JPH05505101A - オリゴヌクレオチド療法における三重らせん形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド　における三重らせん≦１瓜立旦 本発明は、二重鎖ＤＮＡと三重らせんを形成するように設計されたオリゴマーを 用いる療法の態様に関する。さらに詳細には、本発明は、ＤＮＡ二重鎖の主要な グローブを標的とするオリゴヌクレオチドを含む、薬剤組成物を提供することに 関する。 本発明はさらに、逆の極性のタンデム配列を有するオリゴヌクレオチドに関する 。このようなオリゴヌクレオチドは、二本鎖の二重ＤＮＡと三重らせんを形成す るのに°有用である。 逆の極性のオリゴヌクレオチドは、本発明によって、安定化され得る。本発明で は、自然には存在しない末端あるいは内部結合が提供され、それによって、ヌク レアーゼによって起こり得る損傷が回避される。 １１芝！ 三重らせん複合体を形成するための一本鎖オリゴヌクレオチドのＤＮＡ二重鎖と の結合を支配するルールについては、最近記述されだした。現在、三重らせん形 成を起こさせるモチーフとして２つが認識されている。このうち古い方は、一般 的に”ＣＴ”モチーフと呼ばれており、一本鎖オリゴマーの重要な認識部分に、 ピリミジンベースの配列を提供する。 このことによって、生じた三重らせんの結合している３つの鎖を結ぶＴ−Ａ−Ｔ およびＣ−Ｇ−Ｃ’ベースのトリプレットができる。このシステムは、二本の鎖 のうちの一方が、プリン塩基の残基のみを宵するかあるいはほとんどプリン塩基 の残基であるような、長い二重鎖の場合に有効である。ピリミジンを含むオリゴ マーは、二重鎖に結合する際、そのオリゴマーの極性（ｐｏｌａｒｉｔｙ）がプ リンリッチな標的を含む二重鎖の鎖と同方向（ｐａｒａｌｌｅｌ）になるように する。適当なピリミジン／プリン結合は、相補性として知られているものと同じ である。すなわち、オリゴマー中では、ＴはＡＴ対の認識のために提供され、Ｃ は、ＧＣ対の認識のために提供される。 要するに、ＣＴ方式を用いる三重らせんの形成のためには、オリゴマーは、二重 鎖のうちの一本鎖のプリンリッチな領域に、「相捕的な」塩基をその鎖と同方向 に提供するように設計される。この三重らせんの形成の方式は、Ｍｏ５ｅｒ、　 Ｈ，Ｅ、およびＤｅｒｖａｎ、　Ｐ、Ｂ、、の、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７） 　２３８：６４５−６５０に要約しである。 もうひとつのモチーフは、”ＧＴ″モチーフと呼ばれ、より最近認識されてきた 。Ｃｏｏｎｅｙ、　Ｍ、らの、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８＞　ｉ４１：４５６ −４５９では、Ｇ残基を多数含むプリンリッチなオリゴマーが、ＧＣ対に富みか つ一本の鎖にほとんどのプリン残基が位置している標的のＤＮＡ二重鎖と、三重 鎖を形成することが報告された。この結合の方式によって、三重鎖の中の三本の 鎖にわたってＧ−Ｇ−Ｃトリプレットが生じる。そして証明されてはいないが、 Ａ−Ａ−Ｔ　トリプレットが示唆された。 この方式でもまた、プリン残基が二重鎖のうちの一本鎖に偏在している必要があ る。しかし、標的の二重鎖に対するオリゴマーの方間は、前述のＣＴ方式とは逆 である。すなわち、オリゴマーは、二重鎖のうちのプリンリッチな鎖に逆方間に 方向付けられている。三重らせん形成のための上記２つのモチーフの有用性によ って、二重鎖形成を可能にするオリゴマーの設計の可能性が広がる。始めに、す べての場合において、標的の二重鎖のうちの一本鎖のある部分にプリン残基のあ る程度の濃度が必要であることを言っておくべきである。しかし、生じる複合体 に安定性を与え得るかあるいは投与されるオリゴマーに適合性を与え得る付加的 な因子を好都合に利用できるように、二重鎖を標的付けるための数多くのストラ テジーを利用することは、都合がよい。 以下に示すように、三重らせん形成のための少なくとも４つの基本的なストラテ ジーがある。これらのうちの２つでは、逆の極性を含むオリゴマーを用いる。従 って、本発明は、オリゴヌクレオチドのなかの少なくとも２つの領域で逆の極性 を宵スる複数のオリゴヌクレオチドを提供する。「逆の極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ 　ｐｏｌａｒｉｔｙ）　Ｊとは、オリゴヌクレオチドが逆の極性を有するタンデ ムの配列を含むことを意味する。すなわち、５’−３’極性を有する配列の後に ３′−５°極性を有する配列が含まれる場合とその逆の場合とがある。このこと は、これらの配列が、ヌクレオチド同士の３’−３’継目に有効と考えられ得る 結合により連結しているか、　（結合はどのような方法で行っても構わない）、 あるいはヌクレオチド分子内で５°　−５′に有効な結合をしていることを示唆 している。 このようなオシゴマ−は、Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ、　Ｍ、Ｌ、らの、Ｎｕｃｌｅ ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９９０）　１８：２６６１−２６６９によって、 環状オリゴヌクレオチドを得るための反応の副産物であることが示されている。 ３’−３’逆向きあるいは５’−５’逆向きのどちらかを用いてＡＴ結合によっ て結ばれたヘアピンを形成するように設計された「同方間鎖のＤ　Ｎ　Ａ　（ｐ ａｒａｌｌｅＩ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ）　Ｊの組成物が、ｖａｎ　ｄｅ　 ５ａｎｄｅ、　Ｊ、Ｈ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４ユ、５５１− ５５７によって、合成されている。さらに、有効な３°　−３°結合を含むオリ ゴマーを用いた三重らせんの形成が、Ｈｏｒｎｅ。 Ｄ、　Ａ、　およびＤｅｒｖａｎ、　Ｐ、Ｂ、の、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｅ 　（１９９０）　１１２：２−４３５−２４３７に記載されている。 及朋ｊ」１尽 二本鎖二重ＤＮＡを標的づけるためのオリゴヌクレオチド配列の設計では、上記 の結合モチーフの１つあるいは両方を用い得る。そして逆の極性を有するオリゴ ヌクレオチドを用い得る場合と用い得ない場合とがある。これらのことは、オリ ゴマーの投与の特定の環境を特徴付ける標的の二重鎖の性質および他の条件によ って決まる。 ４つの基本的な場合が予想され得る。第一に、当分野で理解されている非常に簡 単なケースでは、結合モチーフは単一の極性の標準的なオリゴマーと一致する。 この場合、二重鎖のうちの一本鎖のみが標的にされ得る。そして、この鏡上の１ を越えるプリンリッチな領域がこの型のオリゴマーとの二重鎖のなかに取り入れ られ得るが、このような複数の領域は、結合が起こらないピッミジンリッチなセ クレチンによって妨害され得る。 二番目の場合では、二重鎖のうちの一本鎖中のプリンリッチな領域を標的付けす ることが望まれ得るが、結合は異なるモチーフを用いて提供される。例えば、オ リゴマー中のントシン残基の結合がｐＨに依存しているために、Ｇ／Ｃリッチな 領域同士が出会ったときに、ＧＴモチーフが都合がよい場合がある。従って、グ アニジンに富むホモプリン領域は、ＧＴモチーフを用いて都合よ（結合し得る。 これに対して、アデニンリッチな領域に接近するには、ＣＴモチーフを用いるこ とが望まれ得る。二重鎖の一本の鎖に結合するモチーフの変化は、モチーフの変 化に対応するオリゴマーの極性の逆転と結び付いているはずである。 第３および４の場合では、二重鎖中の反対側の鏡上のプリンリッチな領域をクロ スオーバーしたり、あちこちで入れ替わったりすることが望まれ得る。このこと は、単一のクロスオーバーでは、同じモチーフを用いて、標的付けするオリゴヌ クレオチドの極性を逆にするか、あるいは極性を一定にして結合モチーフを変え ることによってなされ得る。 従って、ある場合では、オリゴヌクレオチド配列が二本鎖二重ＤＮＡにハイブリ ダイズする能力は、オリゴヌクレオチドに逆の極性を与えることによって促進さ れる。この逆の極性は、結合するオリゴヌクレオチドが極性の／フトに伴って、 二重鎖の−っの相補鎖から別の鎖に移るように与えられるか、あるいはもう一つ のモチーフの利点を生かせるように与えられる。この一番墾単な実施態様では、 結合オリゴヌクレオチド中で、−回の極性の逆転がある。もちろん、ＤＮＡ二重 二重釣橋的配列って、いくつでも逆極性を挿入することはできる。 従って、１つの面では、本発明は、反対の極性のタンデム配列を少なくとも２つ 含み、従ってオリゴヌクレオチドの極性を逆にする少なくとも１つの結合を含む オリゴヌクレオチド配列に関する。さらに本発明は、これらのオリゴヌクレオチ ドを調製しそして用いる方法に関する。極性の逆転は、もし所望であれば、三重 らせん形成に関する結合モチーフの変化と結び付き得る。 本発明はさらに、二重らせんのポリヌクレオチド二重鎖の両方の鎖のタンデムの 部分にオリゴヌクレオチドが結合するための方法を包含する。この方法は、標的 の二重らせんポリヌクレオチド二重鎖をオリゴヌクレオチドに結合させて、二重 鎖を形成する工程を包含する。このオリゴヌクレオチドは、二重鎖の第一の鎖の ある部分に結合し得る第一の配列のヌクレオチド；およびそれに続く、二重鎖の 上記東−の鏡上の標的の部分に隣接する第二の鏡上のある部分に結合し得る第二 の配列のヌクレオチド、とによって特徴付けられる。ここで、この第二の配列は 、第一の配列と逆の極性を有するがあるいは異なった結合モチーフを有する。 なお、他の面において、本発明は、チミン残基の豊富な領域およびそれに続くグ アニン残基の豊富な領域とが交互にあることにより特徴付られるオリゴヌクレオ チドに関する。これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡ二重鎖との結合のための交 互のモチーフを持っている。もう一つの発明の側面は、上記で述べたように、こ れらのモチーフを用いることによって二重鎖に結合する方法に関する。 本発明はまた、二重鎖の一本の鎖の少なくとも２つの隣接部分を逆の極性のオリ ゴヌクレオチドを用いて結合する方法に関する。 【皿ΩＪソＩＬ疲胆 箪１図は、２つの隣接リボシル（ｒｉｂｏｓｙｌ）残基および２つの隣接キシロ シル（ｘｙｌｏｓｙｌ）残基間の１．４−ジヒドロキジルメチルベンゼンに介さ れた結合を示す。 第２図は、第１図において例示された型の「スイッチバック」を含む反応図の概 略を示す。 第３図は、「スイノチバ、り」または極性逆転を得るためのオリゴマーにおける 二量体シントン（５ｙｎｔｈｏｎ）を包含するための反応図の概略を示す。 第４図は、二重鎖の一本の鏡上のプリンリッチな領域を含む二本鎖の候補のンリ ーズを示す。 第５図は、予想されるオリゴマーの型の概略を示す。 及囚区ｍ掻 本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは一般にポリデオキシリ ボヌクレオチド（２゛−デオ牛シーＤ−リボース、またはその改変型を含む）、 即ちＤＮＡ、およびポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース、またはその改変型を 含む）、即ちＲＮ　Ａ、　および他のプリンもしくはピリミジン塩基の、または 修飾プリンもしくは修飾ピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシド であるすべての型のポリヌクレオチドをいう。同様に用語「ヌクレオシド」また は「ヌクレオチド」は、リボヌクレオシドまたはりボヌクレオチド、デオキシリ ボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド、および他のプリンもしくはピ リミジン塩基の、または修飾プリンもしくは修飾ピリミジン塩基のＮ−グリコシ ドまたはＣ−グリコシド　−であるすべての型のヌクレオシドをいう。このよう に、糖の炭素の立体化学は、さらに以下に述べる様に、ある限られた残基中のＤ −リボースのそれ以外であり得る。 「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、既知のプリンおよびピッミジン塩 基のみならず修飾されたヘテロ環状塩基をも包含する成分を含む。このような修 飾物には、アルキル化プリンもしくはアルキル化ピリミジン、アシル化プリンも しくはアシル化ピリミジン、または、他のへテロ環が包含される。そのような「 アナログプリン」および「アナログピリミジン」は当該分野において一般的に知 られており、それらの多くが化学療法剤として使用されている。完全ではないが 典型的なリストには、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメ チル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボ牛ジ メチルアミノーメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル ウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−インペンタニル−アデニン、１ −メチル−アデニン、１−メチルシュードウラシル、ｌ−メチルグアニン、１− メチルイノシン、２．２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチル −グアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン 、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキンアミノ メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキニ−オシン、５゛メトキシカ ルボニルメチルウラシル、５−メト牛シウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イツ ペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酸酸メチルエステル、ウラシル−５ −オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｖｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シェードウラ シル１牛二−オシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２− チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オ キシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シェードウラシル、キニ ーオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミツプリンが含まれる。「ヌク レオシド」あるいは「ヌクレオチド」はまた、糖成分が修飾されたものをも含む 。例えば、糖成分のうちの一つまたはそれ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン、 脂肪族基で置換されるか、または、エステル、アミン、およびその他のように機 能化される。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの例には、以下のものが含ま れるが、これらに限定されない＝２−アミノアゾ／ノン　２゛−チオキシ−２− アミノアデノシン５−ブロモウリジン　２゛−デオ牛シー５−ブロモウリジン５ −クロロウリジン　２°−デオキシ−５−クロロウリジン５−フルオロウリジン 　２゛−デオキシ−５−フルオロウリジン５−ヨードウリジン　２°−デオキシ −５−ヨードウリジンＳ−メチルウリジン　（２°−デオ牛シー５−メチルウリ ジンはチミジンと同じ） イノシン　２゛−デオキシ−イノシン 牛サントシン　２−デオキシ−キサントシンさらに、αアノ−マーはβア／−マ ーと同様の方法で二重鎖に結合するので、一つまたはそれ以上のヌクレオチドが この結合またはそのドメインを含み得る。（Ｐｒａｓｅｕｔｈ、Ｄ、　ラ、ニＮ ａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ＞（１９８８）８５：１３４９−１３５３＞ 。 本発明によるスイッチバックオリゴヌクレオチドは、いかなる長さでもあり得る が、約１０ヌクレオチドかそれより多く、約１５より多いことが好ましい。しか し、特に５０ヌクレオチドより長いかまたは１００ヌクレオチドより長いオリゴ ヌクレオチドも作製され得る。オリゴヌクレオチドは、通常のヌクレオチド間の ホスホジエステル結合を含み得、またはホスホルアミデート＜ｐｈｏｓｐｈｏｒ ａａｉｄａｔｅ）結合のような改変型をも含み得る。これら代替の結合基には以 下のものがあるが、この中の例には限定されない。ここでの例では次式の成分； Ｐ　（０）　ＳＳＰ　（０）　ＮＲ２、Ｐ　（０）　Ｒ，Ｐ　（０）　ＯＲ’、 ｃｏ、またはＣ０ＮＲ２（ＲはＨ（または塩）またはアルキル（１−１２Ｃ）そ しｒＲ’　はアルキル（１−６Ｃ））が−〇−または−Ｓ−を通じて隣接するヌ クレオチドに結合する。同じオリゴマー中で、そのような結合基の全てが同じで ある必要はない。 極性の逆転もまた、オリゴヌクレオチドの「誘導体」中で起こり得る。オリゴマ ーの「誘導体」には、従来当該分野で認識されているものが含まれる。例えば、 オリゴヌクレオチドは、以下のような種々の成分と共有結合し得る：インターカ レーター（ｉｎｔｅｒｅａｌａｔｏｒｓ）、ＤＮＡ二重鎖らせんのマイナーグロ ーブ（ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）および他の任意に選択された標識物（放射能 活性、蛍光、酵素など）のような共役物と特異的に相互作用する物質。これらの 付加的な成分はいかなる好都合な結合を介しても誘導体化され得る。例えば、ア クリジンのようなインターカレーターは、すべての利用し得る一ＯＨまたは−Ｓ Ｈを通じて、例えばＲＮＡまたはＤＮＡの５′末端部分、ＲＮＡ（７）２’　部 分、またはＯＨ％ＮＨ２、Ｃ０ＯＨもしくはＳＨで処理されたピリミジンの５位 （例えばシトシンの５メチルの代わりに、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ ２ＣＨ２０Ｈまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２５Ｈなどを５位に含む誘導型）に結合 し得る。通常の結合を通じて結合したものも含めて広汎な種々の置換体が結合し 得る。オリゴマー中の示された−○Ｈ酸成分、リン酸基（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔ ｅ　ｇｒｏｕｐ＞で置換され得るか、標準の保護基により保護され得るか、また は他のヌクレオチドとさらに結合するために活性化されるか、または結合置換体 に結合し得る。５′末端のＯＨは１ノン酸化され得る；３°末端の２°　−ＯＨ またはＯＨ置換体もまたリン酸化され得る。ヒドロキシル化物（ｈｙｄｒｏｘｙ 　Ｉｓ）もまた標準保護基に誘導され得る。 オリゴヌクレオチド、またはそのセグメントであって、５′→３′　もしくは３ ’−５’極性のものは従来法により、合成される。このような合成方法は、例え ば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ（１９８６）Ｌｉ：５３９９−５４６７：Ｎｕｅｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅ ｓｅａｒｃｈ（１９８ｇ）ｉｓ：４８３１−４８３９；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ 　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９１１７）ｉ：２８７−２９１；Ｆｒｏ ｅｈｌｅｒ、　Ｂ、、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ（１９８６）２７：５５７５−５５−７ ８に記載されている。 一般的に、通常の３’　−５’　または５’−３’結合を含むオリゴヌクレオチ ドの合成には、２種類の通常使用されている、固相を基にしたアプローチがある 。一つは中間体ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）を用 い、他方は中間体ホスホネート結合を用いる。ホスホルアミダイトを基にした合 成では、結合されるべき位置にンアノエチルホスホルアミタイトを持つ、適切に 保護されたヌクレオチドが、固相担体上で伸長するヌクレオチド鎖の遊離のヒド ロキシル化と反応する。反応によって、シアノエチルホスファイト（ｃｙａｎｏ ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）を生じ、その結合は、還元型は酸に不安定なの でそれぞれの中間段階でンアノエチルホスフェートに酸化されなければならない 。Ｈ−ホスホネートを基にした合成は、Ｈ−ホスホネート成分を結合の部位に含 み、適切に保護されたヌクレオシドを！ｌＩ！のヒドロキシル基を持つ固′４＠ 銹導体化されたヌクレオチドと、適正なアクティベーターの存在下で反応させる ことにより行われ、これによって、酸に安定なＨ−ホスホネートジエステル結合 が徨られる。このように、ホスフェートまたはトリホスフェートへの酸化は、オ リゴヌクレオチドの合成中のどの時点でも、またはオリゴヌクレオチドの合成が 完成した後に、行なわれ得る。Ｈ−ホスホネートはまた、四塩化炭素の存在下、 第一級もしくは第二級アミンとの反応によりホスホルアミデート誘導体に転換さ れ得る。２つのアプローチを一般的に表示するために、入ってくるヌクレオシド は「活性化されたホスファイト／ホスフェート」基を持っていると見る。 ヌクレオチド間結合の型における多様性は、例えば、Ｈ−ホスホネートそれ自身 よりむしろメチルホスホネート前駆体を用いることにより、ヌクレオシド成分の チオール誘導体を用いることにより、および当業技術で一般的に知られている方 法により達成される。リン酸以外を基にした結合も用い得る。例えば、１９８９ 年ｌＯ月２４日および１９８９年１２月１１日に出願した同一の出願人による係 属中の米国出願系４２６．６５６号および竿４４８．９１４号中（両者とも同じ 譲受人に譲渡され、そして本明細書において参考として援用されている）に記述 され、クレームされているホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）型結合の ような結合である。 このように、３’−５“極性を持つオリゴヌクレオチドセグメントを得るために 、５“位が保護され、および３°位に活性化ホスファイト／ホスフェート基を含 むヌクレオチドは、３゛−ヒドロ牛ンル基を通じて固体担体に結合しているヌク レオシドの５°位のヒドロキシルと反応する。得られた縮合オリゴマーは脱保護 化され、反応はさらに別の５′　−保護され、３′−ホスファイト／ホスフェー ト活性化されたヌクレオチドと繰り返される。逆に、５’−３’極性のオリゴセ グメントを得るために、３°位が保護されかつ５°位に活性化されたホスファイ ト／ホスフェートを含むヌクレオチドは、５°位を通じて固体担体に結合したヌ クレオチドオリゴマーもしくはヌクレオシドと反応し、３゛　−ヒドロキシルが 反応できるような状態で残る。同様に、入ってくるヌクレオチドの縮合の後、３ ′基は脱保護し、さらに別の３′　−保護され、５′　−活性化されたヌクレオ チドと反応する。この連続が所望の数のヌクレオチドが付加されるまで続けられ る。 これらの非常に便利なおよび今や最も一般的に使用される固相合成手法を採用す ることに加えて、オリゴヌクレオチドはトリエステル合成のような液相法を用い ても合成され得る。 これら方法は実行可能であるが、一般的に、全ての十分な長さのオリゴヌクレオ チドには、あまり効果的ではない。 本発明のオリゴヌクレオチドは二重鎖形成のために二重鎖を標的とするように設 計されており、上記の様に、単一または混合モチーフを持ち得て、逆の極性領域 を含み得る場合と含み得ない場合とがある。モチーフの多様性に関して、オリゴ マーの部分は、ＣＴ−タイプ結合をするように設計された領域を含み得る；同じ オリゴマー中の別の領域は、ＧＴ−タイプ結合をするように設計される。ＣＴ− タイプ結合をするように設計された領域は、以下の方法の様にピリミジン残基が 富化される。Ｔ残基は二重鎖の中のＡ残基を標的にすると考えられ、モしてＣ残 基は二重鎖の中のＣ残基を標的とすると考えられ得、標的とされたプリン領域は オリゴヌクレオチドに関して逆方間に読まれる。ＣＴ結合を行う本発明のオリゴ ヌクレオチド領域はピリミジンリッチであり、同方向に標的二重鎖の鏡上のプリ ンリッチな配列を読むために設計された配列を含み得る。 オリゴスクレオチドのすべてがホーガンモード（Ｈｏｇａｎ冒０ｄｅ）を行う様 に設計されている場合、もちろん、結合配列はプリンリッチであり得る。従って 、混合モチーフオリゴヌクレオチドに対しては、ピリミジンリッチな領域はプリ ンリッチな領域と交互である。モチーフの変更が極性逆転と組合わされている場 合、一般的に、ピリミジンリッチから例えばプリンリッチへの遷移は通常極性の 逆転領域と一致する。 オリゴヌクレオチドがどのような設計でも、プリンリッチな領域を含む二重鎖の うちの１本の鎖は規則を合理化するために形式的に標的とされる。プリンリッチ な領域のこの「標的づけ」は形式的であり、そして規則は、もし所望されるなら ばピリミジンリ・／チな鎖と書き直し得る。 最も一般的な形態では１、本発明の逆の極性オリゴヌクレオチドは、その長さに 沿って次の式の少なくとも一つのセグメントを含む： ３’−−−−→Ｓ゛−−Ｃ−−５°−−−−−３°　（１）あるいは ５°−−−−−３°−−Ｃ−−３°−−−−−５’　（２）ここで−〇−は、反 対極性のヌクレオチド配列を結合するすべての方法を表す。 これらの式において、３°−−−−５°の印はオリゴマーの伸長を示すものであ って、この中では結合は、ヌクレオチドのリボシル残基の５１　ヒドロキシルが 左、ヌクレオチドのリボ　−シル残基の３′　ヒドロキシルが右との間で一貫し て形成されている。従って一番右側のヌクレオチドリボシル残基の５゜ヒドロキ シルは、さらなる結合ができる状態になっている。 同様に、５”　−−−−３’は反対方回のオリゴマーの伸長を示し、ここで、結 合は、左側のヌクレオチドのリボシル残基の３′ヒドロキシルと右側のヌクレオ チドのリボシル残基の５′　ヒドロキシル間で形成され、従って、−香石側のヌ クレオチドリボシル残基の３′　ヒドロキシルがさらなる結合ができる状態にな っている。 一〇−で表される結合は、式（１）の隣接したリボシル残基の５°　ヒドロキシ ル、もしくは式（２）の隣接したリボシル残基の３′　ヒドロキシルに結合する ように形成され得る。あるいは、ｒ−Ｃ−Ｊ結合は逆の極性の鎖が結合するよう に隣接ヌクレオチドの他の部分と結合し得る。ｒ−Ｃ−Ｊはリンカ−成分を、ま たは単に共有結合を表し得る。 もし逆の極性の鏡開の結合が糖残基を含む場合、３°　または２′位のいずれも が結合に用いられ、そしてこれらのいずれの位置もＲまたはＳ立体配置であり得 ることに注意すべきである。立体配置の選択によって、部分的には結合付近にお けるオリゴマーの幾何構造を決定する。このように、たとえば、もし、隣接３° 位が共有結合に用いられれば、結合に用いられている両方の３゛　ヒドロキシル が通常のＲ立体配置にある条件で、オリゴヌクレオチド鎖のより厳密でない変形 が一般に起こり得る。もしそれらが両方ともＳ立体配置にあれば、これは、鎖中 で「もつれ（ｋｉｎｋ）Ｊを生じさせる。 標準オリゴヌクレオチド合成方法の使用、またはリボシル成分間の５°−５°、 もしくは３′−３”結合を行う他の結合法に加えて、逆の極性の２本の鎖を結合 する別のアプローチが用いられ得る。例えば、逆の極性オリゴヌクレオチド配列 における対向した末端に付加された２つの塩基は、直接にもしくはリンカ−を通 じて結合され得る。あるいは、ひとつの塩基は、他方の糖成分に結合し得る。結 合を行うすべての適切な方法が採用し得る。本発明のスイ、１チバ／クオリゴヌ クレオチドの特徴的な面は、逆の極性のタンデム領域を含むことであって、３′ −５”極性の領域の後に５’　−３’　極性の領域がある場合と、またはその逆 の場合、または両方の場合がある。 逆の極性をもつセグメントを結合する方法によって、この結合は、二量体ヌクレ オチドの挿入によりなされ得るかあるいは通常の合成が継続され得る。前者の場 合、二量体の各メンバーの適当な３′位、または二置体各メンバーの５′位が伸 長鎖への二量体の含宵のために活性化される。後者の場合、ヌクレオチドを縮合 させるために、もし鎖の極性が同じままであれば、採用され得るそれと逆の方法 で保護化／活性化されるヌクレオチドを用いる。この付加的なヌクレオチドはま た、鎖を伸長させるために縮合前後に含まれ得るリンカ−成分を含む。 例えば、化学式（１）および（２）の一つ例証の態様では、これらの化合物は該 化学式の逆転を与える結合を包含する：（νＡ壬傘台） （２′） （ｐメ、１体らン または、より完全な式は次の通りである：Ｂは、すべてのプリンもしくはピリミ ジン塩基、修飾プ１ノンもしくはピリミジン塩基、またはアナログヌクレオチド のすべての目的の相当成分であり、■まホスホジエステル結合モジくはその従来 の置喚物（メチル十スホ不−トのような）を表す； ＹはＨ，−ＯＲ，ＳＲ，−ＮＲ２、○−１またはＳ−；Ｘは○、Ｓ、またはＮＲ 。 ここで各Ｒは独立してＨ，アルキル（１−１２Ｃ）、アリール（６−１２Ｃ）、 アラル牛ル（７−２０Ｃ）またはアルカリール（７−２０Ｃ）： ｎは０または１：および Ａはリンカ−基の残基である。 このように、これらの式においては、太線は糖を表し、一方Ｂは塩基を表す。図 中の対角線の中くめはホスホジエステル結合または類似結合を表示する。この対 角線は１本の太線の末端およびもう一つの中央とを結合する６　これらの接合点 は５’　−ＯＨおよび３’　−ＯＨをそれぞれ指す。 このタイプの結合は、襟卓固相合成手法を用いて一〇−が連続的に取り込まれ得 るので簡便である。５′−５°または３′−３′結合が特に示されたが、結合部 分それ自身は、隣接スイノチバＩクヌクレオチド残基上の糖−糖、糖−塩基、ま たは塩基−塩基の結合に用いられ得る。さらに、固相配列内に前もって連結され た二量体を使う、あらゆる結合形態が含まれ得る。 上記実施態様においてｎがＯであるとき、３−３゛または５°−５′結合は、標 準的なオリゴヌクレオチド合成法を使って簡単に形成される。この方法において 配列に付加されるヌクレオチドは、元の鎖の極性が続く場合に使われるのと逆の 方向で保護され活性化される。ｎ＝１であるとき、極性が逆になった結合を行う ために、リッカーが使用される。ｎが１より大であり得ない、という理論的な理 由はない。しかし、合成を１つのリンカ−の介在に制限することは、一般により 好都合である。 リンカ−成分が使用されるとき、ホスファイト／ホスフェート活性化リンカ−は 、継続するオリゴヌクレオチド合成に直接に取り込まれ得、続いて逆転した配列 の最初のヌクレオチドに連結されるか、あるいはそのような最初のヌクレオチド は、既に誘導されたものとして、ホスファイト／ホスフェート活性化リンカ−に 供給され得る。一般に、リンカ−はジオールまたはジアミンを包含し、その残基 は式１′および２′の中でＡ−として表される。従って、代表的な合成のプロト コールでは、ジオール（またはジアミン）のヒドロキシル（またはアミノ）の１ つは保護され、そして他方はホスファイト／ホスフェートで活性化される。この 保護された形態は、固形支持体に結合しているオリゴヌクレオチドに連結され得 、そして次に脱保護され、そして次のヌクレオチド残基と反応させることができ る。 同様なジオールまたはジアミンタイプ（あるいはノスルフヒドリルまたはヒドロ キシル／スルフヒドリルタイプ）のリンカ−がまた好都合であるのは、逆の極性 セグメント間の結合が隣接塩基間または塩基と糖成分の間で生じるとき、あるい は、これらのリンカ−がホスホジエステルまたはそのアナログを含まずに、直接 に隣接の糖に結合させるために使用され得るときである。これらの例では、スイ ノチバノクヌクレオチドニ量体を別々に合成し、次に再び標準的なオリゴヌクレ オチド合成法を使って、形成すべきオリゴヌクレオチドの中にその二量体を挿入 することが、一般に好都合である。隣接する塩基部分が使用される場合、代替と なるリンカ−機能は好都合であり得るが、一般にリンカ−の好都合な形態は、ジ ヒドロキシ、ジアミノ（またはジスルフヒドリルまたはヒドロキシル／スルフヒ ドリル）の化合物から誘導されるものである。これらは標準的なオリゴヌクレオ チド合成のプロトコールの中に統合するために、適切に保護され活性化されるこ とができるか、あるいは逆転した二量体のヌクレオチドを得るために、使用され 得る。 しかし、これらのリンカ−の組み込みにおける重要なステップは、リンカ−が挿 入された後のオリゴマーへの次の添加は、その前の配列部分とは反対の極性をも つ、活性化および脱保護されたヌクレオチドであることである。 従って、実例となる適切なリッカーは、下記の式またはそれらのアナログのジア ミン（またはアルコールアミン）のジオール残基であるか、またはジオール残基 を含む。表示の簡便のために、ジオール構造が使用されるが、一方または両方の ヒドロキシル機能がアミ７基またはスルフヒドリル基で置き換わり得ることは、 注意しておくべきである。 ＨＯ（ＣＨ２）ｒｕＯＨは、ｎｌ（を通常ｌから１５）整数テアルカ、これはま た形状を伸長して使用し得る。１つまたはそれ以上の−ＣＨ２−基は、置換かへ テロ原子に隣接しない条件で、０、Ｓ、またはＮＨによって置き換わり得る。　 （従って、式１゜または２′に組み込まれるとき、このリンカ−によって式−（ ＣＨ２）ｎ＋−の残基として”Ａｏが与えられる。）特に、ジオールは、式ＨＯ （ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ２Ｈであるポリエチレングリコールを示し得、ここでｎ２ は１から５の整数である。 このリンカ−はまた、不飽和を含有し得、その結果典型的な式となり得る： ＨＯＣＨ２（ＣＸ２ＣＸ２）　ｌ１３ＣＨ２ＯＨｌここでｎ３は１から７の整数 であり、Ｘの各ペアまたは隣のＣは独立にＨまたはπ結合であり；または ＨＯＣＨ２（ＣＸ２ＣＸ２）ＩＩ４ＣＨ２（ＣＸ２ＣＸ２）ｎｓｃＨ２０−Ｈｌ 　ここでｎ４とｎ５は０から７の整数であり、　ｎ４と１５の合計は７より大き くなく、Ｘの各ペアまたは隣のＣは独立にＨであるか、またはともに〉結合であ る。 これらの実施態様においてはまた、１またはそれ以上のメチレン基が、別のへテ ロ原子にｗ４接しない条件で、Ｏ，Ｓ。 またはＮＨにより、置換し得る。 ジヒドロキシ、ジアミ／、または等価なワンカー化合物はまた、環式であり得、 非芳香族か芳香族のどちらかである。 非芳香族の例には、／スーまたはトランス−３−４−ジヒドロキシフラン、シス −またはトランス−２−ヒドロキシメチルリーヒドロキシフラン、およびンスー またはトランス−２−ヒドロキシメチル−４−ヒドロキシフランであって、該フ ランはそれ以上は未置換であるか、またはさらに１つまたは２つの非介在性アル キル（１−４Ｃ）置換基で置換されているもの、のようなジオールが含まれるか 、あるいはピペラジンまたはピペリジンのようなＮ複素環を含み得る。 芳香族環を有するリンカ−には、１．２−ジヒドロキンメチルベンゼン；ｌ、４ −ジヒドロキシメチルベンゼン；１．３−ジヒドロキシメチルベンゼン；２．６ −シヒドロキシメチルナフタリン；ｌ、５−ジヒドロキシメチルナフタリン；１ ．４−ビス（３−ヒドロキシプロペニル）ベンゼン；１．３−ビス（３−ヒドロ キシプロペニル）ベンゼン；１．２−ビス（３−ヒドロキシプロペニル）ベンゼ ン；２，６−ビス（３−ヒドロキシプロペニル）ナフタリン；１．５−ビス（３ −ヒドロキシプロペニル）ナフタリン：１．４−ビス（３−ヒドロキシプロピニ ル）ベンゼン：ｌ、３−ビス（３−ヒドロキシプロピニル）ベンゼン；１．２− ビス（３−ヒドロキシプロピニル）ベンゼン；２．６−ビス（３−ヒドロキシプ ロピニル）ナフタレン；および１．５−ビス（３−ヒドロキシプロピニル）ナフ タレンが含まれ得る。図１は、１．４−ジヒドロキシメチルベンゼンを使用して 、それが２つのリボシルまたは２つのキシロシル残基を架橋するときの結合を示 す。逆の極性のオリゴヌクレオチドの部分として、示されているＤＭＴおよびホ スホネート残基が伸長されたヌクレオチド鎖に代替される。同様の例が、上記リ ンカ−の他のもの、特に１．２−および１．３−誘導型ジヒドロキシメチルベン ゼンを含むことができた。 さらに、このリンカ−は、アンスラキノンのようなさらに別の機能基を保持し得 かなり復雑なものであり得る；このタイプのリンカ−の例としては下記のものが ある：逆転結合部でのヌクレオチド間結合の長さとタイプは、部分的に電荷濃度 （例えば、ポリホスフェートジエステル基は電荷が非常に高度に集中し得る）に 依存し、そして所望の三重らせん結合を達成するために二重らせんの中で主要な 溝を広げさせるために要求される距離にも依存する。二重鎖の２本の鎖を５°− ５゛スイ！チバノクでわたっても余りの塩基は含まず、他方、３−３゛スイツチ バツクでは襟的の二重らせんで１から４個の余りの塩基を含む、と現在考えられ ている。一般に、Ｏから４個の余りの塩基を生じさせるオリゴマーの間隔は、態 様に依存する（「余りの」塩基とは、第三の鎖成分に水素結合をしないＤＮＡ二 重らせんの中の塩基対を指す）。したがって、リンカ−の長さは調整し得る。結 合の適切な長さとタイプは、当業者であればルーチンの最適化手法を使って、決 定し得る。 スイッチバックまたは逆の極性モチーフの特定の応用として、ヌクレオチド分解 に対するオリゴヌクレオチドの安定化がある。好ましくは３°末端での単一のヌ クレオチド結合の逆転でさえ、安定性を強化する。下記の実施例６で説明される ヨウに、３゛末端にホスホジエステルまたは誘導ホスホルアミデート結合による 逆の塩基成分をもつオリゴヌクレオチドは、ウシ胎児血清の存在下で強化された 安定性を発揮する。 良腹亙虚 式１°および２′の態様のために、逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、標 準的な固相合成法を使って達成し得る。 このオリゴヌクレオチド鎖伸長は、一連の縮合過程で予め決定されている配列に 一致するように進み、各々によりあらたなヌクレオチドが付加される。活性化ホ スファイト／ホスフェートを有するヌクレオチドを付加する前に、固形支持体に 結合したヌクレオチドの保護基は除去される。代表的には、例えば、通常使用さ れるジメト牛シトリチル（ＤＭＴ）基の除去は、２．５％Ｖ／Ｖジクロロ酢酸／ ジクロロメタンで処理することによりなされるが、１％Ｖ／Ｖ　トリクロロ酢酸 ／ジクロロメタンまたは臭化亜鉛−抱和二トロメタンもまた有用である。他の保 護基に適切なその他の脱保護手法は、当業者に公知である。 固形支持体に結合した脱保護ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、次に、 活性化ホスファイト／ホスフェートを有する適切に保護されたヌクレオチドと反 応する。各サイクルの後、担体に結合したヌクレオチドは、好ましくは無水ピリ ジン／アセトニトリル（１：１．　ｖ／ｖ）で洗浄されて、再び脱保護される。 モして縮合反応は、所望する数の同一極性を有するヌクレオチド間結合を形成す るために要する数のサイクルで達成され、そして所望によってはホスホルアミデ ート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートまたはホスホジエステルに変 換される。 １つの態様では、スイッチバックを提供するために、活性化され保護された入っ てくるヌクレオチドは、支持体に結合したオリゴマーと反対の極性で提供される 。従って、例えば、支持体結合したオリゴマーが３’　−５’である場合、脱保 護された５゛ヒドロ牛ンルは、３−保護、５−活性モノマーと反応し、そしてこ の反応は、５゛位が活性化され３゛位が保護されたモノマーを用いて続けられる 。 他の態様においては、スイッチバックの中にリンカ−を与えるために、一方の端 が支持結合オリゴヌクレオチドへの縮合（水素ホスホネートのような）のために 活性化され、他方の端が保護されたヒドロキシル基（または保護されたチオ基） である分子が、支持結合オリゴヌクレオチド上に縮合する。 リンカ−基は、保護されたヌクレオシド水素ホスホネートを縮合し脱保護するの に使われると同じ条件を使用して、縮合および脱保護される。次に、オリゴヌク レオチド鎖を続いて伸長させるために、鎖の前の部分を合成するために使用した 時とは逆の様式で活性化され保護された、オリゴヌクレオチド残基を使用する。 この鎖の各部位に含まれる２つのヌクレオチド残基にすでに誘導されたリンカ− を使って、この合成を行う１つのアプローチが、図２に示されている。鎖の５° −３゛ヌクレオチド位は、従来と同様に固形支持に結合されている。リンカ−は 、３゛位で２つのヌクレオチド残基に誘導され：残りの５゛位は、１つのヌクレ オチド残基および他のヌクレオチドのホスホネート残基の中の保護基ＤＭＴによ って、誘導体化される。誘導体化されたリンカ−は、標準的試薬条件下で個体に 支持された鎖に結合され、次に従来法により脱保護される。さらなる標準的ヌク レオチド結合によって、３゛−５°方向で鎖の伸長がなされる。 図２で使用される３−３゛結合／ントンの形成を説明する反応は、１．４−ジヒ ドロ牛ジメチルベンゼン（ジブロモメチルベンゼン）により隣接する糖残基の３ ゛部位の結合の実例であるが、反応図１に示されている。 一般に、示される最初のステップは、４５℃２４時間で行われ、式ｌに示される 二重に保護された／ントンが約８０−９５％回収され、これは次にフラ、ンユク ロマトグラフィーによって特に精製される。第二のステップは一方が保護された 豐の化合物を得るために、部分的に脱保護することを含み、図２に示されるよう に、室温で、１５分間のみ行われる。産生物の混合物および粗混合物は、反応の 第３ステツプで使用し得、この反応は、合成の中で使用できるホスホナート誘導 体を産生ずる。 図２に示されるように、固形支持体として誘導された５°−３゜ヌクレオチド鎖 は、最初はンンドンと反応し、脱保護され次に、５′活性３°保護ヌクレオチド と反応する。 反応図１ ユ オリゴヌクレオチドの逆転部分の結合が、隣接するヌクレオチドの塩基を結合さ せるか、あるいは１つのヌクレオチドの塩基を他のヌクレオチドのリボノル部分 に結合させるようなヌクレオチド間の結合によって起こる場合、または、活性化 ホスファイト／ホスフェートを含まない隣接するリボフル残基の結合を通じて結 合させる、ヌクレオチド間の結合によって起こる場合は、二量体のヌクレオチド を形成するのが好ましく、次にこの二量体は、適切に活性化され保護された型で 合成に含められる。例えば、隣接するメチル／トンンまたはチミジンは、メチル 基によりピリミジン環の５位に結合される。このことは、通常実施されているよ うに、第５位を、例えばヒドロキシメチル、アリルアミン、アクリル酸、または プロペニル残基に転換することにより様々な技法を使用して行われる。これらの 反応基は次に、二官能基のリンカ−により、または適切な代替となる縮合によっ て、さらに結合されて、メチルフチジンまたはチミジン、または混合ヌクレオチ ドの二量体型を獲得する。逆の極性のオリゴヌクレオチドの中に二量体を含める ために、必要ならば二量体は、例えば両方の５゛位が保護され、一方の３゛位が 活性化され、合成の継続のために他方が保護される。鎖の伸長は、逆転した保護 ／活性化パターンのヌクレオチドを使用して、含められた二量体から続けられる 。 １つの実施例においては、隣接する５位置士が−（ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ″Ｈ２ＮＨ） ２ＣＯで結合している二量体のために、５−５゜結合を得るためのこの二量体の 包含は、図３に図式的に示さＰｒ８はＤＭＴ保護基；Ｐｒｃはトリメチルアセチ ルｆｌｔＪＩ＆：　ＰＱうに定義されたものである。 二量体はまた、隣接する糖の間で形成し得、そして得られた二量体は標準的合成 で上記のように使用される。例えば、２つのリボンル、キンロンル、または隣接 するヌクレオチドのリボンル／牛ンロシル部分の３°位は、ｐ−ジヒドロキシメ チルベンゼンあるいは、１．３−プロピレングリコール、または下記式のような ｄｄＲのような他のリンカ−によって、結合し得る。 そして二量体５゛位は、続く合成において使用し得る。　（これら後者の２つの リンカ−のために、オリゴマーへの標準的組み込み合成がまた、使用され得る。 ）この場合、一方の５°位は、ＤＭＴにより保護され、他方はホスファイト／ホ スフェート活性化される。逆に、５°位で結合している隣接する糖のために、一 方の３°位が保護され、他方は活性化される。上述したように、結合部位でのオ リゴヌクレオチドの幾何学的形状は、この結合に用いられる３゛炭素のキラリテ ィの影響を受ける。 上述したように、得られたオリゴマーのヌクレオチド間の結合の全ては、同一で ある必要はない。適切な合成技法を使うことにより、あるものはホスホジエステ ルであり得、あるものはホスホネート、あるものはホスホルアミデート、その他 、であり得る。 上で説明されたように、本発明の逆の極性のオリゴヌクレオチドは、誘導され得 る。そのような誘導を形成する１つの都合の良い方法は、ホスホルアミデート結 合を使うことである。ホスホルアミデートを形成するために使用されるアミンは 、有用な特性をオリゴヌクレオチドに賦与することができる置換基を、使用し得 る。例えば、ポリエチレングリコール、ポリペプチドまたは親油性基に結合する アミンが使用される場合、そのような基は、細胞膜越しのオリゴヌクレオチドの 輸送を促進し得、その結果オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加する。 アミン上の置換基はまた、オリゴヌクレオチドが結合する標的ＤＮＡに影響する 基を包含し得る。その基は例えば、標的鎖へ共有結合を提供し、標的鎖へのスイ ッチバックオリゴヌクレオチドの切断および挿入を促進するようなものである。 アミン上の置換基は、オリゴヌクレオチドを同定するための標識としてフルオレ セインのような発色基あるいはその他の標識を包含し得る。その池の標識には、 放射活性標識、キレート剤、金属キレートイオンが含まれる。従って、置換基は また、切断機能（すなわち、二重らせん切断のための部位）、あるいはレセブタ ーリガノドのようなレセプター機能、を提供し得る。従って、ホスナルアミデー ト結合を形成するアミン上の置換基はまた、オリゴヌクレオチドが標的二重らせ んに結合するのを妨げない、あらゆる成分で有り得る。 ２つ、またはそれ以上のホスホルアミデート結合が同じ置換基を保持する必要が ないので、２つ以上の誘導成分もまた使用し得る。これは、最初のヌクレオチド 水素ホスホネート結合をつくって、その後それを第１のアミンで酸化し、第２の 水素ホスホネート結合をつくって、それを第２の（別の）アミンで酸化する、こ とによって達成し得る。 ホスホルアミデート結合の形成により、オリゴヌクレオチドに有用な特性を賦与 するように誘導する基を結合させるための好都合な方法が提供されるが、他の方 法もまた使用し得る。有用な置換基は、糖部分または塩基に付加され得るか、あ るいは当該分野で公知の他のあらゆる方法でも、行い得る。 合成が完結した後、オリゴヌクレオチドは、濃アンモニア水でインキュベーンコ ンするような、従来方法を使って、担体から分離される。あらゆるｇＡ護基（例 えば、プリンまたはプリミジン塩基上の）は、例えば、濃アンモニア試薬を用い る従来と同様の手段で、除去され得る。オリゴヌクレオチドは次に、ＨＰＬＣ， ＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のような従来の手段を使って、 または他の従来技法のいずれかを使って、精製される。 上記の方法は、固体担体を使用することに関連して記載されているが、固体支持 体を使用せずに合成を行うこともまた可能であることが理解される。この場合、 ３′保護基が無傷のままである一方、５保護基が選択的に除去され得るように、 支持体の代わりに、縮合中に使用される５°保護基とは異なり、３−ヒドロキシ 保護基が使用され得る。 血良立皿 逆極性を有するオリゴヌクレオチドを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、標的 オリゴヌクレオチド二重鎖とともに三重鎖形成を行うように設計されている。三 重鎖形成のためのインビトロ条件は多様であるが、疾病の治療または下記の分析 に最大限有効となるようにするためには、一般に、三重鎖形成が、生理学条件の もとで行われることが好ましい。三重鎖形成の様式は、もちろん、オリゴヌクレ オチドの設計に依存する。 ＣＴ−型モチーフに関与するように設計されたオリゴマーが、ＣＴ結合のために 意図された領域中に、ピリミジンをベースにしたヌクレオチドのほとんどを含む ことが理解される。ＧＴ−型結合に関与することが意図されたオリゴヌクレオチ ドの領域は、主に、プリン型ヌクレオチドを含む。同一の結合モチーフを維持し 、標的二重鎖の鎖の間をクロスオーバーするようにされた本発明のオリゴヌクレ オチドについては、極性の逆転が提供される。従って、このヌクレオチドは、３ −３°（または５−５“）逆回き配列の一方のサイドに、二重鎖の１方の鎖に選 択されたモチーフに応じて結合する塩基を含み、そして、その３−３°（５−５ ’）結合部のもう一方のサイドに、二重鎖の反対側の鏡上に引き続いて存在する 塩基に同一のモチーフに応じて結合するものとして選択された塩基を含む。 このように、三重らせん認識は、二重鎖の１本の鎖から他の鎖へと認識をスイッ チすることによって延長され得、必要に応じて、再びもとに戻すことができる。 また、本発明によるオリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼによってｆＪ２ 識されない末端を示し得るため、ある特定のヌクレアーゼは、ブｏ　ツクされ得 る。従って、２つの５゛末端を有するオリゴヌクレオチドは、３”エンドヌクレ アーゼ耐性である。 本発明のスイッチバックオリゴヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡへの結合力を増強 させることを意図しているため、Ａリボヌクレオチドの各部分におけるヌクレオ チドの配列は、標。 的二重鎖における塩基配列によって決定される。ＣＴモチーフについては、１本 の鎖のホモプリン領域中に複数のアデニル残基を含む標的二重鎖配列には、もう １つの鎖の中にグアニンを念むホモプリンの領域が後に続き、該標的二重鎖配列 は、ｐｏｌｙＧ経路の極性とは逆の極性のｐｏｌｙｃが後続するｐｏｌｙＡＪ路 とは逆の極性のｐｏｌｙＴであるスイ、チバノクオリゴヌクレオチＦ′を指令す る。標的二重鎖の第１鎖におけるＡ／Ｇ配列を変化させることにより、二重鎖の 第２鎖の連続した配列に並列な逆極性の配列が後続する、プリンに富んだ標的に 同方向のオリコマ−の第１領域におけるＴ／Ｃ配列の交換が指令される。 もちろん、ＧＴモｆ−−７か、配列５’−ＧＧＧＧＣＣＣＣ−３’およびその相 補体のようなグアニン残基に富んだ二重鎖中の鏡開をクロスオーバーするように 設計された逆極性オリゴマー中に維持され得ることが理解される。このオリゴマ ーは、３’　−ＧＧＧＧ−ＧＧＧＧ−３’であり得る。 二重鎖の２つの鎖の間をクロスオーバーするオリゴヌクレオチドを提供するため のもう１つのアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドは、単一極性で提供され る。しかしこれは異なる結合モチーフであって隣接する領域とともに提供され得 る。従って、例えば、標的オリゴヌクレオチドが、１つの鎖のホモプリン領域に おいて複数のアデニル残基を有する領域（これには、反対側の鎖においてグアニ ンを含むホモプリンの領域が後続する）を有する場合、−」−述のように、もう １つのアプローチは、同一極性のｐｏｌｙＧが後続する、ｐｏｌｙＡ経路と同方 向の極性のｐｏｌｙＴ領域を含むオリゴヌクレオチドを提供することである。一 般に、このアプローチは、このタイプの標的オリゴヌクレオチドに対して適切で あり、この“ｒブＬコーチでは、単一極性のオリゴマーは、グアニンに富んだ領 域に隣接するチミンに富んだ領域を含む。 逆極性のオリゴヌクレオチドはまた、二重鎖を形成するために、二重鎖の１つの 鎖のみを標的づけることが望ましいときに、有用である。このような条件の下で 、極性の逆転は、結合モチーフの改変によって成し逐げられる。このようなオリ ゴマーは、二重鎖が、一本鎖に沿ってプリンで豊富な領域を含む際に、有用であ る。このモデルに適合するように上記の実施例を改変するために、ｐｏｌｙＧ頌 域が後続するｐｏｌｙＡ領域を、５’　−３’　１に上に念む標的二ｆＩ鎖は、 ３−５配向を有するｐＯｌｙＧが後続する５−３配向を有するｐｏｌｙＴを含む オリゴマーによって宵効に標的つけられ得、それによって、逆極性点において、 ＣＴからＧＴモチーフへと切りかわる。 簡潔にするために２　本発明のオリゴマーは、３つの「カテゴリー」すなわち、 同一モチーフを維持する逆極性；モチーフによる切りかえに関連した逆極性：お よびモチーフの単一極性および切りかえの１つとだけ適合する；ということが記 載されているが、これらのカテゴ１７−は、串−のオリゴマー（その二重鎖を形 成する結合様式が、標的された二重鎖により変化する）において共存することが 明かである。従って、逆転がモチーフの切りかえによって成し遂げられる、逆極 性セグメントに続いて、モチーフが維持されるイツ加的な逆転が行なわれ得る。 モチーフの切りかえによって成し遂げられる第１の逆転において、二重鎖の一本 鎖が標的づけられ、モチーフが維持される第２の逆転において、オリゴマーはク ロスオーバーし、二重鎖の第２の鎖を認識する。 欅的二重鎖の鏡開をクロスオーバーするように意図されているオリゴマーの配列 設計においては、効果的に位置ずれして結合に関与する二重鎖内に存在する余り の塩基を考慮しなければならない。現在、その幾何学的形状は完全には知られて いないが、いずれの余りの塩基も考慮されなければならないことは明確である。 二重らせんの幾何学的形状には、ＣＴ−ＣＴモ千−フとのすす：ヌクレオチドに わける３−３♀吉合においでは、約０−４個、二重鎖においては、おそらく１− ２個、実質的に余りの塩基が存在するように、スペースが要求される。５゛−５ スイ、チバノクの場合に要求される余りの塩基はないよってある。これと叉対の ことが、ＧＴ−ＧＴモチーフに結合した３゛−３゛の組合ゼにおいても当てはま る。余りの塩基による間隔は、任意にヌクレオチドを挿入することによって提供 され得、あるいは、リンカ一部分の長さが、これを補うように調整され得る。 二重鎖に結合する向上した能力（これは鏡開のクロスオーバーによる二重鎖の形 成および一本鎖内の標的領域の基づいた二重鎖会合による）に加えて、逆極性ヌ クレオチドがまた、二重鎖でＤ−ループを形成し得る。この状況において、第１ 極性の領域は、例えば、二重鎖を形成し、その一方、逆転した部分は、二重鎖の １つの鎖の部分を置換し、その結果、それに関連する領域において置換二重鎖が 形成される。オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の設計においては、標的鎖に 塩基対がハイブリダイズするように設計される配列を使用することにより、上記 が考慮される。 １里里圭Ｊび投与一 本発明のオリゴヌクレオチドは、重要な二重鎖結合活性によって二重鎖または安 定な他の会合体を形成し得るため、これらのオリゴヌクレオチドは、「アンチセ ンス」療法において有用である。本願で使用される「アンチセンス」療法とは、 特定の結合性オリゴヌクレオチドを使用して、インビトロまたはインビボにおけ る望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡ配列を不活性にすることを含む総称的な用語 である。二重鎖ＤＮＡに対するそれらの優れた結合能力のために、本発明のオリ ゴヌクレオチドは、特に、この点において有用である。 大抵の疾病およびその他の症状は、望ましくないＤＮＡまたはＲＮ　Ａの存在に よって特徴づけられ、それらのいくつかは二重鎖形態であり得る。これらの疾病 および症状は、従来より一般的に理解されているように、アンチセンス療法の原 理を使用して処置され得る。アンチセンス療法は、相補性または任意の他の特定 の結合手段により、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を標的することを含む。本発 明の場合には、ＤＮＡ二重らせんの主要な溝における配列特異的配向を使用する 。−特異的な配列の認識が重要であるアンチセンスへの応用に加えて、それに代 わる本発明のオリゴマーの治療メカニズムも有効に使用され得る。このようなオ リゴマーは、一般に、ウィルスポリメラーゼのようなポリメラーゼの阻止剤とし て有用であり、転写開始因子または阻止因子のような核酸への結合因子に干渉し たり、体内でのインターフェロンの生産を誘引したりする。本発明のオリゴマー は、単独で投与され得、あるいはオリゴマーは組合せて、隣接または離れた標的 のために、または上記の一般的メカニズムとアンチセンスメカニズムとを組み合 わせた効果を得るために投与され得る。 治療の応用において、オリゴマーは、一般に、アンチセンス療法に適切な様式で 使用され、あるいはその代わりとなる上記の治療メカニズムが使用される。この ような療法には、オリゴマーは、全身、局所または局部投与を含む様々な形態の 投与用に処方され得る。技術および処方は、一般に、圏ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｅｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏ、。 Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ、最新版において記載されている。オリゴマー活性成分は 、一般に、投与および投薬形態の特性に応じて、希釈液または賦形剤等の担体と 組み合わせられ、この賦形剤には、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、 崩壊剤、表面活性剤または潤滑剤が含まれる。典型的に投薬形態には、錠剤：粉 末；懸濁液、乳濁液および溶液を含む液体調製物；顆粒剤；カプセルおよび生薬 を含む。さらに、注射液用の液体調製物を含み、これには、リポソーム調製物が 含まれる。 全身投与においては注射が好ましく、これには筋肉内注射、静脈注射、腹腔内注 射、および皮下注射が含まれる。注射においては、本発明のオリゴマーは、液体 溶液中、好ましくは、バンク溶液またはリンガ−液のような生理学的に適合性の ある緩衝液中に調製される。さらに、オリゴマーは、固体状で：ｌｌ製され得、 使用前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた含まれる。 全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によっても成し遂げられ得、または化合 物は経口によって投与され得る。経粘膜または経皮投与においては、浸透される べきバリアに適切な浸透剤が、調製に使用される。このような浸透剤は、一般に 、当該技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与用の胆汁酸塩および フッジン酸誘導体を含む。さらに、洗浄剤が、浸透を容易にするために使用され 得る。経粘膜投与は、例えば、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって成し遂げら れる。経口投与においては、オリゴマーは、カプセル、錠剤およびトニ、り剤の ような従来からの経口投与形態に処方される。 局所投与については、本発明のオリゴマーは、従来より一般に知られているよう に、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームにｇ！！される。 治療に使用されるのに加えて、本発明のオリゴマーは、それらが特異的に結合す る標的Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡ配列の有無を検出するための診断試薬として使用 され得る。このような診断テストは、従来の手段によって検出される三重らせん 形成によるハイブイダイゼーションによって行われる。例えば、オリゴマーは、 放射性、蛍光性または色素生産性標識を使用して標識され得、固体支持体に結合 した標識の存在が検出される。あるいは、三重らせんの存在は、これらの形態を 特異的に認識する抗体によって検出され得る。プローブとしてこのようなオリゴ マーを使用するアＩセイを行うための手段は、一般に知られている。 上記の使用に加えて、オリゴマーの、遺伝子発現を阻止する能力は、インビトロ のシステムにおいて組換えシステムにおける発現のレベルを測定することによっ て証明され得る。 以下の実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明を限定するものではな い。 叉ｍ ３°−ＤＭＴ−！ｌ’−ベンゾイルーｄＣ−５°−Ｈ−ホスホネートの６．４　 ｇ　（１０！１Ｉｌｏｌｅ）のＳ−ＤＭＴ　Ｎ’−ベンゾイル　デオキシ−〇を ｔｏｏ　ｍｌのピリジンを用いて乾燥し、１００■ｌのピリジンに溶解し、これ に、４　ｇ　（１１，８５ｍ１ｏｌｅ）のＤＭＴ−ＣＩを加え、反応混合物を室 温で３日間攪拌する。この反応混合物を蒸発させて、容量を約半分にし、１００ ■ｌのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５ｚの炭酸水素ナトリウム（２ｘ　１００　ｍｌ ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥状態となるまで蒸発させる。この 粗製混合物を１００諷ｌのトルエンに溶解させ、蒸発させて泡沫状とする。これ をもう１回繰り返す。この固体を５０膳１のＣＨ２Ｃｌ２および５０　ｍｌのジ エチルエーテルの混合液中に取り、これを室温で９００璽ｌのヘキサンに加えて 、沈澱させる。この固体を単離し、ＩＳ■ｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、０℃に 冷却し、飽和ＺｎＢｒ２溶液（インプロパ／−ル／ＣＨ２Ｃｌ２　（１５／１１ ５）中）　Ｌ（１（１■１を加え、１５分間攪拌する。反応混合物を４００　ｍ ｌのｌ　Ｍ　ＮＨ４０Ａｃに入れてクエンチし、有機層を分離し、ＮａＨＣＯ３ （１ｘ　２００　ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させる。シ リカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２ＣＩ２１５％　ＭｅＯＨ）で精製して、５ ０％の５−０■生成物を産する。 ５°−０ｉｌヌクレオシドを５０　ｍｌのピリジンを用いて乾燥し、１０−１の ピリジンおよび１０■ｌの塩化メチレン混合物中に取り、それに５　ｍｌのピリ ジン中ＩＭのＰＡ／ＣＨ２Ｃｌ２を２当量加える。この混合物を室温で１５分間 攪拌し、ｌ　Ｍ　ＴＥＡＢに入れてクエンチし、層分離を行ない、有機層をＴＥ ＡＢで洗浄しく１回）、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させて乾燥する。試薬 ＰＡは、フォンブーム（ｙｏｎ　Ｂｏｏ＋＊’ｓ）試薬、２−クロロ−４Ｈ−１ ，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンである。ヌクレオシドＨ−ホス ホネートをＭｅＯＨグラジェントで、シリカゲルクロマトグラフィー（１％のト リエチルアミン／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製する。 Ｋ立叢主 ３−ＤＭＴ−チミジン−５“　−Ｈ−ホスホネート１．２　ｇ　（５５ｔｏｌｅ ）のチミジンを５０履１のピリジンを用いて乾燥し、２０　ｍｌのピリジン中に 取り、これに、５１のピリジン中８２０　ｍｇ　（５，５ｍｍｏｌｅ）のｔ−塩 化ブチルジメチルシリルクロリ　−ドをアルゴンガス雰囲気中で加える。この混 合物を室温で１日攪拌し、約１０　ｍｌに凝縮し、７５　＋ａｌのＣＨ２Ｃｌ２ で希釈し、５％のＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２で水相を逆抽出し、Ｎａ ２ＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させる。粗製のヌクレオシドを２０　ｍｌのピリジ ンを用いて乾燥し、３０１のピリジン中に取り、これに、１．７ｇ（５ｗ＋ｅｏ ｌｅ）のＤＭＴ−ＣＩと０．４　ｍｌのトリエチルアミンを加え、その後、この 混合物を３日間攪拌する。約１０１にまで蒸発させた後、混合物を７５１のＣＨ ２Ｃｌ２で希釈し、ＮａＨＣＯ３（２ｘ　１００　ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２５Ｏ ａ上で乾燥し、蒸発させる。５−ＯＨヌクレオ／ドを６０　ｍｌのＴＨＦに取り 、２０ＩｌｌｌのＩ　Ｍ　ＴＢＡＦ／ＴＨＦを加える。１時間攪拌した後、混合 物を蒸発させて層状とし、ＣＨ２Ｃｌ２中に取に取り、ノリ力ゲル力ラムにかけ る。収率は５０％である。次いで、５−ＯＨヌクレオシドを実施例１のように、 Ｈ−ホスホネートに変換する。 支皿匠ｌ スイッチバックを含むオリゴマーの合成３°末端が固体ポリマー支持体に縮合し たポリヌクレオチドトホスホネートを、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｅ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ　（１９８１１）　１６：４１１３１−４８３９；　Ｎｕｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８６）　１４：５３９９−５４６７；およびＮｕｅＩｅｏ ｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　＜１９８７）　ｉ：２８７−２ ９１に記載されているように、５°が保護されたヌクレオシドＢ−ホスホネート のＤＢＵ塩を使用して調製する。４回のカップリング後、１回のカップリングサ イクルを、以下のエチレングリコール誘導体を使次いで、ポリヌクレオチドＨ− ホスホネートを１２水溶液［Ｎ−メチルモルホリン／水／ＴＨＦ（５１５／９０ ）中０．ＩＭＦで酸化し、ヌクレオチド間のジエステル結合を形成する。次いで 、５回のカップリングサイクルを、３゛が保護されたヌクレオシド５°−Ｈ−ホ スホネートを使用して行い、実施例１および２のように調製する。 これらのカップリングの後、ポリヌクレオシド上の残りのトホスホネート結合を Ｐｙｒ／ＣＣ１４（１１５１５）中の２−メトキシエチルアミンで酸化し、その ことにより、５つのジエステル結合（そのうちの１つは、エチレングリコールリ ッカーである）および５つのホスホルアミデート結合（そのうちの１つは、エチ レングリ；−ルリンカーである）を有するｌＯ量体が生じる。 オリゴマーを固体支持体から除去し、濃ＮＨａＯＨで脱保護し、５０　ｍＭのＴ ＥＡＰ水溶液中のアセトニトリルグラノエントを使用する［（ＰＬＣ（ＰＩ！Ｐ ）　ｉ、：よッテｆＩ４製する。ＤＭＴを８０％（Ｄ　ＨＯＡｃ　（Ｒ，Ｔ、　 ）　ヲ使用して除去し、その溶媒を蒸発させる。この生産物を脱塩化し、蒸発に よって単離する。 このようにして、以下のものが調製される。ここで、ＰＩは、〇 （ｐＨによってイオン化状態を有する）を示す：コｌ　５＋　５１　３１ Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐｌ−ＣＭ２Ｃ）！２−Ｐ１−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃコｌ　 ５１　５１　３１ Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｐ１ＣＨ２ＣＨ２−Ｐｌ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃコｌ　５’ 　５曾　コ會 Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐ１−ＣＭ２ＣＨ２−Ｐｌ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ５°５° を介して固体支持体に固定されるように誘導体化されたヌクレオノドを使用し、 実施例１および２の３°が保護され、５°が活性化されたヌクレオノドで鎖を延 長し、次いで、上記のようにＤＭＴ−０−ＣＨ２ＣＨ２−ＰＩにカップリングし 、次−）で５°が保護され、３°が活性化された従来のヌクレオシドで鎖延長す ることによって、以下のものが調製される。 Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐｌ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｐｌ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ付加リン カ−を挿入することによって、以下のものが調製される： コＣ Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐ　ｌ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｐ　１−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐ 　１−ＣＨ２ＣＨ２−Ｐ　１−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ３Ｉ Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｐ　ニーＣＭ２ＣＨ２−Ｐ　ニーＣ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｐ 　１−ＣＭ２Ｃ）（２−Ｐ　１−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−０３審 Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐ　ｌ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｐ　１−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｐ 　ｌ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｐ　１−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔコ３ Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｐ　１−Ｃ’Ｈ２Ｃ）！２−Ｐ　１−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −Ｐ　１−ＣＩ（２ＣＭ２−Ｐ　ニーＣ−Ｔ−τ−Ｃ−Ｔ。 叉ＪＪＬ先 把−スイノチバ、りのＡ　およびアッセイ実施例３の方法を用いて、プロピレン グリコールと連結したスイＩチバックの２４量体を次式のように調製した。 このオリゴマーが結合する二重鎖ＤＮＡは、このスイッチバックに適合するため に、２６−ｂｐの標的領域（２つの余りの塩基を有する）を有する。この標的領 域は次式のとおりである。 この標的領域と結合するスイッチバックオリゴマーの能力を評価するために、以 下のようにアッセイを行った。４つの３６−ｂｐのカセットを含有する１４４− ｂｐの断片（４つのカセットのうち１つは所望の標的領域に対応する）を、市販 されているクローニングベクターであるｐＴＺ１１１υにクローン化した。この プラスミドを切断し、そして両端を３２　ＰｄＣＴＰで標識した。次いで、それ を第二の制限酵素で分解して一端の標識を消去し、標的ＤＮＡのサイズを縮小し た。得られた３７２ｂｐの断片を５％のアクリルアミドゲルを用いて精製した。 このスイ・／チバｌクオソゴマー（１ｍｍｏｌ）を、５ｘ　１０’ｃｐｍで標識 シタ標的とトモニ、１００＋＋Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭＩＥＣＩ２．５０ｍ Ｍ　ＭＥＳ。 ｐＨ６中で、室温にて１時間インキュベートした。 次いで、この反応混合物を０．５曹ｇ／■Ｉ　ＤＮＡ５ｅ−１で１分間室温にて 処理し、そして抽出して、この分解を終了させ、タンパク質を除去した。エタノ ール沈澱によってこのＤＮＡを回収し、そしてこの試料を８０％のホルムアミド 中の８％のポリアクリルアミドゲル上に負荷し、変性条件下で６０ワツトで２時 間泳動させた。このゲルを乾燥させ、−晩フィルム上に置いた。その結果は、こ のオリゴマーがＤＮＡａｓｅ−１の活性に対する保護を提供することを示し、そ のことにより、関連する標的配列においてではなく、標的領域において三重鎖構 造が形成されることが示された。保護は１４量体の対照物において測定されたよ うに、約２Ｇｂｐの領域にわたって拡張される。 １亘五工 に　１した　・二　に　る：　≦　オリゴマー特定の疾病の状態に関連したＤＮ Ａ配列を有するデータベースのサーチによって、図４に示される数種の例示的な 標的が提供される。図４Ａは、１ｇ単純ヘルペス遺伝子の二重鎖部分の領域を示 す。いくつかの発明のオリゴマーは、この領域を標的するために利用され得る。 （以下余白） まず、次式のオリゴヌクレオチド、すなわち、は、逆の極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ 　ｐｏｌａｒｉｔｙ）の領域を含有しているが、ＣＴモチーフを全体にわたって 維持している。このオリゴマーは、上側の鎖との間にクロスオーバーを起こさせ る。ここで、チミン残基は、反対側の鎖におけるポリＧ領域を標的するポリＣ域 （ｔｒａｃｔ）に対して逆の極性によって、二重鎖の７デニルリノチ部分を標的 する。　（式（１）においてｒＮＪと定義されている部分は、これらの部分が認 識に関与しないような、いずれのヌクレオチドでもあり得る。） 別なアプローチでは、式（２）のオリゴヌクレオチドが設計され、そこではこの クロスオーバーに影響を及ばすため、ＣＴからＧＴへのモチーフの切り換えが用 いられている。 ５°−ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＮＴ　−ＧＧＧＧ−３’　（２）図４Ｂは、６ ７ｋｄのリン酸化されたタンパク質をコードするヒトサイトメガロウィルスゲノ ムの領域を示す。この領域は類似の選択をもたらす。 図４Ｃは、ヒトＩＬ−１βをコードする遺伝子の一部を示す。 このリンホカインの望ましくない量によって特徴付けられる症状に対しては、オ リゴマー（３）または（４）を用いる三重の形成が利用され得る。 ５’−ＧＧＧＧＧＧＧ　−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’　（３）オリゴマー （３）はオリゴマー（２）の逆であり：それはモチーフの切り換えを利用して、 標的された鎖のクロスオーバーに影響を及ぼす。一方、オリゴマー（４）は、オ リゴマー（１）に対する概念において多少類似しており、極性の逆転を利用して 、クロスオーバーに影響を及ぼす。 図４Ｄは、１つの鎖の少なくとも１つの領域における結合を維持するためにある 機会が提供されるような領域（バリセラ　シスター（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ　１２ ｏｓｔｅｒ）のゲノム）の例を提供する。 したがって、示されるように上側の鎖のＧＧＧＡＡＡ部分による二重鎖の形成を 維持するには、このオリゴマー（５）マたｉ！（５）カ利用され得る。 ５−ｃｃｃ　−丁丁丁−３′　（５） リンカー 図に示される別々の鎖に存在するＡ領域と６領域との間のクロスオーバーに影響 を及ぼすには、オリゴマー（１）および（２）に類似のオリゴマーが必要とされ ており、したがって全体としてこの領域に結合するためには、合計で４つの可能 性がある。すなわち、（１）または（２）と組み合わせた（５ン、もしくは（１ ）または（２）と組み合わせた（６）がある。 図４Ｅは一本鎖襟的の池の例を提供する。適切なオリゴマーは次式、　５−ＴＴ ＴＴＴ　−ＧＴＧＴＧＧ−５°　を冑する。 及立五立 口きＮ−キャップ型オリゴヌクレオチドの合３′末端のＡ−Ｔ結合において、ア デニル残基の３゛位がチミジル残基の３位に結合するように改変された配列５’ 　−ＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴを有する１１置体のオリゴヌクレオチドが、標準的 なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成された。但しチミジル残基はオリゴヌ クレオチド合成の最後の工程で５゛位が保護され、かつ３゛位置が活性化されて いる。ホスホジエステルと、リン酸アミド結合のメトキンエチルアミン（ＭＥＡ 　’）誘導体との両方が得られた。これらのオリゴマーを、５末端をガンマ３２ Ｐ　ＡＴＰおよヒＴ４キナーゼで襟議した。１ｍされたオリゴヌクレオチドを次 いで、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて３３ｊ１体：５°−ＴＣＧＣＴＧＡＴＧＧ ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣの鋳型の存在下、１０置体（ ５’−ＴＣＣＡＧＴＧＡＴＴ）に連結した。内部標識された２１置体５°−ＴＣ Ｃ，ｔＧＴＧＡＴＴ３２ｐＴＴ７丁丁ＣＴＣＣＡＴをＣＢ　ＳＰＥカラムで脱塩 した。 ２０ｇＭの非標識オリゴヌクレオチドを添加もしくは無添加で、内部標識された オリゴヌクレオチドを、Ｈ９３８ヒトＴリンパ履細胞培養物の血清含有培地に加 え、１０ｎＭの濃度とした。分解度をポリアクリルアミドゲル分析により、種々 の時間において測定した。この条件下において、３°末端において逆方向の結合 を持たないコントロールの２１置体では約３時間の半減期であるが、逆方向のジ エステルとアミドとが結合した、実験された２１重体では７日を越える半減期を 有していた。 １立五二　′ エーテル　ムしたジヌクレオシドパーホスホネート上記反応図工で示した、式３ の化合物の１−牛シリル結合したアナログを本実施例に記載のように合成した。 この化合物は、５゛位がＤＭＴで保護されたチミジル残基を含んでおり、このチ ミジル残基の３゛位には１．３−牛シリル残基が連結し、そしてその１．３−キ ンリル残基を介して付加的なアデニル残基の３゛位が連結している。第２のチミ ジルは、５゛位でホスホネート残基によって活性化されている。 ＮａＨ（鉱油中６０％分散液）　４００＋＋ｇ（３６ｓｓｏｌ）を無水ＴＦＩＰ （２ｘ　１０ｍＬ）で洗浄し、２０＋ｅＬの無水ＴＨＦ中で＠濁し、そしてこれ に５４５閣ｇ（１，０ｍ麿ｏ１）の５゛をＤＭＴで＠護したヌクレオシドをＡｒ 雰囲気で攪拌下、加えた。水素の発生が止まってから、１５０ｍｇ（１，０＋＋ ■ｏｌ）のＭａｌおよび１３２ｓｇ（０，５ｍ＋ｔｏｌ）のα、α°−ノブロモ ー■−キシレンを加え、そして反応ａ合物を４０℃で２４時間攪拌した。反応混 合物を室温に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、減圧濃縮してゴム状とな ったものをＣＨ２Ｃ１ｚ（５０ｍＬ）ｉｍ取り、ＮａＨＣＯ３（２Ｘ　５０ｍＬ ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、そして減圧１ｅ［した。生成物（反応ス キームｌ中、２）をノリ力ゲルのフラソシコクロマトグラフィーによってＭｅＯ Ｈ／ＣＨ２Ｃｌ２の濃度勾配（Ｏ−５％）を用いて精製し、対称２量体を９５％ の収率で得た。次にこれを、ＭｅＯＨ／ＣＨｚＣ１２（１／１）ｌｈ＋Ｌｌ：溶 解し、これに攪拌下、ＤＣＡノ１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１／１）溶液１ ５ｍＬを加えた。１０分後、飽和Ｎａ１（ＣＯ３を加えて反応をクエンチし、層 分離を行い、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（２Ｘ　２５＋＋Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ ＳＯ４上で乾燥し、そして減圧濃縮した。粗生成物を無水ピリジン（２Ｘ　２０ ｍＬ）で共減圧濃縮し、１ｈＬのピリジン／　ＣＨ２Ｃ１ｚ（１／ｌ）ｉｍ取り 、そして室温テＰＡ（ＩＭ）ノビリジン／ＣＨ２Ｃｌ２（１／１）溶液５社を加 え、１５分間攪拌し、そしてＴＥＡＢ水溶液（ＬＭ、　ｐＨ１１ｇ、　５）７５ ｓＬ中に注いだ。Ｈ−ホスホネートをフラノシ二クロマトグラフィーで精製し、 反応スキーム１における化合物３のキノリルが１．３−結合したアナログ１００ ＋＊ｇ（２５％）を得た。 １１匹ｌ ５°→３°の９個のオリゴヌクレオチド残基が３°→５゛の９個のオリゴヌクレ オチド残基に結合した、”９Ｘ９”のオリゴヌクレオチドの／リーズを設計して 、標的である二重鎖の配列とともにに三重らせんを形成させた。 ９×９のオリゴヌクレオチドは、二重鎖中に１個、２個あるいは３＠の余りの塩 基があると仮定して設計された。したがって１個の余りの塩基対を仮定したオリ ゴマーは、ヌクレオチド配列 ５−ＣＴＴＴＴＴＣＴＴ−Ｘ−ＴＴＴＣＴＴＣＴＴ−５°　（７）を有する。２ 個の余りの塩基対を仮定したオリゴマーは、ヌクレオチド配列 ５°−ＣＴＴＴＴＴＣＴＴ−Ｘ−ＴＴＣＴＴＣＴＴＴ−５°　（８）を有する。 ３個の余りの塩基対を仮定したオリゴマーは、ヌクレオチド配列 ５°−ＴＣＴＴＴＴＴＣＴ−Ｘ−ＴＴＣＴＴＣＴＴＴ−５°　（９）を有する。 上記配列においてＸは、オルト、メタあるいはバラキンレンの残基、プロピレン グリフールの残基、１．２−デオキシリボースおよびｄＴのいずれかである、リ ッカーを表す。リンカ−がオルト、メタあるいはパラキ／レンである場合には、 式中の残基のいずれかの側に示されるチミジル残基は、１ｉｆｆｉ分としてリボ ースおよびキシレンのいずれか一方を含む。 したがって式（））、（８）および（９）の化合物は、Ｘがチミジル残基に隣接 する３°位に連結したＰＧ、　ｄＤＲあるいはｄＴであるか、あるいはＸがオル ト、メタあるいはバラキンレンを表し、かつチミジル塩基がリボースおよび牛／ ロースのいずれかを含むように合成される。この場合”リンカ−”は、隣接する 糖残基が、リボースあるいはキシロースであるかによって（この式中にはチミジ ル残基が示されている）、ｏ−キシロース、璽−キシロース、ｐ−キシロース； ０−リボース、璽−リボース、ｐ−リボースを表す。 熱変性（Ｔｍ）の測定は、Ｇ１１ｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ＩＩ温度制御分 光計を用いて行った。加熱速度は、１５℃−７５℃の間で約０，２５℃／ｓｉｎ であった。すべての二重鎖の最終濃度は約２μＭであった。　′バッファーを１ ４０ｍＭＫｃｌ／　５＋＊Ｍリン酸ナトリウム１５−Ｍ塩化マグネシウムから調 製し、ｐＨ６，２とした。Ｔ■の測定の前に、バ。 ファーをアルゴンで脱気し、ｐＨを正確な値に合わせた。Ｔｍ値は吸光度対温度 の一次導関数のプロットから決定した。 結果を表３に示す。 （以下余白） Ｈ＝６．２における９×９スイツチバツク　３’　−３’　のＴ論すンカ−組匝 　匣　ニ ０−キシロース　４２．１　４７．６　ｎｄ■−キシロース　３９，２　３１． ７　ｎｄＯ−リボース　ｎｄ　３４．８　２６．６１−リボース　ｎｄ　３２． ２　２６．　ｉｐ−リボース　ｎｄ　３１．４　２２４ＰＧ　ｎｄ　３３．５　 ２６．３ ｄｄＲｎｄ　３２．０　２６．３ ｄＴ　ｎｄ　３０．５　３３．３ ｎｄ−検出されない これらの結果は、結合の性質が標的の余りの塩基対の数に合うように設計され得 ることを示している。 オリゴマーの標的二重鎖に対する結合はまた、実施例４に記載のものに類似した 方法で次のように評価した。宿主ベクターに挿入された約５０．０ＯＯｃｐ■の ｐ３２でラベルした、約０．１ｎｓ。 １の標的ＤＮＡを、５０μｌの反応バッファー（ｐＨ６，０の２０ｄ　ＭＥＳ。 １０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｌｏｏＩＩＭ　ＮａＣ１）中、０．１−１００μＭの範 囲における種々の濃度の試験すべきオリゴヌクレオチドとともに約１時間インキ ュベートし、二重鎖を形成させた。二重鎖を０．２単位のＤＮＡ５ｅ　Ｉで１分 間室温で処理し、Ｏ，５ＭのＥＤＴＡ　２μｌで反応を止めた。キャリアーであ るｔＲＮＡのサンプル２μｇを加え、反応混合物をエタノールで沈澱させた。ペ レットを３μｌの８０％ホルムアミドで再懸濁し、５分間９０℃で加温し、そし て６％変性ポリアクリルアミドゲルにかけ、フットプリントを得た。ゲル中で標 的の生成物が切断されないことから、９重９量体により保護されているのがわか る。 Ｌ血芝ユ キシロースリン力−の　口 上記実施例８で述べられたものと同類の方法において、標的として用いるための ２８量体の配列 をベクターに挿入した。この二重鎖を標的とするため、二重鎖中に２個の余りの 塩基が存在すると仮定して以下のオリゴヌクレオチドを設計した。 ５°−ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴ−ｏ−キンｏ−ス−ＴＣＴ−５°　（ｌ Ｏ）５’　ＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴ−’ｏ−キシロース“−ＴＴＣＴＴＴ−５ ’　（１１）Ｓ−ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴ−ＰＣ−ＴＴＣ−５°　（１ ２）５°−ＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴ−ＰＧ−ＴＴＣＴＴＴ−５’　（１３）式 １０は、０−キノロースに基づく結合を有する１５Ｘ３のスイノチバＩクオリゴ マーであり；式１１は、０−キンロース由来のリンカ−を含む１２×６のスイノ チバｌりであり；式１２は、プロピレングリコールリンカ−を有する１５×３の スイッチバノクでアリ；式１３は、プロピレングリコールリンカ−を宵する１２ Ｘ　５のスイッチバイトである。上記実施例８に記載のＴ腸の測定法を用いて、 オリゴマーの二重鎖の形成を試験した。 配列５−丁ＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴ−３°のコントロールのオリゴヌクレ オチドは、３４．１”ＣのＴ−を与えた。式１２および１３の化合物は、それと 同等か、あるいはそれよりも低いＴｍを与え：式１２のＴｍは３４．２℃であり 、式１３のＴＩは２６．５℃である。しかしながら、０−キシロース型結合を含 むオリゴマーは、１重の劇的な上昇が見られる。式１０において４４７℃であり 、式１１において４１．６℃である。 ストラテジーを形成する３つの三重らせんを図解したものを図５に示す。 Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＢ Ｆｉｇｕｒｅ　＋ｊ Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆ工σσＲＥ４Ａ Ｆ工ＧＵＲＥ　４Ｂ Ｆ工ＧＵＲＥ　４Ｃ Ｆ工ＧＵＲＥ　４Ｄ Ｆ工ＧＵＲＥ　４Ｅ Ｆｉｇｕｒｅ　５Ａ ３°　３゜ Ｆｉｇｕｒｅ　５Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　５Ｃ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月２３日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも３個のヌクレオチド残基を含み、３′→５′または５′→３′の 極性を有する第１のヌクレオチド配列、およびそれに結合した、 少なくとも１個のヌクレオチド残基を含み、該第１の配列と逆の極性を有する第 ２のヌクレオチド配列、を含むオリゴヌクレオチド。
2. ２．標的の二重鎖ＤＮＡと三重鎖を形成し得る、請求項１に記載のオリゴヌクレ オチド。
3. ３．請求項１−２に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列の５′ 末端におけるヌクレオチドの５′位が、前記第２の配列の５′末端におけるヌク レオチドの５′位に結合し、または、 前記第１の配列の３′末端におけるヌクレオチドの３′位が、前記第２の配列の ３′末端におけるヌクレオチドの３′位に結合し、または、 前記第１の配列の５′末端におけるヌクレオチドの塩基が、前記第２の配列の５ ′末端におけるヌクレオチドの塩基に結合し、または、 前記第１の配列の３′末端におけるヌクレオチドの塩基が、前記第２の配列の３ ′末端におけるヌクレオチドの塩基に結合し、または、 前記第１の配列の５′末端におけるヌクレオチドの塩基が、前記第２の配列の５ ′末端におけるヌクレオチドの５′位に結合し、または、 前記第１の配列の５′末端におけるヌクレオチドの５′位が、前記第２の配列の ５′末端におけるヌクレオチドの塩基に結合し、または、 前記第１の配列における３′末端のヌクレオチドの塩基が、前記第２の配列の３ ′末端におけるヌクレオチドの３′位に結合し、または、 前記第１の配列の３′末端におけるヌクレオチドの３′位が、前記第２の配列の ３′末端におけるヌクレオチドの塩基に結合している、 オリゴヌクレオチド。
4. ４．前記第１および第２の配列が、リンカー塩基を含む結合により結合した、請 求項１−３に記載のオリゴヌクレオチド。
5. ５．請求項６に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記リンカー残基が次式： −（ＣＨ２）ｎ１− ここでｎ１は１−１５の整数であり、そして、該ＣＨ２基の１もしくはそれ以上 がＯ、Ｓ、またはＮＨに置換され得、但し、該置換体はヘテロ原子に隣接してい ない；または、次式： −（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２− ここでｎ２は１−５の整数である； または次式： ＣＨ２（ＣＸ２ＣＸ２）ｎ３ＣＨ２ ここでｎ３は１−７の整数であり、Ｃに隣接するＸの各ペアは、それぞれ独立し てＨ、あるいは共同してπ結合を形成する； または次式： ＣＨ２（ＣＸ２ＣＸ２）ｎ４ＣＨ２（ＣＸ２ＣＸ２）ｎ５ＣＨ２ここで、ｎ４お よびｎ５は０−７の整数であり、そしてｎ４およびｎ５の合計は７を越えず、Ｃ に隣接するＸの各ペアは、それぞれ独立してＨ、あるいは共同してπ結合を形成 する； で示される、オリゴヌクレオチド。
6. ６．前記リンカー残基が少なくとも１個の環状領域を有する、請求項４に記載の オリゴヌクレオチド。
7. ７．前記環状領域が非芳香性である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
8. ８．前記非芳香性環状領域が、ピペリジン、ピペラジン、フラン、テトラヒドロ フラン、シクロヘキセン、シクロペンテン、シクロペンタンまたはシクロヘキサ ンの残基を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
9. ９．前記環状領域が芳香性である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
10. １０．前記芳香性環状領域が、ｏ、ｍ、またはｐの二置換ベンゼンあるいは二置 換ナフタレン残基である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
11. １１．前記第１および第２の配列が、次式の結合を介して結合している、請求項 １−３に記載のオリゴヌクレオチド：▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＹはＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、Ｏ−、またはＳ−であり；ＸはＯ、 Ｓ、またはＮＲであり、各Ｒは、独立してＨ、アルキル（１−１２Ｃ）、アリー ル（６−１２Ｃ）、アラルキル（７−２０Ｃ）、またはアルカリール（７−２０ Ｃ）であり； ｎは０または１であり；そして Ａはリンカー基の残基である。
12. １２．すべてのＸがＯであり、および／またはすべてのＹがＯである、請求項１ １に記載のオリゴヌクレオチド。
13. １３．前記第１および第２の配列がピリミジン残基に富んでいる、請求項１−１ ２に記載のオリゴヌクレオチド。
14. １４．前記第１のヌクレオチド配列がピリミジン残基に富み、そして、前記第２ のヌクレオチド配列がプリン残基に富む、請求項１−１３に記載のオリゴヌクレ オチド。
15. １５．前記プリン残基がグアニン残基である、請求項１４に記載のオリゴヌクレ オチド。
16. １６．標的のＤＮＡ二重鎖に結合して三重鎖を得るために有用なオリゴヌクレオ チドであって、プリン残基に富んだ少なくとも３個のヌクレオチド残基でなる第 １のヌクレオチド、およびビリミジン残基に富んだ少なくとも３個のヌクレオチ ド残基でなり、隣接する第２のヌクレオチド、を有するオリゴヌクレオチド。
17. １７．前記プリン残基がグアニン残基である、請求項１６に記載のオリゴヌクレ オチド。
18. １８．前記第１および第２のヌクレオチド配列が少なくとも５個のヌクレオチド 残基を含む、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
19. １９．オリゴヌクレオチドを、標的の二重らせんポリヌクレオチド二重鎖の少な くとも１本の鎖の部分に結合させる方法であって、 標的の二重らせんポリヌクレオチド二重鎖を、三重鎖を形成し得る条件下で、オ リゴヌクレオチドと接触させる工程を包含し、 該オリゴヌクレオチドが、該二重鎖の鎖の第１の部分に結合し得る第１のヌクレ オチド配列を含み、該第１の配列が第２の配列に結合しており、該第２の配列が 該二重鎖の１本の鎖上の、隣接する第２の部分に結合し得、そして該第１の配列 とは逆の極性を有する、 方法。
20. ２０．前記二重鎖の前記第１および第２の部分が、前記二重鎮の同一の鎖上にあ り、そして、該オリゴヌクレオチド中の第１および第２の配列のうちの一方がピ リミジンに富み、そして、他方がプリンに富んでいる、請求項１９に記載の方法 。
21. ２１．前記二重鎖の第１および第２の部分が該二重鎖の別々の鎖に存在し、そし て前記第１および第２の配列の両者がピリミジンまたはプリンに富んでいる、請 求項２０に記載の方法。
22. ２２．オリゴヌクレオチドを標的の二重らせんポリヌクレオチド二重鎖の両方の 鎖の部分に結合させる方法であって、標的の二重らせんポリヌクレオチド二重鎖 を、三重鎖を形成し得る条件下でオリゴヌクレオチドと接触させる工程を包含し 、 該オリゴヌクレオチドが、該二重鎖の第１の鎖の第１の部分に結合し得る第１の ヌクレオチド配列を有し、該第１の配列が該二重鎖の第２の鎖上の隣接する第２ の部分に結合し得る第２のヌクレオチド配列に結合しており、該第１の配列がピ リミジンに富み、該第２の配列がプリンに富んでいる、方法。
23. ２３．アンチセンス療法に適切な薬剤組成物であって、効果的な量の請求項１− １８のオリゴヌクレオチドを活性成分として含有する、組成物。
24. ２４．望ましくない二重鎖ポリヌクレオチドの存在により媒介される疾病あるい は症状を処置する方法であって、そのような処置を必要とする被験体に効果的な 量の請求項１−１８のオリゴヌクレオチドまたはその薬剤組成物を投与すること を包含する、方法。