩ部位、分枝移動標的配
列、ｐＵＣ１９の全ポリリンカー、異なる分枝移動標的
配列並びにＮｏｔＩ部位を含む。

【０１２３】ＢｇｌＩＩ部位を使用し、全領域延長ポリ
リンカーを、コスミドベクタを含む他のベクタ中の特有
のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。ＩＰＴＧおよびＸ
−ゲルにより生育させた場合にｐＭＳ１９が青色のコロ
ニーを与えるようリーディングフレームを維持した。既
に配列の決定されたヒトＡＬＡ−Ｄの３．６ｋｂＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ染色体断片をｐＭＳ１９のポリリ
ンカーにクローン化し、プラスミドｐＭＳ１９−Ｇ４を
作製した。

【０１２４】ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩによりｐＭＳ１９
−Ｇ４を消化した。ＳｆｉＩ部位またはＮ−Ｄ−Ｂｒｄ
ＣをラベルするＳ−Ｄ−ＢｒｄＣおよびＳ−Ｌ−ｄＣ並
びにＮｏｔＩ部位をラベルするＮ−Ｌ−ｄＣを使用し、
^３２Ｐラベルリンカー（ＳｆｉＩ）またはディスプレー
サ（ＮｏｔＩ）の分枝移動媒介捕捉により生成物を末端
ラベルした。Ｓａｕ３Ａ１によりこの生成物を種々の時
間消化し、生成物をアガロースゲル電気泳動により解析
した。クローン化断片のＳｆｉＩ末端におけるマッピン
グのオートラジオグラムを図６に示す。得られたＳａｕ
３Ａ１マップは公知のＤＮＡ配列と一致した。

【０１２５】リンカー−ディスプレーサデュープレック
スの融解温度は分枝移動プロセスに対して臨界的でない
ため、ラベルは放射能活性ラベルに限定されず、ラベル
した断片の検出またはアフィニティ精製を可能とする広
範な種類のラベルを含むものに拡張し得る。よって、制
限断片の特異的分枝移動媒介ラベルを、広範なマッピン
グおよび単離技術に適用することができる。

【０１２６】実施例１３トリプルヘリックスの形成実施例１３〜１４で使用した標的ＤＮＡは、実施例１２
に記載したプラスミドｐＭＳ１９とした。

【０１２７】ＥｃｏＲＩによる開裂により予め線状化し
た等量のｐＭＳ１９とスーパーヘリックスｐＭＳ１９Ｄ
ＮＡを混合した。１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ
４．８中で室温にて、このＤＮＡ混合物（２０μｇ／ｍ
ｌ）の画分を、^３２ＰラベルしたＢＴＤ−ＭｅｄＣ−１
（１μｇ／ｍｌ）または^３２ＰラベルしたＢＯ−Ｄ−Ｍ
ｅｄＣ−１（１μｇ／ｍｌ）オリゴデオキシヌクレオチ
ドと混合し、４°Ｃに冷却した。ＢＴ−Ｄ−ＭｅｄＣ−
１およびＢＯ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１の両者は分枝移動構造
を形成し得る配列を含むのに対し、ＢＴ−Ｄ−ＭｅｄＣ
−１のみがトリプルヘリックス形成に参画し得るポリピ
リミジン配列を含む。

【０１２８】インキュベーションの生成物は、１００ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．８中にて１．２％アガ
ロースゲルにより４°Ｃでの電気泳動により分離した。
このゲルを乾燥してオートラジオグラフィに供した。ｐ
ＭＳ１９のスーパーヘリックスおよび線状形態の両者
は、^３２Ｐ−ラベルしたＢＴ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１に安定
に結合した。スーパーヘリックスおよび線状形態の両者
とも、^３２Ｐ−ラベルしたＢＯ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１に安
定に結合しなかった。

【０１２９】よって、分枝移動に最も適切な低いｐＨで
あっても、分枝移動生成物を形成する能力は、線状また
はスーパーヘリックスＤＮＡとさえの安定な複合体の形
成には十分ではなかった。一方、安定なトリプルヘリッ
クス生成物は、ポリピリミジン配列が存在する場合、線
状およびスーパーヘリックスＤＮＡの両者で形成され
た。

【０１３０】実施例１４分枝移動とトリプルヘリックス形成との共役受容体プラスミドを、ＮｃｉＩおよびＳａｌＩにより切
断したｐＭＳ１９とした。ＳａｌＩは５′オーバーハン
グを生成する酵素である。ディスプレーサ分子は^３２Ｐ
ラベルしたＢＯ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１または^３２Ｐラベル
したＢＴ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１とした。リンカー分子はＢ
Ｔ−Ｌ−ｄＣ−１とした。ディスプレーサ−リンカーデ
ュープレックスは、実施例６に記載したように形成し、
実施例７に記載したようにハイブリダイズし、実施例８
に記載したように連結したが、ディスプレーサ−リンカ
ーデュープレックスの濃度は０．２μＭとし、溶媒は２
５ｍＭトリス−酢酸、ｐＨ６．８、１０ｍＭＮａＣｌ、
１ｍＭスペルミン、１ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ_２、１ｍＭＡＴＰとした。

【０１３１】５０％の分子が１００Ｕ／ｍｌにて２５分
で環化するリガーゼ緩衝液と比較し、前記した溶媒中で
ＥｃｏＲＩ線状化ｐＭＳ１９の環化の速度を比較するこ
とにより、有効なリガーゼ活性を決定した。決定したリ
ガーゼ活性は約０．５Ｕ／ｍｌであった。

【０１３２】図７は、分枝移動実験の流れ図を示す。３
０分後、受容体デュープレックスの５０％が、ＢＴ−Ｄ
−ＭｅｄＣ−１の存在下でリンカーを捕捉した。ＢＴ−
Ｄ−ＭｅｄＣ−１によるリンカー捕捉の速度は、実施例
８の方法を使用しリガーゼ活性およびディスプレーサ−
リンカーデュープレックスの濃度について予測されたも
のより３０倍大きかった。

【０１３３】ゲルを乾燥してオートラジオグラフィに供
した。螢光写真のレーン４〜６で見える分枝移動生成物
はオートラジオグラフで見ることができ、新たな螢光写
真バンドは、分枝移動媒介捕捉生成物を示すことを示唆
した。

【０１３４】一夜インキュベートした後、ＢＯＤ−Ｍｅ
ｄＣ−１による連結生成物の５０％収量の両者のディス
プレーサにつき分枝移動生成物が見られた。よって、Ｂ
Ｏ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１ではなくディスプレーサＢＴ−Ｄ
−ＭｅｄＣ−１上の特定の未修飾トリプレックス形成領
域の組み込みにより、分枝移動中間体は３０倍以上安定
化される。

【０１３５】理解を明確にすべく前記発明を図表および
例により幾分詳細に記載したが、前記請求の範囲記載の
範囲において、所定の変更および改変を行い得ることは
自明であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは（Ａ）ｐＡＬＡ−Ｄの制限マップを示
す。Ｒ＝Ｒｓａｌ、Ｐ＝ＰｓｔＩ。断片Ａ〜Ｄはライン
上でラベルし、下に示すヌクレオチド長さを有する。断
片Ｄに唯一のＳｍａＩ部位がある。また（Ｂ）ディスプ
レーサ（白四角）の分枝移動につき、４塩基の３′−オ
ーバーハング（断片のＰｓｔＩ末端）を有する受容体デ
ュープレックス内におけるリンカー（黒四角）への結合
を示す。図１Ｂは、３′オーバーハングのみ（左）に結合したデ
ュープレックスとその後完結した分枝移動（右）との間
の変換を示す。図１Ｃは、特異的ｐＡＬＡ−Ｄ断片による最大置換を示
す。ｍ＝ディスプレーサと相補的受容体鎖との間に形成
され得る塩基対の最大数。

【図２】Ｐ−Ｄ−ＢｒｄＣプラスＰ−Ｌ−ｄＣの捕捉反
応を示す。１％アガロースゲルのＵＶ螢光写真。レーン
１：ＲｓａＩ／ＰｓｔＩ消化ｐＡＬＡ−Ｄ（２００ｎ
ｇ）。Ａ、Ｂ、Ｃ並びにＤは図１に示した断片を示す。
レーン２〜９：それぞれ１、２、４、８、１６、３２、
６４並びに１２８分におけるＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ（６μｇ
／ｍｌ）、Ｐ−Ｌ−ｄＣ（２μｇ／ｍｌ）並びに５Ｕ／
ｍｌリガーゼ存在下での連結後の生成物。

【図３】図２のオートラジオグラムを示す。レーン１〜
８は、図２の放射能ラベルしたレーン２〜９に対応す
る。

【図４】図４Ａは、図３と同様のオートラジオグラムを
示すが、より高いリガーゼ濃度およびＰ−Ｄ−ＢｒｄＣ
を置換するＰ−Ｄ−ｄＣを用いた。図４Ｂは、Ｐ−Ｄ−ＢｒｄＣを置換するＰ−Ｄ−Ｂｒｄ
Ｃ−Ｅ（１０）を使用する以外は、図３と同一のオート
ラジオグラムにおける初期の時間点を示す。図４Ｃは、Ｐ−Ｄ−ＢｒｄＣを置換するＰ−Ｄ−Ｂｒｄ
Ｃ（２４）を使用する以外は図３と同様のオートラジオ
グラムを示す。

【図５】組み込まれたディスプレーサ（ボールド）およ
びリンカー（下線）配列の領域を示す配列決定ゲルのオ
ートラジオグラムを示す。

【図６】ｐＡＬＡＤ−Ｇ４、ヒトＡＬＡＤの染色体断片
およびディスプレーサリンカーデュープレックスＳ−Ｄ
−ＢｒｄＣを含むｐＭＳ１９の誘導体を使用するＢＣＲ
を示し、Ｓ−Ｌ−ｄＣは続いてＳａｕ３Ａ１による部分
消化を受ける。レーン１、２、３、４、５並びに８：そ
れぞれ１、２、３、４、５並びに８分に形成された部分
消化生成物。バンドａ〜ｋは、それぞれ３００、４０
６、１５３８、１５９８、２７０６、２７３１、２７４
８、３１９８と予想される大きさの部分消化バンド並び
にベクタ内の部位により生成した複数の大きなバンドで
ある。

【図７】トリプレックス集積分枝移動媒介リンカー捕捉
を示す。レーン１〜６：ＮｃｉＩおよびＳａｌＩにより
切断し、ＢＴ−Ｄ−ＭｅｄＣ−１、ＢＴ−Ｌ−ｄＣ−１
並びにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ここに記載したよ
うにして０、１、３、１０、３０並びに１２０分インキ
ュベートしたｐＭＳ１９。レーン７：ＡｖａＩＩにより
切断したラムダＤＮＡの分子量マーカー。レーン８〜１
３：ＮｃｉＩおよびＳａｌＩにより切断し、ＢＯ−Ｄ−
ＭｅｄＣ−１、ＢＴ−Ｌ−ｄＣ−１並びにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて、ここに記載したようにして０、３、１
０、３０並びに１２０分インキュベートしたｐＭＳ１
９。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロビンエスクオーテインアメリカ合衆国、ニユージヤージー州 07921、ベドミンスター、メイフイールドロード 80番 (72)発明者デイーンエルエンゲルハートアメリカ合衆国、ニユーヨーク州 10025、ニユーヨーク、リバーサイドドライブ 173番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】受容体ポリデオキシヌクレオチド配列の
１本の鎖と一本鎖ＤＮＡのディスプレーサ配列との不安
定複合体を形成するに際し、ディスプレーサ配列を受容
体ポリデオキシヌクレオチド配列のこの種の鎖に対して
少なくとも部分的に相補的とし、この複合体を安定化さ
せることからなることを特徴とする不安定複合体の形成
方法。
【請求項２】ディスプレーサ鎖中の少なくとも１つの
修飾ヌクレオチドの存在により不安定複合体が安定化さ
れる請求項１記載の方法。
【請求項３】ディスプレーサ配列と受容体デュープレ
ックスとのＤＮＡトリプレックスを形成することにより
複合体を安定化させる請求項１記載の方法。
【請求項４】ディスプレーサ鎖が、ヌクレオチド配列
と配列特異的ＤＮＡ結合部分（これは付着する部位で受
容体ＤＮＡデュープレックスを顕著に融解しない）とか
らなる請求項１記載の方法。
【請求項５】ディスプレーサ配列をディスプレーサ−
リンカーデュープレックス中でリンカーとのデュープレ
ックス形成に供し、このディスプレーサ−リンカーデュ
ープレックスが次の２の鎖：１．ディスプレーサ鎖（その一部は受容体ポリデオキシ
ヌクレオチドデュープレックスの１つの鎖に対して相補
的なヌクレオチドからなり、一部はリンカー鎖に相補的
でハイブリダイズする配列からなる）、および２．ディスプレーサ鎖に相補的でハイブリダイズするリ
ンカー鎖からなる請求項１記載の方法。
【請求項６】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの端部にて分枝移動を開始し得るオリゴまた
はポリデオキシヌクレオチドディスプレーサ−リンカー
デュープレックス（この種の受容体ポリデオキシヌクレ
オチドデュープレックスとの安定なハイブリッドの先行
する形成を伴わない）であって、このディスプレーサ−
リンカーデュープレックスが次の２つの鎖：ａ．ディスプレーサ鎖（その一部は受容体ポリデオキシ
ヌクレオチドデュープレックスの１つの鎖に対して相補
的なヌクレオチドからなり、一部はリンカー鎖に相補的
でハイブリダイズする配列からなる）、およびｂ．ディスプレーサ鎖に相補的でハイブリダイズするリ
ンカー鎖からなることを特徴とするオリゴまたはポリデ
オキシヌクレオチドディスプレーサ−リンカーデュープ
レックス。
【請求項７】制限エンドヌクレアーゼ開裂部位で分枝
移動を開始し得る請求項６記載のディスプレーサ−リン
カーデュープレックス。
【請求項８】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックス上の３′または５′一本鎖延長部にハイブリ
ダイズし、これに隣接して分枝移動を開始し得る請求項
６記載のディスプレーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項９】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１本の鎖に相補的な少なくとも１本のヌク
レオチドが修飾され、ハイブリッドディスプレーサ−受
容体デュープレックスの安定性が増加した請求項６記載
のディスプレーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項１０】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１本の鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドが修飾され、ハイブリッドディスプレーサ−受
容体デュープレックスの融解温度が上昇した請求項６記
載のディスプレーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項１１】修飾ヌクレオチドが、相補的デオキシヌ
クレオチドとの会合定数を少なくとも２０％増加させる
修飾ヌクレオチドよりなる群から選択される請求項９記
載のディスプレーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項１２】修飾ヌクレオチドが、５−ハロゲン化ピ
リミジンヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、
ジアミノプリンデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド並びに２′−アルキル化リボヌクレオチドよりなる群
から選択される請求項９記載のディスプレーサ−リンカ
ーデュープレックス。
【請求項１３】修飾ヌクレオチドが５−ハロゲン化ピリ
ミジンヌクレオチドである請求項９記載のディスプレー
サ−リンカーデュープレックス。
【請求項１４】修飾ヌクレオチドが５−ブロモデオキシ
ウリジンである請求項９記載のディスプレーサ−リンカ
ーデュープレックス。
【請求項１５】修飾ヌクレオチドが５−メチルデオキシ
シチジンである請求項９記載のディスプレーサ−リンカ
ーデュープレックス。
【請求項１６】ディスプレーサ−受容体ハイブリッドの
検出を可能とする修飾体を含む請求項６記載のディスプ
レーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項１７】修飾体が、放射能ラベル、蛍光ラベル並
びに検出の標的（ビオチン部分、酵素並びにホスホロチ
オエート結合を含む）よりなる群から選択される請求項
１６記載の修飾ディスプレーサ−リンカーデュープレッ
クス。
【請求項１８】修飾体がリンカー中に存在する請求項１
６記載の修飾ディスプレーサ−リンカーデュープレック
ス。
【請求項１９】アフィニティクロマトグラフィによりデ
ィスプレーサ−受容体ハイブリッドの捕捉を可能とする
修飾体を含む請求項６記載のディスプレーサ−リンカー
デュープレックス。
【請求項２０】修飾体が、ビオチン部分およびホスホロ
チオエート結合よりなる群から選択される請求項１９記
載のディスプレーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項２１】修飾体がリンカー中に存在する請求項１
９記載のディスプレーサ−リンカーデュープレックス。
【請求項２２】制限エンドヌクレアーゼによるポリデオ
キシヌクレオチドデュープレックスの消化に起因する
５′または３′一本鎖延長部に相補的な５′または３′
一本鎖延長部を更に含む請求項６記載のディスプレーサ
−リンカーデュープレックス。
【請求項２３】請求項６乃至２２いずれかに記載のディ
スプレーサ−リンカーデュープレックスにハイブリダイ
ズした天然に存在する受容体ポリデオキシヌクレオチド
デュープレックスからなることを特徴とする人工構成ポ
リデオキシヌクレオチドハイブリッド。
【請求項２４】リンカー鎖が、受容体デュープレックス
の鎖の１つに共有結合した請求項６乃至２２いずれかに
記載の人工構成ポリデオキシヌクレオチドハイブリッ
ド。
【請求項２５】請求項５７乃至８７記載のディスプレー
サにハイブリダイズした天然に存在する受容体ポリデオ
キシヌクレオチドデュープレックスからなることを特徴
とする人工構成ポリデオキシヌクレオチドハイブリッ
ド。
【請求項２６】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスを修飾するに際し、ハイブリッドポリデオキ
シヌクレオチドデュープレックスの形成を許容する条件
下でこの種の受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープ
レックスとディスプレーサ−リンカーデュープレックス
とを接触させることにより、この際、ディスプレーサ−
リンカーデュープレックスが次の２つの鎖：１．ディスプレーサ鎖（その一部は受容体ポリデオキシ
ヌクレオチドデュープレックスの１つの鎖に対して相補
的なヌクレオチドからなり、一部はリンカー鎖に相補的
でハイブリダイズする配列からなる）、および２．ディスプレーサ鎖に相補的でハイブリダイズするリ
ンカー鎖からなることを特徴とする受容体ポリデオキシ
ヌクレオチドデュープレックスの修飾方法。
【請求項２７】受容体デュープレックスが３′または
５′一本鎖延長部で終止し、ディスプレーサ鎖が延長部
に相補的な配列を含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】ハイブリッドポリヌクレオチドデュープ
レックスの形成後にハイブリッドを安定化する請求項２
６記載の方法。
【請求項２９】ディスプレーサ鎖に相補的な受容体デュ
ープレックスの鎖に対してディスプレーサ−リンカーデ
ュープレックスのリンカー鎖を共有結合させることによ
りハイブリッドを安定化する請求項２８記載の方法。
【請求項３０】共有結合をホスホジエステル結合とする
請求項２９記載の方法。
【請求項３１】Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し、ディスプ
レーサ−リンカーデュープレックスのリンカー鎖をディ
スプレーサ鎖に相補的な受容体デュープレックスの鎖に
連結することによりハイブリッドを安定化させる請求項
２９記載の方法。
【請求項３２】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドを、ハイブリッドディスプレーサ−受容体デュ
ープレックスの安定性を増加させる修飾ヌクレオチドと
する請求項２６記載の方法。
【請求項３３】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドを、ハイブリッドディスプレーサ−受容体デュ
ープレックスの融解温度を上昇させる修飾ヌクレオチド
とする請求項２６記載の方法。
【請求項３４】修飾ヌクレオチドを、相補的デオキシヌ
クレオチドの会合定数を少なくとも約２０％増加させる
修飾ヌクレオチドよりなる群から選択する請求項３２記
載の方法。
【請求項３５】修飾ヌクレオチドを、５−ハロゲン化ピ
リミジンヌクレオチド、５−メチルデオキシシチジン、
ジアミノプリンデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチ
ド並びに２′−アルキル化リボヌクレオチドよりなる群
から選択する請求項３２記載の方法。
【請求項３６】修飾ヌクレオチドを５−ハロゲン化ピリ
ミジンヌクレオチドとする請求項３２記載の方法。
【請求項３７】修飾ヌクレオチドを５−ブロモデオキシ
シチジンとする請求項３２記載の方法。
【請求項３８】修飾ヌクレオチドを５−メチルデオキシ
シチジンとする請求項３２記載の方法。
【請求項３９】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な約１０％〜８０％のヌ
クレオチドを修飾ヌクレオチドとする請求項３２記載の
方法。
【請求項４０】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの端部にて分枝移動を開始し得るディスプレ
ーサ−リンカーデュープレックスにハイブリダイズした
天然に存在する受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの人工構成核酸ハイブリッドをラベルするに
際し（この種の受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスとの安定なハイブリッドの先行する形成を伴
わない）、このディスプレーサ−リンカーデュープレッ
クスが次の２つの鎖：１．ディスプレーサ鎖（その一部は受容体ポリデオキシ
ヌクレオチドデュープレックスの１つの鎖に対して相補
的なヌクレオチドからなり、一部はリンカー鎖に相補的
でハイブリダイズする配列からなる）、および２．ディスプレーサ鎖に相補的でハイブリダイズするリ
ンカー鎖からなるラベル方法であって、このラベル方法は、ディ
スプレーサ−リンカーデュープレックスを修飾して、人
工構成核酸ハイブリッドの検出を可能とする修飾体をそ
の中に組み入れることを特徴とするラベル方法。
【請求項４１】ディスプレーサ−リンカーデュープレッ
クスが、天然に存在する受容体ポリヌクレオチドデュー
プレックスとのハイブリダイゼーションの前に修飾され
る請求項４０記載の方法。
【請求項４２】ディスプレーサ−リンカーデュープレッ
クスのリンカー鎖が、ディスプレーサ鎖に相補的な天然
に存在する受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレ
ックスの鎖に共有結合した請求項４０記載の方法。
【請求項４３】放射能ラベル、蛍光ラベル、酵素並びに
化学的ラベル（ビオチン部分およびホスホロチオエート
結合を含む）よりなる群から修飾体を選択する請求項４
０記載の方法。
【請求項４４】アフィニティクロマトグラフィの標的よ
りなる群から修飾体を選択する請求項４０記載の方法。
【請求項４５】ビオチン部分およびホスホロチオエート
結合よりなる群から修飾体を選択する請求項４４記載の
方法。
【請求項４６】修飾体がディスプレーサ−リンカーデュ
ープレックスの５′または３′一本鎖延長部からなり、
この延長部が、１）ディスプレーサ−リンカー受容体ポリデオキシヌク
レオチドデュープレックスハイブリッドの形成によって
影響を受けず、２）相補的５′または３′一本鎖延長部を含有するポリ
デオキシヌクレオチドデュープレックスへの付着につい
ての標的である請求項４０記載の方法。
【請求項４７】ベクタ中のクローン化デオキシヌクレオ
チド挿入物の一端をラベルするのに使用する請求項４０
記載の方法。
【請求項４８】ベクタをプラスミドベクタとする請求項
４７記載の方法。
【請求項４９】ベクタをコスミドベクタとする請求項４
７記載の方法。
【請求項５０】ベクタを酵母人工染色体ベクタとする請
求項４７記載の方法。
【請求項５１】請求項４０記載の方法により挿入物をラ
ベルすることからなることを特徴とする挿入物の制限エ
ンドヌクレアーゼマッピング方法。
【請求項５２】請求項４０記載の方法によりハイブリッ
ドをラベルすることからなることを特徴とする、アフィ
ニティクロマトグラフィによる人工構成核酸ハイブリッ
ドの捕捉方法。
【請求項５３】請求項４０記載の方法により受容体ポリ
デオキシヌクレオチドデュープレックスをラベルするこ
とからなることを特徴とする、ポリデオキシヌクレオチ
ドデュープレックスの集団中の受容体ポリデオキシヌク
レオチドデュープレックスの集積方法。
【請求項５４】請求項４０記載の方法により得られたハ
イブリッドをラベルすることからなることを特徴とす
る、制限エンドヌクレアーゼリンカーを受容体ポリデオ
キシヌクレオチドデュープレックスに共有付着する方
法。
【請求項５５】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスを選択的にクローン化するに際し、請求項４
０記載の方法によりハイブリッドをラベルすることから
なることを特徴とする、この種の受容体ポリデオキシヌ
クレオチドデュープレックス上に制限エンドヌクレアー
ゼリンカーを共有付着させることによる、受容体ポリデ
オキシヌクレオチドデュープレックスの選択的クローン
化方法。
【請求項５６】接触するポリデオキシリボヌクレオチド
デュープレックスのクローンを単離するに際し、請求項
４０記載の方法によりクローンをラベルすることからな
ることを特徴とする、デュープレックス上に制限エンド
ヌクレアーゼリンカーを共有付着させることによる、接
触するポリデオキシリボヌクレオチドデュープレックス
のクローンの単離方法。
【請求項５７】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスに結合し得るオリゴまたはポリデオキシヌク
レオチドディスプレーサであって、１）トリプルヘリックス形成を開始し得る第１配列であ
って、ａ）少なくとも６つの連続的なピリミジン塩基またはｂ）少なくとも７つの塩基（この場合，塩基の少なくと
も６つはピリミジン塩基であり，７つ目の塩基はグアニ
ンである）からなるもの、および２）この種の第１配列に近似し、受容体デュープレック
スの第２鎖に相補的で逆平行に走り、トリプルヘリック
スに近似する分枝移動を開始し得る第２配列からなるこ
とを特徴とするディスプレーサ。
【請求項５８】第２配列が第１配列に隣接する請求項５
７記載のディスプレーサ。
【請求項５９】第２配列が、１〜５の介在部分により第
１配列から離間する請求項５７記載のディスプレーサ。
【請求項６０】介在部分がヌクレオチドである請求項５
９記載のディスプレーサ。
【請求項６１】少なくとも１つの部分が修飾ヌクレオチ
ドである請求項６０記載のディスプレーサ。
【請求項６２】介在部分の１つが、共有付着した内位添
加剤を有する請求項５９記載のディスプレーサ。
【請求項６３】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドを修飾してディスプレーサ−受容体複合体の安
定性を増加させた請求項５７記載のディスプレーサ。
【請求項６４】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドを修飾してディスプレーサ−受容体複合体の融
解温度を上昇させた請求項５７記載のディスプレーサ。
【請求項６５】相補的デオキシヌクレオチドとの会合定
数を少なくとも約２０％増加させた修飾ヌクレオチドよ
りなる群から修飾ヌクレオチドを選択する請求項６３記
載のディスプレーサ。
【請求項６６】修飾体が第１配列である請求項６３記載
のディスプレーサ。
【請求項６７】修飾ヌクレオチドが５−ハロゲン化ピリ
ミジンヌクレオチドである請求項６６記載のディスプレ
ーサ。
【請求項６８】５−ブロモデオキシウリジンおよび５−
メチルデオキシシチジンよりなる群から修飾ヌクレオチ
ドを選択する請求項６６記載のディスプレーサ。
【請求項６９】修飾体が第２配列に存する請求項６３記
載のディスプレーサ。
【請求項７０】５−ハロゲン化ピリミジンヌクレオチ
ド、５−メチルデオキシシチジン、ジアミノプリンデオ
キシヌクレオチド、リボヌクレオチド並びに２′−アル
キル化リボヌクレオチドよりなる群から修飾ヌクレオチ
ドを選択する請求項６９記載のディスプレーサ。
【請求項７１】修飾ヌクレオチドが５−ハロゲン化ピリ
ミジンヌクレオチドである請求項６９記載のディスプレ
ーサ。
【請求項７２】修飾ヌクレオチドが５−ブロモデオキシ
ウリジンである請求項６９記載のディスプレーサ。
【請求項７３】修飾ヌクレオチドが５−メチルデオキシ
シチジンである請求項６９記載のディスプレーサ。
【請求項７４】オリゴまたはポリデオキシヌクレオチド
の末端に付着した少なくとも１つの部分を更に含み，こ
の部分が付着した末端にエンドヌクレアーゼ耐性を与え
る請求項５７記載のディスプレーサ。
【請求項７５】前記部分が末端ヌクレオチドのデオキシ
リボース部分に付着した請求項７４記載のディスプレー
サ。
【請求項７６】前記部分が末端ヌクレオチドのデオキシ
リボース部分に間接的に付着した請求項７５記載のディ
スプレーサ。
【請求項７７】前記部分が末端ヌクレオチドの水酸基に
付着した請求項７４記載のディスプレーサ。
【請求項７８】前記部分が末端ヌクレオチドのリン酸部
分に付着した請求項７４記載のディスプレーサ。
【請求項７９】内位添加剤、イソウレア、カルボジイミ
ド並びにＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールよりなる群
から前記部分を選択する請求項７４記載のディスプレー
サ。
【請求項８０】前記部分がメチルチオホスホネートであ
る請求項７７記載のディスプレーサ。
【請求項８１】ポリペプチドおよび蛋白質よりなる群か
ら前記部分を選択する請求項７４記載のディスプレー
サ。
【請求項８２】前記部分が、ホスホジエステル結合を介
して３′−末端デオキシリボヌクレオチドに付着した
２′，３′−ジデオキシリボースヌクレオチドである請
求項７４記載のディスプレーサ。
【請求項８３】２′，３′−ジデオキシリボースヌクレ
オチドが修飾２′，３′−ジデオキシリボースヌクレオ
チドである請求項８２記載のディスプレーサ。
【請求項８４】ディスプレーサ−受容体ハイブリッドの
検出を可能とする修飾体を含む請求項５７記載のディス
プレーサ。
【請求項８５】放射能ラベル、蛍光ラベル、酵素および
検出の標的（ビオチン部分およびホスホロチオエート結
合を含む）よりなる群から修飾体を選択する請求項８４
記載の修飾ディスプレーサ。
【請求項８６】アフィニティクロマトグラフィによりデ
ィスプレーサ−受容体ハイブリッドの捕捉を可能とする
修飾体を含む請求項５７記載のディスプレーサ。
【請求項８７】ビオチン部分およびホスホロチオエート
結合よりなる群から修飾体を選択する請求項８６記載の
ディスプレーサ。
【請求項８８】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスを修飾するに際し、この種の受容体ポリデオ
キシヌクレオチドデュープレックスと請求項５７記載の
ディスプレーサとを複合体の形成を可能とする条件下で
接触させることからなることを特徴とする受容体ポリデ
オキシヌクレオチドデュープレックスの修飾方法。
【請求項８９】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドを修飾してディスプレーサ−受容体複合体の安
定性を増加させる請求項８８記載の方法。
【請求項９０】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスの１つの鎖に相補的な少なくとも１つのヌク
レオチドを修飾してディスプレーサ−受容体複合体の融
解温度を上昇させる請求項８８記載の方法。
【請求項９１】相補的デオキシヌクレオチドとの会合定
数を少なくとも約２０％増加させる修飾ヌクレオチドよ
りなる群から修飾ヌクレオチドを選択する請求項８８記
載の方法。
【請求項９２】修飾体が、請求項５７記載のディスプレ
ーサの第１配列に存する請求項８８記載の方法。
【請求項９３】５−ブロモデオキシウリジンおよび５−
メチルデオキシシチジンよりなる群から修飾ヌクレオチ
ドを選択する請求項９２記載の方法。
【請求項９４】修飾体が請求項５７記載のディスプレー
サの第２配列に存する請求項８８記載の方法。
【請求項９５】５−ハロゲン化ピリミジンヌクレオチ
ド、５−メチルデオキシシチジン、ジアミノプリンデオ
キシヌクレオチド、リボヌクレオチド、並びに２′−ア
ルキル化リボヌクレオチドよりなる群から修飾塩基を選
択する請求項９４記載の方法。
【請求項９６】修飾ヌクレオチドを５−ハロゲン化ピリ
ミジンヌクレオチドとする請求項９４記載の方法。
【請求項９７】修飾ヌクレオチドを５−ブロモデオキシ
ウリジンとする請求項９４記載の方法。
【請求項９８】修飾ヌクレオチドを５−メチルデオキシ
シチジンとする請求項９４記載の方法。
【請求項９９】ディスプレーサが、オリゴまたはポリヌ
クレオチドの末端に付着した少なくとも１つの部分を含
み、この部分が付着した末端にエンドヌクレアーゼ耐性
を与える請求項８８記載の方法。
【請求項１００】前記部分が末端ヌクレオチドのデオキ
シリボース部分に付着した請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】前記部分が末端ヌクレオチドのデオキ
シリボース部分に間接的に付着した請求項１００記載の
方法。
【請求項１０２】前記部分が末端ヌクレオチドの水酸基
に付着した請求項９９記載の方法。
【請求項１０３】前記部分が末端ヌクレオチドのリン酸
部分に付着した請求項９９記載の方法。
【請求項１０４】内位添加剤、イソウレア、カルボジイ
ミド並びにＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールよりなる
群から前記部分を選択する請求項９９記載の方法。
【請求項１０５】前記部分がメチルチオホスホネートで
ある請求項１０１記載の方法。
【請求項１０６】ポリペプチドおよび蛋白質よりなる群
から前記部分を選択する請求項９９記載の方法。
【請求項１０７】前記部分が、ホスホジエステル結合を
介して３′−末端デオキシリボヌクレオチドに付着した
２′，３′−ジデオキシリボースヌクレオチドである請
求項９９記載の方法。
【請求項１０８】２′，３′−ジデオキシリボースヌク
レオチドが修飾２′，３′−ジデオキシリボースヌクレ
オチドである請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】ディスプレーサ−受容体複合体をラベ
ルするに際し、受容体ポリデオキシヌクレオチドデュー
プレックスと請求項１０１記載のディスプレーサとを複
合体の形成を許容する条件下で接触させることからな
り、その際ディスプレーサが、ディスプレーサ−受容体
複合体の検出を可能とし得る修飾体を含むことを特徴と
するディスプレーサ−受容体複合体のラベル方法。
【請求項１１０】放射能ラベル、蛍光および化学発光ラ
ベル、酵素および検出のための標的よりなる群から修飾
体を選択する請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】アフィニティクロマトグラフィの標的
よりなる群から修飾体を選択する請求項１０９記載の方
法。
【請求項１１２】ビオチン部分およびホスホロチオエー
ト結合よりなる群から修飾体を選択する請求項１１１記
載の方法。
【請求項１１３】アフィニティクロマトグラフィにより
人工構成核酸ハイブリッドを捕捉するに際し、請求項８
８記載の方法によりハイブリッドを修飾することからな
ることを特徴とする方法。
【請求項１１４】ポリデオキシヌクレオチドデュープレ
ックスの集団中の受容体ポリデオキシヌクレオチドデュ
ープレックスを集積するに際し、請求項８８記載の方法
により受容体ポリデオキシヌクレオチドデュープレック
スをラベルすることからなることを特徴とする方法。
【請求項１１５】受容体ポリデオキシヌクレオチドデュ
ープレックス中のヌクレオチドの部位特異的付加、欠失
または置換を行うに際し、請求項８８記載の方法により
デュープレックスを修飾することからなることを特徴と
する方法。
【請求項１１６】ＤＮＡの修飾鎖により天然に存在する
ＤＮＡの鎖を置換することからなる変異損傷を修復する
方法を行うに際し、請求項８８記載の方法により新しい
鎖を天然に存在するデュープレックスに導入し、元の鎖
を置換することからなることを特徴とする方法。