JP2543751B2 - 抗原性蛋白質の製法 - Google Patents
抗原性蛋白質の製法Info
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-
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-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
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- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
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-
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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- C12R2001/19—Escherichia coli
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は抗原性蛋白質の製法に関するものである。
最近まで肝炎は症状および疫学によって第一に特徴付
けられた疾病であった。1967年にブルムヘルグおよび共
同研究者はまず肝炎Ｂ型による感染と結合した抗原を記
載した〔ブルムベルグ,B.S.サイエンス，第197巻第17頁
（1977年）参照〕その時以来広範囲な研究が疾病につい
て豊富な資料を寄与してきている。作因物質は、肝炎Ｂ
ウイルス（HBV）として知られているDNAウイルスであ
る。感染した患者の血清は感染と結合する種々の粒子型
を含有する。全ウイルス粒子は実質的にエンベロブ、核
およびDNAからなる球形のそして直径42nmであると考え
られ発見者によって“デイン”粒子と称される〔デイン
（Dane）,D.S.等，ランセット1970−I,第695頁（1970
年）〕。エンベロブはブルムベルグによって発見された
表面抗原（HBsAg）を含有する。核は免疫学的に異なる
抗原、HBcAgを含有する。デイン粒子から分離されるDNA
は円形で長さが様々の単一成分領域を含有する、サマ
ー,J.等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA72,第4597頁（1975
年），ランダース,T.A.等,J.virol.第23巻，第368頁（1
977年），フリッシュ,A.等、C.R.Acad.Sci.パリスD287,
第1453頁（1978年）。表面抗原はHBVで感染した人の血
清中にそして一定の担体の状態に見出される。放射線免
疫検定はHBsAg,リング,C.M.等,J.Immunol.第109巻，第8
34頁（1972年）としてそして抗−HBsAg,ホリンガー,F.
等,J.Immunol.第107巻、第1099頁（1971年）として展開
している。
けられた疾病であった。1967年にブルムヘルグおよび共
同研究者はまず肝炎Ｂ型による感染と結合した抗原を記
載した〔ブルムベルグ,B.S.サイエンス，第197巻第17頁
（1977年）参照〕その時以来広範囲な研究が疾病につい
て豊富な資料を寄与してきている。作因物質は、肝炎Ｂ
ウイルス（HBV）として知られているDNAウイルスであ
る。感染した患者の血清は感染と結合する種々の粒子型
を含有する。全ウイルス粒子は実質的にエンベロブ、核
およびDNAからなる球形のそして直径42nmであると考え
られ発見者によって“デイン”粒子と称される〔デイン
（Dane）,D.S.等，ランセット1970−I,第695頁（1970
年）〕。エンベロブはブルムベルグによって発見された
表面抗原（HBsAg）を含有する。核は免疫学的に異なる
抗原、HBcAgを含有する。デイン粒子から分離されるDNA
は円形で長さが様々の単一成分領域を含有する、サマ
ー,J.等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA72,第4597頁（1975
年），ランダース,T.A.等,J.virol.第23巻，第368頁（1
977年），フリッシュ,A.等、C.R.Acad.Sci.パリスD287,
第1453頁（1978年）。表面抗原はHBVで感染した人の血
清中にそして一定の担体の状態に見出される。放射線免
疫検定はHBsAg,リング,C.M.等,J.Immunol.第109巻，第8
34頁（1972年）としてそして抗−HBsAg,ホリンガー,F.
等,J.Immunol.第107巻、第1099頁（1971年）として展開
している。
HBsAgは免疫化学的にウイルスのエンベロブと結合す
る物質をはっきりと示す。以前の研究はHBsAgが大多数
の成分としてグリコシル化およびグリコシル化していな
い蛋白質を包含する様々な抗原性のいくつかの成分を含
有することを示している（ピーターソン,D.L.等,Proc.N
at.Acad.Sci.USA74,第1530頁（1977年），ピーターソ
ン、D.L.等，ウイルス性肝炎における病因学、疫学、発
病学および予防の現代評価（G.N.ヴィアス,S.N.コーエ
ンおよびR.シュミッド、eds.）第569〜573頁，フランク
リン インスティチュートプレス，フィラデルフィア,1
978年）。さらに脂質およびいくつかの追加の蛋白質成
分は表面抗原標本中に存在することが報告されている、
Shi,J.W.K.およびゲリン,J.L.J.virol.第21巻，第347頁
（1977年）。多数の蛋白質成分は各々ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）ゲル電気泳動、ピーターソン等（1977
年）上記に基づくグリコシル化していないおよびグリコ
シル蛋白質として分子量（M.W.）22,000および28,000ダ
ルトンを有するとして報告されていた。標本のSDSゲル
電気泳動によってHBsAgのヒトの担体の血漿から分離さ
れる22,000M.W.蛋白質のＮ−末端配列の９アミノ酸はMe
t−Glu−Asn−Ile−Thr−（Ser）または（Cys）−Glyo
−Phe−Leuであると報告されていた（上記ピーターソン
等、1977年）。
る物質をはっきりと示す。以前の研究はHBsAgが大多数
の成分としてグリコシル化およびグリコシル化していな
い蛋白質を包含する様々な抗原性のいくつかの成分を含
有することを示している（ピーターソン,D.L.等,Proc.N
at.Acad.Sci.USA74,第1530頁（1977年），ピーターソ
ン、D.L.等，ウイルス性肝炎における病因学、疫学、発
病学および予防の現代評価（G.N.ヴィアス,S.N.コーエ
ンおよびR.シュミッド、eds.）第569〜573頁，フランク
リン インスティチュートプレス，フィラデルフィア,1
978年）。さらに脂質およびいくつかの追加の蛋白質成
分は表面抗原標本中に存在することが報告されている、
Shi,J.W.K.およびゲリン,J.L.J.virol.第21巻，第347頁
（1977年）。多数の蛋白質成分は各々ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）ゲル電気泳動、ピーターソン等（1977
年）上記に基づくグリコシル化していないおよびグリコ
シル蛋白質として分子量（M.W.）22,000および28,000ダ
ルトンを有するとして報告されていた。標本のSDSゲル
電気泳動によってHBsAgのヒトの担体の血漿から分離さ
れる22,000M.W.蛋白質のＮ−末端配列の９アミノ酸はMe
t−Glu−Asn−Ile−Thr−（Ser）または（Cys）−Glyo
−Phe−Leuであると報告されていた（上記ピーターソン
等、1977年）。
アミノ酸配列を示す標準の省略がここで用いられる。
Ala＝アラニン Cys＝システイン Gly＝グリシン His＝ヒスチジン Glu＝グルタミン酸 Lys＝リジン Gln＝グルタミン Leu＝ロイシン Asp＝アスパラギン酸 Ile＝イソロイシン Asn＝アスパラギン Val＝バリン Apg＝アルギニン ＭまたはMet＝メチオニン Ser＝セリン Tyr＝チロシン Thr＝スレオニン Phe＝フェニルアラニン Trp＝トリプトファン Pro＝プロリン すべてのアミノ酸は別の方法で安定でない限りＬ−配
置で存在する。ここである場合にはメチオニンは翻訳の
開始で可能な役割を示すためにＭによって示される。同
様に分離される蛋白質に対するＮ−末端配列の19アミノ
酸はMet−Glu−Asn−Ile−Thr−Ser−Gly−Phe−Leu−G
ly−Pro−Leu−Leu−Val−Ser−Gln−Ala−Gly−Pheで
あることが報告されていた（上記ピーターソン等1978
年）。グリコシル化されていない蛋白質は免疫遺伝子で
あると報告されているが上記ピーターソン等1977年に記
載されているように分離したグリコシル化したペプチド
はそうではない。しかしながら他の研究者は免疫遺伝子
であるグリコシル化ペプチド成分を報告している、上記
ゲリン,G.L.等ウイルス性肝炎第147〜153頁（1978年）
中で。矛盾は十分には説明されていない。表面抗原蛋白
質の免疫遺伝は形態変化に感受性があることが知られて
いる。血清および血漿から表面抗原蛋白質の分離および
精製における洗浄剤の使用が恐らく免疫学的反応性を減
少させるのである。表面および核抗原を検出する能力は
輸血が発達した国においてHBV伝搬のより普通の方法の
一つであることから特に可能な供血者の選別として非常
に臨床上価値がある。現在部分的に精製したHBsAgに対
するデイン粒子の利用源は生産される抗体の質および量
を制限する。ウイルスは培養で増殖できないそして感染
したヒトの患者からまたは高級霊長類の感染後得ること
ができるだけである。それ故HBVのストックを維持しま
たは所望量のウイルスまたはあらゆるウイルスを得る手
段はない。ウイルスは培養細胞または組織に細胞病理作
用がないため感染したウイルス粒子の測定手段は一般に
利用できない。遺伝学的に純粋HBVストックは本発明以
前には利用されていない。これらの制限は受動免疫法の
さらに敏感な免疫分析に適した抗体および自動免疫法に
対する抗原の生産のために改良された量および質でHBsA
gを供給するだけにかなり制限している。さらにその上
ヒトまたは高級霊長類から外にウイルスを通過すること
ができないことはワクチンの生産に対して十分な抗原を
得ることを不可能にする。HBVの限定された宿主範囲お
よび組織培養細胞を感染することまでの失敗はウイルス
の研究を徹底的に制限しそしてそれが原因の重病に対す
るワクチンの開発を妨害しているのである。
置で存在する。ここである場合にはメチオニンは翻訳の
開始で可能な役割を示すためにＭによって示される。同
様に分離される蛋白質に対するＮ−末端配列の19アミノ
酸はMet−Glu−Asn−Ile−Thr−Ser−Gly−Phe−Leu−G
ly−Pro−Leu−Leu−Val−Ser−Gln−Ala−Gly−Pheで
あることが報告されていた（上記ピーターソン等1978
年）。グリコシル化されていない蛋白質は免疫遺伝子で
あると報告されているが上記ピーターソン等1977年に記
載されているように分離したグリコシル化したペプチド
はそうではない。しかしながら他の研究者は免疫遺伝子
であるグリコシル化ペプチド成分を報告している、上記
ゲリン,G.L.等ウイルス性肝炎第147〜153頁（1978年）
中で。矛盾は十分には説明されていない。表面抗原蛋白
質の免疫遺伝は形態変化に感受性があることが知られて
いる。血清および血漿から表面抗原蛋白質の分離および
精製における洗浄剤の使用が恐らく免疫学的反応性を減
少させるのである。表面および核抗原を検出する能力は
輸血が発達した国においてHBV伝搬のより普通の方法の
一つであることから特に可能な供血者の選別として非常
に臨床上価値がある。現在部分的に精製したHBsAgに対
するデイン粒子の利用源は生産される抗体の質および量
を制限する。ウイルスは培養で増殖できないそして感染
したヒトの患者からまたは高級霊長類の感染後得ること
ができるだけである。それ故HBVのストックを維持しま
たは所望量のウイルスまたはあらゆるウイルスを得る手
段はない。ウイルスは培養細胞または組織に細胞病理作
用がないため感染したウイルス粒子の測定手段は一般に
利用できない。遺伝学的に純粋HBVストックは本発明以
前には利用されていない。これらの制限は受動免疫法の
さらに敏感な免疫分析に適した抗体および自動免疫法に
対する抗原の生産のために改良された量および質でHBsA
gを供給するだけにかなり制限している。さらにその上
ヒトまたは高級霊長類から外にウイルスを通過すること
ができないことはワクチンの生産に対して十分な抗原を
得ることを不可能にする。HBVの限定された宿主範囲お
よび組織培養細胞を感染することまでの失敗はウイルス
の研究を徹底的に制限しそしてそれが原因の重病に対す
るワクチンの開発を妨害しているのである。
最近HBVおよび原発性の肝細胞の癌との関連が極めて
明白に示されている。疫学的研究は原発性肝細胞癌を有
する患者にHBsAgまたはHBcAgの高い相関を示している、
トリコポウロス,D等，ランセット,1978年第8102頁。さ
らに重大なことは培養した肝細胞の癌細胞（“アレキサ
ンダー”細胞）の菌株はHBsAgを産生することが知られ
ている。それ故これらの細胞はHBVゲノムの少なくとも
一部を含有している。さらに肝細胞発癌におけるHBVの
役割の説明および癌の形質転換の分子機構はウイルスま
たはそのゲノムの保持および操作に対する適当な生物学
系の発達に依存する。
明白に示されている。疫学的研究は原発性肝細胞癌を有
する患者にHBsAgまたはHBcAgの高い相関を示している、
トリコポウロス,D等，ランセット,1978年第8102頁。さ
らに重大なことは培養した肝細胞の癌細胞（“アレキサ
ンダー”細胞）の菌株はHBsAgを産生することが知られ
ている。それ故これらの細胞はHBVゲノムの少なくとも
一部を含有している。さらに肝細胞発癌におけるHBVの
役割の説明および癌の形質転換の分子機構はウイルスま
たはそのゲノムの保持および操作に対する適当な生物学
系の発達に依存する。
本発明はHBVゲノムまたはその断片の遺伝学上純粋な
株を維持、変性および複製するための生物学体系を初め
て提供するものである。系はワクチンに適した外膜およ
び核蛋白質のような遺伝学上純粋なウイルス性成分を生
成しそしてウイルス感染および複製方法の分子生物学の
研究の際に使用するウイルス性DNAを生成する方法を提
供するものである。後者はある種の自己免疫疾病および
ある種の癌を包含するHBVが典型的に引起こす慣性疾患
の誘発を理解するのに有効なため特に価値がある。
株を維持、変性および複製するための生物学体系を初め
て提供するものである。系はワクチンに適した外膜およ
び核蛋白質のような遺伝学上純粋なウイルス性成分を生
成しそしてウイルス感染および複製方法の分子生物学の
研究の際に使用するウイルス性DNAを生成する方法を提
供するものである。後者はある種の自己免疫疾病および
ある種の癌を包含するHBVが典型的に引起こす慣性疾患
の誘発を理解するのに有効なため特に価値がある。
本発明はHBV−DNAのクロン化（cloning）および発現
によって具体化される。新規なDNA運搬仲介物はHBVゲノ
ムの全部およびその一部を含有している。運搬ベクトル
は適当な宿主を転換するために使用され、それによって
クロン化ウイルス性DNAまたはその一部の実施を可能に
しそしてまた所望量でHBsAgの免疫学的に有効な蛋白質
成分を包含するウイルス性蛋白質の生物学的合成を可能
にするHBsAgの免疫学的に有効な蛋白質成分は有効な免
疫法および抗血清の産生のためのワクチンとして有用で
あり、さらに臨床の選別試験および受動免疫を供給する
ために有用である。Ｓ蛋白質と称されるHBsAgの精製さ
れた免疫学的に有効な蛋白質成分およびその原核蛋白質
断片を有する融合蛋白質は微生物によて合成されてい
る。Ｓ−蛋白質およびその誘導体はHBVに対するワクチ
ンを生成する抗原として有用である。
によって具体化される。新規なDNA運搬仲介物はHBVゲノ
ムの全部およびその一部を含有している。運搬ベクトル
は適当な宿主を転換するために使用され、それによって
クロン化ウイルス性DNAまたはその一部の実施を可能に
しそしてまた所望量でHBsAgの免疫学的に有効な蛋白質
成分を包含するウイルス性蛋白質の生物学的合成を可能
にするHBsAgの免疫学的に有効な蛋白質成分は有効な免
疫法および抗血清の産生のためのワクチンとして有用で
あり、さらに臨床の選別試験および受動免疫を供給する
ために有用である。Ｓ蛋白質と称されるHBsAgの精製さ
れた免疫学的に有効な蛋白質成分およびその原核蛋白質
断片を有する融合蛋白質は微生物によて合成されてい
る。Ｓ−蛋白質およびその誘導体はHBVに対するワクチ
ンを生成する抗原として有用である。
全部HBVゲノムからなる新規なDNA運搬仲介物およびそ
こで転換される微生物は原出願の提出とともに1979年５
月23日付でアメリカンタイプカルチュアコレクション,1
2301パークラウンドライブ，ロックヴィル,Md.20852に
おいて寄託せられた。寄託した運搬仲介物はATCC受託番
号第40009号を有するpEco63とここで称される。寄託し
た微生物大腸菌E.coli HB101/pEco63はATCC受託番号第
31518号を有する。
こで転換される微生物は原出願の提出とともに1979年５
月23日付でアメリカンタイプカルチュアコレクション,1
2301パークラウンドライブ，ロックヴィル,Md.20852に
おいて寄託せられた。寄託した運搬仲介物はATCC受託番
号第40009号を有するpEco63とここで称される。寄託し
た微生物大腸菌E.coli HB101/pEco63はATCC受託番号第
31518号を有する。
HBV−DNAは一定のヒトのHBsAg担体の血漿中に存在す
るデイン粒子から得られることができる。デイン粒子は
特異遠心法によって部分的に精製することができる。デ
イン粒子から直接抽出されたDNAの多くは単一成分領域
を含有するのでDNAは単一成分空隙をふさぐことによっ
て初めに直される。普通のDNAポリメラーゼ反応はデイ
ン粒子から抽出されたDNA上で作用して使用することが
できる。しかしながら好ましい方法はホルスカ,J.F.等,
J.virol.第21巻，第666頁（1977年）に記載される通り
それ自体粒子中固有のDNAポリメラーゼ作用を利用する
ものである。好ましい方法においてDNAがまず回復さ
れ、次いで粒子から抽出される。希望するならば放射性
標示がポリメラーゼ反応中に入れることができる。
るデイン粒子から得られることができる。デイン粒子は
特異遠心法によって部分的に精製することができる。デ
イン粒子から直接抽出されたDNAの多くは単一成分領域
を含有するのでDNAは単一成分空隙をふさぐことによっ
て初めに直される。普通のDNAポリメラーゼ反応はデイ
ン粒子から抽出されたDNA上で作用して使用することが
できる。しかしながら好ましい方法はホルスカ,J.F.等,
J.virol.第21巻，第666頁（1977年）に記載される通り
それ自体粒子中固有のDNAポリメラーゼ作用を利用する
ものである。好ましい方法においてDNAがまず回復さ
れ、次いで粒子から抽出される。希望するならば放射性
標示がポリメラーゼ反応中に入れることができる。
クロンの目的に対して円形HBV−DNAはDNA運搬仲介物
に次の共有付加できる一つまたはそれ以上の部位で内部
分割しなければならない。付加処理はDNA−リガース酵
素によって接触作用を及ぼし結紮と称される。内部分割
はその多くが技術において公知である非特異性エンドヌ
クレアーゼを使用して行なわれ、DNA上の任意部位でDNA
のフォスフォジエステル結合の加水分解に接触作用を及
ぼすことができる。しかしながら好ましくは分割は制限
部位として公知の一定のデオキシヌクレオチド塩基配列
内にあるフォスフォジエステルだけの加水分解に接触作
用を及ぼす一種またはそれ以上の制限エンドヌクレアー
ゼを使用して行なわれるべきである。ロベルツ,R.,Cri
t.Rev.Biochem.第４巻，第123頁（1976年）参照。極め
て様々な制限エンドヌクレアーゼが市販されている。HB
Vゲノムの大きさのDNAの一定部分中の一定の制限部位の
存在は非常に偶然の物質である。いくつかの部位はしば
しば見い出すことができるが他のものは全然ない。我々
はHBV−DNAが制限エンドヌクレアーゼEcoR Iに対する単
一部位を含有することを見出した。EcoRIによるHBV−DN
Aの温浸は円形DNAを分子量の重大な変化を伴わない線状
DNAに転換する。制限エンドヌクレアーゼを使用する結
果として線状温浸生成物のすべては末端に同一塩基配列
を有する。同様に酵素BamH Iによる温浸は二つの線状DN
A断片を生成しゲル電気泳動による分子の長さに従って
分別することができる。EcoR IおよびBamH I両酵素での
温浸はゲル電気泳動によって定量した大きさがEcoR I部
位および二つのBamH I部位の相対位置について一定の結
論を可能にする三つの線状DNA断片を生成する。生成し
た断片の大きさについて種々の組合わせの制限エンドヌ
クレアーゼの結果を分析することによってお互いに関し
て相対位置の制限を示すHBV−DNAの限定図を作ることが
できる。かかる図はHBV−DNAに対する第１図中に示され
る。
に次の共有付加できる一つまたはそれ以上の部位で内部
分割しなければならない。付加処理はDNA−リガース酵
素によって接触作用を及ぼし結紮と称される。内部分割
はその多くが技術において公知である非特異性エンドヌ
クレアーゼを使用して行なわれ、DNA上の任意部位でDNA
のフォスフォジエステル結合の加水分解に接触作用を及
ぼすことができる。しかしながら好ましくは分割は制限
部位として公知の一定のデオキシヌクレオチド塩基配列
内にあるフォスフォジエステルだけの加水分解に接触作
用を及ぼす一種またはそれ以上の制限エンドヌクレアー
ゼを使用して行なわれるべきである。ロベルツ,R.,Cri
t.Rev.Biochem.第４巻，第123頁（1976年）参照。極め
て様々な制限エンドヌクレアーゼが市販されている。HB
Vゲノムの大きさのDNAの一定部分中の一定の制限部位の
存在は非常に偶然の物質である。いくつかの部位はしば
しば見い出すことができるが他のものは全然ない。我々
はHBV−DNAが制限エンドヌクレアーゼEcoR Iに対する単
一部位を含有することを見出した。EcoRIによるHBV−DN
Aの温浸は円形DNAを分子量の重大な変化を伴わない線状
DNAに転換する。制限エンドヌクレアーゼを使用する結
果として線状温浸生成物のすべては末端に同一塩基配列
を有する。同様に酵素BamH Iによる温浸は二つの線状DN
A断片を生成しゲル電気泳動による分子の長さに従って
分別することができる。EcoR IおよびBamH I両酵素での
温浸はゲル電気泳動によって定量した大きさがEcoR I部
位および二つのBamH I部位の相対位置について一定の結
論を可能にする三つの線状DNA断片を生成する。生成し
た断片の大きさについて種々の組合わせの制限エンドヌ
クレアーゼの結果を分析することによってお互いに関し
て相対位置の制限を示すHBV−DNAの限定図を作ることが
できる。かかる図はHBV−DNAに対する第１図中に示され
る。
限定エンドヌクレアーゼの適当な選択によってHBVの
全ゲノムまたはあらゆる部分を転移することができそし
て適当な宿主生体中で転移したHBV−DNAを複製すること
ができるDNA運搬仲介物に組合わせ部分を重ねることが
できる。
全ゲノムまたはあらゆる部分を転移することができそし
て適当な宿主生体中で転移したHBV−DNAを複製すること
ができるDNA運搬仲介物に組合わせ部分を重ねることが
できる。
運搬仲介物および宿主の選択は所望の末端使用および
関連した生物の危険のようなある実際的な考察と相関し
そして支配される。ウイルス性粒子の合成に対してまた
はある間隔での発現の最大速度に対して真核生物（euca
ryotic）宿主細胞がさらに適当であることができる。選
択された運搬仲介物は宿主中に入りそして複製すること
が可能でなければならない。迅速なDNA実施・操作の容
易さそして安全性に対して遺伝学的純度の保持に対して
そして手引研究に対して大腸菌のような微生物宿主が好
ましい。多くのDNA運搬仲介物が大腸菌として知られて
いる。プラスミド運搬仲介物は単に便宜上ここで使用し
ている。
関連した生物の危険のようなある実際的な考察と相関し
そして支配される。ウイルス性粒子の合成に対してまた
はある間隔での発現の最大速度に対して真核生物（euca
ryotic）宿主細胞がさらに適当であることができる。選
択された運搬仲介物は宿主中に入りそして複製すること
が可能でなければならない。迅速なDNA実施・操作の容
易さそして安全性に対して遺伝学的純度の保持に対して
そして手引研究に対して大腸菌のような微生物宿主が好
ましい。多くのDNA運搬仲介物が大腸菌として知られて
いる。プラスミド運搬仲介物は単に便宜上ここで使用し
ている。
運搬仲介物へのHBV−DNA付加は好ましくは一定位置で
運搬仲介物を円形DNAに開くことが必要であり、次に線
状運搬仲介物DNAで線状HBV−DNAを結紮して最初に分割
した位置でヌクレオチド配列に挿入したHBV−DNAを含有
する円形組換え運搬仲介物を生成する。好ましくは拡大
に次いで挿入したDNAの回収するために運搬DNAおよびHB
V−DNAの末端を組換え運搬仲介物からHBV−DNAを特異的
に除去するための特定の手段を提供するために処理す
る。処理方法の一つはベース連鎖が一つまたはそれ以上
の制限位置配列を包含する二重成分オリゴデオキシヌク
レオチド“結鎖”分子の添加を要する、シェラー,R.H.
等，科学第196巻，第177頁（1977年）。“末尾（tailin
g）”と称する第二の方法は末端トランスフェラーゼに
よって接触作用を及ぼした反応において各々エンドヌク
レアーゼ−処理プラスミドおよびウイルス性DNAsの末端
でオリゴ−Ｇおよびオリゴ−Ｃ配列の添加を包含する
（DNA中の塩基配列はデオキシリボヌクレオチドに属
し、一方RNA中の配列はリボヌクレオチドに属すること
は理解される。）。結合点でGGCC配列が生成し、それは
Hae IIIに対して特異的な制限位置配列である。挿入し
た部分はHae IIIと消化作用によってプラスミドから放
出することができる〔ヴィラーコマロフ,L.等,Proc.Na
t.Acad.Sci.USA第75巻，第3727頁（1978年）参照〕結鎖
方法は正確に定義される二つのDNAs間の継ぎ目で配列を
可能にする。末尾方法は結合した分子のファミリーを製
造する。末尾につなぐことによって結合した一定のクロ
ンは運搬仲介物遺伝子から通読翻訳によってクロン遺伝
子の発現を可能にする接合される運搬仲介物遺伝子とし
て同様の翻訳読み枠を有する1/3の確率がある。また挿
入したDNAは同様の翻訳方向で接合する1/2の確率がある
ので一定クロンが発現することができる混成確率は1/6
である、ポリスキー,B.等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA第73
巻，第3900頁（1976年）およびイタクラ,K等，科学第19
8巻，第1056頁（1977年）参照。それ故仲介物および挿
入物が枠読むことに関して相中にある証拠がなくて表示
が希望される場合に末尾につなぐことが好ましい。
運搬仲介物を円形DNAに開くことが必要であり、次に線
状運搬仲介物DNAで線状HBV−DNAを結紮して最初に分割
した位置でヌクレオチド配列に挿入したHBV−DNAを含有
する円形組換え運搬仲介物を生成する。好ましくは拡大
に次いで挿入したDNAの回収するために運搬DNAおよびHB
V−DNAの末端を組換え運搬仲介物からHBV−DNAを特異的
に除去するための特定の手段を提供するために処理す
る。処理方法の一つはベース連鎖が一つまたはそれ以上
の制限位置配列を包含する二重成分オリゴデオキシヌク
レオチド“結鎖”分子の添加を要する、シェラー,R.H.
等，科学第196巻，第177頁（1977年）。“末尾（tailin
g）”と称する第二の方法は末端トランスフェラーゼに
よって接触作用を及ぼした反応において各々エンドヌク
レアーゼ−処理プラスミドおよびウイルス性DNAsの末端
でオリゴ−Ｇおよびオリゴ−Ｃ配列の添加を包含する
（DNA中の塩基配列はデオキシリボヌクレオチドに属
し、一方RNA中の配列はリボヌクレオチドに属すること
は理解される。）。結合点でGGCC配列が生成し、それは
Hae IIIに対して特異的な制限位置配列である。挿入し
た部分はHae IIIと消化作用によってプラスミドから放
出することができる〔ヴィラーコマロフ,L.等,Proc.Na
t.Acad.Sci.USA第75巻，第3727頁（1978年）参照〕結鎖
方法は正確に定義される二つのDNAs間の継ぎ目で配列を
可能にする。末尾方法は結合した分子のファミリーを製
造する。末尾につなぐことによって結合した一定のクロ
ンは運搬仲介物遺伝子から通読翻訳によってクロン遺伝
子の発現を可能にする接合される運搬仲介物遺伝子とし
て同様の翻訳読み枠を有する1/3の確率がある。また挿
入したDNAは同様の翻訳方向で接合する1/2の確率がある
ので一定クロンが発現することができる混成確率は1/6
である、ポリスキー,B.等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA第73
巻，第3900頁（1976年）およびイタクラ,K等，科学第19
8巻，第1056頁（1977年）参照。それ故仲介物および挿
入物が枠読むことに関して相中にある証拠がなくて表示
が希望される場合に末尾につなぐことが好ましい。
希望される宿主への組換え運搬仲介物の移動は個々の
宿主−仲介物一組に適当な手段によって達成される。プ
ラスミドは転換によって微生物宿主に一般に移動する。
仲介物含有宿主は宿主細胞の増殖が組換え運搬仲介物の
随伴増加を生じる結果とともにそれ自身の細胞分裂で行
なって運搬仲介物を複製する。宿主細胞を含有する特定
の組換え挿入は適当な選択手段によって確認することが
できる。例えばプラスミドpBR322のPstI位における外因
性DNA断片の挿入はアムピシリン耐性を与える遺伝子を
妨害するので組換えプラスミドによって転換した宿主細
菌はアムピシリン耐性ではない。転換されない細胞は挿
入によって作用されない適当な運搬仲介物製造遺伝子に
よって選別することができる。単一宿主細胞を含有する
組換え運搬仲介物の子孫はその細胞菌株の分枝と適当に
称される。運搬仲介物によって生じる挿入DNA部分はそ
れによってクロン化される。それから出るコピーのすべ
ては非常に稀な任意の突然変異があるだけで同一塩基配
列を有する。組換え運搬仲介物を含有する宿主細胞はコ
ロンDNAに対して実質的に無尽蔵の供給源として働く。
宿主−仲介物一組に適当な手段によって達成される。プ
ラスミドは転換によって微生物宿主に一般に移動する。
仲介物含有宿主は宿主細胞の増殖が組換え運搬仲介物の
随伴増加を生じる結果とともにそれ自身の細胞分裂で行
なって運搬仲介物を複製する。宿主細胞を含有する特定
の組換え挿入は適当な選択手段によって確認することが
できる。例えばプラスミドpBR322のPstI位における外因
性DNA断片の挿入はアムピシリン耐性を与える遺伝子を
妨害するので組換えプラスミドによって転換した宿主細
菌はアムピシリン耐性ではない。転換されない細胞は挿
入によって作用されない適当な運搬仲介物製造遺伝子に
よって選別することができる。単一宿主細胞を含有する
組換え運搬仲介物の子孫はその細胞菌株の分枝と適当に
称される。運搬仲介物によって生じる挿入DNA部分はそ
れによってクロン化される。それから出るコピーのすべ
ては非常に稀な任意の突然変異があるだけで同一塩基配
列を有する。組換え運搬仲介物を含有する宿主細胞はコ
ロンDNAに対して実質的に無尽蔵の供給源として働く。
クロンDNAの表示はクロンDNAに相当するmRNAの合成を
写すことによってまたはクロンDNAから写されたmRNAに
よってコードされた蛋白質の合成を翻訳することによっ
て表わすことができる。転写式の発生はクロンDNAで特
異的にかけあわせることができるRNAの出現によって発
見することができる。翻訳式は予期した蛋白質に対して
特異的な作用の出現によって発見することができる。例
えばかかる作用は酵素活性、ホルモン性活性または免疫
学的特異性でありそれはクロン遺伝子によってコードさ
れた蛋白質の特性である。ウイルス性遺伝子生成物の場
合にはHBVの場合におけるHBsAgまたはHBcAgのような免
疫学的反応性蛋白質の出現が最も好適な実現性である。
特異性結合反応の他の種類は一定の状況で適当であるこ
とができる。固体相の位置で感受性のある放射線免疫検
定は転換された細菌の単一集落から式を検出するために
展開している、上記ヴイラーコマロフ,L.等。
写すことによってまたはクロンDNAから写されたmRNAに
よってコードされた蛋白質の合成を翻訳することによっ
て表わすことができる。転写式の発生はクロンDNAで特
異的にかけあわせることができるRNAの出現によって発
見することができる。翻訳式は予期した蛋白質に対して
特異的な作用の出現によって発見することができる。例
えばかかる作用は酵素活性、ホルモン性活性または免疫
学的特異性でありそれはクロン遺伝子によってコードさ
れた蛋白質の特性である。ウイルス性遺伝子生成物の場
合にはHBVの場合におけるHBsAgまたはHBcAgのような免
疫学的反応性蛋白質の出現が最も好適な実現性である。
特異性結合反応の他の種類は一定の状況で適当であるこ
とができる。固体相の位置で感受性のある放射線免疫検
定は転換された細菌の単一集落から式を検出するために
展開している、上記ヴイラーコマロフ,L.等。
ウイルス成分を維持、複製および合成するために上述
した生物体系は感染したヒトまたは高級霊長類中に直接
または間接に検出されるだけのウイルスの臨床、生化学
的および遺伝学研究を行なう手段を提供する。
した生物体系は感染したヒトまたは高級霊長類中に直接
または間接に検出されるだけのウイルスの臨床、生化学
的および遺伝学研究を行なう手段を提供する。
本発明はウイルス関連疾病の臨床、生化学、免疫画向
および遺伝学研究に対して全く新しい分野を開発するも
のである。系は次の可能性を提供する。ウイルス性ゲノ
ムは遺伝学上純粋な形で維持そして複製することができ
る。直接アミノ酸を配列することによって得られる資料
で関連のある場合、ウイルス性蛋白質のアミノ酸連鎖に
十分な資料を提供するヌクレオチド配列資料を得ること
ができる。逆にヌクレオチド配列はアミノ酸配列よりも
決定が容易である。特に蛋白質の末端における部分アミ
ノ酸配列は出発点および読み枠を確定するために有用で
ある。標示されたウイルス性遺伝物質は感染した細胞ゲ
ノムにおけるウイルス性付着を探し出しそして定量する
かけあわせ実験に使用することができる。ウイルス性蛋
白質は宿主細胞において示され、それによって特徴、そ
れらに対する抗体の産生、検出および測定分析の開発お
よびその付加物および誘導体の製造を可能にする。ワク
チンはウイルス性蛋白質から生産することができる。ワ
クチンは完全なまたは感染性ウイルス粒子によって全く
感染しない記載した方法によって生産することができる
のでかかるワクチンは必要とされる量で利用されそして
実質的安全因子を提供することができる。ウイルス性蛋
白質に対する抗体はウイルス性感染の臨床診断に有用で
ある。量的にウイルス性蛋白質を生産する能力はそれら
の生化学特性およびウイルス性発病の一因となる作用の
方法を研究することを可能にする。前述の能力は本発明
によって可能となる研究の直接利益だけを説明するもの
である。捕え難いまたは予知できない現象に関するさら
に長い言葉の発見もまた非常に重要であると予想するこ
とができる。
および遺伝学研究に対して全く新しい分野を開発するも
のである。系は次の可能性を提供する。ウイルス性ゲノ
ムは遺伝学上純粋な形で維持そして複製することができ
る。直接アミノ酸を配列することによって得られる資料
で関連のある場合、ウイルス性蛋白質のアミノ酸連鎖に
十分な資料を提供するヌクレオチド配列資料を得ること
ができる。逆にヌクレオチド配列はアミノ酸配列よりも
決定が容易である。特に蛋白質の末端における部分アミ
ノ酸配列は出発点および読み枠を確定するために有用で
ある。標示されたウイルス性遺伝物質は感染した細胞ゲ
ノムにおけるウイルス性付着を探し出しそして定量する
かけあわせ実験に使用することができる。ウイルス性蛋
白質は宿主細胞において示され、それによって特徴、そ
れらに対する抗体の産生、検出および測定分析の開発お
よびその付加物および誘導体の製造を可能にする。ワク
チンはウイルス性蛋白質から生産することができる。ワ
クチンは完全なまたは感染性ウイルス粒子によって全く
感染しない記載した方法によって生産することができる
のでかかるワクチンは必要とされる量で利用されそして
実質的安全因子を提供することができる。ウイルス性蛋
白質に対する抗体はウイルス性感染の臨床診断に有用で
ある。量的にウイルス性蛋白質を生産する能力はそれら
の生化学特性およびウイルス性発病の一因となる作用の
方法を研究することを可能にする。前述の能力は本発明
によって可能となる研究の直接利益だけを説明するもの
である。捕え難いまたは予知できない現象に関するさら
に長い言葉の発見もまた非常に重要であると予想するこ
とができる。
実施例 １ ウイルス性DNAゲノムのクロン 二重成分の円形HBV−DNAを上記のフルスカ等によって
記載された通り25μgDNAを含有するデイン粒子から得
た。DNAを最初に酵素の消化生成物のゲル電気泳動によ
って制限エンドヌクレアーゼへの感受性に対して選別し
た。ゲル電気泳動は核酸を分子量の長さにより分別す
る、ヘリング,R.等,J.virol.第14巻，第1235頁（1974
年）。EcoR IエンドヌクレアーゼでDNA100ngの処理によ
り約3200ベース対（bp）の長さに相当する一つの鋭い帯
を得た。BamH Iエンドヌクレアーゼの同様の処理により
約1200および2000pb長さに相当する二つの断片を得た。
制限エンドヌクレアーゼをマサチュセッツ州のビバリー
のニューイングランド生物研究所から得た。単位は生産
者によって定義した。限定エンドヌクレアーゼを使用す
る全反応を生産者の勧める緩衝液中で行なった。各々の
場合に得た断片の数から一つのEcoR I位置および二つの
BamH I位置を含有することを推定した。選択されたDNA
運搬仲介物はプラスミドpBR235であった（ボリヴァ,F.G
ene,第４巻，第121頁（1978年）これはプラスミドpBR32
2から誘導され（ボリヴァ,F.等,Gene第２巻，第95頁（1
977年）そして大腸菌プラスミドpBR325を転換すること
ができ、転換細胞にクロラフェニコール耐性（Cmr）お
よびアムピシリン耐性（Apr）を与える遺伝子を運ぶ。E
coR I位置はEcoR I位置での外因性DNAの挿入がCmr遺伝
子を無効にさせその間Apr遺伝子は未変化のままである
ようにCmr遺伝子中に存在する。転換した大腸菌の組換
えクロンをクロラムフェニコール感受性およびアムピシ
リン耐性として確認し、一方クロラムフェニコールおよ
びアムピシリンに感受性のある転換されない細胞は抗生
物質の存在下では増殖しない。組換えしないpBR325で転
換した分枝をクロラムフェンコール耐性およびアムピシ
リン耐性として確認した。組換え菌株の増殖および選択
に使用される微生物学方法はコールドスプリングハーバ
ー研究所のジェフレイH.ミラーによる分子遺伝学の実験
（1972年）で記載した標準方法であった。
記載された通り25μgDNAを含有するデイン粒子から得
た。DNAを最初に酵素の消化生成物のゲル電気泳動によ
って制限エンドヌクレアーゼへの感受性に対して選別し
た。ゲル電気泳動は核酸を分子量の長さにより分別す
る、ヘリング,R.等,J.virol.第14巻，第1235頁（1974
年）。EcoR IエンドヌクレアーゼでDNA100ngの処理によ
り約3200ベース対（bp）の長さに相当する一つの鋭い帯
を得た。BamH Iエンドヌクレアーゼの同様の処理により
約1200および2000pb長さに相当する二つの断片を得た。
制限エンドヌクレアーゼをマサチュセッツ州のビバリー
のニューイングランド生物研究所から得た。単位は生産
者によって定義した。限定エンドヌクレアーゼを使用す
る全反応を生産者の勧める緩衝液中で行なった。各々の
場合に得た断片の数から一つのEcoR I位置および二つの
BamH I位置を含有することを推定した。選択されたDNA
運搬仲介物はプラスミドpBR235であった（ボリヴァ,F.G
ene,第４巻，第121頁（1978年）これはプラスミドpBR32
2から誘導され（ボリヴァ,F.等,Gene第２巻，第95頁（1
977年）そして大腸菌プラスミドpBR325を転換すること
ができ、転換細胞にクロラフェニコール耐性（Cmr）お
よびアムピシリン耐性（Apr）を与える遺伝子を運ぶ。E
coR I位置はEcoR I位置での外因性DNAの挿入がCmr遺伝
子を無効にさせその間Apr遺伝子は未変化のままである
ようにCmr遺伝子中に存在する。転換した大腸菌の組換
えクロンをクロラムフェニコール感受性およびアムピシ
リン耐性として確認し、一方クロラムフェニコールおよ
びアムピシリンに感受性のある転換されない細胞は抗生
物質の存在下では増殖しない。組換えしないpBR325で転
換した分枝をクロラムフェンコール耐性およびアムピシ
リン耐性として確認した。組換え菌株の増殖および選択
に使用される微生物学方法はコールドスプリングハーバ
ー研究所のジェフレイH.ミラーによる分子遺伝学の実験
（1972年）で記載した標準方法であった。
挿入法に対して精製pBR325、50ngおよび300ngHBV−DN
Aをまず37℃で１時間EcoR Iエンドヌクレアーゼ10単位
（10μ全容量）で共に処理し、線状プラスミドDNAを
精製した。反応混合物をEcoRIエンドヌクレアーゼを不
活性化するために５分間65℃に加熱した。
Aをまず37℃で１時間EcoR Iエンドヌクレアーゼ10単位
（10μ全容量）で共に処理し、線状プラスミドDNAを
精製した。反応混合物をEcoRIエンドヌクレアーゼを不
活性化するために５分間65℃に加熱した。
DNAを２サイクルのエタノール沈殿によって反応混合
物から分離した。沈殿物を緩衝濃縮液が50mMトリーHC
l、pH8.0、1mMATP、10mM MgCl2および20mMジチオスレ
イトールを得るように添加された10μH2O中に再懸濁
した。混合液を37℃５分間次いで室温で５分間保温して
前処理した。次いで混合液を氷浴中で冷却しそして１単
位T4リガーゼ（Ｐ−Ｌ生化学、11,000単位/ml）で14℃1
5時間保温した。反応混合液を標準技術によって転換の
ために調製した大腸菌細胞の懸濁液に直接添加した。選
択された宿主細胞菌株はボイエル,H.W.およびローラン
ドーデュソイクス,D.J.Mol,Biol.第41巻，第459〜472頁
（1969年）によって記載された大腸菌HB101であった。
個別菌株の選択は普通のものに基づいた。菌株HB101は
他のプラスミドを含有せずクロラムフェニコールおよび
アムピシリンに感受性があり相対的に微生物の株の増殖
および維持が容易である。
物から分離した。沈殿物を緩衝濃縮液が50mMトリーHC
l、pH8.0、1mMATP、10mM MgCl2および20mMジチオスレ
イトールを得るように添加された10μH2O中に再懸濁
した。混合液を37℃５分間次いで室温で５分間保温して
前処理した。次いで混合液を氷浴中で冷却しそして１単
位T4リガーゼ（Ｐ−Ｌ生化学、11,000単位/ml）で14℃1
5時間保温した。反応混合液を標準技術によって転換の
ために調製した大腸菌細胞の懸濁液に直接添加した。選
択された宿主細胞菌株はボイエル,H.W.およびローラン
ドーデュソイクス,D.J.Mol,Biol.第41巻，第459〜472頁
（1969年）によって記載された大腸菌HB101であった。
個別菌株の選択は普通のものに基づいた。菌株HB101は
他のプラスミドを含有せずクロラムフェニコールおよび
アムピシリンに感受性があり相対的に微生物の株の増殖
および維持が容易である。
組換えプラスミドを含有する転換細胞の単一集落をク
ロラムフェニコール感受性およびアムピシリン耐性によ
って判断されるように培養中に増殖してプラスミドDNA
源を与える。
ロラムフェニコール感受性およびアムピシリン耐性によ
って判断されるように培養中に増殖してプラスミドDNA
源を与える。
培養をＬ−肉汁中で通気により増殖させそしてレイト
ログ（late log）または定常相中で採集した。次に転換
した細胞を上述のポリヴァ,F.等および上述のボリヴァ
のように1cmクヴェットを使用して適当な最小培地中で
1.0の660nmの光学密度に生長させた。クロムフェニコー
ル170μg/mlを次に添加しそして培養を一晩保温した。
いずれの場合もプラスミドDNAを細胞溶解質からスーパ
ーコイルとしてクレウェル,D.B.およびヘリンスキー,D.
R.Proc.Nat.Acad.Sci.USA第62巻，第1159頁（1969年）
に記載された臭化エチジウムCsCl密度勾配遠心法を使用
して分離した。転換細胞から調製したプラスミドDNAをE
coR Iエンドヌクレアーゼで処理しそして前述の通りゲ
ル電気泳動によって分別した。一つの集落をバーンズ,
W.M.,科学第195巻，第393頁（1977年）によって記載さ
れたトウースピック検定により大挿入物で生じるプラス
ミドを確認するために選別した。約1200bpの長さの挿入
を含有する二つの独立して便利された組換えプラスミド
を次の研究のために選択した。これらをpEco−３および
pEco−63と称した。
ログ（late log）または定常相中で採集した。次に転換
した細胞を上述のポリヴァ,F.等および上述のボリヴァ
のように1cmクヴェットを使用して適当な最小培地中で
1.0の660nmの光学密度に生長させた。クロムフェニコー
ル170μg/mlを次に添加しそして培養を一晩保温した。
いずれの場合もプラスミドDNAを細胞溶解質からスーパ
ーコイルとしてクレウェル,D.B.およびヘリンスキー,D.
R.Proc.Nat.Acad.Sci.USA第62巻，第1159頁（1969年）
に記載された臭化エチジウムCsCl密度勾配遠心法を使用
して分離した。転換細胞から調製したプラスミドDNAをE
coR Iエンドヌクレアーゼで処理しそして前述の通りゲ
ル電気泳動によって分別した。一つの集落をバーンズ,
W.M.,科学第195巻，第393頁（1977年）によって記載さ
れたトウースピック検定により大挿入物で生じるプラス
ミドを確認するために選別した。約1200bpの長さの挿入
を含有する二つの独立して便利された組換えプラスミド
を次の研究のために選択した。これらをpEco−３および
pEco−63と称した。
同様の方法でHBV−DNAのBamH I断片を挿入のためにプ
ラスミドpBR322のBamH I位置を使用して別個に分枝し
た。刻み目翻訳法（リグバイ,P.W.J.等,J.Mol.Biol.第1
13巻，第237頁（1977年）によって32Pで標示したデイン
粒子DNA（200ng）を標示されないデイン粒子DNA200ngお
よび10倍濃縮BamH I温浸緩衝液２μと混合した。DNA
を５単位BamH Iエンドヌクレアーゼと１時間37℃で温浸
した。混合液を65℃で５分間加熱処理し酵素および２サ
イクルエタノール沈殿によって回収したDNAを不活性化
した。運搬仲介物、pBR322を同様にBamH Iエンドヌクレ
アーゼで温浸しさらにウルリッチ,A.等科学第196巻，第
1313頁（1977年）で記載された滷性リ酸酵素で処理し
た。デインDNAを温浸したBamHI（250ng）をpBR322 680n
gと保温し、前述の通り50mMトリス−HCl,pH8.0,1mM AT
P,10mM MgCl2、20mMジチオスレイトールおよびT4DNAリ
ガーゼを含有し次に14℃で15時間前加熱処理する反応混
合液中で前述の通り処理した。結紮反応混合液を大腸菌
を転換するために使用しそして転換物をアムピシリン耐
性およびテトラサイクリン感受性に対して選択した。約
2100pbBmaH I断片を生じる組換えプラスミドをpBam−13
2と称した。より小さい断片約1100bpを生じるプラスミ
ドもまた得られpBam−69と称した。EcoRI位置が約2100b
pBamH I断片内にあるので（第１図参照）、コロンEcoR
I−処理HBV−DNAから1100pbBamH I断片をコロンするこ
とが可能となっている。pEco−63からHBV−DNAの調製を
HBV−DNAを放出する特異分裂により得そしてpBR325のPs
t I位置で挿入した。この操作においてプラスミドpEco6
3（３μｇ）をまずEcoR Iエンドヌクレアーゼで温浸し
次いで各反応に対して前述した条件下でDNAリガーズで
処理した。次いで円形pBR325およびHBV−DNAの生成混合
物をPst Iエンドヌクレアーゼと保温しDNAリガースを使
用して再接合した。pBR325およびHBV−DNAが共に一つの
Pst I位置を有するので全HBV−DNAをpBR325のPst I位置
で挿入することができる。生成組換えプラスミドをpPst
−７と称した。
ラスミドpBR322のBamH I位置を使用して別個に分枝し
た。刻み目翻訳法（リグバイ,P.W.J.等,J.Mol.Biol.第1
13巻，第237頁（1977年）によって32Pで標示したデイン
粒子DNA（200ng）を標示されないデイン粒子DNA200ngお
よび10倍濃縮BamH I温浸緩衝液２μと混合した。DNA
を５単位BamH Iエンドヌクレアーゼと１時間37℃で温浸
した。混合液を65℃で５分間加熱処理し酵素および２サ
イクルエタノール沈殿によって回収したDNAを不活性化
した。運搬仲介物、pBR322を同様にBamH Iエンドヌクレ
アーゼで温浸しさらにウルリッチ,A.等科学第196巻，第
1313頁（1977年）で記載された滷性リ酸酵素で処理し
た。デインDNAを温浸したBamHI（250ng）をpBR322 680n
gと保温し、前述の通り50mMトリス−HCl,pH8.0,1mM AT
P,10mM MgCl2、20mMジチオスレイトールおよびT4DNAリ
ガーゼを含有し次に14℃で15時間前加熱処理する反応混
合液中で前述の通り処理した。結紮反応混合液を大腸菌
を転換するために使用しそして転換物をアムピシリン耐
性およびテトラサイクリン感受性に対して選択した。約
2100pbBmaH I断片を生じる組換えプラスミドをpBam−13
2と称した。より小さい断片約1100bpを生じるプラスミ
ドもまた得られpBam−69と称した。EcoRI位置が約2100b
pBamH I断片内にあるので（第１図参照）、コロンEcoR
I−処理HBV−DNAから1100pbBamH I断片をコロンするこ
とが可能となっている。pEco−63からHBV−DNAの調製を
HBV−DNAを放出する特異分裂により得そしてpBR325のPs
t I位置で挿入した。この操作においてプラスミドpEco6
3（３μｇ）をまずEcoR Iエンドヌクレアーゼで温浸し
次いで各反応に対して前述した条件下でDNAリガーズで
処理した。次いで円形pBR325およびHBV−DNAの生成混合
物をPst Iエンドヌクレアーゼと保温しDNAリガースを使
用して再接合した。pBR325およびHBV−DNAが共に一つの
Pst I位置を有するので全HBV−DNAをpBR325のPst I位置
で挿入することができる。生成組換えプラスミドをpPst
−７と称した。
実施例 ２ 組換えプラスミド中のウイルス性DNAの同定 pEco−３、pEco−63、pBam−132およびpPst−７組換
えプラスミドを転換細胞を増殖し、それからDNAを分離
し、そして臭化エチジウムの存在下平衡密度勾配遠心分
離によって組換えプラスミドDNAから宿主細胞DNAを分離
することによって調製した。次いで組換えプラスミドDN
Aを各挿入位置に特異の限定エンドヌクレアーゼで処理
した。DNAをゲル電気泳動によって分別し、サウザン,E.
M.J.Mol.Biol.第98巻，第503頁（1975年）の方法によっ
て分析した。サウザン法においてDNAをまずアガロース
ゲル電気泳動によって分別し次いでこの位置で変性しそ
してニトロセルロースフィルターにゲルから直接移動し
た。従ってゲルのバンドパターンをニトロセルロースフ
ィルター上に複製する。変性したDNAはニトロセルロー
スフィルターに結合する。フィルター結合DNAを公知の
元の32P−標示DNAとの混成によって固定する。HBV−DNA
クロンの場合にはデイン粒子からの32P−標示DNAを混成
プローブとして使用した。結果を第２表に示した。レー
ン1,2,3および４は各々pEco−3,pEco−63,pBam−132お
よびpPst−７を示す。第2A図（暗い面に鮮明な線）は混
成の前のDNAのゲル電気泳動パターンを示す。各場合に
二つのバンドが見られ、臭化エチジウムで染色する螢光
によって可視が出来る。最上部のバンドはレーン1,2お
よび４の線状運搬仲介物DNA、pBR325およびレーン３のp
BR322であり、底部のバンドは推定のHBV−DNAである
（小さい方のDNA断片は図が示すように下方に移動す
る。）レーンＡはHind III−処理バクテリアファージDN
Aから調製した標準である。第2B図は32P−HBV−DNAで混
成後のニトロセルロースフィルターの自動レントゲン写
真である。混成DNAのバンドが各場合に推定のHBV−コロ
ンDNAに相当すると観察され、一方極めて小さな32P−DN
AがプラスミドDNAバンドに混成したと観察される。プラ
スミドに混成した32P−DNAがpBR325でわずかに感染した
ことがわかった。恐らくプラスミドバンドで観察された
程度の混成と評価する。この様に全ての分枝系を同定の
ために試験した。従って試験した四つのプラスミドはHB
V−DNAを運ぶことを示した。
えプラスミドを転換細胞を増殖し、それからDNAを分離
し、そして臭化エチジウムの存在下平衡密度勾配遠心分
離によって組換えプラスミドDNAから宿主細胞DNAを分離
することによって調製した。次いで組換えプラスミドDN
Aを各挿入位置に特異の限定エンドヌクレアーゼで処理
した。DNAをゲル電気泳動によって分別し、サウザン,E.
M.J.Mol.Biol.第98巻，第503頁（1975年）の方法によっ
て分析した。サウザン法においてDNAをまずアガロース
ゲル電気泳動によって分別し次いでこの位置で変性しそ
してニトロセルロースフィルターにゲルから直接移動し
た。従ってゲルのバンドパターンをニトロセルロースフ
ィルター上に複製する。変性したDNAはニトロセルロー
スフィルターに結合する。フィルター結合DNAを公知の
元の32P−標示DNAとの混成によって固定する。HBV−DNA
クロンの場合にはデイン粒子からの32P−標示DNAを混成
プローブとして使用した。結果を第２表に示した。レー
ン1,2,3および４は各々pEco−3,pEco−63,pBam−132お
よびpPst−７を示す。第2A図（暗い面に鮮明な線）は混
成の前のDNAのゲル電気泳動パターンを示す。各場合に
二つのバンドが見られ、臭化エチジウムで染色する螢光
によって可視が出来る。最上部のバンドはレーン1,2お
よび４の線状運搬仲介物DNA、pBR325およびレーン３のp
BR322であり、底部のバンドは推定のHBV−DNAである
（小さい方のDNA断片は図が示すように下方に移動す
る。）レーンＡはHind III−処理バクテリアファージDN
Aから調製した標準である。第2B図は32P−HBV−DNAで混
成後のニトロセルロースフィルターの自動レントゲン写
真である。混成DNAのバンドが各場合に推定のHBV−コロ
ンDNAに相当すると観察され、一方極めて小さな32P−DN
AがプラスミドDNAバンドに混成したと観察される。プラ
スミドに混成した32P−DNAがpBR325でわずかに感染した
ことがわかった。恐らくプラスミドバンドで観察された
程度の混成と評価する。この様に全ての分枝系を同定の
ために試験した。従って試験した四つのプラスミドはHB
V−DNAを運ぶことを示した。
第2C図はプローブとして独立して調製した32P−標示
デイン粒子DNA試料を使用する独立した実験の結果を示
すものである。レーン１はEcoR Iエンドヌクレアーゼで
温浸し臭化エチジウム螢光染色（暗い面に鮮明なバン
ド）によって可視化したpEco63を示す。レーン２は放射
能写真によって可視化した（明るい面に暗いバンド）、
32P−標示デイン粒子DNAに対するレーン１のDNAの混成
を示す。レーン３は入DNAのHind III温浸によって調製
した分子量標準を示す。レーン４はBamH Iエンドヌクレ
アーゼで温浸したpBam132DNAを示す。レーン５は32P−
表示デイン粒子DNAとレーン4DNAとの混成を示す。レー
ン６はPstIエンドヌクレアーゼで温浸したpPst7DNAを示
す。そしてレーン７は32P−標示デイン粒子DNAとレーン
6DNAの混成を示す。
デイン粒子DNA試料を使用する独立した実験の結果を示
すものである。レーン１はEcoR Iエンドヌクレアーゼで
温浸し臭化エチジウム螢光染色（暗い面に鮮明なバン
ド）によって可視化したpEco63を示す。レーン２は放射
能写真によって可視化した（明るい面に暗いバンド）、
32P−標示デイン粒子DNAに対するレーン１のDNAの混成
を示す。レーン３は入DNAのHind III温浸によって調製
した分子量標準を示す。レーン４はBamH Iエンドヌクレ
アーゼで温浸したpBam132DNAを示す。レーン５は32P−
表示デイン粒子DNAとレーン4DNAとの混成を示す。レー
ン６はPstIエンドヌクレアーゼで温浸したpPst7DNAを示
す。そしてレーン７は32P−標示デイン粒子DNAとレーン
6DNAの混成を示す。
実施例 ３ 転写発現 組換え運搬仲介物によって転写した宿主細胞から分離
したmRNAがウイルス性DNAで補充することを示すことに
よって転写発現を示した。ここで使用した実験方法はア
ルウィン,J.C.等Proc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻，第5350
頁（1977年）である。アルウィン等の方法でゲル電気泳
動によって分別したRNAをゲルバンドパターンを保存固
体相支持体に直接移動する。32P−標示DNAプローブに対
する混成を固体相支持体上で実施する。この方法は実施
例２で記載した技術に類似しているがRNAがニトロセル
ロースフィルターに結合しないので詳細では異なるもの
である。アルウィンの方法ではジアゾベンジルオキシメ
チル濾紙を電気泳動ゲルから移動したRNAを結合するた
めに使用する。RNAを結合した後、誘導された紙を過剰
のジアゾ基を32P−標示プローブの非特異性結合を防ぐ
ために加水分解処理する。
したmRNAがウイルス性DNAで補充することを示すことに
よって転写発現を示した。ここで使用した実験方法はア
ルウィン,J.C.等Proc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻，第5350
頁（1977年）である。アルウィン等の方法でゲル電気泳
動によって分別したRNAをゲルバンドパターンを保存固
体相支持体に直接移動する。32P−標示DNAプローブに対
する混成を固体相支持体上で実施する。この方法は実施
例２で記載した技術に類似しているがRNAがニトロセル
ロースフィルターに結合しないので詳細では異なるもの
である。アルウィンの方法ではジアゾベンジルオキシメ
チル濾紙を電気泳動ゲルから移動したRNAを結合するた
めに使用する。RNAを結合した後、誘導された紙を過剰
のジアゾ基を32P−標示プローブの非特異性結合を防ぐ
ために加水分解処理する。
この実施例において使用した標示DNAプローブを宿主
菌株の増殖中32Pで標示されたpEco−３またはpEco−63D
NAを分枝した。標示したプローブのpBR325部分とそのmR
NAとの間の混成を除くために標示されないpBR325の50倍
量の混成混合液に添加した。
菌株の増殖中32Pで標示されたpEco−３またはpEco−63D
NAを分枝した。標示したプローブのpBR325部分とそのmR
NAとの間の混成を除くために標示されないpBR325の50倍
量の混成混合液に添加した。
RNAを10mlバッチ中中間（mid−log）工程相に生長し
たpEco−3,pEco−63,pBam−69,pBam−132,pPst−７また
はpBR325を運ぶ宿主細胞から分離した。GSAローター
（デュポンインスツルメント，ニュートン，コネチカッ
ト）中で6000rpmで10分間遠心分離で細胞を収集した。
ペレットを10mMトリス,pH7.6,5mM酢酸マグネシウムおよ
び10mM KCL中で再懸濁させ、次いで1mgリゾチームを含
有する管に移した。次いで細胞を急速冷凍し、2.5mlの1
0％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウムを添加し、解凍して
十分に混合した。酢酸ナトリウム,1M,pH5.2,0.25mlを撹
拌しながら添加した。
たpEco−3,pEco−63,pBam−69,pBam−132,pPst−７また
はpBR325を運ぶ宿主細胞から分離した。GSAローター
（デュポンインスツルメント，ニュートン，コネチカッ
ト）中で6000rpmで10分間遠心分離で細胞を収集した。
ペレットを10mMトリス,pH7.6,5mM酢酸マグネシウムおよ
び10mM KCL中で再懸濁させ、次いで1mgリゾチームを含
有する管に移した。次いで細胞を急速冷凍し、2.5mlの1
0％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウムを添加し、解凍して
十分に混合した。酢酸ナトリウム,1M,pH5.2,0.25mlを撹
拌しながら添加した。
RNAを37℃で30分間断続的に混合することによって水
飽和フェノール2.5mlで抽出した。水相を除去し、新し
い水飽和フェノールで再抽出した。次いで水相をエーテ
ルで抽出した。5000rpmで５分間遠心分離が相の分離に
有効であった。界面のゴム状物質を放棄した。RNAを5M
NaClの2/3容量およびエタノール2.5容量の添加を沈殿
させ−20℃で一晩培養した。沈殿物を10,000rpmで（HB4
ローター，デュポンインスツルメント社，ニュータウ
ン，コネチカット）−20℃で20分間遠心分離して収集
し、エタノールで１回洗浄し次いで10mMトリス,pH7.4,1
mM EDTAに再溶解した。溶液をHB4ローターで10,000rpm
において０℃で10分間遠心分離しペレットを捨てた。上
澄み溶液に4.5M酢酸ナトリウムpH6,8mlを添加し、−20
℃で８時間選択的にRNAを沈殿した。沈殿物をHB4ロータ
ー中−20℃で20分間10,000rpmで遠心分離することによ
って収集した。前述の沈殿は約70％のDNAを一般に除い
た。沈殿物を3.5mlのトリス,10mM,pH7.4,1mM EDTA,nml
の酢酸ナトリウム中に再懸濁させ、再び沈殿させた。最
終ペレットを0.4mlのトリスEDTA中に再懸濁させ冷凍貯
蔵した。
飽和フェノール2.5mlで抽出した。水相を除去し、新し
い水飽和フェノールで再抽出した。次いで水相をエーテ
ルで抽出した。5000rpmで５分間遠心分離が相の分離に
有効であった。界面のゴム状物質を放棄した。RNAを5M
NaClの2/3容量およびエタノール2.5容量の添加を沈殿
させ−20℃で一晩培養した。沈殿物を10,000rpmで（HB4
ローター，デュポンインスツルメント社，ニュータウ
ン，コネチカット）−20℃で20分間遠心分離して収集
し、エタノールで１回洗浄し次いで10mMトリス,pH7.4,1
mM EDTAに再溶解した。溶液をHB4ローターで10,000rpm
において０℃で10分間遠心分離しペレットを捨てた。上
澄み溶液に4.5M酢酸ナトリウムpH6,8mlを添加し、−20
℃で８時間選択的にRNAを沈殿した。沈殿物をHB4ロータ
ー中−20℃で20分間10,000rpmで遠心分離することによ
って収集した。前述の沈殿は約70％のDNAを一般に除い
た。沈殿物を3.5mlのトリス,10mM,pH7.4,1mM EDTA,nml
の酢酸ナトリウム中に再懸濁させ、再び沈殿させた。最
終ペレットを0.4mlのトリスEDTA中に再懸濁させ冷凍貯
蔵した。
前述の通り調製したRNAをレーンに対して10μgRNAを
使用するアルウィン等によって記述された通り混成分析
のためにゲル電気泳動によって分別した。結果を第３図
に示す。第3A図は螢光染色によって可視化されるように
ゲル電気泳動結果を示すものである。いずれの場合も二
つの主要なRNAバンドが16Sおよび23SリボゾームRNAに相
当すると見られる。第3B図は各々のゲル中でRNAに混成
できる。pEco63,107cpm/μｇから32P−HBV−DNAの自動
レントゲン写真を示すものである。レーン１〜６は次の
プラスミドで感染した細胞から抽出したRNAでの結果を
示すものである。レーン１はpBam−69、レーン２はpBR3
25、レーン３はpPst−７、レーン４はpEco−63、レーン
５はpEco−３、レーン６はpBam−132を示す。レーンＡ
およびレーンＢは各々精製したバクテリアファージMS−
2RNAおよび大腸菌リボゾームRNAの標準である。
使用するアルウィン等によって記述された通り混成分析
のためにゲル電気泳動によって分別した。結果を第３図
に示す。第3A図は螢光染色によって可視化されるように
ゲル電気泳動結果を示すものである。いずれの場合も二
つの主要なRNAバンドが16Sおよび23SリボゾームRNAに相
当すると見られる。第3B図は各々のゲル中でRNAに混成
できる。pEco63,107cpm/μｇから32P−HBV−DNAの自動
レントゲン写真を示すものである。レーン１〜６は次の
プラスミドで感染した細胞から抽出したRNAでの結果を
示すものである。レーン１はpBam−69、レーン２はpBR3
25、レーン３はpPst−７、レーン４はpEco−63、レーン
５はpEco−３、レーン６はpBam−132を示す。レーンＡ
およびレーンＢは各々精製したバクテリアファージMS−
2RNAおよび大腸菌リボゾームRNAの標準である。
混成物質は各場合に見出され、混成範囲は組換えプラ
スミドの場合に大きい方が重要であることがわかる。さ
らにその上混成物質の大きさに比べて、大なる分枝pEco
−63およびpEco−３がより広範囲のRNAの大きさにそし
てより短い挿入、pBam−69およびpBam−132がするより
もさらに長い最大の長さのRNAに上昇を与えることが見
られる。
スミドの場合に大きい方が重要であることがわかる。さ
らにその上混成物質の大きさに比べて、大なる分枝pEco
−63およびpEco−３がより広範囲のRNAの大きさにそし
てより短い挿入、pBam−69およびpBam−132がするより
もさらに長い最大の長さのRNAに上昇を与えることが見
られる。
前述のデータからの分枝HBV−DNAの転写表現が大腸菌
に生じることが明らかである。
に生じることが明らかである。
実施例 ４ HBV−DNAのヌクレオチド配列 全HBVゲノムの配列を実施例１に記載したプラスミドp
Eco−3,pEco−63またはpPst−７に運ばれた分枝HBV−DN
Aから得た。それはマキサム,A.およびギルベルト,W.Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA第74巻，第560頁（1977年）の方法
によって得た。表１に配列を示した。配列をEcoRI分割
位置で始まる線状配列のように書いている。両成分の配
列を示し、各線の上部配列を５′から３′まで左から右
に読まれ、低（補充）配列は３′から５′まで左から右
に読まれる。使用した略号はデオキシヌクレオチド配列
のベースを示し、アデニンに対してはＡ、チミーンに対
してはＴ、グアニンに対してはＧおよびシトシンに対し
てはＣを示す。
Eco−3,pEco−63またはpPst−７に運ばれた分枝HBV−DN
Aから得た。それはマキサム,A.およびギルベルト,W.Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA第74巻，第560頁（1977年）の方法
によって得た。表１に配列を示した。配列をEcoRI分割
位置で始まる線状配列のように書いている。両成分の配
列を示し、各線の上部配列を５′から３′まで左から右
に読まれ、低（補充）配列は３′から５′まで左から右
に読まれる。使用した略号はデオキシヌクレオチド配列
のベースを示し、アデニンに対してはＡ、チミーンに対
してはＴ、グアニンに対してはＧおよびシトシンに対し
てはＣを示す。
実施例 ５ HBV−DNAのヌクレオチド配列をベースにして実施例４
で定量した通り、Ｓ−蛋白質に対してコードしている配
列位置HBsAgの免疫学的に有効な蛋白質成分は上記ピー
ターソン,D.L.等（1978年）から知られている。約1,100
bp長さの小さい方のBamHI断片は蛋白質成分のＮ−末端1
9アミノ酸に類似の配列に対してコードしているヌクレ
オチド配列を含有することが見出されそしてまた同様の
三つのＣ−末端アミノ酸に対してＮ−末端配列を有する
相において正にTAA末端コドンに先立ってコードするピ
ーターソンによって記載された。この配列によってエン
コードされた蛋白質は226のアミノ酸の長さで25,398の
分子量を有しゲリン,J.L.およびShi,J.W.K.によってま
たは上記ピーターソン等（1978年）によって分離したHB
sAgの他の蛋白質成分のドデシル硫酸ナトリウムゲル電
気泳動で定量された物質（22,000〜24,000）とよく一致
している。ここで記載した226アミノ酸蛋白質をＳ蛋白
質と称す。参考のために配列をコードしているＳ蛋白質
の読みとり構成物を構成物１と称す。構成物２および３
を各々１およびヌクレオチドの方に移動する。配列をコ
ードしているＳ蛋白質の最初の９ヌクレオチドに基づく
次の図式で関係を説明する。
で定量した通り、Ｓ−蛋白質に対してコードしている配
列位置HBsAgの免疫学的に有効な蛋白質成分は上記ピー
ターソン,D.L.等（1978年）から知られている。約1,100
bp長さの小さい方のBamHI断片は蛋白質成分のＮ−末端1
9アミノ酸に類似の配列に対してコードしているヌクレ
オチド配列を含有することが見出されそしてまた同様の
三つのＣ−末端アミノ酸に対してＮ−末端配列を有する
相において正にTAA末端コドンに先立ってコードするピ
ーターソンによって記載された。この配列によってエン
コードされた蛋白質は226のアミノ酸の長さで25,398の
分子量を有しゲリン,J.L.およびShi,J.W.K.によってま
たは上記ピーターソン等（1978年）によって分離したHB
sAgの他の蛋白質成分のドデシル硫酸ナトリウムゲル電
気泳動で定量された物質（22,000〜24,000）とよく一致
している。ここで記載した226アミノ酸蛋白質をＳ蛋白
質と称す。参考のために配列をコードしているＳ蛋白質
の読みとり構成物を構成物１と称す。構成物２および３
を各々１およびヌクレオチドの方に移動する。配列をコ
ードしているＳ蛋白質の最初の９ヌクレオチドに基づく
次の図式で関係を説明する。
ヌクレオチド配列から予想されるＳ蛋白質のアミノ酸
組成物は上記ピーターソン等（1978年）によって記載さ
れたHBsAgの蛋白質成分として報告されたものと極めて
一致している。しかしながらＮ−末端アミノ酸配列はセ
リンの代りに15の位置にロイシン残渣を有することによ
って前に報告したものと異なる。領域をコードしている
Ｓ蛋白質の地図位置を第４図に示す。
組成物は上記ピーターソン等（1978年）によって記載さ
れたHBsAgの蛋白質成分として報告されたものと極めて
一致している。しかしながらＮ−末端アミノ酸配列はセ
リンの代りに15の位置にロイシン残渣を有することによ
って前に報告したものと異なる。領域をコードしている
Ｓ蛋白質の地図位置を第４図に示す。
真核生物遺伝子，ロバートソン,M.S.等，ネイチュア
等278巻，第370頁（1979年）の中間配列の優勢の為、蛋
白質生成物のアミノ酸配列を有する遺伝子のコリネアリ
ティ（colinearity）を推定することは不可能である。
しかしながらＳ蛋白質遺伝子中の中間配列の証明はな
い。それはDNA配列によって予想される分子が表面抗原
の免疫学的に有効な成分の特徴に近似しているからであ
る。あらゆる中間配列が小さく（150以下のベース）構
造遺伝子のほとんどの中間配列は長い。分子のＮ−末端
およびＣ−末端の末端は相中にあり、従ってあらゆる中
間配列もまた相を維持しなければならない。よれ故結論
として同定したＳ蛋白質のコード領域がmRNAコリニア
（colinear）であると判断される。
等278巻，第370頁（1979年）の中間配列の優勢の為、蛋
白質生成物のアミノ酸配列を有する遺伝子のコリネアリ
ティ（colinearity）を推定することは不可能である。
しかしながらＳ蛋白質遺伝子中の中間配列の証明はな
い。それはDNA配列によって予想される分子が表面抗原
の免疫学的に有効な成分の特徴に近似しているからであ
る。あらゆる中間配列が小さく（150以下のベース）構
造遺伝子のほとんどの中間配列は長い。分子のＮ−末端
およびＣ−末端の末端は相中にあり、従ってあらゆる中
間配列もまた相を維持しなければならない。よれ故結論
として同定したＳ蛋白質のコード領域がmRNAコリニア
（colinear）であると判断される。
DNAヌクレオチド配列に基づくＳ−蛋白質の完全なア
ミノ酸配列を表２に示す。蛋白質化学において使用され
る標準略記をアミノ酸を表わすのに使用する。Ｓ−蛋白
質に対して同定される出発点は表２中のヌクレオチド15
64〜1566によってコードされたメチオニン残基である。
第４図および表２中に示した通りＳ−蛋白質コード領域
はヌクレオチド1042〜1044によってコードされたメチオ
ニン次にヌクレオチド1075〜1077またはヌクレオチド13
99〜1401によってコードされたメチオニンに始まるアミ
ノ酸の付加Ｎ−末端配列に対して実質的なコード領域を
包含する。これらの領域によってコードされた蛋白質は
HBrの成分として認められなかった。しかしながらかか
る蛋白質は感染方法でまだ未知としての生物学作用の役
目をすることができる。さらに記載した出発点から開始
した蛋白質はヌクレオチド配列を自然に生じることによ
ってコードされたＮ−末端アミノ酸配列を有する有用な
Ｓ−蛋白質誘導体であり、Ｓ−蛋白質自体より分子量が
大きくそして高い抗原性を有する。これらのＳ−ペプチ
ド類似物は免疫および検出目的に対してＳ−蛋白質に対
して向けられた抗体を引出すのに有用である。
ミノ酸配列を表２に示す。蛋白質化学において使用され
る標準略記をアミノ酸を表わすのに使用する。Ｓ−蛋白
質に対して同定される出発点は表２中のヌクレオチド15
64〜1566によってコードされたメチオニン残基である。
第４図および表２中に示した通りＳ−蛋白質コード領域
はヌクレオチド1042〜1044によってコードされたメチオ
ニン次にヌクレオチド1075〜1077またはヌクレオチド13
99〜1401によってコードされたメチオニンに始まるアミ
ノ酸の付加Ｎ−末端配列に対して実質的なコード領域を
包含する。これらの領域によってコードされた蛋白質は
HBrの成分として認められなかった。しかしながらかか
る蛋白質は感染方法でまだ未知としての生物学作用の役
目をすることができる。さらに記載した出発点から開始
した蛋白質はヌクレオチド配列を自然に生じることによ
ってコードされたＮ−末端アミノ酸配列を有する有用な
Ｓ−蛋白質誘導体であり、Ｓ−蛋白質自体より分子量が
大きくそして高い抗原性を有する。これらのＳ−ペプチ
ド類似物は免疫および検出目的に対してＳ−蛋白質に対
して向けられた抗体を引出すのに有用である。
Ｓ−蛋白質コード領域の両端の近くに位置した二つの
Tac I限定位置がある。小さい方のBamH I断片を鈍感な
末端を与えるためTac Iエンドヌクレアーゼで処理し
た。Hind III結鎖を鈍感な末端結紮によってTac I断片
の鈍感な末端に付けた〔スギノ,A.等,J.Biol.Chem.第25
2巻，第3987頁（1977年）〕。次いで断片をプラスミドp
trpED50から誘導された〔マーシアル,J.等，科学，第20
5巻（1979年）〕標示プラスミドptrpE30に挿入した。プ
ラスミドptrpE30は技術者、助触媒減衰器およびトリプ
トファンオペロンの配列を結合するリボゾームを通常の
翻訳の方向にHind III位置によって続くtrpE蛋白質の７
アミノ酸に対してコードしているヌクレオチド配列を伴
って含有する。このプラスミドをHind III位置の挿入の
際にＳ蛋白質の標示に適合する公知の読み枠を与えるの
に便利に使用した。
Tac I限定位置がある。小さい方のBamH I断片を鈍感な
末端を与えるためTac Iエンドヌクレアーゼで処理し
た。Hind III結鎖を鈍感な末端結紮によってTac I断片
の鈍感な末端に付けた〔スギノ,A.等,J.Biol.Chem.第25
2巻，第3987頁（1977年）〕。次いで断片をプラスミドp
trpED50から誘導された〔マーシアル,J.等，科学，第20
5巻（1979年）〕標示プラスミドptrpE30に挿入した。プ
ラスミドptrpE30は技術者、助触媒減衰器およびトリプ
トファンオペロンの配列を結合するリボゾームを通常の
翻訳の方向にHind III位置によって続くtrpE蛋白質の７
アミノ酸に対してコードしているヌクレオチド配列を伴
って含有する。このプラスミドをHind III位置の挿入の
際にＳ蛋白質の標示に適合する公知の読み枠を与えるの
に便利に使用した。
標示プラスミドptrpE30をHind IIIエンドヌクレアー
ゼで前処理した。次いで処理したＳ−蛋白質をコードし
ている断片を接合反応に触媒作用を及ぼすDNAリガーゼ
によって処理したプラスミドに挿入した。ptrpE30のHin
d III位置は挿入したＳ−蛋白質をコードしている配列
を有する相中の読み枠を与える配列データから知られ
る。大腸菌HB101の転換はトリプトファンオペロン制御
下でtrpE−Ｓ蛋白質融合蛋白質の標示に導きそして次の
記載する通りβ−インドリルアクリル酸で誘導すること
ができる。この菌株を大腸菌HB101/ptrpE30−HBsAgと称
した。
ゼで前処理した。次いで処理したＳ−蛋白質をコードし
ている断片を接合反応に触媒作用を及ぼすDNAリガーゼ
によって処理したプラスミドに挿入した。ptrpE30のHin
d III位置は挿入したＳ−蛋白質をコードしている配列
を有する相中の読み枠を与える配列データから知られ
る。大腸菌HB101の転換はトリプトファンオペロン制御
下でtrpE−Ｓ蛋白質融合蛋白質の標示に導きそして次の
記載する通りβ−インドリルアクリル酸で誘導すること
ができる。この菌株を大腸菌HB101/ptrpE30−HBsAgと称
した。
ptrpE30/HBsAgによって転換された細菌細胞をロイシ
ン、プロリン、ビタミンB1およびアムピシリンで補充し
た標準最小培地（M9）中37℃で増殖した。初期のログ相
でtrpオペロンをβ−インドリルアクリル酸（培地ml当
り30μｇ）の添加によって誘導した。コントロール培養
は誘導しないままにした。３時間以上の増殖後、細胞1.
5mlを20μC:35S−Ｌ−メチオニンの添加および10分間温
浸して放射性を標示した。次に細胞を遠心分離によって
収集し洗浄してそして0.0625MトリスpH6.8中グリコール
10％（v/v）、β−メルカプトエタノール５％（v/v）お
よびSDS2.3％（w/v）を含有する衝撃液250μ中に再懸
濁した。懸濁液を５分間沸騰させ、次いで10％（w/v）S
DS−ポリアクリルアミドゲルに適用しそして電気泳動で
分別した。蛋白質バンドが放射能写真によって可視化さ
れた。結果を第５図に示す。
ン、プロリン、ビタミンB1およびアムピシリンで補充し
た標準最小培地（M9）中37℃で増殖した。初期のログ相
でtrpオペロンをβ−インドリルアクリル酸（培地ml当
り30μｇ）の添加によって誘導した。コントロール培養
は誘導しないままにした。３時間以上の増殖後、細胞1.
5mlを20μC:35S−Ｌ−メチオニンの添加および10分間温
浸して放射性を標示した。次に細胞を遠心分離によって
収集し洗浄してそして0.0625MトリスpH6.8中グリコール
10％（v/v）、β−メルカプトエタノール５％（v/v）お
よびSDS2.3％（w/v）を含有する衝撃液250μ中に再懸
濁した。懸濁液を５分間沸騰させ、次いで10％（w/v）S
DS−ポリアクリルアミドゲルに適用しそして電気泳動で
分別した。蛋白質バンドが放射能写真によって可視化さ
れた。結果を第５図に示す。
転換されたHB101 ptrpE/30/HBsAgの個々の分離物を各
々p126,p135,p146,p150,p155およびp166と称した。誘導
したおよび誘導されない培養の蛋白質を並行して各々例
えばp126indまたはp126を標示した対照として示す。標
準は挿入物のないptrpE30で転換した細胞および各々分
子量（M.W.）69,000（“69K"）、43,000（“43K"）、3
0,000（“30K"）および14,300（“14.3K"）を有する牛
の血清アルブミン、オバルビン、炭酸脱水酵素、および
リゾチームである公知の大きさの混合物または蛋白質を
包含する。
々p126,p135,p146,p150,p155およびp166と称した。誘導
したおよび誘導されない培養の蛋白質を並行して各々例
えばp126indまたはp126を標示した対照として示す。標
準は挿入物のないptrpE30で転換した細胞および各々分
子量（M.W.）69,000（“69K"）、43,000（“43K"）、3
0,000（“30K"）および14,300（“14.3K"）を有する牛
の血清アルブミン、オバルビン、炭酸脱水酵素、および
リゾチームである公知の大きさの混合物または蛋白質を
包含する。
trpE−Ｓ蛋白質融合蛋白質の標示を誘導された培養に
独特な、分子量約27,000を有する蛋白質の第５図中に小
さな矢で示したバンドの出現によって示した。trpE−Ｓ
蛋白質融合生成物の計算分子量は27,458である。融合蛋
白質はtrpE蛋白質のＳ−終点から７アミノ酸およびHind
III結鎖およびTacI位置とＳ−蛋白質コード領域の開始
の間にあるヌクレオチドによってコードされた12アミノ
酸を包含する。融合蛋白質のアミノ酸配列はMet−Gln−
Thr−Gln−Lys−Pro−Thr−Pro−Ser−Leu−Ala−Arg−
Thr−Gly−Asp−Pro−Val−Thr−Asn−Ｓであり、Ｓは
Ｓ−蛋白質のアミノ酸配列を表わす。
独特な、分子量約27,000を有する蛋白質の第５図中に小
さな矢で示したバンドの出現によって示した。trpE−Ｓ
蛋白質融合生成物の計算分子量は27,458である。融合蛋
白質はtrpE蛋白質のＳ−終点から７アミノ酸およびHind
III結鎖およびTacI位置とＳ−蛋白質コード領域の開始
の間にあるヌクレオチドによってコードされた12アミノ
酸を包含する。融合蛋白質のアミノ酸配列はMet−Gln−
Thr−Gln−Lys−Pro−Thr−Pro−Ser−Leu−Ala−Arg−
Thr−Gly−Asp−Pro−Val−Thr−Asn−Ｓであり、Ｓは
Ｓ−蛋白質のアミノ酸配列を表わす。
Ｓ−蛋白質コード領域の表示をHBsAgに対する抗体で
免疫化学反応性によって、標示されたHBsAgで競合放射
線免疫検定において（AUSRIA、商標アボットラボラトリ
ーノースシカゴイリノイ州）検出した。また標示を免疫
沈殿によって検出する。大腸菌HB101/ptrpE30−HBsAgの
培養をβ−インドリルアクリル酸で誘導し、3ml試料パ
ルスを２μCiの14C−標示アミノ酸または35S−メチオニ
ンで一定時間誘導後種々の間隔で標示する。０および４
時間誘導された培養からの試料をマーシャル,J.A.等,Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻，第1816頁（1977年）に記
載した通り抗原抗体コンプレックスを収集するためにホ
ルムアルデヒド処理スタフィロコッカスオーレウスを使
用してHBsAgに対して抗体と反応後、免疫沈殿する。沈
殿した蛋白質を溶解してそしてSDSポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動によって分別する。結果は免疫沈殿出
来る蛋白質が誘導後のみ実質量で出現しトリプトファン
オペロン制御下でＳ−蛋白質コード領域の標示を確認し
そしてHBsAgに対して抗体でＳ−蛋白質の免疫学反応性
を確証することを示す。個々の細菌集落によるＳ−蛋白
質の標示をブルーム,Sおよびギルバー,W.Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA第75巻，第3727頁（1978年）のポリビニル円
板法の変性によって検出する。十分に洗浄したポリビニ
ル円板を未標示のIgGの溶液に（この場合HBsAgに対する
抗体からなる）0.2M NaHCO3中10〜60μg/ml濃度、pH9.
2で３分間浮かべる。次いで円板を洗浄緩衝液中で（10m
g/mlゼラチン、１％血清（ヒト、ウサギまたはギネア
豚）0.1％NP40、0.02％NaN3のリン酸塩緩衝塩中）２回
洗浄する。円板を次いで溶解した細菌集落または寒天に
吸収した小さな液体試料を含有する寒天板に適用する。
細菌集落の溶解を三つの方法のいずれか一つで達成する
ことができる。
免疫化学反応性によって、標示されたHBsAgで競合放射
線免疫検定において（AUSRIA、商標アボットラボラトリ
ーノースシカゴイリノイ州）検出した。また標示を免疫
沈殿によって検出する。大腸菌HB101/ptrpE30−HBsAgの
培養をβ−インドリルアクリル酸で誘導し、3ml試料パ
ルスを２μCiの14C−標示アミノ酸または35S−メチオニ
ンで一定時間誘導後種々の間隔で標示する。０および４
時間誘導された培養からの試料をマーシャル,J.A.等,Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA第74巻，第1816頁（1977年）に記
載した通り抗原抗体コンプレックスを収集するためにホ
ルムアルデヒド処理スタフィロコッカスオーレウスを使
用してHBsAgに対して抗体と反応後、免疫沈殿する。沈
殿した蛋白質を溶解してそしてSDSポリアクリルアミド
ゲル中で電気泳動によって分別する。結果は免疫沈殿出
来る蛋白質が誘導後のみ実質量で出現しトリプトファン
オペロン制御下でＳ−蛋白質コード領域の標示を確認し
そしてHBsAgに対して抗体でＳ−蛋白質の免疫学反応性
を確証することを示す。個々の細菌集落によるＳ−蛋白
質の標示をブルーム,Sおよびギルバー,W.Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA第75巻，第3727頁（1978年）のポリビニル円
板法の変性によって検出する。十分に洗浄したポリビニ
ル円板を未標示のIgGの溶液に（この場合HBsAgに対する
抗体からなる）0.2M NaHCO3中10〜60μg/ml濃度、pH9.
2で３分間浮かべる。次いで円板を洗浄緩衝液中で（10m
g/mlゼラチン、１％血清（ヒト、ウサギまたはギネア
豚）0.1％NP40、0.02％NaN3のリン酸塩緩衝塩中）２回
洗浄する。円板を次いで溶解した細菌集落または寒天に
吸収した小さな液体試料を含有する寒天板に適用する。
細菌集落の溶解を三つの方法のいずれか一つで達成する
ことができる。
１）乾燥器中で10〜20分間CHCl3に露出する。
２）リゾチーム、EDTAおよびトリス−HCl pH9を含有す
る寒天板に細菌集落を移動する。
る寒天板に細菌集落を移動する。
３）リゾチーム、EDTA、トリス−HCl、10％洗浄緩衝液
および１％アガロース溶液と共に集落を含有する寒天板
を置く。重塁を固化した後、被覆したポリビニル円板を
直接に適用することができる。
および１％アガロース溶液と共に集落を含有する寒天板
を置く。重塁を固化した後、被覆したポリビニル円板を
直接に適用することができる。
三方法はすべて同様の感受性を有するようである。重
塁技術な溶解操作後陽性集落から細菌を回収することが
できる利点を有する。４℃で１〜４時間温浸した後、ポ
リビニル円板を再び洗浄緩衝液中で２回洗浄する。現在
ポリビニル円板を４℃で一晩洗浄緩衝液（２×106cpm/m
l）中125I−IgG（抗−HBsAg）2mlで温浸する。ポリビニ
ル円板を個々に15分間洗浄緩衝液中42℃で２回洗浄し、
次いで室温で蒸溜水中２回洗浄する。次いで円板を−70
℃に18〜48時間Ｘ−線フィルムに露出する。抗原を有す
る区域は現像したＸ−線フィルム上に暗点として現われ
る。抗原を有する集落をＳ−蛋白質コード領域を標示す
るものとして同定する。培養を大規模にＳ−蛋白質を生
産する目的で選択した集落から増殖する。trpE−Ｓ蛋白
質融合生成物をゲル濾過および親和クロマトグラフィを
包含する普通の手段で（細胞）溶解質から精製する。
塁技術な溶解操作後陽性集落から細菌を回収することが
できる利点を有する。４℃で１〜４時間温浸した後、ポ
リビニル円板を再び洗浄緩衝液中で２回洗浄する。現在
ポリビニル円板を４℃で一晩洗浄緩衝液（２×106cpm/m
l）中125I−IgG（抗−HBsAg）2mlで温浸する。ポリビニ
ル円板を個々に15分間洗浄緩衝液中42℃で２回洗浄し、
次いで室温で蒸溜水中２回洗浄する。次いで円板を−70
℃に18〜48時間Ｘ−線フィルムに露出する。抗原を有す
る区域は現像したＸ−線フィルム上に暗点として現われ
る。抗原を有する集落をＳ−蛋白質コード領域を標示す
るものとして同定する。培養を大規模にＳ−蛋白質を生
産する目的で選択した集落から増殖する。trpE−Ｓ蛋白
質融合生成物をゲル濾過および親和クロマトグラフィを
包含する普通の手段で（細胞）溶解質から精製する。
実施例 ６ Ｓ−蛋白質の細菌合成 実施例５の標示生成物はＳ−蛋白質およびtrpE蛋白質
（最初Ｎ−終点から７アミノ酸）、Hind III結鎖（次３
アミノ酸）およびTac I位置とＳ−蛋白質を開始するメ
チオニンの間のHBVゲノムの一部（９アミノ酸）から誘
導される19アミノ酸Ｎ−末端配列からなる融合蛋白質で
ある。ヒトのワクチン注射を含む多くの適用に対して、
表２に示した通り、Ｓ−蛋白質自体の合成または性質で
コードした誘導体の一の合成を達成することが好まし
い。エクソペプチダーゼ（アミノペプチダーゼ）で限定
した処理によって19アミノ酸Ｎ−末端配列を除去するこ
とが可能であるがＳ−蛋白質の生産は低いことが予想さ
れる。
（最初Ｎ−終点から７アミノ酸）、Hind III結鎖（次３
アミノ酸）およびTac I位置とＳ−蛋白質を開始するメ
チオニンの間のHBVゲノムの一部（９アミノ酸）から誘
導される19アミノ酸Ｎ−末端配列からなる融合蛋白質で
ある。ヒトのワクチン注射を含む多くの適用に対して、
表２に示した通り、Ｓ−蛋白質自体の合成または性質で
コードした誘導体の一の合成を達成することが好まし
い。エクソペプチダーゼ（アミノペプチダーゼ）で限定
した処理によって19アミノ酸Ｎ−末端配列を除去するこ
とが可能であるがＳ−蛋白質の生産は低いことが予想さ
れる。
Ｓ−蛋白質自体の標示を融合蛋白質の宿主部分に対し
てコードしているヌクレオチドを形成物から除去してそ
してＳ−蛋白質組織遺伝子の出発コドンに先立つ後者の
あらゆるヌクレオチドから除去するために標示プラスミ
ドおよびＳ−蛋白質コード断片の両方を変性することに
よって達成することができる。あらゆる標示プラスミド
を好ましくはptrpE30またはpBH20〔イタクラ等，科学第
198巻，第1056頁（1977年）〕のような翻訳のはじまり
に近い挿入位置を有するものを使用することができる。
てコードしているヌクレオチドを形成物から除去してそ
してＳ−蛋白質組織遺伝子の出発コドンに先立つ後者の
あらゆるヌクレオチドから除去するために標示プラスミ
ドおよびＳ−蛋白質コード断片の両方を変性することに
よって達成することができる。あらゆる標示プラスミド
を好ましくはptrpE30またはpBH20〔イタクラ等，科学第
198巻，第1056頁（1977年）〕のような翻訳のはじまり
に近い挿入位置を有するものを使用することができる。
短いヌクレオチドセグメントを除去する処理をエキソ
ヌクレオチック（exonucleolytic）酵素を使用して達成
する。好ましい酵素はT4ポリメラーゼであり、添加した
デオキシヌクレオチドトリフォスフェートなしで二重成
分DNAのエキソヌクレオチック（exonucleolytic）消化
を３′〜５′接触作用を及ぼす〔イングランド、P.T.,
J.Biol.Chem.第246巻，第3269頁（1971年）〕。温浸の
範囲を技術において公知の原理に従って適当な温度、反
応時間および酵素量の選択によって制御する。最適反応
条件を酵素の各ロットおよび変性した各DNAに対して決
定しなければならないので各場合に実験法が必要とな
る。これらの方法で温浸の範囲を制御することができ
る。前決定中止点で温浸の終末を一つのデオキシヌクレ
オサイドトリフォスフェートを反応混合液中に包含し、
所望の中止点に対応することによって得る。具体的には
dATPの存在下、DNAをポリメタラーゼがdA残渣に達する
まで３′〜５′温浸し、その点でさらに正味の温浸を止
める。各々前決定される中止点を有するいくつかの温浸
サイクルを前決定終末点を有するDNA分子を構成するた
めに順次実施することができる。T4ポリメラーゼを有す
るエキソヌクレオチック（exonucleolytic）消化は３′
終点を有する成分だけに作用する。補充成分は対でない
単一成分末尾として残存しそれもまた除去しなければな
らない。S1ヌクレアーゼはこの目的に対して好ましい酵
素である。T4ポリメラーゼおよびS1ヌクレアーゼで結合
した処理の生成物は鈍感な終末の二重成分のDNAであ
る。
ヌクレオチック（exonucleolytic）酵素を使用して達成
する。好ましい酵素はT4ポリメラーゼであり、添加した
デオキシヌクレオチドトリフォスフェートなしで二重成
分DNAのエキソヌクレオチック（exonucleolytic）消化
を３′〜５′接触作用を及ぼす〔イングランド、P.T.,
J.Biol.Chem.第246巻，第3269頁（1971年）〕。温浸の
範囲を技術において公知の原理に従って適当な温度、反
応時間および酵素量の選択によって制御する。最適反応
条件を酵素の各ロットおよび変性した各DNAに対して決
定しなければならないので各場合に実験法が必要とな
る。これらの方法で温浸の範囲を制御することができ
る。前決定中止点で温浸の終末を一つのデオキシヌクレ
オサイドトリフォスフェートを反応混合液中に包含し、
所望の中止点に対応することによって得る。具体的には
dATPの存在下、DNAをポリメタラーゼがdA残渣に達する
まで３′〜５′温浸し、その点でさらに正味の温浸を止
める。各々前決定される中止点を有するいくつかの温浸
サイクルを前決定終末点を有するDNA分子を構成するた
めに順次実施することができる。T4ポリメラーゼを有す
るエキソヌクレオチック（exonucleolytic）消化は３′
終点を有する成分だけに作用する。補充成分は対でない
単一成分末尾として残存しそれもまた除去しなければな
らない。S1ヌクレアーゼはこの目的に対して好ましい酵
素である。T4ポリメラーゼおよびS1ヌクレアーゼで結合
した処理の生成物は鈍感な終末の二重成分のDNAであ
る。
上述した処理を今の標示プラスミドを処理するために
使用され、融合蛋白質の宿主部分に対してコードしてい
るヌクレオチドを除去する。保護される本質的な要素を
標示単位と称す。標示単位は助触媒および宿主生体中で
作用することができるリボゾーム結合位置を包含する。
実際の問題として融合蛋白質の宿主部分に対してコード
するヌクレオチドを正確に除去することは必要ではな
い。
使用され、融合蛋白質の宿主部分に対してコードしてい
るヌクレオチドを除去する。保護される本質的な要素を
標示単位と称す。標示単位は助触媒および宿主生体中で
作用することができるリボゾーム結合位置を包含する。
実際の問題として融合蛋白質の宿主部分に対してコード
するヌクレオチドを正確に除去することは必要ではな
い。
リボゾーム結合位置と開始コドン（AUP）間の関係は
出発コドンをリボゾーム結合位置の３〜11ヌクレオチド
内のどこにでも位置することができることである、シン
等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,第71巻，第1342頁（1974
年），ステイツ,J.等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,第72巻，
第4734頁（1975年）。この３〜11ヌクレオチド領域にお
いて出会うべき最初のAUGは翻訳のためによみとり構成
物を定める。実施例５に記載した通りptrpE30の場合に
はHind IIIから23〜29ヌクレオチドの最小限の除去はト
リプトファンオペロン制御下、標示単位に挿入のために
位置を与える。
出発コドンをリボゾーム結合位置の３〜11ヌクレオチド
内のどこにでも位置することができることである、シン
等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,第71巻，第1342頁（1974
年），ステイツ,J.等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,第72巻，
第4734頁（1975年）。この３〜11ヌクレオチド領域にお
いて出会うべき最初のAUGは翻訳のためによみとり構成
物を定める。実施例５に記載した通りptrpE30の場合に
はHind IIIから23〜29ヌクレオチドの最小限の除去はト
リプトファンオペロン制御下、標示単位に挿入のために
位置を与える。
Hind IIIエンドヌクレアーゼによるptrpE30の消化を
実質的に限定酵素でプラスミドDNAの分割に対して実施
例１に記載された条件下で実施する。処理DNAを二サイ
クルのエタノール沈殿によって反応混合液から回収す
る。一つの最適T4ポリメラーゼ温浸反応においてDNA15
μｇをH2O中に再懸濁させそして濃縮した塩溶液を全容
量250μ中70mMトリスpH8.8,70mM MgCl2,10mMジチオ
スレイトールおよび13.75単位のT4ポリメラーゼ（Ｐ−
Ｌバイオケミカルス、ミルウォーキーWis.）を含有する
反応混合液を与えるために添加する。反応混合液を37℃
で3.3分保温する。反応を氷浴に保温混合液を早く移す
ことによって終結し次いで65℃で５分加熱処理によって
酵素を不活性化する。DNAをエタノール沈殿によって回
収する。S1ヌクレアーゼ処理を上記ウルリッヒ,A.等に
よって記載された通り実施する。
実質的に限定酵素でプラスミドDNAの分割に対して実施
例１に記載された条件下で実施する。処理DNAを二サイ
クルのエタノール沈殿によって反応混合液から回収す
る。一つの最適T4ポリメラーゼ温浸反応においてDNA15
μｇをH2O中に再懸濁させそして濃縮した塩溶液を全容
量250μ中70mMトリスpH8.8,70mM MgCl2,10mMジチオ
スレイトールおよび13.75単位のT4ポリメラーゼ（Ｐ−
Ｌバイオケミカルス、ミルウォーキーWis.）を含有する
反応混合液を与えるために添加する。反応混合液を37℃
で3.3分保温する。反応を氷浴に保温混合液を早く移す
ことによって終結し次いで65℃で５分加熱処理によって
酵素を不活性化する。DNAをエタノール沈殿によって回
収する。S1ヌクレアーゼ処理を上記ウルリッヒ,A.等に
よって記載された通り実施する。
同様の方法で実施例５に記載したＳ−蛋白質コード領
域からなるHBV−DNAのTacI断片を各３′の終りから約30
デオキシヌクレオチドを除去するためにT4ポリメラーゼ
で処理する。BamHI結鎖を鈍い末端結紮によって付加す
る。
域からなるHBV−DNAのTacI断片を各３′の終りから約30
デオキシヌクレオチドを除去するためにT4ポリメラーゼ
で処理する。BamHI結鎖を鈍い末端結紮によって付加す
る。
結鎖は一成分上配列５′−CCGGATCCGG−３′を有し、
そして他の成分上補充配列を有する。CGGを生成するた
めに配列CCGGを分割するHpa IIエクソスクレアーゼでの
処理は５′−終末CG、例えばHpa IカットDNAまたはCla
IカットDNAを有するあらゆる位置に接合することができ
るDNA断片を生じる。
そして他の成分上補充配列を有する。CGGを生成するた
めに配列CCGGを分割するHpa IIエクソスクレアーゼでの
処理は５′−終末CG、例えばHpa IカットDNAまたはCla
IカットDNAを有するあらゆる位置に接合することができ
るDNA断片を生じる。
記載した通り処理したTac I断片をまた記載した通り
処理したptrpE30に速かに挿入しそして同様にヴァレン
ツェラ等ネイチア第280巻，第815頁（1979年）によって
記載した反応に接触作用を及ぼすDNAリガース中にHpa I
I−特異連鎖で生じる。細菌細胞をプラスミドを有する
挿入物で転換する。転換物を実施例５に記載した通りア
ムピシリン耐性によって選択する。単一集落分離物から
増殖した培養をβ−インドリルアクリル酸で誘発し実施
例５に記載した35S−メチオニンでパルス標示する。標
示した蛋白質をゲル電気泳動および放射能写真で可視化
する。27,000M.W.領域に蛋白質バンドを生じる分岐は前
駆物配列なしでＳ−蛋白質を合成していることはほぼ間
違いない。
処理したptrpE30に速かに挿入しそして同様にヴァレン
ツェラ等ネイチア第280巻，第815頁（1979年）によって
記載した反応に接触作用を及ぼすDNAリガース中にHpa I
I−特異連鎖で生じる。細菌細胞をプラスミドを有する
挿入物で転換する。転換物を実施例５に記載した通りア
ムピシリン耐性によって選択する。単一集落分離物から
増殖した培養をβ−インドリルアクリル酸で誘発し実施
例５に記載した35S−メチオニンでパルス標示する。標
示した蛋白質をゲル電気泳動および放射能写真で可視化
する。27,000M.W.領域に蛋白質バンドを生じる分岐は前
駆物配列なしでＳ−蛋白質を合成していることはほぼ間
違いない。
仲介物DNAの宿主蛋白質コード領域の除去が不完全の
場合、挿入したDNAを融合蛋白質として標示する1/6のチ
ャンスがある。しかしながらあまりに多くのヌクレオチ
ドを仲介物DNAから除去する場合、挿入物DNAによってコ
ードされた蛋白質を形成しないことは有りうることであ
り、一方処理された挿入物が開始コドンから離れたリボ
ゾーム結合位置の11ヌクレオチド以上のようにあまりに
長い場合には蛋白質をほとんどまたは全く形成しない。
仲介物がコード配列の一部を保持しあるいは挿入処理が
Ｓ−蛋白質コード領域の一部を除去している場合にだけ
間違った蛋白質合成のあらゆる可能性がある。それ故、
一定の分枝によって生じた蛋白質を末端基分析具体的に
はエドマン分解によって同定し、Ｎ−末端配列Met−Glu
−Asn−IleのＳ−蛋白質を確認する。正しいプラスミド
構成をDNA塩基配列分析（実施例４）によって確認す
る。標示されたＳ−蛋白質の構造の証明を完全なアミノ
酸配列分析によって達成する。細菌菌株によって合成し
た真のＳ−蛋白質をグル濾過および親和クロマトグラフ
ィーのような標準方法によって精製し、さらに免疫化学
試験およびトリプチック（tryptic）分解物分析によっ
て特徴付けられる。
場合、挿入したDNAを融合蛋白質として標示する1/6のチ
ャンスがある。しかしながらあまりに多くのヌクレオチ
ドを仲介物DNAから除去する場合、挿入物DNAによってコ
ードされた蛋白質を形成しないことは有りうることであ
り、一方処理された挿入物が開始コドンから離れたリボ
ゾーム結合位置の11ヌクレオチド以上のようにあまりに
長い場合には蛋白質をほとんどまたは全く形成しない。
仲介物がコード配列の一部を保持しあるいは挿入処理が
Ｓ−蛋白質コード領域の一部を除去している場合にだけ
間違った蛋白質合成のあらゆる可能性がある。それ故、
一定の分枝によって生じた蛋白質を末端基分析具体的に
はエドマン分解によって同定し、Ｎ−末端配列Met−Glu
−Asn−IleのＳ−蛋白質を確認する。正しいプラスミド
構成をDNA塩基配列分析（実施例４）によって確認す
る。標示されたＳ−蛋白質の構造の証明を完全なアミノ
酸配列分析によって達成する。細菌菌株によって合成し
た真のＳ−蛋白質をグル濾過および親和クロマトグラフ
ィーのような標準方法によって精製し、さらに免疫化学
試験およびトリプチック（tryptic）分解物分析によっ
て特徴付けられる。
精製したＳ−蛋白質は免疫遺伝性でありHBsAgに対し
て抗体と交叉反応性である。Ｓ−蛋白質コード領域の塩
基配列によって決定されるアミノ酸配列は次の通りであ
る。
て抗体と交叉反応性である。Ｓ−蛋白質コード領域の塩
基配列によって決定されるアミノ酸配列は次の通りであ
る。
技術上公知の方法と共に所望の技術の適用は一般式 （式中ＳはＳ−蛋白質のアミノ酸配列である。Ｘは肝炎
Ｂ表面抗原の直前の174アミノ酸から成る配列の少なく
とも一部である抗原性蛋白質である。それは表２に示さ
れる性質上コードされたアミノ酸配列を包含するがそれ
に限定されるものではないそしてまたチロシン、フェニ
ルアラニンおよびトリプトファンのような主として芳香
族アミノ酸からなるペプチドを包含し、該ペプチドはそ
れらが付着する蛋白質の抗原性を増加する特性を有する
セラ、M.,科学，第166巻，第1365頁（1969年）およびセ
ラ,M.定量生化学についてのコールドスプリングハーバ
ーシンポジウム第32巻（1967年）に記載されたアミノ酸
残基の長さ約４以下である。およびＹはアミノ酸、ペプ
チド、蛋白質またはエステルまたはアミド結合における
カルボキシル保護基であり既に述べた芳香族アミノ酸か
らなるペプチドを包含するがそれに限定されるものでは
ない。）を有するＳ−蛋白質誘導体系を構成することを
可能にする。それ故誘導体は25,398より分子量が大き
い。記載したＳ−蛋白質誘導体は蛋白質分解温浸に対し
て抗原性および安定性を高めている。それ故誘導体はワ
クチン注射および検定目的に対する抗原として有用であ
る。
Ｂ表面抗原の直前の174アミノ酸から成る配列の少なく
とも一部である抗原性蛋白質である。それは表２に示さ
れる性質上コードされたアミノ酸配列を包含するがそれ
に限定されるものではないそしてまたチロシン、フェニ
ルアラニンおよびトリプトファンのような主として芳香
族アミノ酸からなるペプチドを包含し、該ペプチドはそ
れらが付着する蛋白質の抗原性を増加する特性を有する
セラ、M.,科学，第166巻，第1365頁（1969年）およびセ
ラ,M.定量生化学についてのコールドスプリングハーバ
ーシンポジウム第32巻（1967年）に記載されたアミノ酸
残基の長さ約４以下である。およびＹはアミノ酸、ペプ
チド、蛋白質またはエステルまたはアミド結合における
カルボキシル保護基であり既に述べた芳香族アミノ酸か
らなるペプチドを包含するがそれに限定されるものでは
ない。）を有するＳ−蛋白質誘導体系を構成することを
可能にする。それ故誘導体は25,398より分子量が大き
い。記載したＳ−蛋白質誘導体は蛋白質分解温浸に対し
て抗原性および安定性を高めている。それ故誘導体はワ
クチン注射および検定目的に対する抗原として有用であ
る。
技術上公知の種々のアミノ保護基はＳ−蛋白質および
そのペプチド誘導体の誘導体を生成する用途に適してい
る。適当なアミノ基の選択は保護されるアミノ酸の性
質、除去の比較的な容易さ、溶媒、温度などのような普
通の反応条件のような因子に依存する。適当なアミノ保
護基はベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキシ）
基、置換されたカルボベンゾキシまたは他のウレタン保
護基、トリフルオロアセチル基、フタリル（またはフタ
ロイル）基、ジフェニルメチル（ベンツヒドリル）基、
トリフェニルメチル（トリチル）基、ホルミル基、ラク
タム、シッフ塩基およびＮ−アミン、ベンジルスルホニ
ル基、トリチルスルフェニル基およびアリールスルフェ
ニル基を包含する。通常使用されるアミノ保護基はtert
ブチルオキシカルボニル基、ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニル基およびトシル基を包含する。ボダンスツキー,
O.等ペプチド合成,CH.4,インターサイエンス発行（1966
年），シュロエダー，ペプチド第１巻，第XXIII〜XXXIX
頁，アカデミックプレス（1965年）および有機化学にお
ける保護基（J.F.W.Mc Omie.ed.）プレヌムプレス（197
3年）などがペプチド化学の標準研究に参考となる。
そのペプチド誘導体の誘導体を生成する用途に適してい
る。適当なアミノ基の選択は保護されるアミノ酸の性
質、除去の比較的な容易さ、溶媒、温度などのような普
通の反応条件のような因子に依存する。適当なアミノ保
護基はベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキシ）
基、置換されたカルボベンゾキシまたは他のウレタン保
護基、トリフルオロアセチル基、フタリル（またはフタ
ロイル）基、ジフェニルメチル（ベンツヒドリル）基、
トリフェニルメチル（トリチル）基、ホルミル基、ラク
タム、シッフ塩基およびＮ−アミン、ベンジルスルホニ
ル基、トリチルスルフェニル基およびアリールスルフェ
ニル基を包含する。通常使用されるアミノ保護基はtert
ブチルオキシカルボニル基、ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニル基およびトシル基を包含する。ボダンスツキー,
O.等ペプチド合成,CH.4,インターサイエンス発行（1966
年），シュロエダー，ペプチド第１巻，第XXIII〜XXXIX
頁，アカデミックプレス（1965年）および有機化学にお
ける保護基（J.F.W.Mc Omie.ed.）プレヌムプレス（197
3年）などがペプチド化学の標準研究に参考となる。
技術上公知の適当なカルボキシル保護基は低級アルキ
ルエステル、フェニル−置換低級アルキルエステル、例
えばベンジルおよびベンツヒドリルエステル、ｐ−ニト
ロベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、
フタールイミドメチルエステル、ｔ−ブチルエステル、
シクロペンチルエステル、メチルチオエチルエステル、
トリメチルシリル基、およびヒドラジドを包含する。特
定基の選択はアミノ保護基の選択に対して先に述べたよ
うな変化に依存する。通常使用されるカルボキシル保護
基はメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルおよびベン
ジルである。
ルエステル、フェニル−置換低級アルキルエステル、例
えばベンジルおよびベンツヒドリルエステル、ｐ−ニト
ロベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、
フタールイミドメチルエステル、ｔ−ブチルエステル、
シクロペンチルエステル、メチルチオエチルエステル、
トリメチルシリル基、およびヒドラジドを包含する。特
定基の選択はアミノ保護基の選択に対して先に述べたよ
うな変化に依存する。通常使用されるカルボキシル保護
基はメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルおよびベン
ジルである。
−OHおよびグアニジノ基のような他の作用基は所望に
より公知の方法で保護することができる。
より公知の方法で保護することができる。
記載したＳ−蛋白質誘導体の合成は上記セラ等に記載
したようにまたは所望の出発点に近いDNAの分割のため
に適当な制限位置を使用しそしてT4ポリメラーゼを使用
する短い末端セグメントを選択的に除去する実施例１〜
６に記載した組換えDNA技術の変形によって達成され
る。限定エンドヌクレアーゼ分割が希望するよりも短い
生成物を生じる場合には希望したデオキシヌクレオチド
配列を化学合成によって提供することができる（例えば
ゴエデル,D.等ネイチュア第281巻，第554頁（1979年）
参照）。本願発明は、DNA運搬仲介物により形質転換さ
れた微生物をそのエンコード配列を発現せしめるに適し
た条件で培養して抗原性蛋白質を産生せしめ、培養物か
ら前記抗原性蛋白質を回収することから成る抗原性蛋白
質の製法であって、前記DNA運搬仲介物が式Ｘ−Ｓ［式
中、Ｓは肝炎Ｂ表面抗原である］で表わされる抗原性蛋
白質をエンコードするヌクレオチド配列から成り、前記
ヌクレオチド配列は肝炎Ｂ核抗原をエンコードするヌク
レオチド配列を実質的に含まず、前記エンコードヌクレ
オチド配列はその発現実現に好適な追加のヌクレオチド
配列の制御下にあり、且つＸが からなるアミノ酸配列のＣ末端部であることを特徴とす
る製法に関する。
したようにまたは所望の出発点に近いDNAの分割のため
に適当な制限位置を使用しそしてT4ポリメラーゼを使用
する短い末端セグメントを選択的に除去する実施例１〜
６に記載した組換えDNA技術の変形によって達成され
る。限定エンドヌクレアーゼ分割が希望するよりも短い
生成物を生じる場合には希望したデオキシヌクレオチド
配列を化学合成によって提供することができる（例えば
ゴエデル,D.等ネイチュア第281巻，第554頁（1979年）
参照）。本願発明は、DNA運搬仲介物により形質転換さ
れた微生物をそのエンコード配列を発現せしめるに適し
た条件で培養して抗原性蛋白質を産生せしめ、培養物か
ら前記抗原性蛋白質を回収することから成る抗原性蛋白
質の製法であって、前記DNA運搬仲介物が式Ｘ−Ｓ［式
中、Ｓは肝炎Ｂ表面抗原である］で表わされる抗原性蛋
白質をエンコードするヌクレオチド配列から成り、前記
ヌクレオチド配列は肝炎Ｂ核抗原をエンコードするヌク
レオチド配列を実質的に含まず、前記エンコードヌクレ
オチド配列はその発現実現に好適な追加のヌクレオチド
配列の制御下にあり、且つＸが からなるアミノ酸配列のＣ末端部であることを特徴とす
る製法に関する。
さらにＳ−蛋白質のグリコシル化誘導体は抗原性であ
り抗体の生産に有用である。予期されるグリコシル化の
位置は−Asn−Ｍ−（Ser）または（Thr）−（Ｍはあら
ゆるアミノ酸である）配列中のアスパラギン残渣であ
る。Ｓ−蛋白質のアミノ酸位置3,59および146における
三つの位置がある。さらに有用なＳ−ペプチド誘導体を
与える性質上コードされた配列内に二つの位置があり、
それによって同様にグリコシル化誘導体として提供す
る。
り抗体の生産に有用である。予期されるグリコシル化の
位置は−Asn−Ｍ−（Ser）または（Thr）−（Ｍはあら
ゆるアミノ酸である）配列中のアスパラギン残渣であ
る。Ｓ−蛋白質のアミノ酸位置3,59および146における
三つの位置がある。さらに有用なＳ−ペプチド誘導体を
与える性質上コードされた配列内に二つの位置があり、
それによって同様にグリコシル化誘導体として提供す
る。
実施例 ７ Ｓ−蛋白質の試験管内合成 Ｓ−蛋白質コード領域の標示を上記ツバイ,G.によっ
て記載されたDNA−指向蛋白質合成系を使用して試験管
内で実施する。合成において使用したDNAはＳ−蛋白質
の標示のために実施例６で記載した組換えプラスミドpt
rpE30/HBsAgまたは変性した組換えプラスミドである。
さらにＳ−蛋白質コード領域を包含するTacI断片のよう
なHBV−DNAの限定エンドヌクレアーゼカット断片をツバ
イ系で使用することができる。系において提供されるア
ミノ酸の一種またはそれ以上を生成物蛋白質に対する感
受性検出に可能にするために放射性で標示する。Ｓ−蛋
白質の合成を先に記載した検出系のいずれかで抗−HBsA
g抗体または抗−Ｓ−蛋白質抗体への放射性で標示した
物質の結合によって検出する。
て記載されたDNA−指向蛋白質合成系を使用して試験管
内で実施する。合成において使用したDNAはＳ−蛋白質
の標示のために実施例６で記載した組換えプラスミドpt
rpE30/HBsAgまたは変性した組換えプラスミドである。
さらにＳ−蛋白質コード領域を包含するTacI断片のよう
なHBV−DNAの限定エンドヌクレアーゼカット断片をツバ
イ系で使用することができる。系において提供されるア
ミノ酸の一種またはそれ以上を生成物蛋白質に対する感
受性検出に可能にするために放射性で標示する。Ｓ−蛋
白質の合成を先に記載した検出系のいずれかで抗−HBsA
g抗体または抗−Ｓ−蛋白質抗体への放射性で標示した
物質の結合によって検出する。
実施例 ８ HBV−DNAおよびその制限断片をバクテリオファージ運
搬仲介物中で分枝した。この目的に対してファージλCh
16Aが適当であるブラットナーF.R.等サイエンス，第196
巻，第161頁（1977年）。ファージはlac5置換に位置し
た一つのEcoRI位置を包含する。lac5領域への挿入は有
用な選択技術を提供する。色素生成基質５−クロロ−４
−ブロモ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトサイド
（XG）を平板培養培地で培養する場合、λCh16Aは鮮明
な青い斑点を示し一方EcoRI位置で挿入物を運ぶλCh16A
はLac−細菌宿主上で平板培養する場合無色の反転を示
す。なおさらにEcoRI位置はβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子のＮ−末端部分を運ぶ融合蛋白質としてコード領域の
標示に適した作用オペレーター提供領域に近い挿入座位
を提供する。
搬仲介物中で分枝した。この目的に対してファージλCh
16Aが適当であるブラットナーF.R.等サイエンス，第196
巻，第161頁（1977年）。ファージはlac5置換に位置し
た一つのEcoRI位置を包含する。lac5領域への挿入は有
用な選択技術を提供する。色素生成基質５−クロロ−４
−ブロモ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトサイド
（XG）を平板培養培地で培養する場合、λCh16Aは鮮明
な青い斑点を示し一方EcoRI位置で挿入物を運ぶλCh16A
はLac−細菌宿主上で平板培養する場合無色の反転を示
す。なおさらにEcoRI位置はβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子のＮ−末端部分を運ぶ融合蛋白質としてコード領域の
標示に適した作用オペレーター提供領域に近い挿入座位
を提供する。
実施例 ９ 実験動物における抗体生成 実施例５に記載したtrpE−Ｓ蛋白質融合蛋白質および
実施例６に記載したＳ−蛋白質は抗体を誘発する十分な
抗原性である。抗体はHBsAgと交叉反応する。ギネア豚
を9,14および56日間隔で実施例５および６で記載した通
り各々精製した50μgS−蛋白質またはtrpE−Ｓ蛋白質融
合生成物を含有する10mlの生理的食塩またはフォスフェ
ート緩衝食塩で皮下注射する。試験動物の血清が0,28,5
6および84における試料であり感染血清から部分的に精
製したデイン粒子またはHBsAgに対して抗体力価を検定
する。上記ホリングレン,F.等の放射線免疫検定を使用
する。大部分の動物は蛋白質の投与後84日間HBsAgと交
叉反応性抗体を示す。同様の結果をサルの注射で得てい
る。従ってHBVの免疫学的活性蛋白質成分は該蛋白質エ
ンコードDNA運搬仲介物によって移動した微生物によっ
て標示され、ウイルスの免疫学的に活性な成分と交叉反
応する抗体を誘発することができる。
実施例６に記載したＳ−蛋白質は抗体を誘発する十分な
抗原性である。抗体はHBsAgと交叉反応する。ギネア豚
を9,14および56日間隔で実施例５および６で記載した通
り各々精製した50μgS−蛋白質またはtrpE−Ｓ蛋白質融
合生成物を含有する10mlの生理的食塩またはフォスフェ
ート緩衝食塩で皮下注射する。試験動物の血清が0,28,5
6および84における試料であり感染血清から部分的に精
製したデイン粒子またはHBsAgに対して抗体力価を検定
する。上記ホリングレン,F.等の放射線免疫検定を使用
する。大部分の動物は蛋白質の投与後84日間HBsAgと交
叉反応性抗体を示す。同様の結果をサルの注射で得てい
る。従ってHBVの免疫学的活性蛋白質成分は該蛋白質エ
ンコードDNA運搬仲介物によって移動した微生物によっ
て標示され、ウイルスの免疫学的に活性な成分と交叉反
応する抗体を誘発することができる。
記載した蛋白質はデイン粒子または保菌者の血清から
得られたHBsAgより重要にも大量に利用できる利点を有
する。さらにその上、trpE−Ｓ蛋白質標示生成物または
Ｓ−蛋白質に完全なウイルスがないので偶然的な感染の
危険がない。対照により血清から精製したウイルス性蛋
白質はウイルス性感染の危険を常につくっている。
得られたHBsAgより重要にも大量に利用できる利点を有
する。さらにその上、trpE−Ｓ蛋白質標示生成物または
Ｓ−蛋白質に完全なウイルスがないので偶然的な感染の
危険がない。対照により血清から精製したウイルス性蛋
白質はウイルス性感染の危険を常につくっている。
実施例 10 実施例９に示した通り、HBVのゲノムによってコード
されそして微生物によって合成された蛋白質は該HBVの
免疫学的反応成分と交叉反応する抗体を誘発することが
できる。さらにまた蛋白質を合成したかかる微生物の誘
導体および融合蛋白質生成物は抗原性でありHBVの免疫
学的反応成分と交叉反応する抗体を誘発することができ
る。それ故記載した通り精製しそして生理的に使用し得
る媒質中で投与される場合、かかる蛋白質および蛋白質
誘導体がウイルスによる感染に対して保護するワクチン
となることは理解される。
されそして微生物によって合成された蛋白質は該HBVの
免疫学的反応成分と交叉反応する抗体を誘発することが
できる。さらにまた蛋白質を合成したかかる微生物の誘
導体および融合蛋白質生成物は抗原性でありHBVの免疫
学的反応成分と交叉反応する抗体を誘発することができ
る。それ故記載した通り精製しそして生理的に使用し得
る媒質中で投与される場合、かかる蛋白質および蛋白質
誘導体がウイルスによる感染に対して保護するワクチン
となることは理解される。
16匹のチンパンジーを三つのグループに分けた。グル
ープＡ（６匹の動物）をB.O.B.肝炎Ｂウイルス1.0mlで
静脈内に接種した。グループＢ（４匹の動物）を生理的
食塩水中実施例５に記載した通り合成および精製したtr
pE−Ｓ蛋白質融合蛋白質5mgを含有する1.0mlで静脈内に
接種した。グループＣ（６匹の動物）はコントロールグ
ループであり接種を受けない。グループＡのチンパンジ
ーは40週以内に臨床に肝炎Ｂ（アンチゲネミア、酵素高
位および／または抗体応答）であることは明白である。
グループＢまたはＣの動物はいずれも同様に40週間にわ
たって臨床上肝炎Ｂを示さなかった。グループＢのチン
パンジーをB.O.B.肝炎Ｂウイルス1.0mlで静脈内に接種
した場合、次の攻撃に対して免疫する。
ープＡ（６匹の動物）をB.O.B.肝炎Ｂウイルス1.0mlで
静脈内に接種した。グループＢ（４匹の動物）を生理的
食塩水中実施例５に記載した通り合成および精製したtr
pE−Ｓ蛋白質融合蛋白質5mgを含有する1.0mlで静脈内に
接種した。グループＣ（６匹の動物）はコントロールグ
ループであり接種を受けない。グループＡのチンパンジ
ーは40週以内に臨床に肝炎Ｂ（アンチゲネミア、酵素高
位および／または抗体応答）であることは明白である。
グループＢまたはＣの動物はいずれも同様に40週間にわ
たって臨床上肝炎Ｂを示さなかった。グループＢのチン
パンジーをB.O.B.肝炎Ｂウイルス1.0mlで静脈内に接種
した場合、次の攻撃に対して免疫する。
実施例６で記載したＳ−蛋白質またはその誘導体を同
様の方法で使用することができ所望の免疫学的応答を与
える。
様の方法で使用することができ所望の免疫学的応答を与
える。
本発明はその特定の態様と関連して記載される一方さ
らに変更することができるそして本出願は本発明のいか
なる変化、用途または適用をも包含しようとするもので
あり、一般に本発明の原理に従い、そして本発明が係る
技術内で公知または慣例的な実施例に入るようなそして
上文に説明した本質的な特徴に適用できるようなそして
特許請求の範囲に従うような本発明の説明から離脱を包
含することは理解される。
らに変更することができるそして本出願は本発明のいか
なる変化、用途または適用をも包含しようとするもので
あり、一般に本発明の原理に従い、そして本発明が係る
技術内で公知または慣例的な実施例に入るようなそして
上文に説明した本質的な特徴に適用できるようなそして
特許請求の範囲に従うような本発明の説明から離脱を包
含することは理解される。
表 ２ HBV−DNAの塩基配列および翻訳。
第４図において出発点０を示す。
Ｍ−メチオニン出発シグナル ・−終末コドン Ａ＝Ａ蛋白質 Ｂ＝Ｂ蛋白質 Ｃ＝核抗原 Ｄ＝Ｄ蛋白質 Ｓ＝Ｓ蛋白質
第１図はPECO63DNAの制限地図（PBR325/デイン）を示
す。 第2A図は交雑（hybridization）の前のDNAのゲル電気泳
動パターンを示すＸ線写真である。 第2B図は32 P−HBV−DNAで交雑のニロセルロースフィル
ターのオートラジオグラフＸ線写真である。 第2C図はプローブとして別個に調製した32 P−標識デイ
ン粒子DNA試料を使用する独立した実験結果を示すＸ線
写真である。 第3A図は螢光染色によって可視化されたゲル電気泳動結
果を示すＸ線写真である。 第3B図は各々のゲル中でRNAに交雑できるPECO63,107cpm
/μｇから32 P−HBV−DNAのオートラジオグラフを示すＸ
線写真である。 第４図はｓ蛋白質コード流域の地図位置を示す。 第５図はオートラジオグラフによって可視化された蛋白
質バンドを示すＸ線写真である。
す。 第2A図は交雑（hybridization）の前のDNAのゲル電気泳
動パターンを示すＸ線写真である。 第2B図は32 P−HBV−DNAで交雑のニロセルロースフィル
ターのオートラジオグラフＸ線写真である。 第2C図はプローブとして別個に調製した32 P−標識デイ
ン粒子DNA試料を使用する独立した実験結果を示すＸ線
写真である。 第3A図は螢光染色によって可視化されたゲル電気泳動結
果を示すＸ線写真である。 第3B図は各々のゲル中でRNAに交雑できるPECO63,107cpm
/μｇから32 P−HBV−DNAのオートラジオグラフを示すＸ
線写真である。 第４図はｓ蛋白質コード流域の地図位置を示す。 第５図はオートラジオグラフによって可視化された蛋白
質バンドを示すＸ線写真である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−104887（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．280，（30. Ａｕｇｕｓｔ 1979）Ｐ．815−819
Claims (1)
- 【請求項１】DNA運搬仲介物により形質転換された微生
物をそのエンコード配列を発現せしめるに適した条件で
培養して抗原性蛋白質を産生せしめ、培養物から前記抗
原性蛋白質を回収することから成る抗原性蛋白質の製法
であって、前記DNA運搬仲介物が式Ｘ−Ｓ［式中、Ｓは
肝炎Ｂ表面抗原である］で表わされる抗原性蛋白質をエ
ンコードするヌクレオチド配列から成り、前記ヌクレオ
チド配列は肝炎Ｂ核抗原をエンコードするヌクレオチド
配列を実質的に含まず、前記エンコードヌクレオチド配
列はその発現発現に好適な追加のヌクレオチド配列の制
御下にあり、且つＸが からなるアミノ酸配列であることを特徴とする製法。
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