JP2014036667A - ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物 - Google Patents

ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】哺乳細胞に存在する特定の標的ポリヌクレオチド配列に対して阻害的効果を有するポリヌクレオチド組成物に対する要求がある。
【解決手段】本発明は、少なくとも１つの標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列と実質的に相同かつ相補的である、２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列を含む、複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子を用いることで上述した課題を解決するものである。
【選択図】 なし

Description

本発明は、哺乳類細胞に存在する特定の標的ポリヌクレオチド配列の機能に対する阻害的または他の制御的効果を有するポリヌクレオチド組成物、および治療、予防、診断および研究方法においてその組成物を使用する方法に関する。
ポリヌクレオチド組成物は、主に哺乳類の疾病の治療または予防用の、ならびにかかる分野における研究用の医薬的使用のために記載されている。特に、現在、ウイルス、細菌、真菌感染などの病原性細胞外および細胞内感染の治療におけるポリヌクレオチド組成物の使用の周りに多くの活動範囲がある。一例として、ＤＮＡワクチンは、哺乳類免疫系を利用することによって病原体と闘う薬剤をインビボで哺乳類細胞に送達すると記載されている。従ってかかるワクチンは、例えばウイルスタンパク質またはポリペプチドを発現し、かつ感染剤による攻撃に対する体液性または細胞性免疫応答を誘発するように設計されている。他方で、遺伝子治療ベクターは、一般に、哺乳類において発現されないか、不適当に発現されるか、あるいは低発現であるかのいずれかであるタンパク質を哺乳細胞に送達するように設計されているポリヌクレオチド組成物である。かかるベクターは、抗原と認識され、あるいは、好ましくない細胞性免疫応答を誘導するこれらポリヌクレオチド配列に対する種特異的免疫応答と取り組まねばならないことが多い。
さらに、ポリヌクレオチド組成物の他の治療的使用は、疾病を有する哺乳類患者に、失われた、あるいは低発現のタンパク質を送達するためである。さらに、ポリヌクレオチドは、インビボ試薬、遺伝子治療における試薬としての診断的／画像的プロトコル、アンチセンスプロトコルおよびワクチン応用としてまたはさもなければ、遺伝的欠損、感染症疾疾病、および自己免疫疾患のごとき種々の病気を治療または予防するのに使用される医薬品として有用である。ポリヌクレオチドはまた、生物学的研究アッセイ、医学的、診断的およびスクリーニングアッセイおよび汚染検出アッセイなどのアッセイのインビトロ試薬として有用である。
当該分野で周知の問題の宿主は、有用な医薬品として広く受け入れられるようになってきた多数のポリヌクレオチド組成物を妨害してきた。従って、哺乳類における疾患の治療のために医学界ですでに受け入れられているかかるＤＮＡワクチンまたは治療剤はあまりない。
ポリヌクレオチド組成物によって媒介される現象は、植物および線虫で観察されており、転写後遺伝子サイレンシングおよび転写サイレンシングと言われる。この現象は、細胞内ですでに発現されているプロモーターまたは本来の遺伝子またはその一部のごとき制御要素といくらかの相同性を有するポリヌクレオチド配列を発現するウイルス、ウイロイド、プラスミドまたはＲＮＡによる植物、線虫またはショウジョウバエのトランスフェクションまたは感染が内因性制御要素または遺伝子および外因性配列の両者の発現の永久的阻害を結果として生じ得ることを示す。このサイレンシング効果は遺伝子特異的と示されていた。例えば、L.TimmonsおよびA.Fire、Nature, ３９５：３５４（１９９８年１０月２９日；非特許文献１）；A.Fireら、Nature, ３９１：８０６−８１０（１９９８年２月１９日；非特許文献２）；およびR.Jorgensenら、Science, ２７９：１４８６−１４８７（１９９８年３月６日；非特許文献３）を参照されたい。全長、プロ−アルファ１コラーゲン遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドが一時的にげっ歯類の繊維芽細胞組織細胞系にトランスフェクトされ、本来のコラーゲン遺伝子に対する「サイレンシング」効果および一時的発現の遺伝子が観察された。［BahramianおよびZarbl, Mol. Cell Bili., １９（１）：２７４−２８３（１９９９年１月；非特許文献４）］。
また、二次構造のアンチセンスＲＮＡおよび／または二本鎖のＲＮＡ分解酵素と組み合わせて使用することによる遺伝子阻害に関する１９９８年２月１２日発行の国際出願ＷＯ９８／０５７７０（特許文献１）を参照されたい。１９９９年１０月２１日発行の国際出願ＷＯ９９／５３０５０（特許文献２）は、特に植物細胞においてセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子をコードするキメラ遺伝子の導入による核酸の表現型発現の減少に関する。
国際公開第９８／０５７７０号 国際公開第９９／５３０５０号
L.TimmonsおよびA.Fire、Nature, ３９５：３５４（１９９８年１０月２９日） A.Fireら、Nature, ３９１：８０６−８１０（１９９８年２月１９日） R.Jorgensenら、Science, ２７９：１４８６−１４８７（１９９８年３月６日） BahramianおよびZarbl, Mol. Cell Bili., １９（１）：２７４−２８３（１９９９年１月）
哺乳類における不可欠な遺伝子配列に悪影響を及ぼすことなく、哺乳細胞にウイルスおよび他の細胞内病原体の複製に必須のポリヌクレオチド配列または細胞外哺乳類病原体の配列または、哺乳類において癌の広がりを媒介する腫瘍抗原の配列などのごとき哺乳類に疾患を引き起こすポリヌクレオチド組成物およびその物を用いてポリヌクレオチド配列の機能を阻害する方法に対する要求がある。
一の態様において、本発明は、哺乳類細胞において標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための組成物を提供する。組成物は、少なくとも長さ約２００ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含む少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子を哺乳細胞へ提供する物質（agent）を含む。ポリヌクレオチド配列は、実質的には標的ポリヌクレオチド配列と相同であり、例えば、ウイルスまたは他の細胞内病原体のポリヌクレオチド配列、癌抗原または必須の発癌性調節配列のポリヌクレオチド配列、哺乳類に存在する細胞外病原体のポリヌクレオチド配列または細胞内で「スイッチがオフである」ことが望ましい他のポリヌクレオチド配列であり得る。このＲＮＡ分子は、好ましくは、機能タンパク質を生産しない。このＲＮＡ分子は、好ましくは、実質的には天然に存する必須の哺乳類ポリヌクレオチド配列と相同ではない。一の具体例において、この組成物の物質は、インビトロで、酵素合成法または化学合成法によって作成されるＲＮＡ分子である。もう１つ別の具体例において、ＲＮＡ分子は、組換え培養基、例えばそれより単離される細菌細胞から生成され、下記の方法で使用される。もう１つの具体例において、この組成物の物質は哺乳類細胞へ送達後のインビボのＲＮＡ分子を生成する。
もう１つの態様において、本発明は、医薬上許容される担体中、１つ以上の直前、かつ以下詳細に記載した組成物および細胞内のポリヌクレオチド取り込みを促進する任意の第二物質を含む医薬組成物を提供する。かかる組成物は、ウイルスのごとき細胞内病原体感染を治療するのに有用である。他のかかる組成物は、ある癌の治療に有用である。他のかかる組成物は、ある細胞外病原体の治療に有用である。さらに他のかかる組成物は、哺乳類でポリヌクレオチド配列の機能を阻害することが治療またはワクチンの使用に望ましいといういずれの疾患または疾病の治療に有用である。
さらなるもう１つの態様において、本発明は、標的ポリヌクレオチドが、感染した哺乳類細胞内でのウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルスポリヌクレオチド配列である１つ以上の前記記載の組成物を、医薬上許容される担体中、細胞内のポリヌクレオチド取り込みを促進させる所望の第二物質と共に哺乳類に投与することによって哺乳類のウイルス感染を治療する方法を提供する。本組成物は、哺乳類細胞内でウイルス配列の機能を減少させるかあるいは阻害するのに有効な量で投与される。
さらにさらなる態様において、本発明は、標的ポリヌクレオチドが感染哺乳類細胞内でウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルスポリヌクレオチド配列である、１つ以上の前記記載の組成物を、医薬上許容される担体中、細胞内のポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に哺乳類に投与することによって、哺乳類のウイルス感染を予防する方法を提供する。本組成物は、その後のウイルスの哺乳類細胞への導入におけるウイルス配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与される。
さらにもう１つの態様において、本発明は、標的ポリヌクレオチドが、配列機能が哺乳類の腫瘍の維持に必要である腫瘍抗原またはその機能的フラグメントまたは制御配列をコードする配列である、１つ以上の前記記載の組成物を哺乳類に投与することによって、哺乳類のウイルス誘発癌の治療または予防の方法を提供する。本組成物は、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質および医薬上許容される担体を含んでよい。本組成物は、哺乳類において腫瘍−維持配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与される。
もう１つの態様において、本発明は、細胞内病原体による哺乳類の感染の治療または予防方法を提供する。哺乳類には、標的ポリヌクレオチドが、感染哺乳類細胞内で病原体の複製および／または発生病理に必要な細胞内病原体のポリヌクレオチド配列である、１つ以上の本明細書中に記載の組成物を投与する。本組成物は、哺乳類において配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、医薬上許容される担体中、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に投与される。
もう１つの態様において、本発明は、細胞外哺乳類病原体による哺乳類の感染の治療または予防のための方法を提供する。哺乳類に、標的ポリヌクレオチドが、感染哺乳類内で病原体の複製および／または発生病理に必要な細胞外病原体のポリヌクレオチド配列である、１つ以上の本明細書中に記載の組成物を投与する。本組成物は、医薬上許容される担体上、哺乳類において配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与される。病原体細胞によってポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に投与されてもよい。
さらにもう一つの態様において、本発明は哺乳類の癌の治療または予防方法を提供する。哺乳類に、標的ポリヌクレオチドが、また遺伝子または制御配列の正常なコピーを有する、哺乳類における異常な癌を引き起こす遺伝子または非−発現制御配列である１つ以上の前記記載の組成物を投与する。この態様によれば、異常な配列および正常な配列間の差異はポリヌクレオチドの差異である。本組成物は、哺乳類において異常な配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、医薬上許容される担体中、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に投与される。
さらに、さらなる態様において本発明は、健常な哺乳類には見られないポリヌクレオチド産物の発現によって特徴付けられる疾患または疾病を有する哺乳類に、標的ポリヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド産物または該産物の発現に必須の非−発現制御配列を発現するポリヌクレオチド配列である１つ以上の前記記載の組成物を投与することを含む、哺乳類における疾患または疾病の治療方法に関わる。本組成物は、哺乳類細胞において標的ポリヌクレオチド産物または制御配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、医薬上許容される担体中、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共にまたはなしで投与される。
本発明のさらにもう１つの態様は、診断または他の研究アッセイにおける使用のためインビトロで、または治療または他の医学的使用のための哺乳類へのリターンのためエキソ・ビボで哺乳類細胞または組織における望ましくない遺伝子発現を減少あるいは阻害する試薬のような研究方法における使用のためにかかる組成物を提供する。
本発明の他の態様は、以下のその好ましい具体例の詳細な記載に記載される。
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター−前方ｇａｇプライマー（Ｔ７Ｆ）および逆転ｇａｇ（Ｒ）プライマーを用いて生じたＰＣＲ産物を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるこのＰＣＲテンプレートからの転写によりＲＮＡ配列ｇａｇセンス螺旋が得られる。 前方ｇａｇプライマー（Ｆ）およびＴ７プロモーター逆転ｇａｇ（Ｔ７Ｒ）プライマーを用いて生じたＰＣＲ産物を示す。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるこのテンプレートの転写により、ＲＮＡ配列ｇａｇアンチセンス螺旋が得られる。図１Ａのテンプレートおよび図１Ｂのテンプレートの両者を使用することで、二重螺旋ｇａｇＲＮＡ配列が得られる。
本発明は、目標が選択される標的ポリヌクレオチド配列の機能を減少あるいは阻害することである哺乳類種を苦しめる疾患および疾病における治療、予防、研究および診断のための新規ポリヌクレオチド組成物および方法を提供する。これら組成物および方法は、インビトロおよびインビボの両者で有用性を有する。これら組成物および方法は、さらに、細胞の分子機構の利用に関わる哺乳類の免疫系の促進の必要なくして治療目標を達成させる。
本明細書中に使用されるように、「標的」または「標的ポリヌクレオチド配列」なる語は、ポリヌクレオチド配列が減少あるいは阻害されることが望まれる機能を有する、細胞内または細胞外病原性感染または疾患により存在する、天然に存在して欠損の可能性のある哺乳類ポリヌクレオチド配列または異種の配列のいずれかで、哺乳類細胞または哺乳類生物内にあるいずれの配列もいう。この標的配列は、コード配列であってもよく、すなわち、翻訳されてタンパク質またはその機能的フラグメントを発現する。あるいは、標的配列は非−コードでもあってもよいが、制御機能を有し得る。ある標的ポリヌクレオチド配列は感染哺乳類細胞におけるウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルスポリヌクレオチド配列である。もう１つの標的ポリヌクレオチド配列の具体例は、配列が哺乳類において腫瘍の維持に必要であるウイルス−誘発癌の腫瘍抗原またはその機能的フラグメントまたは非−発現制御配列である。標的ポリヌクレオチド配列のさらにもう１つの具体例は、感染哺乳類における病原体の複製および／または発生病理に必要な細胞内または細胞外病原体のポリヌクレオチド配列である。標的ポリヌクレオチド配列のさらにもう１つの具体例は、遺伝子または配列の正常なコピーを有する哺乳類における異常な癌を引き起こす遺伝子（または非−発現制御配列）のポリヌクレオチド配列である。異常配列および正常配列間の差異はポリヌクレオチド配列レベルでの差異である。かかる異常配列は例えば、２つの正常遺伝子の融合体であってもよく、標的配列は、融合体をスパンする配列、例えば、ある白血病に特徴的なＢＣＲ−ａｂｌ遺伝子配列であってもよい。「遺伝子」なる語は、プロモーターのごとき制御配列を含む、転写かつ／あるいは翻訳されてもされなくても、「サイレンシング」されると意図されるいずれの標的配列をも含むと意図される。「哺乳類」または「哺乳動物」なる語は、その通常の意味を含むと意図される。本発明は、もっとも望ましくは、ヒトにおける効力を意図する一方、また、イヌ、ネコおよびウマならびに例えば、動物園の動物、農場などの特に問題の哺乳類のごとき家畜動物に用いることもできる。
Ａ．本発明の組成物
本発明によって、哺乳類細胞の標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害する組成物は、少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子を哺乳類細胞に供する物質を含む。一般に、「ＲＮＡ」なる語はまた、他に記載がなければ、例えば、リボースの２'−OH基が独特の結合に必要であるといったＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドも含む。ＲＮＡ分子は分子中に少なくとも長さ約２００ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含む。重要なことには、ＲＮＡ分子のこのポリヌクレオチド配列は、実質的に標的ポリヌクレオチド配列と相同である。このポリヌクレオチド配列はまた、好ましくは、エクソン配列またはその部分を含む。望ましくは、ポリヌクレオチド配列はイントロン配列を含まない。好ましくは、ＲＮＡ分子は機能タンパク質を産生せず、より好ましくは、翻訳されない。ＲＮＡ分子のポリヌクレオチド配列は、好ましくは実質的に、いずれの天然に存在し、正常に機能し、必須の哺乳類ポリヌクレオチド配列とも非−相同である。本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列は、複数標的またはポリエピトープ方法、例えば、単一の標的病原体の、１つ以上の標的病原体に対する、またはサイレンシングしようと望まれる他の種類の標的の１つ以上の遺伝子の配列をコードすることを使用する。
「少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子」なる語は、長さ約１００ないし１０,０００間のポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む。現在、もっとも望ましくは、配列は少なくとも長さ２００ヌクレオチドであるが、ある具体例では、長さ２００ないし８０００ポリヌクレオチドの範囲であってよい。もう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は、長さ７５００ポリヌクレオチドより短くてよい。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は約５０００ポリヌクレオチドより短い配列を有してもよい。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は、約２０００ポリヌクレオチドより短い配列を有してもよい。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は、約１０００ポリヌクレオチドより短い配列を有してもよい。さらにもう１つの具体例では、ＲＮＡ分子は約７５０ポリヌクレオチドより短い配列を有してもよい。
最低限、ＲＮＡ分子を安定に保つために、ポリヌクレオチド配列の組成お物よびΔＧ約−９.２kcal／molに依存して、二本鎖配列に関わる最小１１ないし３０のヌクレオチドを有する。当該分野では公知のごとく、ΔＧは分子の立体配置を安定に保つのに必要な最小外部エネルギーの状態を規定する［例えば、Jaegerら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ２０：７７０６−７７１０（１９８９）およびSolerおよびJankowski, Math. Biosci., ２：１６７−１９０（１９９１）を参照］。この最小限度に基づいて、この一部は二本鎖のＲＮＡ分子配列の少なくとも１０％は二本鎖である。あるいは、これらＲＮＡ分子の二本鎖部分は配列の少なくとも３０％であってよい。もう１つの具体例において、これら分子の二本鎖部分は配列の少なくとも５０％であってよい。さらにもう１つの具体例において、これら分子の二本鎖部分は配列の少なくとも７０％であってよい。さらにもう１つの具体例において、これら分子の二本鎖部分は配列の少なくとも９０％であってよい。もう１つの具体例において、配列全体が二本鎖であってよい。あるいは、これら分子の二本鎖部分は、分子が直鎖である場合には、配列の末端のいずれかまたは両端、または中間部分で存在してもよい。同様に、分子が環状である場合は、二本鎖部分はいずれの位置で存在してもよい。本発明のある具体例において、分子が哺乳類細胞内にある場合にのみＲＮＡ分子の二本鎖部分は二本鎖になる。本発明のさらに他の具体例において、部分的二本鎖分子はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、例えば、インビトロで調製されるＲＮＡおよびＤＮＡを含む単鎖または、２つのかかる単鎖の二重螺旋またはその一部である。さらにもう１つの具体例において、インビボまたはインビトロで作成されたＲＮＡ分子はＲＮＡ単鎖およびＤＮＡ単鎖を含む二重螺旋である。
部分的二本鎖のＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列は、その機能を有効に減少あるいは阻害するために、実質的に標的ポリヌクレオチド配列と相同でなくてはならない。必要な相同性は適当にはコンピューターアルゴリズムの使用によって規定されてよい。当該分野では公知の、「相同性」または「同一性」は、かかる配列の２つの長さ間の合致の同一性によって規定されるごとく、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を意味する。同一性および相同性の両者は、先の技術に残る方法によって容易に算出できる［例えば、COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M.編, Oxford, University Press, New York,（１９８８）；BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.,ed., Academic Press, New York（１９９３）；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,PART１, Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press, New Jersey, （１９９４）；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G.,Academic Press,（１９８７）およびSEQUENCEANALYSIS PRIMER Gribskov, M.およびDevereux,J.編、M Stochton Press, New York,（１９９１）を参照］。２つの配列間の同一性および相同性を測定する多数の方法が存在するが、「同一性」、「類似性」および相同性なる語は当業者には公知である［H.CarilloおよびD,Lipton, SIAM J. Applied Math., ４８：１０７３（１９８８）］。２つの配列間の同一性または相同性を決定するのに通常用いられる方法は、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop編、Academic Press, San Diego, １９９４およびH. CarilloおよびD,Lipton, SIAM J. Applied Math., ４８：１０７３（１９８８）に開示されるものに含まれるがそれに限定されない。同一性または相同性を決定する好ましい方法は、試験される２つの配列間の最大合致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラム中にコーディングされている。２つの配列間の同一性および相同性を決定する好ましいコンピュータープログラムは、ＧＣＧコンピューターパッケージのアルゴリズムBESTFIT［J. Devereuxら、Nucl. Acid Res., １２（１）：３８７（１９８４）］、関連したMACVECTORプログラム（Oxford）およびFASTA（Pearson）プログラムを含むがそれに限定されない。例えば、重要な天然に存在する哺乳類ポリヌクレオチド配列および標的ポリヌクレオチド配列間のデータベース上の配列類似性の検索は、本発明の使用に望ましい適当なＲＮＡ分子の設計を可能にする。いずれのあるＲＮＡ分子にも必要な相同性のアルゴリズムおよび／または程度は、本発明の方法の使用後正常に機能するままであると望まれるいずれの天然に存在する哺乳類配列に対する標的の同一性および／または標的配列の相同性の近さに依存して当業者によって選択できる。
ある好ましい具体例において、デフォルトのアニーリング温度３７℃でMACVECTORプログラムを用いて、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド区分（領域）を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも３０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも５０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも７０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも９０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。
さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも７０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも９０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド区分（領域）を少なくとも１つ含む。
さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の同様の３０ｎｔｓ領域に対して少なくとも５０％の相同性を有する３０の連続したヌクレオチド領域を少なくとも２つ含む。この式の他の具体例は当業者であれば発展させることができる。
第二の好ましい具体例において、デフォルトアニーリング温度３７℃でMACVECTORプログラムを用いて、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも１０％の全体的相同性を有し、その領域で標的配列の５ｎｔｓ領域に対して絶対相同性を有する５つの連続したヌクレオチド区分（領域）を少なくとも１つ含む。この具体例のもう１つの変形において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも３０％の全体的相同性を有し、標的配列の５ｎｔｓ領域に対して絶対相同性を有する５つの連続したヌクレオチド領域を少なくとも１つ含む。もう１つの具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は望ましくは、標的配列に対し少なくとも５０％の全体的相同性を有し、前記の５ｎｔの絶対相同性領域を含む。この具体例の他の変形は当業者であれば発展させることができる。
前記式中にいわれる領域の存在は、配列の残り部分の全体的相同性が低くてもよい；しかしながら、全体的相同性が低いことは、下記の治療組成物の用量に悪影響を与えるであろうと予想される。ＲＮＡポリヌクレオチド配列中のかかる領域の数の増加は、配列の残り部分の全体的相同性を低くするが、用量には影響しない。
相同性を算出するのに必要な相同性の選択、プログラムのためのデフォルトの選択および用いられるプログラムの選択は、本明細書のおしえ、科学論文中の知識があるとすれば当該分野の範囲内であると理解されるべきである。
ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列もまた、望ましくは実質的にいずれか天然に存在し、正常に機能し、必須な哺乳類ポリヌクレオチド配列と非−相同性であるので、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列は、本発明の方法で使用される場合、いずれの必須の天然に存する哺乳類ポリヌクレオチド配列の機能に悪影響を与えない。かかる天然に存在する機能的哺乳類のポリヌクレオチド配列は、望ましいタンパク質をコードする哺乳類配列ならびにコードされないが、健常な哺乳類で必須の制御配列のために供される哺乳類配列を含む。本質的には、本発明において有用なＲＮＡ分子は、配列において、本発明のいずれの方法でも実行された後に、その機能が乱されないと意図されるいずれの哺乳類ポリヌクレオチド配列と実質的に区別される。前記標的配列への相同性を決定するために記載されたごとく、当業者は、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列および正常な哺乳類配列間の相同の必須の欠失を決定する前記に同定したコンピューター・アルゴリズムに訴えてもよい。従って、ある例示的な具体例において、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび選択される正常配列間の相同性は、前記の式の相同性より少ない。より好ましくは、ＲＮＡポリヌクレオチドおよびいずれの正常哺乳動物配列間に相同性がほとんど全くない。必要な相同性の選択は、本明細書のおしえおよび科学論文中の知識があるとすれば、当業者の範囲内である。
最後に、本発明の組成物のＲＮＡ分子のさらにもう一つの望ましい性質は、それが機能的タンパク質を産生しないか、あるいは翻訳されないということである。ＲＮＡ分子または送達物質は、所望により機能的タンパク質を送らないように、あるいは所望により翻訳に関わる細胞因子と相互作用しないように、種々の公知の方法で作成される。従って、例えば、それが合成ＲＮＡ分子であってもまたはインビボでＲＮＡ分子になる物質であっても、その物質は、ポリアデニル化配列を欠失している。同様に、物質はタンパク質翻訳に必要なコザック（Kozak）領域を欠失してもよい。もう１つの具体例において、ＲＮＡ分子はまた、本来の開始メチオニンコドンを欠失してもよい。さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列はキャップ構造を欠失する。さらにさらなる具体例において、ＲＮＡ分子はタンパク質合成のシグナルを有さない。さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡ分子はコード配列または機能的に実施不可能なコード配列を含まない。さらに、もう１つの具体例において、ＲＮＡ配列はイントロン配列で中断されてもよい。さらにさらなる具体例において、存在すれば、本来の開示コドンの前にヘアピン配列を置いてもよい。さらにもう１つの具体例において、ＲＮＡ分子は前記のごとく、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであってもよい。かかる具体例は全て、例えば、下記に引用するテキストの教示に従って設計できる。
以下は、本明細書中に記載のポリヌクレオチド阻害を達成するために使用される種々の具体例である。下記の種々のＲＮＡ（およびＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）構造は、単一で、あるいは、例えば、ラリアット（lariat）（センスまたはアンチセンス）および／または相補的環状および／または直鎖分子の２つ以上のいずれの組み合わせでも使用できる。アンチセンスラリアットまたは環状構造はまた単独で使用されてもよい。さらに、これら構造は、自己相補的領域（例えば、タンデムセンスおよびアンチセンス配列）ならびに望ましい標的に対する付加的アンチセンス配列を含んでもよい。本明細書中ずっと、「アンチセンス」なる語は、いずれのmＲＮＡと相補的でハイブリダイズできるという意味で使用される。
ある具体例において、「ラリアット」形態のポリヌクレオチドが利用できる。ラリアットは、正常な３'−５'結合に対して２'−５'ホスホジエステル結合を含む。かかる構造は、スプライソゾームおよび自己分解リボゾームによって触媒されるスプライシング反応において形成される。これら構造は、スプライシング反応の中間体または副産物のいずれかである。それらは、細胞内で発現（翻訳）中にインビボで調製でき、あるいはインビトロで調製できる。ラリアット形態は、ループバック（loop back）様式でリボースまたはデオキシリボースのいずれかのフリーの５'ホスホリル基がリボースの２'−OH基と結合するようになる場合に形成する。ラリアットはループ内に１０以上のヌクレオチドを含み、２'−５'である場合には、各々、ループバック結合を有する完全な環状であってもよい。最終ヌクレオチドを結合するラリアットは環状様構造を産生する。ループおよび／またはステムは、単一分子で、タンデムにセンスおよびアンチセンス配列のいずれかを含み、あるいは各単一ラリアットはセンスまたはアンチセンス配列のいずれかを含む。別々の分子にセンスおよびアンチセンスを含むラリアットは、二本鎖形態として一緒に投与されるか、あるいは、アンチセンスラリアットは、単一で使用されて細胞中mＲＮＡと一緒に二本鎖を形成してもよい。ラリアットは、ハイブリッドのＲＮＡ部分の２'−OHを介してなされる２'−５'結合を有するＲＮＡまたはＤＮＡハイブリッドであってもよい。［Rees CおよびSong Q. Nucl. Acid Res. ２７, ２６７２−２６８１（１９９９）;Dame Eら、Biochemistry ３８ ３１５７−３１６７, １９９９；Clement J.Q.ら、ＲＮＡ ５, ２０６−２２０, １９９９；Block TおよびHill J. J. Neurovirol. ３, ３１３−３２１, １９９７;Schindewolf CAおよびDomdey H., Nucl. Acid Res., ２３, １１３３−１１３９（１９９５）］。
もう１つの具体例において、環状ＲＮＡ（または環状ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）は末端の２'−５'または３'−５'結合を生じてもよい。これらは、インビトロで末端を近接に持ってくるスプリンターを用いて、ＲＮＡリガーゼを介してあるいは、（インビボおよびインビトロ）で自己スプライシングリボザイムの使用を介して酵素的に生じる。望ましい阻害は、自己相補性を有するかあるいは有さない単環ならびに二本鎖環状ＲＮＡ（標的ポリヌクレオチドに対してセンスおよびアンチセンス両鎖）または、互いに相補的な領域ならびに標的に相補性を有するものを有する一本鎖ＲＮＡの２環を含む、インビトロで作成されるかあるいは、 インビボで発現される１つ以上のＲＮＡ環を供することによって達成される。
もう１つの具体例は、単一のＲＮＡ（またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）アンチセンス環（標的 mＲＮＡに相補的な自己相補性を有さない環状ＲＮＡ）を利用する。さらにもう１つの具体例は標的mＲＮＡ分子に相補的なＲＮＡ−ＤＮＡ環または環状ＤＮＡ分子を利用する。標的メッセージに対し相補性を有するタンデムのセンスおよびアンチセンス配列（いずれの順でも）を有する単環は標的配列の機能を阻害する組成物として使用できる。ロッド様部分ならびに標的に対する付加的アンチセンス配列を形成できるかかる自己相補的配列を有する環状分子を使用することが好ましい［Schindewolf CAおよびDomdey H. Nucl. Acid Res., ２３, １１３３−１１３９（１９９５）；Ress CおよびSong Q., Nucl. Acid Res., ２７, ２６７２−２６８１（１９９９）；Block TおよびHill J, J. Neurovirol. ３, ３１３−３２１（１９９７）］。
さらに、さらなる具体例において、標的配列を阻害する組成物は、キャッピングされた直鎖ＲＮＡである。ｄｓＲＮＡがインビトロまたはインビボのいずれで形成されてもいずれか一本または両鎖がキャッピングされてよい。通常、細胞質発現がＲＮＡ分子のキャッピングを引き起こす結果となっているであろう場合には、キャッピングはワクシニアキャッピング酵素またはアルファウイルスキャッピング酵素のごときキャッピング酵素の使用を含む種々の手段によって行われる。キャッピングされたアンチセンス分子は、標的遺伝子の望ましい翻訳後サイレンシングを行うために使用される。キャッピングされたＲＮＡは、インビトロまたはインビボで調製できる。通常、ＲＮＡｐｏｌIIによって核で作成されたＲＮＡはキャッピングされている。細胞質で発現されたＲＮＡはキャッピングされてもされてなくてよい。キャッピングは、細胞質ウイルスのキャッピング酵素を発現することによって達成される。両者がキャッピングされている、あるいは１つはキャッピングされもう１つはキャッピングされていない、あるいは両者がキャッピングされていないＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド配列のいずれかが、本組成物中で使用されてよい。キャッピングされたあるいはされていないアンチセンス分子は、単一でまたは本明細書中に記載のポリヌクレオチド構造とのいずれの組み合わせでも使用できる。
本発明によるＲＮＡ分子は、Promega Protocols and Applications Guide, （第３版、１９９６）, Doyle編, ISBN No.１−８８２２７４−５７−１のごとき教科書に記載される慣用法によって、例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いる、慣用的酵素合成法によってインビトロで作成されるＲＮＡ分子としてまたは部分的二本鎖のＲＮＡ配列としてまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドとして、組成物中、哺乳類または哺乳類細胞に存在する細胞外病原体に送達される。
あるいは、これら分子は、インビトロで化学合成法によって作成される［例えば、Q. Xuら、Nucl. Acids Res., ２４（１８）：３６４３−４（１９９６年９月）；N. Naryshkinら、Bioog. Khim., ２２（９）：６９１−８（１９９６年９月）；J. A. Grasbyら、Nucl. Adids Res., ２１（１９）：４４４４−５０（１９９３年９月）；C. Chaixら、Nucl. Acids Res., １７（１８）：７３８１−９３（１９８９）；S.H. Chouら、Biochem, ２８（６）：２４２２−３５（１９８９年３月）；O. Odaiら、Nucl. Acids Symp. Ser.,２１：１０５−６ （１９８９）；N.A. Naryshkinら、Bioog. Khim., ２２（９）：６９１−８（１９９６年９月）；S. Sunら、ＲＮＡ, ３（１１）：１３５２−１３６３（１９９７年１１月）；X. Zhangら、Nucl. Acids Res., ２５（２０）：３９８０−３ （１９９７年１０月）；S. M. Grvaznovら、Nucl. Acids Res., ２６（１８）：４１６０−７（１９９８年９月）；M. Kadokuraら、Nucl. Acids Symp. Ser., ３７：７７−８（１９９７）；A. Davisonら、Biomed. Pept.Proteins, Nucl. Acids, ２（１）：１−６（１９９６）；および A. V. Mudrakovskaiaら、Bioorg. Khim., １７（６）：８１９−２２（１９９１年６月）を参照］。
さらに別法として、本発明のＲＮＡ分子は、例えば、細菌および酵母または、例えば哺乳類細胞の組換え宿主細胞である組換え微生物中で作成でき、その培養液から慣用法によって単離できる。例えば、これら手法を記述する実験室マニュアルの例であるSambrookら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, １９８９に記載された手法および引用文献として本明細書中に引用されている米国特許第５,８２４,５３８；５,８７７,１５９および６５,６４３,７７１号に記載された手法を参照。
インビトロで調製あるいは合成されるかかるＲＮＡ分子は、インビトロで作成されるごとく直接哺乳類細胞または哺乳類に送達される。前記引用文献は、本明細書中に提供されるおしえがあるとすれば、当業者にいずれの以下の明確な具体例を産するのに必要な手法を提供する。従って、ある具体例において、組成物の「物質」は二重螺旋（すなわち、二本鎖から成る）、完全にあるいは部分的二本鎖のＲＮＡのいずれかである。もう１つの具体例において、物質は一本鎖ＲＮＡセンス鎖である。もう１つの具体例において、組成物の物質は、一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖である。好ましくは、一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖は片側の末端または両末端でヘアピンを形成する。望ましくは、一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖は末端環の中間部分でヘアピンを形成する。かかる一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖はまた、インビトロまたはインビボで自身の上で折り返して部分的二本鎖になるように設計できる。組成物中に使用される有効物質としての現存のＲＮＡ分子のさらにもう１つの具体例は、所望により、非−塩基対形成のポリヌクレオチド配列によって分離されたセンスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド配列両者を含む一本鎖ＲＮＡ配列である。好ましくは、この一本鎖ＲＮＡ配列は、いったん細胞中に、あるいはその合成の間インビトロで、二本鎖になる能力を有する。さらに本発明のもう１つの具体例は、前記のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。合成ＲＮＡ分子のさらにもう１つの具体例は、所望により、ロッド構造を形成する［例えば、K−S. Wangら、 Nature, ３２３：５０８−５１４（１９８６）を参照］環状ＲＮＡあるいは部分的二本鎖であり、全て出典明示により本明細書の一部とされるS.Wangら、Nucl. Acids Res., ２２（１２）：２３２６−３３（１９９４年６月）；Y. Matsumotoら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ８７（１９）７６２８−３２ （１９９０年１０月）：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ９１（８）：３１１７−２１（１９９４年４月）；M. Tsagrisら、Nucl. Acids Res., １９（７）：１６０５−１２（１９９１年４月）；S. Braunら、Nucl.
Acids Res., ２４（２１）：４１５２−７（１９９６年１１月）；Z. Pasmanら、 ＲＮＡ, ２（６）：６０３−１０（１９９６年６月）；P. G. Zaphiropoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ９３（１３）：６５３６−４１（１９９６年６月）；D. Beaudryら、Nucl. Acids Res., ２３（１５）：３０６４−６（１９９５年８月）に記載される手法によって調製できる。さらにもう１つの物質は、別々の鎖上に存在するかあるいは、同一の鎖上に散在するＲＮＡおよびＤＮＡを含む二本鎖分子である。
別法として、ＲＮＡ分子は、インビボで形成され、従って、物質を哺乳類細胞または哺乳類に送達後にインビボでかかる部分的二本鎖のＲＮＡ分子を形成する「送達物質」によって送達される。従って、本発明の組成物を形成する物質は、一の具体例において、前記のＲＮＡ分子の１つを「コード」する二本鎖ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ物質は、細胞内で転写され二本鎖ＲＮＡになるヌクレオチド配列を供する。もう１つ別の具体例において、ＤＮＡ配列は、所望により、一端または両端でヘアピンを形成するか、あるいは自身で折り返して部分的二本鎖になる前記の一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖へ、細胞内で転写されるデオキシリボヌクレオチド配列を供する。組成物の送達物質であるＤＮＡ分子は、一本鎖ＲＮＡ配列が二本鎖になる能力を有する、所望により非−塩基対形成のポリヌクレオチド配列によって分離されるセンスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド配列両者を含む一本鎖ＲＮＡ配列を供する。あるいは、送達物質であるＤＮＡ分子は、所望により、インビボでロッド構造または部分的二本鎖を形成する前記の環状ＲＮＡ分子の転写を供する。ＤＮＡ分子はまた、インビボで、前記のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖を含む二重螺旋の産生を供する。これら種々のＤＮＡ分子は前記引用のSambrookに記載されるごとく、あるいは前記引用のPromegaの参考文献のように、慣用法に頼って設計することができる。
哺乳類細胞における上記したＲＮＡ分子の形成を可能にする本発明の送達物質は、ＤＮＡ一本鎖または二本鎖プラスミドまたはベクターであってよい。本明細書中に記載のインビトロまたはインビボでＲＮＡを産生するように設計された発現ベクターは、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐｏｌIIおよびＲＮＡｐｏｌIIIを含むいずれのＲＮＡポリメラーゼの制御下、配列を含んでよい。これらベクターは、本発明によって細胞中の望ましいＲＮＡ分子を転写するのに使用できる。ベクターは、望ましくは、内因性ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ（例えば、その場合、かかるベクターが対応するヒトミトコンドリアプロモーターを利用できるヒトミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ）を利用するように設計される。ミトコンドリアポリメラーゼは、（キャッピング酵素の発現を介して）キャッピングされた、あるいはインビボでキャッピングされていないメッセージを生じさせるために使用される。ＲＮＡｐｏｌI、ＲＮＡｐｏｌIIおよびＲＮＡｐｏｌIII転写物はまた、インビボで生じる。かかるＲＮＡは、キャッピングされていてもされていなくてもよく、所望すれば、細胞質キャッピングは、ワクシニアキャッピング酵素またはアルファウイルスキャッピング酵素のごときキャッピング酵素の使用を含む種々の方法によって達成される。ＤＮＡベクターは、１つのプロモーターまたは組み合わされた複数のプロモーター（同属のポリメラーゼと一緒のミトコンドリアＲＮＡｐｏｌI、ＩＩまたはｐｏｌＩＩＩまたはウイルス、細菌またはバクテリオファージプロモーター）を含むように設計される。好ましくは、プロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩである場合、ＲＮＡ分子をコードする配列は核内の分解を回避するために約３００ｎｔｓより多いオープンリーディングフレームを有する。かかるプラスミドまたはベクターは、細菌、ウイルスまたはファージ由来のプラスミド配列を含んでよい。かかるベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス−由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、およびウイルス由来のベクタープラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素由来のごときその組み合わせ由来のベクター、コスミドおよびファージミドを含む。従って、ある例示的ベクターは、一本鎖または二本鎖のファージベクターである。もう１つの例示的ベクターは、一本または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。かかるベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞へ導入する公知の手法によって細胞内に導入される。ファージおよびウイルスベクターである場合、ベクターはまた、パッケージされるか、あるいはカプシドに包まれたウイルスとして感染および形質導入という公知の手法によって、細胞へ導入され手もよく、好ましいウイルスベクターは、複製能力があるかあるいは、複製能力が欠失していてよい。後者の場合、一般にウイルス増殖は相補する宿主細胞内でのみ起こる。
もう１つの具体例において、送達物質は単一のＤＮＡまたはＲＮＡプラスミドまたはベクターより多くを含む。一例として、第一のＤＮＡプラスミドは前記の一本鎖ＲＮＡセンスポリヌクレオチド配列を供し、第二のＤＮＡプラスミドは前記の一本鎖ＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド配列を供する。ここに、センスおよびアンチセンスＲＮＡ配列は塩基対を形成し二本鎖になる能力を有する。かかるプラスミドは、他の慣用的プラスミド配列、例えば、タンパク質の組換え発現のプラスミドおよびベクターを構築するのに使用される公知の配列のごとき細菌配列を含む。しかしながら、タンパク質発現を可能にする配列、例えば、コザック領域などはこれらプラスミド構造に含まれないことが望ましい。
本発明のｄｓＲＮＡを産生するために設計されるベクターは、望ましくは、標的配列と相同的かつ相補的な多数の異なるｄｓＲＮＡを含み、２つ以上を生じるように設計される。この方法は、単一のベクターが、単一の転写単位から、単一のｄｓＲＮＡ分子よりむしろ多数の独立に作動可能なｄｓＲＮＡを産生する上で望ましく、多数の異なるｄｓＲＮＡを産生することによって、自身が最適な効力を選択できる。自己触媒配列ならびにランダムなかつ／あるいは所定のスプライシング部位を創製する分解配列を含む種々の方法がこのことを達成するために用いられる。
哺乳細胞中の前記の望ましいＲＮＡ分子の形成に必要な情報を供する他の送達物質は、本発明の要求されるＲＮＡ分子に必要な配列を含むように設計される、生存、弱毒化または死滅、不活化組換え細菌を含む。かかる組換え細菌細胞、真菌細胞などは、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５,８２４,５３８; ５,８７７,１５９および６５,６４３,７７１号に記載の慣用法を用いることによって調製できる。これら送達物質を調製する上で有用な微生物は、エシェリキア・コリー（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmolnella typhimurium）および種々のシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびスタフィロコッカス属（Staphylococcus）を含む前記の引用文献に記録されるものを含むが、それに限定されない。
哺乳類細胞中望ましい、前記のＲＮＡ分子の形成に必要な情報を供するさらに他の送達物質は、生存、弱毒化または死滅、不活化ウイルス、および特に、前記の要求されるＲＮＡポリヌクレオチド配列を有する組換えウイルスを含む。かかるウイルスは、遺伝子治療などのために細胞に遺伝子を送達するのに現在使用される組換えウイルスと同様に設計されるが、好ましくは、タンパク質またはタンパク質の機能的フラグメントを発現する能力は有さない。インビボで哺乳類細胞に要求されるＲＮＡ分子を供するのに操作される有用なウイルスまたはウイルス配列の中には、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノアソシエーティッドウイルス、バキュロウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、（ＳＶ４０のごとき）パポバウイルス、ポリオウイルス、シュードラビ−ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、＋鎖および−鎖ＲＮＡウイルス、ウイロイドおよびウイロソイドまたはその一部はあるが、それに限定されない。これら種々のウイルス送達物質は、特に、本発明の教示を有するM.Di Nocolaら、 Cancer Gene Ther., ５（６）：３５０−６ （１９９８）に記載のごとき慣用的法を応用することによって設計される。
哺乳類細胞中、望ましい、前記のＲＮＡ分子の形成に必要な情報を供するもう１つの送達物質は、前記の合成ＲＮＡ分子またはＤＮＡ送達分子または送達組換えウイルスでインビトロでトランスフェクトあるいは感染される、生存弱毒化されるかあるいは死滅された、不活性化供与体細胞を含む。これら供与体はついで、以下に詳細に記載されるごとく哺乳類に投与され、この阻害効果を媒介する哺乳類の機構を促進する。これら供与体は、C１２７、３T３、CHO、HeLa、ヒト腎２９３、BHK細胞系およびＣＯＳ−７細胞のごとき望ましくは哺乳類細胞であり、好ましくは、哺乳類受容体と同一の哺乳類種である。かかる供与体は、例えば、Emerichら、 J. Neurosci. １６：５１６８−８１ （１９９６）に記載のものと同様な技術を用いて作成できる。さらにより好ましくは、供与体細胞は、ある哺乳類から収穫され、D. B. Kohnら、 Nature Med., ４（７）：７７５−８０ （１９９８）に記載されるもののごとき養子転移法に類似したエキソビボ（ex vivo）操作によって供与体細胞へ処理および作成される。供与体細胞はまた、所望すれば、非−哺乳類種由来であってもよい。
最終的に、本発明の組成物はまた、１つ以上の前記の選択物質を含み得る。組成物は、前記の合成ＲＮＡ分子、前記の合成ＤＮＡ送達分子および組換え細菌、細胞およびウイルスのごとき前記の他のいずれの送達物質の混合物も含み得る。組成物混合物の同一性は当業者によって容易に選択される。
Ｂ．本発明の医薬（治療的または予防的）組成物
医薬的使用のための本発明の組成物は、望ましくは前記の合成ＲＮＡ分子または医薬品送達のための付加的な所望の成分と共に医薬上許容される担体中、インビボで哺乳類細胞へそのＲＮＡ分子を供する物質を含む。医薬組成物の具体的処方は、ＲＮＡ分子を送達する物質の形態に依存する。
適当な医薬上許容される担体は、本発明のポリヌクレオチド組成物の投与を促進するが、生理学的に不活性かつ／あるいは無害である。担体は当業者によって選択される。かかる単体は、滅菌生理食塩水、リン酸、緩衝生理食塩水、デキストロース、滅菌水、グリセロール、エタノール、乳糖、シュークロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、カンテン、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油および水、およびその組み合わせを含むがそれに限定されない。さらに、担体または希釈剤は、単独であるいはロウと一緒にグリセロール、モノステアリン酸またはジステアリン酸グリセロールのごとき時間遅延物質を含んでもよい。さらに、徐放性ポリマー処方が使用できる。処方は、送達物質形態ばかりでなく、投与様式にも適さなければならない。投与様式による適当な担体の選択は、当業者によってルーチン的に行われる。
組成物が合成ＲＮＡ分子を含む場合、あるいは前記のＤＮＡ分子、プラスミド、ウイルスベクターまたは組換えウイルスまたはポリヌクレオチドの複数コピーまたは異なるポリヌクレオチドなどのごとき物質が別のポリヌクレオチドである場合に、組成物は望ましくは、担体のみと共に「裸の」ポリヌクレオチドとして処方される。あるいは、かかる組成物は望ましくは、所望のポリヌクレオチド促進剤または局所麻酔剤、ペプチド、陽イオン性脂質を含む脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリジンのごときポリカチオン、デンドリマーのごとき分岐鎖を有する三次元ポリカチオン、炭水化物、陽イオン性両親媒性化合物、界面活性剤、ベンジルアンモニウム界面活性剤または細胞へのポリヌクレオチド転移を促進する他の化合物のような「共同物質」を含む。本発明に有用なかかる促進剤または共同物質の非−限定的な例は、それぞれ、出典明示により本明細書の一部とされる、米国特許第５,５９３,９７２; ５,７０３,０５５;５,７３９,１１８; ５,８３７,５３３号、および１９９６年４月４日発行国際出願ＷＯ９６／１００３８および１９９４年８月８日発行国際出願ＷＯ９４／１６７３７に記載される。
使用される促進剤が、局所麻酔剤、好ましくはブピバカインである場合には、ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づいて約０.１重量パーセントないし１.０重量パーセントの量が好ましい。また、約０.００１−０.０３重量％の量で投与される共同物質としてベンジルアンモニウム界面活性剤を組み込むことを教示する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８４１を参照のこと。その内容を出典明示により本明細書の一部とする。
組成物の送達物質がポリヌクレオチド組成物とは別物、例えば、前記のトランスフェクトされた供与体または細菌である場合、組成物はまた、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５,８２４,５３８; ５,６４３,７７１; ５,８７７, １５９号に記載されるもののごとき他の添加物を含む。
さらに、いずれの組成物にも存在する添加成分は、アジュバント、保存剤、化学安定化剤または他の抗原タンパク質である。典型的には、安定化剤、アジュバントおよび保存剤は、標的ヒトまたは動物における効力のための最良の処方を決定するために最適化される。適当な例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。使用されてもよい適当な安定化成分は、例えば、カザミノ酸、シュークロース、ゼラチン、フェノールレッド、N−Zアミン、二リン酸一カリウム、乳糖、ラクトアルブミン加水分解産物およびドライミルクを含む。慣用的なアジュバントは白血球を誘引するか、あるいは免疫応答を促進するのに用いられる。かかるアジュバントは、特に、RiBi、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン（Amphigen）、アブリジン（Avridine）、L１２１／スクワラン、D−ラクチド−ポリ乳酸／グリコシド、プルロニックプリオイス、ムラミルジペプチド、死滅したボルデテラ（Bordetella）とクイルＡ（QuilA）のようなサポニンを含む。
さらに、トランスフェクト剤および／または複製物質および／または炎症物質として機能して、本発明の組成物と共に同時投与される他の物質は、成長因子、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦのごときコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のごときサイトカインおよびリンホカインおよびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のごときインターロイキンを含む。さらに、繊維芽細胞増殖因子、免疫−刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ） のごとき界面活性剤、フロイト不完全アジュバント、モノホスホリルリピッドＡ（MPL）のごときＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体スクワランおよびスクワランのごとき小胞性複合体およびヒアルロン酸はまた、本発明の組成物と共に使用され投与される。
医薬組成物はまた、組成物の選択される投与様式に適当な他の添加物を含んでよい。従って、これら組成物は、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸投与、経膣投与などを含むが、それに限定されない、いずれの慣用的投与経路を介しても投与に適当な添加物を含み得る。かかる経路は全て、これら組成物の投与に適当であり、使用される物質、治療される患者および状態、および同様の因子に依存して治療する医師によって選択される。
本発明の組成物はまた、点鼻または肺内に応用するためのものを含む、散剤、液剤または懸濁化剤の用量形態を展開するために他の医薬上許容される賦形剤と共に使用できる凍結乾燥されるポリヌクレオチドにも関わる。例えば、出典明示により本明細書の一部とされる教示である、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, Vol. ２、第１９版（１９９５）、例えば、Chapter ９５ Aerosols；および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５５４７を参照。これら組成物の投与経路は、所望により、組み合わせたり、調整したりしてもよい。
ある好ましい具体例において、本発明の医薬組成物は、例えば、液剤、散剤、エアロゾル、錠剤、カプセル剤、腸溶性錠剤またはカプセル剤、または坐剤の形態で、哺乳類患者に投与されるために調製される。
医薬組成物として使用される場合、本発明の組成物は、例えば、合成ＲＮＡ分子である組成物の送達物質としてポリヌクレオチド分子約１ｎｇないし約２０ｍｇまたはＤＮＡ分子、プラスミド、ウイルスベクター、組換えウイルスおよびその混合物であってよい送達物質を含む。ある好ましい具体例において、組成物は約１０ｎｇないし約１０ｍｇのポリヌクレオチド配列を含む。他の具体例において、医薬組成物は約０.１ないし約５００μgのポリヌクレオチド配列を含む。ある好ましい具体例において、組成物は約１ないし約３５０μgのポリヌクレオチド配列を含む。さらに他の好ましい具体例において、医薬組成物は約２５ないし約２５０μgのポリヌクレオチド配列を含む。ある好ましい具体例において、ワクチンおよび治療剤は約１００μgのポリヌクレオチド配列を含む。
送達物質が供与細胞または細菌細胞である本発明の組成物は、約１細胞ないし約１０７細胞／用量の用量で送達できる。同様に、送達物質が生きたままの組換えウイルスである場合、適当なベクター−ベースの組成物は用量あたり１x１０２pfuないし１x１０１２pfu間を含む。
本発明の教え、および本発明の組成物でトランスフェクトあるいは感染された細胞よりも多く増殖させられた本発明の方法および組成物の阻害効果の見かけの能力があるとすれば、前記の用量から低く適当に用量調整できる可能性がある。従って、前記用量範囲は単なるガイドラインである。一般に、医薬組成物は、かかる標的機能が疾病または疾病の原因のさらなる広がりに必要である、疾病、疾患または感染の治療または予防のために標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害あるいは減少するのに有効な量で投与される。使用される用量単位での医薬組成物の量は、本発明の組成物に対するインビトロでの細胞の応答および実験動物の応答に基づいて、経験的に決定される。最適用量は、各治療モダリティーおよび適応症のための標準法によって決定される。従って、用量、タイミング、投与経路、およびこれら組成物の再投与の必要性は、治療されるべき状態、その重症度、悪化する状態および、哺乳類患者の年齢および物理的状態などの因子、活性化合物の使用などを考慮に入れて当業者によって決定される。
Ｃ．本発明の治療および予防方法
本発明の方法は、前に詳細に記述した組成物および哺乳類細胞に部分的二本鎖のＲＮＡ分子を供する当該分野で最近使用されるあるいは他のポリヌクレオチド配列（例えば、機能的であってもなくてもタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子またはリボザイムのごとき公知のＲＮＡ触媒配列）を使用できる。しかしながら、この方法の有効性は、タンパク質を産生しないＲＮＡ分子の使用によって促進される。これら方法は、哺乳類または哺乳類細胞において標的ポリヌクレオチド配列の機能を減少あるいは阻害する。前記の組成物、医薬組成物、投与の用量および様式は、細胞外または細胞内病原体のいずれかの異種病原体生物による感染を含む哺乳類を苦しめる種々の疾患の治療に特に望ましい。さらに、本発明の組成物は、病原体の哺乳類への感染を予防する上であるいは、潜在的病原体の再活性化により引き起こされる疾患の発生を予防する上で有用である。これら組成物はまた、病原体誘発癌の治療にも有用である。
本発明のある具体例は、哺乳類のウイルス感染の治療方法である。ＤＮＡウイルスまたは中間体ＤＮＡステージを有するウイルスはかかる治療に特に適当である。レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパデノウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルスおよびパポバウイルス種のウイルスは、かかるウイルスに含まれるがそれに限定されない。特に、この方法での治療に対しより望ましいウイルスのいくつかは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶおよびＥＢＶを含むが、限定されない。この方法に使用される物質は、哺乳類細胞に、感染哺乳類細胞においてウイルスの複製および／または発生病理に必要なウイルスポリヌクレオチド配列である標的ポリヌクレオチドを実質的に相同な、前記の少なくとも部分的二本鎖のＲＮＡ分子を供する。かかる標的ポリヌクレオチド配列の中には、とりわけ、ウイルス増殖に必要なタンパク質のタンパク質コード配列、例えば、ＨＩＶｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子、ＨＰＶ６ Ｌ１および Ｅ２遺伝子、ＨＰＶ１１ Ｌ１およびＥ２遺伝子、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７遺伝子ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７遺伝子ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ逆転写酵素、ＨＳＶｇＤ遺伝子、ＨＳＶｖｐ１６遺伝子、ＨＳＶｇＣ、ｇＨ、ｇＬおよびｇＢ遺伝子、ＨＳＶ ＩＣＰ０、ＩＣＰ４およびＩＣＰ６遺伝子、バリセラ・ゾスター（Varicella zoster）ｇＢ、ｇＣおよびＧH遺伝子およびＢＣＲ−ａｂｌ染色体配列、および細胞から細胞への感染の転移に必要な制御機能を供する非−コードウイルスポリヌクレオチド配列、例えば、ＨＳＶ ＬTRおよびＨＳＶｖｐ１６ プロモーター、ＨＳＶ−ＩＣＰ０プロモーター、ＨＳＶ−ＩＣＰ４、ＩＣＰ６およびｇＤプロモーター、ＨＢＶ表面抗原プロモーター、ＨＢＶプレゲノムプロモーターのごとき他のウイルスプロモーター配列がある。前記のごとく、組成物は、ポリヌクレオチド取り込み増強剤または促進剤および所望の医薬上許容される担体と共に投与される。哺乳類に投与される量または用量は、哺乳類細胞のウイルス配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効である。
理論に束縛されないように願いたいが、いったんＲＮＡ分子がウイルスに感染した細胞へ送達され、細胞内で産生されると、外来ＲＮＡ分子は相同なウイルス配列を減少あるいは阻害（すなわち、スイッチを切る）し、それ自身が阻害されるので、ウイルス配列の機能は減少あるいは阻害される。下記の実施例に説明されるごとく、機能効果の阻害は、外来ＲＮＡ分子を受ける哺乳類細胞から外来ＲＮＡ分子を直接供されない患者の他の哺乳類細胞に転移される。現在、この結果はＲＮＡ分解のレベルで起こることが理論付けられている。
従って、この方法は、ＨＩＶｇａｇのごときウイルス複製および／または発生病理に必須のウイルス遺伝子機能を活動停止あるいは阻害するために、ＨＩＶのごときウイルスにすでに感染した哺乳類患者を治療するのに使用できる。あるいは、この方法は、潜在ウイルス、例えば、バリセラ・ゾスター（Varicella zoster） ウイルスとして哺乳類に存在し、帯状疱疹として公知の疾病の原因であるウイルスの機能を阻害するために使用できる。同様に、アテローム性動脈硬化、潰瘍、慢性疲労症候群および自己免疫疾患、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２再発、ＨＰＶ耐性感染、例えば、性器いぼおよび少なくとも一部にはウイルス、細菌または他の病原体によって引き起こされることが示されている特に慢性ＨＢＶ感染は、哺乳類患者のウイルス複製および／または発生病理に必須のあるウイルスポリヌクレオチド配列を標的とすることによるこの方法によって治療できる。
本発明のさらにもう１つの具体例において、前記の組成物は、哺乳類のウイルス感染を予防する方法で使用できる。前記の方法、すなわち、哺乳類へ、必須の標的ウイルスポリヌクレオチド配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で前記の組成物を投与すること、が哺乳類がウイルスに暴露される前に投与される場合、外来ＲＮＡ分子は、哺乳類内に残存し、その後哺乳類へ自身を提示するいずれの相同なウイルス配列を阻害するために働くと期待される。従って、本発明の組成物は、ワクチン使用のためのウイルスポリヌクレオチド配列の機能を阻害あるいは減少するために使用される。
本発明の前記「抗−ウイルス」方法の類似した具体例は、哺乳類におけるウイルス誘発癌の治療または予防の方法を含む。かかる癌は、特に、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ウイルス誘発頸部癌、ＨＴＬＶ−誘発癌、およびバーキットリンパ腫のごときＥＢＶ誘発癌を含む。この方法は、標的ポリヌクレオチドが腫瘍抗原またはその機能的フラグメントをコードする配列、または哺乳類中抗原または配列機能が腫瘍の維持に必要である非−発現制御配列である前記の組成物を哺乳類に投与することによって達成される。かかる配列の中には、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７配列およびＨＰＶ １８Ｅ６ およびＥ７配列が含まれるが、それに限定されない。他のものは当業者によって容易に選択される。組成物は哺乳類において抗原の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与され、好ましくは、前記の組成物成分、用量、投与経路を使用する。この方法の基礎をなす分子機構は前記と同一である。
本発明のもう１つの具体例において、本発明の組成物は、細胞内または細胞外のいずれかの非−ウイルス性病原体による哺乳類の感染の治療または予防の方法で使用できる。本明細書中に使用されるごとく「細胞内病原体」なる語は、少なくともその生殖または生活環の一部の間、宿主細胞内に存在し、そこに病原体タンパク質が産生されるように産生あるいは引き起こすウイルス、細菌、原生動物または他の病原生物を意味する。細胞内病原体である生活環のステージを含む細胞に感染する細胞内病原体は、リステリア属（Listeria）、クラミジア属（Chlamydia）、 リーシュマニア属（Leishmania）、ブルセラ属（Brucella）、マイコバクテリウム属（Mycobacteria）、シゲラ属（Shigella）ならびにプラスモディア属（Plasmodia）例えば、マラリアの原因であるピー・ファルシパルム（ P. falciparum ）を含むが、それに限定されない。細胞外病原体は、哺乳類細胞の外で複製かつ／あるいは増殖するもの、例えば、特に、ゴナリア属（Gonorrhoeae）およびボレリア属（Borrellia）である。この具体例によって、病原体によるかかる感染は、医薬上許容される担体中、細胞へのポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に前記の組成物を、すでに感染したかあるいは、病原体への先行暴露されたと思われるかのいずれかの哺乳類患者に投与することによって治療あるいは予防できる。この場合、組成物のＲＮＡ分子は、感染哺乳類または哺乳類細胞の病原体の複製および／または増殖に必要な病原体の標的ポリヌクレオチド配列と実質的に相同なポリヌクレオチド配列を有する。前記のごとく、投与される組成物の量は、哺乳類の病原体配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量である。用量、タイミング、投与経路は前記の通りである。
本開示によれば、当業者は、本発明による治療的または予防的組成物が作成できるウイルス科および属または原核および真核の原生動物病原体ならびに多細胞寄生虫を含む病原体を容易に選択できる。例えば、一般的免疫学教科書および出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５,５９３,９７２号のかかる病原体の表を参照のこと。
本発明の組成物および先行技術のタンパク質をコードする可能性のある分子は、また本発明のもう１つの新規の方法で使用される。かかる組成物はまた、ある癌または遺伝疾患のごとき哺乳類のある非−病原性疾病または疾患の治療において有用である。本発明による治療または予防に特に敏感な症状の中には、その機能が疾患の開始または進行に必要である異常型の哺乳類ポリヌクレオチド配列の存在により特徴付けられる症状があるが、害を引き起こしたり、そうでなければ、哺乳類の健康に過度に悪影響を与えたりすることなしに阻害できる。換言すれば、この治療に適当な疾患の特徴は、哺乳類が遺伝子の機能なしで生き残るか、あるいは、遺伝子の機能が実質的に減少している場合に生き残っているということである。かかる場合には、異常型または病的なポリヌクレオチド配列の機能は、治療によって外来性に置換できる。別の場合には、疾病は、哺乳類がまた、ポリヌクレオチド配列または遺伝子の正常なコピーを有し、異常遺伝子および正常遺伝子間の差異がヌクレオチド配列の差異である哺乳類における異常ポリヌクレオチド配列または遺伝子の存在または機能によって引き起こされる。かかる場合、本発明の方法による異常ポリヌクレオチド配列の機能阻害は、外来性の治療なしで、正常ポリヌクレオチド配列を機能させるようである。
従って、ある具体例において、哺乳類における癌の治療または予防方法は、標的ポリヌクレオチド配列が哺乳類の異常な癌を引き起こすポリヌクレオチド配列または遺伝子である本発明の組成物を哺乳類に投与することを含む。本発明の組成物は、哺乳類の異常配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で投与される。前記のごとく、組成物は、細胞中ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質および医薬上許容される担体を含み、前記のごとき用量、投与規則および経路によって投与される。
異常および正常ポリヌクレオチド配列の存在によって特徴付けられる哺乳類の癌は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および異常配列が２つの遺伝子の融合体、すなわちｂｃｒ−ａｂｌである急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む。例えば、これら疾病の記載のため出典明示により本明細書の一部とされる、１９９４年６月２３日発行の国際特許ＷＯ／１３７９３におけるこれら癌の記載を参照のこと。ＣＭＬのごときかかる癌または疾病において、苦しんでいる患者はまた、ポリヌクレオチド配列または遺伝子の正常なコピーを有し、異常および正常配列または遺伝子間の差異はヌクレオチド配列の差異である。例えば、ＣＭＬでは、異常配列は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合体であり、他方で、正常配列はｂｃｒおよびａｂｌである。従って、前記方法では、融合体をスパンする配列である標的ポリヌクレオチド配列が用いられる。哺乳類のかかる癌の治療または予防方法は、標的ポリヌクレオチドが、遺伝子の正常コピーを有し、異常遺伝子および正常遺伝子間の差異がポリヌクレオチド配列の差異である哺乳類における異常な癌を引き起こす遺伝子のポリヌクレオチド配列である本発明の組成物を哺乳類へ投与することを含む。組成物は、哺乳類における異常配列の機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、医薬上許容される担体中に、細胞内ポリヌクレオチド取り込みを促進する所望の第二物質と共に投与される。
従って、本発明は、望ましくない産物または機能を発現するか、あるいは介在する標的ポリヌクレオチドと実質的に相同な部分的二本鎖のＲＮＡ分子を、哺乳類細胞のポリヌクレオチドの機能を減少あるいは阻害するのに有効な量で、哺乳類細胞に送達できる組成物の利用によって、健常な哺乳類には見出されない望ましくないポリヌクレオチド産物またはポリヌクレオチド介在機能の発現によって特徴付けられる哺乳類のいずれの疾病または疾患も治療する前記の分子機構を誘発する方法を包含する。ＲＮＡ分子が必須の哺乳類ポリヌクレオチド配列と実質的に非−相同であるので、これら必須の配列の機能を阻害しないとすれば、この方法は、明らかに多くの治療的および予防的使用を有するように見える。当業者は、前記疾患を容易に選択でき、また、それに対して本発明の組成物が向けられる標的ポリヌクレオチド配列を容易に選択できる。
Ｄ．本発明の他の方法
前記組成物およびこれら組成物を標的ポリヌクレオチド配列の機能を阻害あるいは減少するために使用する一般的方法は、また、種々の研究およびインビトロでの応用に応用できる。例えば、本発明の方法は、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列が、選択される配列に実質的に相同であって、好ましくは、動物の他のポリヌクレオチド配列に実質的に非−相同である本発明の組成物を、組織培養細胞またはインビボで動物に投与することによって、細胞系または哺乳類実験動物の選択されるポリヌクレオチド配列の機能を決定する研究に応用できる。この標的配列の機能阻害は、動物の生物学および生理学に与える影響という研究を可能にする。
同様に、この方法の応用は、その発現に必要な酵素的配列、タンパク質発現配列または制御配列のごとき選択される機能的配列を「サイレンシング」することによって、哺乳類、細菌、酵母、真菌、昆虫および他の生物の細胞系を、選択される経路で欠失させるのに使用できる。かかる操作された細胞は、慣用的アッセイまたは物質スクリーニングアッセイなどで使用される。
同様な方法で、選択される遺伝子の機能を永久に停止するのに十分な投与量に変化させることによって、「ノックアウト」された実験動物が調製できる。従って、前記の実験動物において「ノックアウト」されるのに選択される配列と実質的に相同なポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を送達する本発明の方法は、製薬および遺伝的研究に有用な「ノックアウト」されるマウスおよび他の実験動物を開発するより簡単な技術を提供する。
本発明の組成物および方法を使用するさらに他の研究方法は、望ましいタンパク質の微生物製品のための研究試薬または産業製品株としての使用のための、真核および原核両者の微生物変異体の調製を含む。さらに他の使用は、本明細書中の教えがあるとすれば、当業者には明らかであると思われる。
以下の実施例は、標的ポリヌクレオチド配列を減少あるいは阻害するために組成物の調製および本発明の組成物の使用の方法を例示する。インビトロ合成で作成される組成物の物質として、二本鎖ＲＮＡ分子およびＨＩＶｇａｇまたはＨＳＶｇＤ２の標的ポリヌクレオチド配列を使用するこれら実施例は、単に本発明の具体例を例示する。当業者によって、組成物の種々の物質の他の選択、および標的ポリヌクレオチド配列の同一性が本明細書に教えられるごとく容易に選択されると理解される。これら実施例は、単に例示的であるだけで、本発明の範囲を限定しない。
（実施例）
実施例１： ウイルス感染細胞におけるＨＩＶp２４の機能の減少または阻害
ＨＩＶ感染中、感染された分裂細胞の宿主染色体中に組み込まれる、ウイルスゲノムは、ＤＮＡテンプレートに逆転写される。組込みコピーは、それから、より多くのＨＩＶ粒子が作成される青写真である。、ＨＩＶの複製および／または発生病理に必須のポリヌクレオチド配列が減少あるいは阻害されるとすれば、本発明によって、ウイルス感染は治療できる。本実施例は、本発明の方法の具体例の１つの実施を示す。
プラスミド、ＨＩＶｇｐｔ（AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog）を使用して、欠失ＨＩＶゲノムの組込みコピー、ＨＩＶｇｐｔを含む安定な組込みラブドミオザルコーマ（Rhabdomyosarcoma）（ＲＤ）またはＣＯＳ７細胞系を得た。ＨＩＶｇｐｔゲノムは、エンベロープ遺伝子の場所にミコフェノール酸（ＭＰＡ）耐性遺伝子をコードし、それによってＭＰＡ耐性を授与する。プラスミドで細胞をトランスフェクトし、ついでＭＰＡ中で細胞選択することによって細胞系を作成した。ＭＰＡ耐性細胞は、クローンとして増殖した。培養した、クローンとして増殖した細胞の培地を、ついで、p２４ＥＬＩＳＡアッセイキット（Coulter Corporation）を使用して、p２４（細胞外で分泌されるＨＩＶｇａｇポリペプチド）の存在についてアッセイした。全細胞がp２４陽性であった。
２つのＲＤ細胞系および２つのＣＯＳ７細胞系を使用して、本発明の方法のある具体例、すなわち、これら細胞でp２４合成を制御するＨＩＶp２４標的ポリヌクレオチドの機能の減少または阻害を示す。
本発明の試薬を生じるために、ＨＩＶ ＨＸＢ２株のｇａｇ遺伝子の同一の座標に位置づけ、キャップ、ポリアデニル化配列および本来の開始コドンを欠失する６００ヌクレオチド（ｎｔ）センスＲＮＡ、６００ｎｔアンチセンスＲＮＡおよび６００ｂｐ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞をトランスフェクトするのに使用される。ＲＮＡ分子が、１つの末端にバクテリオファージＴ７ポリメラーゼプロモーターを有するＰＣＲ産物の転写を介して生じる（図１Ａおよび１Ｂを参照）。プライマーの座標はＨＩＶ（ＨＸＢ２）、Genbank 受け入れ番号K０３４５５の完全ゲノムの地図由来だった［また、L. Ratnerら、AIDS Res.Hum.Retroviruses, ３（１）：５７−６９ （１９８７）を参照］。前方ｇａｇプライマーは座標９０１−９２４に位置し、この配列は、Ｔ７前方ｇａｇプライマーのＴ７プロモーターの後に続く。逆転ｇａｇプライマーは、座標１４７６−１５００に位置し、Ｔ７逆転ｇａｇプライマーのＴ７プロモーターの後に続く。
物質が、一本鎖センスＲＮＡである本発明の組成物を生じるために、Ｔ７プロモーターは前方ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。下線のＴ７プロモーターの上流鎖で５'から３'へ書かれるｓｓセンスＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートを生じるために使用されるＰＣＲプライマーは、Ｔ７前方ｇａｇプライマー［配列番号：１］
５' GTAATACGACTCACTATAGGGCGGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG３'
および逆転ｇａｇプライマー［配列番号：２］である。
５' CTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC ３'
物質が、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である組成物を生じるために、Ｔ７プロモーターは逆転ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。これらプライマーは、Ｔ７逆転ｇａｇプライマー ［配列番号：３］
５' GTAATACGACTCACTATAGGGCGCTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC３'
および前方ｇａｇプライマー［配列番号：４］である。
５ ' GCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG ３'
前記ＰＣＲ産物の両タイプは、物質が二本鎖ＲＮＡ分子である組成物を生じるＴ７転写反応に含まれる。あるいは、本発明による組成物の物質は、転写後、センスおよびアンチセンスＲＮＡを一緒に混合することによって調製される。
対照として、同様な大きさのセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ分子がヘルペスシンプレックスウイルス（Herpes Simplex Virus）のｇＤ遺伝子から得られ、２型ゲノムが同一のＰＣＲおよびＴ７転写法によって生じる。ＨＳＶｇＤのＰＣＲプライマーの座標はGenBank受け入れ番号K０１４０８、ＨＳＶｇＤ ２遺伝子のマップから得られる。前方ｇＤプライマーは座標３１３−３３６に位置し;この配列は、Ｔ７前方ｇＤプライマーのＴ７プロモーターの後に続く。逆転ｇＤプライマーは座標８４９−８７２に位置し、Ｔ７逆転ｇＤプライマーのＴ７プロモーターの後に続く。これら対照分子を生じるのに使用されるプライマーセットは、
Ｔ７前方ｇＤプライマー［配列番号：５］
５' GTAATACGACTCACTATAGGGCGGTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC ３'
および前方ｇＤプライマー［配列番号：６］
５' GTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC ３'；
およびＴ７逆転ｇＤプライマー［配列番号：７］
５' GTAATACGACTCACTATAGGGCGGTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC ３'
および逆転ｇＤプライマー［配列番号：８］
５' GTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC ３'であった。
本発明のこれらＲＮＡ分子および前記の対照分子をＲＤおよびＣＯＳ７細胞系で、以下のごとくアッセイする：
６穴プレート上５−６x１０５細胞／ウェルを約８０−９０％集密に達するまで培養し、トランスフェクト剤として１０μlのリポフェクトアミン（Gibco−BRL）を用いて２−３μgの選択されるＲＮＡ分子または対照分子でトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１ないし１７時間の範囲でインキュベートする。別の細胞培養液を１μｇないし５００μｇの範囲の量のＲＮＡでトランスフェクトし、公知のトランスフェクト剤なしで送達し、０.５分から約２日間細胞上でインキュベートする。例えば、ある群の細胞は、センスｇａｇＲＮＡで、別の細胞は、アンチセンスｇａｇＲＮＡで、別の細胞はｄｓｇａｇＲＮＡで、別の細胞はセンスｇＤＲＮＡ対照で、別の細胞はアンチセンスｇＤＲＮＡ対照で、および別の細胞はｄｓｇＤＲＮＡ対照でトランスフェクトされる。また、さらなる陰性対照は、ＲＮＡ分子を受け取らない細胞である。
細胞を３７℃で培養し、数週間という一定期間、p２４合成をモニターする。細胞は、両者とも、p２４ＥＬＩＳＡアッセイキット（Coulter Corp）を用いて細胞培養液中のp２４を測定すること、およびウサギポリクローナル抗−p２４血清（Intracell Corp）およびFITC−コンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧ（Sigma）を用いてp２４につき固定細胞を免疫染色すること両者によって、ＲＮＡ注入２日後から、週３回アッセイする。
本発明によれば、ｇＤ ＲＮＡ分子はどれもp２４合成を阻止あるいは阻害する能力を示さない。しかしながら、本発明によれば、ｄｓｇａｇＲＮＡ分子は、p２４合成を阻害あるいはダウンレギュレートする。
これらＲＮＡが、ある程度の二本鎖を形成できなければ、センスおよびアンチセンスＲＮＡ分子は、p２４合成において、たとえあるとしても緩和な阻害効果のみを引き起こすと思われる。
実施例２ ある細胞培養液から別へのp２４合成減少の程度の測定
ダウンレギュレートされたシグナルがダウンレギュレートされていない細胞に伝達されることを測定するために、本実施例は、減少／阻害効果（すなわち、p２４合成の阻害または減少）が物質によってトランスフェクトされていない培養系の細胞に伝達されることを示す。
Ａ．ＣＯＳ７およびＲＤ細胞の共同培養
Ｐ２４合成減少を示す実施例１の培養液の細胞は、予めいずれのＲＮＡ分子ともインキュベートされておらず、実際野生型レベルでp２４を合成している対照細胞と一緒に培養する。本発明によれば、予めトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされてない細胞に標的ポリヌクレオチド機能阻害を転移でき、共培養系の対照細胞はp２４合成減少によって特徴付けられる。
培養液中、予めトランスフェクトされた細胞と対照細胞を区別するための、第一のプロトコルは以下である：p２４合成阻害を示す実施例１のＣＯＳ７細胞を、野生型レベルでp２４を発現するトランスフェクトされていないＲＤ細胞と、６穴プレート上合計６−７x１０５細胞になるまで細胞型の種々の割合で、例えば、１／１０００ないし１／１０（ＣＯＳ７／ＲＤ）で共培養する。実施例１に明記された条件下で培養２日後、培養系中のＲＤ細胞をp２４合成につき検査する。細胞は３週間、約週３回検査する。
Ｐ２４合成は２つの方法によってアッセイする。第一の方法は、共培養された細胞の培養液をp２４ＥＬＩＳＡアッセイ（Coulter）を用いて、p２４につきアッセイする。第二の方法は、p２４に対するウサギポリクローナル血清（Intracell Corp.）およびFITCにコンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧを用いてp２４につき、細胞を免疫染色する。ＣＯＳ７およびＲＤ細胞は形態によって区別できるので、染色の失敗したＲＤ細胞は、ＣＯＳ７細胞と容易に区別できる。Ｔ７細胞がT抗原を発現しない一方、ＣＯＳ７細胞が発現するので、共培養された細胞はまた、ＳＶ４０T抗原（Pharmagen Corp.）およびr−フィコエリスリンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（PＥ）に対するマウスモノクローナル血清を用いて、TＡｇにつき染色する。これらの条件下では、ＣＯＳ７細胞のみが染色する。細胞染色は、蛍光顕微鏡またはＦＬＯＷサイトメトリーによって測定する。
培養液のＲＤ細胞のp２４機能阻害は、共培養されたＲＤ細胞中ＦＩＴＣ染色の失敗によるＲＤ細胞のみを含む対照培養系との比較によって示される。ＦＩＴＣまたはPＥで染色されない共培養系のＲＤ細胞は、実施例１のＲＮＡ分子（特にｄｓＲＮＡ分子）によるp２４標的ポリヌクレオチドのp２４合成機能の減少または阻害の証拠である。
Ｂ．トランスフェクトされていないＲＤ細胞でのトランスフェクトされたＲＤ細胞の培養
第二のプロトコルでは、減少したp２４産生を示す、実施例１のトランスフェクトされたＲＤ細胞を組込みヒグロマイシン耐性遺伝子を含むように作成して、６穴プレート上総細胞数６−７x１０５まで１／１０００ないし１／１０（ＲＤ／対照ＲＤ）の範囲の割合という異なる細胞割合を用いて正常レベルのp２４を発現する、トランスフェクトされていないＲＤ細胞と共培養する。ヒグロマイシン耐性ＲＤ細胞は以下のごとく作成する：ＲＤ細胞（５−６x１０５細胞） を６穴プレート上８０−９０％コンフルエンスまで培養し、チミジンキナーゼ（TK）プロモーターの制御下、ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＥP４（Invitrogen Corp.）のNru １−Sal １フラグメント、２.５μgでトランスフェクトする。トランスフェクションは、トランスフェクト剤、リポフェクトアミン（Gibco BRL）を用いて行われる。トランスフェクション２日後、４００μg／mlヒグロマイシン存在下、細胞をインキュベートする。耐性細胞がクローン的に広がる。１つ以上のクローン的に広がった細胞系を対照として実験に用いる。
実施例１に明記された条件下での共培養後１日から数週間まで、複製された共培養系を４００μg／mlヒグロマイシンとインキュベートする。この濃度のヒグロマイシンはヒグロマイシン耐性ではないＲＤ細胞を死滅させ、対照ヒグロマイシン耐性ＲＤ細胞のみを残存させる。残りの耐性細胞は対照細胞由来である。P２４レベルを例えば、実施例１のＥＬＩＳＡならびに前記の免疫染色によって、対照細胞から、直接測定する。
本発明によって、p２４産生阻害は少なくとも対照細胞のサブセットで示される。
実施例３ 本発明の方法による内因性インターロイキン−１２減少のインビボ阻害
Ａ．本発明の組成物としてのＲＮＡ分子の設計
この実験の全ＲＮＡ分子は長さ６００ｎｔｓに近く、全ＲＮＡ分子は、ＩＬ−１２のp４０鎖を産生できないように設計する。分子はキャップおよびポリ−A配列を有さず;本来の開始コドンは存在せず、ＲＮＡは全長産物をコードしない。以下のＲＮＡ分子を設計する：
（１）ＩＬ−１２p４０ネズミ伝令ＲＮＡ（mＲＮＡ）に相同な一本鎖（ｓｓ）センスＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（２）ＩＬ−１２p４０ネズミmＲＮＡに相補的なｓｓアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（３）センスおよびアンチセンス両者のp４０ＩＬ−１２ネズミmＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ；
（４）ＩＬ−１２p４０ネズミ異種ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に相同なｓｓセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（５）ＩＬ−１２ p４０ネズミｈｎＲＮＡに相補的なｓｓアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（６）センスおよびアンチセンス両者のＩＬ−１２ p４０ネズミｈｎＲＮＡポリヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子；
（７）ＩＬ−１２p４０プロモーターの上流鎖に相同なｓｓネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（８）ＩＬ−１２p４０プロモーターの下流鎖に相同なｓｓネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列および
（９）ＩＬ−１２p４０プロモーターの上流および下流鎖に相同なネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子。
陰性対照として、実施例１に記載のＨＳＶ２ ｇＤ遺伝子由来のセンス、アンチセンスおよびｄｓＲＮＡもまた使用する。別の対照群はＲＮＡを受けないネズミより成る。
実施例１に記載のごとく、片側末端にＴ７プロモーターを有するＰＣＲ産物のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写を介して前記（１）−（９）の種々のＲＮＡ分子が生じる。センスＲＮＡが所望の場合は、Ｔ７プロモーターは前方ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。アンチセンスＲＮＡが所望の場合は、Ｔ７プロモーターは逆転ＰＣＲプライマーの５'末端に位置する。ｄｓＲＮＡが所望の場合は、両タイプのＰＣＲ産物をＴ７転写反応中に含む。あるいは、転写後、センスおよびアンチセンスＲＮＡを混合する。
本実施例のＲＮＡ分子の構築に使用されるＰＣＲプライマーは５'から３'へ、Ｔ７プロモーターの上流鎖には下線を引く。
前方ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ）［配列番号：９］：
５' TCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG ３'；
および逆転ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ） ［配列番号：１０］：
５' GAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG ３'；
Ｔ７前方ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ）［配列番号：１１］：
５' GTAATACGACTCACTATAGGGTCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG３'；
およびＴ７逆転ＩＬ−１２ゲノム（ｈｎＲＮＡ）［配列番号：１２］：
５' GTAATACGACTCACTATAGGGGAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG ３'；
Ｔ７前方ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１３］：
５' GTAATACGACTCACTATAGGGCCTATAAGCATAAGAGACGCCCTC ３'；
および前方ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１４］：
５' CCTATAAGCATAAGAGACGCCCTC ３'；
逆転ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１５］：
５' GGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC ３'；
およびＴ７逆転ＩＬ−１２プロモーター［配列番号：１６］：
５' GTAATACGACTCACTATAGGGGGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC ３'；
Ｔ７前方ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：１７］：
５' GTAATACGACTCACTATAGGGTGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC３'；
および前方ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：１８］：
５' TGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC ３'；
逆転ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：１９］：
５' GCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA ３'；
およびＴ７逆転ＩＬ−１２cＤＮＡ（mＲＮＡ）［配列番号：２０］：
５' GTAATACGACTCACTATAGGGGCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA ３'。
ゲノムおよびＰＣＲプライマーの座標は、以下の引用に供されるマップに基づく；Toneら、Eur. J. Immunol., ２６：１２２２−１２２７（１９９６）。前方ＩＬ−１２ゲノムプライマーは座標８３０１−８３２５に位置する。逆転ＩＬ−１２プライマーは８８８９−８９１３に位置する。前方ＩＬ−１２プロモータープライマーは座標８３−１０６に位置する。逆転ＩＬ−１２プロモーターは座標６５９−６８２に位置する。ｃＤＮＡ ＰＣＲプライマーの座標は、GenBank受け入れ番号M８６６７１に基づく。前方ＩＬ−１２cＤＮＡプライマーは座標３６−５８に位置する。逆転ＩＬ−１２cＤＮＡプライマーは座標６５９−６８２に位置する。
Ｂ．アッセイ
前記のネズミＩＬ−１２ p４０鎖特異的ＲＮＡまたは前記同定の対照を１０μｇおよび５００μｇの範囲の用量で、Ｂａｌｂ／ｃネズミ（ネズミ５匹／群）に、筋肉内あるいは腹腔内注射する。３週間という期間４日ごとにネズミから血清を集め、Quantikine M−ＩＬ−１２ p４０ ＥＬＩＳＡ アッセイ（Genzyme）を用いてＩＬ−１２p４０鎖のレベルにつきアッセイする。
本発明によれば、ＩＬ−１２mＲＮＡ、ＩＬ−１２ｈｎＲＮＡ両者由来のｄｓＲＮＡ分子およびＩＬ−１２プロモーター由来のｄｓＲＮＡを受けるネズミはＩＬ−１２産生の減少または阻害を示す。ＲＮＡ分子があるレベルの二本鎖を形成する能力を有さなければ、一本鎖ＩＬ−１２由来ＲＮＡ分子を受けるネズミ血清中には、たとえあるとしても緩和な阻害効果が観察される。特定の方法では、ＨＳＶ ｇＤ由来ＲＮＡはインビボでＩＬ−１２を減少あるいは阻害しないと期待される。
実施例４： 疾病の予防における本発明の方法
Ａ．インビトロアッセイ
２０−３０％コンフルエンス密度で接種されたベロおよび／またはＢＨＫ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃にて６穴プレート上で培養する。細胞が８０−９０％集密に達したら、トランスフェクト剤としてリポフェクトアミン（Gibco−BRL）を用いて実施例１に記載の２−３μｇのＨＩＶｇａｇ−およびＨＳＶｇＤ−特異的ＲＮＡ分子でトランスフェクトする。ＲＮＡ分子はまた、５および１００μｇ間で変化する量のいずれの公知のトランスフェクト剤の非存在下送達される。別の群の細胞はＲＮＡを受けない。
さらに他の群のベロおよび／またはBHK細胞は同様に、出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第５,８５１,８０４号記載の二本鎖ＤＮＡプラスミド、プラスミド２４（HＣＭＶプロモーターの制御下ＨＳＶ２ｇＤタンパク質をコードする配列およびＳＶ４０ポリＡ配列を含む）、２−３μｇでトランスフェクトされる。
トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃にて培養する。トランスフェクション後１、２、４および７日に、ＤＭＥＭ２５０μｌの接種原中０.１の感染多重度（ＭＯＩ）にてＨＳＶ２で細胞を感染する。接種原は、ウェル毎ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）２mｌを添加した１時間後吸着される。トランスフェクション後４および７日に感染したこれら細胞につき、細胞が感染時間で全面成長しているので、新しい６穴プレートに移動する。細胞が移動されない場合、過密になる。
感染後３６−４８時間で、細胞溶解産物を、ベロ細胞の慣用的なプラークアッセイ［Clinical Virology Manual, ２d edit., eds. S. Specter and G. Lancz, pp. ４７３−９４ （１９９２）］によって、バイアルタイターをアッセイする。本発明によれば、ｄｓＤＮＡプラスミド、APＬ−４００−０２４およびｇＤ２抗原のポリヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞は、ＨＳＶ２で生産的に感染できない。他の細胞全て、ＨＳＶ２で生産的に感染されるようになると思われる。
Ｂ．インビボアッセイ
ＨＳＶｇＤタンパク質を作る能力および対照としてＨＩＶｇａｇ特異的ＲＮＡ分子を有さない実施例１記載のＨＳＶ−ｇＤ特異的ＲＮＡ分子を用いて、注入された本発明のＨＳＶ２ｇＤ特異的ＲＮＡ分子の使用を介して、ネズミをＨＳＶ攻撃からの保護につき評価する。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス５匹／群）を、１０および５００μｇＲＮＡの範囲の用量で記載ＲＮＡ分子で筋肉内または腹腔内に免疫処理する。ＲＮＡ注入後１、２、４および７日にマウスを経膣接種によってＨＳＶ−２（３０μl中１０５pfu）で攻撃する。ＨＳＶ−２接種後毎日、マウスを感染の徴候につき観察し、０−４の等級で等級付けする。ゼロは感染の徴候なし；１は赤みを示す；２は小胞および赤みを示す；３は小胞、赤みおよび失禁を示す；４は麻痺を示す。
本発明によれば、ＨＳＶ ｇＤ配列を含む本発明のｄｓＲＮＡを受けるマウスは、攻撃に対し保護されることが示される。ＨＩＶｇａｇ対照ＲＮＡ分子を受けるマウスは保護されない。これら分子がインビボで少なくとも部分的二本鎖になる能力を有さなければ、ＨＳＶｇＤ配列を含むssＲＮＡ分子を受けるマウスは、あったとしても最小限、保護されると思われる。本発明によれば、本発明のｄｓＲＮＡ分子はＨＳＶ ｇＤタンパク質を作る能力を有さないので、ＲＮＡ分子の動物への送達によって供される保護は、遺伝子特異的な非−免疫介在機構による。
前記の引用文献は全て出典明示により本明細書の一部とされる。本発明の多数の修飾および変形は前記明細書中に含まれ、当業者には明かであると思われる。本発明の組成物およびプロセスのかかる修飾および改変は本明細書に添付の請求項の範囲内に含まれる。

Claims (67)

  1. 少なくとも１つの標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列と実質的に相同かつ相補的である、２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列を含む、複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  2. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が複数の標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列と実質的に相同または相補的である、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  3. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子の少なくとも１１ないし３０個のヌクレオチドが異なる二本鎖配列の各々に含まれる、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  4. 異なる二本鎖ＲＮＡ配列の各々が標的配列の３０個のヌクレオチド領域と類似する少なくとも５０％の相同性を有する連続する３０個のヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含み、その連続する３０個のヌクレオチドのセグメントも天然に存する必須のポリヌクレオチド配列と非相同である、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  5. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子が長さが約１００個と１００００個の間のポリヌクレオチドである、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  6. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子が長さが少なくとも約２００個のヌクレオチドである、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  7. 異なる二本鎖ＲＮＡ配列の１つまたは複数が、非塩基対ポリヌクレオチド配列により分離されている、センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを含む、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  8. センスおよびアンチセンスポリヌクレオチドがヘアピンを形成する、ところの請求項７記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  9. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が開裂配列により分離されている、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  10. 開裂配列が自己触媒配列またはスプライス部位である、ところの請求項９記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  11. 少なくとも１つの標的遺伝子が単一の標的病原体から由来する、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  12. 複数の標的遺伝子が複数の標的病原体から由来する、ところの請求項２記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  13. 標的病原体がウイルスである、ところの請求項１１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  14. ウイルスがＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶおよびＥＢＶからなる群より選択される、ところの請求項１３記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  15. 複数の標的病原体がウイルスである、ところの請求項１２記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  16. 複数のウイルスがＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶおよびＥＢＶからなる群より選択される、ところの請求項１５記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  17. 少なくとも１つの標的遺伝子が哺乳動物における疾患または障害と関連付けられる、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  18. 少なくとも１つの標的遺伝子が癌関連遺伝子である、ところの請求項１７記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  19. 複数の標的遺伝子が哺乳動物における疾患または障害と関連付けられる、ところの請求項２記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  20. 複数の標的遺伝子が癌関連遺伝子である、ところの請求項１９記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  21. 少なくとも１つの標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列が、転写配列、非転写配列、コード化配列、非コード化配列、エクソン含有配列、制御配列およびプロモーター配列からなる群より選択される、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  22. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子がポリアデニル化信号を欠く、ところの請求項１記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  23. 請求項１に記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子を含む、組成物。
  24. 細胞によるポリヌクレオチド吸収を容易にする物質をさらに含む、請求項２３記載の組成物。
  25. 請求項１に記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子をコード化するＤＮＡ分子。
  26. 請求項１に記載の複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子をコード化する発現ベクター。
  27. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子が、ミトコンドリア・プロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター、ウイルス性プロモーター、細菌性プロモーターおよびバクテリオファージ・プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを用いて発現される、ところの請求項２６記載の発現ベクター。
  28. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子がＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターを用いて発現される、ところの請求項２７記載の発現ベクター。
  29. ベクターがプラスミド、ファージまたは組換えウイルスである、ところの請求項２６記載の発現ベクター。
  30. コード化された複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子がポリアデニル化信号を欠く、ところの請求項２６記載の発現ベクター。
  31. 細胞にて少なくとも１つの標的遺伝子の機能を軽減または阻害するための発現ベクターであって、少なくとも１つの標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列と相同かつ相補的である、２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列をコードする、発現ベクター。
  32. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が複数の標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列と相同または相補的である、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  33. 異なる二本鎖ＲＮＡ配列の各々が二本鎖配列に含まれる少なくとも１１ないし３０個のヌクレオチドを含む、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  34. 異なる二本鎖ＲＮＡ配列の各々が標的配列の３０個のヌクレオチド領域と類似する少なくとも５０％の相同性を有する連続する３０個のヌクレオチドの少なくとも１つのセグメントを含み、その連続する３０個のヌクレオチドのセグメントも該細胞にて天然に存する必須のポリヌクレオチド配列と非相同である、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  35. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列を含む複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子をコード化する、請求項３１記載の発現ベクター。
  36. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子が長さが約１００個と１００００個の間のポリヌクレオチドである、ところの請求項３５記載の発現ベクター。
  37. 複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子が長さが少なくとも約２００個のヌクレオチドである、ところの請求項３５記載の発現ベクター。
  38. 異なる二本鎖ＲＮＡ配列の１つまたは複数が、非塩基対ポリヌクレオチド配列により分離されている、センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを含む、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  39. センスおよびアンチセンスポリヌクレオチドがヘアピンを形成する、ところの請求項３８記載の発現ベクター。
  40. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が開裂配列により分離されている、ところの請求項３５記載の発現ベクター。
  41. 開裂配列が自己触媒配列またはスプライス部位である、ところの請求項４０記載の発現ベクター。
  42. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が、ミトコンドリア・プロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター、ウイルス性プロモーター、細菌性プロモーターおよびバクテリオファージ・プロモーターからなる群より選択されるプロモーターを用いて発現される、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  43. １つまたは複数のプロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである、ところの請求項４２記載の発現ベクター。
  44. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が２つまたはそれ以上のプロモーターを用いて発現される、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  45. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列が２つまたはそれ以上のプロモーターを用いて発現される、ところの請求項３８記載の発現ベクター。
  46. ２つまたはそれ以上のプロモーターが、ミトコンドリア・プロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター、ウイルス性プロモーター、細菌性プロモーターおよびバクテリオファージ・プロモーターからなる群より選択される、ところの請求項４４記載の発現ベクター。
  47. ２つまたはそれ以上のプロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである、ところの請求項４６記載の発現ベクター。
  48. ２つまたはそれ以上のプロモーターが、ミトコンドリア・プロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター、ウイルス性プロモーター、細菌性プロモーターおよびバクテリオファージ・プロモーターからなる群より選択される、ところの請求項４５記載の発現ベクター。
  49. ２つまたはそれ以上のプロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである、ところの請求項４８記載の発現ベクター。
  50. ベクターがプラスミド、ファージまたは組換えウイルスである、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  51. 少なくとも１つの標的遺伝子が単一の標的病原体から由来する、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  52. 複数の標的遺伝子が複数の標的病原体から由来する、ところの請求項３２記載の発現ベクター。
  53. 標的病原体がウイルスである、ところの請求項５０記載の発現ベクター。
  54. ウイルスがＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶおよびＥＢＶからなる群より選択される、ところの請求項５３記載の発現ベクター。
  55. 複数の標的病原体がウイルスである、ところの請求項５２記載の発現ベクター。
  56. 複数のウイルスがＨＢＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶおよびＥＢＶからなる群より選択される、ところの請求項５５記載の発現ベクター。
  57. 少なくとも１つの標的遺伝子が哺乳動物における疾患または障害と関連付けられる、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  58. 少なくとも１つの標的遺伝子が癌関連遺伝子である、ところの請求項５７記載の発現ベクター。
  59. 複数の標的遺伝子が哺乳動物における疾患または障害と関連付けられる、ところの請求項３２記載の発現ベクター。
  60. 複数の標的遺伝子が癌関連遺伝子である、ところの請求項５９記載の発現ベクター。
  61. 少なくとも１つの標的遺伝子の２つまたはそれ以上の配列が、転写配列、非転写配列、コード化配列、非コード化配列、エクソン含有配列、制御配列およびプロモーター配列からなる群より選択される、ところの請求項３１記載の発現ベクター。
  62. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ配列がポリアデニル化信号を欠く、ところの請求項３１記載の発現ベクター ２つまたはそれ以上のプロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである、ところの請求項４６記載の発現ベクター。
  63. ２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ分子を含む組成物の製法であって、請求項３１に記載の発現ベクターを細胞にて発現させることを含む、方法。
  64. 請求項６３に記載の方法により産生される、２つまたはそれ以上の異なる二本鎖ＲＮＡ分子を含む、組成物。
  65. 請求項３１に記載の発現ベクターによりコード化される複数標的の部分的に二本鎖のＲＮＡ分子。
  66. 請求項３１に記載の発現ベクターを含む、組成物。
  67. 細胞によるポリヌクレオチド吸収を容易にする物質をさらに含む、請求項６６記載の組成物。
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