JP6313419B2 - 癌幹細胞の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/785,269号、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/790,072号、および2014年2月7日に出願された米国仮特許出願第61/937,438号の優先権の利益を請求し、それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、がんに関して予め処置された個体におけるがんの転移または再発を処置および予防する方法における、非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用に関する。本発明はまた、非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なオリゴヌクレオチド、および個体における難治性がん(例えば、難治性HPV関連がん)の処置におけるそれらの使用にも関する。
本明細書で引用された全ての参考文献は、特許出願、特許公報、および科学文献を含め、それぞれ個々の参考文献が参照により組み入れられると具体的かつ個々に提示されたかのように参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
個体におけるがんの転移を抑制する方法であって、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を前記個体に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドは、前記キメラミトコンドリアRNA分子とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができ、前記個体は、がんに関して治療で予め処置されている、方法。
(項目2)
前記オリゴヌクレオチドが、
a.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNA、または
b.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、センス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、センス16SミトコンドリアリボゾームRNA
を含むヒト非コードキメラミトコンドリアRNA分子に十分に相補的である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたASncmtRNA分子に相補的である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたASncmtRNA分子に少なくとも85%相補的である、項目1または2に記載の方法。
(項目5)
前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、配列番号7〜198からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1種の抗がん剤と組み合わせて投与される、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記少なくとも1種の抗がん剤が、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチナム、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキセート、ゲフィチニブ、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、CPT−11、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソーマルダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パシリタキセル、ビンブラスチン、IL−2、GM−CSF、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、スリンダク、およびエトポシドからなる群から選択される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、逐次的に投与される、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、同時に投与される、項目6に記載の方法。
(項目10)
前記オリゴヌクレオチドが、放射線療法と組み合わせて投与される、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記オリゴヌクレオチドが、外科手術と組み合わせて投与される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記オリゴヌクレオチドが、同種幹細胞移植療法と組み合わせて投与される、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記オリゴヌクレオチドが、自己幹細胞移植療法と組み合わせて投与される、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記個体が、がんに関して、化学療法、放射線療法、外科手術、またはそれらの組合せを含む治療で予め処置されている、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記個体における前記がんが、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン−アルファ、レナリドマイド、メルファラン、ペグ化インターフェロン−アルファ、プレドニゾン、サリドマイド、およびビンクリスチンの1種または複数での処置後に再発している、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記がんが、固形がんである、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記固形がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、肝臓および胆管がん、肺がん、黒色腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん、前立腺がん、腎臓がん、睾丸がん、または甲状腺がんである、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記がんが、非固形がんである、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記非固形がんが、多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記オリゴヌクレオチドが、前記個体におけるがん幹細胞数を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して減少させる、項目1から19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記オリゴヌクレオチドが、前記個体における腫瘍増殖および/または転移を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して阻害する、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
個体におけるがんの再発を処置または予防するための方法であって、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を前記個体に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドは、前記キメラミトコンドリアRNA分子とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができ、前記個体は、がんに関して治療で予め処置されている、方法。
(項目23)
前記オリゴヌクレオチドが、
a.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNA、または
b.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、センス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、センス16SミトコンドリアリボゾームRNA
を含むヒト非コードキメラミトコンドリアRNA分子に十分に相補的である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたASncmtRNA分子に相補的である、項目22または23に記載の方法。
(項目25)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたASncmtRNA分子に少なくとも85%相補的である、項目22または23に記載の方法。
(項目26)
前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、配列番号7〜198からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目22から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1種の抗がん剤と組み合わせて投与される、項目22から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記少なくとも1種の抗がん剤が、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチナム、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキセート、ゲフィチニブ、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、CPT−11、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソーマルダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パシリタキセル、ビンブラスチン、IL−2、GM−CSF、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、スリンダク、およびエトポシドからなる群から選択される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、逐次的に投与される、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、同時に投与される、項目27に記載の方法。
(項目31)
前記オリゴヌクレオチドが、放射線療法と組み合わせて投与される、項目22から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記オリゴヌクレオチドが、外科手術と組み合わせて投与される、項目22から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記オリゴヌクレオチドが、同種幹細胞移植療法と組み合わせて投与される、項目22から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記オリゴヌクレオチドが、自己幹細胞移植療法と組み合わせて投与される、項目22から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記個体が、がんに関して、化学療法、放射線療法、外科手術、またはそれらの組合せを含む治療で予め処置されている、項目22から34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記個体における前記がんが、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン−アルファ、レナリドマイド、メルファラン、ペグ化インターフェロン−アルファ、プレドニゾン、サリドマイド、およびビンクリスチンの1種または複数での処置後に再発している、項目22から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記がんが、固形がんである、項目22から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記固形がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、肝臓および胆管がん、肺がん、黒色腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん、前立腺がん、腎臓がん、睾丸がん、または甲状腺がんである、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記がんが、非固形がんである、項目22から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記非固形がんが、多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記オリゴヌクレオチドが、前記個体におけるがん幹細胞数を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して減少させる、項目22から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記オリゴヌクレオチドが、前記個体における腫瘍増殖および/または転移を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して阻害する、項目22から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
個体における転移がんを処置するための方法であって、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を前記個体に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドは、前記キメラミトコンドリアRNA分子とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができ、前記個体は、がんに関して治療で予め処置されている、方法。
(項目44)
前記オリゴヌクレオチドが、
a.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNA、または
b.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、センス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、センス16SミトコンドリアリボゾームRNAを含むヒト非コードキメラミトコンドリアRNA分子に十分に相補的である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたASncmtRNA分子に相補的である、項目43または44に記載の方法。
(項目46)
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたASncmtRNA分子に少なくとも85%相補的である、項目43または44に記載の方法。
(項目47)
前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、配列番号7〜198からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目43から46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1種の抗がん剤と組み合わせて投与される、項目43から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記少なくとも1種の抗がん剤が、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチナム、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキセート、ゲフィチニブ、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、CPT−11、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソーマルダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パシリタキセル、ビンブラスチン、IL−2、GM−CSF、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、スリンダク、およびエトポシドからなる群から選択される、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、逐次的に投与される、項目48に記載の方法。
(項目51)
前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、同時に投与される、項目48に記載の方法。
(項目52)
前記オリゴヌクレオチドが、放射線療法と組み合わせて投与される、項目43から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記オリゴヌクレオチドが、外科手術と組み合わせて投与される、項目43から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記オリゴヌクレオチドが、同種幹細胞移植療法と組み合わせて投与される、項目43から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記オリゴヌクレオチドが、自己幹細胞移植療法と組み合わせて投与される、項目43から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記個体が、がんに関して、化学療法、放射線療法、外科手術、またはそれらの組合せを含む治療で予め処置されている、項目43から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記個体における前記転移がんが、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン−アルファ、レナリドマイド、メルファラン、ペグ化インターフェロン−アルファ、プレドニゾン、サリドマイド、およびビンクリスチンの1種または複数での処置後に再発している、項目43から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記がんが、固形がんである、項目43から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記固形がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、肝臓および胆管がん、肺がん、黒色腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん、前立腺がん、腎臓がん、睾丸がん、または甲状腺がんである、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記がんが、非固形がんである、項目43から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記非固形がんが、多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記オリゴヌクレオチドが、前記個体におけるがん幹細胞数を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して減少させる、項目43から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記オリゴヌクレオチドが、前記個体における腫瘍増殖および/または転移を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して阻害する、項目43から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドと、項目1から63のいずれか一項に記載の方法を実施するための説明書とを含むキット。
本発明の実施は、特に他の指定がない限り、当業者周知の、従来の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の技術を採用すると予想される。このような技術は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrookら、1989年)およびMolecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版(SambrookおよびRussel、2001年)、(本明細書では合わせて、「Sambrook」と称する);Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編、1987年、2001年までの付録を含む);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994年);HarlowおよびLane(1988年)Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications、New York;HarlowおよびLane(1999年)Using Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(本明細書では合わせて、「HarlowおよびLane」と称する)、Beaucageら編、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry、John Wiley & Sons, Inc.、New York、2000年)、Handbook of Experimental Immunology、第4版(D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編、Blackwell Science Inc.、1987年);およびGene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. MillerおよびM. P. Calos編、1987年)などの文献で詳細に説明されている。他の有用な参考文献としては、HarrisonのPrinciples of Internal Medicine(McGraw Hill;J. Isseleacherら編)、DuboisのLupus Erythematosus(第5版;D.J. WallaceおよびB.H. Hahn編)が挙げられる。
本発明を詳細に説明する前に、この発明は特定の組成物または生物系に限定されず、それらは当然ながら様々であってもよいことが理解されているものとする。また、本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定を意図していないことも理解されているものとする。
100×分数X/Y
のように計算され、式中Xは、そのプログラムのAおよびBのアライメント中の配列に対して完全一致とスコア付けされた核酸残基の数であり、Yは、B中の核酸残基の総数である。核酸配列Aの長さが核酸配列Bの長さに等しくない場合、AのBに対する%核酸配列同一性は、BのAに対する%核酸配列同一性と等しくなくなることが理解されよう。
ヒト細胞は、多数の独特なキメラミトコンドリアRNA分子を発現する。これらの分子は、非コードであり(すなわち、これらは、タンパク質の翻訳のための鋳型として働くことが知られていない)、逆位反復配列に5’末端で共有結合で連結された16SミトコンドリアリボゾームRNAを含む。キメラミトコンドリアRNA分子は、2つの形態、すなわちセンスおよびアンチセンスで見出される。
RNAおよびDNAの天然に存在するヌクレオシド間連結は、3’と5のホスホジエステル連結である。本明細書で開示された方法のいずれかに従ってがんの転移を抑制する、がんの再発を処置または予防する、または転移がんを処置するのに使用されるオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、1種または複数の改変された、すなわち天然に存在しないヌクレオシド間連結を有していてもよい。治療学的観点では、例えば細胞内取込の強化、標的核酸への親和性の強化、および体液中に存在するヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの所望の特性のために、天然に存在するヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドよりも、改変されたヌクレオシド間連結がしばしば選択される。
本発明の他の実施形態において、リボザイムは、本明細書で説明されるncmtRNA分子に干渉して、転移に関連する増殖性細胞(例えば、CSC)において細胞死を誘導させるのに使用できる。リボザイムの配列は、ASncmtRNAの配列(例えば、配列番号4、配列番号5、もしくは配列番号6に対応する配列、または配列番号203、配列番号204、もしくは配列番号205を含む配列)に従って、またはSncmtRNAの配列(例えば、配列番号1、配列番号2、もしくは配列番号3に対応する配列、または配列番号200、配列番号202、もしくは配列番号203を含む配列)に従って、特異的な転写領域が切断されるように設計できる。リボザイムは、特異的なRNA切断を触媒することができる酵素的なRNA分子である(Rossi, Curr. Biology 4巻:469〜471頁、1994年)。リボザイム作用のメカニズムは、相補的な標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼによる切断を含む。リボザイム分子の組成は、RNAに相補的な1つまたは複数の配列を含むはずであり、さらに、RNA切断に関与する周知の触媒性の配列を含むはずであり、これは、その開示が参照によりその全体として本明細書に組み入れられる米国特許第5,093,246号で説明されている。そのようなものとして、本発明の範囲内で、ハンマーヘッド型リボザイム分子を、本明細書で開示されたASncmtRNAまたはSncmtRNA分子のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効率的に触媒するように加工することができる。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当技術分野で周知であり、説明されている(Haseloffら、Gene、82巻:43〜52頁、1989年)。また本発明のリボザイムは、RNAエンドリボヌクレアーゼを含む場合もある(Zaugら、Science、224巻:574〜578頁、1984年)。一部の実施形態において、本明細書で説明されるリボザイムは、本明細書で説明されるあらゆる方法で使用できる。一部の実施形態において、個体におけるがんの転移を抑制する方法は、本明細書で説明される1種または複数のリボザイムの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体におけるがんの再発を処置または予防するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のリボザイムの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体における転移がんを処置するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のリボザイムの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体における難治性がん(例えば、難治性HPV関連がん)を処置するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のリボザイムの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体は、がんに関して治療(例えば、化学療法、放射線療法、外科手術またはそれらの組合せ)で予め処置されている。
別の態様において、本明細書で開示された方法(例えば、がんの転移を抑制する方法)のいずれかで使用するための、本明細書で開示されたASncmtRNAおよび/またはSncmtRNA分子の機能への干渉は、RNA干渉またはRNAサイレンシングによって達成できる。RNA干渉(RNAi)は、哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのための新規で有望なアプローチとして出現したものである(Elbashirら、Nature 411巻:494〜498頁、2001年;McManusら、Nature Rev. Genet. 3巻:737〜747頁、2002年)。約8から40(例えば約10から36、14から32、18〜28、もしくは22〜24)の塩基対(bp)の、または少なくとも約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40bpの長さの合成された二本鎖RNA分子は、それらの相補的標的RNAに特異的にハイブリダイズして、RNAの分解を引き起こす。短鎖干渉RNAまたはsiRNAにより、数種の異なる遺伝子がうまくサイレンシングされてきた(Luら、Curr. Opin. Mol. Ther. 5巻:225〜234頁、2003年;Wacheckら、Oligonucleotides 13巻:393〜400頁、2003年)。それゆえに、本明細書で開示されたASncmtRNAおよび/またはSncmtRNA分子に標的化された合成二本鎖RNAは、これらの転写物を分解して、がん細胞の死(例えば、CSCの死)を誘導するのに使用することができる。当業者は、siRNAの配列は、ASncmtRNAおよび/またはSncmtRNA分子のあらゆる領域に相補的でなければならない(例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、および/または配列番号6に対応する配列のいずれか一つに相補的であるか、または配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、および/または配列番号205を含む配列のいずれか一つに相補的である)ことを理解しているものと予想される。一部の実施形態において、本明細書で説明されるRNAは、本明細書で説明されるあらゆる方法で使用できる。一部の実施形態において、個体におけるがんの転移を抑制する方法は、本明細書で説明される1種または複数のRNAの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体におけるがんの再発を処置または予防するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のRNAの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体における転移がんを処置するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のRNAの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体における難治性がん(例えば、難治性HPV関連がん)を処置するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のRNAの有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体は、がんに関して治療(例えば、化学療法、放射線療法、外科手術またはそれらの組合せ)で予め処置されている。
一実施形態において、センスおよび/またはアンチセンスキメラ非コードミトコンドリアRNA分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチド(例えば本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドのいずれか)を個体に送達するのに、組換えベクターを使用してもよい。これは、全身への送達と体の特定の領域(例えば骨髄)に限局される送達の両方を含み得る。センスもしくはアンチセンスキメラncmtRNA分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの組換え産生を可能にすることができるあらゆるベクター、および/またはセンスもしくはアンチセンスキメラncmtRNA分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドを宿主細胞に送達することができるあらゆるベクターが、本明細書で考慮される。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれか、原核性または真核性のいずれかであってもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは、DNAワクチンの一部であってもよいし、または当業者公知の宿主細胞中で発現させるために異種遺伝子を送達する他のあらゆる方法の一部として使用されてもよい。組換えベクターは、好適な宿主細胞に形質転換されると複製が可能になる。ウイルスベクターは、多様な非分裂ヒト細胞に感染し、副作用を起こすことなく広くワクチンで使用されてきた。ウイルスベクター(例えば、これらに限定されないが、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(例えばAAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6など、またはそれらを含むハイブリッドAAVベクターなど)は、センスまたはアンチセンスキメラncmtRNA分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドを、がん細胞(例えば形質細胞;例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる米国公開特許公報2004/0224389号を参照、またはCSC)に送達するための本発明の方法で使用するためのベクターの例である。一部の実施形態において、本明細書で説明される組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)は、本明細書で説明されるあらゆる方法で使用できる。一部の実施形態において、個体におけるがんの転移を抑制する方法は、本明細書で説明される1種または複数のオリゴヌクレオチドを含む組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体におけるがんの再発を処置または予防するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のオリゴヌクレオチドを含む組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体における転移がんを処置するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のオリゴヌクレオチドを含む組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体における難治性がん(例えば、難治性HPV関連がん)を処置するための方法は、本明細書で説明される1種または複数のオリゴヌクレオチドを含む組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)の有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体は、がんに関して治療(例えば、化学療法、放射線療法、外科手術またはそれらの組合せ)で予め処置されている。
いくつかの態様において、本明細書で説明される処置方法のいずれかは、個体に1種または複数の追加の抗がん治療剤を投与することを含んでいてもよい。一部の実施形態において、1種または複数の抗がん治療は、化学療法、放射線療法、および外科手術からなる群から選択される。化学療法と抗がん剤とは、本明細書では同義的に使用される。様々なクラスの抗がん剤を使用できる。非限定的な例としては、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗体(例えば、モノクローナルまたはポリクローナル)、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、メシル酸イマチニブ(Gleevec(登録商標)またはGlivec(登録商標)))、ホルモン処置、可溶性受容体および他の抗腫瘍薬が挙げられる。
他の態様において、本明細書で説明される処置方法のいずれかは、自己または同種幹細胞移植療法のどちらを含んでいてもよい。近年、自己造血幹細胞移植を用いた高用量化学療法は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および白血病などのある特定のがんにとって好ましい処置になりつつある。治癒しないとしても、この手順は実際に全生存を延長させて完全な寛解をもたらす。幹細胞移植の前に、患者は最初のクールの導入化学療法を受ける。今日使用されている最も一般的な導入レジメンは、サリドマイド−デキサメタゾン、ボルテゾミブベースのレジメン、およびレナリドマイド−デキサメタゾンである(KyleおよびRajkumar、Blood、111巻(6号):2962〜72頁、2008年)。例えば、自己末梢血幹細胞移植は、50%もの多発性骨髄腫患者に有用である。低い死亡率にもかかわらず、このような移植療法が有する問題としては、腫瘍を根絶できないこと、および移植に使用される幹細胞集団から骨髄腫細胞およびそれらの前駆体を取り出すことが難しいことが挙げられる。
本明細書で開示された抗がん剤(例えばオリゴヌクレオチドベースの薬剤)はいずれも、組成物(例えば、医薬組成物)の形態で投与することができる。これらの化合物は、様々な経路を介した全身投与または局所投与によって投与することができる。特定の適用において有用な投与経路は、当業者にとって明らかである。投与経路としては、これらに限定されないが、経口、直腸、脳脊髄、経皮、皮下、局所、経粘膜、鼻咽頭、肺、静脈内、筋肉内、および鼻腔内が挙げられる。一部の実施形態において、投与は、局所投与である。一部の実施形態において、局所投与は、臓器への投与、空洞への投与、組織への投与、および皮下投与からなる群から選択される。一部の実施形態において、投与は、全身投与である。一部の実施形態において、全身投与は、静脈内または腹膜内投与である。これらの化合物は、注射用組成物と経口用組成物の両方として効果的である。このような組成物は、薬学分野で周知の方式で調製され、少なくとも1種の活性化合物を含む。また本明細書に記載の組成物は、処置される特定の適応にとって必要な1種より多くの活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有する活性化合物を含有していてもよい。経口用組成物として採用される場合、本明細書で開示されたオリゴヌクレオチドおよび他の抗がん剤は、薬学的に許容される保護剤によって胃での酸消化から保護される。
A.がんの転移を抑制または予防するための方法
一態様において、個体におけるがんの転移の抑制または予防で使用するための、1種または複数のオリゴヌクレオチド(またはそれらの組成物)が本明細書で示される。別の態様において、個体におけるがんの転移を抑制または予防するための少なくとも1つの治療と組み合わせて使用するための、1種または複数のオリゴヌクレオチド(またはそれらの組成物)が本明細書で示される。ここで上記態様のいずれかにおいて、個体は、がんに関して治療で予め処置されていてもよい。
他の態様において、個体におけるがんの再発を処置または予防することにおいて使用するための1種または複数のオリゴヌクレオチド(またはそれらの組成物)が本明細書で示される。一部の実施形態において、個体は、最初の処置に応答しており、寛解状態にある。
さらに他の態様において、個体における転移がん(例えば再発した転移がん)の処置で使用するための1種または複数のオリゴヌクレオチド(またはそれらの組成物)が本明細書で示される。
別の態様において、本明細書で説明される1種または複数のオリゴヌクレオチドを含む製造品またはキットが提供される。本製造品またはキットは、本発明の方法における1種または複数のオリゴヌクレオチドの使用説明書をさらに含んでいてもよい。したがって、ある特定の実施形態において、本製造品またはキットは、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を個体に投与することを含む、がんの転移を抑制する、がんの再発を予防もしくは処置する、および/または個体における転移がんを処置するための方法における、1種または複数のオリゴヌクレオチドの使用説明書を含む。ある特定の実施形態において、個体は、がんに関して治療(例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、またはそれらの組合せ)で予め処置されている。一部の実施形態において、本製造品またはキットは、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を個体に投与することを含む、個体における難治性がん(例えば、難治性HPV関連がん)を処置するための方法における、1種または複数のオリゴヌクレオチドの使用説明書を含む。
本出願は、一部の実施形態において、個体における難治性がんを処置する方法であって、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を個体に投与することを含み、オリゴヌクレオチドは、キメラミトコンドリアRNA分子とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができる、方法を提供する。
アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのHCT−116結腸がん細胞およびヒト結腸がん細胞の初代培養の処置がスフィアの形成を停止させた
この研究では、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後に、HCT−116結腸がん細胞株および患者から得られたヒト結腸がん細胞の初代培養の両方からの細胞のスフェロイド体を形成する能力を決定した。利用されたアッセイにより、本明細書ではスフィアとも称されるスフェロイド体の数を、これらのスフェロイド体を形成するがん幹細胞の特異的な能力に基づき測定した。
実験スキーム:
図1は、結腸がん細胞中で形成されたスフィアの数に対するASncmtRNAに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を、これらのスフェロイド体を形成するがん幹細胞の特異的な能力に基づき測定するための、本明細書で利用された実験手順およびアッセイの一般的なスキームを示す。HCT−116結腸がん細胞および患者から得られたヒト結腸がん細胞の初代培養において、スフィアの形成を測定した。
外科手術後、各患者の対応するインフォームドコンセントと共に結腸がんの生検を行った。約500mm3の腫瘍の断片を、DMEM培地、高グルコースのGlataMax(商標)(GIBCO)、10%FCS(Biological Industries)、Fungizone(登録商標)1×、2×抗生−抗真菌剤混合物およびゲンタマイシン25μg/ml(Invitrogen)を含有する50ml滅菌チューブに移した。外科手術から2から3時間以内に生検を処理した。
標準的なプロトコールに従ってHCT−116細胞を培養した。ATCCから入手したHCT−116細胞を、10%FCSと共にペニシリン、ゲンタマイシンおよびファンギゾン(fungizone)を含有するDMEM培地で、37℃および5%CO2で増殖させた。
結腸がんの腫瘍から得られた細胞またはHCT−116培養物を収集し、洗浄して血清を除去し、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、20ng/mlヒトEGF、20ng/mlヒトβFGF、2%のビタミンA非含有B27サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン(Lonza)およびN2サプリメントを補充した無血清DMEM/F12(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)に懸濁した。その後細胞を、非接着性プレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)中、細胞約5,000個/ウェルの密度で、またはT25フラスコ(Corning Inc.T25 3815)中、細胞1×105個で培養した。10日間培養した後、直径100から200μmのスフィアを得た。スフィアを含有する培地を70μmナイロンフィルターを使用してろ過し、単一の細胞を除去した。スフィアを収集し、トリプシン−EDTAで解離させ、ピペットにより機械的に破壊した。次いで細胞を遠心分離して酵素を除去し、105CFSを含有するDMEM培地で1回洗浄し、コラーゲンI(Gibco)でコーティングされた接着性プレートで平板培養し、前述したようにして37℃および5%CO2で培養した。
この研究で使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、IDT(Integrated DNA Technologies、USA)、InvitrogenまたはBiosearch Inc.により、100%ホスホロチオエート(PS)のヌクレオシド間連結を用いて合成された。トランスフェクションのために、12−ウェルプレート(Nunc)に細胞50,000個/ウェルで細胞を植え付けた。次の日、結腸がんの腫瘍またはHCT−116培養物から選択された細胞(スフィアの形成による腫瘍細胞の選択およびコーティングされたプレートへの接着を参照)に、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO1107S:5’−GTCCTAAACTACCAAACC−3’(配列番号197)もしくはASO1537S:5’−CACCCACCCAAGAACAGG−3’(配列番号36)、細胞型に応じて)または対照オリゴヌクレオチド(対照オリゴ154:5’−AGGTGGAGTGGATTGGGG−3’(配列番号199))を、100から200nM(細胞型に応じて)の最終濃度で、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を製造元の指示に従って使用してトランスフェクトした。加えて、細胞の部分集合を未処置のまま、またはリポフェクトアミン2000のみの存在下で残した。通常の培養条件下で48時間トランスフェクションを行った。
トランスフェクション後48時間で、細胞を回収し、計数して、5,000から6,000個の細胞を、前述したようにして(上記参照)非接着性6−ウェルプレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)で培養した。10日間培養した後、直径100から200μmのスフィアを得て、これを計数した。
処置なし、リポフェクトアミンのみでの処置、または対照オリゴ154での処置の後の結腸腫瘍細胞の初代培養物において、スフィアの形成は変化しなかった。しかしながら、ASO1537Sでの処置後のこれらの初代細胞ではスフィアの形成が停止された(図2)。
アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでの子宮頸がん細胞株およびヒト子宮頸がん細胞の初代培養の処置はスフィアの形成を停止させた
アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後に、SiHa子宮頸がん細胞株(ヒトパピローマウイルス16またはHPV16で形質転換された)からの、および患者から得られたヒト子宮頸がん細胞の初代培養物からの子宮頸部細胞のスフェロイド体を形成する能力を決定した。利用されたアッセイにより、がん幹細胞によって形成された、本明細書ではスフィアとも称されるスフェロイド体の数を測定した。
実験スキーム:
本明細書で利用された実験手順およびアッセイにより、子宮頸がん細胞によって形成されたスフィアの数に対するASncmtRNAに標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を測定した(図6)。SiHa子宮頸がん細胞株および患者から得られたヒト子宮頸がん細胞の初代培養物(CerCa)におけるスフィアの形成を測定した。CerCa1、CerCa2およびCerCa3(ヒトパピローマウイルス45で形質転換した)を患者生検から得た。
SiHa細胞を、10%FCSと共にペニシリン、ゲンタマイシンおよびfungizoneを含有するDMEM、「高グルコース」のGlutaMAX(商標)中で、37℃および5%CO2で増殖させた。
外科手術後、患者毎に対応するインフォームドコンセントを行って子宮頸がんの生検を行った。約500mm3の腫瘍の断片を、DMEM培地、高グルコースのGlataMax(商標)(GIBCO)、10%FCS(Biological Industries)、Fungizone(登録商標)1×、2×抗生−抗真菌剤混合物およびゲンタマイシン25μg/ml(Invitrogen)を含有する50mL滅菌チューブに移した。外科手術後2から3時間以内に生検を処理した。
20ng/mlのhEGF、ヒドロコルチゾン、インスリン、GA−1000(Lonza)、0.5×ビタミンA非含有B−27(Invitrogen)、20ng/mlのCFS非含有FGFb(Invitrogen)が補充されたMEGM(商標)培地に再懸濁した約1×105個の細胞を、超低接着性プレート(Corning)上に植え付けた。10日後、位相差顕微鏡下でスフィアを計数し、収集し、70μmのナイロンメッシュを使用してろ過し、単一の細胞を捨てた。フィルターからスフィアを回収し、I型コラーゲン(Gibco)で予めコーティングされた6−ウェルプレート(Corning)上に植え付け、上述したようにして培養した。子宮頸部腫瘍であるCerCa1、CerCa2およびCerCa3の3種のヒト初代培養物を単離した。
PGMY09/11リニアーアレイ(Roche)を用いて様々な初代培養を分析した。CerCa1およびCerCa2の初代細胞培養物中ではHPV16の存在が検出されたが、CerCa3初代細胞培養物中ではHPV45が検出された。
この研究で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、IDT(Integrated DNA Technologies、USA)、InvitrogenまたはBiosearch Inc.により、100%ホスホロチオエート(PS)ヌクレオシド間連結を用いて合成された。トランスフェクションのために、12−ウェルプレート(Nunc)に細胞5000個/ウェルで細胞を植え付けた。次の日、子宮頸がんの腫瘍またはSiHa細胞から選択された細胞(スフィアの形成による腫瘍細胞の選択およびコーティングされたプレートへの接着を参照)に、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO1537S:5’−CACCCACCCAAGAACAGG−3’(配列番号36)、細胞型に応じて)または対照オリゴヌクレオチド154(ASO−C:5’−AGGTGGAGTGGATTGGGG−3’(配列番号199))を、100nM(SiHa細胞)または200nM(CerCa細胞)の最終濃度で、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を製造元の指示に従って使用してトランスフェクトした。加えて、細胞の部分集合を、未処置のまま残すか(NT)、リポフェクトアミン2000(LIPO)のみの存在下でトランスフェクトするか、または45μMシスプラチン(CISP)と共にインキュベートした。通常の培養条件下で72時間トランスフェクションを行った。
トランスフェクション後72時間で、細胞を回収し、計数して、5,000から6,000個の細胞を、上述したようにして非接着性6−ウェルプレート(Corning Inc.、Corning、NY、USA)で培養した。10日間培養した後、直径100から200μmのスフィアを得て、これを計数した。
処置なし(NT)、リポフェクトアミンのみでの処置(LIPO)、または対照オリゴヌクレオチド154(ASO−C)での処置の後の子宮頸部腫瘍細胞の初代培養物において、スフィアの形成は変化しなかった。対照的に、ASO1537Sでの処置後のSiHa、CerCa1、CerCa2およびCerCa3初代培養ではスフィアの形成が停止された(図7および図8)。細胞を薬物シスプラチン(CISP)(45μM)で処置したところ、SiHa、CerCa1およびCerCa2細胞(全てHPV16に感染)のスフィアの形成も停止されたが(図7および図8)、シスプラチンで処置されたCerCa3細胞(HPV45に感染)では作用は観察されなかった。
総合すると、これらの結果から、未処置のまま、リポフェクトアミンのみで処置した、または対照オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた、子宮頸がんの初代培養(CerCa1、CerCa2およびCerCa3細胞)および細胞株SiHaは、スフィアを形成する能力を保持したことが示される。対照的に、アンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(ASncmtRNA)分子またはセンス非コードキメラミトコンドリアRNA(SncmtRNA)分子に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた初代子宮頸部腫瘍細胞またはSiHa細胞は、HPV16またはHPV45陽性かどうかに関わらずそれらのスフィアを形成する能力を失った。これらの結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、処置の際にスフィア形成が失われたことによって示されたように子宮頸がん幹細胞を殺すことができたことが示される。さらに、抗がん薬であるシスプラチンで処置したところ、SiHa、CerCa1およびCerCa2細胞(全てHPV16陽性)のスフィアの形成が停止されたが、HPV45に感染したCerCa3では停止されなかった(図7および図8)。それゆえに、これらの結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチド(oligonuleotides)は、シスプラチン処置に耐性の子宮頸がん幹細胞(CerCa3細胞)を殺すことができることが示される。Tjalmeら、Am. J. Clin. Pathol.、137巻:161頁、2012年;de Sanjoseら、Eur J Cancer.、49巻(16号):3450頁、2013年;Tjalmaら、Int J Cancer.、132巻(4号):854頁、2013年を参照されたい。
皮内黒色腫腫瘍を除去するための外科手術後におけるアンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのマウスの処置は、腫瘍増殖の再発ならびに肺および肝臓での転移を予防した
黒色腫に関する共通の臨床プロトコールの1つは、外科的切除とそれに続く薬物の全身投与を含む。他の腫瘍での実施においては類似のプロトコールが使用される。この代表的な実施例で示される黒色腫モデルでは、C57BL/6マウスの背中にB16F10黒色腫細胞(塩類溶液200μl中に細胞100,000個)を皮下注射した。細胞注射から約11から12日後、700から1,000mm3の間の腫瘍が発生した(マウスにおける1,000mm3の腫瘍は、ヒトにおける腫瘍3,000cc3と同等とみなされる)。この時点で、マウスを、類似の腫瘍体積を有する2つの群(対照オリゴASO154およびASO1560S(配列番号198))にランダムに分けた。腫瘍を麻酔下で外科的に切除し、100μgのASO1560SまたはASO154を含有する250μlで創傷を1回洗浄した。外科的に縫合した後、腫瘍によって残された空洞に、100μgのASO154またはASO1560Sを含有する塩類溶液200μlのボーラス投与を適用した。外科手術から3日後、1日毎で交互に、100μgのASO1560SまたはASO154のいずれかを含有する塩類溶液250μlを、3回の静脈内注射(図9;タイムライン上の第1、第3、第5の矢印)または3回の腹膜内注射(図9;タイムライン上の第2、第4、第6の矢印)でマウスに与えた。腫瘍増殖をノギスで週2回測定した。
皮内腎臓腫瘍を除去するための外科手術後のアンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのマウスの静脈内処置は、腫瘍再発の非存在と完全な生存をもたらした
0日目に、100,000個のRENCA細胞(ATCC(登録商標)CRL−2947(商標)mus musculusの腎臓腺癌(adenocarcina))を皮下注射した。12日目に、800mm3の平均サイズを有する腫瘍を除去し、腫瘍の部位を、両方ともリポソーム中に製剤化した100μgの対照オリゴASO154(4匹の動物)またはASO1560S(5匹の動物)200μlで洗浄した。動物を縫合し、両方ともリポソーム中に製剤化した100μgのASO154(図11、四角)またはASO1560S(図11、三角)250μlを除去した腫瘍の部位に静脈内注射した。さらなる処置は施さなかった。40日目(外科手術の30日後)に、全ての対照動物は死亡し、腫瘍の平均サイズは1,200mm3であり、大規模な転移を起こしていたが、ASO1560Sで処置された全ての動物は腫瘍を有さず、61日目でもまだ生きていた(図11)。
皮内腎臓腫瘍を除去するための外科手術後のアンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのマウスの腹膜内処置は、腫瘍再発の非存在と完全な生存をもたらした
0日目に、8匹のマウスに100,000個のRENCA細胞(ATCC(登録商標)CRL−2947(商標)mus musculusの腎臓腺癌)を皮下注射した。11日目に、腫瘍は、800mm3の平均サイズを有していた。全ての動物の腫瘍を外科手術で除去し、2つの群に分けた。対照群の創傷を縫合前に対照オリゴASO154で1回洗浄し、処置群の創傷を縫合前にASO1560Sで洗浄した。縫合後、腫瘍が増殖していた場所に250μlのボーラスを腹腔内注射し、ここで対照群にはASO154を注射し、処置群にはASO1560Sを注射した。13、15、17および19日目に、リポソーム中に製剤化した25μgのASO154(図12、丸)または25μgのASO1560S(図12、四角)の腹膜内注射を体積250μlで行った。14、16および18日目に、同じプロトコールでマウスに静脈内注射した。22日目に、全ての対照動物は、1,200mm3より大きい腫瘍を有しており、死亡した。60日目に、ASO1560Sで処置された全ての動物は腫瘍を有さず、まだ生きていた(図12)。
皮内黒色腫腫瘍を除去するための外科手術後のアンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのマウスの処置は、腫瘍再発の非存在と完全な生存をもたらした
0日目に、マウスにB16F10黒色腫細胞(200μlのRPMI培地中に細胞100,000個)を皮下注射した。11日目に、外科手術を実行して腫瘍を除去した。腫瘍体積はおよそ800から1200mm3まで様々であった。創傷を1回洗浄した。縫合後、腫瘍部位に、リポソーム中のオリゴ250μlを1回ボーラス注射した。13、15、17、19および21日目に、それぞれ体積250μlの、用量25μgの裸の対照ASO154(図13、四角)、25μgのリポソーム中の対照ASO154(図13、丸)、または50μgのリポソーム中のASO154(図13、三角)をマウスの腹腔内に注射した。他のマウスの群(1群当たり6匹のマウス)に、上述した方式と類似の方式で、50μgの裸のASO1560、25μgのリポソーム中のASO1560Sまたは50μgのリポソーム中のASO1560S(図13、ひし形)を注射した。
皮下膀胱癌の腫瘍を除去するための外科手術後のアンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのマウスの腹膜内または静脈内処置は、腫瘍の非存在と完全な生存をもたらした
12匹のマウスに、100,000個のMB49細胞(マウス膀胱がん細胞)を皮下注射した。15日後、マウスは、800mm3の平均直径を有する腫瘍を有していた。腫瘍を外科的に除去し(0日目)、外科手術の部位に、100μgのASO154(対照)またはASO1560S(活性薬物)を含有する200μlのボーラスを注射した。外科手術から3日後、マウスを2つの群に分け、図14に示すように、ASO154(対照群)またはASO1560S(処置群)を含有する100μlの注射により腹腔内または静脈内処置した。ASO1560Sで腹腔内処置した1匹のマウスだけが、腫瘍を発生させた。ASO1560Sで静脈内処置した全てのマウスは腫瘍がない状態を保ち、完全な生存を達成した。対照オリゴASO154で処置された対照動物は41日目に死亡した(図14)。
ヒト黒色腫の腫瘍除去後におけるアンチセンス非コードキメラミトコンドリアRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでのRag−/−マウスの処置は、腫瘍再発の有意な除去と大幅な生存の延長をもたらした
Rag−/−マウスに、500万個のヒトA375黒色腫細胞を注射した。細胞注射後およそ34日目に、全てのマウスが約700mm3の腫瘍を発生させた。マウスを腫瘍除去手術で処理して、ランダムに2つの群に分けた。
Claims (18)
- 個体における転移がんを処置または抑制するための組成物であって、前記組成物は、
a.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、アンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNA、または
b.逆位反復配列を有するポリヌクレオチドの3’末端に、センス16SミトコンドリアリボゾームRNAの5’末端で共有結合で連結された、センス16SミトコンドリアリボゾームRNA
を含むヒト非コードキメラミトコンドリアRNA分子に相補的な1種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を含み、前記1種または複数のオリゴヌクレオチドは、前記キメラミトコンドリアRNA分子とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができ、前記個体は、がんに関して治療で予め処置されている、組成物。 - 前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5、および配列番号6からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされたアンチセンス16SミトコンドリアリボゾームRNA分子に相補的である、請求項1に記載の組成物。
- 前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、配列番号7〜198からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1種の抗がん剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1種の抗がん剤が、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチナム、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、ギリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキセート、ゲフィチニブ、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、CPT−11、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソーマルダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パシリタキセル、ビンブラスチン、IL−2、GM−CSF、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、スリンダク、およびエトポシドからなる群から選択される、請求項4に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、逐次的に投与されることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも1種の抗がん剤が、同時に投与されることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、
(a)放射線療法
(b)外科手術;
(c)同種幹細胞移植療法;および/または
(d)自己幹細胞移植療法
と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記個体が、がんに関して、化学療法、放射線療法、外科手術、またはそれらの組合せを含む治療で予め処置されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記個体における前記転移がんが、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン−アルファ、レナリドマイド、メルファラン、ペグ化インターフェロン−アルファ、プレドニゾン、サリドマイド、およびビンクリスチンの1種または複数での処置後に再発している、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記転移がんが、固形がんである、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記固形がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、肝臓および胆管がん、肺がん、黒色腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん、前立腺がん、腎臓がん、睾丸がん、または甲状腺がんである、請求項11に記載の組成物。
- 前記転移がんが、非固形がんである、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記非固形がんが、多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、請求項13に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記個体におけるがん幹細胞数を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して減少させる、請求項1から14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記個体における腫瘍増殖および/または転移を、前記オリゴヌクレオチドが投与されていない個体と比較して阻害する、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、10〜50個の核酸塩基の長さである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1種または複数のオリゴヌクレオチドが、10〜30個の核酸塩基の長さである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
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