JPS5936698A - Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞Info
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- JPS5936698A JPS5936698A JP57145092A JP14509282A JPS5936698A JP S5936698 A JPS5936698 A JP S5936698A JP 57145092 A JP57145092 A JP 57145092A JP 14509282 A JP14509282 A JP 14509282A JP S5936698 A JPS5936698 A JP S5936698A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、動物細胞に作用させて形質転換させるのに適
したＢ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡ
、それを用いて形質転換を行なった動物細胞、ことにマ
ウスＬＴＫ−細胞、および（３） それを用いたＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法に関する。
したＢ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡ
、それを用いて形質転換を行なった動物細胞、ことにマ
ウスＬＴＫ−細胞、および（３） それを用いたＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法に関する。
さらに詳しくは、大腸菌と動物細胞の両方で増殖し得る
いわゆるシャトルベクターを用い。
いわゆるシャトルベクターを用い。
これにＢ型肝炎ウィルス（以下＋ ＨＢＶと略す）の遺
伝子を組込んだ新規な組換えＤＮＡを得、これを動物細
胞に作用させて形質転換細胞とし、この形質転換動物細
胞を培養してＨＢＶ蛋白質を大量に生産する方法に関す
る。
伝子を組込んだ新規な組換えＤＮＡを得、これを動物細
胞に作用させて形質転換細胞とし、この形質転換動物細
胞を培養してＨＢＶ蛋白質を大量に生産する方法に関す
る。
Ｂ型ウィルス肝炎は、ＨＢＶ陽性者の血液輸血その他の
原因によって感染する疾患であって、完全な治療薬がな
く、一度罹患するとその完全治癒が困難であり、その予
防には、ＨＢＶ表面（以下。
原因によって感染する疾患であって、完全な治療薬がな
く、一度罹患するとその完全治癒が困難であり、その予
防には、ＨＢＶ表面（以下。
ＨＢｓ 抗原またはＨＢｓＡｇまたは単にＳ抗原と略す
）からなるワクチンが最も有効であると考えられている
。しかしながら−ＨＢＶはヒトやチンパンジーにのみ感
染し、培養細胞への感染の試みは成功していない。この
よりなＨＢＶの特殊性により、そのようなＨＢｓＡｇは
主として人血清よシ求めざるをえない。そのため−ＨＢ
ｓＡｇワクチンの量産に問題がある。
）からなるワクチンが最も有効であると考えられている
。しかしながら−ＨＢＶはヒトやチンパンジーにのみ感
染し、培養細胞への感染の試みは成功していない。この
よりなＨＢＶの特殊性により、そのようなＨＢｓＡｇは
主として人血清よシ求めざるをえない。そのため−ＨＢ
ｓＡｇワクチンの量産に問題がある。
（４）
最近、ＨＢｓＡｇをヒト血清によらず１組換えＤＮＡを
用いて大腸菌に作らせることが提案されて−るが（例え
ば特開昭５５−１０４８８７号）。
用いて大腸菌に作らせることが提案されて−るが（例え
ば特開昭５５−１０４８８７号）。
大腸菌による場合には、生じたＳ抗原が大腸菌内で壊れ
易いとかそのＳ抗原によって大腸菌の増殖が困難である
などの欠点を有するためＨＢｓＡｇの産生量が低く、所
望のＨＢｓＡｇの大量生産には、かならずしも適当でな
い。また、ある種の動物細胞に形質転換を起させる方法
も提案されているが（例えば特開昭５７−８９７８４号
）、この方法で用いられる組換えＤＮＡは大腸菌プラス
ミ１−．ＰＢ、Ｒ８２２ＫＨＢＶＤＮＡが挿入された４
ａ樟り出１ｉＤＮＡであって、ｐＢＲ８２２からの動物
細胞内での複製阻害部位の除去あるいは動物細胞内で増
殖するＳＶ４０などのＤＮＡの付加などの゛処理はなさ
れてｂない。したがって、例えばサル細胞（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ、 Ｙ、、 Ｃｅ１ｌ、 ２８ 、１７５〜．１８
２（１９８１）を参照）にこのＤＮＡを導入した場合に
はその細胞内での増殖は効果的に行ない得ない。
易いとかそのＳ抗原によって大腸菌の増殖が困難である
などの欠点を有するためＨＢｓＡｇの産生量が低く、所
望のＨＢｓＡｇの大量生産には、かならずしも適当でな
い。また、ある種の動物細胞に形質転換を起させる方法
も提案されているが（例えば特開昭５７−８９７８４号
）、この方法で用いられる組換えＤＮＡは大腸菌プラス
ミ１−．ＰＢ、Ｒ８２２ＫＨＢＶＤＮＡが挿入された４
ａ樟り出１ｉＤＮＡであって、ｐＢＲ８２２からの動物
細胞内での複製阻害部位の除去あるいは動物細胞内で増
殖するＳＶ４０などのＤＮＡの付加などの゛処理はなさ
れてｂない。したがって、例えばサル細胞（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ、 Ｙ、、 Ｃｅ１ｌ、 ２８ 、１７５〜．１８
２（１９８１）を参照）にこのＤＮＡを導入した場合に
はその細胞内での増殖は効果的に行ない得ない。
本発明者らは、新しい形質転換動物細胞を用いてＨＢＶ
蛋白質の量産を図るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌
と動物細胞の両方で増殖し得る組換えＤＮＡをシャトル
ベクターとして用い、これに）ＩＢＶ遺伝子を組込んだ
新規な組換えＤＮＡが所望の形質転換細胞の調製に適し
、この形質転換細胞を用いることによりヒト血清由来の
ＨＢＶ蛋白質と同じ免疫学的活性を有するＨＢＶ蛋白質
を量産しうろことを見い出し１本発明を完成するに至っ
た。
蛋白質の量産を図るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌
と動物細胞の両方で増殖し得る組換えＤＮＡをシャトル
ベクターとして用い、これに）ＩＢＶ遺伝子を組込んだ
新規な組換えＤＮＡが所望の形質転換細胞の調製に適し
、この形質転換細胞を用いることによりヒト血清由来の
ＨＢＶ蛋白質と同じ免疫学的活性を有するＨＢＶ蛋白質
を量産しうろことを見い出し１本発明を完成するに至っ
た。
すなわち１本発明は動物細胞の形質転換に適した新規な
組換えＤＮＡ、それによる形質転換動物細胞（ことにマ
ウス形質転換し細胞）および該形質転換細胞によるＨＢ
Ｖ蛋白質の生産方法を提供するものである。
組換えＤＮＡ、それによる形質転換動物細胞（ことにマ
ウス形質転換し細胞）および該形質転換細胞によるＨＢ
Ｖ蛋白質の生産方法を提供するものである。
本発明の新規な組換えＤＮＡの調製は、大腸菌と動物細
胞の両方で増殖しうるシャトルベクター、例えばｐＸＲ
［Ｇを用い、これにＨＢＶの遺伝子を組込むことにより
行なわれる。このようにして得られる新規な組換えＤＮ
Ａを動物細胞、好ましくはチミジンキナーゼ欠損（以下
＋ ＴＫ−と略す）の動物細胞、例えばマウスＬＴＫ−
細胞に作用させて形質転換細胞を得る。この形質転換細
胞を所定の培養条件下に培養することにより所望のＨＢ
Ｖ蛋白質が量産されるが１本発明の方法によれば、ＨＢ
Ｖ蛋白質として、ＨＢｓ抗原のみならず。
胞の両方で増殖しうるシャトルベクター、例えばｐＸＲ
［Ｇを用い、これにＨＢＶの遺伝子を組込むことにより
行なわれる。このようにして得られる新規な組換えＤＮ
Ａを動物細胞、好ましくはチミジンキナーゼ欠損（以下
＋ ＴＫ−と略す）の動物細胞、例えばマウスＬＴＫ−
細胞に作用させて形質転換細胞を得る。この形質転換細
胞を所定の培養条件下に培養することにより所望のＨＢ
Ｖ蛋白質が量産されるが１本発明の方法によれば、ＨＢ
Ｖ蛋白質として、ＨＢｓ抗原のみならず。
これまでその採取が報告されていないＨＢｅ抗原（以下
、ＨＢｅＡｇｉたは単にｅ抗原ということもある）も産
生じ得ることが特徴である。
、ＨＢｅＡｇｉたは単にｅ抗原ということもある）も産
生じ得ることが特徴である。
以下に本発明の組換えＤＮＡ、形質転換細胞。
およびそれによるＨＢＶ蛋白質の生産についてさらに詳
細に説明する。
細に説明する。
（１）ＨＢｖ遺伝子
本発明で用いられるＨＢＶ遺伝子は大腸菌によりクロー
ニングされたＨＢＶＤＮＡで、ことに日本および他の東
南アジアなどで多く見られるＨＢＶサブタイプａｄｒの
ものであり、制限酵素ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩ認識部
位を各々１個有する。とのＨＢＶＤＮＡは通常制限酵素
ＸｈｏＩまたけＢａｍＨＩで処理してＨＢＶ遺伝子を含
んだフラグメン（７） トとして組込みに供される。このフラグメントけ。
ニングされたＨＢＶＤＮＡで、ことに日本および他の東
南アジアなどで多く見られるＨＢＶサブタイプａｄｒの
ものであり、制限酵素ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩ認識部
位を各々１個有する。とのＨＢＶＤＮＡは通常制限酵素
ＸｈｏＩまたけＢａｍＨＩで処理してＨＢＶ遺伝子を含
んだフラグメン（７） トとして組込みに供される。このフラグメントけ。
例えば制限酵素ＢａｍＨＩで処理して得られる１３ａｍ
ハ 在している。また制限酵素ＸｈＯ■で処理して得られる
Ｘｈｏｌ：認識部位を末端としたＨＢｓ遺伝子とＨＢｃ
遺伝子を対応させたもの、さらにそのフラグメントを１
３ａｍ ＨＩで処理して得られるＨＢｓ遺伝子のみのフ
ラグメントも同様に用いられる。
ハ 在している。また制限酵素ＸｈＯ■で処理して得られる
Ｘｈｏｌ：認識部位を末端としたＨＢｓ遺伝子とＨＢｃ
遺伝子を対応させたもの、さらにそのフラグメントを１
３ａｍ ＨＩで処理して得られるＨＢｓ遺伝子のみのフ
ラグメントも同様に用いられる。
このＨＢＶＤＮＡはつぎのようにし、で調製される。
まずＨＢ ｓ抗原保有のヒト血液中に含まれるウィルス
粒子〔ディン（Ｄａｎｅ）粒子〕を常法によす分ｍ−ｔ
−ル。但１．− このＨＢＶＤＮＡは８，２００ｂｐを
有する環状２本鎖構造をとっているが、ＤＮＡ全体の１
５〜５０％の領域は１本鎖であり遺伝子クローニング用
に２本鎖とするために、ザトラーおよびロビンンンの方
法（Ｆ、 ５ａｔｔｌｅｒ ＆Ｗ。
粒子〔ディン（Ｄａｎｅ）粒子〕を常法によす分ｍ−ｔ
−ル。但１．− このＨＢＶＤＮＡは８，２００ｂｐを
有する環状２本鎖構造をとっているが、ＤＮＡ全体の１
５〜５０％の領域は１本鎖であり遺伝子クローニング用
に２本鎖とするために、ザトラーおよびロビンンンの方
法（Ｆ、 ５ａｔｔｌｅｒ ＆Ｗ。
Ｓ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、 ８２ 。
ｉｒｏｌｏｇｙ、 ８２ 。
２２６〜２３３ （１９７９） 、 ”Ｈｅｐａｔｉ
ｔｉｓ ｆ３（８） ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｈａ
ｖｅ ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄｓ” を参照）により
１本鎖部分をＨＢＶに含まれるエントゲナスＤＮＡポリ
メラーゼを利用して２本鎖に修復したのちＤＮＡを抽出
し、これを大腸菌によりクローニングして増幅したのち
１通常は適当な制限酵素で処理して所定のフラグメント
として、後述のプラスミド構築に供する。
ｔｉｓ ｆ３（８） ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｈａ
ｖｅ ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄｓ” を参照）により
１本鎖部分をＨＢＶに含まれるエントゲナスＤＮＡポリ
メラーゼを利用して２本鎖に修復したのちＤＮＡを抽出
し、これを大腸菌によりクローニングして増幅したのち
１通常は適当な制限酵素で処理して所定のフラグメント
として、後述のプラスミド構築に供する。
なお１本発明において用いられるＨＢＶＤＮＡは前述し
たとおり日本などで多く見られるＨＢＶサブタイプａｄ
ｒがとくに好ましいが、欧米において多く見られる）Ｉ
ＢＶサブタイプａｄｗなども同様に用いられうる。
たとおり日本などで多く見られるＨＢＶサブタイプａｄ
ｒがとくに好ましいが、欧米において多く見られる）Ｉ
ＢＶサブタイプａｄｗなども同様に用いられうる。
（２）シャトルベクタ一
本発明で用いられるベクターは大腸菌プラスミドに５Ｖ
４０ＤＮＡの複製開始部位を挿入したものであって、大
腸菌と動物細胞の両方で増殖し得るシャトルベクターで
ある。
４０ＤＮＡの複製開始部位を挿入したものであって、大
腸菌と動物細胞の両方で増殖し得るシャトルベクターで
ある。
その大腸菌プラスミドとしては−ＣｏｌＥ１．ＰＭＢＩ
に由来するプラスミド、Ｐ１５Ａに由来するプラスミド
などが含まれる。
に由来するプラスミド、Ｐ１５Ａに由来するプラスミド
などが含まれる。
この大腸菌プラスミドに挿入される５Ｖ４ＱＤＮＡとは
サルに感染してガンを惹起するウィルスの一種で哺乳動
物のガンウィルスとしてよく研究されているウィルスの
ＤＮＡであって、遺伝子操作の分野におりてこのウィル
スＤＮＡを他のＤＮＡ（例えばグロビン遺伝子）を結合
させて組換えＤＮＡとし、サル培養細胞へ感染させてグ
ロビンを作らせることなどに利用されている。本発明に
おいてはこのよりな５Ｖ４０ＤＮＡの複製開始部位（一
般に５Ｖ４Ｑｏｒｉと略称される）を大腸菌プラスミド
に挿入し、これをＨＢＶ遺伝子による組換えＤＮＡの調
製に適用したものであって、かかる組換えＤＮＡは大腸
菌および動物細胞１例えばサル細胞やマウス細胞の両方
で増殖でき、所望の組換えＤＮＡを産生じつる。
サルに感染してガンを惹起するウィルスの一種で哺乳動
物のガンウィルスとしてよく研究されているウィルスの
ＤＮＡであって、遺伝子操作の分野におりてこのウィル
スＤＮＡを他のＤＮＡ（例えばグロビン遺伝子）を結合
させて組換えＤＮＡとし、サル培養細胞へ感染させてグ
ロビンを作らせることなどに利用されている。本発明に
おいてはこのよりな５Ｖ４０ＤＮＡの複製開始部位（一
般に５Ｖ４Ｑｏｒｉと略称される）を大腸菌プラスミド
に挿入し、これをＨＢＶ遺伝子による組換えＤＮＡの調
製に適用したものであって、かかる組換えＤＮＡは大腸
菌および動物細胞１例えばサル細胞やマウス細胞の両方
で増殖でき、所望の組換えＤＮＡを産生じつる。
本発明のベクターはさらに動物細胞内での複製阻害部分
を欠損させておくのが好ましく１例えば大腸菌プラスミ
ドｐＢＲ８２２から動物細胞に毒性の部分（すなわち動
物細胞内での複製阻害部分。
を欠損させておくのが好ましく１例えば大腸菌プラスミ
ドｐＢＲ８２２から動物細胞に毒性の部分（すなわち動
物細胞内での複製阻害部分。
１．４２６〜２．５２１Ｋｂ）を除したＤＮＡ（ｐＸｆ
３ と称す）と動物細胞の５Ｖ４ＱＤＮＡの複製開始
部分（０，３１４ｂ）との組換えＤＮＡが挙げられ、こ
れをｐＸＲ［Ｇと称している。このものは添付の第２図
に示す構造を有し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ開裂部位
ニＳ Ｖ ４０ Ｄ ＮＡ）Ｗ製開始部分（０，３１Ｋ
ｂ）を挿入し、さらに動物細胞内での複製阻害部分（１
，４２６〜２．５２１Ｋｂ）および、場合により、ベク
ターサイズを短縮する目的で他の不要な部分（例えば１
１０２〜３．２１１Ｋｂ ）を欠損させてなり、テトラ
サイタリン耐性遺伝子（Ｔｃ）とアンピシリン耐性遺伝
子（Ａｐｒ）を有している。
３ と称す）と動物細胞の５Ｖ４ＱＤＮＡの複製開始
部分（０，３１４ｂ）との組換えＤＮＡが挙げられ、こ
れをｐＸＲ［Ｇと称している。このものは添付の第２図
に示す構造を有し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ開裂部位
ニＳ Ｖ ４０ Ｄ ＮＡ）Ｗ製開始部分（０，３１Ｋ
ｂ）を挿入し、さらに動物細胞内での複製阻害部分（１
，４２６〜２．５２１Ｋｂ）および、場合により、ベク
ターサイズを短縮する目的で他の不要な部分（例えば１
１０２〜３．２１１Ｋｂ ）を欠損させてなり、テトラ
サイタリン耐性遺伝子（Ｔｃ）とアンピシリン耐性遺伝
子（Ａｐｒ）を有している。
なお、このような抗生物質耐性遺伝子は後記形質転換細
胞の選択マーカーとなる遺伝子であって。
胞の選択マーカーとなる遺伝子であって。
これらのほかにカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子なども組込むことができる。
ニコール耐性遺伝子なども組込むことができる。
このようなベクターをＨＢＶ遺伝子と結合させて所望の
紘４九 −：ＤＮＡを調製する場合には適当な制限酵素
１例えばＢａｍＨＩ 、Ｓａｌ Ｉ ＋（１１） Ｈｉｎｄ］Ｉｌ々どで処理して開裂させてフラグメント
として用いる。
紘４九 −：ＤＮＡを調製する場合には適当な制限酵素
１例えばＢａｍＨＩ 、Ｓａｌ Ｉ ＋（１１） Ｈｉｎｄ］Ｉｌ々どで処理して開裂させてフラグメント
として用いる。
（３）組換えＤＮＡ（ＨＢＶ遺伝子発現プラスミド）の
構築 前記シャトルベクターを適当な制限酵素（例えば１３ａ
ｍ １−１Ｉ ）で処理して得られるフラグメントとＨ
ＢＶ遺伝子を含むフラグメントとを適当な割合にて結合
反応に付すことにより所望の組換えＤＮＡが得られる。
構築 前記シャトルベクターを適当な制限酵素（例えば１３ａ
ｍ １−１Ｉ ）で処理して得られるフラグメントとＨ
ＢＶ遺伝子を含むフラグメントとを適当な割合にて結合
反応に付すことにより所望の組換えＤＮＡが得られる。
この際、用いられる各フラグメントの使用割合によりベ
クターのフラグメント１個に対しＨＢＶＤＮＡのフラグ
メントが１〜複数個の割合で挿入される。通常１：１〜
１：１０モルの割合で反応させることにより行なわれる
。好ましい組換えＤＮＡけＨＢＶＤＮＡフラグメントが
２〜４個挿入されたものである。
クターのフラグメント１個に対しＨＢＶＤＮＡのフラグ
メントが１〜複数個の割合で挿入される。通常１：１〜
１：１０モルの割合で反応させることにより行なわれる
。好ましい組換えＤＮＡけＨＢＶＤＮＡフラグメントが
２〜４個挿入されたものである。
このような組換えＤＮＡの構造は第３図に示すとおりで
あって、第３図ＡはＨＢ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ ＢａｍＨＩ
フラグメントが１個入ったもの（ｐ ＳＨＢ’ｌ）。
あって、第３図ＡはＨＢ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ ＢａｍＨＩ
フラグメントが１個入ったもの（ｐ ＳＨＢ’ｌ）。
第３図Ｂは同３個入ったもの（ｐＳＨＢ３）を示す。第
３図に示されるようにＨＢＶＤＮＡのフラ（１２） グメントは同じ向きに、すなわち頭−尾の形で挿入され
る。
３図に示されるようにＨＢＶＤＮＡのフラ（１２） グメントは同じ向きに、すなわち頭−尾の形で挿入され
る。
（４）動物細胞の形質転換
前記の）ｉＢＶ遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡを動物細
胞に作用させて培養することによシ動物細胞の形質転換
が行なわれる。
胞に作用させて培養することによシ動物細胞の形質転換
が行なわれる。
この動物細胞としてＴＫ−動物細胞１例えばマウスＬＴ
Ｋ−細胞を用いることが好ましく２この場合形質転換の
際作用させる組換えＤＮＡと共に数十倍から数百倍のＴ
Ｋ遺伝子を同時に作用させることにより所望の形質転換
細胞のみを選択的に取り出し得るため好都合である。な
お１組換えＤＮＡとＴＫ遺伝子を併用する代りに、組換
えＤＮＡに予めＴ Ｋ遺伝子を組込んでおくこともでき
る。
Ｋ−細胞を用いることが好ましく２この場合形質転換の
際作用させる組換えＤＮＡと共に数十倍から数百倍のＴ
Ｋ遺伝子を同時に作用させることにより所望の形質転換
細胞のみを選択的に取り出し得るため好都合である。な
お１組換えＤＮＡとＴＫ遺伝子を併用する代りに、組換
えＤＮＡに予めＴ Ｋ遺伝子を組込んでおくこともでき
る。
つぎに動物細胞としてマウスＬＴＫ−細胞を用いた場合
の形質転換操作をさらに具体的に述べる。
の形質転換操作をさらに具体的に述べる。
例えば、マウスＬＴＫ−細胞を１０％牛血清を含むダル
ベツコ改良イーグル培地（Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏ’ｓｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ 、以
下ＤＭＥＭと略す） （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、几、＆ Ｆ
ｒｅｅｍａｎ、 Ｇ、 ；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ｓ 、
８９６ 、１９５９ ）にて培養し、これに組換えＤ
ＮＡとＴＫ遺伝子ＤＮＡをリン酸カルシウム溶液中に混
合した溶液を加えて室温で数十分間、通常約３０分間放
置したのち、ＤＭＥＭを加えて４〜５時間培養し、培地
を交換し、さらに１２〜２４時間ＤＭＥＭにて培養する
。ついで。
ベツコ改良イーグル培地（Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏ’ｓｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ 、以
下ＤＭＥＭと略す） （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、几、＆ Ｆ
ｒｅｅｍａｎ、 Ｇ、 ；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ｓ 、
８９６ 、１９５９ ）にて培養し、これに組換えＤ
ＮＡとＴＫ遺伝子ＤＮＡをリン酸カルシウム溶液中に混
合した溶液を加えて室温で数十分間、通常約３０分間放
置したのち、ＤＭＥＭを加えて４〜５時間培養し、培地
を交換し、さらに１２〜２４時間ＤＭＥＭにて培養する
。ついで。
ヒポキサンチン（１５μｆ／、ｔ ） 、アミノプテリ
ン（１μｆ／−）およびチミジン（５μｇ／−）を含む
培地（以下、）ｉＡＴ培地とじう） ［Ｌｉｔｔｌｅｆ
ｉｅｌｄ？ Ｊ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７２ 、８９６１〜８９６５
（１９６Ｂ）］ で培養して所望の形質転換マウスＬ細
胞を得る。なお、この場合、出発マウスＬＴＫ−細胞は
ＴＫ遺伝子を欠損しているためＨＡＴ培地では成育でき
ないが、ＴＫ遺伝子を導入して形質転換したマウスＬ細
胞はチミジンキナーゼ合成能を有しＨＡＴ培地で成育す
るため、上記ＨＡＴ培地での培養により所望の形質転換
細胞のみが選択的に得られる。
ン（１μｆ／−）およびチミジン（５μｇ／−）を含む
培地（以下、）ｉＡＴ培地とじう） ［Ｌｉｔｔｌｅｆ
ｉｅｌｄ？ Ｊ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７２ 、８９６１〜８９６５
（１９６Ｂ）］ で培養して所望の形質転換マウスＬ細
胞を得る。なお、この場合、出発マウスＬＴＫ−細胞は
ＴＫ遺伝子を欠損しているためＨＡＴ培地では成育でき
ないが、ＴＫ遺伝子を導入して形質転換したマウスＬ細
胞はチミジンキナーゼ合成能を有しＨＡＴ培地で成育す
るため、上記ＨＡＴ培地での培養により所望の形質転換
細胞のみが選択的に得られる。
（５）ＴＫ遺伝子
本発明のＨＢＶ遺伝子を組込んだ組換えＤＮＡで動物細
胞に形質転換させる場合に同時に混合使用されるＴＫ遺
伝子は、単純ヘルペスウィルスＤＮＡからのＴＫ遺伝子
と大腸菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２との組換えＤ
ＮＡであり、第４図に示すような構造を有する［ Ｆｌ
ｏｒｅｎｃｅ Ｃｏ１ｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ、 ３
ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅ６【ｉｎｇ ｏｆ ＥＳＡ
ＣＴ、 ０ｘｆｏｒｄ １９７９ 、 Ｄｅｖｅｌｏｐ
、 ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ。
胞に形質転換させる場合に同時に混合使用されるＴＫ遺
伝子は、単純ヘルペスウィルスＤＮＡからのＴＫ遺伝子
と大腸菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２との組換えＤ
ＮＡであり、第４図に示すような構造を有する［ Ｆｌ
ｏｒｅｎｃｅ Ｃｏ１ｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ、 ３
ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅ６【ｉｎｇ ｏｆ ＥＳＡ
ＣＴ、 ０ｘｆｏｒｄ １９７９ 、 Ｄｅｖｅｌｏｐ
、 ｂｉｏｌ、 ５ｔａｎｄａｒｄ。
４６７５〜８２ （１９８０）を参照〕。
（６）形質転換細胞の培養およびＨＢＶ蛋白質の生産
前記の方法で得られた形質転換細胞を常法にしたがって
培養することにより生育細胞内に大量のＨＢＶ蛋白質、
すなわちＳ抗原のみならずｅ抗原が産生され、培地内に
放出される。この場合１通常、Ｓ抗原とｅ抗原が混合し
て産生されるが、これらの分離は常法の蛋白質精製法１
例えば、培養液を分離し、抗ＨＢｓ 抗体を充填したカ
ラムに通し、０．１ＭＨＣｚ−グリシン緩衝液で溶出し
てＳ抗原を得る。同様に、抗ＨＢｅ抗体のカラムを用い
て処理してｅ抗原を得る。
培養することにより生育細胞内に大量のＨＢＶ蛋白質、
すなわちＳ抗原のみならずｅ抗原が産生され、培地内に
放出される。この場合１通常、Ｓ抗原とｅ抗原が混合し
て産生されるが、これらの分離は常法の蛋白質精製法１
例えば、培養液を分離し、抗ＨＢｓ 抗体を充填したカ
ラムに通し、０．１ＭＨＣｚ−グリシン緩衝液で溶出し
てＳ抗原を得る。同様に、抗ＨＢｅ抗体のカラムを用い
て処理してｅ抗原を得る。
（１５）
上記の方法で得られるＨＢＶ蛋白質は免疫学的にヒト血
清から得られるものと全く同一であり。
清から得られるものと全く同一であり。
ヒト血清によるものと同様にしてＨＢＶ用ワクチンまた
は疹断用試薬として利用し得る。
は疹断用試薬として利用し得る。
つぎに実施例を挙げて本発明の組換えＤＮＡ−形質転換
細胞、ＨＢＶ蛋白質の生産についてさらに具体的に説明
する。
細胞、ＨＢＶ蛋白質の生産についてさらに具体的に説明
する。
実施例１
（ＩＪＨＢＶＤＮＡ（７）ｌＮ製
（１）ウィルスＤＮＡの調製
ＨＢｓＡｇ陽性かっＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血清型ａ
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７０〇−を５０
００ ｒＰｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除去する
。これを４°Ｃにて１８，０００ ｒＰｍで８時間遠心
分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭトリｙ、 −
ＨＣｌ、０．１ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ ；ｐＨ７
，５）１０−に再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する遠
沈管の頂部に重層させる。これを４°Ｃにて８９．００
０ｒＰｍで４時間遠心分離し、得られた沈査を上記と同
じ緩衝液に再溶解させる。
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７０〇−を５０
００ ｒＰｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除去する
。これを４°Ｃにて１８，０００ ｒＰｍで８時間遠心
分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭトリｙ、 −
ＨＣｌ、０．１ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ ；ｐＨ７
，５）１０−に再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する遠
沈管の頂部に重層させる。これを４°Ｃにて８９．００
０ｒＰｍで４時間遠心分離し、得られた沈査を上記と同
じ緩衝液に再溶解させる。
（１６）
ついで、のちの操作を容易釦するために、ＨＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭ） ！Ｊス
ーＨＣ４（ＰＨ７，５）、８０ ｍＭ ＮＨ４ＣＺ −
２５ｒｎＭ Ｍｇ Ｃｌ３− ０．５％ターシト−ｔｖ
Ｎｐ ４０ （Ｓ ｉ ｇｍａ社製）、０．１％２−メ
ルカプトエタノール。
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭ） ！Ｊス
ーＨＣ４（ＰＨ７，５）、８０ ｍＭ ＮＨ４ＣＺ −
２５ｒｎＭ Ｍｇ Ｃｌ３− ０．５％ターシト−ｔｖ
Ｎｐ ４０ （Ｓ ｉ ｇｍａ社製）、０．１％２−メ
ルカプトエタノール。
３３０μＭのｄｃＴＰ（デオキシシチジントリホスフェ
ート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスフェー
ト）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリホスフェート
）、０．５μＭα−［Ｐ］ｄＴＴＰ（デオキシチアミン
トホスフェート）の混合液５００μを中で３７°Ｃにて
３０分間行なう。
ート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリホスフェー
ト）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリホスフェート
）、０．５μＭα−［Ｐ］ｄＴＴＰ（デオキシチアミン
トホスフェート）の混合液５００μを中で３７°Ｃにて
３０分間行なう。
これにさらにｄＴＴＰを最終濃度３３０μＭになるよう
に加え、３７℃で３時間反応させ、これに同容量の１０
０ｍＭＥＤＴＡ溶液を加える。このＤＮＡポリメラーゼ
反応により、ＤＮＡ中の一本鎖部分が修複され、［Ｐｌ
ラベル化された材料を得、これを蔗糖の３０％、２０％
および１０％水溶液を段階的に重層した遠心管の頂部に
重層し。
に加え、３７℃で３時間反応させ、これに同容量の１０
０ｍＭＥＤＴＡ溶液を加える。このＤＮＡポリメラーゼ
反応により、ＤＮＡ中の一本鎖部分が修複され、［Ｐｌ
ラベル化された材料を得、これを蔗糖の３０％、２０％
および１０％水溶液を段階的に重層した遠心管の頂部に
重層し。
４℃にて８９，０００ ｒＰｍで４．５時間遠心分離す
る。
る。
ついで、ＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するた
めに、上記で得られた沈査を１９／−プロナーゼＥおよ
び０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混液中で３７℃に
て２時間処理したのち−ＤＮＡをフェノール２００μｔ
で２回抽出し、つ−でエーテルで振ってフェノール溶媒
を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。このＤＮＡは２
．５Ｘ１０６ｃｐｍ／μｇ の比放射活性を示し、制限
酵素消化に充分使用し得る。
めに、上記で得られた沈査を１９／−プロナーゼＥおよ
び０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混液中で３７℃に
て２時間処理したのち−ＤＮＡをフェノール２００μｔ
で２回抽出し、つ−でエーテルで振ってフェノール溶媒
を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。このＤＮＡは２
．５Ｘ１０６ｃｐｍ／μｇ の比放射活性を示し、制限
酵素消化に充分使用し得る。
（ｉｆ）ＨＢＶＤＮＡ（７）りａ−ｙ化前記の方法で調
製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、下記のようにし
てまずλフアージシャロン１６ＡＤＮＡをベクターとし
てクローン化シ、さらに公知のプラスミドｐＢＲ８２２
をベクターとして再クローン化を行なう。
製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、下記のようにし
てまずλフアージシャロン１６ＡＤＮＡをベクターとし
てクローン化シ、さらに公知のプラスミドｐＢＲ８２２
をベクターとして再クローン化を行なう。
（Ｎλフアージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系による
クローン化： ＨＢＶＤＮＡ２０ ｎｇを１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣｔ（
ＰＨ７，４）、７ｍＭＭｇＣｔ２− １００ｍＭＮａＣ
ｚ−７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２ｏμを中
にて制限エンドヌクレアーゼＸｈＯ■によす３７°Ｃに
て２時間処理したのち、フェノール２００μｔにて抽出
し、ついでエーテル抽出後、その水層に２倍容量の冷エ
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。この混液を一７
０°Ｃで１時間保持したのち。
クローン化： ＨＢＶＤＮＡ２０ ｎｇを１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣｔ（
ＰＨ７，４）、７ｍＭＭｇＣｔ２− １００ｍＭＮａＣ
ｚ−７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２ｏμを中
にて制限エンドヌクレアーゼＸｈＯ■によす３７°Ｃに
て２時間処理したのち、フェノール２００μｔにて抽出
し、ついでエーテル抽出後、その水層に２倍容量の冷エ
タノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。この混液を一７
０°Ｃで１時間保持したのち。
１０．００ Ｏｒｐｍにて５分間遠心分離して沈殿する
ＤＮＡを回収する。分離した沈査をｌＯｍＭ）！Ｊヌー
ＨＣ４（ｐＨ７，４）および１ｍＭＥＤＴＡの混液５μ
ｔに溶解させる。ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モル量
の前記と同様にして制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩに
より開裂されたλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ（Ｘｈ
ｏＩ認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（５Ｑ ｍＭ Ｉ−リス−ＨＣ１（ＰＨ７，４） −１
０ｒｎＭ Ｍｇ Ｃ１２−１０ｒｎＭジチオスレイトー
ル、１００μｇ／ｒｎ！牛血清アルプミハ この反応混合液を前記と同様にしてフェノール抽出、エ
ーテル処理およびエタノール沈殿に付し。
ＤＮＡを回収する。分離した沈査をｌＯｍＭ）！Ｊヌー
ＨＣ４（ｐＨ７，４）および１ｍＭＥＤＴＡの混液５μ
ｔに溶解させる。ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モル量
の前記と同様にして制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩに
より開裂されたλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ（Ｘｈ
ｏＩ認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（５Ｑ ｍＭ Ｉ−リス−ＨＣ１（ＰＨ７，４） −１
０ｒｎＭ Ｍｇ Ｃ１２−１０ｒｎＭジチオスレイトー
ル、１００μｇ／ｒｎ！牛血清アルプミハ この反応混合液を前記と同様にしてフェノール抽出、エ
ーテル処理およびエタノール沈殿に付し。
得られた沈査をｌ Ｑ ｍＭ ）リス−ＨＣ４（ｐＨ７
，４）および１ｍＭＥＤＴＡ混液１０μを中に溶解させ
（１９） る。
，４）および１ｍＭＥＤＴＡ混液１０μを中に溶解させ
（１９） る。
上記のようにしてアニールさせたＤＮＡより、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ −６８巻−２９９〜３０９を参照
）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５０
ＳｕｐＦを指示菌としてＬ−寒天平板（２３ｍＸ ２８
ｃｍ ）上に １０４個のプラークを形成させる。
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ −６８巻−２９９〜３０９を参照
）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５０
ＳｕｐＦを指示菌としてＬ−寒天平板（２３ｍＸ ２８
ｃｍ ）上に １０４個のプラークを形成させる。
これらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持してい
るファージにより形成されたプラークを選び出すために
、前記で調製した３２Ｐ−ラベルされたＨＢＶＤＮＡを
プローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行な
い（５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻。
るファージにより形成されたプラークを選び出すために
、前記で調製した３２Ｐ−ラベルされたＨＢＶＤＮＡを
プローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行な
い（５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻。
１８０頁＋ １９７７を参照）、目的とするファージ
を複数分離する。
を複数分離する。
（ＢｌプラスミドｐＢＢ、８２２をベクターとした再ク
ローン化： 上記（八で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージに
ついて「生化学実験講座、核酸の化学■」５４〜６５頁
に記載される方法に従い、大腸菌Ｄｐ５０−５ｕｐＦを
感染菌としてファージＤＮＡを（２０） 調製する。得られたＤＮＡを前記の制限酵素Ｘｈ。
ローン化： 上記（八で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージに
ついて「生化学実験講座、核酸の化学■」５４〜６５頁
に記載される方法に従い、大腸菌Ｄｐ５０−５ｕｐＦを
感染菌としてファージＤＮＡを（２０） 調製する。得られたＤＮＡを前記の制限酵素Ｘｈ。
■の反応条件下で２時間消化したのち、この反応液を０
，７５％アガロースゲル電気泳動にかけ５分離Ｌｉ３．
２Ｋｂ ｏＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋沖紙製）に
吸着させてベクターＤＮＡと分離し。
，７５％アガロースゲル電気泳動にかけ５分離Ｌｉ３．
２Ｋｂ ｏＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋沖紙製）に
吸着させてベクターＤＮＡと分離し。
ついでｌ Ｍ Ｎａ ＣＬ浴溶液て溶出する。このＨＢ
ＶＤＮＡｆ：前記と同様のＴ４リガーゼ反応条件下に１
２Ｋｂの環状のＨＢｖＤＮＡとしたのち、このＨＢＶＤ
ＮＡをＢａｍＨＩで処理し−ＨＢＶＤＮＡＢａｖｙ＋
ＨＩフラグメントとする。
ＶＤＮＡｆ：前記と同様のＴ４リガーゼ反応条件下に１
２Ｋｂの環状のＨＢｖＤＮＡとしたのち、このＨＢＶＤ
ＮＡをＢａｍＨＩで処理し−ＨＢＶＤＮＡＢａｖｙ＋
ＨＩフラグメントとする。
つぎに、大腸菌プラスミドｐＢＲ８２２を同様にＢａｍ
ＨＩ （ｐ ＢＲ３２２はＢａｍＨＩ切断部位を１個
有し、それはテトラサイクリン耐性遺伝子の中に存在す
る）にて消化し、その生成物をフェノール抽出およびエ
タノール沈殿によ如精製する。
ＨＩ （ｐ ＢＲ３２２はＢａｍＨＩ切断部位を１個
有し、それはテトラサイクリン耐性遺伝子の中に存在す
る）にて消化し、その生成物をフェノール抽出およびエ
タノール沈殿によ如精製する。
ついで−ＢａｍＨＩ開裂されたｐＢＲ３２２とＢａｍＨ
■末端−ＨＢｖＤＮＡとを分子比１：５で混合し、前記
Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ リガーゼの反応条件下に１８時間
アニールさせる。
■末端−ＨＢｖＤＮＡとを分子比１：５で混合し、前記
Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ リガーゼの反応条件下に１８時間
アニールさせる。
大腸菌Ｘ１７７６の培養液を高木康敬編著［遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０．
１艷に、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０１！ｔを
加えてよく混合させ、０°Ｃで２５分間放置したのち、
アンピシリン（２０μｆ／ｍｔ）、α−ビオチン（１μ
ｆ／−Ｌ ジアミノピメリン酸（１００μＦＩ／ｒｎり
、チミン（２０μｙ／−）を含有するし一寒天プレート
上に塗沫して３７°Ｃで一夜培養する。出現したコロニ
ーについて、テトラサイクリン（２０μｆ／、ｔ）を含
む寒天プレートとアンピシリン（２０μｆ／、ｔ ）を
含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗沫し、アンピ
シリンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選択す
る。
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０．
１艷に、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０１！ｔを
加えてよく混合させ、０°Ｃで２５分間放置したのち、
アンピシリン（２０μｆ／ｍｔ）、α−ビオチン（１μ
ｆ／−Ｌ ジアミノピメリン酸（１００μＦＩ／ｒｎり
、チミン（２０μｙ／−）を含有するし一寒天プレート
上に塗沫して３７°Ｃで一夜培養する。出現したコロニ
ーについて、テトラサイクリン（２０μｆ／、ｔ）を含
む寒天プレートとアンピシリン（２０μｆ／、ｔ ）を
含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗沫し、アンピ
シリンを含むプレートでのみ増殖したコロニーを選択す
る。
ＰＢＲ８２２はアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイク
リン耐性遺伝子を有するが、テトラサイクリン耐性遺伝
子中にあるＢａｍＨＩ部位にＨＢＶＤＮＡが挿入される
ことによりテトラサイクリン耐性が消失される。すなわ
ち選択されたコロニーはｐＢｌ’１２２−ＨＢＶＤＮＡ
（Ｄｍ４ＥｔＤＮＡ’ｔ［持している。得られたコロニ
ー数個について「代謝」第１７巻、第４「リパーゼ」第
８１〜８９頁（１９８０）に記載される方法に従いプラ
スミドを調製する。得られたプラスミド、すなわちｐＢ
Ｒ３２２−ＨＢＶＤＮＡ（ＢａｍＨＩ部位に結合）の組
換えＤＮＡを前記のＢａｍＨＩ反応条件下で処理し、こ
の反応液をｔｌ前記と同様０．７５％アガロースゲル電
気泳動によＩ）ＨＢＶＤＮＡＢａｍＨＩ７ラグメントを
調製する。
リン耐性遺伝子を有するが、テトラサイクリン耐性遺伝
子中にあるＢａｍＨＩ部位にＨＢＶＤＮＡが挿入される
ことによりテトラサイクリン耐性が消失される。すなわ
ち選択されたコロニーはｐＢｌ’１２２−ＨＢＶＤＮＡ
（Ｄｍ４ＥｔＤＮＡ’ｔ［持している。得られたコロニ
ー数個について「代謝」第１７巻、第４「リパーゼ」第
８１〜８９頁（１９８０）に記載される方法に従いプラ
スミドを調製する。得られたプラスミド、すなわちｐＢ
Ｒ３２２−ＨＢＶＤＮＡ（ＢａｍＨＩ部位に結合）の組
換えＤＮＡを前記のＢａｍＨＩ反応条件下で処理し、こ
の反応液をｔｌ前記と同様０．７５％アガロースゲル電
気泳動によＩ）ＨＢＶＤＮＡＢａｍＨＩ７ラグメントを
調製する。
（２）ヘクター（ｐＸＲｎＧ ＢａｍＨＩ ７ラグメ
ント）の調製 米国バーバード大学から入手したシャｌ−ルベクタ−ｐ
ＸＲＩ［Ｇ １１ｔｌ を、ｌ Ｑ ｍＭ ）リス−
ＨＣＬＣＰＨ８，０） 、 ７ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
００ｍＭ ＮａＣｔおよび２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールの混合液２０μを中に加え、これに制限酵素Ｂａ
ｍＨ１１単位（１単位は１時間にλ−ＤＮＡＩμｇを完
全に分解する酵素活性）を加え、これを３０°Ｃで１時
間反応させる。この処理液をフェノールで抽出シ、水層
をエーテルで抽出し、ついでエタノールで沈殿させ、そ
の沈査を水に溶解させる。この水溶液を練婦λ ７゛
・ＤＮＡの調製に用いる。
ント）の調製 米国バーバード大学から入手したシャｌ−ルベクタ−ｐ
ＸＲＩ［Ｇ １１ｔｌ を、ｌ Ｑ ｍＭ ）リス−
ＨＣＬＣＰＨ８，０） 、 ７ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
００ｍＭ ＮａＣｔおよび２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノールの混合液２０μを中に加え、これに制限酵素Ｂａ
ｍＨ１１単位（１単位は１時間にλ−ＤＮＡＩμｇを完
全に分解する酵素活性）を加え、これを３０°Ｃで１時
間反応させる。この処理液をフェノールで抽出シ、水層
をエーテルで抽出し、ついでエタノールで沈殿させ、そ
の沈査を水に溶解させる。この水溶液を練婦λ ７゛
・ＤＮＡの調製に用いる。
（２３）
（３）ＨＢＶＤＮＡ−ｐＸＲ［Ｇ砥掲九 ＤＮＡ
の調製 ＨＢＶＤＮＡ ＢａｍＨＩ７ラグメント１５０ ｎｇお
よびｐＸＲＩＩＧＢａｍＨＩフラグメント５０ｎｇを含
む反応浴ｇ！５０μｔをＴ４ＱＤＮＡリガーゼにより１
６°Ｃで４時間反応させる。
の調製 ＨＢＶＤＮＡ ＢａｍＨＩ７ラグメント１５０ ｎｇお
よびｐＸＲＩＩＧＢａｍＨＩフラグメント５０ｎｇを含
む反応浴ｇ！５０μｔをＴ４ＱＤＮＡリガーゼにより１
６°Ｃで４時間反応させる。
得られた反応液を用いて大腸菌Ｘ１７７６を前記と同様
の方法にて形質転換させ、その形質転換体の中から前記
（１）（Ｂ）に記載の方法と同様にしてＬ−寒天プレー
ト上で１２時間培養後、寒天培地に出現したコロニーを
各々テトラサイクリン（Ｔｃ）（１０μり／−）含有の
寒天培地とアンピシリン（Ａｐ）（４０μｆ／、ｔ）含
有培地に移す。Ｔｃ含有培地で育成不能でかつＡｐ含有
培地で成育可能々コロニー（クローン）を選択し、これ
らのクローンを各々Ａｐを含む前記の大腸菌Ｘ１７７６
培養液にて培養後、前記の方法によりプラスミドを抽出
し１種々の制限酵素（Ｂａｍ ＨＩ ＋ Ｘｈｏ ■、
ＨｉｎｄＩｌｌ−８ａｌＩ）にてその切断パターンを
分析することにより、これらのプラスミドのなかからｐ
ＸＲ（２４） ■６１個に対しＨＢｖＤＮＡ３個挿入されたＰＳＨＢ８
を得る。
の方法にて形質転換させ、その形質転換体の中から前記
（１）（Ｂ）に記載の方法と同様にしてＬ−寒天プレー
ト上で１２時間培養後、寒天培地に出現したコロニーを
各々テトラサイクリン（Ｔｃ）（１０μり／−）含有の
寒天培地とアンピシリン（Ａｐ）（４０μｆ／、ｔ）含
有培地に移す。Ｔｃ含有培地で育成不能でかつＡｐ含有
培地で成育可能々コロニー（クローン）を選択し、これ
らのクローンを各々Ａｐを含む前記の大腸菌Ｘ１７７６
培養液にて培養後、前記の方法によりプラスミドを抽出
し１種々の制限酵素（Ｂａｍ ＨＩ ＋ Ｘｈｏ ■、
ＨｉｎｄＩｌｌ−８ａｌＩ）にてその切断パターンを
分析することにより、これらのプラスミドのなかからｐ
ＸＲ（２４） ■６１個に対しＨＢｖＤＮＡ３個挿入されたＰＳＨＢ８
を得る。
（４）マウスＬＴＫ−細胞の形質転換
下記のＡ液およびＢ液を調製する。
Ａ液：５０ｍＭヘペス（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、２８０ｍＭ Ｎ
ａＣ４，１５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０からなる
溶液１．２５ ｍ／（ｐＨ７，１） Ｂ液：５０μ（ｌ ｐＳＨＢ８．２．５μＦＩｐＴＫお
よび５０μｇサケ精子ＤＮＡ（キャリアーＤＮＡ）から
なるＤＮＡ溶液１．１−と２Ｍ Ｃａ Ｃ７０ｏ、 １
５−の混合液上記Ａ液にＢ液を攪拌 しながらゆっくり
滴下し、室温で３０分間放置する。充分ピペツテイグし
たのち、その混合液０，５−をマウスＬＴＫ−細胞の単
一層（約１０５ｃｅｌｌｓ ／フラスコ）に滴下する。
ラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、２８０ｍＭ Ｎ
ａＣ４，１５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０からなる
溶液１．２５ ｍ／（ｐＨ７，１） Ｂ液：５０μ（ｌ ｐＳＨＢ８．２．５μＦＩｐＴＫお
よび５０μｇサケ精子ＤＮＡ（キャリアーＤＮＡ）から
なるＤＮＡ溶液１．１−と２Ｍ Ｃａ Ｃ７０ｏ、 １
５−の混合液上記Ａ液にＢ液を攪拌 しながらゆっくり
滴下し、室温で３０分間放置する。充分ピペツテイグし
たのち、その混合液０，５−をマウスＬＴＫ−細胞の単
一層（約１０５ｃｅｌｌｓ ／フラスコ）に滴下する。
このまま室温にて３０分間細胞に吸着させたのち。
ＤＭＥＭ５−を添加し、５％Ｃ０，３７°Ｃで約５時間
培養する。ＤＭＥＭを交換後、さらに約２４時間培養し
、ついでＨＡＴ培地に交換する。２〜３日毎にＨＡＴ培
地を交換して培養を続ける。４週間後に出現してくるＴ
Ｋになった細胞の集落を分離して形質転換細胞を得る。
培養する。ＤＭＥＭを交換後、さらに約２４時間培養し
、ついでＨＡＴ培地に交換する。２〜３日毎にＨＡＴ培
地を交換して培養を続ける。４週間後に出現してくるＴ
Ｋになった細胞の集落を分離して形質転換細胞を得る。
（５） ＨＢ Ｖ厘白質の生産
前記（４）で得られた形質転換マウスＬ細胞（ＬＴ十
Ｋ ’）（Ｄ培養液をＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢ
ｃＡｇ検出用キット（アボット社製）にて調べることに
よりＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇは検出されたがＨＢｃ
Ａｇは検出されなかった。
ｃＡｇ検出用キット（アボット社製）にて調べることに
よりＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇは検出されたがＨＢｃ
Ａｇは検出されなかった。
上記培養液について、上記ＨＢｓＡｇ検出用キットを用
いた平行線検定法（厚生省薬務局監修、生物学的製剤基
準解説２４３５頁、１９７３）に従い、抗原の反応性お
よび抗原量を推定した。なか、対照抗原としてヒト血清
から精製したＨＢｓＡｇを用いた。その結果を第５図に
示す。第５図に示すように形質転換マウス細胞の培養液
中の抗原量は６００ ｎｇ／−であった。しかも、対照
抗原との平行性により１本発明により産生されたＨＢＳ
Ａｇけヒト血清由来のＨＢｓＡｇと同様の反応性をもっ
ことが判明した。
いた平行線検定法（厚生省薬務局監修、生物学的製剤基
準解説２４３５頁、１９７３）に従い、抗原の反応性お
よび抗原量を推定した。なか、対照抗原としてヒト血清
から精製したＨＢｓＡｇを用いた。その結果を第５図に
示す。第５図に示すように形質転換マウス細胞の培養液
中の抗原量は６００ ｎｇ／−であった。しかも、対照
抗原との平行性により１本発明により産生されたＨＢＳ
Ａｇけヒト血清由来のＨＢｓＡｇと同様の反応性をもっ
ことが判明した。
上記培養液５−に塩化セシウム１．５ｇを添加し。
２００．０００ｘｇにて４°Ｃで６０時間遠心後、分画
してＨＢ ｓ Ａ ｇおよびＨＢｅＡｇの抗原性の最も
高い画分の比重を算定すると＋ ＨＢｓＡｇについては
約１．２０ 、 ＨＢｅ Ａｇについては約１．２８と
なり。
してＨＢ ｓ Ａ ｇおよびＨＢｅＡｇの抗原性の最も
高い画分の比重を算定すると＋ ＨＢｓＡｇについては
約１．２０ 、 ＨＢｅ Ａｇについては約１．２８と
なり。
これは血清中に存在するＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの
比重とはソ同じ値である。
比重とはソ同じ値である。
また、形質転換細胞を四塩化炭素にて４°ＣＩＯ分間固
定し、これに−次抗体として家兎抗ＨＢ ｓ抗血清を反
応させ、洗浄、乾燥後、二次抗体として螢光色素でラベ
ルされた抗家兎ＩｇＧ抗体を作用させ、洗浄、乾燥、封
入後、螢光顕微鏡にて観察すると、形質転換細胞の細胞
質内にＨＢｓＡｇに対する特異螢光が認められた。
定し、これに−次抗体として家兎抗ＨＢ ｓ抗血清を反
応させ、洗浄、乾燥後、二次抗体として螢光色素でラベ
ルされた抗家兎ＩｇＧ抗体を作用させ、洗浄、乾燥、封
入後、螢光顕微鏡にて観察すると、形質転換細胞の細胞
質内にＨＢｓＡｇに対する特異螢光が認められた。
つぎに、上記培養ｇ１１００μｔと家兎抗ＨＢＳ抗体（
抗体価ＰＨＡ２．８）１００μｔを室温で１２時間反応
後、１０，０００Ｘ＝ｇ 、３０分間遠心させ。
抗体価ＰＨＡ２．８）１００μｔを室温で１２時間反応
後、１０，０００Ｘ＝ｇ 、３０分間遠心させ。
その沈査を酢酸ウラニル染色にて電子顕微鏡観察すると
、同様の処理をほどこした血清由来のＨＢｓ（２７） Ａｇ粒子と同様の直径２２ ｎｍの粒子の凝集像が多数
認められた。但し、管状粒子やディン粒子（ＨＢＶ）は
認められなかった。
、同様の処理をほどこした血清由来のＨＢｓ（２７） Ａｇ粒子と同様の直径２２ ｎｍの粒子の凝集像が多数
認められた。但し、管状粒子やディン粒子（ＨＢＶ）は
認められなかった。
以上のように、前記形質転換マウスＬ細胞はＨＢ ｓ
ＡｇおよびＨＢｅＡｇを培地中に産生放出する。
ＡｇおよびＨＢｅＡｇを培地中に産生放出する。
なお、培養液からのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの分離
は下記のようにして行なう。
は下記のようにして行なう。
該培養液１００ｒｎｌをモルモット抗ＨＢｓ 抗体を結
合させたカラム（担体はセファロースＣＬ４Ｂ）に通し
てＨＢｓＡｇのみを吸着させ、これを０，１Ｍ塩酸−グ
リシン緩衝液（ｐＨ２，５）にて溶出してＨＢ ｓ Ａ
ｇを得る。
合させたカラム（担体はセファロースＣＬ４Ｂ）に通し
てＨＢｓＡｇのみを吸着させ、これを０，１Ｍ塩酸−グ
リシン緩衝液（ｐＨ２，５）にて溶出してＨＢ ｓ Ａ
ｇを得る。
このようにして調製されたＨＢｓＡｇを１０匹のモルモ
ット（雌、３００〜４００ｇ）に１週問おきに３回、さ
らに１力月後に１回皮下接種後、抗ＨＢ ｓ抗体検出キ
ラＩ−（ＡＵＣＡＢ、アボット社製）にて測定すると、
すべてのモルモット血清中に本キット添付の陽性コント
ロールと同程度あるいはそれ以上の抗体価の上昇が認め
られた。
ット（雌、３００〜４００ｇ）に１週問おきに３回、さ
らに１力月後に１回皮下接種後、抗ＨＢ ｓ抗体検出キ
ラＩ−（ＡＵＣＡＢ、アボット社製）にて測定すると、
すべてのモルモット血清中に本キット添付の陽性コント
ロールと同程度あるいはそれ以上の抗体価の上昇が認め
られた。
つぎに、上記のカラム素通り画分をモルモツ！・（２８
） 抗ＨＢｅ抗体を結合させたカラム（担体はセファロース
ＣＬ４Ｂ）に通してＨＢｅＡｇのみを吸着させ、これを
０．１Ｍ塩酸−グリシン緩衝液（ｐＨ２，５）にて溶出
することによりＨＢｅＡｇを得る。
） 抗ＨＢｅ抗体を結合させたカラム（担体はセファロース
ＣＬ４Ｂ）に通してＨＢｅＡｇのみを吸着させ、これを
０．１Ｍ塩酸−グリシン緩衝液（ｐＨ２，５）にて溶出
することによりＨＢｅＡｇを得る。
第１図はＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶＤＮＡフラグメント
の構造、第２図はシャトルベクターｐＸＲＩＩＧの構造
、第３図は本発明のＨＢＶ遺伝子を組込んだ・１ｄＬ４
ｊ ＤＮＡの構造を示し、第３図ＡはＨＢＶＤＮ
Ａフラグメントが１個挿入されたもの（ｐＳＨＢｌ）−
第３図Ｂは同フラグメントが８個挿入されたもの（ｐＳ
ＨＢ３）を示す。 第４図は本発明で用いられるＴＫ遺伝子とｐＢＲ３２２
の組換えＤＮＡ（ｐＴＫ）の構造を示す。 第５図ばＨＢＳＡｇの平行線検定の結果を示すグラフで
ある。 特許出願人 財団法人化学及血清療法研究所代理人弁理
士青山 葆ほか１名 第１図 第２図 手続補正書（自発〕 １．事件の表示 昭和５７年特許願第 １４５０９２ 号形質転換動
物細胞およびＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が開−丁目２番１号名称 科学
技術庁長官官房会計課長 ４代理人 ５補正命令の日付 自発 ７、補正の内容 （１）明Ｍ書の下記箇所において左欄の記載を右欄のご
とく補正する。 （１）４頁１２行 「ＨＢＶ表面」→「ＨＢＶ表面抗原」 （１１〕１０頁６行 「を結合させて」→「と結合させて」 （ｉｉｉ）１６頁４行 「診断用」→「診断用」 ＜＋ｖ）１７頁６行 ［ｄ ｃＴＰＪ→［ｄｃＴＰＪ （Ｖ） ｌ ７頁１０行 「デオキシチアミント ホスフェート」 →「デオキシチアミントリホ スフエート」 （ｖｌ）１８頁３行 「の混液中」→「の混合液２００μＥ中」（Ｖ＋＋）
ｌ ９頁１行 「フェノール２００μｊ」→ →「フェノール２０μｊ」 （ｖ１１υ２４頁５行 ＦＴ４０ＤＮＡＪ→「Ｔ４ＤＮＡ」 （１×９２７頁下から４行 ）−ｐＩ（Ａ ２．８Ｊ −ｒＰＨＡ−２８Ｊ（Ｘ）
２８頁下から５行 「ＡＵｃＡＢＪ →「ＡＩＪ８ＡＢＪ （２）図面中東５図を別紙のとおり補正する（すなわち
「↑苦養液」ヲ「培養液」と補正する）。 以上
の構造、第２図はシャトルベクターｐＸＲＩＩＧの構造
、第３図は本発明のＨＢＶ遺伝子を組込んだ・１ｄＬ４
ｊ ＤＮＡの構造を示し、第３図ＡはＨＢＶＤＮ
Ａフラグメントが１個挿入されたもの（ｐＳＨＢｌ）−
第３図Ｂは同フラグメントが８個挿入されたもの（ｐＳ
ＨＢ３）を示す。 第４図は本発明で用いられるＴＫ遺伝子とｐＢＲ３２２
の組換えＤＮＡ（ｐＴＫ）の構造を示す。 第５図ばＨＢＳＡｇの平行線検定の結果を示すグラフで
ある。 特許出願人 財団法人化学及血清療法研究所代理人弁理
士青山 葆ほか１名 第１図 第２図 手続補正書（自発〕 １．事件の表示 昭和５７年特許願第 １４５０９２ 号形質転換動
物細胞およびＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が開−丁目２番１号名称 科学
技術庁長官官房会計課長 ４代理人 ５補正命令の日付 自発 ７、補正の内容 （１）明Ｍ書の下記箇所において左欄の記載を右欄のご
とく補正する。 （１）４頁１２行 「ＨＢＶ表面」→「ＨＢＶ表面抗原」 （１１〕１０頁６行 「を結合させて」→「と結合させて」 （ｉｉｉ）１６頁４行 「診断用」→「診断用」 ＜＋ｖ）１７頁６行 ［ｄ ｃＴＰＪ→［ｄｃＴＰＪ （Ｖ） ｌ ７頁１０行 「デオキシチアミント ホスフェート」 →「デオキシチアミントリホ スフエート」 （ｖｌ）１８頁３行 「の混液中」→「の混合液２００μＥ中」（Ｖ＋＋）
ｌ ９頁１行 「フェノール２００μｊ」→ →「フェノール２０μｊ」 （ｖ１１υ２４頁５行 ＦＴ４０ＤＮＡＪ→「Ｔ４ＤＮＡ」 （１×９２７頁下から４行 ）−ｐＩ（Ａ ２．８Ｊ −ｒＰＨＡ−２８Ｊ（Ｘ）
２８頁下から５行 「ＡＵｃＡＢＪ →「ＡＩＪ８ＡＢＪ （２）図面中東５図を別紙のとおり補正する（すなわち
「↑苦養液」ヲ「培養液」と補正する）。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）大腸菌プラスミドに５Ｖ４０ＤＮＡの複製開始部
分を挿入したベクターにＢ型肝炎ウィルス遺伝子を組込
んだことを特徴とする組換えＤＮＡ０（２）大腸菌プラ
スミドがＣｏｌ Ｅ １ 、 ｐＭＢ １に由来するプ
ラスミドまたはｐ１５Ａに由来するプラスミドから選ば
れる前記第（１）項の組換えＤ ＮＡｏ（３）該ベクタ
ーが動物細胞内での複製阻害部分を欠損させてなる前記
第（１）項の組換えＤ ＮＡｏ（４）該ベクターが大腸
菌プラスミドｐＢＲ８２２（７）ＥｃｏＲＩ開裂部位Ｋ
ＳＶ４０ＤＮＡの複製開始部分を挿入しかつ動物細胞内
での複製阻害部分を欠損させたものである前記第（１）
項の組換えＤＮＡ０（５）該Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子が
ＨＢＶサブタイプａｄｒの遺伝子である前記第（１）項
の組換えＤＮＡ。 （６）該ＨＢＶｖブタイブａｃｌｒノ遺伝子をＢａｍ
ＨＩで処理したものを、大腸菌プラスミドＰＢＲ８２２
のＥｃｏＲｉ開裂部位ＫＳＶ４０ＤＮＡ（７）複製開始
部分を挿入しかつ動物細胞内での複製阻害部分を欠損さ
せたベクターに組込んだ前記第（１）項の組換えＤＮＡ
。 （７）組込まれて因るＢ型肝炎ウィルス遺伝子が１〜複
数個である前記第（１）項の組換えＤＮＡ０（８）該組
込まれたＢ型肝炎ウィルス遺伝子が２〜４個である前記
第（７）項の組換えＤ ＮＡｏ（９）該組込まれたＢ型
肝炎ウィルス遺伝子が８個である前記第（７）項の組換
えＤＮＡ０（ｔｏ） 該４ａ積え゛ ｌ ＤＮＡがさら
にチミジンキナーゼＤＮＡを組込んでなる前記第（１）
項の組換えＤＮＡ。 （１１）動物細胞に前記第（１）項の組換えＤＮＡを作
用させて形質転換させてなる形質転換動物細胞。 （１２）該動物細胞がチミジンキナーゼ欠損動物細胞で
ある前記第（１１）項の形質転換動物細胞。 （１３）該動物細胞がマウスＬＴＫ−細胞である前記第
（Ｕ）項の形質転換動物細胞。 （１４）膝組％えＤＮＡをチミジンキナーゼＤＮＡと共
に作用させてなる前記第（１２）項の形質転換動物細胞
。 （１５）膝組換えＤＮＡがさらにチミジンキナーゼＤＮ
Ａを組込んだものである前記第（１１）項の形質転換動
物細胞。 （１６）前記第（１１）項の形質転換動物細胞を培養し
てＢ型肝炎ウィルス蛋白質を産出させ、それを収集する
ことを特徴とするＢ型肝炎ウィルス蛋白質の製法。 （１７）該Ｂ型肝炎ウィルス蛋白質がＢ型肝炎ウィルス
の表面抗原である前記第（１６）項の製法。 （１８）該Ｂ型肝炎ウィルス蛋白質がＢ型肝炎つィルス
ｅ抗原である前記第（１６）項の製法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57145092A JPS5936698A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
| CA000434868A CA1287311C (en) | 1982-08-20 | 1983-08-18 | Recombinant dna provided with hepatitis b virus gene, mammalian cells transformed with cloned viral dna, and production of hepatitis b virus proteins |
| DE8383108220T DE3381472D1 (de) | 1982-08-20 | 1983-08-19 | Hepatitis-b-virus-gen enthaltende rekombinante dns, mit der klonierten viralen dns transformierte saeugetierzellen und herstellung von hepatitis-b-virusproteinen. |
| AT83108220T ATE52108T1 (de) | 1982-08-20 | 1983-08-19 | Hepatitis-b-virus-gen enthaltende rekombinante dns, mit der klonierten viralen dns transformierte saeugetierzellen und herstellung von hepatitis-b-virusproteinen. |
| EP83108220A EP0101617B1 (en) | 1982-08-20 | 1983-08-19 | Recombinant dna containing a hepatitis b virus gene, mammalian cells transformed with the cloned viral dna, and production of hepatitis b virus proteins |
| US06/883,138 US5024938A (en) | 1982-08-20 | 1986-07-08 | Recombinant DNA inserted with hepatitis B virus gene, mammalian cells transformed with cloned viral DNA, and production of hepatitis B virus proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57145092A JPS5936698A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5936698A true JPS5936698A (ja) | 1984-02-28 |
| JPS6321476B2 JPS6321476B2 (ja) | 1988-05-07 |
Family
ID=15377189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145092A Granted JPS5936698A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5024938A (ja) |
| EP (1) | EP0101617B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5936698A (ja) |
| AT (1) | ATE52108T1 (ja) |
| CA (1) | CA1287311C (ja) |
| DE (1) | DE3381472D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| JPS62285787A (ja) * | 1986-06-03 | 1987-12-11 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒ−トシヨツクたんぱく質遺伝子ｈｓｐ８３を含む発現ベクタ−及びこれを用いる誘導的発現 |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| US5118627A (en) * | 1984-02-27 | 1992-06-02 | Amgen | Papova virus construction |
| US5324513A (en) * | 1984-03-07 | 1994-06-28 | Institut Pasteur | Composition useful for the fabrication of vaccines |
| FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
| US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| JPS60193925A (ja) * | 1984-03-13 | 1985-10-02 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 凍結乾燥製剤化ワクチン |
| US4624918A (en) * | 1984-07-09 | 1986-11-25 | Genentech, Inc. | Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof |
| JPS61158798A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-18 | Japan Found Cancer Res | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の製造法 |
| IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
| IL86833A0 (en) * | 1987-06-22 | 1988-11-30 | Medico Labs | Peptide containing immunogenic particles |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| US5612487A (en) * | 1991-08-26 | 1997-03-18 | Edible Vaccines, Inc. | Anti-viral vaccines expressed in plants |
| US6297048B1 (en) | 1992-02-04 | 2001-10-02 | Chiron Corporation | Hepatitis therapeutics |
| EP1997900A3 (en) | 1996-04-05 | 2010-10-06 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| WO1998012332A1 (en) | 1996-09-17 | 1998-03-26 | Chiron Corporation | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
| US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
| AUPP249298A0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| ES2374290T3 (es) | 1998-03-20 | 2012-02-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genes sintéticos y constructos genéticos que comprenden los mismos. |
| WO2000044914A1 (en) * | 1999-01-28 | 2000-08-03 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna |
| US20040138168A1 (en) * | 1999-04-21 | 2004-07-15 | Wyeth | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
| EP2363478B1 (en) * | 1999-04-21 | 2019-07-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| CA2369944A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-07-31 | Nucleonics Inc. | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
| WO2005010144A2 (en) * | 2003-04-21 | 2005-02-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Displacing a plasmid in a bacterial population |
| DE202005004135U1 (de) * | 2005-03-11 | 2005-05-19 | Klocke Verpackungs-Service Gmbh | Mehrkomponentenverpackung mit Applikator |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2458584A1 (fr) * | 1979-06-08 | 1981-01-02 | Pasteur Institut | Vecteurs pour le transfert et l'expression de materiel genetique dans une cellule eucaryote et procede pour la production d'une proteine determinee dans des cellules eucaryotes |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| ZW18282A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
-
1982
- 1982-08-20 JP JP57145092A patent/JPS5936698A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-18 CA CA000434868A patent/CA1287311C/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-08-19 DE DE8383108220T patent/DE3381472D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1983-08-19 AT AT83108220T patent/ATE52108T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-08-19 EP EP83108220A patent/EP0101617B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-08 US US06/883,138 patent/US5024938A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| JPH0543352B2 (ja) * | 1982-10-19 | 1993-07-01 | Takeda Chemical Industries Ltd | |
| JPS62285787A (ja) * | 1986-06-03 | 1987-12-11 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒ−トシヨツクたんぱく質遺伝子ｈｓｐ８３を含む発現ベクタ−及びこれを用いる誘導的発現 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5024938A (en) | 1991-06-18 |
| EP0101617B1 (en) | 1990-04-18 |
| EP0101617A3 (en) | 1984-10-10 |
| ATE52108T1 (de) | 1990-05-15 |
| DE3381472D1 (de) | 1990-05-23 |
| CA1287311C (en) | 1991-08-06 |
| JPS6321476B2 (ja) | 1988-05-07 |
| EP0101617A2 (en) | 1984-02-29 |
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