ES2745758T3 - Moduladores del factor B del complemento - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 440, 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453 o 455, en donde el oligonucleótido modificado comprende: un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados; un segmento del ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y un segmento del ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
Description
DESCRIPCIÓN
Moduladores del factor B del complemento
Campo
Las presentes realizaciones se refieren a métodos, compuestos y composiciones para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento administrando un inhibidor específico del factor B del complemento (CFB) a un sujeto.
Antecedentes
El sistema del complemento es parte del sistema inmune innato del huésped implicado en la lisis de células extrañas, mejorar la fagocitosis de antígenos, aglutinar agentes portadores de antígenos, y atraer macrófagos y neutrófilos. El sistema del complemento se divide en tres vías de iniciación, las vías clásica, lectina y alternativa, que convergen en el componente C3 para generar un complejo enzimático conocido como C3 convertasa, que escinde C3 en C3a y C3b. C3b se asocia con la C3 convertasa mediada por CFB y da como resultado la generación de la C5 convertasa, que escinde C5 en C5a y C5b, lo que inicia la vía de ataque a membrana que resulta en la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC) que comprende los componentes C5b, C6, C7. C8, y C9. El complejo de ataque a la membrana (MAC) forma canales transmembrana e interrumpe la bicapa de fosfolípidos de las células objetivo, lo que lleva a la lisis celular.
En el estado homeostático, la vía alternativa se activa continuamente a un nivel de "ralentr bajo como resultado de la activación de la vía alternativa por hidrólisis espontánea de C3 y la producción de C3b, que genera C5 convertasa.
La WO 2004/103288 divulga métodos para tratar, prevenir o reducir el riesgo de abortos espontáneos, especialmente abortos espontáneos recurrentes.
Sumario
El sistema del complemento media la inmunidad innata y desempeña un papel importante en la respuesta inflamatoria normal a la lesión, pero su desregulación puede provocar lesiones graves. La activación de la vía del complemento alternativa más allá de su nivel constitutivo de "ralentí" puede llevar a una hiperactividad sin restricciones y se manifiesta como enfermedades de desregulación del complemento.
La presente invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en las SEQ ID NO: 440, 198, 228, 237, 444,448, 450, 453 o 455, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
La invención también proporciona un compuesto que tiene la fórmula:
, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La invención también proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 598, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 51 que consiste de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 31 que consiste de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 51 y el segmento de ala 3’; en donde el segmento de ala 51 comprende un azúcar 2-O-metoxietilo, azúcar 2-O-metoxietilo y azúcar cEt en la dirección 51 a 3’; en donde el segmento de ala 31 comprende un azúcar cEt, azúcar cEt, y azúcar 2-O-metoxietilo en la dirección 51 a 3’; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
La invención también proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 549, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar cEt; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
La invención también proporciona una composición que comprende un compuesto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en donde el oligonucleótido modificado del compuesto es una sal.
La invención también proporciona un compuesto de la invención o una composición de la invención para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento.
Ciertas realizaciones divulgadas en la presente se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico del factor B del complemento (CFB). Varias realizaciones divulgadas en la presente se refieren a un método para inhibir la expresión de CFB en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento administrando un inhibidor específico de CFB al sujeto. En ciertas realizaciones, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico de CFB al sujeto. En varias realizaciones, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico de CFB al sujeto.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativa. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección usados en la presente son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O (CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo en la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificado 2'-MOE.
"Nucleósido 2'-sustituido" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosilo distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2' sustituidos incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos.
"Sitio objetivo 3 '" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio objetivo 5 '" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro del ±10% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "los compuestos afectaron por lo menos aproximadamente al 70% de inhibición de CFB", está implicado que los niveles de CFB se inhiben dentro de un intervalo del 60% y el 80%.
"Administración" o "administrar" se refiere a las vías de introducción de un compuesto antisentido proporcionado en la presente a un sujeto para realizar su función pretendida. Un ejemplo de una vía de administración que puede usarse incluye, pero no está limitados a, la administración parenteral como inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
"Mejora" se refiere a la disminución de por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. En ciertas realizaciones, la mejora incluye un retraso o una desaceleración en la progresión de uno o más indicadores de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un humano o animal no humano, incluyendo, pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo pero no limitados a , monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y cadena doble como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo en ausencia del compuesto antisentido.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con ácido nucleico objetivo, en donde el resultado o el efecto de la hibridación es o la degradación del objetivo o la ocupación del objetivo con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Complementariedad de base" se refiere a la capacidad para el apareamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertida entre nucleobases correspondientes.
"Fracción de azúcar bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluyendo pero no limitado a un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas de tales realizaciones, el puente conecta el carbono 2’ y el carbono 41 del furanosilo.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" o "nucleósidos BNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 41 y la 21 de la unidad de azúcar del nucleósido, formando de este modo un azúcar bicíclico. Ejemplos de tales azúcar bicíclico incluyen, pero no están limitados a A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (B) p-D-Metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (C) Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-ON(R)-2') LNA y (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA, tal como se representa a continuación.
Como se usa en la presente, los compuestos de LNA incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre las posiciones 41 y 21 del azúcar, en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de - -[C(Ri)(R2)]n-,
C(Ri )=C(R2)-, -C(Ri )=N-, -C(=NRi )-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ri)2-, -S(=O)x- y -N(Ri)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2 -C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(= O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1 -C12 sustituido, o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos puente 4'-2' incluidos en la definición de LNA incluyen, pero no están limitados a, uno de los fórmulas: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- o -C(R1R2)-O-N(R1)-. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de LNA son puentes '-CH2-2 ', 4'-(CH2)2-2',4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' y 4'-CH2-N(R1)-O-2'-, en donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
También se incluyen dentro de la definición de LNA de acuerdo con la invención los LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un puente metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar la fracción de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para el cual se usa el término metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA. Además; en el caso de la fracción de azúcar bicíclica que tiene un grupo puente etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (4 -CH2CH2-O-2 ') LNA. También se incluye en la definición de LNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, como se usa en la presente.
"Estructura de tapa" o "fracción de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"cEt" o "acetato restringido" significa una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Nucleósido de etilo restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Factor B del complemento (CFB)" significa cualquier ácido nucleico o proteína de CFB. "Ácido nucleico de CFB" significa cualquier ácido nucleico que codifique CFB. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de CFB incluye una secuencia de ADN que codifica CFB, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica CFB (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), incluyendo una secuencia de ARN que no codifica proteínas (es decir, no codificante), y una secuencia de ARNm que codifica CFB. "ARNm de c Fb" significa un ARNm que codifica una proteína de c Fb .
"Inhibidor específico de CFB" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión o actividad de ARN de CFB y/o proteína de CFB a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de CFB incluyen ácidos nucleicos (incluyendo los compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas, y otros agentes capaces de inhibir la expresión de ARN de CFB y/o proteína de CFB.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleótidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Compuestos antisentido quiméricos" significa compuestos antisentido que tienen por lo menos 2 regiones químicamente distintas, y cada posición tiene una pluralidad de subunidades.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Comprender', "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Desoxirribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de
sustituyentes.
"Diseñar" o "Diseñado para" se refiere al proceso de diseñar un compuesto oligomérico que híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo, y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y operativas en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no están limitadas a los productos de transcripción y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H está posicionado entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "hueco" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un compuesto antisentido y un objetivo de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no están limitadas a, un oligonucleótido antisentido y un objetivo de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno o afección" significa identificar a un animal al que se le ha diagnosticado la enfermedad, trastorno y/o afección o identificar un animal predispuesto a desarrollar la enfermedad, el trastorno y/o la afección. Tal identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción, bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre los nucleósidos.
Los oligonucleótidos antisentido "alargados" son aquellos que tienen uno o más nucleósidos adicionales en relación con un oligonucleótido antisentido divulgado en la presente.
"Desoxinucleósido enlazado" significa una base de ácido nucleico (A, G, C, T, U) sustituida por desoxirribosa ligada por un éster de fosfato para formar un nucleótido.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace internucleosídico.
"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de
pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificada y/o una nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un fracción de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado, o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un fracción de azúcar natural.
"Modular" se refiere a cambiar o ajustar una característica en una célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, modular el ARNm de CFB puede significar aumentar o disminuir el nivel de ARNm de CFB y/o proteína de CFB en una célula, tejido, órgano u organismo. Un "modulador" efectúa el cambio en la célula, tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de CFB puede ser un modulador que disminuye la cantidad de ARNm de CFB y/o proteína de CFB en una célula, tejido, órgano u organismo.
"Monómero" se refiere a una unidad individual de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido. "Fracción de azúcar natural" significa un fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a una pareja de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o soportan de otra manera la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no está limitado a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla y ácidos nucleicos de cadena doble.
"Nucleobase" significa un fracción de heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejar bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria de la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejar bases con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico objetivo, entonces se considera que la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo es complementaria en esa pareja de nucleobases.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de las nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase ligada a un azúcar.
"Mimético de nucleósidos" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no de furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos enlazados por-N(H)-C(=O)-O- o otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término ligeramente más amplio mimético de nucleósidos, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, nucleobase y/o enlace internucleosídico. En general, se usa un mimético en lugar de azúcar o la combinación de azúcar-enlaces-internucleosídico, y la
nucleobase se mantiene para la hibridación a un objetivo seleccionado.
"Nudeótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que los enlaces internucleosídicos no contienen un átomo de fósforo.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa la administración por inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos activos y una solución acuosa estéril.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Parte" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. "Prevenir" se refiere a retrasar o impedir la aparición, desarrollo o progresión de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Región" se define como una parte del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
Los "segmentos" se definen como regiones más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Efectos secundarios" significa una enfermedad fisiológica y/o afecciones atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de la inyección, anomalías de la prueba de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar general. Por ejemplo, el aumento de los niveles de aminotransferasa en suero puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
Los "sitios", como se usan en la presente, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Retardar la progresión" significa una disminución en el desarrollo de dicha enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o ninguno sobre los ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se
desea una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. Las "condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones bajo las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.
"Sujeto" significa un humano o animal no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Objetivo" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen objetivo" se refiere a un gen que codifica un objetivo.
"Dirigir" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo", "transcripción de ARN objetivo" y "objetivo de ácido nucleico" significan un ácido nucleico capaz de ser atacado por compuestos antisentido.
"Región objetivo" significa una porción de un ácido nucleico objetivo a la que se dirige uno o más compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5 '" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3 '" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección en el animal. En ciertas realizaciones, se pueden administrar una o más composiciones farmacéuticas al animal.
Nucleobases "no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas Realizaciones
Ciertas realizaciones proporcionan métodos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión del Factor B del Complemento (CFB).
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de CFB tiene la secuencia expuesta en el Número de Acceso de GENBANK NMB00K NM_001710.5 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 1), el Número de Acceso de GENBANK NT_007592.15 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 2), el Número de Acceso GENBANK NW _001116486.1 truncado a partir de los nucleótidos 536000 a 545000 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 3), Número de Acceso de GENBANK XM _001113553.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 4), o Número de Acceso de GENBANK NM_008198.2 (incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5).
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende un oligonucleótido modificado que tiene una secuencia de nucleobases que consiste de una cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, por lo menos un azúcar modificado y/o por lo menos una nucleobase modificada.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, por lo menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertas realizaciones, por lo menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico como un grupo 4'-CH(CH3)-O-2', un grupo 4-CH2-O-2', o un grupo 4'-(CH2)2-O-2.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un enlace intemucleosídico modificado como un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende por lo menos una nucleobase modificada como 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los compuestos u oligonucleótidos anteriores comprende:
un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 o 598.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453 o 455, en donde el oligonucleótido modificado comprende
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en el que cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende o consiste de un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, o 455, en donde el oligonucleótido comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende ISIS 588540. En ciertas realizaciones, un compuesto consiste de ISIS 588540. En ciertas realizaciones, ISIS 588540 tiene la siguiente estructura química:
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende o consiste de un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 549, en donde el oligonucleótido modificado comprende
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 51 que consiste de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 31 que consiste de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 51 y el segmento de ala 3’; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar cEt; en el que cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, un compuesto comprende o consiste de un oligonucleótido modificado de cadena sencilla que consiste de 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 598, en donde el oligonucleótido modificado comprende
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 51 que consiste de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 31 que consiste de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 51 y el segmento de ala 3’; en donde el segmento de ala 51 comprende un azúcar 2-O-metoxietilo, azúcar 2-O-metoxietilo y azúcar cEt en la dirección 51 a 3’; en donde el segmento de ala 31 comprende un azúcar cEt, azúcar cEt, y azúcar 2-O-metoxietilo en la dirección 51 a 3’; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99% o un 100%
complementario a un ácido nucleico que codifica CFB.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto u oligonucleótido puede ser de cadena sencilla.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son eficaces en virtud de tener por lo menos uno de un IC50 in vitro de menos de 250 nM, menos de 200 nM, menos de 150 nM, menos de 100 nM, menos de 90 nM, menos de 80 nM, menos de 70 nM, menos de 65 nM, menos de 60 nM, menos de 55 nM, menos de 50 nM, menos de 45 nM, menos de 40 nM, menos de 35 nM, menos de 30 nM, menos de 25 nM, o menos de 20 nM.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son altamente tolerables como se demuestra al tener por lo menos uno de un aumento de un valor de ALT o AST de no más de 4 veces, 3 veces o 2 veces sobre los animales tratados con solución salina o un aumento en el peso del hígado, bazo o riñón de no más del 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% o 2%. En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son altamente tolerables como se demuestra al no tener aumento de ALT o AST sobre animales tratados con solución salina. En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones como se describen en la presente son altamente tolerables como se demuestra al no tener un aumento en el peso del hígado, bazo o riñón sobre animales tratados con solución salina.
Ciertas realizaciones proporcionan una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones anteriormente mencionadas o sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición tiene una viscosidad de menos de aproximadamente 40 centipoise (cP), menos de aproximadamente 30 centipose (cP), menos de aproximadamente 20 centipose (cP), menos de aproximadamente 15 centipose (cP), o menos de aproximadamente 10 centipose (cP). En ciertas realizaciones, la composición que tiene cualquiera de las viscosidades anteriormente mencionadas comprende un compuesto proporcionado en la presente a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 125 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 225 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml, o aproximadamente 300 mg/ml. En ciertas realizaciones, la composición que tiene cualquiera de las viscosidad y/o concentraciones de compuesto mencionadas anteriormente tiene una temperatura de temperatura ambiente o aproximadamente 20° C, aproximadamente 21°C, aproximadamente 22°C, aproximadamente 23°C, aproximadamente 24°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 27°C, aproximadamente 28°C, aproximadamente 29°C, o aproximadamente 30°C.
En ciertas realizaciones, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un inhibidor del Factor B del Complemento (CFB) específico tratando, previniendo o mejorando de este modo la enfermedad. En ciertas realizaciones, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto antisentido dirigido a CFB, como un oligonucleótido antisentido dirigido a CFB. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende por lo menos 8 nucleobases contiguas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobase que comprende o que consiste de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-808. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido modificado que consiste de 10 a 30 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que comprende o que consiste de cualquiera de las SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 y 598. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, o 594430. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 588540, que tiene la siguiente estructura química:
En ciertas realizaciones, la enfermedad es degeneración macular, como degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), que puede ser DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad renal como la nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH) o cualquier combinación de las mismas.
En ciertas realizaciones, un método para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) en un sujeto, comprende administrar al sujeto un inhibidor específico de CFB tratando, previniendo o mejorando de este modo la DMAe , como DMAE húmeda y DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. La Atrofia Geográfica se considera una forma avanzada de DMAE seca que implica degeneración de la retina. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una vía alternativa de complemento que se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, la administración del compuesto antisentido reduce o inhibe la acumulación de niveles oculares de C3, como niveles de proteína C3. En ciertas realizaciones, la administración del compuesto antisentido reduce el nivel de depósitos de C3 oculares o inhibe la acumulación de depósitos de C3 oculares. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588555, 588553, 588555, 588848 o 594430. En ciertas realizaciones, el compuesto se administra al sujeto parenteralmente
En ciertas realizaciones, un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto comprende administrar al sujeto un inhibidor específico del Factor B del Complemento (CFB) tratando, previniendo o mejorando de este modo la enfermedad renal. En ciertas realizaciones, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588555, 588553, 588555, 588848 o 594430. En ciertas realizaciones, el
compuesto se administra al sujeto parenteralmente En ciertas realizaciones, la enfermedad renal es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (SHU) o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, la enfermedad renal está asociada con depósitos de C3, como depósitos de C3 en el glomérulo. En ciertas realizaciones, la enfermedad renal está asociada con niveles de C3 circulantes más bajos de lo normal, como niveles de C3 en suero o plasma. En ciertas realizaciones, la administración del compuesto reduce o inhibe la acumulación de niveles de C3 en el riñón, como los niveles de proteína C3. En ciertas realizaciones, la administración del compuesto reduce el nivel de depósitos de C3 en el riñón o inhibe la acumulación de depósitos de C3 en el riñón, como los niveles de C3 en el glomérulo. En ciertas realizaciones, se identifica que el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento, por ejemplo, detectando niveles del complemento o niveles del complejo membrana-ataque en la sangre del sujeto y/o realizando una prueba genética para mutaciones genéticas de los factores del complemento asociados a la enfermedad.
En ciertas realizaciones, un método para inhibir la expresión del Factor B del Complemento (CFB) en un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico del Factor B del Complemento (CFB) al sujeto, inhibiendo de este modo la expresión de CFB en el sujeto. En ciertas realizaciones, la administración del inhibidor inhibe la expresión de CFB en el ojo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), como DMAE húmeda y DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones, la administración del inhibidor inhibe la expresión de CFB en el riñón, como en el glomérulo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH), o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588555, 588553, 588555, 588848 o 594430. En ciertas realizaciones, el compuesto se administra al sujeto parenteralmente.
En ciertas realizaciones, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el ojo de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico del Factor B del Complemento (CFB) a el sujeto, reduciendo o inhibiendo de este modo la acumulación de depósitos de C3 en el ojo del sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), como DMAE húmeda y DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica.
En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, o 594430. En ciertas realizaciones, el compuesto se administra al sujeto parenteralmente
En ciertas realizaciones, un método para reducir o inhibir la acumulación de depósitos de C3 en el riñón de un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento comprende administrar un inhibidor específico del Factor B del Complemento (CFB) a el sujeto, reduciendo o inhibiendo de este modo la acumulación de depósitos de C3 en el riñón del sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene, o está en riesgo de tener, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH), o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el inhibidor específico de CFB es un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 o 594430.
Ciertas realizaciones se dirigen a un compuesto o composición descrita en la presente para uso en terapia. Ciertas realizaciones se dirigen a un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, o 594430 para su uso en terapia.
Ciertas realizaciones se dirigen a un compuesto o composición descrita en la presente para uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. Ciertas realizaciones se dirigen a un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, o 594430 para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. En ciertas realizaciones, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, la enfermedad es degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), que puede ser DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad renal como nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH), o cualquier combinación de los mismos
Ciertas realizaciones se dirigen a un compuesto que comprende o consiste de ISIS 588540, que tiene la
siguiente estructura química:
, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. En ciertas realizaciones, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, la enfermedad es la degeneración macular, como degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), que puede ser DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad renal como nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH) o cualquier combinación de las mismas.
Ciertas realizaciones se dirigen al uso de un compuesto o composición descrita en la presente para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento.
Ciertas realizaciones se dirigen al uso de un compuesto que comprende o consiste de ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848, o 594430 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. En ciertas realizaciones, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, la enfermedad es degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), que puede ser DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad renal como nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH), o cualquier combinación de las mismas.
Ciertas realizaciones se dirigen al uso de un compuesto que comprende o consiste de ISIS 588540, que
tiene la siguiente estructura química:
, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento. En ciertas realizaciones, la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal. En ciertas realizaciones, la enfermedad es degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), que puede ser DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. En ciertas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad renal como nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH) o cualquier combinación de las mismas.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, el inhibidor específico de CFB puede ser un compuesto antisentido dirigido a CFB. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido antisentido, por ejemplo un oligonucleótido antisentido que consiste de 8 a 80 nucleósidos enlazados, 12 a 30 nucleósidos enlazados, o 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95% o 100% complementario a cualquiera de las secuencias de nucleobases enumeradas en las SEQ ID NO: 1-5. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, por lo menos un azúcar modificado y/o por lo menos una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato, el azúcar modificado es un azúcar bicíclico o un 2-O-metoxietilo, y la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados; un segmento de ala 51 que consiste de nucleósidos enlazados; y un segmento de ala 31 que consiste de nucleósidos enlazados, en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 51 y el segmento de ala 31 y en donde cada nucleósido de cada segmento de
ala comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido se administra por vía parenteral. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido puede administrarse mediante inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo administración intratecal o intracerebroventricular.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una subunidad individual puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de CFB puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una subunidad adicional individual está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar localizada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, la escisión específica del objetivo se logró usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y con 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl -2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Mahery Dolnick(Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem respectivamente, para su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Ciertos motivos y mecanismos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir resistencia aumentada a la degradación de las nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión para el ácido nucleico objetivo y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido
quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
La actividad antisentido puede ser el resultado de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico objetivo, en donde la hibridación en última instancia da como resultado un efecto biológico. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo está modulada. En ciertas realizaciones, la cantidad y/o actividad del ácido nucleico objetivo está reducida. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo da como resultado en última instancia una degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo no da como resultado la degradación del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico objetivo (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o un patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o a través de mecanismos que no se han dilucidado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente no están limitados por un mecanismo particular.
Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de tales mecanismos y/o a través de mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es resultado por lo menos en parte de la degradación del ARN objetivo por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido de cadena sencilla que son "similares a ADN" provocan la actividad de RNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden por lo menos una parte de ADN o nucleósidos similares a ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido comprenden por lo menos un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En ciertas de tales realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de la RNasa H. En ciertas realizaciones, tales compuestos antisentido son gapmers, como se describe en la presente. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos similares a ADN. En ciertas de tales realizaciones, el hueco del gapmer comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos similares a ADN.
Ciertos compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que apoya la escisión de la RNasaH está colocado entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco sirve generalmente como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2'-modificdos (tales nucleósidos 2'.modificados pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos (tales nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos pueden incluir aquellos que tienen un etilo restringido). En ciertas realizaciones, los nucleósidos en las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado incluyendo, por ejemplo, 2'-MOE y fracciones de azúcares bicíclicos como etilo restringido o LNA. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado y no modificado. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, fracciones de azúcares bicíclico como nucleósidos de etilo restringidos o nucleósidos de LNA y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes, o fracciones de azúcar alternas. El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del hueco y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender fracciones de azúcares uniformes, variantes o alternas. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco está colocado inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el hueco, o el hueco y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" está entre 8 y 15 nucleósidos. X, Y o Z puede ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más
nucleósidos.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de CFB tiene un motivo gapmer en el que el hueco consiste de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido tiene un motivo de azúcar descrito por la fórmula A de la siguiente manera:
(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
en donde:
cada A es independientemente un nucleósido 2-sustituido;
cada B es independientemente un nucleósido bicíclico;
cada J es independientemente un nucleósido 2-sustituido o un 2-desoxinucleósido;
cada D es un 2-desoxinucleósido;
m es 0-4; n es 0-2; p es 0-2; r es 0-2; t es 0-2; v es 0-2; w es 0-4; x es 0-2; y es 0-2; z es 0-4; g es 6-14;
siempre que:
por lo menos uno de m, n y r sea distinto de 0;
por lo menos uno de w y y sea distinto de 0;
la suma de m, n, p, r y t sea de 2 a 5; y
la suma de v, w, x, y y z sea de 2 a 5.
Compuestos de ARNi
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARN interferente (ARNi), que incluyen compuestos de ARN de cadena doble (también denominados ARN interferente corto o ARNip) y compuestos de ARNi de cadena sencilla (o ARNmc). Tales compuestos funcionan por lo menos en parte a través de la vía RISC para degradar y/o secuestrar un ácido nucleico objetivo (por tanto, incluyen compuestos de microARN/mímico de microARN). En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden modificaciones que los hacen particularmente adecuados para tales mecanismos.
i. Compuestos de ARNmc
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido incluyendo aquellos particularmente adecuados para su uso como compuestos de ARNi de cadena sencilla (ARNmc) comprenden un extremo 5-terminal modificado. En ciertas de tales realizaciones, el extremo 5-terminal comprende una fracción de fosfato modificado. En ciertas realizaciones, dicho fosfato modificado está estabilizado (por ejemplo, resistente a la degradación/escisión en comparación con el 5-fosfato no modificado). En ciertas realizaciones, tales nucleósidos 5-terminales estabilizan la fracción de 5-fósforo. Ciertos nucleósidos 5-terminales modificados pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en la WO/2011/139702.
En ciertas realizaciones, el 5-nucleósido de un compuesto de ARNmc tiene la Fórmula IIc:
en donde:
T1 es un fracción de fósforo opcionalmente protegido;
T2 es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el compuesto de Fórmula IIc con el compuesto oligomérico;
A tiene una de las fórmulas:
Qi y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 sustituido o N(R3)(R4);
Qa es O, S, N(Ra) o C(R6)(Rt);
cada R3, R4, R5, R6 y R7 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido o alcoxi C1-C6; Ma es O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16) C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) o OC(R15)(Bx2);
R14 es H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
R15, R16, R17 y R18 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
Bx1 es un fracción de base heterocíclica;
o si Bx2 está presente, entonces Bx2 es una fracción de base heterocíclica y Bx1 es H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
J4 , J5, J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
o J4 forma un puente con uno de J5 o J7 en donde dicho puente comprende de 1 a 3 grupos birradicales enlazados seleccionados de O, S, NR19, C(R2o)(R21), C(R2o)=C(R21), C[=C(R2o)(R 21)] y C(=o ) y los otros dos de J5, J6 y J7 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada R19, R20 y R21 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
G es H, OH, halógeno o O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Z;
cada R8 y R9 es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
X1 es O, S o N (E1);
Z es H, halógeno, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 sustituido o N(E2)(E3);
E1, E2 y E3 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
n es de 1 a aproximadamente 6;
m es 0 o 1;
j es 0 o 1;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, N J 1XJ2), =NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) y C(=X2)N(J1)(J2);
X2 es O, S o NJ3
cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
cuando j es 1, Z es distinto de halógeno o N(E 2)(E3); y
en donde dicho compuesto oligomérico comprende de 8 a 40 subunidades monoméricas y puede hibridar con por lo menos una parte de un ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, M3 es O, CH=CH, OCH2 o OC(H)(Bx2). En ciertas realizaciones, M3 es O.
En ciertas realizaciones, J4, J5 , J6 y J7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, J4 forma un puente con uno de J5 o J7.
En ciertas realizaciones, Atiene una de las fórmulas:
en donde:
Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 o alcoxi
C1-C6 sustituido. En ciertas realizaciones, Qi y Q2 son cada uno H. En ciertas realizaciones, Q1 y Q2 son cada uno, independientemente, H o halógeno. En ciertas realizaciones, Qi y Q2 es H y el otro de Qi y Q2 es F, CH3 o OCH3.
En ciertas realizaciones, T1 tiene la fórmula:
en donde:
Ra y Rc son cada uno, independientemente, hidroxilo protegido, tiol protegido, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, amino protegido o amino sustituido; y
Rb es O o S. En ciertas realizaciones, Rb es O y Ra y Rc son cada uno, independientemente, OCH3, OCH2CH3 o CH(CH3)2.
En ciertas realizaciones, G es halógeno, OCH3 , OCH2F, OCHF2 , OCF3, OCH2CH3 , O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3 , OCH2-CH=CH2 , O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R1ü)(Rh ), O(CH2)2-ON(R10)(Rn), O(CH2)2-O(CH2)2-N(Rio)(Rii), OCH2C(=O)-N(Rio)(Rii), OCH2C(=O)-N(Ri2)-(CH2)2-N(Rio)(Rii) o O(CH2)2-N(Ri2)-C(=NRi3)[N(Rio)(Rii)] en donde Rio, R11, R12 y R13 son cada uno, independientemente, H o alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, G es halógeno, O OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2 , O (C ^)2-OCH3 , O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 o OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. En ciertas realizaciones, G es F, OCH3 o O(CH2)2-OCH3. En ciertas realizaciones, G es O(CH2)2-OCH3.
En ciertas realizaciones, el nucleósido 5-terminal tiene la Fórmula IIe:
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluidos los particularmente adecuados para ARNmc, comprenden uno o más tipos de fracciones de azúcar modificado y/o fracciones de azúcar de origen natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Tales motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar tratadas en la presente y/o otras modificaciones de azúcar conocidas.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene modificaciones de azúcar uniformes. En ciertas de tales realizaciones, cada nucleósido de la región comprende la misma modificación de azúcar similar a ARN. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-F. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido cEt. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de la región es un nucleósido de LNA. En ciertas realizaciones, la región uniforme constituye todo o esencialmente todo el oligonucleótido. En ciertas realizaciones, la región constituye el oligonucleótido completo a excepción de los nucleósidos terminales 1-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más regiones de modificaciones de azúcar alternas, en donde los nucleósidos alternan entre nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un primer tipo y nucleótidos que tienen una modificación de azúcar de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de ambos tipos son nucleósidos similares a ARN. En ciertas realizaciones, los nucleósidos alternos se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, las modificaciones alternas son 2'-F y 2'-OMe. Tales regiones pueden ser contiguas o pueden estar interrumpidas por nucleósidos modificados de manera diferente o nucleósidos conjugados.
En ciertas realizaciones, la región alterna de modificaciones alternas consisten cada una en un único nucleósido (es decir, el patrón es (AB)xAy donde A es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un
primer tipo y B es un nucleósido que tiene una modificación de azúcar de un segundo tipo; x es 1-20 e y es 0 o 1). En ciertas realizaciones, una o más regiones alternas en un motivo alterno incluye más de un único nucleósido de un tipo. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden incluir una o más regiones de cualquiera de los siguientes motivos de nucleósidos:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; o
ABABBAABBABABAA;
en donde A es un nucleósido de un primer tipo y B es un nucleósido de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, A y B se seleccionan cada uno de 2'-F, 2'-OMe, BNA y MOE.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen tal motivo alterno también comprenden un nucleósido 5' terminal modificado, tales como los de fórmula IIc o IIe.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo 2-2-3. Tal región comprende el siguiente motivo:
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
en donde: A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B y C son nucleósidos que están modificados de manera diferente de A, sin embargo, B y C pueden tener modificaciones iguales o diferentes entre sí;
x e y son de 1 a 15.
En ciertas realizaciones, A es un nucleósido 2'-OMe modificado. En ciertas realizaciones, B y C son ambos nucleósidos 2'-F modificados. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido 2'-OMe modificado y B y C son ambos nucleósidos 2'-F modificados.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(AB)xAy-(D)z
en donde:
Q es un nucleósido que comprende un fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
B es un segundo tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente a la del nucleósido adyacente a él. Por tanto, si y es 0, entonces D debe modificarse de manera diferente que B y si y es 1, entonces D debe modificarse de manera diferente que A. En ciertas realizaciones, D difiere de tanto A como B.
X es 5-15;
Y es 0 o 1;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, los oligonucleósidos tienen el siguiente motivo de azúcar:
5'-(Q)-(A)x-(D)z
en donde
Q es un nucleósido que comprende un fracción de fosfato estabilizado. En ciertas realizaciones, Q es un nucleósido que tiene la Fórmula IIc o IIe;
A es un primer tipo de nucleósido modificado;
D es un nucleósido modificado que comprende una modificación diferente de A.
X es 11-30;
Z es 0-4.
En ciertas realizaciones, A, B, C y D en los motivos anteriores se seleccionan de: 2'-OMe, 2'-F, 2'-MOE, LNA y cEt. En ciertas realizaciones, D representa nucleósidos terminales. En ciertas realizaciones, tales nucleósidos terminales no están diseñados para hibridar con el ácido nucleico objetivo (aunque uno o más podrían hibridar por casualidad). En algunas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es adenina, independientemente de la identidad de la nucleobase en la posición correspondiente del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la nucleobase de cada nucleósido D es timina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo aquellos particularmente adecuados para su uso como ARNmc comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o un motivo de enlace internucleosídico modificado definidos. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos uniformemente modificados. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está ligada uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está enlazado uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es fosforotioato
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos que tienen cualquiera de los varios motivos de azúcar descritos en la presente, pueden tener cualquier motivo de enlace. Por ejemplo, los oligonucleótidos, incluyendo pero no limitado a los descritos anteriormente, pueden tener un motivo de enlace seleccionado de los no limitativos de la tabla siguiente:
ii. Compuestos de ARNip
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son compuestos de ARNi de cadena doble (ARNip). En tales realizaciones, una o ambas cadenas pueden comprender cualquier motivo de modificación descrito anteriormente para ARNmc. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNmc pueden ser ARN no modificado. En ciertas realizaciones, los compuestos de ARNip pueden comprender nucleósidos de ARN no modificados, pero enlaces internucleosídicos modificados.
Varias realizaciones se refieren a composiciones de cadena doble en las que cada cadena comprende un motivo definido por la localización de uno o más nucleósidos modificados o no modificados. En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un primer y un segundo compuesto oligomérico que están total o por lo menos parcialmente hibridados para formar una región dúplex y que comprenden además una región que es complementaria e hibrida con un objetivo de ácido nucleico. Es adecuado que tal composición comprenda un primer compuesto oligomérico que es una cadena antisentido que tenga una complementariedad total o parcial con un objetivo de ácido nucleico y un segundo compuesto oligomérico que es una cadena con sentido que tenga una o más regiones de complementariedad y forme por lo menos una región dúplex con el primer compuesto oligomérico.
Las composiciones de varias realizaciones modulan la expresión génica hibridando con un objetivo de ácido nucleico que da como resultado la pérdida de su función normal. En ciertas realizaciones, la degradación del CFB objetivo se facilita por un complejo RISC activado que se forma con las composiciones de la invención.
Varias realizaciones están dirigidas a composiciones de cadena doble en las que una de las cadenas es útil
para, por ejemplo, influir en la carga preferencial de la cadena opuesta en el complejo RISC (o escisión). Las composiciones son útiles para apuntar a moléculas de ácido nucleico seleccionadas y modular la expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención hibridan con una parte de un ARN objetivo dando como resultado la pérdida de la función normal del ARN objetivo.
Ciertas realizaciones se dirigen a composiciones de cadena doble en las que ambas cadenas comprenden un motivo hemímero, un motivo completamente modificado, un motivo modificado posicionalmente o un motivo alterno. Cada cadena de las composiciones de la presente invención puede modificarse para cumplir una función particular en, por ejemplo, la vía del ARNip. Usando un motivo diferente en cada cadena o el mismo motivo con diferentes modificaciones químicas en cada cadena permite dirigir la cadena antisentido para el complejo RISC mientras se inhibe la incorporación de la cadena con sentido. Dentro de este modelo, cada cadena puede modificarse independientemente de tal manera que se mejora para su función particular. La cadena antisentido puede modificarse en el extremo 5' para mejorar su función en una región del RISC mientras que el extremo 3' puede modificarse diferencialmente para mejorar su función en una región diferente del RISC.
Las moléculas de oligonucleótidos de cadena doble pueden ser una molécula de polinucleótidos de cadena doble que comprende regiones con sentido y antisentido auto-complementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma. Las moléculas de oligonucleótidos de cadena doble pueden ensamblarse a partir de dos oligonucleótidos separados, donde una cadena es la cadena con sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y con sentido son auto-complementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de secuencia de nucleótidos en la otra cadena; tal como donde la cadena antisentido y la cadena con sentido forman una estructura dúplex o de cadena doble, por ejemplo, en donde la región de cadena doble es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 pares de bases; la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma y la cadena con sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma (por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 o más nucleótidos de la molécula de oligonucleótido de cadena doble son complementarios al ácido nucleico objetivo o una parte del mismo). Alternativamente, el oligonucleótido de cadena doble se ensambla a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones con sentido y antisentido auto-complementarias del ARNip se enlazan por medio de un conector(es) a base de ácido nucleico o no a base de ácido nucleico.
El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrico, de horquilla o de horquilla asimétrica, que tiene regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula ácido nucleico objetivo separada o una parte de la misma y la región con sentido tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico objetivo o una parte de la misma. El oligonucleótido de cadena doble puede ser un polinucleótido de cadena sencilla circular que tiene dos o más estructuras de giro y un vástago que comprende regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos o una parte de la misma, y en donde el polinucleótido circular puede procesarse o in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende secuencias o regiones con sentido y antisentido separadas, en donde las regiones con sentido y antisentido están enlazadas covalentemente por moléculas de conectores nucleotídicos o no nucleotídicos como se conoce en la técnica, o están alternativamente enlazadas no covalentemente por interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der waals, interacciones hidrófobas, y/o interacciones de apilamiento. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo. En otra realización, el oligonucleótido de cadena doble interactúa con la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de una manera que provoca la inhibición de la expresión del gen objetivo.
Como se usa en la presente, los oligonucleótidos de cadena doble no necesitan estar limitados a aquellas moléculas que contienen solo ARN, sino que también incluyen nucleótidos modificados químicamente y no nucleótidos. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico interferente corto carecen de nucleótidos que contienen 2'-hidroxi (2'-OH). En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos interferente cortos opcionalmente no incluyen ningún ribonucleótido (por ejemplo, nucleótidos que tienen un grupo 2'-OH). Sin embargo, tales oligonucleótidos de cadena doble que no requieren la presencia de ribonucleótidos dentro de la molécula para soportar ARNi pueden tener un conector o conectores unidos u otros grupos, fracciones o cadenas unidas o asociadas, que contienen uno o más nucleótidos con grupos 2'-OH. Opcionalmente, los oligonucleótidos de cadena doble pueden comprender ribonucleótidos en aproximadamente el 5, 10, 20, 30, 40, o el 50% de las posiciones de
nucleótidos. Como se usa en la presente, se entiende que el término ARNip es equivalente a otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar ARNi específicos de secuencia, por ejemplo, ARN interferente corto (ARNip), ARN de cadena doble (ARNbc), micro-ARN (miARN), RNA de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido interferente corto, ácido nucleico interferente corto, oligonucleótido modificado interferente corto, ARNip modificado químicamente, ARN silenciador de genes post-transcripcional (ARNsgpt), y otros. Además, como se usa en la presente, se entiende que el término ARNi es equivalente a otros términos usados para describir ARN interferente específico de secuencia, como silenciamiento génico postranscripcional, inhibición translacional o epigenética. Por ejemplo, Los oligonucleótidos de cadena doble pueden usarse para silenciar epigenéticamente genes tanto en el nivel post-transcripcional como en el nivel pre-transcripcional. En un ejemplo no limitativo, la regulación epigenética de la expresión génica por las moléculas de ARNip de la invención puede ser resultado de la modificación mediada por ARNip de la estructura de la cromatina o del patrón de metilación para alterar la expresión génica (ver, por ejemplo, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; y Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Se contempla que los compuestos y composiciones de varias realizaciones proporcionadas en la presente puedan dirigirse a CFB mediante un silenciamiento génico mediado por ARNbc o un mecanismo de ARNi, incluyendo, por ejemplo, moléculas de efector de ARN de cadena doble de tipo "horquilla" o vástago-giro en las que una cadena de ARN individual con las secuencias auto-complementarias es capaz de asumir una conformación de cadena doble, o moléculas de efector de ARNb dúplex que comprenden dos cadenas separadas de ARN. En diversas realizaciones, el ARNbc consiste completamente en ribonucleótidos o consiste de una mezcla de ribonucleótidos y desoxinucleótidos, como los híbridos de ARN/ADN divulgados, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. EL ARNbc o la molécula efectora de ARNbc puede ser una molécula individual con una región de auto-complementariedad tal que los nucleótidos en un segmento de la base de la molécula se emparejen con nucleótidos en otro segmento de la molécula. En varias realizaciones, un ARNbc que consiste de una molécula individual consiste completamente de ribonucleótidos o incluye una región de ribonucleótidos que es complementaria a una región de desoxirribonucleótidos. Alternativamente, el ARNbc puede incluir dos cadenas diferentes que tienen una región de complementariedad entre sí.
En varias realizaciones, ambas cadenas consisten completamente de ribonucleótidos, una cadena consiste completamente en ribonucleótidos y una cadena consiste completamente en desoxirribonucleótidos, o una o ambas cadenas contienen una mezcla de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ciertas realizaciones, las regiones de complementariedad son por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% complementarias entre sí y con una secuencia de ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la región del ARNbc que está presente en una conformación de cadena doble incluye por lo menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos o incluye todos los nucleótidos en un ADNc u otra secuencia de ácido nucleico objetivo que está representada en el ARNbc. En algunas realizaciones, el ARNbc no contiene ninguna región de cadena sencilla, como extremos de cadena sencilla, o el ARNbc es una horquilla. En otras realizaciones, el ARNbc tiene una o más regiones de cadena sencilla o voladizos. En ciertas realizaciones, los híbridos de ARN/ADN incluyen una cadena o región de ADN que es una cadena o región antisentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de complementariedad con un ácido nucleico objetivo) y una cadena o región de ARN que es una cadena o región con sentido (por ejemplo, tiene por lo menos un 70, 80, 90, 95, 98 o 100% de identidad con un ácido nucleico objetivo) y viceversa.
En varias realizaciones, el híbrido de ARN/ADN se realiza in vitro usando métodos sintéticos enzimáticos o químicos como los descritos en la presente o los descritos en la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999. En otras realizaciones, una cadena de ADN sintetizada in vitro se compleja con una cadena de ARN elaborada in vivo o in vitro antes, después, o concurrentemente con la transformación de la cadena de ADN en la célula. En otras realizaciones más, el ARNbc es un ácido nucleico circular individual que contiene una región con sentido y una antisentido, o el ARNbc incluye un ácido nucleico circular y o un segundo ácido nucleico circular o un ácido nucleico lineal (ver, por ejemplo, la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130,377, presentada el 21 de abril de 1999). Los ácidos nucleicos circulares ejemplares incluyen estructuras de lazo en las que el grupo fosforilo 5' libre de un nucleótido se enlaza con el grupo hidroxilo 2' de otro nucleótido en una forma de giro posterior.
En otras realizaciones, el ARNbc incluye uno o más nucleótidos modificados en los que la posición 2' en el azúcar contiene un halógeno (como el grupo flúor) o contiene un grupo alcoxi (como un grupo metoxi) que aumenta la vida media del ARNbc in vitro o in vivo en comparación con el ARNbc correspondiente en el que la posición 2' correspondiente contiene un hidrógeno o un grupo hidroxilo. En otras realizaciones más, el ARNbc incluye uno o más enlaces entre nucleótidos adyacentes distintos de un enlace fosfodiéster de origen natural. Los ejemplos de tales enlaces incluyen enlaces de fosforamida, fosforotioato y fosforoditioato. Los ARNbc también pueden ser moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente como se enseña en la Patente de Estados Unidos N° 6.673.661. En otras realizaciones, el ARNbc contiene una o dos cadenas con caperuza, como se divulga, por ejemplo, por la WO 00/63364, presentada el 19 de abril de 2000 o la US N° de Serie 60/130.377, presentada el 21
de abril de 1999.
En otras realizaciones, el ARNbc puede ser cualquiera de las moléculas ARnbc divulgadas por lo menos parcialmente en la WO 00/63364, así como cualquier otra de las moléculas de ARNbc descritas en la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/399.998; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/419.532 y el PCT/US2003/033466. Cualquiera de los ARNbc puede expresarse in vitro o in vivo usando los métodos descritos en la presente o métodos estándar, como los descritos en la Wo 00/63364.
Ocupación
En ciertas realizaciones, no se espera que los compuestos antisentido den como resultado la escisión o el ácido nucleico objetivo a través de la RNasa H o que den como resultado la escisión o el secuestro a través de la vía de RISC. En ciertas de tales realizaciones, la actividad antisentido puede ser resultado de la ocupación, en donde la presencia del compuesto antisentido hibridado interrumpe la actividad del ácido nucleico objetivo. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido puede modificarse uniformemente o puede comprender una mezcla de modificaciones y/o nucleósidos modificados y no modificados.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican el Factor B del Complemento (CFB) incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 1), N° de Acceso de GENBANK NT_007592.15 truncado de los nucleótidos 31852000 al 31861000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de Acceso de GENBANK NW_001116486.1 truncado de los nucleótidos 536000 a 545000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de Acceso de GENBANK XM_001113553.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 4), o N° de Acceso de GENBANK NM_008198.2 (incorporada en la presente como SeQ ID NO: 5).
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación tiene lugar entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de CFB. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede tener lugar bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas del ácido nucleico a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico de CFB.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse mediante enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de CFB).
Pueden tolerarse nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de CFB siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de CFB, de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, un malapareamiento o una estructura de horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o una parte específica de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios con un ácido nucleico de CFB, una región objetivo, un segmento objetivo, o una parte específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarios con una región objetivo y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 nucleobases con cuatro
nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría una complementariedad total del 77,8% con el ácido nucleico objetivo y, por lo tanto, estaría dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas (BLAST) (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) con un ácido nucleico objetivo, o parte específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario con un ácido nucleico de CFB, o una región objetivo, o un segmento objetivo o una secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de un emparejamiento de bases preciso de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una parte de 20 nucleobases correspondiente del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una parten específica del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una parte de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tenga una longitud de 400 nucleobases. La parte de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria con la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una parte correspondiente de 20 nucleobases en la que cada nucleobase es complementaria a la parte de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser o no completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de CFB, o una parte específica del mismo.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de CFB, o una parte específica del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados también incluyen aquellos que son complementarios con una parte de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "parte" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "parte" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o un compuesto representado por un número de Isis específico, o una parte del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido divulgados en la presente, así como compuestos que tienen bases no idénticas con relación a los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersas a lo largo del compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o partes de los mismos, son, o son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o las SEQ ID NO, o una parte de los mismos, divulgados en la presente.
En ciertas realizaciones, una parte del compuesto antisentido se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una parte de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, una parte del oligonucleótido antisentido se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una parte de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La parte de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazarse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones en los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar, o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados se prefieren a menudo sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada para el objetivo del ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas, o actividad inhibidora aumentada.
También pueden emplearse nucleósidos modificados químicamente para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. Consecuentemente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no de origen natural, se seleccionan a menudo sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural, debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Fracciones de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Tales nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una estabilidad de nucleasas mejorada, una afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillos de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puente de los átomos del anillo no germinales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R2)(R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen el nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5'-2'-bis sustituidos divulgados) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con una
sustitución adicional en la posición 2' (ver Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181 Publicada el 22/11/07 en donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo).
Ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcares modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), '-S, 2'-F, 2 -OCH3, 2 -OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2', incluyen pero no están limitados a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también referido como etilo restringido o cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' ( y análogos de la misma, ver Patente de Estados Unidos 7.399.845, concedida el 15 de julio del 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de la misma ver la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver Patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
También pueden encontrarse informes adicionales relacionados con los nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (ver, por ejemplo, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243: Patentes de Estados Unidos N° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; Patente de Estados Unidos N° de Serie 60/989.574; 61/026.995; 61/026.998; 61/056.564; 61/086.231; 61/097.787; y 61/099.844; Solicitudes Internacionales de PCT Publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478.Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcares estereoquímicos incluyendo, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la Solicitud Internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcares bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre las posiciones 4' y 2' de la fracción de azúcar de pentofuranosilo en donde tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J-i), o sulfoxilo (S(=O)-J-i); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 44'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2 ', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un
grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4-2 'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365 hasta 6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, (A) a-L-metilenoxi (4-CH2-O-21) BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2 ') BNA, (J) propilen carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinilo BNA como se representa a continuación:
en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
en donde:
Bx es unafracción de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, aun fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos quetienen la Fórmula II:
en donde:
Bx es un fracción base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y Xes O o NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos quetienen la Fórmula IV:
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C-C 6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o
alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qcy qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6 , alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos quetienen la Fórmula V:
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y q son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk
o qe y qfjuntos son =C(qg)(q h);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos. (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4-CH2-O-21) BNA y 2-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad comformacionalmente restringido, se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2-amino- y 2-metilamino-BNA y se ha informado anteriormente de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas ARN y de ADN complementarias.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos quetienen la Fórmula VI:
en donde:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qky ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo CrC^sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkoN(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno,
alquilo C1-C12 o alquilo C1- C12 sustituido.
Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4 '-2 '" o "nucleósido bicíclico de 4' a 2' '' se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcares bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o análogo de fracción azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en la presente, "azúcar 2'-modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, incluyendo, pero no limitado a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de los sustituyentes que incluyen, pero no están limitados a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos 2'-sustituyentes también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3 , SO2CH3, ONO2, NO2 , N3 , NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como 2'-O-metilo, O-propilo, y O-aminopropilo. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE también han mostrado ser inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann etal., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el fracción de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto del azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitados a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internudeosídico que enlaza el análogo nucleosídico de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tbes H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5’o 3’-terminal; q1, q2, q3 , q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en los que q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de t Hp de fórmula VII en los que uno de R1 y R2 es flúor. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y Patentes de Estados Unidos 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; y 5.034.506). Como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la fórmula siguiente:
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Tales sustitutos del azúcar son referidos en la presente como "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos sustituidos con 5',2-bis divulgados) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y una sustitución adicional en la posición 21 (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente, la sustitución 51 de un ácido nucleico bicíclico (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181, publicada el 22/11/07 en donde un nucleósido bicíclico 4-CH2-O-21 está sustituido adicionalmente en la posición 51 con un grupo 5-metilo o 5-vinilo). También se han descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no están limitados a, los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, Solicitud de PCT publicada de titularidad compartida WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, f61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud de PCT publicado, WO 06/047842; y Solicitud de PCT publicado WO 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la Fórmula X.
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es unafracción de base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo nucleosídico de ciclohexenilo con un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano con un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado, o un grupo 5’ o 3-terminal; y
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7 , qs y q9 son cada uno, independientemente, H, alq alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en la presente, "2-modificado" o "2-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 21 diferente de H u OH. Los nucleósidos 2-modificados incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 21 y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con 2-substituents sin puente, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo CrC^sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 21 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "2-OMe" o " 2 -OCH3" o "2-O-metilo" se refieren a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 21 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2-MOE" o " 2 -OCH2CH2OCH3" o "2-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 21 del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver por ejemplo artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillos pueden experimentar varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137;
5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873;
5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificado, las fracciones de nucleobase (naturales, modificados o combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2-MOE. En ciertas
realizaciones, los nucleósidos 2'-MOE modificados están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de, pero funcionalmente intercambiables con nucleobases no modificadas de origen natural o sintéticas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobases, incluyendo las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, las sustituciones de 5-metilcitosina han mostrado que aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2° C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Las nucleobases modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Las fracciones de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido acortados o ampliados con huecos dirigidos a un ácido nucleico de CFB comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden enlazarse covalentemente con una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos terminales de compuestos antisentido para mejorar propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidos en los grupos estabilizadores están las estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de la exónucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo terminal 5' (5'-cap), o en el extremo terminal 3' (3'-cap), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas abásicas desoxi invertidas. Los grupos estabilizadores 3' y 5' adicionales que pueden usarse para cubrir uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa incluyen los divulgados en la WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, incluyendo, pero no limitados a aquellos particularmente adecuados para su uso como ARNmc se modifican mediante la unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido unido, incluyendo, pero no limitado a, farmacodinámica, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y depuración. Los grupos conjugados se usan de manera rutinaria en las técnicas químicas y se enlazan directamente o a través de un fracción de enlace conjugada opcional o un grupo de enlace de conjugado a un compuesto original como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación,
intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, fracciones de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Se han descrito con anterioridad ciertos grupos conjugados, por ejemplo: fracción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 1989, 86, 6553 6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al. al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de do-decano-diol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54.), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) o ácido acético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un fracción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Para conjugados adicionales, incluyendo aquellos útiles para ARNmc y su colocación dentro de compuestos antisentido, ver, por ejemplo, la Solicitud de Estados Unidos N°; 61/583.963.
Prueba in vitro de oligonudeótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en el cultivo.
Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTINA en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que puede variar de 2 a 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos rutinarios. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos repetidos.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración de oligonucleótidos antisentido óptima para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A) . Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Ciertas indicaciones
Ciertas realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de CFB, como un compuesto antisentido dirigido a CFB.
Los ejemplos de enfermedades renales asociadas con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables, prevenibles y/o mejorables con los métodos proporcionados en la presente incluyen glomerulopatía C3, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), enfermedad por depósito denso (DDD; también conocida como MPGN Tipo II o C3Neph), y nefropatía CFHR5.
Las enfermedades renales adicionales asociadas con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables, prevenibles y/o mejorables con los métodos proporcionados en la presente incluyen nefropatía por IgA; glomerulonefritis mesangiocapilar (membranoproliferativa) (MPGN); trastornos autoinmunes que incluyen nefritis lúpica y lupus eritematoso sistémico (LES); glomerulonefritis inducida por infección (también conocida como glomerulonefritis postinfecciosa); y lesión por isquemia-reperfusión renal, por ejemplo, lesión por isquemia-reperfusión renal posterior al trasplante.
Los ejemplos de trastornos no renales asociados con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables y/o prevenibles con los métodos proporcionados en la presente incluyen enfermedades oculares como la degeneración macular, por ejemplo degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), incluyendo la DMAE húmeda y la DMAE seca, como la Atrofia Geográfica; neuromielitis optica; enfermedad de la córnea, como inflamación de la córnea; uveítis autoinmune; y la retinopatía diabética. Se ha informado que el sistema del complemento está implicado en las enfermedades oculares. Jha P, et al., Mol Immunol (2007) 44(16):3901-3908. Ejemplos adicionales de trastornos no renales asociados con la desregulación de la vía alternativa del complemento tratables y/o prevenibles con los métodos proporcionados en la presente incluyen vasculitis asociada a ANCA, síndrome antifosfolípido (también conocido como síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS)), asma, artritis reumatoide, Miastenia grave y esclerosis múltiple.
Ciertas realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad renal asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de CFB, tal como un compuesto antisentido dirigido a CFB. En ciertas realizaciones, la enfermedad renal es nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5 o síndrome urémico hemolítico atípico (aUSH), o cualquier combinación de las mismas.
Ciertas realizaciones proporcionadas en la presente se refieren a métodos para tratar, prevenir o mejorar la degeneración macular, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), en un sujeto mediante la administración de un inhibidor específico de CFB, como un compuesto antisentido dirigido a CFB. En ciertas realizaciones, la DMAE es DMAE húmeda o DMAE seca. En ciertas realizaciones, la DMAE seca puede ser Atrofia Geográfica. Los estudios han demostrado la asociación de la desregulación de la vía alternativa del complemento y la DMAE. Los componentes del complemento son constituyentes comunes de las drusas oculares, el material extracelular que se acumula en la mácula de los pacientes con DMAE. Además, se ha informado que las variantes de CFH y CFB representan casi el 75% de los casos de DMAE en el norte de Europa y América del Norte. También se ha descubierto que un polimorfismo de CFB específico confiere protección contra DMAE. Patel, N. et al., Eye (2008) 22(6):768-76 . Además, los ratones nulos homocigotos con CFB tienen una actividad de la vía del complemento más baja, muestran lesiones oculares más pequeñas y neovascularización coroidea (CNV) después de fotocoagulación con láser. Rohrer, B. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2009) 50 (7):3056-64 . Además, el tratamiento con ARNip del CFB protege a los ratones de la CNV inducida por láser. Bora, NS et al., J. Immunol. (2006) 177(3):1872-8 . Los estudios también han demostrado que el riñón y el ojo comparten vías de desarrollo y características estructurales incluyendo la composición del protómero IV de colágeno de la membrana basal y la vascularidad. Savige et al., J Am Soc Nephrol. (2011) 22(8):1403-15. Hay evidencias de que la vía del complemento está implicada en enfermedades renales y oculares. Por ejemplo, la deficiencia proteica reguladora del complemento hereditaria provoca predisposición al síndrome urémico hemolítico atípico y la DMAE. Richards A et al., Adv Immunol. (2007) 96:141-77 . Además, la enfermedad renal crónica se ha asociado con DMAE. Nitsch, D. et al., Ophtalmic Epidemiol. (2009) 16(3):181-6; Choi, J. et al, Ophtalmic Epidemiol. (2011) 18(6):259-63 . La enfermedad por depósito denso (DDD), una enfermedad renal asociada con la vía alternativa del complemento desregulada, se caracteriza por síndrome nefrítico agudo y drusas oculares. Cruz y Smith, GeneReviews (2007) 20 de julio. Además, los ratones que albergan deleción genética de un componente de la vía alternativa del complemento tienen fenotipos de enfermedades renales y oculares coexistentes. Se ha informado que los ratones nulos homocigotos de CFH desarrollan DDD y presentan anomalías retinales y disfunción visual. Pickering et al., Nat Genet. (2002) 31(4):424-8 . Los modelos de ratón de enfermedades renales asociadas con la desregulación de la vía alternativa del complemento también se aceptan como modelos de DMAE. Pennesi ME et al., Mol Apects Med (2012) 33:487-509 . Los ratones nulos de CFH, por ejemplo, son un modelo aceptado para enfermedades renales, como la DDD y la DMAE. Además, se ha informado que la DMAE está asociada con la fuente sistémica de factores del complemento, que se acumulan localmente en el ojo para impulsar la activación del complemento de la vía alternativa. Loyer et al.
Invest Ophthalmol Vis Sci. (2012) 53 (10):6628-37.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Aunque se han descrito ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no pretenden limitar los mismos.
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número de Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo. Ejemplo 1: Inhibición antisentido del factor B del complemento humano (CFB) en células HepG2 por gapmers de MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos en el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó un conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 (secuencia directa AGTCTCTGTGGCATGGTTTGG, designada en la presente como SEQ ID NO: 810; secuencia inversa GGGCGAATGACTGAGATCTTG, designada en la presente como SEQ ID NO: 811; secuencia de sonda TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 812) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, como se mide por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers de 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central está compuesto de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia genética humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en secuencia genética humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como s Eq ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de GENBANK NT_007592.15 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética en particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 1
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Tabla 2
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Tabla 3
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Tabla 4
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Tabla 5
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Ejemplo 2: Inhibición antisentido del Factor B del Complemento humano (CFB) en células HepG2 por gapmers de MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3460_MGB (secuencia directa CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 813; secuencia inversa TGCCTGGAGGGCCTTCTT, designada en la presente como SEQ ID NO: 814; secuencia de sonda AGACCACAAGTTGAAGTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 815) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control sin tratar.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers de 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central está compuesto de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de CFB humano, designado en la presente como s Eq ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de g En BANK NT_007592015 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100% de complementariedad
Tabla 6
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Ejemplo 3: Inhibición antisentido del Factor B del Complemento humano (CFB) en células HepG2 por gapmers de MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo al contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguiente se diseñaron como gapmers de 5-10-5 MOE. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central consiste de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' comprendiendo cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces de fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gapmer en la secuencia genética humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de Ge NBANK NT_007592.15 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética en particular con un 100% de complementariedad. En caso de que no se muestre la alineación de la secuencia para un gen objetivo en una tabla particular, se entiende que ninguno de los oligonucleótidos presentados en esa tabla se alinea con una complementariedad del 100% con ese gen objetivo.
Tabla 7
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Tabla 8
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Ejemplo 4: Inhibición antisentido del factor de complemento B humano (CFB) en células HepG2 por intercomunicadores de MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos en el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 3.000 nM. Después de un
período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se uso el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a Rn , medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 4-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 3-10-4 MOE, 3-10-7 MOE, 6-7-6 MOE, 6-8-6 MOE o 5-7-5 MOE, o como desoxi, MOE y cEt oligonucleótidos.
Los gapmers de 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos del ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 5- 10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 5-7-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 3-10-4 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3 'que comprenden tres y cuatro nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 3-10-7 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y siete nucleósidos, respectivamente. Los gapmers 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos del ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gapmers de 6- 8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene o una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de cEt o una modificación de desoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación de MOE.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso de GENBANK NT_007592015 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia de genes particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 9
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Ejemplo 5: Inhibición antisentido del Factor B del Complemento humano (CFB) en células HepG2 por gapmers de MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 2.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como gapmers de 4-8-5 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, o 6-8-6 MOE.
Los gapmers de 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 5-9 5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 5-10-5 de MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-dexinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers de 3-10-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos 'y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers de 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gapmers de 6-8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes está dirigido al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de acceso de GENBANK NT_007592.15 truncada a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige
a esa secuencia de genes en particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 15
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Tabla 16
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Tabla 17
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Ejemplo 6: Inhibición antisentido del Factor B del Complemento humano (CFB) en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con un oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de cEt o una modificación de desoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación de MOE.
"Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de CFB humano, designado en la presente como s Eq ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso GEn Ba NK NT_007592015 truncado a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa
secuencia genética en particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 18
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Ejemplo 7: Inhibición antisentido del Factor B del Complemento humano (CFB) en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos al ácido nucleico del Factor B del Complemento humano (CFB) y se probaron sus efectos sobre el ARNm de CFB in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados
para cada experimento se presentan por separada en las tablas mostradas a continuación. Se transfectaron células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 500 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de a Rn , medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las Tablas siguientes se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt, o como gapmers de 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE , 3-10-5 MOE, o 6-8-6 MOE.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en donde el nucleósido tiene o una modificación de azúcar de MOE, una modificación de azúcar de cEt o una modificación desoxi. La columna "Química" describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido. 'k' indica una modificación de azúcar cEt; 'd' indica desoxirribosa; y 'e' indica una modificación de MOE.
Los gapmers 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gapmers 3-10-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprenden tres y cinco nucleósidos, respectivamente. Los gapmers 6-7-6 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Los gapmers 6-8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. "Sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el gapmer en la secuencia de genes humana. Cada gapmer enumerado en las Tablas siguientes se dirige al ARNm de CFB humano, designado en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de Acceso de GENBANK NM_001710.5) o a la secuencia genómica del CFB humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (N° de Acceso GENBANK NT_007592015 truncada a partir de los nucleótidos 31852000 a 31861000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética en particular con un 100% de complementariedad.
Tabla 19
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Tabla 20
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Tabla 21
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Tabla 22
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Tabla 23
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Tabla 24
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Ejemplo 8: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2 por gapmers 5 10-5 MOE
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,313 j M, 0,625 j M, 1,25 j M, 2,50 j M, 5,00 j M o 10,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 25
Ejemplo 9: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en varios experimentos con condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,08 j M, 0,25 j M, 0,74 j M, 2,22 j M, 6,67 j M y 20,00 j M, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN,
medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido
Tabla 26
Tabla 27
Tabla 28
Tabla 29
Tabla 29
Tabla 30
Tabla 31
Ejemplo 10: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en varios experimentos con condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,06 j M, 0,25 j M, 1,00 j M y 4,00 j M de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles del ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control sin tratar.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 32
Tabla 33
Tabla 34
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Tabla 35
Tabla 36
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Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB humano en células HepG2
Se seleccionaron gapmers de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro del ARNm de CFB y se probaron a varias dosis en células HepG2. Además, se diseñó un oligonucleótido desoxi, MOE y cEt, ISIS 594430, con la misma secuencia (CTCCTTCCGAGTCAGC, SEQ ID NO: 549) y región objetivo (sitio de inicio objetivo 2195 de la SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio objetivo 6983 de SEQ ID NO: 2 ) como ISIS 588870, otro oligonucleótido desoxi, MOE y cEt. ISIS 594430 es un gapmer de cEt 3-10-3.
Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,01 j i M, 0,04 j i M, 0,12 j i M, 0,37 j i M, 1,11 |jM, 3,33 jiM y 10,00 jiM, como se especifica en la Tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de CFB mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de CFB se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto a las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) para cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de CFB se redujeron de manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 37
Ejemplo 12: Tolerabilidad de gapmers de MOE dirigidos a CFB humano en ratones CD1
Los ratones CD1® (Charles River, MA) son un modelo de ratón multipropósito, utilizado frecuentemente para pruebas de seguridad y eficacia. Los ratones se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores de química del plasma.
Estudio 1 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se inyectaron subcutáneamente a ratones CD1 machos de siete semanas de edad una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Un grupo de ratones CD1 macho se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Un grupo de ratones se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg del oligonucleótido de control ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, designado en la presente como SEQ ID NO: 809, gapmer de 5-10-5 MOE sin objetivo murino conocido). Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles de plasma de las transaminasas y BUN utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 38
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 40 antes de sacrificar a los ratones. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de sacrificar a los ratones. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 39
Estudio 2 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de seis a ocho semanas de edad subcutáneamente una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Un grupo de ratones se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg del oligonucleótido de control ISIS 141923. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis, y se recogieron los órganos y el plasma para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 40
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 42. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 45. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 41
Estudio 3 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de seis a ocho semanas de edad subcutáneamente una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasmas de transaminasas, albúmina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 42
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 42. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 42. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 43
Estudio 4 (con gapmers de (S) cEt y oligonucleótidos de desoxi, MOE y cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de diez semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS de los estudios descritos anteriormente. Además, se diseñaron dos oligonucleótidos, ISIS 594431 e ISIS 594432, como gapmers de 3-10-3 cEt y también se probaron en este estudio. ISIS 594431 (ACCTCCTTCCGAGTCA, SEQ ID NO: 550) está dirigido a la misma región que ISIS 588871, un gapmer de desoxi, MOE y cEt (sitio de inicio objetivo 2197 de la SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio objetivo 6985 de la SEQ ID NO: 2). ISIS 594432 (TGGTCACATTCCCTTC, SEQ ID NO: 542) está dirigido a la misma región que ISIS 588872 un gapmer de desoxi, MOE y cEt (sitio de inicio objetivo 154 de la SEQ ID NO: 1 y sitio de inicio objetivo 1875 de la SEQ ID NO: 2).
Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 44
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 39. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 42. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 45
continuación
Estudio 5 (con gapmers de MOE, gapmers de (S) cEt y oligonucleótidos de desoxi, MOE y cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 machos de ocho a nueve semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótido ISIS. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 46
continuación
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 40. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 42. Los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 47
Estudio 6 (con oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Dos grupos de ratones CD1 macho se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina, bilirrubina y BUN utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 48
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 40. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 45. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 49
Estudio 7 (con gapmers de MOE y desoxi, oligonucleótidos MOE y cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad subcutáneamente una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de oligonucleótidos ISIS. Un grupo de ratones CD1 macho se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal o hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 50
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 44. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 49. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los pesos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 51
continuación
Estudio 8 (con gapmers MOE, oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt, y gapmers cEt)
Se inyectaron a grupos de ratones CD1 macho de ocho a nueve semanas de edad por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas 100 mg/kg de gapmers MOE, o 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt o gapmers cEt. Un grupo de ratones CD1 macho se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Los ratones se sometieron a eutanasia 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para análisis adicional.
Marcadores de química del plasma
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles en plasma de transaminasas, albúmina, creatinina y BUN usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 52
Pesos
Se midieron los pesos corporales de los ratones el día 36. Los pesos de los órganos, el hígado, el riñón y el bazo también se midieron después de que los ratones se sacrificasen el día 43. Los resultados para los pesos de los órganos se expresaron como una relación con los pesos corporales y se normalizaron a la relación de control PBS.
Tabla 53
continuación
Ensayos de citoquinas
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para medir los distintos niveles de citoquinas, como IL-6, MDC, MIP1p, IP-10, MCP1, MIP-1a y RANTES. Los resultados se presentan en la Tabla 54.
Tabla 54
Ensayos de hematología
La sangre obtenida de todos los grupos de ratones se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocritos (HCT), así como de las varias células sanguíneas, como WBC, RBC y plaquetas, y el contenido de hemoglobina total (Hb). Los resultados se presentan en la tabla 55.
Tabla 55
Ejemplo 13: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB humano en ratas Sprague-Dawley Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito usado para evaluaciones de seguridad y eficacia.
Las ratas se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores y se evaluaron los cambios en los niveles de varios marcadores de química del plasma.
Estudio 1 (con gapmers de 5-10-5 MOE)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho, de siete a ocho semanas de edad, en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers 5-10-5 MOE. Un grupo de control de 6 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 56
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 57
Pesos
Se tomaron mediciones del peso corporal el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios
adicionales.
Tabla 58
Estudio 2 (con oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Dos grupos de control de 3 ratas cada uno se inyectaron por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y albúmina y los resultados se presentan en la Tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 59
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 60
Pesos
Las mediciones del peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
Tabla 61
Estudio 3 (con gapmers MOE)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers MOE. Un grupo de control de 6 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para un análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 43 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 62
continuación
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 63
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
Tabla 64
Estudio 4 (con gapmers MOE)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez una semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers MOE. Un grupo de control de 6 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 65
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles en plasma de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 66
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de
estudios adicionales.
Tabla 67
Estudio 5 (con gapmers MOE y oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt)
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a diez semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmer MOE o con 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Un grupo de control de 4 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional. Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 68
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal se midieron los niveles en plasma y orina de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en las Tablas siguientes, expresados en mg/dl. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 69
continuación
Tabla 70
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
Tabla 71
Estudio 6 (gapmers MOE, oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt y gapmers cEt)
Se mantuvieron ratas macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida para ratas normal de Purina, dieta 5001. Cada uno de los grupos de 4 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con 100 mg/kg de gapmers de MOE o con 50 mg/kg de oligonucleótido desoxi, MOE y cEt o gapmer cEt. Un grupo de control de 4 ratas se inyectó por vía subcutánea una vez a la semana durante 6 semanas con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles en plasma de transaminasas el día 42 usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles en plasma de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresada en UI/l.
Tabla 72
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles de proteína total y creatinina en la orina usando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que provocaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios adicionales.
Tabla 73
Pesos
Las mediciones de peso corporal se tomaron el día 39. Los pesos de hígado, corazón, bazo y riñón se midieron al final del estudio el día 42, y se presentan en la tabla siguiente. Los resultados para los pesos de los órganos se expresaron como una relación con los pesos corporales y se normalizaron para la relación de control de PBS.
Tabla 74
continuación
Ejemplo 14: Eficacia de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de CFB en ratones transgénicos hCFB Se probaron compuestos seleccionados para determinar su eficacia en ratones transgénicos CFB humanos, línea fundadora N° 6. El gen de CFB humano está localizado en el cromosoma 6: posición 31913721 31919861. Se seleccionó un Fosmid (ABC14-50933200C23) que contenía la secuencia de CFB para hacer ratones transgénicos que expresan el gen CFB humano. Se usaron las enzimas de restricción Cla I (31926612) y Age I (31926815) para generar un fragmento de 22.127 pb que contiene el gen de CFB para inyección pronuclear. El ADN se confirmó mediante análisis de enzimas de restricción usando Pvu I. El fragmento de a Dn de 22.127 pb se inyectó en embriones C57BL/6NTac. Se criaron 6 fundadores positivos. El fundador N° 6 expresó el ARNm de CFB humano del hígado y se cruzó con la 3a generación. Se usó la progenie de los ratones de 3a generación para evaluar ASO de CFB humanos para la reducción de ARNm de CFB humano.
Tratamiento
Se inyectaron a grupos de 3 ratones cada uno por vía subcutánea dos veces a la semana durante la primera semana 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS, seguido de una dosificación semanal de 50 mg/kg de oligonucleótidos ISIS durante tres semanas adicionales. Un grupo de control de 4 ratones se inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas durante la primera semana con PBS durante la primera semana durante tres semanas adicionales. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, los ratones se sacrificaron y los órganos y el plasma se recogieron para análisis adicional.
Análisis de ARN
Al final del período de dosificación, el ARN se extrajo del hígado y el riñón para el análisis de PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de CFB. Los niveles de ARNm de CFB humano se midieron usando el conjunto de sondas de cebador humano RTS3459. Los niveles de ARNm de CFB se normalizaron a RIBOGREEN®, y también al gen de mantenimiento, Ciclofilina. Los resultados se calcularon como porcentaje de inhibición de la expresión del ARNm de CFB en comparación con el control. Todos los oligonucleótidos antisentido efectuaron la inhibición de los niveles de ARNm de CFB humano en el hígado.
Tabla 75
Ejemplo 15: Inhibición antisentido in vivo de CFB murino
Se diseñaron varios oligonucleótidos antisentido que se dirigieron al ARNm de CFB murino (N° de Acceso de GENBANK NM_008198.2, incorporado en la presente como SEQ ID NO: 5). Los sitios de inicio objetivo y las secuencias de cada oligonucleótido se describen en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la tabla siguiente se diseñaron como gapmers 5-10-5 MOE. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central está compuesto por 102'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos
lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.
Tabla 76
Tratamiento
Se inyectaron a grupos de cuatro ratones C57BL/6 50 mg/kg de ISIS 516269, ISIS 516272, ISIS 516323, ISIS 516330 o ISIS 516341 administrados semanalmente durante 3 semanas. A un grupo de ratones de control se le inyectó solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 3 semanas.
Análisis del ARN de CFB
Al final del estudio, se extrajo el ARN del tejido hepático para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430 (secuencia directa GGGCAAACAGCAATTTGTGA, designada en la presente como SEQ ID NO: 816; secuencia inversa TGGCTACCCACCTCTCCTTGT, designada en la presente como SEQ ID NO: 817; secuencia de sonda CTGGATACTGTCCCAATCCCGGTATTCCX, designada en la presente como SEQ ID NO: 818). Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla siguiente, algunos de los oligonucleótidos antisentido lograron la reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 77
Análisis de proteínas
Los niveles de proteína CFB se midieron en el riñón, el hígado, el plasma y en el ojo mediante transferencia Western usando anticuerpo anti-CFB de cabra (Sigma Aldrich). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, en relación con el control de PBS. 'n/a' indica que no se tomaron mediciones para esa muestra. Como se muestra en la Tabla siguiente, la inhibición antisentido de CFB por los oligonucleótidos ISIS dio como resultado una reducción de la proteína de CFB en varios tejidos. Como se muestra en la Tabla siguiente, la administración sistémica de oligonucleótidos ISIS fue efectiva para reducir los niveles de CFB en el ojo.
Tabla 78
Ejemplo 16: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de CFB murino
Se inyectaron a grupos de cuatro ratones C57BL/6 cada uno 25 mg/kg, 50 mg/kg o 100 mg/kg de ISIS 516272, e ISIS 516323 administrado semanalmente durante 6 semanas. A otros dos grupos de ratones se les inyectaron 100 mg/kg de ISIS 516330 o ISIS 516341 administrados semanalmente durante 6 semanas. A dos grupos de ratones de control se les inyectó una solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada semanalmente durante 6 semanas.
Análisis del ARN de CFB
Se extrajo ARN de los tejidos hepáticos y renales para análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla siguiente, los oligonucleótidos antisentido lograron una reducción dependiente de la dosis de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 79
Análisis de proteínas
Se midieron los niveles de proteína de CFB en el plasma mediante transferencia Western usando anticuerpo anti-CFB de cabra (Sigma Aldrich). Como se muestra en la tabla siguiente, la inhibición antisentido de CFB por los oligonucleótidos ISIS dio como resultado una reducción de la proteína CFB. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control de PBS. 'n/a' indica que no se realizaron mediciones para esa muestra.
Los niveles de proteína de CFB también se midieron en el ojo mediante transferencia Western. Todos los grupos de tratamiento demostraron una inhibición de CFB en un 95%, con algunas mediciones de muestras que estaban por debajo de los niveles de detección del ensayo.
Tabla 80
Ejemplo 17: Efecto de la inhibición antisentido de CFB en el modelo de ratón NZB/W F1
El NZB/W F1 es el modelo clásico más antiguo de lupus, donde los ratones desarrollan fenotipos severos similares a lupus comparables a los de los pacientes con lupus (Theofilopoulos, A.N. y Dixon, F.J. Advances in Immunology, vol. 37, pp. 269-390, 1985 ). Estos fenotipos similares a lupus incluyen linfadenopatía, esplenomegalia, autoanticuerpos antinucleares séricos elevados (ANA) que incluyen IgG anti-ADNbc, la mayoría de los cuales son IgG2a e IgG3, y glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios (GN) que se manifiesta a los 5-6 meses de edad, lo que lleva a insuficiencia renal y muerte a los 10-12 meses de edad.
Estudio 1
Se realizó un estudio para demostrar que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB mejoraría la patología renal en el modelo de ratón. Se adquirieron ratones hembra NZB/W F1 de 17 semanas de edad de Jackson Laboratories. Grupos de 16 ratones recibieron cada uno dosis de 100 pg/kg/semana de ISIS 516272 o ISIS 516323 durante 20 semanas. Otro grupo de 16 ratones recibió dosis de 100 pg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 20 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 20 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis inyectada.
Análisis del ARN de CFB
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Los niveles de ARNm se normalizaron usando RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla siguiente, algunos de los oligonucleótidos antisentido lograron la reducción de CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 81
Proteinuria
Se espera una proteinuria en el 60% de los animales en este modelo de ratón. La incidencia acumulada de proteinuria grave se midió calculando la proporción de proteína total a creatinina usando un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB logró una reducción de la proteinuria en los ratones en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
Tabla 82
Supervivencia
La supervivencia de los ratones se controló llevando la cuenta de los ratones al comienzo del tratamiento y luego nuevamente en la semana 20. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB aumentó la supervivencia en los ratones en comparación con los ratones tratados con PBS de control y con oligonucleótidos de control.
Tabla 83
Deposición glomerular
La cantidad de deposición de C3, así como la deposición de IgG, en los glomérulos de los riñones se midió mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-C3. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB logró una reducción de las deposiciones de C3 e IgG en los glomérulos renales en comparación con los ratones tratados con control de PBS y
con oligonucleótidos de control.
Tabla 84
Estudio 2
Se adquirieron ratones NZB/W F1 hembra de 16 semanas de edad de Jackson Laboratories. Un grupo de 10 ratones recibió dosis de 100 pg/kg/semana de ISIS 516323 durante 12 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de 100 pg/kg/semana del oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 12 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 12 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de que se inyectase la última dosis. Análisis del ARN de CFB
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con ISIS 516323 logró una reducción del CFB murino sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 85
Proteinuria
Se evaluó la incidencia acumulada de proteinuria grave midiendo la proporción de proteína a creatinina total en orina, así como midiendo los niveles totales de microalbúmina. Los resultados se presentan en las tablas siguientes y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB redujo la proteinuria en los ratones en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
Tabla 86
Tabla 87
Supervivencia
Se controló la supervivencia de los ratones llevando la cuenta de los ratones al inicio del tratamiento y luego nuevamente en la semana 12. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB aumentó la supervivencia en los ratones en comparación con los ratones tratados con control de PBS y con oligonucleótidos de control.
Tabla 88
Ejemplo 18: Efecto de la inhibición antisentido de CFB en el modelo de ratón MRL
El modelo de ratón de nefritis lúpica MRL/lpr desarrolla un fenotipo tipo LES caracterizado por linfadenopatía debido a una acumulación de células T doble negativas (CD4- CD8- ) y B220+. Estos ratones muestran una tasa de mortalidad acelerada. Además, los ratones tienen altas concentraciones de inmunoglobulinas circulantes, que incluyen niveles elevados de autoanticuerpos como ANA, anti-ADNmc, anti-ADNbc, anti-Sm y factores reumatoides, lo que resulta en grandes cantidades de complejos inmunes (Andrews, B. et al., J. Exp. Med.
148: 1198-1215, 1978).
Tratamiento
Se realizó un estudio para investigar si el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB revertiría la patología renal en el modelo de ratón. Se adquirieron ratones MRL/lpr hembra de 14 semanas de edad de Jackson Laboratories. Un grupo de 10 ratones recibió dosis de 50 pg/kg/semana de ISIS 516323 durante 7 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de 50 pg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 7 semanas. Otro grupo de 10 ratones recibió dosis de PBS durante 7 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis de inyección.
Análisis del ARN de CFB
Se extrajo ARN de tejido hepático para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la Tabla siguiente, ISIS 516323 redujo el CFB sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 89
Patología renal
La patología renal se evaluó por dos métodos. Se tiñeron secciones histológicas del riñón con hematoxilina y eosina. El control de PBS demostró la presencia de precipitados tubulares crecientes multiglomerulares, que es un síntoma de glomeruloesclerosis. Por el contrario, las secciones de ratones tratados con ISIS 516323 mostraron la ausencia de precipitados tubulares crecientes con cambios fibróticos en la cápsula de bowman mínimos, expansión de células mesangiales segmentarias de moderada a grave y engrosamiento de la membrana basal glomerular.
También se evaluó la acumulación de C3 en el riñón mediante inmunohistoquímica con anticuerpos anti-C3. La puntuación de la intensidad de la inmunohistoquímica de C3 del riñón completa se calculó mediante el sistema de puntuación de la intensidad, que se calculó capturando 10 glomérulos por riñón y calculando la intensidad de la tinción de C3 positiva. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 redujo la acumulación de C3 renal en comparación con los grupos de control.
Tabla 90
Niveles de C3 en plasma
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, evitando el consumo de C3 y llevando a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la hemorragia terminal se midieron mediante un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 aumentó los niveles de C3 (p <0,001) en el plasma en comparación con los grupos de control.
Tabla 91
Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a CFB revierte la patología renal en el modelo de ratón de lupus.
Ejemplo 19: Efecto de la inhibición antisentido de CFB en el modelo de ratón CFH Het
El modelo de ratón heterocigótico de CFH (CFH Het, CFH+/-) expresa una proteína del Factor H mutante en combinación con la proteína de ratón de longitud completa (Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med. 2007. 204: 1249-56). La histología renal permanece normal en estos ratones hasta los seis meses de edad.
Estudio 1
Grupos de 8 ratones CFH+/- de 6 semanas de edad recibieron cada uno dosis de 75 mg/kg/semana de ISIS 516323 o ISIS 516341 durante 6 semanas. Otro grupo de 8 ratones recibió dosis de 75 mg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 6 semanas. Otro grupo de 8 ratones recibió dosis de PBS durante 6 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis de inyección.
Análisis del ARN de CFB
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la Tabla siguiente, los oligonucleótidos antisentido redujeron el CFB sobre el control de PBS. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 92
Niveles de C3 en plasma
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, evitando el consumo de C3 y llevando a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la colección de plasma terminal se midieron mediante un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con ISIS 516323 aumentó el C3 a niveles normales en el plasma.
Tabla 93
Estudio 2
Grupos de 5 ratones CFH+/- cada uno recibieron dosis de 12,5 mg/kg/semana, 25 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana, 75 mg/kg/semana o 100 mg/kg/semana de ISIS 516323 o ISIS 516341 durante 6 semanas. Otro grupo de 5 ratones recibió dosis de 75 pg/kg/semana de oligonucleótido de control ISIS 141923 durante 6 semanas. Otro grupo de 5 ratones recibió dosis de PBS durante 6 semanas y sirvió como grupo de control con el que se compararon todos los otros grupos. Los puntos finales terminales se recogieron 48 horas después de la última dosis de inyección.
Análisis del ARN de CFB
Se extrajo ARN del tejido hepático y renal para el análisis de PCR en tiempo real de CFB, usando el conjunto de sondas de cebador RTS3430. Como se muestra en la Tabla siguiente, los oligonucleótidos antisentido redujeron el CFB sobre el control de PBS de una manera dependiente de la dosis. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de CFB, con respecto al control.
Tabla 94
Niveles de C3 en plasma
La reducción de CFB inhibe la activación de la vía alternativa del complemento, evitando el consumo de C3 y llevando a una elevación aparente de los niveles de C3 en plasma. Los niveles de C3 en plasma de la colección de plasma terminal se midieron mediante un analizador clínico. Los resultados se presentan en la tabla siguiente y demuestran que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dirigidos a CFB aumentó los niveles de C3 en el plasma.
Tabla 95
Ejemplo 20: Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a CFB humano en monos cynomolgus Se trataron monos Cynomolgus con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos anteriores. Se evaluaron la eficacia y tolerabilidad del oligonucleótido antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón.
En el momento en que se realizó este estudio, la secuencia genómica del mono cynomolgus no estaba
disponible en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI); por lo tanto, la reactividad cruzada con la secuencia del gen del mono cynomolgus no pudo ser confirmada. En su lugar, se usaron las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS usados en los monos cynomolgus con una secuencia de monos rhesus para homología. Los oligonucleótidos antisentido humanos analizados a continuación tienen reactividad cruzada (con 0 o 1 malapareamientos) con la secuencia genómica derhesus (N° de Acceso de GENBANK NW _001116486.1 truncado a partir de los nucleótidos 536000 a 545000, designada en la presente como SEQ ID NO: 3). Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido dirigidos a la SEQ ID NO: 3 se presentan en la Tabla siguiente. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmer en la secuencia de genes del mono rhesus. Los "malapareamientos" indican el número de nucleobases en el oligonucleótido humano que no coinciden con la secuencia genómica de rhesus.
Tabla 96
Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante por lo menos un período de 30 días, durante los cuales los animales se observaron diariamente para su salud general. Los monos tenían 2-4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. Once grupos de 4-6 monos cynomolgus macho asignados al azar fueron inyectados cada uno por vía subcutánea con oligonucleótido ISIS o PBS en cuatro sitios en la espalda en una rotación en sentido de las agujas del reloj (es decir, izquierda, superior, derecha e inferior), un sitio por dosis. Los monos recibieron cuatro dosis de carga de PBS o 40 mg/kg de ISIS 532800, ISIS 532809, ISIS 588540, ISIS 588544, ISIS 588548, ISIS 588550, ISIS 588553, ISIS 588555, ISIS 588848, o ISIS 594430 durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7), y posteriormente se administró una dosis por semana durante 12 semanas (días 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 y 84) con PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS.
Reducción del objetivo hepático
Análisis del ARN
En el día 86, se recogieron muestras de hígado y riñón por duplicado (aproximadamente 250 mg cada una) para el análisis de ARNm de CFB. Las muestras se congelaron al instante en nitrógeno líquido en necropsia en el plazo de aproximadamente 10 minutos después del sacrificio.
Se extrajo ARN del hígado y el riñón para el análisis de PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de CFB. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, con respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Los niveles de ARN también se normalizaron con el gen doméstico, Ciclofilina A. Los niveles de ARN se midieron con los conjuntos de sondas de cebador RTS3459, descritos anteriormente, o RTS4445_MGB (secuencia directa CGAAGAAGCTCAGTGAAATCAA, designada en la presente como SEQ ID NO: 819; secuencia inversa TGCCTGGAGGGCCTCTT, designada en la presente como SEQ ID NO: 820; secuencia de sonda AGACCACAAGTTGAAGTC, designada en la presente como SEQ ID NO: 815).
Como se muestra en las Tablas siguientes, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción del ARNm de CFB en comparación con el control de PBS. El análisis de los niveles de ARNm de CFB reveló que varios de los oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de CFB en el hígado y/o riñón. Aquí '0' indica que los niveles de expresión no se inhibieron. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares.
Tabla 97
Tabla 98
Análisis de proteínas
Se recogió aproximadamente 1 ml de sangre de todos los animales disponibles en el día 85 y se colocó en tubos que contenían la sal de potasio de EDTA. Las muestras de sangre se colocaron en hielo húmedo o Kryorack inmediatamente, y se centrifugaron (3000 rpm durante 10 minutos a 4° C) para obtener plasma (aproximadamente 0,4 ml) en el plazo de 60 minutos desde la recogida. Los niveles en plasma de CFB se midieron en el plasma mediante inmunodifusión radial (RID), usando un anticuerpo policlonal anti-Factor B. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. El ISIS 532770 se probó en un estudio separado y los niveles de proteína plasmática se midieron el día 91 o 92 en ese grupo.
El análisis de CFB en plasma reveló que varios oligonucleótidos ISIS redujeron los niveles de proteína de manera sostenida. El ISIS 532770, que se probó en un estudio separado, redujo los niveles de proteína de CFB en el día 91/92 en un 50% en comparación con los valores de referencia. La reducción en los niveles de proteína de CFB en plasma se correlaciona bien con la reducción del nivel de ARNm de CFB hepático en los grupos correspondientes de animales.
Tabla 99
Estudios de tolerabilidad
Mediciones de peso corporal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y de órganos y se presentan en la Tabla siguiente. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el peso corporal y de los órganos estuvo dentro del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
Tabla 100
Tabla 101
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se tomaron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. Se recogió sangre (1,5 ml) en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron (aproximadamente 3.000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Los niveles de varios marcadores de la función hepática se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón).
Se midieron los niveles en plasma de ALT y AST y los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en IU/l. La bilirrubina, un marcador de la función hepática, se midió de manera similar y se presenta en la tabla siguiente expresada en mg/dl. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra. Los resultados indican que la mayoría de los oligonucleótidos antisentido no tuvieron efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 102
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se tomaron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron (aproximadamente 3.000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresada en mg/dl. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra.
Para el análisis de orina, se recogió orina fresca de todos los animales por la mañana usando una bandeja de jaula limpia en hielo húmedo. La comida se retiró durante la noche el día anterior a la recogida de la orina, pero se suministró agua. Se analizaron las muestras de orina (aproximadamente 1 ml) para determinar la relación de proteína a creatinina (P/C) usando un analizador de química automatizado Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). 'n.d.' indica que el nivel de proteína en la orina estaba por debajo del límite de detección del analizador.
Los datos químicos del plasma y la orina indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para oligonucleótidos antisentido.
Tabla 103
Tabla 104
continuación
Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre los parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 0,5 ml de sangre de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Las muestras se analizaron para el recuento de glóbulos rojos (RBC), el recuento de glóbulos blancos (WBC), los recuentos de glóbulos blancos individuales, como el onocitos, neutrófilos, linfocitos, así como el recuento de plaquetas, el contenido de hemoglobina y hematocrito, usando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, USA). Los datos se presentan en las tablas siguientes. '*' indica que el oligonucleótido se probó en un estudio separado con condiciones similares y es la media de las mediciones de monos macho y hembra.
Los datos indican que los oligonucleótidos no provocaron cambios en los parámetros hematológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis.
Tabla 105
Claims (12)
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 440, 198, 228, 237, 444, 448, 450, 453 o 455, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 440, en el que el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
3. Un compuesto que tiene la fórmula:
, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 598, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consiste de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consiste de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde el segmento de ala 5' comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, azúcar 2'-O-metoxietilo, y azúcar cEt en la dirección 5' a 3'; en donde el segmento del ala 3' comprende un azúcar cEt, azúcar cEt, y azúcar 2'-O-metoxietilo en la dirección 5' a 3 '; en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
5. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 16 nucleósidos enlazados que tienen una secuencia de nucleobases que consiste de la secuencia enumerada en la SEQ ID NO: 549, en donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento del ala 5' que consiste de tres nucleósidos enlazados; y
un segmento del ala 3' que consiste de tres nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3'; en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar cEt; en donde cada enlace internucleosídico
es un enlace fosforotioato; y en donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el compuesto consiste del oligonucleótido modificado.
7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el oligonucleótido modificado comprende además un grupo conjugado.
8. Una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
9. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición de la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad asociada con la desregulación de la vía alternativa del complemento.
10. El compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la vía alternativa del complemento se activa más de lo normal.
11. El compuesto o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad es degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), DMAE húmeda, DMAE seca o Atrofia Geográfica.
12. El compuesto o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad es una enfermedad renal, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad por depósito denso (DDD), glomerulonefritis C3 (C3GN), nefropatía CFHR5, o síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS).
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