CN108513588A - Kras表达的调节剂 - Google Patents

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A.雷文科
S.M.弗雷尔
R.A.麦克劳德
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Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本发明实施例提供了用于抑制KRAS表达的方法、化合物、和组合物，这些方法、化合物、和组合物可以用于治疗、预防、或缓解与KRAS相关的疾病。

Description

KRAS表达的调节剂
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表被提供为创建于2016年8月30日的、标题为BIOL0276WOSEQ_ST25.txt的文件，其大小是567kb。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文结合在此。
领域
本发明实施例提供了用于抑制KRAS表达的方法、化合物、和组合物，这些方法、化合物、和组合物可以用于治疗、预防、或缓解与KRAS相关的疾病。
背景
柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(Kirsten Rat Sarcoma Viral OncogeneHomologue，KRAS)是作为小的膜结合的细胞内GTP酶蛋白的三种RAS蛋白家族成员(N、H和K-RAS)之一。KRAS在无活性的鸟苷二磷酸(GDP)结合的状态与有活性的鸟苷三磷酸(GTP)结合的状态之间循环。交换结合的核苷酸的过程由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)和GTP酶激活蛋白(GAP)协助。GEF促进从KRAS中释放GDP用以交换GTP，从而产生有活性的GTP结合的KRAS。GAP促进GTP水解为GDP，从而产生无活性的GDP结合的KRAS。有活性的GTP结合的KRAS与许多效应蛋白相互作用，以刺激调节各种细胞过程(包括增殖和存活)的信号传导途径。激活突变使得KRAS对GAP催化的GTP水解有抗性并且因此将该蛋白锁定在激活状态。
KRAS是人类癌症中最常见的突变的癌基因。全部人类癌症的大约30％具有激活KRAS突变，其中在结肠、肺和胰腺肿瘤中发生率最高，而KRAS突变还与预后不良相关。
概述
尽管KRAS在若干类型的癌症中的作用是普遍的，但是KRAS被认为是“无药可治的(undruggable)”靶标并且尚未有直接靶向KRAS的抑制剂进入临床开发。在此提供的本发明实施例是针对用于抑制KRAS表达的强效且可耐受的化合物和组合物，这些化合物和组合物可以用于治疗、预防、缓解癌症，或减缓其进展。
发明详述
应理解的是，前面的概述和下面的详述两者都只是示例性和说明性的，并且不限制如所要求的本发明。在此，单数的使用包括复数，除非另外明确说明。如在此使用的，“或”的使用意指“和/或”，除非另外说明。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括”(includes)和“包括”(included))的使用没有限制性。同样，术语如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分两者，除非另外明确说明。
在此使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文献、或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文、以及GenBank和NCBI参考序列记录)都针对在此讨论的文献的部分并且以其全文通过引用而清楚地特此结合。
应理解的是，在此包含的实例中的每个SEQ ID NO中列出的序列独立于对糖部分、核苷间连接、或核碱基的任何修饰。因此，由SEQ ID NO定义的化合物可以独立地包括对糖部分、核苷间连接、或核碱基的一种或多种修饰。通过ISIS编号(ISIS#)描述的化合物指示核碱基序列、化学修饰、和基序的组合。
除非另外指明，以下术语具有以下含义：
“2’-脱氧核苷”意指包含2’-H(H)呋喃糖基糖部分的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核酸(DNA)中发现的。在某些实施例中，2’-脱氧核苷可以包括修饰的核碱基或者可以包括RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。
“2’-O-甲氧基乙基”(亦是2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指糖环(例如呋喃糖环)的2’位处的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2’-MOE核苷”(亦是2’-O-甲氧基乙基核苷)意指包含2’-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2’-取代的核苷”或“2-修饰的核苷”意指包含2’-取代的或2’-修饰的糖部分的核苷。如在此使用的，关于糖部分的“2’-取代的”或“2-修饰的”意指包含除H或OH之外的2'-取代基基团的糖部分。“3’靶位点”是指与特定化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5’靶位点”是指与特定化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指具有附接至5位的甲基基团的胞嘧啶。
“约”意指在某值的±10％内。例如，如果指出“这些化合物影响KRAS的至少约70％抑制”，则暗示KRAS水平被抑制在60％和80％的范围内。
“给予(administration)”或“给予(administering)”是指将在此提供的化合物或组合物引入个体体内以执行其预定功能的途径。可以使用的给予途径的实例包括但不限于胃肠外给予，如皮下、静脉内、或肌内注射或输注。
“同时给予”或“共给予”意指以任何方式给予两种或更多种化合物，以此方式两者的药理作用在患者体内显现。同时给予不要求以单个药物组合物、以相同剂型、通过相同给予途径、或同时给予两种化合物。两种化合物的作用本身不需要同时显现出来。这些作用仅需重叠一段时间并且不需同延。同时给予或共给予涵盖并行地或顺序地给予。
“缓解”是指相关疾病、障碍、或病症的至少一种指标、体征、或症状的减轻。在某些实施例中，缓解包括病症或疾病的一种或多种指标的进展的延迟或减缓。指标的严重性可以通过本领域技术人员已知的主观或客观量度来确定。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、以及非人灵长类动物(包括但不限于猴和黑猩猩)。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测的或可测量的活性。在某些实施例中，反义活性是与不存在靶标的反义化合物的情况下的靶核酸水平或靶蛋白水平相比，靶核酸或由这样的靶核酸编码的蛋白质的量或表达的降低。
“反义化合物”意指包含反义寡核苷酸和任选地一种或多种另外的特征(如缀合物基团或端基)的化合物。反义化合物的实例包括单链的和双链的化合物，如反义寡核苷酸、核糖酶、siRNA、shRNA、ssRNA、以及基于占用的化合物。
“反义抑制”意指与不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在该反义化合物的情况下的靶核酸水平的降低。
“反义机制”是涉及化合物与靶核酸的杂交的所有那些机制，其中杂交的结果或作用是靶标降解或靶标占用，同时伴随涉及例如转录或剪接的细胞机器的停转。
“反义寡核苷酸”意指具有与靶核酸或其区域或区段互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，反义寡核苷酸可特异性地与靶核酸或其区域或区段杂交。
“二环核苷”或“BNA”意指包含二环糖部分的核苷。如在此使用的，“二环糖”或“二环糖部分”意指包含两个环的经修饰的糖部分，其中第二环经由连接第一环中的原子中的两个的桥而形成，由此形成二环结构。在某些实施例中，二环糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在某些实施例中，该二环糖部分不包括呋喃糖基部分。
“分支基团”意指具有至少3个以下位置的一组原子，这些位置能够与至少3个基团形成共价键。在某些实施例中，分支基团提供了用于经由缀合物接头和/或可切割的部分将束缚配体连接至寡核苷酸的多个反应性位点。
“靶向细胞的部分”意指能够结合至一种特定细胞类型或多种特定细胞类型的缀合物基团或缀合物基团的部分。
“cEt”或“受约束的乙基”意指包含连接4’-碳和2’-碳的桥的二环呋喃糖基糖部分，其中该桥具有化学式：4’-CH(CH3)-O-2’。
化合物中的“化学修饰”描述了通过该化合物中的任何单位的化学反应的取代或改变。“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一种修饰的核苷间连接、修饰的糖、和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“化学上不同的区域”是指反义化合物的在某种程度上来说与同一反义化合物的另一个区域在化学上不同的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域在化学上不同于具有没有2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合反义化合物”意指具有至少2个化学上不同的区域的反义化合物，每个位置具有多个亚单位。
“可切割的键”意指能够被分离的任何化学键。在某些实施例中，可切割的键选自：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个酯或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物、或肽。
“可切割的部分”意指在例如细胞、动物或人内的生理条件下被切割的原子的键或基团。
“受约束的乙基核苷”(亦是cEt核苷)意指包含以下二环糖部分的核苷，该二环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。
关于寡核苷酸的“互补”意指当将两个核碱基序列在相反方向上进行比对时，这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列。如在此描述的，核碱基匹配或互补核碱基限于腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)，除非另外说明。互补寡核苷酸和/或核酸无需在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。相比之下，关于寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”意指此类寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配。
“缀合物基团”意指附接至母体化合物(例如，寡核苷酸)的一组原子。
“缀合物接头”意指将缀合物基团连接至母体化合物(例如，寡核苷酸)的一组原子。
在寡核苷酸的背景下，“连续”是指彼此紧邻的核苷、核碱基、糖部分、或核苷间连接。例如，“连续核碱基”意指彼此紧邻的核碱基。
“设计”或“被设计为”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的寡聚化合物的过程。
“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未经修饰的DNA核苷是“不同修饰的”，虽然该DNA核苷是未经修饰的。同样地，DNA和RNA是“不同修饰的”，即使两者都是天然存在的未经修饰的核苷。除包含不同的核碱基以外相同的核苷不是不同修饰的。例如，包含2’-OMe修饰的糖和未经修饰的腺嘌呤核碱基的核苷与包含2’-OMe修饰的糖和未经修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不是不同修饰的。
“剂量”意指在单次给予中、或在指定的时间段内提供的药剂的指定量。在某些实施例中，剂量可以按两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂形式给予。例如，在某些实施例中，在希望皮下给予的情况下，所希望的剂量可以要求不是通过单次注射容易地提供的体积。在此类实施例中，可以使用两次或更多次注射达到所希望的剂量。在某些实施例中，剂量可以按两次或更多次注射给予，以使个体体内的注射部位反应最小化。在其他实施例中，经延长的时间段或连续地通过输注给予药剂。可以将剂量指明为每小时、每天、每周或每月的药剂的量。
“给药方案”是被设计为实现一种或多种所希望的效果的剂量的组合。
“双链的反义化合物”意指包含两种寡聚化合物的反义化合物，这两种寡聚化合物彼此互补并且形成双链体，并且其中这两种所述寡聚化合物之一包括反义寡核苷酸。
“有效量”意指足以在对药剂有需要的个体体内实现所希望的生理学结果的化合物的量。有效量在个体之间可以取决于有待治疗的个体的健康和身体状况、有待治疗的个体的分类群、组合物的配方、个体的医学症状的评估、以及其他相关因素而变化。
“功效”意指产生所希望的效果的能力。
“表达”包括借此以将基因的编码信息转变成存在于细胞中并且在细胞中运转的结构的所有功能。此类结构包括但不限于转录和翻译的产物。
关于寡核苷酸的“完全修饰的”意指以下修饰的寡核苷酸，在该寡核苷酸中每个核苷都被修饰。关于寡核苷酸的“一致修饰的”意指以下完全修饰的寡核苷酸，在该寡核苷酸中每个核苷的至少一种修饰是相同的。例如，一致修饰的寡核苷酸的核苷可以各自具有2’-MOE修饰但不同的核碱基修饰，并且核苷间连接可以是不同的。
“缺口体(gapmer)”意指嵌合的反义化合物，在该化合物中具有多个支持RNase H切割的核苷的内部区域被定位在具有一个或多个核苷的外部区域之间，其中这些包含内部区域的核苷在化学上不同于包含外部区域的该核苷或这些核苷。内部区域可以被称作“缺口(gap)”并且外部区域可以被称作“翼(wing)”。
“杂交”意指互补寡核苷酸和/或核酸分子的退火。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和核酸靶标。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸和核酸靶标。
“紧邻”意指在相同种类的紧邻元件之间不存在间插元件(例如在紧邻核碱基之间没有间插核碱基)。
“个体”意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制表达或活性”是指相对于未经处理的或对照样品中的表达或活性，表达或活性的降低或阻断，并且不一定指示表达或活性的彻底消除。
“核苷间连接”意指在寡核苷酸中的相邻核苷之间形成共价连接的基团或键。如在此使用的，“修饰的核苷间连接”意指除天然存在的、磷酸酯核苷间连接之外的任何核苷间连接。
“KRAS”意指KRAS的任何核酸或蛋白质。“KRAS核酸”意指编码KRAS的任何核酸。例如，在某些实施例中，KRAS核酸包括编码KRAS的DNA序列、从编码KRAS的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列(包括非蛋白编码(即非编码)RNA序列)、以及编码KRAS的mRNA序列。“KRAS mRNA”意指编码KRAS蛋白的mRNA。“KRAS”、“K-ras”、“kras”、“k-ras”、“Ki-ras”、和“ki-ras”可以按相互排斥的方式互换地使用，而无需提及核酸或蛋白质时将它们的拼写大写或斜体，除非明确地指明是相反的。
“KRAS特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性地抑制KRAS RNA和/或KRAS蛋白的表达或活性的任何试剂。例如，KRAS特异性抑制剂包括能够抑制KRAS RNA和/或KRAS蛋白的表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子、以及其他试剂。
“加长的反义寡核苷酸”是相对于在此披露的反义寡核苷酸(例如母体寡核苷酸)具有一个或多个另外的核苷的那些。
“线性修饰的糖”或“线性修饰的糖部分”意指包括非环状或非桥接修饰的经修饰的糖部分。此类线性修饰不同于二环糖修饰。
“连接的核苷”意指通过核苷间连接而连接在一起的相邻核苷。
“错配”或“非互补”意指当将第一和第二寡核苷酸进行比对时，该第一寡核苷酸的核碱基不与该第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基互补。例如，核碱基(包括但不限于通用核碱基、肌苷、和次黄嘌呤)能够与至少一个核碱基杂交，但是相对于它所杂交的核碱基仍是错配的或非互补的。作为另一个实例，当将第一和第二寡核苷酸进行比对时，不能够杂交到该第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基上的该第一寡核苷酸的核碱基是错配或非互补核碱基。
“调节”是指改变或调整细胞、组织、器官或生物体中的特征。例如，调节KRAS RNA可以意指升高或降低KRAS RNA和/或KRAS蛋白在细胞、组织、器官或生物体中的水平。“调节剂”在该细胞、组织、器官或生物体中实现该改变。例如，KRAS反义化合物可以是降低细胞、组织、器官或生物体中的KRAS RNA和/或KRAS蛋白的量的调节剂。
“单体”是指寡聚体的单个单位。单体包括但不限于核苷和核苷酸。
“基序”意指未经修饰的和/或修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接在寡核苷酸中的模式。
“天然的”或“天然存在的”意指在自然界中发现的。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、以及双链核酸。
“核碱基”意指能够与另一个核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基序列”意指独立于任何糖、连接、和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“核苷”意指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地是未经修饰的或修饰的。
“寡聚化合物”意指包含单个寡核苷酸和任选地一种或多种另外的特征(如缀合物基团或端基)的化合物。
“寡核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，这些核苷中的每个核苷都可以彼此独立地被修饰或不被修饰。
“母体寡核苷酸”意指其序列被用作具有类似的序列但不同的长度、基序、和/或化学的更多的寡核苷酸的设计基础的寡核苷酸。新设计的寡核苷酸可以具有与母体寡核苷酸相同的或重叠的序列。
“胃肠外给予”意指通过注射或输注给予。胃肠外给予包括皮下给予、静脉内给予、肌内给予、动脉内给予、腹膜内给予、或颅内给予(例如鞘内或脑室内给予)。
“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合于在给予动物中使用的任何物质。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液，如PBS或注射用水。如在此使用的，“药学上可接受的盐”意指化合物(如寡聚化合物)的生理学和药学上可接受的盐，即保留母体化合物的所希望的生物学活性并且不对其赋予不希望的毒理学效应的盐。
“药剂”意指当给予至个体时提供治疗益处的化合物。
“药物组合物”意指适于向个体给予的物质的混合物。例如，药物组合物可以包括一种或多种化合物或其盐和无菌水溶液。
“硫代磷酸酯连接”意指核苷之间的修饰的核苷间连接，其中磷酸二酯键通过用硫原子替换非桥氧原子之一而被修饰。
“磷部分”意指包含磷原子的一组原子。在某些实施例中，磷部分包括单-、二-、或三-磷酸酯、或硫代磷酸酯。
“部分”意指核酸的限定数目的连续(即，连接的)核碱基。在某些实施例中，一个部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施例中，一个部分是寡聚化合物的限定数目的连续核碱基。
“前药”意指当给予至个体时，被代谢为另一种形式的化合物的形式。在某些实施例中，代谢形式是该化合物(例如，药物)的活性、或更具活性形式。
“预防有效量”是指为动物提供预防性(prophylactic或preventative)益处的药剂量。
“区域”被定义为具有至少一种可辨认的结构、功能、或特征的靶核酸部分。
“RNAi化合物”意指至少部分地通过RISC或Ago2而非通过RNase H起作用以调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白质的化合物。RNAi化合物包括但不限于双链siRNA、单链RNA(ssRNA)、和微小RNA(包括微小RNA模拟物)。
“区段”被定义为核酸内的更小的区域或区域的子部分。
“副作用”意指除所希望的作用以外的可归因于治疗的生理疾病和/或病症。在某些实施例中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌肉疾病、以及不适。例如，血清中的转氨酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。
关于化合物的“单链的”意指该化合物仅具有一种寡核苷酸。“自我互补”意指寡核苷酸至少部分地与其自身杂交。由一种寡核苷酸组成的化合物(其中该化合物的寡核苷酸是自我互补的)是单链化合物。单链的反义化合物可以能够结合至互补化合物，以形成双链体。
如在此使用的，“位点”被定义为靶核酸内的独特核碱基位置。
“可特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸与靶核酸之间具有足够的互补性程度以诱导所希望的效应，同时对非靶核酸展现出最小效应或没有效应。在某些实施例中，特异性杂交在生理条件下发生。
“特异性地抑制”靶核酸意指减少或阻断该靶核酸的表达，同时对非靶核酸减少展现出较少的、最少的效应或没有效应，并且不一定指示该靶核酸表达的彻底消除。
“糖部分”意指可以将核碱基连接至另一个基团(如核苷间连接、缀合物基团、或端基)的一组原子。在某些实施例中，糖部分附接至核碱基，以形成核苷。如在此使用的，“未经修饰的糖部分”或“未经修饰的糖”意指2’-OH(H)呋喃糖基部分(如在RNA中发现的)、或2’-H(H)部分(如在DNA中发现的)。未经修饰的糖部分在1’、3’、和4’位的每处具有一个氢，在3’位处具有氧，并且在5’位处具有两个氢。如在此使用的，“修饰的糖部分”或“修饰的糖”意指包含非氢取代基代替未经修饰的糖部分的至少一个氢的修饰的呋喃糖基部分、或糖代用品。在某些实施例中，修饰的糖部分是2’-取代的糖部分。此类修饰的糖部分包括二环糖和线性修饰的糖。
“糖代用品”意指具有不同于呋喃糖基部分的修饰的糖部分，该修饰的糖部分可以将核碱基连接至另一个基团(如核苷间连接、缀合物基团、或端基)。可以将包含糖代用品的修饰的核苷掺入寡核苷酸内的一个或多个位置中。在某些实施例中，此类寡核苷酸能够杂交到互补寡聚化合物或核酸上。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”以及“核酸靶标”全部意指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶区域”意指一种或多种反义化合物所靶向的靶核酸部分。
“靶区段”意指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“端基”意指共价地连接至寡核苷酸的末端的化学基团或一组原子。
“治疗有效量”意指为个体提供治疗益处的化合物、药剂、或组合物的量。
“治疗”是指向动物给予化合物或药物组合物，以便实现该动物的疾病、障碍或病症的改变或改进。
某些实施例
某些实施例提供了用于抑制KRAS表达的方法、化合物和组合物。
某些实施例提供了靶向KRAS核酸的化合物。在某些实施例中，KRAS核酸具有GENBANK登录号NM_004985.4(通过引用结合在此，在此披露为SEQ ID NO:1)；GENBANK登录号NT_009714.17_TRUNC_18116000_18166000_COMP(通过引用结合在此，在此披露为SEQ IDNO:2)、或GENBANK登录号NM_033360.3(通过引用结合在此，在此披露为SEQ ID NO:3)中列出的序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由9至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少9个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由10至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少10个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由11至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少11个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由11至30个连接的核苷组成。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由12至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少12个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16至30个连接的核苷组成。
某些实施例提供了包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由SEQID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成。在某些实施例中，该化合物是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成，具有与SEQ ID NO:1的核苷酸463-478、877-892、1129-1144、1313-1328、1447-1462、1686-1701、1690-1705、1778-1793、1915-1930、1919-1934、1920-1935、2114-2129、2115-2130、2461-2476、2462-2477、2463-2478、4035-4050内的相等长度部分互补的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续核碱基的部分。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由在SEQ ID NO:1的核苷酸463-478、877-892、1129-1144、1313-1328、1447-1462、1686-1701、1690-1705、1778-1793、1915-1930、1919-1934、1920-1935、2114-2129、2115-2130、2461-2476、2462-2477、2463-2478、4035-4050内互补的8至80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续核碱基的部分的核碱基序列。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由10至30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物包括ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233，或者由其组成。在如以下实例部分中描述的筛选的超过2,000种反义寡核苷酸中，就效力和/或可耐受性而言，ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、和740233作为顶级先导化合物而出现。
在某些实施例中，上述寡核苷酸中任一种都包括至少一种修饰的核苷间连接、至少一种修饰的糖、和/或至少一种修饰的核碱基。
在某些实施例中，上述寡核苷酸中任一种都包括至少一种修饰的糖。在某些实施例中，至少一种修饰的糖包括2’-O-甲氧基乙基基团。在某些实施例中，至少一种修饰的糖是二环糖，如4’-CH(CH3)-O-2’基团、4’-CH2-O-2’基团、或4’-(CH2)2-O-2’基团。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷间连接，如硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施例中，上述寡核苷酸中任一种都包括至少一种修饰的核碱基，如5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，上述寡核苷酸中任一种都包括：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；和
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。在某些实施例中，该寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个所列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个所列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该寡核苷酸由16至30个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个所列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个所列举的序列组成的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核碱基组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、和854中任一个所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷都包括受约束的乙基(cEt)核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核碱基组成，具有包含SEQ ID NO:2130中所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由九个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由一个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由六个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段包括cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、和2’-O-甲氧基乙基核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核碱基组成，具有包含SEQ ID NO:804、1028、和2136中任一个所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由四个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核碱基组成，具有包含SEQ ID NO:2142中所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由八个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由六个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核碱基组成，具有包含SEQ ID NO:2154中所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由九个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由五个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括以下修饰的寡核苷酸或由其组成，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核碱基组成，具有包含SEQ ID NO:2158中所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由八个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由五个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、cEt核苷、和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、脱氧核苷、cEt核苷、脱氧核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括ISIS 651987或其盐或者由ISIS 651987或其盐组成，该ISIS 651987或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包括ISIS 696018或其盐或者由ISIS 696018或其盐组成，该ISIS 696018或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包括ISIS 696044或其盐或者由ISIS 696044或其盐组成，该ISIS 696044或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包括ISIS 716600或其盐或者由ISIS 716600或其盐组成，该ISIS 716600或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包括ISIS 716655或其盐或者由ISIS 716655或其盐组成，该ISIS 716655或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包括ISIS 740233或其盐或者由ISIS 740233或其盐组成，该ISIS 740233或其盐具有以下化学结构：
在某些实施例中，化合物包括ISIS 746275或其盐或者由ISIS 746275或其盐组成，该ISIS 746275或其盐具有以下化学结构：
在上述实施例的任一项中，该化合物或寡核苷酸可以与编码KRAS的核酸是至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％互补的。
在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在某些实施例中，该化合物包括脱氧核糖核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该化合物是双链的并且包括核糖核苷酸。
在上述实施例的任一项中，该寡核苷酸可以由8至80、16至80、10至30、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、或16至50个连接的核苷组成。
在某些实施例中，化合物包括在此描述的修饰的寡核苷酸、和缀合物基团。在某些实施例中，该缀合物基团在该修饰的寡核苷酸的5’端连接至该修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该缀合物基团在该修饰的寡核苷酸的3’端连接至该修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该缀合物基团包括至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、至少两个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、或至少三个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
在某些实施例中，在此提供的化合物或组合物包括该修饰的寡核苷酸的盐。在某些实施例中，该盐是钠盐。在某些实施例中，该盐是钾盐。
在某些实施例中，如在此描述的化合物或组合物由于具有小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM、小于90nM、小于80nM、小于70nM、小于65nM、小于60nM、小于55nM、小于50nM、小于45nM、小于40nM、小于35nM、小于30nM、小于25nM、或小于20nM的体外IC50中的至少之一而是有活性的。
在某些实施例中，如在此描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过具有相对于经处理的对照动物丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)值不超过4倍、3倍、或2倍的增加或者与对照处理的动物相比肝、脾、或肾重量不超过30％、20％、15％、12％、10％、5％、或2％的增加中至少一者所证明的。在某些实施例中，如在此描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过相对于对照处理的动物ALT或AST没有增加所证明的。在某些实施例中，如在此描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过相对于对照处理的动物肝、脾、或肾重量没有增加所证明的。
某些适应症
在此提供的某些实施例涉及通过给予KRAS特异性抑制剂(如靶向KRAS的化合物)来抑制KRAS表达的方法，这些方法可以用于治疗、预防、或缓解个体的癌症。癌症类型的实例包括但不限于肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、胃肠道癌(例如大肠癌、小肠癌、和胃癌)、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、造血系统癌(例如白血病、髓细胞性白血病、和淋巴瘤)、脑癌(例如恶性胶质瘤)、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、1型神经纤维瘤病(NF1)突变型MPNST、或神经纤维瘤。在某些实施例中，该癌症具有表达突变型KRAS的癌细胞。
在某些实施例中，治疗、预防、或缓解癌症的方法包括向该个体给予KRAS特异性抑制剂，由此治疗、预防、或缓解癌症。在某些实施例中，该癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、胃肠道癌(例如大肠癌、小肠癌、和胃癌)、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、造血系统癌(例如白血病、髓细胞性白血病、和淋巴瘤)、脑癌(例如恶性胶质瘤)、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、1型神经纤维瘤病(NF1)突变型MPNST、或神经纤维瘤。在某些实施例中，该癌症具有表达突变型KRAS的癌细胞。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是靶向KRAS的化合物，如靶向KRAS的反义寡核苷酸。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地给予至该个体。在某些实施例中，给予该化合物减少个体体内癌细胞的数目，减小个体体内肿瘤的大小，减少或抑制个体体内肿瘤的生长或增殖，防止转移或减小转移的范围，和/或延长患有癌症的个体的存活(包括但不限于无进展存活(PFS)或总体存活)。
在某些实施例中，抑制患有癌症、或处于患上癌症的风险的个体体内的KRAS表达的方法包括向该个体给予KRAS特异性抑制剂，由此抑制该个体体内的KRAS表达。在某些实施例中，该癌症表达突变型KRAS。在某些实施例中，给予该抑制剂抑制KRAS在肿瘤，如肺、胃肠道系统、膀胱、肝、食道、胰腺、胆道、乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈、前列腺、或脑中的肿瘤中的表达。在某些实施例中，给予该KRAS特异性抑制剂抑制突变型KRAS的表达。在某些实施例中，相对于野生型KRAS，给予该KRAS特异性抑制剂选择性地抑制突变型KRAS的表达。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ IDNO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，抑制细胞中的KRAS表达的方法包括使该细胞与KRAS特异性抑制剂接触，由此抑制该细胞中的KRAS表达。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该细胞在肺、胃肠道系统、膀胱、肝、食道、胰腺、胆道、乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈、前列腺、或脑中。在某些实施例中，该细胞在患有癌症、或处于患上癌症的风险的个体的肺、胃肠道系统、膀胱、肝、食道、胰腺、胆道、乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈、前列腺、或脑中。在某些实施例中，该癌细胞表达突变型KRAS，并且使该癌细胞与该KRAS特异性抑制剂接触抑制该癌细胞中的突变型KRAS表达。在某些实施例中，使该癌细胞与该KRAS特异性抑制剂接触选择性地抑制突变型KRAS的表达。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，减少个体体内癌细胞的数目、减小个体体内肿瘤的大小、减少或抑制个体体内肿瘤的生长或增殖、防止转移或减小转移的范围、和/或延长患有癌症的个体的存活(包括但不限于无进展存活(PFS)或总体存活)的方法包括向该个体给予KRAS特异性抑制剂。在某些实施例中，该抑制剂是靶向KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是选择性地靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该癌细胞或肿瘤表达突变型KRAS。在某些实施例中，向该个体给予该KRAS特异性抑制剂选择性地减少表达突变型KRAS的癌细胞的数目，选择性地减小表达突变型KRAS的肿瘤的大小，选择性地减少或抑制表达突变型KRAS的肿瘤的生长或增殖，选择性地防止表达突变型KRAS的肿瘤的转移或减小转移的范围，和/或相对于表达野生型KRAS的细胞、肿瘤、和癌症选择性地延长患有表达突变型KRAS的癌症的个体的存活。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地给予至该个体。
某些实施例起草涉及用于在治疗癌症中使用的KRAS特异性抑制剂上。在某些实施例中，该癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、胃肠道癌(例如大肠癌、小肠癌、和胃癌)、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、造血系统癌(例如白血病、髓细胞性白血病、和淋巴瘤)、脑癌(例如恶性胶质瘤)、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、1型神经纤维瘤病(NF1)突变型MPNST、或神经纤维瘤。在某些实施例中，该癌症表达突变型KRAS。在某些实施例中，该抑制剂是靶向KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是选择性地靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ IDNO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地给予至该个体。
某些实施例起草涉及用于在减少个体体内癌细胞的数目、减小个体体内肿瘤的大小、减少或抑制个体体内肿瘤的生长或增殖、防止转移或减小转移的范围、和/或延长患有癌症或处于患上癌症的风险的个体的存活(包括但不限于无进展存活(PFS)或总体存活)中使用的KRAS特异性抑制剂。在某些实施例中，这些癌细胞或肿瘤表达突变型KRAS。在某些实施例中，该抑制剂是靶向KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是用于在以下项中使用的选择性地靶向突变型KRAS的化合物：选择性地减少个体体内癌细胞的数目，选择性地减小个体体内肿瘤的大小，选择性地减少或抑制个体体内肿瘤的生长或增殖，选择性地防止转移或减小转移的范围，和/或选择性地延长患有表达突变型KRAS的癌症或处于患上该癌症的风险的个体的存活(包括但不限于无进展存活(PFS)或总体存活)。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ IDNO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地给予至该个体。
某些实施例起草涉及KRAS特异性抑制剂用于生产治疗癌症用的药剂的用途。某些实施例起草涉及KRAS特异性抑制剂用于制备治疗癌症用的药剂的用途。在某些实施例中，该癌症表达突变型KRAS。在某些实施例中，该癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、胃肠道癌(例如大肠癌、小肠癌、和胃癌)、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、造血系统癌(例如白血病、髓细胞性白血病、和淋巴瘤)、脑癌(例如恶性胶质瘤)、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、1型神经纤维瘤病(NF1)突变型MPNST、或神经纤维瘤。在某些实施例中，该抑制剂是靶向KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是选择性地靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ IDNO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地给予至该个体。
某些实施例起草涉及KRAS特异性抑制剂用于生产或制备用于在以下项中使用的药剂的用途：减少个体体内癌细胞的数目、减小个体体内肿瘤的大小、减少或抑制个体体内肿瘤的生长或增殖、防止转移或减小转移的范围、和/或延长患有癌症或处于患上癌症的风险的个体的存活(包括但不限于无进展存活(PFS)或总体存活)。在某些实施例中，该癌细胞或肿瘤表达突变型KRAS。在某些实施例中，该抑制剂是靶向KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是靶向KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该抑制剂是用于生产或制备用于在以下项中使用的药剂的选择性地靶向突变型KRAS的化合物：选择性地减少个体体内癌细胞的数目，选择性地减小个体体内肿瘤的大小，选择性地减少或抑制个体体内肿瘤的生长或增殖，选择性地防止转移或减小转移的范围，和/或选择性地延长患有表达突变型KRAS的癌症或处于患上该癌症的风险的个体的存活(包括但不限于无进展存活(PFS)或总体存活)。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190的核碱基序列中任一个的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成并且具有由SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是包含以下修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ IDNO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、804、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、或740233。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#651987。在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂是ISIS#746275。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链寡核苷酸。在上述实施例的任一项中，该修饰的寡核苷酸可以由10至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，将该化合物胃肠外地给予至该个体。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是靶向KRAS的化合物、靶向突变型KRAS的化合物、或选择性地靶向突变型KRAS的化合物。在某些实施例中，该化合物是反义寡核苷酸，例如由8至80个连接的核苷、10至30个连接的核苷、12至30个连接的核苷、或16个连接的核苷组成的反义寡核苷酸。在某些实施例中，该反义寡核苷酸与SEQ IDNO:1-3所列举的核碱基序列中任一个是至少80％、85％、90％、95％或100％互补的。在某些实施例中，该反义寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷间连接、至少一种修饰的糖和/或至少一种修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接，该修饰的糖是二环糖或2’-O-甲氧基乙基，并且该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包括由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段，其中该缺口区段被定位成紧邻该5’翼区段和该3’翼区段并且位于它们之间，并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。
在上述实施例的任一项中，该反义寡核苷酸由12至30、15至30、15至25、15至24、16至24、17至24、18至24、19至24、20至24、19至22、20至22、16至20、或17或20个连接的核苷组成。在某些方面中，该反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1-3所列举的核碱基序列中任一个是至少80％、85％、90％、95％或100％互补的。在某些方面中，该反义寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷间连接、至少一种修饰的糖和/或至少一种修饰的核碱基。在某些方面中，该修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接，该修饰的糖是二环糖或2’-O-甲氧基乙基，并且该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些方面中，该修饰的寡核苷酸包括由连接的2’-脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段，其中该缺口区段被定位成紧邻该5’翼区段和该3’翼区段并且位于它们之间，并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至30个连接的核苷组成，具有包含SEQID NO:13-2190中任一个的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；和
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:239、272、569、607、615、621、640、655、678、715、790、和854中任一个所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷都包括受约束的乙基(cEt)核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:2130所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由九个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由一个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由六个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段包括cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、和2’-O-甲氧基乙基核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸具有包含任何SEQ ID NO:804、1028、和2136中任一个所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由四个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:2142所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由八个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由六个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:2154所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由九个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由五个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以是包含以下修饰的寡核苷酸或由其组成的化合物，该修饰的寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:2158所列举的序列或由其组成的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括
由八个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由五个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、cEt核苷、和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、脱氧核苷、cEt核苷、脱氧核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-80个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16-30个连接的核苷组成。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。
在上述方法或用途的任一项中，该KRAS特异性抑制剂可以胃肠外地给予。例如，在某些实施例中，该KRAS特异性抑制剂可以通过注射或输注来给予。胃肠外给予包括皮下给予、静脉内给予、肌内给予、动脉内给予、腹膜内给予、或颅内给予(例如鞘内或脑室内给予)。
反义化合物
在某些实施例中提供了反义化合物。在某些实施例中，反义化合物包括至少一种寡核苷酸。在某些实施例中，反义化合物由寡核苷酸组成。在某些实施例中，反义化合物由附接至一个或多个缀合物基团的寡核苷酸组成。在某些实施例中，反义化合物由经由一个或多个缀合物接头、和/或可切割的部分而附接至一个或多个缀合物基团的寡核苷酸组成。在某些实施例中，反义化合物的寡核苷酸被修饰。在某些实施例中，反义化合物的寡核苷酸可以具有任何核碱基序列。在某些实施例中，反义化合物的寡核苷酸是具有与靶核酸互补的核碱基序列的反义寡核苷酸。在某些实施例中，反义寡核苷酸与信使RNA(mRNA)互补。
在某些实施例中，反义化合物具有以下核碱基序列，当按5’至3’方向编写时，该核碱基序列包括所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施例中，反义化合物长10至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长12至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长12至22个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长14至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长14至20个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长15至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长15至20个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长16至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长16至20个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长17至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长17至20个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长18至30个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长18至21个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长18至20个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长20至30个亚单位。换言之，此类反义化合物对应地是从12至30个连接的亚单位、14至30个连接的亚单位、14至20个亚单位、15至30个亚单位、15至20个亚单位、16至30个亚单位、16至20个亚单位、17至30个亚单位、17至20个亚单位、18至30个亚单位、18至20个亚单位、18至21个亚单位、20至30个亚单位、或12至22个连接的亚单位。在某些实施例中，反义化合物长14个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长16个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长17个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长18个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长19个亚单位。在某些实施例中，反义化合物长20个亚单位。在其他实施例中，该反义化合物是8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50、或20至30个连接的亚单位。在某些这样的实施例中，这些反义化合物长8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或80个连接的亚单位，或由以上值中任两个所限定的范围。在一些实施例中，该反义化合物是反义寡核苷酸，并且这些连接的亚单位是核苷酸、核苷、或核碱基。
在某些实施例中，该反义化合物或寡聚化合物可以进一步包括另外的附接至该寡核苷酸的特征或元件，如缀合物基团。在缀合物基团包括核苷(即将该缀合物基团连接至该寡核苷酸的核苷)的实施例中，该缀合物基团的核苷未被算在该寡核苷酸的长度中。
在某些实施例中，反义化合物可以被缩短或截短。例如，可以从5’端(5’截短)、或可替代地从3’端(3’截短)删除单个亚单位。靶向KRAS核酸的经缩短的或经截短的反义化合物可以从该反义化合物的5’端删除两个亚单位，或可替代地，可以从该反义化合物的3’端删除两个亚单位。可替代地，被删除的核苷可以分散遍及该反义化合物。
当单个的另外的亚单位存在于加长的反义化合物中时，该另外的亚单位可以位于该反义化合物的5’或3’端。当两个或更多个另外的亚单位存在时，所添加的亚单位可以彼此相邻，例如，在向反义化合物的5’端(5’添加)、或可替代地向3’端(3’添加)添加了两个亚单位的反义化合物中。可替代地，所添加的亚单位可以分散遍及该反义化合物，例如，在向5’端添加了一个亚单位并且向3’端添加了一个亚单位的反义化合物中。
有可能增大或减小反义化合物(如反义寡核苷酸)的长度，和/或引入错配碱基而不消除活性(Woolf等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:7305-7309，1992；Gautschi等人，J.Natl.Cancer Inst.[美国国立癌症研究所杂志]93:463-471，2001年3月；Maher和Dolnick，Nuc.Acid.Res.[核酸研究]16:3341-3358，1988)。然而，表面上看来，寡核苷酸序列、化学和基序中的小变化可以在临床开发所需的许多特性的一者或多者中造成较大的差异(Seth等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]2009，52，10；Egli等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]2011，133，16642)。
在某些实施例中，反义化合物是单链的，由一种寡聚化合物组成。此类单链反义化合物的寡核苷酸是反义寡核苷酸。在某些实施例中，单链反义化合物的反义寡核苷酸被修饰。在某些实施例中，单链反义化合物或寡聚化合物的寡核苷酸包括自我互补的核碱基序列。在某些实施例中，反义化合物是双链的，包含形成双链体的两种寡聚化合物。在某些这样的实施例中，双链反义化合物的一种寡聚化合物包括一个或多个缀合物基团。在某些实施例中，双链反义化合物的每种寡聚化合物包括一个或多个缀合物基团。在某些实施例中，双链反义化合物的每种寡核苷酸都是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，双链反义化合物的一种寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，双链反义化合物的一种寡核苷酸是反义寡核苷酸。在某些这样的实施例中，该反义寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。单链的和双链的反义化合物的实例包括但不限于反义寡核苷酸、siRNA、靶向寡核苷酸的微小RNA、以及单链RNAi化合物，如小发夹RNA(shRNA)、单链siRNA(ssRNA)、和微小RNA模拟物。
在某些实施例中，反义化合物是干扰RNA化合物(RNAi)，这包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此类化合物至少部分地通过RISC途径起作用,以降解和/或螯合靶核酸(因此，包括微小RNA/微小RNA模拟化合物)。如在此使用的，术语siRNA意在与用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语是等效的，这些核酸分子是例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)、以及其他。另外，如在此使用的，术语RNAi意在与用于描述序列特异性RNA干扰(如转录后基因沉默、翻译抑制、或表观遗传学)的其他术语是等效的。
在某些实施例中，双链化合物可以包括靶向在此描述的KRAS的寡核苷酸序列中的任一个。在某些实施例中，双链化合物包括第一链和第二链，该第一链包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基的部分。在某些实施例中，双链化合物包括第一链和第二链，该第一链包含SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该双链化合物包括核糖核苷酸，在这些核糖核苷酸中第一链具有代替SEQ ID NO:13-2190的任一个中的胸腺嘧啶(T)的尿嘧啶(U)。在某些实施例中，双链化合物包括(i)第一链，其包含与KRAS上的SEQ ID NO:13-2190中任一个所靶向的位点互补的核碱基序列，和(ii)第二链。在某些实施例中，该双链化合物包括一个或多个修饰的核苷酸，在这些核苷酸中糖中的2'位包含卤素(如氟基团；2’-F)或包含烷氧基基团(如甲氧基基团；2’-OMe)。在某些实施例中，该双链化合物包括至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰。在某些实施例中，对于沿着该dsRNA化合物的链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基而言，该至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰被安排成交替模式。在某些实施例中，该双链化合物在相邻核苷酸之间包括除天然存在的磷酸二酯连接之外的一种或多种连接。此类连接的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯连接。这些双链化合物还可以是化学修饰的核酸分子，如在美国专利号6,673,661中所传授的。在其他实施例中，该dsRNA包含一条或两条加帽链，如由例如2000年4月19日提交的WO 00/63364所披露的。在某些实施例中，该双链化合物的第一链是siRNA引导链，并且该双链化合物的第二链是siRNA过客链。在某些实施例中，该双链化合物的第二链与第一链互补。在某些实施例中，该双链化合物的每条链都由16、17、18、19、20、21、22、或23个连接的核苷组成。在某些实施例中，该双链化合物的第一或第二链可以包括缀合物基团。
在某些实施例中，单链RNAi(ssRNAi)化合物可以包括靶向在此描述的KRAS的寡核苷酸序列中的任一个。在某些实施例中，ssRNAi化合物包括SEQ ID NO:13-2190中任一个的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基的部分。在某些实施例中，ssRNAi化合物包括SEQ ID NO:13-2190中任一个的核碱基序列。在某些实施例中，该ssRNAi化合物包括核糖核苷酸，在这些核糖核苷酸中尿嘧啶(U)代替SEQ ID NO:13-2190的任一个中的胸腺嘧啶(T)。在某些实施例中，ssRNAi化合物包括与KRAS上的SEQ ID NO:13-2190中任一个所靶向的位点互补的核碱基序列。在某些实施例中，ssRNAi化合物包括一个或多个修饰的核苷酸，在这些核苷酸中糖中的2'位包含卤素(如氟基团；2’-F)或包含烷氧基基团(如甲氧基基团；2’-OMe)。在某些实施例中，ssRNAi化合物包括至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰。在某些实施例中，对于沿着该ssRNAi化合物的链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基而言，该至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰被安排成交替模式。在某些实施例中，该ssRNAi化合物在相邻核苷酸之间包括除天然存在的磷酸二酯连接之外的一种或多种连接。此类连接的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯连接。这些ssRNAi化合物还可以是化学修饰的核酸分子，如在美国专利号6,673,661中所传授的。在其他实施例中，该ssRNAi包含加帽链，如由例如2000年4月19日提交的WO 00/63364所披露的。在某些实施例中，该ssRNAi化合物由16、17、18、19、20、21、22、或23个连接的核苷组成。在某些实施例中，该ssRNAi化合物可以包括缀合物基团。
在某些实施例中，反义化合物包括修饰的寡核苷酸。某些修饰的寡核苷酸具有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体、和其他立体异构构型，就绝对立体化学而言，它们可以被定义为(R)或(S)，或定义为α或β(如针对糖异头物)，或定义为(D)或(L)(如针对氨基酸)等。在此提供的修饰的寡核苷酸中包括所有此类可能的异构体，包括其外消旋的和光学纯的形式，除非另外说明。同样地，也包括所有顺式异构体和反式异构体以及互变异构形式。
某些反义化合物机制
在某些实施例中，反义化合物能够杂交到靶核酸上，从而产生至少一种反义活性。在某些实施例中，反义化合物特异性地影响一个或多个靶核酸。此类特异性反义化合物包括杂交到一个或多个靶核酸上的核碱基序列，从而产生一种或多种所希望的反义活性，并且不杂交到一个或多个非靶核酸上或不以产生所不希望的反义活性的这样一种方式杂交到一个或多个非靶核酸上。
在某些反义活性中，反义化合物与靶核酸的杂交导致募集切割该靶核酸的蛋白质。例如，某些反义化合物导致RNase H介导的靶核酸切割。RNase H是一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。这样的RNA:DNA双链体中的DNA不必是未经修饰的DNA。在某些实施例中，本发明提供了足够“像DNA(DNA-like)”以引起RNase H活性的反义化合物。进一步地，在某些实施例中，在缺口体的缺口中耐受一个或多个非DNA样核苷。
在某些反义活性中，将反义化合物或反义化合物的一部分加载到RNA诱导沉默复合体(RISC)中，从而最终导致靶核酸的切割。例如，某些反义化合物导致该靶核酸被Argonaute切割。在某些实施例中，加载到RISC中的反义化合物是RNAi化合物。
在某些实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交不导致募集切割该靶核酸的蛋白质。在某些这样的实施例中，该反义化合物与该靶核酸的杂交导致该靶核酸的剪接的改变。在某些实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸与蛋白质或其他核酸之间的结合相互作用的抑制。在某些这样的实施例中，反义化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸的翻译的改变。
可以直接地或间接地观察到反义活性。在某些实施例中，反义活性的观察或检测涉及观察或检测靶核酸或由这样的靶核酸编码的蛋白质的量的变化、核酸或蛋白质的剪接变体的比率的变化、和/或细胞或动物中的表型变化。
在某些实施例中，与非缺口体寡核苷酸相比或与具有其他糖基序的缺口体相比，具有在此描述的缺口体糖基序的修饰的寡核苷酸具有令人希望的特性。在某些情况下，令人希望的是鉴定产生强效的反义活性和相对较低的毒性的有利组合的基序。在某些实施例中，本发明的化合物具有有利的治疗指数(活性的量度除毒性的量度)。
靶核酸、靶区域以及核苷酸序列
在某些实施例中，反义化合物包括以下寡核苷酸或由其组成，该寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域。在某些实施例中，该靶核酸是内源RNA分子。在某些实施例中，该靶核酸编码蛋白质。在某些这样的实施例中，该靶核酸选自：mRNA和前mRNA，包括内含子区、外显子区和非翻译区。在某些实施例中，该靶RNA是mRNA。在某些实施例中，该靶核酸是前mRNA。在某些这样的实施例中，该靶区域整个在内含子内。在某些实施例中，该靶区域跨内含子/外显子接点。在某些实施例中，该靶区域的至少50％在内含子内。
编码KRAS的核苷酸序列包括但不限于GENBANK登录号NM_004985.4(通过引用而结合，在此披露为SEQ ID NO:1)；GENBANK登录号NT_009714.17_TRUNC_18116000_18166000_COMP(通过引用而结合，在此披露为SEQ ID NO:2)、和GENBANK登录号NM_033360.3(通过引用而结合，在此披露为SEQ ID NO:3)。
杂交
在一些实施例中，杂交发生在此处披露的反义化合物与KRAS核酸之间。最常见的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合)。
杂交能在不同的条件下发生。杂交条件是序列依赖性的，并且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
测定序列是否可与靶核酸特异性地杂交的方法是本领域熟知的。在某些实施例中，在此提供的反义化合物可与KRAS核酸特异性地杂交。
互补性
当将两个核碱基序列在相反方向上进行比对时，这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列，寡核苷酸被说成与另一个核酸互补。如在此描述的，核碱基匹配或互补核碱基限于腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)，除非另外说明。互补寡核苷酸和/或核酸无需在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。当此类寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配时，寡核苷酸是完全互补的或100％互补的。
反义化合物与KRAS核酸之间的非互补核碱基可以被耐受，只要该反义化合物仍然能够与靶核酸特异性地杂交。此外，反义化合物可以杂交到KRAS核酸的一个或多个区段上，使得间插或相邻区段不涉及在杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施例中，在此提供的反义化合物、或其指定部分与、或至少与KRAS核酸、其靶区域、靶区段、或指定部分是70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％,、或100％互补的。反义化合物与靶核酸的百分比互补性可以使用常规方法测定。
例如，在反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补，并且因此特异性杂交的反义化合物代表90％的互补性。在这个实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补核碱基成簇或散布，并且不需要彼此连续或与互补核碱基连续。因此，长18个核碱基、具有由与靶核酸完全互补的两个区域侧接的四个非互补核碱基的反义化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性，并且因此落入本发明的范围内。使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Genome Res.[基因组研究]，1997，7，649-656)可以常规地确定反义化合物与靶核酸区域的百分比互补性。可以通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，1981，2，482489)算法的Gap程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，用于Unix的版本8，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊大学科技园(University ResearchPark,Madison Wis.))，使用默认设置确定百分比同源性、序列一致性或互补性。
在某些实施例中，在此提供的反义化合物、或其指定部分与靶核酸、或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可以与KRAS核酸、或其靶区域、或靶区段或靶序列完全互补。如在此使用的，“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基都能够与靶核酸的对应核碱基进行精确碱基配对。例如，20个核碱基的反义化合物与400个核碱基长的靶序列完全互补，只要存在与该反义化合物完全互补的靶核酸的相应的20个核碱基部分。完全互补也可以关于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。例如，30个核碱基的反义化合物的20个核碱基部分可以与400个核碱基长的靶序列“完全互补”。30个核碱基的寡核苷酸的20个核碱基部分与该靶序列完全互补，如果该靶序列具有相应的20个核碱基部分，其中每个核碱基与该反义化合物的20个核碱基部分互补的话。同时，整个30个核碱基的反义化合物可以完全或可以不完全与该靶序列互补，取决于该反义化合物的剩余10个核碱基是否也与该靶序列互补。
在某些实施例中，相对于该靶核酸，反义化合物包括一个或多个错配的核碱基。在某些这样的实施例中，针对该靶标的反义活性被此类错配降低，但是针对非靶标的活性被降低更大的量。因此，在某些这样的实施例中，该反义化合物的选择性得以改进。在某些实施例中，该错配特异性地位于具有缺口体基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施例中，该错配在离该缺口区域的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、或8处。在某些这样的实施例中，该错配在离该缺口区域的3’-端的位置9、8、7、6、5、4、3、2、1处。在某些这样的实施例中，该错配在离该翼区域的5’-端的位置1、2、3、或4处。在某些这样的实施例中，该错配在离该翼区域的3’-端的位置4、3、2、或1处。
非互补核碱基的位置可以在该反义化合物的5’端或3’端处。可替代地，这一个或多个非互补核碱基可以在该反义化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即连接的)或不连续的。在一个实施例中，非互补核碱基位于缺口体反义寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施例中，长、或长达11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(如KRAS核酸)、或其指定部分包括不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施例中，长、或长达11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(如KRAS核酸)、或其指定部分包括不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个非互补核碱基。
所提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的那些。如在此使用的，“部分”是指靶核酸的区域或区段内确定数目的连续的(即连接的)核碱基。“部分”也可以指反义化合物的确定数目的连续核碱基。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少8个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少9个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少10个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少11个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少12个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少13个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少14个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少15个核碱基的部分互补。在某些实施例中，这些反义化合物与靶区段的至少16个核碱基的部分互补。还考虑了与靶区段的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个核碱基的部分、或由这些值中任两个所限定的范围互补的反义化合物。
一致性
在此提供的反义化合物也可以与特定核苷酸序列、SEQ ID NO、或由特定Isis编号代表的化合物、或其部分具有确定的百分比一致性。如在此使用的，如果反义化合物具有与在此披露的序列相同的核碱基配对能力，则该反义化合物与在此披露的序列是一致的。例如，代替披露的DNA序列中的胸腺嘧啶而包含尿嘧啶的RNA被认为与该DNA序列是一致的，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶两者均与腺嘌呤配对。还考虑了在此描述的反义化合物的缩短和加长形式以及相对于在此提供的反义化合物具有非一致碱基的化合物。这些非一致碱基可以彼此相邻或分散遍及该反义化合物。反义化合物的百分比一致性根据相对于与它正在进行比较的序列具有一致碱基配对的碱基数来计算。
在某些实施例中，这些反义化合物、或其部分与、或至少与在此披露的反义化合物或SEQ ID NO中的一个或多个、或其部分是70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的。
在某些实施例中，将该反义化合物的一部分与该靶核酸的相同长度部分进行比较。在某些实施例中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核碱基的部分与该靶核酸的相同长度部分进行比较。
在某些实施例中，将该反义寡核苷酸的一部分与该靶核酸的相同长度部分进行比较。在某些实施例中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核碱基的部分与该靶核酸的相同长度部分进行比较。
修饰
对反义化合物的修饰涵盖对核苷间连接、糖部分或核碱基的取代或改变。由于令人希望的特性，例如像增强的细胞摄取、对核酸靶标的增强的亲和力、在核酸酶存在下增加的稳定性、或增加的抑制活性，修饰的反义化合物相对于天然形式通常是优选的。
化学修饰的核苷也可以用于增加缩短或截短的反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，用具有这类化学修饰的核苷的较短的反义化合物通常能获得可比的结果。
修饰的核苷间连接
RNA和DNA中天然存在的核苷间连接是3’到5’的磷酸二酯连接。由于令人希望的特性，例如像增强的细胞摄取、对靶核酸的增强的亲和力、和在核酸酶存在下增加的稳定性，具有一个或多个修饰的(即非天然存在的)核苷间连接的反义化合物通常被选择为优于具有天然存在的核苷间连接的反义化合物。
具有修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间连接以及不具有磷原子的核苷间连接。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、以及硫代磷酸酯。制备含磷连接和非含磷连接的方法是熟知的。
在某些实施例中，可以使用任何核苷间连接将修饰的寡核苷酸的核苷连接在一起。通过存在或不存在磷原子来定义两类主要的核苷间连接基团。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于包含磷酸二酯键(“P＝O”)的磷酸酯(也被称为未经修饰的或天然存在的连接)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、以及硫代磷酸酯(“P＝S”)和二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性的非含磷核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(＝O)-S-)、硫氨酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；以及N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然存在的磷酸酯连接相比，修饰的核苷间连接可以用于改变(典型地是增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施例中，具有手性原子的核苷间连接可以被制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。代表性的手性核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷核苷间连接和非含磷核苷间连接的方法是本领域的技术人员所熟知的。
中性核苷间连接包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5’)、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5’)、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5’)、缩甲乙醛(formacetal)(3'-O-CH2-O-5’)、甲氧丙基、以及硫代缩甲乙醛(3'-S-CH2-O-5’)。另外的中性核苷间连接包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺的非离子连接(参见例如：反义研究中的碳水化合物修饰(Carbohydrate Modifications inAntisense Research)；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编辑，ACS研讨会文集580；第3和第4章，40-65)。另外的中性核苷间连接包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子连接。
在某些实施例中，靶向KRAS核酸的反义化合物包括一个或多个修饰的核苷间连接。在某些实施例中，这些修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在某些实施例中，反义化合物的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域安排成限定模式或修饰的核苷间连接基序的修饰的核苷间连接。在某些实施例中，核苷间连接被安排成带缺口的基序。在这样的实施例中，两个翼区域的每个中的核苷间连接与缺口区域中的核苷间连接是不同的。在某些实施例中，翼中的核苷间连接是磷酸二酯，并且缺口中的核苷间连接是硫代磷酸酯。独立地选择核苷基序，所以具有带缺口的核苷间连接基序的此类寡核苷酸可以具有或可以没有带缺口的核苷基序，并且如果它的确具有带缺口的核苷基序，则翼和缺口长度可以相同或可以不相同。
在某些实施例中，寡核苷酸包括具有交替的核苷间连接基序的区域。在某些实施例中，本发明的寡核苷酸包括一致修饰的核苷间连接的区域。在某些这样的实施例中，该寡核苷酸包括通过硫代磷酸酯核苷间连接均匀地连接的区域。在某些实施例中，该寡核苷酸通过硫代磷酸酯均匀地连接。在某些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷间连接都选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷间连接都选自磷酸二酯和硫代磷酸酯，并且至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯。
在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少6个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少8个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少10个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少一个具有至少6个连续硫代磷酸酯核苷间连接的嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少一个具有至少8个连续硫代磷酸酯核苷间连接的嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少一个具有至少10个连续硫代磷酸酯核苷间连接的嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少一个具有至少12个连续硫代磷酸酯核苷间连接的嵌段。在某些这样的实施例中，至少一个此类嵌段位于该寡核苷酸的3’端。在某些这样的实施例中，至少一个此类嵌段位于该寡核苷酸的3’端的3个核苷内。
在某些实施例中，寡核苷酸包括一个或多个甲基膦酸酯连接。在某些实施例中，具有缺口体核苷基序的寡核苷酸包括除一个或两个甲基膦酸酯连接之外包含所有硫代磷酸酯连接的连接基序。在某些实施例中，一个甲基膦酸酯连接在具有缺口体核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施例中，令人希望的是将硫代磷酸酯核苷间连接和磷酸二酯核苷间连接的数目安排成维持核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是将硫代磷酸酯核苷间连接的数目和位置以及磷酸二酯核苷间连接的数目和位置安排成维持核酸酶抗性。在某些实施例中，可以减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，并且可以增加磷酸二酯核苷间连接的数目。在某些实施例中，可以减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，并且可以增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时仍维持核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，同时保留核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时保留核酸酶抗性。
修饰的糖部分
反义化合物可以任选地包含一个或多个核苷，其中糖基已经被修饰。此类糖修饰的核苷可以赋予这些反义化合物以核酸酶稳定性、增加的结合亲和力、或一些其他有益的生物学特性。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷，这些核苷包含修饰的糖部分。相对于缺乏此类糖修饰的核苷的寡核苷酸，包含一个或多个糖修饰的核苷的此类修饰的寡核苷酸可以具有令人希望的特性，如增强的核酸酶稳定性或与靶核酸的增加的结合亲和力。在某些实施例中，修饰的糖部分是线性修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的糖部分是二环的或三环的糖部分。在某些实施例中，修饰的糖部分是糖代用品。此类糖代用品可以包括对应于取代的糖部分的那些的一个或多个取代。
在某些实施例中，修饰的糖部分是线性修饰的糖部分，这些线性修饰的糖部分包含具有一个或多个非环状取代基(包括但不限于2’和/或5’位处的取代基)的呋喃糖基环。适于线性修饰的糖部分的2’-取代基基团的实例包括但不限于：2’-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)、和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施例中，2’-取代基基团选自：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基、S-烷基、N(Rm)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(Rm)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-烷基烯基(alkylenyl)-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团、或取代的或未取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基基团的某些实施例可以进一步被独立地选自以下项的一个或多个取代基基团取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、硫醇基、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。适于线性修饰的糖部分的5’-取代基基团的实例包括但不限于：5’-甲基(R或S)、5'-乙烯基、和5’-甲氧基。在某些实施例中，线性修饰的糖包括超过一个非桥接糖取代基，例如2'-F-5'-甲基糖部分(关于另外的2',5’-双取代的糖部分和核苷，参见例如PCT国际申请WO 2008/101157)。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-线性修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、NH2、N3、OCF3、OCH3、O(CH2)3NH2、CH2CH＝CH2、OCH2CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、以及N-取代的乙酰胺(OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团、或取代的或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-线性修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、OCF3、OCH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、以及OCH2C(＝O)-N(H)CH3(“NMA”)。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-线性修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、OCH3、和OCH2CH2OCH3。
包含修饰的糖部分(如线性修饰的糖部分)的核苷通过该核苷的糖部分上的一个或多个取代的位置来提及。例如，包含2’-取代的或2-修饰的糖部分的核苷被称为2’-取代的核苷或2-修饰的核苷。
某些修饰的糖部分包括形成第二环的桥接糖取代基，从而产生二环糖部分。在某些这样的实施例中，该二环糖部分在4'与2'呋喃糖环原子之间包括桥。此类4’到2’桥接糖取代基的实例包括但不限于：4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'(“LNA”)、4'-CH2-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(“ENA”)、4'-CH(CH3)-O-2'(当处于S构型时，被称为“受约束的乙基”或“cEt”)、4’-CH2-O-CH2-2’、4’-CH2-N(R)-2’、4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(“受约束的MOE”或“cMOE”)及其类似物(参见例如，美国专利7,399,845)、4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见例如，WO 2009/006478)、4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见例如，WO2008/150729)、4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见例如，US 2004/0171570)、4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见例如，Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]，2009，74，118-134)、4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，公开的PCT国际申请WO 2008/154401)、4’-C(RaRb)-N(R)-O-2’、4’-C(RaRb)-O-N(R)-2’、4'-CH2-O-N(R)-2'、和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中每个R、Ra、和Rb独立地是H、保护基团、或C1-C12烷基(参见例如，美国专利7,427,672)。
在某些实施例中，此类4’到2’桥独立地包括从1至4个独立地选自以下项的连接的基团：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-、以及-N(Ra)-；
其中：
x是0、1、或2；
n是1、2、3、或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)、或次硫酸基(sulfoxyl，S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基、或保护基团。
另外的二环糖部分在本领域是已知的，例如：Freier等人，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]，1997，25(22)，4429-4443；Albaek等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]，2006，71，7731-7740；Singh等人，Chem.Commun.[化学通讯]，1998，4，455-456；Koshkin等人，Tetrahedron[四面体]，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]，2000，97，5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]，1998，8，2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.[有机化学杂志]，1998，63，10035-10039；Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]，20017，129，8362-8379；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs[创新药物新见]，2001，2，558-561；Braasch等人，Chem.Biol.[化学与生物学]，2001，8，1-7；Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.[分子治疗学新见]，2001，3，239-243；美国专利号7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、6,670,461、和7,399,845；WO 2004/106356、WO 1994/14226、WO 2005/021570、和WO 2007/134181；美国专利公开号US 2004/0171570、US 2007/0287831、和US 2008/0039618；美国专利系列号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787、和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US 2008/064591、PCT/US 2008/066154、和PCT/US 2008/068922。
在某些实施例中，二环糖部分和掺入此类二环糖部分的核苷进一步通过同分异构构型来定义。例如，LNA核苷(上文描述的)可以处于α-L构型或处于β-D构型。
α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)或α-L-LNA二环核苷已经被掺入显示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，2003，21，6365-6372)。在此，二环核苷的概述包括两种同分异构构型。当在此处的示例实施例中鉴定具体二环核苷(例如，LNA或cEt)的位置时，它们处于β-D构型，除非另外说明。
在某些实施例中，修饰的糖部分包括一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5’-取代的和4’-2’桥接的糖)。(参见例如，WO 2007/134181，其中LNA核苷进一步被例如5'-甲基或5'-乙烯基基团取代，并且参见例如，美国专利7,547,684；7,750,131；8,030,467；8,268,980；7,666,854；和8,088,746)。
在某些实施例中，修饰的糖部分是糖代用品。在某些这样的实施例中，该糖部分的氧原子被例如硫、碳或氮原子替换。在某些这样的实施例中，此类修饰的糖部分还包括如上描述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖代用品包括4’-硫原子和2'-位(参见例如，US2005/0130923)和/或5’位的取代。
在某些实施例中，糖代用品包括具有不同于5个原子的环。例如，在某些实施例中，糖代用品包括六元四氢吡喃(“THP”)。此类四氢吡喃可以被进一步修饰或取代。包含此类修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、安尼妥(anitol)核酸(“ANA”)、甘露醇核酸(“MNA”)(参见Leumann，CJ.Bioorg.&Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]2002，10，841-854)、氟HNA：
(“F-HNA”，参见例如，美国专利8,088,904；8,440,803；和8,796,437，F-HNA还可以称为F-THP或3'-氟四氢吡喃)、以及包含另外的具有以下化学式的修饰的THP化合物的核苷：
其中，独立地，对于所述修饰的THP核苷中的每者：
Bx是核碱基部分；
T3和T4各自独立地是将该修饰的THP核苷连接至寡核苷酸的剩余部分的核苷间连接基团，或T3和T4之一是将该修饰的THP核苷连接至寡核苷酸的剩余部分的核苷间连接基团，并且T3和T4中另一者是H、羟基保护基团、连接的缀合物基团、或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基；并且
R1和R2中每者独立地选自：氢、卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2、和CN，其中X是O、S或NJ1，并且每个J1、J2、和J3独立地是H或C1-C6烷基。
在某些实施例中，提供了修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个不同于H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个是甲基。在某些实施例中，提供了修饰的THP核苷，其中R1和R2中之一是F。在某些实施例中，R1是F并且R2是H，在某些实施例中，R1是甲氧基并且R2是H，并且在某些实施例中，R1是甲氧基乙氧基并且R2是H。
在某些实施例中，糖代用品包括具有超过5个原子和超过一个杂原子的环。例如，已经报道了包含吗啉基糖部分的核苷及其在寡核苷酸中的使用(参见例如，Braasch等人，Biochemistry[生物化学]，2002，41，4503-4510以及美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444；和5,034,506)。如这里使用的，术语“吗啉基”意指具有以下结构的糖代用品：
在某些实施例中，可以例如通过添加或改变来自以上吗啉基结构的不同取代基基团来修饰吗啉基。此类糖代用品在此被称为“修饰的吗啉基”。
在某些实施例中，糖代用品包括非环状部分。包含此类非环状糖代用品的核苷和寡核苷酸的实例包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、非环状丁基核酸(参见例如，Kumar等人，Org.Biomol.Chem.[有机化学与生物分子化学]，2013，11，5853-5865)、以及WO 2011/133876中描述的核苷和寡核苷酸。
在本领域中已知许多其他可以用于修饰的核苷中的二环和三环糖和糖代用品环系统(参见例如，Leumann，J.C，Bioorganic&Medicinal Chemistry[生物有机化学与医药化学]，2002，10，841-854)。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代在结构上可与天然存在的或合成的未经修饰的核碱基区别，但是在功能上可与其互换。天然的和修饰的核碱基两者都能够参与氢键合。此类核碱基修饰可以赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个包含未经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个包含经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个不包含核碱基的核苷(被称为无碱基核苷)。
在某些实施例中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤、以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：2-氨丙基腺嘌呤，5-羟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-N-甲基鸟嘌呤，6-N-甲基腺嘌呤，2-丙基腺嘌呤，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-丙炔基(C≡C-CH3)尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，6-偶氮胸腺嘧啶，5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基、8-氮杂和其他8-取代的嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶、和5-卤代胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂腺嘌呤，3-去氮杂鸟嘌呤，3-去氮杂腺嘌呤，6-N-苯甲酰基腺嘌呤，2-N-异丁酰基鸟嘌呤，4-N-苯甲酰基胞嘧啶，4-N-苯甲酰基尿嘧啶，5-甲基4-N-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲基4-N-苯甲酰基尿嘧啶，通用碱基，疏水性碱基，混杂的碱基，大小扩大的碱基，以及氟化的碱基。另外的修饰的核碱基包括三环嘧啶，如1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-钳)。修饰的核碱基还可以包括其中的嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替换的那些，例如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括披露于美国专利号3,687,808中的那些，披露于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering[高分子科学与工程简明百科]，Kroschwitz，J.I.编辑，John Wiley&Sons[约翰·威利父子公司]，1990，858-859；Englisch等人，Angewandte Chemie[应用化学]，国际版，1991，30，613；Sanghvi，Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications[反义研究与应用]，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，CRC出版社，1993，273-288中的那些；以及披露于第6和第15章，AntisenseDrug Technology[反义药物技术]，Crooke S.T.编辑，CRC出版社，2008，163-166和442-443中的那些。
传授了上文指出的修饰的核碱基中的某些以及其他修饰的核碱基的制备的公开物包括但不限于Manoharan等人，US 2003/0158403，Manoharan等人，US 2003/0175906；Dinh等人，U.S.4,845,205；Spielvogel等人，U.S.5,130,302；Rogers等人，U.S.5,134,066；Bischofberger等人，U.S.5,175,273；Urdea等人，U.S.5,367,066；Benner等人，U.S.5,432,272；Matteucci等人，U.S.5,434,257；Gmeiner等人，U.S.5,457,187；Cook等人，U.S.5,459,255；Froehler等人，U.S.5,484,908；Matteucci等人，U.S.5,502,177；Hawkins等人，U.S.5,525,711；Haralambidis等人，U.S.5,552,540；Cook等人，U.S.5,587,469；Froehler等人，U.S.5,594,121；Switzer等人，U.S.5,596,091；Cook等人，U.S.5,614,617；Froehler等人，U.S.5,645,985；Cook等人，U.S.5,681,941；Cook等人，U.S.5,811,534；Cook等人，U.S.5,750,692；Cook等人，U.S.5,948,903；Cook等人，U.S.5,587,470；Cook等人，U.S.5,457,191；Matteucci等人，U.S.5,763,588；Froehler等人，U.S.5,830,653；Cook等人，U.S.5,808,027；Cook等人，6,166,199；以及Matteucci等人，U.S.6,005,096。
在某些实施例中，靶向KRAS核酸的反义化合物包括一个或多个修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
某些基序
寡核苷酸可以具有基序，例如未经修饰的和/或修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接的模式。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷，这些核苷包含修饰的糖。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷，这些核苷包含修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷间连接。在这样的实施例中，修饰的寡核苷酸的修饰的、未经修饰的、和不同修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接限定了模式或基序。在某些实施例中，糖部分、核碱基、和核苷间连接的模式是各自彼此独立的。因此，修饰的寡核苷酸可以由其糖基序、核碱基基序和/或核苷间连接基序来描述(如在此使用的，独立于核碱基的序列，核碱基基序描述了对这些核碱基的修饰)。
1.某些糖基序
在某些实施例中，寡核苷酸包括一种或多种类型的沿着该寡核苷酸或其区域安排成限定模式或糖基序的修饰的糖和/或未经修饰的糖部分。在某些实例中，此类糖基序包括但不限于在此讨论的糖修饰中的任一种。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有缺口体基序的区域或由其组成，该缺口体基序包括两个外部区域或“翼”和中心或内部区域或“缺口”。缺口体基序的这三个区域(5’-翼、缺口、和3’-翼)形成连续序列的核苷，其中这些翼中每者的核苷的糖部分中的至少一些不同于该缺口的核苷的糖部分中的至少一些。具体地，至少每个翼的核苷的离缺口最近的糖部分(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)不同于相邻缺口核苷的糖部分，因此在翼与缺口之间限定了边界(即，翼/缺口接点)。在某些实施例中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施例中，该缺口包括一个或多个具有以下糖部分的核苷，该糖部分不同于该缺口的一个或多个其他核苷的糖部分。在某些实施例中，这两个翼的糖基序彼此相同(对称缺口体)。在某些实施例中，5'-翼的糖基序不同于3'-翼的糖基序(不对称缺口体)。
在某些实施例中，缺口体的翼包括1-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的翼包括2-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的翼包括3-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的核苷全部是修饰的核苷。
在某些实施例中，缺口体的缺口包括7-12个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括7-10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括8-10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括10个核苷。在某个实施例中，缺口体的缺口的每个核苷都是未经修饰的2’-脱氧核苷。
在某些实施例中，该缺口体是脱氧缺口体。在这样的实施例中，每个翼/缺口接点的缺口侧上的核苷是未经修饰的2’-脱氧核苷，并且每个翼/缺口接点的翼侧上的核苷是修饰的核苷。在某些这样的实施例中，该缺口的每个核苷都是未经修饰的2’-脱氧核苷。在某些这样的实施例中，每个翼的每个核苷都是修饰的核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成。在这样的实施例中，该修饰的寡核苷酸的完全修饰的区域的每个核苷都包括修饰的糖部分。在某些这样的实施例中，整个修饰的寡核苷酸的每个核苷都包括修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括具有完全修饰的糖基序的区域或由其组成，其中该完全修饰的区域内的每个核苷都包括相同的修饰的糖部分，在此被称为一致修饰的糖基序。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸是一致修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，一致修饰的寡核苷酸的每个核苷都包括相同的2’-修饰。
2.某些核碱基基序
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域安排成限定模式或基序的修饰的和/或未经修饰的核碱基。在某些实施例中，每个核碱基都被修饰。在某些实施例中，这些核碱基都未被修饰。在某些实施例中，每个嘌呤或每个嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个腺嘌呤被修饰。在某些实施例中，每个鸟嘌呤被修饰。在某些实施例中，每个胸腺嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个尿嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个胞嘧啶被修饰。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸中的一些或全部胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包括修饰的核碱基的嵌段。在某些这样的实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的3’-端处。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的3’-端的3个核苷内。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的5’-端处。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的5’-端的3个核苷内。
在某些实施例中，具有缺口体基序的寡核苷酸包括包含修饰的核碱基的核苷。在某些这样的实施例中，包含修饰的核碱基的一个核苷在具有缺口体基序的寡核苷酸的中心缺口中。在某些这样的实施例中，所述核苷的糖部分是2’-脱氧核糖基部分。在某些实施例中，该修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶。
3.某些核苷间连接基序
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域安排成限定模式或基序的修饰的和/或未经修饰的核苷间连接。在某些实施例中，基本上每个核苷间连接基团都是磷酸酯核苷间连接(P＝O)。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团都是硫代磷酸酯(P＝S)。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团独立地选自硫代磷酸酯和磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的糖基序是缺口体，并且该缺口内的核苷间连接全部是修饰的。在某些这样的实施例中，这些翼中的一些或所有核苷间连接是未经修饰的磷酸酯连接。在某些实施例中，末端核苷间连接是修饰的。
某些寡核苷酸
在某些实施例中，寡核苷酸通过其基序和总长度来表征。在某些实施例中，此类参数各自彼此独立。因此，除非另外指明，具有缺口体基序的寡核苷酸的每个核苷间连接都可以是修饰的或未经修饰的，并且可以或可以不遵循这些糖修饰的缺口体修饰模式。例如，缺口体的翼区域内的核苷间连接可以彼此相同或不同，并且可以与缺口区域的核苷间连接相同或不同。同样地，独立于这些糖修饰的缺口体模式，此类缺口体寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核碱基。此外，除非另外指明，完全修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接和每个核碱基都可以是修饰的或未经修饰的。本领域的技术人员应意识到，可以将此类基序组合以产生多种寡核苷酸。在此，如果相对于一个或多个参数寡核苷酸的描述是未提及的，则这样的参数不受限。因此，仅被描述为具有缺口体基序而没有进一步描述的修饰的寡核苷酸可以具有任何长度、核苷间连接基序、和核碱基基序。除非另外指明，所有修饰都独立于核碱基序列。
在某些实施例中，寡核苷酸具有与第二寡核苷酸或靶核酸互补的核碱基序列。在某些这样的实施例中，寡核苷酸的区域具有与第二寡核苷酸或靶核酸互补的核碱基序列。在某些实施例中，寡核苷酸的区域或整个长度的核碱基序列与该第二寡核苷酸或靶核酸是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或100％互补的。在某些实施例中，反义化合物包括两种寡聚化合物，其中这些寡聚化合物的两个寡核苷酸与彼此是至少80％、至少90％、或100％互补的。在某些实施例中，双链反义化合物的一个或两个寡核苷酸包括两个不与另一寡核苷酸互补的核苷。
某些缀合物基团和端基
在某些实施例中，反义化合物和寡聚化合物包括缀合物基团和/或端基。在某些这样的实施例中，寡核苷酸共价地附接至一个或多个缀合物基团。在某些实施例中，缀合物基团修饰所附接的寡核苷酸的一种或多种特性，包括但不限于药效动力学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷以及清除。在某些实施例中，缀合物基团为所附接的寡核苷酸赋予新的特性，例如使得能够检测该寡核苷酸的荧光团或报告基团。可以将缀合物基团和/或端基添加至具有以上描述的修饰或基序中任一个的寡核苷酸中。因此，例如，包含具有缺口体基序的寡核苷酸的反义化合物或寡聚化合物还可以包括缀合物基团。
缀合物基团包括但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、巯基胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光团、以及染料。先前已经描述了某些缀合物基团，例如：胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，1989，86，6553-6556)，胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报]，1994，4，1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报]，1992，660，306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.[生物有机化学与医药化学快报]，1993，3，2765-2770)，巯基胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1992，20，533-538)，脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]，1991，10，1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochimie[生物化学]，1993，75，49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-丙三醇或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-丙三基-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体快报]，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1990，18，3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides[核苷与核苷酸]，1995，14，969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体快报]，1995，36，3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]，1995，1264，229-237)，十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学与实验治疗学杂志]，1996，277，923-937)，生育酚基团(Nishina等人，Molecular Therapy NucleicAcids[分子治疗-核酸]，2015，4，e220；doi:10.1038/mtna.2014.72和Nishina等人，Molecular Therapy[分子治疗]，2008，16，734-740)，或GalNAc簇(例如，WO 2014/179620)。
在某些实施例中，缀合物基团包括活性药品，例如，阿司匹林、华法令、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。
缀合物基团直接地或经由任选的缀合物接头附接至母体化合物(如寡核苷酸)。在某些实施例中，缀合物基团直接附接至寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物基团经由缀合物接头间接地附接至寡核苷酸。在某些实施例中，该缀合物接头包括链结构结构(如烃基链)，或重复单位(如乙二醇或氨基酸单位)的寡聚体。在某些实施例中，缀合物基团包括可切割的部分。在某些实施例中，缀合物基团经由可切割的部分附接至寡核苷酸。在某些实施例中，缀合物接头包括可切割的部分。在某些这样的实施例中，缀合物接头经由可切割的部分附接至寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括可切割的部分，其中该可切割的部分是附接至可切割的核苷间连接(如磷酸酯核苷间连接)的核苷。在某些实施例中，缀合物基团包括核苷或寡核苷酸，其中该缀合物基团的核苷或寡核苷酸间接地附接至母体寡核苷酸。
在某些实施例中，缀合物接头包括一个或多个选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚、以及羟基氨基。在某些这样的实施例中，该缀合物接头包括选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺以及醚基。在某些实施例中，该缀合物接头包括选自烷基和酰胺基团的基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括选自烷基和醚基的基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个磷部分。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个磷酸酯基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个中性连接基团。
在某些实施例中，缀合物接头(包括上文描述的缀合物接头)是双功能连接部分，例如本领域中已知的有用于将缀合物基团附接至母体化合物(如在此提供的寡核苷酸)的那些。通常，双功能连接部分包括至少两个官能团。官能团之一被选择为结合至母体化合物上的特定位点，并且另一官能团被选择为结合至缀合物基团。用于双功能连接部分中的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在某些实施例中，双功能连接部分包括一个或多个选自以下项的基团：氨基、羟基、羧酸、硫醇基、烷基、烯基、以及炔基。
缀合物接头的实例包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他缀合物接头包括但不限于取代的或未取代的C1-C10烷基、取代的或未取代的C2-C10烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基基团的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些实施例中，可切割的部分是可切割的键。在某些实施例中，可切割的部分包括可切割的键。在某些实施例中，可切割的部分是包含至少一个可切割的键的一组原子。在某些实施例中，可切割的部分包括具有一个、两个、三个、四个、或超过四个可切割的键的一组原子。在某些实施例中，可切割的部分被选择性地在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内切割。在某些实施例中，可切割的部分被内源酶(如核酸酶)选择性地切割。
在某些实施例中，可切割的键选自：酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个酯或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、或二硫化物。在某些实施例中，可切割的键是磷酸二酯的一个酯或两个酯。在某些实施例中，可切割的部分包括磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施例中，该可切割的部分是寡核苷酸与缀合物接头或缀合物基团之间的磷酸酯连接。
在某些实施例中，可切割的部分是核苷。在某些这样的实施例中，该未经修饰的或修饰的核苷包括选自以下项的任选地受保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施例中，可切割的部分是选自以下项的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。在某些实施例中，可切割的部分是2'-脱氧核苷，该脱氧核苷通过磷酸酯核苷间连接附接至寡核苷酸的3'或5'-末端核苷并且通过磷酸酯或硫代磷酸酯连接共价地附接至缀合物接头或缀合物基团。在某些这样的实施例中，该可切割的部分是2'-脱氧腺苷。
缀合物基团可以附接至寡核苷酸的任一端或两端和/或附接在任何内部位置处。在某些实施例中，缀合物基团附接至修饰的寡核苷酸的核苷的2'-位。某些实施例中，附接至寡核苷酸的任一端或两端的缀合物基团是端基。在某些这样的实施例中，缀合物基团或端基附接在寡核苷酸的3’和/或5’-端处。在某些这样的实施例中，缀合物基团(或端基)附接在寡核苷酸的3’-端处。在某些实施例中，缀合物基团附接在寡核苷酸的3’-端附近。在某些实施例中，缀合物基团(或端基)附接在寡核苷酸的5’-端处。在某些实施例中，缀合物基团附接在寡核苷酸的5’-端附近。
端基的实例包括但不限于缀合物基团、加帽基团、磷酸酯部分、保护基团、修饰的或未经修饰的核苷、以及两个或更多个独立地修饰的或未经修饰的核苷。
在某些实施例中，缀合物基团是靶向细胞的部分。在某些实施例中，缀合物基团、任选的缀合物接头、和任选的可切割的部分具有以下通式：
其中n是从1至约3(当n是1时m是0；当n是2或更大时m是1)，j是1或0，并且k是1或0。
在某些实施例中，n是1，j是1并且k是0。在某些实施例中，n是1，j是0并且k是1。在某些实施例中，n是1，j是1并且k是1。在某些实施例中，n是2，j是1并且k是0。在某些实施例中，n是2，j是0并且k是1。在某些实施例中，n是2，j是1并且k是1。在某些实施例中，n是3，j是1并且k是0。在某些实施例中，n是3，j是0并且k是1。在某些实施例中，n是3，j是1并且k是1。
在某些实施例中，缀合物基团包括具有至少一个束缚配体的靶向细胞的部分。在某些实施例中，靶向细胞的部分包括两个共价地附接至分支基团的束缚配体。在某些实施例中，靶向细胞的部分包括三个共价地附接至分支基团的束缚配体。
在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括包含一个或多个选自以下项的基团的分支基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚以及羟基氨基基团。在某些实施例中，该分支基团包括包含选自以下项的基团的分支的脂族基：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚以及羟基氨基基团。在某些这样的实施例中，该分支的脂族基包括选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺以及醚基。在某些这样的实施例中，该分支的脂族基包括选自以下项的基团：烷基、氨基和醚基。在某些这样的实施例中，该分支的脂族基包括选自烷基和醚基的基团。在某些实施例中，该分支基团包括单环的或多环的环系统。
在某些实施例中，靶向细胞的部分的每个束缚以任何组合包括一个或多个选自以下项的基团：烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺、磷酸二酯、以及聚乙二醇。在某些实施例中，每个束缚是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、醚、硫醚、二硫化物、氨基、氧代、酰胺、以及聚乙二醇。在某些实施例中，每个束缚是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、磷酸二酯、醚、氨基、氧代、以及酰胺。在某些实施例中，每个束缚是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、醚、氨基、氧代、以及酰胺。在某些实施例中，每个束缚是以任何组合包含一个或多个选自以下项的基团的直链脂族基：烷基、氨基、和氧代。在某些实施例中，每个束缚是以任何组合包含一个或多个选自烷基和氧代的基团的直链脂族基。在某些实施例中，每个束缚是以任何组合包含一个或多个选自烷基和磷酸二酯的基团的直链脂族基。在某些实施例中，每个束缚包括至少一个磷连接基团或中性连接基团。在某些实施例中，每个束缚包括长约6至约20个原子的链。在某些实施例中，每个束缚包括长约10至约18个原子的链。在某些实施例中，每个束缚包括的链长约10个原子。
在某些实施例中，靶向细胞的部分的每个配体都对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。在某些实施例中，每个配体都对哺乳动物肝细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲和力。在某些实施例中，每个配体都对肝脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲和力。在某些实施例中，每个配体都是碳水化合物。在某些实施例中，每个配体都独立地选自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及海藻糖。在某些实施例中，每个配体都是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括3个GalNAc配体。在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括2个GalNAc配体。在某些实施例中，该靶向细胞的部分包括1个GalNAc配体。
在某些实施例中，靶向细胞的部分的每个配体都是碳水化合物、碳水化合物衍生物、修饰的碳水化合物、多糖、修饰的多糖、或多糖衍生物。在某些这样的实施例中，该缀合物基团包括碳水化合物簇(参见例如，Maier等人，“Synthesis of AntisenseOligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster forCellular Targeting[缀合至用于细胞靶向的多价碳水化合物簇的反义寡核苷酸的合成]”，Bioconjugate Chemistry[生物缀合物化学]，2003，14，18-29，或Rensen等人，“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipidsfor Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor[用于将脂蛋白靶向肝脱唾液酸糖蛋白受体的新颖N-乙酰半乳糖胺封端的糖脂的设计与合成]”，J.Med.Chem.[药物化学杂志]2004，47，5798-5808，将其通过引用以其全文结合在此)。在某些这样的实施例中，每个配体都是氨基糖或硫糖。例如，氨基糖可以选自本领域已知的任何数目的化合物，如唾液酸、α-D-半乳糖胺、β-胞壁酸、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡哺甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡糖和N-磺基-D-葡糖胺、以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫糖可以选自5-硫代-β-D-吡喃葡糖、甲基2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡糖苷、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、以及乙基3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-葡-庚吡喃糖苷(heptopyranoside)。
在某些实施例中，缀合物基团包括具有以下化学式的靶向细胞的部分：
在某些实施例中，缀合物基团包括具有以下化学式的靶向细胞的部分：
在某些实施例中，缀合物基团包括具有以下化学式的靶向细胞的部分：
在某些实施例中，反义化合物和寡聚化合物包括在此被描述为“LICA-1”的缀合物基团和缀合物接头。LICA-1具有以下化学式：
在某些实施例中，包含LICA-1的反义化合物和寡聚化合物具有以下化学式：
其中oligo是寡核苷酸。
传授了上文指出的缀合物基团，包含缀合物基团、束缚、缀合物接头、分支基团、配体、可切割的部分以及其他修饰的寡聚化合物和反义化合物中某些的制备的代表性公开物包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO2013/033230和WO 2012/037254，Biessen等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]1995，38，1846-1852，Lee等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry[生物有机化学与医药化学]2011，19，2494-2500，Rensen等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2001，276，37577-37584，Rensen等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]2004，47，5798-5808，Sliedregt等人，J.Med.Chem.[药物化学杂志]1999，42，609-618，以及Valentijn等人，Tetrahedron[四面体]，1997，53，759-770，将其各自通过引用以其全文结合在此。
在某些实施例中，反义化合物和寡聚化合物包括包含缺口体或完全修饰的基序的修饰的寡核苷酸以及包含至少一个、两个、或三个GalNAc配体的缀合物基团。在某些实施例中，反义化合物和寡聚化合物包括在以下参考文献任一个中所发现的缀合物基团：Lee，Carbohydr Res[碳水化合物研究]，1978，67，509-514；Connolly等人，J Biol Chem[生物化学杂志]，1982，257，939-945；Pavia等人，IntJPep Protein Res[肽与蛋白质研究国际杂志]，1983，22，539-548；Lee等人，Biochem[生物化学]，1984，23，4255-4261；Lee等人，Glycoconjugate J[糖缀合物杂志]，1987，4，317-328；Toyokuni等人，Tetrahedron Lett[四面体快报]，1990，31，2673-2676；Biessen等人，J Med Chem[药物化学杂志]，1995，38，1538-1546；Valentijn等人，Tetrahedron[四面体]，1997，53，759-770；Kim等人，Tetrahedron Lett[四面体快报]，1997，38，3487-3490；Lee等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，1997，8，762-765；Kato等人，Glycobiol[糖生物学]，2001，11，821-829；Rensen等人，J Biol Chem[生物化学杂志]，2001，276，37577-37584；Lee等人，Methods Enzymol[酶学方法]，2003，362，38-43；Westerlind等人，Glycoconj J[糖缀合物杂志]，2004，21，227-241；Lee等人，Bioorg Med Chem Lett[生物有机化学与医药化学快报]，2006，16(19)，5132-5135；Maierhofer等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2007，15，7661-7676；Khorev等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2008，16，5216-5231；Lee等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2011，19，2494-2500；Kornilova等人，Analyt Biochem[分析生物化学]，2012，425，43-46；Pujol等人，AngewChemie Int Ed Engl[应用化学-国际版]，2012，51，7445-7448；Biessen等人，J Med Chem[药物化学杂志]，1995，38，1846-1852；Sliedregt等人，J Med Chem[药物化学杂志]，1999，42，609-618；Rensen等人，J Med Chem[药物化学杂志]，2004，47，5798-5808；Rensen等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol[动脉硬化血栓与血管生物学]，2006，26，169-175；vanRossenberg等人，Gene Ther[基因治疗]，2004，11，457-464；Sato等人，JAm Chem Soc[美国化学学会杂志]，2004，126，14013-14022；Lee等人，J Org Chem[有机化学杂志]，2012，77，7564-7571；Biessen等人，FASEB J[美国实验生物学会联合会会志]，2000，14，1784-1792；Rajur等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，1997，8，935-940；Duff等人，MethodsEnzymol[酶学方法]，2000，313，297-321；Maier等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，2003，14，18-29；Jayaprakash等人，Org Lett[有机快报]，2010，12，5410-5413；Manoharan，Antisense Nucleic Acid Drug Dev[反义核酸药物开发]，2002，12，103-128；Merwin等人，Bioconjug Chem[生物缀合物化学]，1994，5，612-620；Tomiya等人，Bioorg Med Chem[生物有机化学与医药化学]，2013，21，5275-5281；国际申请WO 1998/013381；WO 2011/038356；WO 1997/046098；WO 2008/098788；WO 2004/101619；WO 2012/037254；WO 2011/120053；WO2011/100131；WO 2011/163121；WO 2012/177947；WO 2013/033230；WO 2013/075035；WO2012/083185；WO 2012/083046；WO 2009/082607；WO 2009/134487；WO 2010/144740；WO2010/148013；WO 1997/020563；WO 2010/088537；WO 2002/043771；WO 2010/129709；WO2012/068187；WO 2009/126933；WO 2004/024757；WO 2010/054406；WO 2012/089352；WO2012/089602；WO 2013/166121；WO 2013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；公开的美国专利申请公开US 2011/0097264；US 2011/0097265；US 2013/0004427；US 2005/0164235；US 2006/0148740；US 2008/0281044；US2010/0240730；US 2003/0119724；US 2006/0183886；US 2008/0206869；US 2011/0269814；US 2009/0286973；US 2011/0207799；US 2012/0136042；US 2012/0165393；US 2008/0281041；US 2009/0203135；US 2012/0035115；US 2012/0095075；US 2012/0101148；US2012/0128760；US 2012/0157509；US 2012/0230938；US 2013/0109817；US 2013/0121954；US 2013/0178512；US 2013/0236968；US 2011/0123520；US 2003/0077829；US 2008/0108801；以及US 2009/0203132；将其各自通过引用以其全文而结合。
组合物和用于配制药物组合物的方法
可以将化合物与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或配制品。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个标准，包括但不限于给药途径、疾病程度、或待给予的剂量。
在某些实施例中，本发明提供了包含一种或多种化合物或其盐的药物组合物。在某些这样的实施例中，该药物组合物包括适合的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施例中，药物组合物包括无菌盐溶液和一种或多种化合物。在某些实施例中，这样的药物组合物由无菌盐溶液和一种或多种化合物组成。在某些实施例中，该无菌盐水是药用级盐水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种反义化合物和无菌水。在某些实施例中，药物组合物由一种化合物和无菌水组成。在某些实施例中，该无菌水是药用级水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施例中，药物组合物由一种或多种化合物和无菌PBS组成。在某些实施例中，该无菌PBS是药用级PBS。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个标准，包括但不限于给药途径、疾病程度、或待给予的剂量。
可以在药物组合物中利用靶向KRAS核酸的化合物，这是通过将该化合物和适合的药学上可接受的稀释剂或载体组合。在某些实施例中，药学上可接受的稀释剂是水，如适于注射的无菌水。因此，在一个实施例中，在此描述的方法中采用的是包含靶向KRAS核酸的化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施例中，该药学上可接受的稀释剂是水。在某些实施例中，该化合物是在此提供的反义寡核苷酸。
包含化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或任何其他寡核苷酸，它们在被给予动物(包括人)后能够提供(直接地或间接地)生物上具有活性的代谢物或其残余物。因此，例如，本披露还起草涉及化合物的药学上可接受的盐、前药、这些前药的药学上可接受的盐、以及其他生物等效物。适合的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可以包括在化合物的一端或两端掺入另外的核苷，所述核苷在体内被内源核酸酶切割，以形成活性化合物。
在某些实施例中，这些化合物或组合物进一步包括药学上可接受的载体或稀释剂。
实例
以下实例描述了用于鉴定靶向KRAS的先导化合物的筛选过程。对大约2,000种新设计的化合物的对人KRAS mRNA的作用进行了测试。将新化合物与先前描述的化合物ISIS6957进行比较，该化合物在美国号6,784,290中被报告为最强效的反义化合物之一。在筛选的超过2,000种反义寡核苷酸中，ISIS#651530、651987、695785、695823、651555、651587、695980、695995、696018、696044、716600、746275、716655、716772、740179、740191、740201、740223、和740233作为顶级先导化合物而出现。
非限制性披露和通过引用结合
虽然本文件所附序列表将每个序列根据需要鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上那些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域的技术人员应容易地意识到，如“RNA”或“DNA”这样的名称描述修饰的寡核苷酸在某些情况下是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被描述为具有修饰的糖(针对DNA的天然2’-H为2’-OH)的DNA或具有修饰的碱基(针对RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化的尿嘧啶))的RNA。
因此，在此提供的核酸序列(包括但不限于在序列表中的那些)旨在涵盖含有任何组合的天然或修饰的RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为另外的实例而非限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡核苷酸涵盖具有这样的核碱基序列的任何寡核苷酸，无论是修饰的还是未经修饰的，包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些以及具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些。
尽管在此描述的某些化合物、组合物和方法已经根据某些实施例具体地进行了描述，但以下实例仅用以说明在此描述的化合物并不旨在限制它们。在本申请中引用的各个参考文献通过引用以其全文结合在此。
实例1：cEt缺口体对SKOV3细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。使用电穿孔用2,500nM反义寡核苷酸以每孔20,000个细胞的密度转染培养的SKOV3细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS246(正向序列CCCAGGTGCGGGAGAGA，在此指定为SEQ ID NO:4；反向序列GCTGTATCGTCAAGGCACTCTTG；在此指定为SEQ ID NO:5；探针序列CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAG，在此指定为SEQ ID NO:6)用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都被靶向人类K-Ras mRNA(在此指定为SEQ ID NO:1，GENBANK登录号NM_004985.4)、人类K-Ras基因组序列(在此指定为SEQ ID NO:2，从核苷酸18116000至18166000截短的GENBANK登录号NT_009714.17的互补体)、或人类K-Ras mRNA序列(在此指定为SEQ ID NO:3，GENBANK登录号NM_033360.3)。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表1
靶向SEQ ID NO:1、2、和3的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表2
靶向SEQ ID NO:1、2、和3的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例2：cEt缺口体对Hep3B细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。使用电穿孔用2,000nM反义寡核苷酸以每孔20,000个细胞的密度转染培养的Hep3B细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB(正向序列GACACAAAACAGGCTCAGGACTT，在此指定为SEQ ID NO:7；反向序列TCTTGTCTTTGCTGATGTTTCAATAA，在此指定为SEQ ID NO:8；探针序列AAGAAGTTATGGAATTCC，在此指定为SEQ ID NO:9)用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表3
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表4
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表5
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例3：cEt缺口体对A431细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。将培养的A431细胞以每孔5,000个细胞的密度通过自由摄取用1,000nM反义寡核苷酸处理。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表6
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表7
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表8
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表9
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表10
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例4：cEt缺口体对A431细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。将培养的A431细胞以每孔5,000个细胞的密度通过自由摄取用1,000nM反义寡核苷酸处理。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-RasmRNA水平。将人类引物探针组RTS132(正向序列CAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCT，在此指定为SEQ ID NO:10；反向序列CTGGTCCCTCATTGCACTGTAC；在此指定为SEQ ID NO:11；探针序列TGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAGG，在此指定为SEQ ID NO:12)用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表11
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例5：cEt缺口体对A431细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。将培养的A431细胞以每孔5,000个细胞的密度通过自由摄取用2,000nM反义寡核苷酸处理。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表12
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表13
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例6：A431细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。将培养的A431细胞以每孔5,000个细胞的密度通过自由摄取用2,000nM反义寡核苷酸处理。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体或脱氧、MOE和(S)-cEt缺口体。这些3-10-3cEt缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。这些脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸长16个核苷，其中这些核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰、或脱氧修饰。‘化学’栏描述了每个寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；‘d’之后的数字指示脱氧核苷的数目；并且‘e’指示MOE修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表14
靶向SEQ ID NO:1和2的缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表15
靶向SEQ ID NO:1和2的缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表16
靶向SEQ ID NO:1和2的缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例7：cEt缺口体对A431细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。将培养的A431细胞以每孔5,000个细胞的密度通过自由摄取用1,000nM反义寡核苷酸处理。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。在未示出特定表中的靶基因的序列比对的情况下，应理解的是呈现在该表中的全部寡核苷酸都未以100％互补性与该靶基因比对。
表17
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表18
靶向SEQ ID NO:2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表19
靶向SEQ ID NO:2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表20
靶向SEQ ID NO:2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例7：cEt缺口体对Hep3B细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。使用电穿孔用2,000nM反义寡核苷酸以每孔20,000个细胞的密度转染培养的Hep3B细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。某些寡核苷酸被靶向SEQ ID NO:3。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。在未示出特定表中的靶基因的序列比对的情况下，应理解的是呈现在该表中的全部寡核苷酸都未以100％互补性与该靶基因比对。
表21
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表22
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表23
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表24
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表25
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表26
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表27
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表28
靶向SEQ ID NO:1、2和3的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表29
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例8：cEt缺口体对HepG2细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。使用电穿孔用4,000nM反义寡核苷酸以每孔20,000个细胞的密度转染培养的HepG2细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS132用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。某些反义寡核苷酸以一个错配靶向靶序列。通过将错配的核苷加粗加下划线而将这些反义寡核苷酸呈现在下表中。
表30
靶向SEQ ID NO:1和2的3-10-3cEt缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例9：A431细胞中的人类K-Ras的反义抑制
设计靶向K-Ras核酸的反义寡核苷酸并且针对其在体外对K-Ras mRNA的作用进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些反义寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。将培养的A431细胞以每孔5,000个细胞的密度通过自由摄取用2,000nM反义寡核苷酸处理。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将人类引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA水平，如通过测量的。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
将下表中的新设计的嵌合反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体或脱氧、MOE和(S)-cEt缺口体。这些3-10-3cEt缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。这些脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸长16个核苷，其中这些核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰、或脱氧修饰。‘化学’栏描述了每个寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；‘d’之后的数字指示脱氧核苷的数目；并且‘e’指示MOE修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示反义寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。
表31
靶向SEQ ID NO:1和2的缺口体对K-Ras mRNA的抑制
表32
靶向SEQ ID NO:1和2的缺口体对K-Ras mRNA的抑制
实例10：人类K-Ras mRNA表达在A431细胞中的剂量依赖性抑制
在A431细胞中以不同剂量对描述于以上研究中的反义寡核苷酸进行测试。作为不靶向K-Ras的对照寡核苷酸的Isis编号549148(3-10-3cEt缺口体，GGCTACTACGCCGTCA，在此指定为SEQ ID NO:2191)或ISIS 141923(5-10-5MOE缺口体，CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC，在此指定为SEQ ID NO:2192)在每个实验中被包括作为阴性对照。
研究1
将细胞以每孔5,000个细胞的密度铺板。用下表中指定浓度的反义寡核苷酸孵育细胞。每个表代表单独的实验。在大约72小时之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将上述人类K-Ras引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。将K-Ras mRNA水平相对于β-肌动蛋白mRNA水平或进行归一化。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
对于一些反义寡核苷酸，还呈现了半最大抑制浓度(IC50)。如下表中所说明的，寡核苷酸被这些细胞成功地吸收，并且在经反义寡核苷酸处理的细胞中，K-Ras mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表33
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表34
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表35
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表36
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表37
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表38
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表39
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表40
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表41
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表42
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
研究2
将A431细胞以每孔10,000个细胞的密度铺板。用下表中指定浓度的反义寡核苷酸孵育细胞。每个表代表单独的实验。在大约48小时之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将上述人类K-Ras引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。将K-Ras mRNA水平相对于进行归一化。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。负值的抑制百分比指示K-Ras mRNA水平高于未经处理的细胞中的。
对于一些反义寡核苷酸，还呈现了半最大抑制浓度(IC50)。如下表中所说明的，寡核苷酸被这些细胞成功地吸收，并且在经反义寡核苷酸处理的细胞中，K-Ras mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表43
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表44
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
研究3
将Hep3B细胞以每孔20,000个细胞的密度铺板。使用电穿孔用如下所示的增加浓度的反义寡核苷酸转染细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量人类K-Ras mRNA水平。将上述人类K-Ras引物探针组RTS3496_MGB用于测量mRNA水平。将K-Ras mRNA水平相对于Ribogreen进行归一化。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。
还呈现了半最大抑制浓度(IC50)。如下表中所说明的，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，K-Ras mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表45
ISIS寡核苷酸的电穿孔对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
实例11：靶向K-Ras的反义寡核苷酸在食蟹猴原代肝细胞中的剂量依赖性抑制
在进行这项研究的时候，食蟹猴基因组序列在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库是不可得的；因此，无法确认与食蟹猴基因序列的交叉反应性。作为替代，将食蟹猴中所用的ISIS反义寡核苷酸的序列与恒河猴基因组DNA序列针对互补性进行比较。预期的是与恒河猴序列具有互补性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列具有完全交叉反应性。所测试的人类反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(从核苷酸25479955至25525362截短的GENBANK登录号NC_007868.1的互补体，在此指定为SEQ ID NO:2194)至多具有一个错配。在下表中，这些寡核苷酸相对于恒河猴基因组序列的错配数目被表示为“#MM”。
表46
在食蟹猴肝细胞中针对降低K-Ras表达的能力在不同剂量下对上述反义寡核苷酸进行测试。将低温保存的食蟹猴原代肝细胞以每孔35,000个细胞的密度铺板，并且使用电穿孔用如下表所指定的不同浓度的反义寡核苷酸转染。在大约24小时的处理期之后，将细胞洗涤并裂解，并且分离RNA。使用如上所述的引物探针组RTS3496_MGB通过定量实时PCR测量猴K-Ras mRNA水平。根据总RNA含量调整K-Ras mRNA目标水平，如通过测量的。在下表中，将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras抑制百分比。如在此使用的，值‘0’指示用反义寡核苷酸处理不抑制mRNA水平。
表47
将ISIS寡核苷酸电穿孔进原代食蟹猴肝细胞中对猴K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
表48
将ISIS寡核苷酸电穿孔进原代食蟹猴肝细胞中对猴K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
实例12：靶向人类K-Ras mRNA的反义寡核苷酸在瘦BALB/c小鼠中的可耐受性
处理
以100mg/kg/周，用反义寡核苷酸或用盐水皮下注射六至七周龄的雄性BALB/c小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)，巴港，缅因州)，一周两次，持续四周(一共8次处理)。每个处理组由4只动物组成。在最后给予之后72小时将小鼠处死。
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯(Hitachi Olympus)Au400e，梅尔维尔，纽约)测量ALT转氨酶、白蛋白、血尿素氮(BUN)和总胆红素的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标记物的水平变化的反义寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表49
雄性BALB/c小鼠中的血浆化学标记物
身体重量和器官重量
在第1天和第27天测量BALB/c小鼠的体重，并且将每个组的平均体重呈现在下表中。在研究结束时测量肝、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。将导致超出反义寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的反义寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表50
身体重量和器官重量(以克计)
实例13：靶向K-Ras的反义寡核苷酸在A431表皮样癌异种移植物模型中的药效动力学和毒理学特征
将雌性、6-8周龄NCr裸小鼠(塔科尼克生物科学公司(Taconic Biosciences)，哈德逊，纽约)用人类表皮样癌A431细胞接种并用上表中描述的反义寡核苷酸或用PBS处理。评估寡核苷酸对肿瘤中的K-Ras mRNA表达和小鼠中的可耐受性的影响。
处理
将每只小鼠用50％基质胶(Matrigel)(BD生物科学公司(BD Bioscience))中的5x106个A431细胞接种，用于肿瘤发展。在肿瘤接种之后第10-14天，当平均肿瘤大小达到大约200mm3时开始反义寡核苷酸处理。以50mg/kg，用反义寡核苷酸或PBS皮下注射小鼠，每周三次(150mg/kg/周)，持续三周，一共九个剂量。每周测量一次小鼠的体重。在开始处理之后三周，将小鼠处死，测量肿瘤中的K-Ras mRNA水平、脾重量、和体重。
研究1
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比，相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶或β-肌动蛋白mRNA水平进行了归一化。如下表中所示的，与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。
表51
A431异种移植物模型中反义介导的人类K-Ras mRNA表达的抑制
ISIS编号 抑制(％)
651499 39
651530 55
651541 32
651555 51
651587 51
651603 41
651634 37
651795 46
651987 50
651990 46
652004 47
695815 24
695823 54
695847 50
695867 68
695912 34
695930 45
695976 42
695980 56
695981 35
695995 47
696026 35
696317 40
696816 31
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。在研究结束时测量脾的重量，并且呈现在下表中。
表52
A431异种移植物模型中的身体和脾重量测量值
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶、总胆红素和血尿素氮(BUN)的血浆水平。结果呈现在下表中。
表53
A431异种移植物模型中的血浆化学标记物
研究2
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比。如下表中所示的，与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。
表54
A431异种移植物模型中反义介导的人类K-Ras mRNA表达的抑制
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。在研究结束时(第21天)测量脾的重量，并且呈现在下表中。
表55
A431异种移植物模型中的身体和脾重量测量值
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶、总胆红素和血尿素氮(BUN)的血浆水平。结果呈现在下表中。
表56
A431异种移植物模型中的血浆化学标记物
研究3
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比。如下表中所示的，与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。
表57
A431异种移植物模型中反义介导的人类K-Ras mRNA表达的抑制
ISIS编号 抑制(％)
651588 69
651653 41
651987 51
716587 40
716588 37
716600 55
716608 43
716612 39
716628 48
716655 49
716656 64
716673 54
716683 50
716716 51
716758 74
716769 52
716772 47
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。在研究结束时(第23天)测量器官的重量，并且呈现在下表中。
表58
A431异种移植物模型中的身体重量和器官重量测量值
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶、总胆红素和血尿素氮(BUN)的血浆水平。结果呈现在下表中。
表59
A431异种移植物模型中的血浆化学标记物
研究4
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比。如下表中所示的，与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。
表60
A431异种移植物模型中反义介导的人类K-Ras mRNA表达的抑制
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。在研究结束时测量器官的重量，并且呈现在下表中。
表61
A431异种移植物模型中的体重测量值
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶、总胆红素和血尿素氮(BUN)的血浆水平。结果呈现在下表中。
表62
A431异种移植物模型中的血浆化学标记物
研究5
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比，相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶或β-肌动蛋白mRNA水平进行了归一化。如下表中所示的，与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。
表63
A431异种移植物模型中反义介导的人类K-Ras mRNA表达的抑制
ISIS编号 抑制(％)
651555 48
651987 36
695823 26
695980 35
696018 47
716744 25
716749 0
716754 26
746273 9
746275 51
746276 26
746279 31
746280 43
746285 24
746286 51
746287 45
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。在研究结束时(第23天)，测量器官重量并呈现在下表中。
表64
A431异种移植物模型中的身体重量和器官重量测量值
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶、总胆红素和血尿素氮(BUN)的血浆水平。结果呈现在下表中。
表65
A431异种移植物模型中的血浆化学标记物
表66
A431异种移植物模型中的血浆化学标记物
实例14：靶向人类K-Ras mRNA的反义寡核苷酸在斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠中的可耐受性
还在斯普拉-道来大鼠中针对体内可耐受性对描述于以上研究中的反义寡核苷酸进行了测试。
用50mg/kg的反义寡核苷酸皮下注射四只斯普拉-道来大鼠的组，每周一次，持续6周，一共7次处理。用PBS皮下注射对照组的大鼠，每周一次，持续6周。在最后给药之后两天，使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。贯穿整个研究测量体重。
为了评估反义寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶(ALT、AST)、白蛋白(Alb)和总胆红素(T.Bil.)的血浆浓度。
为了评估反义寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cre)的血浆浓度。还测量了白蛋白(Alb)。还测定了总尿蛋白(微量总蛋白(MTP))和尿肌酸酐水平以及总尿蛋白与肌酸酐的比率(MTP/CREA)。
在研究结束时测量肝、脾、和肾的重量。
结果呈现在下表中并且显示许多靶向人类K-Ras的反义寡核苷酸在斯普拉-道来大鼠中是良好耐受的。
表67
身体重量和器官重量
表68
血浆和尿临床化学
实例15：靶向人类K-Ras mRNA的反义寡核苷酸在斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠中的可耐受性
还在斯普拉-道来大鼠中针对体内可耐受性对描述于以上研究中的反义寡核苷酸进行了测试。
用50mg/kg的反义寡核苷酸皮下注射四只斯普拉-道来大鼠的组，每周一次，持续6周，一共7次处理。用PBS皮下注射对照组的大鼠，每周一次，持续6周。在最后给药之后两天，使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。贯穿整个研究测量体重。
为了评估反义寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶(ALT、AST)、白蛋白(Alb)和总胆红素(T.Bil.)的血浆浓度。
为了评估反义寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cre)的血浆浓度。还测量了白蛋白(Alb)。还测定了总尿蛋白(微量总蛋白(MTP))和尿肌酸酐水平以及总尿蛋白与肌酸酐的比率(MTP/CREA)。
在研究结束时测量肝、脾、和肾的重量。
结果呈现在下表中并且显示许多靶向人类K-Ras的反义寡核苷酸在斯普拉-道来大鼠中是良好耐受的。
表69
身体重量和器官重量
表70
血浆和尿临床化学
实例16：Gen1.0和Gen2.5人类K-RAS反义寡核苷酸的效力的比较评估
在A431细胞中以不同剂量对上述反义寡核苷酸和Isis编号6957进行测试。描述于美国专利号6,784,290中的Isis编号6957由经由硫代磷酸酯核苷间连接进行连接的2’-脱氧核苷组成，并且序列是CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG(SEQ ID NO:2193)。不靶向K-Ras的Isis编号549148被包括作为阴性对照。将A431细胞以每孔10,000个细胞的密度铺板并且用下表24中指定浓度的反义寡核苷酸孵育。在24小时之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时PCR测量K-Ras mRNA水平。将RTS3496_MGB引物探针组用于测量K-Ras mRNA水平。将K-Ras mRNA水平相对于β-肌动蛋白mRNA水平进行归一化。将结果呈现为相对于未经处理的对照细胞的K-Ras mRNA抑制百分比。
如下表中所说明的，新的反义寡核苷酸的效力比Isis编号6957多得多，Isis编号6957展现出最少的K-Ras抑制。
表71
ISIS寡核苷酸的自由摄取对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
实例17：人类K-Ras反义寡核苷酸在COLO205腺癌异种移植物模型中的药效动力学和毒理学特征
将雌性、6-8周龄NCr裸小鼠(塔科尼克生物科学公司，哈德逊，纽约)用人类结直肠腺癌COLO205细胞接种并用反义寡核苷酸或用PBS处理。在小鼠中评估K-Ras表达和寡核苷酸的可耐受性。
处理
对于肿瘤发展，将小鼠各自用50％基质胶(BD生物科学公司)中的3×106个COLO205细胞接种右侧脂肪垫。在肿瘤接种之后第10天左右，当平均肿瘤大小达到大约200mm3时开始反义寡核苷酸处理。以30或50mg/kg/周，用反义寡核苷酸或PBS皮下注射小鼠，每周三次，持续三周，一共九个剂量(150或250mg/kg/周)。从肿瘤组织中提取RNA用于实时PCR分析。在最后给药之后24小时，使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。贯穿整个研究测量体重。在研究结束时测量肝、脾、和肾的重量。结果呈现在下表中，证明许多靶向人类K-Ras的反义寡核苷酸导致K-Ras mRNA水平降低，并且是良好耐受的。
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比，相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA水平进行了归一化。如下表中所示的，与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。
表72
COLO205异种移植物模型中的人类K-Ras mRNA表达的抑制
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。在研究结束时，测量器官重量并呈现在下表中。
表73
身体重量和器官重量测量值
血浆化学标记物
使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)，测量了转氨酶(ALT、AST)和总胆红素(T.Bil.)的血浆浓度以评估反义寡核苷酸对肝功能的影响，并且测量了血尿素氮(BUN)的血浆浓度以评估反义寡核苷酸对肾功能的影响。还测量了白蛋白(Alb)。结果呈现在下表中并且显示许多靶向人类K-Ras mRNA的反义寡核苷酸在COLO205腺癌异种移植物模型中是良好耐受的。
表74
血浆临床化学
实例18：人类K-Ras反义寡核苷酸对H460细胞增殖的影响(3D测定)
将体外三维(3D)模型用于评价人类K-Ras反义寡核苷酸对突变型K-Ras癌症肿瘤细胞生长的影响。使人类突变型K-Ras非小细胞肺癌细胞(NCI-H460)在ThermoScientificTM NunclonTM SpheraTM超低附着微孔板中生长为球体。癌症球体模拟肿瘤生长的3D结构，从而允许研究肿瘤进展和反义寡核苷酸的体外功效。
处理
将NCI-H460细胞以每孔1000个细胞的密度铺板并且用不同剂量的反义寡核苷酸或用PBS孵育八天的时间。评估K-Ras mRNA表达和寡核苷酸对球体体积的影响并且呈现在下表中。
RNA分析
在第六天，从细胞中分离RNA用于实时PCR分析，并且使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比，相对于β-肌动蛋白mRNA水平进行了归一化。与PBS对照相比，用Isis反义寡核苷酸处理导致人类K-Ras mRNA的减少。还呈现了每个寡核苷酸的半最大抑制浓度(IC50)。
表75
反义寡核苷酸对人类K-Ras mRNA表达的剂量依赖性抑制
球体体积分析
在第八天，为H460球体照相并且使用ImageJ测量它们的相对体积。每个处理组的结果被表示为相对于PBS对照而言的球体体积的平均减少百分比。还呈现了每个寡核苷酸的半最大生长抑制浓度(IC50)。
表76
在第8天，相对于未经处理的NCI-H460细胞的相对球体体积
实例19：肿瘤体积的H358异种移植物研究
产生非小细胞肺癌(NSCLC)的K-Ras突变型小鼠异种移植物模型并且将其用于研究先导反义寡核苷酸ISIS编号651987和746275与未经处理的小鼠相比以及与用作为阴性对照的ISIS编号549148处理的小鼠相比的功效。将每只小鼠用NCI-H358人类NSCLC细胞接种，用于肿瘤发展。
处理
将三十二只雌性、无胸腺裸鼠(CrTac:NCr-Foxn1nu；塔科尼克生物科学公司，哈德逊，纽约)(6-8周龄并且起始重量19-21g)分为四组，每个处理组八只受试者，除用ISIS编号549148处理的对照组包含五只受试者之外。将50％基质胶(BD生物科学公司)中的5x106个NCI-H358细胞接种进小鼠的乳腺脂肪垫中。在肿瘤接种之后第10-14天，当平均肿瘤大小达到大约200mm3时开始反义寡核苷酸处理。用反义寡核苷酸(以50mg/kg，每周五次(250mg/kg/周)，持续4.5周(一共22个剂量))、或用PBS(作为未经处理的对照)皮下注射小鼠。评估KRAS反义寡核苷酸对肿瘤K-Ras mRNA表达和肿瘤生长的影响以及KRAS寡核苷酸在小鼠中的可耐受性。每周测量一次小鼠的体重。在研究结束时(第33天)，将小鼠处死，收获器官和肿瘤，并且测量肿瘤中的K-Ras mRNA水平。
RNA分析
从肿瘤组织中提取RNA，用于实时PCR分析以及使用上文描述的引物探针组RTS3496_MGB测量人类K-Ras mRNA水平。每个处理组的结果在下表中被表示为相对于PBS对照而言的K-Ras平均抑制百分比，相对于β-肌动蛋白mRNA水平进行了归一化。
表77
在H358异种移植物模型中，相对于对照人类K-Ras mRNA表达的抑制百分比
ISIS编号 抑制(％)
549148 0
651987 36
746275 56
体重测量
贯穿整个处理期测量体重。在研究结束时(第33天)，为器官称重，并且呈现在下表中的数据是每个处理组在不同时间点的平均值。
表78
H358异种移植物模型中的身体重量和器官重量测量值
血浆化学标记物
为了评估反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶、总胆红素和血尿素氮(BUN)的血浆水平。结果呈现在下表中。
表79
H358异种移植物模型中的血浆化学标记物
肿瘤体积
为了评估反义寡核苷酸对肿瘤体积的影响，在不同时间点测量肿瘤部位。结果呈现在下表中。
表80
H358异种移植物模型中的相对肿瘤体积，从第一天的％
两种先导反义寡核苷酸ISIS 651987和ISIS 746275在整个研究过程中抑制肿瘤生长。
实例20：KRAS ASO对KRAS突变型和KRAS野生型肿瘤细胞体外增殖的影响(3D)
在一系列表达突变型或野生型KRAS的肺癌、结肠癌和胰腺癌细胞系中以3D形式在体外评价了651987对KRAS mRNA水平和增殖的影响。KRAS mRNA的下调(IC50)与软琼脂中的生长抑制(IC50)之间的相关性示于下表中。来自此项研究的观察结果显示651987下调突变型和野生型KRAS同种型并且在体外对KRAS突变型细胞具有选择性表型效应。
RNA分析
为了分析对KRAS mRNA表达的影响，将细胞铺板进96孔板中并且用KRAS ASO的剂量反应处理最少48小时。为了分析mRNA表达，将使用快车道细胞探针试剂盒(FastLaneCell Probe kit)(凯杰公司(Qiagen))制备的细胞裂解物用于实时一步RT-PCR反应中，这些RT-PCR反应是在ABI 7900HT仪器(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))或Lightcycler 480仪器(罗氏公司(Roche))上进行的。使用GAPDH或18S rRNA CT值来归一化，使用如先前在用户公告(User Bulletin)#2ABI PRISM 7700序列检测系统10/2001中描述的比较Ct(-ΔΔCt)方法来计算基因表达值。用于人类KRAS(Hs00364284_g1)、人类GAPDH(4333764F)、真核生物18S rRNA(4333760F)的ABI FAM MGB测定探针来自赛默飞世尔科技公司。
3D菌落测定
在96孔板中进行菌落测定。将75μl的0.3％琼脂中的细胞(500-2000个细胞/孔)接种到10％RPMI-1640生长培养基中的50μl 1％琼脂层上。然后将琼脂层用50μl的包含处理的培养基覆盖，将琼脂和培养基的整个体积考虑在内。使菌落生长7至24天，取决于细胞系以及通过扫描GelCount扫描仪(牛津奥普托尼斯公司(Oxford Optronix)，阿宾顿，英国)和对指定直径的菌落计数评价的菌落形成。PC9细胞获得自Akiko Hiraide，临床前科学R&D，AZ，日本。所有其他细胞获得自ATCC。
表81
在此项研究中使用的细胞系的细节，包括STR指纹测试的结果、KRAS和其他关键突变。在KRAS野生型和突变型细胞系中KRAS mRNA下调的IC50(μM)与651987对菌落形成的抑制之间的相关性。
实例21：靶向K-Ras的反义寡核苷酸在食蟹猴中的可耐受性
在六周的通过皮下给予的处理之后，针对其在雄性食蟹猴的重复剂量研究中的相对功效、可耐受性、药代动力学和药效动力学特征对八种反义寡核苷酸进行比较。在该研究中使用的这些反义寡核苷酸描述于下表中。
表82
处理
在研究之前，将猴保持隔离，在此期间每天观察这些动物的一般健康状况。这些猴是二到三岁并且称重为两到三kg。在适应和预处理期期间每天记录一次所有动物的观察结果，在处理期期间并且在尸检之前每天记录两次(在给药天的给药前后，在非给药天的上下午)。
在适应期期间在分组之前每天为所有研究动物称重一次，并且在处理期期间每周称重一次。在计划处死的当天，在尸检之前称体重。从头静脉或股静脉中收集血液样品，用于评估血液学、凝固、和临床化学。从所有可用的动物收集新鲜的尿样品，用于尿分析/尿化学参数。在血液收集之前使动物禁食过夜，用于临床化学和尿收集。
在研究结束时，将这些猴处死，进行尸检并取出器官。在该实例中描述的方案得到了研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
将三十六只雄性食蟹猴分为九组，每组四只猴，其中用0.9％盐水处理的一组作为阴性对照。以40mg/kg皮下给予这八种反义寡核苷酸，第一周每隔一天(第1、3、5和7天)持续一共四个负荷剂量，并且在此之后一周一次(第14、21、28、35、和42或43天)持续6周。在整个研究过程中测量若干临床终点。在第一次皮下给予之前1周进行尾部采血，然后在第9、16、30、44、58、72、和86天再次采血。
身体重量和器官重量
每周评价体重。在一些这些时间点的体重、和器官重量(在第44天)呈现在下表中。没有观察到反义寡核苷酸对体重有显著影响。
表83
用反义寡核苷酸处理的食蟹猴的身体重量和器官重量
RNA分析
在研究结束时，从猴的肝和肾中提取RNA，用于K-Ras的mRNA表达的测量的实时PCR分析。如上所述的，使用引物探针组RTS3496_MGB，并且将每个组的结果取平均值并且表示为相对于PBS对照的mRNA抑制百分比，用恒河猴亲环蛋白A进行了归一化。将两次试验的结果取平均值并且呈现在下表中。
表84
相对于PBS对照，食蟹猴肝中的K-Ras mRNA抑制百分比
ISIS编号 ％抑制 SEQ ID NO
651530 73 239
651555 81 615
651587 78 621
651987 84 272
695785 88 569
695823 71 607
695980 45 640
695995 71 655
表85
在用ISIS 651987处理之后，相对于PBS对照，各种猴组织中K-Ras mRNA
的抑制
寡核苷酸 651987
组织 抑制％
肝 84
肾 69
肺 23
十二指肠 53
胰脏 21
心脏 32
血液学
为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中对血液学参数的任何影响，在第44天在包含K2-EDTA的管中从每只研究动物收集大约1.3mL的血液的血液样品。使用ADVIA120血液学分析仪(拜耳公司，美国)针对红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、嗜碱细胞计数(BAS)，并且针对血小板计数(PLT)和平均血小板体积(MPV)对样品进行分析。将数据呈现在下表中。
表86
血液学
数据指示这些寡核苷酸没有导致超出在这个剂量下的反义寡核苷酸的预期范围的血液学参数的任何显著变化。就血液学参数而言，这些反义寡核苷酸在猴中是良好耐受的。
肝和肾功能
为了评估这些反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在第44天从所有研究组收集血液、血浆、血清和尿样品。在给药后48hr经由股静脉穿刺收集血液样品。在血液收集之前，使猴禁食过夜。将来自每只动物的大约1.5mL的血液收集进没有抗凝剂的管中，用于血清分离。使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量各种标记物的水平。测量了总尿蛋白和尿肌酸酐水平，并且测定了总尿蛋白与肌酸酐的比率(P/C比)。
为了评估反义寡核苷酸对肝功能的影响，测量了转氨酶(ALT、AST)、白蛋白(Alb)和总胆红素(“T.Bil”)的血浆浓度。为了评估反义寡核苷酸对肾功能的影响，测量了血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cre)的血浆浓度。测量了白蛋白(Alb)、肌酸酐(Cre)和总尿蛋白(微量总蛋白(MTP))的尿水平，并且测定了总尿蛋白与肌酸酐的比率(P/C比)。
为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中的任何炎症效应，在第42天对C-反应蛋白(CRP)(其在肝中合成并且充当炎症的标记物)进行了测量。为此，从禁食猴中取血液样品，将管在室温下保持最少90min.，并且在室温下以3,000rpm离心10min，以获得血清。结果呈现在下表中并且指示靶向人类K-Ras的大部分反义寡核苷酸在食蟹猴中是良好耐受的。
表87
血清和尿临床化学
补体C3水平
在给药之前并且在第42天(给药前后)，在研究期期间在若干天测量C3水平。当将第42天给药前与平行对照(盐水)和基线(第-14天给药前)进行比较时，在所有经反义寡核苷酸处理的组中注意到降低趋势，用ISIS编号651555处理的动物除外。与给药前相比，在第42天最低的C3水平(第42天给药前基线值的82％)显示在用ISIS编号651987处理的动物中。补体C3分析的结果示于下表中。
表88
与基线和对照组相比，在第42天的C3分析(mg/dL)
在所有经寡核苷酸处理的组中观察到降低的C3水平(与基线对照相比，降低大约6％至18％)，用ISIS编号651555处理的动物除外。最低的C3水平显示在用ISIS编号651987处理的动物中。
表89
食蟹猴的肝和肺中的ISIS反义寡核苷酸的浓度
表90
6周的给药后，食蟹猴的肝和肾皮质中的K-Ras浓度
总之，将靶向K-Ras mRNA的八种反义寡核苷酸皮下注射6周是良好耐受的，而没有明显毒性。在此项研究中没有观察到死亡率、体重、凝固和尿分析/尿化学的处理相关变化。
实例22：靶向K-Ras的反义寡核苷酸在食蟹猴中的可耐受性
在六周的通过皮下给予的处理之后，针对六种反义寡核苷酸在雄性食蟹猴的重复剂量研究中的相对功效、可耐受性、药代动力学和药效动力学特征对这六种反义寡核苷酸进行比较。在该研究中使用的这些反义寡核苷酸描述于下表中。
表91
处理
在研究之前，将猴保持隔离，在此期间每天观察这些动物的一般健康状况。这些猴是二到三岁并且称重为两到三kg。在适应和预处理期期间每天记录一次所有动物的观察结果，在处理期期间并且在尸检之前每天记录两次(在给药天的给药前后，在非给药天的上下午)。
在适应期期间在分组之前每天为所有研究动物称重一次，并且在处理期期间每周称重一次。在计划处死的当天，在尸检之前称体重。从头静脉或股静脉中收集血液样品，用于评估血液学、凝固、和临床化学。从所有可用的动物收集新鲜的尿样品，用于尿分析/尿化学参数。在血液收集之前使动物禁食过夜，用于临床化学和尿收集。
在研究结束时，将这些猴处死，进行尸检并取出器官。在该实例中描述的方案得到了研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
将二十八只雄性食蟹猴分为七组，每组四只猴，其中用0.9％盐水处理的一组作为阴性对照。以40mg/kg皮下给予这六种反义寡核苷酸，第一周每隔一天(第1、3、5和7天)持续一共四个负荷剂量，并且在此之后一周一次(第14、21、28、35、和4天)持续6周。在整个研究过程中测量若干临床终点。在第一次皮下给予之前2周和1周进行尾部采血，然后在第16、30、和44天再次采血。在第一次皮下给予之前2周并且在第42天对血清进行测试，并且在研究开始之前1周并且在第44天收集尿。
身体重量和器官重量
每周评价体重。在一些这些时间点的体重、和器官重量(在第44天)呈现在下表中。没有观察到反义寡核苷酸对体重有显著影响。
表92
用反义寡核苷酸处理的食蟹猴的体重
表93
用反义寡核苷酸处理的食蟹猴的器官重量
血液学
为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中对血液学参数的任何影响，在第44天在包含K2-EDTA的管中从每只研究动物收集大约1.3mL的血液的血液样品。使用ADVIA120血液学分析仪(拜耳公司，美国)针对红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、嗜碱细胞计数(BAS)，并且针对血小板计数(PLT)和平均血小板体积(MPV)对样品进行分析。将数据呈现在下表中。
表94
血液学
数据指示这些寡核苷酸没有导致超出在这个剂量下的反义寡核苷酸的预期范围的血液学参数的任何显著变化。就血液学参数而言，这些反义寡核苷酸在猴中是良好耐受的。
肝和肾功能
为了评估这些反义寡核苷酸对肝和肾功能的影响，在第44天从所有研究组收集血液、血浆、血清和尿样品。在给药后48hr经由股静脉穿刺收集血液样品。在血液收集之前，使猴禁食过夜。将来自每只动物的大约1.5mL的血液收集进没有抗凝剂的管中，用于血清分离。使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯Au400e，梅尔维尔，纽约)测量各种标记物的水平。测量了总尿蛋白和尿肌酸酐水平，并且测定了总尿蛋白与肌酸酐的比率(P/C比)。
为了评估反义寡核苷酸对肝功能的影响，测量了转氨酶(ALT、AST)、白蛋白(Alb)和总胆红素(“T.Bil”)的血浆浓度。为了评估反义寡核苷酸对肾功能的影响，测量了血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cre)的血浆浓度。测量了白蛋白(Alb)、肌酸酐(Cre)和总尿蛋白(微量总蛋白(MTP))的尿水平，并且测定了总尿蛋白与肌酸酐的比率(P/C比)。
为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中的任何炎症效应，在第42天对C-反应蛋白(CRP)(其在肝中合成并且充当炎症的标记物)进行了测量。为此，从禁食猴中取血液样品，将管在室温下保持最少90min.，并且在室温下以3,000rpm离心10min，以获得血清。结果呈现在下表中并且指示靶向人类K-Ras的大部分反义寡核苷酸在食蟹猴中是良好耐受的。
表95
血清和尿临床化学
RNA分析
在研究结束时，针对用ISIS 746275处理的动物，从各种猴组织中提取RNA，用于K-Ras的mRNA表达的测量的实时PCR分析。如上所述的，使用引物探针组RTS3496_MGB，并且将每个组的结果取平均值并且表示为相对于PBS对照的mRNA抑制百分比，用恒河猴亲环蛋白A进行了归一化。
表96
在用ISIS 746275处理之后，相对于PBS对照，各种猴组织中K-Ras mRNA的抑制
组织 抑制％
肝 69
肾 51
肺 27
十二指肠 39
胰脏 0
心脏 28

Claims (45)

1.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：13-2190的核碱基序列中任一个的至少8、9、10、11、或12个连续核碱基的核碱基序列。
2.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成并且具有包含SEQ ID NO：13-2190中任一个的核碱基序列的核碱基序列。
3.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO：13-2190中任一个的核碱基序列组成。
4.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由在SEQ ID NO：1的核碱基463-478、877-892、1129-1144、1313-1328、1447-1462、1686-1701、1690-1705、1778-1793、1915-1930、1919-1934、1920-1935、2114-2129、2115-2130、2461-2476、2462-2477、2463-2478、4035-4050内互补的8至80个连接的核苷组成，其中所述修饰的寡核苷酸与SEQ IDNO：1是至少85％、90％、95％、或100％互补的。
5.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由8至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：272、804、239、569、607、615、621、640、655、678、715、790、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列中任一个的至少8、9、10、11、或12个连续核碱基的核碱基序列。
6.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：272、804、239、569、607、615、621、640、655、678、715、790、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个的核碱基序列的核碱基序列。
7.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成，具有由SEQ ID NO：272、804、239、569、607、615、621、640、655、678、715、790、854、1028、2130、2136、2142、2154、和2158中任一个组成的核碱基序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；和
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。
9.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：272、239、569、607、615、621、640、655、678、715、790、和854中任一个的核碱基序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷都包括受约束的乙基(cEt)核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
10.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：2130的核碱基序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由九个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由一个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由六个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段包括cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、和2’-O-甲氧基乙基核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
11.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：804、1028、和2136中任一个的核碱基序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由四个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
12.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：2142的核碱基序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由八个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由六个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
13.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：2154的核碱基序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由九个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由两个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由五个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、cEt核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
14.一种包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至80个连接的核苷组成，具有包含SEQ ID NO：2158的核碱基序列的核碱基序列，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由八个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；和
由五个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段位于该5’翼区段与该3’翼区段之间；其中该5’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、cEt核苷、和cEt核苷；其中该3’翼区段在5’到3’方向上包括cEt核苷、脱氧核苷、cEt核苷、脱氧核苷、和cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
15.如权利要求1-14中任一项所述的化合物，其中该寡核苷酸与SEQ ID NO：1或2是至少80％、85％、90％、95％或100％互补的。
16.如权利要求1-15中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷间连接、至少一种修饰的糖、或至少一种修饰的核碱基。
17.如权利要求16所述的化合物，其中该修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
18.如权利要求16或17所述的化合物，其中该修饰的糖是二环糖。
19.如权利要求18所述的化合物，其中该二环糖选自下组，该组由以下各项组成：4′-(CH2)-O-2′(LNA)；4′-(CH2)2-O-2′(ENA)；和4′-CH(CH3)-O-2′(cEt)。
20.如权利要求16-19中任一项所述的化合物，其中该修饰的糖是2’-O-甲氧基乙基。
21.如权利要求16-20中任一项所述的化合物，其中该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
22.如权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸包括：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；和
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中该缺口区段被定位成紧邻该5’翼区段和该3’翼区段并且位于该5’翼区段与该3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷都包括修饰的糖。
23.如权利要求1-22中任一项所述的化合物，其中该化合物是单链的。
24.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中该化合物是双链的。
25.如权利要求1-24中任一项所述的化合物，其中该化合物包括核糖核苷酸。
26.如权利要求25所述的化合物，其中该化合物包括双链RNA寡核苷酸，其中该双链RNA寡核苷酸的一条链是该修饰的寡核苷酸。
27.如权利要求1-24中任一项所述的化合物，其中该化合物包括脱氧核糖核苷酸。
28.如权利要求1-27中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸由10至30、12至30、15至30、16至30、或16个连接的核苷组成。
29.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中该化合物包括缀合物和该修饰的寡核苷酸。
30.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中该化合物由缀合物和该修饰的寡核苷酸组成。
31.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中该化合物由该修饰的寡核苷酸组成。
32.一种化合物，其由如权利要求1-31所述的化合物中任一种的药学上可接受的盐组成。
33.如权利要求32所述的化合物，其中该药学上可接受的盐是钠盐。
34.如权利要求32所述的化合物，其中该药学上可接受的盐是钾盐。
35.一种化合物，其包含具有以下化学式的ISIS 651987、或其药学上可接受的盐：
36.一种化合物，其由具有以下化学式的ISIS 651987、或其药学上可接受的盐组成：
37.如权利要求35或36所述的化合物，其中该药学上可接受的盐是钠盐。
38.一种组合物，其包括如权利要求1-37中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
39.一种治疗、预防、或缓解个体的癌症的方法，该方法包括向该个体给予如权利要求1-37中任一项所述的化合物或如权利要求38所述的组合物，由此治疗、预防、或缓解该个体的癌症。
40.如权利要求39所述的方法，其中该癌症是肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、造血系统癌、脑癌、恶性胶质瘤、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、1型神经纤维瘤病(NF1)突变型MPNST、神经纤维瘤、白血病、髓细胞性白血病、或淋巴瘤。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中给予该化合物减少该个体体内癌细胞的数目、减小该个体体内肿瘤的大小、减少或抑制该个体体内肿瘤的生长或增殖、防止在该个体体内的转移或者减小转移的范围、或延长该个体的存活。
42.一种抑制细胞中的KRAS表达的方法，该方法包括使该细胞与如权利要求1-37中任一项所述的化合物或如权利要求38所述的组合物接触，由此抑制该细胞中的KRAS表达。
43.如权利要求1-37中任一项所述的化合物或如权利要求38所述的组合物用于治疗、预防、或缓解个体的癌症的用途。
44.如权利要求1-37中任一项所述的化合物或如权利要求38所述的组合物用于生产治疗癌症的药剂的用途。
45.如权利要求43或44所述的用途，其中该癌症是肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、造血系统癌、脑癌、恶性胶质瘤、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、1型神经纤维瘤病(NF1)突变型MPNST、神经纤维瘤、白血病、髓细胞性白血病、或淋巴瘤。
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ZA (1) ZA201802663B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110981943A (zh) * 2019-12-02 2020-04-10 清华大学 多肽及其在制备药物中的用途和药物
CN113286601A (zh) * 2018-11-14 2021-08-20 Ionis制药公司 Foxp3表达的调节剂

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR092645A1 (es) 2012-09-25 2015-04-29 Hoffmann La Roche Derivados biciclicos inhibidores de autotaxina (atx)
AR095079A1 (es) 2013-03-12 2015-09-16 Hoffmann La Roche Derivados de octahidro-pirrolo[3,4-c]-pirrol y piridina-fenilo
UA118201C2 (uk) 2013-11-26 2018-12-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг НОВИЙ ОКТАГІДРОЦИКЛОБУТА[1,2-c;3,4-c']ДИПІРОЛ-2-ІЛ
MX2016010675A (es) 2014-03-26 2016-11-10 Hoffmann La Roche Compuestos condensados de [1,4]diazepina como inhibidores de produccion de la autotaxina (atx) y acido lisofosfatidico (lpa).
EP3122750B1 (en) 2014-03-26 2019-09-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Bicyclic compounds as autotaxin (atx) and lysophosphatidic acid (lpa) production inhibitors
MA41898A (fr) 2015-04-10 2018-02-13 Hoffmann La Roche Dérivés de quinazolinone bicyclique
MX2020004504A (es) 2015-09-04 2021-11-10 Hoffmann La Roche Derivados de fenoximetilo.
RU2018114289A (ru) 2015-09-24 2019-10-24 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Бициклические соединения в качестве ингибиторов аутотаксина (atx)
EP3353181B1 (en) 2015-09-24 2021-08-11 F. Hoffmann-La Roche AG Bicyclic compounds as dual atx/ca inhibitors
MX2018001890A (es) 2015-09-24 2018-06-20 Hoffmann La Roche Compuestos biciclicos como inhibidores de autotaxina (atx).
BR112018006080A2 (pt) 2015-09-24 2018-10-09 F. Hoffmann-La Roche Ag novos compostos bicíclicos como inibidores de dupla ação de atx/ca
ES2863873T3 (es) 2016-05-18 2021-10-11 Mirati Therapeutics Inc Inhibidores de KRAS G12C
WO2018146316A1 (en) * 2017-02-13 2018-08-16 Astrazeneca Ab Combination of a mapk pathway inhibitor and an antisense compound targeted to kras
US11261440B2 (en) 2017-02-21 2022-03-01 Osaka University Antisense oligonucleic acid
CR20190423A (es) 2017-03-16 2019-11-01 Hoffmann La Roche Nuevos compuestos biciclícos como inhibidores dobles de atx/ca
EP3596060B1 (en) 2017-03-16 2023-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG New bicyclic compounds as atx inhibitors
US10647715B2 (en) 2017-11-15 2020-05-12 Mirati Therapeutics, Inc. KRas G12C inhibitors
US10689377B2 (en) 2017-11-15 2020-06-23 Mirati Therapeutics, Inc. KRas G12C inhibitors
US11332733B2 (en) 2018-02-12 2022-05-17 lonis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
US11512315B2 (en) * 2018-02-12 2022-11-29 Codiak Biosciences, Inc. Methods and compositions for macrophage polarization
BR112020016001A2 (pt) * 2018-03-02 2020-12-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Moduladores de expressão irf4
WO2019217307A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Mirati Therapeutics, Inc. Kras g12c inhibitors
JP7247227B2 (ja) * 2018-05-22 2023-03-28 アイオニス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ａｐｏｌ１発現のモジュレーター
WO2020027227A1 (ja) * 2018-07-31 2020-02-06 国立大学法人大阪大学 オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬
EP3908283A4 (en) 2019-01-10 2022-10-12 Mirati Therapeutics, Inc. KRAS G12C INHIBITORS
KR20210122809A (ko) 2019-01-31 2021-10-12 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Yap1 발현의 조절인자
EP4013872A1 (en) * 2019-08-14 2022-06-22 Codiak BioSciences, Inc. Extracellular vesicles with antisense oligonucleotides targeting kras
US11453683B1 (en) 2019-08-29 2022-09-27 Mirati Therapeutics, Inc. KRas G12D inhibitors
JP2022548791A (ja) 2019-09-24 2022-11-21 ミラティ セラピューティクス， インコーポレイテッド 組み合わせ療法
MX2022007515A (es) 2019-12-20 2022-09-19 Mirati Therapeutics Inc Inhibidores de sos1.
JP7427227B2 (ja) 2020-01-21 2024-02-05 学校法人産業医科大学 腫瘍細胞の生存を低下させるｋｒａｓアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途
KR102574252B1 (ko) * 2020-12-15 2023-09-07 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물
WO2023034537A1 (en) * 2021-09-02 2023-03-09 Molecular Axiom, Llc Compositions and methods for modulating kras expression

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010115202A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of kras by blunt ended double-stranded rna

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666A (en) 1850-09-24 harris
US854A (en) 1838-07-26 Iixvi-lx n
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US4751219A (en) 1985-02-05 1988-06-14 Nederlandse Centrale Organisatie Voor Toegepast-Natuur-Wetenschappelijk Onderzoek Synthetic glycolipides, a process for the preparation thereof and several uses for these synthetic glycolipides
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
DE3851889T2 (de) 1987-06-24 1995-04-13 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
ATE154246T1 (de) 1990-07-27 1997-06-15 Isis Pharmaceuticals Inc Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
DE637965T1 (de) 1991-11-26 1995-12-14 Gilead Sciences Inc Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen.
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US6784290B1 (en) 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US5994517A (en) 1995-11-22 1999-11-30 Paul O. P. Ts'o Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US6620916B1 (en) 1996-09-26 2003-09-16 Ajinomoto Co., Inc. Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
JP2002542263A (ja) 1999-04-21 2002-12-10 ワイス ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6383812B1 (en) 1999-05-28 2002-05-07 Academia Sinica Anti liver disease drug R-YEEE and method of synthesizing branched galactose-terminal glycoproteins
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
CN100406065C (zh) 2000-12-01 2008-07-30 细胞工厂治疗公司 糖基化/半乳糖基化肽、双官能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物以及相关的组合物和使用方法
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP1543019A2 (en) 2002-09-11 2005-06-22 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP1578765A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS CONTAINING SUGAR SUBSTITUTE AND COMPOSITIONS FOR USE IN GENE MODULATION
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
EP2664672A1 (en) 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
JPWO2004101619A1 (ja) 2003-05-15 2006-10-26 塩野義製薬株式会社 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
US7427672B2 (en) 2003-08-28 2008-09-23 Takeshi Imanishi Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
AU2004274021B2 (en) 2003-09-18 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
EP2990410A1 (en) 2004-08-10 2016-03-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
US20090203132A1 (en) 2004-09-09 2009-08-13 Swayze Eric E Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
WO2006078217A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Avaris Ab COMPLEX CONTAINING SiRNA, ShRNA OR ANTISENSE MOLECULE AND FUNCTIONAL ENTITY, FOR IMPROVED SPECIFICITY AND DELIVERY
EP2314594B1 (en) 2006-01-27 2014-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
DK2066684T3 (da) 2006-05-11 2012-10-22 Isis Pharmaceuticals Inc 5´-Modificerede bicycliske nukleinsyreanaloge
AU2007285782B2 (en) 2006-08-18 2010-06-24 Arrowhead Research Corporation Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
US20100190837A1 (en) 2007-02-15 2010-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Substituted-2-F' Modified Nucleosides and Oligomeric Compounds Prepared Therefrom
EP2129402A2 (en) 2007-02-16 2009-12-09 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor and antigen targeted prodrug
US8877917B2 (en) 2007-04-23 2014-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of RNA interference agents
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
EP2188298B1 (en) 2007-08-15 2013-09-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
AU2009241591A1 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of DSRNA targeting the PCSK9 gene
US20110130440A1 (en) 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
JP2012513953A (ja) 2008-09-23 2012-06-21 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 付加環化を用いたモノマーおよびオリゴヌクレオチドの化学修飾
KR20220150995A (ko) 2008-11-10 2022-11-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
CA2751342C (en) 2009-01-29 2019-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
SG10201402054UA (en) 2009-05-05 2014-09-26 Muthiah Manoharan Lipid compositions
CN104873464B (zh) 2009-06-10 2018-06-22 阿布特斯生物制药公司 改进的脂质制剂
CN104651408A (zh) 2009-06-15 2015-05-27 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
US8552163B2 (en) 2009-09-25 2013-10-08 Johns Hopkins University Liver-targeting agents and their synthesis
TWI388338B (zh) 2009-10-26 2013-03-11 Iner Aec Executive Yuan 對聚合醣鏈進行放射標誌以作為肝受體造影劑之方法
TWI391144B (zh) 2009-10-26 2013-04-01 Iner Aec Executive Yuan 一種定量肝殘餘功能的檢驗方法與其新穎肝受體造影檢驗藥劑
WO2011072290A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Regents Of The University Of Michigan Targeted dendrimer-drug conjugates
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
EA024534B1 (ru) 2010-02-24 2016-09-30 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн КОНЪЮГИРОВАННАЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК (миРНК) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ
WO2011120053A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
US20130109817A1 (en) 2010-03-26 2013-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Modified Polymers for Delivery of Polynucleotides, Method of Manufacture, and Methods of Use Thereof
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
EP2616543A1 (en) 2010-09-15 2013-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
US8987377B2 (en) 2010-11-19 2015-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
SG189474A1 (en) 2010-12-17 2013-05-31 Arrowhead Res Corp Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for sirna
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
WO2012089352A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
RU2631805C2 (ru) 2011-06-21 2017-09-26 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы ингибирования экспрессии генов аполипопротеина с-iii (арос3)
KR20140051357A (ko) 2011-08-26 2014-04-30 애로우헤드 리서치 코오포레이션 Ｉｎ Ｖｉｖｏ 핵산 전달용 폴리(비닐 에스테르) 고분자
EP3640332A1 (en) 2011-08-29 2020-04-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
KR102385013B1 (ko) 2011-11-18 2022-04-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
EA031393B1 (ru) 2013-05-01 2018-12-28 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии hbv и ttr

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010115202A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of kras by blunt ended double-stranded rna

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIA-HUI WANG等: "Antisense knockdown of Kras inhibits fibrosis in a rat model of unilateral ureteric obstruction", 《THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113286601A (zh) * 2018-11-14 2021-08-20 Ionis制药公司 Foxp3表达的调节剂
CN110981943A (zh) * 2019-12-02 2020-04-10 清华大学 多肽及其在制备药物中的用途和药物
CN110981943B (zh) * 2019-12-02 2021-08-03 清华大学 多肽及其在制备药物中的用途和药物

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