ES2673960T3 - Métodos para modular la expresión de un transcrito-1 de adenocarcinoma en pulmón asociado a metástasis (MALAT-1) - Google Patents

Métodos para modular la expresión de un transcrito-1 de adenocarcinoma en pulmón asociado a metástasis (MALAT-1) Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido antisentido para su uso en un método para tratar un animal que tiene cáncer, en donde el cáncer es un cáncer primario, y en donde el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados que tiene una secuencia de nucleobases por lo menos un 85% complementaria al ácido nucleico Transcrito-1 de Adenocarcinoma en Pulmón Asociado a Metástasis (MALAT-1) y en donde el compuesto antisentido reduce la expresión de MALAT-1.

Description

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Métodos para modular la expresión de un transcrito-1 de adenocarcinoma en pulmón asociado a metástasis (MALAT-1)
Descripción
CAMPO
Las presentes realizaciones se refieren al campo de la biología del cáncer. Más particularmente, las realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a compuestos y métodos para reducir la expresión del ARN y/o proteína asociados al Transcrito-1 de Adenocarcinoma en Pulmón Asociado a Metástasis (MALAT-1) en un animal. Tales métodos son útiles para tratar el cáncer, como cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de hígado y/o cáncer de próstata. En varios aspectos, el cáncer es un cáncer primario.
ANTECEDENTES
El MALAT, también conocido como transcrito abundante nuclear-enriquecido no codificante 2 (NEAT2) es un ARN no codificante, infrecuentemente cortado y empalmado, grande, que está altamente conservado entre los mamíferos. El MALAT-1 se expresa en el núcleo y regula positivamente la motilidad celular mediante regulación transcripcional y/o postranscripcional de los genes relacionados con la motilidad. Adicionalmente, el MALAT-1 ha sido implicado en la regulación del corte y empalme alternativo. Sin embargo, el papel funcional del MALAT-1 en la carcinogénesis es en gran parte desconocido.
Schmidt et al. (2011) se refiere al ARN MALAT-1 no codificante largo indicando un pronóstico pobre en cáncer de pulmón de células no pequeñas e induciendo la migración y el crecimiento tumoral. Guo et al. (2010) trata la inhibición del transcrito de adenocarcinoma de pulmón asociado a metástasis 1 en células de cáncer de cuello uterino humano CaSki que suprimen la proliferación e invasión celular. Tano et al. (2010) se refiere a MALAT-1 mejorando la motilidad celular de células de adenocarcinoma de pulmón influyendo en la expresión de genes relacionados con la motilidad. Lai et al. (2011) se refiere a la sobreexpresión de MALAT-1 de ARN no codificante largo que predice la recurrencia tumoral del carcinoma hepatocelular después del trasplante de hígado. La WO 2012/012467 se refiere a métodos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de ARN conservado nuclearmente.
SUMARIO
La invención proporciona un oligonucleótido antisentido para su uso en un método para tratar un animal que tiene cáncer, en donde el cáncer es un cáncer primario, y en donde el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos ligados que tiene una secuencia de nucleobases por lo menos un 85% complementaria a un ácido nucleico asociado a un ácido nucleico del Transcrito-1 de Adenocarcinoma en Pulmón Asociado a Metástasis (MALAT-1) y en donde el compuesto antisentido reduce la expresión de MALAT-1.
Las realizaciones divulgadas en la presente se refieren al descubrimiento de que los inhibidores específicos de MALAT-1 pueden tratar el cáncer in vivo. Se perfilan varias realizaciones para inhibidores específicos de MALAT-1, como compuestos antisentido, y métodos para modular la expresión de ARN y proteína de MALAT-1 usando los mismos. En ciertas realizaciones, los inhibidores específicos de MALAT-1 modulan la expresión o actividad de ARN y/o proteína de MALAT-1.
También se divulgan métodos para tratar el cáncer con inhibidores específicos de MALAT-1, tales como compuestos antisentido. En algunas realizaciones, los métodos para tratar el cáncer primario en un animal incluyen administrar al animal un compuesto antisentido que reduce la expresión de MALAT-1. Los tipos de cánceres que pueden tratarse con los inhibidores específicos de MALAT-1 proporcionados en la presente incluyen, pero no están limitados a, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de hígado, y/o cáncer de próstata.
En varias realizaciones, un método para tratar el cáncer en un animal incluye administrar al animal un compuesto antisentido que reduce la expresión de MALAT-1. El compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1.
Varias realizaciones divulgadas en la presente se refieren al uso de un compuesto que incluye un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos ligados por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
Realizaciones adicionales se refieren a compuestos para su uso en el tratamiento del cáncer que incluyen un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos ligados por lo menos un 85% complementario a
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un ácido nucleico de MALAT-1.
En varios aspectos de cualquiera de las realizaciones anteriormente mencionadas, se reduce la expresión de ARN de MALAT-1; se reduce la expresión de la proteína de MALAT-1; el animal es un humano; el ácido nucleico de MALAT-1 es un ácido nucleico de MALAT-1 humano (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 1-9); el oligonucleótido modificado es un 100% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1 humano (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 1-9); el oligonucleótido modificado inhibe el crecimiento del cáncer primario y opcionalmente la metástasis; el oligonucleótido modificado aumenta la supervivencia del animal; el cáncer es cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, o cáncer de próstata; el cáncer es un cáncer primario; la expresión de MALAT-1 se reduce en las células cancerosas del animal en comparación con animales de control o no tratados; el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de cadena sencilla; el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado como un enlace internucleosídico de fosforotioato; por lo menos un nucleósido comprende un azúcar modificado; el azúcar modificado es un azúcar bicíclico como un puente 4'-CH(CH3)-O-2'; el oligonucleótido modificado incluye por lo menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano en el que un anillo de tetrahidropirano reemplaza al anillo de furanosa; el azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo; y/o por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada como una 5-metilcitosina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son explicativas solamente y no son restrictivas de la invención tal como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Adicionalmente, como se usa en la presente, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en la presente son los bien conocidos y usados comúnmente en la técnica. Las técnicas estándar se pueden usar para la síntesis química, y el análisis químico.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etil de la posición 2' de un anillo de furanosilo. Un azúcar modificado 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietil) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificado 2'-MOE.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5- metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro del ±7% de un valor. Por ejemplo, si se afirma, "los compuestos inhibieron MALAT-1 en aproximadamente un 70%", se da a entender que los niveles de MALAT-1 se inhiben dentro de un intervalo del 63% y el 77%.
"Región objetivo activa" o "región objetivo" significa una región a la que están dirigidos uno o más compuestos antisentido activos. "Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles del ácido nucleico objetivo o los niveles de proteína.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un individuo, e incluye, pero no está limitado a, administrar por un profesional médico y autoadministración.
"Mejora" o "mejorar" o "mejorando" se refiere a una disminución de por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos, y primates no humanos, incluyendo, pero no limitado a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una
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disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico objetivo o proteína codificada por dicho ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble, como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc y ARNmi.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles del ácido nucleico objetivo o niveles de proteína objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles del ácido nucleico objetivo o los niveles de la proteína objetivo en ausencia del compuesto antisentido.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosilo modificado por el puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Nucleósido bicíclico" (también BNA) significa un nucleósido que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el 4'-carbono y el 2'-carbono del anillo de azúcar.
"Estructura de tapón" o "fracción de tapón terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos terminales de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta el 4'-carbono 'y el 2'-carbono, en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Nucleósido de etilo restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene 2'-O-metoxietil nucleótidos es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O- metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene por lo menos dos regiones químicamente distintas.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo con necesidad del agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
" Transcrito-1 de Adenocarcinoma en Pulmón Asociado a Metástasis (MALAT-1)" significa cualquier ácido nucleico o proteína de MALAT-1. "Ácido nucleico de MALAT-1" significa cualquier ácido nucleico que codifica MALAT-1. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de MALAT-1 incluye una secuencia de ADN que codifica MALAT-1, una secuencia de ARN transcrita de ADN que codifica MALAT-1 (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), que incluye una codificación no proteica (es decir no codificante) secuencia de aRn, y una secuencia de ARNm que codifica MALAT-1. "ARNm de MALAT-1" significa un ARNm que codifica una proteína de MALAT-1.
"Inhibidor específico de MALAT-1" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente el ARN MALAT-1 y/o la expresión o actividad de la proteína de MALAT-1 a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de MALAT-1 incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARN de MALAT-1 y/o proteína de MALAT-1.
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"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H está situada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "hueco" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Hueco-ampliado" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento hueco de 12 o más 2-desoxirribonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de uno a seis nucleósidos.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intervinientes entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir MALAT-1" significa reducir la expresión de los niveles de ARN y/o proteína de MALAT-1 en presencia de un inhibidor específico de MALAT-1, incluyendo un oligonucleótido antisentido de MALAT-1, en comparación con la expresión de ARN y/o niveles de proteína de MALAT-1 en ausencia de un inhibidor específico de MALAT-1, como un oligonucleótido antisentido de MALAT-1.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Nucleósidos ligados" significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.
"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico objetivo.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico de fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" se refiere a cualquier nucleobase distinta a adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y la bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado o una nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Fracción de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla, ácidos nucleicos de cadena doble, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN).
"Nucleobase" significa una fracción heterocíclica capaz de emparejarse con una base de otro ácido
nucleico.
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"Secuencia de nucleobases" significa el orden de las nucleobases contiguas independientemente de cualquier modificación de azúcares, enlaces o nucleobases.
"Nucleósido" significa una nucleobase ligada a un azúcar.
"Mimético de nucleósido " incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar sin furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos ligados por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto de azúcar se superpone con el mimético de nucleósido de término ligeramente más amplio, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en donde el grupo de azúcar de furanosa ha sido reemplazado un sistema de anillo de tetrahidropiranilo.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato ligado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos ligados cada uno de los cuales puede estar modificado o sin modificar, uno independiente del otro.
"Administración parenteral" significa la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada ligando por lo menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace de fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno no puente por un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato (P=S) es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, ligadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Oligonucleótido de cadena sencilla" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no objetivo bajo condiciones en las que se desea unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Direccionamiento" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcrito de ARN objetivo" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser el objetivo de los compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "sitio objetivo 3'" se refiere al nucleótido más 3 de un segmento objetivo.
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"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D- ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas Realizaciones
Ciertas realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a métodos para disminuir la expresión de ARN y/o proteína de MALAT-1 en un animal.
Ciertas realizaciones proporcionan métodos para el tratamiento o mejora de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con MALAT-1, como cáncer, en un animal con necesidad de ello. En varias realizaciones, el cáncer puede ser cáncer de colon, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de hígado y/o cáncer de próstata.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un inhibidor específico de MALAT-1 para tratar cáncer en un animal administrando un inhibidor específico de MALAT-1, como ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido) capaces de reducir los niveles de ARN de MALAT-1 y/o proteína de MALAT-1.
Ciertas realizaciones proporcionan métodos para tratar el cáncer en un animal, que comprenden administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor específico de MALAT-1. En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 es un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico es un oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 es un oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de cadena sencilla.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleósidos
ligados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que es un 80%, 85%, 90%, 95% o 100% complementaria a un ácido nucleico de MALAT-1 humano.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
En ciertas realizaciones, el azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.
En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5'-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano en donde un anillo de tetrahidropirano reemplaza al anillo de furanosa. En ciertas realizaciones, cada uno de por lo menos un nucleósido modificado con tetrahidropirano tiene la estructura:
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en la que Bx es una fracción de base heterocíclica opcionalmente protegida.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i) un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos ligados;
(ii) un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos ligados;
(iii) un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos ligados, en donde el segmento de hueco está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En algunas de dichas realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i) un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos ligados;
(ii) un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos ligados;
(iii) un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos unidos, en donde el segmento de hueco está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato. En algunas de dichas realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
Varias realizaciones descritas en la presente proporcionan métodos que comprenden administrar a un animal que tiene cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es por lo menos un 80% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1 humano. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es por lo menos un 90% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1 humano. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado es un 100% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1 humano.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado está dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 humano que puede seleccionarse de, pero no está limitado a, uno o más de los N° de acceso de GENBANK EF177381.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de acceso de GENBANK BK001411.1 1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de acceso GENBANK BQ429080.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de acceso GENBANK BQ428957.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 4), N° de acceso de GEnBaNK NT_033903.7 truncado de las nucleobases 10569000 a 10582000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5), N° de acceso de GENBANK XR_001309.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 6), o N° de acceso de GENBANK NR_002819.2 (incorporado en la presente como SEQ iD NO: 7), N° de acceso GENBANK NC_000011.9 de las nucleobases 65265233 a 65273940 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 8) o el complemento del mismo, y el N° de acceso de GENBANK Ac_000143.1 de las nucleobases 61592326 a 61601033 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 9) o el complemento del mismo.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado está dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 de ratón que puede seleccionarse de, pero no está limitado a, uno o más del N° de acceso de GENBANK NR_002847.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 10), N° de acceso de GENBANK FJ209304.1 (incorporado en la presente como SeQ ID NO: 11), y el complemento del N° de acceso GENBANK NT_082868.4 truncado de las nucleobases 2689000 a 2699000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 12).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobases por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, o por lo menos un 99% complementaria a una porción de longitud igual de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12.
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En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido pueden comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de nucleobases 100% complementaria a una porción de longitud igual de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 12.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es un 100% complementaria a una secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.
Compuestos Antisentido
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente se refieren a compuestos oligoméricos capaces de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo mediante enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble, como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc y miARN.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades ligadas. En otras realizaciones, el compuesto antisentido está formado por de 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22 o 20 subunidades ligadas. En ciertas de tales realizaciones, los compuestos antisentido son de 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,
75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades ligadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores
anteriores. En algunas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades ligadas son nucleósidos.
En varias realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 puede tener porciones antisentido de 10 a 50 nucleobases de longitud. Un experto en la técnica apreciará que esto incluye compuestos antisentido que tienen porciones antisentido de 1 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleobases de longitud, o cualquier intervalo dentro de los mismos.
En varias realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 puede tener porciones antisentido de 12 a 30 nucleobases de longitud. Un experto en la materia apreciará que esto incluye compuestos antisentido que tienen porciones antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud, o cualquier intervalo dentro de los mismos.
En algunas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 puede tener porciones antisentido de 12 ó 13 a 24 nucleobases de longitud. Un experto en la técnica apreciará que esto incluye compuestos antisentido que tienen porciones antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 nucleobases de longitud, o cualquier intervalo dentro de los mismos.
En algunas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 puede tener porciones antisentido de 19 a 23 nucleobases de longitud. Un experto en la técnica apreciará que esto incluye compuestos antisentido que tienen porciones antisentido de 19, 20, 21, 22, o 23 bases nucleotídicas de longitud, o cualquier intervalo dentro de los mismos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de MALAT-1 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una subunidad individual puede eliminarse del extremo 5 '(truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3 '(truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse a través del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando hay una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar localizada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un
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compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse a través del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir malapareamientos sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 ó 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido eran capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellas con 1 ó 3 malapareamientos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm bcl-2 y que tiene 3 desapareamientos con el ARNm bcl-xL para reducir la expresión de ambos bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases sólo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ciertos Motivos y Mecanismos de Compuestos Antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido han modificado químicamente subunidades dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo . Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir una resistencia aumentada a la degradación de nucleasa, una captación celular aumentada, una afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico objetivo y/o actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como un sustrato para la RNasa H de endonucleasa celular, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
La actividad antisentido puede ser resultado de cualquier mecanismo que implica la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico objetivo, en el que la hibridación finalmente da como resultado un efecto biológico. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo está modulada. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo se reduce. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo finalmente da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo no da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico objetivo (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o a través de mecanismos que no se han elucidado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente no están limitados por mecanismos particulares.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía de RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de tales mecanismos y/o a través de mecanismos adicionales.
Antisentido Mediado por RNasa H
En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es resultado por lo menos en parte de la degradación del ARN objetivo por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "tipo ADN" provocan actividad de RNasa H en células mamíferas. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden por lo menos una porción de ADN o nucleósidos de tipo ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan
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RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido comprenden por lo menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En ciertas de tales realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad RNasa H. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido son gapmers, como se describe en la presente. En ciertas de dichas realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos tipo ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos de tipo ADN.
Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soportan la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de endonucleasa, mientras que los segmentos ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden en algunas realizaciones incluir p-D-ribonucleósidos, p-D- desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2'-modificados (tales nucleósidos 2-modificados pueden incluir 2'-MOE y 2'-O- CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un etilo restringido). En ciertas realizaciones, los nucleósidos en las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificadas, incluyendo, por ejemplo, 2'-MOE y fracciones de azúcar bicíclico como etilo o LNA restringido. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificadas y no modificadas. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, fracciones de azúcar bicíclico como nucleósidos de etilo o nucleósidos de LNA restringidos, y 2'- desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes o fracciones de azúcar alternas. El motivo ala-espacio-ala se describe frecuentemente como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del hueco, y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes o alternas. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'- desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco está colocado inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intervinientes entre el ala 5' y el hueco, o el hueco y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones, son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" está entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 tiene un motivo gapmer en el que el hueco consiste de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos ligados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo de azúcar descrito por la Fórmula A como sigue. (J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z en donde:
cada A es independientemente un nucleósido 2'-sustituido; cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido 2'-sustituido o un 2'-desoxinucleósido; cada D es un 2'-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14; siempre que:
por lo menos uno de m, n, y r sea distinto de 0; por lo menos uno de w e y sea distinto de 0; la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y la suma de v, w, x, y, y z sea de 2 a 5.
Compuestos de ARNi
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARN interferente (ARNi), que incluyen compuestos de ARN de cadena doble (también denominados ARN de interferencia corta o ARNip) y compuestos de ARNi de cadena sencilla (o ARNmc). Dichos compuestos funcionan por lo menos en parte a través de la vía RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico objetivo (por tanto, incluyen compuestos de micro ARN/mímicos de microARN). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para tales mecanismos.
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i. compuestos de ARNmc
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido incluyendo aquellos particularmente adecuados para uso como compuestos de ARNi de cadena sencilla (ARNmc) comprenden un extremo 5' terminal modificado. En ciertas de tales realizaciones, el extremo 5' terminal comprende una fracción de fosfato modificado. En ciertas realizaciones, dicho fosfato modificado está estabilizado (por ejemplo, es resistente a la degradación/escisión en comparación con el 5'-fosfato no modificado). En ciertas realizaciones, dichos nucleósidos 5'-terminales estabilizan la fracción de 5'-fósforo. Ciertos nucleósidos 5'-terminales modificados pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en la WO/2011/139702.
En ciertas realizaciones, el 5 '-nucleósido de un compuesto de ARNmc tiene la Fórmula IIc:
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en la que:
T1 es una fracción de fósforo opcionalmente protegido;
T2 es un grupo de enlace internucleosídico que liga el compuesto de Fórmula IIc con el compuesto oligomérico;
A tiene una de las fórmulas:
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Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1- C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido o N(R3)(R4);
Qa es O, S, N(Ra) o C(R6)(Rt);
cada R3, R4, R5, R6 y R 7 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6sustituido o alcoxi C1-C6; Ma es O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) o OC(R15)(Bx2);
R14 es H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
R15, R16, R17 y R18 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
Bx1 es una fracción de base heterocíclica;
o si Bx2 está presente, entonces Bx2 es una fracción de base heterocíclica y Bx1 es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6
sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
J4, J5, J6y 7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
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o J4 forma un puente con uno de J5 o J7 en donde dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales ligados seleccionados de O, S, NR19, C(R2ü)(R21), C(R2ü)=C(R21), C[=C(R20)(R 21)] y C(=o) y los otros dos de J5, J6y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada R19, R20 y R21 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
G es H, OH, halógeno u O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Z;
cada R8 y R9 es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
X1 es O, S o N(E1);
Z es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido o N(E2)(E3);
E1, E2 y E3 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido; n es de 1 a aproximadamente 6; m es 0 ó 1; j es 0 ó 1;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, NJ1J2), =NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) y C(=X2)N(J1)(J2);
X2 es O, S o NJ3;
cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6; cuando j es 1 entonces Z es distinto de halógeno o N(E2)(E3); y
en donde dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y es hibridable a por lo menos una porción de un ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, M3 es O, CH=CH, OCH2 o OC(H)(Bx2). En ciertas realizaciones, M3 es O.
En ciertas realizaciones, J4, J5, J6 y J7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, J4 forma un puente con uno de J5 o J7 .
En ciertas realizaciones, A tiene una de las fórmulas:
Qi>
y
q2
y
Qb
y
x
q2
en las que:
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 o alcoxi C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno H. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H o halógeno. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 es H y el otro de Q1 y Q2 es F, CH3 o OCH 3.
En ciertas realizaciones, T1 tiene la fórmula:
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en la que:
Ray Rc son cada uno, independientemente, hidroxilo protegido, tiol protegido, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 o alcoxi C1-C6 sustituido, amino protegido o amino sustituido; y Rb es O o S. En ciertas realizaciones, Rbes O y Ray R c son cada uno, independientemente, OCH3, OCH2CH3 o CH(CH3)2 .
En ciertas formas de realización, G es halógeno, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CHE3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R1ü)(R11), O(CH2)2-ON(R1q)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R1ü)(R11), OCH2C(=O)-N(R1ü)(Rh), OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2-N(R1o)(Rh) u O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R1o)(R11)] en donde R10, R11, R12y R13son cada uno, independientemente, H o alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=Ch2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 u OCH2-N(H)- C(=NH)NH2. En ciertas realizaciones, G es F, OCH3 u O(cH2)2-oCh3 . En ciertas realizaciones, G es O(CH2)2-OCH3.
En ciertas realizaciones, el nucleósido 5-terminal tiene la Fórmula IIe:
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En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo aquellos particularmente adecuados para ARNmc comprenden uno o más tipos de fracciones de azúcar modificado y/o fracciones de azúcar de origen natural dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Dichos motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar tratadas en la presente y/o otras modificaciones de azúcar conocidas.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten de una región que tiene modificaciones de azúcar uniformes. En ciertas de tales realizaciones, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar tipo ARN. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2’- F. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En ciertas realizaciones, la región constituye el oligonucleótido completo excepto por 1-4 nucleósidos terminales.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones de azúcar alternas, en donde los nucleósidos alternan entre nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos tipo ARN. En ciertas realizaciones, los nucleósidos alternos se seleccionan de: 2-OMe, 2’-F, 2-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, las modificaciones alternas son 2’-F y 2- OMe. Tales regiones pueden ser contiguas o pueden estar interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados.
En ciertas realizaciones, la región alterna de las modificaciones alternas consiste cada una de un único nucleósido (es decir, el patrón es (AB)xAy donde A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 ó 1). En ciertas realizaciones, una o más regiones alternas en un motivo alterno incluyen más de un único nucleósido de un tipo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
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AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; o ABABBAABBABABAA;
donde A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, A y B se seleccionan cada uno de 2'-F, 2'-OMe, BNA y MOE.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen dicho motivo alterno también comprenden un nucleósido 5 'terminal modificado, como los de fórmula IIc o IIe.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Tales regiones comprenden el siguiente motivo:
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
en donde: A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B y C son nucleósidos que están modificados de manera diferente que A, sin embargo, B y C pueden tener las mismas o diferentes modificaciones entre sí; x e y son de 1 a 15.
En ciertas realizaciones, A es un nucleósido modificado 2'-OMe. En ciertas realizaciones, B y C son ambos nucleósidos modificados 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido modificado 2'-OMe y B y C son ambos nucleósidos modificados 2'-F.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende una fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B es un segundo tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente del nucleósido adyacente a él. Por tanto, si y es 0, entonces D debe modificarse de manera diferente que B y si y es 1, entonces D debe modificarse de manera diferente que A. En ciertas realizaciones, D difiere de A y B.
X es 5-15;
Y es 0 o 1;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(A)x-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende una fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un
nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.
X es 11-30;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, A, B, C y D en los motivos anteriores se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, D representa nucleósidos terminales. En ciertas realizaciones, dichos nucleósidos terminales no están diseñados para hibridar con el ácido nucleico objetivo (aunque uno o más podrían hibridar por casualidad). En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, que incluyen aquellos particularmente adecuados para uso como enlaces internucleosídicos modificados que comprenden ARNmc dispuestos a lo largo del oligonucleótido
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o la región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos modificados uniformemente. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está ligada uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido se liga uniformemente mediante enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de dichos bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los varios motivos de azúcar descritos en la presente, pueden tener cualquier motivo de enlace. Por ejemplo, los oligonucleótidos, incluyendo, pero no limitados a, los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de enlace seleccionado de la siguiente tabla no limitativa:
Enlace más 5'
Región central Región 3'-
PS
PO/PS alterno 6 PS
PS
PO/PS alterno 7 PS
PS
PO/PS alterno 8 PS
ii. Compuestos de ARNip
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi de cadena doble (ARNip). En tales realizaciones, una o ambas cadenas pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNmc. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNmc pueden ser RNA no modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNip pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero enlaces internucleosídicos modificados.
Varias realizaciones se refieren a composiciones de cadena doble en las que cada cadena comprende un motivo definido por la localización de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un primer y un segundo compuesto oligomérico que están hibridados completamente o al menos parcialmente para formar una región dúplex y que comprenden además una región que es complementaria e hibrida con un objetivo de ácido nucleico. Es adecuado que tal composición comprenda un primer compuesto oligomérico que es una cadena antisentido que tiene complementariedad total o parcial con un objetivo de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que es una cadena de sentido que tiene una o más regiones de complementariedad y forme por lo menos un región dúplex con el primer compuesto oligomérico.
Las composiciones de varias realizaciones modulan la expresión génica hibridando con un objetivo de ácido nucleico que da como resultado la pérdida de su función normal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo es MALAT-1. En cierta realización, la degradación del MALAT-1 objetivo se ve facilitada por un complejo RISC activado que se forma con las composiciones de la invención.
Varias realizaciones están dirigidas a composiciones de cadena doble en las que una de las cadenas es útil, por ejemplo, en influenciar la carga preferente de la cadena opuesta en el complejo RISC (o escisión). Las composiciones son útiles para dirigir moléculas de ácido nucleico seleccionadas y modular la expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención hibridan con una porción de un ARN objetivo dando como resultado la pérdida de la función normal del ARN objetivo.
Ciertas realizaciones se perfilan para composiciones de cadena doble en las que ambas cadenas
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comprenden un motivo de hemímero, un motivo completamente modificado, un motivo posicionalmente modificado o un motivo alterno. Cada cadena de las composiciones de la presente invención puede modificarse para cumplir un papel particular en, por ejemplo, la vía de ARNip. Usar un motivo diferente en cada cadena o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada cadena permite dirigir la cadena antisentido para el complejo RISC a la vez que se inhibe la incorporación de la cadena de sentido. Dentro de este modelo, cada cadena puede modificarse de manera independiente de modo que se mejore para su función particular. La cadena antisentido puede modificarse en el extremo 5' para mejorar su papel en una región del RISC mientras que el extremo 3' puede modificarse diferencialmente para mejorar su papel en una región diferente del RISC.
Las moléculas de oligonucleótidos de cadena dobles pueden ser una molécula de polinucleótidos de cadena doble que comprende regiones de sentido y antisentido auto-complementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos cadena doble pueden ensamblarse a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena de sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas sentido y antisentido son auto- complementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra cadena; como cuando la cadena antisentido y la cadena sentido forman una estructura dúplex o de cadena doble, por ejemplo, en donde la región de cadena doble es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 pares de bases; la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la cadena de sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótido de cadena doble son complementarios al ácido nucleico objetivo o a una porción del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido de cadena doble se ensambla a partir de un oligonucleótido individual, donde las regiones de sentido y antisentido auto-complementarias del ARNip están ligadas por medio de un conector(es) a base de ácidos nucleicos o a base de no ácidos nucleicos.
El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrica, horquilla o horquilla asimétrica, que tiene regiones de sentido y antisentido auto- complementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico separada o una porción de la misma y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma. El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido de cadena sencilla circular que tiene dos o más estructuras de giro y un vástago que comprende regiones de sentido y antisentido auto-complementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma y la región de sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una porción de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede procesarse o in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende secuencias o regiones de sentido y antisentido separadas, en donde las regiones sentido y antisentido están ligadas covalentemente por moléculas conectoras de nucleótidos o no nucleótidos como se conoce en la técnica, o están alternativamente ligadas no covalentemente mediante interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas y/o interacciones de apilamiento. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. En otra realización, el oligonucleótido de cadena doble interacciona con la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen objetivo.
Como se usa en la presente, los oligonucleótidos de cadena doble no necesitan estar limitados a las moléculas que contienen solo ARN, sino que abarcan además nucleótidos y no nucleótidos químicamente modificados. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico interferentes cortas carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos interferentes cortos no incluyen opcionalmente ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tengan un grupo 2'-OH). Dichos oligonucleótidos de cadena doble que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar ARNi pueden sin embargo tener un conector o conectores unidos u otros grupos, fracciones o cadenas unidos o asociados que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos de cadena doble pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 20, 30, 40, o 50% de las posiciones de nucleótidos. Como se usa en la presente, el término ARNip pretende ser equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específico de la secuencia, por ejemplo, ARN corto interferente (ARNip), ARNA de cadena doble (ARNcd), micro-RNA (ARNmi), ARN de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido interferente corto, ácido nucleico interferente corto, oligonucleótido modificado interferente corto, ARNip químicamente modificado, ARN silenciador de genes postranscripcional (ARNptgs) y otros. Adicionalmente, como se
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usa en la presente, el término ARNi pretende ser equivalente a otros términos usados para describir la interferencia de ARN específica de la secuencia, como silenciamiento génico postranscripcional, inhibición traduccional o epigenética. Por ejemplo, los oligonucleótidos de cadena doble pueden usarse para silenciar epigenéticamente genes tanto a nivel post-transcripcional como a nivel pre-transcripcional. En un ejemplo no limitativo, la regulación epigenética de la expresión génica por moléculas de ARNip de la invención puede resultar de la modificación mediada por ARNip de la estructura de la cromatina o del patrón de metilación para alterar la expresión génica (ver, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 22152218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Se contempla que los compuestos y composiciones de varias realizaciones proporcionadas en la presente puedan dirigirse a MALAT-1 mediante un silenciamiento génico mediado por ARNcd o mecanismo de ARNi, incluyendo, por ejemplo, moléculas efectoras de ARN de cadena doble de "horquilla" o vástago-giro en las que una única cadena de ARN con secuencias auto-complementarias es capaz de asumir una conformación de cadena doble, o moléculas efectoras de ARNcd dúplex que comprenden dos cadenas separadas de ARN. En varias realizaciones, el ARNcd consiste completamente de ribonucleótidos o consiste de una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, como los híbridos de ARN/ADN divulgados, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la U.S. N° de Serie 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999. El ARNcd o la molécula efectora de ARNcd puede ser una sola molécula con una región de auto-complementariedad tal que los nucleótidos en un segmento de la base de la molécula se emparejan con nucleótidos en otro segmento de la molécula. En varias realizaciones, un ARNcd que consiste en una sola molécula consiste completamente en ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNcd puede incluir dos cadenas diferentes que tienen una región de complementariedad entre sí.
En varias realizaciones, ambas cadenas consisten completamente de ribonucleótidos, una cadena consiste completamente de ribonucleótidos y una cadena consiste completamente de desoxirribonucleótidos, o una o ambas cadenas contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ciertas realizaciones, las regiones de complementariedad son por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% complementarias entre sí y con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la región del ARNcd que está presente en una conformación de cadena doble incluye por lo menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico objetivo representada en el ARNcd. En algunas realizaciones, el ARNcd no contiene ninguna región de cadena sencilla, como extremos de cadena sencilla, o el ARNcd es una horquilla. En otras realizaciones, el ARNcd tiene una o más regiones de cadena sencilla o sobresale. En ciertas realizaciones, los híbridos de ARN/ADN incluyen una cadena o región de ADN que es una cadena o región antisentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de complementariedad con un ácido nucleico objetivo) y una cadena o región de ARN región que es una cadena o región de sentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de identidad con un ácido nucleico objetivo), y viceversa.
En varias realizaciones, el híbrido de ARN/ADN se prepara in vitro usando métodos sintéticos enzimáticos o químicos como los descritos en la presente o los descritos en la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la U.S. N° de Serie 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999 . En otras realizaciones, una cadena de ADN sintetizada in vitro se compleja con una cadena de ARN producida in vivo o in vitro antes, después o simultáneamente con la transformación de la cadena de ADN en la célula. En otras realizaciones más, el ARNcd es un único ácido nucleico circular que contiene una región de sentido y una antisentido, o el ARNcd incluye un ácido nucleico circular y un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (ver, por ejemplo, la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la U.S. N° de serie 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999). Los ácidos nucleicos circulares ejemplares incluyen estructuras de lariat en las que el grupo 5' fosforilo libre de un nucleótido se liga al grupo 2' hidroxilo de otro nucleótido en una manera de retorno de giro.
En otras realizaciones, el ARNcd incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2' en el azúcar contiene un halógeno (como un grupo flúor) o contiene un grupo alcoxi (como un grupo metoxi) que aumenta la vida media del ARNcd in vitro o in vivo en comparación con el ARNcd correspondiente en el que la posición 2' correspondiente contiene un hidrógeno o un grupo hidroxilo. En otras realizaciones más, el ARNcd incluye uno o más enlaces entre nucleótidos adyacentes distintos del enlace fosfodiéster de origen natural. Los ejemplos de tales enlaces incluyen enlaces fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNcd también pueden ser moléculas de ácido nucleico químicamente modificadas como se enseña en la Patente U.S. N° 6.673.661. En otras realizaciones, el ARNcd contiene una o dos cadenas tapadas, como se describe, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000, o la U.S. N° de Serie 60/130.377, presentada el 21 de abril de 1999 .
En otras realizaciones, el ARNcd puede ser cualquiera de las moléculas de ARNcd por lo menos parcialmente divulgadas en la WO 00/63364, así como cualquiera de las moléculas de ARNcd divulgadas en la Solicitud Provisional U.S. 60/399.998; y la Solicitud Provisional U.S. 60/419.532 y el
PCT/US2003/033466 . Cualquiera de los ARNcd puede expresarse in vitro o in vivo usando los métodos descritos en la presente o métodos estándar, tales como los descritos en la WO 00/63364 .
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Ocupación
En ciertas realizaciones, no se espera que los compuestos antisentido den como resultado la escisión o el ácido nucleico objetivo a través de la RNasa H o que den como resultado la escisión o el secuestro a través de la vía de RISC. En ciertas de tales realizaciones, la actividad antisentido puede dar como resultado de la ocupación, en donde la presencia del compuesto antisentido hibridado altera la actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido puede modificarse uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones y/o nucleósidos modificados y no modificados.
Ácidos Nucleicos Objetivo, Regiones Objetivo y Secuencias de Nucleótidos
"Dirigir" un compuesto oligomérico a una molécula de ácido nucleico particular puede ser un proceso de múltiples pasos. El proceso comienza generalmente con la identificación de un ácido nucleico objetivo cuya función se va a modular. Este ácido nucleico objetivo puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión está asociada con un trastorno o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En varias realizaciones proporcionadas en la presente, el ácido nucleico objetivo codifica MALAT-1.
Las secuencias de nucleótidos que codifican MALAT-1 humano son ácidos nucleicos objetivo en varias realizaciones que incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de acceso GENBANK EF177381.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de acceso GENBANK BK001411.1 1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de acceso GENbAnK BQ429080.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de acceso GENBANK BQ428957.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 4), N° de acceso GENBANK NT_033903.7 truncado de las nucleobases 10569000 a 10582000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5), N° de acceso GENBANK XR_001309.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 6), o N° de acceso GENBANK NR_002819.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de acceso GENBANK NC_000011.9 de las nucleobases 65265233 a 65273940 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de acceso GENBANK AC_000143.1 de las nucleobases 61592326 a 61601033 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 9).
Las secuencias de nucleótidos que codifican MALAT-1 de ratón son ácidos nucleicos objetivo en varias realizaciones que incluyen, sin limitación, los siguientes: N° de acceso GENBANK NR_002847.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 10), N° de acceso GENBANK FJ209304.1 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 11), y el complemento del N° de acceso GENBANK NT_082868.4 truncado de las nucleobases 2689000 a 2699000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 12).
Se entiende que la secuencia que expuesta en cada SEQ ID NO en la Descripción Detallada y/o los Ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación en una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones en una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobases y motivo.
El proceso de direccionamiento también incluye habitualmente la determinación de por lo menos una región, segmento o sitio objetivo dentro del ácido nucleico objetivo para que tenga lugar la interacción antisentido de manera que resulte el efecto deseado, por ejemplo, modulación de la expresión. Dentro del contexto de las presentes realizaciones, el término "región" se define como una porción del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de los ácidos nucleicos objetivo hay segmentos. Los "segmentos" se definen como porciones más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo. "Sitios", como se usan en la presente invención, se definen como posiciones dentro de un ácido nucleico objetivo.
El direccionamiento incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo al que se hibrida un compuesto antisentido, de manera que tiene lugar un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.
Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Pueden superponerse múltiples segmentos objetivo dentro de una región objetivo. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por dos cualquiera de los valores precedentes. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos
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en el ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios objetivo 5' o sitios objetivo 3' enumerados en la presente.
En general, se pueden encontrar segmentos objetivo adecuados dentro de una UTR 5', una región codificante, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de parada son generalmente también segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente como el codón de inicio o el codón de parada. Sin embargo, como los transcritos de MALAT-1 se consideran no codificantes, se pueden encontrar segmentos objetivo adecuados a lo largo de la longitud del transcrito, que se cree que no se ha traducido.
No obstante, los segmentos objetivo que incluyen posibles transcritos de codificación de MALAT-1 y cualquier región estructuralmente definida se contemplan todavía en varias realizaciones. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región del ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para MALAT-1 se pueden obtener por el número de acceso de bases de datos de secuencias como NCBI. En ciertas realizaciones, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la misma región objetivo.
Como, se sabe en la técnica, el codón de inicio de la traducción es típicamente 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de inicio de la traducción también se denomina "codón AUG", el "codón de partida" o el" codón de partida AUG". Una minoría de genes tienen un codón de inicio de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG que han demostrado funcionarin vivo .Por lo tanto, los términos "codón de inicio de la traducción" y "codón de partida" pueden abarcar muchas secuencias de codones, aunque el aminoácido iniciador en cada caso es típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de partida alternativos, cualquiera de los cuales puede utilizarse preferentemente para el inicio de la traducción en un tipo o tejido celular particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la invención, "codón de partida" y "codón de inicio de la traducción" se refieren al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito de un gen que codifica tirosinasa, independientemente de la secuencia(s) de dichos codones. También se sabe en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o "codón de parada") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'- UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).
Los términos "región de codón de partida" y "región de codón de inicio de la traducción" se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5 'o 3') a partir de un codón de inicio de traducción. De manera similar, los términos "región de codón de parada" y "región de codón de terminación de traducción" se refieren a una porción de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5 'o 3') de un codón de terminación de la traducción. Consecuentemente, la "región de codón de partida" (o "región de codón de inicio de traducción") y la "región de codón de parada" (o "región de codón de terminación de la traducción") son todas regiones que pueden ser dirigidas efectivamente con los compuestos antisentido de la presente invención.
El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificante", que se conoce en la técnica para referirse a la región entre el codón de inicio de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede dirigirse con eficacia.
Otras regiones objetivo incluyen la región 5' no traducida (5'UTR), conocida en la técnica para referirse a la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de inicio de la traducción, y que incluye nucleótidos entre el sitio de tapón 5' y el codón de inicio de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen), y la región 3' no traducida (3'UTR), conocida en la técnica para referirse a la porción de un ARNm en la dirección 3' del codón de terminación de la traducción, y, por tanto, incluye nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3 'de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio de tapón 5 'de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo más 5' del ARNm a través de un enlace trifosfato 5'-5'. La región tapón 5' de un ARNm se considera que incluye la misma estructura de tapón 5' así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio tapón.'
Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se extirpan de una transcripción antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y por lo tanto traducidas) se conocen como "exones" y se cortan y empalman juntas para formar una secuencia continua de ARNm. Los sitios de corte y empalme dirigidos, es decir, uniones intrón-exón o uniones exón- intrón, también pueden ser particularmente útiles en situaciones donde el corte y empalme aberrante está implicado en la enfermedad, o cuando una sobreproducción de un producto de corte y empalme particular está implicado en la
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enfermedad. Las uniones de fusión aberrantes debido a reordenamientos o deleciones también son posibles sitios objetivo. Los transcritos de ARNm producidos a través del proceso de corte y empalme de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcritos de fusión". También se sabe que los intrones pueden ser dirigidos eficazmente usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.
También se sabe en la técnica que pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de la misma región genómica de ADN. Estos transcritos alternativos se conocen generalmente como "variantes". Más específicamente, las "variantes de pre-ARNm" son transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico en su posición de inicio o parada y que contienen tanto secuencia intrónica como exónica.
Tras la escisión de una o más regiones de exones o intrones, o porciones de las mismas durante el corte y empalme, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm" más pequeñas. Consecuentemente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante única de pre-ARNm debe producir siempre una variante de ARNm única como resultado del corte y empalme. Estas variantes de ARNm también se conocen como "variantes de corte y empalme alternativas". Si no se produce el corte y empalme de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm.
También se sabe en la técnica que pueden producirse variantes mediante el uso de señales alternativas para iniciar o detener la transcripción y que los pre-ARNm y los ARNm pueden poseer más de un codón de inicio o codón de parada. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de partida alternativos se conocen como "variantes de partida alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codón de parada alternativo se conocen como "variantes de parada alternativas" de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de parada alternativa es la "variante poliA" en la que los múltiples transcritos producidos son el resultado de la selección alternativa de una de las "señales de parada poliA" por la maquinaria de transcripción, produciendo de este modo transcritos que terminan en sitios poliA únicos.
La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, puede usarse el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera del objetivo).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de MALAT-1 son indicativos de la inhibición de la expresión de MALAT-1. Las reducciones en los niveles de proteína de MALAT-1 también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm objetivo.
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de MALAT-1. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno de Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede tener lugar en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas del ácido nucleico a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente son específicamente hibridables con un ácido nucleico de MALAT-1.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de MALAT-1).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de MALAT-1 pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de MALAT-1 de manera que los segmentos intervinientes o adyacentes no están implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, malapareamiento o estructura en horquilla).
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En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o una porción especificada de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% complementarios a un ácido nucleico de MALAT-1, una región objetivo, segmento objetivo, o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo, y por lo tanto hibridarían específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que es de 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamientos locales básicos) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI), usando los ajustes por defecto, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o porciones específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico objetivo, o a una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de MALAT-1, o a una región objetivo, o a un segmento objetivo o secuencia objetivo de los mismos. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción de 20 nucleobases correspondiente del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser o no completamente complementario a la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, ligadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que son de, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de MALAT-1, o una porción específica del mismo.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que son, o son de hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de MALAT-1, o una porción específica del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, ligadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a por lo menos una porción de 15 nucleobases de un segmento
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objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a por lo menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO:, o compuesto representado por un número de Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. Se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido proporcionados en la presente así como también compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o dispersarse por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tiene un emparejamiento de bases idéntico en relación a una secuencia con la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en la presente.
En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, se compara una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, se compara una porción de de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobases (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato ligado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede ligarse a la fracción de hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia comúnmente a que los grupos fosfato forman los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones de los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para el objetivo de ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas, o actividad inhibidora aumentada.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. Consecuentemente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces Internucleosídicos Modificados
El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no de origen natural se seleccionan a menudo sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada para ácidos nucleicos objetivo, y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
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En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de MALAT-1 comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Fracciones de Azúcar Modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo de azúcar ha sido modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasas mejorada, afinidad de unión aumentada, o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillos de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puentes de átomos de anillos no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R-i)(R2) (R, R-iy R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen el nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) o sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S con sustitución adicional en la posición 2' (ver Solicitud de Patente U.S. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio del 2005) o alternativamente 5'-sustitución de un BNA (ver Solicitud Internacional de PCT WO2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o uno 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2-OCH3, 2-OCH2CH3, 2-OCH2CH2F y 2'- O (CH 2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, Oalquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-ON(Rm)(Rn), O-CH2-(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R-,)- (CH2)2 N(Rm)(Rn), donde cada Rl, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosílico 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos en puente de 4' a 2' incluyen, pero no están limitados a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también denominado como etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver Patente U.S. 7.399.845, concedida el 15 de julio del 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(y análogos del mismo ver Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero del 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo ver Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre del 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver Solicitud de Patente U.S. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre del 2004; 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver Patente U.S. 7.427.672, concedida el 23 de septiembre del 2008); 4'- CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2'(y análogos del mismo ver Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre del 2008).
Informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos también pueden encontrarse en la bibliografía publicada (ver, por ejemplo, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes U.S. N° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de Patente U.S. N° US2008-0039618; US2009-0012281; Número de Serie de Patente U.S. 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; y 61/099,844; Solicitudes Internacionales de PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones estereoquímicas de azúcar que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver solicitud Internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como wO 99/14226).
En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcares bicíclicos de nucleósidos de BNA incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y la posición 2' de la fracción de azúcar de pentofuranosilo en donde tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos ligados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, - Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)- en donde:
x es 0, 1 o 2;
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n es 1,2, 3 ó4;
cada Ray Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo Ci-C12, alquilo Ci-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2 -C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5 -C20, arilo C5 -C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2 -C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5 -C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo
(C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1 -C12o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de una fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, - C(RaRb)-N(R)-O- or -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'- CH2-O-21, 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' and 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4-2 'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Previamente, se han incorporado los BNA de a-L- metilenoxi (4'-CH2-O-2') en oligonucleótidos antisentido que mostraron actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2‘) BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O- N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2‘) BNA, y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2‘) BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2‘) BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2‘) BNA, (I) carbocíclico de metilo (4'-CH2-CH(CH3)-2‘) BNA, (J) carbocíclico de propileno (4'-(CH2)3-2‘) BNA y (K) vinil BNA como se representa a continuación:
imagen6
en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-
C12 .
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
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en la que:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
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en la que:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jdy Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1- C6 sustituido y X es O o NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
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en la que:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo
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de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
imagen10
en la que:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qcy qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2- C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6
sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1 -C6o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
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en la que:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qey qfson cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12sustituido, alcoxi C1- C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJ C(=O)Jj, O-C(=O)- JjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk
o qey q fjuntos son = C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y la preparación de los monómeros metilenoxi(4-CH2 -O-21) BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos
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también se ha descrito en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4-CH2-O-21) BNA y 2-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222).También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226) Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad conformacionalmente restringido (Singh et al, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2-amino- y 2-metilamino-BNA y se ha informado anteriormente de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas de ARN y ADN complementarias.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
imagen12
en la que:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Tay Tbson cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2- C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk,
N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qkjuntos son =C(qg)(qh), en donde qgy qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' ( Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4-2' " o "nucleósido bicíclico de 41 a 21 11 se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 21 y el átomo de carbono 41 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o análogo de la fracción de azúcar, de un nucleósido se puede modificar o sustituir en cualquier posición.
Como se usa en la presente, "azúcar modificado en 21 " significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2’. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, incluyendo, pero no limitado a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 21 se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no están limitados a: O[(CH2)nO]mCHs, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCHs, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CHs, and O(CH2)nON[(CH2)nCHs]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 21 también se pueden seleccionar de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O- aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2-MOE (Baker et
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al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000.). Se ha descrito que dicha sustitución de 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'- O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para el uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido en el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto del azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitados a, lo que en la técnica es referido como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
imagen13
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar se seleccionan teniendo la Fórmula VII:
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en la que independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tbson cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que liga el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tbes un grupo de enlace internucleosídico que liga el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado ligado o un grupo terminal 5' o 3';
q-i, q2, q3, q4, q5, q6y q 7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y
R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J-i, OC(=X)NJj2, NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1 -C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados de fórmula VII en la que q1, q2, q3, q4, q5, q6y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP de fórmula VII en la que uno de R 1 y R 2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; Patentes U.S. 5.698.685 ; 5.166.315 ; 5.185.444 ; y 5.034.506 ). Como se usa en la presente, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la fórmula siguiente:
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En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. Tales sustitutos de azúcar son referidos en la presente como morfolinos modificados.
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (ver Solicitud internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2-bis sustituidos divulgados) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S y la sustitución adicional en la posición 21 (ver Solicitud de Patente U.S. publicadaUS2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la 5-sustitución de un ácido nucleico bicíclico (ver Solicitud internacional de PCT WO 2007/134181, publicada el 22 de noviembre del 2007 en donde un nucleósido bicíclico 4-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 51 con un grupo 5-metilo o 5-vinilo). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no están limitados a, los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, la Solicitud de PCT de propiedad conjunta publicada WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, f61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001,29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001,66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001,20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud de PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud de PCT publicada WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen Fórmula X.
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en la que independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
T3y T4son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo con un compuesto antisentido o uno de T3y T4es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano con un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado ligado, o un grupo 51 o 3-terminal; y
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6sustituido,
alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en la presente, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 21 distinta de H u OH. Los nucleósidos 2-modificados incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo
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de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con 2'-substituyentess sin puente, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(Ch2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, o O-CH2-C(=O)- N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2'-modificados 'pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "2'-OMe" o "2-OCH3" o "2'-O-metilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2'-MOE" o "2-OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos ligados. En ciertas realizaciones, se modifican uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillo sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Dichos sistemas de anillos pueden someterse a varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas patentes U.S. representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen sin limitación, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio del 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre del 2005.
En los nucleótidos que tienen fracciones de azúcares modificados, las fracciones de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcares modificados. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O- 2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
Compuestos Antisentido Conjugados
Los compuestos antisentido se pueden ligar covalentemente a una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que están generalmente unidos a uno o a ambos extremos terminales de compuestos antisentido para mejorar propiedades como, por ejemplo, estabilidad de nucleasas. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de tapón. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasas, y pueden ayudar a la administración y/o localización dentro de una célula. El tapón puede estar presente en el extremo 5'-terminal (tapón 5), o en el 3'-terminal (tapón 3'), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Las estructuras de tapón son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapones desoxi abásicas invertidas. Grupos 3' y 5' estabilizadores adicionales que pueden usarse para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad a nucleasas incluyen los divulgados en la WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003 .
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo, pero no limitados a, aquellos particularmente adecuados para usar como ARNmc, se modifican por la unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido unido, incluyendo, pero no
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limitado a, farmacodinamia, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y depuración. Los grupos conjugados se usan rutinariamente en las técnicas químicas y se ligan directamente o a través de una fracción de enlace conjugada opcional o grupo de enlace conjugado a un compuesto inicial como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, fracciones de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Ciertos grupos conjugados se han descrito anteriormente, por ejemplo: fracción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de do-decan-diol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o de polietilenglicol Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético ((Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una fracción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke etal., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Para conjugados adicionales incluyendo aquellos útiles para ARNmc y su colocación dentro de compuestos antisentido, ver, por ejemplo, Solicitud US N°; 61/583.963.
Composiciones y Métodos para Formular Composiciones Farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, incluyendo, pero no limitados a, vía de administración, extensión de la enfermedad, o dosis a administrar.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). El PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, en una realización, se emplea en los métodos descritos en la presente una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MALAT-1 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Tratamiento del Cáncer
En varias realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente son útiles para el tratamiento del cáncer en un animal. Los ejemplos de ciertos tipos de cánceres que pueden tratarse con los compuestos antisentido descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, cáncer de colon, cáncer intestinal, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de hígado y/o cáncer de próstata.
Como se usan en la presente, los términos "células tumorales", "células cancerosas", "células malignas" y "células neoplásicas" se usan de manera intercambiable y no requieren una distinción particular en cuanto a la extensión o grado de transformación o malignidad con respecto a una "célula normal". En consecuencia, "células tumorales", "células cancerosas" y "células neoplásicas" son células transformadas y/o malignas, mientras que las "células normales" no se transforman y/o no son malignas.
El término "tratar el cáncer" se refiere a realizar acciones que llevan a la mejora del cáncer o de los síntomas acompañados con él en gran medida. La combinación de dichas acciones está abarcada por el término "tratamiento". La mejora de un cáncer incluye, pero no está limitada a, reducir el número de células cancerosas en un animal o reducir el número de células cancerosas en un sitio específico en el cuerpo de un animal. Dicho tratamiento, como se usa en la presente, también incluye una restauración completa de la salud con respecto a los cánceres referidos en la presente. Debe entenderse que el tratamiento según se usa de acuerdo con las realizaciones proporcionadas en la presente puede no ser eficaz en todos los sujetos a tratar. Sin embargo, una parte estadísticamente significativa de sujetos que padecen un cáncer referido en la presente puede tratarse con éxito. Si una parte es estadísticamente significativa puede determinarse sin un experto en la técnica usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc.
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El término "administración" o "administrar" incluye vías de introducir un inhibidor específico de MALAT-1 a un animal para realizar su función prevista. Un ejemplo de una vía de administración que puede usarse incluye, pero no está limitado a, administración parenteral, como inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal o intracraneal.
Cuando un inhibidor específico de MALAT-1 se administra por vía parenteral, como por inyección subcutánea o intravenosa u otra inyección, puede estar en la forma de una solución o suspensión acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. Las suspensiones pueden formularse usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. Las composiciones para inyección pueden contener un vehículo como agua, solución salina (por ejemplo, solución salina fisiológicamente tamponada) u otros vehículos isotónicos como solución isotónica de cloruro de sodio, solución de Ringer, solución de dextrosa u otros vehículos conocidos en la técnica.
Como se usa en la presente, el término "tratamiento del cáncer" o "tratar el cáncer" puede describirse por una serie de parámetros diferentes que incluyen, pero no limitados a, reducción en el tamaño de un tumor en un animal que tiene cáncer, reducción en el crecimiento o proliferación de un tumor en un animal que tiene cáncer, prevención de metástasis o reducción del alcance de la metástasis, y/o ampliación de la supervivencia de un animal que tiene cáncer en comparación con el control. En el contexto del cáncer de colon, el tratamiento del cáncer de colon también puede medirse mediante una reducción en el número de pólipos en el colon de un animal que tiene cáncer de colon. En varias realizaciones, el cáncer puede ser un cáncer primario.
Se perfilan varias realizaciones de métodos para reducir el volumen o el número de tumores en un animal que comprenden administrar un inhibidor específico de MALAT-1 al animal. En varios aspectos de tales realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 puede ser un compuesto antisentido que reduce la expresión de MALAT-1. Se entenderá que cualquiera de los inhibidores específicos de MALAT-1 descritos en la presente puede usarse en realizaciones relacionadas con los métodos para reducir el volumen o el número de tumores en un animal. Además, cualquier compuesto antisentido dirigido a MALAT-1 como se describe en la presente puede usarse en métodos para reducir el volumen o el número de tumores en un animal. Por ejemplo, un compuesto antisentido útil para reducir el volumen tumoral puede incluir un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1. En varias realizaciones, el volumen tumoral puede referirse al volumen de un tumor primario.
Se perfilan varias realizaciones de los métodos para inhibir el crecimiento o la proliferación tumoral en un animal que comprenden administrar un inhibidor específico de MALAT-1 al animal. En varios aspectos, el crecimiento o proliferación de un tumor primario se puede inhibir administrando un inhibidor específico de MALAT-1 al animal. En varios aspectos de tales realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 puede ser un compuesto antisentido que reduce la expresión de MALAT-1. Se entenderá que cualquiera de los inhibidores específicos de MALAT-1 descritos en la presente puede usarse en realizaciones relacionadas con los métodos para inhibir el crecimiento o la proliferación tumoral en un animal. Además, cualquier compuesto antisentido dirigido a MALAT-1 como se describe en la presente puede usarse en métodos para inhibir el crecimiento o la proliferación tumoral en un animal. Por ejemplo, un compuesto antisentido útil para inhibir el crecimiento o proliferación tumoral puede incluir un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT 1.
Se perfilan ciertas realizaciones para métodos para inhibir metástasis de cáncer en un animal que comprenden administrar un inhibidor específico de MALAT-1 al animal. En varios aspectos de tales realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 puede ser un compuesto antisentido que reduce la expresión de MALAT-1. Se entenderá que cualquiera de los inhibidores específicos de MALAT-1 descritos en la presente puede usarse en realizaciones relacionadas con métodos para inhibir metástasis de cáncer en un animal. Además, cualquier compuesto antisentido dirigido a MALAT-1 como se describe en la presente se puede usar en métodos de inhibición de metástasis de cáncer en un animal. Por ejemplo, un compuesto antisentido útil para inhibir metástasis de cáncer puede incluir un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado es por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT 1.
Se perfilan varias realizaciones de métodos para aumentar la supervivencia de un animal que tiene cáncer que comprenden administrar un inhibidor específico de MALAT-1 al animal. En varios aspectos de tales realizaciones, el inhibidor específico de MALAT-1 puede ser un compuesto antisentido que reduce la expresión de MALAT-1. Se entenderá que cualquiera de los inhibidores específicos de MALAT-1 descritos en la presente se puede usar en realizaciones relacionadas con métodos para aumentar la supervivencia de un animal que tiene cáncer. Además, cualquier compuesto antisentido dirigido a MALAT-1 como se describe en la presente puede usarse en métodos para aumentar la supervivencia de un animal que tiene cáncer. Por ejemplo, un compuesto antisentido útil para aumentar la supervivencia en un animal que tiene cáncer puede incluir un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos, en donde el oligonucleótido modificado es por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT 1.
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Ciertas realizaciones están dirigidas al uso de un inhibidor específico de MALAT-1 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer. En varios aspectos, el cáncer puede ser un cáncer primario. Se entenderá que cualquiera de los inhibidores específicos de MALAT-1 descritos en la presente puede usarse en realizaciones relacionadas con el uso de tales inhibidores en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer. En algunos aspectos, el inhibidor específico de MALAT-1 puede comprender un compuesto que incluye un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1. También se entenderá que los inhibidores específicos de MALAT-1 pueden usarse en la fabricación de un medicamento para reducir el volumen o el número de tumores, inhibir el crecimiento o la proliferación tumoral, inhibir la metástasis del cáncer, y/o aumentar la supervivencia de un animal que tiene cáncer.
De manera similar, varias realizaciones se refieren a un inhibidor específico de MALAT-1 para su uso en el tratamiento del cáncer. En varios aspectos, el cáncer puede ser un cáncer primario. Se entenderá que cualquiera de los inhibidores específicos de MALAT-1 descritos en la presente pueden ser para uso en el tratamiento del cáncer. En algunos aspectos, el inhibidor específico de MALAT-1 puede comprender un compuesto que incluye un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados por lo menos un 85% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1. También se entenderá que los inhibidores específicos de MALAT-1 pueden usarse para reducir el volumen o el número de tumores, inhibir el crecimiento o la proliferación tumoral, inhibir la metástasis del cáncer y/o aumentar la supervivencia de un animal que tiene cáncer.
Se pueden proporcionar inhibidores específicos de MALAT-1 de varias realizaciones a un médico administrante u otro profesional del cuidado de la salud en forma de un kit. El kit es un paquete que aloja un recipiente que contiene el inhibidor específico de MALAT-1 en una composición farmacéutica adecuada, y las instrucciones para administrar la composición farmacéutica a un animal. El kit también puede contener dosis separadas de un inhibidor específico de MALAT-1 para administración en serie o secuencial. El kit puede contener dispositivos de administración adecuados, por ejemplo, jeringuillas y similares, junto con instrucciones para administrar el inhibidor específico de MALAT-1. El kit puede contener opcionalmente instrucciones para el almacenamiento, la reconstitución (si corresponde) y la administración. El kit puede incluir una pluralidad de recipientes que reflejan el número de administraciones que se administrarán a un animal.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, actividad o expresión de los ácidos nucleicos de MALAT-1 pueden probarse in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizadas para tales análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del vendedor usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Como un ejemplo, se pueden usar células b.END para probar compuestos antisentido sobre la actividad o expresión de ácidos nucleicos de MALAT-1.
Prueba in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar de forma apropiada para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM del oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos rutinarios. Las células se recogen típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, en cuyo momento se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo por métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la
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media de los tratamientos repetidos.
La concentración de oligonucleótido antisentido usado varía de línea celular a línea celular. Los métodos para determinar la concentración de oligonucleótidos antisentido óptima para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el Reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de niveles o expresión objetivo
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de MALAT-1 se puede analizar de diversas maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real cuantitativa. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es una rutina en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede llevar a cabo convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 comercialmente disponible, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de PCR en Tiempo Real Cuantitativo de los Niveles de ARN Objetivo
La cuantificación de los niveles de ARN objetivo puede realizarse mediante PCR en tiempo real cuantitativa usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR en tiempo real cuantitativa son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. La RT y las reacciones de PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. La RT y los reactivos de PCR en tiempo real se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las cantidades objetivo de genes (o ARN) obtenidas mediante PCR en tiempo real se normalizan usando o el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutando simultáneamente con el objetivo, multiplexación o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico de MALAT-1. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software como el Software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los Niveles de Proteína
La inhibición antisentido de ácidos nucleicos MALAT-1 puede evaluarse midiendo los niveles de proteína de MALAT-1. Los niveles de proteína de MALAT-1 pueden evaluarse o cuantificarse de una variedad de formas bien conocidas en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos de proteínas cuantitativos, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse por métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de MALAT-1 están disponibles comercialmente.
EJEMPLOS
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Habiendo descrito en general realizaciones perfiladas a compuestos y métodos para tratar el cáncer en un animal que incluyen administrar un compuesto antisentido que se dirige a MALAT-1, se puede obtener una comprensión adicional por referencia a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan en la presente solo con fines ilustrativos, y que no se pretende que sean limitativos.
Ejemplo 1: Inhibición antisentido de ARN no codificante de transcritol de adenocarcinoma en pulmón asociado a metástasis murino (MALAT-1) en células b.END
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de MALAT-1 murino se probaron para sus efectos sobre el ARN de MALAT-1 in vitro. Las células b.END cultivadas se colocaron en placas a una densidad de 4.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de Citofectina con concentraciones de 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25,0 nM, 50,0 nM o 100,0 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 1. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARN de MALAT-1 mediante PCR en tiempo real cuantitativa.
El ISIS 395251 (CCAGGCTGGTTATGACTCAG; SEQ ID NO: 13), dirigido a la secuencia del gen de MALAT-1 murino, SEQ ID NO: 10 (N° de acceso GENBANK NR_002847.2) en el sitio de inicio 3338; el ISIS 399462 (GGGTCAGCTGCCAATGCTAG; SEQ ID NO: 14), dirigido a la SEQ ID NO: 10 en el sitio de inicio 1280; y el ISIS 399479 (CGGTGCAAGGCTTAGGAATT; SEQ ID NO: 15) dirigido a la SEQ ID NO: 10 en el sitio de inicio 4004, eran tres de los oligonucleótidos antisentido probados en el ensayo. El ISIS 395251 también tiene reactividad cruzada con la secuencia del gen de MALAT-1 humano (N° de acceso GENBANK NR_00819.2, SEQ ID NO:: 7) en el sitio de inicio 4897. Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron como gapmers 5-10-5 MOE, y son de 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en todo el gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en todo el gapmer son 5- metilcitosinas. La concentración inhibitoria media máxima (IC50) de cada oligonucleótido se presenta también en la Tabla 1. Como se ilustra en la Tabla 1, los niveles de ARN de MALAT-1 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 1
Inhibición dependiente de la dosis de ARN de MALAT-1 en células b.END
ISIS N°
3.125 nM 6.25 nM 12.5 nM 25.0 nM 50.0 nM 100.0 nM IC50 (nM)
399479
14 31 55 71 84 91 12.6
399462
20 36 50 68 81 92 12.3
395251
23 45 57 66 85 90 10.1
Ejemplo 2: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón ApcMin
La ApcMin (Min, neoplasia intestinal múltiple) es una mutación puntual en el homólogo murino del gen APC. Los ratones Min/+ desarrollan adenomas intestinales y se consideran un modelo estándar que refleja la condición humana (Moser, A.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 8977, 1993). El efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido en la carga de pólipos de intestino delgado se examinó en ratones ApcMin.
Tratamiento
Se dividieron aleatoriamente ratones ApcMin de 9 semanas de edad en tres grupos de tratamiento de 4 ratones cada uno. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 399479 (SEQ ID NO: 15), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 4 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de oligonucleótido de control, ISIS 141923 (5'-CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC-3 ', un gapmer 5-10-5 MOE, designado en la presente como SEQ ID NO: 16, que no tiene homología conocida con ningún gen de ratón), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 4 semanas. El tercer grupo se inyectó con PBS, administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 4 semanas. El día 28, los ratones se sacrificaron con isoflurano seguido de una dislocación cervical. El intestino delgado, los colones y el tejido hepático se recogieron y procesaron para su posterior análisis.
Análisis de ARN
El aislamiento del ARN se realizó usando el Kit de Purificación de ARN Total Invitrogen PureLink™, de
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15
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acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizó RT-PCR usando el sistema Step One Plus de Applied Biosystems. La expresión de ARN de MALAT-1 se midió usando el conjunto de sonda de cebador mMALAT1#2 (secuencia directa TGGGTTAGAGAAGGCGTGTACTG, designada en la presente como SEQ ID NO: 17, secuencia inversa TCAGCGGCAACTGGGAAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 18, secuencia de sonda CGTTGGCACGACACCTTCAGGGACT, designada en la presente como SEQ ID NO: 19) y se normalizó a la expresión de ARNm de ciclofilina. La sonda de cebador establecida para ciclofilina fue m_Cyclo24 (secuencia directa TCGCCGCTTGCTGCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 20, secuencia inversa ATCGGCCGTGATGTCGA, designada en la presente como SEQ ID NO: 21, secuencia de sonda CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 22).
La expresión de ARN de MALAT-1 se evaluó en el hígado y los intestinos. Como se muestra en la Tabla 2, la expresión de ARN de MALAT-1 en ratones tratados con ISIS 399479 se inhibió significativamente en comparación con el grupo tratado con oligonucleótido de control. Los niveles de expresión de ARNm se expresan como porcentaje de inhibición de los niveles de expresión en comparación con el control de PBS.
Tabla 2
Porcentaje de inhibición de los niveles de ARN de MALAT-1 (%) en comparación con el control de PBS
ISIS 399479 ISIS 141923
Hígado
98 0
Intestinos
94 6
Análisis de proliferación celular
El ensayo de proliferación celular BrdU (Rothaeusler, K. y Baumgarth, N. Curr. Protoc. Cytom. 2007. Capítulo 7: Unidad 7.31) detecta 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) incorporada en el ADN celular durante la proliferación celular. La cantidad de BrdU incorporada en las células es un indicador directo de la proliferación celular y se midió usando un anticuerpo anti-BrdU (Sigma Aldrich).
El BrdU, a una concentración de 50 mg/kg, se inyectó por vía intraperitoneal durante 5 días consecutivos comenzando en el día 24. Los animales se sacrificaron el día 28. Todo el intestino delgado de cada animal se hizo en un "rollo suizo", una técnica estándar para estudios histológicos de intestino de roedor (Moolenbeek, C. y Ruitenberg, E.J. Lab Anim. 1981. 15: 57-9). Se extirparon dos secciones del intestino separadas por lo menos 500 |jm de cada rodillo. Las células tumorales BrdU positivas se midieron de todos los pólipos en ambas secciones.
Los resultados se presentan en la Tabla 3, como el porcentaje de células BrdU positivas detectadas. Como se muestra en la Tabla 3 hubo una disminución en el porcentaje de células positivas en los ratones tratados con ISIS 399479 en comparación con el control. Este resultado se corresponde con la reducción en la expresión de MALAT-1, medida usando el software ViewRNA y como se muestra en la Tabla 4. Los datos se presentan como la densidad de señal de los niveles de expresión de ARNm de MALAT-1 multiplicados por las células BrdU positivas totales, presentadas en unidades arbitrarias .
Por lo tanto, el tratamiento de ratones ApcMin con oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 muestra una disminución en la proliferación de células tumorales en comparación con el grupo control.
Tabla 3
Células BrdU positivas (%) en ratones ApcMin
%
ISIS 399479
23
ISIS 141923
51
PBS
48
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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55
60
65
Niveles de expresión de MALAT-1 en ratones ApcMin (densidad de señal de los niveles de expresión de ARNm de MALAT-1 multiplicados por el total de células BrdU positivas presentadas como unidades arbitrarias (a.u.))
a.u.
ISIS 399479
9.6
ISIS 141923
16.2
Medición de la carga de pólipos tumorales
El intestino delgado completo de cada animal se hizo en un "rollo suizo" y se procesó para inclusión en parafina. Se recogieron dos secciones del intestino separadas por al menos 500 |jm de cada rollo. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se contó el número de pólipos en ambas secciones, y luego se dividió por dos. Como se muestra en la Tabla 5, la carga de pólipos tumorales disminuyó en ratones ApcMin tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 en comparación con el grupo de oligonucleótidos de control.
Tabla 5
Carga de pólipos tumorales en ratones ApcMin
Pólipos/animal
ISIS 399479
1.6
ISIS 141923
4.5
PBS
5.8
Ejemplo 3: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón de carcinoma hepatocelular inducido por DEN
La dietil nitrosamina (DEN) es un carcinógeno químico estándar para inducir carcinoma hepatocelular (HCC) en roedores (Park, D.H. et al., Toxicol. Lett. 2009. 191:321-6). En este modelo se examinó el efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido sobre el desarrollo y la progresión de HCC.
Tratamiento
A ratones machos C57BL/6, de 2 semanas de edad, se les dio 25 mg/ml de DEN por inyección intraperitoneal para inducir el desarrollo de HCC. Cinco meses después de la inyección de DEN, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento recibió 50 mg/kg de ISIS 399479, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 16 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de oligonucleótido de control, ISIS 141923, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 16 semanas. El tercer grupo se inyectó con PBS, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 16 semanas. Los ratones se sacrificaron el día 111 (el primer tratamiento con oligonucleótidos se contó como el día 1). Se contaron los HCC inducidos por DEN en la superficie del hígado y se recogieron y procesaron para análisis posterior.
Análisis de ARN
Se aisló ARN de cada HCC usando un kit de extracción de ARN de Qiagen. La expresión de ARN de MALAT-1 se midió mediante qPCR usando el conjunto de sonda de cebador mMALAT1#2 y se normalizó a la expresión de ARNm de ciclofilina.
La expresión de ARN de MALAT-1 en ratones tratados con ISIS 399479 se inhibió significativamente en un 94% en comparación con el grupo tratado con PBS.
Medición de carga tumoral
Los tumores de la superficie del hígado en ratones de todos los grupos se contaron al final del experimento. Como se muestra en la Tabla 6, el número de tumores disminuyó significativamente en ratones tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 en comparación con el grupo de PBS (p=0,017) o el
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grupo de oligonucleótidos de control (p=0,02).
Número de tumores en el modelo de ratón de HCC inducido por DEN
Grupos de tratamiento
Tumores/ratón
ISIS 399479
1.9
ISIS 141923
4.0
PBS
4.3
Ejemplo 4: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón de xenoinjerto C26
Se examinó el efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido sobre la progresión de HCC en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon C26 murino.
Tratamiento
Se cultivaron células de carcinoma de colon C26 en medio RPMI que contenía suero bovino fetal a una concentración final del 10%, y con 5% de CO2 a 37° C. Se implantaron por vía subcutánea cinco millones de células en ratones CD2F1 macho.
Cuatro días después de la implantación tumoral, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 399462 (SEQ ID NO: 14), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 395251 (SEQ ID NO: 13), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. El tercer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de oligonucleótido de control, ISIS 347526 (TCTTATGTTTCCGAACCGTT; gapmer 5-10-5 MOE sin objetivo murino o humano conocido) (SEQ ID NO: 23) administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. Los ratones se sacrificaron el día 26. Se recogieron los tejidos del hígado y del tumor y se procesaron para un análisis posterior. Los datos presentados son la media de 2 experimentos independientes con resultados similares.
Análisis de ARN
La extracción de ARN y los análisis se realizaron utilizando un kit de extracción de ARN de Qiagen. La expresión de ARN de MALAT-1 se midió usando el conjunto de sonda de cebador mMALAT1 (secuencia directa GTAGGTTAAGTTGACGGCCGTTA, designada en la presente como SEQ ID NO: 24, secuencia inversa ATCTTCCCTGTTTCCAACTCATG, designada en la presente como SEQ ID NO: 25, secuencia de sonda AAAAATCCTTCGACTGGCGCATGTACG, designada en la presente como SEQ ID NO:: 26) y se normalizó a la expresión de ARNm de ciclofilina.
La expresión del ARN de MALAT-1 se evaluó en el hígado. Como se muestra en la Tabla 7, la expresión del ARN de MALAT-1 en ratones tratados con ISIS 395251 o ISIS 399462 se inhibió en comparación con el grupo tratado con oligonucleótido de control. Los niveles de expresión de ARNm se expresan como porcentaje de inhibición de los niveles de expresión en comparación con el del grupo control (normalizado al 0%).
Tabla 7
Porcentaje de inhibición de los niveles de ARN de MALAT-1 (%) en comparación con el control de PBS
% de inhibición
ISIS 395251
57
ISIS 399462
71
Medición del peso y del volumen tumorales
Los volúmenes tumorales se midieron de forma regular durante todo el período del estudio, usando calibres Vernier. Como se muestra en la Tabla 8, los volúmenes tumorales se redujeron significativamente en ratones tratados con ISIS 395251 o ISIS 399462.
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El peso del tumor en cada ratón de todos los grupos también se evaluó el día 26. Tal como se muestra en la Tabla 9, el peso tumoral disminuyó en ratones tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 en comparación con el del grupo de oligonucleotídico de control. Estos resultados demuestran que los oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 redujeron el crecimiento de cáncer de colon.
Tabla 8
Volumen tumoral (mm 3) en el modelo de xenoinjerto C26
ISIS N°
día 8 día 11 día 14 día 19 día 22 día 25
399462
406 615 960 1365 1802 2275
395251
341 501 877 1480 1635 1641
347526
408 803 1493 2437 2647 3405
Tabla 9
Peso tumoral en el modelo de xenoinjerto C26
ISIS N°
Peso (gramos)
395251
1.6
399462
1.7
347526
2.6
Ejemplo 5: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón ortotópico de hígado Hep3B
Un modelo tumoral de xenoinjerto ortotópico de carcinoma hepatocelular creado por inyección de células Hep3B directamente en el parénquima del hígado de ratones desnudos es un modelo estándar para estudiar HCC (Yao, X. et al., Clin. Cancer Res. 2003. 9: 2719). El efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido sobre la supervivencia animal se examinó en el modelo ortotópico de hígado Hep3B.
Tratamiento
La línea celular de HCC humano Hep3B se adquirió de ATCC. Se mantuvieron células Hep3B se mantuvieron en medio MEM que contenía suero bovino fetal a una concentración final del 10%, y con 5% de CO2 a 37° C. Se recogieron células Hep3B que crecían exponencialmente mediante tratamiento con tripsina-EDTA (Gibco- BRL) y se lavaron una vez con PBS. El sedimento celular se suspendió en PBS y se mantuvo en hielo antes de la inyección intrahepática en ratones.
Se anestesiaron ratones desnudos atímicos BALB/c hembra (nu/nu) de 4 a 6 semanas de edad con isoflurano. Se hizo una pequeña incisión transversal debajo del esternón para exponer el hígado. Se inyectó lentamente una suspensión PBS de 2 x 106 células Hep3B en el lóbulo superior izquierdo del hígado usando una aguja de calibre 28. Las células se inyectaron en un ángulo de 30 grados en el hígado. Después de la inyección, se colocó una pequeña pieza de gasa estéril en el lugar de la inyección y se aplicó presión ligera durante 1 minuto para evitar el sangrado. El abdomen se cerró luego con una sutura de seda 6-0. Se permitió que los ratones se recuperasen en una jaula caliente.
Después de 10 días, se analizó el nivel de expresión de alfa-fetoproteína (AFP), que se usó como un marcador positivo de crecimiento tumoral en los ratones. Los ratones que dieron positivo para el marcador se dividieron aleatoriamente en dos grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 395251 (SEQ ID NO: 13), administrado por vía intraperitoneal 2 días a la semana durante 7 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de oligonucleótido control, ISIS 347526 (SEQ ID NO: 23) administrado por vía intraperitoneal 2 días a la semana durante 7 semanas.
Supervivencia mediana
Cada grupo fue monitorizado y se registraron las muertes. Al final del estudio, se calculó la supervivencia mediana de cada grupo usando la fórmula estadística de Kaplan-Meier y los datos se presentan en la Tabla 10. Como se muestra en la Tabla 10, la supervivencia mediana aumentó significativamente en ratones tratados con ISIS
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395251 en comparación con el grupo de control. Estos datos demuestran que los oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 aumentan la supervivencia de los animales que tienen cáncer.
Tabla 10
Supervivencia mediana en el modelo ortotópico de hígado Hep3B
ISIS N°
días
395251
88
347526
49
Ejemplo 6: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón de xenoinjerto EBC-1 metastásico
El efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido sobre la metástasis se examinó en un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de pulmón EBC-1.
Tratamiento
La línea celular humana EBC-1 se adquirió de Health Sciences Foundation, Japón. Se mantuvieron células EBC-1 en medio RPMI que contenía suero bovino fetal a una concentración final del 10%, y con 5% de CO2 a 37° C. Se recogieron las células EBC-1 que crecían exponencialmente mediante tripsina-EDTA (Gibco-BRL) y se lavaron una vez con PBS. El sedimento celular se suspendió en PBS y se implantaron un millón de células mediante inyección subcutánea en ratones desnudos BALB/c.
Dos semanas después de la implantación del tumor humano EBC-1, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg 5 días a la semana de ISIS 395251 (SEQ ID NO: 13), administrado por vía subcutánea durante 5 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg 5 días a la semana de oligonucleótido de control, ISIS 347526 (SEQ ID NO: 23) administrado por vía subcutánea durante 5 semanas. En la semana 7, se extirpó quirúrgicamente el tumor subcutáneo y la herida se cerró con una sutura 4-0. Los ratones se sacrificaron en la semana 12 después del inicio del tratamiento con oligonucleótidos antisentido. El tejido pulmonar se recolectó y procesó para un análisis adicional. Los datos presentados son la media de 3 experimentos independientes con resultados similares.
Medición del volumen del tumor primario y la multiplicidad de tumores pulmonares
A lo largo del período de estudio se midieron los volúmenes tumorales primarios, usando calibres Vernier. Como se muestra en la Tabla 11, en la semana 7 justo antes de la extracción del xenoinjerto, los volúmenes del tumor disminuyeron significativamente en los ratones tratados con ISIS 395251 en comparación con el grupo control (p=0,00006).
La multiplicidad de tumores también se contó usando un microscopio de luz. Como se muestra en la Tabla 12, la multiplicidad de tumores disminuyó en ratones tratados con ISIS 395251 en comparación con el control. Estos datos demuestran que los oligonucleótidos antisentido dirigidos a MALAT-1 inhiben la metástasis.
Tabla 11
Volumen tumoral en el modelo de xenoinjerto EBC-1
ISIS N°
Volumen (mm3)
395251
1755
347526
2838
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Multiplicidad de tumores en el modelo de xenoinjerto EBC- 1
ISIS N°
Recuento de tumores
395251
68
347526
167
Ejemplo 7: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en el modelo de ratón TRAMP
El adenocarcinoma transgénico del modelo de próstata de ratón (TRAMP) refleja estrechamente la patogénesis del cáncer de próstata humano (Hurwitz, A.A. et al., Curr. Protoc. Immunol. 2001. Capítulo 20: Unidad 20.5). El efecto de la inhibición de la expresión del ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido en la progresión tumoral se examinó en ratones TRAMP.
Tratamiento
Se dividieron aleatoriamente ratones TRAMP de 23 semanas de edad en dos grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 395251 (SEQ ID NO: 13), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con PBS administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. Los ratones se sacrificaron al final de las 26 semanas. El tejido de la próstata se recogió y procesó para análisis adicional.
Análisis de ARN
La extracción de ARN se realizó usando un kit de extracción de ARN de Qiagen. La expresión de ARN de MALAT-1 se midió usando el conjunto de sonda de cebador mMALAT1 y se normalizó a la expresión de ARNm de ciclofilina.
Se evaluó en el tumor la expresión de ARN de MALAT-1. La expresión de ARN de MALAT-1 en ratones tratados con ISIS 395251 se inhibió en un 80% en comparación con el grupo de control.
Medición del peso tumoral
El tejido tumoral se extirpó de la próstata. Los pesos tumorales se midieron de forma regular durante todo el período del estudio, usando calibres Vernier. Como se muestra en la Tabla 13, el peso tumoral disminuyó en los ratones tratados con ISIS 395251 en comparación con el grupo de control.
Tabla 13
Peso tumoral en el TRAMP
Peso (gramos)
ISIS 395251
1.0
PBS
9.3
Ejemplo 8: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células no pequeñas derivado de paciente
La biopsia de la masa tumoral se realizó en un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (en la Universidad de California, Davis) y esta se implantó directamente en ratones NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtmlWjl/SzJ macho (NSG; Jackson Laboratories). Después de 2 pases in vivo, las células tumorales del xenoinjerto se depositaron en Jackson Laboratories (designadas en la presente como LG-476 P2). Se examinó el efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido en la progresión tumoral de este tumor en ratones.
Tratamiento
Se implantó a dos ratones NSG con el tumor LG-476 P2 y se monitorizaron tres veces por semana. Una vez que los tumores alcanzaron 1.000 mm3 de volumen, se recogieron los tumores y se fragmentaron do en 3-5 mm3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de tamaño. Cada fragmento se implantó luego subcutáneamente en el flanco trasero derecho de 30 ratones NSG. Los ratones se observaron tres veces por semana y una vez que los tumores alcanzaron 200-250 mm3 de tamaño, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 395251 (SEQ ID NO: 13), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con PBS administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3 semanas. Los ratones se sacrificaron por inhalación de CO2 24 horas después de la última dosis. El tejido tumoral se recogió y procesó para análisis adicional.
Análisis de ARN
La extracción de ARN se realizó usando un kit de extracción de ARN de Qiagen. La expresión de ARN de MALAT-1 se midió usando el conjunto de sonda de cebador RTS2736 y se normalizó a la expresión de ARNm de ciclofilina.
Se evaluó la expresión del ARN MALAT-1 en el tumor. La expresión de ARN de MALAT-1 en ratones tratados con ISIS 395251 se inhibió en un 76% en comparación con el grupo de control.
Medición del volumen tumoral
Los volúmenes tumorales se midieron de forma regular durante todo el período del estudio, usando calibres Vernier. Como se muestra en la Tabla 14, los volúmenes tumorales disminuyeron en los ratones tratados con ISIS 395251 en comparación con el grupo control.
Tabla 14
Volumen tumoral (mm3) en diferentes días en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón de células pequeñas
Día 1 Día 3 Día 6 Día 8 Día 10 Día 13 Día 15 Día 17 Día 20
ISIS 395251
227 376 391 448 529 681 661 747 715
PBS
225 314 384 494 568 696 917 1047 2049
Ejemplo 9: Efecto de la inhibición antisentido de MALAT-1 en un modelo de ratón de xenoinjerto Colo201
El efecto de la inhibición de la expresión de ARN de MALAT-1 con oligonucleótidos antisentido sobre la progresión tumoral se examinó en el modelo de ratón de xenoinjerto Colo201.
Tratamiento
Se adquirió la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano Colo201 de ATCC. Se mantuvieron células Colo201 en medio RPMI que contenía suero bovino fetal a una concentración final del 10%, y con 5% de CO2 a 37° C. Se recogieron células Colo201 que crecían exponencialmente mediante tripsina-EDTA (Gibco-BRL) y se lavaron una vez con PBS. El sedimento celular se suspendió en PBS y se mantuvo en hielo antes de la inyección intrahepática en ratones desnudos BALB/c hembra.
Cuatro días después de la implantación del tumor, los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento. El primer grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 395251 (SEQ ID NO: 13), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3,5 semanas. El segundo grupo de tratamiento se inyectó con 50 mg/kg de ISIS 347526 (SEQ ID NO: 23), administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3,5 semanas. El tercer grupo se inyectó con PBS administrado por vía subcutánea 5 días a la semana durante 3,5 semanas. Los ratones se sacrificaron el día 29. El tejido tumoral se recogió y se procesó para análisis adicional.
Análisis de ARN
La extracción de ARN se realizó usando un kit de extracción de ARN de Qiagen. La expresión de ARN de MALAT-1 se midió usando el conjunto de sonda de cebador RTS2736 y se normalizó a la expresión de ARNm de ciclofilina.
Se evaluó en el hígado la expresión del ARN de MALAT-1. La expresión de ARN de MALAT-1 en ratones tratados con ISIS 395251 se inhibió en un 39% en comparación con el grupo de control.
Medición del volumen del tumoral
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los volúmenes tumorales se midieron de forma regular durante todo el período del estudio, usando calibres Vernier. Como se muestra en la Tabla 15, los volúmenes tumorales disminuyeron en ratones tratados con ISIS 395251 en comparación con el grupo de control.
Tabla 15
Volumen tumoral en días diferentes en el modelo de xenoinjerto de cáncer Colo201
Día 4 Día 7 Día 10 Día 15 Día 18 Día 21 Día 24 Día 29
ISIS 395251
138 132 186 207 241 247 288 341
ISIS 347526
148 156 209 238 354 439 428 476
PBS
159 142 184 240 373 393 404 495
LISTADO DE SECUENCIAS
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<150> 61/579,343 <151> 2011-12-22
<160> 29
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1 <211 > 8708 <212> ADN <213> Homo sapien
<400> 1

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un oligonucleótido antisentido para su uso en un método para tratar un animal que tiene cáncer, en donde el cáncer es un cáncer primario, y en donde el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos ligados que tiene una secuencia de nucleobases por lo menos un 85% complementaria al ácido nucleico Transcrito-1 de Adenocarcinoma en Pulmón Asociado a Metástasis (MALAT-1) y en donde el compuesto antisentido reduce la expresión de MALAT-1.
  2. 2. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico de MALAT-1 es un ácido nucleico de MALAT-1 humano.
  3. 3. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico de MALAT-1 humano tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
  4. 4. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el oligonucleótido modificado es un 100% complementario a un ácido nucleico de MALAT-1 humano.
  5. 5. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el oligonucleótido antisentido inhibe el crecimiento del cáncer primario.
  6. 6. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el cáncer primario es cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, o cáncer intestinal.
  7. 7. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido de cadena sencilla.
  8. 8. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, opcionalmente en el que el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
  9. 9. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado.
  10. 10. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el azúcar modificado es un azúcar bicíclico, opcionalmente en el que el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CHCH3)-O-2', 4'-(CH2)-O-2', o 4'-(CH2)2-O-2'.
  11. 11. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.
  12. 12. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que por lo menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.
  13. 13. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
  14. 14. El oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
    un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos unidos; un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos unidos; y
    un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos unidos, en el que el segmento de hueco está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
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