JP2002542263A - ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物 - Google Patents

ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物

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JP2002542263A JP2000612443A JP2000612443A JP2002542263A JP 2002542263 A JP2002542263 A JP 2002542263A JP 2000612443 A JP2000612443 A JP 2000612443A JP 2000612443 A JP2000612443 A JP 2000612443A JP 2002542263 A JP2002542263 A JP 2002542263A
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Abstract

(57)【要約】 哺乳類細胞における標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害する治療用組成物が、長さが少なくとも約２００のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子を哺乳類細胞に供する物質を含み、ここで該ポリヌクレオチド配列が該標的ポリヌクレオチド配列と実質的に相同である。このＲＮＡ分子は、望ましくは、機能的タンパク質を産生しない。この組成物に有用な物質はインビトロでの酵素的合成方法または化学的合成方法により生成される；あるいは微生物の組換え培養基にて生成され、それから単離された；あるいはまた、哺乳類細胞に送達された後にインビボにて所望のＤＮＡ分子を産生することのできるＲＮＡ分子とすることができる。ウイルス感染、他の病原性感染または特定の癌の治療または予防法においては、これらの組成物を、とりわけ、病原性起源であるか、または腫瘍または他の癌に応答して産生され得る、標的ポリヌクレオチド配列の機能を減少または阻害するのに有効な量にて投与する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、哺乳類細胞に存在する特定の標的ポリヌクレオチド配列の機能に
対する阻害的または他の制御的効果を有するポリヌクレオチド組成物、および治
療、予防、診断および研究方法においてその組成物を使用する方法に関する。
【０００２】 （背景技術） ポリヌクレオチド組成物は、主に哺乳類の疾病の治療または予防用の、ならび
にかかる分野における研究用の医薬的使用のために記載されている。特に、現在
、ウイルス、細菌、真菌感染などの病原性細胞外および細胞内感染の治療におけ
るポリヌクレオチド組成物の使用の周りに多くの活動範囲がある。一例として、
ＤＮＡワクチンは、哺乳類免疫系を利用することによって病原体と闘う薬剤をイ
ンビボで哺乳類細胞に送達すると記載されている。従ってかかるワクチンは、例
えばウイルスタンパク質またはポリペプチドを発現し、かつ感染剤による攻撃に
対する体液性または細胞性免疫応答を誘発するように設計されている。他方で、
遺伝子治療ベクターは、一般に、哺乳類において発現されないか、不適当に発現
されるか、あるいは低発現であるかのいずれかであるタンパク質を哺乳細胞に送
達するように設計されているポリヌクレオチド組成物である。かかるベクターは
、抗原と認識され、あるいは、好ましくない細胞性免疫応答を誘導するこれらポ
リヌクレオチド配列に対する種特異的免疫応答と取り組まねばならないことが多
い。
【０００３】 さらに、ポリヌクレオチド組成物の他の治療的使用は、疾病を有する哺乳類患
者に、失われた、あるいは低発現のタンパク質を送達するためである。さらに、
ポリヌクレオチドは、インビボ試薬、遺伝子治療における試薬としての診断的／
画像的プロトコル、アンチセンスプロトコルおよびワクチン応用としてまたはさ
もなければ、遺伝的欠損、感染症疾疾病、および自己免疫疾患のごとき種々の病
気を治療または予防するのに使用される医薬品として有用である。ポリヌクレオ
チドはまた、生物学的研究アッセイ、医学的、診断的およびスクリーニングアッ
セイおよび汚染検出アッセイなどのアッセイのインビトロ試薬として有用である
。 当該分野で周知の問題の宿主は、有用な医薬品として広く受け入れられるよう
になってきた多数のポリヌクレオチド組成物を妨害してきた。従って、哺乳類に
おける疾患の治療のために医学界ですでに受け入れられているかかるＤＮＡワク
チンまたは治療剤はあまりない。
【０００４】 ポリヌクレオチド組成物によって媒介される現象は、植物および線虫で観察さ
れており、転写後遺伝子サイレンシングおよび転写サイレンシングと言われる。
この現象は、細胞内ですでに発現されているプロモーターまたは本来の遺伝子ま
たはその一部のごとき制御要素といくらかの相同性を有するポリヌクレオチド配
列を発現するウイルス、ウイロイド、プラスミドまたはＲＮＡによる植物、線虫
またはショウジョウバエのトランスフェクションまたは感染が内因性制御要素ま
たは遺伝子および外因性配列の両者の発現の永久的阻害を結果として生じ得るこ
とを示す。このサイレンシング効果は遺伝子特異的と示されていた。例えば、L.
TimmonsおよびA.Fire、Nature, ３９５：３５４（１９９８年１０月２９日）；A
.Fireら、Nature, ３９１：８０６−８１０（１９９８年２月１９日）；およびR
.Jorgensenら、Science, ２７９：１４８６−１４８７（１９９８年３月６日）
を参照されたい。全長、プロ−アルファ１コラーゲン遺伝子をコードするＤＮＡ
プラスミドが一時的にげっ歯類の繊維芽細胞組織細胞系にトランスフェクトされ
、本来のコラーゲン遺伝子に対する「サイレンシング」効果および一時的発現の
遺伝子が観察された。［BahramianおよびZarbl, Mol. Cell Bili., １９（１）
：２７４−２８３（１９９９年１月）］。
【０００５】 また、二次構造のアンチセンスＲＮＡおよび／または二本鎖のＲＮＡ分解酵素
と組み合わせて使用することによる遺伝子阻害に関する１９９８年２月１２日発
行の国際出願ＷＯ９８／０５７７０を参照されたい。１９９９年１０月２１日発
行の国際出願ＷＯ９９／５３０５０は、特に植物細胞においてセンスおよびアン
チセンスＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子の導入による核酸の表現型発現の
減少に関する。 哺乳類における不可欠な遺伝子配列に悪影響を及ぼすことなく、哺乳細胞にウ
イルスおよび他の細胞内病原体の複製に必須のポリヌクレオチド配列または細胞
外哺乳類病原体の配列または、哺乳類において癌の広がりを媒介する腫瘍抗原の
配列などのごとき哺乳類に疾患を引き起こすポリヌクレオチド組成物およびその
物を用いてポリヌクレオチド配列の機能を阻害する方法に対する要求がある。
【０００６】 （発明の開示） 一の態様において、本発明は、哺乳類細胞において標的ポリヌクレオチド配列
の機能を阻害するための組成物を提供する。組成物は、少なくとも長さ約２００
ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含む少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分
子を哺乳細胞へ提供する物質（agent）を含む。ポリヌクレオチド配列は、実質
的には標的ポリヌクレオチド配列と相同であり、例えば、ウイルスまたは他の細
胞内病原体のポリヌクレオチド配列、癌抗原または必須の発癌性調節配列のポリ
ヌクレオチド配列、哺乳類に存在する細胞外病原体のポリヌクレオチド配列また
は細胞内で「スイッチがオフである」ことが望ましい他のポリヌクレオチド配列
であり得る。このＲＮＡ分子は、好ましくは、機能タンパク質を生産しない。こ
のＲＮＡ分子は、好ましくは、実質的には天然に存する必須の哺乳類ポリヌクレ
オチド配列と相同ではない。一の具体例において、この組成物の物質は、インビ
トロで、酵素合成法または化学合成法によって作成されるＲＮＡ分子である。も
う１つ別の具体例において、ＲＮＡ分子は、組換え培養基、例えばそれより単離
される細菌細胞から生成され、下記の方法で使用される。もう１つの具体例にお
いて、この組成物の物質は哺乳類細胞へ送達後のインビボのＲＮＡ分子を生成す
る。
【０００７】 もう１つの態様において、本発明は、医薬上許容される担体中、１つ以上の直
前、かつ以下詳細に記載した組成物および細胞内のポリヌクレオチド取り込みを
促進する任意の第二物質を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、ウイル
スのごとき細胞内病原体感染を治療するのに有用である。他のかかる組成物は、
ある癌の治療に有用である。他のかかる組成物は、ある細胞外病原体の治療に有
用である。さらに他のかかる組成物は、哺乳類でポリヌクレオチド配列の機能を
阻害することが治療またはワクチンの使用に望ましいといういずれの疾患または
疾病の治療に有用である。
【０００８】 さらなるもう１つの態様において、本発明は、標的ポリヌクレオチドが、感染
した哺乳類細胞内でのウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルス
ポリヌクレオチド配列である１つ以上の前記記載の組成物を、医薬上許容される
担体中、細胞内のポリヌクレオチド取り込みを促進させる所望の第二物質と共に
哺乳類に投与することによって哺乳類のウイルス感染を治療する方法を提供する
。本組成物は、哺乳類細胞内でウイルス配列の機能を減少させるかあるいは阻害
するのに有効な量で投与される。 さらにさらなる態様において、本発明は、標的ポリヌクレオチドが感染哺乳類
細胞内でウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルスポリヌクレオ
チド配列である、１つ以上の前記記載の組成物を、医薬上許容される担体中、細
胞内のポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に哺乳類に投与
することによって、哺乳類のウイルス感染を予防する方法を提供する。本組成物
は、その後のウイルスの哺乳類細胞への導入におけるウイルス配列の機能を減少
あるいは阻害するのに有効な量で投与される。
【０００９】 さらにもう１つの態様において、本発明は、標的ポリヌクレオチドが、配列機
能が哺乳類の腫瘍の維持に必要である腫瘍抗原またはその機能的フラグメントま
たは制御配列をコードする配列である、１つ以上の前記記載の組成物を哺乳類に
投与することによって、哺乳類のウイルス誘発癌の治療または予防の方法を提供
する。本組成物は、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質
および医薬上許容される担体を含んでよい。本組成物は、哺乳類において腫瘍−
維持配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与される。 もう１つの態様において、本発明は、細胞内病原体による哺乳類の感染の治療
または予防方法を提供する。哺乳類には、標的ポリヌクレオチドが、感染哺乳類
細胞内で病原体の複製および／または発生病理に必要な細胞内病原体のポリヌク
レオチド配列である、１つ以上の本明細書中に記載の組成物を投与する。本組成
物は、哺乳類において配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、医薬
上許容される担体中、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物
質と共に投与される。
【００１０】 もう１つの態様において、本発明は、細胞外哺乳類病原体による哺乳類の感染
の治療または予防のための方法を提供する。哺乳類に、標的ポリヌクレオチドが
、感染哺乳類内で病原体の複製および／または発生病理に必要な細胞外病原体の
ポリヌクレオチド配列である、１つ以上の本明細書中に記載の組成物を投与する
。本組成物は、医薬上許容される担体上、哺乳類において配列の機能を減少ある
いは阻害するのに有効な量で投与される。病原体細胞によってポリヌクレオチド
取り込みを促進する所望の第二物質と共に投与されてもよい。 さらにもう一つの態様において、本発明は哺乳類の癌の治療または予防方法を
提供する。哺乳類に、標的ポリヌクレオチドが、また遺伝子または制御配列の正
常なコピーを有する、哺乳類における異常な癌を引き起こす遺伝子または非−発
現制御配列である１つ以上の前記記載の組成物を投与する。この態様によれば、
異常な配列および正常な配列間の差異はポリヌクレオチドの差異である。本組成
物は、哺乳類において異常な配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で
、医薬上許容される担体中、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の
第二物質と共に投与される。
【００１１】 さらに、さらなる態様において本発明は、健常な哺乳類には見られないポリヌ
クレオチド産物の発現によって特徴付けられる疾患または疾病を有する哺乳類に
、標的ポリヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド産物または該産物の発現に必
須の非−発現制御配列を発現するポリヌクレオチド配列である１つ以上の前記記
載の組成物を投与することを含む、哺乳類における疾患または疾病の治療方法に
関わる。本組成物は、哺乳類細胞において標的ポリヌクレオチド産物または制御
配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、医薬上許容される担体中、
細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共にまたはなしで
投与される。
【００１２】 本発明のさらにもう１つの態様は、診断または他の研究アッセイにおける使用
のためインビトロで、または治療または他の医学的使用のための哺乳類へのリタ
ーンのためエキソ・ビボで哺乳類細胞または組織における望ましくない遺伝子発
現を減少あるいは阻害する試薬のような研究方法における使用のためにかかる組
成物を提供する。 本発明の他の態様は、以下のその好ましい具体例の詳細な記載に記載される。
【００１３】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、目標が選択される標的ポリヌクレオチド配列の機能を減少あるいは
阻害することである哺乳類種を苦しめる疾患および疾病における治療、予防、研
究および診断のための新規ポリヌクレオチド組成物および方法を提供する。これ
ら組成物および方法は、インビトロおよびインビボの両者で有用性を有する。こ
れら組成物および方法は、さらに、細胞の分子機構の利用に関わる哺乳類の免疫
系の促進の必要なくして治療目標を達成させる。
【００１４】 本明細書中に使用されるように、「標的」または「標的ポリヌクレオチド配列
」なる語は、ポリヌクレオチド配列が減少あるいは阻害されることが望まれる機
能を有する、細胞内または細胞外病原性感染または疾患により存在する、天然に
存在して欠損の可能性のある哺乳類ポリヌクレオチド配列または異種の配列のい
ずれかで、哺乳類細胞または哺乳類生物内にあるいずれの配列もいう。この標的
配列は、コード配列であってもよく、すなわち、翻訳されてタンパク質またはそ
の機能的フラグメントを発現する。あるいは、標的配列は非−コードでもあって
もよいが、制御機能を有し得る。ある標的ポリヌクレオチド配列は感染哺乳類細
胞におけるウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルスポリヌクレ
オチド配列である。もう１つの標的ポリヌクレオチド配列の具体例は、配列が哺
乳類において腫瘍の維持に必要であるウイルス−誘発癌の腫瘍抗原またはその機
能的フラグメントまたは非−発現制御配列である。標的ポリヌクレオチド配列の
さらにもう１つの具体例は、感染哺乳類における病原体の複製および／または発
生病理に必要な細胞内または細胞外病原体のポリヌクレオチド配列である。標的
ポリヌクレオチド配列のさらにもう１つの具体例は、遺伝子または配列の正常な
コピーを有する哺乳類における異常な癌を引き起こす遺伝子（または非−発現制
御配列）のポリヌクレオチド配列である。異常配列および正常配列間の差異はポ
リヌクレオチド配列レベルでの差異である。かかる異常配列は例えば、２つの正
常遺伝子の融合体であってもよく、標的配列は、融合体をスパンする配列、例え
ば、ある白血病に特徴的なＢＣＲ−ａｂｌ遺伝子配列であってもよい。「遺伝子
」なる語は、プロモーターのごとき制御配列を含む、転写かつ／あるいは翻訳さ
れてもされなくても、「サイレンシング」されると意図されるいずれの標的配列
をも含むと意図される。「哺乳類」または「哺乳動物」なる語は、その通常の意
味を含むと意図される。本発明は、もっとも望ましくは、ヒトにおける効力を意
図する一方、また、イヌ、ネコおよびウマならびに例えば、動物園の動物、農場
などの特に問題の哺乳類のごとき家畜動物に用いることもできる。
【００１５】 Ａ．本発明の組成物 本発明によって、哺乳類細胞の標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害する組
成物は、少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子を哺乳類細胞に供する物質を含む
。一般に、「ＲＮＡ」なる語はまた、他に記載がなければ、例えば、リボースの
２'−OH基が独特の結合に必要であるといったＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドも含
む。ＲＮＡ分子は分子中に少なくとも長さ約２００ヌクレオチドのポリヌクレオ
チド配列を含む。重要なことには、ＲＮＡ分子のこのポリヌクレオチド配列は、
実質的に標的ポリヌクレオチド配列と相同である。このポリヌクレオチド配列は
また、好ましくは、エクソン配列またはその部分を含む。望ましくは、ポリヌク
レオチド配列はイントロン配列を含まない。好ましくは、ＲＮＡ分子は機能タン
パク質を産生せず、より好ましくは、翻訳されない。ＲＮＡ分子のポリヌクレオ
チド配列は、好ましくは実質的に、いずれの天然に存在し、正常に機能し、必須
の哺乳類ポリヌクレオチド配列とも非−相同である。本明細書中に記載のポリヌ
クレオチド配列は、複数標的またはポリエピトープ方法、例えば、単一の標的病
原体の、１つ以上の標的病原体に対する、またはサイレンシングしようと望まれ
る他の種類の標的の１つ以上の遺伝子の配列をコードすることを使用する。
【００１６】 「少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子」なる語は、長さ約１００ないし１０
,０００間のポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む。現在、も
っとも望ましくは、配列は少なくとも長さ２００ヌクレオチドであるが、ある具
体例では、長さ２００ないし８０００ポリヌクレオチドの範囲であってよい。も
う１つの具体例では、ＲＮＡ分子は、長さ７５００ポリヌクレオチドより短くて
よい。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は約５０００ポリヌクレオチド
より短い配列を有してもよい。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は、約
２０００ポリヌクレオチドより短い配列を有してもよい。さらにもう１つの具体
例では、ＲＮＡ分子は、約１０００ポリヌクレオチドより短い配列を有してもよ
い。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は約７５０ポリヌクレオチドより
短い配列を有してもよい。
【００１７】 最低限、ＲＮＡ分子を安定に保つために、ポリヌクレオチド配列の組成お物よ
びΔＧ約−９.２kcal／molに依存して、二本鎖配列に関わる最小１１ないし３０
のヌクレオチドを有する。当該分野では公知のごとく、ΔＧは分子の立体配置を
安定に保つのに必要な最小外部エネルギーの状態を規定する［例えば、Jaegerら
、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ２０：７７０６−７７１０（１９８９）およ
びSolerおよびJankowski, Math. Biosci., ２：１６７−１９０（１９９１）を
参照］。この最小限度に基づいて、この一部は二本鎖のＲＮＡ分子配列の少なく
とも１０％は二本鎖である。あるいは、これらＲＮＡ分子の二本鎖部分は配列の
少なくとも３０％であってよい。もう１つの具体例において、これら分子の二本
鎖部分は配列の少なくとも５０％であってよい。さらにもう１つの具体例におい
て、これら分子の二本鎖部分は配列の少なくとも７０％であってよい。さらにも
う１つの具体例において、これら分子の二本鎖部分は配列の少なくとも９０％で
あってよい。もう１つの具体例において、配列全体が二本鎖であってよい。ある
いは、これら分子の二本鎖部分は、分子が直鎖である場合には、配列の末端のい
ずれかまたは両端、または中間部分で存在してもよい。同様に、分子が環状であ
る場合は、二本鎖部分はいずれの位置で存在してもよい。本発明のある具体例に
おいて、分子が哺乳類細胞内にある場合にのみＲＮＡ分子の二本鎖部分は二本鎖
になる。本発明のさらに他の具体例において、部分的二本鎖分子はＲＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッド、例えば、インビトロで調製されるＲＮＡおよびＤＮＡを含む単
鎖または、２つのかかる単鎖の二重螺旋またはその一部である。さらにもう１つ
の具体例において、インビボまたはインビトロで作成されたＲＮＡ分子はＲＮＡ
単鎖およびＤＮＡ単鎖を含む二重螺旋である。
【００１８】 部分的二本鎖のＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列は、その機能を有効に減少あ
るいは阻害するために、実質的に標的ポリヌクレオチド配列と相同でなくてはな
らない。必要な相同性は適当にはコンピューターアルゴリズムの使用によって規
定されてよい。当該分野では公知の、「相同性」または「同一性」は、かかる配
列の２つの長さ間の合致の同一性によって規定されるごとく、２つのポリペプチ
ドまたは２つのポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を意味する。同一性およ
び相同性の両者は、先の技術に残る方法によって容易に算出できる［例えば、CO
MPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M.編, Oxford, University Press, N
ew York,（１９８８）；BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smi
th,D.W.,ed., Academic Press, New York（１９９３）；COMPUTER ANALYSIS OF
SEQUENCE DATA,PART１, Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press, Ne
w Jersey, （１９９４）；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Hein
je, G.,Academic Press,（１９８７）およびSEQUENCEANALYSIS PRIMER Gribskov
, M.およびDevereux,J.編、M Stochton Press, New York,（１９９１）を参照］
。２つの配列間の同一性および相同性を測定する多数の方法が存在するが、「同
一性」、「類似性」および相同性なる語は当業者には公知である［H.Carilloお
よびD,Lipton, SIAM J. Applied Math., ４８：１０７３（１９８８）］。２つ
の配列間の同一性または相同性を決定するのに通常用いられる方法は、Guide to
Huge Computers, Martin J. Bishop編、Academic Press, San Diego, １９９４
およびH. CarilloおよびD,Lipton, SIAM J. Applied Math., ４８：１０７３（
１９８８）に開示されるものに含まれるがそれに限定されない。同一性または相
同性を決定する好ましい方法は、試験される２つの配列間の最大合致を与えるよ
うに設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログ
ラム中にコーディングされている。２つの配列間の同一性および相同性を決定す
る好ましいコンピュータープログラムは、ＧＣＧコンピューターパッケージのア
ルゴリズムBESTFIT［J. Devereuxら、Nucl. Acid Res., １２（１）：３８７（
１９８４）］、関連したMACVECTORプログラム（Oxford）およびFASTA（Pearson
）プログラムを含むがそれに限定されない。例えば、重要な天然に存在する哺乳
類ポリヌクレオチド配列および標的ポリヌクレオチド配列間のデータベース上の
配列類似性の検索は、本発明の使用に望ましい適当なＲＮＡ分子の設計を可能に
する。いずれのあるＲＮＡ分子にも必要な相同性のアルゴリズムおよび／または
程度は、本発明の方法の使用後正常に機能するままであると望まれるいずれの天
然に存在する哺乳類配列に対する標的の同一性および／または標的配列の相同性
の近さに依存して当業者によって選択できる。
【００１９】 ある好ましい具体例において、デフォルトのアニーリング温度３７℃でMACVEC
TORプログラムを用いて、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列
に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３
０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレ
オチド区分（領域）を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡ
ポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも３０％の全体的
相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも
５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む
。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的
配列に対し少なくとも５０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様
の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌ
クレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリ
ヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも７０％の全体的相同
性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０
％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。も
う１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列
に対し少なくとも９０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３
０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレ
オチド領域を少なくとも１つ含む。
【００２０】 さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは
、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列
の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも７０％の相同性を有する３０の連続
したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮ
Ａポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも１０％の全体
的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくと
も９０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド区分（領域）を少なくと
も１つ含む。 さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは
、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列
の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続
したヌクレオチド領域を少なくとも２つ含む。この式の他の具体例は当業者であ
れば発展させることができる。
【００２１】 第二の好ましい具体例において、デフォルトアニーリング温度３７℃でMACVEC
TORプログラムを用いて、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列
に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の５ｎｔｓ
領域に対して絶対相同性を有する５つの連続したヌクレオチド区分（領域）を少
なくとも１つ含む。この具体例のもう１つの変形において、ＲＮＡポリヌクレオ
チド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも３０％の全体的相同性を有し
、標的配列の５ｎｔｓ領域に対して絶対相同性を有する５つの連続したヌクレオ
チド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレ
オチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも５０％の全体的相同性を有
し、前記の５ｎｔの絶対相同性領域を含む。この具体例の他の変形は当業者であ
れば発展させることができる。
【００２２】 前記式中にいわれる領域の存在は、配列の残り部分の全体的相同性が低くても
よい；しかしながら、全体的相同性が低いことは、下記の治療組成物の用量に悪
影響を与えるであろうと予想される。ＲＮＡポリヌクレオチド配列中のかかる領
域の数の増加は、配列の残り部分の全体的相同性を低くするが、用量には影響し
ない。 相同性を算出するのに必要な相同性の選択、プログラムのためのデフォルトの
選択および用いられるプログラムの選択は、本明細書のおしえ、科学論文中の知
識があるとすれば当該分野の範囲内であると理解されるべきである。
【００２３】 ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列もまた、望ましくは実質的にいずれか天然に
存在し、正常に機能し、必須な哺乳類ポリヌクレオチド配列と非−相同性である
ので、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列は、本発明の方法で使用される場合、い
ずれの必須の天然に存する哺乳類ポリヌクレオチド配列の機能に悪影響を与えな
い。かかる天然に存在する機能的哺乳類のポリヌクレオチド配列は、望ましいタ
ンパク質をコードする哺乳類配列ならびにコードされないが、健常な哺乳類で必
須の制御配列のために供される哺乳類配列を含む。本質的には、本発明において
有用なＲＮＡ分子は、配列において、本発明のいずれの方法でも実行された後に
、その機能が乱されないと意図されるいずれの哺乳類ポリヌクレオチド配列と実
質的に区別される。前記標的配列への相同性を決定するために記載されたごとく
、当業者は、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列および正常な哺乳類配列間の相同
の必須の欠失を決定する前記に同定したコンピューター・アルゴリズムに訴えて
もよい。従って、ある例示的な具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび
選択される正常配列間の相同性は、前記の式の相同性より少ない。より好ましく
は、ＲＮＡポリヌクレオチドおよびいずれの正常哺乳動物配列間に相同性がほと
んど全くない。必要な相同性の選択は、本明細書のおしえおよび科学論文中の知
識があるとすれば、当業者の範囲内である。
【００２４】 最後に、本発明の組成物のＲＮＡ分子のさらにもう一つの望ましい性質は、そ
れが機能的タンパク質を産生しないか、あるいは翻訳されないということである
。ＲＮＡ分子または送達物質は、所望により機能的タンパク質を送らないように
、あるいは所望により翻訳に関わる細胞因子と相互作用しないように、種々の公
知の方法で作成される。従って、例えば、それが合成ＲＮＡ分子であってもまた
はインビボでＲＮＡ分子になる物質であっても、その物質は、ポリアデニル化配
列を欠失している。同様に、物質はタンパク質翻訳に必要なコザック（Kozak）
領域を欠失してもよい。もう１つの具体例において、ＲＮＡ分子はまた、本来の
開始メチオニンコドンを欠失してもよい。さらにもう１つの具体例において、Ｒ
ＮＡ分子ポリヌクレオチド配列はキャップ構造を欠失する。さらにさらなる具体
例において、ＲＮＡ分子はタンパク質合成のシグナルを有さない。さらにもう１
つの具体例において、ＲＮＡ分子はコード配列または機能的に実施不可能なコー
ド配列を含まない。さらに、もう１つの具体例において、ＲＮＡ配列はイントロ
ン配列で中断されてもよい。さらにさらなる具体例において、存在すれば、本来
の開示コドンの前にヘアピン配列を置いてもよい。さらにもう１つの具体例にお
いて、ＲＮＡ分子は前記のごとく、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであってもよい
。かかる具体例は全て、例えば、下記に引用するテキストの教示に従って設計で
きる。
【００２５】 以下は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド阻害を達成するために使用され
る種々の具体例である。下記の種々のＲＮＡ（およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ド）構造は、単一で、あるいは、例えば、ラリアット（lariat）（センスまたは
アンチセンス）および／または相補的環状および／または直鎖分子の２つ以上の
いずれの組み合わせでも使用できる。アンチセンスラリアットまたは環状構造は
また単独で使用されてもよい。さらに、これら構造は、自己相補的領域（例えば
、タンデムセンスおよびアンチセンス配列）ならびに望ましい標的に対する付加
的アンチセンス配列を含んでもよい。本明細書中ずっと、「アンチセンス」なる
語は、いずれのmＲＮＡと相補的でハイブリダイズできるという意味で使用され
る。
【００２６】 ある具体例において、「ラリアット」形態のポリヌクレオチドが利用できる。
ラリアットは、正常な３'−５'結合に対して２'−５'ホスホジエステル結合を含
む。かかる構造は、スプライソゾームおよび自己分解リボゾームによって触媒さ
れるスプライシング反応において形成される。これら構造は、スプライシング反
応の中間体または副産物のいずれかである。それらは、細胞内で発現（翻訳）中
にインビボで調製でき、あるいはインビトロで調製できる。ラリアット形態は、
ループバック（loop back）様式でリボースまたはデオキシリボースのいずれか
のフリーの５'ホスホリル基がリボースの２'−OH基と結合するようになる場合に
形成する。ラリアットはループ内に１０以上のヌクレオチドを含み、２'−５'で
ある場合には、各々、ループバック結合を有する完全な環状であってもよい。最
終ヌクレオチドを結合するラリアットは環状様構造を産生する。ループおよび／
またはステムは、単一分子で、タンデムにセンスおよびアンチセンス配列のいず
れかを含み、あるいは各単一ラリアットはセンスまたはアンチセンス配列のいず
れかを含む。別々の分子にセンスおよびアンチセンスを含むラリアットは、二本
鎖形態として一緒に投与されるか、あるいは、アンチセンスラリアットは、単一
で使用されて細胞中mＲＮＡと一緒に二本鎖を形成してもよい。ラリアットは、
ハイブリッドのＲＮＡ部分の２'−OHを介してなされる２'−５'結合を有するＲ
ＮＡまたはＤＮＡハイブリッドであってもよい。［Rees CおよびSong Q. Nucl.
Acid Res. ２７, ２６７２−２６８１（１９９９）;Dame Eら、Biochemistry ３
８ ３１５７−３１６７, １９９９；Clement J.Q.ら、ＲＮＡ ５, ２０６−２２
０, １９９９；Block TおよびHill J. J. Neurovirol. ３, ３１３−３２１, １
９９７;Schindewolf CAおよびDomdey H., Nucl. Acid Res., ２３, １１３３−
１１３９（１９９５）］。
【００２７】 もう１つの具体例において、環状ＲＮＡ（または環状ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ッド）は末端の２'−５'または３'−５'結合を生じてもよい。これらは、インビ
トロで末端を近接に持ってくるスプリンターを用いて、ＲＮＡリガーゼを介して
あるいは、（インビボおよびインビトロ）で自己スプライシングリボザイムの使
用を介して酵素的に生じる。望ましい阻害は、自己相補性を有するかあるいは有
さない単環ならびに二本鎖環状ＲＮＡ（標的ポリヌクレオチドに対してセンスお
よびアンチセンス両鎖）または、互いに相補的な領域ならびに標的に相補性を有
するものを有する一本鎖ＲＮＡの２環を含む、インビトロで作成されるかあるい
は、 インビボで発現される１つ以上のＲＮＡ環を供することによって達成され
る。
【００２８】 もう１つの具体例は、単一のＲＮＡ（またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）ア
ンチセンス環（標的 mＲＮＡに相補的な自己相補性を有さない環状ＲＮＡ）を利
用する。さらにもう１つの具体例は標的mＲＮＡ分子に相補的なＲＮＡ−ＤＮＡ
環または環状ＤＮＡ分子を利用する。標的メッセージに対し相補性を有するタン
デムのセンスおよびアンチセンス配列（いずれの順でも）を有する単環は標的配
列の機能を阻害する組成物として使用できる。ロッド様部分ならびに標的に対す
る付加的アンチセンス配列を形成できるかかる自己相補的配列を有する環状分子
を使用することが好ましい［Schindewolf CAおよびDomdey H. Nucl. Acid Res.,
２３, １１３３−１１３９（１９９５）；Ress CおよびSong Q., Nucl. Acid R
es., ２７, ２６７２−２６８１（１９９９）；Block TおよびHill J, J. Neuro
virol. ３, ３１３−３２１（１９９７）］。
【００２９】 さらに、さらなる具体例において、標的配列を阻害する組成物は、キャッピン
グされた直鎖ＲＮＡである。ｄｓＲＮＡがインビトロまたはインビボのいずれで
形成されてもいずれか一本または両鎖がキャッピングされてよい。通常、細胞質
発現がＲＮＡ分子のキャッピングを引き起こす結果となっているであろう場合に
は、キャッピングはワクシニアキャッピング酵素またはアルファウイルスキャッ
ピング酵素のごときキャッピング酵素の使用を含む種々の手段によって行われる
。キャッピングされたアンチセンス分子は、標的遺伝子の望ましい翻訳後サイレ
ンシングを行うために使用される。キャッピングされたＲＮＡは、インビトロま
たはインビボで調製できる。通常、ＲＮＡｐｏｌIIによって核で作成されたＲＮ
Ａはキャッピングされている。細胞質で発現されたＲＮＡはキャッピングされて
もされてなくてよい。キャッピングは、細胞質ウイルスのキャッピング酵素を発
現することによって達成される。両者がキャッピングされている、あるいは１つ
はキャッピングされもう１つはキャッピングされていない、あるいは両者がキャ
ッピングされていないＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド配列のいずれか
が、本組成物中で使用されてよい。キャッピングされたあるいはされていないア
ンチセンス分子は、単一でまたは本明細書中に記載のポリヌクレオチド構造との
いずれの組み合わせでも使用できる。
【００３０】 本発明によるＲＮＡ分子は、Promega Protocols and Applications Guide, （
第３版、１９９６）, Doyle編, ISBN No.１−８８２２７４−５７−１のごとき
教科書に記載される慣用法によって、例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、
またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いる、慣用的酵素合成法によってインビト
ロで作成されるＲＮＡ分子としてまたは部分的二本鎖のＲＮＡ配列としてまたは
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドとして、組成物中、哺乳類または哺乳類細胞に存在
する細胞外病原体に送達される。
【００３１】 あるいは、これら分子は、インビトロで化学合成法によって作成される［例え
ば、Q. Xuら、Nucl. Acids Res., ２４（１８）：３６４３−４（１９９６年９
月）；N. Naryshkinら、Bioog. Khim., ２２（９）：６９１−８（１９９６年９
月）；J. A. Grasbyら、Nucl. Adids Res., ２１（１９）：４４４４−５０（１
９９３年９月）；C. Chaixら、Nucl. Acids Res., １７（１８）：７３８１−９
３（１９８９）；S.H. Chouら、Biochem, ２８（６）：２４２２−３５（１９８
９年３月）；O. Odaiら、Nucl. Acids Symp. Ser.,２１：１０５−６ （１９８
９）；N.A. Naryshkinら、Bioog. Khim., ２２（９）：６９１−８（１９９６年
９月）；S. Sunら、ＲＮＡ, ３（１１）：１３５２−１３６３（１９９７年１１
月）；X. Zhangら、Nucl. Acids Res., ２５（２０）：３９８０−３ （１９９
７年１０月）；S. M. Grvaznovら、Nucl. Acids Res., ２６（１８）：４１６０
−７（１９９８年９月）；M. Kadokuraら、Nucl. Acids Symp. Ser., ３７：７
７−８（１９９７）；A. Davisonら、Biomed. Pept.Proteins, Nucl. Acids, ２
（１）：１−６（１９９６）；および A. V. Mudrakovskaiaら、Bioorg. Khim.,
１７（６）：８１９−２２（１９９１年６月）を参照］。
【００３２】 さらに別法として、本発明のＲＮＡ分子は、例えば、細菌および酵母または、
例えば哺乳類細胞の組換え宿主細胞である組換え微生物中で作成でき、その培養
液から慣用法によって単離できる。例えば、これら手法を記述する実験室マニュ
アルの例であるSambrookら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第２版
；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １
９８９に記載された手法および引用文献として本明細書中に引用されている米国
特許第５,８２４,５３８；５,８７７,１５９および６５,６４３,７７１号に記載
された手法を参照。
【００３３】 インビトロで調製あるいは合成されるかかるＲＮＡ分子は、インビトロで作成
されるごとく直接哺乳類細胞または哺乳類に送達される。前記引用文献は、本明
細書中に提供されるおしえがあるとすれば、当業者にいずれの以下の明確な具体
例を産するのに必要な手法を提供する。従って、ある具体例において、組成物の
「物質」は二重螺旋（すなわち、二本鎖から成る）、完全にあるいは部分的二本
鎖のＲＮＡのいずれかである。もう１つの具体例において、物質は一本鎖ＲＮＡ
センス鎖である。もう１つの具体例において、組成物の物質は、一本鎖ＲＮＡア
ンチセンス鎖である。好ましくは、一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖は
片側の末端または両末端でヘアピンを形成する。望ましくは、一本鎖ＲＮＡセン
スまたはアンチセンス鎖は末端環の中間部分でヘアピンを形成する。かかる一本
鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖はまた、インビトロまたはインビボで自身
の上で折り返して部分的二本鎖になるように設計できる。組成物中に使用される
有効物質としての現存のＲＮＡ分子のさらにもう１つの具体例は、所望により、
非−塩基対形成のポリヌクレオチド配列によって分離されたセンスポリヌクレオ
チド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド配列両者を含む一本鎖ＲＮＡ配列
である。好ましくは、この一本鎖ＲＮＡ配列は、いったん細胞中に、あるいはそ
の合成の間インビトロで、二本鎖になる能力を有する。さらに本発明のもう１つ
の具体例は、前記のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。合成ＲＮＡ分子のさら
にもう１つの具体例は、所望により、ロッド構造を形成する［例えば、K−S. Wa
ngら、 Nature, ３２３：５０８−５１４（１９８６）を参照］環状ＲＮＡある
いは部分的二本鎖であり、全て出典明示により本明細書の一部とされるS.Wangら
、Nucl. Acids Res., ２２（１２）：２３２６−３３（１９９４年６月）；Y. M
atsumotoら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ８７（１９）７６２８−３２ （１
９９０年１０月）：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ９１（８）：３１１７−２
１（１９９４年４月）；M. Tsagrisら、Nucl. Acids Res., １９（７）：１６０
５−１２（１９９１年４月）；S. Braunら、Nucl. Acids Res., ２４（２１）：
４１５２−７（１９９６年１１月）；Z. Pasmanら、 ＲＮＡ, ２（６）：６０３
−１０（１９９６年６月）；P. G. Zaphiropoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., U
SA, ９３（１３）：６５３６−４１（１９９６年６月）；D. Beaudryら、Nucl.
Acids Res., ２３（１５）：３０６４−６（１９９５年８月）に記載される手法
によって調製できる。さらにもう１つの物質は、別々の鎖上に存在するかあるい
は、同一の鎖上に散在するＲＮＡおよびＤＮＡを含む二本鎖分子である。
【００３４】 別法として、ＲＮＡ分子は、インビボで形成され、従って、物質を哺乳類細胞
または哺乳類に送達後にインビボでかかる部分的二本鎖のＲＮＡ分子を形成する
「送達物質」によって送達される。従って、本発明の組成物を形成する物質は、
一の具体例において、前記のＲＮＡ分子の１つを「コード」する二本鎖ＤＮＡ分
子である。ＤＮＡ物質は、細胞内で転写され二本鎖ＲＮＡになるヌクレオチド配
列を供する。もう１つ別の具体例において、ＤＮＡ配列は、所望により、一端ま
たは両端でヘアピンを形成するか、あるいは自身で折り返して部分的二本鎖にな
る前記の一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖へ、細胞内で転写されるデオ
キシリボヌクレオチド配列を供する。組成物の送達物質であるＤＮＡ分子は、一
本鎖ＲＮＡ配列が二本鎖になる能力を有する、所望により非−塩基対形成のポリ
ヌクレオチド配列によって分離されるセンスポリヌクレオチド配列およびアンチ
センスポリヌクレオチド配列両者を含む一本鎖ＲＮＡ配列を供する。あるいは、
送達物質であるＤＮＡ分子は、所望により、インビボでロッド構造または部分的
二本鎖を形成する前記の環状ＲＮＡ分子の転写を供する。ＤＮＡ分子はまた、イ
ンビボで、前記のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは１本のＲＮＡ鎖および１本
のＤＮＡ鎖を含む二重螺旋の産生を供する。これら種々のＤＮＡ分子は前記引用
のSambrookに記載されるごとく、あるいは前記引用のPromegaの参考文献のよう
に、慣用法に頼って設計することができる。
【００３５】 哺乳類細胞における上記したＲＮＡ分子の形成を可能にする本発明の送達物質
は、ＤＮＡ一本鎖または二本鎖プラスミドまたはベクターであってよい。本明細
書中に記載のインビトロまたはインビボでＲＮＡを産生するように設計された発
現ベクターは、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐ
ｏｌIIおよびＲＮＡｐｏｌIIIを含むいずれのＲＮＡポリメラーゼの制御下、配
列を含んでよい。これらベクターは、本発明によって細胞中の望ましいＲＮＡ分
子を転写するのに使用できる。ベクターは、望ましくは、内因性ミトコンドリア
ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、その場合、かかるベクターが対応するヒトミトコ
ンドリアプロモーターを利用できるヒトミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ）を
利用するように設計される。ミトコンドリアポリメラーゼは、（キャッピング酵
素の発現を介して）キャッピングされた、あるいはインビボでキャッピングされ
ていないメッセージを生じさせるために使用される。ＲＮＡｐｏｌI、ＲＮＡｐ
ｏｌIIおよびＲＮＡｐｏｌIII転写物はまた、インビボで生じる。かかるＲＮＡ
は、キャッピングされていてもされていなくてもよく、所望すれば、細胞質キャ
ッピングは、ワクシニアキャッピング酵素またはアルファウイルスキャッピング
酵素のごときキャッピング酵素の使用を含む種々の方法によって達成される。Ｄ
ＮＡベクターは、１つのプロモーターまたは組み合わされた複数のプロモーター
（同属のポリメラーゼと一緒のミトコンドリアＲＮＡｐｏｌI、ＩＩまたはｐｏ
ｌＩＩＩまたはウイルス、細菌またはバクテリオファージプロモーター）を含む
ように設計される。好ましくは、プロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩである場合、
ＲＮＡ分子をコードする配列は核内の分解を回避するために約３００ｎｔｓより
多いオープンリーディングフレームを有する。かかるプラスミドまたはベクター
は、細菌、ウイルスまたはファージ由来のプラスミド配列を含んでよい。かかる
ベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス−由来ベクター、例えば、細菌
プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、およびウ
イルス由来のベクタープラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素由来のご
ときその組み合わせ由来のベクター、コスミドおよびファージミドを含む。従っ
て、ある例示的ベクターは、一本鎖または二本鎖のファージベクターである。も
う１つの例示的ベクターは、一本または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベ
クターである。かかるベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして
、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞へ導入する公知の手法によって細胞内に導入される
。ファージおよびウイルスベクターである場合、ベクターはまた、パッケージさ
れるか、あるいはカプシドに包まれたウイルスとして感染および形質導入という
公知の手法によって、細胞へ導入され手もよく、好ましいウイルスベクターは、
複製能力があるかあるいは、複製能力が欠失していてよい。後者の場合、一般に
ウイルス増殖は相補する宿主細胞内でのみ起こる。
【００３６】 もう１つの具体例において、送達物質は単一のＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド
またはベクターより多くを含む。一例として、第一のＤＮＡプラスミドは前記の
一本鎖ＲＮＡセンスポリヌクレオチド配列を供し、第二のＤＮＡプラスミドは前
記の一本鎖ＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド配列を供する。ここに、センス
およびアンチセンスＲＮＡ配列は塩基対を形成し二本鎖になる能力を有する。か
かるプラスミドは、他の慣用的プラスミド配列、例えば、タンパク質の組換え発
現のプラスミドおよびベクターを構築するのに使用される公知の配列のごとき細
菌配列を含む。しかしながら、タンパク質発現を可能にする配列、例えば、コザ
ック領域などはこれらプラスミド構造に含まれないことが望ましい。
【００３７】 本発明のｄｓＲＮＡを産生するために設計されるベクターは、望ましくは、標
的配列と相同的かつ相補的な多数の異なるｄｓＲＮＡを含み、２つ以上を生じる
ように設計される。この方法は、単一のベクターが、単一の転写単位から、単一
のｄｓＲＮＡ分子よりむしろ多数の独立に作動可能なｄｓＲＮＡを産生する上で
望ましく、多数の異なるｄｓＲＮＡを産生することによって、自身が最適な効力
を選択できる。自己触媒配列ならびにランダムなかつ／あるいは所定のスプライ
シング部位を創製する分解配列を含む種々の方法がこのことを達成するために用
いられる。
【００３８】 哺乳細胞中の前記の望ましいＲＮＡ分子の形成に必要な情報を供する他の送達
物質は、本発明の要求されるＲＮＡ分子に必要な配列を含むように設計される、
生存、弱毒化または死滅、不活化組換え細菌を含む。かかる組換え細菌細胞、真
菌細胞などは、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５,８２４,５
３８; ５,８７７,１５９および６５,６４３,７７１号に記載の慣用法を用いるこ
とによって調製できる。これら送達物質を調製する上で有用な微生物は、エシェ
リキア・コリー（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtil
is）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmolnella typhimurium）および種々のシ
ュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）および
スタフィロコッカス属（Staphylococcus）を含む前記の引用文献に記録されるも
のを含むが、それに限定されない。
【００３９】 哺乳類細胞中望ましい、前記のＲＮＡ分子の形成に必要な情報を供するさらに
他の送達物質は、生存、弱毒化または死滅、不活化ウイルス、および特に、前記
の要求されるＲＮＡポリヌクレオチド配列を有する組換えウイルスを含む。かか
るウイルスは、遺伝子治療などのために細胞に遺伝子を送達するのに現在使用さ
れる組換えウイルスと同様に設計されるが、好ましくは、タンパク質またはタン
パク質の機能的フラグメントを発現する能力は有さない。インビボで哺乳類細胞
に要求されるＲＮＡ分子を供するのに操作される有用なウイルスまたはウイルス
配列の中には、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーティッド
ウイルス、バキュロウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイル
ス、ヘルペスウイルス、（ＳＶ４０のごとき）パポバウイルス、ポリオウイルス
、シュードラビ−ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、＋鎖および
−鎖ＲＮＡウイルス、ウイロイドおよびウイロソイドまたはその一部はあるが、
それに限定されない。これら種々のウイルス送達物質は、特に、本発明の教示を
有するM.Di Nocolaら、 Cancer Gene Ther., ５（６）：３５０−６ （１９９８
）に記載のごとき慣用的法を応用することによって設計される。
【００４０】 哺乳類細胞中、望ましい、前記のＲＮＡ分子の形成に必要な情報を供するもう
１つの送達物質は、前記の合成ＲＮＡ分子またはＤＮＡ送達分子または送達組換
えウイルスでインビトロでトランスフェクトあるいは感染される、生存弱毒化さ
れるかあるいは死滅された、不活性化供与体細胞を含む。これら供与体はついで
、以下に詳細に記載されるごとく哺乳類に投与され、この阻害効果を媒介する哺
乳類の機構を促進する。これら供与体は、C１２７、３T３、CHO、HeLa、ヒト腎
２９３、BHK細胞系およびＣＯＳ−７細胞のごとき望ましくは哺乳類細胞であり
、好ましくは、哺乳類受容体と同一の哺乳類種である。かかる供与体は、例えば
、Emerichら、 J. Neurosci. １６：５１６８−８１ （１９９６）に記載のもの
と同様な技術を用いて作成できる。さらにより好ましくは、供与体細胞は、ある
哺乳類から収穫され、D. B. Kohnら、 Nature Med., ４（７）：７７５−８０
（１９９８）に記載されるもののごとき養子転移法に類似したエキソビボ（ex v
ivo）操作によって供与体細胞へ処理および作成される。供与体細胞はまた、所
望すれば、非−哺乳類種由来であってもよい。
【００４１】 最終的に、本発明の組成物はまた、１つ以上の前記の選択物質を含み得る。組
成物は、前記の合成ＲＮＡ分子、前記の合成ＤＮＡ送達分子および組換え細菌、
細胞およびウイルスのごとき前記の他のいずれの送達物質の混合物も含み得る。
組成物混合物の同一性は当業者によって容易に選択される。
【００４２】 Ｂ．本発明の医薬（治療的または予防的）組成物 医薬的使用のための本発明の組成物は、望ましくは前記の合成ＲＮＡ分子また
は医薬品送達のための付加的な所望の成分と共に医薬上許容される担体中、イン
ビボで哺乳類細胞へそのＲＮＡ分子を供する物質を含む。医薬組成物の具体的処
方は、ＲＮＡ分子を送達する物質の形態に依存する。 適当な医薬上許容される担体は、本発明のポリヌクレオチド組成物の投与を促
進するが、生理学的に不活性かつ／あるいは無害である。担体は当業者によって
選択される。かかる単体は、滅菌生理食塩水、リン酸、緩衝生理食塩水、デキス
トロース、滅菌水、グリセロール、エタノール、乳糖、シュークロース、リン酸
カルシウム、ゼラチン、デキストラン、カンテン、ペクチン、落花生油、オリー
ブ油、ゴマ油および水、およびその組み合わせを含むがそれに限定されない。さ
らに、担体または希釈剤は、単独であるいはロウと一緒にグリセロール、モノス
テアリン酸またはジステアリン酸グリセロールのごとき時間遅延物質を含んでも
よい。さらに、徐放性ポリマー処方が使用できる。処方は、送達物質形態ばかり
でなく、投与様式にも適さなければならない。投与様式による適当な担体の選択
は、当業者によってルーチン的に行われる。
【００４３】 組成物が合成ＲＮＡ分子を含む場合、あるいは前記のＤＮＡ分子、プラスミド
、ウイルスベクターまたは組換えウイルスまたはポリヌクレオチドの複数コピー
または異なるポリヌクレオチドなどのごとき物質が別のポリヌクレオチドである
場合に、組成物は望ましくは、担体のみと共に「裸の」ポリヌクレオチドとして
処方される。あるいは、かかる組成物は望ましくは、所望のポリヌクレオチド促
進剤または局所麻酔剤、ペプチド、陽イオン性脂質を含む脂質、リポソームまた
は脂質粒子、ポリリジンのごときポリカチオン、デンドリマーのごとき分岐鎖を
有する三次元ポリカチオン、炭水化物、陽イオン性両親媒性化合物、界面活性剤
、ベンジルアンモニウム界面活性剤または細胞へのポリヌクレオチド転移を促進
する他の化合物のような「共同物質」を含む。本発明に有用なかかる促進剤また
は共同物質の非−限定的な例は、それぞれ、出典明示により本明細書の一部とさ
れる、米国特許第５,５９３,９７２; ５,７０３,０５５;５,７３９,１１８; ５,
８３７,５３３号、および１９９６年４月４日発行国際出願ＷＯ９６／１００３
８および１９９４年８月８日発行国際出願ＷＯ９４／１６７３７に記載される。
【００４４】 使用される促進剤が、局所麻酔剤、好ましくはブピバカインである場合には、
ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づいて約０.１重量パーセントないし１.０
重量パーセントの量が好ましい。また、約０.００１−０.０３重量％の量で投与
される共同物質としてベンジルアンモニウム界面活性剤を組み込むことを教示す
る国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８４１を参照のこと。その内容を出典明示に
より本明細書の一部とする。 組成物の送達物質がポリヌクレオチド組成物とは別物、例えば、前記のトラン
スフェクトされた供与体または細菌である場合、組成物はまた、出典明示により
本明細書の一部とされる米国特許第５,８２４,５３８; ５,６４３,７７１; ５,
８７７, １５９号に記載されるもののごとき他の添加物を含む。
【００４５】 さらに、いずれの組成物にも存在する添加成分は、アジュバント、保存剤、化
学安定化剤または他の抗原タンパク質である。典型的には、安定化剤、アジュバ
ントおよび保存剤は、標的ヒトまたは動物における効力のための最良の処方を決
定するために最適化される。適当な例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビ
ン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチル
バニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。使用さ
れてもよい適当な安定化成分は、例えば、カザミノ酸、シュークロース、ゼラチ
ン、フェノールレッド、N−Zアミン、二リン酸一カリウム、乳糖、ラクトアルブ
ミン加水分解産物およびドライミルクを含む。慣用的なアジュバントは白血球を
誘引するか、あるいは免疫応答を促進するのに用いられる。かかるアジュバント
は、特に、RiBi、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン（Amphigen
）、アブリジン（Avridine）、L１２１／スクワラン、D−ラクチド−ポリ乳酸／
グリコシド、プルロニックプリオイス、ムラミルジペプチド、死滅したボルデテ
ラ（Bordetella）とクイルＡ（QuilA）のようなサポニンを含む。
【００４６】 さらに、トランスフェクト剤および／または複製物質および／または炎症物質
として機能して、本発明の組成物と共に同時投与される他の物質は、成長因子、
アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子
（ＰＤＧＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦのごときコロニー刺激因子、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のごときサイトカインおよびリンホカ
インおよびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０お
よびＩＬ−１２のごときインターロイキンを含む。さらに、繊維芽細胞増殖因子
、免疫−刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ） のごとき界面活性剤、フロイト不完全ア
ジュバント、モノホスホリルリピッドＡ（MPL）のごときＬＰＳ類似体、ムラミ
ルペプチド、キノン類似体スクワランおよびスクワランのごとき小胞性複合体お
よびヒアルロン酸はまた、本発明の組成物と共に使用され投与される。
【００４７】 医薬組成物はまた、組成物の選択される投与様式に適当な他の添加物を含んで
よい。従って、これら組成物は、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内
投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸
投与、経膣投与などを含むが、それに限定されない、いずれの慣用的投与経路を
介しても投与に適当な添加物を含み得る。かかる経路は全て、これら組成物の投
与に適当であり、使用される物質、治療される患者および状態、および同様の因
子に依存して治療する医師によって選択される。
【００４８】 本発明の組成物はまた、点鼻または肺内に応用するためのものを含む、散剤、
液剤または懸濁化剤の用量形態を展開するために他の医薬上許容される賦形剤と
共に使用できる凍結乾燥されるポリヌクレオチドにも関わる。例えば、出典明示
により本明細書の一部とされる教示である、例えば、Remington：The Science a
nd Practice of Pharmacy, Vol. ２、第１９版（１９９５）、例えば、Chapter
９５ Aerosols；および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５５４７を参照。これら
組成物の投与経路は、所望により、組み合わせたり、調整したりしてもよい。 ある好ましい具体例において、本発明の医薬組成物は、例えば、液剤、散剤、
エアロゾル、錠剤、カプセル剤、腸溶性錠剤またはカプセル剤、または坐剤の形
態で、哺乳類患者に投与されるために調製される。
【００４９】 医薬組成物として使用される場合、本発明の組成物は、例えば、合成ＲＮＡ分
子である組成物の送達物質としてポリヌクレオチド分子約１ｎｇないし約２０ｍ
ｇまたはＤＮＡ分子、プラスミド、ウイルスベクター、組換えウイルスおよびそ
の混合物であってよい送達物質を含む。ある好ましい具体例において、組成物は
約１０ｎｇないし約１０ｍｇのポリヌクレオチド配列を含む。他の具体例におい
て、医薬組成物は約０.１ないし約５００μgのポリヌクレオチド配列を含む。あ
る好ましい具体例において、組成物は約１ないし約３５０μgのポリヌクレオチ
ド配列を含む。さらに他の好ましい具体例において、医薬組成物は約２５ないし
約２５０μgのポリヌクレオチド配列を含む。ある好ましい具体例において、ワ
クチンおよび治療剤は約１００μgのポリヌクレオチド配列を含む。
【００５０】 送達物質が供与細胞または細菌細胞である本発明の組成物は、約１細胞ないし
約１０７細胞／用量の用量で送達できる。同様に、送達物質が生きたままの組換
えウイルスである場合、適当なベクター−ベースの組成物は用量あたり１x１０
２pfuないし１x１０１２pfu間を含む。 本発明の教え、および本発明の組成物でトランスフェクトあるいは感染された
細胞よりも多く増殖させられた本発明の方法および組成物の阻害効果の見かけの
能力があるとすれば、前記の用量から低く適当に用量調整できる可能性がある。
従って、前記用量範囲は単なるガイドラインである。一般に、医薬組成物は、か
かる標的機能が疾病または疾病の原因のさらなる広がりに必要である、疾病、疾
患または感染の治療または予防のために標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害
あるいは減少するのに有効な量で投与される。使用される用量単位での医薬組成
物の量は、本発明の組成物に対するインビトロでの細胞の応答および実験動物の
応答に基づいて、経験的に決定される。最適用量は、各治療モダリティーおよび
適応症のための標準法によって決定される。従って、用量、タイミング、投与経
路、およびこれら組成物の再投与の必要性は、治療されるべき状態、その重症度
、悪化する状態および、哺乳類患者の年齢および物理的状態などの因子、活性化
合物の使用などを考慮に入れて当業者によって決定される。
【００５１】 Ｃ．本発明の治療および予防方法 本発明の方法は、前に詳細に記述した組成物および哺乳類細胞に部分的二本鎖
のＲＮＡ分子を供する当該分野で最近使用されるあるいは他のポリヌクレオチド
配列（例えば、機能的であってもなくてもタンパク質をコードするポリヌクレオ
チド分子またはリボザイムのごとき公知のＲＮＡ触媒配列）を使用できる。しか
しながら、この方法の有効性は、タンパク質を産生しないＲＮＡ分子の使用によ
って促進される。これら方法は、哺乳類または哺乳類細胞において標的ポリヌク
レオチド配列の機能を減少あるいは阻害する。前記の組成物、医薬組成物、投与
の用量および様式は、細胞外または細胞内病原体のいずれかの異種病原体生物に
よる感染を含む哺乳類を苦しめる種々の疾患の治療に特に望ましい。さらに、本
発明の組成物は、病原体の哺乳類への感染を予防する上であるいは、潜在的病原
体の再活性化により引き起こされる疾患の発生を予防する上で有用である。これ
ら組成物はまた、病原体誘発癌の治療にも有用である。
【００５２】 本発明のある具体例は、哺乳類のウイルス感染の治療方法である。ＤＮＡウイ
ルスまたは中間体ＤＮＡステージを有するウイルスはかかる治療に特に適当であ
る。レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパデノウイルス、ポックスウイルス
、パルボウイルス、パピローマウイルスおよびパポバウイルス種のウイルスは、
かかるウイルスに含まれるがそれに限定されない。特に、この方法での治療に対
しより望ましいウイルスのいくつかは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰ
Ｖ、ＨＴＬＶおよびＥＢＶを含むが、限定されない。この方法に使用される物質
は、哺乳類細胞に、感染哺乳類細胞においてウイルスの複製および／または発生
病理に必要なウイルスポリヌクレオチド配列である標的ポリヌクレオチドを実質
的に相同な、前記の少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子を供する。かかる標的
ポリヌクレオチド配列の中には、とりわけ、ウイルス増殖に必要なタンパク質の
タンパク質コード配列、例えば、ＨＩＶｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子、Ｈ
ＰＶ６ Ｌ１および Ｅ２遺伝子、ＨＰＶ１１ Ｌ１およびＥ２遺伝子、ＨＰＶ１
６ Ｅ６およびＥ７遺伝子ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７遺伝子ＨＢＶ表面抗原、Ｈ
ＢＶコア抗原、ＨＢＶ逆転写酵素、ＨＳＶｇＤ遺伝子、ＨＳＶｖｐ１６遺伝子、
ＨＳＶｇＣ、ｇＨ、ｇＬおよびｇＢ遺伝子、ＨＳＶ ＩＣＰ０、ＩＣＰ４および
ＩＣＰ６遺伝子、バリセラ・ゾスター（Varicella zoster）ｇＢ、ｇＣおよびＧH
遺伝子およびＢＣＲ−ａｂｌ染色体配列、および細胞から細胞への感染の転移に
必要な制御機能を供する非−コードウイルスポリヌクレオチド配列、例えば、Ｈ
ＳＶ ＬTRおよびＨＳＶｖｐ１６ プロモーター、ＨＳＶ−ＩＣＰ０プロモーター
、ＨＳＶ−ＩＣＰ４、ＩＣＰ６およびｇＤプロモーター、ＨＢＶ表面抗原プロモ
ーター、ＨＢＶプレゲノムプロモーターのごとき他のウイルスプロモーター配列
がある。前記のごとく、組成物は、ポリヌクレオチド取り込み増強剤または促進
剤および所望の医薬上許容される担体と共に投与される。哺乳類に投与される量
または用量は、哺乳類細胞のウイルス配列の機能を減少あるいは阻害するのに有
効である。
【００５３】 理論に束縛されないように願いたいが、いったんＲＮＡ分子がウイルスに感染
した細胞へ送達され、細胞内で産生されると、外来ＲＮＡ分子は相同なウイルス
配列を減少あるいは阻害（すなわち、スイッチを切る）し、それ自身が阻害され
るので、ウイルス配列の機能は減少あるいは阻害される。下記の実施例に説明さ
れるごとく、機能効果の阻害は、外来ＲＮＡ分子を受ける哺乳類細胞から外来Ｒ
ＮＡ分子を直接供されない患者の他の哺乳類細胞に転移される。現在、この結果
はＲＮＡ分解のレベルで起こることが理論付けられている。
【００５４】 従って、この方法は、ＨＩＶｇａｇのごときウイルス複製および／または発生
病理に必須のウイルス遺伝子機能を活動停止あるいは阻害するために、ＨＩＶの
ごときウイルスにすでに感染した哺乳類患者を治療するのに使用できる。あるい
は、この方法は、潜在ウイルス、例えば、バリセラ・ゾスター（Varicella zoste
r） ウイルスとして哺乳類に存在し、帯状疱疹として公知の疾病の原因であるウ
イルスの機能を阻害するために使用できる。同様に、アテローム性動脈硬化、潰
瘍、慢性疲労症候群および自己免疫疾患、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２再発、Ｈ
ＰＶ耐性感染、例えば、性器いぼおよび少なくとも一部にはウイルス、細菌また
は他の病原体によって引き起こされることが示されている特に慢性ＨＢＶ感染は
、哺乳類患者のウイルス複製および／または発生病理に必須のあるウイルスポリ
ヌクレオチド配列を標的とすることによるこの方法によって治療できる。
【００５５】 本発明のさらにもう１つの具体例において、前記の組成物は、哺乳類のウイル
ス感染を予防する方法で使用できる。前記の方法、すなわち、哺乳類へ、必須の
標的ウイルスポリヌクレオチド配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量
で前記の組成物を投与すること、が哺乳類がウイルスに暴露される前に投与され
る場合、外来ＲＮＡ分子は、哺乳類内に残存し、その後哺乳類へ自身を提示する
いずれの相同なウイルス配列を阻害するために働くと期待される。従って、本発
明の組成物は、ワクチン使用のためのウイルスポリヌクレオチド配列の機能を阻
害あるいは減少するために使用される。
【００５６】 本発明の前記「抗−ウイルス」方法の類似した具体例は、哺乳類におけるウイ
ルス誘発癌の治療または予防の方法を含む。かかる癌は、特に、ＨＰＶ Ｅ６／
Ｅ７ウイルス誘発頸部癌、ＨＴＬＶ−誘発癌、およびバーキットリンパ腫のごと
きＥＢＶ誘発癌を含む。この方法は、標的ポリヌクレオチドが腫瘍抗原またはそ
の機能的フラグメントをコードする配列、または哺乳類中抗原または配列機能が
腫瘍の維持に必要である非−発現制御配列である前記の組成物を哺乳類に投与す
ることによって達成される。かかる配列の中には、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７
配列およびＨＰＶ １８Ｅ６ およびＥ７配列が含まれるが、それに限定されない
。他のものは当業者によって容易に選択される。組成物は哺乳類において抗原の
機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与され、好ましくは、前記の組成
物成分、用量、投与経路を使用する。この方法の基礎をなす分子機構は前記と同
一である。
【００５７】 本発明のもう１つの具体例において、本発明の組成物は、細胞内または細胞外
のいずれかの非−ウイルス性病原体による哺乳類の感染の治療または予防の方法
で使用できる。本明細書中に使用されるごとく「細胞内病原体」なる語は、少な
くともその生殖または生活環の一部の間、宿主細胞内に存在し、そこに病原体タ
ンパク質が産生されるように産生あるいは引き起こすウイルス、細菌、原生動物
または他の病原生物を意味する。細胞内病原体である生活環のステージを含む細
胞に感染する細胞内病原体は、リステリア属（Listeria）、クラミジア属（Chla
mydia）、 リーシュマニア属（Leishmania）、ブルセラ属（Brucella）、マイコ
バクテリウム属（Mycobacteria）、シゲラ属（Shigella）ならびにプラスモディ
ア属（Plasmodia）例えば、マラリアの原因であるピー・ファルシパルム（ P. fa
lciparum ）を含むが、それに限定されない。細胞外病原体は、哺乳類細胞の外
で複製かつ／あるいは増殖するもの、例えば、特に、ゴナリア属（Gonorrhoeae
）およびボレリア属（Borrellia）である。この具体例によって、病原体による
かかる感染は、医薬上許容される担体中、細胞へのポリヌクレオチド取り込みを
促進する所望の第二物質と共に前記の組成物を、すでに感染したかあるいは、病
原体への先行暴露されたと思われるかのいずれかの哺乳類患者に投与することに
よって治療あるいは予防できる。この場合、組成物のＲＮＡ分子は、感染哺乳類
または哺乳類細胞の病原体の複製および／または増殖に必要な病原体の標的ポリ
ヌクレオチド配列と実質的に相同なポリヌクレオチド配列を有する。前記のごと
く、投与される組成物の量は、哺乳類の病原体配列の機能を減少あるいは阻害す
るのに有効な量である。用量、タイミング、投与経路は前記の通りである。
【００５８】 本開示によれば、当業者は、本発明による治療的または予防的組成物が作成で
きるウイルス科および属または原核および真核の原生動物病原体ならびに多細胞
寄生虫を含む病原体を容易に選択できる。例えば、一般的免疫学教科書および出
典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５,５９３,９７２号のかかる病
原体の表を参照のこと。 本発明の組成物および先行技術のタンパク質をコードする可能性のある分子は
、また本発明のもう１つの新規の方法で使用される。かかる組成物はまた、ある
癌または遺伝疾患のごとき哺乳類のある非−病原性疾病または疾患の治療におい
て有用である。本発明による治療または予防に特に敏感な症状の中には、その機
能が疾患の開始または進行に必要である異常型の哺乳類ポリヌクレオチド配列の
存在により特徴付けられる症状があるが、害を引き起こしたり、そうでなければ
、哺乳類の健康に過度に悪影響を与えたりすることなしに阻害できる。換言すれ
ば、この治療に適当な疾患の特徴は、哺乳類が遺伝子の機能なしで生き残るか、
あるいは、遺伝子の機能が実質的に減少している場合に生き残っているというこ
とである。かかる場合には、異常型または病的なポリヌクレオチド配列の機能は
、治療によって外来性に置換できる。別の場合には、疾病は、哺乳類がまた、ポ
リヌクレオチド配列または遺伝子の正常なコピーを有し、異常遺伝子および正常
遺伝子間の差異がヌクレオチド配列の差異である哺乳類における異常ポリヌクレ
オチド配列または遺伝子の存在または機能によって引き起こされる。かかる場合
、本発明の方法による異常ポリヌクレオチド配列の機能阻害は、外来性の治療な
しで、正常ポリヌクレオチド配列を機能させるようである。
【００５９】 従って、ある具体例において、哺乳類における癌の治療または予防方法は、標
的ポリヌクレオチド配列が哺乳類の異常な癌を引き起こすポリヌクレオチド配列
または遺伝子である本発明の組成物を哺乳類に投与することを含む。本発明の組
成物は、哺乳類の異常配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与さ
れる。前記のごとく、組成物は、細胞中ポリヌクレオチド取り込みを促進する所
望の第二物質および医薬上許容される担体を含み、前記のごとき用量、投与規則
および経路によって投与される。 異常および正常ポリヌクレオチド配列の存在によって特徴付けられる哺乳類の
癌は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および異常配列が２つの遺伝子の融合体、す
なわちｂｃｒ−ａｂｌである急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む。例えば
、これら疾病の記載のため出典明示により本明細書の一部とされる、１９９４年
６月２３日発行の国際特許ＷＯ／１３７９３におけるこれら癌の記載を参照のこ
と。ＣＭＬのごときかかる癌または疾病において、苦しんでいる患者はまた、ポ
リヌクレオチド配列または遺伝子の正常なコピーを有し、異常および正常配列ま
たは遺伝子間の差異はヌクレオチド配列の差異である。例えば、ＣＭＬでは、異
常配列は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合体であり、他方で、正常配列はｂｃｒおよびａｂ
ｌである。従って、前記方法では、融合体をスパンする配列である標的ポリヌク
レオチド配列が用いられる。哺乳類のかかる癌の治療または予防方法は、標的ポ
リヌクレオチドが、遺伝子の正常コピーを有し、異常遺伝子および正常遺伝子間
の差異がポリヌクレオチド配列の差異である哺乳類における異常な癌を引き起こ
す遺伝子のポリヌクレオチド配列である本発明の組成物を哺乳類へ投与すること
を含む。組成物は、哺乳類における異常配列の機能を減少あるいは阻害するのに
有効な量で、医薬上許容される担体中に、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促
進する所望の第二物質と共に投与される。
【００６０】 従って、本発明は、望ましくない産物または機能を発現するか、あるいは介在
する標的ポリヌクレオチドと実質的に相同な部分的二本鎖のＲＮＡ分子を、哺乳
類細胞のポリヌクレオチドの機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、哺乳
類細胞に送達できる組成物の利用によって、健常な哺乳類には見出されない望ま
しくないポリヌクレオチド産物またはポリヌクレオチド介在機能の発現によって
特徴付けられる哺乳類のいずれの疾病または疾患も治療する前記の分子機構を誘
発する方法を包含する。ＲＮＡ分子が必須の哺乳類ポリヌクレオチド配列と実質
的に非−相同であるので、これら必須の配列の機能を阻害しないとすれば、この
方法は、明らかに多くの治療的および予防的使用を有するように見える。当業者
は、前記疾患を容易に選択でき、また、それに対して本発明の組成物が向けられ
る標的ポリヌクレオチド配列を容易に選択できる。
【００６１】 Ｄ．本発明の他の方法 前記組成物およびこれら組成物を標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害ある
いは減少するために使用する一般的方法は、また、種々の研究およびインビトロ
での応用に応用できる。例えば、本発明の方法は、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド
配列が、選択される配列に実質的に相同であって、好ましくは、動物の他のポリ
ヌクレオチド配列に実質的に非−相同である本発明の組成物を、組織培養細胞ま
たはインビボで動物に投与することによって、細胞系または哺乳類実験動物の選
択されるポリヌクレオチド配列の機能を決定する研究に応用できる。この標的配
列の機能阻害は、動物の生物学および生理学に与える影響という研究を可能にす
る。
【００６２】 同様に、この方法の応用は、その発現に必要な酵素的配列、タンパク質発現配
列または制御配列のごとき選択される機能的配列を「サイレンシング」すること
によって、哺乳類、細菌、酵母、真菌、昆虫および他の生物の細胞系を、選択さ
れる経路で欠失させるのに使用できる。かかる操作された細胞は、慣用的アッセ
イまたは物質スクリーニングアッセイなどで使用される。 同様な方法で、選択される遺伝子の機能を永久に停止するのに十分な投与量に
変化させることによって、「ノックアウト」された実験動物が調製できる。従っ
て、前記の実験動物において「ノックアウト」されるのに選択される配列と実質
的に相同なポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を送達する本発明の方法は
、製薬および遺伝的研究に有用な「ノックアウト」されるマウスおよび他の実験
動物を開発するより簡単な技術を提供する。 本発明の組成物および方法を使用するさらに他の研究方法は、望ましいタンパ
ク質の微生物製品のための研究試薬または産業製品株としての使用のための、真
核および原核両者の微生物変異体の調製を含む。さらに他の使用は、本明細書中
の教えがあるとすれば、当業者には明らかであると思われる。
【００６３】 以下の実施例は、標的ポリヌクレオチド配列を減少あるいは阻害するために組
成物の調製および本発明の組成物の使用の方法を例示する。インビトロ合成で作
成される組成物の物質として、二本鎖ＲＮＡ分子およびＨＩＶｇａｇまたはＨＳ
ＶｇＤ２の標的ポリヌクレオチド配列を使用するこれら実施例は、単に本発明の
具体例を例示する。当業者によって、組成物の種々の物質の他の選択、および標
的ポリヌクレオチド配列の同一性が本明細書に教えられるごとく容易に選択され
ると理解される。これら実施例は、単に例示的であるだけで、本発明の範囲を限
定しない。
【００６４】 （実施例） 実施例１： ウイルス感染細胞におけるＨＩＶp２４の機能の減少または阻害 ＨＩＶ感染中、感染された分裂細胞の宿主染色体中に組み込まれる、ウイルス
ゲノムは、ＤＮＡテンプレートに逆転写される。組込みコピーは、それから、よ
り多くのＨＩＶ粒子が作成される青写真である。、ＨＩＶの複製および／または
発生病理に必須のポリヌクレオチド配列が減少あるいは阻害されるとすれば、本
発明によって、ウイルス感染は治療できる。本実施例は、本発明の方法の具体例
の１つの実施を示す。 プラスミド、ＨＩＶｇｐｔ（AIDS Research and Reference Reagent Program
Catalog）を使用して、欠失ＨＩＶゲノムの組込みコピー、ＨＩＶｇｐｔを含む
安定な組込みラブドミオザルコーマ（Rhabdomyosarcoma）（ＲＤ）またはＣＯＳ
７細胞系を得た。ＨＩＶｇｐｔゲノムは、エンベロープ遺伝子の場所にミコフェ
ノール酸（ＭＰＡ）耐性遺伝子をコードし、それによってＭＰＡ耐性を授与する
。プラスミドで細胞をトランスフェクトし、ついでＭＰＡ中で細胞選択すること
によって細胞系を作成した。ＭＰＡ耐性細胞は、クローンとして増殖した。培養
した、クローンとして増殖した細胞の培地を、ついで、p２４ＥＬＩＳＡアッセ
イキット（Coulter Corporation）を使用して、p２４（細胞外で分泌されるＨＩ
Ｖｇａｇポリペプチド）の存在についてアッセイした。全細胞がp２４陽性であ
った。
【００６５】 ２つのＲＤ細胞系および２つのＣＯＳ７細胞系を使用して、本発明の方法のあ
る具体例、すなわち、これら細胞でp２４合成を制御するＨＩＶp２４標的ポリヌ
クレオチドの機能の減少または阻害を示す。 本発明の試薬を生じるために、ＨＩＶ ＨＸＢ２株のｇａｇ遺伝子の同一の座
標に位置づけ、キャップ、ポリアデニル化配列および本来の開始コドンを欠失す
る６００ヌクレオチド（ｎｔ）センスＲＮＡ、６００ｎｔアンチセンスＲＮＡお
よび６００ｂｐ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞をトランスフェクトするのに
使用される。ＲＮＡ分子が、１つの末端にバクテリオファージＴ７ポリメラーゼ
プロモーターを有するＰＣＲ産物の転写を介して生じる（図１Ａおよび１Ｂを参
照）。プライマーの座標はＨＩＶ（ＨＸＢ２）、Genbank 受け入れ番号K０３４
５５の完全ゲノムの地図由来だった［また、L. Ratnerら、AIDS Res.Hum.Retrov
iruses, ３（１）：５７−６９ （１９８７）を参照］。前方ｇａｇプライマー
は座標９０１−９２４に位置し、この配列は、Ｔ７前方ｇａｇプライマーのＴ７
プロモーターの後に続く。逆転ｇａｇプライマーは、座標１４７６−１５００に
位置し、Ｔ７逆転ｇａｇプライマーのＴ７プロモーターの後に続く。
【００６６】 物質が、一本鎖センスＲＮＡである本発明の組成物を生じるために、Ｔ７プロ
モーターは前方ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。下線のＴ７プロモータ
ーの上流鎖で５'から３'へ書かれるｓｓセンスＲＮＡをコードするＤＮＡテンプ
レートを生じるために使用されるＰＣＲプライマーは、Ｔ７前方ｇａｇプライマ
ー［配列番号：１］ ５' GTAATACGACTCACTATAGGGCGGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG３' および逆転ｇａｇプライマー［配列番号：２］である。 ５' CTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC ３'
【００６７】 物質が、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である組成物を生じるために、Ｔ７プ
ロモーターは逆転ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。これらプライマーは
、Ｔ７逆転ｇａｇプライマー ［配列番号：３］ ５' GTAATACGACTCACTATAGGGCGCTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC３' および前方ｇａｇプライマー［配列番号：４］である。 ５ ' GCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG ３'
【００６８】 前記ＰＣＲ産物の両タイプは、物質が二本鎖ＲＮＡ分子である組成物を生じる
Ｔ７転写反応に含まれる。あるいは、本発明による組成物の物質は、転写後、セ
ンスおよびアンチセンスＲＮＡを一緒に混合することによって調製される。
【００６９】 対照として、同様な大きさのセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲ
ＮＡ分子がヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes Simplex Virus）のｇＤ遺
伝子から得られ、２型ゲノムが同一のＰＣＲおよびＴ７転写法によって生じる。
ＨＳＶｇＤのＰＣＲプライマーの座標はGenBank受け入れ番号K０１４０８、ＨＳ
ＶｇＤ ２遺伝子のマップから得られる。前方ｇＤプライマーは座標３１３−３
３６に位置し;この配列は、Ｔ７前方ｇＤプライマーのＴ７プロモーターの後に
続く。逆転ｇＤプライマーは座標８４９−８７２に位置し、Ｔ７逆転ｇＤプライ
マーのＴ７プロモーターの後に続く。これら対照分子を生じるのに使用されるプ
ライマーセットは、 Ｔ７前方ｇＤプライマー［配列番号：５］５' GTAATACGACTCACTATAGGGCG GTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC ３' および前方ｇＤプライマー［配列番号：６］ ５' GTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC ３'； およびＴ７逆転ｇＤプライマー［配列番号：７］５' GTAATACGACTCACTATAGGGCG GTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC ３' および逆転ｇＤプライマー［配列番号：８］ ５' GTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC ３'であった。
【００７０】 本発明のこれらＲＮＡ分子および前記の対照分子をＲＤおよびＣＯＳ７細胞系
で、以下のごとくアッセイする： ６穴プレート上５−６x１０５細胞／ウェルを約８０−９０％集密に達するま
で培養し、トランスフェクト剤として１０μlのリポフェクトアミン（Gibco−BR
L）を用いて２−３μgの選択されるＲＮＡ分子または対照分子でトランスフェク
トする。トランスフェクトされた細胞を、１ないし１７時間の範囲でインキュベ
ートする。別の細胞培養液を１μｇないし５００μｇの範囲の量のＲＮＡでトラ
ンスフェクトし、公知のトランスフェクト剤なしで送達し、０.５分から約２日
間細胞上でインキュベートする。例えば、ある群の細胞は、センスｇａｇＲＮＡ
で、別の細胞は、アンチセンスｇａｇＲＮＡで、別の細胞はｄｓｇａｇＲＮＡで
、別の細胞はセンスｇＤＲＮＡ対照で、別の細胞はアンチセンスｇＤＲＮＡ対照
で、および別の細胞はｄｓｇＤＲＮＡ対照でトランスフェクトされる。また、さ
らなる陰性対照は、ＲＮＡ分子を受け取らない細胞である。
【００７１】 細胞を３７℃で培養し、数週間という一定期間、p２４合成をモニターする。
細胞は、両者とも、p２４ＥＬＩＳＡアッセイキット（Coulter Corp）を用いて
細胞培養液中のp２４を測定すること、およびウサギポリクローナル抗−p２４血
清（Intracell Corp）およびFITC−コンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧ（Si
gma）を用いてp２４につき固定細胞を免疫染色すること両者によって、ＲＮＡ注
入２日後から、週３回アッセイする。 本発明によれば、ｇＤ ＲＮＡ分子はどれもp２４合成を阻止あるいは阻害する
能力を示さない。しかしながら、本発明によれば、ｄｓｇａｇＲＮＡ分子は、p
２４合成を阻害あるいはダウンレギュレートする。 これらＲＮＡが、ある程度の二本鎖を形成できなければ、センスおよびアンチセ
ンスＲＮＡ分子は、p２４合成において、たとえあるとしても緩和な阻害効果の
みを引き起こすと思われる。
【００７２】 実施例２ ある細胞培養液から別へのp２４合成減少の程度の測定 ダウンレギュレートされたシグナルがダウンレギュレートされていない細胞に
伝達されることを測定するために、本実施例は、減少／阻害効果（すなわち、p
２４合成の阻害または減少）が物質によってトランスフェクトされていない培養
系の細胞に伝達されることを示す。
【００７３】 Ａ．ＣＯＳ７およびＲＤ細胞の共同培養 Ｐ２４合成減少を示す実施例１の培養液の細胞は、予めいずれのＲＮＡ分子と
もインキュベートされておらず、実際野生型レベルでp２４を合成している対照
細胞と一緒に培養する。本発明によれば、予めトランスフェクトされた細胞は、
トランスフェクトされてない細胞に標的ポリヌクレオチド機能阻害を転移でき、
共培養系の対照細胞はp２４合成減少によって特徴付けられる。
【００７４】 培養液中、予めトランスフェクトされた細胞と対照細胞を区別するための、第
一のプロトコルは以下である：p２４合成阻害を示す実施例１のＣＯＳ７細胞を
、野生型レベルでp２４を発現するトランスフェクトされていないＲＤ細胞と、
６穴プレート上合計６−７x１０５細胞になるまで細胞型の種々の割合で、例え
ば、１／１０００ないし１／１０（ＣＯＳ７／ＲＤ）で共培養する。実施例１に
明記された条件下で培養２日後、培養系中のＲＤ細胞をp２４合成につき検査す
る。細胞は３週間、約週３回検査する。
【００７５】 Ｐ２４合成は２つの方法によってアッセイする。第一の方法は、共培養された
細胞の培養液をp２４ＥＬＩＳＡアッセイ（Coulter）を用いて、p２４につきア
ッセイする。第二の方法は、p２４に対するウサギポリクローナル血清（Intrace
ll Corp.）およびFITCにコンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧを用いてp２４
につき、細胞を免疫染色する。ＣＯＳ７およびＲＤ細胞は形態によって区別でき
るので、染色の失敗したＲＤ細胞は、ＣＯＳ７細胞と容易に区別できる。Ｔ７細
胞がT抗原を発現しない一方、ＣＯＳ７細胞が発現するので、共培養された細胞
はまた、ＳＶ４０T抗原（Pharmagen Corp.）およびr−フィコエリスリンにコン
ジュゲートした抗マウスＩｇＧ（PＥ）に対するマウスモノクローナル血清を用
いて、TＡｇにつき染色する。これらの条件下では、ＣＯＳ７細胞のみが染色す
る。細胞染色は、蛍光顕微鏡またはＦＬＯＷサイトメトリーによって測定する。
【００７６】 培養液のＲＤ細胞のp２４機能阻害は、共培養されたＲＤ細胞中ＦＩＴＣ染色
の失敗によるＲＤ細胞のみを含む対照培養系との比較によって示される。ＦＩＴ
ＣまたはPＥで染色されない共培養系のＲＤ細胞は、実施例１のＲＮＡ分子（特
にｄｓＲＮＡ分子）によるp２４標的ポリヌクレオチドのp２４合成機能の減少ま
たは阻害の証拠である。
【００７７】 Ｂ．トランスフェクトされていないＲＤ細胞でのトランスフェクトされたＲＤ細
胞の培養 第二のプロトコルでは、減少したp２４産生を示す、実施例１のトランスフェ
クトされたＲＤ細胞を組込みヒグロマイシン耐性遺伝子を含むように作成して、
６穴プレート上総細胞数６−７x１０５まで１／１０００ないし１／１０（ＲＤ
／対照ＲＤ）の範囲の割合という異なる細胞割合を用いて正常レベルのp２４を
発現する、トランスフェクトされていないＲＤ細胞と共培養する。ヒグロマイシ
ン耐性ＲＤ細胞は以下のごとく作成する：ＲＤ細胞（５−６x１０５細胞） を６
穴プレート上８０−９０％コンフルエンスまで培養し、チミジンキナーゼ（TK）
プロモーターの制御下、ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＥP４（Invitroge
n Corp.）のNru １−Sal １フラグメント、２.５μgでトランスフェクトする。
トランスフェクションは、トランスフェクト剤、リポフェクトアミン（Gibco BR
L）を用いて行われる。トランスフェクション２日後、４００μg／mlヒグロマイ
シン存在下、細胞をインキュベートする。耐性細胞がクローン的に広がる。１つ
以上のクローン的に広がった細胞系を対照として実験に用いる。
【００７８】 実施例１に明記された条件下での共培養後１日から数週間まで、複製された共
培養系を４００μg／mlヒグロマイシンとインキュベートする。この濃度のヒグ
ロマイシンはヒグロマイシン耐性ではないＲＤ細胞を死滅させ、対照ヒグロマイ
シン耐性ＲＤ細胞のみを残存させる。残りの耐性細胞は対照細胞由来である。P
２４レベルを例えば、実施例１のＥＬＩＳＡならびに前記の免疫染色によって、
対照細胞から、直接測定する。 本発明によって、p２４産生阻害は少なくとも対照細胞のサブセットで示され
る。
【００７９】 実施例３ 本発明の方法による内因性インターロイキン−１２減少のインビボ阻
害 Ａ．本発明の組成物としてのＲＮＡ分子の設計 この実験の全ＲＮＡ分子は長さ６００ｎｔｓに近く、全ＲＮＡ分子は、ＩＬ−１
２のp４０鎖を産生できないように設計する。分子はキャップおよびポリ−A配列
を有さず;本来の開始コドンは存在せず、ＲＮＡは全長産物をコードしない。以
下のＲＮＡ分子を設計する： （１）ＩＬ−１２p４０ネズミ伝令ＲＮＡ（mＲＮＡ）に相同な一本鎖（ｓｓ）
センスＲＮＡポリヌクレオチド配列； （２）ＩＬ−１２p４０ネズミmＲＮＡに相補的なｓｓアンチセンスＲＮＡポリ
ヌクレオチド配列； （３）センスおよびアンチセンス両者のp４０ＩＬ−１２ネズミmＲＮＡポリヌ
クレオチド配列を含む二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ； （４）ＩＬ−１２p４０ネズミ異種ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に相同なｓｓセンス
ＲＮＡポリヌクレオチド配列； （５）ＩＬ−１２ p４０ネズミｈｎＲＮＡに相補的なｓｓアンチセンスＲＮＡ
ポリヌクレオチド配列； （６）センスおよびアンチセンス両者のＩＬ−１２ p４０ネズミｈｎＲＮＡポ
リヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子； （７）ＩＬ−１２p４０プロモーターの上流鎖に相同なｓｓネズミＲＮＡポリ
ヌクレオチド配列； （８）ＩＬ−１２p４０プロモーターの下流鎖に相同なｓｓネズミＲＮＡポリ
ヌクレオチド配列および （９）ＩＬ−１２p４０プロモーターの上流および下流鎖に相同なネズミＲＮ
Ａポリヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子。
【００８０】 陰性対照として、実施例１に記載のＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子由来のセンス、アン
チセンスおよびｄｓＲＮＡもまた使用する。別の対照群はＲＮＡを受けないネズ
ミより成る。 実施例１に記載のごとく、片側末端にＴ７プロモーターを有するＰＣＲ産物の
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写を介して前記（１）−（９）の種々のＲＮＡ分子が
生じる。センスＲＮＡが所望の場合は、Ｔ７プロモーターは前方ＰＣＲプライマ
ーの５'末端に位置する。アンチセンスＲＮＡが所望の場合は、Ｔ７プロモータ
ーは逆転ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。ｄｓＲＮＡが所望の場合は、
両タイプのＰＣＲ産物をＴ７転写反応中に含む。あるいは、転写後、センスおよ
びアンチセンスＲＮＡを混合する。
【００８１】 本実施例のＲＮＡ分子の構築に使用されるＰＣＲプライマーは５'から３'へ、
Ｔ７プロモーターの上流鎖には下線を引く。 前方ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ）［配列番号：９］： ５' TCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG ３'； および逆転ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ） ［配列番号：１０］： ５' GAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG ３'； Ｔ７前方ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ）［配列番号：１１］： ５' GTAATACGACTCACTATAGGGTCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG３'； およびＴ７逆転ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ）［配列番号：１２］： ５' GTAATACGACTCACTATAGGGGAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG ３'；
【００８２】 Ｔ７前方ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１３］： ５' GTAATACGACTCACTATAGGGCCTATAAGCATAAGAGACGCCCTC ３'； および前方ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１４］： ５' CCTATAAGCATAAGAGACGCCCTC ３'； 逆転ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１５］： ５' GGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC ３'； およびＴ７逆転ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１６］： ５' GTAATACGACTCACTATAGGGGGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC ３'； Ｔ７前方ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：１７］： ５' GTAATACGACTCACTATAGGGTGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC３'；
【００８３】 および前方ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：１８］： ５' TGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC ３'； 逆転ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：１９］： ５' GCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA ３'； およびＴ７逆転ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：２０］： ５' GTAATACGACTCACTATAGGGGCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA ３'。
【００８４】 ゲノムおよびＰＣＲプライマーの座標は、以下の引用に供されるマップに基づ
く；Toneら、Eur. J. Immunol., ２６：１２２２−１２２７（１９９６）。前方
ＩＬ−１２ゲノムプライマーは座標８３０１−８３２５に位置する。逆転ＩＬ−
１２プライマーは８８８９−８９１３に位置する。前方ＩＬ−１２プロモーター
プライマーは座標８３−１０６に位置する。逆転ＩＬ−１２プロモーターは座標
６５９−６８２に位置する。ｃＤＮＡ ＰＣＲプライマーの座標は、GenBank受け
入れ番号M８６６７１に基づく。前方ＩＬ−１２cＤＮＡプライマーは座標３６−
５８に位置する。逆転ＩＬ−１２cＤＮＡプライマーは座標６５９−６８２に位
置する。
【００８５】 Ｂ．アッセイ 前記のネズミＩＬ−１２ p４０鎖特異的ＲＮＡまたは前記同定の対照を１０μ
ｇおよび５００μｇの範囲の用量で、Ｂａｌｂ／ｃネズミ（ネズミ５匹／群）に
、筋肉内あるいは腹腔内注射する。３週間という期間４日ごとにネズミから血清
を集め、Quantikine M−ＩＬ−１２ p４０ ＥＬＩＳＡ アッセイ（Genzyme）を
用いてＩＬ−１２p４０鎖のレベルにつきアッセイする。 本発明によれば、ＩＬ−１２mＲＮＡ、ＩＬ−１２ｈｎＲＮＡ両者由来のｄｓ
ＲＮＡ分子およびＩＬ−１２プロモーター由来のｄｓＲＮＡを受けるネズミはＩ
Ｌ−１２産生の減少または阻害を示す。ＲＮＡ分子があるレベルの二本鎖を形成
する能力を有さなければ、一本鎖ＩＬ−１２由来ＲＮＡ分子を受けるネズミ血清
中には、たとえあるとしても緩和な阻害効果が観察される。特定の方法では、Ｈ
ＳＶ ｇＤ由来ＲＮＡはインビボでＩＬ−１２を減少あるいは阻害しないと期待
される。
【００８６】 実施例４： 疾病の予防における本発明の方法 Ａ．インビトロアッセイ ２０−３０％コンフルエンス密度で接種されたベロおよび／またはＢＨＫ細胞
を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃にて６穴プレート上で培養する。細
胞が８０−９０％集密に達したら、トランスフェクト剤としてリポフェクトアミ
ン（Gibco−BRL）を用いて実施例１に記載の２−３μｇのＨＩＶｇａｇ−および
ＨＳＶｇＤ−特異的ＲＮＡ分子でトランスフェクトする。ＲＮＡ分子はまた、５
および１００μｇ間で変化する量のいずれの公知のトランスフェクト剤の非存在
下送達される。別の群の細胞はＲＮＡを受けない。
【００８７】 さらに他の群のベロおよび／またはBHK細胞は同様に、出典明示により本明細
書の一部とされる米国特許第５,８５１,８０４号記載の二本鎖ＤＮＡプラスミド
、プラスミド２４（HＣＭＶプロモーターの制御下ＨＳＶ２ｇＤタンパク質をコ
ードする配列およびＳＶ４０ポリＡ配列を含む）、２−３μｇでトランスフェク
トされる。 トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃にて
培養する。トランスフェクション後１、２、４および７日に、ＤＭＥＭ２５０μ
ｌの接種原中０.１の感染多重度（ＭＯＩ）にてＨＳＶ２で細胞を感染する。接
種原は、ウェル毎ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）２mｌを添加した１時間後吸着され
る。トランスフェクション後４および７日に感染したこれら細胞につき、細胞が
感染時間で全面成長しているので、新しい６穴プレートに移動する。細胞が移動
されない場合、過密になる。
【００８８】 感染後３６−４８時間で、細胞溶解産物を、ベロ細胞の慣用的なプラークアッ
セイ［Clinical Virology Manual, ２d edit., eds. S. Specter and G. Lancz,
pp. ４７３−９４ （１９９２）］によって、バイアルタイターをアッセイする
。本発明によれば、ｄｓＤＮＡプラスミド、APＬ−４００−０２４およびｇＤ２
抗原のポリヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子でトランスフェクトされた細
胞は、ＨＳＶ２で生産的に感染できない。他の細胞全て、ＨＳＶ２で生産的に感
染されるようになると思われる。
【００８９】 Ｂ．インビボアッセイ ＨＳＶｇＤタンパク質を作る能力および対照としてＨＩＶｇａｇ特異的ＲＮＡ
分子を有さない実施例１記載のＨＳＶ−ｇＤ特異的ＲＮＡ分子を用いて、注入さ
れた本発明のＨＳＶ２ｇＤ特異的ＲＮＡ分子の使用を介して、ネズミをＨＳＶ攻
撃からの保護につき評価する。 Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス５匹／群）を、１０および５００μｇＲＮＡの範
囲の用量で記載ＲＮＡ分子で筋肉内または腹腔内に免疫処理する。ＲＮＡ注入後
１、２、４および７日にマウスを経膣接種によってＨＳＶ−２（３０μl中１０
５pfu）で攻撃する。ＨＳＶ−２接種後毎日、マウスを感染の徴候につき観察し
、０−４の等級で等級付けする。ゼロは感染の徴候なし；１は赤みを示す；２は
小胞および赤みを示す；３は小胞、赤みおよび失禁を示す；４は麻痺を示す。
【００９０】 本発明によれば、ＨＳＶ ｇＤ配列を含む本発明のｄｓＲＮＡを受けるマウス
は、攻撃に対し保護されることが示される。ＨＩＶｇａｇ対照ＲＮＡ分子を受け
るマウスは保護されない。これら分子がインビボで少なくとも部分的二本鎖にな
る能力を有さなければ、ＨＳＶｇＤ配列を含むssＲＮＡ分子を受けるマウスは、
あったとしても最小限、保護されると思われる。本発明によれば、本発明のｄｓ
ＲＮＡ分子はＨＳＶ ｇＤタンパク質を作る能力を有さないので、ＲＮＡ分子の
動物への送達によって供される保護は、遺伝子特異的な非−免疫介在機構による
。
【００９１】 前記の引用文献は全て出典明示により本明細書の一部とされる。本発明の多数
の修飾および変形は前記明細書中に含まれ、当業者には明かであると思われる。
本発明の組成物およびプロセスのかかる修飾および改変は本明細書に添付の請求
項の範囲内に含まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター−前方
ｇａｇプライマー（Ｔ７Ｆ）および逆転ｇａｇ（Ｒ）プライマーを用いて生じた
ＰＣＲ産物を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるこのＰＣＲテンプレートか
らの転写によりＲＮＡ配列ｇａｇセンス螺旋が得られる。
【図１Ｂ】前方ｇａｇプライマー（Ｆ）およびＴ７プロモーター逆転ｇａｇ
（Ｔ７Ｒ）プライマーを用いて生じたＰＣＲ産物を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼを用いるこのテンプレートの転写により、ＲＮＡ配列ｇａｇアンチセンス螺旋
が得られる。図１Ａのテンプレートおよび図１Ｂのテンプレートの両者を使用す
ることで、二重螺旋ｇａｇＲＮＡ配列が得られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA11 CA20 DA02 GA13 HA17 HA20 4C076 DD60 FF34 4C084 AA13 ZB26 ZB32 ZB33 4C086 AA01 EA16 MA01 MA02 MA04 MA05 NA14 ZB26 ZB32 ZB33 4C087 AA01 BC01 BC83 NA14 ZB26 ZB32 ZB33

Claims (67)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類細胞における標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害
    する組成物であって、機能的タンパク質を産生せず、長さが少なくとも約２００
    のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも部分的に二本鎖のＲ
    ＮＡ分子を哺乳類細胞に供する物質を含み、ここで該ポリヌクレオチド配列が該
    標的ポリヌクレオチド配列と実質的に相同であり、選択される天然に存在する必
    須の哺乳類ポリヌクレオチド配列と実質的に非相同である、組成物。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチド配列の組成物および−９．２ｋｃａｌ／ｍ
    ｏｌのΔＧに依存して、ＲＮＡ分子のポリヌクレオチド配列の少なくとも１１の
    連続したヌクレオチドが二本鎖配列上に存在する、請求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】 実質的にＲＮＡ分子のポリヌクレオチド配列全体が二本鎖で
    ある、請求項２記載の組成物。
  4. 【請求項４】 ＲＮＡ分子のポリヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチド
    に対して少なくとも約１２ないし約１６の連続したヌクレオチドの配列にて正確
    な相同性を有し、該ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列の該標的配列に対する全相
    同性が約１０％よりも大きい、請求項１記載の組成物。
  5. 【請求項５】 相同性が約５０％より大きい、請求項４記載の組成物。
  6. 【請求項６】 物質がインビトロでの酵素合成法または化学合成法によって
    作製されるＲＮＡ分子である、請求項１記載の組成物。
  7. 【請求項７】 物質が組換え微生物または該微生物を増殖させる培地より単
    離することによってインビトロにて作製されるＲＮＡ分子である、請求項１記載
    の組成物。
  8. 【請求項８】 哺乳類細胞に送達された後に、物質がインビボにてＲＮＡ分
    子を生成する、請求項１記載の組成物。
  9. 【請求項９】 物質が二本鎖ＲＮＡである、請求項１記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 物質が一本鎖ＲＮＡセンス鎖である、請求項１記載の組成
    物。
  11. 【請求項１１】 一本鎖ＲＮＡセンス鎖が一端または両端あるいは該末端間
    の中間でヘアピンを形成する、請求項１０記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 一本鎖ＲＮＡセンス鎖が自身上で折り返して部分的二本鎖
    になる、請求項１０記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 物質が一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖である、請求項１記載
    の組成物。
  14. 【請求項１４】 一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖が一端または両端あるいは該
    末端間の中間でヘアピンを形成する、請求項１３記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖が自身上で折り返して部分的
    二本鎖になる、請求項１３記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 物質が、非塩基対ポリヌクレオチド配列により分離されて
    いてもよい、センスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド
    配列の両方を有する一本鎖ＲＮＡ配列であり、その一本鎖ＲＮＡ配列が二本鎖に
    なる能力を有する、請求項１記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 物質がロッド構造を形成する環状ＲＮＡ分子である、請求
    項１記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 物質がＲＮＡ分子をコードする二本鎖ＤＮＡ分子である、
    請求項８記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 ＤＮＡが二本鎖ＲＮＡをコードする、請求項１８記載の組
    成物。
  20. 【請求項２０】 ＤＮＡが一本鎖ＲＮＡセンス鎖をコードする、請求項１８
    記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 ＤＮＡが一端または両端あるいは該末端間の中間でヘアピ
    ンを形成する一本鎖ＲＮＡセンス鎖をコードする、請求項２０記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 ＤＮＡが自身上で折り返して部分的二本鎖になる一本鎖Ｒ
    ＮＡセンス鎖をコードする、請求項２０記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 ＤＮＡが一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖をコードする、請求
    項１８記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 ＤＮＡが一端または両端あるいは該末端間の中間でヘアピ
    ンを形成する一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖をコードする、請求項２３記載の組成
    物。
  25. 【請求項２５】 ＤＮＡが自身上で折り返して部分的二本鎖になる一本鎖Ｒ
    ＮＡアンチセンス鎖をコードする、請求項２３記載の組成物。
  26. 【請求項２６】 ＤＮＡが、非塩基対ポリヌクレオチド配列により分離され
    ていてもよい、センスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチ
    ド配列の両方を有する一本鎖ＲＮＡ配列をコードし、その一本鎖ＲＮＡ配列が二
    本鎖になる能力を有する、請求項１８記載の組成物。
  27. 【請求項２７】 ＤＮＡがロッド構造を形成する環状ＲＮＡ分子をコードす
    る、請求項１８記載の組成物。
  28. 【請求項２８】 物質がプラスミドである、請求項１記載の組成物。
  29. 【請求項２９】 物質が、一本鎖ＲＮＡセンスポリヌクレオチド配列をコー
    ドする第一ＤＮＡプラスミドおよび一本鎖ＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド
    配列をコードする第二ＤＮＡプラスミドを含み、ここで該センスおよびアンチセ
    ンスＲＮＡ配列が塩基対を形成して二本鎖になる能力を有する、請求項１記載の
    組成物。
  30. 【請求項３０】 プラスミドが細菌配列を含む、請求項２８記載の組成物。
  31. 【請求項３１】 物質が組換え細菌である、請求項１記載の組成物。
  32. 【請求項３２】 物質が組換えウイルスである、請求項１記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 物質が請求項２ないし３２のいずれか１項記載の分子で、
    インビトロでトランスフェクトされる供与細胞である、請求項１記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 物質が、生存している組換えウイルス、細菌または細胞、
    死滅しているウイルス、細菌または細胞、あるいは不活化ウイルス、細菌または
    細胞からなる群より選択される、請求項３０ないし３２のいずれか１項記載の組
    成物。
  35. 【請求項３５】 物質がポリアデニル化配列を欠く、請求項１記載の組成物
    。
  36. 【請求項３６】 ＲＮＡ分子が翻訳されない、請求項１記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 物質がコザック配列を欠く、請求項１記載の組成物。
  38. 【請求項３８】 物質が開始メチオニンコドンを欠く、請求項１記載の組成
    物。
  39. 【請求項３９】 ＲＮＡ分子がキャップ構造を欠く、請求項１記載の組成物
    。
  40. 【請求項４０】 物質がタンパク質合成のためのシグナルを欠く、請求項１
    記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 異なる物質の混合物を含む、請求項１記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 標的ポリヌクレオチド配列が感染した哺乳類細胞内でウイ
    ルスの複製および／または発生病理に不可欠なウイルスポリヌクレオチド配列で
    ある、請求項１記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 ウイルスがＤＮＡウイルスおよび中間ＤＮＡ段階を有する
    ウイルスよりなる群から選択される、請求項４２記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 ウイルスがレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパデノ
    ウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルスおよびパポ
    バウイルスよりなる群から選択される、請求項４３記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 ウイルスがＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、Ｈ
    ＴＬＶ、およびＥＢＶよりなる群から選択される，請求項４４記載の組成物。
  46. 【請求項４６】 標的ポリヌクレオチド配列が腫瘍抗原またはその機能的フ
    ラグメントあるいはウイルス誘発癌の調節配列であり、その抗原または配列が該
    哺乳類における該腫瘍の維持に必要である、請求項１記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 癌がＨＰＶＥ６／Ｅ７ウイルス−誘発頸癌、ＨＴＬＶ−誘
    発癌およびＥＢＶ誘発癌よりなる群から選択される、請求項４６記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 標的ポリヌクレオチド配列が感染哺乳類細胞における病原
    体の複製および／または発生病理に不可欠な細胞内または細胞外病原体のポリヌ
    クレオチド配列である、請求項１記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 標的ポリヌクレオチド配列が配列の正常なコピーをも有す
    る哺乳類中の異常な癌惹起性配列のポリヌクレオチド配列であり、異常な配列と
    正常な配列の間の差異がポリヌクレオチドの差異である、請求項１記載の組成物
    。
  50. 【請求項５０】 異常配列が２つの正常な遺伝子の融合体である、請求項４
    ９記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 標的ポリヌクレオチドが該融合体をスパンするポリヌクレ
    オチド配列である、請求項５０記載の組成物。
  52. 【請求項５２】 医薬上許容される担体中、請求項１−５１のいずれか１項
    記載の組成物および細胞内でのポリヌクレオチドの取り込みを促進する任意の第
    二物質を含む、医薬組成物。
  53. 【請求項５３】 第二物質が、細胞へのポリヌクレオチド移動を促進する、
    局所麻酔剤、ペプチド、陽イオン性脂質を含む脂質、リポソームまたは脂質粒子
    、ポリカチオン、分岐した三次元ポリカチオン、炭水化物、陽イオン性両親媒性
    物質、界面活性剤、ベンジルアンモニウム界面活性剤または別の化合物よりなる
    群から選択される、請求項５２記載の組成物。
  54. 【請求項５４】 第二物質がブピバカインである、請求項５３記載の組成物
    。
  55. 【請求項５５】 哺乳類におけるウイルス感染を治療する方法であって、 医薬上許容される担体中、細胞のポリヌクレオチド摂取を促進する任意の第二
    物質と一緒に、請求項１に記載の組成物を該哺乳類細胞内で該ウイルス配列の機
    能を減少あるいは阻害するのに有効な量で該哺乳類に投与し、ここで標的ポリヌ
    クレオチドは感染哺乳類細胞中で該ウイルスの複製および／または発生病理に不
    可欠なウイルスポリヌクレオチド配列である、ことを特徴とする方法。
  56. 【請求項５６】 哺乳類におけるウイルス感染を予防する方法であって、 医薬上許容される担体中、細胞のポリヌクレオチド摂取を促進する任意の第二
    物質と一緒に、請求項１に記載の組成物を、その後の該ウイルスの哺乳類細胞へ
    の導入に対して、該ウイルス配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で
    該哺乳類に投与し、ここで標的ポリヌクレオチドは感染哺乳類細胞中で該ウイル
    スの複製および／または発生病理に不可欠なウイルスポリヌクレオチド配列であ
    る、ことを特徴とする方法。
  57. 【請求項５７】 哺乳類におけるウイルス性誘発癌を治療または予防する方
    法であって、 医薬上許容される担体中、細胞のポリヌクレオチド摂取を促進する任意の第二
    物質と一緒に、請求項１に記載の組成物を、哺乳類における抗原の機能を減少あ
    るいは阻害するのに有効な量で該哺乳類に投与し、ここで標的ポリヌクレオチド
    は腫瘍抗原、調節配列またはその機能性フラグメントをコードする配列であり、
    その抗原または配列が該哺乳類における腫瘍の維持に不可欠である、ことを特徴
    とする方法。
  58. 【請求項５８】 細胞内または細胞外病原体による哺乳類の感染の治療また
    は予防のための方法であって、医薬上許容される担体中、病原性または哺乳類細
    胞のポリヌクレオチド摂取を促進する任意の第二物質と一緒に、請求項１に記載
    の組成物を該哺乳類内で該配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で該
    哺乳類に投与し、ここで該標的ポリヌクレオチドは感染哺乳類または哺乳類細胞
    中で該病原体の複製および／または発生病理に不可欠な病原体のポリヌクレオチ
    ド配列である、ことを特徴とする方法。
  59. 【請求項５９】 哺乳類における癌の治療または予防方法であって、医薬上
    許容される担体中、細胞のポリヌクレオチド摂取を促進する任意の第二物質と一
    緒に、請求項１に記載の組成物を、該哺乳類における異常な配列の機能を減少あ
    るいは阻害するのに有効な量で該哺乳類に投与し、ここで該標的ポリヌクレオチ
    ドは配列の正常なコピーをも有する哺乳類中の異常な癌惹起性配列のポリヌクレ
    オチド配列であり、異常な配列と正常な配列の間の差異がポリヌクレオチドの差
    異である、ことを特徴とする方法。
  60. 【請求項６０】 哺乳類の疾患または障害の治療法であって、 健常な哺乳類には見られないポリヌクレオチド産物の発現によって特徴付けら
    れる疾患または疾患を有する該哺乳類に、請求項１に記載の組成物を、該細胞類
    の細胞中の該標的ポリヌクレオチド産物の機能を減少あるいは阻害するのに有効
    な量で投与し、ここで該標的ポリヌクレオチド配列が該ポリヌクレオチド産物を
    発現するポリヌクレオチド配列あるいは該産物の発現に不可欠な調節配列である
    、ことを特徴とする方法。
  61. 【請求項６１】 哺乳類におけるウイルス感染の治療用医薬の製造における
    、医薬上許容される担体中、請求項１に記載の組成物と、細胞のポリヌクレオチ
    ド摂取を促進する任意の第二物質との使用であって、標的ポリヌクレオチドが感
    染した哺乳類細胞中で該ウイルスの複製および／または発生病理に不可欠なウイ
    ルスポリヌクレオチド配列である、ことを特徴とする使用。
  62. 【請求項６２】 組成物が該哺乳類の細胞内で該ウイルス配列の機能を減少
    あるいは阻害するのに有効な量にて配合される、請求項６１記載の使用。
  63. 【請求項６３】 組成物がウイルスの哺乳類細胞へのその後の導入に対して
    該ウイルス配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で存在する、請求項
    ６１記載の使用。
  64. 【請求項６４】 哺乳類におけるウイルス誘発の癌の治療または予防用医薬
    の製造における、該哺乳類における該抗原の機能を減少または阻害するのに効果
    的な量での、医薬上許容される担体中、請求項１に記載の組成物と、細胞のポリ
    ヌクレオチド摂取を促進する任意の第二物質との使用であって、標的ポリヌクレ
    オチドが腫瘍抗原、調節配列またはそのフラグメントをコードする配列であり、
    その抗原または配列機能が該哺乳類における該腫瘍の維持に不可欠である、こと
    を特徴とする使用。
  65. 【請求項６５】 細胞内または細胞外病原体による哺乳類の感染の治療また
    は予防用医薬の製造における、該哺乳類における該配列の機能を減少または阻害
    するのに効果的な量での、医薬上許容される担体中、請求項１に記載の組成物と
    、病原性または哺乳類細胞のポリヌクレオチド摂取を促進する任意の第二物質と
    の使用であって、該標的ポリヌクレオチドが感染した哺乳類または哺乳類細胞に
    おける該病原体の複製および／または発生病理に不可欠な該病理体のポリヌクレ
    オチド配列である、ことを特徴とする使用。
  66. 【請求項６６】 哺乳類の癌の治療または予防用医薬の製造における、該哺
    乳類における該異常な配列の機能を減少または阻害するのに効果的な量での、医
    薬上許容される担体中、請求項１に記載の組成物と、細胞のポリヌクレオチド摂
    取を促進する任意の第二物質との使用であって、該標的ポリヌクレオチドが該配
    列の正常なコピーをも有する哺乳類中の異常な癌惹起性配列のポリヌクレオチド
    配列であり、異常な配列と正常な配列の間の差異がポリヌクレオチドの差異であ
    る、ことを特徴とする使用。
  67. 【請求項６７】 標的ポリヌクレオチド産物の発現により特徴付けられる哺
    乳動物における疾患または障害の治療用医薬の製造における、該哺乳類の細胞に
    おける該産物の機能を減少または阻害するのに効果的な量での、該標的ポリヌク
    レオチド配列が該ポリヌクレオチド産物を発現するポリヌクレオチド配列または
    健康な哺乳類には見られない該ポリヌクレオチド産物の発現に不可欠な調節配列
    である、請求項１記載の組成物の使用。
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